FACULTAD I)E CIENCIAS QUíMICAS DEPARTAMENTO DE … · diabetes insípida ‘-a....

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRIDFACULTAD I)E CIENCIAS QUíMICAS

DEPARTAMENTODE QUíMICA ORGANICA

lmuuIu¡¡unuuuau* 5309552798*

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE

DERIVADOS DE 2,5-DICETOPIPERIDINASY 3-OXOINDOLIZIDINAS COMO UNAAPROXIMACION A LA OBIENCION

DE PEPTIDOMIMETICOS

TESIS DOCTORAL

MARIA JOSE DOMINGUEZ PEREZ

DIRECTOR: Dra. ROSARIO GONZALEZ MTJNIZ

A mis pad2res

El Trabajo que se describeen estaMemoria ha sido

realizado en el Instituto de Química Médica del Consejo

Superiorde InvestigacionesCientíficasbajo la dirección dela Dra. ~ Rosario GonzálezMufliz, a quien quiero

expresar mi más sincero agradecimientopor su granayuda, dedicacióny asesoramiento.

Deseo expresar mi gratitud, de manera muy

especial, a la Dra. M~ Teresa García López por lasfacilidadesdadas,como Directora del Instituto de Química

Médica, para la realización de este Trabajo, así como, y

principalmente,por su constanteayuda e interés en el

desarrollo del mismo, como Jefe del Equipo de

Investigación.Agradezcoal Dr. Benito Alcaide Alañón el haber

aceptadoserponentede estaTesis.

Mi reconocimientotambiénal Dr. Joaquíndel Río

Zambran.apor la realización de los ensayosbiológicos.Agradezcoal Dr Ibón Alkorta Osoro la realización

de los estudiosde modelizaciónmolecular.

Igualmente, deseoagradecera la Dra. ~ Luisa

Jimeno Herranz su asesoramientoen los estudiosde

análisis conformacionalmedianteRMN.

Agradezco también al Dr. B. Lundt, Jefe del

Departamento del Sistema Nervioso Central de la

compañíadanesaNovo-NordiskAIS, su interésen nuestro

tema de trabajo y a los Dres. NL. Johansen,PL Th0gersen

‘c P. Suzdaky al Sr. K. Madsen,su colaboracióndirecta en

el mismo.

Agradezcoal Dr. Federico Gómez de las Heras,

Director del Instituto de QuímicaMédica cuandocomencé

este Trabajo, las facilidades dadas para iniciar surealización.

Quiero dar las gracias también al personalespecializadodel C.N.Q.O. por la realización de los

microanálisisy los espectrosde Masasy, especiaSiente,a

Dita. ~ Dolores CasadoLópezy a Dita. MercedesPlazaRamírezpor su ayudacon los espectrosde RMN.

Igualmente, agradezcoa Dña. Asunción Lorenzo

Vián su colaboración con el HPLC y a D. FranciscoCaballero Pérez, su ayuda en la transcripción del

manuscrito.A la Dra. Rosario Herranz Herranz y a mis

compañerosde laboratorio, Ana, Isabel, Juan, Marisol,M~ Luisa, Mercedesy Natalia, gracias por vuestroapoyoy

por todos los buenosmomentosque hemoscompartidoa lo

largo de estosaños.

D4DICE

Págs.

1. INTRODUCCION . . 15

1.1. APROXIMACIONES HACIA LA BÚSQUEDA DE PEPTIDOMIMÉTICOS.... 19

1.1.1. Búsquedaal azarde nuevoscompuestoscabezade serie 19

1.1.2. Diseño racional de peptidomiméticos 21

1.2. RESTRICCIONESCONFORMACIONALES EN PÉFEIDOS BIOACTIVOS.

UTILIZACIÓN DE LACTAMAS 27

1.3. ANTECEDENTES INMEDIATOS, OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO 29

2. RESULTADOSY DISCUSION 352 1 2,5 DICETOPIPERIDINASCOMO ANÁLOGOS CÍCLICOS DE PSEUDOPÉP-

TIDOS CETOMETILÉNICOS 37

2.1.1. 3-Metoxicarbonil-2,5-dicetopiperidinas6-sustituidas 38

2.1.2. 2.5-Dicetopiperidinas 3,3,6-trisustituidas 43

2.1.3. Pseudodipéptidoscetometilénicoscíclicos 52

2.2. DERIVADOS DE 3-OXOINDOLIZIDINAS COMO ANALOGOS CONFOR-

MACIONALMENTE RESTRINGIDOS DE DIPÉPTIDOS 54

2.2.1. Formación del esqueleto de 8-amino-3-oxoindo]izidina-2-carboxi-

lato 55

2.2.2. Alquilacién de derivados de 8-amino-3-oxoindolizidina-2-carboxi.

lato SS2.2.3. Enantioselectividaden la formación de derivados de S-amino-3-oxo-

indolizidina.2-carboxi]ato 61

2.2.4. Formación de derivadosde Sa-bidroxi- y Sa-alcoxi-8-amino-3-oxoin-dolizidina-2-carboxilato2-sustituidos 70

2.2.5. Modelización molecular de derivadosde S-amino-3-oxoindolizidina-

2-carboxilato. Análisis confornvacionalmediante dinámica molecu-

lar 752.3. ANÁLOGOS CONFORMACIONALMENTE RESTRINGIDOSDE COLECIS-

TOQUININA Y NEUROTENSINA 89

2.3.1. Análogos conformacionalmenterestringidos de CCK 89

2.3.1.1. Análogosde CCÑ derivadosde 2,5-dicetopiperidinas 922.3.1.2. Análogos de CCÑ portadoresdel esqueletode 3-oxoindolizi-

dina 97

2.3.2. Análogos conformacionalmenterestringidos de NT 107

Págs.

3. PARTE EXPERIMENTAL 117

3.1. SÍNTESIS DE CLOROMETILCETONAS DERIVADAS DE AMINOÁCIDOS. 12332. SÍNTESIS DE 4-CETODIESTERESDERIVADOS DE AMINOÁCIDOS 125

3.3. OBTENCIÓN DE 4-CETODIÉSTERES 2-SUSTITUIDOS 127

3.4. SíNTESIS DE 2,5-DICETOPIPERIDINAS3.4.1. Síntesisde 3-mnetoxicarbonil-2,5-dicetopiperidinas6-sustituidas 130

.3.4.2. Síntesis de 6-aralquil-3-metoxicarbonil-2,5-dicetopiperidinas3.3-di-

sustituidas 136

3.4.3. Síntesis de pseudodipéptidoscetometilénicoscíclicos 143

3.5. SÍNTESIS DE 3-OXOINDOLIZIDINAS 1441

3.5.1. Síntesis de 8-(terc-butoxicarboniflamino-2-metoxicarbonil-3-oxoin-

dolizidinas 146

3.5.2. Preparaciónde S-(terc-butoxicarbonil)amino-3-oxoindolizidina 147

3.5.3. Síntesis de 8-(terc-butoxicarboniliamino-2-rnetoxicarbonil-S-oxoin-

dolizidinas 2,2-disustituidas 151

3,5.3.1. Preparaciónde derivados 2-bencil, 2-etoxiearbonilrnetil y

2-tere-butoxicarbonilmetil sustituidos 151

3,5.3.2. Obtenciónde derivados2-(indol-3-il)metil sustituidos 154

3.5.3.3. Preparación de 8-(eerc-butoxicarbonil)amino-2-carboxi-3-

oxoindolizidinas 2,2-disustituidas 159

3.5.4. Preparación de derivados de MTPA 1&4

3,5.4.1. Reaccionesde derivatizacióncon el ácido (R)-(±)-cx-metoxi-

os-<trifluorornetil)fenilacético í64

3.5.4.2. Reaccionesde derivatizacióncon el cloruro de (S) (4> o (R>(—)-a-metoxi-a-(trifluorometil)feni]acetilo 1%

3.5.5. Obtención de derivados de Sa-hidroxi- y Sa-a]coxi-S-amino-3-oxoin-dolizidina-2-carboxiíato 2-sustituidos 16,9

3.5.5.1. Reaccionesde hidrogenación del 2-bencil-4-cetodiésterderi-vado de Boc-Orn<Z)-OH

3.5.5.2. Reaccionesde reducción de 8a-hidroxi- y 8a-alcoxi-3-oxoin-

dolizidinas 175

3.5.5.3. Obtenciónde AWBa~bexahidroindo1izinas 1773.6. PREPARACIÓN DE ANALOGOS DE COLECISTOQUININA DERIVADOS

DE 2,5-DICETOPIPERIDINAS 181

3.6.1, Acoplamiento peptídico de derivados de 2,5-dicetopiperidinas conH-Phe-NH2 181

3.6.2. Eliminación del grupo protector terc-butilo 1823.7. PREPA1?.ACIÓNDE LNÁLOGOS DE COLECISTOQUININA DERIVADOS

DE 3-OXOINDOLIZIDINAS 1&3

3.7.1. Acoplamiento peptídico de derivados de 3-oxoindolizidina 2-bencil

sustituidoscon Boc-L-Trp-OH 6 Boc-D-Trp-OH 186

3.7.2. Transformaciónde ésteresmetílicos en amida~ 188

3.7.3. Acoplamientopeptídico de derivadosde 3-oxoindolizidina 2-/erc-buto-xicarbonilmetil sustituidoscon H-Phe-N112 191

Págs.

3.7.4. Acoplamientopeptídico de derivadosde 3-oxoindolizidina 2-carboxi-

ruetil sustituidos con Boc-L-Trp-OH 192

3.7.5. Eliminación del grupo protector terc-butoxicarbonilo 1%

3.8. SÍNTESIS DE ANÁLOGOS DE NEUROTENSINA PORTADORES DE ES-

QUELETOS DE 3-OXOINDOLIZIDINAS 199

3.9. MÉTODOS BIOLÓGICOS .

3.9.1. Ensayosde unión a los receptoresde CCK.. . . .

3.9,2. Ensayosde liberación de amilasa3.93. Inhibición de las contraccionesinducidaspor CCK~ ó CCK4 en el íleon

de cobaya:Preparaciónde músculolongitudinal- plexo mientérico...

3.9.4. Ensayos de unión a los receptores de NT

4. CONCLUSIONES 2&5

5. BU3LJOGBAFÍA . 211

NOTA SOBRE NOMENCLATURA

A lo largo de esta Memoria se han utilizado la nomenclatura y

simbolismo de aminoácidosrecomendadospor la Comisión de Nomenclatura

de Bioquímica (JCBN) de la IUPAC-IUB (“Nomenclature and Symbolísm for

Aminoacidsand Peptides’%Pure & Áppl. Chern., 1984, 56, 595).

Los aminoácidosse nombran medianteel sistema de símbolos de tres

letrasy pertenecena la sedenatural L, salvo que seindique lo contrario. Las

sustituciones sobre el grupo u-NH2 se indican anteponiendoel símbolo

aceptadopara el sustituyente al símbolo del aminoácido,mientras que las

sustitucionessobrelos gruposfuncionalesde las cadenaslateralesse indican

entreparéntesis,inmediatamentedespuésdel símbolo del aminoácido.

En cuanto a los péptidos,el residuoque tiene el grupo amino libre, o no

adiado por otro aminoácido, se denominaN-terminal y el que tiene el grupo

carboxilo libre se denomina C-terminal. Tanto para nombrarlos como para

representarlosgráficamentese comienzapor el residuo N-terminal, seguido

de los aminoácidosinternosen orden,parafinalizar con el residuoC-terminal.

Para las sustituciones del enlace peptídico por agrupamientos

bioisósteros se utiliza la terminología aceptada para pseudopéptidos,

consistenteen la introducción de la letra griega W entre los símbolos de los

aminoácidoscuyo enlacepeptídicose ha modificado,seguidadel agrupamiento

que sustituyeal enlacepeptídicoentrecorchetes.

ABREVMTURAS UTILIZADAS

Boc terc-butoxicarbonilo

BOP : hexafluorofosfatode benzotriazol-1-iloxitris(dimetilamino)fosfonio

DCC : N,N’-diciclohexilcarbodiimida

J)CU : N,N’-diciclohexilurea

DIEA : diisopropiletilamina

DMAP : N,N-dimetilaminopiridina

TiME : 1,2-dimetoxietano

HOSu: N-hidroxisuccinimida

In 3-indoliloMTPA ácido a-metoxi-cx-(trifluorometil)fenilacético

NMM N-meti]morfolina

TEA: trietilarnina

TEA : ácido trifluoroacético

TFAE : i-(9-antril)-2,2,2-trifluoroetanol

THF : tetrahidrofurano

Z: benciloxicarboni]o

1. INTRODUCCIÓN

El descubrimiento y caracterización,así como el estudio de las

propiedadesy funcionesbiológicas,de los péptidosbloactivos, han tenido undesarrolloexponencialen los últimos 40 años.Estedesarrolloes resultadodelos avancessurgidos tanto en la químicaorgánicade péptidos (síntesisen fase

sólida), la biología molecular (producción de hormonas por ingenieríagenética, clonaje de receptores),como en las técnicasdisponiblespara losestudiosestructurales,más químico-físicos(RMN, métodos informáticos) ypara la caracterizaciónfarmacológica (ensayos de unión al receptor,radioinmunoensayos).La participaciónde los péptidos en la mayoríade losprocesosbioquímicos,donde actúancomo hormonasy/o neurotransmisores,hace que la modulación con agonistaso antagonistasde los receptorespeptídicosasociadosa la superficie celular, o la inhibición de las enzimasimplicadas en su biosíntesisy¡o degradación,puedan tener importantesimplicaciones terapéuticas (Figura 1). De hecho, péptidos o análogospeptídicos,entre los que destacacomo ejemplo clásico la Insulina, son ya de

uso clínico generalizado.Entre ellos, los análogos sintéticos del FactorLiberadorde la HormonaLuteinízante(LH-IRH), Busereliny Goserelin,y de laSomatostatina,Octeotride, se han comercializadopara el tratamiento deciertos tumores, mientras que el Acetato de Desmopresina,un agonistaselectivo de Vasopresina,se utiliza actualmenteen el tratamiento de la

diabetesinsípida ‘-a.Desafortunadamente,el interésde los péptidoscomo fuentedirecta de

nuevos fármacos está limitado por una serie de propiedadesadversas,inherentesa la propia estructurapeptídica,como son:

a) Bajaestabilidadmetabólicao, lo quees lo mismo, rápidadegradaciónpor peptidasastanto en el tracto gastrointestinalcomo en la sangre,

que origina efectosbiológicos de cortaduración.

¿Vi Pobrebiodisponibilidadoral, debidaal alto pesomolecularde estoscompuestoso a la falta de sistemasespecíficosde transporteo a unaconjunciónde ambosfactores.

—17—-

Figura 1. Principalesgruposdepéptidosbioactivose interés

terapéuticode los mismos

Interésterapéutico

1. NEUROPÉPTIDOS

PéptidosoploidesSustanciaP (SP)Neurotensina (NT)Neuroquininas (NR)Hormonasdel hipotálamo

Tirotropina (TRWSomatostatina(ST)

FactorLiberadorde l.aHormona Luteinizante (LH-RH)

Hormonas de la Hipófisis1-lormonadel Crecimiento(Somatotropina)Oxitocina (OT)Vasopresina

AnalgésicoHipotensor, antiinflamatorioHipotensorHipotensor,antidepresivo

DesórdenestiroidalesDiabetes,úlcerasgástricas,cáncerde próstata

Fertilidad, contracepción,cáncerdepróstata

Enanismo, osteoporos3sContraccionesuterinasDiabetesinsípida

2. PÉPTIDOS GASTROINTESTINALES

InsulinaGlucagónGastrinaColecistoquinina (CCK.~

DiabetesHipoglicemia, fallo cardíacoSecreción HCIPancreatitis, anorexia,ansiedad

3. PÉPTIDOS DE IMPORTANCIA INMUNOLÓGICA

CiclosporinasMuramilpéptidos

Inmunosupresor(Transplantes)Inmunoestimulante

4. PÉPTIDOSDEL SISTEMA RENINA-ANGIOTENSiNA

Inhibidores de ECAInhibidores de Reuma

AntihipertensorAntihipertensor

5. VACUNAS

Péptidossintéticos Gripe, SIDA

6. PÉPTIDOSNATRIURÉTICOS ATRIALES

ANE Diurético, antihipertensor

7. OTROS

SaborizantesPéptidosantibióticosPéptidos-Leucotrienos

Edulcorante (AspartameAntibióticoAntialérgico, antiinflamatorio

Péptido

—18

c) Rápidaexcrecióna travésdel hígadoy del riñón.

d) Alta flexibilidad conformacional,queconlíevala posibilidad de unión

a diversosreceptoresy, por lo tanto, una baja especificidadde accion.

Uno de los mayoresretos actualesde la Química Médica es encontrar

vías racionalespara la transformación sistemática de la información con-

tenidaen un ligando peptidiconatural en moléculasno peptídicasde bajo peso

molecular,capacesde interaccionarcon receptoresespecíficospara eseligan-

do y de mimetizar o bloquearla accióndel péptidoendógenoconsiderado4<7. Es

de esperar que estos compuestosno peptídicos, denominadospeptido-

miméticos, poseanpropiedadesfarmacodinámicasmejoradascon respectoa

las de los péptidosnaturalesy, por lo tanto, puedenconsiderarsea priori un

objetivo mejor en el procesode desarrollode nuevosfármacos.Por otra parte,

la aparición de reaccionesinmunológicas tras la aplicación de fármacos

peptídicoses otro factor que apoya,cadavez más, la necesidadde profundizar

en la investigaciónconducenteal desarrollode peptidomiméticos8~

1.1. APROXIMACIONESHACIA LA BÚSQUEDADE PEPTH)OMIMIETICOS

La obtención de peptidomiméticos puede abordarse desde dos

perspectivasbien diferenciadas,la búsquedaal azar,más o menosdirigida, de

nuevoscompuestoscabezade seriey el diseñoracional 9.

1.1.1. BÚSQUEDAAL AZAR DE NUEVOSCOMPUESTOSCABEZA DE SERIE

Estaestrategiaconsisteen el ensayogeneralizadode compuestostanto de

origen natural como sintético, sobreun amplio abanico de receptorespeptídi-

cos, con el fin de identificar estructurascabezade serie. Posteriormente,a

partir de aquel compuestoque haya mostrado una afinidad interesante,

aunquegeneralmentemoderada,por un determinadoreceptor, se aplican los

principios de variacionesestructuralesclásicos de la Química Médica hasta

lograrel desarrollode un agenteterapéuticocon propiedadesadecuadas1042•

El primer gran éxito en este campo surgió a raíz de la moderada

capacidadpara actuar como antagonistade Colecistoquinina(CCK) mostrada

por la Asperlicina (1) 13.Tras una serie de modificaciones en el anillo de

1,4-benzodiazepina,característicaestructuralclave para la actividad de este

producto natural, se desarrollaronlos compuestosMK-329 (Devazepide,2),

— 19—

antagonistaselectivo de los receptoresperiféricos de CCK (CCKA) y activo por

vía oral 14, así como el análogoL-365,260 (3), que resultó ser un antagonista

selectivo de los receptores centrales (CCKB) de este neuropéptido15

Concretamente,el Devazepide está siendo objeto de estudios clínicos en

humanos para explorar su potencial aplicación en la pancreatitis y en el

síndromede irritación intestinal. Por otra parte, los antagonistasde CCKB

puedenser de utilidad para el tratamiento de disfuncionesalimentarias y

ciertosdesórdenesasociadoscon la ansiedad.

O

NH HOH H /\ /NN N

N\ H O HN N

O — HN o

H

1 2

H HN N CY

O

3

Entre otros ejemplos de peptidomiméticosdesarrolladospor estavía se

puedendestacarel compuesto4, antagonistade AngiotensinaII y, por tanto,

con aplicación en el control de la hipertensión16, los antagonistas de

SustanciaP 5 y 6, con interés para el tratamiento de la inflamación y el

dolor 17,18 y el antagonistade Oxitocina (01) 7, que permitirá la evaluaciónde

la utilidad clínica de los antagonistasde 01 en la prevención del parto

prematuro19•

Es de destacarque,aunquealgunosde los antagonistasde neuropéptidos

comentados anteriormente están en fase clínica avanzada, esta vía de

aproximaciónno ha conducidotodavíaa la obtenciónde peptidomiméticoscon

capacidadpara actuar como agonistas.Sin embargo,y como aspectopositivo,

O

—20—

los peptidomiméticossurgidosde esta primera vía pueden contribuir a una

mejor comprensiónde los grupos farmacóforosimplicados en las uniones

péptido/receptor y, por lo tanto, deberánser consideradosa la hora de

emprender el diseño racional de un peptidomimético a partir del corres-

pondientepéptidobioactivo.

clN

N OH

4

CH3O

NROH

6 7

1.1.2. DISEÑO RACIONAL DE PEPTIDOMIMÉTICOS

La preparación de peptidomiméticos a través de diseño racional,

utilizando un péptido de interés o sus análogoscomo punto de partida para

realizar modificaciones estructurales posteriores, es la segunda vía

desarrolladapara accedera estetipo de compuestos2022•

Teniendoen cuentaqueen las interaccionespéptido/receptorsolamente

un reducidonúmerode aminoácidosdel péptido bioactivo sonresponsablesdel

procesode activaciónlinhibición de dicho receptor, parecerazonablesuponer

que moléculaspequeñaspuedanasumir susfunciones.Sin embargo,el diseño

5

O ~

OtS

O

O

21 —

de estasmoléculases un procesolaborioso,ya que requiereel conocimientoprevio de los elementosquímicosy espacialesdel farmacóforode interés.Por lo

tanto, el diseñode un peptidomiméticodebe contemplarlos siguientespuntosfundamentales:

1. Identificaciónde los gruposimportantespara la unión al receptor.2. Definición de la disposicióntridimensionalde dichosgrupos.

3. Unión de los grupos necesariospara la interacciónen estructurasrígidas, no peptídicas,que cumplan los requisitostridimensionalespreviamenteespecificados.

A partir de un péptidobiológicamenteactivo, y comose indica de maneraesquemáticaen la figura 2, la primera etapaa llevar a cabo es la determi-nación del fragmentomínimo necesariopara la actividadbiológica. Una vezconocido este fragmento, la sustitución de cada uno de sus aminoácidosconstituyentespor alanina da idea de la importancia que tienen para laactividad el tipo y la funcionalidadde las cadenaslateralesde cadaresiduo.Posteriormente,las sustitucionesde los distintos aminoácidospor sus aná-

logos de configuraciónD aportaninformaciónacercade la disposiciónespacialpreferidapor las diferentescadenaslaterales.La D-sustitución.junto con laintroducción de aminoácidosmodificados, generalmenteanálogosconforma-

cionalmenterestringidos,y el estudio de los derivadospeptídicosresultantesson de crucial interésparallegar a definir una seriede parámetrosconforma-cionaleslocales,así como para establecerla presenciade estructurassecun-darias concretas23• De una manera paralela, la sustitución del enlace

peptídico por grupos bioisósteroso estructuralmenterelacionados,tales comoCH2NH, COCI-12,NHCO, permite determinarla participaciónde los enlaces

CONH del esqueletoenlas interaccionesconel receptor,bien por formacióndeenlacestipo puentede hidrógenoo bien por ser responsablesde la adopcióndeuna disposiciónespacial adecuadade las cadenaslateralescríticas 24 Lapreparaciónde análogosconformacionalmenterestringidos,tanto por mediode diferentestipos de ciclaciones21,23 como por introducciónde miméticosde

estructurassecundariaspeptídicas25,26, constituyeuna etapaavanzadahaciael desarrollode peptidomiméticos,ya quepermitecomprobarsi los parámetrosconformacionalespreviamentedefinidos se ajustana la topografíadel receptoren estudio.Paraello, se han de realizarlos análisisconformacionalesy fisico-químicostanto de los compuestosque muestrenactividadsignificativacomo de

—22-—

PÉPTIDO BIOLÓGICAMENTE ACTiVO

Eliminación continuao% discontinunderesiduos

Fragmentomínimo activo

Ji SustitucionesporAla

Importancia de las cadenaslaterales

‘a Sustitucionespor D-aminoácidosy aminoácidosmodificados

Definición de parámetrosconformacionaleslocales(Determinacióndc la presenciadeestructurassecundarias)

‘It SustitutosdelenlacepeptídicocicíacionesMiméticosdela estructurasecundariapeptídica

Análogosconfonnacionalmenterestringidos -IAnálisis conformacionalEstudiosfísico-químicos

Hipótesisde la conformaciónbioactiva

Diseñode nuevoscompuestosquemimeticenlos elementostridimensionalescríticos

¡Figura 2. Aproximacioneshacia el diseñoracional depeptidomiméticos.

Actividadbiológica

‘a‘It

1

—23—

aquéllosque resulteninactivos. Una vez llegadosa estepunto, se define unahipótesispara la conformaciónbioactiva del péptido, a partir de la cual sepuede abordar la preparaciónde moléculaspequeñas,no peptídicas, quecumplanlos requisitospreestablecidos,tanto en cuantoa grupos funciona]es

necesarios para la actividad como, y principalmente, en cuanto a su

disposiciónespacial.La falta de estudiosde relacionesestructura-actividaddetalladospara

muchos péptidos bioactivos, junto con la dificultad de extrapolar las

conformacionesen estado sólido y/o en disolución con las de unión a undeterminadoreceptor,ralentizanla obtenciónde peptidomiméticossiguiendoesta estrategia. Sin embargo, los ejemplos de compuestosno peptídicosdesarrolladospor estavía en los últimos añosapoyanla validez de la misma.La primeraaplicacióncon éxito de estaestrategiase encuentraen el campodelos inhibidores de la Enzima Convertidorade Angiotensina(ECA). Así. loscompuestosCaptopril (10) y Enalapril (11) surgieron,por diseñoracional, a

partir del moderadopoderde inhibición sobrela ECA mostradopor el Teprótido(8) y el dipéptido9 y del conocimientode la presenciade un átomode Zn en e]centro activo de dicha enzima27,28 Posteriormente,estudiosde modelizaciónmolecular, basadosen las coordenadasde R-X y en datos de RMN del

Captopril, permitieron el diseño de una nueva generaciónde inhibidoresconformacionalmenterestringidos,entrelos que destacael Cilazapril (12) 29,30Los compuestos10, 11 y 12 se encuentranactualmentecomercializadospara eltratamientode la hipertensiónarterial.

H-pGlu-Trp-Pro-Arg-Pro-Glu-Ile-Pro-Pro-OH H-Ala-Pro-OH

8 9

Ph

CH,

N NHOCOH ~ COH

10 11

Más recientementes~, la utilización de la 3-desoxi-~3-D-glucosacomo

molde para el anclaje de las cadenaslateralesesencialesdel análogo de

Ph

H

12

—24—

15

Somatostatina(ST) 15, ha conducidoa los derivados13 y 14, que se unenalreceptorde la ST con afinidadesde rango micromolar,mostrandopropiedadesmixtas agonistalantagonista.El compuesto13 seunetambiéna los receptoresg-adrenérgicosy al receptorde la SustanciaP, todosellos receptoresacoplados

a proteínasG, lo quepone de manifiestounagran similitud estructuralen loscentros de unión de esta familia de receptores.Por su parte, el benciloxiderivado14 actúacomoun antagonistapotentede la SP 31•

Ph Ph

y /NHo oN

O N 1-1 0

Ph

NH2 OH NH2

R=H,OBn 13,14

Basándoseen la rigidez y en las múltiples posibilidadesde anclajeque

ofrecen los esqueletosde tipo esteróidico, el grupo de Hirschmann hapreparadoel compuesto16, como mimético del péptidoH-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-

Pro-OH (17), un agonistadel receptor del Fibrinógeno, responsablede lainiciación de la agregaciónplaquetaria.Desafortunadamente,el antagonista

16 presentauna afinidad demasiadobaja para ser consideradocomo uncandidatode utilidad terapéutica32•

1-1 HN NR N NR42 42

NH NH

HN

H-Gly — NH

U

HO-Pro-Ser —N

£0211 CO2H

17

o

16

—25—

El derivado de piperidina 18, peptidomimético antagonista de SP, fue

diseñadoa partir de estudioscombinadosde RMN y de mecánicamolecular dela SP y análogos activos, y admitiendo la hipótesis de que el fragmento-Phe-Phe-es el responsableprincipal de la unión al receptor de la SP (19) ~3.

Ph

18

H-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln—N

¡Ph

H U PhN

00 Gly-Leu-Met-NH2

19

El derivado de ciclohexano143,5-cis-trisustituido20 se diseñó comomimético de la HormonaLiberadorade Tirotropina (TRH, pGlu-His-Pro-NH2,

21), un péptido hipotalámicoqueparecerelacionarsecon ciertosdesórdenesde

la memoria, como son los asociadoscon la enfermedadde Alzheimer. Elcompuesto20 presentauna actividad similar a la TRH en diversosmodelos

animales,siendoactivo por vía oral. Sin embargo,este peptidomiméticonocompite con la TRH tritiada en su unión al receptor,por lo que se estáestudiandoel mecanismode accióna travésdel cual estederivadoes capazdemimetizarlos efectosdel péptidoendógeno3’~.

=4

NH

oN

=4

N ~ CONH2OH

CONHQ

20 21

Ph

=4

O,

-3Ph

—26—

1.2. RESTRICCIONES CONFORMACIONAJ.ES EN PÉPTIDOSBLOACTIVOS.UTILIZACIÓN DE LACTAMAS

La determinaciónde relacionesestructuratridimensional-actividaden

péptidosbioactivos,enormementedificultadapor la flexibilidad inherentea lasestructuraspeptídicas,constituyeuna etapafundamentalen el diseñoracional

de peptidomiméticos.Dado el amplio desconocimientode los receptorespeptídicosy la dificultad de establecercuál o cuálesde los muchosconfórmerospresentesen disolución se ajusta(n)a la geometríadel receptor,paraabordar

este problema se aplica una aproximación sintética que consiste en laintroducción de restriccionesconformacionales.Así, es de esperarque unanálogo conformacionalmenterestringido adopte,en disolución, conforma-

ciones preferentes,que permitan una extrapolaciónmás fidedigna de la(s)conformación(es)bioactiva(s).Atendiendoal grado de rigidez que se incorpora

al péptido, las restriccionesconformacionalespueden agruparseen tresapartados:

1. Restriccioneslocales: Incorporaciónde sustitutosdel enlacepeptídico

como N-alquil derivados, retroanálogos,dobles enlaces trans y

restriccionesde la movilidad de las cadenaslaterales,como tt-alquil,

dehidroy ciclopropil aminoácidos.2. Restriccionesregionales:Introducción de miméticos de la estructura

secundariapeptídica,hélices cx, láminas¡3, giros inversos ¡3 y ‘y.

3. Restriccionesglobales:Ciclaciones.

Los dos primeros tipos de modificacionesson muy útiles para dar unavisión generalde la importanciade la conformaciónde residuosespecíficosyde la participación o no de estructurassecundarias,respectivamente,en la

unión al receptor. Por otra parte, los compuestosobtenidos medianteciclacionesN-C-terminal, cadenalateral-gruposN- y/o C-terminales o porunión de los grupos funcionales de distintas cadenaslaterales,facilitan elestudio de la conformación global del péptido y la extrapolaciónde estaconformación con la de unión al receptor. Además, la introducción derestricciones conformacionalesproporciona en muchos casos ligandos

selectivospara un determinadosubtipo de receptore incrementade manerageneralla resistenciafrente a la proteólisisenzimática5,2í~

La incorporaciónde lactamasen péptidosbioactivos como vía para lapreparaciónde análogosconformacionalmenterestringidos fue iniciada por

—27—

Freidinger a principios de la décadade los 80 ~ Estas lactamas,concebidas

en principio para fijar el enlace peptídico en su forma trans, han marcadolapauta de una línea de investigación de creciente actualidad que engloba a los

miméticos de la estructura secundariapeptídica, también denominadosmiméticos de la conformación peptídica25,26 En los últimos años se han

descritoun grannúmerode ciclos pequeños,principalmentede tipo lactámico,cuya incorporaciónen péptidosde interésbiológico ha dado lugar a análogosconformacionalmenterestringidos que, en mayor o menor medida, han

contribuido al esclarecimientode las interaccionespéptido-receptor25,26 Lasestructurasmásrepresentativasde estoscompuestosse recogenen la figura 3.

11

NH2N

O

CO2H

Ii

C02H

NR2

H2N

R

O

COQH

R

22 n=1,2

( ~n

N

HO

CO2H

11

25 n~1,2

O

NH2N

O COQH

27

H2N N

CQH

26 n=1,2

ON o CO2H11

28

Figura 3. Lactamasde utilidad para la introducción de restriccionesconformacionalesen péptidos.

La introduccióndey- y 8-lactamasde tipo 22 ha dado lugar a la obtención

de agonistaso antagonistasde diferentespéptidosbioactivos~ asícomoainteresantes inhibidores enzimáticos40~ La lactama monocíclica 23 fuediseñadacomo mimético de giros ¡3 por Olson y colaboradores41, habiéndose

HN

23 24

—28----

demostrado,tanto por RMN como por modelizaciónmolecular,que es un buenmimético de este tipo de estructurasecundariapeptídica.Por otra parte, lalactama de siete miembros 24, ideadapara restringir conformacionalmentegiros -y, se ha utilizado para estudiar la contribución de estos giros en la

conformación bioactiva de antagonistasdel receptor del Fibrinógeno y deinhibidoresde la proteasadel HIV-1 42,43, Los derivadosde espirolactama25son capacesde forzar conformacionesde giro ¡3 tras su incorporación en

diferentes sistemaspeptídicos44-46, De manerasimilar, la introducción delBTD (Bicyclic Turned Dipeptide, 26, n = 2) en péptidos de interés biológicoinduce a éstosa adoptarconformacionesde giro 3 ‘~7”~9. Los buenosresultados

obtenidos con el BTD han conducido a un desarrollo espectacularen la

búsqueda de lactamas bicíclicas, estructuralmenterelacionadas,como

miméticosde giros ¡3 [26 (n = 1), 27, 28 y otras]50-56

1.3. ANTECEDENTESINMEDIATOS, OBJETIVOSY PLAN DE TRABAJO

Teniendo en cuenta el interés general despertadopor los análogospeptídicos conformacionalmentorestringidos, y en particular por las

estructuraslactámicasreferidasen el apartadoanterior, se plantearoncomoobjetivossintéticosprincipalespara estetrabajo la obtenciónde los derivadosde2,5-dicetopiperidina 30 y 3-oxoindolizidina 81, indicados en el esquema

siguiente, como representantesde lactamas monocíclicas y bicíclicas,respectivamente.

Ou’

COQHHN

A O

30H2N CO2R

O

29 E CO2H

It2

NR9

31RutaA: It’, Ii

2 = cadenaslateralesde aminoácidos

RutaB: It1 = (CI-12)3NH9;R

2 = cadenaslateralesde aminoácidos

—29—

Las 2,5-dicetopiperidinas 30 podrían ser incorporadas posteriormente a

péptidos de mayor tamaño para conducir a análogosconformacionalmente

restringidos en el pseudodipéptidoN-terminal, o bien dar paso a lospseudodipéptidos cetometílénicos correspondientestras una simpledescarboxilación.En amboscasos, la presenciadel anillo monolactámicovendríaa contrarrestarel aumentode flexibilidad conformacionalresultantede sustituir el enlacepeptidico -CONH- por el isósterocetometilénico-COCH2-,

sustitución generalmenteutilizada para proporcionar resistenciafrente apeptidasas24,

La elección de las 3-oxoindolizidinas 31 fue resultado de variasconsideraciones.En primer lugar, la presenciade grupos NH2 y CO2H las

hacía susceptiblesde incorporacióna cadenaspeptídicastanto en la posiciónC-terminal como en la N-terminal. En segundolugar, dentro del interésgeneradopor las lactamasbicíclicas como posiblesmiméticos de estructuras

secundariaspeptídícas, las 3-oxoindolizidinas 31 están particularmenterelacionadascon aquéllascuyo mimetísmoestá demostrado.Tal es el caso delBTD (26) como mimético de giros ¡3, indicadoen el apartadoanterior4749.

Desdeel punto de vista de viabilidad sintética,la experienciarecientedenuestroslaboratorios en la preparaciónde los 4-cetodiésteresderivadosdcaminoácidos29 5762,productosa utilizar comomaterialde partidacomúnque

debería dar accesoa las 2,5-dicetopiperidinas30 y 3-oxoindolizidinas31,constituyó un factor importanteen la selecciónde ambostipos de lactamas

comoobjetivosde estetrabajo.Así, el esqueletode 2,5-dicetopiperidina3-carboxísustituidodeberlaresultarde la 8-lactamizaciónde los aminodiésteres29 ó de

derivadossencillos de éstos (Ruta A). Por su parte, el esqueletode 3-oxo-indolizidina 2-carboxi sustituido debería formarse mediante aminaciónreductivadel cetodiésterderivadode ornitina 29 [R

1 = (CH2)gNH2], seguidade

acilación intramolecular de la piperidina resultante (Ruta 13). Una rutaparalela,basadaen la conocidacapacidadde los derivadosde Orn y Mg paraexperimentarciclacionesintramoleculares36,63, había sido puestaa puntoennuestros laboratorios para la preparación de S-amino-3-oxoindolizidinas2-aralquil sustituidas, carentes del resto carboxilo, a partir de pseudo-dipéptidos cetometilénicosderivadosde ornitina 64 Esta experienciapropia,unida a la referentea la obtenciónde los compuestos29, constituyen los

antecedentessintéticosmásinmediatosdel trabajode estaMemona.Por último, para empezara explorar la utilidad en el campo de los

peptidomiméticosde los sistemaslactámicos30 y 31, se definió tambiéncomo

—30—

objetivo de este trabajo la introducciónde los mismos en péptidos de interésbiológico, así como la posterior evaluación biológica de los análogosconformacionalmenterestringidosobtenidos.Para este fin se eligieron losneuropéptidosColecistoquininay Neurotensina,y más concretamente,susfragmentosmínimos activosCCK4 (H-Trp-Met-Asp-Phe-NH2)y NT8j3 (H-Arg-

Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu-OH). Además del interés particular que tienen estos

péptidosen la búsquedade nuevosfármacos,como se detallaráen el capítulocorrespondiente,la elección estuvo basadaen sendascolaboracionesquenuestro grupo mantiene con el Departamentode Farmacología de laUniversidad de Navarra y la CompañíaNovo-Nordisk, interesadosen los

estudiosde CCK y NT. respectivamente.Como se concretaráen el capítulo2.3de esta Memoria, para el diseño de los análogos conformacionalmenterestringidosde estosneuropéptidossehantenido en cuentalos estudiosprevios

de relacionesestructura-actividaddescritosen la bibliografYa paraIta CCK y laNT, así comolos estudiosde sus análisisconformacionalesrespectivos.

Paraabordarlos objetivosanteriormenteexpuestos,se ha seguidoel plande trabajo que seresumea continuación:

— Derivados de 2,5-dicetopiperidinascomo análogos cíclicos de

pseudopéptidoscetometilénicos.Puestaa punto de métodosde aplicacióngeneralpara la obtención

del esqueletofundamentalde 2,5-dicetopiperidinay su extensióna lasíntesisde pseudodipéptidoscetometilénicos.Estudiode las propie-dadesconformacionalesde estaslactamasmonocíclicaspor RMN.

— Derivados de 3-oxoindolizidinas como análogos conformacional-menterestringidosde dipéptidos.

Síntesisde derivadosde 8-amino-3-oxoindolizidina-2-carboxilatoyestudio de la enantioselectividaddel procesode formación del anillode 3-oxoindolizidina. Análisis de la capacidadde esta estructurapara inducir conformacionesde giro ¡3.

— Análogosconformacionalmenterestringidosde Colecistoquinina.Síntesisy actividadbiológica de derivadosde 2,5-dicetopiperidinasy

3-oxoindolizidinasanálogosde CCIQ.— Análogosconformacionalmenterestringidosde Neurotensina.

Síntesisde análogosde NTgj3 que incorporan3-oxoindolizidinasen

sustitucióndel dipéptidocentralPro’0-Tyr11. Ensayosde unión a los

receptorescentralesde la Neurotensina.

—31—

Se pretende, finalmente, que los resultadosde actividad biológicaobtenidospara los diferentesanálogosconformacionalmenterestringidosdeCCK4 y NTg.jg sirvanparaestablecerrelacionesestructura-actividad,asícomo

paracontribuir a perfilar los requisitosestructuralesde los receptoresde CCI(y NT, tanto en lo que se refiere a cadenaslateralesimprescindiblespara la

actividadcomo a su disposicióntridimensionalconcreta.Los antecedentes,objetivos y vías de aproximacióna estosúltimos se

recogende forma esquemáticaen la figura 4.

—32—

U)

E-,zoorí~

U)

oE-’

oz0oCf)o5o

~-E~~~~1z-Qoo

dkueeeCiCi

‘eueuee49-

9-

ooQ

sE-’

2~

Z‘o

~d

e4—,

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e-•

—o’

e>

Che)

13e>

‘e>

4

Che>

0

ea

.5.~

~

c~

oo

2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

2.1. 2,5-DICETOPLPERIDINAS COMO ANÁLOGOS CÍCLICOSDE PSEUDOPEPTIIDOS CETOMETILENICOS

Como se ha comentadoen la introducción, la sustitución del enlaceamida por el agrupamientobioisósterocetometilenoconlíeva la pérdida derigidez del esqueletopeptídico.Con el fin de contrarrestaresteefecto, se dirigióla atenciónhacia los correspondientespseudopéptidoscetometilénicoscíclicoscomo análogosconformacionalmenterestringidos.Llevadospor esteinterés,se diseñaron los derivados de 2,5-dicetopiperidina-3-carboxiíato33 comointermedios comunes,bien para dar accesoa los pseudodipéptidoscíclicosciclo[XaaT[COCH2IYaa] (34: Yaa = Gly; 35: Yaa!=Gly) o bien a los análogos

3-carboxi 3-sustituidos30, susceptiblesde ser incorporadosen los pseudo-péptidosde mayor tamaño36 (Esquema1).

O Oit It

1

ZHN CO2Me HN HNÑ$

CO4Nk CO2Me

32 33 34

O

It’

£HN 0211

U2

O30

Onl

CO-Xaa-OHUN

0 y O = cadenaslateralesde aminoácidos OXaa= aminoácido, péptido 36

Esquema1

O

fiN

35

—37—

Los 4-cetodiésteres32, a utilizar como productos de partida para la

preparaciónde los intermedios clave 33, estabangarantizados,dada laexperiencia previa de nuestro laboratorio en su síntesis a partir dehalometilcetonasderivadasde aminoácidosy malonatode dimetilo 57,58~

2.1.1. 3-METOXICARBONIL-2,5-DICETOPIPERIDINAS6-SUSTITUIDAS

Para estudiar el método más adecuadopara la obtención de estos

compuestosmediante lactamizaciónde los correspondientesderivadosde5-amino-4-cetodiésteres,se seleccionaronaquéllosprocedentesde fenilalanina

y triptófano, ya que la presenciade anillos aromáticosdeberíafacilitar laasignaciónpor RMN del nuevo centro asimétrico creado en posición 3 delanillo de 2,5-dicetopiperidina.Comométodo conocido6570, y en principio másdirecto, se ensayóen primer lugar la calefaccióna reflujo de MeOH de los

aminodiésteres39 y 40, procedentesde la N-desprotecciónde 37 y 38(Esquema2). Sin embargo,esteprocedimientocondujo, en nuestrocaso, a losderivados de pirazina 41 y 42, respectivamente,junto con productos de

descomposición.

Rl

ZUN CO2Me HVPd-C CO2MeMeORO CO2Me O CO2Me

37,88 39,40

AjMCO~~

It1 N CO

2MeMeO2C + productosde

CO2MeN R

1 descomposiciónMeO

2C

41,42

37, 39, 41: R’ = CH2PhaS,40,42:fi’ = CH2In

Esquema2

La estructurade estosderivadosfue establecidaa partir de sus datosanalíticosy espectroscópicos,incluyendoMasas, ‘H RMN y

13C RMN. En el

espectrode masasde 41 se observael pico base a rn’e 548, correspondienteal

—38—

ion molecular, junto con las fragmentacionescaracterísticasde este tipo deestructuras71,72~Los espectrosde 1H RMN de los compuestos41 y 42 muestranuna notablesimplicidad,observándose,en amboscasos,la desapariciónde losprotones a-CH y a-NH del aminoácido de partida, junto con undesapantallamientoconsiderabLedel grupo ¡3—CH

2 de los correspondientes

aminoácidos.Este desplazamientoestáde acuerdocon el esperadopara ungrupo metileno flanqueadopor dos anillos aromáticos.Dada la simetríadeestasmoléculas,las resonanciasdebidasa los grupos2- y 5-CH2y al CH delrestode malonato,aparecencomo únicosdobletey triplete, respectivamente,si

bien ligeramentedesapantalladosen comparacióncon dichosprotonesen el‘y-cetodiésterde partida.Finalmente,en los espectrosde ‘

3C RMN de41 y 42 seobservandos señalesde carbonocuaternarioa 150,25y 147,91ppm y 150,20y147,54ppm, respectivamente,atribuiblesa los carbonos2 (5) y 3 (6), o viceversa,del anillo de pirazina‘7~t’~’~~

La obtención de estos derivadosde pirazina puede explicarsepor laautocondensaciónde dos moléculasde la (x-aminocetonacorrespondientepara

dar lugar a las dihidropirazinas43 y 44, que, posteriormente,se aromatizan,transformándoseen los derivadosde pirazina 41 y 42, respectivamente

(Esquema3). Esteprocesoconstituyeuno de los métodos descritospara lapreparaciónde pirazinas2,5-disustituidas72,7577

R1 ,NH2 CO2Me

MeO2C-4-

MeO2C H2N’ ~‘ CO2Me

39,40 39,40

1II’ N CQMe It’ N CO2Me¡ —.- 1

MeO2C [o] MeO2CtDO2Me

CO2Me~ It1MeO>C Me02C

43,44 41,42

139,41,43:R =CH2Ph

40, 42, 44: R’ = CH2Ln

Esquema3

39—

Para intentar obviar este inconveniente, debido a la reactividad de lasa-aminocetonas,se recurrió a la utilización de condicionesde reacciónmás

suaves.Para ello se llevó a cabo la hidrogenacióncatalítica de los 4-cefo-diésteresZ-protegidos,esperandoque la lactamizacióntuviera lugar en elpropiomedio de reacción(Esquema4). En estascondiciones,los compuestos37y 38 condujeron en una sola etapa a los respectivos derivados de 2,5-diceto-

piperidina 45 y 46, aunque senecesitarontiempos de reacción bastante largos y

los rendimientosobtenidosfueron moderados.En cuantoa la estereoquímicadel nuevo centro asimétrico en el carbono C-3 del anillo de 2,5-diceto-piperidina, se encontró una estereoselectividadcasi total en el caso del

derivadode Phe, mientrasque en el de Trp se llegó a una mezclade los dosdiastereoisdmerosposiblesen proporción5:2. En amboscasosse aisló tambiénunapequeñacantidaddel derivadode pirazinacorrespondiente41 ó 42.

It1

71W CO2Me

O CO2Me

37,88 HOSo

DCC

1t/Pd-C Método 2 ZH=4 CO9MeMeOR 112/Pd-C O CO2Su

AcOEt 47,48

O ~1 O Métodos

+HN ‘CO2Me CO2Me

O O

45a,46a 46b

137,45,47:R =CH2Ph38,46,48:R’ = CHoIn

Esquema4

La configuraciónabsolutaen C-3 de estosderivados3,6-disustituidosse

estableciómedianteel estudiocomparativode susespectrosde1H RMN. En el

espectro registrado en DMSO-d6 de la parejade diastereoisómeros46 se

observa que el protón H-3 del isómero mayoritario se encuentra

—40—

considerablementedesplazadohacia campo más alto respectoal mismo protón

del isómerominoritario. Esteapantallamíentoesdebidoa la corrientede anil]odel indol en posición 6, lo queindica que en el isómeromayoritario el protón

H-3 y el anillo aromáticoestánen disposición relativa cís ~ Teniendo encuentaque la configuraciónabsolutaen C-6 esS paraambosisómeros,ya queen la síntesisse partió de L-Trp, al isómero mayoritario le correspondelaestructura46a, de configuraciónabsolutaS en C-3, mientrasque al isómerominoritario 46b se le asignóla configuración(SR,6S).En el casodel derivadode

Phe 45, al obtenersecasi exclusivamenteun isómero, la asignaciónde laconfiguración en C-3 se efectuó por comparaciónde su espectrode 1~ RMNcon el de los correspondientesderivadosde Trp 46ab.

Una vez sintetizadosy caracterizadosestos derivados dc 2,5-diceto-piperidina, se decidiómodificar el método empleado,en un intento de mejorarlos rendimientos,así como de reducir los tiempos de reacción.Este tercer

método,tambiénindicadoen el esquema4, consisteen utilizar como productosde partida los aminodiésteresmixtos 47 y 48, en los queuna de las funcionescarboxilato ha sido previamenteactivada en forma de éster N-hidroxi-

succinimídico~ De estemodo, la hidrogenaciónen presenciade Pd-C deestos compuestoscondujo a las dicetopiperidinasbuscadas45 y 46, conrendimientosy estereoselectividadessimilaresa los obtenidossiguiendo elmétodo 2. Como se esperaba,la presenciade los ésteresactivadosredujo eltiempo de reacción, pero no se observó ninguna mejora apreciableen elrendimiento, posiblementecomo consecuenciade la gran reactividady, portanto, inestabilidad,de los ésteresN-hidroxisuccinimídicos.

Con objeto de estudiarla influenciade la estereoquímicadel aminoácidode partida en eí proceso de lactamización, así como de extender elprocedimientoanterior a la obtenciónde los análogoscetometilénicoscíclicos

procedentesde aminoácidosde la serieo, serealizó la síntesisde las 2,5-diceto-piperidinas 53 y 54 derivadasde Z-D-Phe y Z-D-Trp (Esquema 5). Lahidrogenaciónen presenciade Pd-C de los cetodiésteres51 y 52, preparadossiguiendoel mismométododescritoparasus enantiómeros37 y 38, condujoaresultadosanálogosalos obtenidosen el casode los derivadosde L-Phey L-Trp,tanto en lo que se refiere a rendimientoscomo a la estereoselectividaddelproceso.La asignaciónde la configuraciónabsolutade los compuestos53ay54ab, enantiómerosde 45a y 4Gab, respectivamente,se llevó a cabo porcomparaciónde sus espectrosde 1H RMN entresí, tal y como se ha indicadopara los derivadosde la serie L. Al efectuaresta comparaciónse observóuna

—41-—-

total coincidenciade los espectrosde los compuestos45a-58a,46a-54ay 46h-54b,lo queratifica que setrata de tresparejasde compuestosenantiórneros.

O 1VBnOCOCI/NMM O

TI-IF R”~..OH

2) CH2N2 ZHNZHN 3) 11C144eOH

49,50

I 1) NaXjIDME2)NaHC(CO2Me»

o CO2Me

It’,’.. CO0Me

ZHN

H~Ípd-c

1 MeOH(Método2)

o ou

1 N CO2Me

e—

+ + MeO2C CQMeUN CO2Me UN > It’

£O2Me MeO2C

53a, 54a 54b 41,42

1,41,49,51,53:R= CH2Ph42, 50, 52, 54: = CH2In

Esquema5

En la tabla 1 se resumenlos resultadosobtenidosen la síntesisde losderivadosde 2,5-dicetopiperidina3,6-disustituidos,utilizando los métodos2 y 3.De los datosde la tablasededucequeambosmétodosconducena las 2,5-diceto-piperidinasobjeto de estecapítulo con rendimientosmoderados.El tiempo dereacción se reduce en un 50% cuando se utilizan los ésteresmonohidroxi-succinimídicos(método 3), no observándose,en ningún caso, mejorasen losrendimientoscuandolos tiempos de reacción se prolongan.En cuantoa laproporción de diastereoisómeros,hay que señalarque para los derivadosde

Phe se obtuvo casi exclusivamenteel isómero con disposición¿rans de los

—42—

sustituyentesen posiciones3 y 6, conindependenciadel método.En el casodelos derivadosde Trp, se observaronproporcionesvariables,si bien el isómero3,6-transfue siempremayoritario.

‘fabla 1. Resultadosobtenidosen la síntesisde los compuestos

45a, 4Bab, 53a y 54ab,utilizando los métodos2y 3

Proporción deaTiempo de reacción Rendimiento diastereoisómeros1)

Compuesto Método (días) (%) a/b

45a 2 6 42 s 10:13 3 60 >10:1

46ab 2 6 42 5:2

3 3 40 3:2

58a 2 6 30 >10:1

54ab 2 6 34 6:5

a Calculadoa part:r de los correspondientescetodiésteres37,38,51y 52.

b Estimadapor 111 RMN.

2.1.2. 2,5-DICETOPIPERIDINAS3,3,6-TRISUSTITUIDAS

Una vez puestaa punto la síntesisde las 3-metoxicarbonil-2,5-diceto-

piperidinas 6-sustituidasde fórmula general 33, el pasosiguientepara lapreparación de los pseudopéptidoscetometilénicoscíclicos propuestoslo

constituyó la introducciónde la cadenalateral del aminoácidoC-terminal o deun precursorde la misma en la posición 3 del anillo de 2,5-dicetopiperidina.

Para ello, se planteó en primer lugar estudiarla alquilación directa de losderivados45ay 4Bab, eligiéndosetresagentesalquilantesdiferentescapacesdesuministrarlas cadenaslateralesde tres aminoácidosde distinta naturaleza,como son la fenilalanina, la alaninay el ácido aspártico.Así, la alquilaciónde45a y 46abcon bromurode bencilo y bromoacetatode etilo en DME, utilizandocomo basemetóxidosódico(métodoA), condujoa los derivadosS5ab,56ab,57ab

y 58ab, respectivamente(Esquema6). Un tratamientosimilar con yoduro demetilo como agentealquilante llevó a la obtencióndel derivadocorrespondiente3-metil sustituido6Oabcon bajo rendimiento,mientrasque el análogo59abno

43—

pudo obtenersepor este método. Los productos59aby BOab se prepararon

finalmente por alquilación de las dicetopiperidinas 45a y 46ab con yoduro de

metilo, en condicionesde transferenciade fase, duranteseis días, utilizando

NaOH como base e hidrogenosulfato de tetrabutilamonio como catalizador

(método B) 81,82 En estascondicionesse recuperóentre un 25 y un 30% de

producto de partida inalterado. Sin embargo,la prolongación excesivade los

tiempos de reacciónhastadesaparicióndel productode partida, lleva consigo

la saponificación de los ésteres metílicos, lo que dificulta la etapa de

aislamientoy purificación de los productosobtenidos.

oo CO~kIe

CO2Me UN

ZHN CO2MeO

37,38 45a,46ab

NaMeO 2MétodoA~ R-XDME

MétodoE

Oo CO2Me H2/Pd-C

2

It’ McOH .,,, UNZUN It

2 CO2Me MétodoC Rcogvre 112

O

61-66 55b-60b

55ab,61:R’ =CH2Pb,R2 =CH

2Ph56ab,62: R’ = CH2In, E

2 = CH2Ph

1 257ab,63: R = CH2PE,R = CH2CO2Et

58ab,64: R’ = CH2In,E2 = CH

2CO2Et

59ab,65: E’ =CH2Ph,Ii2 =CH

3

6Oab, 66: Ii’ = CH2In, E2 = CH

3

Esquema6

Los derivadosde 2,5-dicetopiperidina3,3,6-trisustituidos55ab,5Bab, 58ab,

59aby BOab se obtuvieron como mezclasde dos diastereoisómerosen proporción2:1, mientrasque el compuesto57ab se obtuvo tambiéncomo mezclade dos

diastereoisómeros,pero en proporción3:1, segúnse deducede los espectrosde1H RMN. La separación cromatográfica de los dos diastereoisómeros

O

55a-60a

—44 —

solamentefue posibleen el casode 56ab. La configuraciónabsolutaen C-3 de

todos estosderivados3,3-disustituidosse establecióuna vez más a partir de los

datosde 1H IRMN de cadaparejadediastereoísómeros.En los espectrosdeS5ab

y 5Bab se observa que el protón H-6 de los isómeros minoritarios aparece

apantallado con respecto al mismo protón de sus correspondientes

diastereoisómerosmayoritarios. Este efecto indica que, en los isómeros

minoritarios,el protónH-6 se encuentraen disposicióncts respectoal anillo

aromáticoen posición3. Teniendoen cuentaque en todos estoscompuestosla

configuraciónabsolutaen C-6 es8, la de los isómerosminoritarios55b y 5Gb se

asignócomo (3R,6S),mientrasque la de los mayoritarios55ay 56a lo fue como

(3S,68).De manerasimilar, en los espectrosde los compuestos59ab y BOab,se

observaque el singletecorrespondienteal grupo metilo en posición 3 aparece

ligeramente apantalladoen el isómero mayoritario comparado con el

minoritario. Este hecho puede explicarse,nuevamente,por el efecto de la

corriente de anillo del resto aromáticoen posición 6, lo que indica que en el

isómeromayoritarioel sustituyenteen 6 y el grupometilo en3 estándispuestos

del mismo lado del anillo de 2,5-dicetopiperidina~ Siguiendoel mismo

razonamiento,en el casode los análogos3-(etoxicarbonil)metilsustituidos57ab

y 58ab, el apantallamientoobservadoparalas resonanciasdel grupo 3-CH2 en

el isómero mayoritario permitió la asignaciónde la configuración de estos

compuestos.

El estudio de los espectrosde13C RMN de todos estos derivados de

2,5-dicetopiperidinaha revelado la existencia de diferencias significativas

entre los distintos diastereolsómeros.Así, en los isómerosmayoritarios, los

carbonosendocíclicosC-4 y C-6, así comolos CH2 ó CH3 pertenecientesa las

cadenaslaterales,aparecena campoligeramentemásalto que en los isómeros

minoritarios, mientras que el carbono C-5 aparecedesapantalladoen losisómeros mayoritarios respectoa los minoritarios. El hecho de que estas

diferenciasseanprácticamenteconstantesa lo largo de la serie de compuestos

aquídescritosabreJa posibilidad de queestosresultadosde ‘~C iRMN puedan

ser utilizados como criterios para la asignaciónde la configuración en otros

derivados similares.

Dado que los rendimientosde la alquilación de las 3-metoxicarbonil-

2,5-dicetopiperidinas 6-sustituidas no resultaron todo lo buenos que se

esperaba,y teniendo en cuenta que la alquilación de 4-cetodiésterestrans-

curre, en general, con buenosrendimientos~ se consideróconvenienteensayarla secuenciainversade reacciones. De estemodo, la reacciónde los

—45—

4-cetodiésteres37 y 38 conbromurodebencilo,bromoacetatode etilo y yodurodemetilo, en presenciade metóxido sódico, dio lugar a los derivadosde malonatodisustituidos61-66 ~7, respectivamente. La hidrogenacióncatalíticade estosderivados condujo a las 2,5-dícetopiperídinas55-60, que se obtuvieronnuevamentecomo mezclas de dos díastereoisómeros,en proporcionesidénticasa las encontradascuandose siguieronlos métodosA y 13. pero conrendimientosconsiderablementemejores.

Los resultadoscomparativosobtenidosen la síntesisde los derivadosde

2,5-dicetopiperidina3,3,6-trisustituidos,por los tres procedimientosensayados,serecogenen la tabla 2.

Tabla2. Resultadosobtenidosen la síntesisde los compuestos

55-60,utilizando los métodosA, ¡3 y C

Compuesto Método

Proporción de

Rendimientoglobal a diastercoisémerosb(04) alb

55ab 00

3457

2:12:1

SSab 00

551

2:12:1

57ab 00

3241

3:13:1

SSab 00

2360

2:12:1

5Oab 23C

1964

2:12:1

SOab 223C

117

54

2:12:1

2:1

ba Calculadoapartir de los cetodiésteres87 y SS. Estimadapor111 RMN.

Estos resultados indican que el método C conduce a rendimientos

globalesmejoresque los métodosA y B, constituyendoasí el métodode elección

para la síntesis de este tipo de derivadosheterocíclicos.Por otra parte, la

proporción de diastereoisómerosfue muy similar en todos los casos,con

independenciadel método utilizado. Así, cuando se aplicaron los métodos

—46—

A o B, ni la naturalezadel agentealquilante(R2) ni la estereoquímicaen C-3 de

la 2,5-dicetopiperidinade partida afectaron,en general, a la estereoselec-

tividad de la alquilación. De manerasimilar, cuandose aplicó el método C, nila naturalezadel aminoácido de partida (R’) ni la del sustituyente(R2)influyeron en la estereoselectividadde la ciclación.En todos los casosse obtuvo

como diastercoisómeromayoritario el derivadode 2,5-dicetopiperidina3,3,6-tri-sustituido en el que los sustituyentes alquilicos en posiciones 3 y 6 se

encuentranen disposiciónrelativa cts.

Se conoce a través de la bibliografía 78,83,85-89 que las 2,5-diceto-

piperazinasprocedentesde dipéptidos en los que uno de los aminoácidoses

aromático, adoptanpreferentementeuna conformaciónen la que la cadena

lateral aromáticase pliega sobreel anillo de dicetopiperazina.La preferenciapor esta conformaciónplegada viene apoyadapor una serie de estudios de

RMN 78.83,85 R-X 86.87 cálculos termodinámicos85,88 y de OM 89 En los casos

en los que, además, el segundo aminoácido posee una cadena lateral

voluminosa, las interferenciasestéricasentre las cadenaslateralesde los dos

aminoácidos condicionan también la adopción de una conformación

determinada, llegándose a una situación de compromiso en la que se

maximiza la interacción estabilizante entre el anillo aromático y el de

2,5-dicetopiperazina,a la vez que se evita la interferencia estéricaentre las

cadenaslaterales86.87

Teniendo en cuenta que para la asignaciónde la configuraciónen C-3 delas 2,5-dicetopiperidinasaquí descritas se ha consideradola existencia de

conformacionesplegadas,y con el fin de establecerclaramentesi estetipo de

compuestospresentao no un comportamientoconformacionalparalelo al de

las 2,5-dicetopiperazinas,sedecidió llevar a caboun estudiodetalladoa partir

de sus espectrosde ‘H RMN. Estos estudiosconformacionalesse realizaronendos disolventes distintos, DMSO-d

6 y CDCI3, ya que se habían observado

diferencias notablesen los espectrossegúnque el disolvente utilizado fuera

uno u otro.

Considerandola existenciade un equilibrio conformacional,debido a la

rotación libre alrededordel enlaceC6-C7 ~,entrelos tres confórmerosA, 13 y O

indicados (Tabla 3), se pueden calcular las poblacionesrelativasde los tres

Nota sobre nomenclatura:El grupo £112 unido a la posición 6 del anillo de 2,5-diceto-piperidina se ha numeradocomo (2-7 para simplificar la notación.

—47-----

estadosrotacionales si se conocenlas constantesde acoplamientocorrespon-

dientesa cadauno. Como no es posible determinarexperimentalmenteestas

constantesde acoplamientopara cadarotámero, ya que los valores que se

obtienen a partir de los espectrosde 1H RMN correspondenal promedio de

todos los confórmeros que contribuyen al equilibrio, éstas se calcularon

utilizando la ecuaciónde Karplus parametrizadaparatres sustituyentes90,91,

Las fraccionesmolares de los rotámerosn4, n~ y nc se obtuvieron por

resolucióndel siguientesistema de ecuaciones:

nA +nB+nc—- 1

60 180 30C~(G,Y)cxp nA ~6,? + ~23 + U~ h.7

300 60 180~(6,7’)cxp = náJ6-, + nB ~6.7’ + nc ‘~67

Los subíndicesA, B y O indican el confórmeroy los superíndiceslos

ángulos de torsión interprotónicos. Los valores de las constantes deacoplamientocalculadosa partir de la ecuaciónde Karplus se indican a

continuación:

60 300 60 180 180 300

= 3,39;3A 2,65; J

23 = 3,62; J3 = 11,8; J~ = 11,8; J~ = 2,87.

Puestoque no es posibleasignarindividualmentelas resonanciasde losprotones11-7 y H-7, los porcentajesde los rotámerosA, 13 y O se calcularonpara las dos posibles soluciones1 y II (Tabla 3). De los datosobtenidosen este

estudio se deduceque el equilibrio conformacionaldependeclaramentedel

disolvente. Así, la cadena6-aralquilica adopta preferentementela confor-

mación plegadaA en DMSO-d6, mientrasque las conformacionesB o C son las

preferidas en CDCI3. Estos resultadosestánde acuerdocon las diferencias

observadasentre los espectrosde 111 RMN de los derivadosde 2,5—dicetopi-

peridina estudiados,segúnqueesténregistradosen CDCI3 ó en DMSO-d6.Así,

parala pareja de diastereoisómeros4Bab, el apantallamientoobservadoparael

protón H-3 en el isómeromayoritario 46a esmucho más acusadoen DMSO-d6

que en CDCl3, lo que refleja una mayor abundanciade la conformación

plegadaen el primerode los disolventes.En estaconformación,el protón 11-3 y

el anillo aromáticodel sustituyenteen posición 6 estánmás próximos en el

espacio,por lo quela influenciade la corrientede anillo esmayor

—48—

Tabla 3. Porcentajescalculadosde losrotánierosA, 11, y (2

NH— NH—

paralas2,5-dicetopiperidinas45,4Gab,SSab-OOab

iso’ >11—

z~H7300CO117

(213

Compuesto Disolvente %Ai %~i %C¡ %A11 %23n ~Cíf

51 20 29

17 262 73

50 18 32 50 3018 7 75 23 74

11 228 80

13 252 86

18 22

5 83

44 14 42

7 8 85

59 24 175 8 87

60 11 29

52 16 32

52 16 32

8 9 83

47 21 32

67 1818 79

63 2014 84

60 1818 82

46 40 14

14 85

57 1511 87

61

1

282

25 14

53 29 18

55 26 19

15 82 3

47 30 23

153

172

22o

1-17.60~

Ar 1-17

A

Ar

45a

46a46a

4Gb

4Gb

DMSO-d6

DM50 -a6COCl~

DMSO-dgCDC13

5725

56 26 22

53 2330 70

24o

203

6712

6212

6012

55a55a

55b55b56a

56a

5Gb

57a

58a58a

59a

59b

OOaOlla

60b

DMSO-d6CDC)g

DMSO-d6CD Cl~

DMSO-d6CDCI3

DM50-dg

CDCIg

DM50CDCI3

DMSO-d6

DM50-

DMSO-dE

CDC)3

DMSO-d6

—49—

Del mismo modo, se explica que, en el compuesto BOab, el

apantallamientoejercido por el anillo aromáticosobreel grupo 3-metilo en el

isómero BOa, en el que dicho grupo metilo estáen disposicióncts respectoal

anillo, sea también bastante mayor en DMSO-d6 que en CDC]3. Por el

contrario,en los derivados3-bencil sustituidos55aby 5Bab,el apantallamiento

observadopara el protón H-6 en los isómerosminoritarios 55b y 56b esmásacusadoen CDCI3 que en DMSO-d6. Esto pareceindicar que,en los compuestos

55ab y 5Bab, la contribución de una conformaciónplegadadel grupobenciloenposición 3 es más importante en CDC]3 que en DMSO-d6, mientras que la

cadenaaromáticaen 6 adoptapreferentementeestetipo de conformaciónenDMSO-d6.

En cuanto a las posibles conformacionesdel anillo de dicetopiperidina

(Figura 5), en DMSO-d6, la adopciónde una de las formas de bote torcido

liv o 5/ pareceser consistentecon el plegamientode la cadenaaromáticaen

posición 6 sobreel anillo de dicetopiperidinay con los valoresobservadosdelas

constantesde acoplamientoCH-NP? (Figura 6, Tabla4) 83,84,92 Cuando el

disolvente es CDCl3, se podría pensar igualmente en las conformaciones

11V o 5/, pero sin descartarlas formas bote II o III 84,86,87

11’ 0

11’ N

11 N té 1-11-1 ~ U

.7 1-3

1 III III

ORl R

1-1

O o

5=1-3 5=0

nr

Figura 5. Conformacionesdelanillo de2,5-dicetopiperidinay constantesdeacoplamientoOH-NH para los confórmerosII, III, 15/y V.

Rl

5=0

—50——

H

O o

11N4~H

Iv

R2, R3 = H, CO2Me,CH2Ph,CH2CO2Et,CH~

Figura 6. PosiblesconformacionesenDMSO-d6paralos derivadosde

2,5-dicetopiperidinarelacionadosen la tabla4.

Tabla4. Constantesde acoplamientoCH-NH y conformacionesposiblesen DMSO-d6

de los derivadosde 2,5-dicetopiperidina

Compuesto J1,6 (Hz) Conformación

45a 2,0 IV

46a 2,0 IV

4Gb 0 y

55a O V

55b 2,4 IV

56a O V

5Gb 2,6 IV

58a O V

59a O V

59b 1,2 IV

60a O V

60b 1,9 IV

—51---—

O o

y

2.1.3. PSEUDODIPÉPTIDOSCETOMETILÉNICOSCÍCLICOS

Siguiendoel esquemageneralde síntesispropuestoen el apartado2.1, laobtenciónde pseudodipéptidoscetometilénicoscíclicosciclo[XaaM-’LCOCH2]Cxly](34) y ciclo[XaaW¡ICOCH2]Yaa] (35), requiere la eliminacióndel grupo3-metoxi-carbonilo de los derivadosde 2,5-dicetopiperidina3,6-di y 3,3,6-trisustituidos,

respectivamente.Esta eliminación, que implicó saponificacióndel éstermeti$lico seguidade descarboxilación,sellevó a cabo únicamentea partir de loscompuestos4Gaby 55ab,elegidoscomorespectivosejemplosrepresentativosdederivadosque deberíanconducir a pseudodipéptidoscetometilénicoscíclicos en

los que el aminoácidoC-terminal es Gly y otro aminoácidodiferente de éste

(Esquema7). De estamanera,la saponificaciónde los compuestos46aby SSab

condujo a los correspondientesácidos carboxílicos G7ab y 6Sab, cuyadescarboxilación por calefacción a reflujo de dioxano dio lugar aciclo[Trp’P1iCOCH~]Gly] 69 y ciclo[PheW[COCH2]-ambo-Phe] 7Oab, respectiva-mente,obteniéndoseeste último como una mezclade dosdíastereoisómerosen

proporción 2:1.

O O O

1) NaOIUIeOH dioxaoofiN 2)HGI fiN A

CO2Me co2uO O

46ab, 55ab 67ab, 68ab 69, 7Oab

67ab,69: R’ = CH2In, R2 = H

GSab,70:R1=R2 =CH2Ph

Esquema7

La asignación de la configuración absoluta de la pareja de diastercoisó-

meros 7Oab se realizó a partir de los espectrosde1H RMN, basándose

nuevamenteen los efectosde apantallamientode los anillos aromáticosde las

cadenaslateralessobre los protonesdel anillo de 2,5-dicetopiperidina.Así, enel espectrode 1H RMN en DMSO-d

6del compuesto7Oabseobservaque en el

isómero minoritario 70b, tanto el protón H-3 como el H-6 se encuentranapantalladoscon respectoa esosmismos protonesen el isómeromayoritario.Esto indica disposicionescts entre los protonesH-3 y H-6 y las cadenas6- y

—52—

3-aralquilicas, respectivamente.Por lo tanto, la configuración absolutadeldiastereoisómeromayoritario 70a se asignó como (3R,6S) y la de 70bcomo(3S,6S).

El hecho de que la descarboxilación de BSab para dar lugar a 7Oab

transcurrade forma estereoselectiva66,93 podríaexplicarsesuponiendoque la

descarboxilaciónse producea través de la formación del enol intermedio 71

(Esquema8). Segúnestemecanismopropuesto,la protonacióndel carbono0-3

tiene lugar preferentementepor la carainferior del anillo, menos impedida,

dandolugar mayoritariamenteal isómero70a 94.

o 1Ph Ph Ph Ph~

r I{Ny~2’68ab 71

o o

Ph Ph+

HN Ph HN

O o

lOa 70b

Esquema8

O1-1

—53—

2.2. DERiVADOS DE 8-OXOINUOLIZIDINAS COMO ANÁLOGOSCONFORMACIONALMENTE RESTRINGIDOS DE DIPÉPTIDOS

Como se indicó en el apartado1.3, el esquemasintético quenos deberíapermitir la obtenciónde las 8-amino-3-oxoindolizidina—2-carboxilato2—susti-tuidas objeto de este trabajo, se basóen el procedimientoque, previamente,había conducido con facilidad a 8-amino-3-oxoindolizidinas2-aralquil susti-tuidas a partir de pseudodipéptidoscetometilénicosderivadosde ornitinaconvenientementeprotegidos(Boc-Orn(Z)W!ICOCH2]Yaa,Yaa = Phe, Trp) 64~

En esteprecedente,el procedimiento,consistenteen unasimple hidrogenacióncatalítica, condujo directamentea las 3-oxoindolizidinasentoncesbuscadasatravés de un procesoque implica, en un solo paso,la hidrogenolisisdel grupoZ, aminación reductivay y-lactamización.A la vista de estosresultados,sepropusieron las dos rutas sintéticas alternativas indicadas en el esquema

general9, en las que la elaboracióndel biciclo lactámico,bien en una primera

etapa(ruta A), o bien en una segunda(ruta B), constituyeel pasofundamental.

CO e

l3ocHN

73NHZ RutaA

11

BodHN CO2Me CO2Meo BodUN

CQMe

72 NHZ

RutaE

CQMeBodHN

o RCO2Me

74

iR = cadenaslaterales dediferentes aminoácidos

Esquema9

o

——54—

Así, mediante la ruta A, la aplicación del citado procedimiento a]

cetodiésterderivadode ornitina 72 deberíaconduciral esqueletode 8-amino-3-oxoindolizidina-2-carboxilato73 comointermedio comúnpara la introducción

posteriorde las cadenaslateralesde los diferentesaminoácidos(R), incluidascomo sustituyentesen las 3-oxoindolizidinas2,2-disustituidas75. Alternativa-mente,siguiendola ruta B, la introducciónprevia de las cadenaslateralesde

aminoácidos(R) en el cetodiéster72 y la subsiguienteformación del biciclo

lactámico deberían dar lugar a las 3-oxoindolizidinas buscadas75. La

desprotecciónselectiva de los grupos NP?2 6 CO2H de los compuestos75

conduciríaa los derivadosde 3-oxoindolizidina aptospara ser incorporadosacadenaspeptídicasde mayor tamano.

2.2.1. FORMACIÓN DEL ESQUELETODE 8-AMINO-3-OXOINIJOLIZIDINA-

2-CARBOXILATO

Siguiendo la ruta A del esquemageneral 9, se llevó a cabo la

hidrogenacióncatalítica del 4-cetodiésterderivadode Orn 72, paradar lugar en

un solo paso de reacción, y de acuerdocon lo esperadosegún el ya citado

antecedente64, a la 3-oxoindolizidina73 (Esquema10). Estecompuestomostró

un espectrode ‘H RMN complejo, en el que, al menos,se podía observar la

presenciaesperadade dos diastercoisómerosmayoritarios en proporción 1:1

debidosa ]a creación de] centroasimétricoen el carbono0-2. La separacióncromatográficade estamezclade 3-oxoindolizidinasisómeras73 no se intentó,dada la conocida tendenciaa racemizarsede los derivados de malonatos

monosustituidos,que impide su resolución95,96

Con el fin de determinarla estereoselectividadde la aminaciónreductiva

y de asignar la estereoquímicaen 0-Sa, se procedió a eliminar el grupo

2-metoxicarbonilo. Así, la descarboxilacióndel ácido 76, procedentede la

hidrólisis del éster 73, condujo a una mezclade los derivadosde 8-amino-3-

oxoindolizidina 78a y 78b en proporción 12:1, determinada por HPLC.

Resultadossimilares se obtuvierontanto en la formaciónde los compuestos76

a partir del cetodiácido 77 como en la descarboxilaciónsubsiguiente. La

asignaciónde la estereoquímicade los diastereoisómeros78a y 78b se llevó a

cabo a partir de sus espectrosde1H RMN. Así, en el espectrodel isómero

mayoritario 78a, se observauna constantede acoplamiento~88a de 9,8 Hz, lo

que indica una disposicióntrans-diaxialde los protonesH-8 y H-8a, mientras

56—

queparael isómerominoritario 78b el valor de la ~S,8aesde 2,9 Hz, indicando

unadisposicióncts paralos mencionadosprotones.

NHZO

112¡Pd-C(2O2Me

McOH

BocHN CO2Meo BocHNCO2Me

72 ‘73

I I) NaOHIMeOI-I ji> NaOHI1~1eOH

2) HO) 2) Hcl

NHZO

H2IPd-C

MeOH 2

BocHN 211o 00211 BocHN

77 76

I dioxano/A

o O

+

flodUN BocHN

78b

78a/78b=12:1

Esquema10

Estos resultadosindican que la aminación reductiva implicada en la

elaboracióndel esqueletode oxoindolizidina transcurre con un alto grado de

estereoselectividad,conduciendomuy mayoritariamentea una disposicióntrans de los sustituyentesen 8 y Sa. En cuantoa configuracionesabsolutas,ala esperade poderdeterminarsi hay racemizaciónalgunadel resto de L-Orn

durantela formación de la oxoindolizidina, se asignaronde forma tentativacomo (SS,8aR)y (8S,8aS)paralos compuestos78ay 78b, respectivamente.Por

78a

—56—-

tanto, el compuesto73 y su análogo76 estaríanconstituidospor unamezcladedos parejasde diastereolsómerosen 0-2 de configuraciones(2RS,SS,8aR)y(2RS,8S,8aS).

O

N

CO2R

BocHN

73ab:R = CH37Gab: R = H

O

N

CO2R

BocHN

73cd: R = CH~7Gcd: R = H

Con el fin principal de disponerde unaseriede derivadosde 8-amino-3-oxoindolizidina-2-carboxilato con distintas configuraciones en sus centros

quiralespara ser insertadosposteriormenteen cadenaspeptídicas,se decidió

preparar los compuestos81, análogosde 73, siguiendo el mismo procedi-

miento, pero utilizando D-Orn como producto de partida (Esquema11). La

preparación del 4-cetodiésterderivado de Boc-D-Orn(Z) 80 se llevó a cabo

siguiendoel mismo método descritopara su enantiómero64• La hidrogenación

catalíticade 80 condujoa la obtencióndel derivadode 3-oxoindolizidinaSi como

una mezclade diastercoisómerosen las mismasproporcionesque en el caso de

sus respectivosenantiómeros73.

NHZ NHZ

1) BijOCOCIINMM, TIff

OH 2) CH2N23) HCI’MeOH BocHN Cl

O

4) NaI/THF

5)NaBC(CO2Me»

79

NHZ

BodHN’ CO,2MeO CO2Me

80

I H 2/Pd-c

MeOH

O

N

CO2Me

BocHN

81

Esquemail

BodUN’O

—57—

2.2.2. ALQUILACIÓN DE DERIVADOS

DE 8-AMJNO-3-OXOINDOLIZIDINA-2-CARBOXILATO

Para estudiar la posibilidad de introducción de cadenaslaterales de

diferentesaminoácidosen la posición 2 del anillo de 8-amino-2-metoxicarbonil—

3-oxoindolizidina, se realizó, en primer lugar, un estudiode la alquilación del

compuesto 73 con bromuro de bencilo (Esquema 12). Además de la gran

reactividad de este agente alquilante, la presenciade una cadena lateral

aromática en el anillo de 3-oxoindolizidina podría ser de utilidad para la

asignación de la estereoquímicade los productos finales obtenidos. De este

modo, se sintetizó el compuesto82 como mezcla de tres diastereoisómeros.en

proporciones 11:2:1, que pudieron ser separadospor cromatografía y cuya

estereoquímicase establecióa partir de sus datosde 1H RMN. Los isómeros

obtenidosen mayor proporción presentanuna disposocióntrans entre los

protones H-8 y Hl-Sa, como se deducede los valores de las constantesde

acoplamientoJ8,Sa,de 8,6 y 9,7 Hz, respectivamente.Por otra parte, en el

espectrocorrespondienteal isómerominoritario el valor de la constanteJgs~es

de 3,1 Hz, lo que está de acuerdocon una disposición relativa ds entre los

mencionadosprotones. Asumiendo~ que la configuraciónen 0-8 es S en los

tres casos,la configuración en 0-Sa se asignó como R para los isómeros

mayoritarios y como S para el minoritario. Por otra parte, el protón Hl-Sa del

diastereoisómeromayoritario 82a apareceapantalladocon respectoa ese

mismo protón en el compuesto78a, ambosde configuraciónR en 0-Sa. Esta

diferenciase atribuyó al apantallamientoproducidopor el anillo aromáticodel

sustituyenteen posición 2, por lo que sededucequeel protón H-8a y eí grupo2-

bencilo se disponen en la misma cara del anillo heterocíclico.Como era de

esperar,el protónH-Sa del isómero82b presentóun desplazamientoquímicomuy similar al de esemismo protón en 78a. Finalmente, la configuración

absolutadel isómerominoritario 82c se asignócomo(2S,SS,SaS),teniendoencuentael apantallamientoobservadopara el protónHl-Sa de estecompuestoencomparacióncon el de 78b, que indicabanuevamenteuna disposición relativacts entreel grupo bunciioyel mencionadoprotón.

+ Como ya se ha mencionadoen el capítulo anterior, las asignacionesde configuraciones

absolutas,tanto en las indolizidinas obtenidas a partir de L-Orn como de D-Orn, serealizaron, en principio, de manera tentativa partiendo de una ausencia total deracemizaciónen el C-cx del aminoácido.Este aspectose resolverádefinitivamente tras elestudiode enantioselectividaden el procesode formación de estosbiciclos (Apartado2.2.3.)

——58—

La introducciónde la cadenalateral del Trp en la posición2 del anillo de

3-oxoindolizidina, se llevó a cabo por tratamiento del compuesto 73 con

metíyoduro de gramina, utilizando metóxido sódico como base. En estas

condicionesseobtuvo el compuesto83, tambiénformadopor una mezclade tres

diastereoisómerosen proporciones11:2:1. La asignaciónde la configuraciónen

0-2 y 0-Sa se realizó nuevamentea partir de las constantesde acoplamiento

~8,8a y los valoresde desplazamientoquímico de los protonesH-8a, siguiendoel

mismo razonamientoqueen el casode los derivados82.

O

NCQMe

Bocl-IN

73

IO

N

CO2Me

BocHN

82a,SSa,Ma

1O

N

COQE

BocHN

85w 86a

O

N CO2Me

+

Boel-IN

82b, 83b, Mb

4,O

N cO2H+

‘—II

BocHN

85b, 8Gb

O

N CQMe+

ti

BodUN

82c,83c,Mc

1O

>4 C02H+

ti

BocHN

85c

82a,82b, 82c,85a,85b, 85c: R = Ph

83a,SSb, 83c,SGa,8Gb: U = In

84a,Mb, 84c: R = CO2Et

Esquema12

—59-----

La alquilación de 73 con bromoacetatode etilo, agentealquilante portadorde un precursorde la cadenalateral del Asp, utilizando metóxido sódico como

base,condujo a la obtención de 84 con bajo rendimiento. Sin embargo,una

reacciónsimilar utilizando NaH dio lugar al compuesto84 con un rendimiento

aceptable. El espectro de 1H RMN de 84 indicó la presenciaclara de dos

diastereoisómerosen proporción aproximada5:1, detectándosetambién trazas

de un tercerdiastereoisómero.Como en estecaso no fue posible la separacióncromatográficade los mismos,la asignaciónde la configuraciónse realizó apartir de los datos de 1H RMN de la mezcla. Nuevamente,el isómeromayoritario presenta una constante de acoplamiento ~88a de 8,5 Hz,

concordante con una disposición trans entre los protones H-8 y H-Sa.

Suponiendoqueel ataquedel agentealquilantetiene lugarpreferentementeporla mismacaradel anillo que en los casosanteriores,el compuestomayoritario84a se corresponderíacon el isómero(2S,SS,SaR),mientrasqueel minoritario84b presentaríaconfiguración(2R,8S,SaR).

La desprotecciónparcial de los compuestos82a, 82b,82e, 83ay 83b por

tratamientocon NaOH, condujoa los correspondientesácidoscarboxílicos85a,85b, 85c, SBay 86b, respectivamente(Esquema12), adecuadospara su

introducciónenpéptidosde mayor tamaño,como sedetallaráen el capítulo2.3.La alquilación con bromurode bencilo del correspondientederivado de

3-oxoindolizidina 81, preparadoa partir de D-Orn, dio lugar al compuesto87

(Esquema 13), constituido por una mezcla de tres diastereoisómerosen

idénticasproporcionesa las descritaspara82. Los espectrosde ‘H RMN deestos tres diasteroisómerosson idénticos a los de sus enantiómeros

correspondientes,82a,82b y 82c, respectivamente.Los compuestos87ay 87b fueron saponificadosa los ácidoscarboxílicos

88a y 88b, adecuadospara su introducción posterior en la secuenciadelhexapéptidoC-terminal de la Neurotensina,como se indicaráen el capítulo

correspondiente.De forma general,la alquilación de las 2-metoxicarbonil-3-oxoindolizi-

dinas transcurrecon rendimientosmoderados,que oscilanentre el 58% y el69%, obteniéndoseen todos los casos con esteroselectividadessimilares,independientementedel agentealquilanteutilizado. Se observatambiénque la

entrada del agentealquilante tiene lugar preferentementepor la misma cara

del anillo de 3-oxoindolizidinaen la quese encuentrael protón H-8a.

——60—

ON

CO2Me

BocHN

O

N CO2Me

Ph

B ocHN

8’7a

81

+ CO2Me

BocHN

Sm

O

N —Ph+

BocHN

87c

4O

N CO2H

— — Ph

88a

BOCHN

SSb

Esquema13

2.2.8. ENANTIOSELECTIVIDAD EN LA FORMACIÓN DE DERIVADOS

DE S-AMINO-3-OXOINDOLIZJDINA-2-CARBOXILATO

Cuando se llevó a cabo el acoplamientode los compuestos82 conBoc-L-Trp, con objeto de prepararanálogosconformacionalmenterestringidosde COK (Capítulo2.3), seobservóque, tanto a partir del compuesto82acomode

82h, se obteníanmezclasde dos diastereoisómeros.Este hechopodíaserdebido,bien a la racemizaciónparcial del L-Trp duranteel procesode acoplamientoobien a que las 3-oxoindolizidinas82ay 82b estabanconstituidaspor mezclasdeenantiómeros.Teniendoen cuentaque los métodos de formación del enlacepeptídico empleadosno producennormalmenteracemización,la segundaexplicaciónparecíamásprobable.Para esclarecerestepunto, se llevó a caboun seguimientode la ruta sintética utilizada para la preparaciónde losderivadosde 3-oxoindolizidina,estudiándoseconcretamentelos 4-cetodiésteresderivados de Orn y las 3-oxoindolizidinas2,2-disustituidas.Los primeros

BocHN

o

Ph

CO2H

—61-——

fueron elegidospara determinarsi durantela etapade obtenciónde los 4-ceto-

diésteresse producíaracemizacióndel derivado de Orn de partida. Por otraparte, la determinación del exceso enantioméricode las 3-oxoindolizidinas

2,2-disustituidasnos daríaideade la enantioselectividadduranteel procesode

generacióndel anillo de 3-oxoindolizidina. En este caso, no se eligieron las

2-metoxicarbonil-3-oxoindolizidinasintermedias,ya que el hecho de que seobtengan como mezclas de diastereoisómerosinterconvertibles en 0-2dificultaría el estudio.Además,es poco probableque la reacciónde alquilación

en 0-2 afecte a los centrosasimétricos0-8 y 0-Sa,previamentecreados,por loque los resultadosobtenidoscon los derivados2,2-disustituidospuedenserextrapolablesa las 2-metoxicarbonil-3-oxoindolizidinas.Parallevar a caboesteestudiose prepararon,en primerlugar y de formaparalela,los 4-cetodiésteres72 y 80, derivadosde L- y D-Orn, respectivamente.A continuación estos

compuestosfueron hidrogenadosen idénticascondicionesde concentraciónypresiónde H2, y a temperaturasde 12-14 OC para72 y 14-15 CC para80, dando

lugar a las 2-metoxicarbonil-3-oxoindolizidinas73 y 81. Estosderivadosfueron

alquilados posteriormentecon bromuro de bencilo, en las condicionesyaindicadas, para dar lugar a los compuestos82 y 87, respectivamente,procediéndosefinalmente a la separacióncromatográficade los correspon-dientesdiastereoisómeros.

Paradeterminarla purezaenantioméricade los 4-cetodiésteres72 y 80,

asícomo de los derivados82a,82b,87ay 87b, serecurrióal empleode auxiliares

quirales~, para obtener,si fuera el caso,los correspondientesderivadoscomomezclasde diastereoisómeros,detectablespor RMN. Entre los diversostipos de

auxiliares quirales existentesse eligieron, en primer lugar, los agentesquiralesde solvatación97,98, dadala rapidezy simplicidaddel experimentoy laimposibilidad tanto de problemasde resolucióncinéticacomo de racemización

de la muestra.Los espectrosde ‘Hl RMN de los compuestos72, 82a y 82bregistradosen presenciade cantidadescrecientes(de 1 a 4 equivalentes)de(S)-(+)-TFAE y utilizando CDCl3 como disolventeno presentarondesdobla-

miento en ningunade las señales.Aunque el CDCI3 es uno de los disolventes

más adecuadospara estetipo de ensayos,dadasu baja polaridad, se registrótambiénel espectrode ‘Hl RMN del compuesto82bjunto con 3 equivalentesde(S)-(+)-TFAE en benceno-d6,por si la menorpolaridad de este último pudiera

ser un factor decisivo para la eficacia del experimento.Sin embargo,tampocoen estecasose observódesdoblamientode señales.

——62—

72

Los agentesquirales de derivatízación~, de uso muy extendido para

determinar excesosenantioméricos,presentanla ventaja de que para los

diastereoisómerosobtenidosel A~ observadosueleserdel ordende cinco veces

superioral que se observacon los agentesquirales de solvatación.Dentro deestos agentes,se utilizó el ácido a-metoxi-c~-(trifluorometil)feni1acético

(MTPA) 99, que es el de aplicación más amplia para derivatizar aminasprimariasy secundarias,así como aminoácidos100.

La desproteccióndel grupo 5-aminode los 4-cetodiésteres72 y 80 conTFA, seguidade tratamiento con (R)-(+)-MTPA en presenciade BOP 101,

condujoa la obtenciónde los derivados89 y 90, respectivamente(Esquema14).

>4HZ NUZ

O

BocHN CO2Me 1)TFA/C142C!2 MeO2)(R9-(+)-MTPA Ph N A2

11 o (‘O MeCO<2Me

‘289

NHZ NI-IZ

1) ‘ITA! cti2ci2 MeO O

BocH>4 CO2Me 2) (R)-(+)-MTPA Ph N CO#fe

O CQMe CF3 11 CO2Me

80

Esquema14

En la evaluaciónpor }{PLC de los crudosde reacciónseobservóquetantopara 89 como para90 seobtenía un solo pico con idéntico tiempo de retención.Tras una cuidadosapurificación cromatográficase registraronlos espectrosde

1H RMN en CDCl3. Cadauno de ellos muestrala existenciade un único

grupo de señales,con pequeñasdiferenciasde desplazamientosentre uno y

otro. Paradeterminarsi estasdiferenciaserandebidasa pequeñasvariacionesen las condicionesen que se obtuvieronlos espectros,se compararonéstosconel espectrode una mezclapreparadacon los derivados89 y 90 en proporción3:1. En este último se observa el desdoblamientoclaro de las señales

O

O

90

——63—

correspondientesa los protonesH-7 y al OCH3 del MTPA. Por tanto, se puede

concluir que,dentro de los límites de detecciónde la RMN, la formación de los4-cetodiésteresderivados de L- y O-Orn transcurresin racemización.Losvaloresde AS (~sg-~9o)observadosestánde acuerdoconlas prediccionesteóricas

del modelo del MTPA, segúnel cual los derivadosde este tipo adoptan,endisolución, una conformaciónpreferenteen la que el grupo carbonilo de laamidase encuentraeclipsadocon el grupo trifluorometilo y con el hidrógeno

11-5 ~ (Figura 7). Así, los protones11-7 del compuesto90 aparecenapantalladospor la corrientede anillo del grupo fenilo 99, próximo en el espacio(AS = 0,22ppm). Por otra parte,el AS observadopara el grupo a-metoxilo (—0,13 ppm)

indica que, en el isómero90, los protonesde dicho grupo estándesapantalladospor eí grupo carbonilo, ya que ambosgruposestánorientadoshacia el mismolado del planodel MTPA ~.

COcH2cH(cO2cH3)2 (CH<93-NHZMeO Ph Ph

ZHN-(CH2y,

45)

89 90

Figura 7. Conformacionespreferentesen disolución, segúnel modelodel

MTPA, de los cetodiésteresderivatizados89y 90.

Seguidamentese derivatizaroncon (R)-(+)-MTPA los compuestos82ay

87a(Esquema15) y 82by 87b (Esquema16), aplicandoel mismoprocedimientoutilizado paralos 4-cetodiésteres.

El análisisde HPLC de los crudosde reacciónindicó quetanto a partir de82a como de 87a se obtenía la mezcla de diastereoisómeros91a+91b,enproporciones6,3:1 y 1:5,8, respectivamente.Del mismo modo, la derivatizaciónpor separadode 82b y 87b condujoen amboscasosa la obtencióndel compuesto

92ab,en proporciones a/b de 5,4:1 y de 1:3,9,respectivamente.Nuevamente,los valores de AS(a-b) encontradosen los espectrosde

‘Hl RMN de las parejasde diastereoisómeros9lab y 92ab presentanuna granconcordanciacon las prediccionesdel modelo del MTPA (Tabla 5, Figura 8).Así, los valoresde AS negativosparalos protones11-1 y Hl-Sa son consistentes

con el apantallamientode dichosprotonespor la corrientede anillo del grupo

MeO

—64 —

fenilo en los isómeros 91a y 92a, mientras que los valores positivos para losprotones H-7 indican que son éstos los que, en los isámeros 91b y 92b, seencuentrandel mismo lado que el anillo aromático.

oN Ph

CO~Me

BocHN

82a

O

N CO2Me

— PhBodUN

87a

1) TFA/cH2CI22) (R)-(i-)-MTPA

(S)-(+)-MTPA-clo

O

Ph

¼ CO~Me+

(R)-MTPA-HN

91a

O

N CO2Me

— Ph

(R)-MTPA-HN

91b

Esquema15

O

N CO2Me

“—ph

BocHN

82b

O

N Ph

CO2Me

BocliN

87b

1) TFA/cH2cI22) (R)-(+)-MTPA

O

N ¡ CO2Me

—Ph

(R)-MTPA-HN

92a

O

N Pb

CO Me2

+

(R).MTPA-HN

92b

Esquema 16

—65—

Tabla 5. Diferenciasde desplazamientoquímico (ppm) más significativas

de ‘a RMN [(CDg)2C0]delasparejasde diastereoisómeros9laby 92ab

Compuesto 11-1

AS(a-b),ppm

H-7 ¡1-Sa

9lab —0,26 + 0,11 + 0,12 —0,16

92ab —0,29 —0,17 + 0,11 + 0,16 —0,14

Ph

Cofa3

H H Ph

E ~ OCa3

~ O CF3

91a

CO2CH3

11N<t. OCaS11 o

92a

Ph

11CHSO2C o

11N

01130, ~N

11CE3

0 H

91b

92b

Figura 8. Conformacionespreferentesen disolución,segúnel modelo

delMTPA, de los compuestos9lab y 92ab.

La diferenciaen la proporción de díastereoisómerosobtenidaa partir de

82a (6,3:1)y 82b (5,4:1), en los que, por proceder de la mismareacción, el exceso

enantioméricodebe ser idéntico, sugiere la existenciade algún problema de

resolución cinética, debido a las diferentesvelocidadesde reacción de los

O11

—66-—

sustratosenantiómerosfrente al reactivo quiral 9~. Se obtieneun resultado

similar al derivatizarlos compuestos87ay 87b, como ya se ha indicado.Paratratar de evitar esteproblema,seprocediódenuevoala introduccióndel MTPAen los derivadosde 3-oxoindolizidina,utilizando un gran excesode! cloruro delácido de Mosher correspondiente,mucho más reactivo loo. En estascondiciones,los diastereoisómeros9lab se obtuvieronen proporciones5,3:1 y

1:5,3, a partir de 82ay 87a, respectivamente.Sin embargo,una derivatizaciónsimilar de 82ay 87a concloruro de (R)-(—)-MTPA condujoa proporcionesde laparejade diastercoisómeros93abde 7,6:1 y de 1:4,9, respectivamente(Esquema17). Estehechoindica quela utilización de los clorurosde ácido no solucionaelproblemade resolucióncinéticay, por lo tanto, las proporcionesde las mezclasde diastercoisómerosobtenidassedebenconsiderarcomo aproximadas.

O OPh N CO2Me

CO2Me Ph

Boel-IN BocHN

82a 87a

1) TFA’0112C1, 42> (R)-(—$NIWA-c:

O O

N Ph CO2Me+

CQAle — Ph

(S)-MTPA-I-IN (SYMTPA-HN

93a 93b

Esquema17

En cualquiercaso, los resultadosde esteestudiode derivatizaciónconMTPA ponende manifiestoque los derivadosde 3-oxoindolizidinapreparados

están constituidos por mezclasde dos enantiémerosformados durante elprocesode elaboracióndel anillo heterocíclico. Teniendo en cuentaque elcentroasimétricoen 0-Sase forma durantela reacciónde aminaciónreductivaintramolecular,los intermediosde esta reacciónhande ser los determinantesde la formación de las mezclasde enantiómerosobtenidas(Esquema18). Así,si la reacciónde hidrogenación del ‘y-cetodiéster72 transcurriesea travésde la

—67—

ae

ao

ti

448aO

/z

ao

o

+

o> ‘4

a

e

z

zao

4ao

a

z~“Iz

a

o

+

4ae

O

z

ao

o -9

+

4’o

z2:

2:ao

+

o>

ao

a

=42:ao

Q

zao

ao

ti

ao

¿4O

O

=4rs-

2:ao

+

=4ao

o> ‘4

a

e

2:

2:ao

E-

u.-

imina intermedia A 102,103, se obtendríanlas piperidinas D y E que, trasy-lactamización,daríanlugar a los derivadosde 3-oxoindolizidina73aby 73cd

mayoritarios.Por otra parte, a través de un equilibrio imina-enamina,laimina A puedeconvertirseen la imina 0, cuya hidrogenacióngeneraríalas

3-oxoindolizidinas8lab y 8lcd. Dado que las transposicionesimina-enaminaestánfavorecidaspor el calor, para comprobarla validez de estemecanismopropuesto,se llevó a cabo la hidrogenacióndel ‘y-cetodiéster72 a 40 OC. La

derivatizacióndel compuesto82a, preparadopor alquilación de la 2-metoxi-carbonil-3-oxoindolizidina 73 así obtenida, condujo a los derivados9lab(a¡b = 2,1:1)y 98ab(a/b = 2,8:1), siendolasproporcionesa/bmuy superioresalasencontradascuando la hidrogenación de 72 se había llevado a cabo atemperaturamásbaja(Tabla6).

Tabla 6. Excesosenantioméricosdeterminadostras derivatizaciéncon MTPA

de las 3-oxoindolizidinas82a,82b, 87ay 87b

Proporciónalb (% excesoenantiornérico)Prod. de Temp. de Prod. final — __________ ______

partida hidrogen. denvatizado (R)-(+)-MTPA-OH (S)-(+)-MTPA-C~ (R)-&-i-MTPA-CI

u-Orn 12-14 0C 9lab 6,3:1 (73) 5,3:1 (68)

L-Orn 400C 91ab 2,3:1 (39) 2,1:1 (35)

D-Orn 14-15 0C 9iab 1:5,8(71) 1:5,3 (68)

u-Orn 12-140C 92ab 5,4:1 (69)

1)-Orn 14-15<C 92ab 1:3,9(59)

u-Orn 12-140C 93ab 7,6:1 (77)

u-Orn 40<C SSab 2,8:1 (47)

n-Orn 14-15 0C S3ab 1:4,9 (66)

La estereoselectividadobtenidaen 0-Sase puedeexplicar tambiénpormedio de este mecanismo,ya que es de esperarque la hidrogenaciónocurra

preferentementepor la cara superiorde la imina A o por la inferior de laimina 0, para dar lugar al derivadode piperidinacon los dos sustituyentesen

disposición relativa trans diecuatorial (D o F). La pequeñaproporción delisómerominoritario podría procederde la hidrogenaciónde la imina por ellado menosfavorable o bien de la hidrogenaciónde la enamina.Sin embargo,

la gran resistenciaa la reduccióndel doble enlaceenamínicoobservadatanto

—69—

en el derivado de hexahidroindolizina 106, que se describemásadelante,comoen el casode otros sistemasrelacionados104,105,apoyael que la hidrogenación

procedaen todoslos casosvía la imina intermedia.

2.2.4. FORMACIÓN DE DERIVADOS DE Sa-HIDROXI- Y Sa-ALCOXI-8-AMINO-

3-OXOINDOLIZIDINA-2-CARBOXILATO 2-SUSTITUIDOS

De acuerdocon el esquema9 (Apartado2.2) se abordéla ruta sintéticaB,como alternativa a la descrita en el apartado2.2.1 para la síntesisde losderivadosde 8-amino-3-oxoindolizidinas2,2-disustituidasde fórmula general

75. Cabríaesperar,en principio, que por esta segundaruta, la reacción dealquilación para introducir las cadenaslateralesde los aminoácidos,en este

caso, en los derivados malónicos lineales, transcurriera con mayorrendimiento que en el caso de la ruta A, en que se introducían en la

oxoindolizidina previamenteformada. En una segundaetapa, los 4-ceto-

diésteresportadoresde dichas cadenasdeberíanconducir, en las condicionesde hidrogenaciónhabituales,a los derivadosde 3-oxoindolizidina-2-carboxilato2-sustituidos,de manerasimilar a como ocurría en las 3-oxoindolizidinas2-monosustituidasanálogas64

Paraexplorarestasegundaruta, se preparó,con excelenterendimiento,el 4-cetodiéster94 por alquilacióndel compuesto72 con bromurode bencilo. Encontrade lo esperado,la hidrogenacióncatalíticade 94 utilizando MeOH comodisolvente(método A), no dio lugar a las correspondientes3-oxoindolizidinas2,2-disustituidasbuscadassino a una mezclade los derivadosSa-metoxi y

Sa-hidroxi sustituidos95 y 96 (Esquema19), amboscon el grupo 2-carboxflatocomo ácido libre. Efectuandoel seguimientode la hidrogenaciónpor HPLC seobservala formación exclusivadel compuesto95, mientrasqueel derivado96

se obtienepor hidrólisis de 95 durantela manipulaciónde la reacción.En elespectrode ‘H RMN registradoen DMSO-d6 de la mezclade 95 y 96 no seobservanlas señalescorrespondientesa los protonesH-8a, apareciendolos

protonesH-1 simplificados en forma de dobletes. Por otra parte, entre lasseñalesatribuibles al derivadomayoritario 95 se observaun singletea 3,01ppm, queintegrapara tresprotonesy que indica la presenciadel hemiaminalO-metilado. El espectrode ‘

3C RMN muestra señalescaracterísticasdecarbono cuaternario a 90,18 y 85,49 ppm, asignables a los carbonoshemiaminálicos0-Sade95 y 96, respectivamente1061OS~

—70-—

o

oo

o

=4 0

=4zao>

+

o>

oo

O

=4 ‘0

2:ao>

+

sio

2:

2:

o

o+

0 9o 4-.

2: •~~‘o=4Oo>

2:Oo>

o

o

+

-r

oo

o

tiOb

Ob

Ob

=4Oo>

o o~0o‘o

QN

N

2:

E

‘.5

ccl

o

o

o>

o‘O

Ob

o

½=4ao

0 oc

2-4

Con el fin de minimizar la fácil hidrólisis del compuesto95 e impedir asísu transformaciónen el derivado Sa-hidroxilado96, se trató la mezclade losdos con CH2N2, lo que dio lugar a la obtenciónde los ésteresmetílicos97 y 98,

que pudieron ser separadospor cromatografía. La asignación de laconfiguración absolutade los dos nuevoscentrosasimétricosgeneradosen elprocesode formacióndel anillo de 3-oxoindolizidina,0-2 y C-8a, se llevó a cabo

a partir de los compuestos97 y 98 por medio de experimentos de NOEbidimensional (NOESY). El compuesto98 muestraun fuerte intercambiodipolar de magnetización(NOE) entrelos protonesH-1¡3 y 11-5, por una parte,yH-1j3 y 2-CH2, por otra (Figura 9), lo que indica que el protón 11-8 y el grupo

bencilo en posición 2 se encuentrandel mismo lado de la molécula.Del mismomodo, se observaun fuerte NOE entrelos protones11-la y OH, de dondese

deducequeel protónH-8 y el grupo OH debenhallarseen disposiciónrelativatrans. En el caso del derivado 8a-metoxi sustituido 97, se observanfuertesNOEsentrelos protones H-1j3-OCH3,11-113-2-0112y H-8-OCH3,indicandoqueelprotón 11-8 y los grupos OCR3 y 2-bencilo se encuentranen disposícion

relativacia

O OCOQCH3

Ph

BocHN H BocEN H

98

Figura 9. NOEssignificativosobservadospara los compuestos97y 98.

Paraintentar explicar la formación del derivadocarboxílico 95, así como

los resultadosestereoquimicosde la ciclación, se puedenproponerdos posiblesmecanismos(Esquema20). Así, suponiendola formacióninicial del hemiami-nal A, en el que el anillo de piperidinaadoptauna conformacióntipo silla conlos grupos 2-alquilo y 3-amino en disposición relativa trans-diecuatorial,lahidrólisis del éster metílico al correspondienteácido carboxilico podría tenerlugar a través de la lactona D, mediante el desplazamientodel grupo

carboxílato por ataquedel disolvente (MeOH> 109, paradar lugar directamente

97

—72—

-c

• 01~•o o

o

z

oo

O

o

z

2:za

-c04 o

O

04

~o

z O

=4ao>

o

zo

q

zo0

oO

-c‘9 04al

o

o

2:0

—2:a

o>to

oo

O

=4 —~~0

2:ao>

L~.

N

2:

O

oo

o

=4ao>

t

o o

4-

o2:ao>

¿4o

2:ao>

al derivadoSa-metoxisustituido95. Estafisión alquil-O ocurreprobablementea

través de un mecanismo bimolecular BAL2 110-112, ya que se obtieneexclusivamenteel isómeroque procedede la inversióntotal de la configuración

del carbonoU-Sa. La lactama tricíclica D podría formarsea partir del ioniminio 0, procedentea su vez del derivado Sa-hidroxilado98, o de la másimprobable acilación intramolecularde la imina intermedia B 113,114 El

segundo mecanismo propuesto implica la formación de la espirolactonaintermediaE, que podría evolucionarhacia la lactamaD o tranformarse,porataquedel disolvente,en la metoxipiperidinaF, por medio también de unmecanismoBAL2. En este último caso, una rápida y-lactamizaciónde F a

través del éstermetílico exclusivamentedaríalugar al ácido carboxílico95. Elestereocontrolobservadoen 0-2, al obtenerseúnicamenteel isómero de

configuración 2S, podría estardeterminadopor la posibilidadde formación deenlacesde hidrógeno~ en el hemiaminalintermedioA o por la existenciadeun mecanismode tipo concertado,que implicasela formación de la lactamatricíclica D y su hidrólisis por el MeOH o bienla metanolisisde la espirolactonaE y su‘y-lactamizacióna travésdel éstermetílico.

Con el fin de comprobarla participacióndel disolventealcohólico en elcursode la reacción,se llevó a cabo la hidrogenacióndel 2-bencil-4-cetodiéster

94, utilizando EtOR como disolvente(Esquema19, métodoB). Se obtuvo asíelanálogoSa-etoxisustituido99, junto con Ja3-oxoindolizidinaSa-hidroxilada96,procedente,también en este caso, de la hidrólisis del alcoxi derivado. Eltratamientode estamezclacon CH

2N2 dio lugar a los correspondientesésteres

metílicos 100 y 98. La caracterizaciónde los compuestos99 y 100 se efectuóporcorrelaciónde susespectrosde 111 RMN y de 130 RMN conlos de los Sa-metoxiderivados95 y 97, respectivamente.

Una vez puestade manifiestola implicación del alcohol utilizado como

disolvente en esta reacción, se llevaron a cabo dos ensayos más dehidrogenacióndel 4-cetodiéster94 en disolventesno alcohólicos,concretamenteAcOEt y THF (Esquema19, método 0). La aplicación del procedimientohabitual dio lugar, en amboscasos,a un único producto de reacción, que se

identificó como la 8a-hidroxi-3-oxoindolizidina 98. La formación delhemiaminal A con dos enlacesde hidrógenointramolecularespodría explicarla estereoespecificidadobservadaen la formación de este producto. Laobtenciónde este derivado de 3-oxoindolizidinaSa-hidroxi sustituido pareceindicar que, en estecaso, la y-lactamizacióndel hemiaminalA es más rápida

que su hidrogenolisispara formar la correspondientepiperidina, y que la

—74-----

N-acilación intramolecular del hemiaminal impide la subsiguientereducción,

al menosen las condicionesde hidrogenaciónutilizadas.

Para intentar esclarecerla participación del compuesto98 como

intermedio en el procesode obtenciónde los derivados8a-alcoxi sustituidos,se

efectuóun seguimientode las correspondientesdisolucionesde 98 en MeOH yEtOH a lo largo de varios días. En estascondicionesel hidroxi derivado 98resultó completamenteestable,por lo que, de los dos mecanismospropuestos,e] quetranscurrea travésdela espirolactonaparecee] másprobable.

La hidrogenacióncatalíticade 2-bencil-4-cetodiésteresderivadosde Ornconduce,por tanto, de forma totalmenteestereoespecífica,a derivados de8-amino-3-oxoindolizidina2,2-disustituidosportadoresde un grupo hidroxilo oalcoxilo en posiciónSa.dependiendodel disolventeutilizado.

Teniendo en cuenta el alto grado de funcionalización de estoscompuestos,se considerósu posibleutilidad como intermediospara la síntesisde diferentes análogos de indolizidinas. Por una parte, se intentó ladesoxigenaciónradicálicadel derivado98 con hidruro de tributilestaño,previaesterificacióndel grupoOH conel reactivoadecuado116 (Esquema21).

O dR/DMA?, O OCH3CN 6 THF CO2Me N CO2Me

-~ ‘—Ph —Ph011

BocHN BociziN BocHN

Bu>5nH

oCO.~Me

II:: CSOPH,COCO2Me Ph + Bu3Sn

BocHN

82b, 82c

Esquema21

Con ello se pretendíaaccederpreferentementea los derivados82b u 82c,

isómeros que se habían obtenido de forma minoritaria al efectuar laalquilación directa del anillo de 2-metoxicarbonil-3-oxoindolizidina. Sin

embargo,el tratamientode 98 con cloruro de feniloxitiocarbonilo en presencia

98

75—

de DMAP no condujo a la obtencióndel producto de esterificacióndeseado,probablementedebidoa problemasde impedimentoestérico.Sin embargo,la

utilización de cloruro de metoxalilo117, menosvoluminoso, tampocodio lugaral resultadoesperado,recuperándoseel productode partida inalterado.Estehechopareceindicar que el grupo OH del hemiaminalno es lo suficientementereactivofrentea los agentesde acilaciónempleados.

Por otra parte, y ante el fracasode estos intentos, se procedió a la

utilización de métodos más drásticos de reducción. Los ensayos dehidrogenacióndel compuesto98, utilizando comocatalizadoresPd(OH»y PtO2,

resultarontambiéninfructuosos.Finalmente,la calefacióna reflujo de THF de98 en presenciade 3 equivalentesde NaBHi, (Esquema22) condujo, tras

purificación cromatográfica,a la obtenciónde dos productosde reducción,101y 102, que fueron caracterizadosa partir de sus datos analíticos y

espectroscópicos.En ambos casos se observala transformacióndel éstermetiico en el correspondientealcohol. Además,el espectrode ‘

3C RMN de 101mantiene el carbonocuaternariodel grupo hemiaminal 0-Sa (85,67 ppm).mientras que en el espectrode 130 RMN del producto minoritario 102 seobserva la desaparición de las señales correspondientesal carbonohemiaminálicoy al carbonocarbonílico 0-3, lo queindica que ha tenidolugarla reducciónde ambosgrupos.En el espectrode 111 RMN de 102,el valor de laconstantede acoplamiento~8,8a es de 10,0 Hz, indicando una disposición

relativatransentrelos protonesH-8 y Hl-Sa.

Comovía alternativapara la preparacióndel compuesto102, se ensayóla reducción del derivado de 3-oxoindolizidina 82b con NaJ3H

4 y LiAlH4

(Esquema22). Sin embargo,en estascondiciones,los compuestos82a y 82bcondujerona los derivados103 y 104, respectivamente,en los que únicamentese redujo el grupometoxicarbonilo.De manerasimilar, el tratamientodel Sa-etoxi derivado 100 con LiAlH4 a reflujo de THF dio lugar exclusivamentea la

obtencióndel productode reduccióndel éstermetílico 105.Los derivados8a-hidroxi y 8a-alcoxi sustituidosanteriormentedescritos,

pierdenfácilmente una molécula de H20 ó alcohol en presenciade medios

ácidos.Así, el tratamientodel compuesto98 con cantidadescatalíticasde TEA(Esquema23) condujoa la obtencióndel derivadoenamínico106. El espectrode‘H RMN de este producto muestra la desaparición de las señalescorrespondientesa los protones11-8 y H-Sa, mientrasque en el espectrode130 RMN seobservauna señalde carbonocuaternarioa 109,03ppm, atribuible

a los carbonos0-8 y 0-Sa11S~ Todos los intentos de hidrogenacióndel doble

—76—-

enlace enamínico, a diferentes presiones y temperaturasy con distintos

catalizadores,resultaroninfructuosos.El tratamientocon NaBH3CNen medio

ácido 119 tampococondujoal correspondientecompuestosaturado.

oN OH

PhOH

BocHN

101

OH

+

BocHN

102

NaBH4 6LiAIH4

CO2Me TIff, A

O

N Ph

“—011

BocHN

103

NaBII1 6

LIAIIbPh TElE, A

Eo cHN

OH

Ph

¶04

LIAIH4

TElE, A

BocHN

OH

Ph

105

Esquema22

O

N CO2Me

01-1BocHN

98

O

El’ N CO2MQCH2CI2 Ph

BoefiN

106

Esquema23

OCO2Me

BocHN

Ph

NaBH4

lEE, A

98

Bo cHN

82a

BocHN

82b

O

“—Ph

BocHNOEt

100

—77-—

2.2.5, MODELIZACIÓN MOLECULAR DE DERIVADOS DE S-AMINO-3-OXOINDO-LIZIDINA-2-CARBOXILATO. ANÁLISIS CONFORMACIONAL MEDIANTE

DINÁMICA MOLECULAR

Puestoquelas 3-oxoindolízidinasaquídescritassepuedenrelacionarconotras lactamasbicíclicas capacesde mimetizar giros 13 4756, se consideródeinterés efectuarel análisis conformacionalde estosderivadoscon el fin de

conocer su capacidad para inducir conformaciones plegadas y, másconcretamente,conformacionesde giro 13.

Estructuralmentelos giros 13 puedendefinirse comopseudociclosde diez

eslabones,estabilizadospor un puentede hidrógenointramolecularentre elgrupo carbonilo del primer residuo y el NR del cuarto, y para los que ladistanciactC1-cC4es=7 A (Figura 10) 120,121 Por otra parte,el tipo específico

de giro 13 se clasifica de acuerdoconlos ángulosdetorsión b y ‘-Y de los residuos2 y 3 delesqueletopeptídico.

R2 ~,

UN’

11’ H>4uCj

fiN-tcrniinal

0

jiC-termiral

dac1-rC4=7A

Tipo ‘½ ‘Vg

—60 —30 —90 0

60 30 90 0

—60 120 80 0

60 —120 —80 0

—60 —30 —60 —so

iii- 60 60 30

Figura 10. Estructurageneralde los giros ¡3 y principalestipos.

—78—

H3C

Parallevar a cabo el estudioconformacionalse eligieron como modelossencilloslos derivadosde 3-oxoindolizidinaA, B y C, en los que los grupos

N-acetiloy N-metilcarboxamidaconstituyenuna simplificación usual de losresiduos1 y 4 de los giros 13. Por otraparte, la estereoquímicade los diferentes

centrosasimétricosse correspondecon la de aquellosisómerosquese obtienentras alquilación en C-2 del esqueletobásico de 2-metoxicarbonil-3-oxo-indolizidina.

O o oN H N H

oHN H HYL. HN PIN~ HN Fi HN~ CH3

CTSH3C

A B C

Las estructuras iniciales de los compuestosmodelos A, B y C, seconstruyeron utilizando distancias y ángulos estándar incluidos en elprogramaInsightll 122• Estasgeometrías,una vez optimizadascon el campo

de fuerza de segundageneracióncvff9l 123, se utilizaron como punto inicialpara el minucioso análisisconformacionalllevado a cabo con cadauna de lasmoléculas.

La metodologíautilizada para el análisis conformacionalha usadolas

técnicasde dinámicamoleculara alta temperaturay posteriorminimización.El uso de la dinámicamolecularestábasadoen la ideade queel aumentode laenergíade la molécula,por asignacióna cadaátomo de velocidadesal azar,

puedeser llevado a cabo de tal forma que le permita superarlas barrerasenergéticasexistentesentre los diferentesmínimos, siguiendolas leyes deNewton. La posterior minimización de las estructurasobtenidaspor estemétodoproporcionaunaidea de los diferentesmínimos accesiblesparadichamolécula.

La efectividadde estametodologíaparaexplorar el espacioconforma-cional en función de la temperaturautilizada en la dinámicamolecularhasido estudiadapor Kollman 124, aplicándola al éter 18-corona-6.En estetrabajo se llega a la conclusiónde que cuando las simulacionesse llevan acaboentre 700 y 800 1< se encuentraun númeromayorde conformacionesdemínima energíaque a temperaturasmás altas o más bajas. Con e] fin de

—79—

comprobarsi éstees un principio generalpara todo tipo de compuestoso si

solamentees aplicableal compuestoestudiadopor Kollman, se realizarontresdinámicasmolecularesa 750 K para cada uno de los compuestosantesmencionados. La primera dinámica utilizó como estructura inicial la

comentadaanteriormente, la segunda,aquélla de mínima energíade laprimera dinámicay la tercera,la estructurade menor energíano encontradaen la primera dinámica.Asimismo, se efectuarontres dinámicaspara cadacompuestoa 1500 K utilizando las mismasestructurasinicialesquea 750 K.

Las condicionesexactasen que se ha realizadoesteestudiosuponenunprimer paso de calentamientoprogresivo, en el que se fue elevando latemperaturade las moléculas5 K cada0,15 Ps (10 K para las dinámicasa1500 K) hastallegar a la temperaturadeseada.Esteprocesofue seguidode

20 Ps de estabilizacióncon el fin de que la energíacinética se distribuyerauniformementeen la molécula. Por ultimo, se llevaron a cabo 75 Ps desimulación, durante los que se almacenaron300 estructurasa intervalosregularesde tiempo. Cadauna de estasestructurasse optimizó aplicandoel

campode fuerzacvIIiYl durante500 ciclos del métodode minimizaciónSteepestDecent, con el fin de eliminar las interaccionesmás importantesen lasmoléculasy, posteriormente,durante los ciclos necesariosdel método deminimizaciónConjugateGradientshastaque el gradientealcanzaseun valormenor de 0,001.Los mínimos así obtenidosse compararonentre sí con el fin

de eliminar aquéllosque se encontrabanrepetidos.Los mínimos encontradosen cada una de las dinámicasefectuadasa

750 K y a 1500 K se encuentranrecogidosen la tabla 7. El número total demínimos obtenidos,considerandoconjuntamentelas dinámicasa 750 K y a

1500 K, fue de 93 para el compuestoA, 76 paraB y 88 paraC. Dado el elevadonúmero de mínimos, y aunque todos ellos fueron estudiados,para lapresentación de los resultados se consideraronúnicamente los veintemínimosde menorenergía,tal y como serecogeen las tablas8-10.

En primer lugar, se observaque en estructurascon pocos grados delibertad, como las estudiadasen este caso, la probabilidadde encontrarelmínimo absoluto es mayor que la de encontrarotros mínimos.Así, en todaslas dinámicasse ha llegado al mínimo absoluto, cualquiera que fuese laestructurade partida. En cuantoa la distribuciónde mínimos,se observaqueen las dinámicas a 750 K, la mayoría de las conformacionesobtenidascorrespondena aquéllasde másbaja energía,mientrasque otros confórmerossólo aparecencuandose utilizan temperaturasmásaltas(1500K). Ademas,se

—80—

compruebaque las dinámicasa 1500 K proporcionan,independientementede

la estructurade partida, un númeromayor de confórmerosde baja energía

quelas dinámicasa 750 K, en contrade lo expuestopor Kollman parael éter1S-corona-6124 La mayor desventajade la utilización de temperaturaselevadases la facilidad con que se producela isomerizaciónde los enlaces

peptídicosa disposicionescis, poco habitualesexperimentalmente.Estaisomerizaciónno seobservacuandola dinámicase efectúaa 750 1<.

Tabla 7. Mínimos encontradosen las diferentesdinámicasmoleculares

llevadasa cabocon lasestructurasA, E y C

Temperatura Estructura

Número de mínimos

1’. Dinámica 2’. Dinámica 3’. Dinámica

750K A 20 15(22) 24(27)E 15 21 (22) 13 (22)C 14 15(16) 13(17)

1500K A 49 62(72) 72(92>8 51 49(65) 55(75)C 65 34(74) 62(87)

Los númerosentreparéntesisindicanel númerototal de mínimosteniendoen cuentalasdinámicasantenores.

Como ya se ha indicado, para cualquier tipo de giro 13 la distancia

czCí-aC4 debe ser inferior o igual a 7 A y, por lo tanto, éste es un primer

parámetroa tener en cuentapara determinar la presenciade este tipo degiros. Así, de los veinte mínimos de bajaenergíaobtenidospara la estructuraA, únicamentelos confórmerosA4, AS y Ah presentaronvaloresde dctC1-uC4inferiores a 7 A (Tabla 8), lo que indica una tendenciamoderadade este

derivado a adoptar conformaciones plegadas. En el caso de la 3-oxoindolizidina B, se observa la formación prácticamenteexclusiva deconformacionesextendidas,ya que en el único confórmerocon distanciactC1-

ctC4 inferior a 7 Á, BiS, uno de los enlacesamidaestáen disposicióncis (Tabla9). En todos los confórmerosencontradospara las estructurasA y B, el anillode piperidina adoptauna conformaciónde tipo silla con disposición trans-

diecuatorialde los sustituyentesen posiciones8 y 8a.

— si —

Tabla 8. Confórrnerosde mínima energíaobtenidosparala estructuraA en funcidn de la

dinámicallevadaa caboy distancia ctCí-c104paracadauno de ellos

EnergíaConf. (Kcal/inol)

doCí-aC4(A)

Dinámicas(750 K)Total750K

Dinámicas(1500K)Total1500K1 2 3 1 2 3

x x x x x x x

Lx Lx Lx Lx Lx Lx Lx x

Lx Y Lx Lx Lx Lx Lx Y

Lx Lx Lx Lx Lx Lx Lx Lx


Lx Lx Lx Lx Lx Lx Y Lx



Y Lx Lx Lx Lx Lx Lx Lx

Lx Lx Lx Lx Lx Lx

Lx Lx Lx Lx Lx

Lx Lx

Lx Lx

Lx Lx Lx Lx Lx

Y Lx Lx Lx

Lx Lx Lx Lx Lx Lx

Y Y Lx Lx Lx Lx Y

Lx Lx Lx Lx

Lx Lx

Lx Lx

Lx Lx Lx

Lx

Lx

Lx Lx Lx Lx

Lx Lx Lx Lx Lx Lx Lx

Por otra parte, la obtención de doce confórmeros,

absoluto,con daC1-cxC4dentrodel valor establecido(Tabla

incluido el mínimo

10), esindicativo de

la gran preferenciade la estructuraC por adoptarconformacionesplegadas.

Tambiénen estecaso, el anillo de piperidina de la 3-oxoindolizidina adopta

conformacionestipo silla. Sin embargo,los sustituyentesen posiciones8 y Sa

adoptanexclusivamentedisposicionesaxial y ecuatorial, respectivamente.La

visualización de los doce mínimos de conformación plegadaindicó que los

confórmerosCl, C2, ClO y C17 presentanun puentede hidrógeno entre el

Al

A2

ASA4

AS

A6

A7A8

A9

AlO

Ah

A12

A13

A14

A15

A16

Al?

A18

A19

A20

--29,28

—27,91

—27,89

—27,80

—27,72

—27,33

—27,31

—27,25

—26,68

—26,39

—25,85

—23,86

—23,13

—23,07

—23.06

—22,98

—22,91

—22,87

—22,83

—22,72

8,10

‘7,44

9,85

6,04

6,92

9,49

9,26

8,54

10,04

8,99

6,06

9,63

9,37

8,98

7,82

8,96

7,26

8,26

8,91

9,94

Lx Lx

Lx

Lx

Lx

Lx

Lx

—82—

S-NH y el grupo carbonilo de la posición 2, es decir, entre el NR

correspondienteal segundoresiduoy el CO del tercero, incompatible con lasconformacionesde tipo giro 13. Por otra parte,en los confórmerosCS, C13 y

CiS, uno de los dos enlacesamida estáen forma cts, manteniendoen los dos

primeros casosel puentede hidrógenoanteriormenteseñalado.Finalmente,

los mínimos C5, C9, C12, C16 y C20 son los queposeena priori disposicionesespacialesde los sustituyentesen posiciones2 y 5 próximas a las esperadas

para las conformacionesde tipo giro 13.

Tabla9. Confórmerosde mínima energíaobtenidosparala estructuraE en función de la

dinámicallevada a caboy distancia~C1-aC4 para cadauno de ellos

Conf.

Energía(KcalImol)

daCl-uC4

(A>

Dinámicas (750 K)Total

750K

Dinámicas(1500 K)Total

1500K1 2 3 1 2 3

81 —28,55 9,10 x Lx Lx x x Lx Lx Lx

82 —28,31 8,74 X Lx Lx Lx Lx Lx X

83 —27,88 9,61 x x Lx x Lx Lx Lx X

84 —27,75 8,55 Lx Lx Lx Lx Lx Lx Lx X

85 —27,49 9,77 x x x Lx

86 —27,43 7,97 x x Lx Lx Lx Lx

B7 —27.30 9,35 x x x Lx Lx Lx Lx

88 27,oo 9,07 Lx x x Lx Lx Lx Lx

B9 —26,88 9,49 Lx Lx Lx Lx Lx Lx Lx Lx

BlO —26,36 9,57 Lx Lx Lx Lx Lx Lx Lx Lx

811 —24,36 9.24 Lx Lx Lx Lx Lx Lx Lx Lx

812 —24,21 8,80 Lx Lx Lx Lx Lx Lx Lx

BiS —23,87 9,71 Lx X Lx Lx Lx Lx Lx Lx

814 —23,09 7,62 Lx Lx Lx Lx

815 —23,05 6,02 Lx Lx Y Lx

816 —23,03 8,15 x x x x x x x

817 —22,99 896 x Lx x Lx

818 —22,81 7,47 Lx Lx Lx Lx

819 —22,77 7,22 Lx x Lx

820 —22,61 9,09 x x x

—83—

Tabla 10. Confórmerosde mínima energíaobtenidosparala estructuraC en función de la

dinámica llevadaa caboy distanciaaCí-cxC4para cadauno de eííos

Energía

Conf (Kcal/mol)

dcíCí-cxC4

(Á)

Dinámicas(750 K>

1 2 3

Dinámicas(1500 1<)Total750K 1 2 3

X Lx Lx Lx Y Lx Y X

Lx Lx Lx Y X Lx Lx Lx

Y Lx Y Y Lx Lx Lx Lx

Y Lx Lx Lx Y Lx Y Lx

Y Y

Lx Lx Y Y Lx

Y Lx Lx Lx Lx

Y

Lx Lx

Lx Lx

Y

Lx Lx Y

Lx Y Lx

Y Y Y

Y Y

Lx Y Y Y Lx

Y Lx Lx Lx Y

Lx Y Y Y

Y

Y

Y

Lx

Lx

Lx Y

Y Y Lx Lx Lx Lx Y Y

Lx Y Y Lx

Lx

Lx Lx

Y

Y X Lx Lx

Lx Lx

Y Y Y Lx

Y Y

En la figura 11 se muestran de forma gráfica las dos clases de

conformacionesplegadasobtenidasparael derivadode 3-oxoindolizidina C, elconfórmeroCl, como representantede las estructurascon un puente dehidrógenoentrelos gruposS-NH y 2-CO, y el mínimo C5, comoejemplode las

conformacionesque poseenun puentede hidrógenoentreel grupo carbonilodel primerresiduoy el NH del cuartoresiduo,característicode los giros 13.

Tott<l

1500K

Cl

C2

Ca

C4

C5

C6

C7

C8

C9

Cío

Cli

CI.2

C13C14

Cis

C16

C17

C18

C19

C20

—35,98

—33,54

—33,08

—32,88

—32,02

—32,01

—31,99

—31,97

—30,72

—30,66

—30,43

—30,36

—30,12

—29,78

—29,48

—29,47

—29,28

—29,14

—29,05

—28,75

4,98

4,32

7,83

8,57

4,81

7,94

8,66

6,26

4,05

5,56

9,66

3,77

6,12

9,36

7,38

3,65

6,72

5,74

10,10

4,66

—84—

Cl C5

Figura 11. Conformacionesplegadasdel derivadode 3-oxoindolizidinaC:

Cl (8-NH--2-CO~y C5 (giro ¡3 tipo It.

Los mínimos encontradospara las tres estructuras estudiadassecompararon con diferentestipos de giros 13, construidosa partir del derivado

dipeptídicoAc-Ala-Ala-NHCH3, utilizando ángulosestándar120,121 Para ello

se efectuóla superposiciónde los diez átomosquedefinenel esqueletopeptídicocon sus análogos en los derivados de 3-oxoindolizidina, señaladosen trazo

grueso.

CH:3 N— CH3Fi

FiN H1» o FiN4

H:3C

En la tabla 11 se recogen los valores de rms (root mean square)

encontradosen estassuperposicionespara los confórmerosplegadosde losderivadosA, B y C. Los mínimoscon conformacionesextendidas,no reflejadosen la tabla,presentanen todoslos casosvaloresde rms muy superiores,como

era de esperar.A la vista de los datosde la tabla se puedededucir que losvaloresmásbajosde rms para los confórmerosA4, A5 y Ah se obtienenporsuperposicióncon los giros 13 idealesde tipos 1 y III, tal y como se puede

FiN

YO

Hg

—85—

apreciaren la figura 12. Para los mínimos de conformaciónp]egadade laestructuraC, los mejoresvaloresde rms se obtienencon los giros 13 de tipos 1’

y II, con preferenciapor esteúltimo. Así, la superposicióndel confórmeroC5con estos giros 13 (Figura 13) muestrauna mejor correlación, tanto de los

átomosdel esqueletopeptídicocomo de la cadenalateral del tercerresiduo,enel casodel giro 13 detipo II queen el de tipo It

Tabla 11. Valoresde rms obtenidospor superposiciónde los confórmerosplegados

de los derivadosde 3-oxoindolizidinaA, B y O con diferentestipos de giros I~

rms (A)

Confórmero

A4

AS

Ah

815

Cl

dcxCí-cÉC4(A)

6,04

6,92

6,06

6,02

4,98

02 4,32

05 481

C8 6 26

1

0,66

0,82

0,53

0,87

0,87

1,15

0,82

0.96

1•

1,11

1,40

1,20

1,13

0,91

0,69

0,52

1,18

II

0,84

1,06

0,82

0,90

0,72

0,82

0,48

0,99

117 III III’

0,72

0,99

0,70

0,87

0,85

0,96

0,57

1,06

0,64

0,73

0,47

0,84

0,99

1,31

0,97

0,97

1,21

1,43

1,29

1,16

1,02

0,81

0,71

1,23

1,20 0,88

1,33

1,14

1,12

0,98

1,54

0,75

0,83

093

1.03

0.82

1,31 0,82

1.03 0,65

Ce 4,05

CíO

012

013

5,56

377

6 12

016

017

3,65

1,04

1,23

0,94

1,05

0,77

1,49

1,23

0,88

018

6,72

0,69

0,72

0,66

0,91

0,85

0,92

0,79

0,45

0,80

0,86

0,56

0,82

0,60

1,13

0,87

0,51020

5,74

0,85

0,95

0,76

0,91

0,78

1,21

0,97

0,604,66

—86—

a

Figura 12. Superposicióndel confórmeroAh Cinea continua)congiros /3 idealesde tipo 1 (a) y III (b).

a

Figura 13. Superposicióndel confórmeroC5 (líneacontinua)

congiros ¡3 idealesde tipo II (a) y 1’ (b).

En resumen,los derivadosde 3-oxoindolizidina A y B, con disposición

trans entre los sustituyentes en posiciones 8 y Sa, presentan capacidadmoderaday nula, respectivamente,para inducir conformacionesde tipo

b

-N

b

—87—

giro 13. Únicamenteun pequeñoporcentajede confórmerosde la estructuraA

se asemejaa los giros 13 idealesde tipos 1 y III. Por el contrario, el isómero8,Sa-cis, C, mostró una gran tendencia a adoptar dos clases de

conformacionesplegadas.Una primera claseoriginada por la formación deun puentede hidrógenointramolecularentrelos grupos 8-NH y 2-CO, y unasegunda constituida por la adopción de conformaciones de giro 13.especialmentede tipo II. Por tanto,estosresultadosindican queel esqueletode(2S,SS,8aS)-8-amino-3-oxoindolizidina-2-carboxilatose puedeconsiderarcomoun nuevomimético de esteúltimo tipo de giros 13.

—88-—

2.3. ANALOGOS CONFORMACIONALMENTE RESTRLNGIIX)SDE COLECISTOQUININA Y NEUROTENSINA

Una vez puestasa punto las vías sintéticasque permitenel accesoa los

esqueletosfundamentalesde 2,5-dicetopiperidinay 3-oxoindolizidina,se explorósu aplicacióna la preparaciónde análogosconformacionalmenterestringidosdepéptidos de interés biológico. La colaboraciónque nuestro grupo de trabajomantienecon el Departamentode Farmacologíade la Facultadde Medicinade la

Universidadde Navarray con la empresadanesaNovo Nordisk A/S, interesadosen el estudiode Colecistoouinina(CCK) y Neurotensina(NT), respectivamente,decantaronnuestraelecciónhacia estosneuropéptidos.Por otra parte, el hechode que los fragmentosmínimosactivosparaestospéptidosesténconstituidosporun númeroreducidode residuosde aminoácidos,podría facilitar, en principio, lapreparaciónde los correspondientesanálogosrestringidos.

2.3.1. ANÁLOGOS CONTORMACIONALMENTE RESTRINGIDOSDE CCK

La CCK es una hormona peptídica ampliamente distribuida en el tracto

gastrointestinal y en el sistema nervioso central 125 A nivel periférico, la CCKestimula la contracción de la vesícula biliar, la secreción pancreáticay la

motilidad gastrointestinal.En el sistemanervioso central, dondeactúa comoneuromoduladory/o neurotransmisor,la CCK induce hipotermia,analgesiayestimula la liberación de las hormonasde la pituitaria, entre otros efectos.Porotra parte, Ja colocalización de la CCK en el cerebro con Dopamina (DA),

Serotonina(5-HT), Encefalinas,GABA y aminoácidosexcitatorios,pareceindicarque esteneuropéptidopodríaestarinvolucradoen la modulaciónde las acciones

de estos neurotransmisores126-130~ Se ha demostradotambiénque tanto laadministracióncentral como periféricade CCK producesaciedad,sin que, por elmomento,estéclaro el mecanismoa travésdel cual ejerceesteefecto.

La CCK se ha aislado en varias formas moleculares,denominadas

CCK5g, CCK39, CCK33, CCK8 y CCÑ, provenientesdel procesamientode unprecursorcomún. La CCK33, CCK8 y CCIQ sonlas formas predominantesa nivel

periférico, mientrasque en el cerebrose encuentraprincipalmenteel octapéptidoC-terminal,CCK8 125~

H-Asp-Tyr(SO3EI)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2

CCK8

89—

Las actividades biológicas de la CCK estánmediadaspor dos tiposdiferentes de receptores, los receptores centrales CCKB, ampliamentedistribuidos en el cerebroy los receptoresperiféricos CCKA, distribuidos en los

órganosperiféricos, aunquetambién estánpresentesen algunasregionesdel

cerebro 131~ Sin embargo,la participaciónconcretade uno u otro tipo de receptor

en las respuestas farmacológicas inducidas por la CCK mencionadasanteriormente, todavía no ha sido completamenteelucidadao es materia de

controversia.Teniendoen cuentael rangode actividadesbiológicas de la CCK, la

disponibilidad de agonistas y antagonistaspotentes, altamente selectivos,

metabólicamenteestablesy con propiedadesfarmacocinéticasadecuadas,podría

teneruna clara aplicación parael desarro]lode nuevosfármacos132•

La aplicación de la estrategia general de diseño racional depeptidomiméticos,comentadaen la introducción, y en la que se han utilizado

comopuntosde partida la CCK7, fragmentomínimo activo a nivel periférico, y la

CCÑ, H-Trp-Met-Asp-Phe-NH2,estructuramínima necesariapara la activación

de los receptoresCCKB, ha dado lugar a la preparaciónde agonistasy

antagonistaspotentesy selectivos, aunque la mayoríaconservangran parte delcarácter peptídico inicial 132443 Por otra parte, la optimización, mediante

estudios de relacionesestructura-actividad,de compuestossurgidosa través del

muestreo al azar ha conducido a antagonistas de gran interés, como losderivadosbenzodiazepínicos2 y 3 ya comentados14,15•

Dentro de los agonistas basadosen la estructurade la CCÑ cabedestacarel compuesto A-71623 (107), agonista selectivo de los receptoresCCKA con

propiedadesanoréxicas similares a las inducidas por la CCK8 144,145 y los

derivados conformacionalmenterestringidos 108, agonistas selectivosde losreceptoresCCKB 146~

H ON~k

Boc-Trp Asp-(N-Me)Phe-NH2o

N Asp-Phe.-NH2

Fi ~ FiN OHN4N Fi o

O x = ii-Fr, n-Bu, ‘Bu

107 108

—90—

Por otra parte, los derivados 109, 110 y 111 constituyen ejemplosrepresentativosde antagonistasselectivos de los receptores CCKB 147152,

desarrolladostomandocomo modelo la secuenciapeptídicade la CCIQ, mientras

que el análogo tripeptídico 112 muestra propiedadesantagonistasa nivelperiférico~5g.

o

~ Ml

CH2 FiNu o

109

oL

A’ Leu-Asp-NH2

1 NH

olCl

111

Asp-Phe-NH2N

OBoc-Trp

110

H OBoc-Tr< 2¼

o

N OH

112

Tomandocomo antecedenteslos estudiosconocidossobre la importancia

de las cadenaslaterales de los aminoácidosque integran la secuenciade la

CCK4 132, los estudios conformacionalesque indican la existencia deconformacionesplegadaspara el tetrapéptidoC-terminalde la CCK 154,155y losejemplosanteriormenteexpuestos,sehandiseñadola seriede análogosde CCÑ

56, 113, 114 y 115, que incorporananillos de 2,5-dicetopiperidinay 3-oxoindolizi-dina adecuadamentesustituidos.

En los derivados56 y 114 seha reemplazadoel fragmentoMet-Asp por losesqueletosheterocíclicosseñalados,mientras que en los análogos 113 y 115únicamentese ha eliminado el residuo de Met, menos importante para laactividad, manteniendola cadenalateral ácida del Asp, cuya contribucióna la

actividadde la CCK esmásacusada.

—91—

Teniendoen cuentaque la presenciay disposiciónespacialrelativa de lascadenaslateralesaromáticasde los residuosde Trp y Phejueganun papel muyimportante en el reconocimiento de los receptoresde CCK, en todos loscompuestosdiseñadosse han incorporadodichas cadenaslaterales.Además,laintroducciónde restriccionesconformacionalesa distintos niveles podría ser deutilidad para intentar establecerlos requisitostridimensionalesde las cadenaslateralespresentesen estosderivados.

Boc-TÉp-HN’

o

O

Ph

COR

o

Fi o

113

B oc-Trp-HN

114 R=OCH3,NFI2

o

C02Fi

Phe-N112

CO?

Phe-NH2

115

2.3.1.1. Análogosde CCK4 derivadosde 2,5-dicetopiperidinas

La síntesisde los compuestos56a y 56b, en los que el anillo de 2,5-diceto-

piperidina reemplaza al fragmento dipeptídico Met-Asp y que incorporan

restriccionesconformacionalestanto de la cadenalateral del Trp como de la Phe,está descrita en el capítulo 2.1.2. Estos compuestos fueron ensayados

farmacológicamenteen forma de éstermetflico, ya que los intentos de obtenerlasamidas correspondientes,por tratamiento con NH3/MeOH, dieron lugar amezclascomplejasde reacción.

In

O

Ph

CO2Me

IpPh

FiNCO2Me

o

561,

Fi

56

CO2Me

HN

o

56a

92—

Para abordar la preparación de los derivados 113 se llevó a cabo,

inicialmente, la secuenciade reaccionesindicadas en el esquema 24. La

formacióndel enlacepeptidico,por el métododel ésteractivo N-hidroxisuccinimí-dico 156, entreel derivadocarboxílico ll6ab, obtenido previamentepor hidrólisisselectivadel éstermetílico de 5Sab, y H-Phe-NH2, condujoal compuestoll7ab.

Estederivado se obtuvo como unamezclade dos diastereoisómerosen proporción

2:1, similar a la del productodepartida 5Sab.En el espectrode ‘H RMN de ll7abse observaque el protón 1-1-6 del isómeromayoritarioaparececonsiderablementeapantallado con respecto al mismo protón del isómero minoritario(Ab = 1,57 ppm). Esta diferencia de desplazamientoquímico indica que, en el

isómeromayoritario, el protón H-6 y el anillo aromáticodel residuo de Phe seencuentranen disposición relativacts y que, por tanto, la configuraciónabsoluta

de esteisómeroes(3R.6S).La saponificacióndel compuestoll7ab, no condujo al derivado ll3ab

esperado,sino que dio lugar a una mezclacompleja de reacción,probablementedebido a la epimerización de alguno de los centros quirales durante eltratamientoprolongadocon NaOH.

o o

In CO2EI 1)NaOH/MeOl-1 lo CO2Et

UN 2)HCI UNCO2Me C02Fi

o o

SSab ll6abalb =2:1

1) HO5uiDCC

j2) H-Pbc-NH2

O o

CO~EtIn C02FiHN FiN

Phe-NH2 Phe-NFi2o o o o

ll3ab 11 7ab

a/li 2:1

Esquema24

Paraevitar esteinconveniente,se preparóel derivadode 2,5-dicetopiperi-

dina ll9ab (Esquema25), en e] que la cadenalateral del Asp estáprotegidaen

—93——

forma de éster terc-butílico, lo que permite realizar la desprotecciónfinal enmedio ácido. A partir de ll9ab, y siguiendouna secuenciade reaccionessimilar ala indicadaparala obtencióndc ll7ab, sesintetizó el derivadotripeptídicol2lab,constituido por una mezcla de dos diastereoisómerosen proporción 3:1, que

fueron separadospor cromatografía.La asignaciónde la configuraciónabsolutade los derivados121ay 121b como (3R.6S)y (SS,6S),respectivamente,se efectuósiguiendoel mismorazonamientoque paralos análogosetil sustituidosll7ab.

o CQMe

o CO2Me NaO\IcJBrCH2CO2tBu lo CO

2tBu

In CO2Me ZUN CO2MO

ZHN 11838

H2/Pd-CI MeOH

O O

In VNaOU/MeOH lo CO~Bu

FiN 2)HCI FiNC02Fi C 02M e

O O

l2Oab ll9abafh = 2:1

I 1) HO5uflCC

2) H-Phc-NH2

O O

In In CO2~Bu+

UNPhe-NFi2

o o

121a 121b

jTFA/CHSCI2 {TFA/cH2C]2

O O

In CO» In~.AJ,fl

FiN ¼>~~~PbNH UN Phe-NH2

O O o O

liSa 113b

Esquema25

FiNCO2tBU

O o

—94—

Finalmente, la eliminación del grupoterc-butilo por tratamiento con TFA

dio lugar a los análogosde CCÑ buscados113a y 113b, en los que la restricción

conformacionalse centraen las cadenaslateralesdel Trp y del Asp.La capacidadde unión a los receptoresCCKA y CCKB de los derivadosque

incorporan2,5-dicetopiperidinas56a,5Gb, 113ay 113b, fue evaluadaen homoge-neizadosde páncreasy cortezacerebralde rata,utilizando [3H]-propionil-CCKg

como marcador157 (Tabla 12). A efectoscomparativos,en la tabla se incluyentambiénlos datos correspondientesa la CCKg, Boc-CCIQ y a los antagonistas

centrales3 y 109.

Tabla 12.Afinidadespor los receptoresCCKÁ y CCKB

de los derivadosde 2,5-dicetopiperidinas

O

1In R

UN

Oo

1C50a CM)

Páncreas CerebroCompuesto Config. C-3 (CCKA) (CCKB)

56a Ph OMe S 6,7 >10

56b Ph OMe E 88,0 > 10

liSa CO2H L-Pbe-NH2 R >100 > 10

llSb C0211 L-Phe-NH2 S 50,0 > 10

CCKs 0,0006 0,006B

Boc-CCÑ 1,8 0,025

3 0,8 0,05

109 1,7 0,01

aEl valor de 1C50 representa la concentración capaz de produciruna inhibición del 50% de la unión específicadMa [

3H]-propionil-CCK8 a los receptores de CCK. Los valoresindicadoscorresponden a la mediade los

obtenidos entresexperimentos separados.b valores publicados en la referencia 151.

—95——

Los valores reflejados en la tabla indican que los análogosde CCK4

derivadosde 2,5-dicetopiperidinaspresentanentresí distinta afinidad por losreceptoresperiféricos,que puedecalificarse desdemoderadaa nula, careciendode afinidad hacia los receptoresCCKB a concentracionesinferiores a IO~ M. Elcompuestomás efectivo frente a los receptoresCCKA, 56a, mostró afinidadmicromolar, del mismo orden que la Boc-CCIQ. Si se comparanlos resultados

obtenidoscon los diastereoisómeros56ay 5Gb, se deduceque la disposiciónvisentrelas cadenaslateralesaromáticasen posiciones3 y 6 del anillo de 2,5-diceto-piperidina, favorecela unión a los receptoresCCKA. Observaciónsimilar resulta

de compararlos datosobtenidosparala parejade diastereoisómeros113ay lISb,en los que las cadenaslateralesde Trp y Phese encuentranen disposicionestrans y cis, respectivamente.En estos últimos derivados, la presenciade la

cadenalateral del Asp no contribuyea mejorar los valores de afinidad,posible-mente debido a una disposiciónespacialinadecuada,tanto de la mencionadacadenalateralcomo del grupo fenilo del residuode Phe.

Por otra parte, ninguno de los compuestosde esta serie fue capaz deinhibir la liberación de amilasa de los acinos pancreáticosinducida por laCCKs 158, un ensayofuncional que da idea de la capacidadde los derivados

evaluadosparaactuarcomo antagonistasperiféricos.Finalmente, las 2,5-dicetopiperidinassintetizadas se ensayaron en

preparacionesde músculo longitudinal-plexoruientérico de íleon de cobaya130

En estetipo de ensayola CCK8 produceun efectocontráctil por estimulacióndelos receptoresCCKA, mientrasque la CCK4 contrae el íleon a través de la

activación de los receptoresCCKB. Estascontraccionespuedenser inhibidaspor

antagonistasselectivosparauno u otro tipo de receptory, por lo tanto, el ensayosepuedeutilizar para evaluarla capacidadantagonistaperiférica o central de uncompuestodado. Los porcentajesde inhibición obtenidosparalos compuestosSOa,56b, 113a y 113b, en la contracción del íleon inducida por CCK8 ó CCK~ se recogen

en la tabla 13.

Del análisisde estosdatoshay quedestacarqueno existe unacorrelaciónclara entrelos ensayosde unión al receptory los de inhibición de la contracción

del íleon. Estehecho podríaatribuirsea posiblesdiferenciasentrelos receptoresde distintas especies,ratay cobaya.Además,en el casode los receptoresCCKB,

no existe unaevidenciamolecularconcluyentede la identidadde estosreceptoresen la periferia y en el cerebro. En cualquier caso,ninguno de los derivados

ensayadospresentaactividadantagonistasignificativa.

—96

Tabla 13. Inhibición de la contraccióninducidapor la CCK

en plexo mientéricode cobaya

Compuesto

(10-aM)

% de inhibición

CCKs (10~M) CCK4 (í0-~ M)

56a 186 + 5,7 278 + 7,4

56b +165 + 8,0 a ~ + 66~

liSa 210 + 7,5 ±320 + 19,98

113b 114 + 7,5 -*556 + 223a

3 851±2,7 100

109 604± 4,8 797 + 14,0

a El signo + indica potenciación en vezde inhibición.

2.3.1.2. Análogosde CCKg portadores del esqueletode3-oxoindolizidina

Parala preparaciónde las seriesde análogosde CCK4 representadospor

las fórmulas generales114 y 115 se eligieron como productosde partida los de-rivados de 3-oxoindolizidina 2,2-disustituidos75 (Esquema26). La disponibilidad

O

114

OR N

CONHQ ~2zt CO2Me

BocUN

75 R = CH2Ph,CH2CO2Et

1?O

N R

Phe-NH2O

115 R = CH2CO2IHI

Esquema26

Boc-Trp-HN

1? = CH2Ph

Boc-Trp-HN

—97—

de diferentesisómerosen el carbonoasimétrico0-2, junto con la posibilidad de

acoplar un resto de Trp de configuración L o D con el grupo NWS, permitiría la

obtención de derivadoscon diferentes disposiciones espacialesde las cadenas

aromáticas del Trp y de la Phe. Con ello se pretende profundizar en elconocimiento de los requisitos tridimensionalesde estas cadenaslateralesaromáticasnecesariosparala unión a los receptoresCCKA y/o CCKB y paralasactividadesbiológicasmediadaspor dichosreceptores.

Segúnseindica en los esquemas27 y 28, la obtenciónde los derivados122,123, 126y 127 sellevó a cabopor tratamientoconTEA delas 3-oxoindollizidinas82a

y 82b y posteriorformacióndel enlacepeptídicoconBoc-L-Trp ó Boc-D-Trp. Debidoa la falta de enantioespecificidadcon que se forman las 3-oxoindolizidinasdepartida, estos triptofil derivadosse obtienencomo mezclasde dos diastercoisó-merosen las proporcionesindicadasen la tabla 14.

Tabla 14. Proporciónde diastereoisómerosen los derivados

de 3-oxoundolizidinade fórmula general

O

N Ph

E

Boc-Xaa-HN

Compuesto Xaa E

Configuración2,8,8aProporción de

diastereoisómerosa/b aa b

122ab L-Trp CO2Me RSE SRS 10:1

124ab L-Trp CONH2 SSE RES 10:1

l2Sab D-Trp CO2Me RSE SRS 10:1

l2Sab fl-Trp CONH2 SS!? RRS 10:1

l2Gab L-Trp CO2Me SSE RES 4:1

128ab L-Trp CONH2 RSE SRS 4:1

127ab D-Trp CO2Me SSE RRS 3:1

129ab L-Trp CONH2 ESE SRS 3:1

Determinadapor HPLC.

—98—

z~

03

uo

.0z

-4—

.,Izoo

++

0-4Zoo

o

zz4-4

0-4Zao

o

z

2:

oo

oo3

o

o

z

+oo

o

z

2:oo

o

oo

o8)

a

2:

2:oo

+

oCo1—o

,

—cl

oo

o

2:

e”1~

2:o

z

o

z

0e

os

ooo

en

to

~Ic

O)

o3

o

oz

+O

)

oo

o

2:

2:04oo

ose,,

2:ooo

oo

0

.02:

e.)o

oo

o.0

ZObe,”—

2:oeso

++

cl4

;2:8

)o

2:.~

ose”

eso

2:~

8)

oos

z2

:~

oe)o

en

o6o

o

.0

6~e-)o

+

89

oE

os2:

2:~

e.)o

clC

o

—o

—cl

4;

O)

oo

o

2:

e)o

+.0e,”

5Co

oO—C

l

O)cl

83

o

2:

2:ze)o

6o

o

.0e-a.;’

~hz—e.)o+

8)

o

2:1

ose-e

”2

:~

oe)

o

eCo

Como era de esperar,los espectrosde ‘H RMN de los isómeros122a,122b,126a y 126b son idénticos a los de sus enantiómeros 123b, 123a, 127b y 127a,

respectivamente. El tratamiento de los compuestos 122, 123, 126 y 127 conNH3/MeOH condujo a las amidas 124, 125, 128 y 129 correspondientes,constituidas también por mezclasde dos diastereoisómerosen proporcionesidénticas a las de los ésteresde partida.

Las diferenciasen las proporcionesde diastereoisómerosobservadaspara

estos derivadospodrían ser debidasa la utilización de diferentespartidasde las

3-oxoindolizidinas82ay 82b, o a un problemade resolucióncinéticadurantelacondensacióncon Trp, o bien a una combinaciónde ambosfactores.

Con objeto de estudiarla influenciadel grupoprotectorBoc en la actividadde estosderivados,se procedióa la N-desprotecciónde los compuestosl2Sab y129ab (Esquema29). Se obtuvieron así las mezclas de diastereoisórnerosdesprotegidos l3Oab y l3lab, que pudieron ser separadospor HPLC

semipreparativo.

O

N CONH2

‘—Pb

O

CONFiO

~efl y—Ph

Bac-L-’Prp-HN 1 28a+

TEA/O112012

O

N Ph‘4

CONH2

H-L-Trp-IIN lSOa+

O

N —Ph

CONFi,,

Boc-L-Trp-FiN Fi-L-Trp-HN

OCONII

N 2

‘—ph

O

N CONH2

~—Ph

Boc-o-Trp-HN+

H-n-Trp-HN+

N Ph

O ONH2

N Ph

CONI12

Boc-b-Trp-HN

Esquema29

1 28b ‘Sol>

129a

o

TFAICH2CI2 iSla

O

1 29b Fi-o-T¡-p-FiN lSlb

—101—

Lógicamente, los espectros de ‘H RMN de 130a y 131b, por una parte, y

130b y 131a, por otra, son coincidentes,mientras que los valores del poder ópticorotatorioson idénticosy de signo contrarioparacadapareja.

Para la preparaciónde los análogosde CCI¾115 se intentó en primer

lugar la saponificaciónselectivadel éstermetílico del diésterS4ab mediantetratamientocon un equivalentede NaOH. Sin embargo,estetratamientocondujoa unamezclaconstituidapor el producto dc partiday los derivadoscarboxílicosprocedentesde la monosaponificacióntanto del éstermetílico como del etílico.Paraevitar estafalta de selectividadse llevó a cabola saponificaciónen el diésteranálogo132ab, obtenidopor alquilación del correspondientederivado 2-mono-sustituido73, enel queel restode acetatode etilo de 84abseha sustituidopor el deacetatode terc-butilo (Esquema30). La reacciónde acoplamientopeptídico delácido carboxílico 133ab con H-Phe-NH2 condujo a una mezcla6,6:1 de los

diastereoisómeros134a y 134b, que pudieron ser separadospor cromatografía.

Cadauno de estosderivados,segúnse apreciaen el espectrode1H RMN, está

impurificado con una pequeñacantidad del diastercoisómeroprovenientede la

mezclaenantioméricade la 3-oxoindolizidina de partida.

o O

N CO2tBU N CO2tBu1) NaOHJMcOH

CO2Me 2)HCI -.,.,~ CO»

BoeFiN BocFiN

132ab 133abaib = 5:1

I 1) HO5u/DCC2> H-Phc-N1112

0 00

N CO2tBu N Pbe-NFi

2+

~Phe-NH2 ‘— CQ’BuO

BocFiN BocFiN

1 54a 1 34b

Esquem.a30

102—

Finalmente, los análogos de CCK liSa y 115b se obtuvieron por

tratamiento de 134a y 134b con TEA, seguido de acoplamiento con el éster

N-hidroxisuccinimídico de Boc-L-Trp (Esquema31). El tratamiento con TFA del

derivado115acondujoal correspondienteanálogodesprotegido135.

O

N CO2tBu

CPhe.NH2

OBodUN

134a

I ~

00

N Phe-NH2

‘4— C(>21Bu

BocHN1 34b

T i) TEX’CH2C]2

2) Poc-Trp-OSu

O

N co»

~—Pbe-NH2

oE oc-Trp-I-IN

115a

00

N -Phe-NFi2

“—C02H

Hoc-Trp-HN

115b

T TFAICH2CJ•2

o

N co»

»-~Phe-NH2o

Fi-hp-UN135

Esquem.a31

La asignaciónde la configuraciónabsolutade estos análogosde CCK se

realizópor medio de experimentosde NOE bidimensional (ROESY).El compuesto

liSa muestra fuertes NOEs entre los protones U-Sa y H-la, U-la y 2-CH2, y H-8 y

H-lfl, lo que indica que el protón U-Sa y el resto de Asp en posición 2 se

encuentranen disposición relativacis. Por el contrario, para el isómero115b los

protonesdel grupo 2-CH2 muestranNOE conel protónH-1~, al igual que el H-8,indicando que el protónH-8 y el sustituyentealquilico de la posición2 se disponen

del mismo lado del anillo de 3-oxoindolizidina(Figura 14).

— 103—

o 00C02Fi Phe-NFi2

Phe-NH2 co»

Boc-Trp-HN Fi Fi~ Boc-Trp-HN Fi

115a 1 lSb

Figura 14. NOEsmássignificativosobservados

para los compuestosll5ay 115b.

Los valoresde afinidadpor los receptoresCCKA y CCKp de los derivados

de 3-oxoindolizidinasintetizadosserecogenen la tabla 15, junto con los obtenidospara los compuestosde referencia.

Dentro de los análogosconformacionalmenterestringidosde COK1 en los

que se sustituye el fragmento dipeptídico Met-Asp por un resto de 3-oxoindoli-

zidina, los derivadosen los queel grupo2-bencilo y el residuode Trp se sitúandelmismo lado del anillo de 3-oxoindolizidinapresentanmayoresafinidadespor losreceptoresOCKB quepor los periféricos.Si secomparanlos compuestos123 y 125

se observaquela sustitucióndel éster metílico por amida conduceal aumentodeun orden de magnitud en la capacidadde unión a los receptoresCCKB. Se

produceun resultadosimilar con la sustitución de L-Trp por D-Trp, como sededuce de la comparaciónde los valores de afinidad obtenidos para loscompuestos124y 125. Por el contrario,cuandoel grupo 2-benciloy el residuodeTrp se encuentranen lados contrariosde la molécula,se observaselectividadpor

los receptoresCORA, obteniéndoseafinidadesde rangomicromolar. En estecaso,

la introducción de Boc-L-Trp en la posición 8 del anillo de 3-oxoindolizidina

condujoa mejoresresultados(126) que la incorporaciónde Trp de configuracióno

(127). Nuevamente se obtienen mejores afinidades para los carboxamido

derivados(ver compuestos126 y 128). En estaserie de compuestosla eliminación

del grupo Boc dio lugar a la pérdidade afinidad, indicando la importanciadelgrupo hidrofóbicoen la posiciónN~ del Trp, de maneraanálogaa la descritaparaotros derivadosde COK4 147450

Por otra parte,la introducción de la cadenalateral del Asp en la posición2

del anillo de 3-oxoindolizidina condujo a compuestosinefectivos para ambosreceptores.

Fi~

—104—

Tabla 15. Afinidadespor losreceptoresCCKA ~ CCKB

de los derivadosde 3-oxoindolizidina

R-Trp-HN

O

Configuracióna ICso (pM) b

Compuesto Fi Trp 2,8,8a

Proporción

alb

C

CCKA

C

CCKB

l2Sab Boc Ph OCH~ D ESR 10:1 > 10 4,3(SE5)

124ab Boc Ph NR2 L SSE 10:1 >10 3,9(RES)

125ab Boc Ph NR2 SSE 10:1 > 10 0,7(RES)

l2Gab Boc Ph OCFig L SSR 4:1 9,2 > 10

(RES)

127ab Boc Ph OCHg u SSE 3:1 >10 >10(RES)

l2Sab Boc Ph NR2 L RSE 4:1 3,9 > 10

(SE5)

130a H Ph NR2 L RSE — >100 >100

130b Fi Ph NR2 L SRS — >100 >100

liSa Boc CO2IvI L-Phe•-NH2 L SSE — >10 >10

1 15b Boc CO2H L-Phe-NH2 L RSR — > 10 > 10

135 H CO2H L-Fhe-NH2 L SSE — > 10 > 10

CCK8 0,0006 0,006

Boc-CCÑ c 1,8 0,025

3 0,8 0,05

109 1,7 001

a Las configuracionesindicadasentre paréntesis corresponden a las de] diastereolsómero minoritario presente

enla mezcla.b El valor de 1C50representala concentración capaz de producir una inhibición del 50% de la unión específica

de la [3Fi1-propiooil-CCK~a los receptores de CCI{. Los valores indicados corresponden a la media de los

obtenidosen tres experimentos separados.c \Talores publicados en la referencia 151.

— 105 —

112

En el ensayode liberaciónde amilasade los acinospancreáticosinducidapor COK8, el derivadol2Sab inhibió, a una concentracióni0~ M, la liberaciónde

esta enzimaen un 70%. Por lo tanto, el compuesto128 actúa como antagonista

periférico.

La capacidadantagonistade los derivadosde 3-oxoindolizidinaquehabían

mostrado afinidades a concentracionesinferiores a 10~ M fue evaluadaen el

ensayode músculolongitudinal-plexomientéricodeíleon de cobaya(Tabla 16). En

esteensayo,los compuestos126aby l2Sab inhibieron la contraccióndel íleon

mediada por los receptores periféricos en porcentajes del 70 y 88%,

respectivamente,en consonanciacon sus afinidadespor dichos receptores.Este

resultadoestáde acuerdocon el obtenidopara 128 en el ensayode liberación de

amilasa comentadoanteriormente.Se confirma así que estos derivadosson

antagonistasperiféricos,aunquecon actividadmoderada.

Los D-triptofil-3-oxoindolizidina derivados123 y 125 no inhibieron signifi-cativamentelas contraccionesdel íleon inducidas por la COK4, aunquesus

afinidadespor los receptorescentralessonaceptables.

Tabla 16. Inhibición de la contraccióninducida por la CCK

en plexo mientéricode cobaya

Compuesto(10~ M>

% de inhibición

CCK8 (108 Nt CCK1 (10v Nt

l2Sab 25,3 + 42 193 + 0,5

124ab 52,6 ± 7,3 --i-441 + 22,0

125ab 2,9 ± 7,4 -4-08± 4,2 a

l2Sab 70,0 ~- 60 261 + 2,3

l2Sab 88,2 + 32 +170 * ~ a

lSOa 27,2 ± 7,3 16 + 11,9

lSOb ±5,6+ ~ a ±167+ 10,8 a

3 85,1~27 100

109 60,4 + 48 797 + 14,0

a El signo-4 indica potenciación en lugar de inhibición.

— 106 —

La capacidadantagonistaperiférica del compuesto124, capaz de inhibiren un 52% las contraccionesdel íleon inducidas por CCK8, no tiene una

explicaciónclara, ya que su afinidad por los receptoresCCKA es muy baja.

Finalmente, la disminución de la potenciaantagonistade los derivados

130ay 130b, análogosde 128ab,en los queseha eliminado el grupoprotectorBoc,

estáde acuerdocon la pérdidade afinidad mostradapor estoscompuestos.

Teniendo en cuenta que los derivados 123-128 están constituidos por

mezclas de diastercoisómeroses difícil establecer relaciones estructura

tridimensional-actividadbiológica, especialmenteen el caso de los tres últimos

compuestosdonde la proporción de isómeroses más pareciday la contribución

del isómero minoritario podría ser más importante. En cualquier caso, el

compuesto128, un antagonistamoderadode los receptoresCCKA, y el derivado

125, con afinidad 1O~ M por los receptorescentrales,podrían constituir la base

para la preparaciónde nuevosanálogosmáspotentesy selectivos,Asimismo en

aquellos compuestosde mayor interés, quedapendiente la resolución de las

parejasde diastereoisómeros,que seda de gran ayudapara llegar a establecer

cúal o cuálesde las muchasdisposicionesespacialesde las cadenasaromáticas

favorecenla interaccióncon los diferentestipos de receptores.

2.3.2. ANÁLOGOS CONFORMACIONALMENTE RESTRINGIDOSDE NT

La Neurotensina(NT), H-Pyr-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-

Ile-Leu-OH, es un tridecapéptidocon un extensoperfil farmacológicoque incluye

accionestanto en el sistemanervioso periférico como en el central 159,160 La

administración periférica de NT induce hipotensión, incrennentala permeabi-

lidad vasculary estimula la contracciónintestinal. A nivel del sistemanervioso

central la NT ejerce potentesaccionesde hipotermia y analgesia.Además, este

neuropéptidoactúa como moduladorde la transmisióndopaminérgicay podría

tener importantes implicaciones en la etiología de la esquizofreniay de la

enfermedadde Parkinson.

Los estudios de relacionesestructura-actividadbiológica han permitido

establecer los requisitos estructurales necesarios para la interacción

NT-receptor(es)16 1-165, habiéndosedeterminadoque el hexapéptidoC-terminal de

la NT, NT&18 (H-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu-OH), es el fragmentomínimo capazde

unirsea los receptoresde NT y de expresarla totalidad de las accionesbiológicas

de esteneuropéptido164• Sin embargo,la existenciao no de diferentessubtiposde

— 107—

receptores no está todavía bien establecida166• Este hecho se debe,principalmente, a la falta de antagonistasespecíficosy de análogos de NTmetabólicamenteestables,que constituyenlas herramientasnecesariaspara la

caracterizacióntanto de los receptorescorno de las implicaciones fisiológicasespecíficasde dicho neuropéptido.

Teniendo en cuenta que la prolina es uno de los residuos que másfrecuentementeentrana formar partede los giros ~3120, y quela sustituciónde la

Pro10 en la NT por D-Pro o por Gly coníleva una disminución acusadade laactividad164, diversosautoreshan postuladoque la importanciade esteresiduoestá directamenterelacionadacon la adopciónde conformacionesde tipo giro

inverso 167,168~ Sin embargo,los análisisconformacionalesllevadosa cabocon laNT y susfragmentosactivosno hancontribuidoa esclarecerestepunto, ya que,

mientras en disolución se puede descartarla existencia de estructurassecundariasconcretas169,170 algunosestudiosde cálculos de energíaindican lapresenciade un giro 3 de tipo 1 constituido por el fragmento Arg-Pro-Tyr-

Ile 167,171

Con objeto de intentar aportar nuevosdatos acercade la conformación

bioactiva de esteneuropéptido,y dentro del marcode colaboraciónque nuestrogrupo de trabajo mantienecon la compañíaNovo-Nordisk XIS, se consideródeinterés la preparación de una serie de análogos conformacionalmenterestringidosde NT

613 de fórmula general186. En estosderivados,el dipéptído

Pro’0-Tyr11sesustituyópor esqueletosde 3-oxoindolizidina2-hendísustituidacon

diferentesestereoquímicas,capacesde inducir restriccionesconformacionalesdeíndole diversa.Por facilidad sintética,se reemplazóla cadenalateral de la Tyr

por Phe,dado que estasustituciónno modifica sustancialmentela actividadde laNTg.

13.

oPh

fle-Leu-OH

H-Arg-Arg-HN

Como derivadosde 3-oxoindolizidinade partidapara la preparaciónde losanálogosde NT8.j3 136, se utilizaron los compuestos85a,85b, 85c, 88a y 88b,

previamentepreparados(Apartado 2.2.2).

136

—108—

o OoN Ph N N CO2H

co2n ‘—Ph ‘—Ph

BocHN l3ocHN BocHN

85a 85b 85c

(IRSR) (ISSR) (ISSS)

o oN CO2H N Ph

‘—Ph CO2H

BocHN BocHN

88a 88b

= 8-amino-2-bencil-3-oxoindolizidina-2-carhoxilato.Las tres letras siguientesa la letra 1 indican la conflguraciónde C-2, C-8 y C-8a, respectivamente.

A partir de estos derivadosde 2-bencil-3-oxoindolizídina-2-carboxilato,elDr. Nils L. Jobansen(Novo-Nordisk) abordó la síntesis de los derivadosbexapeptídicosconformacionalmenterestringidos [IRSRlQí 11 NT8j3 (136a),FISSR

101’JNT&ís(lSBb), [ISSS’0’111NT&13(136c), [ISRS

1Q”]NT813 (136d)e

[IRRS1O’111NT

313 (136e), utilizando la metodologíade péptidos en fase sólida y

siguiendo la estrategiaBoe/BzI. En concreto, se utilizó una resma PAM[4-(bidroximetil)fenilacetamidometil resma] como soporte sólido, las cadenaslaterales de los residuos de Arg se protegieronen forma de tosilato y los

acoplamientos de los diferentes Boc-aminoácidosse realizaron con loscorrespondientesésteresde N-hidroxibenzotriazol,previamenteformados.Parala introducciónde los derivadosde 3-oxoindolizidinasse empleóBOP como agente

de condensación.Finalmente,la separaciónde los péptidos de la resma y laeliminación de los gruposprotectoresde las cadenaslaterales,por tratamiento

con HF, condujo, tras purificación por RP-HPLC, a los derivados136a-lSBebuscados.

Teniendo en cuentaque cada una de las 3-oxoindolizidinasde partidaestabacompuestapor una mezclade enantiómeros,todos los crudosde reacción

obtenidos mostraron la existencia de dos derivados hexapeptidicosdiastereoisómeros(Tabla 17).

— 109 —

Tabla 17. Proporciónde diastereoisórnerosobtenidosen la síntesis

de los análogosrestringidos de NT513

Producto

de partida

Proporción

de enantiómerosa

producto

final

Proporción

de diastereoisómerosb

85a±SSa 6:1 136a + 136d 9:1

85b+ SSb 6:1 136b+ 136e 2,5:1

85a +SSa 1:5 136a +136d 1:3,2

85b+SSb 1:5 136b+136e 1:8,7

a Medidapor HPLC apartir de los correspondientesanálogosderivatizadoscon MTPA (Apartado2.2.3).

b Medidapor 1-IPLC en los crudosde reacc~on.

Las diferenciasen las proporcionesde diastereoisómerosde los análogos

peptídicos finales cuando los productos de partida presentan excesosenantioméricos idénticos, indican nuevamentela existenciade problemasde

resolucióncinética, tal y como sehabíapuestode manifiestoen las reaccionesde

derivatizaciónde las indolizidinas con MTPA. A partir de estosresultadosse

puede concluir que las indolizidinas 85a (IRSR) y 88b (IRRS), ambas deconfiguración R en C-2, reaccionanmás rápidamenteque sus respectivosenantiómerosSSa(ISRS)y 85b (ISSR). Esta diferenciapodría atribuirse a unempaquetamientomayor entreel grupo2-benciloy la cadenalateralde la Ile en el

caso de las 2S-indolizidinasque dificulte la reacción de estos derivadoscon elfragmentodipeptídicoH-Ile-Leu-Resina.

El derivado hexapeptídico correspondiente a la indolizidina deconfiguración (2R,SR,8aR),enantiómerade 85c, no pudo ser aisladoya que, por

unaparte,al ser85eel isómerominoritario setrabajabacon pequeñascantidadesy, por otra, existía un pequeñoproblemade contaminacióndel compuesto 85ccon

el derivado 85a, debido a la dificultad de separacióncromatográficade susrespectivoscompuestosprecursores82c y 82a.

Los derivados 136a-136e fueron caracterizadosmediante sus datos

analíticosy espectroscópicos,como se detallaráen el capítulo correspondientede

la parte experimental.

Los resultadosde afinidad por los receptorescentralesde NT 172 de los

análogosconformacionalmenterestringidosincluidos en estecapítulo se recogen

— 110—

en la tabla 18. A efectos comparativos, se incluyen también los datoscorrespondientesa la NT813y susanálogos[Pbe

1flNTsj3 y [A1a

11]NTs.i3.

Tabla18. Aflnidad por los receptoresdc NT de los análogos136a-136e

aCompuesto IC5o ( nM)

136a H-Arg-Arg-IRSR-Ile-Leu-O11 267 ±79

136b H-Arg-Arg-ISSR-fle-Leu-OH 279 ±129

136c HArg-Arg-ISSS-Ile-Leu-OH ~1O0OO

136d H-Arg-Arg-ISRS-11&-Leu-OH 200 ±62

136e H-Arg-Arg-JRRS.Ile-Leu-OH 342 ±127

[Ala”}NTs~s WArg~Arg-Pro-A1a-Ile-Leu-OH 223 ±70

[Phe11]NT~j~ l1-Arg-Arg-Pro-Phe-Ile-Leu-Ol-l 39 ±19

NTg1~ H-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu-OH 10 ± 7

a Los valoresde 1C50indican la concentraciónala cual se produceun 50% de inhibición dela unión específica

de [3H]-NT a homogeneizadosde cortezade cerebrode rata. Estosvalorescorrespondena la media de al

menostresexperimentosrealizadospor separado.

Como se deducede los datosde la tabla,los compuestos136a-136by 136d-136e, en los que el dipéptido Pro-Tyrha sido reemplazadopor derivadosde 3-oxo-

indolizidinas de configuración(SS,SaR)y (8R,8aS),respectivamente,resultaron

equipotentesentre sí y aproximadamenteun orden de magnitud menos afines

por los receptoresde NT que el fragmento mínimo activo NT313 y su análogo

[Phe11]NT

843. Sin embargo, el derivado 136c, con disposición cis entre los

sustituyentesen posiciones8 y Sa del anillo de indolizidina, fue inactivo a una

concentraciónde iO~ M. Estos resultadosparecenindicar que, mientras la

estereoquímicaen C-2 no tiene influencia en la unión a los receptoresde NT, la

disposición 8,8a-transjuegaun papel importanteen dichaunión. Por lo tanto, las

restriccionesconformacionalesinducidaspor las 3-oxoindolizidinas 8 ,8a-transen

los análogos de NT813 se ajustan mejor a los requisitos topográficos de los

receptoresque las inducidaspor el derivado8,8a-cis.La disminuciónen un orden

de magnitud de la afinidad de los análogosconformacionalmenterestringidos

136a,136b, 136d y 136e,con respectoa la NT8j3 y [Phe”iNTsig, podríadebersea

que las cadenaslaterales de los diferentesaminoácidosde estos derivadosno

puedanadoptaren su conjunto las disposicionesespacialesmás favorablespara

— 111 —

la interaccióncon los receptoresde NT. rj9eniendoen cuentaque los valores deJCso obtenidospara estos análogosson similares al del derivado [Ala”]NTsa

3,

otra posible explicación, en términos conformacionales,a la disminución de

afinidad podría particularizarse en una disposición espacial inadecuadadelgrupo 2-bencilo, que impediría su interacción con la cavidad hidrofóbicacorrespondienteal residuode Tyr

11 en el mencionadoreceptor.Para intentar profundizar en el conocimientode las relacionesestructura

tridimensional-afinidadpor los receptoresde NT de estos análogosconforma-

cionalmente restringidos de NT8j¿, se realizó un estudio de modelización

moleculardel derivado dipeptídico Ac-Pro-Tyr-NHCHg, como modelo sencillode

NT5.j3, y de las 2-bencil-3-oxoindolizidinasA. B y O.

- 01-1EN

ENCH3 WC

Ac-Pro-Tyr-NHCH3

O O

1~1NNEN CH3 EN+ 0

8 e

Siguiendola metodologíaexpuestaen el apartado2.2.5, se llevaron a cabo

tres dinámicasmolecularesa 1500 K para el derivadodipeptídico Ac-Pro-Tyr-NHCH3 y dos para los compuestosA, B y C. En todos los casos,ci valor de la

constantede rotación del enlacepeptídicose aumentóartificialmente durantelas

dinámicaspara evitar la formación de los correspondientesisómeroscis. El total

de mínimos encontradosfue de 135 para el dipéptido y 74. 78 y 82 para los

derivadosrestringidosA, B, y O, respectivamente.

Hg

A

“0r1~1N% CH1

EN%0

o O

—112—

En la tabla 19 se recogenlas energíasrelativas, las distancias dctC1-ctC4y

los valores de rms obtenidospor superposicióncon diferentestipos de giros 3 para

los veinte confórmerosde menor energíade] derivado Ac-Pro-Tyr-NHCH3.

Tabla 19. Comparaciónde los veinte confórmerosde mínima energíadel derivadodipeptidico

Ac-Pro-Tyr-NECH3 con diferentestipos de giros 3

rms (Á)E relativa

Conf. (Kcal/mo))

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

1.2

13

14

15

16

17

18

19

20

0,00

0,17

0,95

1,02

tOS

1,24

1,28

1,31

1.43

1,43

1,49

1,56

1,61

1,66

1,67

1,74

1,75

1,78

1,79

1,82

daC1-aC4(A)

5,98

8,95

8,92

6,65

4,56

4,54

6,33

9,06

8,64

7,53

7,82

5,91

5,16

6,13

5,02

8,53

6,98

8,81

9,03

6,92

31 31 [3-II [311’ 3111 [3111’

0,33

1,62

1,58

0,64

0,66

0,70

1,16

1,47

1,30

0,84

1,92

0,30

0,70

0,46

0,33

1,27

1,32

1,93

1,67

0,89

125

1,99

2,01

1,08

1,14

1,17

1,07

1,71

1,83

1,36

1,50

1,18

1,27

1,27

0,95

1,60

1,23

2,00

1,98

1,13

0,85

1,89

1,8.5

0,76

0,92

0,96

1,12

1,59

1,58

1,07

1,68

0,78

1,02

0,86

0,58

1,42

1,29

2,00

1,93

0,94

0,73

1,84

1,80

0,79

0,80

0,84

1,06

1,59

1,53

1,06

1,69

0,67

0,90

0,78

0,51

1,42

1,23

2,01

1,88

0,93

0,17

1,42

1,38

0,61

0,70

0,74

1,21

1,33

1,08

0,70

1,85

0,21

0,67

0,37

0,51

1,14

1,34

1,79

1,47

0,90

1,34

1,81

1,84

1,14

1,23

1,26

1,05

1,65

1,80

1,38

1,31

1,28

1.35

1,34

1,07

1,57

1., 18

1,87

1,79

1,15

La obtención

incluido el mínimo

de 11 confórmeroscon

absoluto,indica la gran

distanciactC1-uC4 inferior a 7 A,

tendenciadel derivado dipeptídicoAc-Pro-Tyr-NHCH3 a adoptar conformacionesplegadas de tipo giro 13,obteniéndoselos mejoresvaloresde rms por superposiciónde estosconfórmeros

— 113—

con giros ¡3 ideales de tipos 1 y III (Figura 15). Además, la mayoría de los

confórmeros con distancia aCj-cxC4superior a 7 Á presentanun puente de

hidrógenointramolecularentreel grupo carbonilodel acetilo y el NH del residuode Tyr, característicode los giros ‘y inversos120~ Por lo tanto, si se realiza una

extrapolación de estos resultadosa la NT, cabe esperarque los fragmentospeptídicosArg-Pro-Tyr-Ile y Arg-Pro-Tyr presentencapacidadespara adoptar

conformacionesde giro ¡3 (1 o III) y giro y, respectivamente,similares a las

mostradaspor el péptido modelo.

Figura 15. Superposicióndel mínimoabsolutodel derivado Ac-Pro-Tyr-NHCH3(línea continua)congiros /3 idealesde tipos 1 (a) y 111 (b).

Por otra parte, el análisis conformacionalefectuadopara las 2-bencil-3-

oxoindolizidinas A, B y C (Tabla 20) condujo a resultadosmuy similares a los

obtenidos previamente para sus correspondientesderivados desbencilados

(Apartado 2.2.5). Así, se puedeobservarque, mientras la indolizidina A presenta

una tendenciamoderadaa adoptarconformacionesplegadas,las conformaciones

extendidas son predominantesen el caso de la estructura B. Sin embargo,

aunquelos valores de rms de las formas plegadasde A parecenindicar una

correlaciónpreferentecon los giros ¡3 de tipos 1 y liii, en la superposiciónde los

confórmerosA20 y A9 con estostipos degiro 13 seobservaque las disposicionesde

los respectivos enlaces peptídicos, especialmenteel C-terminal, son muy

diferentes (Figura 16). Por lo tanto, no sepuedeconsiderarque estederivado de

2-bencil-3-oxoindolizidinaactúe corno mimético de giros ¡3.

ba

—114—

Tabla20. Confórmerosde las estructurasA, B y C quepresentandaC1-aC4inferior a 7 Áy comparacióncon los diferentestipos de giros ¡3

E relativa

Conf a (Kcal/mol>

A4

AO

Ah

A18

A19

MO

1,48

2,16

‘2,66

3,43

3,47

3,59

B20

Cl

C2

Cg

CCCts

C9

C 13

C14

C16

GiS

C20

3,26

0,00

1,02

1,43

1,84

1,89

2,29

2,81

3,26

4,41

4,93

5,06

rius (A)d

aCj-aC4 <Aí

6,82

6,4-4

6,57

6,44

6,12

5,18

6,83

4,78

3,91

4,66

4,31

4,39

4,20

4,20

3,97

5,31

4,82

6,92

0,81

0,74

0,76

0,88

0,84

0,63

1,40

1,37

1,38

1,31

1,30

1,08

1,06

1,01

1,03

1,04

1,01

0,75

0,98

0,93

0,94

0,92

0,88

0,65

0,71

0,66

0,68

0,79

0,76

0,68

1,12 Ét79 0,75 0,86 1,15 0,74

116

1,15

1,16

1,17

0,81

0,79

1,17

0,82

1,26

0,81

1,12

0,69

0,70

0,68

0,68

0,94

0,99

0,68

0,97

0,68

0,52

0,86

0,78

0,79

0,78

0,81

0,69

0,71

0,81

0,70

0,85

0,48

0,90

0,89

0,90

0,88

0,96

0,82

0,84

0,96

0,84

0,95

0,57

0,92

1,29

1,32

1,29

~1,33

(1,96

0,94

1,34

0,98

1,37

0,96

1,15

a Únicamentese hanconsideradolos veinteconfórmerosde mínimaenergía.

Finalmente, la 3-oxoindolizidina 8,Sa-cis C adopta preferantemente

conformacionesplegadasque se caracterizanpor poseerun puente de hidrógeno

intraniolecular entre los grupos 8-NH y 2-CO (confórmeros01-03. 05, 06, 09,

013, 014, 016 y 020). Además,en estecaso,el conférmeroCiS secorrespondecon

una conformación de tipo giro 13 (II, 1) idéntica a la del mínimo 05 del

correspondientederivado no sustituido en 0-2 (Apartado2.2.5).

[3111

1,44

1,443

1,43

1,37

1,37

1,20

0,78

0,84

0,78

0,79

1,08

1,14

0,80

1,12

0,72

0,71

0,87

115—

Figura 16. a: Superposicióndel confórmeroA20(línea continua)con un giro /3

ideal de tipo L b: Superposicióndel confórineroA9 (línea continua)

con un giro fi ideal de tipo hL

Si, como en el caso de Ac-Pro-Tyr-NHCHI3, el comportamiento

conformacionalde los análogosrestringidosde NT8~13 136a-136cfuera similar al

determinadocon los modelos sencillos A, 13 y C, respectivamente,la falta de

afinidad del derivado 136c indicaría que las conformacionesplegadasde laestructura C (SNH—>2C0 y giro 13 II) son incompatibles con la conformación

bioactiva de la NT. Por otra parte, la carencia de estructuras secundarias

definidaspara los derivados de 3-oxoindolizidinasA y B no permite establecer

una relación clara entre la moderadaafinidad de los análogosrestringidosdeNT815 iSBa y 13Gb y la conformaciónpreferentede la NT en suunión al receptor.

Para llegar a esclarecerla participación o no de conformacionesde tipo

giro ¡3 (1 o III) y/o y en la conformaciónbioactiva de la NT sería necesanala

preparación de análogos conformacionalmenterestringidos que incorporen

miméticospara estostipos concretosde giros inversos.

a b

—116—

3. PARTE EXPERIMENTAL

Los análisis elementalesse efectuaronen el laboratorio de microanálisis

del C.N.Q.O. con un analizadorHeareus CHN-O-RAPID y se hallan en el

rango de ±0,4 respectoa los valores teóricos calculadospara las fórmulas

moleculares.

Los puntos de fusión se determinaronen un aparato Reichert-Jung

Kofler y no estáncorregidos.

Los espectrosde masasse registraron en un espectrómetroVacuum

GeneratorsVG 12-250.

Los espectrosde PD-MS se registraron en un instrumento Bio-lon 20

(Applied Biosystems).

Los poderes rotatorios se determinaron en un polarímetro Perkin

Elmer 141.

Los espectrosmonodimensionalesde ‘H RMN se registraron en un

espectrómetroVarian EM-390 (90 MHz), en un Varian Gernini 200 (200 MHz),

en un Varian XL-300 (300 MHz), en un Brucker AMX2-400 (400 MHz) o en un

Varian Unity 500 (500 MHz), utilizando TMS comoreferenciainterna en el caso

de los espectrosregistradosen CDCI3, DMSO-d6 y (CDahCO,y DDS para los

registradosen D20. Los experimentosde NOESY se registraronen el Varian

XL-300, utilizando 1,5 s de tiempo de relajación y 600 ms de tiempo de mezcla.

Para los experimentosde ROESY, registradosen el Varian Unity 500, se

utilizaron 1 s de tiempode relajacióny 150 nis de tiempode mezcla.

Los espectrosde13C RMN se registraron en el Varian Gemini 200

(50 MHz), en el Varian XIL-300 (75 MHz) o en un espectrómetroBrucker AM-200

(50 MHz).

Las cromatografías analíticas en capa fina se realizaron encromatofoliosde 0,2 mm de espesor,con gel de sílice tipo 60, Merck F

254. Los

compuestosse detectaroncon luz UY de 254 nm, mediantepulverización con

disolución de ácido sulfúrico en etanol (3:7), con disolución de ninhidrina en

etanolal 2% y calentandoo con yodo.

Las separacionescromatográficasen columna sellevaron a cabo con ge]

de síliceMerck tipo 60 (230-400mesh).

Las cromatografíaspreparativasse realizaron en placas de 2 mm de

espesorcon gel de sílice 11F254 Merck o mediante cromatografía circular

centrífuga en capa fina (CCTLC) en cromatotrón,en placasde 1 ó 2 mm deespesorcon gel de sílice Merck tipo 60 PF-254con CaSO4.

Los HPLC analíticos se llevaron a cabo sobre un aparato Waters y

utilizando las siguientescolumnasde fasereversa:

— Columna núm. 1: LichrosorbCís (4 x 250 nnn. 5 ¡im).

— Columna núm. 2: UltrasphereC18 (4,6 x 250 mm, 5 ~ím).

— Columna núm. 3: NovapakC18 (3,9x 150 mm, 4 um).

— Columna núm. 4: ~ BondapakC18 (3,9x 300 mm, 10 gnt.

Los sistemasde eluyentes utilizadosseindican a continuación:

— Eluyente A: CH3CN/H20 (0,05%TFA).

— EluyenteB: CH3CN¡TEAP (TEAIP = tampónEtgN/HgPO4,pH 6,5).

— Eluyente C: CH3CN/H20.

En todos los casosel flujo fue de 1 mL/mm y la detecciónde picos se

realizópor LIV a 214 nm

Para el HPLC preparativo se utilizó una columna ~í Bondapak Cís

(7,8 x 300 mm, 10 gm) y el sistemade eluyentesA, el flujo fue de 3 mL/mm y la

detección,igual queparael HPLC analítico, seefectuóporUY a 214 nm.

Los análisis de aminoácidosse realizaronpor hidrólisis de los péptidos

en HCl 6 N a 1100C durante22 h, seguidode derivatizaciónconisotiocianatode

fenilo y análisis por HPLC.

PRODUCTOS COMERCIALES

Ácido trifluoroacético FLUKA

ALDRICH

Bromoacetatode terc-butilo ALDRICH

Bromoacetatodeetilo ALDRICH

Bromuro de bencilo

Cloroformiato de isobutilo ALDRICH

DCC

Gramina

Hidrogenosulfatode tetrabutilamonio

N-hidroxisuccinimida

LiAIH4

Malonatode dimetilo

MERCK

FLUKA

ALDRICH

ALDRICH

N-meti1monolina ALDRICH

(R)-ú-)-MTPA ALDRICH(R)-(-)-MTPA-Cl ALDRICH

(S)-(-i-)-MTPA-CI ALDRICHNaBH4 FLUKA

NaH ALDRICH

PANREAC

(S)-(±)-TFAE

Trietilamina SCHARLAUYoduro de metilo QUIMICEN

Los aminoácidosy susderivadoscuyasíntesisno se describeprocedende

BOP

FLUKA

FLUKA

SIGMA

NalPd-C FLUKA

FLURA

la casacomercial BACHEM AG.

3.1. SINTESIS DE CLOROMETILCETONAS DERIVADAS DEAMINOÁCIDOS

Procedimientogeneral:

A una disolución del derivadode aminoácidocorrespondiente(8 mmoles)

en THF (20 xnL), enfriadaa —20 oc, se le añadenNMM (1,2 niL, 11 mmoles)y

cloroformiatode isobutilo(1,5 mL, 11 inmoles).Despuésde 30 mm de agitacióna la temperaturaindicada, se adiciona CH2N2, generadosobreéter etílico a

partir de N-metil-N-nitrosourea(3 g), y se deja que la reacción transcurraaO

0C durante30 mm. A continuación,se añadepoco a poco y agitando unadisoluciónsaturadade HCI en MeOH hastaquecesael desprendimientode N

2.

Trasneutralizarel excesode HCí con TEA, seelimina el disolventey el residuoresultantese lava con H20 y con disoluciónsaturadade NaCí, sucesivamente,y seextraeconAcOEt. El extractoorgánicosesecasobreNa2SO4y seevaporael

disolventea sequedad.El residuose purifica por cromatografíaen columnadegel de sílice,utilizando el sistemade eluyentesqueseindica en cadacaso,

Z-D-Phe-cH2Cl(4%

Eluyente:AcOEt-hexano(1:3). Rendimiento:78%.

Sólidoblanco.PAl: 89-90 oc (AcOEt-hexano).

1H RMIN (90 MHz, CDC13): a 7,4-7,0[m, 10 H, C6H5 y Ph(Z)], 5,2 (m, 1 H, a-NH),

5,0 lIs, 2 H, CH2 (Z)], 4,7 (m, 1 H, cx-Phe),4,0 (d, 2 H, CH2-Cl), 3,1 (m, 2 H, 13-Phe).

Calculado(Cí8Hí8C]N03) 65,16 5,47 4,22 10,69

Encontrado 64,92 5,58 4,17 10,55

Z-D-Trp-CH2CI (5Q)


Sólido blanco.PS.: 134-136 oc (AcOEt-hexano).

— 123 —

1H RMN (90 MHz, CDCl3): 6 8,1 (s, 1 H, NHi), 7,8-6,8[m, 10 H, In y Ph (Z)], 5,4

(m, 1 H, cz-NH), 5,0 Jis, 2 H, CH2 (Zfl, 4,8 (m, 1 H, a-Trp),4,0 (m, 2 H. CH2-Cl),3,2 (d, 2 H, 13-Trp).

Análisis elemental(%) C H N Cl

Calculado(C20H19C1N203) 64.78 5,16 7,55 9,56Encontrado 64,57 5,22 7,30 9,38

Boc-D-Orn(Z)-CH2CZ (79)

Eluyente:AcOEt-hexano(1:3). Rendimiento:82%.Sólido blanco.P.f.: 80-82

0C (AcOEt-hexano).

HPLC: tR = 13,60mm; eluyenteA (50:50);columnanúm. 1.

1H RMN (300 MHz, CDCl3): 67,36-7,31[m, 5 H, Ph(Z)1, 5,14 (d, 1H, cz-NH), 5,09

Ls, 2 H. CH2 (Z)], 4,89 (ni. 1 H, a-NH), 4,51 (m. 1 H, a-Orn),4,25 (s, 2 H, CH2-Cl).3,22 (m, 2 H, a-Orn), 1,86 (m, 1 H, 13-Orn), 1.56(m, 3 H, 13- y y-Orn), 1,43 jis, 9 H,CH3 (Bocfl.

Análisis elemental(%) C H N Cl

Calculado(C19H27C1N205) 57,21 6,82 7,02 8,89Encontrado 57,23 6,62 7,05 9,08

— 124 —

3.2. SÍNTESIS DE 4-CETODIÉSTERES DERiVADOS DE AI’IIINOÁCU)OS


A una disolución de la clorometilcetonacorrespondiente(7 mmoles) enDME (10 mL) se le añadeNal (7 mmoles)y se agita a temperaturaambientedurante15 mm. La suspensiónobtenidase adicionasobreunadisolución de lasal monosódicadel ma]onato de dimetilo (7,7 mmoles) en DME (10 mL)

recientementepreparadaa partir de malonato de dirnetilo y NaMeO. Tras

agitar a temperatura ambiente durante 1 h, se elimina el disolvente y el

residuo resultantese extrae con AcOEt y se lava con H20 y con disolución

saturadade NaCí, sucesivamente.La fase orgánicase secasobreNa2SO4y se

evaporaa sequedad.El residuo obtenido se purifica por cromatografíaencolumnade gel de sílice, utilizando como eluyenteel sistemaque se especifica

en cadacaso.

(5R)-5-(Bendiloxicarbonil)amino-&fenil-2-metoxicarbonll-4-osrhexanoatodemetilo (51)

Eluyente:AcOEt-hexano(1:3). Rendimiento:88%. Sirupe.

1J¡ RMIN (90 MHz, CDCl3): 6 7,4-7,0Em, 10 II, C6Hs y Ph (Z)], 5,2 (m, 1 H, 5-NH),

5,0 Es, 2 H, CH2 (Z)], 4,5 (m, 1 H, H-5), 3,8 (t, 1 H, H-2), 3,7 (s, 6 II, CO2CH3),3,0

(ni, 4 H, H-3 y H-6).

~ Análisis elemental(Wc,> _ C H N

Calculado(C~H25NO7) 64,63 5,90 3,28

Encontrado 64,38 5,92 3,15

(5R)-5-(Rendfloxicarbonil)amino-64¿ndol-3’-il)-2-metaricarbonil-4-arohetcanoatodemetilo(52)


— 125 —

1H RMN (90 MHz, CDCI3): 5 8,2 (s, 1 H, NRO, 7,6-6,9[ni, 10 H, In y Ph (Z)], 5,4

(m, 1 H, 5-NH), 5,0 Es, 2 H, CH2 (Z)], 4,7 Cm, 1 H, H-5), 3,8 (t, 1 H. H-2). 3,7 (s,

6 14, CO2CH3),2,6 (ni, 4 H. H-3y H-6).

Análisis elemental(%,> C H N

Calculado(C25H26N207) 64,37 5,62 6,00

Encontrado 64,02 5,79 5,75

(51V-8-(BencilaricarbonWwnino-5-(tere-butaricarbonil)amino-2-ntetox¿carbonil-4-oxooctanoatodemetilo (80)


Sólidoblanco.PS.: 98-990C (AcOEt-bexano).


‘H R.IVIiN (300MHz, CDCl3): 5 7,36-7,30[m, 5 H, Ph 2)], 5,13 (d, 1 H, 5-NH), 5,09

Es, 2 H, CH2 (Z)1, 4,93 Cm, 1 H, 8-NH), 4,34 (ni, 1 11, H-5), 3,91 (t, 1 H, H-2), 3,73 (s,

6 H, CO2CH3), 3,23 Cm, 2 H, H-8), 3,17 (dd, 1 H, H-3, J = 18,3 y 7,8), 3,05 (dd, 1 H,

H-3, J = 18,3 y 6,6), 1,92 (ni, 1 H, 11-6), 1,55 (ni, 3 11, 11-6 y 11-7), 1,43 Ls, 9 11,

CH3 (BocXl.

Análisis elemental(%) C __ _ _ H N

Calculado(C24H34N209) 56,16 7,28 5,95

Encontrado 56,37 7,08 5,68

— 126 —

3.3. OBTENCIóN DE 4-CETODIESTERES 2-SUSTITUIDOS


A una disolucióndel 4-cetodiéstercorrespondiente(3 mmoles)en DME oTHF (20 mM se le añadenNaMeO, recientementepreparado(3,3 mmoles) y,

despuésde 10 mm de agitación,el agentealquilante apropiado,bromuro de

bencilo, bromoacetatode etilo, yoduro de metilo o bromoacetatode terc-butilo

(9 mmoles).Tras dejar que la reacción transcurraa temperaturaambientedurantetoda la noche,se elimina el disolventey, a continuación,se extraecon

AcOEt y selava con H20 y con disoluciónsaturadade NaCí, sucesivamente.El

extracto orgánico se secasobreNa2SO4 y se evaporaa presión reducida. El

residuo obtenido se purifica por cromatografíaen columna de gel de sílice,

utilizando el sistemade eluyentesquese especificaen cadacaso.

Los productosobtenidospor estemétodose describena continuación,consus correspondientesdatosanalíticosy espectroscópicos.

(5S)-2-Bencil-5-(bendilaricarbonil)amino-&fenil-2-metoxicarbonW

*axohexanoatodemetilo (61)

Fluyente:AcOEt-hexano(1:4). Rendimiento:85%. Sirupe.

‘H RMN (90 MHz, CDCl3): ~ 7,3-6,8Em, 15 14, C6H5 y Ph (Z)], 5,2 (d, 1 H, 5-NH),

5,0 Ls, 2 14, CH2 (Z)], 4,5 (ni, 1 14, H-5), 3,6 (s, 6 14, CO2CH3), 3,3 (s, 2 14, 2-CH2),

2,9 (m, 4 H, 14-3 y 14-6).

Análisis elemental(%) C 14 N

Calculado(C30H31N07) 69,62 6,04 2,71

Encontrado 69,71 5,95 2,56

(5S)-2-Bendil-5-(bendiloxicarbonil)amino-64indol.3’-il)-2-metoxicarbonil-4-oxohexanoatodemetilo (62)

Fluyente: AcOEt-hexano(1:3). Rendimiento:82%.Sirupe.

— 127 —

1H RMN (300 MHz, DMSO-d6Á¿ 10,87 (s, 1 H, NS), 7,88 (d, 1 H, 5-NH, J= 8,1),

7,53-6,87[ni, 15 H, In, C6145y Ph (Z)], 5,04 lId, 1 11, CH2 (Z), J = 12,9], 4,98 lid, 1 14.

CH2 (Z)], 4,31 (ni, 1 U, 14-5), 3,61 (s, 6 14, CO2CH3),3,22 (s, 2 H, 2-CH2), 3,10 (m,

214,11-3y 14-6), 2,98(d, 1 14, 14-3,J= 19,2),2,89(dd,1 14, 14-6,J = 14,7 y 9,3).


Calculado(C32H32N207) 69,05 5,79 5,03

Encontrado 68,89 5,77 5,22

(68)-64Bendiloakarbonil)amino-7-fenil-3,3-dirnetaricarbonil-

5-oxoheptanoatodeetilo (63)

Eluyente:AcOEt-hexano(1:3). Rendimiento:82%. Sirupe,

1H R1VIiN (90 MHz, CDCl3): 8 7,3-7,0[ni, 10 14, C6115y Ph (Z)], 5,2 (d, 1 14, 6-NH),

5,0 Es, 2 14, CH2 (Z)], 4,5 (ni, 1 H, H-6), 4,0 lIc, 2 14, CH2 (Et)jJ, 3,6 (s, 6 14, C02C143),

3,3 (s, 2 14, 14-2), 3,0 (m, 4 H, 14-4y 14-7), 1,1 lIt, 3 11, CH3 (EtA.


Calculado(C271431N09) 63,15 6,08 2,73

Encontrado 63,08 6,27 2,81

(GS)-6-(Bendiloxicarbonil)amino-7-(indol-3‘-il)-3,3-dimetoxicarbonil-

5-oxoheptanoatodeetilo (64)

Eluyente:AcOEt-hexano(1:3). Rendimiento:89%. Espuma.

1H RMN (90 MHz, CDCIs): 6 8,2 (s, 1 14, NHi), 7,6-6,9 [ni, 10 14, In y Ph (Z)], 5,4

(d, 1 14, 6-NII), 5,0 [s, 2 14, CH2 (Z)], 4,6 (m, 1 14, 14-6), 4,0 lIc, 2 14, CH2 (Et)], 3,6 (s,

6 14, CO2CHs), 3,3 (s, 2 14, 14-2), 3,1 (m, 2 14. 14-7), 3,0 (s, 2 14, 14-4), 1,2 [t. 3 H,

CH3 (Et)].

Análisis elemental(%) C Ii N

Calculado(C29H32N209)

Encontrado

63,04

62,97

5,84

5,77

5.074,84

— 128 —

(5S)-5-(Bendiloxiearboniflamino-6-(indol-3‘-il)-2-metil-2-metoxicarbonil-4-oxoheranoatodemetilo (66)


1H RMIN (300 MHz, DMSO-dÓ: 8 10,86 (s, 1 14, NH~), 7,80 (d, 1 14, 5-NH, J = 7.8),

7,56-6.96Em, 10 14, In y Ph (ZXl, 5,03 [d, 1 H, CH~ (Z), J = 12,7], 4,96 [d, 1 14,

CH2 (Z)], 4,30 (m, 1 14. 14-5), 3,60 (s, 6 14, C02C143),3,23 (d, 1 14, 14-3, J = 18,4),

3,10 (dd, 1 14, 14-6, J = 14,3 y 5,7), 3,08(d, 1 14, 14-3), 2,89(dd, 1 H, 14-6, ¿1 = 14,3y

9,3), 1,31(s, 3 H. 2-CH3).


Calculado(C26H28N207) 64,99 5,87 5,83

Encontrado 64,87 5.91 5,55

(6S)-6-(Bendilaxicarboniflwnino-7-(indol-3’-il)-3,3-dimetoxiearbonil-5-oxoheptanoatodeterc-butilo (118)


1H RMN (300MHz, CDCl3): 8 8,10 (s, 1 14, NHi), 7,62-6,99[ni, 10 14, In y Ph (Z)1,

5,36 (d, 1 14, 6-NH, J = 6,9), 5,05 lIs, 2 14, CH2 (Z)], 4,68 (ni, 1 14, 14-6), 3,68(s, 6 H,

C02C143),3,40(s, 214,14-2), 3,33, (dd, 114, 14-7, J = 15,1y 6,0), 3,15 (dd, 1 14, 14-7,J = 15,1 y 5,8), 3,00 (s, 2 14, H-4), 1,39 lIs, 9H, CH3 (CO2tBu)].

Análisis elemental( c,> C 14 N

CaJculado(CaíH3eNaOg) 64,13 6,25 4,82

Encontrado 64,41 6,50 5,04

— 129 —

3.4. SINTESISDE 2,5-DICETOPIPERIDINAS

3.4.1. SÍNTESIS DE 3-METOXICNRI3ONIL-2,5-DICETOPIPERIDINAS6-SUSTITUIDAS

Método1: Calefacciónen MeOHde 4-cetodiésteres

Se disuelve el 4-cetodiéster37 ó 38 (5 mmoles)en MeOH (150 mL) y se

añadeun 10% de Pd-C (10%). La suspensiónasí obtenida se hidrogena a

temperaturaambientey 25 psi de presióndurante1 E. Tras comprobarporcromatografía en capa fina la desproteccióndel grupo amino, se separael

catalizador por filtración y la disolución sc calienta a reflujo durante 4 h. A

continuación, se elimina el disolvente y el residuo obtenido se purifica por

cromatografíaen columnade gel de sílice, utilizando comoeluyenteel sistema

que seindica en cadacaso.Aunque esteprocedimientono permitió la obtención de las 2,5-diceto-

piperidinas buscadas,a continuación se describen los dos derivados depirazinaobtenidos.

3,6-Dibendil-2,5-bisI(21,2-dimetoxicarbonifletil]pirazina(41)

Eluyente:AcOEt-hexano(1:2). Rendimiento:12%.Sólidoblanco.PS: 133-1340C (EtOH).

1H RMN (300 MHz, CDCla): 8 7,30-7,15(ni, 10 14, CeHs), 4,16 (t, 2 14, 14-2,J = 7,4),4,10 (s, 4 14, 3- y 6-CH

2), 3,67 (s, 1214, CO’2CH3), 3,37(d, 414,2- y 5-CHg,

J — 7 4).

13C RMN (75 MHz, CDCl3): 8 169,76(CO2), 150,25, 147,91(C-2y C-5, C-3 y C-6),

137,89, 128,76, 328,51,126,43(CsHs),52,57(OCR), 49,05(C-20,40,19(3- y 6-CH2),

31,95 (2- y 5-CH2).

EM: 549 (M~ + 1, 25,43),548 (Mt, 100,00),489 (M~ —59, 51,24),457 (M~ — 91,

26,18),430 (M~ — 118, 5,83), 3,66 (M~ — 182, 2,85), 91 (Bn, 93,92), 59 (CO2Me,

13,28).

— 130—

Análisis elemental(%) C H N

Calculado(CsoHa2N2Os) 65,68 5,88 5,11Encontrado 65,34 6,25 5,32

2,5-Bis[(2 ‘,2Sdimetaxicarbonil)etill-3,6-bis[(indol-3’~il)meW]pfrazinn (42)

Eluyente:AcOEt-hexano(lxi). Rendimiento:31%.

Sólidoblanco.PI: 168-1690C (AcOEt-hexano).

1H RlIIiN (300MHz, DMSO-d6):8 10,89(s, 2 H, NBÚ, 7,52-6,92(ni, 10 H, In), 4,16

(s, 414, 3- y 6-CH2),4,06 (t, 214,14-2,J = 7,2), 3,58(s, 12 14, C02C143),3,35(d, 4 14,2- y 5-CH2,J = 7,2).

1~C RMN (75 MHz, DMSO-d6): 6 169,32(CO2), 150,20, 147,54(C-2 y C-5, C-3 y

C-6), 136,18, 126,99, 123,12,121,09, 118,54,118,44, 111,39, 110,64 (In), 52,35

(0C143),48,69 (C-2), 31,48,30,52 (2- y 5-CH2, 3- y 6-CH2).


Calculado(C34H34N408) 65,17 5,47 8,94

Encontrado 65,33 5,66 8,99

Método2: Hidrogenaciónde 4-cetodiésteres

A una disolución del 4-cetodiéster37, 38, 51 6 52 (5 mmoles) en MeOH

(150mL) se le añadeun 10% de Pd-C (10%) y la suspensiónse bidrogenaa

temperaturaambientey 25 psi de presióndurante6 días.Una vez separadoel

catalizadorpor filtración, se elimina el disolventey el residuo resultantesepurifica por cromatografíaen columnade gel de sílice, utilizando el sistemade

eluyentesqueseespecificaen cadacaso.

Método3: Hidrogenaciónde 4-cetodiésteresnionoactivados

A unadisolucióndel 4-cetodiéster37 ó 38 (5 mmoles)en MeOH (50 nI) sele añadeNaOH 2 N (2,5 mL, 5 inmoles) y se agita a temperaturaambientedurante2 h. A continuación,se elimina el disolventey el residuo obtenidose

—131—

disuelve en 1420 (40 mL) y se acidifica bastaPH 3 con HCl 1 N, extrayendo

seguidamenteel ácido así liberado con AcOEt. El extracto orgánico se secasobreNa2SO4y se evaporaa sequedad.El nuevo residuo se disuelve en THF

(50 mL) y se le añadenHOSu (5 mmoles)y DCC (5 mmoles).Despuésde agitar

a temperaturaambientedurante30 mm, y tras comprobarpor cromatografíaen capafina la formación del ésteractivado, se separapor filtración la DCUformaday se elimina de nuevo el disolvente.El residuoresultantese disuelve

enAcOEt (150 mL) y la disoluciónse hidrogenaen presenciadeun 10% dePd-C(10%) a temperaturaambientey 25 psi de presióndurante3 días.Transcurridoestetiempo, se separael catalizadorpor filtración y el disolventese elimina porevaporación a presión reducida. Finalmente, los productos obtenidos sepurifican por cromatografíaen columnade gel de sílice, utilizando el sistema

de eluyentesindicadoen cadacaso.

A continuaciónse detallanlos productosobtenidospor estosdos últimos

métodos.

(3S)-6-Bendil-3-metoxiearbonil-2,5-dicetopiperidina(45W

Eluyente:AcOEt-hexano(1:1). Rendimiento:42% (a partir del compuesto37,método2); 60% (a partir de37, método3).

Sólido blanco.P.f.: 15 1-152CC (EtOH).

EM: 262 (M~ + 1, 8,69),261 (Mt, 8,95),202 (M~ —59, 28,45),170 (M~ —91, 5,83),91

(Bn, 100,00),59 (CO2Me,5,93).


Calculado(C14H15N04) 64,36 5,79 5,36

Encontrado 64,10 5,89 5,60

(SS,65)-y (3I~~

2,5-dicetop~pcridbm(48a) y (4Gb)

Eluyente:AcOEt-hexano(2:1). Rendimiento:42% (a partir del cetodiéster38,método 2); 40% (a partir de 38, método 3). Espuma. Proporción de

diastereoisómeros(3S,6S)/(3R,6S)5:2 (método2) y 3:2 (método3).

—132—

EM: 300(Mt, 3,96), 130(CgHgN, 100,00).

Análisis elemental(%) C FI N 1Calculado(C161116N204) 63,99 5,37 9,33Encontrado 64,15 5,60 9,65

(3W6R)-6-Bendil-3-metoxicarbonil-2,5-dieetopiperidina(53a)

Eluyente:AcOEt-hexano(1:1). Rendimiento:30% (a partir de 51, método2).Sólido blanco.PI: 15 1-152

0C (EtOH).

Análisis elemental(Wc) C 14 N

Calculado(Cí4HísNO4) 64,36 5,79 5,36

Encontrado 64,06 5,58 5,43

(3W611)- y (3S,6P0-6-(Indol-3-il)ntetil-3-metoxicarbonil-

~5-diceto¡4peridina (Ma) y (Mb)

Eluyente:AcOEt-hexano(2:1). Rendimiento:34% (a partir del cetodiéster52,método 2). Espuma.Proporciónde diastereoisómeros(3R,6R)/(3S,6R)6:5.

Análisis elemental (Wc) C 11 N

Calculado(C16H16N204) 63,99 5,37 9,33Encontrado 63,78 5,46 9,37

Los datosde 111 RMN de los productosobtenidospor estosdos métodosse

encuentrandetalladosen la tabla 21. Asimismo, en la tabla 22 se recogenlos

datosde ‘3C RMN delos derivadospertenecientesa la serie L.

Al aplicar el método2 a la preparaciónde estas2,5-dicetopiperidínas,seaislaron pequeñas cantidadesde los derivados de pirazina descritosanteriormente41 y 42. Así, a partir de los cetodiésteres37 y 51 seobtuvoun 2 yun 3%, respectivamente,del producto 41. Del mismo modo, a partir de loscetodiésteres38 y 52 se obtuvo el derivado 42, siendo los rendimientosrespectivosdel 4 y del 3%.

— 133—

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3.4.2. SÍNTESISDE 6RALQUIL4METOXICARBONIJr

2,5-DICETOPIPERIDINAS3,3-DISUSTITUIDAS

MétodoA

A una disolución del derivado de 2,5-dicetopiperidina 45a ó 46ab

(1,5 mmoles) y NaMeO (1,6 mmoles) en DME (10 mL) se le añadeel agente

alquilantecorrespondiente,bromurode bencilo,bromoacetatode etilo o yoduro

de metilo (4,5 mmoles). Despuésde agitar a temperatura ambiente bajo

atmósferade argón durante6-7 h, seelimina el disolventey el residuoobtenido

se extrae con AcOEt y se lava, primero con 1420 y despuéscon disolución

saturadade NaCí. La fase orgánica se secasobreNa2SO4 y, tras eliminar el

disolventepor evaporacióna presiónreducida,sepurifica el residuoresultante

por cromatografíaen columna de gel de sílice, utilizando como eluyente el

sistemaque se indica en cadacaso.

Método13

A unadisolución del compuesto45aó 46ab(1 mmol) y C1131 (8 mnioles)en CH2Cla(1 mL) sele añade(n-Bu)4N14S04(1 mmol) previamentedisuelto en

NaOH 2 N (1 mL, 2 mmoles).Despuésde 6 días de agitacióna temperaturaambiente,la mezclade reacciónse trata con C142C12(50 mL) y 1120 (5 mL), seseparala fase orgánica,se secasobre Na2SO4y se elimina el disolventepor

evaporación.Finalmente,el residuoobtenido se purifica por cromatografíaencolumnade gel de sílice, utilizando como eluyente el sistemaespecificadoen

cadacaso,

Método C

Una disolucióndel 4-cetodiéster61-66ó 118 (2 mmoles) en MeOH (200 mL)sehidrogenaa temperaturaambiente,en presenciade un 10% de Pd-C (10%),a

30 psi de presión durante 7 días. Transcurrido este tiempo, se separaelcatalizadorpor filtración y se elimina el disolventepor evaporacióna vacío. El

residuo obtenido se purifica por cromatografíaen columna de gel de sílice,utilizando el sistemade eluyentesindicadoen cadacaso.

—136—

Los productosobtenidospor estosmétodos,junto con susdatosanalíticos

y de espectrometríade masas, se detallan a continuación. Los datos de114 RMN y de ‘3C RMN serecogenen las tablas23 y 24, respectivamente.

(3S,6Sky (3R,6S$3,6-Dibendil-3-metaricarbonil-2,5-dicet-opiperidina(55Wy (55b)

Eluyente:AcOEt-hexano(1:3). Rendimiento:57% (a partir del compuesto45a,

método A); 67% (a partir de 61, método C). Espuma. Proporción dediastercoisómeros(3S,6S)/(3R,6S)2:1 (métodosA y C).

EM: 352 (M~ + 1, 12,32),351(Mt, 19,55),292(M~ —59, 21,48),260(M~ —91, 25,32),91 (Bn, 100,00), 59 (CO

2Me,6,83).


Calculado(C2iH2iNO4) 71,78 6,02 3,99

Encontrado 71,51 5,85 4,15

(3S,6S)-y (3WOS)-3-Bendil-6-(indol-3’-il)metil-3-metoxicarbonil-

2,5-dicetop~peridbm(56W y (56b)

La cromatografía en columna con AcOEt-hexano (1:1) condujo a la

mezclade los dos diastereoisómeros.Rendimiento: 17% (a partir de 46ab,

método A); 62% (a partir del cetodiéster62, método C). Proporción dediastereoisómeros(3S,6S)/(3R,6S)2:1 (métodosA y C). La separaciónde los dosdiastereoisómerosse llevó a cabo por cromatografía preparativa encromatotrón,utilizando comoeluyenteC142C12-MeOH(200:1).

Isómero(3S,6S):56a

Espuma.

EM: 390 (Me, 4,30), 130(C91{gN, 100,00).

Análisis_elemental(Wc,> C H NCalculado(C23H22N204) 70,75 5,68 7,17

Encontrado 70,52 5,90 6,89

— 137 —

Isómero(3R,SS):56b

Espuma.


[alculadoC (C231422N204) 70,75 5,68 7,17Encontrado 70,46 5,88 6,95

(31?,6S)-y (3S,6S)-&Bencil.3-(etoxiearbonil)metil-3-nwtoxicarbonil-2,5-dicetopjperidina(57Wy (57b)

Eluyente: AcOEt-hexano(1:1). Rendimiento: 54% (a partir del producto45a,

método A); 50% (a partir de 63, método C). Sólido blanco. Proporción de

diastereoisómeros(3R,6S)/(3S,6S)3:1 (métodosA y C).

EM: 347 (Me, 16,59),288 (M~ — 59, 63,78),256 (M~ — 91, 29,12),91 (Bn, 100,00),59 (CO2Me, 13.68).

Análisis elemental(%) C _ H NCalculado(C18H21N06) 6224 6,09 4,03

Encontrado 62,01 5,97 4,20

(31?,68)- y (3S,GS)-3-(Etoxicarbonil)metil-6-(indol-3‘-i1)metil-3-metoxiearbonil-

Z5-dicetop~ridina(58a)y (58b)

Eluyente:AcOEt-hexano(1:1). Rendimiento:55%(a partir del compuesto46ab,

método A); 67% (a partir de 64, método C). Espuma. Proporción de

diastercoisómeros(3R,6S)/(3S,6S)2:1 (métodosA y C).

EM: 386 (Mt, 4,56), 130 (CgH8N, 100,00).

Análisis elemental(Wc,> C 14 NCalculado(C201422N206) 62,17 5,74 7,25Encontrado 62,08 6,00 7,50

— 13S—

(3$6S)-y (3W6S)-6-Bencil-3-meW-3-metadcarbonhl-2,5-dicetopiperklina(5%)y (59b)

Eluyente:AcOEt-hexano(1:2). Rendimiento:31% (a partir de 45a, método B);

70% (a partir del compuesto 65, método C). Espuma. Proporción

diastereoisómeros(3S,6S)/(3R,6S)2:1 (métodosB y O).

EM: 275 (Mt 12,23),260 (M~ — 15, 20,41),216 (M~ — 59, 45,23), 184 (M~ — 91,29,62),91 (Bu, 100,00),59 (CO2Me,7,17).

Análisis elemental ( 6 C 14 N

Calculado(C151417N04) 65,44 6,22 5,09

Encontrado 65,24 6,18 5,13

(SS,65)-y (3W68)-6-<’Indol-3‘-il)metil-3-nwtil-3-metoxi.carbonil-2,5-dicetopiperidina(60Wy (60b)

Eluyente:AcOEt-hexano(2:1). Rendimiento:16% (a partir de 46ab,métodoA);41% (a partir de 4Bab, métodoB); 61% (a partir de 66. método C). Espuma.

Proporciónde diastereoisómeros(3S,6S)/(3R,68)2:1 (métodosA, B y O).

EM: 314 (Mt 3,38),130 (CgHsN,100,00).

Análisis elemental(%~) __ C 14 NCalculado(Cí7HisN2O4) 64,96 5,77 8,91

Encontrado 64,79 6,08 8,88

(311,65)-y(35,6S)-3-(terc4?utoxicarbonil)metil-&(indol-3’-il)metil-3-metoxicarbonil-2,5-dketopiperidina(119a)y (119b)

Eluyente:AcOEt-hexano(1:1). Rendimiento:79% (a partir de 118, métodoO).

Espuma.Proporciónde diastereoisómeros(3R,6S)/(3S,6S)2:1.

Análisis elemental(Wc) C 14 NCalculado(C221126N206) 63,76 6,32 6,76

Encontrado 63,61 6,60 7,01

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3.4.3. SÍNTESISDE PSEUDODIPÉPTIDOSCETOMETILÉNICOSCÍCLICOS

Ácidos(SS,68)-y (3W6S).6Z(indol-3 ‘-iDmetil-2,5-dicetopiperidina-3.carfr«ilicos (67a)y (67b)

A unadisolución de46ab(0,6 g, 2 mmoles)en MeOH (40 miL) sele añade

NaOH 2 N (1 mL, 2 mmoles)y se agita a temperaturaambientedurante3 h.Tras eliminar el disolvente por evaporacióna presión reducida, el residuoobtenidose disuelveen H20 (20 mL) y seacidifica hastapH 3 con 14011 N. A

continuación,se extraecon AcOEt, se secael extractoorgánicosobreNa2SO4y

se evapora el disolvente a sequedad.El residuo resultantese purifica porcromatografía en columna de gel de sílice, utilizando como eluyenteCH2CI2-MeOH (8:1) conteniendo0,1% de AcOil, para dar lugar al producto

G7ab como un sólido blanco (0,24 g, 42%). Proporción de diastereoisómeros

(3S,68)/(3R,GS)3:1 -

½iRMIN (300MHz, DMSO-d6):

Isómero(38,65):a 10,93 (s, 1 14, NH~), 7,50-6,88(m, 6 14, In y 14-1), 4,07 (m, 1 14, 14-6), 3,20 (dd.

1 14, H-7, J 14,6y 5,0), 3,02 (m, 2 14, 14-3y H-7), 2,61 (dd, 1 14, 14-4, J = 16,4y 7,0),

2,21(dd, 1 14, 14-4,J = 16,4y 5,5).

Isómero(3R,65):

8 10,75 (s, 1 14, NS), 7,50-6,88(ng 6 14, In y 11-1), 4,15 (m, 1 14, 14-6), 3,72 (dd,1 14,14-3,J 110,4 y 5,6), 3,13(m, 1 14, 14-7), 3,02(m, 1 14, 14-7), 2,65(dd, 1 H, 14-4,J = 16,6y 5,6),2,41 (dd, 1 II, 14-4, J = 16,6y 10,4).

130 RMiN (75 MHz, DMSO-d6):

isómero(35.68):8 206,85(C-5), 177,08(00214),170,57(0-2), 135,96, 127,35, 124,56,120,87,118,66,

118,40, 111,36, 108,73(In), 59,97(0-6), 50,79(0-3), 27,59(0-7).Isómero(3R,6S):

a206,85(0-5), 177,02(00214), 171,73(0-2), 135,96,127,27, 124,28, 120,77. 118,93,

118,34, 111,22,108,73,(In), 59,97(0-6), 50,79(C-3), 27,59(0-7).

EM: 242 (M~ —44, 3,64),130 (09145N,100,00).

— 143

Análisis elemental(%) O H N

Calculado(C15H14N204) 62,93 4,93 9,79

Encontrado 62,66 5,15 9,64

cicloflYp ‘4COCHy2JGIy] (69)

Se calienta a reflujo durante 2,5 h una disolución de 67ab (0,2 g,0,7 mmoles) en dioxano (20 mL). Despuésde eliminar el disolvente por

evaporacióna vacío, el residuo obtenido se purifica por cromatografíaencolumna de gel de sílice, utilizando como sistemade elución CHCI3-MeOH

(10:1), paradar lugar al producto69 (0,07 g, 41%) en forma deespuma.

‘H RMiIN (300 MHz, DMSO-d6): 6 10.92 (s, 1 14, NH~), 7.73 (d, 1 14. cx-NH-Trp,J = 2,1), 7,48-6,93(m, 5 14, In), 4,07 (m, 1 14. cí-Trp), 3,19 (dd, 1 14, 3-Trp, J = 15,9

y 5,3), 3,02 (dd, 1 14, f3-Trp, J = 15,9 y 5,1), 2,51 (m, 1 14, cz-Gly), 2,25 (m, 1 14,

000142),2,11 (m, 1 H, 000142),1,78 (m. 1 14. cz-Gly).

13C RJYTiN (75 MHz, DMSO-d6): 6 208,02(COCH2), 170,77(CONH), 135,98, 127,14,

124,55,120,99,118,66,118,50, 111,32,108,83(In), 60,77(ct-Trp), 35,38(000142).28,51,y 28,21 (a-Glyy ~B-Trp).

EM: 242 (Mt 3,50), 130(C9HgN, 100,00).

Análisis elemental(Wc,> C 14 NCalculado(0141414N202) 6941 5,82 11,56

Encontrado 69,35 5,99 11,50

ciclo[Phe tflCOCHJ~arnbo.Phe](7Oab)

A unadisolucióndel compuesto55ab(0,35 g, 1 mmol) en dioxano(20 mL)se le añadeNaOH 2 N (0,5 mL, 1 mmol) y se agita bajo atmósferade argóndurante3 h. Despuésde eliminar el disolvente por evaporacióna presiónreducida,el residuoresultantese disuelveen 1420 (10 mL) y se acidíficahasta

pH 3 con 1401 1 N. A continuación se extraecon AcOEt, se seca el extractoorgánico sobre Na2SO4 y se evaporacl disolventea sequedad.El crudo de

reacción obtenido se disuelve en dioxano (25 mL) y se calienta a reflujo

144—

durante5 h. Tras eliminar el disolvente, el residuo obtenido se purifica por

cromatografíaen columnade gel de sílice, utilizando AcOEt-hexano(1:2) comoeluyente,paradar lugar al producto7Oabcomoun sólido blanco(0,18 g, 63% apartir de 5Sab).Proporcióndediastereoisómeros(3R,68)/(3S,6S)2:1.

‘H RMN (300 MHz, DMSO-d@):

Isómero (3R,6S):8 7,87 (s, 1 H, KB), 7,25-6,96(m, 10 14, 06145),4,26 (m, 1 14, u-Phe1),2,96-2,80(m,4 14, a-Phe2,[3-Phe1,3-Phe2),2,28 (dd, 1 14, 000142,J = 16,6 y 5,4), 2,10 (m, 1 14,j3-Phe2),1,85(m, 1 14, COCH

2).

Isómero (3S,6S):8 7,92 (4, 1 14, NH, J = 2,0),7,25-6,96(m, 10 14, C6145),4,04 (m, 1 14, cx-Phe

1),3,08(dd, 1 14, 13-Phe’,J = 13,4y 4,9), 2,96-2,80(m, 2 H, I3-Phe’ y 13-Phe2),2,49(m, 1 H,

ct-Phe2),2,41 (dd, 1 14, g-Phe2,J = 14,2 y 9,3), 2,32(m, 1 H, COCI-{2), 1,94 (dd, 1 14,

COCH2,J = 16,2y 4,4).

EM: 293 (Mt 44,97),202(M~ —91, 5,39), 91 (Bn, 100,00).

Análisis elemental(Wc) O 14 N

Calculado(C191419N02) 77,79 6,53 4,77

Encontrado 77,60 6,70 4,53

—145—


Calculado(015H24N205) 57,68 7,74 8,99Encontrado 57,71 7,63 8,67

3.5. SÑTESIS DE3-OXOINIJOLIZIIDINAS

3.5.1. SÍNTESISDE 8-(terc-BUTOXJCARBONIL)AMJNO-

2-METOXICARBONJL-3-OXOINDOLIZIDJNAS


A una disolución del 4-cetodiéster72 u 80 (5 g, 10 mmoles) en MeOH

(200 mL) se le añadeun 10% de Pd-C (10%) y la suspensiónse hidrogenaa

temperaturaambientey 30 psi de presióndurante4 h. Una vez separadoel

catalizadorpor filtración, se elimina el disolventey el residuoresultantese

purifica por cromatografíaen columna de gel de sílice, utilizando comosistema de eluyentesAcOEt-hexano (1:1), obteniéndoseen cada caso los

productosque se describena continuación.

(211$8StSaR*).y (2RS,8St8aS*).8.(terc.Butoxicarbonll)amino~2-metoxicarbonil-3-oxoindoflzidina(‘73ab)y (‘73c4>

Rendimiento:2,96 g (95%).Espumablanca.

HPLC: tR = 9,95 y 10,46mm; eluyenteA (30:70);columnanúm. 1.

Análisis elemental(Wc) O 14 NCalculado(C15H24N205) 57,68 7,74 8,99Encontrado 57,50 7,38 8,75

(2RS8Rt8aS*).y (211$8Rt8aR*)~8~(terc.Butoxicarboni1)wnino~2-metoxicarbonil-3-oxoindolizidina(Slab) y (8lcd)

Rendimiento:2,92g (94%).Espumablanca.

Los datosde 111 RMN y 130 RMN de estoscompuestosseindican en las

tablas25 y 26, respectivamente.

—146—

35.2. PREPARACIÓN DE 8-(terc-BUTOXICARBONIL)AMINO-

3-OXOINDOLIZIDINA

Ácidos (2RSSSS8aR*).y (211$8S*,8aS*).8.(terc.butaricarbonil)wnino~3-aroindolizidinar2-carboxí-lieos(‘YOab) y (‘76cd)

Procedimiento1: Hidrólisis del compuesto73

A unadisoluciónde 73 (0,72 g, 2,8 mmoles)en MeOH (lOiniL) sele añadeNaOH 2 N (1,5 miL, 3 mmoles)y se agitaa temperaturaambientedurante1 h.Tras eliminar el disolvente por evaporacióna presión reducida, el residuoobtenidose disuelveen 1420 (10 mL) y se acidifica hastapH 3 con BOl 1 N. A

continuacionse extraecon AcOEt, se secael extractoorgánicosobreNa2SO4y

se evaporael disolventea sequedad,obteniéndoseel producto 76 en forma desólidoblanco(0,61 g, 90%).

Procedimiento2: Hidrogenacióndel 4-cetodiácido77

A una disolución del 4-cetodiéster72 (2,5 g, 5 inmoles)enMeOH (50 mL)

se le añadeNaOH 2 N (5 mL, 10 mmoles) y se agita a temperaturaambiente

durante 2 h. Despuésde eliminar el disolvente por evaporacióna presiónreducida,eí residuoresultantesedisuelveen H20 (30 mL) y se acidifica hasta

pH 3 con HCl 1 N. A continuaciónse extraecon AcOEt, se secael extractoorgánico sobre Na2SO4y se evaporael disolventea sequedad.El crudo de

reacciónobtenido se disuelveen MeOR (100 niL) y la disolución se hidrogenaa

temperaturaambiente,en presenciade un 10% de Pd-C (10%), a 30 psi de

presión durante4 h. Transcurridoestetiempo, se separael catalizadorpor

filtración y se elimina el disolventepor evaporacióna vacío para dar lugar al

producto76 (sólido blanco,1,4 g, 94%).

EM: 299 (M~ + 1, 0,05), 298 (Mt, 0,07), 254 (M~ —44, 1,11), 197 (M~ — 101, 2,35),181 (Mi— 117, 22,03),151 (Mt— 147, 1,02), 137 (Me— 161, 100,00),57 (tBu, 81,61).

Análisis elemental (Wc) 0 14 NCalculado(C14H22N205) 56,36 7,43 9,39Encontrado 56,21 7,79 9,07

— 147—

Los datosde 1H RMN y 130 RMN de estecompuestoseencuentranen las


(8St8aR*)~y (8St8aS*).&(terc.Butat~icarbonU)amino~3-oxoindoilzidina(78a)y (178b)

Se calienta a reflujo durante 15 h una disolución de 76 (0,43 g. 1,4

mmoles) en dioxano (25 mL). Después de eliminar el disolvente por

evaporacióna vacio, se obtiene el compuesto78, constituidopor una mezclade

dos diastereoisómerosen proporción 12:1, determinadapor HPLC [Eluyente B

(25:75); columnanúm. 2]. La cromatografíaen columnade gel de silice con e]

sistema de eluyentesCH2CI2-MeOH (40:1) conducea la separaciónde los dos

diastereoisómeros,que se describena continuación.

Isómero(8St8aS*):78b

Rendimiento:20 mg (5,5%). Espuma

HPLC: tR = 10,94mm; eluyenteB (25:75);columnanúm. 2.

Isómero(8St8aR*): 78a

Rendimiento:260 mg (71%). Espuma.

HPLC: tR = 12,39mm; eluyenteB (25:75);columnanúm. 2.

Análisis elemental(Wc,> O 14 N


Los datosde 114 RMN de estoscompuestosestánrecogidosen la tabla 25.

— 143 —

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3.5.3. SÍNTESISDE S-(terc-BUTOXICARBONIL)AMINO-2-METOXICARHONJL-

3-OXO1NDOLIZJDJNAS 2,2-DISUSTITUIDAS

3.5.8.1. Preparacióndederivados2-bencil,,2-etoxicarbonilinetil

y2-terc-butoxicatbonilmetil sustituidos


A una disolución del derivado de 3-oxoindolizidina 73 u 81 (1,56 g,

5 mmoles) y NaMeO o NaH (8,5 mmoles)en DME o THF (40 mL) sele añadeel

agentealquilantecorrespondiente,bromurode bencilo,bromoacetatode etilo obromoacetatode terc-butilo (8,5 mmoles). Despuésde agitar a temperatura

ambientedurante2 h, se elimina el disolventey el residuoresultantese extraecon AcOEt y se lava con 1420 y con disolución saturada de NaC1,sucesivamente.La fase orgánica se secasobre Na2SO4 y, tras eliminar el

disolvente,sepurifica el residuoobtenidopor cromatografíaen columnade gelde sílice, utilizando como eluyenteel sistemaquese especificaen cadacaso.

Los productos obtenidos por este procedimiento se detallan a

continuación.Los datosde 114 RMN y 150 RMN serecogenen las tablas27 y 28,respectivamente.

Alquilación de 73 con bromurode bencilo

(2St8St8aS*).2.Bencil~8~(terc-butoxicarbonibamino-2-metoxi-carbonll-3-oxoindolizidina(82c)

Eluyente:AcOEt-hexano(1:2). Rendimiento:4,5%. Sirupe.

HPLC: tR = 17,83 mm; eluyenteA (45:55);columnanúm. 1.

Análisis elemental(%,> 0 14 NCalculado(C22H30N205) 65,65 7,51 6,96Encontrado 65,48 7,71 6,76

— 151—

(2Rt8St8aR*).2.Bendil~8.(terc~butoxicarbonh1)cunino.2.metoxicarbonll.3-oxoindolizidina(82W

Eluyente:AcOEt-hexano(1:2). Rendimiento:50%. Espumablanca.

HPLC: t~ = 15,56mm; eluyenteA (45:55);columnanúm. 1.

EM: 402 (Me, 0,54),345 (M~ — 57, 1,57), 285 (M~ — 117, 100,00), 226 (M~ — 176,9,39), 194 (M~ —208,98,70),91 (Bn, 34,14),57 (tBu, 31,93).

Análisis elemental(Wc,> 0 14 N 2

6,96Calculado(CnHsoN2O5) 65,65 7,51Encontrado 65,52 7,70 7,02

(2St8SS8aR*).2.Bendll.8~(terc.butcxricarboniVwnino-.2-.metoxicarboniJ-.3-aroindolizidina(82b)

Eluyente:AcOEt-hexano(1:1). Rendmiento:10,3%.Espumablanca.

HPLC: t~ = 16,63mm; eluyenteA (45:55);columnanúm. 1.

Análisis elemental(%) 0

KÑlculadoO (C22H30N205) 65,65Encontrado 65,73

14 N

7,517,38 6,966,98

Alquilación de 81 con bromuro de bencilo

(2Rt8Rt8aR*)~2.Bencil.84terc.butoxicarboniVamino-.2~metoxicarbonit3-ojwindolizidina(87c)

Eluyente:AcOEt-hexano(1:2). Rendimiento:4,5%. Sirupe.

Análisis elemental (Wc)

0 14 N


— 152 —

(2SS8Rt8aS*).2~Bencil.8.(terc~butoxiearboniOwnino.2-.metoxicarbonh1.

3-oxoindolizidina(87W

Eluyente:AcOEt-bexano(1:2). Rendimiento:55,6%.Espumablanca.

Análisis elemental (%) 0 14 NCalculado(0221430N205) 65,65 7,51 6,96Encontrado 65,38 7,69 6,91

(2RS8Rt8aS*).2.Bendil~8.(terc-.butoxicarbonhl)amino.2~nwtoxicarbonil.3-ornindolizidina (8Th)

Eluyente:AcOEt-hexano(1:1). Rendimiento:10,0%.Espumablanca.

Análisis elemental(Wc) 0 14 N


Alquilación de 73 con bromoacetatode etilo

(2St8St8aRt)-, (2Rt8SSSaR*)- y (2Rt8St8aS*).8.(terc.ButavicarboniDwnino~

2-(etoxicarbonll)metil-2-metoxicarbonil-3-o.windolizidina(84W, (Mb) y (84c)

Eluyente:AcOEt-hexano(1:2). Se obtieneunamezclade tres diastereoisómeros.

Rendimiento: 59%. Sólido blanco. Proporción de diastercoisómeros(2S*,8S*,8aR*)/(2R~~,8S%,8aRt5:1; (2R~<,8S*,8a&),trazas.


EM: 367 (M~ —31, 1,20), 353 (M~ —45, 5,38),281 (M~ — 117, 64,10),222(M~ — 176,

100,00),194(M~ —204, 19,76),150 (M~ —248, 5,61),57 (tBu, 80,79).

Análisis_elemental(%,>

Calculado(C19H80N207)

0 14 N

57,27 7,59 7,03Encontrado 57,21 7,41 6,95

153—

Alquilación de 73 con bromoacetatode terc-butilo

(‘2St8St8aR*$y (2W’,8St8aRt>-8-(terc-Butoxicarbonll,>amino-2-(terc-butoxicarboniflnwtil-2-nwtaricarbonil-3-aroindolizidina(132Wy (132b)

Eluyente: AcOEt-hexano(1:2). Rendimiento: 70%. Espumablanca. Proporción

de diastercoisómeros(2S*,8St8aRt/(2R*,88*,8aR*)5:1.

Análisis elemental(Wc,> O H NCalculado(C21H34N207) 59,14 8,04 6,57Encontrado 58,97 8,04 6,68

35.32. Obtención de derivados 2-(indol-3’-il)metll sustituidos

A una disolución de 73 (1,56 g, 5 mmoles)en DME (40 mL) se le añaden

NaMeO recientementepreparado(324 mg, 6 mmoles), gramina (871 mg,

5 mmoles)y 0H31 (0,63 mL, 10 mmoles).Tras agitarprimero durante15 mm a

o oo y, después,a temperaturaambientedurante2,5 h, se elimina el disolvente

y el residuo resultantese extraecon AcOEt y se lava, primero con ~ y

despuéscon disolución saturadade NaCí. La fase orgánica se secasobreNa2SO4y se evaporael disolvente a sequedad.El residuo obtenido se purifica

por cromatografía en columna de gel de sílice con el sistema de eluyentes

AcOEt-hexano (1:1), obteniéndoseuna mezclade tres diastereoisómeros.La

cromatografíaen placa preparativa,utilizando como eluyente AcOEt-hexano

(1:2) conducea la separaciónde los mencionadosdiastereoisómeros.

(2St8St8aS*).8.(terc.Butoxicarboni.ikzmino~2~(indol.3t~il)meti1.

2-metoxkarbonll-3-oxoindolizidina(83c)

Rendimiento: 4,3%. Espuma.

HPLC: tR = 19,11 mm; eluyenteA (40:60); columnanúm. 1.

— 154—

Análisis elemental (Wc,> O 14 N1

Calculado(C,24H31N805) 65,29 7,08 9,52Encontrado 65,44 6,95 9,26

(2St8St8aR*)~8.(tere-Bzaaxicarbonil)amino-2-(indol-3‘-¡1)metil-2-metaricarbonil-3-avoindolizidina(SSb)

Rendimiento:8,5%. Espuma.




(2RtSStSaR*)-8-(terc-Butoxicarbonll)amino-2-(indol-3-iDmetil-2-metoxicarbonll-3-axvindolizidina(8%)

Rendimiento: 45,2%.Espuma.

HPLC: tR = 17,18mm; eluyenteA (40:60);columnanúm.1.

Análisis elemental(Wc) 0 14 NCalculado(C24H31N305) 65,29 7,08 9,52Encontrado 65,13 7,21 9,47

Los datosde 114 RMN y 130 RMN de los tres diastereoisómeros83a,83b y

83c seindican en las tablas27 y 28, respectivamente.

— 155—

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3.&3.3. Preparaciónde8-(terc-butoxicarbonil)andno-2-carboxi-3-oxoindoliñdinas2,2-disusfituidas


A unadisolucióndel derivadode 3-oxoindolizidina82a,82b, 82c, 87a,87b,83a,83b ó 132ab(0,3 mmoles)en MeOH (5 miL) sele añadeNaOH 2 N (0,23 mL,

0,45 mmoles)y se agita a temperaturaambientedurante2 días.Tras eliminarel disolventepor evaporacióna presiónreducida,el residuoobtenido sedisuelve

en H20 (10 mL) y se acidifica hastaPH 3 con 1401 1 N. A continuaciónse extrae

con AcOEt, sesecael extractoorgánicosobreNa2SO4y seevaporael disolvente

a sequedad.El residuoresultantesepurifica por cromatografíaen colunma degel de sílice en los casosen quese especifica.

Los productos obtenidos por este procedimiento

continuación.Los datosde 114 RMN serecogenen la tabla 29.

Ácido (2Rt8St8aR*).2~bencil~8~(terc.butoxiearbonil)amino.

3-oxoindolizidino~2-carboxilico(85W

Rendimiento: 98%. Espumablanca.


Análisis elemental (Wc,> 0 14 NCalculado(C21H2sN2O5) 64,93 7,27 7,21Encontrado 64,94 7,33 7,00

Ácido (2SS8SS8aR*).2-bencil-8-(ten,-butoxicarbonil)amino-.

3-cxoindolizidina-2-carbarílico(85b)

Rendimiento: 96%. Espumablanca.

HPLC: t~ = 19,03 mm; eluyenteA (35:65);columnanúm. 1.

Análisis elemental (%) 0 14 N1Calculado(0211428N205)Encontrado

64,9364,82

7,277,43

7,217,15

se detallan a

— 159—

Ácido(2St8SS8aS*)-2-bendd-8-(terc-bu-toxicarbonil)amino-3-avoindolizidina-2-carboxilico(SSe)

Rendimiento:96%. Espumablanca.



Calculado(021H28N205) 64,93 7,27 7,21Encontrado 64,75 6,96 7,45

Ácido (2St8Rt8aS*)~2~bencil.8.(terc~butoxicarboniDamino.3-aniñndolizidin«-2-carbox‘leo (88W




Ácido (2Rt8RS8aSt>-2-bendil-8-(tere-butoxicarboni?)amino-3-oxoindnlizidñuz-2-carboxdico(88b)


Análisis elemental(Wc,> O 14 NCalculado(C21H28N205) 64,93 7,27 7,21

Encontrado 64,72 7,03 7,38

Acido (2RSBSt8aR*)-8-(tec-butox’icarbonil)amino-2-(indol-3-ll)metll-3-acoindolizidin-a-2-earb<yxílieo(86a)

Purificado por cromatografíaen columna. Eluyente:C142C12-MeOH(10:1).

Rendimiento:84%, Espuma.

— 160 —


Análisis elemental(%) 0 14 N 29,83Calculado(C23H29N505) 64,62 6,84

Encontrado 64,28 6,67 9,50

Ácido (2St8St8aR*).8~(t>erc~butoxicarbonll)wnino~2.(indol.3.il)nletll~3aroindolizidinor2-carboxílieo(861>)

Purificado por cromatografíaen columna.Eluyente:C142C12-MeOH(10:1).

Rendimiento:82%. Espuma.

HPLC: t11 = 16,05mm; eluyenteA (35:65); columnanúm. 1.

Análisis elemental(Wc) 0 14 NCalculado(C231429N305) 64,62 6,84 9,83Encontrado 64,45 6,72 9,95

Ácidos(2St8St8aR*$y (2Rt8St8aR*)~8~(terc-butoxicarbonll)amino-

2-(terc-.butoxicarbonWmetil-3-oxoindolizidina-2-.carboxilicos(13%) y (133b)

Rendimiento: 98%. Espuma blanca. Proporción de diastereoisómeros(28*,88*,SaJt)/(2Rt8S’t8aR’*) 5:1.

Análisis elemental(%,> O 14 NCalculado(C20H32N2O-¡) 58,24 7,82 6,79Encontrado 58,10 8,01 6,90

— 161—

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3.5.4. PREPARACIÓNDE DERIVADOS DE MTPA

3.5.4.1. Reaccionesdederivatízación conelácido(R)-(+)-a-metoxi-u-(Úifluorometil)fenilacéúco

Procedimlento general:

A una disolución del 4-cetodiéster72 u 80 ó del derivado de 3-oxo-indolizidina 82a, 87a, 82bu 87b (0,25 mmoles)en C142C12(4 mL) se le añade

TEA (2 mt) y se agita a temperaturaambientedurante1 lv Tras eliminar eldisolventepor evaporacióna presión reducida,el residuoobtenido se disuelve

en CH2Cl2 (5 mt) y se añadenTEA (0,07 mt, 0,5 mmoles) y, a continuación

BOP (122 mg, 0,28 mmoles). Tras 10 mm de agitación, se añadeel reactivo

quiral, (R)-(±)-MTPA(64,5 mg, 0,28 mmoles).Despuésde agitar durante5 h a

temperatura ambiente, se elimina el disolvente y el residuo resultante se

extraecon AcOEt y selava,primero con H20 y despuéscon disoluciónsaturada

de NaCL. La fase orgánica se secasobreNa2SO4 y se elimina el disolvente.El

residuo obtenido se purifica por cromatografíaen columna de gel de sílice,

utilizando el sistemade eluyentesque seespecificaen cadacaso.

Los productos obtenidos por este procedimiento se describen a

continuación.

(5S,2¶?)-8-(BendiloxicarboniVwnino-2-metoxicarbonil-5-(2’-metcix¡-

2’.trifluorometil)fenilacetamido-4-oxooctanoatodemetilo (89)


HPLC: t11 = 11,69 mm; eluyenteA (50:50); columnanúm. 3.

Análisis elemental(%) C 14 NCalculado(C291433F6N209) 57,05 5,45 4,59Encontrado 57,17 5,63 4,32

— 164—

(5E<,2’IR) -8-(Benciloxicarboniflamino-2-metaricarbonil-5-(2-metari-2’-trifluorometil)fenilacetamido4omoctanoatodemetilo (90)


HPLC: tp = 11,69mm; eluyenteA (50:50);columnanúm. 3.

Análisis elemental(Wc,> C 14 NCalculado(C29H33F3N209) 57,05 5,45 4,59Encontrado 56,91 5,55 4,47

Los datosde 114 RMN de los compuestos89 y 90 seindicanen la tabla30.

(21R,SS,8a11,2‘11)- y (28,SW8a$2’RF2-BenciU2-metaricarbonW8-(2’-metari-

2’-trifluorometll)fenilacetamido-3-ornindolizidina(91W y (91b)

Eluyente: AcOEt-hexano (1:1). Rendimiento: 62%. Espuma blanca.proporción de diastereoisómerosobtenida en función de la procedenciadelproductode partidaseindica en la tabla 6.

HPLC: ½= 51.75 mm [isómero (2R,8S,8aR,2R)]; 56,61 mm [isómero(2S,SR,8aS,2’R)];eluyenteA (35:65); columnanúm.3.L Análisis elemental (%)Calculado (C271429F3N205)Encontrado C 14 N1

62,5462,48

5,645,71

5,405.39

(2S.8S,8aPs2rPJ~y (2R,SR,SaS,2’P0-2-Rencil-2-metoxicarbonil-842’-metoxi.2’-trifluorometil)fenil-acetamido-3-awindolizidina(92W y (92b)

Eluyente: AcOEt—hexano (1:1). Rendimiento: 61%. Espuma blanca. La

proporciónde diastereoisómerosobtenidase indica en la tabla6.

HPLC: t~ = 22,53 mm [isómero (2S,8.S, SaR,2 ‘R)]; 24,88 mm [isómero

(2R,SR,8aS,2Rj;eluyenteA (40:60); columnanúm. 3.

La

— 165—

[Análisis elemental(Wc) C H NCalculado(C27H29F5N205) 62,54 5,64 5,40Encontrado 62,61 5,89 5,47

Los datos de 114 RMN de los compuestos9lab y 92ab se encuentran

recogidosen la tabla 31.

3.5.4.2. Reaccionesdederivatizaciónconelclorurode (S)-(+)-ó (R)(-)-&metoxi-cz-(tiifluorometil)fenilacetilo


Una disolución del derivado de 3-oxoindolizidina 82a u 87a (3,2 mg,

8 gmoles)en TFA (200 iL) seagita a temperaturaambientedurante2 h. Tras

eliminar el disolvente,el residuoobtenido se disuelve en piridina (0,5 mt). seañadeel reactivo quiral correspondiente(30 gL, 160 imoles) y la disolución seagRa a temperatura ambientedurante 1,5 h. Transcurrido este tiempo, se

adicionaH20 (25 gL) y, a continuación,se evaporael disolvente.La proporción

de diastereoisómerosse determinaen el crudo de reacción, medianteHPLC,

obteniéndoselos resultadosque se especificanen la tabla 6.

En las reaccionescon (R)-(—)-MTPA-Cl se obtienen los compuestos

(2R,8S,8aR,2’S)-y (28,8R,SaS,2’S)-2-bencil-2-metoxicarbonil-8-(2-metoxi-2-tri-

fluorometil)fenilacetamido-3-oxoindolizidina(93a) y (93b), enantiómerosde91b

y 91a, respectivamente.

— 166—

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3.5.5. OBTENCIÓNDE DERIVADOS DE Sa-HIDROXiI- Y 8a-ALCOXI-8-AMINO-3-OXOINIDOLIZIDINA-2-CARBOXILATO 2-SUSTITUIDOS

3.5.5.1. Reaccionesdehidrogenacióndel2-bencil4cetodiéster

derivado deBoc-Orn(Z)-OH

MétodoA: Reacciónen MeOH

A una disolución del compuesto94 (2,3 g, 4 mmoles)en MeOH (140 mL)sele añaden230 mg de Pd-C(10%) y la suspensiónsehidrogenaa temperatura

ambientey 30 psi de presióndurante4 h. Una vez separadoel catalizadorpor

filtración, se elimina el disolvente y el residuo resultante se purifica por

cromatografía en columna de gel de sílice, utilizando como sistema de

eluyentesC142C12-MeOH(50:1), obteniéndoselos productosque se indican a

continuación.

Ácido (2S,8S,8aP0-2-bencil-S-(terc-butoxicarbonll)amino-8a-metoxi-3-oxoindolizidina-2-carboxllico(95)

Rendimiento:1,04 g (63%). Espumablanca.

HPLC: t11 = 9,89 mm; eluyenteA (70:30);columnanúm. 1.

EM: 374 (M~ —44, 0,1), 342 (M~ — 76, 7,85),286 (M~ — 132, 100,00),242 (M~ — 176,

24,26),227 (M~ — 191, 1,79), 195 (M~ —223, 14,31),150 (M~ — 268, 18,60),91 (Bn,

Análisis elemental (Wc,> C 14 NCalculado(C221430N206) 63,14 7,23 6,69

Encontrado 62,89 7,35 6,70

Acido (2S,8S,8aS)-2-ben-cil-8-(terc-butoxicarbonll)amino-<Sa-hidroxi-3-.oxoindolizidina-2-carboxilico(96).

Rendimiento: 0,26 g (16%). Espumablanca.

— 169—

HPLC: tR = 7,48 mm; eluyenteA (70:30); columnanúm. 1.

EM: 342 (M~ —62, 6,07),286 (M~ — 118, 67,32), 242 (M~ — 162, 12,35).227 (M~ —

177, 100,00),195 (M~ — 209,7,04), 150 (M~ — 254, 13,01), 136 (M~ —268, 6,04), 91

(Bn, 28,05),57 (tBu, 64,00).


Calculado(C211428N206) 62,36 6,98 6,93

Encontrado 62,04 7,31 6.85

MétodoB: ReacciónenEtOH

Una disolución del compuesto94 (0,8 g, 1,4 mmoles)en EtOH (50 mL) se

hidrogenaen presenciade un 10% de Pd-C (10%) en las mismas condiciones

descritaspara el métodoA. Tras la aplicación de un procedimientototalmente

análogo,se obtienenlos productosque seindican a continuación.

Ácido (28,8S,8aP0-2-bencil-8-(terc-butoxicarbonil)amino-8a-etavi-

3-arnindolizidána-2-carboxilico(99)


HPLC: t~ = 12,93 mm; eluyenteA (70:30); columnanúm. 1.


Calculado(CnH32N2O6) 63,87 7,46 6,48

Encontrado 63,49 7,61 6,36

También se obtiene un compuestode menor Rf identificado como 96

(116mg, 21%).

MétodoC: Reacciónen disolventesapróticos

Una disolución del 4-cetodiéster94 (lg, 1,7 mmoles) en AcOEt o THF

(60 mL) se hidrogenadurante20 h en las mismascondicionesdescritaspara

—170—

los métodos A y B. Despuésde separarel catalizador por fi]tración y de

eliminar el disolvente,el residuoresultantese purifica por cromatografíaencolumna de gel de sílice con el sistema de eluyentesAcOEt-bexano(1:1),

obteniéndoseel compuestoqueseindica a continuación.

(2S8S,8aS$2.Bendll4(telrrbutaxicwtonil)amino-SadlidrarV2-metoxicarbonil-3-oxoindollzidina(98,)

Rendimiento:0,6 g, 83% (AcOEt); 0,57g, 79% (THF). Espumablanca.



Calculado(C221430N206) 63,14 7,23 6,69

Encontrado 63,28 7,42 6,54

Los datosde 114 RMN y de13C RMN de los productosobtenidosen estas

reaccionesde hidrogenaciónserecogenen las tablas32 y 33, respectivamente.

(2S,BS,SaP0-2-Bendil-8.(terc-butor¡carbonil)amino-Barmetaxi-2-metoxicarbonil-3-aroindoliz¡dina (97)

A una disolución, enfriada a O o>C, de una mezclade los compuestos95 y

96 en proporción 4:1 (0,9 g, 2,1 mmoles) en THF (20 mL) se le añadeuna

disolución etéreade C142N2 (generadoa partir de 0,5 g de N-metil-N-nitroso-

urea). Después de agitar durante 1 h, se eliminan los disolventes por

evaporacióny el residuo resultantese purifica por cromatografíaen columnade gel de sílice, utilizando AcOEt-hexano(1:2) como eluyente,obteniéndoseel

producto97 como una espumablanca.Rendimiento:0,53 g (56%).

HIPLC: tR = 19,25mm; eluyenteA (70:30);columnanúm. 1.

EM: 433 (M~ + 1, 4,59),432 (Mt, 19,59),400 (M~ —32, 2,52), 376 (M~~ —57, 7,87),

345 (M’ —87, 29,70),317 (M~ — 115, 70,33),149 (M~ —283, 5,05), 91 (Bn, 57,66),57 (tBu, 88,15).

— 171 —

Análisis elemental(%) C H N

Calculado(CnHa2Nj=06) 63,87 7,46 6,48Encontrado 63,70 7,57 6,60

Tambiénseobtieneel compuesto98 (0.13g, 15%).

(2S,8S,8aP0-2-Bendll-84terc-butoxicarbonil)amino-8a~etoxi-2-metoxicarbonil-3-oxoindolizidina(100)

A una disolución, enfriada a O 0C, de una mezclade los compuestos99 y

96 en proporción3:1 aproximadamente(0,18g, 0,4 inmoles)en THF (5 mL) sele

añadeuna disolución de CH2N2 en éteretílico (generadoa partir de 0,1 g dc

N-metil-N-nitrosourea).Trasagitar durante1 h a la temperaturaindicada,se

eliminan los disolventespor evaporacióny el residuoobtenido se purifica porcromatografíaen columnade gel de sílice, utilizando AcOEt-hexano(1:3) comoeluyente,paradar lugar al producto 100 en forma de espuma.Rendimiento:0,12 g (64%).

HIPLC: t~ = 27,23 mm; eluyenteA (70:30);columnanúm. 1.

Análisis elemental(%) C II NCalculado(C241434N206) 64,55 7,67 6,27

Encontrado 64,51 7,43 6,12

Tambiénseobtieneel compuesto98 (34 mg, 19%).

En las tablas32 y 33 se detallan los datos de 114 RMN y RMN,

respectivamente,de los productos obtenidos en estas reacciones de

esterificación.

—172—

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3.5.5.2. Reaccionesdereducciónde8a-hidroxi-y 8a-alcoxi-3-oxoindolizidinas

Reducciónde los compuestos82a, 82by 100 conLiAlH4


A una disolucióndel correspondientederivadode 3-oxoindolizidina82a,821> ó 100 (0,3 mmoles)en THF (10 mt) se le añadeLiAI}14 (0,9 inmoles)y se

calienta a reflujo durante6 h. Tras neutralizarcon UCí 1 N, se elimina eldisolventepor evaporacióny el residuoresultantese extrae con AcOEt y selava, primero con 1420 y despuéscon disolución saturadade NaCí. El extracto

orgánicosesecasobreNa2SO4y seevaporaa sequedad.

Los productos obtenidos por este procedimiento se detallan acontinuación.Los datosde 114 RMN y

13C RMN seindican en las tablas34 y 35,respectivamente.

(2St8S*,8aR*).2.Bendil.8~(terc~butox¡earbonU)wnino~2-hidroximetil-3-oxoindolizidin.a(103)


HPLC: ¼= 6,12mm; eluyenteC (35:65);columnanúm. 3.

(2Rt8St8aR*)~2.Bendll.8.(terc~butoxicarbonll)amino~2-hidroximetil-3-oxoindolizid¡na(104)


HPLC: tp = 5,51 mm; eluyenteC (35:65);columnanúm. 3.

— 175—

(2R,8S,8aPJ-2-Bendil-8-(terc-butoxicarbonll)amino-8a-eto-xi-2-h¡droxinwtil-3-oxoindolizidina(105)

Rendimiento:77%. Espuma.

HPLC: t11 = 12,49mm; eluyenteC (40:60);colunmanúm. 3.

Reduccióndel compuesto98 con NaBH4

A una disolución del derivado do 3-oxoindolizidina 98 (125 mg,0,3 mmoles) en THF (10 mL) se le añadeNaBH4 (34 mg, 0,9 mmoles)y se.

calientaa reflujo durante6 h. Tras eliminar el disolventepor evaporación,elresiduoobtenidose disuelveenAcOEt y seJava,primerocon 1420 y despuéscon

disolución saturadade NaCí. El extractoorgánico se secasobreNa2SO4y se

evaporael disolvente.El residuo resultantese purifica por cromatografíaencolumnade gel de sílice con el sistemade eluyentesque se especificaen cadacaso,para dar lugar a los productosquese detallana continuación.

(2W8S8aS)-2-Beiwit8-(terc-butoxicarbonil)aniino-Radddravi-2-hidroxinwtil-3-oxo¡ndolizidina (101) o

Eluyente:C112C12-MeOH(50:1). Rendimiento:25 mg (20%). Sirupe.



Los datosde 114 RMN y ‘3C RMN de estecompuestose indican en las


(211,8S,BaPO-2-Bencil-8-(terc-butoxicarbonil)amino-2-hid,roximetilindolizidina (102)

Eluyente:CH2Cl2-MeOH(20:1). Rendimiento:25 mg (22%). Sirupe.

— 176

1H RMN(300 MHz, CDCl

3): 5 7,27-7,12(m, 5 H, C6H5), 4,46 (s ancho, 1 14, NR), 3,47 (m,1 14, 14-8), 3,39 (d, 1 H, C142-OH,J = 10,5), 3,33 (d, 1 14, C142-OH), 3,13 (d, 1 14,14-3, J = 9,4), 3,02 (m, 1 14, H-Sec), 2,89 (d, 1 14, C142-Ph,J = 13,3), 2,81 (d, 1 14,C142-Ph),2,27 (d, 1 H, H-3), 2,10 (m, 1 14, H-Sax), 2,01(m, 2 14, 14-7 y H-8a), 1,73

(m, 3 14, 14-1 y 14-6), 1,45 (m, 1 14, 14-6), 1,41 [s, 9 14, CH3 (IBoc)], 1,08 (m, 1 14,

H-7).

[300 MHz, (CD3)2C0]: 5 7,32-7,17(m, 5 14, C6145), 5,85 (s ancho, 1 14, NR), 3,50(m, 1 14, 14-8, J = 10,0), 3,33 (d, 1 H, C142-O14,J = 10,3), 3,29 (d, 1 14, CH2-014),3,07 (m, 2 14, 14-3y H-Sec),2,91 (d, 1 14, CH2-Ph,J 13,0),2,83 (d, 1 14, C142-Ph),

2,22 (d, 1 14, 14-3. J = 9,4), 2,08 (m, 1 14, 14-Sa),2,05(m, 1 14, H-Sax).2,04 (m, 1 14,14-7), 1.72(m, 3 14, 14-1 y 14-6), 1,39 (m, 1 H, 14-6), 1,38 [s, 9 14, CH3 (Boc)], 1,26(m,

1 14, 14-7).

1~C RMN (50 MHz, CDClg): 5 155,28[CO (Boc)], 138,40, 130,28,128,15,126,28(C

6145), 79,40 [C (Boc)]. 68,40 (C-8a), 67,21 (C142-OH), 61,70 (C-3), 51,80 (C-8),51,21(C-5), 44,92(C-2). 43,25(C-1), 38,63(CH2-Ph),31,32(C-7), 28,34[CH3 (Boc)1,

23,43(C-6).

Análisis elemental (%) C______ 14 N

Calculado(C211428N203) 70,76 7,92 7,86Encontrado 70,58 7,99 7,81

3.5.5.3. ObtencióndeA~MLhexa1iidroindolizinas

A una disolución del compuesto98 (0,1 g, 0,24 mmoles) en CH2Cl2(10 mL) se le añadeTEA (5,7 pi, 0,05 mmoles) y se agita a temperatura

ambientedurante 3 h. Despuésde eliminar el disolvente por evaporación,el

residuo resultante se purifica por cromatografíaen placa preparativa,utilizando como eluyenteEt2O-AcOEt(40:1), obteniéndoseel producto 106 como

unaespumablanca. Rendimiento:53 mg (55%).

— 177—

(2S)-2-Bencil-8-(terc-butc&xiearbonll)wnino-(106)

1H RMIN (300 MHz, CDCI3): 3 7,30-7,13(m, 5 H, C6H5), 5,25 (s, 1 H, NH), 3,80 (s,

3 H, CO2CH3),3,40 (m, 1 14, H-Sec), 3,27 (d, 1 14, 2-CH2, J = 14,2), 3,11 (d, 1 14,

14-1, J = 17,1), 3,10 (d, 1 14, 2-CH2),2,71 (d, 1 14, H-1), 2,04 (m, 2 14, 14-Sazy

1,75 (m, 2 14, 14-6y 14-7), 1,45 [s, 9 14, CH3 (Boc)], 1,45 (m, 1 14, 14-6).

13C RMN (50 MHz, CDCI3): 5 171,48(C-3), 170,76(CO2CH3), 155,80[CO (Boc)],

135,57,129,97, 128,22,127,07(C6145), 109,03(C-8 y C-Sa),80,05 liC (Boc)], 56,13(C-2), 52,93 (OCH3),39,59y 38,77(C-5 y 2-CH2),30,59(C-1), 28,22 [CH3 (Boc)],

25,96(C-7), 20,42(C-6).

Análisis elemental(Wc) C 14 NCalculado(C22H28N205) 65,98 7,04 7,00Encontrado 66,11 7,29 6,67

—178—

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3.6. PREPARACIÓNDE ANALOGOS DE COLECISTOQUININADERIVADOS DE 2,5-DICETOPIPERIDINAS

3&1. ACOPLAMIENTO PEPTÍDICO DE DERIVADOSDE 2,5-DICETOPIPERIDINASCON H-Phe-M-12


A una disolución del compuestoSSab ó ll9ab (1,3 mmoles) en MeOH(15 mL) se le añadeNaOH 2 N (0,65 mL, 1,3 mmoles)y se agita a temperaturaambientedurante3 h. Tras eliminar el disolventepor evaporacióna presiónreducida,el residuo resultantese disuelveen 1420 (15 mL), se acidifica hasta

pH 3 con HCi 1 N y se extrae con AcOEt. El extracto orgánico se secasobreNa2SO4y el disolventese evaporaa sequedad.El crudo de reacciónobtenidose

disuelve en THF (8 mL), la disolución se enfría a O0C y se le añadeHOSu

(173 mg, 1,5 mmoles)y DCC (310 mg, 1,5 inmoles).Trasagitar durante1 h a latemperatura indicada,se adiciona H-Phe-NH

2(215 mg, 1,3 mmoles)en THF(5 mL) y la mezclade reacciónse agila a temperaturaambientedurante3 días.

Transcurridoestetiempo, sefiltra paraeliminar la DCU formaday se evaporael disolventea sequedad.El residuoobtenidosedisuelveenAcOEt y selava conácido cítrico al 10%, NaHCOg al 10% y disolución saturadade NaCí,sucesivamente.El extracto orgánico se seca sobreNa2SO4y se elimina el

disolvente por evaporacióna presión reducida. El residuo se purifica por

cromatografíaen columnade gel de sílice, utilizando como eluyenteCH2CI2-

MeOH (40:1).

Los productos preparadospor este procedimiento se detallan acontinuación.Los datosde 114 RMN y de

13C RMN serecogenen las tablas36 y

37, respectivamente.

(31~68,1‘8)- y (38,68,1‘S)-3-(1‘-Carbamoll-2-feniletll)carbaznoil-

3-(etoxicarboniflmetil-6-(indnl-3‘ Li.Umetil~2,5.dicetopiperidina(117a)y (1lIb)

Rendimiento:275 mg (41%). Sólido amarillo. Proporciónde diastereoisómeros(3R,6S,1S)/(3S,6S.1S)2:1, medidapor HPLC.

— 181—

HPLC: tR = 5,05 mm (isómeromayoritario); 6,40 mm (isómerominoritario);eluyenteA (45:55); columnanúm. 1.

Análisis elemental(Wc) C H NCalculado(C2gHgoN4Os) 64,85 5,83 10,80

Encontrado 64.75 6,02 11,01

(311,68,1‘S)-3-(terc-Butoxicarbonilftnetll-3-(1‘-carbwnoll-2’-fenlletil)earbwnoíl-6-ffndol-3’~4VmetiJ-2,5-dicetopipeHdina(12la)

Purificado por cromatografíapreparativaen cromatotronEluyente:CH2Cl2-MeOH(60:1). Rendimiento:310 mg (44%).

Sólido blanco(amorfo).


Calculado(C30H34N4O6) 65,92 6,27 10,25

Encontrado 66,07 6,43 10,36

(38,68,1‘S)-3-(terc-ButoxicarboniVmetll-3-(1’-carbaznoil-2’-fenlletibcarbanroíl-6~Gndo1~3M.ll)metll~2,5~dicetopipeñdina(121b)

Purificadopor cromatografíapreparativaen cromatotrón.Eluyente:CH2Clz-MeOH(60:1). Rendimiento:95 mg (13%).Sólido blanco(amorfo).

Análisis elemental (Wc,> C H NCalculado(C30H84N406) 65,92 6,27 10,25

Encontrado 65,66 6,63 9,98

3.6.2. ELIMINACIÓN DEL GRUPOPROTECTORterc-BUTILO

A una disolucióndel derivadode 2,5-dicetopiperidina121aó 121b (82 mg,

Ojl5 mmoles) en CHoClo (2 mI) se le añadeTFA (1 mU> y se agita a

— 182—

temperatura ambiente durante 1,5 h. Tras eliminar el disolvente porevaporación a presión reducida, el residuo resultante se purifica porcromatografíapreparativaen cromatotrón,utilizando como eluyente C112C12-

MeOH (15:1).Los productos obtenidos medianteeste procedimiento se detallan a

continuación,junto con susdatosanalíticos.Los datosde1H RMN y ‘3C RMN

seindican en las tablas36 y 37, respectivamente.

Ácido (311,68,1‘8)4(1 ‘-carbamoíl-2‘-/‘eniletil)carbanwíl-6-(indol-3’ ~41)nwtil-2,5-dicetopiperidin-a-3-acético(113W

Rendimiento:65 mg (88 o). Sólido blanco(amorfo)

Análisis elemental1%) C 14 NCalculado(C

261426N406) 63,67 5,34 11,42

Encontrado 63,52 5,61 11,52

Ácido (3S,68,1’S)-3-(1~2,5-dicetopiperidina-3-acético(113b)

Rendimiento:60 mg (82%). Sólido blanco(amorfo)

Análisis elemental(Wc,> C 14 N


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t7. PREPARACIÓN DE ANÁLOGOS DE COLECISTOQUININADERIVADOS DE 3-OXOINDOLIflDINAS

371. ACOPLAMIENTO PEPTÍDICO DE DERIVADOS DE 3-OXOINDOLIZIDINA

2-BENCIL SUSTITUIDOSCON Boc-L-Trp-OH Ó Boc-O-Trp-OH


A unadisoluciónde Boc-L-Trp-OH ó I3oc-D-Trp-O14(228 mg, 0,75mmoles)en THF (4 mL), enfriada a O 0C, se le añadenHIOSu (104 mg, 0,9 mmoles) yDCC (186mg, 0,9 mmoles) y se agita durante 1 h a la temperaturamencionada.Por otra parte,a unadisolucióndel derivado de 3-oxoindolizidina82au 82b (300 mg, 0,75mmoles)enCH

2Cl2 (5 mL) sele añadeTEA (2,5 mL) y se

agita a temperaturaambientedurante 1 lii. Tras eliminar el disolvente, elresiduo obtenido se disuelve en THF (5 mL), se le añadeTEA (0,1 mL, 0,75

mmoles)y, seguidamente,se adicionaesta disolución sobre la que contieneel

éster activo de Trp, preparadainmediatamenteantes.Despuésde agitardurante3 días a temperaturaambiente,la reacciónse procesatal y como se

indica en el procedimientogeneralrecogido en el apartado3.6.1. El residuoresultantese purifica por cromatografíaen columna de gel de sílice, utilizandocomoeluyenteC142C12-MeOH(50:1).


continuación,con suscorrespondientesdatosanalíticos.Los datosde1H RMN

serecogenen la tabla38.

(211,8S,8aP0-y (2S,8W8aS)~2~Rendll~8.1N~it(terc.butaricarbonilyL-triptofihlanúno-2-metoxicarbonit3-oxoindolizidina(122a)y (122b)

Rendimiento: 250 mg (57%). Sólido blanco. Proporción de diastereoisórneros

(2R,8S,8aR)/(2S,8R,8aS)10:1, medidaporHPLC.

HPLC: tR = 25,89 mm (isómeromayoritario);30,88 mm (isómerominoritario);eluyenteA (35:65); columnanúm. 3.

Análisis elemental (Wc,> C 14 NCalculado(C

33H40N4O6) 67,33 6,85 9,52

Encontrado 67,52 7,11 9,83 1

— 186—

(211,8S,8aP0-y (28,8E1,8aS).2-Benci1-8-IN<~-(t.erc-butoxicarbonll)-D-triptofdlamino-2-metaricarbonW3-OaxándflhizidifltL(123Wy (123b)

Rendimiento:235 mg (53%). Espumablanca. Proporciónde diastereoisómeros(2R,SS,8aR)/(2S,8R,8aS)10:1, medidapor HPLC. Los tiemposde retenciónde123a y 123b son idénticos

respectivamente.

Análisis elemental(Wc,> C 14 NCalcu]ado(C331440N406) 67,33 6,85 9,52Encontrado 67,11 6,50 9,52

(2S,88,8aPJ-y (2W8W8aS)-2-Bencil-&1N0.(terc-butaricarbonil)-Ldriptofihlamino-2-metoxicarbOnll-3-aroindolizidina(126Wy (12Gb)

Rendimiento:265 mg (60%). Sólido blanco. Proporciónde diastereoisómeros(2,S,8S,8aR)/(2R.8R.8aS)4:1, medidaporHPLC.

HPLC: tn = 32,30 mm (isómeromayoritario);37,68 mm (isómerominoritario);eluyenteA (40:60);columnanúm. 1.

Análisis elemental(Wc) C 14 NCalculado(C3¿H4oN4O6) 67,33 6,85 9,52

Encontrado 67,58 7,21 9,81

(2S,88,8aR)-y ~D-friptofiflwnino-2-nietoxicarbonil-3-oxoindolizidina (127Wy (127b)

Rendimiento:210 mg (48%). Sólido blanco. Proporciónde diastereoisómeros(2S,8S.8aR)/(2R,8R,BaS)3:1, medidapor HPLC. Los tiemposde retenciónde127a y 127b son idénticos a los de sus enantiómeros 126b y 126a,respectivamente.



a los de sus enantiómeros 122b y 122a,

— 187—

3.t2. TRANSFORMACIÓNDE ÉSTERESMETÍLICOS EN AMIDAS


Una disolución del derivado de 3-oxoindolizidina 122ab,123ab, 126abó127ab(150 mg, 0,25 mmoles)en MeOH saturadode N143 (50 mL) se agita atemperaturaambientedurante6 días, renovandodiariamenteel N145/MeOH.

Transcurrido este tiempo, se evaporael disolvente a sequedad.El residuo

resultante se purifica por cromatografía preparativa en cromatotrón,

utilizando comoeluyenteC142C12-MeOH(40:1).

Los productos obtenidos por este procedimiento se indican a

continuación,con sus correspondientesdatos analíticos, En la tabla 38 se

encuentranrecogidoslos datosde1H RMN.

(28,BS,SaR>-.y (2W8F48aS).2.Benci1~8.INCt(terc-bzdoxicarboni-l)-L-tripto/ZIPamino-2-carbamoil-3-wxándolizidina(124Wy (1Mb)

Rendimiento: 135 mg (94%). Sólido blanco. Proporción de diastercoisómeros

(2S,8S,8aR)I(2R,8R,8aS)10:1, medidaporHPLC.

HPLC: tR = 14,82 mm (isómeromayoritario); 15,88 mm (isómerominoritario);eluyenteA (35:65); columnanúm. 3.

Análisis elemental(Wc) C 14 N 1Calculado(C

82H59N505) 67,00 6,85 12,21

Encontrado 67,12 7,11 12,28

(28,8S,SaFt)-y ~amino-2-carbamoíl-3-oxoindolizidina(125W y (125b)

Rendimiento:140 mg (98%). Sólido blanco. Proporciónde diastercoisómeros(2S,8S,8aR)/(2R,8R,8aS)10:1, medidapor HPLC. Los tiemposde retenciónde125a y 125b son idénticos a los de sus enantiómeros 124b y 124a,

respectivamente.

— 1•ss —

Análisis elemental (0%) C 14 N


(211,88,SaP0-y (28,8E1,8a$.2.Bendil.&[NcY4tercrbutÚxicarbonW~L~triptofih]~

amino-2-carbanzoil4-ozwindolizidina(128Wy (128b)

Rendimiento:138 mg (96%). Sólido blanco. Proporciónde diastereoisómeros(2R,8S,8aR)/(2S,8R,8aS)4:1, medidapor HPLC.

HPLC: tR = 20,11 mm (isómeromayoritario);23,05mm (isómerominoritario);eluyenteA (40:60);columnanúm. 1.



(2W8S,8aP0-y (28,8~8aS)-2-Bendil~8~LN<4(terc-butaxicarbonit-D-triptofilkamino-2-carbwnoíl-3-oxoindolizidina(12%) y (129b)

Rendimiento: 140 mg (98%). Sólido blanco. Proporciónde diastereoisómeros

(2R,8S,8aR)/(2S,8R,8aS)3:1, medida por HPLC. Los tiemposde retenciónde129a y 129b son idénticos a los de sus enantiómeros 128b y 128a,respectivamente.

Análisis elemental (Wc,> C 14 NCalculado(C32H39N505) 67,00 6,85 12,21Encontrado 66,76 7,01 12,45

— 189—

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3.7.3. ACOPLAMIENTO PEPTÍDICO DE DERIVADOS DE 3-OXOINDOLIZIDINA2-terc-BUTOXJCARBONILMETILSUSTITUIDOSCON I4-Phe-NIH2

A una disolución del compuesto133ab (1,57 g, 3,8 inmoles) en THF

(20 mL), enfriada a O 0C, se le añadeHOSu (525 mg, 4,6 inmoles) ~ DCC(940 mg, 4,6 mmoles). La mezcla de reacción se agita durante 1 h a latemperaturamencionaday, a continuación,sele adicionaH-Phe-NH

2(623 mg,

3,8 mmoles) en THF (5 mL) y se agita a temperaturaambientedurante3 días.

Tras un procesadosimilar al indicado en el apartado3.6.1, el residuoobtenido

se purifica por cromatografíaen columna de gel de sílice con el sistemadeeluyentes CH2CJ3-MeOH (40:1), seguidade cromatografíapreparativa en

cromatotrón,utilizando el mismo eluyente,paradar lugar a los productosquese indican a continuación.

(2S*,8St8aRtl‘S)-8-(terc.Butoxicarbonll)amino-2-(terc-butoxicarbonll)metil-2-(1‘-carbanwíl-2’-feniletll)carbanwil-3-oxoindolizidina(134W


~H RMN (300 MHz, CDCI3): 8 7,88 (d, 114, 1’-NH, J = 7,9), 7,32-7,21(m, 5 14,

C6H5), 6,96 (s, 1 14, CONH2), 5,50 (s, 1 14, CONH2),4,73 (m, 1 14, 140.1’), 4,52 (d,

1 14, 8-NH, J = 8,5),4,02 (m, 1 14, H-Sec),3,32 (dd, 1 14, 14-2,J = 14,3 y 5,2), 3,22

(m, 1 14, 14-Sa), 3,03 (dd, 1 14, 14-2’), 3,03 (m, 1 14, 14-8), 2,69 (d, 1 H, 2-CH2,J = 15,2), 2,60 (m, 1 14, H-Sax),2,57 (d, 1 14, 2-CH2), 2,34 (m, 1 14, 14-1), 2,27(dd, 1

14, H-1, J = 14,1 y 7,5), 2,10 (m, 1 14, 14-7), 1,79 (in, 1 14, 14-6), 1,46 (ni, 1 H, 14-6),1,46 lis. 914, CH3 (Boc ó CO2tBu)l, 1,41 lis, 9 14, CH3 (Boc ó CO2tBu)], 1.35 (m,

1 1-1, H-7.

Análisis elemental (Wc,> C 14 NCalculado(C29H42N407) 62,35 7,58 10,03

Encontrado 62,05 7,70 10,21

(2RtSSt8aRt1‘S)-8-(terc-Butoxicarbonil)amino-2-(terc-buto~xjcarbonil)nwtjI-2-(1‘-carbamoll-2’-feniletil)carbanzoíl-3-oxoindolizidina(184b)

Rendimiento:220 mg (10%). Espumablanca.

— 191—

1H RMIN (300 MHz, CDCl3): 5 7,89 (d, 1 14, 1-NH, J = 7,3), 7,32-7,18(in. 5 14,

C6H5), 6,49 (s, 1 14, CONH2),5,40 (s, 1 14, CONH2),4,68 (m, 1 14, 14-1), 4,43 (d,

1 14, 8-NH, <-1 = 7,3), 3,99 (m, 1 14, H-Sec),3,25 (m, 1 14, 14-Sa),3,12 (m, 3 14, 14-8 y

14-20,2,64 (m. 1 14, 14-1), 2,57 (m, 1 14, 14-Saz),2,56(d, 1 14, 2-CH2, J = 15,9), 2,37(d, 1 14, 2- CH2), 2,20 (dd, 1 14, 14-1, J = 14,4 y 7,9), 2,02 (m, 1 14, 14-7), 1,72 (m,

1 14, 14-6), 1,44 (m, 1 14, 11-6), 1,44 Ls, 9 14, CH3 (Boc ó CO2tBu)], 1,39 lis, 9 14, CH3(Boc ó CO2tBu)1,1,29 (in, 1 14, 14-7).

Análisis elemental (Wc) C 14 N1


3.7.4. ACOPLAMIENTO PEPTÍDICODE DERIVADOS DE 3-OXOINDOLIZIDINA

2-CARBOXIMETIL SUSTITUIDOSCON Boc-L-Trp-OH

A una disolución de Boc-Trp-O14 (107 mg, 0,35 mmoles) en THF (3 mL),

enfriada a O C, se le añade HOSu (48 mg, 0,42 mmoíes) y DCC (87 mg,0,42 inmoles) y se agita durante 1 h a la temperaturamencionada.Por otra

parte,a unadisolución del derivadode 3-oxoindolizidina 134aó 134b (195 mg,0,35 inmoles) en C112C12(3 mi) se le añadeTEA (1,5 mli y se agita a

temperaturaambientedurante 2 h. Despuésde eliminar el disolvente por

evaporacióna vacío, el crudo de reacciónobtenido se disuelve en THF (3 mL),se le añadeTEA (0,05 mL, 0,35 mmoles) y, seguidamente,se adiciona estadisolución sobre la que contiene el éster activo de Trp, preparadainmediatamenteantes. Después de agitar durante 3 días a temperatura

ambientey tras un procesadosimilar al indicado en el apartado3.6.1. elresiduo obtenido se purifica por cromatografíaen columna de gel de sílice,

utilizando comoeluyenteC142C12-MeOH(40:1).


continuación.Los datosde 114 RMN y ‘3C RMN se encuentranrecogidosen las


—192—

Ácido (2StBStSaRtl‘S)-8-INC’4terc-butoxiearbonit-.L-triptofihlamino-2-(1 ‘-carbamoíl-2‘-feniletibcarbamoil-3-oxoindolizidina-2-acético(115a)

Rendimiento:135 mg (56%). Sólido blanco(amorfo).

Análisis elemental (Wc,> C 14 N

Calculado(C361444N608) 62,78 6,44 12,20Encontrado 62,40 6,30 11,97

Ácido (2RtSS*,BaRtl‘S).8~1NU4terc.butoxicarboniI)~L-triptofih]amino~2-(1‘-carbamoll-2’-feni1~etll)carbwnoll-3-aroindolizidina-2-acético(115b)

Rendimiento:140 mg (58%). Sólido blanco(amorfo).

L__Análisiselemental (Wc,> CCalculado(C38H44N608) 62,78Encontrado 62,71

14 N

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8.7.5. ELIMINACIÓN DEL GRUPOPROTECTORterc-BUTOXICARBONILO

Una disolución del derivado de 3-oxoindolizidina I2Sab, 129ab ó 115a

(75 mg, 0,13 mmoles) en CH2CI2 (2 mL) y TEA (1 mL) seagita a temperaturaambientedurante2 h. A continuación,se elimina el disolventepor evaporacióna presiónreduciday el residuo resultantese purifica por HPLC preparativo,utilizando el eluyente que se especifica en cada caso, obteniéndose,trasliofilización, los productos que se describenseguidamenteen forma de

trifluoroacetato.Los datosde 114 RMN de estoscompuestosse encuentranrecogidosen las

tablas39 y41.

Trifluoroacetatode(2R,8S,8aR)-2-bendil-2-carbamoíl-

8-(L-triptofitanñno-3-axoindolizidina(130W

EluyenteA (23:77)-Rendimiento:58 mg (76%).Sólido blanco(liofilizado). [a]~:+51,90 Cc = 0,75,MeOR).

HPLC: tp = 12,85mm; eluyenteA (25:75);columnanúm. 1.

Trifluoroacetato de(28,811,8aS)-2-bencil-2-carbamoi-l-8-<’Ldriptofibamino-3-oxoindolizidina(130W

fluyenteA (23:77).Rendimiento:13 mg (17%).Sólidoblanco(liofilizado). [u]1~:±2,20(c = 0,85, MeOH).


Trifluoroacetatode (2WSS8aB)-2-bendil-2-carbamoi-1-

84D-triptofibamino-3-oirindolizidinn (131W

EluyenteA (21:79).Rendimiento:47 mg (58%).

Sólido blanco(liofilizado). liu119: —3,2~ (c = 0,75, MeOH).

HPLC: El tiempo de retenciónesigual al desu enantiómerolSOb.

— 196—

Trifluoroacetato de(2S,814,8aS)-2-benci.l-2-carbamoíl-8-(D-triptofl»amino-3-cxoindolizidina(131W

EluyenteA (21:79).Rendimiento:17 mg (22%).Sólido blanco(liofilizado). lia]19: —36,6~(c = 0,675,MeOH).

HPLC: El tiempo de retenciónesigual al de su enantiómerolSOa.

Ácido (2St8St8aRtl‘S)-2-(1‘-carbamoil-2’-feniletil)earbamoll-8-(L-triptofd)amino-3-oxoindolizidinor2-acético(135)

En estecasono fue necesariala purificación por HPLC.

Rendimiento:70 mg (93%). Sólido blanco(amorfo)


Los datosde 114 RMN de estecompuestoseindican en la tabla 39.

—197—

Co

‘-‘4-~

zoC.D

Co0)

Le

00:~

•-CdCd

fr~1

0-5-

EHéCh

rsChCd

UD

UDH10<-.0

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Ce

Ce

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“oCi

t8. SÍNTESIS DE ANÁLOGOS DE NEUROTENSINAPORTADORES

DE ESQUELETOSDE 3-OXOJNDOLIZIDINA.S

Síntesisen fasesólida:

La síntesisen fase sólida se llevó a caboen un sintetizadorde péptidos

automático ABI 430A. El acoplamientode los diferentes Boc-aminoácídos

(7,5 eq) se realizó con los ésteresde N-hidroxibenzotriazol, previamente

formados, en CH2Cl2JDMF (9:1) durante 20 h a temperaturaambiente.Los

derivadosde 3.-oxoindolizidina 85a-85c,88a y 88b (1,6 eq) se incorporaronal

fragmento H-Ile-Leu-PAM-resina(leq) en las mismas condicionesanteriores,

utilizando BOP como agente de acoplamiento.En todos los casos,el ensayo

cuantitativo con ninhidrina indicó acoplamientossuperioresal 99%. Lasdesproteccionesde los grupos N-Boc se realizaroncon TFA durante 5 mm,

seguidode neutralizaciónde la resmaconDIEAIDMF al 20% durante1 mm.La separaciónde los derivados hexapeptídicosde la resma,con eliminación

simultáneade los gruposprotectoresde las cadenaslaterales,se llevó a cabo

por acidolisis con HF/m-cresol(9:1) durante75 mm a O <0C. Tras precipitación

con étery filtración, los péptidosse extrajeronconAcOH al 1% y se liofilizaron.

La purificación de los crudosde reacción,por RP-HPLC, sellevó a cabo en un

cromatógirafoVarian equipadocon una columna C18 (25 x 250 mm, 7 jm),utilizando como eluyenteCH3CN/(NH4)2504(0,1 M, PH = 2,7) (Gradiente:0,2%

CH3CN/min) y un flujo de 10 mL/mm. Finalmente, los productospuros se

aislaron por liofilización. Siguiendo este procedimiento, se prepararon los

derivados136a-136e,cuyosdatosanalíticosy espectroscópicosse recogenen las

tablas42 y 43.

—199—

Tabla 42. Desplazamientosquímicos(8. ppm) más significativosde 1H RMN

de los derivados136a-136e[400 MHz, 1120/020(9:1)]a

Compuesto

Residuo Protón 136a 13Gb 131k 136d iSGe

Arg8

Arg9

1n dolizidina

Ile12

Leu13

a La asignaciónde cadauno de losprotonesserealizó medianteexperimentoscosyy TOCSY0

a-CH13-CH2y-CH 2S-CH2

a-NHa-CH¡3-CH2y-C ~2¿-CH2

3,891,741,513,04

8,644,061,61

1,51 1,443,08

2,15 1,923,74 2,291,61 1,231,67 1,07

3,202,128,11

3,06 2,85

8,254,051,76

1,34 1,050,790.72

8,224,211,48

1,510,78 0,74

3,961,79

1,50

3,11

8,664,081,66

1,53 1.45

3,11

2,50 1,703,82 2,551.60 1,041,64 1,18

2,25

3,178,10

3,20 289

7,954,081,83

1,39 1,120,87

0,81

8,244251,51

1,510,81 0,75

3,931,781,4<83,09

5,674,30

1,62

1,61 1,513,05

2,17 1,903,83 2,411,48 1,381,54 1,38

3,832,568,42

3,14 2,92

8,584,151,92

1,35 1,100,910,82

8,204,15

1,551,55

0,83 0,79

3,971,81

1,483,08

8,714,131,68

1,55 1,48

3,08

2,30 1,893,80 2,361,65 1,321,70 1.15

3,302,368,21

3,05 2.92

8,4~54,03

1,811,32 1,06

0,830,79

8,314,241,55

1,550/79 0,75

1-1-1H-511-6H-7H-811-Sa8-NE2-CH2

a-NHa-CH¡3-CHy- CH2y-CH g8-CHa

a-NHu-CH¡3-CH2y-CH8-CH3

3,921,781.502,95

8,674061,61

1,50 1,39

3,04

2,47 1,743,76 2,521,57 1,051,61 1,17

2,6-4

3,148,09

3,08 2,89

7,964,02

1,741,29 099

0,770,70

8,264,23

1,471,50

0,78 0,74

— 200—

Tabla 43.Datos analíticosde los análogosde NTg{3 136a-136e

Comp. Rendimiento (91) 0’

136a

13Gb

131k

136d

131k

53(57)

35(49)

9

24(31>

43 (45,

HPLC anal.b

tR (mm)

25,13

26,89

30,33

27,20

23,55

PD-MS

826,9

827,0

826,7

826,7

827,4

Análisis de aminoácidosArg Ile Leu

2,05

1,95

2,02

2,03

1,91

0,97

0,97

1,07

0,95

0,58

1,01

0,94

0,89

0,98

0,96

a

Los valores entre paréntesiscorrespondena?rendimiento global considerandoen cadacasoel segumndodiastereoisérnero.b columna:Vvdac 218 TP54 C18 (4,6 x ‘250 mm, 5 pm). Fluyente: CH3CN/(N114)2S04(0,1 M, pH 2,5): Gradientede 5’¿ a60% de CH8CN en 50 mm. Flujo: 1 mL

1rnin. Detección:17V (214 nm>.

—201—

3.9.MÉTODOSBIOLÓGICOS

3.9.1.ENSAYOSDE UNIÓN A LOS RECEPTORESDE CCK ~

Los experimentosse llevaron a cabo en cortezade cerebroy páncreasderatas macho Sprague-Dawley.La preparaciónde estasmembranasy losensayosde unión a los receptoresse realizaronsegúnel método descritopor

Dauge et al. ~ El radioligando li3H]pCCKs (Amersham) se incubó a

concentracionesfijas de 1 nM en homogeneizadosde cortezacerebral (1 h,25 o>C) y de 0,5 nM en los homogeneizadosde tejido pancreático(2h, 25 0C), en

presenciade concentracionesvariablesdel competidor.Las concentracionesanterioresde radioligandorepresentanaproximadamentela Ej del procesode

fijación.

392. ENSAYOSDE LIBERACIÓN DE AMILASA 158

Paraesteensayoseutilizaron acinospancreáticosde rata. La liberaciónde

amilasa,medidacomo la diferenciaen la actividadde la amilasaliberada en e]

medio extracelularal final de la incubacióncon y sin secretógeno,se expresa

como porcentajede la estimulación máxima obtenida con CCKs (35%±3 del

total de la ainilasa contenida en los acinos) menos la secreción basal de

amilasa sin secretógeno(7%±2 del total de la amilasa contenida en los

acinos). Los compuestosa ensayarse administrarona dosis fijas de íC—~ M

junto con la CCK8.

3.9.3. INHIBICIÓN DE LAS CONTRACCIONESINDUCIDAS

PORCCK8 6 CCÑ EN EL ÍLEON DE COBAYA:PREPARACIÓNDE MÚSCULO LONGITUDINAL-PLEXO MIENTÉRICO 130

Los segmentosdel íleon se sumergenen un baño paratejidos aisladosque

contienetampón Krebs y se conectana un electrodo.Despuésde equilibrar los

tejidos (30 mm, a 0,5 g de fuerzapasiva),se procedea su estimulacióneléctrica

(30 mm, 0,1 Hz, 1 ms, 10-15 V) y se tratan con KCl 67 mM paradeterminarla

contraccióninicial máxima del músculo. Las curvas de respuestacontráctil-

concentración para la CCK8 y Ja CCK4 se obtuvieron por incrementos

— 202

progresivosde la concentracióndel péptido, despuésde un lavadode la dosis

precedente.Para cada tejido sólo se examinó un péptido. Para evaluar losefectosde los distintosproductosen la respuestacontráctil de los péptidos,cada

tejido se equilibré con el producto correspondiente(iO~ M) antesde añadirel

péptido liCCKs (1O~ M), CCIQ (1V M)].

3.9.4.ENSAYOS DE UNIÓN A LOS RECEPTORES DE NT17’2

Los ensayosse llevaron a cabo en homogeneizadosde cortezacerebralde

rata. La preparaciónde las membranasy los ensayosde unión a los receptores

se realizaron según el método descrito por Milis et al. 172 El radioligando

li3H]-NT se incubó a una concentraciónde 5 nM (1 h, 25 0C) en presenciadeconcentracionesvariablesdel competidor.

203—

4. CONCLUSIONES

El trabajo quese recogeen estaMemoria describela síntesisde una

seriede derivadosde 2,5-dicetopiperidinasy 3-oxoindolizidinas,diseñados

para ser aplicadosen el campo de los peptoideso peptidonilméticos.Concretamente,se da cuentade la aplicación de estaslactamasmono ybicíclicas, respectivamente,a la preparaciónde análogosconformacional-mente restringidos de los neuropéptidosColecistoquinina (CCK) y

Neurotensina (NT), así como de los resultados de afinidad de los

compuestossintetizadospor los respectivosreceptoresde CCKy NT.

Los aspectosmás significativos de este trabajo se resumenen las

siguientes conclusiones:

1. Se describen dos rutas sintéticas alternativas para la

preparaciónde 6-bencil- y 6-(indol-3-il)metil-3-metoxicarbonil-

2.5-dicetopiperidinas y sus correspondientesderivados 3,3-

disustituidosqueincorporanen posición 3 las cadenaslaterales

de los aminoácidosPhe,Ma y Asp. Se discutenlas similitudesydiferenciasentre ambasrutas, tanto en cuantoa rendimientocorno en cuantoa estereoselectividad.

2. Se ha llevado a cabo el estudioconformacionalpor 1H RMN de

los derivadosde 2,5-dicetopiperidinaincluidos en el apartado

anterior, encontrándoseque, en DM80, la cadena6-aralquíicaadopta preferentementeuna conformación en la que dicha

cadena se pliega sobre el anillo de 2,5-dicetopiperidina.

Asimismo, estosresultadosparecenindicar que el anillo de 2,5-

dicetopiperidinaadoptaconformacionesde tipo bote torcido.

3. Se ha puesto a punto un procedimientopara la preparaciónde

pseudodipéptidoscetometilénicoscíclicos.

4. Se describela síntesisde derivadosde 8-amino-3-oxoindohzi-dina-2-carboxilatopor hidrogenacióncatalítica de y-cetodiésteres

derivadosde Boc-L-Orn(Z)-014y Boc-n-Orn(Z)-OH.Como dato a

destacaren estasíntesis,indicar que transcurreen un solo paso

—207—

que implica eliminación del grupo protector Z, seguida de

aminación reductiva intramoleculary y-lactamización.Se ha

establecidoque la elaboracióndel esqueletode 3-oxoindolizidinaprocedecon un alto grado de estereoselectivídad,conduciendo

muy mayoritariamentea los isómeros con disposición trans delos sustituyentesen posiciones8 y 8a.

5. Se han sintetizadouna serie de derivadosde 8-amino-2-metoxi-

carbonil-3-oxoindolizidinaportadoresde las cadenaslateralesde

diferentes aminoácidos (Phe, Trp, Asp) en posición 2. La

incorporación de estas cadenas, mediante reacción de

alquilación con el agentealquilante adecuado,transcurrede

forma estereoselectiva.

6. Se ha realizado un estudio de la enantioselectividaden el

proceso de formación de las 3-oxoindolizidinas objeto de este

trabajo, poniéndosede manifiestoque estas lactamasbicíclicasestánconstituidaspor mezclasde dos enantiómerosformados

durante el procesode elaboracióndel anillo heterocíclico.Se ha

demostradoque la enantioselectividadaumentaal disminuir Ja

temperaturade la reacción de hidrogenaciónimplicada en

dicho proceso.

7. Se han preparado de forma estereoespecíficaderivados de

8-amino-3-oxoindolizidina 2,2-disustituidosportadores de un

grupo hidroxilo o alcoxilo en posición Sa, por hidrogenación

catalítica, en diferentesdisolventes,de 2-bencil-4-cetodiésteres

derivadosde Orn.

8. Con el fin de conocerla capacidadde los derivadosde 8-amino-3-

oxoindolizidina-2-carboxilatopara inducir conformacionesdetipo giro j3. se ha llevado a cabo un estudio de modelización

molecular con modelos sencillos, utilizando la técnica dedinámica molecular. Los resultadosde este estudio indicaron

que los derivadosde 3-oxoindolizidina con disposición trans delos sustituyentesen posiciones8 y Sa adoptanpreferentemente

conformacionesextendidas.Por el contrario, el isómero8,8a-cis

mostró una gran tendenciaa adoptarconformacionesplegadas,

bien mediante formación de un puente de hidrógeno intra-

molecularentrelos grupos8-NR y 2-CO, bien conformacionesdetipo giro jB II.

— 208—

9. Se han preparadouna seriede análogosconformacionalmenterestringidosde CCK4, H-Trp-Met-Asp-Phe-N142,en los que el

residuo de Met o el fragmento dipeptídico Met-Asp se han

reemplazadopor esqueletosde 2,5-dicetopiperidinaconveniente-

mente sustituidos.Los resultadosde afinidad por los receptores

de CCK indicaron que, en esta serie de compuestos,la dispo-

sición relativa cts entrelas cadenaslateralescorrespondientesalos aminoácidosTrp y Phe favorecela unión a los receptores

periféricos CCKA, mientrasque la disposicióntrans da lugar a

compuestosmenos efectivos, En el mejor de los casos, las

afinidades encontradasfueron moderadas(~ 106 M). Estos

derivados fueron inefectivos en su unión a los receptores

centralesCCKB. En Los ensayosfuncionalesninguno de los deri-

vadosestudiadospresentóactividadantagonistasignificativa.

10. Se ha llevado a cabo la preparaciónde diferentes análogosde

CCK4 portadoresde esqueletosde 3-oxoindolizidina,encontrán-

doseque los mejoresvalores de afinidad por los receptoresdeCCK se obtuvieron para aquellos derivadosen los que estaslactamas bicíclicas reemplazan al dipéptido Met-Asp.Asimismo, se ha observadoque la disposiciónespacialrelativadel grupo 2-bencilo y el residuo de Trp, así como la

estereoquímicadel restode Trp, afectanal grado de selectividad

por los receptoresCCKA o CCKB. La presenciadel grupo

carboxamida en posición C-terminal de estos derivadosaumentaen un orden de magnitud la afinidad por ambostiposde receptores.Aquellos derivadoscon afinidad aceptablepor losreceptoresCCKA se comportaroncomo antagonistasperiféricos

moderados.

11. Con objeto de intentar aportar nuevos datos acerca de laconformaciónbioactivade la NT, sehansintetizadouna seriedeanálogosconformacionalmenterestringidos de NT813, H-Arg-

Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu-OH, en los que el fragmento dipeptídicoPro-Tyr se ha sustituidopor esqueletosde 3-oxoindolizidina con

diferentesestereoquímicas.A partir de los datos de afinidad de

estosanálogospuedededucirseque, mientras la estereoquímica

en C-2 no tiene influenciaen la unión a los receptoresde NT, ladisposición relativa, cis o trans, de los sustituyentesen

— 209

posiciones 8 y 8a juega un papel importante. Mediante las

diferenciasde afinidad observadaspuedeestablecerseque lasrestriccionesconformacionalesinducidaspor las 3-oxoindolizi-

dinas8,8a-transen los análogosde NTwís seajustanmejor a losrequisitostopográficosde los receptoresde NT que las inducidas

por el derivado8,8a-cis.12. Se ha realizado un estudio de modelización molecular del

derivado dipeptídico Ac-Pro-Tyr-NHCHg y de diferentes

8-acetilamino-2-bencil-3-oxoindolizidina-2-(N-metil)carboxamidoderivados, como modelos sencillos de NTgj3 y sus análogos

restringidos, respectivamente.Este estudiopuso de manifiesto

que el derivado dipeptídico tiene una alta tendenciaa adoptar

conformacionesde giro ¡3, tipos 1 o III, y de giro y-inverso. Por

otra parte, la 8-amino-2-bencil-2-carboxi-3-oxoindolizidinacon

disposición 8,8a-cis, que fue la única que mostró una gran

preferencia por conformacionesplegadas,concretamentedetipos 8N14—*2C0 y giro ¡311, dio lugar a un análogode NT813

inactivo. Estos resultadosindican que estostipos de conforma-

ciones son incompatibles con la conformación bloactiva de la

Neurotensina.

—210—

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