EXTENSION SANGUINEA

EXTENSION SANGUINEA La practica de una extensin sangunea es de gran importancia en hematologa ya que muchas hematopatas se diagnostican con solo observar las caractersticas morfolgicas de las clulas circundantes.Por ello la calidad de la extensin debe ser impecable Es recomendable realizarla en la misma cabecera del enfermo y de ser posible con sangre sin anticoagulante. Esto obedece a que tanto el tiempo como la naturaleza del anticoagulante ejercen un efecto directo sobre la morfologa celular induciendo la aparicin de artefactos(polimorfo neutrfilos y monocitos) o alterando la distribucin de las clulas (sobre todo las plaquetas)Debe remarcarse que los extendidos deben ser secados inmediatamente con aire seco a temperatura no mayor de 40C.Previa constatacin del volumen adecuada de muestra y de la ausencia de micro cogulos, contaminacin o crio aglutinacin(en este ultimo caso se aconseja calentar la muestra a 37C y diluir para el recuento, con solucin fisiologica,en iguales condiciones).

La calidad de la extensin es decisiva para poder apreciar la morfologa eritrocitaria y muy importante para efectuar el recuento diferencial de leucocitos.Para realizar una buena extensin de sangre pueden emplearse procedimientos manuales o mecanizados (automatizados).REALIZACION MANUALPRECAUCIONES O RECOMENDACIONES A SEGUIR:Todo el material a emplear (portaobjetos o cubreobjetos) han de estar escrupulosamente limpios y desengrasados.Si se parte de una puncin digital, debe desecharse siempre la primera gotaSi se parte de una puncin venosa debe hacerse con la mxima rapidez, y de ser posible, antes de mezclar la sangre con el anticoagulanteSi no puede realizarse de inmediato, la extensin debe de practicarse dentro de las 2 horas de practicada la extraccin y empleando EDTA-K2 EN PROPORCION DE 1.5 -2.2 mg /ml de sangre.

Almacenamiento y transporte de muestras de sangre.Los extendidos preparados con sangre anticoagulados (EDTA),que han permanecido no mas de 1 hora a temperatura ambiente, presentan pocos cambios en comparacin con los extendidos preparados inmediatamente despus de extraer la muestra.A las 3 horas los cambios empiezan a observarse .

Cambios observables Los glbulos blancos presentan vacuolas y cambios nucleares degenerativos .La morfologa de los glbulos rojos no se ve muy afectada si la sangre permanece hasta 6 horas a temperatura ambiente, pero luego de este lapso comienza la crenacion .Todo estos cambios se producen con mayor rapidez si la temperatura ambiente es mas alta .Se retrasan los cambios si la sangre se conserva a 4C.Otros cambios: Los glbulos rojos nucleados desaparecen de la muestra de sangre en 24 a 48 horas

Mtodo de los dos portaobjetosProcedimiento de eleccin en la practica clnica y consiste en extender una gota de sangre sobre un portaobjetos de iguales dimensiones. Se recomienda seguir los siguientes pasos:Colocar una pequea gota de sangre no mas de 3 mm.de dimetro sobre la superficie de un portaobjetos a 2 cm aproximadamente de uno de sus extremos.Colocar el canto de otro portaobjetos esmerilado por la parte anterior a la gota de sangre sobre la superficie del primer portaobjetos ,formando un ngulo de aproximadamente de 45 desplazarlo suavemente hacia atrs hasta que alcance la gota de sangre.Esperar que por capilaridad toda la sangre se distribuya de manera uniforme .Es aconsejable que la sangre no llegue a los lados del portaobjetos sobre el que se realizara la extensin.Deslizar suavemente y a velocidad moderada un portaobjetos sobre el otro en sentido longitudinal, hasta que la gota de sangre quede bien extendida sobre la superficie del primer portaobjetos. El grosor de la extensin se puede variar segn sea el ngulo que formen entre si ambos .As, si es superior a 45, la extensin obtenida ser gruesa y corta: por el contrario, si es inferior a 45, ser larga y fina.Secado de la extensin a temperatura ambiente y en posicin vertical.

UNA BUENA EXTENSION REALIZADA PRESENTARA 3 AREAS DE DIFERENTE GROSOR Y CON UNA DISTRIBUCION TAMBIEN DISTINTA DE LEUCOCITOS: ZONA EXCESIVAMENTE GRUESA. Se halla en la regin inmediata al punto de partida de la extensin (cabeza).En ella se aprecia siempre un aumento del numero de linfocitos.ZONA EXCESIVAMENTE FINA. Corresponde al final d la extensin y termina con un rea donde las clulas adoptan una disposicin acordonada (barbas).En esta regin se observa un exceso de granulocitos y monocitos.ZONA IDEAL. Corresponde a la regin situada entre las dos anteriores (zona intermedia) y en ella existe un reparto equilibrado de las clulas.

Adems de la irregular distribucin de los leucocitos ,este procedimiento tiene el inconveniente de que produce en ellos cierto traumatismo.Mtodo de los cubreobjetos EL PROCEDIMIENTO ES ALGO MAS ENGORROSO.

DISTRIBUCION LEUCOCITARIA ES MAS HOMOGENEA. Consiste en realizar una extensin distribuyendo una gota de sangre entre 2 cubreobjetos (aproximadamente 2 cm/lado). Es muy importante tener en cuenta el volumen de la gota y la rapidez en la realizacin del proceso que consta de las siguientes etapas:

Colocar una pequea gota de sangre en el centro de un cubreobjetosColocar un segundo cubreobjetos sobre la gota de sangre de forma cruzada de modo que ambos cubreobjetos formen una imagen de una estrella de 8 puntas.Esperar a que por capilaridad la sangre se halla distribuido de manera uniforme entre ambas superficies

Separar ambos cubreobjetos desplazando uno de ellos paralelamente al otroSecar al aire ambas extensiones.

REALIZACION MECANICA.

Consiste en la realizacin de una extensin sangunea sobre el portaobjetos mediante sistemas mecnicos que eliminan la variabilidad tcnica propia del mtodo manual. han desaparecido ,sustituidos por equipos de anlisis computarizados.Permiten estandarizar el mtodoFacilitan la distribucin homognea de las clulas sanguneas sobre el portaobjetos.

AUTOANALIZADORES HEMATOLOGICOS Un sistema que automticamente se desplaza un cristal esmerilado sobre la superficie del portaobjetos. Se adapta a cada espcimen de forma individualizada, de manera que el grosor se ajusta automticamente segn el valor del hematocrito proporcionado por el mismo autoanalizador

TINCION DE LA EXTENSION SANGUINEAPRINCIPIOCOLORACIONES EMPEADAS EN HEMATOLOGIAMATERIAL METODOS

redcellreyes La extensin sangunea, una vez seca ,debe someterse lo antes posible (nunca mas de 24 horas)a un proceso de fijacin para poder ser teida mediante el colorante de eleccin .los mtodos empleados para teir las clulas se basan en el mtodo de Romanoswsky constituido fundamentalmente por la mezcla de eosina y azul de metileno.El mtodo de Romanowsky en hematologa requiere dos premisas fundamentales:La fijacin de la sangre extendida sobre el portaobjetos antes de la aplicacin del coloranteEl empleo junto a la eosina y el azul de metileno de derivados por oxidacin del azul de metileno, que se conocen con el nombre de azures (azur A, azur B y azur C) .Estas sustancias son las responsables de la coloracin purpura de la cromatina leucocitaria y de ciertas granulaciones citoplasmticas, que por ello se denominan azurofilas

ASPECTOS MORFOLOGICOS DE LAS CELULAS Forma ,dimensiones y contorno de las clulasNcleo celular y restos de cromatina(color purpura)Citoplasma de los linfocitos (color azul)Citoplasma de los monocitos (color grisceo)Granulaciones de los polimorfonucleares:Eosinofilos:color naranjaBasofilos: azul oscuroNeutrofilos: color pardoEritrocitos :color rosa plidoReticulocitos:color azulado

PRINCIPIO Tanto la eosina como el azul de metileno son muy sensibles a las variaciones de ph de las diferentes estructuras celulares, de forma que las que tien carcter bsico fijan en mayor medida la eosina(colorante acido) ,mientras que las que poseen propiedades acidas fijan principalmente el azul de metileno(colorante bsico).Esto explica que ciertas estructuras basofilas presentes en el ncleo(nucleolo) o en el citoplasma (ribosomas) se colorean de azul, mientras que otros componentes acidofilos como la hemoglobina adquieren un color rosado. De igual modo, la diferente afinidad de ciertas granulaciones citoplasmticas por dichos colorantes permite clasificar los leucocitos polimorfonucleares en tres grupos:GRANULOCITOS NEUTROFILOS, en los que la granulacin posee compuestos neutros que fijan ambos colorantes simultaneamente.El color resultante es pardo y las granulaciones se denominan neutrofilas.GRANULOCITOS EOSINOFILOS, en los que la granulacin especifica contiene sustancias de intenso carcter bsico(espermina y derivados),que fijan fundamentalmente los colorantes cidos(compuestos acidofilos). El color resultante es rojo-naranja.GRANULOCITOS BASOFILOS , en los que la granulacion especifica posee sustancias de fuerte carcter acido( heparina) ,que fijan los colorantes basicos como el azul de metileno(compuestos basofilos) .El color resultante es azul oscuro. El azur B tie de color purpura la granulacion primaria de los neutrofilos, la fina granulacion de los monocitos y la que puede observarse en ciertos linfocitos de gran tamao y abundante citoplasma(linfocitos grandes granulados).

Este colorante tambin tie ciertas inclusiones eritrocitarias derivadas de la cariorrexis( punteado azurofilo o polvillo nuclear) o los hemoparasitos.Entre los mtodos de tincin basados en el empleo de colorantes tipo Romanowsky, los mas utilizados son el Giemsa,May-Grunwald-Giemsa y el de Wright.CAUSAS POTENCIALES DE FROTIS DE SANGRE TEIDOS DE MANERA INAPROPIADASI EL FROTIS DE SANGRE ES:CAUSAS EXCESIVAMENTE AZUL U OSCUROTINCION PROLONGADA LAVADO INADECUADOALCALINIDAD DEMASIADO ALTA DEL COLORANTE O DEL AMORTIGUADOR O AMBOS EXCESIVAMENTE ROSADO O CLAROFROTIS DE SANGRE GRUESO TINCION INSUFICIENTE LAVADO PROLONGADOACIDEZ DEMASIADO ALTA DEL COLORANTE O DEL AMORTIGUADOR O AMBOS HAY PRESENCIA DE PRECIPITADOPORTAOBJETOS SUCIOSDESECACION DURANTE EL PROCESO DE TINCION FILTRADO INADECUADO DEL COLORANTE TINCIONES CITOQUIMICASLa citoquimica estudia la clula y permite realizar la localizacin topogrfica de diversas sustancias, considerndose como un la unin entre la morfologa y la bioqumica, al conjugar forma y funcin.Las sustancias a reconocer en la clula son: glucogeno,(reaccin de PAS),grasas neutras ( Sudn black),enzimas tales como mieloperoxidas,hidrolasas alcalinas(fosfatas alcalina) y otrasPEROXIDASA(MIELOPEROXIDASA)LA MIELOPEROXIDASA ES UNA ENZIMA CON LA CAPACIDAD DE CATALIZAR LA OXIDACION DE SUSTANCIAS MEDIANTE PEROXIDO DE HIDROGENO.LOS SITIOS DE ACTIVIDAD DE LA MIELOPEROXIDASA SE IDENTIFICAN POR UN PRODUCTO DE REACCION INSOLUBLE DE COLOR NEGRO PARDO.ESTA ENZIMA ESTA PRESENTE EN NEUTROFILOS Y SUS PRECURSORES, EOSINOFILOS Y MONOCITOS .LOS LINFOCITOS NO EXHIBEN ACTIVIDAD DE MIELOPEROXIDASA .ES UTIL EN LA DIFERENCIACION ENTRE LAS LEUCEMIAS MIELOBLASTICAS AGUDAS Y LEUCEMIAS LINFOBLASTICAS AGUDAS.

SUDAN NEGRO BES UN COLORANTE DIAZO QUE TIE FOSFOLIPIDOS ,GRASAS NEUTRAS Y ESTEROLES .LOS COMPONENTES CELULARES QUE CONTIENEN LIPIDOS SE TIEN DE COLOR NEGRO PARDO CON EL COLORANTE TIE LOS GRANULOS PRIMARIOS Y SECUNDARIOS DE LA LINEA CELULAR GRANULOCITICA .LOS NEUTROFILOS,LOS PRECURSORES DE LOS NEUTROFILOS Y LOS EOSINOFILOS MUESTRAN GRANULACION INTRACELULAR DE COLOR NEGROLOS MONOCITOS SE TIEN CON MENOS INTENSIDADLOS LINFOCITOS NO SE TIEN ES UTIL EN LA DIFERENCIACION ENTRE LEUCEMIAS MIELOBLASTICAS AGUDAS Y LEUCEMIAS LINFOBLASTICAS AGUDAS

Tincion con cloroacetato esterasaLA CLOROACETATO ESTERASA DE NAFTOL AS-D SE CONSIDERA ESPECIFICA PARA LA LINEA DE CELULAS GRANULOCITICAS .LOS SITIOS DE ACTIVIDAD DE LA ENZIMA MUESTRAN GRANULACION ROJO BRILLANTE .LA ACTIVIDAD ENZIMATICA ES DEBIL O ESTA AUSENTE EN LOS MONOCITOS Y LOS LINFOCITOS ES UTIL PARA LA DIFERENCIACION ENTRE LAS LEUCEMIAS MIELOBLASTICAS AGUDAS Y LEUCEMIAS LINFOBLASTICAS GUDAS. ACIDO PERYODICO DE SHIFF(PAS)LOS COMPONENTE S CELULARES QUE CONTIENEN POLISACARIDOS, MUCOPOLISACARIDOS Y GLUC OPROTEINAS POSEEN LOS GRUPOS 1,2 GLICOL Y SE TIEN .LA TINCION ACIDO PERYODICO DE SCHIFF(PAS)SE VE EN CASI TODAS LAS CELULAS HEMATOPOYETICAS NORMALES .EN LA LINEA CELULAR GRANULOCITICA ,LA INTENSIDAD DE LA TINCION AUMENTA CON LA MADUREZ.LOS MONOCITOS EXHIBEN UN PATRON DIFUSO ,LOS LINFOCITOS PUEDEN SER NEGATIVOS O MOSTRAR UNOS CUANTOS GRANULOS POSITIVOS A PAS .LOS MEGACARIOCITOS Y LAS PLAQUETAS SE TIEN DE MANERA INTENSA LOS ERITROBLASTOS NORMALES NO SE TIEN .

HIERRO TINCION DE HIERRO CON AZUL DE PRUSIA ESTA DISEADA PARA DEMOSTRAR LA PRESENCIA DE HEMOSIDERINA (RESERVA DE HIERRO ) EN LA MEDULA OSEA Y DE HIERRO TINGIBLE EN LOS ERITROBLASTOS (SIDEROBLASTOS) O ERITROCITOS (SIDEROCITOS).El HIERRO LIBERADO SE PRESENTA COMO UN MATERIAL DIFUSO DE COLOR AZUL VERDE Y LOS NUCLEOS DE COLOR ROJO.ES UTIL EN LA CLASIFICACION DE LAS ANEMIAS VINCULADAS CON LA SINTESIS DEFECTUOSA DE LA HEMOGLOBINA .LA PRESENCIA DE CUERPOS DE PAPPENHEIMER PUEDEN CONFIRMARSE CON EL AZUL DE PRUSIA .

OTRAS TINCIONES TINCIONES SUPRAVITALES NO EVALUA MORFOLOGIA EN EL RECUENTO RETICULOCITARIO SE RECONOCE LA RED DE RETICULINA. AZUL DE METILENO BRILLANTE DE CRESILO