Establecer relaciones filogenéticas entre individuos/ especies/ seres vivos.

Diagnóstico de enfermedades.

Evaluar los niveles de expresión génica.

Modificar genéticamente organismos.

Etc.

Cantidad del material de partida.

Condiciones en las que se encuentra dicho material.

Contaminantes e interferentes en el material biológico.

Contaminación por material biológico humano.

Contaminación microbiológica.

Contaminacion química.

Técnica Orgánica (Solventes)

ADN de muy buena calidad y cantidad.

Péptidos y proteínas son extraídas en la fase orgánica (Fenol), después se

realiza digestión con proteinasa K.

El cloroformo permite que todo el fenol pueda ser lavado.

DESVENTAJAS:

Reactivos altamente tóxicos.

Pérdidas significativas de ADN y mucho mas si esta degradado.

Técnica de tipo inorgánica

Utiliza reactivos bajos en toxicidad

Permite visualizar la malla del ADN.

Desventajas:

Requiere una mayor cantidad de muestra.

1.Pesar 1 g de tejido fresco

2.Macerar el tejido en un mortero utilizando nitrógeno líquido.

3.Agregar 2 ml de solución de cloruro de guanidinio (2 volúmenes por 1 de muestra) y

mezclar por inversión.

4.Agregar 2 ml de fenol:cloroformo (1 vol. Fenol + 1 vol. Cloroformo), mezclar y

centrifugar a 10,000 rpm por 45 minutos a 4 °C.

5.Transferir la fase superior a un tubo limpio y repetir el paso 4, pero centrifugando 15

min.

6.Agregar 0.7 ml (0.7 vol.) de etanol absoluto y 0.2 vol. De ácido acético 1M.

7.Incubar toda la noche a -20 °C para precipitar el RNA.

8. Centrifugar a 10,000 rpm por 10 minutos y desechar el sobrenadante.

9. Lavar la pastilla con acetato de sodio 3M pH= 5.2.

10. Centrifugar 5 min. a 13,000 rpm y 4 °C.

11. Agregar 400 µl de etanol al 70% y lavar la pastilla.

12. Centrifugar por 3 minutos y eliminar el sobrenadante.

13. Resuspender la pastilla con agua destilada estéril y almacenar a -20 °C.

1. Moler el tejido hasta obtener un polvo fino con Nitrógeno líquido.

2. Adicionar 1 ml de TRIzol por cada 100 mg de micelio. Seguir moliendo 1 min más y

descongelar hasta que esté a punto de atole.

3. Transferir 1 ml de atole a cada tubo Eppendorf nuevo y estéril con una punta para pipeta

cortada de la punta.

4. Incubar durante 5 minutos a 24 °C.

5. Adicionar 200 µl de Cloroformo/Alcohol Isoamílico 24:1 y agitar en vortex durante 15

segundos.

6. Incubar durante 3 minutos a 24 °C.

7. Centrifugar a 12,000 rpm durante 10 minutos a 8 °C.

8. Transferir la fase acuosa a un nuevo tubo (capa superior incolora).

9. Precipitar adicionando 500 µl de alcohol isopropílico. Agitar en vortex durante 5

segundos e incubar durante 10 minutos a 24 °C.

10. Centrifugar a 12,000 rpm durante 10 minutos a 8 °C. Se verá una pequeña pastilla en el

fondo del tubo. Colocar los tubos en hielo.

11. Desechar el sobrenadante por decantación. Eliminar el liq. remanente con una pipeta.

12. Lavar la pastilla adicionando 500 µl de etanol al 70% (preparado con agua con DEPC).

13. Centrifugar a 12,000 rpm durante 10 minutos a 8 °C. Colocar los tubos en hielo.

14. Desechar el sobrenadante por decantación e invertir el tubo sobre una sanita para

eliminar el líquido residual.

15. No dejar secar por mucho tiempo la pastilla.

16. Adicionar 10-20 µl de agua con DEPC y resuspender la pastilla pipeteando de 20 a 30

veces. Colocar los tubos en hielo.

17. Almacenar en el Revco a -70 °C.