fag492a-Aclimatacion-Chloraea
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Aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl cultivadas in vitro
Memoria presentada como parte de los requisitos para optar al tiacutetulo de Ingeniero Agroacutenomo
VALEacuteRIE VAN GINDERDEUREN RAVESCHOT VALDIVIA ndash CHILE
2009
PROFESOR PATROCINANTE
____________________________________
Peter Seemann Fahrenkrog Ing Agr Dr rer hort Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal PROFESORES INFORMANTES ____________________________________ Magaly Rivero Gutieacuterrez Prof Biol Y Quim Dr Cs ____________________________________ Nancy Andrade Soto Ing Agr M Sc Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal
A mis papaacutes por su carintildeo y apoyo incondicional
A mis hermanos por estar conmigo
A Claudia y Camila por su paciencia preocupacioacuten y ayuda y
a todos los que compartieron conmigo esta experiencia
I
INDICE DE MATERIAS
Capiacutetulo Paacutegina
RESUMEN 1
REacuteSUMEacute 2
1 INTRODUCCION 3
2 REVISION BIBLIOGRAFICA 4
21 Descripcioacuten general 4
211 Descripcioacuten geograacutefica 4
212 Formas de vida 4
213 Descripcioacuten morfoloacutegica 4
214 Geacuteneros y especies chilenas 5
2141 Chloraea virescens 6
22 Requerimientos de las orquiacutedeas 7
221 Agua 7
222 Luz 8
223 Fertilizacioacuten 8
224 Temperatura 8
23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas 9
231 Biologiacutea de las semillas 9
232 Germinacioacuten simbioacutetica y no simbioacutetica de semillas 9
233 Condiciones de esterilidad 9
2331 Siembra de las semillas 10
234 Transplante 10
24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas 11
241 Orquiacutedeas terrestres 11
2411 Cypripedium 11
2412 Preservacioacuten in vitro de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes 12
2413 Longevidad de semillas de orquiacutedeas terrestres 12
2414 Sobrevivencia de orquiacutedeas terrestres transplantadas a sectores
urbanos 13
II
2415 Micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres 13
242 Orquiacutedeas epiacutefitas 14
2421 Preservacioacuten de Cattleya walkeriana usando propagacioacuten in vitro 14
2422 Establecimiento de cultivos in vitro y micropropagacioacuten de Cattleya
aurantiaca (Bateman ex Lindl) 14
2423 Establecimiento in vitro y regeneracioacuten de plantas de Laelia autumnales
(Llave y Lex) Lindl 15
25 Aclimatacioacuten 16
251 Stress de agua 16
2511 Cutiacutecula 16
2512 Estomas 17
252 Humedad 17
253 Luz 17
254 Temperatura 17
255 Fotosiacutentesis 18
256 Sustrato 18
3 MATERIAL Y METODO 20
31 Material 20
311 Material vegetal 20
312 Material de laboratorio 20
32 Meacutetodo 20
321 Preparacioacuten del medio de cultivo 20
322 Obtencioacuten del material vegetal 20
323 Sustratos 21
324 Plantacioacuten 21
325 Disentildeo de los ensayos 21
326 Disentildeo experimental 22
327 Paraacutemetros a evaluar 22
328 Anaacutelisis estadiacutestico 22
III
4 PRESENTACIOacuteN Y DISCUSION DE RESULTADOS 24
41 Nuacutemero de hojas finales 25
411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula 25
412 Efecto del tipo de sustrato 26
413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato 27
42 Raiacuteces iniciales 28
421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula 29
422 Efecto del tipo de sustrato 30
423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato 30
43 Raiacuteces finales 31
431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula 32
432 Efecto del tipo de sustrato 32
433 Interaccioacuten tamantildeo de plaacutentula y sustrato 33
44 Altura 35
45 Sobrevivencia 36
5 CONCLUSIONES 38
6 BIBLIOGRAFIA 39
7 ANEXOS 42
IV
INDICE DE CUADROS
Cuadro Paacutegina
1 Composicioacuten de solucioacuten nutritiva Hoagland 21
2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de
raiacuteces inicial y final 24
3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas 25
V
INDICE DE FIGURAS
Figura Paacutegina
1 C virescens 7
2 Plaacutentulas de C virescens en caacutemara de crecimiento in vitro 20
3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS
B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten 24
4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) 26
5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final
de hojas (Test de Dunn) 27
6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 28
7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses
de pre aclimatacioacuten 28
8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 29
9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final
de raiacuteces (Test de Dunn) 30
10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no
parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 31
11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses
de aclimatacioacuten 31
12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 32
13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final
de raiacuteces (Test de Dunn) 33
14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre para la variable no
parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 34
15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) 35
VI
16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable
parameacutetrica altura final de plaacutentulas 35
17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) 37
18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la
variable parameacutetrica de sobrevivencia 37
VII
INDICE DE ANEXOS
Anexo Paacutegina
1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962)
y suplementos orgaacutenicos 44
2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio 45
3 Registro de temperaturas miacutenimas maacutexima y promedio durante
el estudio 46
4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas
finales 47
5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales 47
6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces
iniciales 48
7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces
iniciales 48
8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces
finales 49
9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales 49
10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en
aclimatacioacuten 50
11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura 50
12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de
plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten 51
13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia 51
14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea 52
1
RESUMEN Dentro del esquema de micropropagacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens la aclimatacioacuten es la etapa final donde la manipulacioacuten debe ser muy cuidadosa ya que es donde se produce el mayor iacutendice de mortandad principalmente en el proceso de trasplante Esta etapa es muy importante ya que gracias a ella se veraacute la eficiencia del proceso y la calidad final de las plantas producidas in vitro por eso el objetivo general de este trabajo es evaluar la influencia del tamantildeo de plaacutentulas y utilizacioacuten de distintos sustratos en la aclimatacioacuten ex vitro de plaacutentulas de C virescens Se utilizaron plaacutentulas de Chloraea virescens obtenidas a partir de la micropropagacioacuten de protocormos provenientes de germinacioacuten asimbioacuteticas de semillas efectuada en el laboratorio de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal de la Universidad Austral de Chile Las plaacutentulas fueron repicadas hasta obtener el nuacutemero adecuado para el ensayo Luego fueron trasladadas a una sala del laboratorio en macetas de seis ocho y diez plaacutentulas dependiendo del tamantildeo de la plaacutentula (maacutes de 3cm 2-3cm y 1-2cm respectivamente) por dos meses posteriormente fueron transferidas a 3 sustratos turba+perlita (11) Sphagnum y turba+arena (11) y fueron llevadas a invernadero durante cuatro meses Las variables evaluadas fueron nuacutemero final de hojas nuacutemero inicial y final de raiacuteces altura y sobrevivencia de las plaacutentulas Los resultados obtenidos demostraron que los tamantildeos y los sustratos ocupados influyen en el crecimiento de las plaacutentulas El mejor tamantildeo para la aclimatacioacuten es de maacutes de 3cm obteniendo con eacuteste los mejores resultados en todas las variables evaluadas Lo mismo ocurrioacute con el sustrato turba+perlita el cual fue el mejor evaluado
2
REacuteSUMEacute Dans le scheacutema de la micropropagation de Chloraea virescens lacclimatation est la derniegravere eacutetape ougrave il faut ecirctre prudent parce que cest agrave ce moment lagrave que les taux de mortaliteacute sont les plus eacuteleveacutes principalement dans le processus de transplantation Cette eacutetape est tregraves importante parce que ce sera gracircce agrave elle quacuteon verra lefficaciteacute du processus et la qualiteacute finale des plantes produites in vitro Lobjectif geacuteneacuteral de cette eacutetude est dacuteeacutevaluer linfluence de la taille des plantes et lutilisation de divers substrats pour lacuteacclimatation de C virescens On a utiliseacute des plantes de C virescens obtenue a partir de la micropropagation de protocormos en provenance du laboratoire de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal de la Universidad Austral de Chile Les plantes ont eacuteteacute subdiviseacutee pour obtenir le nombre approprieacute Elles ont ensuite eacuteteacute transfeacutereacutees agrave des pots dans une piegravece du laboratoire de six huit et dix en fonction de la taille de la plante (plus de 3 cm de 2-3 cm et 1-2 cm respectivement) pour deux mois ensuite elles ont eacuteteacute transfeacutereacutee dans trois substrats tourbe + perlite (11) Sphagnum et tourbe + sable (11) et elles ont eacuteteacute mises dans une serre pour quatre mois Les variables agrave eacutevaluer sont nombre final de feuilles nombre de racines au deacutebut et agrave la fin la hauteur et la survie des plantes Les reacutesultats ont montreacute que la taille et les substrats utiliseacutes ont une influence sur la croissance des jeunes plantes La taille ideacuteale pour lacclimatation est plus de 3cm avec cette derniegravere on a obtenu les meilleurs reacutesultats dans toutes les variables qui ont eacuteteacute eacutevalueacutees Le mecircme reacutesultat sest produit avec le substrat de tourbe + perlite lequel a aussi montreacute les meilleurs reacutesultats
3
1 INTRODUCCION La familia Orchidaceae (Orquiacutedeas) es la que mayor nuacutemero de especies comprende en el Reino Vegetal Se estima que debe haber alrededor de 35000 especies de Orquiacutedeas en todo el mundo pertenecientes a unos 750 geacuteneros ademaacutes de miles de hiacutebridos En Chile esta familia es probablemente el grupo menos estudiado de plantas con flores y soacutelo se han realizado estudios en base a su taxonomiacutea biologiacutea reproductiva fenologiacutea y distribucioacuten
La produccioacuten de flores de orquiacutedeas ha tomado importancia por la belleza de sus flores dada la enorme variedad de formas colores y perfumes Existen orquiacutedeas terrestres y epiacutefitas estas uacuteltimas representan maacutes del 90 del total de especies y son las que mayoritariamente se encuentran a la venta Las flores tienen un alto valor ornamental o como flor cortada ya que eacutestas pueden permanecer separadas de las plantas sin marchitarse hasta tres o cuatro semanas y en la planta permanecen hasta tres meses
La obtencioacuten de plantas de orquiacutedeas a partir de semillas es muy difiacutecil ya que eacutestas son diminutas y de germinacioacuten irregular Como una alternativa de obtencioacuten de plantas aparece la micropropagacioacuten pudiendo asiacute aumentar el nuacutemero de plantas en forma relativamente faacutecil y raacutepida Luego de la etapa de micropropagacioacuten viene la etapa de aclimatacioacuten en la cual la manipulacioacuten debe ser en extremo cuidadosa ya que es donde se produce el mayor iacutendice de mortandad principalmente en el proceso de transplante Esta etapa es muy importante ya que gracias a ella se veraacute la eficiencia del proceso y la calidad final de las plantas producidas in vitro Considerando la produccioacuten de plaacutentulas mediante la micropropagacioacuten en este trabajo se plantea la hipoacutetesis que ldquoel tamantildeo de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro y los distintos sustratos son factores que inciden en el desarrollo y su aclimatacioacutenrdquo El objetivo general de este trabajo es
Evaluar la influencia del tamantildeo de plaacutentulas y utilizacioacuten de distintos sustratos en la aclimatacioacuten ex vitro de plaacutentulas de C virescens
Los objetivos especiacuteficos son
Medir el efecto del tamantildeo de plaacutentulas de C virescens en la sobrevivencia y desarrollo de eacutestas ex vitro
Comparar el uso de tres sustratos en el desarrollo y sobrevivencia de plaacutentulas de C virescens
4
2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA 21 Descripcioacuten general 211 Descripcioacuten geograacutefica Las orquiacutedeas pertenecen a la familia Orchidaceae clase Liliopsida (monocotiledoacuteneas) Son plantas herbaacuteceas perennes originarias de regiones tropicales y subtropicales pero existen tambieacuten en todos los continentes a excepcioacuten de las regiones polares La zona donde se encuentran estas plantas estaacute comprendida entre los 68ordm latitud norte y 56ordm latitud sur Es evidente que en los liacutemites extremos de estas latitudes se encuentran pocos geacuteneros y especies esto va en aumento desde las regiones temperadas hasta las regiones intertropicales donde el nuacutemero es el mayor Los territorios maacutes interesantes por su nuacutemero son
Ameacuterica del Sur y Ameacuterica Central Asia e India Madagascar Australia es el continente menos poblado en orquiacutedeas dentro de las regiones
del globo Por su parte Europa presenta numerosos geacuteneros y especies de orquiacutedeas
terrestres Soacutelo en Francia existen 75 especies repartidas en 16 geacuteneros todas terrestres (LECOUFLE y ROSE 1956)
212 Formas de vida Las zonas donde crecen estas plantas influyen sobre su manera de vivir Algunas orquiacutedeas son terrestres y se encuentran representadas en todas las regiones Tambieacuten existen las epiacutefitas (vegetal que fijado a otro no obtiene de eacuteste su alimento) En este caso se necesita que el grado higromeacutetrico y la temperatura permitan este tipo de adaptacioacuten Ademaacutes existen las orquiacutedeas litofiacuteticas que viven sobre rocas Las raiacuteces de las epiacutefitas y litofiacuteticas estaacuten adaptadas a vivir expuestas al aire o inmersas en materia orgaacutenica ya que tienen un tejido acumulador de agua llamado velo En zonas friacuteas y templado friacuteas todas las orquiacutedeas son terrestres En zonas subtropicales o tropicales la gran mayoriacutea es epiacutefita Otra particularidad debida seguramente a la influencia de estas zonas es la floracioacuten Es en las zonas tropicales y subtropicales que se dan los mayores tamantildeos de flores asiacute como tambieacuten la mayor variedad de colores (LECOUFLE y ROSE 1956)
213 Descripcioacuten morfoloacutegica Las orquiacutedeas se caracterizan por poseer flores muy vistosas hermafroditas (ambos sexos en la misma flor) zigomorfas (con un solo plano de simetriacutea) triacutemeras (tres seacutepalos y tres peacutetalos) y una columna central que sustenta las estructuras reproductivas masculinas anteras y femeninas pistilo llamada ginostemo El peacutetalo inferior se llama labelo y su morfologiacutea define a los distintos geacuteneros de orquiacutedeas Las flores pueden ser aisladas o en inflorescencia y son polinizadas por insectos El polen se encuentra aglomerado formando una masa llamada polinio el que tiene un extremo con un ensanchamiento glandular pegajoso que sirve para que el
5
polinio se adhiera al cuerpo del insecto polinizador El fruto es una caacutepsula seca con muchas semillas pequentildeas sin endosperma y con embrioacuten no diferenciado Tienen dos tipos baacutesicos de crecimiento Simpodial en las que el nuevo crecimiento se produce en sentido horizontal a partir de un tallo subterraacuteneo o rizoma generando una sub-unidad capaz de producir una flor o inflorescencia y de ser eventualmente separada de la planta (ej Cattleya) Monopodial en las que el nuevo crecimiento se produce en sentido vertical con lo cual la planta crece constantemente en altura (ej Phalaenopsis) (ORQUIDEAS 2007) 214 Geacuteneros y especies chilenas Seguacuten NOVOA et al (2006) en la familia Orchidaceae se encuentran 49 especies de flora nativa dentro de las cuales se encuentra Chloraea virescens (Willd) Lindl Los geacuteneros de Orchidaceae en Chile son 7
- Aa Bipinnula Brachystele Codonorchis Chloraea Gavilea y Habenaria
Dentro del geacutenero Chloraea existen 31 especies - Chloraea alpina Poepp - Chloraea barbata Lindl - Chloraea bidendata (Poepp y Endl) Correa - Chloraea bletioides Lindl - Chloraea cuneata Lindl - Chloraea chica Speg - Chloraea chrysantha Poepp - Chloraea crispa Lindl - Chloraea cristata Lindl - Chloraea cylindrostachya Poepp - Chloraea disoides Lindl - Chloraea galeata Lindl - Chloraea gaudichaudii Brongn - Chloraea gavilu Lindl - Chloraea grandiflora Lindl - Chloraea heteroglossa Rchbf - Chloraea incisa Poepp - Chloraea lamellata Lindl - Chloraea lechleri Lindl - Chloraea leptopetala Reiche - Chloraea longipetala Lindl - Chloraea magellanica Hookf - Chloraea multiflora Lindl - Chloraea nudilabia Lindl - Chloraea philippii Reichbf - Chloraea picta Phil - Chloraea prodigiosa Reichbf - Chloraea speciosa Poepp - Chloraea virescens Lindl - Chloraea viridiflora Poepp
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- Chloraea volkmanni Phil (NOVOA et al 2006) 2141 Chloraea virescens Planta perenne de 40-90 cm de altura Sus hojas son de 5-12cm de largo por 15-25cm de ancho estrechas lanceoladas agudas dispuestas en roseta basal generalmente marchitas al final de la antesis Su escapo floral tiene vainas caulinares lanceoladas agudas y distantes La inflorescencia es de 8-20cm de largo densa con 10-15 flores erguidas Sus flores son blancas con estriacuteas y aacutepices verdes El seacutepalo dorsal es de 16-33mm de largo por 4-6mm de ancho oblongo lanceolado obtuso algo coacutencavo a veces ligeramente estrechado al centro aacutepice algo carnoso Los seacutepalos laterales de 18-33mm de largo por 4-5mm de ancho son ensiformes con aacutepice obtuso engrosado verde negruzco a veces espatulado y dentado a veces verrugoso Los peacutetalos son de 15-23mm de largo por 5-58mm de ancho estrechamente aovados obtusos verrugosos con maacutes frecuencia solo la mitad inferior a veces el borde denticulado y carnoso El labelo de 15-26mm de largo por 10-20mm de ancho es mas o menos romboidal a levemente trilobulado El loacutebulo central tiene 5-7 nervios longitudinales recorridos por laminillas interrumpidas membranaacuteceas con segmentos falciformes de borde carnoso de color verde Los nervios laterales que se ramifican oblicuamente hacia el aacutepice en los loacutebulos laterales tienen pequentildeas laminillas y verrugas y su borde es laciniado inciso en la mitad apical hacia la base denticulado aacutepice generalmente engrosado La columna es de 12-18mm de largo delgada blanca con estriacuteas anaranjada La base de la zona nectariacutefera tiene un color amarillo-limoacuten con maacuteculas anaranjadas orificio nectario verde El ala de la columna es recta y estrecha El estigma es triangular y globoso La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la Vordf (Vintildea del Mar) hasta la XIordf Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile Sin embargo es posible que tenga una distribucioacuten maacutes restringida por que se le ha confundido con Chloraea incisa Su floracioacuten es desde noviembre a febrero y su estado de conservacioacuten no estaacute evaluado (NOVOA et al 2006) En el Anexo 14 se incluyen antecedentes sobre su distribucioacuten y eacutepoca de floracioacuten
7
FIGURA 1 Chloraea virescens FUENTE NOVOA et al (2006) 22 Requerimientos de las orquiacutedeas Para tener eacutexito en el cultivo de orquiacutedeas hay que tomar en cuenta factores de importancia como son 221 Agua El riego correcto es el principio y el fin del cuidado de orquiacutedeas (ROLLKE 2005) Este elemento es primordial para las orquiacutedeas asiacute como tambieacuten para todo tipo de plantas En el caso de eacutestas se dice muchas veces que la calidad del agua usada es el factor maacutes importante en el cultivo de orquiacutedeas ya que el porcentaje maacutes alto de muerte se produce por el exceso de este factor (SHEEHAN 1980) Hay que tomar en cuenta que la mayoriacutea de las orquiacutedeas son epiacutefitas lo que significa que tienen sus raiacuteces a la vista gracias a las cuales absorben el agua de lluvia Se recomienda un sustrato poroso y de reaccioacuten neutra ya que de esta manera el agua escurre sin acumularse no permitiendo la pudricioacuten de las raiacuteces Para las orquiacutedeas terrestres es lo mismo solo que se pueden regar con maacutes frecuencia pero sin mantenerlas saturadas (OSPINA y DRESSLER 1979) Seguacuten DUMOIS (2007) el agua es lo maacutes difiacutecil de controlar ya que depende de muchas variables como por ejemplo humedad relativa tipo de sustrato intensidad luminosa temperatura y circulacioacuten de aire Ademaacutes muchas orquiacutedeas necesitan un periacuteodo de receso vegetativo que si no es respetado resulta en ausencia de floracioacuten En general hay que antildeadir agua en abundancia cuando la planta se encuentra en crecimiento activo y reducirla despueacutes de la floracioacuten
8
Las especies con pseudobulbos almacenan agua y estaacuten preparadas para su periacuteodo de receso Otras que no cuentan con estos oacuterganos requieren de humedad maacutes constante 222 Luz Ninguna planta puede crecer sin la iluminacioacuten adecuada Muchas orquiacutedeas viven en las alturas de los aacuterboles y estaacuten expuestas a plena luz del sol otras crecen en el suelo selvaacutetico protegidas del sol por espesos follajes (ROLLKE 2005) La funcioacuten principal de la luz es activar el proceso de fotosiacutentesis Los cultivadores han estudiado la luz y han descubierto que hay orquiacutedeas que florecen con diacutea largo y otras con diacutea corto (OSPINA y DRESSLER 1979) Gracias a la fotosiacutentesis se convierten los minerales presentes en el ambiente en savia y nutrientes Hojas oscuras y falta de floracioacuten indican falta de luz hojas amarillas e incluso quemadas apuntan hacia un exceso de sol (DUMOIS 2007) 223 Fertilizacioacuten Las orquiacutedeas necesitan los mismos nutrientes que otras plantas Un abono para orquiacutedeas debe contener los nutrientes principales nitroacutegeno (N) foacutesforo (P) y potasio (K) asiacute como tambieacuten oligoelementos como hierro (Fe) magnesio (Mg) zinc (Zn) estantildeo (Sn) y manganeso (Mn) (ROLLKE 2005) Por otra parte la fertilizacioacuten depende de varios factores dentro de los cuales los maacutes criacuteticos son
- El medio utilizado - La edad de las plantas - Estado de las plantas ya sea floracioacuten crecimiento reposo
En cuanto a absorcioacuten se ha demostrado que es igual de eficiente por viacutea foliar como a traveacutes de las raiacuteces Es necesario tener en cuenta algunas reglas baacutesicas a la hora de fertilizar las orquiacutedeas (Asociacioacuten Costarricense de Orquideologiacutea ACO 1970)
1 Regar las plantas antes de fertilizar 2 Fraccionar las dosis 3 Aplicar el fertilizante de forma liacutequida 4 No usar fertilizantes soacutelidos 5 No fertilizar las plantas recieacuten plantadas 6 No fertilizar plantas en reposo 7 No abonar plantas enfermas
224 Temperatura Es conocido el hecho de que cada planta tiene liacutemites de temperatura dentro de los cuales prospera o perece De ahiacute la necesidad de conocer las temperaturas correspondientes al lugar de donde viene cada especie de orquiacutedea pudiendo proporcionarle la temperatura adecuada (OSPINA y DRESSLER 1979) Se puede clasificar a las orquiacutedeas como de clima caacutelido (temperatura nocturna miacutenima de 20ordmC) templado (miacutenimo de 13 a 18ordmC) y de ambiente friacuteo (de 10 a 13ordmC) (DUMOIS 2007)
9
Seguacuten SHEEHAN (1980) las temperaturas ideales para las orquiacutedeas de origen tropical son 10ordmC en la noche y entre 21ordm - 24ordmC durante el diacutea 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas La micropropagacioacuten de orquiacutedeas estaacute en vanguardia hoy en diacutea El estudio de cultivo de tejido de orquiacutedeas se lleva a cabo en muchos laboratorios de todo el mundo (ARDITTI and ERNST 1992) 231 Biologiacutea de las semillas Las semillas de orquiacutedeas son conocidas usualmente como semillas polvo porque son minuacutesculas y contienen pocas reservas de alimento Estas semillas por lo general no germinan en el medio natural a menos que sean infectadas por un hongo micorriacutezico Este hongo abastece a las plantas joacutevenes con azuacutecares y nutrientes hasta que sean lo suficientemente grandes para fabricar su propio alimento Cuando la semilla germina produce una masa indiferenciada de ceacutelulas llamada protocormo Manteniendo las condiciones normales el protocormo continuaraacute su crecimiento por varias semanas meses o incluso antildeos dependiendo de la especie hasta que alcance la edad apropiada para producir raiacuteces y hojas En el caso de orquiacutedeas terrestres es de vital importancia que la relacioacuten orquiacutedea-hongo se conserve durante los estados tempranos del ciclo de vida de la planta ya que el protocormo enterrado no puede fabricar alimento por siacute mismo Por otro lado los protocormos de las orquiacutedeas epiacutefitas son comuacutenmente verdes lo que les posibilita producir parte de su alimento La relacioacuten orquiacutedea-hongo no ha sido en su totalidad investigada para el caso de las orquiacutedeas tropicales (McKENDRICK 2000) 232 Germinacioacuten simbioacutetica y no simbioacutetica de semillas Mediante la germinacioacuten in vitro las semillas germinan en frascos de vidrio o plaacutestico Estos frascos contienen en su interior un medio nutritivo solidificado con agar con todos los azuacutecares y minerales necesarios para la germinacioacuten y crecimiento de las semillas Hay dos tipos de germinacioacuten la simbioacutetica y la asimbioacutetica En la germinacioacuten simbioacutetica las semillas se siembran junto con una pequentildea cantidad del hongo micorriza adecuado Dicho hongo crece en el medio coloniza a las semillas que estaacuten en proceso de germinacioacuten y se produce una relacioacuten simbioacutetica la cual alimentaraacute al protocormo hasta que este sea capaz de producir sus hojas y se vuelva autotroacutefico Esta teacutecnica es usada principalmente en propagacioacuten de orquiacutedeas terrestres en zonas templadas La germinacioacuten asimbioacutetica se usa principalmente en propagacioacuten de orquiacutedeas tropicales que crecen maacutes raacutepido que sus parientes de zonas templadas Para este tipo de germinacioacuten se necesita un medio de cultivo maacutes complejo ya que todos los nutrientes orgaacutenicos e inorgaacutenicos asiacute como tambieacuten los azuacutecares deben estar en forma disponible pues no existe la intermediacioacuten del hongo (McKENDRICK 2000) 233 Condiciones de esterilidad Tanto para la germinacioacuten simbioacutetica como para la asimbioacutetica es de vital importancia que los frascos las semillas aparatos y el medio esteacuten esteacuteriles desde el principio del proceso Esto debido a que cualquier hongo o bacteria que se introduzca creceraacute maacutes raacutepido que las semillas ocupando su espacio hasta matarlas Esto se evita gracias al autoclave el cual regulado a 12 atm y 120ordmC por 20 minutos mata hongos o bacterias presentes en el medio (McKENDRICK 2000)
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2331 Siembra de las semillas Las semillas pueden ser recolectadas desde caacutepsulas verdes o maduras La caacutepsula verde que estaacute madurando estaacute llena de semillas y no se deforma cuando se aprieta con las pinzas Estas semillas pueden ser almacenadas por algunas semanas en un lugar refrigerado con bastante aireacioacuten Las semillas se pueden sembrar a partir de caacutepsulas verdes o semillas secas A continuacioacuten se muestran las ventajas y desventajas de ambos meacutetodos
- Siembra a partir de caacutepsulas verdes Si las caacutepsulas se mantienen intactas el interior (las semillas) se mantiene esteacuteril Por lo tanto si se esteriliza la parte exterior de las mismas donde hongos y bacterias pueden desarrollarse y se abren las caacutepsulas bajo condiciones esteacuteriles y las semillas podraacuten mantenerse desinfectadas
La ventaja de este meacutetodo es que no se requiere de esterilizacioacuten de las semillas lo que provoca su deterioro Otro punto a favor es que algunas semillas podriacutean germinar maacutes raacutepido que las provenientes de caacutepsulas maduras por los mecanismos de dormancia La desventaja es que en este caso todas las semillas deben ser utilizadas o eliminadas mientras que las semillas maduras se pueden almacenar Tambieacuten se debe considerar que las semillas sembradas a partir de caacutepsulas que no han madurado lo suficiente podriacutean germinar lentamente o simplemente no germinar - Siembra a partir de semillas secas En este caso una vez que la caacutepsula es abierta las semillas dejan de ser esteacuteriles y requieren de un proceso de esterilizacioacuten Comuacutenmente se utiliza una solucioacuten de hipoclorito de sodio hipoclorito de calcio o peroacutexido de hidroacutegeno Las semillas se agitan dentro de la solucioacuten que ademaacutes contiene una gota de detergente para ldquohumedecerlasrdquo luego se las enjuaga con agua destilada y se las siembra en el medio preparado La ventaja de este meacutetodo es que las semillas pueden ser colectadas secadas al aire almacenadas por varios meses en el refrigerador y utilizarlas cuando sea necesario Se debe considerar que la siembra ya sea de caacutepsulas verdes o de semillas secas estaacute determinado por la eacutepoca en que se colectan (McKENDRICK 2000) 234 Trasplante En la caacutemara de incubacioacuten las plaacutentulas se han desarrollado en condiciones limpias y en un ambiente cerrado por lo que deben acostumbrase gradualmente al ambiente exterior antes de ser trasplantadas a las macetas Tambieacuten la temperatura y la luz la cual es baja han sido constantes durante el cultivo in vitro En el medio natural la temperatura y la luz variacutean constantemente por lo que las nuevas plantas deben estar protegidas de la fuerte luz solar la cual puede quemar las hojas con soacutelo una pequentildea cantidad de eacutesta La humedad en los frascos es alta y las plantas estaacuten protegidas de ataques por hongos o bacterias Ademaacutes las plaacutentulas han crecido bajo condiciones de alta humedad y por lo tanto tendraacuten cutiacuteculas deacutebiles por lo que necesitan acostumbrase a medios menos huacutemedos antes de ser transplantadas
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Para el trasplante se deben colocar los frascos en un lugar protegido de la lluvia para que se aclimaticen a las nuevas condiciones de luz y temperatura Se deben dejar por 2 a 4 semanas en los frascos tapados Luego se debe ir aflojando las tapas para dejar entrar pequentildeas cantidades de aire hasta el punto de dejarlas descubiertas Se debe revisar si hay hojas marchitas y ver que el sustrato esteacute huacutemedo
Lo ideal es dejarlas sin tapa durante una semana antes de pasarlas a las macetas Para el trasplante se debe elegir un sustrato adecuado para el tipo de planta humedecerlo y transplantar las plantas con cuidado de no dantildear las raiacuteces y evitando la deshidratacioacuten En esta etapa tambieacuten se debe dejar las macetas selladas para evitar una raacutepida deshidratacioacuten e ir abrieacutendolas paulatinamente (McKENDRICK 2000)
24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas 241 Orquiacutedeas terrestres 2411 Cypripedium Esta es una orquiacutedea terrestre de zonas templadas se desarrolla en el Hemisferio Norte como por ejemplo en Guatemala y en Honduras pero donde se encuentra principalmente es en China Su forma maacutes comuacuten de propagacioacuten es in vitro a partir de semillas La forma maacutes eficiente es a partir de semillas inmaduras Existe un intervalo de tiempo entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten eacuteste dependeraacute de la especie y de la zona donde se desarrolle Se asume que existen aproximadamente cuatro semanas entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten El oacuteptimo para una buena germinacioacuten de Cypripedium es entre 42 y 60 diacuteas despueacutes de la polinizacioacuten y entre 14 y 32 diacuteas despueacutes de la fertilizacioacuten La germinacioacuten ocurre entre la segunda y cuarta semana despueacutes de ser sembradas y los protocormos deberiacutean ser cambiados de medio de cultivo cada dos a cuatro meses si no se corre el riesgo de sufrir agotamiento de nutrientes Los rizomas y las raiacuteces se empiezan a desarrollar a partir de los siete meses para luego dar lugar a las primeras hojas Para obtener un buen transplante se deben tener raiacuteces de miacutenimo un centiacutemetro de largo El desarrollo de raiacuteces se ve potenciado al tener un periacuteodo corto de bajas temperaturas (10degC) exposicioacuten a la luz reduccioacuten en la concentracioacuten de iones del medio de cultivo o transferirlas a un compost esteacuteril Al tener raiacuteces suficientes y el tamantildeo adecuado se podraacuten llevar las plantas al lugar donde creceraacuten definitivamente En el momento del transplante las plantas son muy susceptibles al desecamiento por lo cual lo ideal es que los brotes sean maacutes chicos que las raiacuteces El mejor sustrato seriacutea aquel donde crece naturalmente la orquiacutedea (RAumlNNBAumlCK 2007) 2412 Preservacioacuten in vitro de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes Este estudio fue hecho para establecer que parte de tejido es viable para la micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes del noreste de Europa pudiendo asiacute reestablecer dichas orquiacutedeas a sus aacutereas correspondientes La propagacioacuten in vitro de orquiacutedeas
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terrestres de clima templado es maacutes difiacutecil que las orquiacutedeas epiacutefitas de clima subtropical y tropical Las orquiacutedeas terrestres tienen requerimientos maacutes estrictos que las epiacutefitas y se conoce menos sobre sus necesidades especiacuteficas (VAASA y ROSENBERG 2004) En Estonia existen 36 especies de orquiacutedeas terrestres pero solo tres estaacuten bajo proteccioacuten Dactylorhiza baltica Dactylorhiza ruthei Dactylorhiza praetermissa Como explantes para este estudio en el caso de D baltica se ocuparon protocormos en los otros dos casos se utilizaron semillas semi maduras las cuales fueron colectadas siete y diez semanas despueacutes de ser polinizadas Para D baltica se ocupoacute el medio Murashige y Skoog suplementado con 05 mgL de aacutecido naftaleacuten aceacutetico (ANA) y 2 mgL de isonpentenyl adenina Para el caso de las semillas semi maduras se ocuparon los medios de Lindemann de Heller de Norstog y de Murashige y Skoog como control
La composicioacuten del medio y la madurez de las semillas influye mucho en el desarrollo de las orquiacutedeas in vitro Se ha demostrado que se necesita una alta concentracioacuten de microelementos para obtener una correcta germinacioacuten de las semillas Tambieacuten se puede decir que los primeros tres meses son los de mayor crecimiento luego de este tiempo el crecimiento se vuelve maacutes lento (VAASA y ROSENBERG 2004)
Luego de cuatro semanas de crecimiento de D baltica el 60 de los explantes de meristemas apicales empezaron a crecer en cambio los de meristemas laterales no expresaron ninguacuten tipo de crecimiento Las raiacuteces empezaron su desarrollo luego de dos meses despueacutes de la siembra
En el caso de D ruthei y D praetermissa la germinacioacuten se produjo despueacutes de dos meses desde la inoculacioacuten Luego de cuatro y seis meses el mayor crecimiento fue observado en el medio Norstog superando en 14 al medio testigo Murashige y Skoog (VAASA y ROSENBERG 2004)
2413 Longevidad de semillas de orquiacutedeas terrestres Por lo general las orquiacutedeas producen muchas pero pequentildeas semillas que contienen muy pocas reservas de alimento Dichas semillas estaacuten estructuralmente adaptadas para ser dispersadas por el viento pero poco se sabe del destino de eacutestas luego de ser dispersadas Algunos estudios de viabilidad de semillas indican una sobrevivencia de uno a dos antildeos en orquiacutedeas de clima templado Las semillas que son guardadas en laboratorio duran mucho maacutes tiempo Se estudioacute la viabilidad de siete especies de orquiacutedeas norteamericanas dentro de las cuales se encuentran Goodyera pubescens y Liparis liliifolia Las semillas de eacutestas se colocaron en bolsas con suelo y sustratos de bosques provenientes de sus haacutebitats naturales (WHIGHAM et al 2005) En Goodyera pubescens la mayoriacutea de las semillas germinaron en un antildeo Cuatro otras especies germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero algunas semillas no germinadas despueacutes de siete antildeos seguiacutean siendo viables En la especie Liparis liliifolia semillas que han estado cuatro antildeos bajo observacioacuten han tenido una tasa de
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germinacioacuten de un 68 al ser sembradas in vitro junto con el hongo micorriacutezico adecuado Las dos especies restantes no germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero las semillas fueron evaluadas como intactas y testeadas positivamente en cuanto a su viabilidad despueacutes de cuatro antildeos en el suelo Estas observaciones fueron interpretadas como diferentes estrategias para especies especiacuteficas de germinacioacuten in situ (WHIGHAM et al 2005) 2414 Sobrevivencia de orquiacutedeas terrestres transplantadas a sectores urbanos La conservacioacuten de poblaciones de orquiacutedeas silvestres depende del establecimiento de las orquiacutedeas propagadas a los campos Sin embargo se conoce muy poco de los factores bioacuteticos que influencian el establecimiento de orquiacutedeas terrestres a sus haacutebitats naturales Un experimento fue establecido para medir la sobrevivencia de seis especies durante su primer periacuteodo de crecimiento seguido del transplante a un sector urbano en Australia (SCADE et al 2006)
Las orquiacutedeas germinadas simbioacuteticamente crecieron en laboratorio durante cinco meses antes de establecer la plantacioacuten en sitios adyacentes con alta o baja cobertura de malezas Existioacute una muerte gradual de las plaacutentulas durante el primer periacuteodo de crecimiento primeramente por ataque de insectos no siendo evitado por la presencia de una malla cobertora Los iacutendices de sobrevivencia variacutean desde 49 para Microtis media una especie capaz de crecer en un ambiente atiacutepico hasta un 21 para Caladenia arenicola la orquiacutedea nativa maacutes comuacuten de esos sitios Sin embargo no todas las orquiacutedeas sobrevivientes producen tubeacuterculos por lo que la tasa de sobrevivencia despueacutes del primer periacuteodo seco disminuye
La sobrevivencia de las orquiacutedeas sembradas no puede ser comparada con orquiacutedeas de la misma especie que crecieron en los mismos lugares ya que no existioacute la presencia del hongo compatible para estas orquiacutedeas (SCADE et al 2006)
2415 Micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres En India dos orquiacutedeas muy importantes para la horticultura del geacutenero Anoectochilus fueron exitosamente propagadas Noacutedulos aislados de A sikkimensis colectadas en Himalaya y A regalis colectadas en India fueron cultivadas in vitro durante 12 semanas para obtener un maacuteximo de 48 a 56 protocormos y brotes obteniendo como resultado un 95 y 98 de eficiencia respectivamente Durante el repicado de los explantes in vitro de A regalis se observoacute que el nuacutemero total de brotes obtenidos a partir de noacutedulos fue 214 asiacute como tambieacuten 82 puntas de brotes En cambio para A sikkimensis fueron mucho maacutes bajos 123 y 43 respectivamente teniendo un crecimiento maacutes lento pero plantas maacutes fuertes Las raiacuteces de 4 a 6cm crecieron con la presencia de NAA (270 microM ) en el medio asiacute como tambieacuten con carbono activado (02) Durante la aclimatacioacuten la tasa de establecimiento fue entre 95 y 98 Luego de seis meses en invernadero las plantas de A regalis fueron transferidas a bosque nativo donde se obtuvo una tasa de
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sobrevivencia de entre 70 y 95 despueacutes de 12 meses Estas plantas establecidas en bosque nativo estaacuten libres de cualquier defecto morfoloacutegico y de crecimiento (GANGAPRASAD et al 2000) 242 Orquiacutedeas epiacutefitas Estas orquiacutedeas viven en los aacuterboles pero no obtienen de eacuteste su alimento no son paraacutesitas 2421 Preservacioacuten de Cattleya walkeriana usando propagacioacuten in vitro El geacutenero Cattleya se encuentra en Meacutexico y Ameacuterica Central asiacute como tambieacuten en Venezuela Colombia y las laderas de los Andes Esta orquiacutedea tambieacuten se encuentra en varias regiones del Brasil creciendo en aacuterboles rocas cerca de riacuteos lagos y pantanos Las flores de esta orquiacutedea son conocidas debido a su hermosura y a causa de la destruccioacuten de su haacutebitat y a la excesiva coleccioacuten de eacutestas se encuentra en extincioacuten
La composicioacuten del medio de cultivo es esencial para la propagacioacuten in vitro ya que suple todos los nutrientes necesarios para el desarrollo y seraacute distinto dependiendo de cada especie en este caso se utilizoacute la mitad de los macronutrientes del medio Muchos autores sugieren el uso de carboacuten activado en el medio ya que por lo general en muchas especies aumenta el desarrollo de las raiacuteces En este estudio se probaron distintas dosis de carboacuten activado 1 2 4 y 6gL con un pH de 6 (TADEU DE FARIA et al 2002) Las semillas se obtuvieron de flores artificialmente polinizadas en invernadero Plaacutentulas de aproximadamente un centiacutemetro fueron seleccionadas y cultivadas nuevamente en el medio de cultivo Murashige y Skoog pero esta vez con las diferentes dosis de carboacuten activado Se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces el nuacutemero de brotes y el peso de la materia verde total Durante el autoclavado se produce normalmente una hidroacutelisis de sacarina la cual es de 10 aproximadamente este porcentaje aumenta considerablemente al agregar un 1 de carboacuten activado llegando a ser de 95
El desarrollo de las plaacutentulas de C walkeriana aumentan con una mayor concentracioacuten de carboacuten activado asiacute como tambieacuten un mayor tiempo de cultivo El resultado fue que la dosis ideal para el desarrollo de esta orquiacutedea es 2gL de carboacuten activado (TADEU DE FARIA et al 2002) 2422 Establecimiento de cultivos in vitro y micropropagacioacuten de Cattleya aurantiaca (Bateman ex Lindl) Por medio de siembra in vitro se logroacute el establecimiento de C aurantiaca con alto porcentaje de germinacioacuten y desarrollo de protocormos Para la oacuteptima formacioacuten de callo y para la proliferacioacuten de protocormos se determinaron los medios oacuteptimos (MS 10 mgL ANA 10 mgL BA) asiacute como tambieacuten de manera directa sobre explantes de hoja y pseudobulbos (MS 01 mgL ANA 01 mgL GA3)
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Con este uacuteltimo medio tambieacuten se logroacute una oacuteptima regeneracioacuten y desarrollo de plaacutentulas Los medios liacutequidos (sin agitacioacuten) son una buena opcioacuten para conseguir la produccioacuten masiva de protocormos ya que con ellos se optimizoacute la micropropagacioacuten de C aurantiaca Las plaacutentulas micropropagadas presentaron alto porcentaje de sobrevivencia y buen desarrollo despueacutes de su trasplante y aclimatacioacuten lo cual demuestra que es un buen sistema de propagacioacuten para C aurantiaca (GUTIERREZ y SALGADO 2007) En cuanto a transplante y aclimatacioacuten despueacutes de 45 diacuteas de desarrollo in vitro las plaacutentulas de un tamantildeo entre 3 y 5 cm con raiacuteces bien desarrolladas fueron llevadas a condiciones ex vitro eliminando los restos de medio de cultivo con agua potable y ocupando un sustrato de partes iguales de tezontle y corteza de encino cubierta con hojarasca de encino finamente molida Se mantuvieron cubiertas durante 15 diacuteas abriendo cada dos diacuteas hasta poder retirar la tapa en 30 diacuteas Despueacutes de dos meses de haber sido retiradas del cultivo in vitro las plaacutentulas presentaron 70 de sobrevivencia y alcanzaron una altura de hasta 7 cm presentando nuevas hojas y raiacuteces las plantas se muestran vigorosas y capaces de continuar su crecimiento en condiciones ambientales de invernadero (GUTIERREZ y SALGADO 2007)
2423 Establecimiento in vitro y regeneracioacuten de plantas de Laelia autumnalis (Llave y Lex) Lindl Para este estudio se obtuvieron las semillas de una caacutepsula desarrollada despueacutes de 6 meses de la floracioacuten las cuales se sembraron in vitro sin presentar contaminacioacuten ya que la siembra por este meacutetodo es muy eficiente en comparacioacuten al cultivo de semillas libres donde algunas veces se presenta la contaminacioacuten Las observaciones se realizaron cada 15 diacuteas la germinacioacuten se detectoacute en los primeros 15 diacuteas en la mayoriacutea de los medios de cultivos probados con la presencia de protocormos de 1mm de diaacutemetro (HUAPEO y SALGADO 2004) El porcentaje de germinacioacuten que se obtuvo de las semillas cultivadas in vitro de L autumnalis fue de 95 a 100 en todos los medios de cultivo la uacutenica diferencia fue el tiempo entre las germinaciones A excepcioacuten de las semillas cultivadas en el medio MS 100 la germinacioacuten del 100 se obtuvo hasta los 30 diacuteas de cultivo mientras que en el primero la germinacioacuten fue a los 15 diacuteas del cultivo Las plaacutentulas con raiacutez y un par de hojas se lograron a los 90 diacuteas de cultivo en el medio MS 100 alcanzando 07 mm de altura Estas plaacutentulas fueron subcultivadas en medio MS con 05 mgl de ANA y 01 mgl de GA3 para tener plaacutentulas fuente de explante (segmentos de hojas) un medio oacuteptimo de desarrollo de plaacutentulas de L speciosa No fue necesario probar otros medios de cultivos ya que se hicieron pruebas anteriores que demostraron que era el adecuado
Las plaacutentulas de 6 meses de cultivo in vitro despueacutes de su germinacioacuten presentaron una altura promedio de 5 cm con raiacuteces con velamen y hasta dos pares de hojas Segmentos de hoja de eacutestas fueron cultivadas en el medio MS conteniendo ANA BA y GA3 en diferentes concentraciones y se realizaron observaciones cada 30 diacuteas para determinar medios inductores de callo protocormos y raiacuteces La mejor respuesta en formacioacuten de callo fue observada en los segmentos de hoja de plaacutentulas de L autumnalis cultivados en MS con 1 mgl de ANA BA y GA3 iniciando la induccioacuten de
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eacuteste desde los 30 diacuteas de cultivo solamente en un 70 de los explantes cultivados El 100 se logroacute a los 90 diacuteas de cultivo observando callo abundante alrededor de todo el tejido de color blanco con puntos pigmentados de color verde La regeneracioacuten de protocormos de esta orquiacutedea se establecioacute con la siembra de segmentos de hoja de plaacutentulas de 6 meses de edad de manera directa o a partir de callos En callos la produccioacuten fue oacuteptima en el medio MS con 01 mgl de ANABAGA3 ya que a los 60 diacuteas se obtuvieron 50 protocormos por segmento de callo Solamente se produjeron 10 protocormos por explante al cultivarse los segmentos de hoja en MS con 01 mgl de ANABAGA3 a los 120 diacuteas de cultivo (HUAPEO y SALGADO 2004) 25 Aclimatacioacuten Aclimatacioacuten significa que el hombre intercede y guiacutea el proceso de acondicionamiento de las plantas hasta que eacutestas sean aptas para crecer en el campo yo invernadero
Un alto nuacutemero de plantas micropropagadas no sobreviven al cambio desde el cultivo in vitro hacia el ambiente exterior ya sea en campo o invernadero Eacutestos dos uacuteltimos tienen menor humedad relativa niveles maacutes altos de luminosidad y un ambiente seacuteptico los cuales son maacutes estresantes para las plantas micropropagadas La mayoriacutea de las especies que crecen in vitro necesitan un proceso de aclimatacioacuten pudiendo obtener asiacute un nuacutemero suficiente de plantas vivas y vigorosas para trasplantar al suelo (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991)
La aclimatacioacuten no es uacutenicamente para micropropagacioacuten siendo usada ademaacutes en propagacioacuten convencional durante antildeos Despueacutes de cortar las hojas y de haber formado raiacuteces por lo general son aclimatadas antes de ser llevadas al campo o invernadero Ejemplos de dos teacutecnicas comunes son bajar gradualmente la humedad y mantener el nivel de luz con un 50 de sombra antes de trasladarlos al campo Las raiacuteces que han sido cortadas y mal limpiadas muchas veces son focos de infeccioacuten En estos casos las plantas muestran signos de marchitez hojas necrosadas y tambieacuten se puede llegar a la muerte de eacutestas El cultivo in vitro reduce la necesidad de fotosiacutentesis ya que las condiciones de la caacutemara de incubacioacuten proveen a la planta de sacarosa u otro azuacutecar Tambieacuten en estas condiciones se reduce el stress por patoacutegenos al ser un ambiente aseacuteptico Todo esto se traduce en que las plantas micropropagadas no son aptas para el campo yo invernadero (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 251 Stress hiacutedrico El stress hiacutedrico puede ser el resultado de una excesiva transpiracioacuten de las diferentes partes aeacutereas de las plantas especialmente de las hojas o por una inadecuada absorcioacuten de agua por parte de las raiacuteces La cutiacutecula y los estomas son la ruta primaria de peacuterdida de agua desde de las hojas provenientes de esta teacutecnica reproductiva 2511 Cutiacutecula La cutiacutecula es una membrana compuesta por una matriz de cutina que a su vez se encuentra cubierta en su superficie por ceras cuya funcioacuten primaria consiste en limitar la peacuterdida de agua por transpiracioacuten La permeabilidad del agua a traveacutes de la cutiacutecula se ve influenciada principalmente por la estructura y la cantidad de
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ceras cuticulares y epicuticulares no vieacutendose afectada la peacuterdida de agua por el grosor de eacutesta o la naturaleza quiacutemica de la matriz de la cutina La estructura cristalina de la parte encerada de las hojas es distinta en las plantas micropropagadas con respecto a las plantas que crecen en el campo La cera epicuticular de las hojas de plantas in vitro tienen una proporcioacuten maacutes alta de esteres y de componentes polares por el contrario tienen unas cadenas de hidrocarbonos mucho maacutes cortas Esto hace que las plantas in vitro pierdan maacutes agua que las cultivadas en campo o invernadero
Las plantas que han crecido en el campo son naturalmente de color verde pero el color de las plantas cultivadas in vitro es diferente y se puede ver a simple vista Las plantas que son pasadas a invernadero y que tengan un color verde se aclimatan de mejor forma al ambiente exterior (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 2512 Estomas La estructura estomaacutetica y su funcionamiento han sido implicados recurrentemente en el desbalance de agua exhibido por plantas micropropagadas al momento de ser removidas del cultivo in vitro Estudios con microscopiacutea de scanner electroacutenico han indicado que la estructura estomaacutetica presente en algunas especies de plantas cultivadas in vitro difieren marcadamente de las cultivadas en invernadero o en el suelo Debido a que las primeras presentan estomas de mayor tamantildeo y maacutes redondos a diferencia de las plantas cultivadas de manera normal que presentan estomas maacutes pequentildeos y eliacutepticos lo que resulta en una deshidratacioacuten maacutes raacutepida en el caso de las provenientes de cultivo in vitro (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 252 Humedad Debido a la anatomiacutea y la condicioacuten fisioloacutegica de las plantas desarrolladas in vitro donde se ha mantenido una alta humedad relativa es necesario regar al momento del traslado para obtener una alta sobrevivencia Muchos laboratorios aseguran que hay que evitar tener un sistema de aspersioacuten ya que se produce el ambiente necesario (muy huacutemedo) para la aparicioacuten de hongos algas o bacterias Otros meacutetodos incluyen el uso de humidificadores o poner las macetas en un lugar cerrado donde se retenga vapor para esto se pueden usar por ejemplo tapas de polietileno Este meacutetodo es relativamente econoacutemico pero se debe tener control del calor y monitorear la falta de agua (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 253 Luz Durante la etapa in vitro las plantas estaacuten expuestas a altos niveles de luminosidad lo que se traduce en hojas delgadas Antes del traslado se recomienda mantener las plantas con un 50 de sombra para asiacute poder aclimatarlas de mejor manera esto debido a que las plantas micropropagadas tienen un bajo control sobre la transpiracioacuten y un inadecuado mecanismo de fotosiacutentesis La sombra reduce la transpiracioacuten evitando excesivas peacuterdidas de agua asiacute como tambieacuten el exceso de luz destruye las moleacuteculas de clorofila Luego del periacuteodo bajo sombra se deben mover las macetas gradualmente hacia el nivel de luz al cual seraacute llevado para su crecimiento final (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 254 Temperatura La temperatura del aire y del medio o sustrato de crecimiento estaacute generalmente controlado durante el periacuteodo de aclimatacioacuten El calor es necesario en los meses de invierno y el friacuteo (enfriar) es esencial en los meses de verano Ajustando la cantidad de sombra y humedad se obtiene un control sobre la temperatura El
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enfriamiento se puede obtener gracias a ventilacioacuten abanicos niebla o aire acondicionado El calor puede provenir del sistema existente en el edificio o invernadero donde esteacuten ubicadas las macetas o por las laacutemparas ocupadas para el control del fotoperiacuteodo El rango de temperatura que se mantiene por lo general es entre los 13 y 30ordmC y esta determinado principalmente por la especie en cuestioacuten La temperatura de la zona donde se encuentran las raiacuteces es muy importante para el crecimiento lo ideal es que dicho sector tenga una mayor temperatura que el aire fomentando el crecimiento de las raiacuteces e incrementando la humedad alrededor de la planta Durante el verano esto es difiacutecil de obtener ya que la temperatura del aire es muy alta debido a la alta radiacioacuten solar Terminado el proceso de aclimatacioacuten esto ya no es necesario (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 255 Fotosiacutentesis Las plantas sufren un cambio radical cuando son removidas desde cultivo in vitro ya que son forzadas a cambiar de heterotroacuteficas a autotroacuteficas y la fotosiacutentesis se vuelve fundamental para la sobrevivencia Las hojas de las plantas in vitro no estaacuten formadas para hacer fotosiacutentesis ya que en la caacutemara de incubacioacuten no se produce un fuerte intercambio gaseoso esto debido a que la sacarosa es entregada a traveacutes del medio de cultivo Las hojas de las plantas que son trasladadas al campo o invernadero sufren deterioro debido a que no estaacuten formadas para la fijacioacuten de carbono Esto se produce por un tiempo aproximado de cuatro semanas despueacutes de las cuales las hojas nuevas suplen a las viejas Otro punto es que las hojas de las plantas cultivadas in vitro contienen menor proporcioacuten de clorofila que las plantas que han crecido normalmente en el campo En un estudio de coliflor cultivado in vitro se midioacute el CO2 y se obtuvo un balance negativo el cual se mantuvo durante dos semanas despueacutes del transplante Algo similar ocurrioacute con frutilla despueacutes del transplante las hojas se deterioraron raacutepidamente lo que quiere decir que no hubo incremento en la fijacioacuten de carbono indicando falta de desarrollo en la competencia fotosinteacutetica
El bajo nivel de CO2 durante el cultivo in vitro limita el proceso de fotosiacutentesis lo cual se puede compensar usando sacarosa en el medio de cultivo Tambieacuten se puede incrementar el nivel de luz y CO2 obteniendo un fuerte aumento en el crecimiento de varias especies como orquiacutedeas clavel etc (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 256 Sustrato Un sustrato es todo material soacutelido distinto del suelo natural mineral u orgaacutenico que colocado en un contenedor en forma pura o en mezcla permite el anclaje del sistema radicular de la planta desempentildeando por lo tanto un papel de soporte para la planta El sustrato puede intervenir o no en el complejo proceso de la nutricioacuten mineral de la planta (INFOAGRO 2007) El sustrato y los contenedores dentro de los cuales se van a transplantar las plaacutentulas in vitro son importantes para una buena sobrevivencia
Los sustratos ejercen una influencia significativa en la arquitectura del sistema radical de las plantas y en las asociaciones bioloacutegicas de este con el suelo influenciando el
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estado nutricional y la translocacioacuten de agua en el sistema suelo-planta-atmoacutesfera Uno de los requisitos fundamentales que debe cumplir el sustrato para su utilizacioacuten es la sanidad Cuando estos no se elaboran almacenan o manejan correctamente pueden contaminarse y provocar serios dantildeos a las plantas durante la aclimatacioacuten por esta razoacuten son preferidos como componentes para su elaboracioacuten materiales inertes o aquellos en las cuales el proceso de obtencioacuten garantice la mayor desinfeccioacuten posible
Uno de los factores de mayor importancia a la hora de seleccionar los materiales que pueden constituir el sustrato es su disponibilidad tanto en teacuterminos de facilidad de obtencioacuten o suministro como de su costo (VILCHEZ et al 2007)
La presencia de inhibidores o tambieacuten cambios en el pH del sustrato pueden afectar el crecimiento de las raiacuteces y consecuentemente el eacutexito del transplante
Muchos laboratorios y viveros transplantan a un sustrato uniforme debiendo ser eacuteste adecuado en cuanto a soporte de las plantas pH porosidad aireacioacuten y drenaje (DEBERGH y ZIMMERMAN 1991)
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3 MATERIAL Y MEacuteTODO
Para la realizacioacuten de este trabajo se utilizoacute el siguiente material y meacutetodo
31 Material La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio e invernadero de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal pertenecientes a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de Chile
311 Material vegetal Se utilizaron plaacutentulas de C virescens cultivadas in vitro a partir de semillas las cuales fueron proporcionadas por el laboratorio estas plaacutentulas fueron separadas y repicadas para aumentar la poblacioacuten y obtener la cantidad necesaria para el ensayo
FIGURA 2 Plaacutentulas de C virescens en caacutemara de crecimiento in vitro
312 Materiales Los materiales que se utilizaron fueron los siguientes Equipos autoclave caacutemara de flujo laminar dispensador de medios medidor
de pH agitador magneacutetico horno microondas balanza mechero termoacutemetro Materiales vasos de precipitado matraces probetas pipetas papel de
aluminio frascos de vidrio placas Petri pinzas bisturiacute macetas regadera Soluciones soluciones madre (Medio MS) gelificante etanol 70 y 95
32 Meacutetodo A continuacioacuten se da a conocer la metodologiacutea con la cual se trabajoacute 321 Preparacioacuten del medio de cultivo Para la obtencioacuten de plantas a traveacutes de la micropropagacioacuten se ocupoacute el medio basal de MURASHIGE y SKOOG (1962) tambieacuten llamado medio MS Este medio tiene un pH de entre 56-57 Posteriormente se dosificoacute con el dispensador de medios para que cada frasco tenga una cantidad adecuada (25 mL) y se llevoacute a autoclave para esterilizar a 12 atm 120ordm C por 20 min
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322 Obtencioacuten del material vegetal Al tener el medio esterilizado se procedioacute a la separacioacuten y repicado de plaacutentulas existentes en el laboratorio Las siembras se realizaron en el mes de mayo del 2007 Estas siembras se realizaron en la caacutemara de flujo laminar de modo de asegurar que la siembra sea 100 aseacuteptica Estas plaacutentulas fueron mantenidas en la caacutemara de incubacioacuten hasta obtener los tamantildeos requeridos para el ensayo donde las condiciones fueron las siguientes
minus Temperatura ambiental de 23-25ordm C minus Fotoperiacuteodo de 16 horas minus Intensidad lumiacutenica controlada de 50-55 micromol m-2s-1
323 Sustratos Se utilizaron tres tipos de sustratos el primero corresponde a una mezcla de turba + perlita (11) el segundo corresponde a Sphagnum (100) y el tercero corresponde a una mezcla de turba + arena (11) Una vez realizadas las mezclas se procedioacute a una esterilizacioacuten en un autoclave a 121ordm C por 20 minutos a 12 atmoacutesfera De esta forma se trabajoacute con material limpio y sano evitando ataque de hongos o bacterias El anaacutelisis quiacutemico de los sustratos se muestra en el Anexo 2 324 Plantacioacuten Las plaacutentulas con un promedio de cuatro meses en condiciones de caacutemara de crecimiento in vitro obtuvieron el tamantildeo adecuado para ser utilizadas Se sacaron de los frascos y se plantaron en las macetas de plaacutestico transparente con los sustratos Posteriormente fueron dejadas en la sala del laboratorio donde se debioacute asperjar con solucioacuten nutritiva Hoagland y fungicida Captan CUADRO 1 Composicioacuten de solucioacuten nutritiva Hoagland
KNO3 102 gL Ca(NO3) 4 H2 O 0492 gL
NH4H2 (PO4) 023 gL MgSO4 7 H2O 049 gL
H3BO3 286 mgL MnCl2 2 H2O 181 mgL CuSO4 5 H2O 008 mgL ZnSO4 5 H2O 022 mgL Na2MoO4 H2O 009 mgL
FeSO4 7 H2O 05 06 mL FUENTE FINCK 1988 325 Disentildeo de los ensayos Este trabajo de investigacioacuten constoacute de un ensayo con dos etapas Antes que todo se realizoacute la separacioacuten y repicado in vitro de plaacutentulas de C virescens para la obtencioacuten del nuacutemero necesario de plantas En la etapa 1 se utilizaron tres tamantildeos de plaacutentulas obtenidas in vitro de 1-2cm de 2-3cm y de maacutes de 3cm de altura que se transplantaron a tres sustratos turba + perlita 11(vv) Sphagnum (100) y turba + arena 11 (vv) La turba provino de la Sociedad
22
Minera Patagonia Peat SA en Hijuelas el Sphagnum de la empresa Lonquen Chile de Puerto Montt y la perlita se obtuvo a traveacutes del sitio web wwwjardisencl (representante legal Walter Rathgeb Penza Ingeniero Agroacutenomo Santiago) Las plaacutentulas se plantaron de acuerdo a su tamantildeo las de maacutes de 3cm se colocaron de 6 por maceta las de 2 a 3cm de a 8 por maceta y las maacutes chicas de a 10 por maceta Estas macetas fueron dejadas en una sala de aclimatacioacuten con una temperatura promedio de 20ordm C intensidad lumiacutenica de 50-55 micromol m-2s-1 y 14-16 hrs de fotoperiacuteodo Se fertilizoacute asperjando cada cinco diacuteas con solucioacuten nutritiva Hoagland Esta etapa se llevoacute a cabo durante dos meses desde el cinco de septiembre hasta el cinco de noviembre de 2007
En la etapa 2 se continuoacute el proceso de aclimatacioacuten en invernadero de las plaacutentulas obtenidas en la etapa 1 que despueacutes de dos meses teniacutean un mayor tamantildeo y se habiacutean acondicionado al ambiente exterior (fuera de la caacutemara de crecimiento) Las plantas se mantuvieron en las macetas durante tres semanas para aclimatarlas y luego las plantas sobrevivientes fueron transplantadas a macetas maacutes grandes individuales durante tres meses aproximadamente hasta el cinco de marzo 2008 Estas nuevas macetas tuvieron como sustrato turba y suelo (trumao) en igual proporcioacuten (Anexo 2) La temperatura promedio de invernadero fluctuoacute de 13 a 35 degC seguacuten el mes En enero el promedio fue de 25 (Anexo 3) Para bajar la temperatura alrededor de 5deg C se instaloacute una malla Rachel 326 Disentildeo experimental El disentildeo experimental utilizado fue completamente al azar ordenado como experimento factorial con dos factores tamantildeo (3) y sustrato (3) Cada tratamiento tuvo tres repeticiones con un miacutenimo de 6 plantas por recipiente 327 Variables a evaluar Durante los dos meses en que las macetas estuvieron en la sala de aclimatacioacuten se evaluoacute el desarrollo foliar contando el nuacutemero de hojas una vez al mes Posteriormente se trasladaron las mismas macetas a invernadero durante tres semanas para continuar con la aclimatacioacuten de las plaacutentulas Transcurrido este tiempo se transplantaron las plaacutentulas sobrevivientes a macetas individuales y continuoacute mensualmente la evaluacioacuten de eacutestas (nuacutemero de hojas) hasta la obtencioacuten de plantas establecidas Al momento del transplante y al final del ensayo se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces asiacute como tambieacuten al final del ensayo de evaluoacute el crecimiento en altura (cm) La sobrevivencia fue evaluada al final del ensayo por maceta
Tanto en la sala de aclimatacioacuten coacutemo en el invernadero se registroacute la temperatura con la ayuda de un termoacutemetro de maacutexima y miacutenima (Anexo 3) 328 Anaacutelisis estadiacutestico Una vez obtenidos los datos se procedioacute a comprobar si estos cumpliacutean con los supuestos de aleatoriedad normalidad y homogeneidad de varianzas que exige este tipo de anaacutelisis En el caso de no cumplirse estos supuestos los datos se transformaron utilizando log10(x+05) raiacutez(x+05) o 1x para normalizarlos
23
y enseguida se sometioacute los datos a un anaacutelisis estadiacutestico (ANDEVA) Posteriormente en los casos en que se observoacute diferencias significativas en el ANDEVA se aplicoacute una prueba de rangos muacuteltiples (Tukey) al 5 de significancia Para las variables no parameacutetricas que no cumplieron con los supuestos para un anaacutelisis de varianza se realizoacute la prueba de KruskalndashWallis y las comparaciones muacuteltiples a traveacutes del test de Dunn con un nivel de 5 de significancia
Se utilizaron los programas estadiacutesticos STATGRAPHICS 20 y GRAPHPAD PRISM 5 para el anaacutelisis de datos
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4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
En los siguientes puntos se discuten los resultados obtenidos en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens
En la Figura 3 se observan plaacutentulas de C virescens micropropagadas en medio MS en caacutemara de crecimiento al inicio del ensayo (A) y en invernadero despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten (B)
BA
FIGURA 3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten
A continuacioacuten se presentan los resultados obtenidos para las variables analizadas (Cuadro 2 y 3) de esta manera se pueden visualizar en general los resultados obtenidos en el proceso de aclimatacioacuten durante seis meses
CUADRO 2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de raiacuteces
inicial y final Variables
Hojas finales (nuacutemero)
Raiacuteces iniciales (nuacutemero)
Raiacuteces finales (nuacutemero)
Tamantildeo de plaacutentulas 36 24 37 47 29 46
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 61 43 76
Sustratos 53 36 56 43 29 51
Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 46 27 49
Significa que hay diferencias significativas al 95 Test de Dunn
25
Las variables no parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en hojas finales y raiacuteces iniciales en sus rangos de distribucioacuten Las raiacuteces finales no presentaron diferencias seguacuten el sustrato utilizado pero de acuerdo al tamantildeo hubo diferencias en su distribucioacuten
CUADRO 3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas
Variables Altura final de plaacutentulas
(cm) Sobrevivencia
Tamantildeo de plaacutentulas
36 c 567 b 47 b 821 a
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 59 a 908 a
Sustratos 52 a 933 a
41 ab 59 b Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 49 b 772 a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY Las variables parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en altura final de hojas y en sobrevivencia 41 Nuacutemero de hojas finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentulas y de sustratos para la variable nuacutemero final de hojas 411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula Seguacuten el Cuadro 2 y Figura 4 las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero final de hojas Las plaacutentulas pequentildeas de 1-2 cm obtuvieron el nuacutemero maacutes bajo de hojas finales con una media de 36 hojas por plaacutentula lo cual es la mitad de las hojas finales que se obtuvo con las plaacutentulas de mayor tamantildeo (61 hojas aproximado por plaacutentula) Para las plaacutentulas medianas de 2-3 cm se obtuvo una media de 47 hojas por plaacutentula (Figura 4)
26
Hojas finales
1-2 cm 2-3cm maacutes de 3 cm0
5
10
15
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn)
BLANCO (2006) sentildeala que plaacutentulas cultivadas in vitro crecen bajo condiciones especiales como alta humedad relativa y baja luminosidad ademaacutes son suplidas con sacarosa Estas condiciones fueron proporcionadas en una caacutemara de crecimiento en el laboratorio donde las plantas micropropagadas no son dependientes por completo de su fotosiacutentesis son heteroacutetrofas Parece ser necesario un estiacutemulo para convertirse en organismos totalmente capaces de sustentar sus propios requisitos de carbono y nitroacutegeno reducido pasando de esta manera a ser autoacutetrofos
Al ser sacadas de un medio in vitro las hojas no estaacuten preparadas para producir su propio alimento y sobreviven gracias a que el medio de cultivo le proporciona los nutrientes necesarios para vivir En este punto muchas de las hojas mueren y nacen hojas nuevas capaces de generar su alimento supliendo asiacute las hojas viejas (SEELYE et al 2003) En este ensayo las plaacutentulas de Chloraea virescens presentaron en general una buena adaptacioacuten al ser sacadas de un medio in vitro
Se observoacute que plaacutentulas con menor tamantildeo al ser aclimatadas y tener menor tejido fue maacutes difiacutecil y maacutes lento que empezaran a generar nuevos tejidos y materia orgaacutenica a partir de dioacutexido de carbono POSPIacuteŠILOVAacute et al (1999) sentildeala que al tener los estomas con desarrollo incompleto maacutes grandes y de forma maacutes redonda pierden maacutes agua lo cual puede provocar una peacuterdida de hojas muriendo asiacute la plaacutentula Por esta razoacuten las plaacutentulas pequentildeas se demoran maacutes tiempo en generar hojas nuevas es por ello que al finalizar este estudio muestran el menor nuacutemero final de hojas 412 Efecto del tipo de sustrato Al analizar la influencia del tipo de sustrato se encontraron diferencias significativas entre los tres sustratos utilizados Seguacuten el Cuadro 2 y la Figura 5 el sustrato donde se obtuvo mejores resultados fue
27
turba+perlita en el cual se observoacute un promedio de 53 hojas por plaacutentula siendo Sphagnum el maacutes bajo con 43 hojas por plaacutentula De acuerdo a los resultados del anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados el sustrato turba+perlita tiene mayor cantidad de nitroacutegeno foacutesforo calcio magnesio y azufre disponible comparativamente con los otros dos sustratos (Sphagnum y arena+turba) (Anexo 2)
Hojas finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
Sustratos
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) Para la brotacioacuten y el crecimiento de las plantas se necesita agua y Nitroacutegeno lo que favorece a una mayor tasa de aparicioacuten de hojas lo que se traduce en una mayor cantidad de hojas finales El Nitroacutegeno se encuentra en mayor cantidad en el sustrato turba+perlita debido a lo cual los mejores resultados se obtienen en dicho sustrato 413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Despueacutes de analizados los efectos individuales del tamantildeo y del sustrato al interactuar ambos factores existen diferencias significativas La mejor interaccioacuten se obtuvo con el sustrato turba+perlita y con el mayor tamantildeo de la plaacutentula (Figura 6) Debido a la buena estructura (porosa) de dicho sustrato se podriacutea decir que se favorecioacute la absorcioacuten radicular de nutrientes obteniendo por ello un mayor nuacutemero de hojas finales Para los menores tamantildeos no se observan diferencias significativas obteniendo como promedio 41 hojas por plaacutentula Para el mayor tamantildeo el promedio fue de 6 hojas por plaacutentula
28
Hojas finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 42 Raiacuteces iniciales Este paraacutemetro se evaluoacute luego de la primera etapa de aclimatacioacuten la cual se realizoacute en una sala de aclimatacioacuten del laboratorio Se analizoacute la influencia de diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos sobre la variable nuacutemero raiacuteces iniciales (Anaacutelisis de Kruskal-Wallis en Anexo 7)
FIGURA 7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses de pre aclimatacioacuten
29
En la Figura 7 se puede observar los resultados de pre aclimatacioacuten en sala de laboratorio En esta etapa ya es posible ver la presencia de raiacuteces desarrolladas 421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula En el Cuadro 2 se puede observar que las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero inicial de raiacuteces y en la Figura 8 se puede comprobar que para los dos tamantildeos de plaacutentula maacutes pequentildeos no se observa gran cantidad de raiacuteces esto no impidioacute el desarrollo posterior de las plaacutentulas las cuales lograron enraizar al final del estudio Esto se contrapone a lo observado en un estudio de Lapageria rosea donde la presencia de raiacutez y brote para lograr una multiplicacioacuten exitosa de plantas es de vital importancia Incluso algunas plaacutentulas de L rosea no brotan en condiciones in vitro en donde tienen las mejores condiciones nutricionales y hormonales para hacerlo Esto se debe a factores internos de la plaacutentula siendo muy difiacutecil que broten inmediatamente en caacutemara de aclimatacioacuten donde ya dejan de recibir los nutrientes necesarios de manera directa y requieren de balances de energiacutea para poder seguir elongando raiacuteces absorber nutrientes y brotar para poder obtener los carbohidratos necesarios para seguir su crecimiento (BLANCO 2006) El tamantildeo de plaacutentula tiene importancia para el desarrollo de raiacuteces se distingue notoriamente que en los tamantildeos maacutes grandes el nuacutemero de raiacuteces es mayor comparativamente con los tamantildeos pequentildeos donde el nuacutemero de raiacuteces fue escaso Debido a la presencia de maacutes hojas existe una mayor cantidad de aacuterea fotosinteacutetica esta situacioacuten estimula el crecimiento de las raiacuteces para la obtencioacuten de agua y nutrientes
Raices iniciales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
2
4
6
8
10
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o inicial de ra
iacuteces
FIGURA 8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn)
30
422 Efecto del tipo de sustrato Para el sustrato turba+perlita se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas en el nuacutemero de raiacuteces con respecto a los dos otros sustratos esto se puede ver en el Figura 9 donde se observa que se obtuvieron los mayores resultados En cualquier medio de crecimiento el espacio no ocupado por un soacutelido se llama porosidad este espacio puede ser ocupado en parte para retener agua y en parte para proporcionarle aire a las raiacuteces La ausencia de uno de estos elementos es perjudicial para las plantas La turba es conocida por tener estas propiedades y la perlita tambieacuten por esta razoacuten se sabe que la mezcla turba-perlita provee propiedades fiacutesicas excelentes como medio de crecimiento y propagacioacuten (INFOAGRO 2007) Estos resultados con turba-perlita (298 de materia orgaacutenica) coinciden con los obtenidos por DIAZ et al (2004) quienes al utilizar un sustrato compuesto por 100 de humus de lombriz para aclimatar cantildea de azuacutecar obtuvieron el mayor nuacutemero de raiacuteces Esto puede atribuirse al importante aporte de materia orgaacutenica del humus (47) lo que le confiere una mejor estructura obtenieacutendose una excelente porosidad del sustrato La aireacioacuten del suelo es necesaria para favorecer la maacutexima absorcioacuten de nutrientes por las raiacuteces Esto tambieacuten sucede en el sustrato turba+perlita el cual posee la mayor cantidad de materia orgaacutenica de los tres sustratos utilizados
Raices iniciales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
2
4
6
8
10
Sustratos
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato En los anaacutelisis para la variable nuacutemero de raiacuteces se puede decir que la mejor interaccioacuten se presentoacute para el sustrato de turba+perlita junto con el mayor tamantildeo de plaacutentulas obteniendo los valores maacutes altos entre los nueve tratamientos La presencia de raiacuteces luego de la micropropagacioacuten aumenta la posibilidad de eacutexito en el transplante ya que se crea un favorable balance de agua Pero esto no quiere
31
decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
10
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
32
En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
33
El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
34
Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
PROFESOR PATROCINANTE
____________________________________
Peter Seemann Fahrenkrog Ing Agr Dr rer hort Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal PROFESORES INFORMANTES ____________________________________ Magaly Rivero Gutieacuterrez Prof Biol Y Quim Dr Cs ____________________________________ Nancy Andrade Soto Ing Agr M Sc Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal
A mis papaacutes por su carintildeo y apoyo incondicional
A mis hermanos por estar conmigo
A Claudia y Camila por su paciencia preocupacioacuten y ayuda y
a todos los que compartieron conmigo esta experiencia
I
INDICE DE MATERIAS
Capiacutetulo Paacutegina
RESUMEN 1
REacuteSUMEacute 2
1 INTRODUCCION 3
2 REVISION BIBLIOGRAFICA 4
21 Descripcioacuten general 4
211 Descripcioacuten geograacutefica 4
212 Formas de vida 4
213 Descripcioacuten morfoloacutegica 4
214 Geacuteneros y especies chilenas 5
2141 Chloraea virescens 6
22 Requerimientos de las orquiacutedeas 7
221 Agua 7
222 Luz 8
223 Fertilizacioacuten 8
224 Temperatura 8
23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas 9
231 Biologiacutea de las semillas 9
232 Germinacioacuten simbioacutetica y no simbioacutetica de semillas 9
233 Condiciones de esterilidad 9
2331 Siembra de las semillas 10
234 Transplante 10
24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas 11
241 Orquiacutedeas terrestres 11
2411 Cypripedium 11
2412 Preservacioacuten in vitro de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes 12
2413 Longevidad de semillas de orquiacutedeas terrestres 12
2414 Sobrevivencia de orquiacutedeas terrestres transplantadas a sectores
urbanos 13
II
2415 Micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres 13
242 Orquiacutedeas epiacutefitas 14
2421 Preservacioacuten de Cattleya walkeriana usando propagacioacuten in vitro 14
2422 Establecimiento de cultivos in vitro y micropropagacioacuten de Cattleya
aurantiaca (Bateman ex Lindl) 14
2423 Establecimiento in vitro y regeneracioacuten de plantas de Laelia autumnales
(Llave y Lex) Lindl 15
25 Aclimatacioacuten 16
251 Stress de agua 16
2511 Cutiacutecula 16
2512 Estomas 17
252 Humedad 17
253 Luz 17
254 Temperatura 17
255 Fotosiacutentesis 18
256 Sustrato 18
3 MATERIAL Y METODO 20
31 Material 20
311 Material vegetal 20
312 Material de laboratorio 20
32 Meacutetodo 20
321 Preparacioacuten del medio de cultivo 20
322 Obtencioacuten del material vegetal 20
323 Sustratos 21
324 Plantacioacuten 21
325 Disentildeo de los ensayos 21
326 Disentildeo experimental 22
327 Paraacutemetros a evaluar 22
328 Anaacutelisis estadiacutestico 22
III
4 PRESENTACIOacuteN Y DISCUSION DE RESULTADOS 24
41 Nuacutemero de hojas finales 25
411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula 25
412 Efecto del tipo de sustrato 26
413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato 27
42 Raiacuteces iniciales 28
421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula 29
422 Efecto del tipo de sustrato 30
423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato 30
43 Raiacuteces finales 31
431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula 32
432 Efecto del tipo de sustrato 32
433 Interaccioacuten tamantildeo de plaacutentula y sustrato 33
44 Altura 35
45 Sobrevivencia 36
5 CONCLUSIONES 38
6 BIBLIOGRAFIA 39
7 ANEXOS 42
IV
INDICE DE CUADROS
Cuadro Paacutegina
1 Composicioacuten de solucioacuten nutritiva Hoagland 21
2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de
raiacuteces inicial y final 24
3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas 25
V
INDICE DE FIGURAS
Figura Paacutegina
1 C virescens 7
2 Plaacutentulas de C virescens en caacutemara de crecimiento in vitro 20
3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS
B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten 24
4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) 26
5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final
de hojas (Test de Dunn) 27
6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 28
7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses
de pre aclimatacioacuten 28
8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 29
9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final
de raiacuteces (Test de Dunn) 30
10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no
parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 31
11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses
de aclimatacioacuten 31
12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 32
13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final
de raiacuteces (Test de Dunn) 33
14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre para la variable no
parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 34
15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) 35
VI
16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable
parameacutetrica altura final de plaacutentulas 35
17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) 37
18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la
variable parameacutetrica de sobrevivencia 37
VII
INDICE DE ANEXOS
Anexo Paacutegina
1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962)
y suplementos orgaacutenicos 44
2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio 45
3 Registro de temperaturas miacutenimas maacutexima y promedio durante
el estudio 46
4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas
finales 47
5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales 47
6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces
iniciales 48
7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces
iniciales 48
8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces
finales 49
9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales 49
10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en
aclimatacioacuten 50
11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura 50
12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de
plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten 51
13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia 51
14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea 52
1
RESUMEN Dentro del esquema de micropropagacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens la aclimatacioacuten es la etapa final donde la manipulacioacuten debe ser muy cuidadosa ya que es donde se produce el mayor iacutendice de mortandad principalmente en el proceso de trasplante Esta etapa es muy importante ya que gracias a ella se veraacute la eficiencia del proceso y la calidad final de las plantas producidas in vitro por eso el objetivo general de este trabajo es evaluar la influencia del tamantildeo de plaacutentulas y utilizacioacuten de distintos sustratos en la aclimatacioacuten ex vitro de plaacutentulas de C virescens Se utilizaron plaacutentulas de Chloraea virescens obtenidas a partir de la micropropagacioacuten de protocormos provenientes de germinacioacuten asimbioacuteticas de semillas efectuada en el laboratorio de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal de la Universidad Austral de Chile Las plaacutentulas fueron repicadas hasta obtener el nuacutemero adecuado para el ensayo Luego fueron trasladadas a una sala del laboratorio en macetas de seis ocho y diez plaacutentulas dependiendo del tamantildeo de la plaacutentula (maacutes de 3cm 2-3cm y 1-2cm respectivamente) por dos meses posteriormente fueron transferidas a 3 sustratos turba+perlita (11) Sphagnum y turba+arena (11) y fueron llevadas a invernadero durante cuatro meses Las variables evaluadas fueron nuacutemero final de hojas nuacutemero inicial y final de raiacuteces altura y sobrevivencia de las plaacutentulas Los resultados obtenidos demostraron que los tamantildeos y los sustratos ocupados influyen en el crecimiento de las plaacutentulas El mejor tamantildeo para la aclimatacioacuten es de maacutes de 3cm obteniendo con eacuteste los mejores resultados en todas las variables evaluadas Lo mismo ocurrioacute con el sustrato turba+perlita el cual fue el mejor evaluado
2
REacuteSUMEacute Dans le scheacutema de la micropropagation de Chloraea virescens lacclimatation est la derniegravere eacutetape ougrave il faut ecirctre prudent parce que cest agrave ce moment lagrave que les taux de mortaliteacute sont les plus eacuteleveacutes principalement dans le processus de transplantation Cette eacutetape est tregraves importante parce que ce sera gracircce agrave elle quacuteon verra lefficaciteacute du processus et la qualiteacute finale des plantes produites in vitro Lobjectif geacuteneacuteral de cette eacutetude est dacuteeacutevaluer linfluence de la taille des plantes et lutilisation de divers substrats pour lacuteacclimatation de C virescens On a utiliseacute des plantes de C virescens obtenue a partir de la micropropagation de protocormos en provenance du laboratoire de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal de la Universidad Austral de Chile Les plantes ont eacuteteacute subdiviseacutee pour obtenir le nombre approprieacute Elles ont ensuite eacuteteacute transfeacutereacutees agrave des pots dans une piegravece du laboratoire de six huit et dix en fonction de la taille de la plante (plus de 3 cm de 2-3 cm et 1-2 cm respectivement) pour deux mois ensuite elles ont eacuteteacute transfeacutereacutee dans trois substrats tourbe + perlite (11) Sphagnum et tourbe + sable (11) et elles ont eacuteteacute mises dans une serre pour quatre mois Les variables agrave eacutevaluer sont nombre final de feuilles nombre de racines au deacutebut et agrave la fin la hauteur et la survie des plantes Les reacutesultats ont montreacute que la taille et les substrats utiliseacutes ont une influence sur la croissance des jeunes plantes La taille ideacuteale pour lacclimatation est plus de 3cm avec cette derniegravere on a obtenu les meilleurs reacutesultats dans toutes les variables qui ont eacuteteacute eacutevalueacutees Le mecircme reacutesultat sest produit avec le substrat de tourbe + perlite lequel a aussi montreacute les meilleurs reacutesultats
3
1 INTRODUCCION La familia Orchidaceae (Orquiacutedeas) es la que mayor nuacutemero de especies comprende en el Reino Vegetal Se estima que debe haber alrededor de 35000 especies de Orquiacutedeas en todo el mundo pertenecientes a unos 750 geacuteneros ademaacutes de miles de hiacutebridos En Chile esta familia es probablemente el grupo menos estudiado de plantas con flores y soacutelo se han realizado estudios en base a su taxonomiacutea biologiacutea reproductiva fenologiacutea y distribucioacuten
La produccioacuten de flores de orquiacutedeas ha tomado importancia por la belleza de sus flores dada la enorme variedad de formas colores y perfumes Existen orquiacutedeas terrestres y epiacutefitas estas uacuteltimas representan maacutes del 90 del total de especies y son las que mayoritariamente se encuentran a la venta Las flores tienen un alto valor ornamental o como flor cortada ya que eacutestas pueden permanecer separadas de las plantas sin marchitarse hasta tres o cuatro semanas y en la planta permanecen hasta tres meses
La obtencioacuten de plantas de orquiacutedeas a partir de semillas es muy difiacutecil ya que eacutestas son diminutas y de germinacioacuten irregular Como una alternativa de obtencioacuten de plantas aparece la micropropagacioacuten pudiendo asiacute aumentar el nuacutemero de plantas en forma relativamente faacutecil y raacutepida Luego de la etapa de micropropagacioacuten viene la etapa de aclimatacioacuten en la cual la manipulacioacuten debe ser en extremo cuidadosa ya que es donde se produce el mayor iacutendice de mortandad principalmente en el proceso de transplante Esta etapa es muy importante ya que gracias a ella se veraacute la eficiencia del proceso y la calidad final de las plantas producidas in vitro Considerando la produccioacuten de plaacutentulas mediante la micropropagacioacuten en este trabajo se plantea la hipoacutetesis que ldquoel tamantildeo de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro y los distintos sustratos son factores que inciden en el desarrollo y su aclimatacioacutenrdquo El objetivo general de este trabajo es
Evaluar la influencia del tamantildeo de plaacutentulas y utilizacioacuten de distintos sustratos en la aclimatacioacuten ex vitro de plaacutentulas de C virescens
Los objetivos especiacuteficos son
Medir el efecto del tamantildeo de plaacutentulas de C virescens en la sobrevivencia y desarrollo de eacutestas ex vitro
Comparar el uso de tres sustratos en el desarrollo y sobrevivencia de plaacutentulas de C virescens
4
2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA 21 Descripcioacuten general 211 Descripcioacuten geograacutefica Las orquiacutedeas pertenecen a la familia Orchidaceae clase Liliopsida (monocotiledoacuteneas) Son plantas herbaacuteceas perennes originarias de regiones tropicales y subtropicales pero existen tambieacuten en todos los continentes a excepcioacuten de las regiones polares La zona donde se encuentran estas plantas estaacute comprendida entre los 68ordm latitud norte y 56ordm latitud sur Es evidente que en los liacutemites extremos de estas latitudes se encuentran pocos geacuteneros y especies esto va en aumento desde las regiones temperadas hasta las regiones intertropicales donde el nuacutemero es el mayor Los territorios maacutes interesantes por su nuacutemero son
Ameacuterica del Sur y Ameacuterica Central Asia e India Madagascar Australia es el continente menos poblado en orquiacutedeas dentro de las regiones
del globo Por su parte Europa presenta numerosos geacuteneros y especies de orquiacutedeas
terrestres Soacutelo en Francia existen 75 especies repartidas en 16 geacuteneros todas terrestres (LECOUFLE y ROSE 1956)
212 Formas de vida Las zonas donde crecen estas plantas influyen sobre su manera de vivir Algunas orquiacutedeas son terrestres y se encuentran representadas en todas las regiones Tambieacuten existen las epiacutefitas (vegetal que fijado a otro no obtiene de eacuteste su alimento) En este caso se necesita que el grado higromeacutetrico y la temperatura permitan este tipo de adaptacioacuten Ademaacutes existen las orquiacutedeas litofiacuteticas que viven sobre rocas Las raiacuteces de las epiacutefitas y litofiacuteticas estaacuten adaptadas a vivir expuestas al aire o inmersas en materia orgaacutenica ya que tienen un tejido acumulador de agua llamado velo En zonas friacuteas y templado friacuteas todas las orquiacutedeas son terrestres En zonas subtropicales o tropicales la gran mayoriacutea es epiacutefita Otra particularidad debida seguramente a la influencia de estas zonas es la floracioacuten Es en las zonas tropicales y subtropicales que se dan los mayores tamantildeos de flores asiacute como tambieacuten la mayor variedad de colores (LECOUFLE y ROSE 1956)
213 Descripcioacuten morfoloacutegica Las orquiacutedeas se caracterizan por poseer flores muy vistosas hermafroditas (ambos sexos en la misma flor) zigomorfas (con un solo plano de simetriacutea) triacutemeras (tres seacutepalos y tres peacutetalos) y una columna central que sustenta las estructuras reproductivas masculinas anteras y femeninas pistilo llamada ginostemo El peacutetalo inferior se llama labelo y su morfologiacutea define a los distintos geacuteneros de orquiacutedeas Las flores pueden ser aisladas o en inflorescencia y son polinizadas por insectos El polen se encuentra aglomerado formando una masa llamada polinio el que tiene un extremo con un ensanchamiento glandular pegajoso que sirve para que el
5
polinio se adhiera al cuerpo del insecto polinizador El fruto es una caacutepsula seca con muchas semillas pequentildeas sin endosperma y con embrioacuten no diferenciado Tienen dos tipos baacutesicos de crecimiento Simpodial en las que el nuevo crecimiento se produce en sentido horizontal a partir de un tallo subterraacuteneo o rizoma generando una sub-unidad capaz de producir una flor o inflorescencia y de ser eventualmente separada de la planta (ej Cattleya) Monopodial en las que el nuevo crecimiento se produce en sentido vertical con lo cual la planta crece constantemente en altura (ej Phalaenopsis) (ORQUIDEAS 2007) 214 Geacuteneros y especies chilenas Seguacuten NOVOA et al (2006) en la familia Orchidaceae se encuentran 49 especies de flora nativa dentro de las cuales se encuentra Chloraea virescens (Willd) Lindl Los geacuteneros de Orchidaceae en Chile son 7
- Aa Bipinnula Brachystele Codonorchis Chloraea Gavilea y Habenaria
Dentro del geacutenero Chloraea existen 31 especies - Chloraea alpina Poepp - Chloraea barbata Lindl - Chloraea bidendata (Poepp y Endl) Correa - Chloraea bletioides Lindl - Chloraea cuneata Lindl - Chloraea chica Speg - Chloraea chrysantha Poepp - Chloraea crispa Lindl - Chloraea cristata Lindl - Chloraea cylindrostachya Poepp - Chloraea disoides Lindl - Chloraea galeata Lindl - Chloraea gaudichaudii Brongn - Chloraea gavilu Lindl - Chloraea grandiflora Lindl - Chloraea heteroglossa Rchbf - Chloraea incisa Poepp - Chloraea lamellata Lindl - Chloraea lechleri Lindl - Chloraea leptopetala Reiche - Chloraea longipetala Lindl - Chloraea magellanica Hookf - Chloraea multiflora Lindl - Chloraea nudilabia Lindl - Chloraea philippii Reichbf - Chloraea picta Phil - Chloraea prodigiosa Reichbf - Chloraea speciosa Poepp - Chloraea virescens Lindl - Chloraea viridiflora Poepp
6
- Chloraea volkmanni Phil (NOVOA et al 2006) 2141 Chloraea virescens Planta perenne de 40-90 cm de altura Sus hojas son de 5-12cm de largo por 15-25cm de ancho estrechas lanceoladas agudas dispuestas en roseta basal generalmente marchitas al final de la antesis Su escapo floral tiene vainas caulinares lanceoladas agudas y distantes La inflorescencia es de 8-20cm de largo densa con 10-15 flores erguidas Sus flores son blancas con estriacuteas y aacutepices verdes El seacutepalo dorsal es de 16-33mm de largo por 4-6mm de ancho oblongo lanceolado obtuso algo coacutencavo a veces ligeramente estrechado al centro aacutepice algo carnoso Los seacutepalos laterales de 18-33mm de largo por 4-5mm de ancho son ensiformes con aacutepice obtuso engrosado verde negruzco a veces espatulado y dentado a veces verrugoso Los peacutetalos son de 15-23mm de largo por 5-58mm de ancho estrechamente aovados obtusos verrugosos con maacutes frecuencia solo la mitad inferior a veces el borde denticulado y carnoso El labelo de 15-26mm de largo por 10-20mm de ancho es mas o menos romboidal a levemente trilobulado El loacutebulo central tiene 5-7 nervios longitudinales recorridos por laminillas interrumpidas membranaacuteceas con segmentos falciformes de borde carnoso de color verde Los nervios laterales que se ramifican oblicuamente hacia el aacutepice en los loacutebulos laterales tienen pequentildeas laminillas y verrugas y su borde es laciniado inciso en la mitad apical hacia la base denticulado aacutepice generalmente engrosado La columna es de 12-18mm de largo delgada blanca con estriacuteas anaranjada La base de la zona nectariacutefera tiene un color amarillo-limoacuten con maacuteculas anaranjadas orificio nectario verde El ala de la columna es recta y estrecha El estigma es triangular y globoso La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la Vordf (Vintildea del Mar) hasta la XIordf Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile Sin embargo es posible que tenga una distribucioacuten maacutes restringida por que se le ha confundido con Chloraea incisa Su floracioacuten es desde noviembre a febrero y su estado de conservacioacuten no estaacute evaluado (NOVOA et al 2006) En el Anexo 14 se incluyen antecedentes sobre su distribucioacuten y eacutepoca de floracioacuten
7
FIGURA 1 Chloraea virescens FUENTE NOVOA et al (2006) 22 Requerimientos de las orquiacutedeas Para tener eacutexito en el cultivo de orquiacutedeas hay que tomar en cuenta factores de importancia como son 221 Agua El riego correcto es el principio y el fin del cuidado de orquiacutedeas (ROLLKE 2005) Este elemento es primordial para las orquiacutedeas asiacute como tambieacuten para todo tipo de plantas En el caso de eacutestas se dice muchas veces que la calidad del agua usada es el factor maacutes importante en el cultivo de orquiacutedeas ya que el porcentaje maacutes alto de muerte se produce por el exceso de este factor (SHEEHAN 1980) Hay que tomar en cuenta que la mayoriacutea de las orquiacutedeas son epiacutefitas lo que significa que tienen sus raiacuteces a la vista gracias a las cuales absorben el agua de lluvia Se recomienda un sustrato poroso y de reaccioacuten neutra ya que de esta manera el agua escurre sin acumularse no permitiendo la pudricioacuten de las raiacuteces Para las orquiacutedeas terrestres es lo mismo solo que se pueden regar con maacutes frecuencia pero sin mantenerlas saturadas (OSPINA y DRESSLER 1979) Seguacuten DUMOIS (2007) el agua es lo maacutes difiacutecil de controlar ya que depende de muchas variables como por ejemplo humedad relativa tipo de sustrato intensidad luminosa temperatura y circulacioacuten de aire Ademaacutes muchas orquiacutedeas necesitan un periacuteodo de receso vegetativo que si no es respetado resulta en ausencia de floracioacuten En general hay que antildeadir agua en abundancia cuando la planta se encuentra en crecimiento activo y reducirla despueacutes de la floracioacuten
8
Las especies con pseudobulbos almacenan agua y estaacuten preparadas para su periacuteodo de receso Otras que no cuentan con estos oacuterganos requieren de humedad maacutes constante 222 Luz Ninguna planta puede crecer sin la iluminacioacuten adecuada Muchas orquiacutedeas viven en las alturas de los aacuterboles y estaacuten expuestas a plena luz del sol otras crecen en el suelo selvaacutetico protegidas del sol por espesos follajes (ROLLKE 2005) La funcioacuten principal de la luz es activar el proceso de fotosiacutentesis Los cultivadores han estudiado la luz y han descubierto que hay orquiacutedeas que florecen con diacutea largo y otras con diacutea corto (OSPINA y DRESSLER 1979) Gracias a la fotosiacutentesis se convierten los minerales presentes en el ambiente en savia y nutrientes Hojas oscuras y falta de floracioacuten indican falta de luz hojas amarillas e incluso quemadas apuntan hacia un exceso de sol (DUMOIS 2007) 223 Fertilizacioacuten Las orquiacutedeas necesitan los mismos nutrientes que otras plantas Un abono para orquiacutedeas debe contener los nutrientes principales nitroacutegeno (N) foacutesforo (P) y potasio (K) asiacute como tambieacuten oligoelementos como hierro (Fe) magnesio (Mg) zinc (Zn) estantildeo (Sn) y manganeso (Mn) (ROLLKE 2005) Por otra parte la fertilizacioacuten depende de varios factores dentro de los cuales los maacutes criacuteticos son
- El medio utilizado - La edad de las plantas - Estado de las plantas ya sea floracioacuten crecimiento reposo
En cuanto a absorcioacuten se ha demostrado que es igual de eficiente por viacutea foliar como a traveacutes de las raiacuteces Es necesario tener en cuenta algunas reglas baacutesicas a la hora de fertilizar las orquiacutedeas (Asociacioacuten Costarricense de Orquideologiacutea ACO 1970)
1 Regar las plantas antes de fertilizar 2 Fraccionar las dosis 3 Aplicar el fertilizante de forma liacutequida 4 No usar fertilizantes soacutelidos 5 No fertilizar las plantas recieacuten plantadas 6 No fertilizar plantas en reposo 7 No abonar plantas enfermas
224 Temperatura Es conocido el hecho de que cada planta tiene liacutemites de temperatura dentro de los cuales prospera o perece De ahiacute la necesidad de conocer las temperaturas correspondientes al lugar de donde viene cada especie de orquiacutedea pudiendo proporcionarle la temperatura adecuada (OSPINA y DRESSLER 1979) Se puede clasificar a las orquiacutedeas como de clima caacutelido (temperatura nocturna miacutenima de 20ordmC) templado (miacutenimo de 13 a 18ordmC) y de ambiente friacuteo (de 10 a 13ordmC) (DUMOIS 2007)
9
Seguacuten SHEEHAN (1980) las temperaturas ideales para las orquiacutedeas de origen tropical son 10ordmC en la noche y entre 21ordm - 24ordmC durante el diacutea 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas La micropropagacioacuten de orquiacutedeas estaacute en vanguardia hoy en diacutea El estudio de cultivo de tejido de orquiacutedeas se lleva a cabo en muchos laboratorios de todo el mundo (ARDITTI and ERNST 1992) 231 Biologiacutea de las semillas Las semillas de orquiacutedeas son conocidas usualmente como semillas polvo porque son minuacutesculas y contienen pocas reservas de alimento Estas semillas por lo general no germinan en el medio natural a menos que sean infectadas por un hongo micorriacutezico Este hongo abastece a las plantas joacutevenes con azuacutecares y nutrientes hasta que sean lo suficientemente grandes para fabricar su propio alimento Cuando la semilla germina produce una masa indiferenciada de ceacutelulas llamada protocormo Manteniendo las condiciones normales el protocormo continuaraacute su crecimiento por varias semanas meses o incluso antildeos dependiendo de la especie hasta que alcance la edad apropiada para producir raiacuteces y hojas En el caso de orquiacutedeas terrestres es de vital importancia que la relacioacuten orquiacutedea-hongo se conserve durante los estados tempranos del ciclo de vida de la planta ya que el protocormo enterrado no puede fabricar alimento por siacute mismo Por otro lado los protocormos de las orquiacutedeas epiacutefitas son comuacutenmente verdes lo que les posibilita producir parte de su alimento La relacioacuten orquiacutedea-hongo no ha sido en su totalidad investigada para el caso de las orquiacutedeas tropicales (McKENDRICK 2000) 232 Germinacioacuten simbioacutetica y no simbioacutetica de semillas Mediante la germinacioacuten in vitro las semillas germinan en frascos de vidrio o plaacutestico Estos frascos contienen en su interior un medio nutritivo solidificado con agar con todos los azuacutecares y minerales necesarios para la germinacioacuten y crecimiento de las semillas Hay dos tipos de germinacioacuten la simbioacutetica y la asimbioacutetica En la germinacioacuten simbioacutetica las semillas se siembran junto con una pequentildea cantidad del hongo micorriza adecuado Dicho hongo crece en el medio coloniza a las semillas que estaacuten en proceso de germinacioacuten y se produce una relacioacuten simbioacutetica la cual alimentaraacute al protocormo hasta que este sea capaz de producir sus hojas y se vuelva autotroacutefico Esta teacutecnica es usada principalmente en propagacioacuten de orquiacutedeas terrestres en zonas templadas La germinacioacuten asimbioacutetica se usa principalmente en propagacioacuten de orquiacutedeas tropicales que crecen maacutes raacutepido que sus parientes de zonas templadas Para este tipo de germinacioacuten se necesita un medio de cultivo maacutes complejo ya que todos los nutrientes orgaacutenicos e inorgaacutenicos asiacute como tambieacuten los azuacutecares deben estar en forma disponible pues no existe la intermediacioacuten del hongo (McKENDRICK 2000) 233 Condiciones de esterilidad Tanto para la germinacioacuten simbioacutetica como para la asimbioacutetica es de vital importancia que los frascos las semillas aparatos y el medio esteacuten esteacuteriles desde el principio del proceso Esto debido a que cualquier hongo o bacteria que se introduzca creceraacute maacutes raacutepido que las semillas ocupando su espacio hasta matarlas Esto se evita gracias al autoclave el cual regulado a 12 atm y 120ordmC por 20 minutos mata hongos o bacterias presentes en el medio (McKENDRICK 2000)
10
2331 Siembra de las semillas Las semillas pueden ser recolectadas desde caacutepsulas verdes o maduras La caacutepsula verde que estaacute madurando estaacute llena de semillas y no se deforma cuando se aprieta con las pinzas Estas semillas pueden ser almacenadas por algunas semanas en un lugar refrigerado con bastante aireacioacuten Las semillas se pueden sembrar a partir de caacutepsulas verdes o semillas secas A continuacioacuten se muestran las ventajas y desventajas de ambos meacutetodos
- Siembra a partir de caacutepsulas verdes Si las caacutepsulas se mantienen intactas el interior (las semillas) se mantiene esteacuteril Por lo tanto si se esteriliza la parte exterior de las mismas donde hongos y bacterias pueden desarrollarse y se abren las caacutepsulas bajo condiciones esteacuteriles y las semillas podraacuten mantenerse desinfectadas
La ventaja de este meacutetodo es que no se requiere de esterilizacioacuten de las semillas lo que provoca su deterioro Otro punto a favor es que algunas semillas podriacutean germinar maacutes raacutepido que las provenientes de caacutepsulas maduras por los mecanismos de dormancia La desventaja es que en este caso todas las semillas deben ser utilizadas o eliminadas mientras que las semillas maduras se pueden almacenar Tambieacuten se debe considerar que las semillas sembradas a partir de caacutepsulas que no han madurado lo suficiente podriacutean germinar lentamente o simplemente no germinar - Siembra a partir de semillas secas En este caso una vez que la caacutepsula es abierta las semillas dejan de ser esteacuteriles y requieren de un proceso de esterilizacioacuten Comuacutenmente se utiliza una solucioacuten de hipoclorito de sodio hipoclorito de calcio o peroacutexido de hidroacutegeno Las semillas se agitan dentro de la solucioacuten que ademaacutes contiene una gota de detergente para ldquohumedecerlasrdquo luego se las enjuaga con agua destilada y se las siembra en el medio preparado La ventaja de este meacutetodo es que las semillas pueden ser colectadas secadas al aire almacenadas por varios meses en el refrigerador y utilizarlas cuando sea necesario Se debe considerar que la siembra ya sea de caacutepsulas verdes o de semillas secas estaacute determinado por la eacutepoca en que se colectan (McKENDRICK 2000) 234 Trasplante En la caacutemara de incubacioacuten las plaacutentulas se han desarrollado en condiciones limpias y en un ambiente cerrado por lo que deben acostumbrase gradualmente al ambiente exterior antes de ser trasplantadas a las macetas Tambieacuten la temperatura y la luz la cual es baja han sido constantes durante el cultivo in vitro En el medio natural la temperatura y la luz variacutean constantemente por lo que las nuevas plantas deben estar protegidas de la fuerte luz solar la cual puede quemar las hojas con soacutelo una pequentildea cantidad de eacutesta La humedad en los frascos es alta y las plantas estaacuten protegidas de ataques por hongos o bacterias Ademaacutes las plaacutentulas han crecido bajo condiciones de alta humedad y por lo tanto tendraacuten cutiacuteculas deacutebiles por lo que necesitan acostumbrase a medios menos huacutemedos antes de ser transplantadas
11
Para el trasplante se deben colocar los frascos en un lugar protegido de la lluvia para que se aclimaticen a las nuevas condiciones de luz y temperatura Se deben dejar por 2 a 4 semanas en los frascos tapados Luego se debe ir aflojando las tapas para dejar entrar pequentildeas cantidades de aire hasta el punto de dejarlas descubiertas Se debe revisar si hay hojas marchitas y ver que el sustrato esteacute huacutemedo
Lo ideal es dejarlas sin tapa durante una semana antes de pasarlas a las macetas Para el trasplante se debe elegir un sustrato adecuado para el tipo de planta humedecerlo y transplantar las plantas con cuidado de no dantildear las raiacuteces y evitando la deshidratacioacuten En esta etapa tambieacuten se debe dejar las macetas selladas para evitar una raacutepida deshidratacioacuten e ir abrieacutendolas paulatinamente (McKENDRICK 2000)
24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas 241 Orquiacutedeas terrestres 2411 Cypripedium Esta es una orquiacutedea terrestre de zonas templadas se desarrolla en el Hemisferio Norte como por ejemplo en Guatemala y en Honduras pero donde se encuentra principalmente es en China Su forma maacutes comuacuten de propagacioacuten es in vitro a partir de semillas La forma maacutes eficiente es a partir de semillas inmaduras Existe un intervalo de tiempo entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten eacuteste dependeraacute de la especie y de la zona donde se desarrolle Se asume que existen aproximadamente cuatro semanas entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten El oacuteptimo para una buena germinacioacuten de Cypripedium es entre 42 y 60 diacuteas despueacutes de la polinizacioacuten y entre 14 y 32 diacuteas despueacutes de la fertilizacioacuten La germinacioacuten ocurre entre la segunda y cuarta semana despueacutes de ser sembradas y los protocormos deberiacutean ser cambiados de medio de cultivo cada dos a cuatro meses si no se corre el riesgo de sufrir agotamiento de nutrientes Los rizomas y las raiacuteces se empiezan a desarrollar a partir de los siete meses para luego dar lugar a las primeras hojas Para obtener un buen transplante se deben tener raiacuteces de miacutenimo un centiacutemetro de largo El desarrollo de raiacuteces se ve potenciado al tener un periacuteodo corto de bajas temperaturas (10degC) exposicioacuten a la luz reduccioacuten en la concentracioacuten de iones del medio de cultivo o transferirlas a un compost esteacuteril Al tener raiacuteces suficientes y el tamantildeo adecuado se podraacuten llevar las plantas al lugar donde creceraacuten definitivamente En el momento del transplante las plantas son muy susceptibles al desecamiento por lo cual lo ideal es que los brotes sean maacutes chicos que las raiacuteces El mejor sustrato seriacutea aquel donde crece naturalmente la orquiacutedea (RAumlNNBAumlCK 2007) 2412 Preservacioacuten in vitro de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes Este estudio fue hecho para establecer que parte de tejido es viable para la micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes del noreste de Europa pudiendo asiacute reestablecer dichas orquiacutedeas a sus aacutereas correspondientes La propagacioacuten in vitro de orquiacutedeas
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terrestres de clima templado es maacutes difiacutecil que las orquiacutedeas epiacutefitas de clima subtropical y tropical Las orquiacutedeas terrestres tienen requerimientos maacutes estrictos que las epiacutefitas y se conoce menos sobre sus necesidades especiacuteficas (VAASA y ROSENBERG 2004) En Estonia existen 36 especies de orquiacutedeas terrestres pero solo tres estaacuten bajo proteccioacuten Dactylorhiza baltica Dactylorhiza ruthei Dactylorhiza praetermissa Como explantes para este estudio en el caso de D baltica se ocuparon protocormos en los otros dos casos se utilizaron semillas semi maduras las cuales fueron colectadas siete y diez semanas despueacutes de ser polinizadas Para D baltica se ocupoacute el medio Murashige y Skoog suplementado con 05 mgL de aacutecido naftaleacuten aceacutetico (ANA) y 2 mgL de isonpentenyl adenina Para el caso de las semillas semi maduras se ocuparon los medios de Lindemann de Heller de Norstog y de Murashige y Skoog como control
La composicioacuten del medio y la madurez de las semillas influye mucho en el desarrollo de las orquiacutedeas in vitro Se ha demostrado que se necesita una alta concentracioacuten de microelementos para obtener una correcta germinacioacuten de las semillas Tambieacuten se puede decir que los primeros tres meses son los de mayor crecimiento luego de este tiempo el crecimiento se vuelve maacutes lento (VAASA y ROSENBERG 2004)
Luego de cuatro semanas de crecimiento de D baltica el 60 de los explantes de meristemas apicales empezaron a crecer en cambio los de meristemas laterales no expresaron ninguacuten tipo de crecimiento Las raiacuteces empezaron su desarrollo luego de dos meses despueacutes de la siembra
En el caso de D ruthei y D praetermissa la germinacioacuten se produjo despueacutes de dos meses desde la inoculacioacuten Luego de cuatro y seis meses el mayor crecimiento fue observado en el medio Norstog superando en 14 al medio testigo Murashige y Skoog (VAASA y ROSENBERG 2004)
2413 Longevidad de semillas de orquiacutedeas terrestres Por lo general las orquiacutedeas producen muchas pero pequentildeas semillas que contienen muy pocas reservas de alimento Dichas semillas estaacuten estructuralmente adaptadas para ser dispersadas por el viento pero poco se sabe del destino de eacutestas luego de ser dispersadas Algunos estudios de viabilidad de semillas indican una sobrevivencia de uno a dos antildeos en orquiacutedeas de clima templado Las semillas que son guardadas en laboratorio duran mucho maacutes tiempo Se estudioacute la viabilidad de siete especies de orquiacutedeas norteamericanas dentro de las cuales se encuentran Goodyera pubescens y Liparis liliifolia Las semillas de eacutestas se colocaron en bolsas con suelo y sustratos de bosques provenientes de sus haacutebitats naturales (WHIGHAM et al 2005) En Goodyera pubescens la mayoriacutea de las semillas germinaron en un antildeo Cuatro otras especies germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero algunas semillas no germinadas despueacutes de siete antildeos seguiacutean siendo viables En la especie Liparis liliifolia semillas que han estado cuatro antildeos bajo observacioacuten han tenido una tasa de
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germinacioacuten de un 68 al ser sembradas in vitro junto con el hongo micorriacutezico adecuado Las dos especies restantes no germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero las semillas fueron evaluadas como intactas y testeadas positivamente en cuanto a su viabilidad despueacutes de cuatro antildeos en el suelo Estas observaciones fueron interpretadas como diferentes estrategias para especies especiacuteficas de germinacioacuten in situ (WHIGHAM et al 2005) 2414 Sobrevivencia de orquiacutedeas terrestres transplantadas a sectores urbanos La conservacioacuten de poblaciones de orquiacutedeas silvestres depende del establecimiento de las orquiacutedeas propagadas a los campos Sin embargo se conoce muy poco de los factores bioacuteticos que influencian el establecimiento de orquiacutedeas terrestres a sus haacutebitats naturales Un experimento fue establecido para medir la sobrevivencia de seis especies durante su primer periacuteodo de crecimiento seguido del transplante a un sector urbano en Australia (SCADE et al 2006)
Las orquiacutedeas germinadas simbioacuteticamente crecieron en laboratorio durante cinco meses antes de establecer la plantacioacuten en sitios adyacentes con alta o baja cobertura de malezas Existioacute una muerte gradual de las plaacutentulas durante el primer periacuteodo de crecimiento primeramente por ataque de insectos no siendo evitado por la presencia de una malla cobertora Los iacutendices de sobrevivencia variacutean desde 49 para Microtis media una especie capaz de crecer en un ambiente atiacutepico hasta un 21 para Caladenia arenicola la orquiacutedea nativa maacutes comuacuten de esos sitios Sin embargo no todas las orquiacutedeas sobrevivientes producen tubeacuterculos por lo que la tasa de sobrevivencia despueacutes del primer periacuteodo seco disminuye
La sobrevivencia de las orquiacutedeas sembradas no puede ser comparada con orquiacutedeas de la misma especie que crecieron en los mismos lugares ya que no existioacute la presencia del hongo compatible para estas orquiacutedeas (SCADE et al 2006)
2415 Micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres En India dos orquiacutedeas muy importantes para la horticultura del geacutenero Anoectochilus fueron exitosamente propagadas Noacutedulos aislados de A sikkimensis colectadas en Himalaya y A regalis colectadas en India fueron cultivadas in vitro durante 12 semanas para obtener un maacuteximo de 48 a 56 protocormos y brotes obteniendo como resultado un 95 y 98 de eficiencia respectivamente Durante el repicado de los explantes in vitro de A regalis se observoacute que el nuacutemero total de brotes obtenidos a partir de noacutedulos fue 214 asiacute como tambieacuten 82 puntas de brotes En cambio para A sikkimensis fueron mucho maacutes bajos 123 y 43 respectivamente teniendo un crecimiento maacutes lento pero plantas maacutes fuertes Las raiacuteces de 4 a 6cm crecieron con la presencia de NAA (270 microM ) en el medio asiacute como tambieacuten con carbono activado (02) Durante la aclimatacioacuten la tasa de establecimiento fue entre 95 y 98 Luego de seis meses en invernadero las plantas de A regalis fueron transferidas a bosque nativo donde se obtuvo una tasa de
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sobrevivencia de entre 70 y 95 despueacutes de 12 meses Estas plantas establecidas en bosque nativo estaacuten libres de cualquier defecto morfoloacutegico y de crecimiento (GANGAPRASAD et al 2000) 242 Orquiacutedeas epiacutefitas Estas orquiacutedeas viven en los aacuterboles pero no obtienen de eacuteste su alimento no son paraacutesitas 2421 Preservacioacuten de Cattleya walkeriana usando propagacioacuten in vitro El geacutenero Cattleya se encuentra en Meacutexico y Ameacuterica Central asiacute como tambieacuten en Venezuela Colombia y las laderas de los Andes Esta orquiacutedea tambieacuten se encuentra en varias regiones del Brasil creciendo en aacuterboles rocas cerca de riacuteos lagos y pantanos Las flores de esta orquiacutedea son conocidas debido a su hermosura y a causa de la destruccioacuten de su haacutebitat y a la excesiva coleccioacuten de eacutestas se encuentra en extincioacuten
La composicioacuten del medio de cultivo es esencial para la propagacioacuten in vitro ya que suple todos los nutrientes necesarios para el desarrollo y seraacute distinto dependiendo de cada especie en este caso se utilizoacute la mitad de los macronutrientes del medio Muchos autores sugieren el uso de carboacuten activado en el medio ya que por lo general en muchas especies aumenta el desarrollo de las raiacuteces En este estudio se probaron distintas dosis de carboacuten activado 1 2 4 y 6gL con un pH de 6 (TADEU DE FARIA et al 2002) Las semillas se obtuvieron de flores artificialmente polinizadas en invernadero Plaacutentulas de aproximadamente un centiacutemetro fueron seleccionadas y cultivadas nuevamente en el medio de cultivo Murashige y Skoog pero esta vez con las diferentes dosis de carboacuten activado Se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces el nuacutemero de brotes y el peso de la materia verde total Durante el autoclavado se produce normalmente una hidroacutelisis de sacarina la cual es de 10 aproximadamente este porcentaje aumenta considerablemente al agregar un 1 de carboacuten activado llegando a ser de 95
El desarrollo de las plaacutentulas de C walkeriana aumentan con una mayor concentracioacuten de carboacuten activado asiacute como tambieacuten un mayor tiempo de cultivo El resultado fue que la dosis ideal para el desarrollo de esta orquiacutedea es 2gL de carboacuten activado (TADEU DE FARIA et al 2002) 2422 Establecimiento de cultivos in vitro y micropropagacioacuten de Cattleya aurantiaca (Bateman ex Lindl) Por medio de siembra in vitro se logroacute el establecimiento de C aurantiaca con alto porcentaje de germinacioacuten y desarrollo de protocormos Para la oacuteptima formacioacuten de callo y para la proliferacioacuten de protocormos se determinaron los medios oacuteptimos (MS 10 mgL ANA 10 mgL BA) asiacute como tambieacuten de manera directa sobre explantes de hoja y pseudobulbos (MS 01 mgL ANA 01 mgL GA3)
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Con este uacuteltimo medio tambieacuten se logroacute una oacuteptima regeneracioacuten y desarrollo de plaacutentulas Los medios liacutequidos (sin agitacioacuten) son una buena opcioacuten para conseguir la produccioacuten masiva de protocormos ya que con ellos se optimizoacute la micropropagacioacuten de C aurantiaca Las plaacutentulas micropropagadas presentaron alto porcentaje de sobrevivencia y buen desarrollo despueacutes de su trasplante y aclimatacioacuten lo cual demuestra que es un buen sistema de propagacioacuten para C aurantiaca (GUTIERREZ y SALGADO 2007) En cuanto a transplante y aclimatacioacuten despueacutes de 45 diacuteas de desarrollo in vitro las plaacutentulas de un tamantildeo entre 3 y 5 cm con raiacuteces bien desarrolladas fueron llevadas a condiciones ex vitro eliminando los restos de medio de cultivo con agua potable y ocupando un sustrato de partes iguales de tezontle y corteza de encino cubierta con hojarasca de encino finamente molida Se mantuvieron cubiertas durante 15 diacuteas abriendo cada dos diacuteas hasta poder retirar la tapa en 30 diacuteas Despueacutes de dos meses de haber sido retiradas del cultivo in vitro las plaacutentulas presentaron 70 de sobrevivencia y alcanzaron una altura de hasta 7 cm presentando nuevas hojas y raiacuteces las plantas se muestran vigorosas y capaces de continuar su crecimiento en condiciones ambientales de invernadero (GUTIERREZ y SALGADO 2007)
2423 Establecimiento in vitro y regeneracioacuten de plantas de Laelia autumnalis (Llave y Lex) Lindl Para este estudio se obtuvieron las semillas de una caacutepsula desarrollada despueacutes de 6 meses de la floracioacuten las cuales se sembraron in vitro sin presentar contaminacioacuten ya que la siembra por este meacutetodo es muy eficiente en comparacioacuten al cultivo de semillas libres donde algunas veces se presenta la contaminacioacuten Las observaciones se realizaron cada 15 diacuteas la germinacioacuten se detectoacute en los primeros 15 diacuteas en la mayoriacutea de los medios de cultivos probados con la presencia de protocormos de 1mm de diaacutemetro (HUAPEO y SALGADO 2004) El porcentaje de germinacioacuten que se obtuvo de las semillas cultivadas in vitro de L autumnalis fue de 95 a 100 en todos los medios de cultivo la uacutenica diferencia fue el tiempo entre las germinaciones A excepcioacuten de las semillas cultivadas en el medio MS 100 la germinacioacuten del 100 se obtuvo hasta los 30 diacuteas de cultivo mientras que en el primero la germinacioacuten fue a los 15 diacuteas del cultivo Las plaacutentulas con raiacutez y un par de hojas se lograron a los 90 diacuteas de cultivo en el medio MS 100 alcanzando 07 mm de altura Estas plaacutentulas fueron subcultivadas en medio MS con 05 mgl de ANA y 01 mgl de GA3 para tener plaacutentulas fuente de explante (segmentos de hojas) un medio oacuteptimo de desarrollo de plaacutentulas de L speciosa No fue necesario probar otros medios de cultivos ya que se hicieron pruebas anteriores que demostraron que era el adecuado
Las plaacutentulas de 6 meses de cultivo in vitro despueacutes de su germinacioacuten presentaron una altura promedio de 5 cm con raiacuteces con velamen y hasta dos pares de hojas Segmentos de hoja de eacutestas fueron cultivadas en el medio MS conteniendo ANA BA y GA3 en diferentes concentraciones y se realizaron observaciones cada 30 diacuteas para determinar medios inductores de callo protocormos y raiacuteces La mejor respuesta en formacioacuten de callo fue observada en los segmentos de hoja de plaacutentulas de L autumnalis cultivados en MS con 1 mgl de ANA BA y GA3 iniciando la induccioacuten de
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eacuteste desde los 30 diacuteas de cultivo solamente en un 70 de los explantes cultivados El 100 se logroacute a los 90 diacuteas de cultivo observando callo abundante alrededor de todo el tejido de color blanco con puntos pigmentados de color verde La regeneracioacuten de protocormos de esta orquiacutedea se establecioacute con la siembra de segmentos de hoja de plaacutentulas de 6 meses de edad de manera directa o a partir de callos En callos la produccioacuten fue oacuteptima en el medio MS con 01 mgl de ANABAGA3 ya que a los 60 diacuteas se obtuvieron 50 protocormos por segmento de callo Solamente se produjeron 10 protocormos por explante al cultivarse los segmentos de hoja en MS con 01 mgl de ANABAGA3 a los 120 diacuteas de cultivo (HUAPEO y SALGADO 2004) 25 Aclimatacioacuten Aclimatacioacuten significa que el hombre intercede y guiacutea el proceso de acondicionamiento de las plantas hasta que eacutestas sean aptas para crecer en el campo yo invernadero
Un alto nuacutemero de plantas micropropagadas no sobreviven al cambio desde el cultivo in vitro hacia el ambiente exterior ya sea en campo o invernadero Eacutestos dos uacuteltimos tienen menor humedad relativa niveles maacutes altos de luminosidad y un ambiente seacuteptico los cuales son maacutes estresantes para las plantas micropropagadas La mayoriacutea de las especies que crecen in vitro necesitan un proceso de aclimatacioacuten pudiendo obtener asiacute un nuacutemero suficiente de plantas vivas y vigorosas para trasplantar al suelo (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991)
La aclimatacioacuten no es uacutenicamente para micropropagacioacuten siendo usada ademaacutes en propagacioacuten convencional durante antildeos Despueacutes de cortar las hojas y de haber formado raiacuteces por lo general son aclimatadas antes de ser llevadas al campo o invernadero Ejemplos de dos teacutecnicas comunes son bajar gradualmente la humedad y mantener el nivel de luz con un 50 de sombra antes de trasladarlos al campo Las raiacuteces que han sido cortadas y mal limpiadas muchas veces son focos de infeccioacuten En estos casos las plantas muestran signos de marchitez hojas necrosadas y tambieacuten se puede llegar a la muerte de eacutestas El cultivo in vitro reduce la necesidad de fotosiacutentesis ya que las condiciones de la caacutemara de incubacioacuten proveen a la planta de sacarosa u otro azuacutecar Tambieacuten en estas condiciones se reduce el stress por patoacutegenos al ser un ambiente aseacuteptico Todo esto se traduce en que las plantas micropropagadas no son aptas para el campo yo invernadero (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 251 Stress hiacutedrico El stress hiacutedrico puede ser el resultado de una excesiva transpiracioacuten de las diferentes partes aeacutereas de las plantas especialmente de las hojas o por una inadecuada absorcioacuten de agua por parte de las raiacuteces La cutiacutecula y los estomas son la ruta primaria de peacuterdida de agua desde de las hojas provenientes de esta teacutecnica reproductiva 2511 Cutiacutecula La cutiacutecula es una membrana compuesta por una matriz de cutina que a su vez se encuentra cubierta en su superficie por ceras cuya funcioacuten primaria consiste en limitar la peacuterdida de agua por transpiracioacuten La permeabilidad del agua a traveacutes de la cutiacutecula se ve influenciada principalmente por la estructura y la cantidad de
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ceras cuticulares y epicuticulares no vieacutendose afectada la peacuterdida de agua por el grosor de eacutesta o la naturaleza quiacutemica de la matriz de la cutina La estructura cristalina de la parte encerada de las hojas es distinta en las plantas micropropagadas con respecto a las plantas que crecen en el campo La cera epicuticular de las hojas de plantas in vitro tienen una proporcioacuten maacutes alta de esteres y de componentes polares por el contrario tienen unas cadenas de hidrocarbonos mucho maacutes cortas Esto hace que las plantas in vitro pierdan maacutes agua que las cultivadas en campo o invernadero
Las plantas que han crecido en el campo son naturalmente de color verde pero el color de las plantas cultivadas in vitro es diferente y se puede ver a simple vista Las plantas que son pasadas a invernadero y que tengan un color verde se aclimatan de mejor forma al ambiente exterior (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 2512 Estomas La estructura estomaacutetica y su funcionamiento han sido implicados recurrentemente en el desbalance de agua exhibido por plantas micropropagadas al momento de ser removidas del cultivo in vitro Estudios con microscopiacutea de scanner electroacutenico han indicado que la estructura estomaacutetica presente en algunas especies de plantas cultivadas in vitro difieren marcadamente de las cultivadas en invernadero o en el suelo Debido a que las primeras presentan estomas de mayor tamantildeo y maacutes redondos a diferencia de las plantas cultivadas de manera normal que presentan estomas maacutes pequentildeos y eliacutepticos lo que resulta en una deshidratacioacuten maacutes raacutepida en el caso de las provenientes de cultivo in vitro (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 252 Humedad Debido a la anatomiacutea y la condicioacuten fisioloacutegica de las plantas desarrolladas in vitro donde se ha mantenido una alta humedad relativa es necesario regar al momento del traslado para obtener una alta sobrevivencia Muchos laboratorios aseguran que hay que evitar tener un sistema de aspersioacuten ya que se produce el ambiente necesario (muy huacutemedo) para la aparicioacuten de hongos algas o bacterias Otros meacutetodos incluyen el uso de humidificadores o poner las macetas en un lugar cerrado donde se retenga vapor para esto se pueden usar por ejemplo tapas de polietileno Este meacutetodo es relativamente econoacutemico pero se debe tener control del calor y monitorear la falta de agua (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 253 Luz Durante la etapa in vitro las plantas estaacuten expuestas a altos niveles de luminosidad lo que se traduce en hojas delgadas Antes del traslado se recomienda mantener las plantas con un 50 de sombra para asiacute poder aclimatarlas de mejor manera esto debido a que las plantas micropropagadas tienen un bajo control sobre la transpiracioacuten y un inadecuado mecanismo de fotosiacutentesis La sombra reduce la transpiracioacuten evitando excesivas peacuterdidas de agua asiacute como tambieacuten el exceso de luz destruye las moleacuteculas de clorofila Luego del periacuteodo bajo sombra se deben mover las macetas gradualmente hacia el nivel de luz al cual seraacute llevado para su crecimiento final (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 254 Temperatura La temperatura del aire y del medio o sustrato de crecimiento estaacute generalmente controlado durante el periacuteodo de aclimatacioacuten El calor es necesario en los meses de invierno y el friacuteo (enfriar) es esencial en los meses de verano Ajustando la cantidad de sombra y humedad se obtiene un control sobre la temperatura El
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enfriamiento se puede obtener gracias a ventilacioacuten abanicos niebla o aire acondicionado El calor puede provenir del sistema existente en el edificio o invernadero donde esteacuten ubicadas las macetas o por las laacutemparas ocupadas para el control del fotoperiacuteodo El rango de temperatura que se mantiene por lo general es entre los 13 y 30ordmC y esta determinado principalmente por la especie en cuestioacuten La temperatura de la zona donde se encuentran las raiacuteces es muy importante para el crecimiento lo ideal es que dicho sector tenga una mayor temperatura que el aire fomentando el crecimiento de las raiacuteces e incrementando la humedad alrededor de la planta Durante el verano esto es difiacutecil de obtener ya que la temperatura del aire es muy alta debido a la alta radiacioacuten solar Terminado el proceso de aclimatacioacuten esto ya no es necesario (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 255 Fotosiacutentesis Las plantas sufren un cambio radical cuando son removidas desde cultivo in vitro ya que son forzadas a cambiar de heterotroacuteficas a autotroacuteficas y la fotosiacutentesis se vuelve fundamental para la sobrevivencia Las hojas de las plantas in vitro no estaacuten formadas para hacer fotosiacutentesis ya que en la caacutemara de incubacioacuten no se produce un fuerte intercambio gaseoso esto debido a que la sacarosa es entregada a traveacutes del medio de cultivo Las hojas de las plantas que son trasladadas al campo o invernadero sufren deterioro debido a que no estaacuten formadas para la fijacioacuten de carbono Esto se produce por un tiempo aproximado de cuatro semanas despueacutes de las cuales las hojas nuevas suplen a las viejas Otro punto es que las hojas de las plantas cultivadas in vitro contienen menor proporcioacuten de clorofila que las plantas que han crecido normalmente en el campo En un estudio de coliflor cultivado in vitro se midioacute el CO2 y se obtuvo un balance negativo el cual se mantuvo durante dos semanas despueacutes del transplante Algo similar ocurrioacute con frutilla despueacutes del transplante las hojas se deterioraron raacutepidamente lo que quiere decir que no hubo incremento en la fijacioacuten de carbono indicando falta de desarrollo en la competencia fotosinteacutetica
El bajo nivel de CO2 durante el cultivo in vitro limita el proceso de fotosiacutentesis lo cual se puede compensar usando sacarosa en el medio de cultivo Tambieacuten se puede incrementar el nivel de luz y CO2 obteniendo un fuerte aumento en el crecimiento de varias especies como orquiacutedeas clavel etc (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 256 Sustrato Un sustrato es todo material soacutelido distinto del suelo natural mineral u orgaacutenico que colocado en un contenedor en forma pura o en mezcla permite el anclaje del sistema radicular de la planta desempentildeando por lo tanto un papel de soporte para la planta El sustrato puede intervenir o no en el complejo proceso de la nutricioacuten mineral de la planta (INFOAGRO 2007) El sustrato y los contenedores dentro de los cuales se van a transplantar las plaacutentulas in vitro son importantes para una buena sobrevivencia
Los sustratos ejercen una influencia significativa en la arquitectura del sistema radical de las plantas y en las asociaciones bioloacutegicas de este con el suelo influenciando el
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estado nutricional y la translocacioacuten de agua en el sistema suelo-planta-atmoacutesfera Uno de los requisitos fundamentales que debe cumplir el sustrato para su utilizacioacuten es la sanidad Cuando estos no se elaboran almacenan o manejan correctamente pueden contaminarse y provocar serios dantildeos a las plantas durante la aclimatacioacuten por esta razoacuten son preferidos como componentes para su elaboracioacuten materiales inertes o aquellos en las cuales el proceso de obtencioacuten garantice la mayor desinfeccioacuten posible
Uno de los factores de mayor importancia a la hora de seleccionar los materiales que pueden constituir el sustrato es su disponibilidad tanto en teacuterminos de facilidad de obtencioacuten o suministro como de su costo (VILCHEZ et al 2007)
La presencia de inhibidores o tambieacuten cambios en el pH del sustrato pueden afectar el crecimiento de las raiacuteces y consecuentemente el eacutexito del transplante
Muchos laboratorios y viveros transplantan a un sustrato uniforme debiendo ser eacuteste adecuado en cuanto a soporte de las plantas pH porosidad aireacioacuten y drenaje (DEBERGH y ZIMMERMAN 1991)
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3 MATERIAL Y MEacuteTODO
Para la realizacioacuten de este trabajo se utilizoacute el siguiente material y meacutetodo
31 Material La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio e invernadero de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal pertenecientes a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de Chile
311 Material vegetal Se utilizaron plaacutentulas de C virescens cultivadas in vitro a partir de semillas las cuales fueron proporcionadas por el laboratorio estas plaacutentulas fueron separadas y repicadas para aumentar la poblacioacuten y obtener la cantidad necesaria para el ensayo
FIGURA 2 Plaacutentulas de C virescens en caacutemara de crecimiento in vitro
312 Materiales Los materiales que se utilizaron fueron los siguientes Equipos autoclave caacutemara de flujo laminar dispensador de medios medidor
de pH agitador magneacutetico horno microondas balanza mechero termoacutemetro Materiales vasos de precipitado matraces probetas pipetas papel de
aluminio frascos de vidrio placas Petri pinzas bisturiacute macetas regadera Soluciones soluciones madre (Medio MS) gelificante etanol 70 y 95
32 Meacutetodo A continuacioacuten se da a conocer la metodologiacutea con la cual se trabajoacute 321 Preparacioacuten del medio de cultivo Para la obtencioacuten de plantas a traveacutes de la micropropagacioacuten se ocupoacute el medio basal de MURASHIGE y SKOOG (1962) tambieacuten llamado medio MS Este medio tiene un pH de entre 56-57 Posteriormente se dosificoacute con el dispensador de medios para que cada frasco tenga una cantidad adecuada (25 mL) y se llevoacute a autoclave para esterilizar a 12 atm 120ordm C por 20 min
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322 Obtencioacuten del material vegetal Al tener el medio esterilizado se procedioacute a la separacioacuten y repicado de plaacutentulas existentes en el laboratorio Las siembras se realizaron en el mes de mayo del 2007 Estas siembras se realizaron en la caacutemara de flujo laminar de modo de asegurar que la siembra sea 100 aseacuteptica Estas plaacutentulas fueron mantenidas en la caacutemara de incubacioacuten hasta obtener los tamantildeos requeridos para el ensayo donde las condiciones fueron las siguientes
minus Temperatura ambiental de 23-25ordm C minus Fotoperiacuteodo de 16 horas minus Intensidad lumiacutenica controlada de 50-55 micromol m-2s-1
323 Sustratos Se utilizaron tres tipos de sustratos el primero corresponde a una mezcla de turba + perlita (11) el segundo corresponde a Sphagnum (100) y el tercero corresponde a una mezcla de turba + arena (11) Una vez realizadas las mezclas se procedioacute a una esterilizacioacuten en un autoclave a 121ordm C por 20 minutos a 12 atmoacutesfera De esta forma se trabajoacute con material limpio y sano evitando ataque de hongos o bacterias El anaacutelisis quiacutemico de los sustratos se muestra en el Anexo 2 324 Plantacioacuten Las plaacutentulas con un promedio de cuatro meses en condiciones de caacutemara de crecimiento in vitro obtuvieron el tamantildeo adecuado para ser utilizadas Se sacaron de los frascos y se plantaron en las macetas de plaacutestico transparente con los sustratos Posteriormente fueron dejadas en la sala del laboratorio donde se debioacute asperjar con solucioacuten nutritiva Hoagland y fungicida Captan CUADRO 1 Composicioacuten de solucioacuten nutritiva Hoagland
KNO3 102 gL Ca(NO3) 4 H2 O 0492 gL
NH4H2 (PO4) 023 gL MgSO4 7 H2O 049 gL
H3BO3 286 mgL MnCl2 2 H2O 181 mgL CuSO4 5 H2O 008 mgL ZnSO4 5 H2O 022 mgL Na2MoO4 H2O 009 mgL
FeSO4 7 H2O 05 06 mL FUENTE FINCK 1988 325 Disentildeo de los ensayos Este trabajo de investigacioacuten constoacute de un ensayo con dos etapas Antes que todo se realizoacute la separacioacuten y repicado in vitro de plaacutentulas de C virescens para la obtencioacuten del nuacutemero necesario de plantas En la etapa 1 se utilizaron tres tamantildeos de plaacutentulas obtenidas in vitro de 1-2cm de 2-3cm y de maacutes de 3cm de altura que se transplantaron a tres sustratos turba + perlita 11(vv) Sphagnum (100) y turba + arena 11 (vv) La turba provino de la Sociedad
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Minera Patagonia Peat SA en Hijuelas el Sphagnum de la empresa Lonquen Chile de Puerto Montt y la perlita se obtuvo a traveacutes del sitio web wwwjardisencl (representante legal Walter Rathgeb Penza Ingeniero Agroacutenomo Santiago) Las plaacutentulas se plantaron de acuerdo a su tamantildeo las de maacutes de 3cm se colocaron de 6 por maceta las de 2 a 3cm de a 8 por maceta y las maacutes chicas de a 10 por maceta Estas macetas fueron dejadas en una sala de aclimatacioacuten con una temperatura promedio de 20ordm C intensidad lumiacutenica de 50-55 micromol m-2s-1 y 14-16 hrs de fotoperiacuteodo Se fertilizoacute asperjando cada cinco diacuteas con solucioacuten nutritiva Hoagland Esta etapa se llevoacute a cabo durante dos meses desde el cinco de septiembre hasta el cinco de noviembre de 2007
En la etapa 2 se continuoacute el proceso de aclimatacioacuten en invernadero de las plaacutentulas obtenidas en la etapa 1 que despueacutes de dos meses teniacutean un mayor tamantildeo y se habiacutean acondicionado al ambiente exterior (fuera de la caacutemara de crecimiento) Las plantas se mantuvieron en las macetas durante tres semanas para aclimatarlas y luego las plantas sobrevivientes fueron transplantadas a macetas maacutes grandes individuales durante tres meses aproximadamente hasta el cinco de marzo 2008 Estas nuevas macetas tuvieron como sustrato turba y suelo (trumao) en igual proporcioacuten (Anexo 2) La temperatura promedio de invernadero fluctuoacute de 13 a 35 degC seguacuten el mes En enero el promedio fue de 25 (Anexo 3) Para bajar la temperatura alrededor de 5deg C se instaloacute una malla Rachel 326 Disentildeo experimental El disentildeo experimental utilizado fue completamente al azar ordenado como experimento factorial con dos factores tamantildeo (3) y sustrato (3) Cada tratamiento tuvo tres repeticiones con un miacutenimo de 6 plantas por recipiente 327 Variables a evaluar Durante los dos meses en que las macetas estuvieron en la sala de aclimatacioacuten se evaluoacute el desarrollo foliar contando el nuacutemero de hojas una vez al mes Posteriormente se trasladaron las mismas macetas a invernadero durante tres semanas para continuar con la aclimatacioacuten de las plaacutentulas Transcurrido este tiempo se transplantaron las plaacutentulas sobrevivientes a macetas individuales y continuoacute mensualmente la evaluacioacuten de eacutestas (nuacutemero de hojas) hasta la obtencioacuten de plantas establecidas Al momento del transplante y al final del ensayo se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces asiacute como tambieacuten al final del ensayo de evaluoacute el crecimiento en altura (cm) La sobrevivencia fue evaluada al final del ensayo por maceta
Tanto en la sala de aclimatacioacuten coacutemo en el invernadero se registroacute la temperatura con la ayuda de un termoacutemetro de maacutexima y miacutenima (Anexo 3) 328 Anaacutelisis estadiacutestico Una vez obtenidos los datos se procedioacute a comprobar si estos cumpliacutean con los supuestos de aleatoriedad normalidad y homogeneidad de varianzas que exige este tipo de anaacutelisis En el caso de no cumplirse estos supuestos los datos se transformaron utilizando log10(x+05) raiacutez(x+05) o 1x para normalizarlos
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y enseguida se sometioacute los datos a un anaacutelisis estadiacutestico (ANDEVA) Posteriormente en los casos en que se observoacute diferencias significativas en el ANDEVA se aplicoacute una prueba de rangos muacuteltiples (Tukey) al 5 de significancia Para las variables no parameacutetricas que no cumplieron con los supuestos para un anaacutelisis de varianza se realizoacute la prueba de KruskalndashWallis y las comparaciones muacuteltiples a traveacutes del test de Dunn con un nivel de 5 de significancia
Se utilizaron los programas estadiacutesticos STATGRAPHICS 20 y GRAPHPAD PRISM 5 para el anaacutelisis de datos
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4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
En los siguientes puntos se discuten los resultados obtenidos en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens
En la Figura 3 se observan plaacutentulas de C virescens micropropagadas en medio MS en caacutemara de crecimiento al inicio del ensayo (A) y en invernadero despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten (B)
BA
FIGURA 3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten
A continuacioacuten se presentan los resultados obtenidos para las variables analizadas (Cuadro 2 y 3) de esta manera se pueden visualizar en general los resultados obtenidos en el proceso de aclimatacioacuten durante seis meses
CUADRO 2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de raiacuteces
inicial y final Variables
Hojas finales (nuacutemero)
Raiacuteces iniciales (nuacutemero)
Raiacuteces finales (nuacutemero)
Tamantildeo de plaacutentulas 36 24 37 47 29 46
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 61 43 76
Sustratos 53 36 56 43 29 51
Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 46 27 49
Significa que hay diferencias significativas al 95 Test de Dunn
25
Las variables no parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en hojas finales y raiacuteces iniciales en sus rangos de distribucioacuten Las raiacuteces finales no presentaron diferencias seguacuten el sustrato utilizado pero de acuerdo al tamantildeo hubo diferencias en su distribucioacuten
CUADRO 3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas
Variables Altura final de plaacutentulas
(cm) Sobrevivencia
Tamantildeo de plaacutentulas
36 c 567 b 47 b 821 a
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 59 a 908 a
Sustratos 52 a 933 a
41 ab 59 b Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 49 b 772 a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY Las variables parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en altura final de hojas y en sobrevivencia 41 Nuacutemero de hojas finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentulas y de sustratos para la variable nuacutemero final de hojas 411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula Seguacuten el Cuadro 2 y Figura 4 las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero final de hojas Las plaacutentulas pequentildeas de 1-2 cm obtuvieron el nuacutemero maacutes bajo de hojas finales con una media de 36 hojas por plaacutentula lo cual es la mitad de las hojas finales que se obtuvo con las plaacutentulas de mayor tamantildeo (61 hojas aproximado por plaacutentula) Para las plaacutentulas medianas de 2-3 cm se obtuvo una media de 47 hojas por plaacutentula (Figura 4)
26
Hojas finales
1-2 cm 2-3cm maacutes de 3 cm0
5
10
15
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn)
BLANCO (2006) sentildeala que plaacutentulas cultivadas in vitro crecen bajo condiciones especiales como alta humedad relativa y baja luminosidad ademaacutes son suplidas con sacarosa Estas condiciones fueron proporcionadas en una caacutemara de crecimiento en el laboratorio donde las plantas micropropagadas no son dependientes por completo de su fotosiacutentesis son heteroacutetrofas Parece ser necesario un estiacutemulo para convertirse en organismos totalmente capaces de sustentar sus propios requisitos de carbono y nitroacutegeno reducido pasando de esta manera a ser autoacutetrofos
Al ser sacadas de un medio in vitro las hojas no estaacuten preparadas para producir su propio alimento y sobreviven gracias a que el medio de cultivo le proporciona los nutrientes necesarios para vivir En este punto muchas de las hojas mueren y nacen hojas nuevas capaces de generar su alimento supliendo asiacute las hojas viejas (SEELYE et al 2003) En este ensayo las plaacutentulas de Chloraea virescens presentaron en general una buena adaptacioacuten al ser sacadas de un medio in vitro
Se observoacute que plaacutentulas con menor tamantildeo al ser aclimatadas y tener menor tejido fue maacutes difiacutecil y maacutes lento que empezaran a generar nuevos tejidos y materia orgaacutenica a partir de dioacutexido de carbono POSPIacuteŠILOVAacute et al (1999) sentildeala que al tener los estomas con desarrollo incompleto maacutes grandes y de forma maacutes redonda pierden maacutes agua lo cual puede provocar una peacuterdida de hojas muriendo asiacute la plaacutentula Por esta razoacuten las plaacutentulas pequentildeas se demoran maacutes tiempo en generar hojas nuevas es por ello que al finalizar este estudio muestran el menor nuacutemero final de hojas 412 Efecto del tipo de sustrato Al analizar la influencia del tipo de sustrato se encontraron diferencias significativas entre los tres sustratos utilizados Seguacuten el Cuadro 2 y la Figura 5 el sustrato donde se obtuvo mejores resultados fue
27
turba+perlita en el cual se observoacute un promedio de 53 hojas por plaacutentula siendo Sphagnum el maacutes bajo con 43 hojas por plaacutentula De acuerdo a los resultados del anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados el sustrato turba+perlita tiene mayor cantidad de nitroacutegeno foacutesforo calcio magnesio y azufre disponible comparativamente con los otros dos sustratos (Sphagnum y arena+turba) (Anexo 2)
Hojas finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
Sustratos
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) Para la brotacioacuten y el crecimiento de las plantas se necesita agua y Nitroacutegeno lo que favorece a una mayor tasa de aparicioacuten de hojas lo que se traduce en una mayor cantidad de hojas finales El Nitroacutegeno se encuentra en mayor cantidad en el sustrato turba+perlita debido a lo cual los mejores resultados se obtienen en dicho sustrato 413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Despueacutes de analizados los efectos individuales del tamantildeo y del sustrato al interactuar ambos factores existen diferencias significativas La mejor interaccioacuten se obtuvo con el sustrato turba+perlita y con el mayor tamantildeo de la plaacutentula (Figura 6) Debido a la buena estructura (porosa) de dicho sustrato se podriacutea decir que se favorecioacute la absorcioacuten radicular de nutrientes obteniendo por ello un mayor nuacutemero de hojas finales Para los menores tamantildeos no se observan diferencias significativas obteniendo como promedio 41 hojas por plaacutentula Para el mayor tamantildeo el promedio fue de 6 hojas por plaacutentula
28
Hojas finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 42 Raiacuteces iniciales Este paraacutemetro se evaluoacute luego de la primera etapa de aclimatacioacuten la cual se realizoacute en una sala de aclimatacioacuten del laboratorio Se analizoacute la influencia de diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos sobre la variable nuacutemero raiacuteces iniciales (Anaacutelisis de Kruskal-Wallis en Anexo 7)
FIGURA 7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses de pre aclimatacioacuten
29
En la Figura 7 se puede observar los resultados de pre aclimatacioacuten en sala de laboratorio En esta etapa ya es posible ver la presencia de raiacuteces desarrolladas 421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula En el Cuadro 2 se puede observar que las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero inicial de raiacuteces y en la Figura 8 se puede comprobar que para los dos tamantildeos de plaacutentula maacutes pequentildeos no se observa gran cantidad de raiacuteces esto no impidioacute el desarrollo posterior de las plaacutentulas las cuales lograron enraizar al final del estudio Esto se contrapone a lo observado en un estudio de Lapageria rosea donde la presencia de raiacutez y brote para lograr una multiplicacioacuten exitosa de plantas es de vital importancia Incluso algunas plaacutentulas de L rosea no brotan en condiciones in vitro en donde tienen las mejores condiciones nutricionales y hormonales para hacerlo Esto se debe a factores internos de la plaacutentula siendo muy difiacutecil que broten inmediatamente en caacutemara de aclimatacioacuten donde ya dejan de recibir los nutrientes necesarios de manera directa y requieren de balances de energiacutea para poder seguir elongando raiacuteces absorber nutrientes y brotar para poder obtener los carbohidratos necesarios para seguir su crecimiento (BLANCO 2006) El tamantildeo de plaacutentula tiene importancia para el desarrollo de raiacuteces se distingue notoriamente que en los tamantildeos maacutes grandes el nuacutemero de raiacuteces es mayor comparativamente con los tamantildeos pequentildeos donde el nuacutemero de raiacuteces fue escaso Debido a la presencia de maacutes hojas existe una mayor cantidad de aacuterea fotosinteacutetica esta situacioacuten estimula el crecimiento de las raiacuteces para la obtencioacuten de agua y nutrientes
Raices iniciales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
2
4
6
8
10
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o inicial de ra
iacuteces
FIGURA 8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn)
30
422 Efecto del tipo de sustrato Para el sustrato turba+perlita se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas en el nuacutemero de raiacuteces con respecto a los dos otros sustratos esto se puede ver en el Figura 9 donde se observa que se obtuvieron los mayores resultados En cualquier medio de crecimiento el espacio no ocupado por un soacutelido se llama porosidad este espacio puede ser ocupado en parte para retener agua y en parte para proporcionarle aire a las raiacuteces La ausencia de uno de estos elementos es perjudicial para las plantas La turba es conocida por tener estas propiedades y la perlita tambieacuten por esta razoacuten se sabe que la mezcla turba-perlita provee propiedades fiacutesicas excelentes como medio de crecimiento y propagacioacuten (INFOAGRO 2007) Estos resultados con turba-perlita (298 de materia orgaacutenica) coinciden con los obtenidos por DIAZ et al (2004) quienes al utilizar un sustrato compuesto por 100 de humus de lombriz para aclimatar cantildea de azuacutecar obtuvieron el mayor nuacutemero de raiacuteces Esto puede atribuirse al importante aporte de materia orgaacutenica del humus (47) lo que le confiere una mejor estructura obtenieacutendose una excelente porosidad del sustrato La aireacioacuten del suelo es necesaria para favorecer la maacutexima absorcioacuten de nutrientes por las raiacuteces Esto tambieacuten sucede en el sustrato turba+perlita el cual posee la mayor cantidad de materia orgaacutenica de los tres sustratos utilizados
Raices iniciales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
2
4
6
8
10
Sustratos
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato En los anaacutelisis para la variable nuacutemero de raiacuteces se puede decir que la mejor interaccioacuten se presentoacute para el sustrato de turba+perlita junto con el mayor tamantildeo de plaacutentulas obteniendo los valores maacutes altos entre los nueve tratamientos La presencia de raiacuteces luego de la micropropagacioacuten aumenta la posibilidad de eacutexito en el transplante ya que se crea un favorable balance de agua Pero esto no quiere
31
decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
10
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
32
En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
33
El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
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Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
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Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
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5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
A mis papaacutes por su carintildeo y apoyo incondicional
A mis hermanos por estar conmigo
A Claudia y Camila por su paciencia preocupacioacuten y ayuda y
a todos los que compartieron conmigo esta experiencia
I
INDICE DE MATERIAS
Capiacutetulo Paacutegina
RESUMEN 1
REacuteSUMEacute 2
1 INTRODUCCION 3
2 REVISION BIBLIOGRAFICA 4
21 Descripcioacuten general 4
211 Descripcioacuten geograacutefica 4
212 Formas de vida 4
213 Descripcioacuten morfoloacutegica 4
214 Geacuteneros y especies chilenas 5
2141 Chloraea virescens 6
22 Requerimientos de las orquiacutedeas 7
221 Agua 7
222 Luz 8
223 Fertilizacioacuten 8
224 Temperatura 8
23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas 9
231 Biologiacutea de las semillas 9
232 Germinacioacuten simbioacutetica y no simbioacutetica de semillas 9
233 Condiciones de esterilidad 9
2331 Siembra de las semillas 10
234 Transplante 10
24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas 11
241 Orquiacutedeas terrestres 11
2411 Cypripedium 11
2412 Preservacioacuten in vitro de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes 12
2413 Longevidad de semillas de orquiacutedeas terrestres 12
2414 Sobrevivencia de orquiacutedeas terrestres transplantadas a sectores
urbanos 13
II
2415 Micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres 13
242 Orquiacutedeas epiacutefitas 14
2421 Preservacioacuten de Cattleya walkeriana usando propagacioacuten in vitro 14
2422 Establecimiento de cultivos in vitro y micropropagacioacuten de Cattleya
aurantiaca (Bateman ex Lindl) 14
2423 Establecimiento in vitro y regeneracioacuten de plantas de Laelia autumnales
(Llave y Lex) Lindl 15
25 Aclimatacioacuten 16
251 Stress de agua 16
2511 Cutiacutecula 16
2512 Estomas 17
252 Humedad 17
253 Luz 17
254 Temperatura 17
255 Fotosiacutentesis 18
256 Sustrato 18
3 MATERIAL Y METODO 20
31 Material 20
311 Material vegetal 20
312 Material de laboratorio 20
32 Meacutetodo 20
321 Preparacioacuten del medio de cultivo 20
322 Obtencioacuten del material vegetal 20
323 Sustratos 21
324 Plantacioacuten 21
325 Disentildeo de los ensayos 21
326 Disentildeo experimental 22
327 Paraacutemetros a evaluar 22
328 Anaacutelisis estadiacutestico 22
III
4 PRESENTACIOacuteN Y DISCUSION DE RESULTADOS 24
41 Nuacutemero de hojas finales 25
411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula 25
412 Efecto del tipo de sustrato 26
413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato 27
42 Raiacuteces iniciales 28
421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula 29
422 Efecto del tipo de sustrato 30
423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato 30
43 Raiacuteces finales 31
431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula 32
432 Efecto del tipo de sustrato 32
433 Interaccioacuten tamantildeo de plaacutentula y sustrato 33
44 Altura 35
45 Sobrevivencia 36
5 CONCLUSIONES 38
6 BIBLIOGRAFIA 39
7 ANEXOS 42
IV
INDICE DE CUADROS
Cuadro Paacutegina
1 Composicioacuten de solucioacuten nutritiva Hoagland 21
2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de
raiacuteces inicial y final 24
3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas 25
V
INDICE DE FIGURAS
Figura Paacutegina
1 C virescens 7
2 Plaacutentulas de C virescens en caacutemara de crecimiento in vitro 20
3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS
B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten 24
4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) 26
5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final
de hojas (Test de Dunn) 27
6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 28
7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses
de pre aclimatacioacuten 28
8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 29
9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final
de raiacuteces (Test de Dunn) 30
10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no
parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 31
11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses
de aclimatacioacuten 31
12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 32
13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final
de raiacuteces (Test de Dunn) 33
14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre para la variable no
parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 34
15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) 35
VI
16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable
parameacutetrica altura final de plaacutentulas 35
17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) 37
18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la
variable parameacutetrica de sobrevivencia 37
VII
INDICE DE ANEXOS
Anexo Paacutegina
1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962)
y suplementos orgaacutenicos 44
2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio 45
3 Registro de temperaturas miacutenimas maacutexima y promedio durante
el estudio 46
4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas
finales 47
5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales 47
6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces
iniciales 48
7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces
iniciales 48
8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces
finales 49
9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales 49
10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en
aclimatacioacuten 50
11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura 50
12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de
plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten 51
13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia 51
14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea 52
1
RESUMEN Dentro del esquema de micropropagacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens la aclimatacioacuten es la etapa final donde la manipulacioacuten debe ser muy cuidadosa ya que es donde se produce el mayor iacutendice de mortandad principalmente en el proceso de trasplante Esta etapa es muy importante ya que gracias a ella se veraacute la eficiencia del proceso y la calidad final de las plantas producidas in vitro por eso el objetivo general de este trabajo es evaluar la influencia del tamantildeo de plaacutentulas y utilizacioacuten de distintos sustratos en la aclimatacioacuten ex vitro de plaacutentulas de C virescens Se utilizaron plaacutentulas de Chloraea virescens obtenidas a partir de la micropropagacioacuten de protocormos provenientes de germinacioacuten asimbioacuteticas de semillas efectuada en el laboratorio de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal de la Universidad Austral de Chile Las plaacutentulas fueron repicadas hasta obtener el nuacutemero adecuado para el ensayo Luego fueron trasladadas a una sala del laboratorio en macetas de seis ocho y diez plaacutentulas dependiendo del tamantildeo de la plaacutentula (maacutes de 3cm 2-3cm y 1-2cm respectivamente) por dos meses posteriormente fueron transferidas a 3 sustratos turba+perlita (11) Sphagnum y turba+arena (11) y fueron llevadas a invernadero durante cuatro meses Las variables evaluadas fueron nuacutemero final de hojas nuacutemero inicial y final de raiacuteces altura y sobrevivencia de las plaacutentulas Los resultados obtenidos demostraron que los tamantildeos y los sustratos ocupados influyen en el crecimiento de las plaacutentulas El mejor tamantildeo para la aclimatacioacuten es de maacutes de 3cm obteniendo con eacuteste los mejores resultados en todas las variables evaluadas Lo mismo ocurrioacute con el sustrato turba+perlita el cual fue el mejor evaluado
2
REacuteSUMEacute Dans le scheacutema de la micropropagation de Chloraea virescens lacclimatation est la derniegravere eacutetape ougrave il faut ecirctre prudent parce que cest agrave ce moment lagrave que les taux de mortaliteacute sont les plus eacuteleveacutes principalement dans le processus de transplantation Cette eacutetape est tregraves importante parce que ce sera gracircce agrave elle quacuteon verra lefficaciteacute du processus et la qualiteacute finale des plantes produites in vitro Lobjectif geacuteneacuteral de cette eacutetude est dacuteeacutevaluer linfluence de la taille des plantes et lutilisation de divers substrats pour lacuteacclimatation de C virescens On a utiliseacute des plantes de C virescens obtenue a partir de la micropropagation de protocormos en provenance du laboratoire de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal de la Universidad Austral de Chile Les plantes ont eacuteteacute subdiviseacutee pour obtenir le nombre approprieacute Elles ont ensuite eacuteteacute transfeacutereacutees agrave des pots dans une piegravece du laboratoire de six huit et dix en fonction de la taille de la plante (plus de 3 cm de 2-3 cm et 1-2 cm respectivement) pour deux mois ensuite elles ont eacuteteacute transfeacutereacutee dans trois substrats tourbe + perlite (11) Sphagnum et tourbe + sable (11) et elles ont eacuteteacute mises dans une serre pour quatre mois Les variables agrave eacutevaluer sont nombre final de feuilles nombre de racines au deacutebut et agrave la fin la hauteur et la survie des plantes Les reacutesultats ont montreacute que la taille et les substrats utiliseacutes ont une influence sur la croissance des jeunes plantes La taille ideacuteale pour lacclimatation est plus de 3cm avec cette derniegravere on a obtenu les meilleurs reacutesultats dans toutes les variables qui ont eacuteteacute eacutevalueacutees Le mecircme reacutesultat sest produit avec le substrat de tourbe + perlite lequel a aussi montreacute les meilleurs reacutesultats
3
1 INTRODUCCION La familia Orchidaceae (Orquiacutedeas) es la que mayor nuacutemero de especies comprende en el Reino Vegetal Se estima que debe haber alrededor de 35000 especies de Orquiacutedeas en todo el mundo pertenecientes a unos 750 geacuteneros ademaacutes de miles de hiacutebridos En Chile esta familia es probablemente el grupo menos estudiado de plantas con flores y soacutelo se han realizado estudios en base a su taxonomiacutea biologiacutea reproductiva fenologiacutea y distribucioacuten
La produccioacuten de flores de orquiacutedeas ha tomado importancia por la belleza de sus flores dada la enorme variedad de formas colores y perfumes Existen orquiacutedeas terrestres y epiacutefitas estas uacuteltimas representan maacutes del 90 del total de especies y son las que mayoritariamente se encuentran a la venta Las flores tienen un alto valor ornamental o como flor cortada ya que eacutestas pueden permanecer separadas de las plantas sin marchitarse hasta tres o cuatro semanas y en la planta permanecen hasta tres meses
La obtencioacuten de plantas de orquiacutedeas a partir de semillas es muy difiacutecil ya que eacutestas son diminutas y de germinacioacuten irregular Como una alternativa de obtencioacuten de plantas aparece la micropropagacioacuten pudiendo asiacute aumentar el nuacutemero de plantas en forma relativamente faacutecil y raacutepida Luego de la etapa de micropropagacioacuten viene la etapa de aclimatacioacuten en la cual la manipulacioacuten debe ser en extremo cuidadosa ya que es donde se produce el mayor iacutendice de mortandad principalmente en el proceso de transplante Esta etapa es muy importante ya que gracias a ella se veraacute la eficiencia del proceso y la calidad final de las plantas producidas in vitro Considerando la produccioacuten de plaacutentulas mediante la micropropagacioacuten en este trabajo se plantea la hipoacutetesis que ldquoel tamantildeo de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro y los distintos sustratos son factores que inciden en el desarrollo y su aclimatacioacutenrdquo El objetivo general de este trabajo es
Evaluar la influencia del tamantildeo de plaacutentulas y utilizacioacuten de distintos sustratos en la aclimatacioacuten ex vitro de plaacutentulas de C virescens
Los objetivos especiacuteficos son
Medir el efecto del tamantildeo de plaacutentulas de C virescens en la sobrevivencia y desarrollo de eacutestas ex vitro
Comparar el uso de tres sustratos en el desarrollo y sobrevivencia de plaacutentulas de C virescens
4
2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA 21 Descripcioacuten general 211 Descripcioacuten geograacutefica Las orquiacutedeas pertenecen a la familia Orchidaceae clase Liliopsida (monocotiledoacuteneas) Son plantas herbaacuteceas perennes originarias de regiones tropicales y subtropicales pero existen tambieacuten en todos los continentes a excepcioacuten de las regiones polares La zona donde se encuentran estas plantas estaacute comprendida entre los 68ordm latitud norte y 56ordm latitud sur Es evidente que en los liacutemites extremos de estas latitudes se encuentran pocos geacuteneros y especies esto va en aumento desde las regiones temperadas hasta las regiones intertropicales donde el nuacutemero es el mayor Los territorios maacutes interesantes por su nuacutemero son
Ameacuterica del Sur y Ameacuterica Central Asia e India Madagascar Australia es el continente menos poblado en orquiacutedeas dentro de las regiones
del globo Por su parte Europa presenta numerosos geacuteneros y especies de orquiacutedeas
terrestres Soacutelo en Francia existen 75 especies repartidas en 16 geacuteneros todas terrestres (LECOUFLE y ROSE 1956)
212 Formas de vida Las zonas donde crecen estas plantas influyen sobre su manera de vivir Algunas orquiacutedeas son terrestres y se encuentran representadas en todas las regiones Tambieacuten existen las epiacutefitas (vegetal que fijado a otro no obtiene de eacuteste su alimento) En este caso se necesita que el grado higromeacutetrico y la temperatura permitan este tipo de adaptacioacuten Ademaacutes existen las orquiacutedeas litofiacuteticas que viven sobre rocas Las raiacuteces de las epiacutefitas y litofiacuteticas estaacuten adaptadas a vivir expuestas al aire o inmersas en materia orgaacutenica ya que tienen un tejido acumulador de agua llamado velo En zonas friacuteas y templado friacuteas todas las orquiacutedeas son terrestres En zonas subtropicales o tropicales la gran mayoriacutea es epiacutefita Otra particularidad debida seguramente a la influencia de estas zonas es la floracioacuten Es en las zonas tropicales y subtropicales que se dan los mayores tamantildeos de flores asiacute como tambieacuten la mayor variedad de colores (LECOUFLE y ROSE 1956)
213 Descripcioacuten morfoloacutegica Las orquiacutedeas se caracterizan por poseer flores muy vistosas hermafroditas (ambos sexos en la misma flor) zigomorfas (con un solo plano de simetriacutea) triacutemeras (tres seacutepalos y tres peacutetalos) y una columna central que sustenta las estructuras reproductivas masculinas anteras y femeninas pistilo llamada ginostemo El peacutetalo inferior se llama labelo y su morfologiacutea define a los distintos geacuteneros de orquiacutedeas Las flores pueden ser aisladas o en inflorescencia y son polinizadas por insectos El polen se encuentra aglomerado formando una masa llamada polinio el que tiene un extremo con un ensanchamiento glandular pegajoso que sirve para que el
5
polinio se adhiera al cuerpo del insecto polinizador El fruto es una caacutepsula seca con muchas semillas pequentildeas sin endosperma y con embrioacuten no diferenciado Tienen dos tipos baacutesicos de crecimiento Simpodial en las que el nuevo crecimiento se produce en sentido horizontal a partir de un tallo subterraacuteneo o rizoma generando una sub-unidad capaz de producir una flor o inflorescencia y de ser eventualmente separada de la planta (ej Cattleya) Monopodial en las que el nuevo crecimiento se produce en sentido vertical con lo cual la planta crece constantemente en altura (ej Phalaenopsis) (ORQUIDEAS 2007) 214 Geacuteneros y especies chilenas Seguacuten NOVOA et al (2006) en la familia Orchidaceae se encuentran 49 especies de flora nativa dentro de las cuales se encuentra Chloraea virescens (Willd) Lindl Los geacuteneros de Orchidaceae en Chile son 7
- Aa Bipinnula Brachystele Codonorchis Chloraea Gavilea y Habenaria
Dentro del geacutenero Chloraea existen 31 especies - Chloraea alpina Poepp - Chloraea barbata Lindl - Chloraea bidendata (Poepp y Endl) Correa - Chloraea bletioides Lindl - Chloraea cuneata Lindl - Chloraea chica Speg - Chloraea chrysantha Poepp - Chloraea crispa Lindl - Chloraea cristata Lindl - Chloraea cylindrostachya Poepp - Chloraea disoides Lindl - Chloraea galeata Lindl - Chloraea gaudichaudii Brongn - Chloraea gavilu Lindl - Chloraea grandiflora Lindl - Chloraea heteroglossa Rchbf - Chloraea incisa Poepp - Chloraea lamellata Lindl - Chloraea lechleri Lindl - Chloraea leptopetala Reiche - Chloraea longipetala Lindl - Chloraea magellanica Hookf - Chloraea multiflora Lindl - Chloraea nudilabia Lindl - Chloraea philippii Reichbf - Chloraea picta Phil - Chloraea prodigiosa Reichbf - Chloraea speciosa Poepp - Chloraea virescens Lindl - Chloraea viridiflora Poepp
6
- Chloraea volkmanni Phil (NOVOA et al 2006) 2141 Chloraea virescens Planta perenne de 40-90 cm de altura Sus hojas son de 5-12cm de largo por 15-25cm de ancho estrechas lanceoladas agudas dispuestas en roseta basal generalmente marchitas al final de la antesis Su escapo floral tiene vainas caulinares lanceoladas agudas y distantes La inflorescencia es de 8-20cm de largo densa con 10-15 flores erguidas Sus flores son blancas con estriacuteas y aacutepices verdes El seacutepalo dorsal es de 16-33mm de largo por 4-6mm de ancho oblongo lanceolado obtuso algo coacutencavo a veces ligeramente estrechado al centro aacutepice algo carnoso Los seacutepalos laterales de 18-33mm de largo por 4-5mm de ancho son ensiformes con aacutepice obtuso engrosado verde negruzco a veces espatulado y dentado a veces verrugoso Los peacutetalos son de 15-23mm de largo por 5-58mm de ancho estrechamente aovados obtusos verrugosos con maacutes frecuencia solo la mitad inferior a veces el borde denticulado y carnoso El labelo de 15-26mm de largo por 10-20mm de ancho es mas o menos romboidal a levemente trilobulado El loacutebulo central tiene 5-7 nervios longitudinales recorridos por laminillas interrumpidas membranaacuteceas con segmentos falciformes de borde carnoso de color verde Los nervios laterales que se ramifican oblicuamente hacia el aacutepice en los loacutebulos laterales tienen pequentildeas laminillas y verrugas y su borde es laciniado inciso en la mitad apical hacia la base denticulado aacutepice generalmente engrosado La columna es de 12-18mm de largo delgada blanca con estriacuteas anaranjada La base de la zona nectariacutefera tiene un color amarillo-limoacuten con maacuteculas anaranjadas orificio nectario verde El ala de la columna es recta y estrecha El estigma es triangular y globoso La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la Vordf (Vintildea del Mar) hasta la XIordf Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile Sin embargo es posible que tenga una distribucioacuten maacutes restringida por que se le ha confundido con Chloraea incisa Su floracioacuten es desde noviembre a febrero y su estado de conservacioacuten no estaacute evaluado (NOVOA et al 2006) En el Anexo 14 se incluyen antecedentes sobre su distribucioacuten y eacutepoca de floracioacuten
7
FIGURA 1 Chloraea virescens FUENTE NOVOA et al (2006) 22 Requerimientos de las orquiacutedeas Para tener eacutexito en el cultivo de orquiacutedeas hay que tomar en cuenta factores de importancia como son 221 Agua El riego correcto es el principio y el fin del cuidado de orquiacutedeas (ROLLKE 2005) Este elemento es primordial para las orquiacutedeas asiacute como tambieacuten para todo tipo de plantas En el caso de eacutestas se dice muchas veces que la calidad del agua usada es el factor maacutes importante en el cultivo de orquiacutedeas ya que el porcentaje maacutes alto de muerte se produce por el exceso de este factor (SHEEHAN 1980) Hay que tomar en cuenta que la mayoriacutea de las orquiacutedeas son epiacutefitas lo que significa que tienen sus raiacuteces a la vista gracias a las cuales absorben el agua de lluvia Se recomienda un sustrato poroso y de reaccioacuten neutra ya que de esta manera el agua escurre sin acumularse no permitiendo la pudricioacuten de las raiacuteces Para las orquiacutedeas terrestres es lo mismo solo que se pueden regar con maacutes frecuencia pero sin mantenerlas saturadas (OSPINA y DRESSLER 1979) Seguacuten DUMOIS (2007) el agua es lo maacutes difiacutecil de controlar ya que depende de muchas variables como por ejemplo humedad relativa tipo de sustrato intensidad luminosa temperatura y circulacioacuten de aire Ademaacutes muchas orquiacutedeas necesitan un periacuteodo de receso vegetativo que si no es respetado resulta en ausencia de floracioacuten En general hay que antildeadir agua en abundancia cuando la planta se encuentra en crecimiento activo y reducirla despueacutes de la floracioacuten
8
Las especies con pseudobulbos almacenan agua y estaacuten preparadas para su periacuteodo de receso Otras que no cuentan con estos oacuterganos requieren de humedad maacutes constante 222 Luz Ninguna planta puede crecer sin la iluminacioacuten adecuada Muchas orquiacutedeas viven en las alturas de los aacuterboles y estaacuten expuestas a plena luz del sol otras crecen en el suelo selvaacutetico protegidas del sol por espesos follajes (ROLLKE 2005) La funcioacuten principal de la luz es activar el proceso de fotosiacutentesis Los cultivadores han estudiado la luz y han descubierto que hay orquiacutedeas que florecen con diacutea largo y otras con diacutea corto (OSPINA y DRESSLER 1979) Gracias a la fotosiacutentesis se convierten los minerales presentes en el ambiente en savia y nutrientes Hojas oscuras y falta de floracioacuten indican falta de luz hojas amarillas e incluso quemadas apuntan hacia un exceso de sol (DUMOIS 2007) 223 Fertilizacioacuten Las orquiacutedeas necesitan los mismos nutrientes que otras plantas Un abono para orquiacutedeas debe contener los nutrientes principales nitroacutegeno (N) foacutesforo (P) y potasio (K) asiacute como tambieacuten oligoelementos como hierro (Fe) magnesio (Mg) zinc (Zn) estantildeo (Sn) y manganeso (Mn) (ROLLKE 2005) Por otra parte la fertilizacioacuten depende de varios factores dentro de los cuales los maacutes criacuteticos son
- El medio utilizado - La edad de las plantas - Estado de las plantas ya sea floracioacuten crecimiento reposo
En cuanto a absorcioacuten se ha demostrado que es igual de eficiente por viacutea foliar como a traveacutes de las raiacuteces Es necesario tener en cuenta algunas reglas baacutesicas a la hora de fertilizar las orquiacutedeas (Asociacioacuten Costarricense de Orquideologiacutea ACO 1970)
1 Regar las plantas antes de fertilizar 2 Fraccionar las dosis 3 Aplicar el fertilizante de forma liacutequida 4 No usar fertilizantes soacutelidos 5 No fertilizar las plantas recieacuten plantadas 6 No fertilizar plantas en reposo 7 No abonar plantas enfermas
224 Temperatura Es conocido el hecho de que cada planta tiene liacutemites de temperatura dentro de los cuales prospera o perece De ahiacute la necesidad de conocer las temperaturas correspondientes al lugar de donde viene cada especie de orquiacutedea pudiendo proporcionarle la temperatura adecuada (OSPINA y DRESSLER 1979) Se puede clasificar a las orquiacutedeas como de clima caacutelido (temperatura nocturna miacutenima de 20ordmC) templado (miacutenimo de 13 a 18ordmC) y de ambiente friacuteo (de 10 a 13ordmC) (DUMOIS 2007)
9
Seguacuten SHEEHAN (1980) las temperaturas ideales para las orquiacutedeas de origen tropical son 10ordmC en la noche y entre 21ordm - 24ordmC durante el diacutea 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas La micropropagacioacuten de orquiacutedeas estaacute en vanguardia hoy en diacutea El estudio de cultivo de tejido de orquiacutedeas se lleva a cabo en muchos laboratorios de todo el mundo (ARDITTI and ERNST 1992) 231 Biologiacutea de las semillas Las semillas de orquiacutedeas son conocidas usualmente como semillas polvo porque son minuacutesculas y contienen pocas reservas de alimento Estas semillas por lo general no germinan en el medio natural a menos que sean infectadas por un hongo micorriacutezico Este hongo abastece a las plantas joacutevenes con azuacutecares y nutrientes hasta que sean lo suficientemente grandes para fabricar su propio alimento Cuando la semilla germina produce una masa indiferenciada de ceacutelulas llamada protocormo Manteniendo las condiciones normales el protocormo continuaraacute su crecimiento por varias semanas meses o incluso antildeos dependiendo de la especie hasta que alcance la edad apropiada para producir raiacuteces y hojas En el caso de orquiacutedeas terrestres es de vital importancia que la relacioacuten orquiacutedea-hongo se conserve durante los estados tempranos del ciclo de vida de la planta ya que el protocormo enterrado no puede fabricar alimento por siacute mismo Por otro lado los protocormos de las orquiacutedeas epiacutefitas son comuacutenmente verdes lo que les posibilita producir parte de su alimento La relacioacuten orquiacutedea-hongo no ha sido en su totalidad investigada para el caso de las orquiacutedeas tropicales (McKENDRICK 2000) 232 Germinacioacuten simbioacutetica y no simbioacutetica de semillas Mediante la germinacioacuten in vitro las semillas germinan en frascos de vidrio o plaacutestico Estos frascos contienen en su interior un medio nutritivo solidificado con agar con todos los azuacutecares y minerales necesarios para la germinacioacuten y crecimiento de las semillas Hay dos tipos de germinacioacuten la simbioacutetica y la asimbioacutetica En la germinacioacuten simbioacutetica las semillas se siembran junto con una pequentildea cantidad del hongo micorriza adecuado Dicho hongo crece en el medio coloniza a las semillas que estaacuten en proceso de germinacioacuten y se produce una relacioacuten simbioacutetica la cual alimentaraacute al protocormo hasta que este sea capaz de producir sus hojas y se vuelva autotroacutefico Esta teacutecnica es usada principalmente en propagacioacuten de orquiacutedeas terrestres en zonas templadas La germinacioacuten asimbioacutetica se usa principalmente en propagacioacuten de orquiacutedeas tropicales que crecen maacutes raacutepido que sus parientes de zonas templadas Para este tipo de germinacioacuten se necesita un medio de cultivo maacutes complejo ya que todos los nutrientes orgaacutenicos e inorgaacutenicos asiacute como tambieacuten los azuacutecares deben estar en forma disponible pues no existe la intermediacioacuten del hongo (McKENDRICK 2000) 233 Condiciones de esterilidad Tanto para la germinacioacuten simbioacutetica como para la asimbioacutetica es de vital importancia que los frascos las semillas aparatos y el medio esteacuten esteacuteriles desde el principio del proceso Esto debido a que cualquier hongo o bacteria que se introduzca creceraacute maacutes raacutepido que las semillas ocupando su espacio hasta matarlas Esto se evita gracias al autoclave el cual regulado a 12 atm y 120ordmC por 20 minutos mata hongos o bacterias presentes en el medio (McKENDRICK 2000)
10
2331 Siembra de las semillas Las semillas pueden ser recolectadas desde caacutepsulas verdes o maduras La caacutepsula verde que estaacute madurando estaacute llena de semillas y no se deforma cuando se aprieta con las pinzas Estas semillas pueden ser almacenadas por algunas semanas en un lugar refrigerado con bastante aireacioacuten Las semillas se pueden sembrar a partir de caacutepsulas verdes o semillas secas A continuacioacuten se muestran las ventajas y desventajas de ambos meacutetodos
- Siembra a partir de caacutepsulas verdes Si las caacutepsulas se mantienen intactas el interior (las semillas) se mantiene esteacuteril Por lo tanto si se esteriliza la parte exterior de las mismas donde hongos y bacterias pueden desarrollarse y se abren las caacutepsulas bajo condiciones esteacuteriles y las semillas podraacuten mantenerse desinfectadas
La ventaja de este meacutetodo es que no se requiere de esterilizacioacuten de las semillas lo que provoca su deterioro Otro punto a favor es que algunas semillas podriacutean germinar maacutes raacutepido que las provenientes de caacutepsulas maduras por los mecanismos de dormancia La desventaja es que en este caso todas las semillas deben ser utilizadas o eliminadas mientras que las semillas maduras se pueden almacenar Tambieacuten se debe considerar que las semillas sembradas a partir de caacutepsulas que no han madurado lo suficiente podriacutean germinar lentamente o simplemente no germinar - Siembra a partir de semillas secas En este caso una vez que la caacutepsula es abierta las semillas dejan de ser esteacuteriles y requieren de un proceso de esterilizacioacuten Comuacutenmente se utiliza una solucioacuten de hipoclorito de sodio hipoclorito de calcio o peroacutexido de hidroacutegeno Las semillas se agitan dentro de la solucioacuten que ademaacutes contiene una gota de detergente para ldquohumedecerlasrdquo luego se las enjuaga con agua destilada y se las siembra en el medio preparado La ventaja de este meacutetodo es que las semillas pueden ser colectadas secadas al aire almacenadas por varios meses en el refrigerador y utilizarlas cuando sea necesario Se debe considerar que la siembra ya sea de caacutepsulas verdes o de semillas secas estaacute determinado por la eacutepoca en que se colectan (McKENDRICK 2000) 234 Trasplante En la caacutemara de incubacioacuten las plaacutentulas se han desarrollado en condiciones limpias y en un ambiente cerrado por lo que deben acostumbrase gradualmente al ambiente exterior antes de ser trasplantadas a las macetas Tambieacuten la temperatura y la luz la cual es baja han sido constantes durante el cultivo in vitro En el medio natural la temperatura y la luz variacutean constantemente por lo que las nuevas plantas deben estar protegidas de la fuerte luz solar la cual puede quemar las hojas con soacutelo una pequentildea cantidad de eacutesta La humedad en los frascos es alta y las plantas estaacuten protegidas de ataques por hongos o bacterias Ademaacutes las plaacutentulas han crecido bajo condiciones de alta humedad y por lo tanto tendraacuten cutiacuteculas deacutebiles por lo que necesitan acostumbrase a medios menos huacutemedos antes de ser transplantadas
11
Para el trasplante se deben colocar los frascos en un lugar protegido de la lluvia para que se aclimaticen a las nuevas condiciones de luz y temperatura Se deben dejar por 2 a 4 semanas en los frascos tapados Luego se debe ir aflojando las tapas para dejar entrar pequentildeas cantidades de aire hasta el punto de dejarlas descubiertas Se debe revisar si hay hojas marchitas y ver que el sustrato esteacute huacutemedo
Lo ideal es dejarlas sin tapa durante una semana antes de pasarlas a las macetas Para el trasplante se debe elegir un sustrato adecuado para el tipo de planta humedecerlo y transplantar las plantas con cuidado de no dantildear las raiacuteces y evitando la deshidratacioacuten En esta etapa tambieacuten se debe dejar las macetas selladas para evitar una raacutepida deshidratacioacuten e ir abrieacutendolas paulatinamente (McKENDRICK 2000)
24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas 241 Orquiacutedeas terrestres 2411 Cypripedium Esta es una orquiacutedea terrestre de zonas templadas se desarrolla en el Hemisferio Norte como por ejemplo en Guatemala y en Honduras pero donde se encuentra principalmente es en China Su forma maacutes comuacuten de propagacioacuten es in vitro a partir de semillas La forma maacutes eficiente es a partir de semillas inmaduras Existe un intervalo de tiempo entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten eacuteste dependeraacute de la especie y de la zona donde se desarrolle Se asume que existen aproximadamente cuatro semanas entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten El oacuteptimo para una buena germinacioacuten de Cypripedium es entre 42 y 60 diacuteas despueacutes de la polinizacioacuten y entre 14 y 32 diacuteas despueacutes de la fertilizacioacuten La germinacioacuten ocurre entre la segunda y cuarta semana despueacutes de ser sembradas y los protocormos deberiacutean ser cambiados de medio de cultivo cada dos a cuatro meses si no se corre el riesgo de sufrir agotamiento de nutrientes Los rizomas y las raiacuteces se empiezan a desarrollar a partir de los siete meses para luego dar lugar a las primeras hojas Para obtener un buen transplante se deben tener raiacuteces de miacutenimo un centiacutemetro de largo El desarrollo de raiacuteces se ve potenciado al tener un periacuteodo corto de bajas temperaturas (10degC) exposicioacuten a la luz reduccioacuten en la concentracioacuten de iones del medio de cultivo o transferirlas a un compost esteacuteril Al tener raiacuteces suficientes y el tamantildeo adecuado se podraacuten llevar las plantas al lugar donde creceraacuten definitivamente En el momento del transplante las plantas son muy susceptibles al desecamiento por lo cual lo ideal es que los brotes sean maacutes chicos que las raiacuteces El mejor sustrato seriacutea aquel donde crece naturalmente la orquiacutedea (RAumlNNBAumlCK 2007) 2412 Preservacioacuten in vitro de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes Este estudio fue hecho para establecer que parte de tejido es viable para la micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes del noreste de Europa pudiendo asiacute reestablecer dichas orquiacutedeas a sus aacutereas correspondientes La propagacioacuten in vitro de orquiacutedeas
12
terrestres de clima templado es maacutes difiacutecil que las orquiacutedeas epiacutefitas de clima subtropical y tropical Las orquiacutedeas terrestres tienen requerimientos maacutes estrictos que las epiacutefitas y se conoce menos sobre sus necesidades especiacuteficas (VAASA y ROSENBERG 2004) En Estonia existen 36 especies de orquiacutedeas terrestres pero solo tres estaacuten bajo proteccioacuten Dactylorhiza baltica Dactylorhiza ruthei Dactylorhiza praetermissa Como explantes para este estudio en el caso de D baltica se ocuparon protocormos en los otros dos casos se utilizaron semillas semi maduras las cuales fueron colectadas siete y diez semanas despueacutes de ser polinizadas Para D baltica se ocupoacute el medio Murashige y Skoog suplementado con 05 mgL de aacutecido naftaleacuten aceacutetico (ANA) y 2 mgL de isonpentenyl adenina Para el caso de las semillas semi maduras se ocuparon los medios de Lindemann de Heller de Norstog y de Murashige y Skoog como control
La composicioacuten del medio y la madurez de las semillas influye mucho en el desarrollo de las orquiacutedeas in vitro Se ha demostrado que se necesita una alta concentracioacuten de microelementos para obtener una correcta germinacioacuten de las semillas Tambieacuten se puede decir que los primeros tres meses son los de mayor crecimiento luego de este tiempo el crecimiento se vuelve maacutes lento (VAASA y ROSENBERG 2004)
Luego de cuatro semanas de crecimiento de D baltica el 60 de los explantes de meristemas apicales empezaron a crecer en cambio los de meristemas laterales no expresaron ninguacuten tipo de crecimiento Las raiacuteces empezaron su desarrollo luego de dos meses despueacutes de la siembra
En el caso de D ruthei y D praetermissa la germinacioacuten se produjo despueacutes de dos meses desde la inoculacioacuten Luego de cuatro y seis meses el mayor crecimiento fue observado en el medio Norstog superando en 14 al medio testigo Murashige y Skoog (VAASA y ROSENBERG 2004)
2413 Longevidad de semillas de orquiacutedeas terrestres Por lo general las orquiacutedeas producen muchas pero pequentildeas semillas que contienen muy pocas reservas de alimento Dichas semillas estaacuten estructuralmente adaptadas para ser dispersadas por el viento pero poco se sabe del destino de eacutestas luego de ser dispersadas Algunos estudios de viabilidad de semillas indican una sobrevivencia de uno a dos antildeos en orquiacutedeas de clima templado Las semillas que son guardadas en laboratorio duran mucho maacutes tiempo Se estudioacute la viabilidad de siete especies de orquiacutedeas norteamericanas dentro de las cuales se encuentran Goodyera pubescens y Liparis liliifolia Las semillas de eacutestas se colocaron en bolsas con suelo y sustratos de bosques provenientes de sus haacutebitats naturales (WHIGHAM et al 2005) En Goodyera pubescens la mayoriacutea de las semillas germinaron en un antildeo Cuatro otras especies germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero algunas semillas no germinadas despueacutes de siete antildeos seguiacutean siendo viables En la especie Liparis liliifolia semillas que han estado cuatro antildeos bajo observacioacuten han tenido una tasa de
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germinacioacuten de un 68 al ser sembradas in vitro junto con el hongo micorriacutezico adecuado Las dos especies restantes no germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero las semillas fueron evaluadas como intactas y testeadas positivamente en cuanto a su viabilidad despueacutes de cuatro antildeos en el suelo Estas observaciones fueron interpretadas como diferentes estrategias para especies especiacuteficas de germinacioacuten in situ (WHIGHAM et al 2005) 2414 Sobrevivencia de orquiacutedeas terrestres transplantadas a sectores urbanos La conservacioacuten de poblaciones de orquiacutedeas silvestres depende del establecimiento de las orquiacutedeas propagadas a los campos Sin embargo se conoce muy poco de los factores bioacuteticos que influencian el establecimiento de orquiacutedeas terrestres a sus haacutebitats naturales Un experimento fue establecido para medir la sobrevivencia de seis especies durante su primer periacuteodo de crecimiento seguido del transplante a un sector urbano en Australia (SCADE et al 2006)
Las orquiacutedeas germinadas simbioacuteticamente crecieron en laboratorio durante cinco meses antes de establecer la plantacioacuten en sitios adyacentes con alta o baja cobertura de malezas Existioacute una muerte gradual de las plaacutentulas durante el primer periacuteodo de crecimiento primeramente por ataque de insectos no siendo evitado por la presencia de una malla cobertora Los iacutendices de sobrevivencia variacutean desde 49 para Microtis media una especie capaz de crecer en un ambiente atiacutepico hasta un 21 para Caladenia arenicola la orquiacutedea nativa maacutes comuacuten de esos sitios Sin embargo no todas las orquiacutedeas sobrevivientes producen tubeacuterculos por lo que la tasa de sobrevivencia despueacutes del primer periacuteodo seco disminuye
La sobrevivencia de las orquiacutedeas sembradas no puede ser comparada con orquiacutedeas de la misma especie que crecieron en los mismos lugares ya que no existioacute la presencia del hongo compatible para estas orquiacutedeas (SCADE et al 2006)
2415 Micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres En India dos orquiacutedeas muy importantes para la horticultura del geacutenero Anoectochilus fueron exitosamente propagadas Noacutedulos aislados de A sikkimensis colectadas en Himalaya y A regalis colectadas en India fueron cultivadas in vitro durante 12 semanas para obtener un maacuteximo de 48 a 56 protocormos y brotes obteniendo como resultado un 95 y 98 de eficiencia respectivamente Durante el repicado de los explantes in vitro de A regalis se observoacute que el nuacutemero total de brotes obtenidos a partir de noacutedulos fue 214 asiacute como tambieacuten 82 puntas de brotes En cambio para A sikkimensis fueron mucho maacutes bajos 123 y 43 respectivamente teniendo un crecimiento maacutes lento pero plantas maacutes fuertes Las raiacuteces de 4 a 6cm crecieron con la presencia de NAA (270 microM ) en el medio asiacute como tambieacuten con carbono activado (02) Durante la aclimatacioacuten la tasa de establecimiento fue entre 95 y 98 Luego de seis meses en invernadero las plantas de A regalis fueron transferidas a bosque nativo donde se obtuvo una tasa de
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sobrevivencia de entre 70 y 95 despueacutes de 12 meses Estas plantas establecidas en bosque nativo estaacuten libres de cualquier defecto morfoloacutegico y de crecimiento (GANGAPRASAD et al 2000) 242 Orquiacutedeas epiacutefitas Estas orquiacutedeas viven en los aacuterboles pero no obtienen de eacuteste su alimento no son paraacutesitas 2421 Preservacioacuten de Cattleya walkeriana usando propagacioacuten in vitro El geacutenero Cattleya se encuentra en Meacutexico y Ameacuterica Central asiacute como tambieacuten en Venezuela Colombia y las laderas de los Andes Esta orquiacutedea tambieacuten se encuentra en varias regiones del Brasil creciendo en aacuterboles rocas cerca de riacuteos lagos y pantanos Las flores de esta orquiacutedea son conocidas debido a su hermosura y a causa de la destruccioacuten de su haacutebitat y a la excesiva coleccioacuten de eacutestas se encuentra en extincioacuten
La composicioacuten del medio de cultivo es esencial para la propagacioacuten in vitro ya que suple todos los nutrientes necesarios para el desarrollo y seraacute distinto dependiendo de cada especie en este caso se utilizoacute la mitad de los macronutrientes del medio Muchos autores sugieren el uso de carboacuten activado en el medio ya que por lo general en muchas especies aumenta el desarrollo de las raiacuteces En este estudio se probaron distintas dosis de carboacuten activado 1 2 4 y 6gL con un pH de 6 (TADEU DE FARIA et al 2002) Las semillas se obtuvieron de flores artificialmente polinizadas en invernadero Plaacutentulas de aproximadamente un centiacutemetro fueron seleccionadas y cultivadas nuevamente en el medio de cultivo Murashige y Skoog pero esta vez con las diferentes dosis de carboacuten activado Se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces el nuacutemero de brotes y el peso de la materia verde total Durante el autoclavado se produce normalmente una hidroacutelisis de sacarina la cual es de 10 aproximadamente este porcentaje aumenta considerablemente al agregar un 1 de carboacuten activado llegando a ser de 95
El desarrollo de las plaacutentulas de C walkeriana aumentan con una mayor concentracioacuten de carboacuten activado asiacute como tambieacuten un mayor tiempo de cultivo El resultado fue que la dosis ideal para el desarrollo de esta orquiacutedea es 2gL de carboacuten activado (TADEU DE FARIA et al 2002) 2422 Establecimiento de cultivos in vitro y micropropagacioacuten de Cattleya aurantiaca (Bateman ex Lindl) Por medio de siembra in vitro se logroacute el establecimiento de C aurantiaca con alto porcentaje de germinacioacuten y desarrollo de protocormos Para la oacuteptima formacioacuten de callo y para la proliferacioacuten de protocormos se determinaron los medios oacuteptimos (MS 10 mgL ANA 10 mgL BA) asiacute como tambieacuten de manera directa sobre explantes de hoja y pseudobulbos (MS 01 mgL ANA 01 mgL GA3)
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Con este uacuteltimo medio tambieacuten se logroacute una oacuteptima regeneracioacuten y desarrollo de plaacutentulas Los medios liacutequidos (sin agitacioacuten) son una buena opcioacuten para conseguir la produccioacuten masiva de protocormos ya que con ellos se optimizoacute la micropropagacioacuten de C aurantiaca Las plaacutentulas micropropagadas presentaron alto porcentaje de sobrevivencia y buen desarrollo despueacutes de su trasplante y aclimatacioacuten lo cual demuestra que es un buen sistema de propagacioacuten para C aurantiaca (GUTIERREZ y SALGADO 2007) En cuanto a transplante y aclimatacioacuten despueacutes de 45 diacuteas de desarrollo in vitro las plaacutentulas de un tamantildeo entre 3 y 5 cm con raiacuteces bien desarrolladas fueron llevadas a condiciones ex vitro eliminando los restos de medio de cultivo con agua potable y ocupando un sustrato de partes iguales de tezontle y corteza de encino cubierta con hojarasca de encino finamente molida Se mantuvieron cubiertas durante 15 diacuteas abriendo cada dos diacuteas hasta poder retirar la tapa en 30 diacuteas Despueacutes de dos meses de haber sido retiradas del cultivo in vitro las plaacutentulas presentaron 70 de sobrevivencia y alcanzaron una altura de hasta 7 cm presentando nuevas hojas y raiacuteces las plantas se muestran vigorosas y capaces de continuar su crecimiento en condiciones ambientales de invernadero (GUTIERREZ y SALGADO 2007)
2423 Establecimiento in vitro y regeneracioacuten de plantas de Laelia autumnalis (Llave y Lex) Lindl Para este estudio se obtuvieron las semillas de una caacutepsula desarrollada despueacutes de 6 meses de la floracioacuten las cuales se sembraron in vitro sin presentar contaminacioacuten ya que la siembra por este meacutetodo es muy eficiente en comparacioacuten al cultivo de semillas libres donde algunas veces se presenta la contaminacioacuten Las observaciones se realizaron cada 15 diacuteas la germinacioacuten se detectoacute en los primeros 15 diacuteas en la mayoriacutea de los medios de cultivos probados con la presencia de protocormos de 1mm de diaacutemetro (HUAPEO y SALGADO 2004) El porcentaje de germinacioacuten que se obtuvo de las semillas cultivadas in vitro de L autumnalis fue de 95 a 100 en todos los medios de cultivo la uacutenica diferencia fue el tiempo entre las germinaciones A excepcioacuten de las semillas cultivadas en el medio MS 100 la germinacioacuten del 100 se obtuvo hasta los 30 diacuteas de cultivo mientras que en el primero la germinacioacuten fue a los 15 diacuteas del cultivo Las plaacutentulas con raiacutez y un par de hojas se lograron a los 90 diacuteas de cultivo en el medio MS 100 alcanzando 07 mm de altura Estas plaacutentulas fueron subcultivadas en medio MS con 05 mgl de ANA y 01 mgl de GA3 para tener plaacutentulas fuente de explante (segmentos de hojas) un medio oacuteptimo de desarrollo de plaacutentulas de L speciosa No fue necesario probar otros medios de cultivos ya que se hicieron pruebas anteriores que demostraron que era el adecuado
Las plaacutentulas de 6 meses de cultivo in vitro despueacutes de su germinacioacuten presentaron una altura promedio de 5 cm con raiacuteces con velamen y hasta dos pares de hojas Segmentos de hoja de eacutestas fueron cultivadas en el medio MS conteniendo ANA BA y GA3 en diferentes concentraciones y se realizaron observaciones cada 30 diacuteas para determinar medios inductores de callo protocormos y raiacuteces La mejor respuesta en formacioacuten de callo fue observada en los segmentos de hoja de plaacutentulas de L autumnalis cultivados en MS con 1 mgl de ANA BA y GA3 iniciando la induccioacuten de
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eacuteste desde los 30 diacuteas de cultivo solamente en un 70 de los explantes cultivados El 100 se logroacute a los 90 diacuteas de cultivo observando callo abundante alrededor de todo el tejido de color blanco con puntos pigmentados de color verde La regeneracioacuten de protocormos de esta orquiacutedea se establecioacute con la siembra de segmentos de hoja de plaacutentulas de 6 meses de edad de manera directa o a partir de callos En callos la produccioacuten fue oacuteptima en el medio MS con 01 mgl de ANABAGA3 ya que a los 60 diacuteas se obtuvieron 50 protocormos por segmento de callo Solamente se produjeron 10 protocormos por explante al cultivarse los segmentos de hoja en MS con 01 mgl de ANABAGA3 a los 120 diacuteas de cultivo (HUAPEO y SALGADO 2004) 25 Aclimatacioacuten Aclimatacioacuten significa que el hombre intercede y guiacutea el proceso de acondicionamiento de las plantas hasta que eacutestas sean aptas para crecer en el campo yo invernadero
Un alto nuacutemero de plantas micropropagadas no sobreviven al cambio desde el cultivo in vitro hacia el ambiente exterior ya sea en campo o invernadero Eacutestos dos uacuteltimos tienen menor humedad relativa niveles maacutes altos de luminosidad y un ambiente seacuteptico los cuales son maacutes estresantes para las plantas micropropagadas La mayoriacutea de las especies que crecen in vitro necesitan un proceso de aclimatacioacuten pudiendo obtener asiacute un nuacutemero suficiente de plantas vivas y vigorosas para trasplantar al suelo (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991)
La aclimatacioacuten no es uacutenicamente para micropropagacioacuten siendo usada ademaacutes en propagacioacuten convencional durante antildeos Despueacutes de cortar las hojas y de haber formado raiacuteces por lo general son aclimatadas antes de ser llevadas al campo o invernadero Ejemplos de dos teacutecnicas comunes son bajar gradualmente la humedad y mantener el nivel de luz con un 50 de sombra antes de trasladarlos al campo Las raiacuteces que han sido cortadas y mal limpiadas muchas veces son focos de infeccioacuten En estos casos las plantas muestran signos de marchitez hojas necrosadas y tambieacuten se puede llegar a la muerte de eacutestas El cultivo in vitro reduce la necesidad de fotosiacutentesis ya que las condiciones de la caacutemara de incubacioacuten proveen a la planta de sacarosa u otro azuacutecar Tambieacuten en estas condiciones se reduce el stress por patoacutegenos al ser un ambiente aseacuteptico Todo esto se traduce en que las plantas micropropagadas no son aptas para el campo yo invernadero (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 251 Stress hiacutedrico El stress hiacutedrico puede ser el resultado de una excesiva transpiracioacuten de las diferentes partes aeacutereas de las plantas especialmente de las hojas o por una inadecuada absorcioacuten de agua por parte de las raiacuteces La cutiacutecula y los estomas son la ruta primaria de peacuterdida de agua desde de las hojas provenientes de esta teacutecnica reproductiva 2511 Cutiacutecula La cutiacutecula es una membrana compuesta por una matriz de cutina que a su vez se encuentra cubierta en su superficie por ceras cuya funcioacuten primaria consiste en limitar la peacuterdida de agua por transpiracioacuten La permeabilidad del agua a traveacutes de la cutiacutecula se ve influenciada principalmente por la estructura y la cantidad de
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ceras cuticulares y epicuticulares no vieacutendose afectada la peacuterdida de agua por el grosor de eacutesta o la naturaleza quiacutemica de la matriz de la cutina La estructura cristalina de la parte encerada de las hojas es distinta en las plantas micropropagadas con respecto a las plantas que crecen en el campo La cera epicuticular de las hojas de plantas in vitro tienen una proporcioacuten maacutes alta de esteres y de componentes polares por el contrario tienen unas cadenas de hidrocarbonos mucho maacutes cortas Esto hace que las plantas in vitro pierdan maacutes agua que las cultivadas en campo o invernadero
Las plantas que han crecido en el campo son naturalmente de color verde pero el color de las plantas cultivadas in vitro es diferente y se puede ver a simple vista Las plantas que son pasadas a invernadero y que tengan un color verde se aclimatan de mejor forma al ambiente exterior (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 2512 Estomas La estructura estomaacutetica y su funcionamiento han sido implicados recurrentemente en el desbalance de agua exhibido por plantas micropropagadas al momento de ser removidas del cultivo in vitro Estudios con microscopiacutea de scanner electroacutenico han indicado que la estructura estomaacutetica presente en algunas especies de plantas cultivadas in vitro difieren marcadamente de las cultivadas en invernadero o en el suelo Debido a que las primeras presentan estomas de mayor tamantildeo y maacutes redondos a diferencia de las plantas cultivadas de manera normal que presentan estomas maacutes pequentildeos y eliacutepticos lo que resulta en una deshidratacioacuten maacutes raacutepida en el caso de las provenientes de cultivo in vitro (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 252 Humedad Debido a la anatomiacutea y la condicioacuten fisioloacutegica de las plantas desarrolladas in vitro donde se ha mantenido una alta humedad relativa es necesario regar al momento del traslado para obtener una alta sobrevivencia Muchos laboratorios aseguran que hay que evitar tener un sistema de aspersioacuten ya que se produce el ambiente necesario (muy huacutemedo) para la aparicioacuten de hongos algas o bacterias Otros meacutetodos incluyen el uso de humidificadores o poner las macetas en un lugar cerrado donde se retenga vapor para esto se pueden usar por ejemplo tapas de polietileno Este meacutetodo es relativamente econoacutemico pero se debe tener control del calor y monitorear la falta de agua (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 253 Luz Durante la etapa in vitro las plantas estaacuten expuestas a altos niveles de luminosidad lo que se traduce en hojas delgadas Antes del traslado se recomienda mantener las plantas con un 50 de sombra para asiacute poder aclimatarlas de mejor manera esto debido a que las plantas micropropagadas tienen un bajo control sobre la transpiracioacuten y un inadecuado mecanismo de fotosiacutentesis La sombra reduce la transpiracioacuten evitando excesivas peacuterdidas de agua asiacute como tambieacuten el exceso de luz destruye las moleacuteculas de clorofila Luego del periacuteodo bajo sombra se deben mover las macetas gradualmente hacia el nivel de luz al cual seraacute llevado para su crecimiento final (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 254 Temperatura La temperatura del aire y del medio o sustrato de crecimiento estaacute generalmente controlado durante el periacuteodo de aclimatacioacuten El calor es necesario en los meses de invierno y el friacuteo (enfriar) es esencial en los meses de verano Ajustando la cantidad de sombra y humedad se obtiene un control sobre la temperatura El
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enfriamiento se puede obtener gracias a ventilacioacuten abanicos niebla o aire acondicionado El calor puede provenir del sistema existente en el edificio o invernadero donde esteacuten ubicadas las macetas o por las laacutemparas ocupadas para el control del fotoperiacuteodo El rango de temperatura que se mantiene por lo general es entre los 13 y 30ordmC y esta determinado principalmente por la especie en cuestioacuten La temperatura de la zona donde se encuentran las raiacuteces es muy importante para el crecimiento lo ideal es que dicho sector tenga una mayor temperatura que el aire fomentando el crecimiento de las raiacuteces e incrementando la humedad alrededor de la planta Durante el verano esto es difiacutecil de obtener ya que la temperatura del aire es muy alta debido a la alta radiacioacuten solar Terminado el proceso de aclimatacioacuten esto ya no es necesario (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 255 Fotosiacutentesis Las plantas sufren un cambio radical cuando son removidas desde cultivo in vitro ya que son forzadas a cambiar de heterotroacuteficas a autotroacuteficas y la fotosiacutentesis se vuelve fundamental para la sobrevivencia Las hojas de las plantas in vitro no estaacuten formadas para hacer fotosiacutentesis ya que en la caacutemara de incubacioacuten no se produce un fuerte intercambio gaseoso esto debido a que la sacarosa es entregada a traveacutes del medio de cultivo Las hojas de las plantas que son trasladadas al campo o invernadero sufren deterioro debido a que no estaacuten formadas para la fijacioacuten de carbono Esto se produce por un tiempo aproximado de cuatro semanas despueacutes de las cuales las hojas nuevas suplen a las viejas Otro punto es que las hojas de las plantas cultivadas in vitro contienen menor proporcioacuten de clorofila que las plantas que han crecido normalmente en el campo En un estudio de coliflor cultivado in vitro se midioacute el CO2 y se obtuvo un balance negativo el cual se mantuvo durante dos semanas despueacutes del transplante Algo similar ocurrioacute con frutilla despueacutes del transplante las hojas se deterioraron raacutepidamente lo que quiere decir que no hubo incremento en la fijacioacuten de carbono indicando falta de desarrollo en la competencia fotosinteacutetica
El bajo nivel de CO2 durante el cultivo in vitro limita el proceso de fotosiacutentesis lo cual se puede compensar usando sacarosa en el medio de cultivo Tambieacuten se puede incrementar el nivel de luz y CO2 obteniendo un fuerte aumento en el crecimiento de varias especies como orquiacutedeas clavel etc (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 256 Sustrato Un sustrato es todo material soacutelido distinto del suelo natural mineral u orgaacutenico que colocado en un contenedor en forma pura o en mezcla permite el anclaje del sistema radicular de la planta desempentildeando por lo tanto un papel de soporte para la planta El sustrato puede intervenir o no en el complejo proceso de la nutricioacuten mineral de la planta (INFOAGRO 2007) El sustrato y los contenedores dentro de los cuales se van a transplantar las plaacutentulas in vitro son importantes para una buena sobrevivencia
Los sustratos ejercen una influencia significativa en la arquitectura del sistema radical de las plantas y en las asociaciones bioloacutegicas de este con el suelo influenciando el
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estado nutricional y la translocacioacuten de agua en el sistema suelo-planta-atmoacutesfera Uno de los requisitos fundamentales que debe cumplir el sustrato para su utilizacioacuten es la sanidad Cuando estos no se elaboran almacenan o manejan correctamente pueden contaminarse y provocar serios dantildeos a las plantas durante la aclimatacioacuten por esta razoacuten son preferidos como componentes para su elaboracioacuten materiales inertes o aquellos en las cuales el proceso de obtencioacuten garantice la mayor desinfeccioacuten posible
Uno de los factores de mayor importancia a la hora de seleccionar los materiales que pueden constituir el sustrato es su disponibilidad tanto en teacuterminos de facilidad de obtencioacuten o suministro como de su costo (VILCHEZ et al 2007)
La presencia de inhibidores o tambieacuten cambios en el pH del sustrato pueden afectar el crecimiento de las raiacuteces y consecuentemente el eacutexito del transplante
Muchos laboratorios y viveros transplantan a un sustrato uniforme debiendo ser eacuteste adecuado en cuanto a soporte de las plantas pH porosidad aireacioacuten y drenaje (DEBERGH y ZIMMERMAN 1991)
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3 MATERIAL Y MEacuteTODO
Para la realizacioacuten de este trabajo se utilizoacute el siguiente material y meacutetodo
31 Material La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio e invernadero de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal pertenecientes a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de Chile
311 Material vegetal Se utilizaron plaacutentulas de C virescens cultivadas in vitro a partir de semillas las cuales fueron proporcionadas por el laboratorio estas plaacutentulas fueron separadas y repicadas para aumentar la poblacioacuten y obtener la cantidad necesaria para el ensayo
FIGURA 2 Plaacutentulas de C virescens en caacutemara de crecimiento in vitro
312 Materiales Los materiales que se utilizaron fueron los siguientes Equipos autoclave caacutemara de flujo laminar dispensador de medios medidor
de pH agitador magneacutetico horno microondas balanza mechero termoacutemetro Materiales vasos de precipitado matraces probetas pipetas papel de
aluminio frascos de vidrio placas Petri pinzas bisturiacute macetas regadera Soluciones soluciones madre (Medio MS) gelificante etanol 70 y 95
32 Meacutetodo A continuacioacuten se da a conocer la metodologiacutea con la cual se trabajoacute 321 Preparacioacuten del medio de cultivo Para la obtencioacuten de plantas a traveacutes de la micropropagacioacuten se ocupoacute el medio basal de MURASHIGE y SKOOG (1962) tambieacuten llamado medio MS Este medio tiene un pH de entre 56-57 Posteriormente se dosificoacute con el dispensador de medios para que cada frasco tenga una cantidad adecuada (25 mL) y se llevoacute a autoclave para esterilizar a 12 atm 120ordm C por 20 min
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322 Obtencioacuten del material vegetal Al tener el medio esterilizado se procedioacute a la separacioacuten y repicado de plaacutentulas existentes en el laboratorio Las siembras se realizaron en el mes de mayo del 2007 Estas siembras se realizaron en la caacutemara de flujo laminar de modo de asegurar que la siembra sea 100 aseacuteptica Estas plaacutentulas fueron mantenidas en la caacutemara de incubacioacuten hasta obtener los tamantildeos requeridos para el ensayo donde las condiciones fueron las siguientes
minus Temperatura ambiental de 23-25ordm C minus Fotoperiacuteodo de 16 horas minus Intensidad lumiacutenica controlada de 50-55 micromol m-2s-1
323 Sustratos Se utilizaron tres tipos de sustratos el primero corresponde a una mezcla de turba + perlita (11) el segundo corresponde a Sphagnum (100) y el tercero corresponde a una mezcla de turba + arena (11) Una vez realizadas las mezclas se procedioacute a una esterilizacioacuten en un autoclave a 121ordm C por 20 minutos a 12 atmoacutesfera De esta forma se trabajoacute con material limpio y sano evitando ataque de hongos o bacterias El anaacutelisis quiacutemico de los sustratos se muestra en el Anexo 2 324 Plantacioacuten Las plaacutentulas con un promedio de cuatro meses en condiciones de caacutemara de crecimiento in vitro obtuvieron el tamantildeo adecuado para ser utilizadas Se sacaron de los frascos y se plantaron en las macetas de plaacutestico transparente con los sustratos Posteriormente fueron dejadas en la sala del laboratorio donde se debioacute asperjar con solucioacuten nutritiva Hoagland y fungicida Captan CUADRO 1 Composicioacuten de solucioacuten nutritiva Hoagland
KNO3 102 gL Ca(NO3) 4 H2 O 0492 gL
NH4H2 (PO4) 023 gL MgSO4 7 H2O 049 gL
H3BO3 286 mgL MnCl2 2 H2O 181 mgL CuSO4 5 H2O 008 mgL ZnSO4 5 H2O 022 mgL Na2MoO4 H2O 009 mgL
FeSO4 7 H2O 05 06 mL FUENTE FINCK 1988 325 Disentildeo de los ensayos Este trabajo de investigacioacuten constoacute de un ensayo con dos etapas Antes que todo se realizoacute la separacioacuten y repicado in vitro de plaacutentulas de C virescens para la obtencioacuten del nuacutemero necesario de plantas En la etapa 1 se utilizaron tres tamantildeos de plaacutentulas obtenidas in vitro de 1-2cm de 2-3cm y de maacutes de 3cm de altura que se transplantaron a tres sustratos turba + perlita 11(vv) Sphagnum (100) y turba + arena 11 (vv) La turba provino de la Sociedad
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Minera Patagonia Peat SA en Hijuelas el Sphagnum de la empresa Lonquen Chile de Puerto Montt y la perlita se obtuvo a traveacutes del sitio web wwwjardisencl (representante legal Walter Rathgeb Penza Ingeniero Agroacutenomo Santiago) Las plaacutentulas se plantaron de acuerdo a su tamantildeo las de maacutes de 3cm se colocaron de 6 por maceta las de 2 a 3cm de a 8 por maceta y las maacutes chicas de a 10 por maceta Estas macetas fueron dejadas en una sala de aclimatacioacuten con una temperatura promedio de 20ordm C intensidad lumiacutenica de 50-55 micromol m-2s-1 y 14-16 hrs de fotoperiacuteodo Se fertilizoacute asperjando cada cinco diacuteas con solucioacuten nutritiva Hoagland Esta etapa se llevoacute a cabo durante dos meses desde el cinco de septiembre hasta el cinco de noviembre de 2007
En la etapa 2 se continuoacute el proceso de aclimatacioacuten en invernadero de las plaacutentulas obtenidas en la etapa 1 que despueacutes de dos meses teniacutean un mayor tamantildeo y se habiacutean acondicionado al ambiente exterior (fuera de la caacutemara de crecimiento) Las plantas se mantuvieron en las macetas durante tres semanas para aclimatarlas y luego las plantas sobrevivientes fueron transplantadas a macetas maacutes grandes individuales durante tres meses aproximadamente hasta el cinco de marzo 2008 Estas nuevas macetas tuvieron como sustrato turba y suelo (trumao) en igual proporcioacuten (Anexo 2) La temperatura promedio de invernadero fluctuoacute de 13 a 35 degC seguacuten el mes En enero el promedio fue de 25 (Anexo 3) Para bajar la temperatura alrededor de 5deg C se instaloacute una malla Rachel 326 Disentildeo experimental El disentildeo experimental utilizado fue completamente al azar ordenado como experimento factorial con dos factores tamantildeo (3) y sustrato (3) Cada tratamiento tuvo tres repeticiones con un miacutenimo de 6 plantas por recipiente 327 Variables a evaluar Durante los dos meses en que las macetas estuvieron en la sala de aclimatacioacuten se evaluoacute el desarrollo foliar contando el nuacutemero de hojas una vez al mes Posteriormente se trasladaron las mismas macetas a invernadero durante tres semanas para continuar con la aclimatacioacuten de las plaacutentulas Transcurrido este tiempo se transplantaron las plaacutentulas sobrevivientes a macetas individuales y continuoacute mensualmente la evaluacioacuten de eacutestas (nuacutemero de hojas) hasta la obtencioacuten de plantas establecidas Al momento del transplante y al final del ensayo se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces asiacute como tambieacuten al final del ensayo de evaluoacute el crecimiento en altura (cm) La sobrevivencia fue evaluada al final del ensayo por maceta
Tanto en la sala de aclimatacioacuten coacutemo en el invernadero se registroacute la temperatura con la ayuda de un termoacutemetro de maacutexima y miacutenima (Anexo 3) 328 Anaacutelisis estadiacutestico Una vez obtenidos los datos se procedioacute a comprobar si estos cumpliacutean con los supuestos de aleatoriedad normalidad y homogeneidad de varianzas que exige este tipo de anaacutelisis En el caso de no cumplirse estos supuestos los datos se transformaron utilizando log10(x+05) raiacutez(x+05) o 1x para normalizarlos
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y enseguida se sometioacute los datos a un anaacutelisis estadiacutestico (ANDEVA) Posteriormente en los casos en que se observoacute diferencias significativas en el ANDEVA se aplicoacute una prueba de rangos muacuteltiples (Tukey) al 5 de significancia Para las variables no parameacutetricas que no cumplieron con los supuestos para un anaacutelisis de varianza se realizoacute la prueba de KruskalndashWallis y las comparaciones muacuteltiples a traveacutes del test de Dunn con un nivel de 5 de significancia
Se utilizaron los programas estadiacutesticos STATGRAPHICS 20 y GRAPHPAD PRISM 5 para el anaacutelisis de datos
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4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
En los siguientes puntos se discuten los resultados obtenidos en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens
En la Figura 3 se observan plaacutentulas de C virescens micropropagadas en medio MS en caacutemara de crecimiento al inicio del ensayo (A) y en invernadero despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten (B)
BA
FIGURA 3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten
A continuacioacuten se presentan los resultados obtenidos para las variables analizadas (Cuadro 2 y 3) de esta manera se pueden visualizar en general los resultados obtenidos en el proceso de aclimatacioacuten durante seis meses
CUADRO 2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de raiacuteces
inicial y final Variables
Hojas finales (nuacutemero)
Raiacuteces iniciales (nuacutemero)
Raiacuteces finales (nuacutemero)
Tamantildeo de plaacutentulas 36 24 37 47 29 46
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 61 43 76
Sustratos 53 36 56 43 29 51
Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 46 27 49
Significa que hay diferencias significativas al 95 Test de Dunn
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Las variables no parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en hojas finales y raiacuteces iniciales en sus rangos de distribucioacuten Las raiacuteces finales no presentaron diferencias seguacuten el sustrato utilizado pero de acuerdo al tamantildeo hubo diferencias en su distribucioacuten
CUADRO 3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas
Variables Altura final de plaacutentulas
(cm) Sobrevivencia
Tamantildeo de plaacutentulas
36 c 567 b 47 b 821 a
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 59 a 908 a
Sustratos 52 a 933 a
41 ab 59 b Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 49 b 772 a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY Las variables parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en altura final de hojas y en sobrevivencia 41 Nuacutemero de hojas finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentulas y de sustratos para la variable nuacutemero final de hojas 411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula Seguacuten el Cuadro 2 y Figura 4 las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero final de hojas Las plaacutentulas pequentildeas de 1-2 cm obtuvieron el nuacutemero maacutes bajo de hojas finales con una media de 36 hojas por plaacutentula lo cual es la mitad de las hojas finales que se obtuvo con las plaacutentulas de mayor tamantildeo (61 hojas aproximado por plaacutentula) Para las plaacutentulas medianas de 2-3 cm se obtuvo una media de 47 hojas por plaacutentula (Figura 4)
26
Hojas finales
1-2 cm 2-3cm maacutes de 3 cm0
5
10
15
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn)
BLANCO (2006) sentildeala que plaacutentulas cultivadas in vitro crecen bajo condiciones especiales como alta humedad relativa y baja luminosidad ademaacutes son suplidas con sacarosa Estas condiciones fueron proporcionadas en una caacutemara de crecimiento en el laboratorio donde las plantas micropropagadas no son dependientes por completo de su fotosiacutentesis son heteroacutetrofas Parece ser necesario un estiacutemulo para convertirse en organismos totalmente capaces de sustentar sus propios requisitos de carbono y nitroacutegeno reducido pasando de esta manera a ser autoacutetrofos
Al ser sacadas de un medio in vitro las hojas no estaacuten preparadas para producir su propio alimento y sobreviven gracias a que el medio de cultivo le proporciona los nutrientes necesarios para vivir En este punto muchas de las hojas mueren y nacen hojas nuevas capaces de generar su alimento supliendo asiacute las hojas viejas (SEELYE et al 2003) En este ensayo las plaacutentulas de Chloraea virescens presentaron en general una buena adaptacioacuten al ser sacadas de un medio in vitro
Se observoacute que plaacutentulas con menor tamantildeo al ser aclimatadas y tener menor tejido fue maacutes difiacutecil y maacutes lento que empezaran a generar nuevos tejidos y materia orgaacutenica a partir de dioacutexido de carbono POSPIacuteŠILOVAacute et al (1999) sentildeala que al tener los estomas con desarrollo incompleto maacutes grandes y de forma maacutes redonda pierden maacutes agua lo cual puede provocar una peacuterdida de hojas muriendo asiacute la plaacutentula Por esta razoacuten las plaacutentulas pequentildeas se demoran maacutes tiempo en generar hojas nuevas es por ello que al finalizar este estudio muestran el menor nuacutemero final de hojas 412 Efecto del tipo de sustrato Al analizar la influencia del tipo de sustrato se encontraron diferencias significativas entre los tres sustratos utilizados Seguacuten el Cuadro 2 y la Figura 5 el sustrato donde se obtuvo mejores resultados fue
27
turba+perlita en el cual se observoacute un promedio de 53 hojas por plaacutentula siendo Sphagnum el maacutes bajo con 43 hojas por plaacutentula De acuerdo a los resultados del anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados el sustrato turba+perlita tiene mayor cantidad de nitroacutegeno foacutesforo calcio magnesio y azufre disponible comparativamente con los otros dos sustratos (Sphagnum y arena+turba) (Anexo 2)
Hojas finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
Sustratos
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) Para la brotacioacuten y el crecimiento de las plantas se necesita agua y Nitroacutegeno lo que favorece a una mayor tasa de aparicioacuten de hojas lo que se traduce en una mayor cantidad de hojas finales El Nitroacutegeno se encuentra en mayor cantidad en el sustrato turba+perlita debido a lo cual los mejores resultados se obtienen en dicho sustrato 413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Despueacutes de analizados los efectos individuales del tamantildeo y del sustrato al interactuar ambos factores existen diferencias significativas La mejor interaccioacuten se obtuvo con el sustrato turba+perlita y con el mayor tamantildeo de la plaacutentula (Figura 6) Debido a la buena estructura (porosa) de dicho sustrato se podriacutea decir que se favorecioacute la absorcioacuten radicular de nutrientes obteniendo por ello un mayor nuacutemero de hojas finales Para los menores tamantildeos no se observan diferencias significativas obteniendo como promedio 41 hojas por plaacutentula Para el mayor tamantildeo el promedio fue de 6 hojas por plaacutentula
28
Hojas finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 42 Raiacuteces iniciales Este paraacutemetro se evaluoacute luego de la primera etapa de aclimatacioacuten la cual se realizoacute en una sala de aclimatacioacuten del laboratorio Se analizoacute la influencia de diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos sobre la variable nuacutemero raiacuteces iniciales (Anaacutelisis de Kruskal-Wallis en Anexo 7)
FIGURA 7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses de pre aclimatacioacuten
29
En la Figura 7 se puede observar los resultados de pre aclimatacioacuten en sala de laboratorio En esta etapa ya es posible ver la presencia de raiacuteces desarrolladas 421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula En el Cuadro 2 se puede observar que las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero inicial de raiacuteces y en la Figura 8 se puede comprobar que para los dos tamantildeos de plaacutentula maacutes pequentildeos no se observa gran cantidad de raiacuteces esto no impidioacute el desarrollo posterior de las plaacutentulas las cuales lograron enraizar al final del estudio Esto se contrapone a lo observado en un estudio de Lapageria rosea donde la presencia de raiacutez y brote para lograr una multiplicacioacuten exitosa de plantas es de vital importancia Incluso algunas plaacutentulas de L rosea no brotan en condiciones in vitro en donde tienen las mejores condiciones nutricionales y hormonales para hacerlo Esto se debe a factores internos de la plaacutentula siendo muy difiacutecil que broten inmediatamente en caacutemara de aclimatacioacuten donde ya dejan de recibir los nutrientes necesarios de manera directa y requieren de balances de energiacutea para poder seguir elongando raiacuteces absorber nutrientes y brotar para poder obtener los carbohidratos necesarios para seguir su crecimiento (BLANCO 2006) El tamantildeo de plaacutentula tiene importancia para el desarrollo de raiacuteces se distingue notoriamente que en los tamantildeos maacutes grandes el nuacutemero de raiacuteces es mayor comparativamente con los tamantildeos pequentildeos donde el nuacutemero de raiacuteces fue escaso Debido a la presencia de maacutes hojas existe una mayor cantidad de aacuterea fotosinteacutetica esta situacioacuten estimula el crecimiento de las raiacuteces para la obtencioacuten de agua y nutrientes
Raices iniciales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
2
4
6
8
10
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o inicial de ra
iacuteces
FIGURA 8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn)
30
422 Efecto del tipo de sustrato Para el sustrato turba+perlita se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas en el nuacutemero de raiacuteces con respecto a los dos otros sustratos esto se puede ver en el Figura 9 donde se observa que se obtuvieron los mayores resultados En cualquier medio de crecimiento el espacio no ocupado por un soacutelido se llama porosidad este espacio puede ser ocupado en parte para retener agua y en parte para proporcionarle aire a las raiacuteces La ausencia de uno de estos elementos es perjudicial para las plantas La turba es conocida por tener estas propiedades y la perlita tambieacuten por esta razoacuten se sabe que la mezcla turba-perlita provee propiedades fiacutesicas excelentes como medio de crecimiento y propagacioacuten (INFOAGRO 2007) Estos resultados con turba-perlita (298 de materia orgaacutenica) coinciden con los obtenidos por DIAZ et al (2004) quienes al utilizar un sustrato compuesto por 100 de humus de lombriz para aclimatar cantildea de azuacutecar obtuvieron el mayor nuacutemero de raiacuteces Esto puede atribuirse al importante aporte de materia orgaacutenica del humus (47) lo que le confiere una mejor estructura obtenieacutendose una excelente porosidad del sustrato La aireacioacuten del suelo es necesaria para favorecer la maacutexima absorcioacuten de nutrientes por las raiacuteces Esto tambieacuten sucede en el sustrato turba+perlita el cual posee la mayor cantidad de materia orgaacutenica de los tres sustratos utilizados
Raices iniciales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
2
4
6
8
10
Sustratos
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato En los anaacutelisis para la variable nuacutemero de raiacuteces se puede decir que la mejor interaccioacuten se presentoacute para el sustrato de turba+perlita junto con el mayor tamantildeo de plaacutentulas obteniendo los valores maacutes altos entre los nueve tratamientos La presencia de raiacuteces luego de la micropropagacioacuten aumenta la posibilidad de eacutexito en el transplante ya que se crea un favorable balance de agua Pero esto no quiere
31
decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
10
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
32
En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
33
El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
34
Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
I
INDICE DE MATERIAS
Capiacutetulo Paacutegina
RESUMEN 1
REacuteSUMEacute 2
1 INTRODUCCION 3
2 REVISION BIBLIOGRAFICA 4
21 Descripcioacuten general 4
211 Descripcioacuten geograacutefica 4
212 Formas de vida 4
213 Descripcioacuten morfoloacutegica 4
214 Geacuteneros y especies chilenas 5
2141 Chloraea virescens 6
22 Requerimientos de las orquiacutedeas 7
221 Agua 7
222 Luz 8
223 Fertilizacioacuten 8
224 Temperatura 8
23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas 9
231 Biologiacutea de las semillas 9
232 Germinacioacuten simbioacutetica y no simbioacutetica de semillas 9
233 Condiciones de esterilidad 9
2331 Siembra de las semillas 10
234 Transplante 10
24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas 11
241 Orquiacutedeas terrestres 11
2411 Cypripedium 11
2412 Preservacioacuten in vitro de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes 12
2413 Longevidad de semillas de orquiacutedeas terrestres 12
2414 Sobrevivencia de orquiacutedeas terrestres transplantadas a sectores
urbanos 13
II
2415 Micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres 13
242 Orquiacutedeas epiacutefitas 14
2421 Preservacioacuten de Cattleya walkeriana usando propagacioacuten in vitro 14
2422 Establecimiento de cultivos in vitro y micropropagacioacuten de Cattleya
aurantiaca (Bateman ex Lindl) 14
2423 Establecimiento in vitro y regeneracioacuten de plantas de Laelia autumnales
(Llave y Lex) Lindl 15
25 Aclimatacioacuten 16
251 Stress de agua 16
2511 Cutiacutecula 16
2512 Estomas 17
252 Humedad 17
253 Luz 17
254 Temperatura 17
255 Fotosiacutentesis 18
256 Sustrato 18
3 MATERIAL Y METODO 20
31 Material 20
311 Material vegetal 20
312 Material de laboratorio 20
32 Meacutetodo 20
321 Preparacioacuten del medio de cultivo 20
322 Obtencioacuten del material vegetal 20
323 Sustratos 21
324 Plantacioacuten 21
325 Disentildeo de los ensayos 21
326 Disentildeo experimental 22
327 Paraacutemetros a evaluar 22
328 Anaacutelisis estadiacutestico 22
III
4 PRESENTACIOacuteN Y DISCUSION DE RESULTADOS 24
41 Nuacutemero de hojas finales 25
411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula 25
412 Efecto del tipo de sustrato 26
413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato 27
42 Raiacuteces iniciales 28
421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula 29
422 Efecto del tipo de sustrato 30
423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato 30
43 Raiacuteces finales 31
431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula 32
432 Efecto del tipo de sustrato 32
433 Interaccioacuten tamantildeo de plaacutentula y sustrato 33
44 Altura 35
45 Sobrevivencia 36
5 CONCLUSIONES 38
6 BIBLIOGRAFIA 39
7 ANEXOS 42
IV
INDICE DE CUADROS
Cuadro Paacutegina
1 Composicioacuten de solucioacuten nutritiva Hoagland 21
2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de
raiacuteces inicial y final 24
3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas 25
V
INDICE DE FIGURAS
Figura Paacutegina
1 C virescens 7
2 Plaacutentulas de C virescens en caacutemara de crecimiento in vitro 20
3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS
B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten 24
4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) 26
5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final
de hojas (Test de Dunn) 27
6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 28
7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses
de pre aclimatacioacuten 28
8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 29
9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final
de raiacuteces (Test de Dunn) 30
10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no
parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 31
11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses
de aclimatacioacuten 31
12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 32
13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final
de raiacuteces (Test de Dunn) 33
14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre para la variable no
parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 34
15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) 35
VI
16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable
parameacutetrica altura final de plaacutentulas 35
17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) 37
18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la
variable parameacutetrica de sobrevivencia 37
VII
INDICE DE ANEXOS
Anexo Paacutegina
1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962)
y suplementos orgaacutenicos 44
2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio 45
3 Registro de temperaturas miacutenimas maacutexima y promedio durante
el estudio 46
4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas
finales 47
5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales 47
6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces
iniciales 48
7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces
iniciales 48
8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces
finales 49
9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales 49
10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en
aclimatacioacuten 50
11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura 50
12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de
plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten 51
13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia 51
14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea 52
1
RESUMEN Dentro del esquema de micropropagacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens la aclimatacioacuten es la etapa final donde la manipulacioacuten debe ser muy cuidadosa ya que es donde se produce el mayor iacutendice de mortandad principalmente en el proceso de trasplante Esta etapa es muy importante ya que gracias a ella se veraacute la eficiencia del proceso y la calidad final de las plantas producidas in vitro por eso el objetivo general de este trabajo es evaluar la influencia del tamantildeo de plaacutentulas y utilizacioacuten de distintos sustratos en la aclimatacioacuten ex vitro de plaacutentulas de C virescens Se utilizaron plaacutentulas de Chloraea virescens obtenidas a partir de la micropropagacioacuten de protocormos provenientes de germinacioacuten asimbioacuteticas de semillas efectuada en el laboratorio de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal de la Universidad Austral de Chile Las plaacutentulas fueron repicadas hasta obtener el nuacutemero adecuado para el ensayo Luego fueron trasladadas a una sala del laboratorio en macetas de seis ocho y diez plaacutentulas dependiendo del tamantildeo de la plaacutentula (maacutes de 3cm 2-3cm y 1-2cm respectivamente) por dos meses posteriormente fueron transferidas a 3 sustratos turba+perlita (11) Sphagnum y turba+arena (11) y fueron llevadas a invernadero durante cuatro meses Las variables evaluadas fueron nuacutemero final de hojas nuacutemero inicial y final de raiacuteces altura y sobrevivencia de las plaacutentulas Los resultados obtenidos demostraron que los tamantildeos y los sustratos ocupados influyen en el crecimiento de las plaacutentulas El mejor tamantildeo para la aclimatacioacuten es de maacutes de 3cm obteniendo con eacuteste los mejores resultados en todas las variables evaluadas Lo mismo ocurrioacute con el sustrato turba+perlita el cual fue el mejor evaluado
2
REacuteSUMEacute Dans le scheacutema de la micropropagation de Chloraea virescens lacclimatation est la derniegravere eacutetape ougrave il faut ecirctre prudent parce que cest agrave ce moment lagrave que les taux de mortaliteacute sont les plus eacuteleveacutes principalement dans le processus de transplantation Cette eacutetape est tregraves importante parce que ce sera gracircce agrave elle quacuteon verra lefficaciteacute du processus et la qualiteacute finale des plantes produites in vitro Lobjectif geacuteneacuteral de cette eacutetude est dacuteeacutevaluer linfluence de la taille des plantes et lutilisation de divers substrats pour lacuteacclimatation de C virescens On a utiliseacute des plantes de C virescens obtenue a partir de la micropropagation de protocormos en provenance du laboratoire de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal de la Universidad Austral de Chile Les plantes ont eacuteteacute subdiviseacutee pour obtenir le nombre approprieacute Elles ont ensuite eacuteteacute transfeacutereacutees agrave des pots dans une piegravece du laboratoire de six huit et dix en fonction de la taille de la plante (plus de 3 cm de 2-3 cm et 1-2 cm respectivement) pour deux mois ensuite elles ont eacuteteacute transfeacutereacutee dans trois substrats tourbe + perlite (11) Sphagnum et tourbe + sable (11) et elles ont eacuteteacute mises dans une serre pour quatre mois Les variables agrave eacutevaluer sont nombre final de feuilles nombre de racines au deacutebut et agrave la fin la hauteur et la survie des plantes Les reacutesultats ont montreacute que la taille et les substrats utiliseacutes ont une influence sur la croissance des jeunes plantes La taille ideacuteale pour lacclimatation est plus de 3cm avec cette derniegravere on a obtenu les meilleurs reacutesultats dans toutes les variables qui ont eacuteteacute eacutevalueacutees Le mecircme reacutesultat sest produit avec le substrat de tourbe + perlite lequel a aussi montreacute les meilleurs reacutesultats
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1 INTRODUCCION La familia Orchidaceae (Orquiacutedeas) es la que mayor nuacutemero de especies comprende en el Reino Vegetal Se estima que debe haber alrededor de 35000 especies de Orquiacutedeas en todo el mundo pertenecientes a unos 750 geacuteneros ademaacutes de miles de hiacutebridos En Chile esta familia es probablemente el grupo menos estudiado de plantas con flores y soacutelo se han realizado estudios en base a su taxonomiacutea biologiacutea reproductiva fenologiacutea y distribucioacuten
La produccioacuten de flores de orquiacutedeas ha tomado importancia por la belleza de sus flores dada la enorme variedad de formas colores y perfumes Existen orquiacutedeas terrestres y epiacutefitas estas uacuteltimas representan maacutes del 90 del total de especies y son las que mayoritariamente se encuentran a la venta Las flores tienen un alto valor ornamental o como flor cortada ya que eacutestas pueden permanecer separadas de las plantas sin marchitarse hasta tres o cuatro semanas y en la planta permanecen hasta tres meses
La obtencioacuten de plantas de orquiacutedeas a partir de semillas es muy difiacutecil ya que eacutestas son diminutas y de germinacioacuten irregular Como una alternativa de obtencioacuten de plantas aparece la micropropagacioacuten pudiendo asiacute aumentar el nuacutemero de plantas en forma relativamente faacutecil y raacutepida Luego de la etapa de micropropagacioacuten viene la etapa de aclimatacioacuten en la cual la manipulacioacuten debe ser en extremo cuidadosa ya que es donde se produce el mayor iacutendice de mortandad principalmente en el proceso de transplante Esta etapa es muy importante ya que gracias a ella se veraacute la eficiencia del proceso y la calidad final de las plantas producidas in vitro Considerando la produccioacuten de plaacutentulas mediante la micropropagacioacuten en este trabajo se plantea la hipoacutetesis que ldquoel tamantildeo de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro y los distintos sustratos son factores que inciden en el desarrollo y su aclimatacioacutenrdquo El objetivo general de este trabajo es
Evaluar la influencia del tamantildeo de plaacutentulas y utilizacioacuten de distintos sustratos en la aclimatacioacuten ex vitro de plaacutentulas de C virescens
Los objetivos especiacuteficos son
Medir el efecto del tamantildeo de plaacutentulas de C virescens en la sobrevivencia y desarrollo de eacutestas ex vitro
Comparar el uso de tres sustratos en el desarrollo y sobrevivencia de plaacutentulas de C virescens
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2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA 21 Descripcioacuten general 211 Descripcioacuten geograacutefica Las orquiacutedeas pertenecen a la familia Orchidaceae clase Liliopsida (monocotiledoacuteneas) Son plantas herbaacuteceas perennes originarias de regiones tropicales y subtropicales pero existen tambieacuten en todos los continentes a excepcioacuten de las regiones polares La zona donde se encuentran estas plantas estaacute comprendida entre los 68ordm latitud norte y 56ordm latitud sur Es evidente que en los liacutemites extremos de estas latitudes se encuentran pocos geacuteneros y especies esto va en aumento desde las regiones temperadas hasta las regiones intertropicales donde el nuacutemero es el mayor Los territorios maacutes interesantes por su nuacutemero son
Ameacuterica del Sur y Ameacuterica Central Asia e India Madagascar Australia es el continente menos poblado en orquiacutedeas dentro de las regiones
del globo Por su parte Europa presenta numerosos geacuteneros y especies de orquiacutedeas
terrestres Soacutelo en Francia existen 75 especies repartidas en 16 geacuteneros todas terrestres (LECOUFLE y ROSE 1956)
212 Formas de vida Las zonas donde crecen estas plantas influyen sobre su manera de vivir Algunas orquiacutedeas son terrestres y se encuentran representadas en todas las regiones Tambieacuten existen las epiacutefitas (vegetal que fijado a otro no obtiene de eacuteste su alimento) En este caso se necesita que el grado higromeacutetrico y la temperatura permitan este tipo de adaptacioacuten Ademaacutes existen las orquiacutedeas litofiacuteticas que viven sobre rocas Las raiacuteces de las epiacutefitas y litofiacuteticas estaacuten adaptadas a vivir expuestas al aire o inmersas en materia orgaacutenica ya que tienen un tejido acumulador de agua llamado velo En zonas friacuteas y templado friacuteas todas las orquiacutedeas son terrestres En zonas subtropicales o tropicales la gran mayoriacutea es epiacutefita Otra particularidad debida seguramente a la influencia de estas zonas es la floracioacuten Es en las zonas tropicales y subtropicales que se dan los mayores tamantildeos de flores asiacute como tambieacuten la mayor variedad de colores (LECOUFLE y ROSE 1956)
213 Descripcioacuten morfoloacutegica Las orquiacutedeas se caracterizan por poseer flores muy vistosas hermafroditas (ambos sexos en la misma flor) zigomorfas (con un solo plano de simetriacutea) triacutemeras (tres seacutepalos y tres peacutetalos) y una columna central que sustenta las estructuras reproductivas masculinas anteras y femeninas pistilo llamada ginostemo El peacutetalo inferior se llama labelo y su morfologiacutea define a los distintos geacuteneros de orquiacutedeas Las flores pueden ser aisladas o en inflorescencia y son polinizadas por insectos El polen se encuentra aglomerado formando una masa llamada polinio el que tiene un extremo con un ensanchamiento glandular pegajoso que sirve para que el
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polinio se adhiera al cuerpo del insecto polinizador El fruto es una caacutepsula seca con muchas semillas pequentildeas sin endosperma y con embrioacuten no diferenciado Tienen dos tipos baacutesicos de crecimiento Simpodial en las que el nuevo crecimiento se produce en sentido horizontal a partir de un tallo subterraacuteneo o rizoma generando una sub-unidad capaz de producir una flor o inflorescencia y de ser eventualmente separada de la planta (ej Cattleya) Monopodial en las que el nuevo crecimiento se produce en sentido vertical con lo cual la planta crece constantemente en altura (ej Phalaenopsis) (ORQUIDEAS 2007) 214 Geacuteneros y especies chilenas Seguacuten NOVOA et al (2006) en la familia Orchidaceae se encuentran 49 especies de flora nativa dentro de las cuales se encuentra Chloraea virescens (Willd) Lindl Los geacuteneros de Orchidaceae en Chile son 7
- Aa Bipinnula Brachystele Codonorchis Chloraea Gavilea y Habenaria
Dentro del geacutenero Chloraea existen 31 especies - Chloraea alpina Poepp - Chloraea barbata Lindl - Chloraea bidendata (Poepp y Endl) Correa - Chloraea bletioides Lindl - Chloraea cuneata Lindl - Chloraea chica Speg - Chloraea chrysantha Poepp - Chloraea crispa Lindl - Chloraea cristata Lindl - Chloraea cylindrostachya Poepp - Chloraea disoides Lindl - Chloraea galeata Lindl - Chloraea gaudichaudii Brongn - Chloraea gavilu Lindl - Chloraea grandiflora Lindl - Chloraea heteroglossa Rchbf - Chloraea incisa Poepp - Chloraea lamellata Lindl - Chloraea lechleri Lindl - Chloraea leptopetala Reiche - Chloraea longipetala Lindl - Chloraea magellanica Hookf - Chloraea multiflora Lindl - Chloraea nudilabia Lindl - Chloraea philippii Reichbf - Chloraea picta Phil - Chloraea prodigiosa Reichbf - Chloraea speciosa Poepp - Chloraea virescens Lindl - Chloraea viridiflora Poepp
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- Chloraea volkmanni Phil (NOVOA et al 2006) 2141 Chloraea virescens Planta perenne de 40-90 cm de altura Sus hojas son de 5-12cm de largo por 15-25cm de ancho estrechas lanceoladas agudas dispuestas en roseta basal generalmente marchitas al final de la antesis Su escapo floral tiene vainas caulinares lanceoladas agudas y distantes La inflorescencia es de 8-20cm de largo densa con 10-15 flores erguidas Sus flores son blancas con estriacuteas y aacutepices verdes El seacutepalo dorsal es de 16-33mm de largo por 4-6mm de ancho oblongo lanceolado obtuso algo coacutencavo a veces ligeramente estrechado al centro aacutepice algo carnoso Los seacutepalos laterales de 18-33mm de largo por 4-5mm de ancho son ensiformes con aacutepice obtuso engrosado verde negruzco a veces espatulado y dentado a veces verrugoso Los peacutetalos son de 15-23mm de largo por 5-58mm de ancho estrechamente aovados obtusos verrugosos con maacutes frecuencia solo la mitad inferior a veces el borde denticulado y carnoso El labelo de 15-26mm de largo por 10-20mm de ancho es mas o menos romboidal a levemente trilobulado El loacutebulo central tiene 5-7 nervios longitudinales recorridos por laminillas interrumpidas membranaacuteceas con segmentos falciformes de borde carnoso de color verde Los nervios laterales que se ramifican oblicuamente hacia el aacutepice en los loacutebulos laterales tienen pequentildeas laminillas y verrugas y su borde es laciniado inciso en la mitad apical hacia la base denticulado aacutepice generalmente engrosado La columna es de 12-18mm de largo delgada blanca con estriacuteas anaranjada La base de la zona nectariacutefera tiene un color amarillo-limoacuten con maacuteculas anaranjadas orificio nectario verde El ala de la columna es recta y estrecha El estigma es triangular y globoso La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la Vordf (Vintildea del Mar) hasta la XIordf Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile Sin embargo es posible que tenga una distribucioacuten maacutes restringida por que se le ha confundido con Chloraea incisa Su floracioacuten es desde noviembre a febrero y su estado de conservacioacuten no estaacute evaluado (NOVOA et al 2006) En el Anexo 14 se incluyen antecedentes sobre su distribucioacuten y eacutepoca de floracioacuten
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FIGURA 1 Chloraea virescens FUENTE NOVOA et al (2006) 22 Requerimientos de las orquiacutedeas Para tener eacutexito en el cultivo de orquiacutedeas hay que tomar en cuenta factores de importancia como son 221 Agua El riego correcto es el principio y el fin del cuidado de orquiacutedeas (ROLLKE 2005) Este elemento es primordial para las orquiacutedeas asiacute como tambieacuten para todo tipo de plantas En el caso de eacutestas se dice muchas veces que la calidad del agua usada es el factor maacutes importante en el cultivo de orquiacutedeas ya que el porcentaje maacutes alto de muerte se produce por el exceso de este factor (SHEEHAN 1980) Hay que tomar en cuenta que la mayoriacutea de las orquiacutedeas son epiacutefitas lo que significa que tienen sus raiacuteces a la vista gracias a las cuales absorben el agua de lluvia Se recomienda un sustrato poroso y de reaccioacuten neutra ya que de esta manera el agua escurre sin acumularse no permitiendo la pudricioacuten de las raiacuteces Para las orquiacutedeas terrestres es lo mismo solo que se pueden regar con maacutes frecuencia pero sin mantenerlas saturadas (OSPINA y DRESSLER 1979) Seguacuten DUMOIS (2007) el agua es lo maacutes difiacutecil de controlar ya que depende de muchas variables como por ejemplo humedad relativa tipo de sustrato intensidad luminosa temperatura y circulacioacuten de aire Ademaacutes muchas orquiacutedeas necesitan un periacuteodo de receso vegetativo que si no es respetado resulta en ausencia de floracioacuten En general hay que antildeadir agua en abundancia cuando la planta se encuentra en crecimiento activo y reducirla despueacutes de la floracioacuten
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Las especies con pseudobulbos almacenan agua y estaacuten preparadas para su periacuteodo de receso Otras que no cuentan con estos oacuterganos requieren de humedad maacutes constante 222 Luz Ninguna planta puede crecer sin la iluminacioacuten adecuada Muchas orquiacutedeas viven en las alturas de los aacuterboles y estaacuten expuestas a plena luz del sol otras crecen en el suelo selvaacutetico protegidas del sol por espesos follajes (ROLLKE 2005) La funcioacuten principal de la luz es activar el proceso de fotosiacutentesis Los cultivadores han estudiado la luz y han descubierto que hay orquiacutedeas que florecen con diacutea largo y otras con diacutea corto (OSPINA y DRESSLER 1979) Gracias a la fotosiacutentesis se convierten los minerales presentes en el ambiente en savia y nutrientes Hojas oscuras y falta de floracioacuten indican falta de luz hojas amarillas e incluso quemadas apuntan hacia un exceso de sol (DUMOIS 2007) 223 Fertilizacioacuten Las orquiacutedeas necesitan los mismos nutrientes que otras plantas Un abono para orquiacutedeas debe contener los nutrientes principales nitroacutegeno (N) foacutesforo (P) y potasio (K) asiacute como tambieacuten oligoelementos como hierro (Fe) magnesio (Mg) zinc (Zn) estantildeo (Sn) y manganeso (Mn) (ROLLKE 2005) Por otra parte la fertilizacioacuten depende de varios factores dentro de los cuales los maacutes criacuteticos son
- El medio utilizado - La edad de las plantas - Estado de las plantas ya sea floracioacuten crecimiento reposo
En cuanto a absorcioacuten se ha demostrado que es igual de eficiente por viacutea foliar como a traveacutes de las raiacuteces Es necesario tener en cuenta algunas reglas baacutesicas a la hora de fertilizar las orquiacutedeas (Asociacioacuten Costarricense de Orquideologiacutea ACO 1970)
1 Regar las plantas antes de fertilizar 2 Fraccionar las dosis 3 Aplicar el fertilizante de forma liacutequida 4 No usar fertilizantes soacutelidos 5 No fertilizar las plantas recieacuten plantadas 6 No fertilizar plantas en reposo 7 No abonar plantas enfermas
224 Temperatura Es conocido el hecho de que cada planta tiene liacutemites de temperatura dentro de los cuales prospera o perece De ahiacute la necesidad de conocer las temperaturas correspondientes al lugar de donde viene cada especie de orquiacutedea pudiendo proporcionarle la temperatura adecuada (OSPINA y DRESSLER 1979) Se puede clasificar a las orquiacutedeas como de clima caacutelido (temperatura nocturna miacutenima de 20ordmC) templado (miacutenimo de 13 a 18ordmC) y de ambiente friacuteo (de 10 a 13ordmC) (DUMOIS 2007)
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Seguacuten SHEEHAN (1980) las temperaturas ideales para las orquiacutedeas de origen tropical son 10ordmC en la noche y entre 21ordm - 24ordmC durante el diacutea 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas La micropropagacioacuten de orquiacutedeas estaacute en vanguardia hoy en diacutea El estudio de cultivo de tejido de orquiacutedeas se lleva a cabo en muchos laboratorios de todo el mundo (ARDITTI and ERNST 1992) 231 Biologiacutea de las semillas Las semillas de orquiacutedeas son conocidas usualmente como semillas polvo porque son minuacutesculas y contienen pocas reservas de alimento Estas semillas por lo general no germinan en el medio natural a menos que sean infectadas por un hongo micorriacutezico Este hongo abastece a las plantas joacutevenes con azuacutecares y nutrientes hasta que sean lo suficientemente grandes para fabricar su propio alimento Cuando la semilla germina produce una masa indiferenciada de ceacutelulas llamada protocormo Manteniendo las condiciones normales el protocormo continuaraacute su crecimiento por varias semanas meses o incluso antildeos dependiendo de la especie hasta que alcance la edad apropiada para producir raiacuteces y hojas En el caso de orquiacutedeas terrestres es de vital importancia que la relacioacuten orquiacutedea-hongo se conserve durante los estados tempranos del ciclo de vida de la planta ya que el protocormo enterrado no puede fabricar alimento por siacute mismo Por otro lado los protocormos de las orquiacutedeas epiacutefitas son comuacutenmente verdes lo que les posibilita producir parte de su alimento La relacioacuten orquiacutedea-hongo no ha sido en su totalidad investigada para el caso de las orquiacutedeas tropicales (McKENDRICK 2000) 232 Germinacioacuten simbioacutetica y no simbioacutetica de semillas Mediante la germinacioacuten in vitro las semillas germinan en frascos de vidrio o plaacutestico Estos frascos contienen en su interior un medio nutritivo solidificado con agar con todos los azuacutecares y minerales necesarios para la germinacioacuten y crecimiento de las semillas Hay dos tipos de germinacioacuten la simbioacutetica y la asimbioacutetica En la germinacioacuten simbioacutetica las semillas se siembran junto con una pequentildea cantidad del hongo micorriza adecuado Dicho hongo crece en el medio coloniza a las semillas que estaacuten en proceso de germinacioacuten y se produce una relacioacuten simbioacutetica la cual alimentaraacute al protocormo hasta que este sea capaz de producir sus hojas y se vuelva autotroacutefico Esta teacutecnica es usada principalmente en propagacioacuten de orquiacutedeas terrestres en zonas templadas La germinacioacuten asimbioacutetica se usa principalmente en propagacioacuten de orquiacutedeas tropicales que crecen maacutes raacutepido que sus parientes de zonas templadas Para este tipo de germinacioacuten se necesita un medio de cultivo maacutes complejo ya que todos los nutrientes orgaacutenicos e inorgaacutenicos asiacute como tambieacuten los azuacutecares deben estar en forma disponible pues no existe la intermediacioacuten del hongo (McKENDRICK 2000) 233 Condiciones de esterilidad Tanto para la germinacioacuten simbioacutetica como para la asimbioacutetica es de vital importancia que los frascos las semillas aparatos y el medio esteacuten esteacuteriles desde el principio del proceso Esto debido a que cualquier hongo o bacteria que se introduzca creceraacute maacutes raacutepido que las semillas ocupando su espacio hasta matarlas Esto se evita gracias al autoclave el cual regulado a 12 atm y 120ordmC por 20 minutos mata hongos o bacterias presentes en el medio (McKENDRICK 2000)
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2331 Siembra de las semillas Las semillas pueden ser recolectadas desde caacutepsulas verdes o maduras La caacutepsula verde que estaacute madurando estaacute llena de semillas y no se deforma cuando se aprieta con las pinzas Estas semillas pueden ser almacenadas por algunas semanas en un lugar refrigerado con bastante aireacioacuten Las semillas se pueden sembrar a partir de caacutepsulas verdes o semillas secas A continuacioacuten se muestran las ventajas y desventajas de ambos meacutetodos
- Siembra a partir de caacutepsulas verdes Si las caacutepsulas se mantienen intactas el interior (las semillas) se mantiene esteacuteril Por lo tanto si se esteriliza la parte exterior de las mismas donde hongos y bacterias pueden desarrollarse y se abren las caacutepsulas bajo condiciones esteacuteriles y las semillas podraacuten mantenerse desinfectadas
La ventaja de este meacutetodo es que no se requiere de esterilizacioacuten de las semillas lo que provoca su deterioro Otro punto a favor es que algunas semillas podriacutean germinar maacutes raacutepido que las provenientes de caacutepsulas maduras por los mecanismos de dormancia La desventaja es que en este caso todas las semillas deben ser utilizadas o eliminadas mientras que las semillas maduras se pueden almacenar Tambieacuten se debe considerar que las semillas sembradas a partir de caacutepsulas que no han madurado lo suficiente podriacutean germinar lentamente o simplemente no germinar - Siembra a partir de semillas secas En este caso una vez que la caacutepsula es abierta las semillas dejan de ser esteacuteriles y requieren de un proceso de esterilizacioacuten Comuacutenmente se utiliza una solucioacuten de hipoclorito de sodio hipoclorito de calcio o peroacutexido de hidroacutegeno Las semillas se agitan dentro de la solucioacuten que ademaacutes contiene una gota de detergente para ldquohumedecerlasrdquo luego se las enjuaga con agua destilada y se las siembra en el medio preparado La ventaja de este meacutetodo es que las semillas pueden ser colectadas secadas al aire almacenadas por varios meses en el refrigerador y utilizarlas cuando sea necesario Se debe considerar que la siembra ya sea de caacutepsulas verdes o de semillas secas estaacute determinado por la eacutepoca en que se colectan (McKENDRICK 2000) 234 Trasplante En la caacutemara de incubacioacuten las plaacutentulas se han desarrollado en condiciones limpias y en un ambiente cerrado por lo que deben acostumbrase gradualmente al ambiente exterior antes de ser trasplantadas a las macetas Tambieacuten la temperatura y la luz la cual es baja han sido constantes durante el cultivo in vitro En el medio natural la temperatura y la luz variacutean constantemente por lo que las nuevas plantas deben estar protegidas de la fuerte luz solar la cual puede quemar las hojas con soacutelo una pequentildea cantidad de eacutesta La humedad en los frascos es alta y las plantas estaacuten protegidas de ataques por hongos o bacterias Ademaacutes las plaacutentulas han crecido bajo condiciones de alta humedad y por lo tanto tendraacuten cutiacuteculas deacutebiles por lo que necesitan acostumbrase a medios menos huacutemedos antes de ser transplantadas
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Para el trasplante se deben colocar los frascos en un lugar protegido de la lluvia para que se aclimaticen a las nuevas condiciones de luz y temperatura Se deben dejar por 2 a 4 semanas en los frascos tapados Luego se debe ir aflojando las tapas para dejar entrar pequentildeas cantidades de aire hasta el punto de dejarlas descubiertas Se debe revisar si hay hojas marchitas y ver que el sustrato esteacute huacutemedo
Lo ideal es dejarlas sin tapa durante una semana antes de pasarlas a las macetas Para el trasplante se debe elegir un sustrato adecuado para el tipo de planta humedecerlo y transplantar las plantas con cuidado de no dantildear las raiacuteces y evitando la deshidratacioacuten En esta etapa tambieacuten se debe dejar las macetas selladas para evitar una raacutepida deshidratacioacuten e ir abrieacutendolas paulatinamente (McKENDRICK 2000)
24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas 241 Orquiacutedeas terrestres 2411 Cypripedium Esta es una orquiacutedea terrestre de zonas templadas se desarrolla en el Hemisferio Norte como por ejemplo en Guatemala y en Honduras pero donde se encuentra principalmente es en China Su forma maacutes comuacuten de propagacioacuten es in vitro a partir de semillas La forma maacutes eficiente es a partir de semillas inmaduras Existe un intervalo de tiempo entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten eacuteste dependeraacute de la especie y de la zona donde se desarrolle Se asume que existen aproximadamente cuatro semanas entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten El oacuteptimo para una buena germinacioacuten de Cypripedium es entre 42 y 60 diacuteas despueacutes de la polinizacioacuten y entre 14 y 32 diacuteas despueacutes de la fertilizacioacuten La germinacioacuten ocurre entre la segunda y cuarta semana despueacutes de ser sembradas y los protocormos deberiacutean ser cambiados de medio de cultivo cada dos a cuatro meses si no se corre el riesgo de sufrir agotamiento de nutrientes Los rizomas y las raiacuteces se empiezan a desarrollar a partir de los siete meses para luego dar lugar a las primeras hojas Para obtener un buen transplante se deben tener raiacuteces de miacutenimo un centiacutemetro de largo El desarrollo de raiacuteces se ve potenciado al tener un periacuteodo corto de bajas temperaturas (10degC) exposicioacuten a la luz reduccioacuten en la concentracioacuten de iones del medio de cultivo o transferirlas a un compost esteacuteril Al tener raiacuteces suficientes y el tamantildeo adecuado se podraacuten llevar las plantas al lugar donde creceraacuten definitivamente En el momento del transplante las plantas son muy susceptibles al desecamiento por lo cual lo ideal es que los brotes sean maacutes chicos que las raiacuteces El mejor sustrato seriacutea aquel donde crece naturalmente la orquiacutedea (RAumlNNBAumlCK 2007) 2412 Preservacioacuten in vitro de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes Este estudio fue hecho para establecer que parte de tejido es viable para la micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes del noreste de Europa pudiendo asiacute reestablecer dichas orquiacutedeas a sus aacutereas correspondientes La propagacioacuten in vitro de orquiacutedeas
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terrestres de clima templado es maacutes difiacutecil que las orquiacutedeas epiacutefitas de clima subtropical y tropical Las orquiacutedeas terrestres tienen requerimientos maacutes estrictos que las epiacutefitas y se conoce menos sobre sus necesidades especiacuteficas (VAASA y ROSENBERG 2004) En Estonia existen 36 especies de orquiacutedeas terrestres pero solo tres estaacuten bajo proteccioacuten Dactylorhiza baltica Dactylorhiza ruthei Dactylorhiza praetermissa Como explantes para este estudio en el caso de D baltica se ocuparon protocormos en los otros dos casos se utilizaron semillas semi maduras las cuales fueron colectadas siete y diez semanas despueacutes de ser polinizadas Para D baltica se ocupoacute el medio Murashige y Skoog suplementado con 05 mgL de aacutecido naftaleacuten aceacutetico (ANA) y 2 mgL de isonpentenyl adenina Para el caso de las semillas semi maduras se ocuparon los medios de Lindemann de Heller de Norstog y de Murashige y Skoog como control
La composicioacuten del medio y la madurez de las semillas influye mucho en el desarrollo de las orquiacutedeas in vitro Se ha demostrado que se necesita una alta concentracioacuten de microelementos para obtener una correcta germinacioacuten de las semillas Tambieacuten se puede decir que los primeros tres meses son los de mayor crecimiento luego de este tiempo el crecimiento se vuelve maacutes lento (VAASA y ROSENBERG 2004)
Luego de cuatro semanas de crecimiento de D baltica el 60 de los explantes de meristemas apicales empezaron a crecer en cambio los de meristemas laterales no expresaron ninguacuten tipo de crecimiento Las raiacuteces empezaron su desarrollo luego de dos meses despueacutes de la siembra
En el caso de D ruthei y D praetermissa la germinacioacuten se produjo despueacutes de dos meses desde la inoculacioacuten Luego de cuatro y seis meses el mayor crecimiento fue observado en el medio Norstog superando en 14 al medio testigo Murashige y Skoog (VAASA y ROSENBERG 2004)
2413 Longevidad de semillas de orquiacutedeas terrestres Por lo general las orquiacutedeas producen muchas pero pequentildeas semillas que contienen muy pocas reservas de alimento Dichas semillas estaacuten estructuralmente adaptadas para ser dispersadas por el viento pero poco se sabe del destino de eacutestas luego de ser dispersadas Algunos estudios de viabilidad de semillas indican una sobrevivencia de uno a dos antildeos en orquiacutedeas de clima templado Las semillas que son guardadas en laboratorio duran mucho maacutes tiempo Se estudioacute la viabilidad de siete especies de orquiacutedeas norteamericanas dentro de las cuales se encuentran Goodyera pubescens y Liparis liliifolia Las semillas de eacutestas se colocaron en bolsas con suelo y sustratos de bosques provenientes de sus haacutebitats naturales (WHIGHAM et al 2005) En Goodyera pubescens la mayoriacutea de las semillas germinaron en un antildeo Cuatro otras especies germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero algunas semillas no germinadas despueacutes de siete antildeos seguiacutean siendo viables En la especie Liparis liliifolia semillas que han estado cuatro antildeos bajo observacioacuten han tenido una tasa de
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germinacioacuten de un 68 al ser sembradas in vitro junto con el hongo micorriacutezico adecuado Las dos especies restantes no germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero las semillas fueron evaluadas como intactas y testeadas positivamente en cuanto a su viabilidad despueacutes de cuatro antildeos en el suelo Estas observaciones fueron interpretadas como diferentes estrategias para especies especiacuteficas de germinacioacuten in situ (WHIGHAM et al 2005) 2414 Sobrevivencia de orquiacutedeas terrestres transplantadas a sectores urbanos La conservacioacuten de poblaciones de orquiacutedeas silvestres depende del establecimiento de las orquiacutedeas propagadas a los campos Sin embargo se conoce muy poco de los factores bioacuteticos que influencian el establecimiento de orquiacutedeas terrestres a sus haacutebitats naturales Un experimento fue establecido para medir la sobrevivencia de seis especies durante su primer periacuteodo de crecimiento seguido del transplante a un sector urbano en Australia (SCADE et al 2006)
Las orquiacutedeas germinadas simbioacuteticamente crecieron en laboratorio durante cinco meses antes de establecer la plantacioacuten en sitios adyacentes con alta o baja cobertura de malezas Existioacute una muerte gradual de las plaacutentulas durante el primer periacuteodo de crecimiento primeramente por ataque de insectos no siendo evitado por la presencia de una malla cobertora Los iacutendices de sobrevivencia variacutean desde 49 para Microtis media una especie capaz de crecer en un ambiente atiacutepico hasta un 21 para Caladenia arenicola la orquiacutedea nativa maacutes comuacuten de esos sitios Sin embargo no todas las orquiacutedeas sobrevivientes producen tubeacuterculos por lo que la tasa de sobrevivencia despueacutes del primer periacuteodo seco disminuye
La sobrevivencia de las orquiacutedeas sembradas no puede ser comparada con orquiacutedeas de la misma especie que crecieron en los mismos lugares ya que no existioacute la presencia del hongo compatible para estas orquiacutedeas (SCADE et al 2006)
2415 Micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres En India dos orquiacutedeas muy importantes para la horticultura del geacutenero Anoectochilus fueron exitosamente propagadas Noacutedulos aislados de A sikkimensis colectadas en Himalaya y A regalis colectadas en India fueron cultivadas in vitro durante 12 semanas para obtener un maacuteximo de 48 a 56 protocormos y brotes obteniendo como resultado un 95 y 98 de eficiencia respectivamente Durante el repicado de los explantes in vitro de A regalis se observoacute que el nuacutemero total de brotes obtenidos a partir de noacutedulos fue 214 asiacute como tambieacuten 82 puntas de brotes En cambio para A sikkimensis fueron mucho maacutes bajos 123 y 43 respectivamente teniendo un crecimiento maacutes lento pero plantas maacutes fuertes Las raiacuteces de 4 a 6cm crecieron con la presencia de NAA (270 microM ) en el medio asiacute como tambieacuten con carbono activado (02) Durante la aclimatacioacuten la tasa de establecimiento fue entre 95 y 98 Luego de seis meses en invernadero las plantas de A regalis fueron transferidas a bosque nativo donde se obtuvo una tasa de
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sobrevivencia de entre 70 y 95 despueacutes de 12 meses Estas plantas establecidas en bosque nativo estaacuten libres de cualquier defecto morfoloacutegico y de crecimiento (GANGAPRASAD et al 2000) 242 Orquiacutedeas epiacutefitas Estas orquiacutedeas viven en los aacuterboles pero no obtienen de eacuteste su alimento no son paraacutesitas 2421 Preservacioacuten de Cattleya walkeriana usando propagacioacuten in vitro El geacutenero Cattleya se encuentra en Meacutexico y Ameacuterica Central asiacute como tambieacuten en Venezuela Colombia y las laderas de los Andes Esta orquiacutedea tambieacuten se encuentra en varias regiones del Brasil creciendo en aacuterboles rocas cerca de riacuteos lagos y pantanos Las flores de esta orquiacutedea son conocidas debido a su hermosura y a causa de la destruccioacuten de su haacutebitat y a la excesiva coleccioacuten de eacutestas se encuentra en extincioacuten
La composicioacuten del medio de cultivo es esencial para la propagacioacuten in vitro ya que suple todos los nutrientes necesarios para el desarrollo y seraacute distinto dependiendo de cada especie en este caso se utilizoacute la mitad de los macronutrientes del medio Muchos autores sugieren el uso de carboacuten activado en el medio ya que por lo general en muchas especies aumenta el desarrollo de las raiacuteces En este estudio se probaron distintas dosis de carboacuten activado 1 2 4 y 6gL con un pH de 6 (TADEU DE FARIA et al 2002) Las semillas se obtuvieron de flores artificialmente polinizadas en invernadero Plaacutentulas de aproximadamente un centiacutemetro fueron seleccionadas y cultivadas nuevamente en el medio de cultivo Murashige y Skoog pero esta vez con las diferentes dosis de carboacuten activado Se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces el nuacutemero de brotes y el peso de la materia verde total Durante el autoclavado se produce normalmente una hidroacutelisis de sacarina la cual es de 10 aproximadamente este porcentaje aumenta considerablemente al agregar un 1 de carboacuten activado llegando a ser de 95
El desarrollo de las plaacutentulas de C walkeriana aumentan con una mayor concentracioacuten de carboacuten activado asiacute como tambieacuten un mayor tiempo de cultivo El resultado fue que la dosis ideal para el desarrollo de esta orquiacutedea es 2gL de carboacuten activado (TADEU DE FARIA et al 2002) 2422 Establecimiento de cultivos in vitro y micropropagacioacuten de Cattleya aurantiaca (Bateman ex Lindl) Por medio de siembra in vitro se logroacute el establecimiento de C aurantiaca con alto porcentaje de germinacioacuten y desarrollo de protocormos Para la oacuteptima formacioacuten de callo y para la proliferacioacuten de protocormos se determinaron los medios oacuteptimos (MS 10 mgL ANA 10 mgL BA) asiacute como tambieacuten de manera directa sobre explantes de hoja y pseudobulbos (MS 01 mgL ANA 01 mgL GA3)
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Con este uacuteltimo medio tambieacuten se logroacute una oacuteptima regeneracioacuten y desarrollo de plaacutentulas Los medios liacutequidos (sin agitacioacuten) son una buena opcioacuten para conseguir la produccioacuten masiva de protocormos ya que con ellos se optimizoacute la micropropagacioacuten de C aurantiaca Las plaacutentulas micropropagadas presentaron alto porcentaje de sobrevivencia y buen desarrollo despueacutes de su trasplante y aclimatacioacuten lo cual demuestra que es un buen sistema de propagacioacuten para C aurantiaca (GUTIERREZ y SALGADO 2007) En cuanto a transplante y aclimatacioacuten despueacutes de 45 diacuteas de desarrollo in vitro las plaacutentulas de un tamantildeo entre 3 y 5 cm con raiacuteces bien desarrolladas fueron llevadas a condiciones ex vitro eliminando los restos de medio de cultivo con agua potable y ocupando un sustrato de partes iguales de tezontle y corteza de encino cubierta con hojarasca de encino finamente molida Se mantuvieron cubiertas durante 15 diacuteas abriendo cada dos diacuteas hasta poder retirar la tapa en 30 diacuteas Despueacutes de dos meses de haber sido retiradas del cultivo in vitro las plaacutentulas presentaron 70 de sobrevivencia y alcanzaron una altura de hasta 7 cm presentando nuevas hojas y raiacuteces las plantas se muestran vigorosas y capaces de continuar su crecimiento en condiciones ambientales de invernadero (GUTIERREZ y SALGADO 2007)
2423 Establecimiento in vitro y regeneracioacuten de plantas de Laelia autumnalis (Llave y Lex) Lindl Para este estudio se obtuvieron las semillas de una caacutepsula desarrollada despueacutes de 6 meses de la floracioacuten las cuales se sembraron in vitro sin presentar contaminacioacuten ya que la siembra por este meacutetodo es muy eficiente en comparacioacuten al cultivo de semillas libres donde algunas veces se presenta la contaminacioacuten Las observaciones se realizaron cada 15 diacuteas la germinacioacuten se detectoacute en los primeros 15 diacuteas en la mayoriacutea de los medios de cultivos probados con la presencia de protocormos de 1mm de diaacutemetro (HUAPEO y SALGADO 2004) El porcentaje de germinacioacuten que se obtuvo de las semillas cultivadas in vitro de L autumnalis fue de 95 a 100 en todos los medios de cultivo la uacutenica diferencia fue el tiempo entre las germinaciones A excepcioacuten de las semillas cultivadas en el medio MS 100 la germinacioacuten del 100 se obtuvo hasta los 30 diacuteas de cultivo mientras que en el primero la germinacioacuten fue a los 15 diacuteas del cultivo Las plaacutentulas con raiacutez y un par de hojas se lograron a los 90 diacuteas de cultivo en el medio MS 100 alcanzando 07 mm de altura Estas plaacutentulas fueron subcultivadas en medio MS con 05 mgl de ANA y 01 mgl de GA3 para tener plaacutentulas fuente de explante (segmentos de hojas) un medio oacuteptimo de desarrollo de plaacutentulas de L speciosa No fue necesario probar otros medios de cultivos ya que se hicieron pruebas anteriores que demostraron que era el adecuado
Las plaacutentulas de 6 meses de cultivo in vitro despueacutes de su germinacioacuten presentaron una altura promedio de 5 cm con raiacuteces con velamen y hasta dos pares de hojas Segmentos de hoja de eacutestas fueron cultivadas en el medio MS conteniendo ANA BA y GA3 en diferentes concentraciones y se realizaron observaciones cada 30 diacuteas para determinar medios inductores de callo protocormos y raiacuteces La mejor respuesta en formacioacuten de callo fue observada en los segmentos de hoja de plaacutentulas de L autumnalis cultivados en MS con 1 mgl de ANA BA y GA3 iniciando la induccioacuten de
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eacuteste desde los 30 diacuteas de cultivo solamente en un 70 de los explantes cultivados El 100 se logroacute a los 90 diacuteas de cultivo observando callo abundante alrededor de todo el tejido de color blanco con puntos pigmentados de color verde La regeneracioacuten de protocormos de esta orquiacutedea se establecioacute con la siembra de segmentos de hoja de plaacutentulas de 6 meses de edad de manera directa o a partir de callos En callos la produccioacuten fue oacuteptima en el medio MS con 01 mgl de ANABAGA3 ya que a los 60 diacuteas se obtuvieron 50 protocormos por segmento de callo Solamente se produjeron 10 protocormos por explante al cultivarse los segmentos de hoja en MS con 01 mgl de ANABAGA3 a los 120 diacuteas de cultivo (HUAPEO y SALGADO 2004) 25 Aclimatacioacuten Aclimatacioacuten significa que el hombre intercede y guiacutea el proceso de acondicionamiento de las plantas hasta que eacutestas sean aptas para crecer en el campo yo invernadero
Un alto nuacutemero de plantas micropropagadas no sobreviven al cambio desde el cultivo in vitro hacia el ambiente exterior ya sea en campo o invernadero Eacutestos dos uacuteltimos tienen menor humedad relativa niveles maacutes altos de luminosidad y un ambiente seacuteptico los cuales son maacutes estresantes para las plantas micropropagadas La mayoriacutea de las especies que crecen in vitro necesitan un proceso de aclimatacioacuten pudiendo obtener asiacute un nuacutemero suficiente de plantas vivas y vigorosas para trasplantar al suelo (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991)
La aclimatacioacuten no es uacutenicamente para micropropagacioacuten siendo usada ademaacutes en propagacioacuten convencional durante antildeos Despueacutes de cortar las hojas y de haber formado raiacuteces por lo general son aclimatadas antes de ser llevadas al campo o invernadero Ejemplos de dos teacutecnicas comunes son bajar gradualmente la humedad y mantener el nivel de luz con un 50 de sombra antes de trasladarlos al campo Las raiacuteces que han sido cortadas y mal limpiadas muchas veces son focos de infeccioacuten En estos casos las plantas muestran signos de marchitez hojas necrosadas y tambieacuten se puede llegar a la muerte de eacutestas El cultivo in vitro reduce la necesidad de fotosiacutentesis ya que las condiciones de la caacutemara de incubacioacuten proveen a la planta de sacarosa u otro azuacutecar Tambieacuten en estas condiciones se reduce el stress por patoacutegenos al ser un ambiente aseacuteptico Todo esto se traduce en que las plantas micropropagadas no son aptas para el campo yo invernadero (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 251 Stress hiacutedrico El stress hiacutedrico puede ser el resultado de una excesiva transpiracioacuten de las diferentes partes aeacutereas de las plantas especialmente de las hojas o por una inadecuada absorcioacuten de agua por parte de las raiacuteces La cutiacutecula y los estomas son la ruta primaria de peacuterdida de agua desde de las hojas provenientes de esta teacutecnica reproductiva 2511 Cutiacutecula La cutiacutecula es una membrana compuesta por una matriz de cutina que a su vez se encuentra cubierta en su superficie por ceras cuya funcioacuten primaria consiste en limitar la peacuterdida de agua por transpiracioacuten La permeabilidad del agua a traveacutes de la cutiacutecula se ve influenciada principalmente por la estructura y la cantidad de
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ceras cuticulares y epicuticulares no vieacutendose afectada la peacuterdida de agua por el grosor de eacutesta o la naturaleza quiacutemica de la matriz de la cutina La estructura cristalina de la parte encerada de las hojas es distinta en las plantas micropropagadas con respecto a las plantas que crecen en el campo La cera epicuticular de las hojas de plantas in vitro tienen una proporcioacuten maacutes alta de esteres y de componentes polares por el contrario tienen unas cadenas de hidrocarbonos mucho maacutes cortas Esto hace que las plantas in vitro pierdan maacutes agua que las cultivadas en campo o invernadero
Las plantas que han crecido en el campo son naturalmente de color verde pero el color de las plantas cultivadas in vitro es diferente y se puede ver a simple vista Las plantas que son pasadas a invernadero y que tengan un color verde se aclimatan de mejor forma al ambiente exterior (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 2512 Estomas La estructura estomaacutetica y su funcionamiento han sido implicados recurrentemente en el desbalance de agua exhibido por plantas micropropagadas al momento de ser removidas del cultivo in vitro Estudios con microscopiacutea de scanner electroacutenico han indicado que la estructura estomaacutetica presente en algunas especies de plantas cultivadas in vitro difieren marcadamente de las cultivadas en invernadero o en el suelo Debido a que las primeras presentan estomas de mayor tamantildeo y maacutes redondos a diferencia de las plantas cultivadas de manera normal que presentan estomas maacutes pequentildeos y eliacutepticos lo que resulta en una deshidratacioacuten maacutes raacutepida en el caso de las provenientes de cultivo in vitro (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 252 Humedad Debido a la anatomiacutea y la condicioacuten fisioloacutegica de las plantas desarrolladas in vitro donde se ha mantenido una alta humedad relativa es necesario regar al momento del traslado para obtener una alta sobrevivencia Muchos laboratorios aseguran que hay que evitar tener un sistema de aspersioacuten ya que se produce el ambiente necesario (muy huacutemedo) para la aparicioacuten de hongos algas o bacterias Otros meacutetodos incluyen el uso de humidificadores o poner las macetas en un lugar cerrado donde se retenga vapor para esto se pueden usar por ejemplo tapas de polietileno Este meacutetodo es relativamente econoacutemico pero se debe tener control del calor y monitorear la falta de agua (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 253 Luz Durante la etapa in vitro las plantas estaacuten expuestas a altos niveles de luminosidad lo que se traduce en hojas delgadas Antes del traslado se recomienda mantener las plantas con un 50 de sombra para asiacute poder aclimatarlas de mejor manera esto debido a que las plantas micropropagadas tienen un bajo control sobre la transpiracioacuten y un inadecuado mecanismo de fotosiacutentesis La sombra reduce la transpiracioacuten evitando excesivas peacuterdidas de agua asiacute como tambieacuten el exceso de luz destruye las moleacuteculas de clorofila Luego del periacuteodo bajo sombra se deben mover las macetas gradualmente hacia el nivel de luz al cual seraacute llevado para su crecimiento final (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 254 Temperatura La temperatura del aire y del medio o sustrato de crecimiento estaacute generalmente controlado durante el periacuteodo de aclimatacioacuten El calor es necesario en los meses de invierno y el friacuteo (enfriar) es esencial en los meses de verano Ajustando la cantidad de sombra y humedad se obtiene un control sobre la temperatura El
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enfriamiento se puede obtener gracias a ventilacioacuten abanicos niebla o aire acondicionado El calor puede provenir del sistema existente en el edificio o invernadero donde esteacuten ubicadas las macetas o por las laacutemparas ocupadas para el control del fotoperiacuteodo El rango de temperatura que se mantiene por lo general es entre los 13 y 30ordmC y esta determinado principalmente por la especie en cuestioacuten La temperatura de la zona donde se encuentran las raiacuteces es muy importante para el crecimiento lo ideal es que dicho sector tenga una mayor temperatura que el aire fomentando el crecimiento de las raiacuteces e incrementando la humedad alrededor de la planta Durante el verano esto es difiacutecil de obtener ya que la temperatura del aire es muy alta debido a la alta radiacioacuten solar Terminado el proceso de aclimatacioacuten esto ya no es necesario (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 255 Fotosiacutentesis Las plantas sufren un cambio radical cuando son removidas desde cultivo in vitro ya que son forzadas a cambiar de heterotroacuteficas a autotroacuteficas y la fotosiacutentesis se vuelve fundamental para la sobrevivencia Las hojas de las plantas in vitro no estaacuten formadas para hacer fotosiacutentesis ya que en la caacutemara de incubacioacuten no se produce un fuerte intercambio gaseoso esto debido a que la sacarosa es entregada a traveacutes del medio de cultivo Las hojas de las plantas que son trasladadas al campo o invernadero sufren deterioro debido a que no estaacuten formadas para la fijacioacuten de carbono Esto se produce por un tiempo aproximado de cuatro semanas despueacutes de las cuales las hojas nuevas suplen a las viejas Otro punto es que las hojas de las plantas cultivadas in vitro contienen menor proporcioacuten de clorofila que las plantas que han crecido normalmente en el campo En un estudio de coliflor cultivado in vitro se midioacute el CO2 y se obtuvo un balance negativo el cual se mantuvo durante dos semanas despueacutes del transplante Algo similar ocurrioacute con frutilla despueacutes del transplante las hojas se deterioraron raacutepidamente lo que quiere decir que no hubo incremento en la fijacioacuten de carbono indicando falta de desarrollo en la competencia fotosinteacutetica
El bajo nivel de CO2 durante el cultivo in vitro limita el proceso de fotosiacutentesis lo cual se puede compensar usando sacarosa en el medio de cultivo Tambieacuten se puede incrementar el nivel de luz y CO2 obteniendo un fuerte aumento en el crecimiento de varias especies como orquiacutedeas clavel etc (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 256 Sustrato Un sustrato es todo material soacutelido distinto del suelo natural mineral u orgaacutenico que colocado en un contenedor en forma pura o en mezcla permite el anclaje del sistema radicular de la planta desempentildeando por lo tanto un papel de soporte para la planta El sustrato puede intervenir o no en el complejo proceso de la nutricioacuten mineral de la planta (INFOAGRO 2007) El sustrato y los contenedores dentro de los cuales se van a transplantar las plaacutentulas in vitro son importantes para una buena sobrevivencia
Los sustratos ejercen una influencia significativa en la arquitectura del sistema radical de las plantas y en las asociaciones bioloacutegicas de este con el suelo influenciando el
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estado nutricional y la translocacioacuten de agua en el sistema suelo-planta-atmoacutesfera Uno de los requisitos fundamentales que debe cumplir el sustrato para su utilizacioacuten es la sanidad Cuando estos no se elaboran almacenan o manejan correctamente pueden contaminarse y provocar serios dantildeos a las plantas durante la aclimatacioacuten por esta razoacuten son preferidos como componentes para su elaboracioacuten materiales inertes o aquellos en las cuales el proceso de obtencioacuten garantice la mayor desinfeccioacuten posible
Uno de los factores de mayor importancia a la hora de seleccionar los materiales que pueden constituir el sustrato es su disponibilidad tanto en teacuterminos de facilidad de obtencioacuten o suministro como de su costo (VILCHEZ et al 2007)
La presencia de inhibidores o tambieacuten cambios en el pH del sustrato pueden afectar el crecimiento de las raiacuteces y consecuentemente el eacutexito del transplante
Muchos laboratorios y viveros transplantan a un sustrato uniforme debiendo ser eacuteste adecuado en cuanto a soporte de las plantas pH porosidad aireacioacuten y drenaje (DEBERGH y ZIMMERMAN 1991)
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3 MATERIAL Y MEacuteTODO
Para la realizacioacuten de este trabajo se utilizoacute el siguiente material y meacutetodo
31 Material La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio e invernadero de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal pertenecientes a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de Chile
311 Material vegetal Se utilizaron plaacutentulas de C virescens cultivadas in vitro a partir de semillas las cuales fueron proporcionadas por el laboratorio estas plaacutentulas fueron separadas y repicadas para aumentar la poblacioacuten y obtener la cantidad necesaria para el ensayo
FIGURA 2 Plaacutentulas de C virescens en caacutemara de crecimiento in vitro
312 Materiales Los materiales que se utilizaron fueron los siguientes Equipos autoclave caacutemara de flujo laminar dispensador de medios medidor
de pH agitador magneacutetico horno microondas balanza mechero termoacutemetro Materiales vasos de precipitado matraces probetas pipetas papel de
aluminio frascos de vidrio placas Petri pinzas bisturiacute macetas regadera Soluciones soluciones madre (Medio MS) gelificante etanol 70 y 95
32 Meacutetodo A continuacioacuten se da a conocer la metodologiacutea con la cual se trabajoacute 321 Preparacioacuten del medio de cultivo Para la obtencioacuten de plantas a traveacutes de la micropropagacioacuten se ocupoacute el medio basal de MURASHIGE y SKOOG (1962) tambieacuten llamado medio MS Este medio tiene un pH de entre 56-57 Posteriormente se dosificoacute con el dispensador de medios para que cada frasco tenga una cantidad adecuada (25 mL) y se llevoacute a autoclave para esterilizar a 12 atm 120ordm C por 20 min
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322 Obtencioacuten del material vegetal Al tener el medio esterilizado se procedioacute a la separacioacuten y repicado de plaacutentulas existentes en el laboratorio Las siembras se realizaron en el mes de mayo del 2007 Estas siembras se realizaron en la caacutemara de flujo laminar de modo de asegurar que la siembra sea 100 aseacuteptica Estas plaacutentulas fueron mantenidas en la caacutemara de incubacioacuten hasta obtener los tamantildeos requeridos para el ensayo donde las condiciones fueron las siguientes
minus Temperatura ambiental de 23-25ordm C minus Fotoperiacuteodo de 16 horas minus Intensidad lumiacutenica controlada de 50-55 micromol m-2s-1
323 Sustratos Se utilizaron tres tipos de sustratos el primero corresponde a una mezcla de turba + perlita (11) el segundo corresponde a Sphagnum (100) y el tercero corresponde a una mezcla de turba + arena (11) Una vez realizadas las mezclas se procedioacute a una esterilizacioacuten en un autoclave a 121ordm C por 20 minutos a 12 atmoacutesfera De esta forma se trabajoacute con material limpio y sano evitando ataque de hongos o bacterias El anaacutelisis quiacutemico de los sustratos se muestra en el Anexo 2 324 Plantacioacuten Las plaacutentulas con un promedio de cuatro meses en condiciones de caacutemara de crecimiento in vitro obtuvieron el tamantildeo adecuado para ser utilizadas Se sacaron de los frascos y se plantaron en las macetas de plaacutestico transparente con los sustratos Posteriormente fueron dejadas en la sala del laboratorio donde se debioacute asperjar con solucioacuten nutritiva Hoagland y fungicida Captan CUADRO 1 Composicioacuten de solucioacuten nutritiva Hoagland
KNO3 102 gL Ca(NO3) 4 H2 O 0492 gL
NH4H2 (PO4) 023 gL MgSO4 7 H2O 049 gL
H3BO3 286 mgL MnCl2 2 H2O 181 mgL CuSO4 5 H2O 008 mgL ZnSO4 5 H2O 022 mgL Na2MoO4 H2O 009 mgL
FeSO4 7 H2O 05 06 mL FUENTE FINCK 1988 325 Disentildeo de los ensayos Este trabajo de investigacioacuten constoacute de un ensayo con dos etapas Antes que todo se realizoacute la separacioacuten y repicado in vitro de plaacutentulas de C virescens para la obtencioacuten del nuacutemero necesario de plantas En la etapa 1 se utilizaron tres tamantildeos de plaacutentulas obtenidas in vitro de 1-2cm de 2-3cm y de maacutes de 3cm de altura que se transplantaron a tres sustratos turba + perlita 11(vv) Sphagnum (100) y turba + arena 11 (vv) La turba provino de la Sociedad
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Minera Patagonia Peat SA en Hijuelas el Sphagnum de la empresa Lonquen Chile de Puerto Montt y la perlita se obtuvo a traveacutes del sitio web wwwjardisencl (representante legal Walter Rathgeb Penza Ingeniero Agroacutenomo Santiago) Las plaacutentulas se plantaron de acuerdo a su tamantildeo las de maacutes de 3cm se colocaron de 6 por maceta las de 2 a 3cm de a 8 por maceta y las maacutes chicas de a 10 por maceta Estas macetas fueron dejadas en una sala de aclimatacioacuten con una temperatura promedio de 20ordm C intensidad lumiacutenica de 50-55 micromol m-2s-1 y 14-16 hrs de fotoperiacuteodo Se fertilizoacute asperjando cada cinco diacuteas con solucioacuten nutritiva Hoagland Esta etapa se llevoacute a cabo durante dos meses desde el cinco de septiembre hasta el cinco de noviembre de 2007
En la etapa 2 se continuoacute el proceso de aclimatacioacuten en invernadero de las plaacutentulas obtenidas en la etapa 1 que despueacutes de dos meses teniacutean un mayor tamantildeo y se habiacutean acondicionado al ambiente exterior (fuera de la caacutemara de crecimiento) Las plantas se mantuvieron en las macetas durante tres semanas para aclimatarlas y luego las plantas sobrevivientes fueron transplantadas a macetas maacutes grandes individuales durante tres meses aproximadamente hasta el cinco de marzo 2008 Estas nuevas macetas tuvieron como sustrato turba y suelo (trumao) en igual proporcioacuten (Anexo 2) La temperatura promedio de invernadero fluctuoacute de 13 a 35 degC seguacuten el mes En enero el promedio fue de 25 (Anexo 3) Para bajar la temperatura alrededor de 5deg C se instaloacute una malla Rachel 326 Disentildeo experimental El disentildeo experimental utilizado fue completamente al azar ordenado como experimento factorial con dos factores tamantildeo (3) y sustrato (3) Cada tratamiento tuvo tres repeticiones con un miacutenimo de 6 plantas por recipiente 327 Variables a evaluar Durante los dos meses en que las macetas estuvieron en la sala de aclimatacioacuten se evaluoacute el desarrollo foliar contando el nuacutemero de hojas una vez al mes Posteriormente se trasladaron las mismas macetas a invernadero durante tres semanas para continuar con la aclimatacioacuten de las plaacutentulas Transcurrido este tiempo se transplantaron las plaacutentulas sobrevivientes a macetas individuales y continuoacute mensualmente la evaluacioacuten de eacutestas (nuacutemero de hojas) hasta la obtencioacuten de plantas establecidas Al momento del transplante y al final del ensayo se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces asiacute como tambieacuten al final del ensayo de evaluoacute el crecimiento en altura (cm) La sobrevivencia fue evaluada al final del ensayo por maceta
Tanto en la sala de aclimatacioacuten coacutemo en el invernadero se registroacute la temperatura con la ayuda de un termoacutemetro de maacutexima y miacutenima (Anexo 3) 328 Anaacutelisis estadiacutestico Una vez obtenidos los datos se procedioacute a comprobar si estos cumpliacutean con los supuestos de aleatoriedad normalidad y homogeneidad de varianzas que exige este tipo de anaacutelisis En el caso de no cumplirse estos supuestos los datos se transformaron utilizando log10(x+05) raiacutez(x+05) o 1x para normalizarlos
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y enseguida se sometioacute los datos a un anaacutelisis estadiacutestico (ANDEVA) Posteriormente en los casos en que se observoacute diferencias significativas en el ANDEVA se aplicoacute una prueba de rangos muacuteltiples (Tukey) al 5 de significancia Para las variables no parameacutetricas que no cumplieron con los supuestos para un anaacutelisis de varianza se realizoacute la prueba de KruskalndashWallis y las comparaciones muacuteltiples a traveacutes del test de Dunn con un nivel de 5 de significancia
Se utilizaron los programas estadiacutesticos STATGRAPHICS 20 y GRAPHPAD PRISM 5 para el anaacutelisis de datos
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4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
En los siguientes puntos se discuten los resultados obtenidos en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens
En la Figura 3 se observan plaacutentulas de C virescens micropropagadas en medio MS en caacutemara de crecimiento al inicio del ensayo (A) y en invernadero despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten (B)
BA
FIGURA 3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten
A continuacioacuten se presentan los resultados obtenidos para las variables analizadas (Cuadro 2 y 3) de esta manera se pueden visualizar en general los resultados obtenidos en el proceso de aclimatacioacuten durante seis meses
CUADRO 2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de raiacuteces
inicial y final Variables
Hojas finales (nuacutemero)
Raiacuteces iniciales (nuacutemero)
Raiacuteces finales (nuacutemero)
Tamantildeo de plaacutentulas 36 24 37 47 29 46
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 61 43 76
Sustratos 53 36 56 43 29 51
Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 46 27 49
Significa que hay diferencias significativas al 95 Test de Dunn
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Las variables no parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en hojas finales y raiacuteces iniciales en sus rangos de distribucioacuten Las raiacuteces finales no presentaron diferencias seguacuten el sustrato utilizado pero de acuerdo al tamantildeo hubo diferencias en su distribucioacuten
CUADRO 3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas
Variables Altura final de plaacutentulas
(cm) Sobrevivencia
Tamantildeo de plaacutentulas
36 c 567 b 47 b 821 a
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 59 a 908 a
Sustratos 52 a 933 a
41 ab 59 b Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 49 b 772 a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY Las variables parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en altura final de hojas y en sobrevivencia 41 Nuacutemero de hojas finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentulas y de sustratos para la variable nuacutemero final de hojas 411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula Seguacuten el Cuadro 2 y Figura 4 las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero final de hojas Las plaacutentulas pequentildeas de 1-2 cm obtuvieron el nuacutemero maacutes bajo de hojas finales con una media de 36 hojas por plaacutentula lo cual es la mitad de las hojas finales que se obtuvo con las plaacutentulas de mayor tamantildeo (61 hojas aproximado por plaacutentula) Para las plaacutentulas medianas de 2-3 cm se obtuvo una media de 47 hojas por plaacutentula (Figura 4)
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Hojas finales
1-2 cm 2-3cm maacutes de 3 cm0
5
10
15
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn)
BLANCO (2006) sentildeala que plaacutentulas cultivadas in vitro crecen bajo condiciones especiales como alta humedad relativa y baja luminosidad ademaacutes son suplidas con sacarosa Estas condiciones fueron proporcionadas en una caacutemara de crecimiento en el laboratorio donde las plantas micropropagadas no son dependientes por completo de su fotosiacutentesis son heteroacutetrofas Parece ser necesario un estiacutemulo para convertirse en organismos totalmente capaces de sustentar sus propios requisitos de carbono y nitroacutegeno reducido pasando de esta manera a ser autoacutetrofos
Al ser sacadas de un medio in vitro las hojas no estaacuten preparadas para producir su propio alimento y sobreviven gracias a que el medio de cultivo le proporciona los nutrientes necesarios para vivir En este punto muchas de las hojas mueren y nacen hojas nuevas capaces de generar su alimento supliendo asiacute las hojas viejas (SEELYE et al 2003) En este ensayo las plaacutentulas de Chloraea virescens presentaron en general una buena adaptacioacuten al ser sacadas de un medio in vitro
Se observoacute que plaacutentulas con menor tamantildeo al ser aclimatadas y tener menor tejido fue maacutes difiacutecil y maacutes lento que empezaran a generar nuevos tejidos y materia orgaacutenica a partir de dioacutexido de carbono POSPIacuteŠILOVAacute et al (1999) sentildeala que al tener los estomas con desarrollo incompleto maacutes grandes y de forma maacutes redonda pierden maacutes agua lo cual puede provocar una peacuterdida de hojas muriendo asiacute la plaacutentula Por esta razoacuten las plaacutentulas pequentildeas se demoran maacutes tiempo en generar hojas nuevas es por ello que al finalizar este estudio muestran el menor nuacutemero final de hojas 412 Efecto del tipo de sustrato Al analizar la influencia del tipo de sustrato se encontraron diferencias significativas entre los tres sustratos utilizados Seguacuten el Cuadro 2 y la Figura 5 el sustrato donde se obtuvo mejores resultados fue
27
turba+perlita en el cual se observoacute un promedio de 53 hojas por plaacutentula siendo Sphagnum el maacutes bajo con 43 hojas por plaacutentula De acuerdo a los resultados del anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados el sustrato turba+perlita tiene mayor cantidad de nitroacutegeno foacutesforo calcio magnesio y azufre disponible comparativamente con los otros dos sustratos (Sphagnum y arena+turba) (Anexo 2)
Hojas finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
Sustratos
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) Para la brotacioacuten y el crecimiento de las plantas se necesita agua y Nitroacutegeno lo que favorece a una mayor tasa de aparicioacuten de hojas lo que se traduce en una mayor cantidad de hojas finales El Nitroacutegeno se encuentra en mayor cantidad en el sustrato turba+perlita debido a lo cual los mejores resultados se obtienen en dicho sustrato 413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Despueacutes de analizados los efectos individuales del tamantildeo y del sustrato al interactuar ambos factores existen diferencias significativas La mejor interaccioacuten se obtuvo con el sustrato turba+perlita y con el mayor tamantildeo de la plaacutentula (Figura 6) Debido a la buena estructura (porosa) de dicho sustrato se podriacutea decir que se favorecioacute la absorcioacuten radicular de nutrientes obteniendo por ello un mayor nuacutemero de hojas finales Para los menores tamantildeos no se observan diferencias significativas obteniendo como promedio 41 hojas por plaacutentula Para el mayor tamantildeo el promedio fue de 6 hojas por plaacutentula
28
Hojas finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 42 Raiacuteces iniciales Este paraacutemetro se evaluoacute luego de la primera etapa de aclimatacioacuten la cual se realizoacute en una sala de aclimatacioacuten del laboratorio Se analizoacute la influencia de diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos sobre la variable nuacutemero raiacuteces iniciales (Anaacutelisis de Kruskal-Wallis en Anexo 7)
FIGURA 7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses de pre aclimatacioacuten
29
En la Figura 7 se puede observar los resultados de pre aclimatacioacuten en sala de laboratorio En esta etapa ya es posible ver la presencia de raiacuteces desarrolladas 421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula En el Cuadro 2 se puede observar que las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero inicial de raiacuteces y en la Figura 8 se puede comprobar que para los dos tamantildeos de plaacutentula maacutes pequentildeos no se observa gran cantidad de raiacuteces esto no impidioacute el desarrollo posterior de las plaacutentulas las cuales lograron enraizar al final del estudio Esto se contrapone a lo observado en un estudio de Lapageria rosea donde la presencia de raiacutez y brote para lograr una multiplicacioacuten exitosa de plantas es de vital importancia Incluso algunas plaacutentulas de L rosea no brotan en condiciones in vitro en donde tienen las mejores condiciones nutricionales y hormonales para hacerlo Esto se debe a factores internos de la plaacutentula siendo muy difiacutecil que broten inmediatamente en caacutemara de aclimatacioacuten donde ya dejan de recibir los nutrientes necesarios de manera directa y requieren de balances de energiacutea para poder seguir elongando raiacuteces absorber nutrientes y brotar para poder obtener los carbohidratos necesarios para seguir su crecimiento (BLANCO 2006) El tamantildeo de plaacutentula tiene importancia para el desarrollo de raiacuteces se distingue notoriamente que en los tamantildeos maacutes grandes el nuacutemero de raiacuteces es mayor comparativamente con los tamantildeos pequentildeos donde el nuacutemero de raiacuteces fue escaso Debido a la presencia de maacutes hojas existe una mayor cantidad de aacuterea fotosinteacutetica esta situacioacuten estimula el crecimiento de las raiacuteces para la obtencioacuten de agua y nutrientes
Raices iniciales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
2
4
6
8
10
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o inicial de ra
iacuteces
FIGURA 8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn)
30
422 Efecto del tipo de sustrato Para el sustrato turba+perlita se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas en el nuacutemero de raiacuteces con respecto a los dos otros sustratos esto se puede ver en el Figura 9 donde se observa que se obtuvieron los mayores resultados En cualquier medio de crecimiento el espacio no ocupado por un soacutelido se llama porosidad este espacio puede ser ocupado en parte para retener agua y en parte para proporcionarle aire a las raiacuteces La ausencia de uno de estos elementos es perjudicial para las plantas La turba es conocida por tener estas propiedades y la perlita tambieacuten por esta razoacuten se sabe que la mezcla turba-perlita provee propiedades fiacutesicas excelentes como medio de crecimiento y propagacioacuten (INFOAGRO 2007) Estos resultados con turba-perlita (298 de materia orgaacutenica) coinciden con los obtenidos por DIAZ et al (2004) quienes al utilizar un sustrato compuesto por 100 de humus de lombriz para aclimatar cantildea de azuacutecar obtuvieron el mayor nuacutemero de raiacuteces Esto puede atribuirse al importante aporte de materia orgaacutenica del humus (47) lo que le confiere una mejor estructura obtenieacutendose una excelente porosidad del sustrato La aireacioacuten del suelo es necesaria para favorecer la maacutexima absorcioacuten de nutrientes por las raiacuteces Esto tambieacuten sucede en el sustrato turba+perlita el cual posee la mayor cantidad de materia orgaacutenica de los tres sustratos utilizados
Raices iniciales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
2
4
6
8
10
Sustratos
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato En los anaacutelisis para la variable nuacutemero de raiacuteces se puede decir que la mejor interaccioacuten se presentoacute para el sustrato de turba+perlita junto con el mayor tamantildeo de plaacutentulas obteniendo los valores maacutes altos entre los nueve tratamientos La presencia de raiacuteces luego de la micropropagacioacuten aumenta la posibilidad de eacutexito en el transplante ya que se crea un favorable balance de agua Pero esto no quiere
31
decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
10
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
32
En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
33
El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
34
Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
II
2415 Micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres 13
242 Orquiacutedeas epiacutefitas 14
2421 Preservacioacuten de Cattleya walkeriana usando propagacioacuten in vitro 14
2422 Establecimiento de cultivos in vitro y micropropagacioacuten de Cattleya
aurantiaca (Bateman ex Lindl) 14
2423 Establecimiento in vitro y regeneracioacuten de plantas de Laelia autumnales
(Llave y Lex) Lindl 15
25 Aclimatacioacuten 16
251 Stress de agua 16
2511 Cutiacutecula 16
2512 Estomas 17
252 Humedad 17
253 Luz 17
254 Temperatura 17
255 Fotosiacutentesis 18
256 Sustrato 18
3 MATERIAL Y METODO 20
31 Material 20
311 Material vegetal 20
312 Material de laboratorio 20
32 Meacutetodo 20
321 Preparacioacuten del medio de cultivo 20
322 Obtencioacuten del material vegetal 20
323 Sustratos 21
324 Plantacioacuten 21
325 Disentildeo de los ensayos 21
326 Disentildeo experimental 22
327 Paraacutemetros a evaluar 22
328 Anaacutelisis estadiacutestico 22
III
4 PRESENTACIOacuteN Y DISCUSION DE RESULTADOS 24
41 Nuacutemero de hojas finales 25
411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula 25
412 Efecto del tipo de sustrato 26
413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato 27
42 Raiacuteces iniciales 28
421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula 29
422 Efecto del tipo de sustrato 30
423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato 30
43 Raiacuteces finales 31
431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula 32
432 Efecto del tipo de sustrato 32
433 Interaccioacuten tamantildeo de plaacutentula y sustrato 33
44 Altura 35
45 Sobrevivencia 36
5 CONCLUSIONES 38
6 BIBLIOGRAFIA 39
7 ANEXOS 42
IV
INDICE DE CUADROS
Cuadro Paacutegina
1 Composicioacuten de solucioacuten nutritiva Hoagland 21
2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de
raiacuteces inicial y final 24
3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas 25
V
INDICE DE FIGURAS
Figura Paacutegina
1 C virescens 7
2 Plaacutentulas de C virescens en caacutemara de crecimiento in vitro 20
3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS
B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten 24
4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) 26
5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final
de hojas (Test de Dunn) 27
6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 28
7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses
de pre aclimatacioacuten 28
8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 29
9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final
de raiacuteces (Test de Dunn) 30
10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no
parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 31
11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses
de aclimatacioacuten 31
12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 32
13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final
de raiacuteces (Test de Dunn) 33
14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre para la variable no
parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 34
15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) 35
VI
16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable
parameacutetrica altura final de plaacutentulas 35
17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) 37
18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la
variable parameacutetrica de sobrevivencia 37
VII
INDICE DE ANEXOS
Anexo Paacutegina
1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962)
y suplementos orgaacutenicos 44
2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio 45
3 Registro de temperaturas miacutenimas maacutexima y promedio durante
el estudio 46
4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas
finales 47
5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales 47
6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces
iniciales 48
7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces
iniciales 48
8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces
finales 49
9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales 49
10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en
aclimatacioacuten 50
11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura 50
12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de
plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten 51
13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia 51
14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea 52
1
RESUMEN Dentro del esquema de micropropagacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens la aclimatacioacuten es la etapa final donde la manipulacioacuten debe ser muy cuidadosa ya que es donde se produce el mayor iacutendice de mortandad principalmente en el proceso de trasplante Esta etapa es muy importante ya que gracias a ella se veraacute la eficiencia del proceso y la calidad final de las plantas producidas in vitro por eso el objetivo general de este trabajo es evaluar la influencia del tamantildeo de plaacutentulas y utilizacioacuten de distintos sustratos en la aclimatacioacuten ex vitro de plaacutentulas de C virescens Se utilizaron plaacutentulas de Chloraea virescens obtenidas a partir de la micropropagacioacuten de protocormos provenientes de germinacioacuten asimbioacuteticas de semillas efectuada en el laboratorio de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal de la Universidad Austral de Chile Las plaacutentulas fueron repicadas hasta obtener el nuacutemero adecuado para el ensayo Luego fueron trasladadas a una sala del laboratorio en macetas de seis ocho y diez plaacutentulas dependiendo del tamantildeo de la plaacutentula (maacutes de 3cm 2-3cm y 1-2cm respectivamente) por dos meses posteriormente fueron transferidas a 3 sustratos turba+perlita (11) Sphagnum y turba+arena (11) y fueron llevadas a invernadero durante cuatro meses Las variables evaluadas fueron nuacutemero final de hojas nuacutemero inicial y final de raiacuteces altura y sobrevivencia de las plaacutentulas Los resultados obtenidos demostraron que los tamantildeos y los sustratos ocupados influyen en el crecimiento de las plaacutentulas El mejor tamantildeo para la aclimatacioacuten es de maacutes de 3cm obteniendo con eacuteste los mejores resultados en todas las variables evaluadas Lo mismo ocurrioacute con el sustrato turba+perlita el cual fue el mejor evaluado
2
REacuteSUMEacute Dans le scheacutema de la micropropagation de Chloraea virescens lacclimatation est la derniegravere eacutetape ougrave il faut ecirctre prudent parce que cest agrave ce moment lagrave que les taux de mortaliteacute sont les plus eacuteleveacutes principalement dans le processus de transplantation Cette eacutetape est tregraves importante parce que ce sera gracircce agrave elle quacuteon verra lefficaciteacute du processus et la qualiteacute finale des plantes produites in vitro Lobjectif geacuteneacuteral de cette eacutetude est dacuteeacutevaluer linfluence de la taille des plantes et lutilisation de divers substrats pour lacuteacclimatation de C virescens On a utiliseacute des plantes de C virescens obtenue a partir de la micropropagation de protocormos en provenance du laboratoire de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal de la Universidad Austral de Chile Les plantes ont eacuteteacute subdiviseacutee pour obtenir le nombre approprieacute Elles ont ensuite eacuteteacute transfeacutereacutees agrave des pots dans une piegravece du laboratoire de six huit et dix en fonction de la taille de la plante (plus de 3 cm de 2-3 cm et 1-2 cm respectivement) pour deux mois ensuite elles ont eacuteteacute transfeacutereacutee dans trois substrats tourbe + perlite (11) Sphagnum et tourbe + sable (11) et elles ont eacuteteacute mises dans une serre pour quatre mois Les variables agrave eacutevaluer sont nombre final de feuilles nombre de racines au deacutebut et agrave la fin la hauteur et la survie des plantes Les reacutesultats ont montreacute que la taille et les substrats utiliseacutes ont une influence sur la croissance des jeunes plantes La taille ideacuteale pour lacclimatation est plus de 3cm avec cette derniegravere on a obtenu les meilleurs reacutesultats dans toutes les variables qui ont eacuteteacute eacutevalueacutees Le mecircme reacutesultat sest produit avec le substrat de tourbe + perlite lequel a aussi montreacute les meilleurs reacutesultats
3
1 INTRODUCCION La familia Orchidaceae (Orquiacutedeas) es la que mayor nuacutemero de especies comprende en el Reino Vegetal Se estima que debe haber alrededor de 35000 especies de Orquiacutedeas en todo el mundo pertenecientes a unos 750 geacuteneros ademaacutes de miles de hiacutebridos En Chile esta familia es probablemente el grupo menos estudiado de plantas con flores y soacutelo se han realizado estudios en base a su taxonomiacutea biologiacutea reproductiva fenologiacutea y distribucioacuten
La produccioacuten de flores de orquiacutedeas ha tomado importancia por la belleza de sus flores dada la enorme variedad de formas colores y perfumes Existen orquiacutedeas terrestres y epiacutefitas estas uacuteltimas representan maacutes del 90 del total de especies y son las que mayoritariamente se encuentran a la venta Las flores tienen un alto valor ornamental o como flor cortada ya que eacutestas pueden permanecer separadas de las plantas sin marchitarse hasta tres o cuatro semanas y en la planta permanecen hasta tres meses
La obtencioacuten de plantas de orquiacutedeas a partir de semillas es muy difiacutecil ya que eacutestas son diminutas y de germinacioacuten irregular Como una alternativa de obtencioacuten de plantas aparece la micropropagacioacuten pudiendo asiacute aumentar el nuacutemero de plantas en forma relativamente faacutecil y raacutepida Luego de la etapa de micropropagacioacuten viene la etapa de aclimatacioacuten en la cual la manipulacioacuten debe ser en extremo cuidadosa ya que es donde se produce el mayor iacutendice de mortandad principalmente en el proceso de transplante Esta etapa es muy importante ya que gracias a ella se veraacute la eficiencia del proceso y la calidad final de las plantas producidas in vitro Considerando la produccioacuten de plaacutentulas mediante la micropropagacioacuten en este trabajo se plantea la hipoacutetesis que ldquoel tamantildeo de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro y los distintos sustratos son factores que inciden en el desarrollo y su aclimatacioacutenrdquo El objetivo general de este trabajo es
Evaluar la influencia del tamantildeo de plaacutentulas y utilizacioacuten de distintos sustratos en la aclimatacioacuten ex vitro de plaacutentulas de C virescens
Los objetivos especiacuteficos son
Medir el efecto del tamantildeo de plaacutentulas de C virescens en la sobrevivencia y desarrollo de eacutestas ex vitro
Comparar el uso de tres sustratos en el desarrollo y sobrevivencia de plaacutentulas de C virescens
4
2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA 21 Descripcioacuten general 211 Descripcioacuten geograacutefica Las orquiacutedeas pertenecen a la familia Orchidaceae clase Liliopsida (monocotiledoacuteneas) Son plantas herbaacuteceas perennes originarias de regiones tropicales y subtropicales pero existen tambieacuten en todos los continentes a excepcioacuten de las regiones polares La zona donde se encuentran estas plantas estaacute comprendida entre los 68ordm latitud norte y 56ordm latitud sur Es evidente que en los liacutemites extremos de estas latitudes se encuentran pocos geacuteneros y especies esto va en aumento desde las regiones temperadas hasta las regiones intertropicales donde el nuacutemero es el mayor Los territorios maacutes interesantes por su nuacutemero son
Ameacuterica del Sur y Ameacuterica Central Asia e India Madagascar Australia es el continente menos poblado en orquiacutedeas dentro de las regiones
del globo Por su parte Europa presenta numerosos geacuteneros y especies de orquiacutedeas
terrestres Soacutelo en Francia existen 75 especies repartidas en 16 geacuteneros todas terrestres (LECOUFLE y ROSE 1956)
212 Formas de vida Las zonas donde crecen estas plantas influyen sobre su manera de vivir Algunas orquiacutedeas son terrestres y se encuentran representadas en todas las regiones Tambieacuten existen las epiacutefitas (vegetal que fijado a otro no obtiene de eacuteste su alimento) En este caso se necesita que el grado higromeacutetrico y la temperatura permitan este tipo de adaptacioacuten Ademaacutes existen las orquiacutedeas litofiacuteticas que viven sobre rocas Las raiacuteces de las epiacutefitas y litofiacuteticas estaacuten adaptadas a vivir expuestas al aire o inmersas en materia orgaacutenica ya que tienen un tejido acumulador de agua llamado velo En zonas friacuteas y templado friacuteas todas las orquiacutedeas son terrestres En zonas subtropicales o tropicales la gran mayoriacutea es epiacutefita Otra particularidad debida seguramente a la influencia de estas zonas es la floracioacuten Es en las zonas tropicales y subtropicales que se dan los mayores tamantildeos de flores asiacute como tambieacuten la mayor variedad de colores (LECOUFLE y ROSE 1956)
213 Descripcioacuten morfoloacutegica Las orquiacutedeas se caracterizan por poseer flores muy vistosas hermafroditas (ambos sexos en la misma flor) zigomorfas (con un solo plano de simetriacutea) triacutemeras (tres seacutepalos y tres peacutetalos) y una columna central que sustenta las estructuras reproductivas masculinas anteras y femeninas pistilo llamada ginostemo El peacutetalo inferior se llama labelo y su morfologiacutea define a los distintos geacuteneros de orquiacutedeas Las flores pueden ser aisladas o en inflorescencia y son polinizadas por insectos El polen se encuentra aglomerado formando una masa llamada polinio el que tiene un extremo con un ensanchamiento glandular pegajoso que sirve para que el
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polinio se adhiera al cuerpo del insecto polinizador El fruto es una caacutepsula seca con muchas semillas pequentildeas sin endosperma y con embrioacuten no diferenciado Tienen dos tipos baacutesicos de crecimiento Simpodial en las que el nuevo crecimiento se produce en sentido horizontal a partir de un tallo subterraacuteneo o rizoma generando una sub-unidad capaz de producir una flor o inflorescencia y de ser eventualmente separada de la planta (ej Cattleya) Monopodial en las que el nuevo crecimiento se produce en sentido vertical con lo cual la planta crece constantemente en altura (ej Phalaenopsis) (ORQUIDEAS 2007) 214 Geacuteneros y especies chilenas Seguacuten NOVOA et al (2006) en la familia Orchidaceae se encuentran 49 especies de flora nativa dentro de las cuales se encuentra Chloraea virescens (Willd) Lindl Los geacuteneros de Orchidaceae en Chile son 7
- Aa Bipinnula Brachystele Codonorchis Chloraea Gavilea y Habenaria
Dentro del geacutenero Chloraea existen 31 especies - Chloraea alpina Poepp - Chloraea barbata Lindl - Chloraea bidendata (Poepp y Endl) Correa - Chloraea bletioides Lindl - Chloraea cuneata Lindl - Chloraea chica Speg - Chloraea chrysantha Poepp - Chloraea crispa Lindl - Chloraea cristata Lindl - Chloraea cylindrostachya Poepp - Chloraea disoides Lindl - Chloraea galeata Lindl - Chloraea gaudichaudii Brongn - Chloraea gavilu Lindl - Chloraea grandiflora Lindl - Chloraea heteroglossa Rchbf - Chloraea incisa Poepp - Chloraea lamellata Lindl - Chloraea lechleri Lindl - Chloraea leptopetala Reiche - Chloraea longipetala Lindl - Chloraea magellanica Hookf - Chloraea multiflora Lindl - Chloraea nudilabia Lindl - Chloraea philippii Reichbf - Chloraea picta Phil - Chloraea prodigiosa Reichbf - Chloraea speciosa Poepp - Chloraea virescens Lindl - Chloraea viridiflora Poepp
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- Chloraea volkmanni Phil (NOVOA et al 2006) 2141 Chloraea virescens Planta perenne de 40-90 cm de altura Sus hojas son de 5-12cm de largo por 15-25cm de ancho estrechas lanceoladas agudas dispuestas en roseta basal generalmente marchitas al final de la antesis Su escapo floral tiene vainas caulinares lanceoladas agudas y distantes La inflorescencia es de 8-20cm de largo densa con 10-15 flores erguidas Sus flores son blancas con estriacuteas y aacutepices verdes El seacutepalo dorsal es de 16-33mm de largo por 4-6mm de ancho oblongo lanceolado obtuso algo coacutencavo a veces ligeramente estrechado al centro aacutepice algo carnoso Los seacutepalos laterales de 18-33mm de largo por 4-5mm de ancho son ensiformes con aacutepice obtuso engrosado verde negruzco a veces espatulado y dentado a veces verrugoso Los peacutetalos son de 15-23mm de largo por 5-58mm de ancho estrechamente aovados obtusos verrugosos con maacutes frecuencia solo la mitad inferior a veces el borde denticulado y carnoso El labelo de 15-26mm de largo por 10-20mm de ancho es mas o menos romboidal a levemente trilobulado El loacutebulo central tiene 5-7 nervios longitudinales recorridos por laminillas interrumpidas membranaacuteceas con segmentos falciformes de borde carnoso de color verde Los nervios laterales que se ramifican oblicuamente hacia el aacutepice en los loacutebulos laterales tienen pequentildeas laminillas y verrugas y su borde es laciniado inciso en la mitad apical hacia la base denticulado aacutepice generalmente engrosado La columna es de 12-18mm de largo delgada blanca con estriacuteas anaranjada La base de la zona nectariacutefera tiene un color amarillo-limoacuten con maacuteculas anaranjadas orificio nectario verde El ala de la columna es recta y estrecha El estigma es triangular y globoso La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la Vordf (Vintildea del Mar) hasta la XIordf Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile Sin embargo es posible que tenga una distribucioacuten maacutes restringida por que se le ha confundido con Chloraea incisa Su floracioacuten es desde noviembre a febrero y su estado de conservacioacuten no estaacute evaluado (NOVOA et al 2006) En el Anexo 14 se incluyen antecedentes sobre su distribucioacuten y eacutepoca de floracioacuten
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FIGURA 1 Chloraea virescens FUENTE NOVOA et al (2006) 22 Requerimientos de las orquiacutedeas Para tener eacutexito en el cultivo de orquiacutedeas hay que tomar en cuenta factores de importancia como son 221 Agua El riego correcto es el principio y el fin del cuidado de orquiacutedeas (ROLLKE 2005) Este elemento es primordial para las orquiacutedeas asiacute como tambieacuten para todo tipo de plantas En el caso de eacutestas se dice muchas veces que la calidad del agua usada es el factor maacutes importante en el cultivo de orquiacutedeas ya que el porcentaje maacutes alto de muerte se produce por el exceso de este factor (SHEEHAN 1980) Hay que tomar en cuenta que la mayoriacutea de las orquiacutedeas son epiacutefitas lo que significa que tienen sus raiacuteces a la vista gracias a las cuales absorben el agua de lluvia Se recomienda un sustrato poroso y de reaccioacuten neutra ya que de esta manera el agua escurre sin acumularse no permitiendo la pudricioacuten de las raiacuteces Para las orquiacutedeas terrestres es lo mismo solo que se pueden regar con maacutes frecuencia pero sin mantenerlas saturadas (OSPINA y DRESSLER 1979) Seguacuten DUMOIS (2007) el agua es lo maacutes difiacutecil de controlar ya que depende de muchas variables como por ejemplo humedad relativa tipo de sustrato intensidad luminosa temperatura y circulacioacuten de aire Ademaacutes muchas orquiacutedeas necesitan un periacuteodo de receso vegetativo que si no es respetado resulta en ausencia de floracioacuten En general hay que antildeadir agua en abundancia cuando la planta se encuentra en crecimiento activo y reducirla despueacutes de la floracioacuten
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Las especies con pseudobulbos almacenan agua y estaacuten preparadas para su periacuteodo de receso Otras que no cuentan con estos oacuterganos requieren de humedad maacutes constante 222 Luz Ninguna planta puede crecer sin la iluminacioacuten adecuada Muchas orquiacutedeas viven en las alturas de los aacuterboles y estaacuten expuestas a plena luz del sol otras crecen en el suelo selvaacutetico protegidas del sol por espesos follajes (ROLLKE 2005) La funcioacuten principal de la luz es activar el proceso de fotosiacutentesis Los cultivadores han estudiado la luz y han descubierto que hay orquiacutedeas que florecen con diacutea largo y otras con diacutea corto (OSPINA y DRESSLER 1979) Gracias a la fotosiacutentesis se convierten los minerales presentes en el ambiente en savia y nutrientes Hojas oscuras y falta de floracioacuten indican falta de luz hojas amarillas e incluso quemadas apuntan hacia un exceso de sol (DUMOIS 2007) 223 Fertilizacioacuten Las orquiacutedeas necesitan los mismos nutrientes que otras plantas Un abono para orquiacutedeas debe contener los nutrientes principales nitroacutegeno (N) foacutesforo (P) y potasio (K) asiacute como tambieacuten oligoelementos como hierro (Fe) magnesio (Mg) zinc (Zn) estantildeo (Sn) y manganeso (Mn) (ROLLKE 2005) Por otra parte la fertilizacioacuten depende de varios factores dentro de los cuales los maacutes criacuteticos son
- El medio utilizado - La edad de las plantas - Estado de las plantas ya sea floracioacuten crecimiento reposo
En cuanto a absorcioacuten se ha demostrado que es igual de eficiente por viacutea foliar como a traveacutes de las raiacuteces Es necesario tener en cuenta algunas reglas baacutesicas a la hora de fertilizar las orquiacutedeas (Asociacioacuten Costarricense de Orquideologiacutea ACO 1970)
1 Regar las plantas antes de fertilizar 2 Fraccionar las dosis 3 Aplicar el fertilizante de forma liacutequida 4 No usar fertilizantes soacutelidos 5 No fertilizar las plantas recieacuten plantadas 6 No fertilizar plantas en reposo 7 No abonar plantas enfermas
224 Temperatura Es conocido el hecho de que cada planta tiene liacutemites de temperatura dentro de los cuales prospera o perece De ahiacute la necesidad de conocer las temperaturas correspondientes al lugar de donde viene cada especie de orquiacutedea pudiendo proporcionarle la temperatura adecuada (OSPINA y DRESSLER 1979) Se puede clasificar a las orquiacutedeas como de clima caacutelido (temperatura nocturna miacutenima de 20ordmC) templado (miacutenimo de 13 a 18ordmC) y de ambiente friacuteo (de 10 a 13ordmC) (DUMOIS 2007)
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Seguacuten SHEEHAN (1980) las temperaturas ideales para las orquiacutedeas de origen tropical son 10ordmC en la noche y entre 21ordm - 24ordmC durante el diacutea 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas La micropropagacioacuten de orquiacutedeas estaacute en vanguardia hoy en diacutea El estudio de cultivo de tejido de orquiacutedeas se lleva a cabo en muchos laboratorios de todo el mundo (ARDITTI and ERNST 1992) 231 Biologiacutea de las semillas Las semillas de orquiacutedeas son conocidas usualmente como semillas polvo porque son minuacutesculas y contienen pocas reservas de alimento Estas semillas por lo general no germinan en el medio natural a menos que sean infectadas por un hongo micorriacutezico Este hongo abastece a las plantas joacutevenes con azuacutecares y nutrientes hasta que sean lo suficientemente grandes para fabricar su propio alimento Cuando la semilla germina produce una masa indiferenciada de ceacutelulas llamada protocormo Manteniendo las condiciones normales el protocormo continuaraacute su crecimiento por varias semanas meses o incluso antildeos dependiendo de la especie hasta que alcance la edad apropiada para producir raiacuteces y hojas En el caso de orquiacutedeas terrestres es de vital importancia que la relacioacuten orquiacutedea-hongo se conserve durante los estados tempranos del ciclo de vida de la planta ya que el protocormo enterrado no puede fabricar alimento por siacute mismo Por otro lado los protocormos de las orquiacutedeas epiacutefitas son comuacutenmente verdes lo que les posibilita producir parte de su alimento La relacioacuten orquiacutedea-hongo no ha sido en su totalidad investigada para el caso de las orquiacutedeas tropicales (McKENDRICK 2000) 232 Germinacioacuten simbioacutetica y no simbioacutetica de semillas Mediante la germinacioacuten in vitro las semillas germinan en frascos de vidrio o plaacutestico Estos frascos contienen en su interior un medio nutritivo solidificado con agar con todos los azuacutecares y minerales necesarios para la germinacioacuten y crecimiento de las semillas Hay dos tipos de germinacioacuten la simbioacutetica y la asimbioacutetica En la germinacioacuten simbioacutetica las semillas se siembran junto con una pequentildea cantidad del hongo micorriza adecuado Dicho hongo crece en el medio coloniza a las semillas que estaacuten en proceso de germinacioacuten y se produce una relacioacuten simbioacutetica la cual alimentaraacute al protocormo hasta que este sea capaz de producir sus hojas y se vuelva autotroacutefico Esta teacutecnica es usada principalmente en propagacioacuten de orquiacutedeas terrestres en zonas templadas La germinacioacuten asimbioacutetica se usa principalmente en propagacioacuten de orquiacutedeas tropicales que crecen maacutes raacutepido que sus parientes de zonas templadas Para este tipo de germinacioacuten se necesita un medio de cultivo maacutes complejo ya que todos los nutrientes orgaacutenicos e inorgaacutenicos asiacute como tambieacuten los azuacutecares deben estar en forma disponible pues no existe la intermediacioacuten del hongo (McKENDRICK 2000) 233 Condiciones de esterilidad Tanto para la germinacioacuten simbioacutetica como para la asimbioacutetica es de vital importancia que los frascos las semillas aparatos y el medio esteacuten esteacuteriles desde el principio del proceso Esto debido a que cualquier hongo o bacteria que se introduzca creceraacute maacutes raacutepido que las semillas ocupando su espacio hasta matarlas Esto se evita gracias al autoclave el cual regulado a 12 atm y 120ordmC por 20 minutos mata hongos o bacterias presentes en el medio (McKENDRICK 2000)
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2331 Siembra de las semillas Las semillas pueden ser recolectadas desde caacutepsulas verdes o maduras La caacutepsula verde que estaacute madurando estaacute llena de semillas y no se deforma cuando se aprieta con las pinzas Estas semillas pueden ser almacenadas por algunas semanas en un lugar refrigerado con bastante aireacioacuten Las semillas se pueden sembrar a partir de caacutepsulas verdes o semillas secas A continuacioacuten se muestran las ventajas y desventajas de ambos meacutetodos
- Siembra a partir de caacutepsulas verdes Si las caacutepsulas se mantienen intactas el interior (las semillas) se mantiene esteacuteril Por lo tanto si se esteriliza la parte exterior de las mismas donde hongos y bacterias pueden desarrollarse y se abren las caacutepsulas bajo condiciones esteacuteriles y las semillas podraacuten mantenerse desinfectadas
La ventaja de este meacutetodo es que no se requiere de esterilizacioacuten de las semillas lo que provoca su deterioro Otro punto a favor es que algunas semillas podriacutean germinar maacutes raacutepido que las provenientes de caacutepsulas maduras por los mecanismos de dormancia La desventaja es que en este caso todas las semillas deben ser utilizadas o eliminadas mientras que las semillas maduras se pueden almacenar Tambieacuten se debe considerar que las semillas sembradas a partir de caacutepsulas que no han madurado lo suficiente podriacutean germinar lentamente o simplemente no germinar - Siembra a partir de semillas secas En este caso una vez que la caacutepsula es abierta las semillas dejan de ser esteacuteriles y requieren de un proceso de esterilizacioacuten Comuacutenmente se utiliza una solucioacuten de hipoclorito de sodio hipoclorito de calcio o peroacutexido de hidroacutegeno Las semillas se agitan dentro de la solucioacuten que ademaacutes contiene una gota de detergente para ldquohumedecerlasrdquo luego se las enjuaga con agua destilada y se las siembra en el medio preparado La ventaja de este meacutetodo es que las semillas pueden ser colectadas secadas al aire almacenadas por varios meses en el refrigerador y utilizarlas cuando sea necesario Se debe considerar que la siembra ya sea de caacutepsulas verdes o de semillas secas estaacute determinado por la eacutepoca en que se colectan (McKENDRICK 2000) 234 Trasplante En la caacutemara de incubacioacuten las plaacutentulas se han desarrollado en condiciones limpias y en un ambiente cerrado por lo que deben acostumbrase gradualmente al ambiente exterior antes de ser trasplantadas a las macetas Tambieacuten la temperatura y la luz la cual es baja han sido constantes durante el cultivo in vitro En el medio natural la temperatura y la luz variacutean constantemente por lo que las nuevas plantas deben estar protegidas de la fuerte luz solar la cual puede quemar las hojas con soacutelo una pequentildea cantidad de eacutesta La humedad en los frascos es alta y las plantas estaacuten protegidas de ataques por hongos o bacterias Ademaacutes las plaacutentulas han crecido bajo condiciones de alta humedad y por lo tanto tendraacuten cutiacuteculas deacutebiles por lo que necesitan acostumbrase a medios menos huacutemedos antes de ser transplantadas
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Para el trasplante se deben colocar los frascos en un lugar protegido de la lluvia para que se aclimaticen a las nuevas condiciones de luz y temperatura Se deben dejar por 2 a 4 semanas en los frascos tapados Luego se debe ir aflojando las tapas para dejar entrar pequentildeas cantidades de aire hasta el punto de dejarlas descubiertas Se debe revisar si hay hojas marchitas y ver que el sustrato esteacute huacutemedo
Lo ideal es dejarlas sin tapa durante una semana antes de pasarlas a las macetas Para el trasplante se debe elegir un sustrato adecuado para el tipo de planta humedecerlo y transplantar las plantas con cuidado de no dantildear las raiacuteces y evitando la deshidratacioacuten En esta etapa tambieacuten se debe dejar las macetas selladas para evitar una raacutepida deshidratacioacuten e ir abrieacutendolas paulatinamente (McKENDRICK 2000)
24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas 241 Orquiacutedeas terrestres 2411 Cypripedium Esta es una orquiacutedea terrestre de zonas templadas se desarrolla en el Hemisferio Norte como por ejemplo en Guatemala y en Honduras pero donde se encuentra principalmente es en China Su forma maacutes comuacuten de propagacioacuten es in vitro a partir de semillas La forma maacutes eficiente es a partir de semillas inmaduras Existe un intervalo de tiempo entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten eacuteste dependeraacute de la especie y de la zona donde se desarrolle Se asume que existen aproximadamente cuatro semanas entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten El oacuteptimo para una buena germinacioacuten de Cypripedium es entre 42 y 60 diacuteas despueacutes de la polinizacioacuten y entre 14 y 32 diacuteas despueacutes de la fertilizacioacuten La germinacioacuten ocurre entre la segunda y cuarta semana despueacutes de ser sembradas y los protocormos deberiacutean ser cambiados de medio de cultivo cada dos a cuatro meses si no se corre el riesgo de sufrir agotamiento de nutrientes Los rizomas y las raiacuteces se empiezan a desarrollar a partir de los siete meses para luego dar lugar a las primeras hojas Para obtener un buen transplante se deben tener raiacuteces de miacutenimo un centiacutemetro de largo El desarrollo de raiacuteces se ve potenciado al tener un periacuteodo corto de bajas temperaturas (10degC) exposicioacuten a la luz reduccioacuten en la concentracioacuten de iones del medio de cultivo o transferirlas a un compost esteacuteril Al tener raiacuteces suficientes y el tamantildeo adecuado se podraacuten llevar las plantas al lugar donde creceraacuten definitivamente En el momento del transplante las plantas son muy susceptibles al desecamiento por lo cual lo ideal es que los brotes sean maacutes chicos que las raiacuteces El mejor sustrato seriacutea aquel donde crece naturalmente la orquiacutedea (RAumlNNBAumlCK 2007) 2412 Preservacioacuten in vitro de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes Este estudio fue hecho para establecer que parte de tejido es viable para la micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes del noreste de Europa pudiendo asiacute reestablecer dichas orquiacutedeas a sus aacutereas correspondientes La propagacioacuten in vitro de orquiacutedeas
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terrestres de clima templado es maacutes difiacutecil que las orquiacutedeas epiacutefitas de clima subtropical y tropical Las orquiacutedeas terrestres tienen requerimientos maacutes estrictos que las epiacutefitas y se conoce menos sobre sus necesidades especiacuteficas (VAASA y ROSENBERG 2004) En Estonia existen 36 especies de orquiacutedeas terrestres pero solo tres estaacuten bajo proteccioacuten Dactylorhiza baltica Dactylorhiza ruthei Dactylorhiza praetermissa Como explantes para este estudio en el caso de D baltica se ocuparon protocormos en los otros dos casos se utilizaron semillas semi maduras las cuales fueron colectadas siete y diez semanas despueacutes de ser polinizadas Para D baltica se ocupoacute el medio Murashige y Skoog suplementado con 05 mgL de aacutecido naftaleacuten aceacutetico (ANA) y 2 mgL de isonpentenyl adenina Para el caso de las semillas semi maduras se ocuparon los medios de Lindemann de Heller de Norstog y de Murashige y Skoog como control
La composicioacuten del medio y la madurez de las semillas influye mucho en el desarrollo de las orquiacutedeas in vitro Se ha demostrado que se necesita una alta concentracioacuten de microelementos para obtener una correcta germinacioacuten de las semillas Tambieacuten se puede decir que los primeros tres meses son los de mayor crecimiento luego de este tiempo el crecimiento se vuelve maacutes lento (VAASA y ROSENBERG 2004)
Luego de cuatro semanas de crecimiento de D baltica el 60 de los explantes de meristemas apicales empezaron a crecer en cambio los de meristemas laterales no expresaron ninguacuten tipo de crecimiento Las raiacuteces empezaron su desarrollo luego de dos meses despueacutes de la siembra
En el caso de D ruthei y D praetermissa la germinacioacuten se produjo despueacutes de dos meses desde la inoculacioacuten Luego de cuatro y seis meses el mayor crecimiento fue observado en el medio Norstog superando en 14 al medio testigo Murashige y Skoog (VAASA y ROSENBERG 2004)
2413 Longevidad de semillas de orquiacutedeas terrestres Por lo general las orquiacutedeas producen muchas pero pequentildeas semillas que contienen muy pocas reservas de alimento Dichas semillas estaacuten estructuralmente adaptadas para ser dispersadas por el viento pero poco se sabe del destino de eacutestas luego de ser dispersadas Algunos estudios de viabilidad de semillas indican una sobrevivencia de uno a dos antildeos en orquiacutedeas de clima templado Las semillas que son guardadas en laboratorio duran mucho maacutes tiempo Se estudioacute la viabilidad de siete especies de orquiacutedeas norteamericanas dentro de las cuales se encuentran Goodyera pubescens y Liparis liliifolia Las semillas de eacutestas se colocaron en bolsas con suelo y sustratos de bosques provenientes de sus haacutebitats naturales (WHIGHAM et al 2005) En Goodyera pubescens la mayoriacutea de las semillas germinaron en un antildeo Cuatro otras especies germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero algunas semillas no germinadas despueacutes de siete antildeos seguiacutean siendo viables En la especie Liparis liliifolia semillas que han estado cuatro antildeos bajo observacioacuten han tenido una tasa de
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germinacioacuten de un 68 al ser sembradas in vitro junto con el hongo micorriacutezico adecuado Las dos especies restantes no germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero las semillas fueron evaluadas como intactas y testeadas positivamente en cuanto a su viabilidad despueacutes de cuatro antildeos en el suelo Estas observaciones fueron interpretadas como diferentes estrategias para especies especiacuteficas de germinacioacuten in situ (WHIGHAM et al 2005) 2414 Sobrevivencia de orquiacutedeas terrestres transplantadas a sectores urbanos La conservacioacuten de poblaciones de orquiacutedeas silvestres depende del establecimiento de las orquiacutedeas propagadas a los campos Sin embargo se conoce muy poco de los factores bioacuteticos que influencian el establecimiento de orquiacutedeas terrestres a sus haacutebitats naturales Un experimento fue establecido para medir la sobrevivencia de seis especies durante su primer periacuteodo de crecimiento seguido del transplante a un sector urbano en Australia (SCADE et al 2006)
Las orquiacutedeas germinadas simbioacuteticamente crecieron en laboratorio durante cinco meses antes de establecer la plantacioacuten en sitios adyacentes con alta o baja cobertura de malezas Existioacute una muerte gradual de las plaacutentulas durante el primer periacuteodo de crecimiento primeramente por ataque de insectos no siendo evitado por la presencia de una malla cobertora Los iacutendices de sobrevivencia variacutean desde 49 para Microtis media una especie capaz de crecer en un ambiente atiacutepico hasta un 21 para Caladenia arenicola la orquiacutedea nativa maacutes comuacuten de esos sitios Sin embargo no todas las orquiacutedeas sobrevivientes producen tubeacuterculos por lo que la tasa de sobrevivencia despueacutes del primer periacuteodo seco disminuye
La sobrevivencia de las orquiacutedeas sembradas no puede ser comparada con orquiacutedeas de la misma especie que crecieron en los mismos lugares ya que no existioacute la presencia del hongo compatible para estas orquiacutedeas (SCADE et al 2006)
2415 Micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres En India dos orquiacutedeas muy importantes para la horticultura del geacutenero Anoectochilus fueron exitosamente propagadas Noacutedulos aislados de A sikkimensis colectadas en Himalaya y A regalis colectadas en India fueron cultivadas in vitro durante 12 semanas para obtener un maacuteximo de 48 a 56 protocormos y brotes obteniendo como resultado un 95 y 98 de eficiencia respectivamente Durante el repicado de los explantes in vitro de A regalis se observoacute que el nuacutemero total de brotes obtenidos a partir de noacutedulos fue 214 asiacute como tambieacuten 82 puntas de brotes En cambio para A sikkimensis fueron mucho maacutes bajos 123 y 43 respectivamente teniendo un crecimiento maacutes lento pero plantas maacutes fuertes Las raiacuteces de 4 a 6cm crecieron con la presencia de NAA (270 microM ) en el medio asiacute como tambieacuten con carbono activado (02) Durante la aclimatacioacuten la tasa de establecimiento fue entre 95 y 98 Luego de seis meses en invernadero las plantas de A regalis fueron transferidas a bosque nativo donde se obtuvo una tasa de
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sobrevivencia de entre 70 y 95 despueacutes de 12 meses Estas plantas establecidas en bosque nativo estaacuten libres de cualquier defecto morfoloacutegico y de crecimiento (GANGAPRASAD et al 2000) 242 Orquiacutedeas epiacutefitas Estas orquiacutedeas viven en los aacuterboles pero no obtienen de eacuteste su alimento no son paraacutesitas 2421 Preservacioacuten de Cattleya walkeriana usando propagacioacuten in vitro El geacutenero Cattleya se encuentra en Meacutexico y Ameacuterica Central asiacute como tambieacuten en Venezuela Colombia y las laderas de los Andes Esta orquiacutedea tambieacuten se encuentra en varias regiones del Brasil creciendo en aacuterboles rocas cerca de riacuteos lagos y pantanos Las flores de esta orquiacutedea son conocidas debido a su hermosura y a causa de la destruccioacuten de su haacutebitat y a la excesiva coleccioacuten de eacutestas se encuentra en extincioacuten
La composicioacuten del medio de cultivo es esencial para la propagacioacuten in vitro ya que suple todos los nutrientes necesarios para el desarrollo y seraacute distinto dependiendo de cada especie en este caso se utilizoacute la mitad de los macronutrientes del medio Muchos autores sugieren el uso de carboacuten activado en el medio ya que por lo general en muchas especies aumenta el desarrollo de las raiacuteces En este estudio se probaron distintas dosis de carboacuten activado 1 2 4 y 6gL con un pH de 6 (TADEU DE FARIA et al 2002) Las semillas se obtuvieron de flores artificialmente polinizadas en invernadero Plaacutentulas de aproximadamente un centiacutemetro fueron seleccionadas y cultivadas nuevamente en el medio de cultivo Murashige y Skoog pero esta vez con las diferentes dosis de carboacuten activado Se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces el nuacutemero de brotes y el peso de la materia verde total Durante el autoclavado se produce normalmente una hidroacutelisis de sacarina la cual es de 10 aproximadamente este porcentaje aumenta considerablemente al agregar un 1 de carboacuten activado llegando a ser de 95
El desarrollo de las plaacutentulas de C walkeriana aumentan con una mayor concentracioacuten de carboacuten activado asiacute como tambieacuten un mayor tiempo de cultivo El resultado fue que la dosis ideal para el desarrollo de esta orquiacutedea es 2gL de carboacuten activado (TADEU DE FARIA et al 2002) 2422 Establecimiento de cultivos in vitro y micropropagacioacuten de Cattleya aurantiaca (Bateman ex Lindl) Por medio de siembra in vitro se logroacute el establecimiento de C aurantiaca con alto porcentaje de germinacioacuten y desarrollo de protocormos Para la oacuteptima formacioacuten de callo y para la proliferacioacuten de protocormos se determinaron los medios oacuteptimos (MS 10 mgL ANA 10 mgL BA) asiacute como tambieacuten de manera directa sobre explantes de hoja y pseudobulbos (MS 01 mgL ANA 01 mgL GA3)
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Con este uacuteltimo medio tambieacuten se logroacute una oacuteptima regeneracioacuten y desarrollo de plaacutentulas Los medios liacutequidos (sin agitacioacuten) son una buena opcioacuten para conseguir la produccioacuten masiva de protocormos ya que con ellos se optimizoacute la micropropagacioacuten de C aurantiaca Las plaacutentulas micropropagadas presentaron alto porcentaje de sobrevivencia y buen desarrollo despueacutes de su trasplante y aclimatacioacuten lo cual demuestra que es un buen sistema de propagacioacuten para C aurantiaca (GUTIERREZ y SALGADO 2007) En cuanto a transplante y aclimatacioacuten despueacutes de 45 diacuteas de desarrollo in vitro las plaacutentulas de un tamantildeo entre 3 y 5 cm con raiacuteces bien desarrolladas fueron llevadas a condiciones ex vitro eliminando los restos de medio de cultivo con agua potable y ocupando un sustrato de partes iguales de tezontle y corteza de encino cubierta con hojarasca de encino finamente molida Se mantuvieron cubiertas durante 15 diacuteas abriendo cada dos diacuteas hasta poder retirar la tapa en 30 diacuteas Despueacutes de dos meses de haber sido retiradas del cultivo in vitro las plaacutentulas presentaron 70 de sobrevivencia y alcanzaron una altura de hasta 7 cm presentando nuevas hojas y raiacuteces las plantas se muestran vigorosas y capaces de continuar su crecimiento en condiciones ambientales de invernadero (GUTIERREZ y SALGADO 2007)
2423 Establecimiento in vitro y regeneracioacuten de plantas de Laelia autumnalis (Llave y Lex) Lindl Para este estudio se obtuvieron las semillas de una caacutepsula desarrollada despueacutes de 6 meses de la floracioacuten las cuales se sembraron in vitro sin presentar contaminacioacuten ya que la siembra por este meacutetodo es muy eficiente en comparacioacuten al cultivo de semillas libres donde algunas veces se presenta la contaminacioacuten Las observaciones se realizaron cada 15 diacuteas la germinacioacuten se detectoacute en los primeros 15 diacuteas en la mayoriacutea de los medios de cultivos probados con la presencia de protocormos de 1mm de diaacutemetro (HUAPEO y SALGADO 2004) El porcentaje de germinacioacuten que se obtuvo de las semillas cultivadas in vitro de L autumnalis fue de 95 a 100 en todos los medios de cultivo la uacutenica diferencia fue el tiempo entre las germinaciones A excepcioacuten de las semillas cultivadas en el medio MS 100 la germinacioacuten del 100 se obtuvo hasta los 30 diacuteas de cultivo mientras que en el primero la germinacioacuten fue a los 15 diacuteas del cultivo Las plaacutentulas con raiacutez y un par de hojas se lograron a los 90 diacuteas de cultivo en el medio MS 100 alcanzando 07 mm de altura Estas plaacutentulas fueron subcultivadas en medio MS con 05 mgl de ANA y 01 mgl de GA3 para tener plaacutentulas fuente de explante (segmentos de hojas) un medio oacuteptimo de desarrollo de plaacutentulas de L speciosa No fue necesario probar otros medios de cultivos ya que se hicieron pruebas anteriores que demostraron que era el adecuado
Las plaacutentulas de 6 meses de cultivo in vitro despueacutes de su germinacioacuten presentaron una altura promedio de 5 cm con raiacuteces con velamen y hasta dos pares de hojas Segmentos de hoja de eacutestas fueron cultivadas en el medio MS conteniendo ANA BA y GA3 en diferentes concentraciones y se realizaron observaciones cada 30 diacuteas para determinar medios inductores de callo protocormos y raiacuteces La mejor respuesta en formacioacuten de callo fue observada en los segmentos de hoja de plaacutentulas de L autumnalis cultivados en MS con 1 mgl de ANA BA y GA3 iniciando la induccioacuten de
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eacuteste desde los 30 diacuteas de cultivo solamente en un 70 de los explantes cultivados El 100 se logroacute a los 90 diacuteas de cultivo observando callo abundante alrededor de todo el tejido de color blanco con puntos pigmentados de color verde La regeneracioacuten de protocormos de esta orquiacutedea se establecioacute con la siembra de segmentos de hoja de plaacutentulas de 6 meses de edad de manera directa o a partir de callos En callos la produccioacuten fue oacuteptima en el medio MS con 01 mgl de ANABAGA3 ya que a los 60 diacuteas se obtuvieron 50 protocormos por segmento de callo Solamente se produjeron 10 protocormos por explante al cultivarse los segmentos de hoja en MS con 01 mgl de ANABAGA3 a los 120 diacuteas de cultivo (HUAPEO y SALGADO 2004) 25 Aclimatacioacuten Aclimatacioacuten significa que el hombre intercede y guiacutea el proceso de acondicionamiento de las plantas hasta que eacutestas sean aptas para crecer en el campo yo invernadero
Un alto nuacutemero de plantas micropropagadas no sobreviven al cambio desde el cultivo in vitro hacia el ambiente exterior ya sea en campo o invernadero Eacutestos dos uacuteltimos tienen menor humedad relativa niveles maacutes altos de luminosidad y un ambiente seacuteptico los cuales son maacutes estresantes para las plantas micropropagadas La mayoriacutea de las especies que crecen in vitro necesitan un proceso de aclimatacioacuten pudiendo obtener asiacute un nuacutemero suficiente de plantas vivas y vigorosas para trasplantar al suelo (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991)
La aclimatacioacuten no es uacutenicamente para micropropagacioacuten siendo usada ademaacutes en propagacioacuten convencional durante antildeos Despueacutes de cortar las hojas y de haber formado raiacuteces por lo general son aclimatadas antes de ser llevadas al campo o invernadero Ejemplos de dos teacutecnicas comunes son bajar gradualmente la humedad y mantener el nivel de luz con un 50 de sombra antes de trasladarlos al campo Las raiacuteces que han sido cortadas y mal limpiadas muchas veces son focos de infeccioacuten En estos casos las plantas muestran signos de marchitez hojas necrosadas y tambieacuten se puede llegar a la muerte de eacutestas El cultivo in vitro reduce la necesidad de fotosiacutentesis ya que las condiciones de la caacutemara de incubacioacuten proveen a la planta de sacarosa u otro azuacutecar Tambieacuten en estas condiciones se reduce el stress por patoacutegenos al ser un ambiente aseacuteptico Todo esto se traduce en que las plantas micropropagadas no son aptas para el campo yo invernadero (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 251 Stress hiacutedrico El stress hiacutedrico puede ser el resultado de una excesiva transpiracioacuten de las diferentes partes aeacutereas de las plantas especialmente de las hojas o por una inadecuada absorcioacuten de agua por parte de las raiacuteces La cutiacutecula y los estomas son la ruta primaria de peacuterdida de agua desde de las hojas provenientes de esta teacutecnica reproductiva 2511 Cutiacutecula La cutiacutecula es una membrana compuesta por una matriz de cutina que a su vez se encuentra cubierta en su superficie por ceras cuya funcioacuten primaria consiste en limitar la peacuterdida de agua por transpiracioacuten La permeabilidad del agua a traveacutes de la cutiacutecula se ve influenciada principalmente por la estructura y la cantidad de
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ceras cuticulares y epicuticulares no vieacutendose afectada la peacuterdida de agua por el grosor de eacutesta o la naturaleza quiacutemica de la matriz de la cutina La estructura cristalina de la parte encerada de las hojas es distinta en las plantas micropropagadas con respecto a las plantas que crecen en el campo La cera epicuticular de las hojas de plantas in vitro tienen una proporcioacuten maacutes alta de esteres y de componentes polares por el contrario tienen unas cadenas de hidrocarbonos mucho maacutes cortas Esto hace que las plantas in vitro pierdan maacutes agua que las cultivadas en campo o invernadero
Las plantas que han crecido en el campo son naturalmente de color verde pero el color de las plantas cultivadas in vitro es diferente y se puede ver a simple vista Las plantas que son pasadas a invernadero y que tengan un color verde se aclimatan de mejor forma al ambiente exterior (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 2512 Estomas La estructura estomaacutetica y su funcionamiento han sido implicados recurrentemente en el desbalance de agua exhibido por plantas micropropagadas al momento de ser removidas del cultivo in vitro Estudios con microscopiacutea de scanner electroacutenico han indicado que la estructura estomaacutetica presente en algunas especies de plantas cultivadas in vitro difieren marcadamente de las cultivadas en invernadero o en el suelo Debido a que las primeras presentan estomas de mayor tamantildeo y maacutes redondos a diferencia de las plantas cultivadas de manera normal que presentan estomas maacutes pequentildeos y eliacutepticos lo que resulta en una deshidratacioacuten maacutes raacutepida en el caso de las provenientes de cultivo in vitro (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 252 Humedad Debido a la anatomiacutea y la condicioacuten fisioloacutegica de las plantas desarrolladas in vitro donde se ha mantenido una alta humedad relativa es necesario regar al momento del traslado para obtener una alta sobrevivencia Muchos laboratorios aseguran que hay que evitar tener un sistema de aspersioacuten ya que se produce el ambiente necesario (muy huacutemedo) para la aparicioacuten de hongos algas o bacterias Otros meacutetodos incluyen el uso de humidificadores o poner las macetas en un lugar cerrado donde se retenga vapor para esto se pueden usar por ejemplo tapas de polietileno Este meacutetodo es relativamente econoacutemico pero se debe tener control del calor y monitorear la falta de agua (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 253 Luz Durante la etapa in vitro las plantas estaacuten expuestas a altos niveles de luminosidad lo que se traduce en hojas delgadas Antes del traslado se recomienda mantener las plantas con un 50 de sombra para asiacute poder aclimatarlas de mejor manera esto debido a que las plantas micropropagadas tienen un bajo control sobre la transpiracioacuten y un inadecuado mecanismo de fotosiacutentesis La sombra reduce la transpiracioacuten evitando excesivas peacuterdidas de agua asiacute como tambieacuten el exceso de luz destruye las moleacuteculas de clorofila Luego del periacuteodo bajo sombra se deben mover las macetas gradualmente hacia el nivel de luz al cual seraacute llevado para su crecimiento final (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 254 Temperatura La temperatura del aire y del medio o sustrato de crecimiento estaacute generalmente controlado durante el periacuteodo de aclimatacioacuten El calor es necesario en los meses de invierno y el friacuteo (enfriar) es esencial en los meses de verano Ajustando la cantidad de sombra y humedad se obtiene un control sobre la temperatura El
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enfriamiento se puede obtener gracias a ventilacioacuten abanicos niebla o aire acondicionado El calor puede provenir del sistema existente en el edificio o invernadero donde esteacuten ubicadas las macetas o por las laacutemparas ocupadas para el control del fotoperiacuteodo El rango de temperatura que se mantiene por lo general es entre los 13 y 30ordmC y esta determinado principalmente por la especie en cuestioacuten La temperatura de la zona donde se encuentran las raiacuteces es muy importante para el crecimiento lo ideal es que dicho sector tenga una mayor temperatura que el aire fomentando el crecimiento de las raiacuteces e incrementando la humedad alrededor de la planta Durante el verano esto es difiacutecil de obtener ya que la temperatura del aire es muy alta debido a la alta radiacioacuten solar Terminado el proceso de aclimatacioacuten esto ya no es necesario (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 255 Fotosiacutentesis Las plantas sufren un cambio radical cuando son removidas desde cultivo in vitro ya que son forzadas a cambiar de heterotroacuteficas a autotroacuteficas y la fotosiacutentesis se vuelve fundamental para la sobrevivencia Las hojas de las plantas in vitro no estaacuten formadas para hacer fotosiacutentesis ya que en la caacutemara de incubacioacuten no se produce un fuerte intercambio gaseoso esto debido a que la sacarosa es entregada a traveacutes del medio de cultivo Las hojas de las plantas que son trasladadas al campo o invernadero sufren deterioro debido a que no estaacuten formadas para la fijacioacuten de carbono Esto se produce por un tiempo aproximado de cuatro semanas despueacutes de las cuales las hojas nuevas suplen a las viejas Otro punto es que las hojas de las plantas cultivadas in vitro contienen menor proporcioacuten de clorofila que las plantas que han crecido normalmente en el campo En un estudio de coliflor cultivado in vitro se midioacute el CO2 y se obtuvo un balance negativo el cual se mantuvo durante dos semanas despueacutes del transplante Algo similar ocurrioacute con frutilla despueacutes del transplante las hojas se deterioraron raacutepidamente lo que quiere decir que no hubo incremento en la fijacioacuten de carbono indicando falta de desarrollo en la competencia fotosinteacutetica
El bajo nivel de CO2 durante el cultivo in vitro limita el proceso de fotosiacutentesis lo cual se puede compensar usando sacarosa en el medio de cultivo Tambieacuten se puede incrementar el nivel de luz y CO2 obteniendo un fuerte aumento en el crecimiento de varias especies como orquiacutedeas clavel etc (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 256 Sustrato Un sustrato es todo material soacutelido distinto del suelo natural mineral u orgaacutenico que colocado en un contenedor en forma pura o en mezcla permite el anclaje del sistema radicular de la planta desempentildeando por lo tanto un papel de soporte para la planta El sustrato puede intervenir o no en el complejo proceso de la nutricioacuten mineral de la planta (INFOAGRO 2007) El sustrato y los contenedores dentro de los cuales se van a transplantar las plaacutentulas in vitro son importantes para una buena sobrevivencia
Los sustratos ejercen una influencia significativa en la arquitectura del sistema radical de las plantas y en las asociaciones bioloacutegicas de este con el suelo influenciando el
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estado nutricional y la translocacioacuten de agua en el sistema suelo-planta-atmoacutesfera Uno de los requisitos fundamentales que debe cumplir el sustrato para su utilizacioacuten es la sanidad Cuando estos no se elaboran almacenan o manejan correctamente pueden contaminarse y provocar serios dantildeos a las plantas durante la aclimatacioacuten por esta razoacuten son preferidos como componentes para su elaboracioacuten materiales inertes o aquellos en las cuales el proceso de obtencioacuten garantice la mayor desinfeccioacuten posible
Uno de los factores de mayor importancia a la hora de seleccionar los materiales que pueden constituir el sustrato es su disponibilidad tanto en teacuterminos de facilidad de obtencioacuten o suministro como de su costo (VILCHEZ et al 2007)
La presencia de inhibidores o tambieacuten cambios en el pH del sustrato pueden afectar el crecimiento de las raiacuteces y consecuentemente el eacutexito del transplante
Muchos laboratorios y viveros transplantan a un sustrato uniforme debiendo ser eacuteste adecuado en cuanto a soporte de las plantas pH porosidad aireacioacuten y drenaje (DEBERGH y ZIMMERMAN 1991)
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3 MATERIAL Y MEacuteTODO
Para la realizacioacuten de este trabajo se utilizoacute el siguiente material y meacutetodo
31 Material La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio e invernadero de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal pertenecientes a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de Chile
311 Material vegetal Se utilizaron plaacutentulas de C virescens cultivadas in vitro a partir de semillas las cuales fueron proporcionadas por el laboratorio estas plaacutentulas fueron separadas y repicadas para aumentar la poblacioacuten y obtener la cantidad necesaria para el ensayo
FIGURA 2 Plaacutentulas de C virescens en caacutemara de crecimiento in vitro
312 Materiales Los materiales que se utilizaron fueron los siguientes Equipos autoclave caacutemara de flujo laminar dispensador de medios medidor
de pH agitador magneacutetico horno microondas balanza mechero termoacutemetro Materiales vasos de precipitado matraces probetas pipetas papel de
aluminio frascos de vidrio placas Petri pinzas bisturiacute macetas regadera Soluciones soluciones madre (Medio MS) gelificante etanol 70 y 95
32 Meacutetodo A continuacioacuten se da a conocer la metodologiacutea con la cual se trabajoacute 321 Preparacioacuten del medio de cultivo Para la obtencioacuten de plantas a traveacutes de la micropropagacioacuten se ocupoacute el medio basal de MURASHIGE y SKOOG (1962) tambieacuten llamado medio MS Este medio tiene un pH de entre 56-57 Posteriormente se dosificoacute con el dispensador de medios para que cada frasco tenga una cantidad adecuada (25 mL) y se llevoacute a autoclave para esterilizar a 12 atm 120ordm C por 20 min
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322 Obtencioacuten del material vegetal Al tener el medio esterilizado se procedioacute a la separacioacuten y repicado de plaacutentulas existentes en el laboratorio Las siembras se realizaron en el mes de mayo del 2007 Estas siembras se realizaron en la caacutemara de flujo laminar de modo de asegurar que la siembra sea 100 aseacuteptica Estas plaacutentulas fueron mantenidas en la caacutemara de incubacioacuten hasta obtener los tamantildeos requeridos para el ensayo donde las condiciones fueron las siguientes
minus Temperatura ambiental de 23-25ordm C minus Fotoperiacuteodo de 16 horas minus Intensidad lumiacutenica controlada de 50-55 micromol m-2s-1
323 Sustratos Se utilizaron tres tipos de sustratos el primero corresponde a una mezcla de turba + perlita (11) el segundo corresponde a Sphagnum (100) y el tercero corresponde a una mezcla de turba + arena (11) Una vez realizadas las mezclas se procedioacute a una esterilizacioacuten en un autoclave a 121ordm C por 20 minutos a 12 atmoacutesfera De esta forma se trabajoacute con material limpio y sano evitando ataque de hongos o bacterias El anaacutelisis quiacutemico de los sustratos se muestra en el Anexo 2 324 Plantacioacuten Las plaacutentulas con un promedio de cuatro meses en condiciones de caacutemara de crecimiento in vitro obtuvieron el tamantildeo adecuado para ser utilizadas Se sacaron de los frascos y se plantaron en las macetas de plaacutestico transparente con los sustratos Posteriormente fueron dejadas en la sala del laboratorio donde se debioacute asperjar con solucioacuten nutritiva Hoagland y fungicida Captan CUADRO 1 Composicioacuten de solucioacuten nutritiva Hoagland
KNO3 102 gL Ca(NO3) 4 H2 O 0492 gL
NH4H2 (PO4) 023 gL MgSO4 7 H2O 049 gL
H3BO3 286 mgL MnCl2 2 H2O 181 mgL CuSO4 5 H2O 008 mgL ZnSO4 5 H2O 022 mgL Na2MoO4 H2O 009 mgL
FeSO4 7 H2O 05 06 mL FUENTE FINCK 1988 325 Disentildeo de los ensayos Este trabajo de investigacioacuten constoacute de un ensayo con dos etapas Antes que todo se realizoacute la separacioacuten y repicado in vitro de plaacutentulas de C virescens para la obtencioacuten del nuacutemero necesario de plantas En la etapa 1 se utilizaron tres tamantildeos de plaacutentulas obtenidas in vitro de 1-2cm de 2-3cm y de maacutes de 3cm de altura que se transplantaron a tres sustratos turba + perlita 11(vv) Sphagnum (100) y turba + arena 11 (vv) La turba provino de la Sociedad
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Minera Patagonia Peat SA en Hijuelas el Sphagnum de la empresa Lonquen Chile de Puerto Montt y la perlita se obtuvo a traveacutes del sitio web wwwjardisencl (representante legal Walter Rathgeb Penza Ingeniero Agroacutenomo Santiago) Las plaacutentulas se plantaron de acuerdo a su tamantildeo las de maacutes de 3cm se colocaron de 6 por maceta las de 2 a 3cm de a 8 por maceta y las maacutes chicas de a 10 por maceta Estas macetas fueron dejadas en una sala de aclimatacioacuten con una temperatura promedio de 20ordm C intensidad lumiacutenica de 50-55 micromol m-2s-1 y 14-16 hrs de fotoperiacuteodo Se fertilizoacute asperjando cada cinco diacuteas con solucioacuten nutritiva Hoagland Esta etapa se llevoacute a cabo durante dos meses desde el cinco de septiembre hasta el cinco de noviembre de 2007
En la etapa 2 se continuoacute el proceso de aclimatacioacuten en invernadero de las plaacutentulas obtenidas en la etapa 1 que despueacutes de dos meses teniacutean un mayor tamantildeo y se habiacutean acondicionado al ambiente exterior (fuera de la caacutemara de crecimiento) Las plantas se mantuvieron en las macetas durante tres semanas para aclimatarlas y luego las plantas sobrevivientes fueron transplantadas a macetas maacutes grandes individuales durante tres meses aproximadamente hasta el cinco de marzo 2008 Estas nuevas macetas tuvieron como sustrato turba y suelo (trumao) en igual proporcioacuten (Anexo 2) La temperatura promedio de invernadero fluctuoacute de 13 a 35 degC seguacuten el mes En enero el promedio fue de 25 (Anexo 3) Para bajar la temperatura alrededor de 5deg C se instaloacute una malla Rachel 326 Disentildeo experimental El disentildeo experimental utilizado fue completamente al azar ordenado como experimento factorial con dos factores tamantildeo (3) y sustrato (3) Cada tratamiento tuvo tres repeticiones con un miacutenimo de 6 plantas por recipiente 327 Variables a evaluar Durante los dos meses en que las macetas estuvieron en la sala de aclimatacioacuten se evaluoacute el desarrollo foliar contando el nuacutemero de hojas una vez al mes Posteriormente se trasladaron las mismas macetas a invernadero durante tres semanas para continuar con la aclimatacioacuten de las plaacutentulas Transcurrido este tiempo se transplantaron las plaacutentulas sobrevivientes a macetas individuales y continuoacute mensualmente la evaluacioacuten de eacutestas (nuacutemero de hojas) hasta la obtencioacuten de plantas establecidas Al momento del transplante y al final del ensayo se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces asiacute como tambieacuten al final del ensayo de evaluoacute el crecimiento en altura (cm) La sobrevivencia fue evaluada al final del ensayo por maceta
Tanto en la sala de aclimatacioacuten coacutemo en el invernadero se registroacute la temperatura con la ayuda de un termoacutemetro de maacutexima y miacutenima (Anexo 3) 328 Anaacutelisis estadiacutestico Una vez obtenidos los datos se procedioacute a comprobar si estos cumpliacutean con los supuestos de aleatoriedad normalidad y homogeneidad de varianzas que exige este tipo de anaacutelisis En el caso de no cumplirse estos supuestos los datos se transformaron utilizando log10(x+05) raiacutez(x+05) o 1x para normalizarlos
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y enseguida se sometioacute los datos a un anaacutelisis estadiacutestico (ANDEVA) Posteriormente en los casos en que se observoacute diferencias significativas en el ANDEVA se aplicoacute una prueba de rangos muacuteltiples (Tukey) al 5 de significancia Para las variables no parameacutetricas que no cumplieron con los supuestos para un anaacutelisis de varianza se realizoacute la prueba de KruskalndashWallis y las comparaciones muacuteltiples a traveacutes del test de Dunn con un nivel de 5 de significancia
Se utilizaron los programas estadiacutesticos STATGRAPHICS 20 y GRAPHPAD PRISM 5 para el anaacutelisis de datos
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4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
En los siguientes puntos se discuten los resultados obtenidos en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens
En la Figura 3 se observan plaacutentulas de C virescens micropropagadas en medio MS en caacutemara de crecimiento al inicio del ensayo (A) y en invernadero despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten (B)
BA
FIGURA 3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten
A continuacioacuten se presentan los resultados obtenidos para las variables analizadas (Cuadro 2 y 3) de esta manera se pueden visualizar en general los resultados obtenidos en el proceso de aclimatacioacuten durante seis meses
CUADRO 2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de raiacuteces
inicial y final Variables
Hojas finales (nuacutemero)
Raiacuteces iniciales (nuacutemero)
Raiacuteces finales (nuacutemero)
Tamantildeo de plaacutentulas 36 24 37 47 29 46
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 61 43 76
Sustratos 53 36 56 43 29 51
Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 46 27 49
Significa que hay diferencias significativas al 95 Test de Dunn
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Las variables no parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en hojas finales y raiacuteces iniciales en sus rangos de distribucioacuten Las raiacuteces finales no presentaron diferencias seguacuten el sustrato utilizado pero de acuerdo al tamantildeo hubo diferencias en su distribucioacuten
CUADRO 3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas
Variables Altura final de plaacutentulas
(cm) Sobrevivencia
Tamantildeo de plaacutentulas
36 c 567 b 47 b 821 a
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 59 a 908 a
Sustratos 52 a 933 a
41 ab 59 b Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 49 b 772 a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY Las variables parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en altura final de hojas y en sobrevivencia 41 Nuacutemero de hojas finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentulas y de sustratos para la variable nuacutemero final de hojas 411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula Seguacuten el Cuadro 2 y Figura 4 las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero final de hojas Las plaacutentulas pequentildeas de 1-2 cm obtuvieron el nuacutemero maacutes bajo de hojas finales con una media de 36 hojas por plaacutentula lo cual es la mitad de las hojas finales que se obtuvo con las plaacutentulas de mayor tamantildeo (61 hojas aproximado por plaacutentula) Para las plaacutentulas medianas de 2-3 cm se obtuvo una media de 47 hojas por plaacutentula (Figura 4)
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Hojas finales
1-2 cm 2-3cm maacutes de 3 cm0
5
10
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Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn)
BLANCO (2006) sentildeala que plaacutentulas cultivadas in vitro crecen bajo condiciones especiales como alta humedad relativa y baja luminosidad ademaacutes son suplidas con sacarosa Estas condiciones fueron proporcionadas en una caacutemara de crecimiento en el laboratorio donde las plantas micropropagadas no son dependientes por completo de su fotosiacutentesis son heteroacutetrofas Parece ser necesario un estiacutemulo para convertirse en organismos totalmente capaces de sustentar sus propios requisitos de carbono y nitroacutegeno reducido pasando de esta manera a ser autoacutetrofos
Al ser sacadas de un medio in vitro las hojas no estaacuten preparadas para producir su propio alimento y sobreviven gracias a que el medio de cultivo le proporciona los nutrientes necesarios para vivir En este punto muchas de las hojas mueren y nacen hojas nuevas capaces de generar su alimento supliendo asiacute las hojas viejas (SEELYE et al 2003) En este ensayo las plaacutentulas de Chloraea virescens presentaron en general una buena adaptacioacuten al ser sacadas de un medio in vitro
Se observoacute que plaacutentulas con menor tamantildeo al ser aclimatadas y tener menor tejido fue maacutes difiacutecil y maacutes lento que empezaran a generar nuevos tejidos y materia orgaacutenica a partir de dioacutexido de carbono POSPIacuteŠILOVAacute et al (1999) sentildeala que al tener los estomas con desarrollo incompleto maacutes grandes y de forma maacutes redonda pierden maacutes agua lo cual puede provocar una peacuterdida de hojas muriendo asiacute la plaacutentula Por esta razoacuten las plaacutentulas pequentildeas se demoran maacutes tiempo en generar hojas nuevas es por ello que al finalizar este estudio muestran el menor nuacutemero final de hojas 412 Efecto del tipo de sustrato Al analizar la influencia del tipo de sustrato se encontraron diferencias significativas entre los tres sustratos utilizados Seguacuten el Cuadro 2 y la Figura 5 el sustrato donde se obtuvo mejores resultados fue
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turba+perlita en el cual se observoacute un promedio de 53 hojas por plaacutentula siendo Sphagnum el maacutes bajo con 43 hojas por plaacutentula De acuerdo a los resultados del anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados el sustrato turba+perlita tiene mayor cantidad de nitroacutegeno foacutesforo calcio magnesio y azufre disponible comparativamente con los otros dos sustratos (Sphagnum y arena+turba) (Anexo 2)
Hojas finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
Sustratos
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) Para la brotacioacuten y el crecimiento de las plantas se necesita agua y Nitroacutegeno lo que favorece a una mayor tasa de aparicioacuten de hojas lo que se traduce en una mayor cantidad de hojas finales El Nitroacutegeno se encuentra en mayor cantidad en el sustrato turba+perlita debido a lo cual los mejores resultados se obtienen en dicho sustrato 413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Despueacutes de analizados los efectos individuales del tamantildeo y del sustrato al interactuar ambos factores existen diferencias significativas La mejor interaccioacuten se obtuvo con el sustrato turba+perlita y con el mayor tamantildeo de la plaacutentula (Figura 6) Debido a la buena estructura (porosa) de dicho sustrato se podriacutea decir que se favorecioacute la absorcioacuten radicular de nutrientes obteniendo por ello un mayor nuacutemero de hojas finales Para los menores tamantildeos no se observan diferencias significativas obteniendo como promedio 41 hojas por plaacutentula Para el mayor tamantildeo el promedio fue de 6 hojas por plaacutentula
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Hojas finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
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Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 42 Raiacuteces iniciales Este paraacutemetro se evaluoacute luego de la primera etapa de aclimatacioacuten la cual se realizoacute en una sala de aclimatacioacuten del laboratorio Se analizoacute la influencia de diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos sobre la variable nuacutemero raiacuteces iniciales (Anaacutelisis de Kruskal-Wallis en Anexo 7)
FIGURA 7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses de pre aclimatacioacuten
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En la Figura 7 se puede observar los resultados de pre aclimatacioacuten en sala de laboratorio En esta etapa ya es posible ver la presencia de raiacuteces desarrolladas 421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula En el Cuadro 2 se puede observar que las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero inicial de raiacuteces y en la Figura 8 se puede comprobar que para los dos tamantildeos de plaacutentula maacutes pequentildeos no se observa gran cantidad de raiacuteces esto no impidioacute el desarrollo posterior de las plaacutentulas las cuales lograron enraizar al final del estudio Esto se contrapone a lo observado en un estudio de Lapageria rosea donde la presencia de raiacutez y brote para lograr una multiplicacioacuten exitosa de plantas es de vital importancia Incluso algunas plaacutentulas de L rosea no brotan en condiciones in vitro en donde tienen las mejores condiciones nutricionales y hormonales para hacerlo Esto se debe a factores internos de la plaacutentula siendo muy difiacutecil que broten inmediatamente en caacutemara de aclimatacioacuten donde ya dejan de recibir los nutrientes necesarios de manera directa y requieren de balances de energiacutea para poder seguir elongando raiacuteces absorber nutrientes y brotar para poder obtener los carbohidratos necesarios para seguir su crecimiento (BLANCO 2006) El tamantildeo de plaacutentula tiene importancia para el desarrollo de raiacuteces se distingue notoriamente que en los tamantildeos maacutes grandes el nuacutemero de raiacuteces es mayor comparativamente con los tamantildeos pequentildeos donde el nuacutemero de raiacuteces fue escaso Debido a la presencia de maacutes hojas existe una mayor cantidad de aacuterea fotosinteacutetica esta situacioacuten estimula el crecimiento de las raiacuteces para la obtencioacuten de agua y nutrientes
Raices iniciales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
2
4
6
8
10
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o inicial de ra
iacuteces
FIGURA 8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn)
30
422 Efecto del tipo de sustrato Para el sustrato turba+perlita se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas en el nuacutemero de raiacuteces con respecto a los dos otros sustratos esto se puede ver en el Figura 9 donde se observa que se obtuvieron los mayores resultados En cualquier medio de crecimiento el espacio no ocupado por un soacutelido se llama porosidad este espacio puede ser ocupado en parte para retener agua y en parte para proporcionarle aire a las raiacuteces La ausencia de uno de estos elementos es perjudicial para las plantas La turba es conocida por tener estas propiedades y la perlita tambieacuten por esta razoacuten se sabe que la mezcla turba-perlita provee propiedades fiacutesicas excelentes como medio de crecimiento y propagacioacuten (INFOAGRO 2007) Estos resultados con turba-perlita (298 de materia orgaacutenica) coinciden con los obtenidos por DIAZ et al (2004) quienes al utilizar un sustrato compuesto por 100 de humus de lombriz para aclimatar cantildea de azuacutecar obtuvieron el mayor nuacutemero de raiacuteces Esto puede atribuirse al importante aporte de materia orgaacutenica del humus (47) lo que le confiere una mejor estructura obtenieacutendose una excelente porosidad del sustrato La aireacioacuten del suelo es necesaria para favorecer la maacutexima absorcioacuten de nutrientes por las raiacuteces Esto tambieacuten sucede en el sustrato turba+perlita el cual posee la mayor cantidad de materia orgaacutenica de los tres sustratos utilizados
Raices iniciales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
2
4
6
8
10
Sustratos
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato En los anaacutelisis para la variable nuacutemero de raiacuteces se puede decir que la mejor interaccioacuten se presentoacute para el sustrato de turba+perlita junto con el mayor tamantildeo de plaacutentulas obteniendo los valores maacutes altos entre los nueve tratamientos La presencia de raiacuteces luego de la micropropagacioacuten aumenta la posibilidad de eacutexito en el transplante ya que se crea un favorable balance de agua Pero esto no quiere
31
decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
10
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
32
En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
33
El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
34
Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
III
4 PRESENTACIOacuteN Y DISCUSION DE RESULTADOS 24
41 Nuacutemero de hojas finales 25
411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula 25
412 Efecto del tipo de sustrato 26
413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato 27
42 Raiacuteces iniciales 28
421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula 29
422 Efecto del tipo de sustrato 30
423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato 30
43 Raiacuteces finales 31
431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula 32
432 Efecto del tipo de sustrato 32
433 Interaccioacuten tamantildeo de plaacutentula y sustrato 33
44 Altura 35
45 Sobrevivencia 36
5 CONCLUSIONES 38
6 BIBLIOGRAFIA 39
7 ANEXOS 42
IV
INDICE DE CUADROS
Cuadro Paacutegina
1 Composicioacuten de solucioacuten nutritiva Hoagland 21
2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de
raiacuteces inicial y final 24
3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas 25
V
INDICE DE FIGURAS
Figura Paacutegina
1 C virescens 7
2 Plaacutentulas de C virescens en caacutemara de crecimiento in vitro 20
3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS
B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten 24
4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) 26
5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final
de hojas (Test de Dunn) 27
6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 28
7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses
de pre aclimatacioacuten 28
8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 29
9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final
de raiacuteces (Test de Dunn) 30
10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no
parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 31
11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses
de aclimatacioacuten 31
12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 32
13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final
de raiacuteces (Test de Dunn) 33
14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre para la variable no
parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 34
15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) 35
VI
16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable
parameacutetrica altura final de plaacutentulas 35
17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) 37
18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la
variable parameacutetrica de sobrevivencia 37
VII
INDICE DE ANEXOS
Anexo Paacutegina
1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962)
y suplementos orgaacutenicos 44
2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio 45
3 Registro de temperaturas miacutenimas maacutexima y promedio durante
el estudio 46
4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas
finales 47
5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales 47
6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces
iniciales 48
7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces
iniciales 48
8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces
finales 49
9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales 49
10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en
aclimatacioacuten 50
11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura 50
12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de
plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten 51
13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia 51
14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea 52
1
RESUMEN Dentro del esquema de micropropagacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens la aclimatacioacuten es la etapa final donde la manipulacioacuten debe ser muy cuidadosa ya que es donde se produce el mayor iacutendice de mortandad principalmente en el proceso de trasplante Esta etapa es muy importante ya que gracias a ella se veraacute la eficiencia del proceso y la calidad final de las plantas producidas in vitro por eso el objetivo general de este trabajo es evaluar la influencia del tamantildeo de plaacutentulas y utilizacioacuten de distintos sustratos en la aclimatacioacuten ex vitro de plaacutentulas de C virescens Se utilizaron plaacutentulas de Chloraea virescens obtenidas a partir de la micropropagacioacuten de protocormos provenientes de germinacioacuten asimbioacuteticas de semillas efectuada en el laboratorio de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal de la Universidad Austral de Chile Las plaacutentulas fueron repicadas hasta obtener el nuacutemero adecuado para el ensayo Luego fueron trasladadas a una sala del laboratorio en macetas de seis ocho y diez plaacutentulas dependiendo del tamantildeo de la plaacutentula (maacutes de 3cm 2-3cm y 1-2cm respectivamente) por dos meses posteriormente fueron transferidas a 3 sustratos turba+perlita (11) Sphagnum y turba+arena (11) y fueron llevadas a invernadero durante cuatro meses Las variables evaluadas fueron nuacutemero final de hojas nuacutemero inicial y final de raiacuteces altura y sobrevivencia de las plaacutentulas Los resultados obtenidos demostraron que los tamantildeos y los sustratos ocupados influyen en el crecimiento de las plaacutentulas El mejor tamantildeo para la aclimatacioacuten es de maacutes de 3cm obteniendo con eacuteste los mejores resultados en todas las variables evaluadas Lo mismo ocurrioacute con el sustrato turba+perlita el cual fue el mejor evaluado
2
REacuteSUMEacute Dans le scheacutema de la micropropagation de Chloraea virescens lacclimatation est la derniegravere eacutetape ougrave il faut ecirctre prudent parce que cest agrave ce moment lagrave que les taux de mortaliteacute sont les plus eacuteleveacutes principalement dans le processus de transplantation Cette eacutetape est tregraves importante parce que ce sera gracircce agrave elle quacuteon verra lefficaciteacute du processus et la qualiteacute finale des plantes produites in vitro Lobjectif geacuteneacuteral de cette eacutetude est dacuteeacutevaluer linfluence de la taille des plantes et lutilisation de divers substrats pour lacuteacclimatation de C virescens On a utiliseacute des plantes de C virescens obtenue a partir de la micropropagation de protocormos en provenance du laboratoire de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal de la Universidad Austral de Chile Les plantes ont eacuteteacute subdiviseacutee pour obtenir le nombre approprieacute Elles ont ensuite eacuteteacute transfeacutereacutees agrave des pots dans une piegravece du laboratoire de six huit et dix en fonction de la taille de la plante (plus de 3 cm de 2-3 cm et 1-2 cm respectivement) pour deux mois ensuite elles ont eacuteteacute transfeacutereacutee dans trois substrats tourbe + perlite (11) Sphagnum et tourbe + sable (11) et elles ont eacuteteacute mises dans une serre pour quatre mois Les variables agrave eacutevaluer sont nombre final de feuilles nombre de racines au deacutebut et agrave la fin la hauteur et la survie des plantes Les reacutesultats ont montreacute que la taille et les substrats utiliseacutes ont une influence sur la croissance des jeunes plantes La taille ideacuteale pour lacclimatation est plus de 3cm avec cette derniegravere on a obtenu les meilleurs reacutesultats dans toutes les variables qui ont eacuteteacute eacutevalueacutees Le mecircme reacutesultat sest produit avec le substrat de tourbe + perlite lequel a aussi montreacute les meilleurs reacutesultats
3
1 INTRODUCCION La familia Orchidaceae (Orquiacutedeas) es la que mayor nuacutemero de especies comprende en el Reino Vegetal Se estima que debe haber alrededor de 35000 especies de Orquiacutedeas en todo el mundo pertenecientes a unos 750 geacuteneros ademaacutes de miles de hiacutebridos En Chile esta familia es probablemente el grupo menos estudiado de plantas con flores y soacutelo se han realizado estudios en base a su taxonomiacutea biologiacutea reproductiva fenologiacutea y distribucioacuten
La produccioacuten de flores de orquiacutedeas ha tomado importancia por la belleza de sus flores dada la enorme variedad de formas colores y perfumes Existen orquiacutedeas terrestres y epiacutefitas estas uacuteltimas representan maacutes del 90 del total de especies y son las que mayoritariamente se encuentran a la venta Las flores tienen un alto valor ornamental o como flor cortada ya que eacutestas pueden permanecer separadas de las plantas sin marchitarse hasta tres o cuatro semanas y en la planta permanecen hasta tres meses
La obtencioacuten de plantas de orquiacutedeas a partir de semillas es muy difiacutecil ya que eacutestas son diminutas y de germinacioacuten irregular Como una alternativa de obtencioacuten de plantas aparece la micropropagacioacuten pudiendo asiacute aumentar el nuacutemero de plantas en forma relativamente faacutecil y raacutepida Luego de la etapa de micropropagacioacuten viene la etapa de aclimatacioacuten en la cual la manipulacioacuten debe ser en extremo cuidadosa ya que es donde se produce el mayor iacutendice de mortandad principalmente en el proceso de transplante Esta etapa es muy importante ya que gracias a ella se veraacute la eficiencia del proceso y la calidad final de las plantas producidas in vitro Considerando la produccioacuten de plaacutentulas mediante la micropropagacioacuten en este trabajo se plantea la hipoacutetesis que ldquoel tamantildeo de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro y los distintos sustratos son factores que inciden en el desarrollo y su aclimatacioacutenrdquo El objetivo general de este trabajo es
Evaluar la influencia del tamantildeo de plaacutentulas y utilizacioacuten de distintos sustratos en la aclimatacioacuten ex vitro de plaacutentulas de C virescens
Los objetivos especiacuteficos son
Medir el efecto del tamantildeo de plaacutentulas de C virescens en la sobrevivencia y desarrollo de eacutestas ex vitro
Comparar el uso de tres sustratos en el desarrollo y sobrevivencia de plaacutentulas de C virescens
4
2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA 21 Descripcioacuten general 211 Descripcioacuten geograacutefica Las orquiacutedeas pertenecen a la familia Orchidaceae clase Liliopsida (monocotiledoacuteneas) Son plantas herbaacuteceas perennes originarias de regiones tropicales y subtropicales pero existen tambieacuten en todos los continentes a excepcioacuten de las regiones polares La zona donde se encuentran estas plantas estaacute comprendida entre los 68ordm latitud norte y 56ordm latitud sur Es evidente que en los liacutemites extremos de estas latitudes se encuentran pocos geacuteneros y especies esto va en aumento desde las regiones temperadas hasta las regiones intertropicales donde el nuacutemero es el mayor Los territorios maacutes interesantes por su nuacutemero son
Ameacuterica del Sur y Ameacuterica Central Asia e India Madagascar Australia es el continente menos poblado en orquiacutedeas dentro de las regiones
del globo Por su parte Europa presenta numerosos geacuteneros y especies de orquiacutedeas
terrestres Soacutelo en Francia existen 75 especies repartidas en 16 geacuteneros todas terrestres (LECOUFLE y ROSE 1956)
212 Formas de vida Las zonas donde crecen estas plantas influyen sobre su manera de vivir Algunas orquiacutedeas son terrestres y se encuentran representadas en todas las regiones Tambieacuten existen las epiacutefitas (vegetal que fijado a otro no obtiene de eacuteste su alimento) En este caso se necesita que el grado higromeacutetrico y la temperatura permitan este tipo de adaptacioacuten Ademaacutes existen las orquiacutedeas litofiacuteticas que viven sobre rocas Las raiacuteces de las epiacutefitas y litofiacuteticas estaacuten adaptadas a vivir expuestas al aire o inmersas en materia orgaacutenica ya que tienen un tejido acumulador de agua llamado velo En zonas friacuteas y templado friacuteas todas las orquiacutedeas son terrestres En zonas subtropicales o tropicales la gran mayoriacutea es epiacutefita Otra particularidad debida seguramente a la influencia de estas zonas es la floracioacuten Es en las zonas tropicales y subtropicales que se dan los mayores tamantildeos de flores asiacute como tambieacuten la mayor variedad de colores (LECOUFLE y ROSE 1956)
213 Descripcioacuten morfoloacutegica Las orquiacutedeas se caracterizan por poseer flores muy vistosas hermafroditas (ambos sexos en la misma flor) zigomorfas (con un solo plano de simetriacutea) triacutemeras (tres seacutepalos y tres peacutetalos) y una columna central que sustenta las estructuras reproductivas masculinas anteras y femeninas pistilo llamada ginostemo El peacutetalo inferior se llama labelo y su morfologiacutea define a los distintos geacuteneros de orquiacutedeas Las flores pueden ser aisladas o en inflorescencia y son polinizadas por insectos El polen se encuentra aglomerado formando una masa llamada polinio el que tiene un extremo con un ensanchamiento glandular pegajoso que sirve para que el
5
polinio se adhiera al cuerpo del insecto polinizador El fruto es una caacutepsula seca con muchas semillas pequentildeas sin endosperma y con embrioacuten no diferenciado Tienen dos tipos baacutesicos de crecimiento Simpodial en las que el nuevo crecimiento se produce en sentido horizontal a partir de un tallo subterraacuteneo o rizoma generando una sub-unidad capaz de producir una flor o inflorescencia y de ser eventualmente separada de la planta (ej Cattleya) Monopodial en las que el nuevo crecimiento se produce en sentido vertical con lo cual la planta crece constantemente en altura (ej Phalaenopsis) (ORQUIDEAS 2007) 214 Geacuteneros y especies chilenas Seguacuten NOVOA et al (2006) en la familia Orchidaceae se encuentran 49 especies de flora nativa dentro de las cuales se encuentra Chloraea virescens (Willd) Lindl Los geacuteneros de Orchidaceae en Chile son 7
- Aa Bipinnula Brachystele Codonorchis Chloraea Gavilea y Habenaria
Dentro del geacutenero Chloraea existen 31 especies - Chloraea alpina Poepp - Chloraea barbata Lindl - Chloraea bidendata (Poepp y Endl) Correa - Chloraea bletioides Lindl - Chloraea cuneata Lindl - Chloraea chica Speg - Chloraea chrysantha Poepp - Chloraea crispa Lindl - Chloraea cristata Lindl - Chloraea cylindrostachya Poepp - Chloraea disoides Lindl - Chloraea galeata Lindl - Chloraea gaudichaudii Brongn - Chloraea gavilu Lindl - Chloraea grandiflora Lindl - Chloraea heteroglossa Rchbf - Chloraea incisa Poepp - Chloraea lamellata Lindl - Chloraea lechleri Lindl - Chloraea leptopetala Reiche - Chloraea longipetala Lindl - Chloraea magellanica Hookf - Chloraea multiflora Lindl - Chloraea nudilabia Lindl - Chloraea philippii Reichbf - Chloraea picta Phil - Chloraea prodigiosa Reichbf - Chloraea speciosa Poepp - Chloraea virescens Lindl - Chloraea viridiflora Poepp
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- Chloraea volkmanni Phil (NOVOA et al 2006) 2141 Chloraea virescens Planta perenne de 40-90 cm de altura Sus hojas son de 5-12cm de largo por 15-25cm de ancho estrechas lanceoladas agudas dispuestas en roseta basal generalmente marchitas al final de la antesis Su escapo floral tiene vainas caulinares lanceoladas agudas y distantes La inflorescencia es de 8-20cm de largo densa con 10-15 flores erguidas Sus flores son blancas con estriacuteas y aacutepices verdes El seacutepalo dorsal es de 16-33mm de largo por 4-6mm de ancho oblongo lanceolado obtuso algo coacutencavo a veces ligeramente estrechado al centro aacutepice algo carnoso Los seacutepalos laterales de 18-33mm de largo por 4-5mm de ancho son ensiformes con aacutepice obtuso engrosado verde negruzco a veces espatulado y dentado a veces verrugoso Los peacutetalos son de 15-23mm de largo por 5-58mm de ancho estrechamente aovados obtusos verrugosos con maacutes frecuencia solo la mitad inferior a veces el borde denticulado y carnoso El labelo de 15-26mm de largo por 10-20mm de ancho es mas o menos romboidal a levemente trilobulado El loacutebulo central tiene 5-7 nervios longitudinales recorridos por laminillas interrumpidas membranaacuteceas con segmentos falciformes de borde carnoso de color verde Los nervios laterales que se ramifican oblicuamente hacia el aacutepice en los loacutebulos laterales tienen pequentildeas laminillas y verrugas y su borde es laciniado inciso en la mitad apical hacia la base denticulado aacutepice generalmente engrosado La columna es de 12-18mm de largo delgada blanca con estriacuteas anaranjada La base de la zona nectariacutefera tiene un color amarillo-limoacuten con maacuteculas anaranjadas orificio nectario verde El ala de la columna es recta y estrecha El estigma es triangular y globoso La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la Vordf (Vintildea del Mar) hasta la XIordf Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile Sin embargo es posible que tenga una distribucioacuten maacutes restringida por que se le ha confundido con Chloraea incisa Su floracioacuten es desde noviembre a febrero y su estado de conservacioacuten no estaacute evaluado (NOVOA et al 2006) En el Anexo 14 se incluyen antecedentes sobre su distribucioacuten y eacutepoca de floracioacuten
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FIGURA 1 Chloraea virescens FUENTE NOVOA et al (2006) 22 Requerimientos de las orquiacutedeas Para tener eacutexito en el cultivo de orquiacutedeas hay que tomar en cuenta factores de importancia como son 221 Agua El riego correcto es el principio y el fin del cuidado de orquiacutedeas (ROLLKE 2005) Este elemento es primordial para las orquiacutedeas asiacute como tambieacuten para todo tipo de plantas En el caso de eacutestas se dice muchas veces que la calidad del agua usada es el factor maacutes importante en el cultivo de orquiacutedeas ya que el porcentaje maacutes alto de muerte se produce por el exceso de este factor (SHEEHAN 1980) Hay que tomar en cuenta que la mayoriacutea de las orquiacutedeas son epiacutefitas lo que significa que tienen sus raiacuteces a la vista gracias a las cuales absorben el agua de lluvia Se recomienda un sustrato poroso y de reaccioacuten neutra ya que de esta manera el agua escurre sin acumularse no permitiendo la pudricioacuten de las raiacuteces Para las orquiacutedeas terrestres es lo mismo solo que se pueden regar con maacutes frecuencia pero sin mantenerlas saturadas (OSPINA y DRESSLER 1979) Seguacuten DUMOIS (2007) el agua es lo maacutes difiacutecil de controlar ya que depende de muchas variables como por ejemplo humedad relativa tipo de sustrato intensidad luminosa temperatura y circulacioacuten de aire Ademaacutes muchas orquiacutedeas necesitan un periacuteodo de receso vegetativo que si no es respetado resulta en ausencia de floracioacuten En general hay que antildeadir agua en abundancia cuando la planta se encuentra en crecimiento activo y reducirla despueacutes de la floracioacuten
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Las especies con pseudobulbos almacenan agua y estaacuten preparadas para su periacuteodo de receso Otras que no cuentan con estos oacuterganos requieren de humedad maacutes constante 222 Luz Ninguna planta puede crecer sin la iluminacioacuten adecuada Muchas orquiacutedeas viven en las alturas de los aacuterboles y estaacuten expuestas a plena luz del sol otras crecen en el suelo selvaacutetico protegidas del sol por espesos follajes (ROLLKE 2005) La funcioacuten principal de la luz es activar el proceso de fotosiacutentesis Los cultivadores han estudiado la luz y han descubierto que hay orquiacutedeas que florecen con diacutea largo y otras con diacutea corto (OSPINA y DRESSLER 1979) Gracias a la fotosiacutentesis se convierten los minerales presentes en el ambiente en savia y nutrientes Hojas oscuras y falta de floracioacuten indican falta de luz hojas amarillas e incluso quemadas apuntan hacia un exceso de sol (DUMOIS 2007) 223 Fertilizacioacuten Las orquiacutedeas necesitan los mismos nutrientes que otras plantas Un abono para orquiacutedeas debe contener los nutrientes principales nitroacutegeno (N) foacutesforo (P) y potasio (K) asiacute como tambieacuten oligoelementos como hierro (Fe) magnesio (Mg) zinc (Zn) estantildeo (Sn) y manganeso (Mn) (ROLLKE 2005) Por otra parte la fertilizacioacuten depende de varios factores dentro de los cuales los maacutes criacuteticos son
- El medio utilizado - La edad de las plantas - Estado de las plantas ya sea floracioacuten crecimiento reposo
En cuanto a absorcioacuten se ha demostrado que es igual de eficiente por viacutea foliar como a traveacutes de las raiacuteces Es necesario tener en cuenta algunas reglas baacutesicas a la hora de fertilizar las orquiacutedeas (Asociacioacuten Costarricense de Orquideologiacutea ACO 1970)
1 Regar las plantas antes de fertilizar 2 Fraccionar las dosis 3 Aplicar el fertilizante de forma liacutequida 4 No usar fertilizantes soacutelidos 5 No fertilizar las plantas recieacuten plantadas 6 No fertilizar plantas en reposo 7 No abonar plantas enfermas
224 Temperatura Es conocido el hecho de que cada planta tiene liacutemites de temperatura dentro de los cuales prospera o perece De ahiacute la necesidad de conocer las temperaturas correspondientes al lugar de donde viene cada especie de orquiacutedea pudiendo proporcionarle la temperatura adecuada (OSPINA y DRESSLER 1979) Se puede clasificar a las orquiacutedeas como de clima caacutelido (temperatura nocturna miacutenima de 20ordmC) templado (miacutenimo de 13 a 18ordmC) y de ambiente friacuteo (de 10 a 13ordmC) (DUMOIS 2007)
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Seguacuten SHEEHAN (1980) las temperaturas ideales para las orquiacutedeas de origen tropical son 10ordmC en la noche y entre 21ordm - 24ordmC durante el diacutea 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas La micropropagacioacuten de orquiacutedeas estaacute en vanguardia hoy en diacutea El estudio de cultivo de tejido de orquiacutedeas se lleva a cabo en muchos laboratorios de todo el mundo (ARDITTI and ERNST 1992) 231 Biologiacutea de las semillas Las semillas de orquiacutedeas son conocidas usualmente como semillas polvo porque son minuacutesculas y contienen pocas reservas de alimento Estas semillas por lo general no germinan en el medio natural a menos que sean infectadas por un hongo micorriacutezico Este hongo abastece a las plantas joacutevenes con azuacutecares y nutrientes hasta que sean lo suficientemente grandes para fabricar su propio alimento Cuando la semilla germina produce una masa indiferenciada de ceacutelulas llamada protocormo Manteniendo las condiciones normales el protocormo continuaraacute su crecimiento por varias semanas meses o incluso antildeos dependiendo de la especie hasta que alcance la edad apropiada para producir raiacuteces y hojas En el caso de orquiacutedeas terrestres es de vital importancia que la relacioacuten orquiacutedea-hongo se conserve durante los estados tempranos del ciclo de vida de la planta ya que el protocormo enterrado no puede fabricar alimento por siacute mismo Por otro lado los protocormos de las orquiacutedeas epiacutefitas son comuacutenmente verdes lo que les posibilita producir parte de su alimento La relacioacuten orquiacutedea-hongo no ha sido en su totalidad investigada para el caso de las orquiacutedeas tropicales (McKENDRICK 2000) 232 Germinacioacuten simbioacutetica y no simbioacutetica de semillas Mediante la germinacioacuten in vitro las semillas germinan en frascos de vidrio o plaacutestico Estos frascos contienen en su interior un medio nutritivo solidificado con agar con todos los azuacutecares y minerales necesarios para la germinacioacuten y crecimiento de las semillas Hay dos tipos de germinacioacuten la simbioacutetica y la asimbioacutetica En la germinacioacuten simbioacutetica las semillas se siembran junto con una pequentildea cantidad del hongo micorriza adecuado Dicho hongo crece en el medio coloniza a las semillas que estaacuten en proceso de germinacioacuten y se produce una relacioacuten simbioacutetica la cual alimentaraacute al protocormo hasta que este sea capaz de producir sus hojas y se vuelva autotroacutefico Esta teacutecnica es usada principalmente en propagacioacuten de orquiacutedeas terrestres en zonas templadas La germinacioacuten asimbioacutetica se usa principalmente en propagacioacuten de orquiacutedeas tropicales que crecen maacutes raacutepido que sus parientes de zonas templadas Para este tipo de germinacioacuten se necesita un medio de cultivo maacutes complejo ya que todos los nutrientes orgaacutenicos e inorgaacutenicos asiacute como tambieacuten los azuacutecares deben estar en forma disponible pues no existe la intermediacioacuten del hongo (McKENDRICK 2000) 233 Condiciones de esterilidad Tanto para la germinacioacuten simbioacutetica como para la asimbioacutetica es de vital importancia que los frascos las semillas aparatos y el medio esteacuten esteacuteriles desde el principio del proceso Esto debido a que cualquier hongo o bacteria que se introduzca creceraacute maacutes raacutepido que las semillas ocupando su espacio hasta matarlas Esto se evita gracias al autoclave el cual regulado a 12 atm y 120ordmC por 20 minutos mata hongos o bacterias presentes en el medio (McKENDRICK 2000)
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2331 Siembra de las semillas Las semillas pueden ser recolectadas desde caacutepsulas verdes o maduras La caacutepsula verde que estaacute madurando estaacute llena de semillas y no se deforma cuando se aprieta con las pinzas Estas semillas pueden ser almacenadas por algunas semanas en un lugar refrigerado con bastante aireacioacuten Las semillas se pueden sembrar a partir de caacutepsulas verdes o semillas secas A continuacioacuten se muestran las ventajas y desventajas de ambos meacutetodos
- Siembra a partir de caacutepsulas verdes Si las caacutepsulas se mantienen intactas el interior (las semillas) se mantiene esteacuteril Por lo tanto si se esteriliza la parte exterior de las mismas donde hongos y bacterias pueden desarrollarse y se abren las caacutepsulas bajo condiciones esteacuteriles y las semillas podraacuten mantenerse desinfectadas
La ventaja de este meacutetodo es que no se requiere de esterilizacioacuten de las semillas lo que provoca su deterioro Otro punto a favor es que algunas semillas podriacutean germinar maacutes raacutepido que las provenientes de caacutepsulas maduras por los mecanismos de dormancia La desventaja es que en este caso todas las semillas deben ser utilizadas o eliminadas mientras que las semillas maduras se pueden almacenar Tambieacuten se debe considerar que las semillas sembradas a partir de caacutepsulas que no han madurado lo suficiente podriacutean germinar lentamente o simplemente no germinar - Siembra a partir de semillas secas En este caso una vez que la caacutepsula es abierta las semillas dejan de ser esteacuteriles y requieren de un proceso de esterilizacioacuten Comuacutenmente se utiliza una solucioacuten de hipoclorito de sodio hipoclorito de calcio o peroacutexido de hidroacutegeno Las semillas se agitan dentro de la solucioacuten que ademaacutes contiene una gota de detergente para ldquohumedecerlasrdquo luego se las enjuaga con agua destilada y se las siembra en el medio preparado La ventaja de este meacutetodo es que las semillas pueden ser colectadas secadas al aire almacenadas por varios meses en el refrigerador y utilizarlas cuando sea necesario Se debe considerar que la siembra ya sea de caacutepsulas verdes o de semillas secas estaacute determinado por la eacutepoca en que se colectan (McKENDRICK 2000) 234 Trasplante En la caacutemara de incubacioacuten las plaacutentulas se han desarrollado en condiciones limpias y en un ambiente cerrado por lo que deben acostumbrase gradualmente al ambiente exterior antes de ser trasplantadas a las macetas Tambieacuten la temperatura y la luz la cual es baja han sido constantes durante el cultivo in vitro En el medio natural la temperatura y la luz variacutean constantemente por lo que las nuevas plantas deben estar protegidas de la fuerte luz solar la cual puede quemar las hojas con soacutelo una pequentildea cantidad de eacutesta La humedad en los frascos es alta y las plantas estaacuten protegidas de ataques por hongos o bacterias Ademaacutes las plaacutentulas han crecido bajo condiciones de alta humedad y por lo tanto tendraacuten cutiacuteculas deacutebiles por lo que necesitan acostumbrase a medios menos huacutemedos antes de ser transplantadas
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Para el trasplante se deben colocar los frascos en un lugar protegido de la lluvia para que se aclimaticen a las nuevas condiciones de luz y temperatura Se deben dejar por 2 a 4 semanas en los frascos tapados Luego se debe ir aflojando las tapas para dejar entrar pequentildeas cantidades de aire hasta el punto de dejarlas descubiertas Se debe revisar si hay hojas marchitas y ver que el sustrato esteacute huacutemedo
Lo ideal es dejarlas sin tapa durante una semana antes de pasarlas a las macetas Para el trasplante se debe elegir un sustrato adecuado para el tipo de planta humedecerlo y transplantar las plantas con cuidado de no dantildear las raiacuteces y evitando la deshidratacioacuten En esta etapa tambieacuten se debe dejar las macetas selladas para evitar una raacutepida deshidratacioacuten e ir abrieacutendolas paulatinamente (McKENDRICK 2000)
24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas 241 Orquiacutedeas terrestres 2411 Cypripedium Esta es una orquiacutedea terrestre de zonas templadas se desarrolla en el Hemisferio Norte como por ejemplo en Guatemala y en Honduras pero donde se encuentra principalmente es en China Su forma maacutes comuacuten de propagacioacuten es in vitro a partir de semillas La forma maacutes eficiente es a partir de semillas inmaduras Existe un intervalo de tiempo entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten eacuteste dependeraacute de la especie y de la zona donde se desarrolle Se asume que existen aproximadamente cuatro semanas entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten El oacuteptimo para una buena germinacioacuten de Cypripedium es entre 42 y 60 diacuteas despueacutes de la polinizacioacuten y entre 14 y 32 diacuteas despueacutes de la fertilizacioacuten La germinacioacuten ocurre entre la segunda y cuarta semana despueacutes de ser sembradas y los protocormos deberiacutean ser cambiados de medio de cultivo cada dos a cuatro meses si no se corre el riesgo de sufrir agotamiento de nutrientes Los rizomas y las raiacuteces se empiezan a desarrollar a partir de los siete meses para luego dar lugar a las primeras hojas Para obtener un buen transplante se deben tener raiacuteces de miacutenimo un centiacutemetro de largo El desarrollo de raiacuteces se ve potenciado al tener un periacuteodo corto de bajas temperaturas (10degC) exposicioacuten a la luz reduccioacuten en la concentracioacuten de iones del medio de cultivo o transferirlas a un compost esteacuteril Al tener raiacuteces suficientes y el tamantildeo adecuado se podraacuten llevar las plantas al lugar donde creceraacuten definitivamente En el momento del transplante las plantas son muy susceptibles al desecamiento por lo cual lo ideal es que los brotes sean maacutes chicos que las raiacuteces El mejor sustrato seriacutea aquel donde crece naturalmente la orquiacutedea (RAumlNNBAumlCK 2007) 2412 Preservacioacuten in vitro de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes Este estudio fue hecho para establecer que parte de tejido es viable para la micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes del noreste de Europa pudiendo asiacute reestablecer dichas orquiacutedeas a sus aacutereas correspondientes La propagacioacuten in vitro de orquiacutedeas
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terrestres de clima templado es maacutes difiacutecil que las orquiacutedeas epiacutefitas de clima subtropical y tropical Las orquiacutedeas terrestres tienen requerimientos maacutes estrictos que las epiacutefitas y se conoce menos sobre sus necesidades especiacuteficas (VAASA y ROSENBERG 2004) En Estonia existen 36 especies de orquiacutedeas terrestres pero solo tres estaacuten bajo proteccioacuten Dactylorhiza baltica Dactylorhiza ruthei Dactylorhiza praetermissa Como explantes para este estudio en el caso de D baltica se ocuparon protocormos en los otros dos casos se utilizaron semillas semi maduras las cuales fueron colectadas siete y diez semanas despueacutes de ser polinizadas Para D baltica se ocupoacute el medio Murashige y Skoog suplementado con 05 mgL de aacutecido naftaleacuten aceacutetico (ANA) y 2 mgL de isonpentenyl adenina Para el caso de las semillas semi maduras se ocuparon los medios de Lindemann de Heller de Norstog y de Murashige y Skoog como control
La composicioacuten del medio y la madurez de las semillas influye mucho en el desarrollo de las orquiacutedeas in vitro Se ha demostrado que se necesita una alta concentracioacuten de microelementos para obtener una correcta germinacioacuten de las semillas Tambieacuten se puede decir que los primeros tres meses son los de mayor crecimiento luego de este tiempo el crecimiento se vuelve maacutes lento (VAASA y ROSENBERG 2004)
Luego de cuatro semanas de crecimiento de D baltica el 60 de los explantes de meristemas apicales empezaron a crecer en cambio los de meristemas laterales no expresaron ninguacuten tipo de crecimiento Las raiacuteces empezaron su desarrollo luego de dos meses despueacutes de la siembra
En el caso de D ruthei y D praetermissa la germinacioacuten se produjo despueacutes de dos meses desde la inoculacioacuten Luego de cuatro y seis meses el mayor crecimiento fue observado en el medio Norstog superando en 14 al medio testigo Murashige y Skoog (VAASA y ROSENBERG 2004)
2413 Longevidad de semillas de orquiacutedeas terrestres Por lo general las orquiacutedeas producen muchas pero pequentildeas semillas que contienen muy pocas reservas de alimento Dichas semillas estaacuten estructuralmente adaptadas para ser dispersadas por el viento pero poco se sabe del destino de eacutestas luego de ser dispersadas Algunos estudios de viabilidad de semillas indican una sobrevivencia de uno a dos antildeos en orquiacutedeas de clima templado Las semillas que son guardadas en laboratorio duran mucho maacutes tiempo Se estudioacute la viabilidad de siete especies de orquiacutedeas norteamericanas dentro de las cuales se encuentran Goodyera pubescens y Liparis liliifolia Las semillas de eacutestas se colocaron en bolsas con suelo y sustratos de bosques provenientes de sus haacutebitats naturales (WHIGHAM et al 2005) En Goodyera pubescens la mayoriacutea de las semillas germinaron en un antildeo Cuatro otras especies germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero algunas semillas no germinadas despueacutes de siete antildeos seguiacutean siendo viables En la especie Liparis liliifolia semillas que han estado cuatro antildeos bajo observacioacuten han tenido una tasa de
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germinacioacuten de un 68 al ser sembradas in vitro junto con el hongo micorriacutezico adecuado Las dos especies restantes no germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero las semillas fueron evaluadas como intactas y testeadas positivamente en cuanto a su viabilidad despueacutes de cuatro antildeos en el suelo Estas observaciones fueron interpretadas como diferentes estrategias para especies especiacuteficas de germinacioacuten in situ (WHIGHAM et al 2005) 2414 Sobrevivencia de orquiacutedeas terrestres transplantadas a sectores urbanos La conservacioacuten de poblaciones de orquiacutedeas silvestres depende del establecimiento de las orquiacutedeas propagadas a los campos Sin embargo se conoce muy poco de los factores bioacuteticos que influencian el establecimiento de orquiacutedeas terrestres a sus haacutebitats naturales Un experimento fue establecido para medir la sobrevivencia de seis especies durante su primer periacuteodo de crecimiento seguido del transplante a un sector urbano en Australia (SCADE et al 2006)
Las orquiacutedeas germinadas simbioacuteticamente crecieron en laboratorio durante cinco meses antes de establecer la plantacioacuten en sitios adyacentes con alta o baja cobertura de malezas Existioacute una muerte gradual de las plaacutentulas durante el primer periacuteodo de crecimiento primeramente por ataque de insectos no siendo evitado por la presencia de una malla cobertora Los iacutendices de sobrevivencia variacutean desde 49 para Microtis media una especie capaz de crecer en un ambiente atiacutepico hasta un 21 para Caladenia arenicola la orquiacutedea nativa maacutes comuacuten de esos sitios Sin embargo no todas las orquiacutedeas sobrevivientes producen tubeacuterculos por lo que la tasa de sobrevivencia despueacutes del primer periacuteodo seco disminuye
La sobrevivencia de las orquiacutedeas sembradas no puede ser comparada con orquiacutedeas de la misma especie que crecieron en los mismos lugares ya que no existioacute la presencia del hongo compatible para estas orquiacutedeas (SCADE et al 2006)
2415 Micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres En India dos orquiacutedeas muy importantes para la horticultura del geacutenero Anoectochilus fueron exitosamente propagadas Noacutedulos aislados de A sikkimensis colectadas en Himalaya y A regalis colectadas en India fueron cultivadas in vitro durante 12 semanas para obtener un maacuteximo de 48 a 56 protocormos y brotes obteniendo como resultado un 95 y 98 de eficiencia respectivamente Durante el repicado de los explantes in vitro de A regalis se observoacute que el nuacutemero total de brotes obtenidos a partir de noacutedulos fue 214 asiacute como tambieacuten 82 puntas de brotes En cambio para A sikkimensis fueron mucho maacutes bajos 123 y 43 respectivamente teniendo un crecimiento maacutes lento pero plantas maacutes fuertes Las raiacuteces de 4 a 6cm crecieron con la presencia de NAA (270 microM ) en el medio asiacute como tambieacuten con carbono activado (02) Durante la aclimatacioacuten la tasa de establecimiento fue entre 95 y 98 Luego de seis meses en invernadero las plantas de A regalis fueron transferidas a bosque nativo donde se obtuvo una tasa de
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sobrevivencia de entre 70 y 95 despueacutes de 12 meses Estas plantas establecidas en bosque nativo estaacuten libres de cualquier defecto morfoloacutegico y de crecimiento (GANGAPRASAD et al 2000) 242 Orquiacutedeas epiacutefitas Estas orquiacutedeas viven en los aacuterboles pero no obtienen de eacuteste su alimento no son paraacutesitas 2421 Preservacioacuten de Cattleya walkeriana usando propagacioacuten in vitro El geacutenero Cattleya se encuentra en Meacutexico y Ameacuterica Central asiacute como tambieacuten en Venezuela Colombia y las laderas de los Andes Esta orquiacutedea tambieacuten se encuentra en varias regiones del Brasil creciendo en aacuterboles rocas cerca de riacuteos lagos y pantanos Las flores de esta orquiacutedea son conocidas debido a su hermosura y a causa de la destruccioacuten de su haacutebitat y a la excesiva coleccioacuten de eacutestas se encuentra en extincioacuten
La composicioacuten del medio de cultivo es esencial para la propagacioacuten in vitro ya que suple todos los nutrientes necesarios para el desarrollo y seraacute distinto dependiendo de cada especie en este caso se utilizoacute la mitad de los macronutrientes del medio Muchos autores sugieren el uso de carboacuten activado en el medio ya que por lo general en muchas especies aumenta el desarrollo de las raiacuteces En este estudio se probaron distintas dosis de carboacuten activado 1 2 4 y 6gL con un pH de 6 (TADEU DE FARIA et al 2002) Las semillas se obtuvieron de flores artificialmente polinizadas en invernadero Plaacutentulas de aproximadamente un centiacutemetro fueron seleccionadas y cultivadas nuevamente en el medio de cultivo Murashige y Skoog pero esta vez con las diferentes dosis de carboacuten activado Se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces el nuacutemero de brotes y el peso de la materia verde total Durante el autoclavado se produce normalmente una hidroacutelisis de sacarina la cual es de 10 aproximadamente este porcentaje aumenta considerablemente al agregar un 1 de carboacuten activado llegando a ser de 95
El desarrollo de las plaacutentulas de C walkeriana aumentan con una mayor concentracioacuten de carboacuten activado asiacute como tambieacuten un mayor tiempo de cultivo El resultado fue que la dosis ideal para el desarrollo de esta orquiacutedea es 2gL de carboacuten activado (TADEU DE FARIA et al 2002) 2422 Establecimiento de cultivos in vitro y micropropagacioacuten de Cattleya aurantiaca (Bateman ex Lindl) Por medio de siembra in vitro se logroacute el establecimiento de C aurantiaca con alto porcentaje de germinacioacuten y desarrollo de protocormos Para la oacuteptima formacioacuten de callo y para la proliferacioacuten de protocormos se determinaron los medios oacuteptimos (MS 10 mgL ANA 10 mgL BA) asiacute como tambieacuten de manera directa sobre explantes de hoja y pseudobulbos (MS 01 mgL ANA 01 mgL GA3)
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Con este uacuteltimo medio tambieacuten se logroacute una oacuteptima regeneracioacuten y desarrollo de plaacutentulas Los medios liacutequidos (sin agitacioacuten) son una buena opcioacuten para conseguir la produccioacuten masiva de protocormos ya que con ellos se optimizoacute la micropropagacioacuten de C aurantiaca Las plaacutentulas micropropagadas presentaron alto porcentaje de sobrevivencia y buen desarrollo despueacutes de su trasplante y aclimatacioacuten lo cual demuestra que es un buen sistema de propagacioacuten para C aurantiaca (GUTIERREZ y SALGADO 2007) En cuanto a transplante y aclimatacioacuten despueacutes de 45 diacuteas de desarrollo in vitro las plaacutentulas de un tamantildeo entre 3 y 5 cm con raiacuteces bien desarrolladas fueron llevadas a condiciones ex vitro eliminando los restos de medio de cultivo con agua potable y ocupando un sustrato de partes iguales de tezontle y corteza de encino cubierta con hojarasca de encino finamente molida Se mantuvieron cubiertas durante 15 diacuteas abriendo cada dos diacuteas hasta poder retirar la tapa en 30 diacuteas Despueacutes de dos meses de haber sido retiradas del cultivo in vitro las plaacutentulas presentaron 70 de sobrevivencia y alcanzaron una altura de hasta 7 cm presentando nuevas hojas y raiacuteces las plantas se muestran vigorosas y capaces de continuar su crecimiento en condiciones ambientales de invernadero (GUTIERREZ y SALGADO 2007)
2423 Establecimiento in vitro y regeneracioacuten de plantas de Laelia autumnalis (Llave y Lex) Lindl Para este estudio se obtuvieron las semillas de una caacutepsula desarrollada despueacutes de 6 meses de la floracioacuten las cuales se sembraron in vitro sin presentar contaminacioacuten ya que la siembra por este meacutetodo es muy eficiente en comparacioacuten al cultivo de semillas libres donde algunas veces se presenta la contaminacioacuten Las observaciones se realizaron cada 15 diacuteas la germinacioacuten se detectoacute en los primeros 15 diacuteas en la mayoriacutea de los medios de cultivos probados con la presencia de protocormos de 1mm de diaacutemetro (HUAPEO y SALGADO 2004) El porcentaje de germinacioacuten que se obtuvo de las semillas cultivadas in vitro de L autumnalis fue de 95 a 100 en todos los medios de cultivo la uacutenica diferencia fue el tiempo entre las germinaciones A excepcioacuten de las semillas cultivadas en el medio MS 100 la germinacioacuten del 100 se obtuvo hasta los 30 diacuteas de cultivo mientras que en el primero la germinacioacuten fue a los 15 diacuteas del cultivo Las plaacutentulas con raiacutez y un par de hojas se lograron a los 90 diacuteas de cultivo en el medio MS 100 alcanzando 07 mm de altura Estas plaacutentulas fueron subcultivadas en medio MS con 05 mgl de ANA y 01 mgl de GA3 para tener plaacutentulas fuente de explante (segmentos de hojas) un medio oacuteptimo de desarrollo de plaacutentulas de L speciosa No fue necesario probar otros medios de cultivos ya que se hicieron pruebas anteriores que demostraron que era el adecuado
Las plaacutentulas de 6 meses de cultivo in vitro despueacutes de su germinacioacuten presentaron una altura promedio de 5 cm con raiacuteces con velamen y hasta dos pares de hojas Segmentos de hoja de eacutestas fueron cultivadas en el medio MS conteniendo ANA BA y GA3 en diferentes concentraciones y se realizaron observaciones cada 30 diacuteas para determinar medios inductores de callo protocormos y raiacuteces La mejor respuesta en formacioacuten de callo fue observada en los segmentos de hoja de plaacutentulas de L autumnalis cultivados en MS con 1 mgl de ANA BA y GA3 iniciando la induccioacuten de
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eacuteste desde los 30 diacuteas de cultivo solamente en un 70 de los explantes cultivados El 100 se logroacute a los 90 diacuteas de cultivo observando callo abundante alrededor de todo el tejido de color blanco con puntos pigmentados de color verde La regeneracioacuten de protocormos de esta orquiacutedea se establecioacute con la siembra de segmentos de hoja de plaacutentulas de 6 meses de edad de manera directa o a partir de callos En callos la produccioacuten fue oacuteptima en el medio MS con 01 mgl de ANABAGA3 ya que a los 60 diacuteas se obtuvieron 50 protocormos por segmento de callo Solamente se produjeron 10 protocormos por explante al cultivarse los segmentos de hoja en MS con 01 mgl de ANABAGA3 a los 120 diacuteas de cultivo (HUAPEO y SALGADO 2004) 25 Aclimatacioacuten Aclimatacioacuten significa que el hombre intercede y guiacutea el proceso de acondicionamiento de las plantas hasta que eacutestas sean aptas para crecer en el campo yo invernadero
Un alto nuacutemero de plantas micropropagadas no sobreviven al cambio desde el cultivo in vitro hacia el ambiente exterior ya sea en campo o invernadero Eacutestos dos uacuteltimos tienen menor humedad relativa niveles maacutes altos de luminosidad y un ambiente seacuteptico los cuales son maacutes estresantes para las plantas micropropagadas La mayoriacutea de las especies que crecen in vitro necesitan un proceso de aclimatacioacuten pudiendo obtener asiacute un nuacutemero suficiente de plantas vivas y vigorosas para trasplantar al suelo (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991)
La aclimatacioacuten no es uacutenicamente para micropropagacioacuten siendo usada ademaacutes en propagacioacuten convencional durante antildeos Despueacutes de cortar las hojas y de haber formado raiacuteces por lo general son aclimatadas antes de ser llevadas al campo o invernadero Ejemplos de dos teacutecnicas comunes son bajar gradualmente la humedad y mantener el nivel de luz con un 50 de sombra antes de trasladarlos al campo Las raiacuteces que han sido cortadas y mal limpiadas muchas veces son focos de infeccioacuten En estos casos las plantas muestran signos de marchitez hojas necrosadas y tambieacuten se puede llegar a la muerte de eacutestas El cultivo in vitro reduce la necesidad de fotosiacutentesis ya que las condiciones de la caacutemara de incubacioacuten proveen a la planta de sacarosa u otro azuacutecar Tambieacuten en estas condiciones se reduce el stress por patoacutegenos al ser un ambiente aseacuteptico Todo esto se traduce en que las plantas micropropagadas no son aptas para el campo yo invernadero (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 251 Stress hiacutedrico El stress hiacutedrico puede ser el resultado de una excesiva transpiracioacuten de las diferentes partes aeacutereas de las plantas especialmente de las hojas o por una inadecuada absorcioacuten de agua por parte de las raiacuteces La cutiacutecula y los estomas son la ruta primaria de peacuterdida de agua desde de las hojas provenientes de esta teacutecnica reproductiva 2511 Cutiacutecula La cutiacutecula es una membrana compuesta por una matriz de cutina que a su vez se encuentra cubierta en su superficie por ceras cuya funcioacuten primaria consiste en limitar la peacuterdida de agua por transpiracioacuten La permeabilidad del agua a traveacutes de la cutiacutecula se ve influenciada principalmente por la estructura y la cantidad de
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ceras cuticulares y epicuticulares no vieacutendose afectada la peacuterdida de agua por el grosor de eacutesta o la naturaleza quiacutemica de la matriz de la cutina La estructura cristalina de la parte encerada de las hojas es distinta en las plantas micropropagadas con respecto a las plantas que crecen en el campo La cera epicuticular de las hojas de plantas in vitro tienen una proporcioacuten maacutes alta de esteres y de componentes polares por el contrario tienen unas cadenas de hidrocarbonos mucho maacutes cortas Esto hace que las plantas in vitro pierdan maacutes agua que las cultivadas en campo o invernadero
Las plantas que han crecido en el campo son naturalmente de color verde pero el color de las plantas cultivadas in vitro es diferente y se puede ver a simple vista Las plantas que son pasadas a invernadero y que tengan un color verde se aclimatan de mejor forma al ambiente exterior (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 2512 Estomas La estructura estomaacutetica y su funcionamiento han sido implicados recurrentemente en el desbalance de agua exhibido por plantas micropropagadas al momento de ser removidas del cultivo in vitro Estudios con microscopiacutea de scanner electroacutenico han indicado que la estructura estomaacutetica presente en algunas especies de plantas cultivadas in vitro difieren marcadamente de las cultivadas en invernadero o en el suelo Debido a que las primeras presentan estomas de mayor tamantildeo y maacutes redondos a diferencia de las plantas cultivadas de manera normal que presentan estomas maacutes pequentildeos y eliacutepticos lo que resulta en una deshidratacioacuten maacutes raacutepida en el caso de las provenientes de cultivo in vitro (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 252 Humedad Debido a la anatomiacutea y la condicioacuten fisioloacutegica de las plantas desarrolladas in vitro donde se ha mantenido una alta humedad relativa es necesario regar al momento del traslado para obtener una alta sobrevivencia Muchos laboratorios aseguran que hay que evitar tener un sistema de aspersioacuten ya que se produce el ambiente necesario (muy huacutemedo) para la aparicioacuten de hongos algas o bacterias Otros meacutetodos incluyen el uso de humidificadores o poner las macetas en un lugar cerrado donde se retenga vapor para esto se pueden usar por ejemplo tapas de polietileno Este meacutetodo es relativamente econoacutemico pero se debe tener control del calor y monitorear la falta de agua (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 253 Luz Durante la etapa in vitro las plantas estaacuten expuestas a altos niveles de luminosidad lo que se traduce en hojas delgadas Antes del traslado se recomienda mantener las plantas con un 50 de sombra para asiacute poder aclimatarlas de mejor manera esto debido a que las plantas micropropagadas tienen un bajo control sobre la transpiracioacuten y un inadecuado mecanismo de fotosiacutentesis La sombra reduce la transpiracioacuten evitando excesivas peacuterdidas de agua asiacute como tambieacuten el exceso de luz destruye las moleacuteculas de clorofila Luego del periacuteodo bajo sombra se deben mover las macetas gradualmente hacia el nivel de luz al cual seraacute llevado para su crecimiento final (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 254 Temperatura La temperatura del aire y del medio o sustrato de crecimiento estaacute generalmente controlado durante el periacuteodo de aclimatacioacuten El calor es necesario en los meses de invierno y el friacuteo (enfriar) es esencial en los meses de verano Ajustando la cantidad de sombra y humedad se obtiene un control sobre la temperatura El
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enfriamiento se puede obtener gracias a ventilacioacuten abanicos niebla o aire acondicionado El calor puede provenir del sistema existente en el edificio o invernadero donde esteacuten ubicadas las macetas o por las laacutemparas ocupadas para el control del fotoperiacuteodo El rango de temperatura que se mantiene por lo general es entre los 13 y 30ordmC y esta determinado principalmente por la especie en cuestioacuten La temperatura de la zona donde se encuentran las raiacuteces es muy importante para el crecimiento lo ideal es que dicho sector tenga una mayor temperatura que el aire fomentando el crecimiento de las raiacuteces e incrementando la humedad alrededor de la planta Durante el verano esto es difiacutecil de obtener ya que la temperatura del aire es muy alta debido a la alta radiacioacuten solar Terminado el proceso de aclimatacioacuten esto ya no es necesario (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 255 Fotosiacutentesis Las plantas sufren un cambio radical cuando son removidas desde cultivo in vitro ya que son forzadas a cambiar de heterotroacuteficas a autotroacuteficas y la fotosiacutentesis se vuelve fundamental para la sobrevivencia Las hojas de las plantas in vitro no estaacuten formadas para hacer fotosiacutentesis ya que en la caacutemara de incubacioacuten no se produce un fuerte intercambio gaseoso esto debido a que la sacarosa es entregada a traveacutes del medio de cultivo Las hojas de las plantas que son trasladadas al campo o invernadero sufren deterioro debido a que no estaacuten formadas para la fijacioacuten de carbono Esto se produce por un tiempo aproximado de cuatro semanas despueacutes de las cuales las hojas nuevas suplen a las viejas Otro punto es que las hojas de las plantas cultivadas in vitro contienen menor proporcioacuten de clorofila que las plantas que han crecido normalmente en el campo En un estudio de coliflor cultivado in vitro se midioacute el CO2 y se obtuvo un balance negativo el cual se mantuvo durante dos semanas despueacutes del transplante Algo similar ocurrioacute con frutilla despueacutes del transplante las hojas se deterioraron raacutepidamente lo que quiere decir que no hubo incremento en la fijacioacuten de carbono indicando falta de desarrollo en la competencia fotosinteacutetica
El bajo nivel de CO2 durante el cultivo in vitro limita el proceso de fotosiacutentesis lo cual se puede compensar usando sacarosa en el medio de cultivo Tambieacuten se puede incrementar el nivel de luz y CO2 obteniendo un fuerte aumento en el crecimiento de varias especies como orquiacutedeas clavel etc (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 256 Sustrato Un sustrato es todo material soacutelido distinto del suelo natural mineral u orgaacutenico que colocado en un contenedor en forma pura o en mezcla permite el anclaje del sistema radicular de la planta desempentildeando por lo tanto un papel de soporte para la planta El sustrato puede intervenir o no en el complejo proceso de la nutricioacuten mineral de la planta (INFOAGRO 2007) El sustrato y los contenedores dentro de los cuales se van a transplantar las plaacutentulas in vitro son importantes para una buena sobrevivencia
Los sustratos ejercen una influencia significativa en la arquitectura del sistema radical de las plantas y en las asociaciones bioloacutegicas de este con el suelo influenciando el
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estado nutricional y la translocacioacuten de agua en el sistema suelo-planta-atmoacutesfera Uno de los requisitos fundamentales que debe cumplir el sustrato para su utilizacioacuten es la sanidad Cuando estos no se elaboran almacenan o manejan correctamente pueden contaminarse y provocar serios dantildeos a las plantas durante la aclimatacioacuten por esta razoacuten son preferidos como componentes para su elaboracioacuten materiales inertes o aquellos en las cuales el proceso de obtencioacuten garantice la mayor desinfeccioacuten posible
Uno de los factores de mayor importancia a la hora de seleccionar los materiales que pueden constituir el sustrato es su disponibilidad tanto en teacuterminos de facilidad de obtencioacuten o suministro como de su costo (VILCHEZ et al 2007)
La presencia de inhibidores o tambieacuten cambios en el pH del sustrato pueden afectar el crecimiento de las raiacuteces y consecuentemente el eacutexito del transplante
Muchos laboratorios y viveros transplantan a un sustrato uniforme debiendo ser eacuteste adecuado en cuanto a soporte de las plantas pH porosidad aireacioacuten y drenaje (DEBERGH y ZIMMERMAN 1991)
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3 MATERIAL Y MEacuteTODO
Para la realizacioacuten de este trabajo se utilizoacute el siguiente material y meacutetodo
31 Material La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio e invernadero de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal pertenecientes a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de Chile
311 Material vegetal Se utilizaron plaacutentulas de C virescens cultivadas in vitro a partir de semillas las cuales fueron proporcionadas por el laboratorio estas plaacutentulas fueron separadas y repicadas para aumentar la poblacioacuten y obtener la cantidad necesaria para el ensayo
FIGURA 2 Plaacutentulas de C virescens en caacutemara de crecimiento in vitro
312 Materiales Los materiales que se utilizaron fueron los siguientes Equipos autoclave caacutemara de flujo laminar dispensador de medios medidor
de pH agitador magneacutetico horno microondas balanza mechero termoacutemetro Materiales vasos de precipitado matraces probetas pipetas papel de
aluminio frascos de vidrio placas Petri pinzas bisturiacute macetas regadera Soluciones soluciones madre (Medio MS) gelificante etanol 70 y 95
32 Meacutetodo A continuacioacuten se da a conocer la metodologiacutea con la cual se trabajoacute 321 Preparacioacuten del medio de cultivo Para la obtencioacuten de plantas a traveacutes de la micropropagacioacuten se ocupoacute el medio basal de MURASHIGE y SKOOG (1962) tambieacuten llamado medio MS Este medio tiene un pH de entre 56-57 Posteriormente se dosificoacute con el dispensador de medios para que cada frasco tenga una cantidad adecuada (25 mL) y se llevoacute a autoclave para esterilizar a 12 atm 120ordm C por 20 min
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322 Obtencioacuten del material vegetal Al tener el medio esterilizado se procedioacute a la separacioacuten y repicado de plaacutentulas existentes en el laboratorio Las siembras se realizaron en el mes de mayo del 2007 Estas siembras se realizaron en la caacutemara de flujo laminar de modo de asegurar que la siembra sea 100 aseacuteptica Estas plaacutentulas fueron mantenidas en la caacutemara de incubacioacuten hasta obtener los tamantildeos requeridos para el ensayo donde las condiciones fueron las siguientes
minus Temperatura ambiental de 23-25ordm C minus Fotoperiacuteodo de 16 horas minus Intensidad lumiacutenica controlada de 50-55 micromol m-2s-1
323 Sustratos Se utilizaron tres tipos de sustratos el primero corresponde a una mezcla de turba + perlita (11) el segundo corresponde a Sphagnum (100) y el tercero corresponde a una mezcla de turba + arena (11) Una vez realizadas las mezclas se procedioacute a una esterilizacioacuten en un autoclave a 121ordm C por 20 minutos a 12 atmoacutesfera De esta forma se trabajoacute con material limpio y sano evitando ataque de hongos o bacterias El anaacutelisis quiacutemico de los sustratos se muestra en el Anexo 2 324 Plantacioacuten Las plaacutentulas con un promedio de cuatro meses en condiciones de caacutemara de crecimiento in vitro obtuvieron el tamantildeo adecuado para ser utilizadas Se sacaron de los frascos y se plantaron en las macetas de plaacutestico transparente con los sustratos Posteriormente fueron dejadas en la sala del laboratorio donde se debioacute asperjar con solucioacuten nutritiva Hoagland y fungicida Captan CUADRO 1 Composicioacuten de solucioacuten nutritiva Hoagland
KNO3 102 gL Ca(NO3) 4 H2 O 0492 gL
NH4H2 (PO4) 023 gL MgSO4 7 H2O 049 gL
H3BO3 286 mgL MnCl2 2 H2O 181 mgL CuSO4 5 H2O 008 mgL ZnSO4 5 H2O 022 mgL Na2MoO4 H2O 009 mgL
FeSO4 7 H2O 05 06 mL FUENTE FINCK 1988 325 Disentildeo de los ensayos Este trabajo de investigacioacuten constoacute de un ensayo con dos etapas Antes que todo se realizoacute la separacioacuten y repicado in vitro de plaacutentulas de C virescens para la obtencioacuten del nuacutemero necesario de plantas En la etapa 1 se utilizaron tres tamantildeos de plaacutentulas obtenidas in vitro de 1-2cm de 2-3cm y de maacutes de 3cm de altura que se transplantaron a tres sustratos turba + perlita 11(vv) Sphagnum (100) y turba + arena 11 (vv) La turba provino de la Sociedad
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Minera Patagonia Peat SA en Hijuelas el Sphagnum de la empresa Lonquen Chile de Puerto Montt y la perlita se obtuvo a traveacutes del sitio web wwwjardisencl (representante legal Walter Rathgeb Penza Ingeniero Agroacutenomo Santiago) Las plaacutentulas se plantaron de acuerdo a su tamantildeo las de maacutes de 3cm se colocaron de 6 por maceta las de 2 a 3cm de a 8 por maceta y las maacutes chicas de a 10 por maceta Estas macetas fueron dejadas en una sala de aclimatacioacuten con una temperatura promedio de 20ordm C intensidad lumiacutenica de 50-55 micromol m-2s-1 y 14-16 hrs de fotoperiacuteodo Se fertilizoacute asperjando cada cinco diacuteas con solucioacuten nutritiva Hoagland Esta etapa se llevoacute a cabo durante dos meses desde el cinco de septiembre hasta el cinco de noviembre de 2007
En la etapa 2 se continuoacute el proceso de aclimatacioacuten en invernadero de las plaacutentulas obtenidas en la etapa 1 que despueacutes de dos meses teniacutean un mayor tamantildeo y se habiacutean acondicionado al ambiente exterior (fuera de la caacutemara de crecimiento) Las plantas se mantuvieron en las macetas durante tres semanas para aclimatarlas y luego las plantas sobrevivientes fueron transplantadas a macetas maacutes grandes individuales durante tres meses aproximadamente hasta el cinco de marzo 2008 Estas nuevas macetas tuvieron como sustrato turba y suelo (trumao) en igual proporcioacuten (Anexo 2) La temperatura promedio de invernadero fluctuoacute de 13 a 35 degC seguacuten el mes En enero el promedio fue de 25 (Anexo 3) Para bajar la temperatura alrededor de 5deg C se instaloacute una malla Rachel 326 Disentildeo experimental El disentildeo experimental utilizado fue completamente al azar ordenado como experimento factorial con dos factores tamantildeo (3) y sustrato (3) Cada tratamiento tuvo tres repeticiones con un miacutenimo de 6 plantas por recipiente 327 Variables a evaluar Durante los dos meses en que las macetas estuvieron en la sala de aclimatacioacuten se evaluoacute el desarrollo foliar contando el nuacutemero de hojas una vez al mes Posteriormente se trasladaron las mismas macetas a invernadero durante tres semanas para continuar con la aclimatacioacuten de las plaacutentulas Transcurrido este tiempo se transplantaron las plaacutentulas sobrevivientes a macetas individuales y continuoacute mensualmente la evaluacioacuten de eacutestas (nuacutemero de hojas) hasta la obtencioacuten de plantas establecidas Al momento del transplante y al final del ensayo se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces asiacute como tambieacuten al final del ensayo de evaluoacute el crecimiento en altura (cm) La sobrevivencia fue evaluada al final del ensayo por maceta
Tanto en la sala de aclimatacioacuten coacutemo en el invernadero se registroacute la temperatura con la ayuda de un termoacutemetro de maacutexima y miacutenima (Anexo 3) 328 Anaacutelisis estadiacutestico Una vez obtenidos los datos se procedioacute a comprobar si estos cumpliacutean con los supuestos de aleatoriedad normalidad y homogeneidad de varianzas que exige este tipo de anaacutelisis En el caso de no cumplirse estos supuestos los datos se transformaron utilizando log10(x+05) raiacutez(x+05) o 1x para normalizarlos
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y enseguida se sometioacute los datos a un anaacutelisis estadiacutestico (ANDEVA) Posteriormente en los casos en que se observoacute diferencias significativas en el ANDEVA se aplicoacute una prueba de rangos muacuteltiples (Tukey) al 5 de significancia Para las variables no parameacutetricas que no cumplieron con los supuestos para un anaacutelisis de varianza se realizoacute la prueba de KruskalndashWallis y las comparaciones muacuteltiples a traveacutes del test de Dunn con un nivel de 5 de significancia
Se utilizaron los programas estadiacutesticos STATGRAPHICS 20 y GRAPHPAD PRISM 5 para el anaacutelisis de datos
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4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
En los siguientes puntos se discuten los resultados obtenidos en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens
En la Figura 3 se observan plaacutentulas de C virescens micropropagadas en medio MS en caacutemara de crecimiento al inicio del ensayo (A) y en invernadero despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten (B)
BA
FIGURA 3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten
A continuacioacuten se presentan los resultados obtenidos para las variables analizadas (Cuadro 2 y 3) de esta manera se pueden visualizar en general los resultados obtenidos en el proceso de aclimatacioacuten durante seis meses
CUADRO 2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de raiacuteces
inicial y final Variables
Hojas finales (nuacutemero)
Raiacuteces iniciales (nuacutemero)
Raiacuteces finales (nuacutemero)
Tamantildeo de plaacutentulas 36 24 37 47 29 46
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 61 43 76
Sustratos 53 36 56 43 29 51
Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 46 27 49
Significa que hay diferencias significativas al 95 Test de Dunn
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Las variables no parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en hojas finales y raiacuteces iniciales en sus rangos de distribucioacuten Las raiacuteces finales no presentaron diferencias seguacuten el sustrato utilizado pero de acuerdo al tamantildeo hubo diferencias en su distribucioacuten
CUADRO 3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas
Variables Altura final de plaacutentulas
(cm) Sobrevivencia
Tamantildeo de plaacutentulas
36 c 567 b 47 b 821 a
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 59 a 908 a
Sustratos 52 a 933 a
41 ab 59 b Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 49 b 772 a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY Las variables parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en altura final de hojas y en sobrevivencia 41 Nuacutemero de hojas finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentulas y de sustratos para la variable nuacutemero final de hojas 411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula Seguacuten el Cuadro 2 y Figura 4 las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero final de hojas Las plaacutentulas pequentildeas de 1-2 cm obtuvieron el nuacutemero maacutes bajo de hojas finales con una media de 36 hojas por plaacutentula lo cual es la mitad de las hojas finales que se obtuvo con las plaacutentulas de mayor tamantildeo (61 hojas aproximado por plaacutentula) Para las plaacutentulas medianas de 2-3 cm se obtuvo una media de 47 hojas por plaacutentula (Figura 4)
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Hojas finales
1-2 cm 2-3cm maacutes de 3 cm0
5
10
15
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn)
BLANCO (2006) sentildeala que plaacutentulas cultivadas in vitro crecen bajo condiciones especiales como alta humedad relativa y baja luminosidad ademaacutes son suplidas con sacarosa Estas condiciones fueron proporcionadas en una caacutemara de crecimiento en el laboratorio donde las plantas micropropagadas no son dependientes por completo de su fotosiacutentesis son heteroacutetrofas Parece ser necesario un estiacutemulo para convertirse en organismos totalmente capaces de sustentar sus propios requisitos de carbono y nitroacutegeno reducido pasando de esta manera a ser autoacutetrofos
Al ser sacadas de un medio in vitro las hojas no estaacuten preparadas para producir su propio alimento y sobreviven gracias a que el medio de cultivo le proporciona los nutrientes necesarios para vivir En este punto muchas de las hojas mueren y nacen hojas nuevas capaces de generar su alimento supliendo asiacute las hojas viejas (SEELYE et al 2003) En este ensayo las plaacutentulas de Chloraea virescens presentaron en general una buena adaptacioacuten al ser sacadas de un medio in vitro
Se observoacute que plaacutentulas con menor tamantildeo al ser aclimatadas y tener menor tejido fue maacutes difiacutecil y maacutes lento que empezaran a generar nuevos tejidos y materia orgaacutenica a partir de dioacutexido de carbono POSPIacuteŠILOVAacute et al (1999) sentildeala que al tener los estomas con desarrollo incompleto maacutes grandes y de forma maacutes redonda pierden maacutes agua lo cual puede provocar una peacuterdida de hojas muriendo asiacute la plaacutentula Por esta razoacuten las plaacutentulas pequentildeas se demoran maacutes tiempo en generar hojas nuevas es por ello que al finalizar este estudio muestran el menor nuacutemero final de hojas 412 Efecto del tipo de sustrato Al analizar la influencia del tipo de sustrato se encontraron diferencias significativas entre los tres sustratos utilizados Seguacuten el Cuadro 2 y la Figura 5 el sustrato donde se obtuvo mejores resultados fue
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turba+perlita en el cual se observoacute un promedio de 53 hojas por plaacutentula siendo Sphagnum el maacutes bajo con 43 hojas por plaacutentula De acuerdo a los resultados del anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados el sustrato turba+perlita tiene mayor cantidad de nitroacutegeno foacutesforo calcio magnesio y azufre disponible comparativamente con los otros dos sustratos (Sphagnum y arena+turba) (Anexo 2)
Hojas finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
Sustratos
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) Para la brotacioacuten y el crecimiento de las plantas se necesita agua y Nitroacutegeno lo que favorece a una mayor tasa de aparicioacuten de hojas lo que se traduce en una mayor cantidad de hojas finales El Nitroacutegeno se encuentra en mayor cantidad en el sustrato turba+perlita debido a lo cual los mejores resultados se obtienen en dicho sustrato 413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Despueacutes de analizados los efectos individuales del tamantildeo y del sustrato al interactuar ambos factores existen diferencias significativas La mejor interaccioacuten se obtuvo con el sustrato turba+perlita y con el mayor tamantildeo de la plaacutentula (Figura 6) Debido a la buena estructura (porosa) de dicho sustrato se podriacutea decir que se favorecioacute la absorcioacuten radicular de nutrientes obteniendo por ello un mayor nuacutemero de hojas finales Para los menores tamantildeos no se observan diferencias significativas obteniendo como promedio 41 hojas por plaacutentula Para el mayor tamantildeo el promedio fue de 6 hojas por plaacutentula
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Hojas finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
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Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 42 Raiacuteces iniciales Este paraacutemetro se evaluoacute luego de la primera etapa de aclimatacioacuten la cual se realizoacute en una sala de aclimatacioacuten del laboratorio Se analizoacute la influencia de diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos sobre la variable nuacutemero raiacuteces iniciales (Anaacutelisis de Kruskal-Wallis en Anexo 7)
FIGURA 7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses de pre aclimatacioacuten
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En la Figura 7 se puede observar los resultados de pre aclimatacioacuten en sala de laboratorio En esta etapa ya es posible ver la presencia de raiacuteces desarrolladas 421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula En el Cuadro 2 se puede observar que las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero inicial de raiacuteces y en la Figura 8 se puede comprobar que para los dos tamantildeos de plaacutentula maacutes pequentildeos no se observa gran cantidad de raiacuteces esto no impidioacute el desarrollo posterior de las plaacutentulas las cuales lograron enraizar al final del estudio Esto se contrapone a lo observado en un estudio de Lapageria rosea donde la presencia de raiacutez y brote para lograr una multiplicacioacuten exitosa de plantas es de vital importancia Incluso algunas plaacutentulas de L rosea no brotan en condiciones in vitro en donde tienen las mejores condiciones nutricionales y hormonales para hacerlo Esto se debe a factores internos de la plaacutentula siendo muy difiacutecil que broten inmediatamente en caacutemara de aclimatacioacuten donde ya dejan de recibir los nutrientes necesarios de manera directa y requieren de balances de energiacutea para poder seguir elongando raiacuteces absorber nutrientes y brotar para poder obtener los carbohidratos necesarios para seguir su crecimiento (BLANCO 2006) El tamantildeo de plaacutentula tiene importancia para el desarrollo de raiacuteces se distingue notoriamente que en los tamantildeos maacutes grandes el nuacutemero de raiacuteces es mayor comparativamente con los tamantildeos pequentildeos donde el nuacutemero de raiacuteces fue escaso Debido a la presencia de maacutes hojas existe una mayor cantidad de aacuterea fotosinteacutetica esta situacioacuten estimula el crecimiento de las raiacuteces para la obtencioacuten de agua y nutrientes
Raices iniciales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
2
4
6
8
10
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o inicial de ra
iacuteces
FIGURA 8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn)
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422 Efecto del tipo de sustrato Para el sustrato turba+perlita se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas en el nuacutemero de raiacuteces con respecto a los dos otros sustratos esto se puede ver en el Figura 9 donde se observa que se obtuvieron los mayores resultados En cualquier medio de crecimiento el espacio no ocupado por un soacutelido se llama porosidad este espacio puede ser ocupado en parte para retener agua y en parte para proporcionarle aire a las raiacuteces La ausencia de uno de estos elementos es perjudicial para las plantas La turba es conocida por tener estas propiedades y la perlita tambieacuten por esta razoacuten se sabe que la mezcla turba-perlita provee propiedades fiacutesicas excelentes como medio de crecimiento y propagacioacuten (INFOAGRO 2007) Estos resultados con turba-perlita (298 de materia orgaacutenica) coinciden con los obtenidos por DIAZ et al (2004) quienes al utilizar un sustrato compuesto por 100 de humus de lombriz para aclimatar cantildea de azuacutecar obtuvieron el mayor nuacutemero de raiacuteces Esto puede atribuirse al importante aporte de materia orgaacutenica del humus (47) lo que le confiere una mejor estructura obtenieacutendose una excelente porosidad del sustrato La aireacioacuten del suelo es necesaria para favorecer la maacutexima absorcioacuten de nutrientes por las raiacuteces Esto tambieacuten sucede en el sustrato turba+perlita el cual posee la mayor cantidad de materia orgaacutenica de los tres sustratos utilizados
Raices iniciales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
2
4
6
8
10
Sustratos
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato En los anaacutelisis para la variable nuacutemero de raiacuteces se puede decir que la mejor interaccioacuten se presentoacute para el sustrato de turba+perlita junto con el mayor tamantildeo de plaacutentulas obteniendo los valores maacutes altos entre los nueve tratamientos La presencia de raiacuteces luego de la micropropagacioacuten aumenta la posibilidad de eacutexito en el transplante ya que se crea un favorable balance de agua Pero esto no quiere
31
decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
10
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
32
En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
33
El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
34
Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
IV
INDICE DE CUADROS
Cuadro Paacutegina
1 Composicioacuten de solucioacuten nutritiva Hoagland 21
2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de
raiacuteces inicial y final 24
3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas 25
V
INDICE DE FIGURAS
Figura Paacutegina
1 C virescens 7
2 Plaacutentulas de C virescens en caacutemara de crecimiento in vitro 20
3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS
B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten 24
4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) 26
5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final
de hojas (Test de Dunn) 27
6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 28
7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses
de pre aclimatacioacuten 28
8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 29
9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final
de raiacuteces (Test de Dunn) 30
10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no
parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 31
11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses
de aclimatacioacuten 31
12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 32
13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final
de raiacuteces (Test de Dunn) 33
14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre para la variable no
parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 34
15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) 35
VI
16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable
parameacutetrica altura final de plaacutentulas 35
17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) 37
18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la
variable parameacutetrica de sobrevivencia 37
VII
INDICE DE ANEXOS
Anexo Paacutegina
1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962)
y suplementos orgaacutenicos 44
2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio 45
3 Registro de temperaturas miacutenimas maacutexima y promedio durante
el estudio 46
4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas
finales 47
5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales 47
6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces
iniciales 48
7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces
iniciales 48
8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces
finales 49
9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales 49
10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en
aclimatacioacuten 50
11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura 50
12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de
plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten 51
13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia 51
14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea 52
1
RESUMEN Dentro del esquema de micropropagacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens la aclimatacioacuten es la etapa final donde la manipulacioacuten debe ser muy cuidadosa ya que es donde se produce el mayor iacutendice de mortandad principalmente en el proceso de trasplante Esta etapa es muy importante ya que gracias a ella se veraacute la eficiencia del proceso y la calidad final de las plantas producidas in vitro por eso el objetivo general de este trabajo es evaluar la influencia del tamantildeo de plaacutentulas y utilizacioacuten de distintos sustratos en la aclimatacioacuten ex vitro de plaacutentulas de C virescens Se utilizaron plaacutentulas de Chloraea virescens obtenidas a partir de la micropropagacioacuten de protocormos provenientes de germinacioacuten asimbioacuteticas de semillas efectuada en el laboratorio de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal de la Universidad Austral de Chile Las plaacutentulas fueron repicadas hasta obtener el nuacutemero adecuado para el ensayo Luego fueron trasladadas a una sala del laboratorio en macetas de seis ocho y diez plaacutentulas dependiendo del tamantildeo de la plaacutentula (maacutes de 3cm 2-3cm y 1-2cm respectivamente) por dos meses posteriormente fueron transferidas a 3 sustratos turba+perlita (11) Sphagnum y turba+arena (11) y fueron llevadas a invernadero durante cuatro meses Las variables evaluadas fueron nuacutemero final de hojas nuacutemero inicial y final de raiacuteces altura y sobrevivencia de las plaacutentulas Los resultados obtenidos demostraron que los tamantildeos y los sustratos ocupados influyen en el crecimiento de las plaacutentulas El mejor tamantildeo para la aclimatacioacuten es de maacutes de 3cm obteniendo con eacuteste los mejores resultados en todas las variables evaluadas Lo mismo ocurrioacute con el sustrato turba+perlita el cual fue el mejor evaluado
2
REacuteSUMEacute Dans le scheacutema de la micropropagation de Chloraea virescens lacclimatation est la derniegravere eacutetape ougrave il faut ecirctre prudent parce que cest agrave ce moment lagrave que les taux de mortaliteacute sont les plus eacuteleveacutes principalement dans le processus de transplantation Cette eacutetape est tregraves importante parce que ce sera gracircce agrave elle quacuteon verra lefficaciteacute du processus et la qualiteacute finale des plantes produites in vitro Lobjectif geacuteneacuteral de cette eacutetude est dacuteeacutevaluer linfluence de la taille des plantes et lutilisation de divers substrats pour lacuteacclimatation de C virescens On a utiliseacute des plantes de C virescens obtenue a partir de la micropropagation de protocormos en provenance du laboratoire de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal de la Universidad Austral de Chile Les plantes ont eacuteteacute subdiviseacutee pour obtenir le nombre approprieacute Elles ont ensuite eacuteteacute transfeacutereacutees agrave des pots dans une piegravece du laboratoire de six huit et dix en fonction de la taille de la plante (plus de 3 cm de 2-3 cm et 1-2 cm respectivement) pour deux mois ensuite elles ont eacuteteacute transfeacutereacutee dans trois substrats tourbe + perlite (11) Sphagnum et tourbe + sable (11) et elles ont eacuteteacute mises dans une serre pour quatre mois Les variables agrave eacutevaluer sont nombre final de feuilles nombre de racines au deacutebut et agrave la fin la hauteur et la survie des plantes Les reacutesultats ont montreacute que la taille et les substrats utiliseacutes ont une influence sur la croissance des jeunes plantes La taille ideacuteale pour lacclimatation est plus de 3cm avec cette derniegravere on a obtenu les meilleurs reacutesultats dans toutes les variables qui ont eacuteteacute eacutevalueacutees Le mecircme reacutesultat sest produit avec le substrat de tourbe + perlite lequel a aussi montreacute les meilleurs reacutesultats
3
1 INTRODUCCION La familia Orchidaceae (Orquiacutedeas) es la que mayor nuacutemero de especies comprende en el Reino Vegetal Se estima que debe haber alrededor de 35000 especies de Orquiacutedeas en todo el mundo pertenecientes a unos 750 geacuteneros ademaacutes de miles de hiacutebridos En Chile esta familia es probablemente el grupo menos estudiado de plantas con flores y soacutelo se han realizado estudios en base a su taxonomiacutea biologiacutea reproductiva fenologiacutea y distribucioacuten
La produccioacuten de flores de orquiacutedeas ha tomado importancia por la belleza de sus flores dada la enorme variedad de formas colores y perfumes Existen orquiacutedeas terrestres y epiacutefitas estas uacuteltimas representan maacutes del 90 del total de especies y son las que mayoritariamente se encuentran a la venta Las flores tienen un alto valor ornamental o como flor cortada ya que eacutestas pueden permanecer separadas de las plantas sin marchitarse hasta tres o cuatro semanas y en la planta permanecen hasta tres meses
La obtencioacuten de plantas de orquiacutedeas a partir de semillas es muy difiacutecil ya que eacutestas son diminutas y de germinacioacuten irregular Como una alternativa de obtencioacuten de plantas aparece la micropropagacioacuten pudiendo asiacute aumentar el nuacutemero de plantas en forma relativamente faacutecil y raacutepida Luego de la etapa de micropropagacioacuten viene la etapa de aclimatacioacuten en la cual la manipulacioacuten debe ser en extremo cuidadosa ya que es donde se produce el mayor iacutendice de mortandad principalmente en el proceso de transplante Esta etapa es muy importante ya que gracias a ella se veraacute la eficiencia del proceso y la calidad final de las plantas producidas in vitro Considerando la produccioacuten de plaacutentulas mediante la micropropagacioacuten en este trabajo se plantea la hipoacutetesis que ldquoel tamantildeo de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro y los distintos sustratos son factores que inciden en el desarrollo y su aclimatacioacutenrdquo El objetivo general de este trabajo es
Evaluar la influencia del tamantildeo de plaacutentulas y utilizacioacuten de distintos sustratos en la aclimatacioacuten ex vitro de plaacutentulas de C virescens
Los objetivos especiacuteficos son
Medir el efecto del tamantildeo de plaacutentulas de C virescens en la sobrevivencia y desarrollo de eacutestas ex vitro
Comparar el uso de tres sustratos en el desarrollo y sobrevivencia de plaacutentulas de C virescens
4
2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA 21 Descripcioacuten general 211 Descripcioacuten geograacutefica Las orquiacutedeas pertenecen a la familia Orchidaceae clase Liliopsida (monocotiledoacuteneas) Son plantas herbaacuteceas perennes originarias de regiones tropicales y subtropicales pero existen tambieacuten en todos los continentes a excepcioacuten de las regiones polares La zona donde se encuentran estas plantas estaacute comprendida entre los 68ordm latitud norte y 56ordm latitud sur Es evidente que en los liacutemites extremos de estas latitudes se encuentran pocos geacuteneros y especies esto va en aumento desde las regiones temperadas hasta las regiones intertropicales donde el nuacutemero es el mayor Los territorios maacutes interesantes por su nuacutemero son
Ameacuterica del Sur y Ameacuterica Central Asia e India Madagascar Australia es el continente menos poblado en orquiacutedeas dentro de las regiones
del globo Por su parte Europa presenta numerosos geacuteneros y especies de orquiacutedeas
terrestres Soacutelo en Francia existen 75 especies repartidas en 16 geacuteneros todas terrestres (LECOUFLE y ROSE 1956)
212 Formas de vida Las zonas donde crecen estas plantas influyen sobre su manera de vivir Algunas orquiacutedeas son terrestres y se encuentran representadas en todas las regiones Tambieacuten existen las epiacutefitas (vegetal que fijado a otro no obtiene de eacuteste su alimento) En este caso se necesita que el grado higromeacutetrico y la temperatura permitan este tipo de adaptacioacuten Ademaacutes existen las orquiacutedeas litofiacuteticas que viven sobre rocas Las raiacuteces de las epiacutefitas y litofiacuteticas estaacuten adaptadas a vivir expuestas al aire o inmersas en materia orgaacutenica ya que tienen un tejido acumulador de agua llamado velo En zonas friacuteas y templado friacuteas todas las orquiacutedeas son terrestres En zonas subtropicales o tropicales la gran mayoriacutea es epiacutefita Otra particularidad debida seguramente a la influencia de estas zonas es la floracioacuten Es en las zonas tropicales y subtropicales que se dan los mayores tamantildeos de flores asiacute como tambieacuten la mayor variedad de colores (LECOUFLE y ROSE 1956)
213 Descripcioacuten morfoloacutegica Las orquiacutedeas se caracterizan por poseer flores muy vistosas hermafroditas (ambos sexos en la misma flor) zigomorfas (con un solo plano de simetriacutea) triacutemeras (tres seacutepalos y tres peacutetalos) y una columna central que sustenta las estructuras reproductivas masculinas anteras y femeninas pistilo llamada ginostemo El peacutetalo inferior se llama labelo y su morfologiacutea define a los distintos geacuteneros de orquiacutedeas Las flores pueden ser aisladas o en inflorescencia y son polinizadas por insectos El polen se encuentra aglomerado formando una masa llamada polinio el que tiene un extremo con un ensanchamiento glandular pegajoso que sirve para que el
5
polinio se adhiera al cuerpo del insecto polinizador El fruto es una caacutepsula seca con muchas semillas pequentildeas sin endosperma y con embrioacuten no diferenciado Tienen dos tipos baacutesicos de crecimiento Simpodial en las que el nuevo crecimiento se produce en sentido horizontal a partir de un tallo subterraacuteneo o rizoma generando una sub-unidad capaz de producir una flor o inflorescencia y de ser eventualmente separada de la planta (ej Cattleya) Monopodial en las que el nuevo crecimiento se produce en sentido vertical con lo cual la planta crece constantemente en altura (ej Phalaenopsis) (ORQUIDEAS 2007) 214 Geacuteneros y especies chilenas Seguacuten NOVOA et al (2006) en la familia Orchidaceae se encuentran 49 especies de flora nativa dentro de las cuales se encuentra Chloraea virescens (Willd) Lindl Los geacuteneros de Orchidaceae en Chile son 7
- Aa Bipinnula Brachystele Codonorchis Chloraea Gavilea y Habenaria
Dentro del geacutenero Chloraea existen 31 especies - Chloraea alpina Poepp - Chloraea barbata Lindl - Chloraea bidendata (Poepp y Endl) Correa - Chloraea bletioides Lindl - Chloraea cuneata Lindl - Chloraea chica Speg - Chloraea chrysantha Poepp - Chloraea crispa Lindl - Chloraea cristata Lindl - Chloraea cylindrostachya Poepp - Chloraea disoides Lindl - Chloraea galeata Lindl - Chloraea gaudichaudii Brongn - Chloraea gavilu Lindl - Chloraea grandiflora Lindl - Chloraea heteroglossa Rchbf - Chloraea incisa Poepp - Chloraea lamellata Lindl - Chloraea lechleri Lindl - Chloraea leptopetala Reiche - Chloraea longipetala Lindl - Chloraea magellanica Hookf - Chloraea multiflora Lindl - Chloraea nudilabia Lindl - Chloraea philippii Reichbf - Chloraea picta Phil - Chloraea prodigiosa Reichbf - Chloraea speciosa Poepp - Chloraea virescens Lindl - Chloraea viridiflora Poepp
6
- Chloraea volkmanni Phil (NOVOA et al 2006) 2141 Chloraea virescens Planta perenne de 40-90 cm de altura Sus hojas son de 5-12cm de largo por 15-25cm de ancho estrechas lanceoladas agudas dispuestas en roseta basal generalmente marchitas al final de la antesis Su escapo floral tiene vainas caulinares lanceoladas agudas y distantes La inflorescencia es de 8-20cm de largo densa con 10-15 flores erguidas Sus flores son blancas con estriacuteas y aacutepices verdes El seacutepalo dorsal es de 16-33mm de largo por 4-6mm de ancho oblongo lanceolado obtuso algo coacutencavo a veces ligeramente estrechado al centro aacutepice algo carnoso Los seacutepalos laterales de 18-33mm de largo por 4-5mm de ancho son ensiformes con aacutepice obtuso engrosado verde negruzco a veces espatulado y dentado a veces verrugoso Los peacutetalos son de 15-23mm de largo por 5-58mm de ancho estrechamente aovados obtusos verrugosos con maacutes frecuencia solo la mitad inferior a veces el borde denticulado y carnoso El labelo de 15-26mm de largo por 10-20mm de ancho es mas o menos romboidal a levemente trilobulado El loacutebulo central tiene 5-7 nervios longitudinales recorridos por laminillas interrumpidas membranaacuteceas con segmentos falciformes de borde carnoso de color verde Los nervios laterales que se ramifican oblicuamente hacia el aacutepice en los loacutebulos laterales tienen pequentildeas laminillas y verrugas y su borde es laciniado inciso en la mitad apical hacia la base denticulado aacutepice generalmente engrosado La columna es de 12-18mm de largo delgada blanca con estriacuteas anaranjada La base de la zona nectariacutefera tiene un color amarillo-limoacuten con maacuteculas anaranjadas orificio nectario verde El ala de la columna es recta y estrecha El estigma es triangular y globoso La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la Vordf (Vintildea del Mar) hasta la XIordf Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile Sin embargo es posible que tenga una distribucioacuten maacutes restringida por que se le ha confundido con Chloraea incisa Su floracioacuten es desde noviembre a febrero y su estado de conservacioacuten no estaacute evaluado (NOVOA et al 2006) En el Anexo 14 se incluyen antecedentes sobre su distribucioacuten y eacutepoca de floracioacuten
7
FIGURA 1 Chloraea virescens FUENTE NOVOA et al (2006) 22 Requerimientos de las orquiacutedeas Para tener eacutexito en el cultivo de orquiacutedeas hay que tomar en cuenta factores de importancia como son 221 Agua El riego correcto es el principio y el fin del cuidado de orquiacutedeas (ROLLKE 2005) Este elemento es primordial para las orquiacutedeas asiacute como tambieacuten para todo tipo de plantas En el caso de eacutestas se dice muchas veces que la calidad del agua usada es el factor maacutes importante en el cultivo de orquiacutedeas ya que el porcentaje maacutes alto de muerte se produce por el exceso de este factor (SHEEHAN 1980) Hay que tomar en cuenta que la mayoriacutea de las orquiacutedeas son epiacutefitas lo que significa que tienen sus raiacuteces a la vista gracias a las cuales absorben el agua de lluvia Se recomienda un sustrato poroso y de reaccioacuten neutra ya que de esta manera el agua escurre sin acumularse no permitiendo la pudricioacuten de las raiacuteces Para las orquiacutedeas terrestres es lo mismo solo que se pueden regar con maacutes frecuencia pero sin mantenerlas saturadas (OSPINA y DRESSLER 1979) Seguacuten DUMOIS (2007) el agua es lo maacutes difiacutecil de controlar ya que depende de muchas variables como por ejemplo humedad relativa tipo de sustrato intensidad luminosa temperatura y circulacioacuten de aire Ademaacutes muchas orquiacutedeas necesitan un periacuteodo de receso vegetativo que si no es respetado resulta en ausencia de floracioacuten En general hay que antildeadir agua en abundancia cuando la planta se encuentra en crecimiento activo y reducirla despueacutes de la floracioacuten
8
Las especies con pseudobulbos almacenan agua y estaacuten preparadas para su periacuteodo de receso Otras que no cuentan con estos oacuterganos requieren de humedad maacutes constante 222 Luz Ninguna planta puede crecer sin la iluminacioacuten adecuada Muchas orquiacutedeas viven en las alturas de los aacuterboles y estaacuten expuestas a plena luz del sol otras crecen en el suelo selvaacutetico protegidas del sol por espesos follajes (ROLLKE 2005) La funcioacuten principal de la luz es activar el proceso de fotosiacutentesis Los cultivadores han estudiado la luz y han descubierto que hay orquiacutedeas que florecen con diacutea largo y otras con diacutea corto (OSPINA y DRESSLER 1979) Gracias a la fotosiacutentesis se convierten los minerales presentes en el ambiente en savia y nutrientes Hojas oscuras y falta de floracioacuten indican falta de luz hojas amarillas e incluso quemadas apuntan hacia un exceso de sol (DUMOIS 2007) 223 Fertilizacioacuten Las orquiacutedeas necesitan los mismos nutrientes que otras plantas Un abono para orquiacutedeas debe contener los nutrientes principales nitroacutegeno (N) foacutesforo (P) y potasio (K) asiacute como tambieacuten oligoelementos como hierro (Fe) magnesio (Mg) zinc (Zn) estantildeo (Sn) y manganeso (Mn) (ROLLKE 2005) Por otra parte la fertilizacioacuten depende de varios factores dentro de los cuales los maacutes criacuteticos son
- El medio utilizado - La edad de las plantas - Estado de las plantas ya sea floracioacuten crecimiento reposo
En cuanto a absorcioacuten se ha demostrado que es igual de eficiente por viacutea foliar como a traveacutes de las raiacuteces Es necesario tener en cuenta algunas reglas baacutesicas a la hora de fertilizar las orquiacutedeas (Asociacioacuten Costarricense de Orquideologiacutea ACO 1970)
1 Regar las plantas antes de fertilizar 2 Fraccionar las dosis 3 Aplicar el fertilizante de forma liacutequida 4 No usar fertilizantes soacutelidos 5 No fertilizar las plantas recieacuten plantadas 6 No fertilizar plantas en reposo 7 No abonar plantas enfermas
224 Temperatura Es conocido el hecho de que cada planta tiene liacutemites de temperatura dentro de los cuales prospera o perece De ahiacute la necesidad de conocer las temperaturas correspondientes al lugar de donde viene cada especie de orquiacutedea pudiendo proporcionarle la temperatura adecuada (OSPINA y DRESSLER 1979) Se puede clasificar a las orquiacutedeas como de clima caacutelido (temperatura nocturna miacutenima de 20ordmC) templado (miacutenimo de 13 a 18ordmC) y de ambiente friacuteo (de 10 a 13ordmC) (DUMOIS 2007)
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Seguacuten SHEEHAN (1980) las temperaturas ideales para las orquiacutedeas de origen tropical son 10ordmC en la noche y entre 21ordm - 24ordmC durante el diacutea 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas La micropropagacioacuten de orquiacutedeas estaacute en vanguardia hoy en diacutea El estudio de cultivo de tejido de orquiacutedeas se lleva a cabo en muchos laboratorios de todo el mundo (ARDITTI and ERNST 1992) 231 Biologiacutea de las semillas Las semillas de orquiacutedeas son conocidas usualmente como semillas polvo porque son minuacutesculas y contienen pocas reservas de alimento Estas semillas por lo general no germinan en el medio natural a menos que sean infectadas por un hongo micorriacutezico Este hongo abastece a las plantas joacutevenes con azuacutecares y nutrientes hasta que sean lo suficientemente grandes para fabricar su propio alimento Cuando la semilla germina produce una masa indiferenciada de ceacutelulas llamada protocormo Manteniendo las condiciones normales el protocormo continuaraacute su crecimiento por varias semanas meses o incluso antildeos dependiendo de la especie hasta que alcance la edad apropiada para producir raiacuteces y hojas En el caso de orquiacutedeas terrestres es de vital importancia que la relacioacuten orquiacutedea-hongo se conserve durante los estados tempranos del ciclo de vida de la planta ya que el protocormo enterrado no puede fabricar alimento por siacute mismo Por otro lado los protocormos de las orquiacutedeas epiacutefitas son comuacutenmente verdes lo que les posibilita producir parte de su alimento La relacioacuten orquiacutedea-hongo no ha sido en su totalidad investigada para el caso de las orquiacutedeas tropicales (McKENDRICK 2000) 232 Germinacioacuten simbioacutetica y no simbioacutetica de semillas Mediante la germinacioacuten in vitro las semillas germinan en frascos de vidrio o plaacutestico Estos frascos contienen en su interior un medio nutritivo solidificado con agar con todos los azuacutecares y minerales necesarios para la germinacioacuten y crecimiento de las semillas Hay dos tipos de germinacioacuten la simbioacutetica y la asimbioacutetica En la germinacioacuten simbioacutetica las semillas se siembran junto con una pequentildea cantidad del hongo micorriza adecuado Dicho hongo crece en el medio coloniza a las semillas que estaacuten en proceso de germinacioacuten y se produce una relacioacuten simbioacutetica la cual alimentaraacute al protocormo hasta que este sea capaz de producir sus hojas y se vuelva autotroacutefico Esta teacutecnica es usada principalmente en propagacioacuten de orquiacutedeas terrestres en zonas templadas La germinacioacuten asimbioacutetica se usa principalmente en propagacioacuten de orquiacutedeas tropicales que crecen maacutes raacutepido que sus parientes de zonas templadas Para este tipo de germinacioacuten se necesita un medio de cultivo maacutes complejo ya que todos los nutrientes orgaacutenicos e inorgaacutenicos asiacute como tambieacuten los azuacutecares deben estar en forma disponible pues no existe la intermediacioacuten del hongo (McKENDRICK 2000) 233 Condiciones de esterilidad Tanto para la germinacioacuten simbioacutetica como para la asimbioacutetica es de vital importancia que los frascos las semillas aparatos y el medio esteacuten esteacuteriles desde el principio del proceso Esto debido a que cualquier hongo o bacteria que se introduzca creceraacute maacutes raacutepido que las semillas ocupando su espacio hasta matarlas Esto se evita gracias al autoclave el cual regulado a 12 atm y 120ordmC por 20 minutos mata hongos o bacterias presentes en el medio (McKENDRICK 2000)
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2331 Siembra de las semillas Las semillas pueden ser recolectadas desde caacutepsulas verdes o maduras La caacutepsula verde que estaacute madurando estaacute llena de semillas y no se deforma cuando se aprieta con las pinzas Estas semillas pueden ser almacenadas por algunas semanas en un lugar refrigerado con bastante aireacioacuten Las semillas se pueden sembrar a partir de caacutepsulas verdes o semillas secas A continuacioacuten se muestran las ventajas y desventajas de ambos meacutetodos
- Siembra a partir de caacutepsulas verdes Si las caacutepsulas se mantienen intactas el interior (las semillas) se mantiene esteacuteril Por lo tanto si se esteriliza la parte exterior de las mismas donde hongos y bacterias pueden desarrollarse y se abren las caacutepsulas bajo condiciones esteacuteriles y las semillas podraacuten mantenerse desinfectadas
La ventaja de este meacutetodo es que no se requiere de esterilizacioacuten de las semillas lo que provoca su deterioro Otro punto a favor es que algunas semillas podriacutean germinar maacutes raacutepido que las provenientes de caacutepsulas maduras por los mecanismos de dormancia La desventaja es que en este caso todas las semillas deben ser utilizadas o eliminadas mientras que las semillas maduras se pueden almacenar Tambieacuten se debe considerar que las semillas sembradas a partir de caacutepsulas que no han madurado lo suficiente podriacutean germinar lentamente o simplemente no germinar - Siembra a partir de semillas secas En este caso una vez que la caacutepsula es abierta las semillas dejan de ser esteacuteriles y requieren de un proceso de esterilizacioacuten Comuacutenmente se utiliza una solucioacuten de hipoclorito de sodio hipoclorito de calcio o peroacutexido de hidroacutegeno Las semillas se agitan dentro de la solucioacuten que ademaacutes contiene una gota de detergente para ldquohumedecerlasrdquo luego se las enjuaga con agua destilada y se las siembra en el medio preparado La ventaja de este meacutetodo es que las semillas pueden ser colectadas secadas al aire almacenadas por varios meses en el refrigerador y utilizarlas cuando sea necesario Se debe considerar que la siembra ya sea de caacutepsulas verdes o de semillas secas estaacute determinado por la eacutepoca en que se colectan (McKENDRICK 2000) 234 Trasplante En la caacutemara de incubacioacuten las plaacutentulas se han desarrollado en condiciones limpias y en un ambiente cerrado por lo que deben acostumbrase gradualmente al ambiente exterior antes de ser trasplantadas a las macetas Tambieacuten la temperatura y la luz la cual es baja han sido constantes durante el cultivo in vitro En el medio natural la temperatura y la luz variacutean constantemente por lo que las nuevas plantas deben estar protegidas de la fuerte luz solar la cual puede quemar las hojas con soacutelo una pequentildea cantidad de eacutesta La humedad en los frascos es alta y las plantas estaacuten protegidas de ataques por hongos o bacterias Ademaacutes las plaacutentulas han crecido bajo condiciones de alta humedad y por lo tanto tendraacuten cutiacuteculas deacutebiles por lo que necesitan acostumbrase a medios menos huacutemedos antes de ser transplantadas
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Para el trasplante se deben colocar los frascos en un lugar protegido de la lluvia para que se aclimaticen a las nuevas condiciones de luz y temperatura Se deben dejar por 2 a 4 semanas en los frascos tapados Luego se debe ir aflojando las tapas para dejar entrar pequentildeas cantidades de aire hasta el punto de dejarlas descubiertas Se debe revisar si hay hojas marchitas y ver que el sustrato esteacute huacutemedo
Lo ideal es dejarlas sin tapa durante una semana antes de pasarlas a las macetas Para el trasplante se debe elegir un sustrato adecuado para el tipo de planta humedecerlo y transplantar las plantas con cuidado de no dantildear las raiacuteces y evitando la deshidratacioacuten En esta etapa tambieacuten se debe dejar las macetas selladas para evitar una raacutepida deshidratacioacuten e ir abrieacutendolas paulatinamente (McKENDRICK 2000)
24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas 241 Orquiacutedeas terrestres 2411 Cypripedium Esta es una orquiacutedea terrestre de zonas templadas se desarrolla en el Hemisferio Norte como por ejemplo en Guatemala y en Honduras pero donde se encuentra principalmente es en China Su forma maacutes comuacuten de propagacioacuten es in vitro a partir de semillas La forma maacutes eficiente es a partir de semillas inmaduras Existe un intervalo de tiempo entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten eacuteste dependeraacute de la especie y de la zona donde se desarrolle Se asume que existen aproximadamente cuatro semanas entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten El oacuteptimo para una buena germinacioacuten de Cypripedium es entre 42 y 60 diacuteas despueacutes de la polinizacioacuten y entre 14 y 32 diacuteas despueacutes de la fertilizacioacuten La germinacioacuten ocurre entre la segunda y cuarta semana despueacutes de ser sembradas y los protocormos deberiacutean ser cambiados de medio de cultivo cada dos a cuatro meses si no se corre el riesgo de sufrir agotamiento de nutrientes Los rizomas y las raiacuteces se empiezan a desarrollar a partir de los siete meses para luego dar lugar a las primeras hojas Para obtener un buen transplante se deben tener raiacuteces de miacutenimo un centiacutemetro de largo El desarrollo de raiacuteces se ve potenciado al tener un periacuteodo corto de bajas temperaturas (10degC) exposicioacuten a la luz reduccioacuten en la concentracioacuten de iones del medio de cultivo o transferirlas a un compost esteacuteril Al tener raiacuteces suficientes y el tamantildeo adecuado se podraacuten llevar las plantas al lugar donde creceraacuten definitivamente En el momento del transplante las plantas son muy susceptibles al desecamiento por lo cual lo ideal es que los brotes sean maacutes chicos que las raiacuteces El mejor sustrato seriacutea aquel donde crece naturalmente la orquiacutedea (RAumlNNBAumlCK 2007) 2412 Preservacioacuten in vitro de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes Este estudio fue hecho para establecer que parte de tejido es viable para la micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes del noreste de Europa pudiendo asiacute reestablecer dichas orquiacutedeas a sus aacutereas correspondientes La propagacioacuten in vitro de orquiacutedeas
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terrestres de clima templado es maacutes difiacutecil que las orquiacutedeas epiacutefitas de clima subtropical y tropical Las orquiacutedeas terrestres tienen requerimientos maacutes estrictos que las epiacutefitas y se conoce menos sobre sus necesidades especiacuteficas (VAASA y ROSENBERG 2004) En Estonia existen 36 especies de orquiacutedeas terrestres pero solo tres estaacuten bajo proteccioacuten Dactylorhiza baltica Dactylorhiza ruthei Dactylorhiza praetermissa Como explantes para este estudio en el caso de D baltica se ocuparon protocormos en los otros dos casos se utilizaron semillas semi maduras las cuales fueron colectadas siete y diez semanas despueacutes de ser polinizadas Para D baltica se ocupoacute el medio Murashige y Skoog suplementado con 05 mgL de aacutecido naftaleacuten aceacutetico (ANA) y 2 mgL de isonpentenyl adenina Para el caso de las semillas semi maduras se ocuparon los medios de Lindemann de Heller de Norstog y de Murashige y Skoog como control
La composicioacuten del medio y la madurez de las semillas influye mucho en el desarrollo de las orquiacutedeas in vitro Se ha demostrado que se necesita una alta concentracioacuten de microelementos para obtener una correcta germinacioacuten de las semillas Tambieacuten se puede decir que los primeros tres meses son los de mayor crecimiento luego de este tiempo el crecimiento se vuelve maacutes lento (VAASA y ROSENBERG 2004)
Luego de cuatro semanas de crecimiento de D baltica el 60 de los explantes de meristemas apicales empezaron a crecer en cambio los de meristemas laterales no expresaron ninguacuten tipo de crecimiento Las raiacuteces empezaron su desarrollo luego de dos meses despueacutes de la siembra
En el caso de D ruthei y D praetermissa la germinacioacuten se produjo despueacutes de dos meses desde la inoculacioacuten Luego de cuatro y seis meses el mayor crecimiento fue observado en el medio Norstog superando en 14 al medio testigo Murashige y Skoog (VAASA y ROSENBERG 2004)
2413 Longevidad de semillas de orquiacutedeas terrestres Por lo general las orquiacutedeas producen muchas pero pequentildeas semillas que contienen muy pocas reservas de alimento Dichas semillas estaacuten estructuralmente adaptadas para ser dispersadas por el viento pero poco se sabe del destino de eacutestas luego de ser dispersadas Algunos estudios de viabilidad de semillas indican una sobrevivencia de uno a dos antildeos en orquiacutedeas de clima templado Las semillas que son guardadas en laboratorio duran mucho maacutes tiempo Se estudioacute la viabilidad de siete especies de orquiacutedeas norteamericanas dentro de las cuales se encuentran Goodyera pubescens y Liparis liliifolia Las semillas de eacutestas se colocaron en bolsas con suelo y sustratos de bosques provenientes de sus haacutebitats naturales (WHIGHAM et al 2005) En Goodyera pubescens la mayoriacutea de las semillas germinaron en un antildeo Cuatro otras especies germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero algunas semillas no germinadas despueacutes de siete antildeos seguiacutean siendo viables En la especie Liparis liliifolia semillas que han estado cuatro antildeos bajo observacioacuten han tenido una tasa de
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germinacioacuten de un 68 al ser sembradas in vitro junto con el hongo micorriacutezico adecuado Las dos especies restantes no germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero las semillas fueron evaluadas como intactas y testeadas positivamente en cuanto a su viabilidad despueacutes de cuatro antildeos en el suelo Estas observaciones fueron interpretadas como diferentes estrategias para especies especiacuteficas de germinacioacuten in situ (WHIGHAM et al 2005) 2414 Sobrevivencia de orquiacutedeas terrestres transplantadas a sectores urbanos La conservacioacuten de poblaciones de orquiacutedeas silvestres depende del establecimiento de las orquiacutedeas propagadas a los campos Sin embargo se conoce muy poco de los factores bioacuteticos que influencian el establecimiento de orquiacutedeas terrestres a sus haacutebitats naturales Un experimento fue establecido para medir la sobrevivencia de seis especies durante su primer periacuteodo de crecimiento seguido del transplante a un sector urbano en Australia (SCADE et al 2006)
Las orquiacutedeas germinadas simbioacuteticamente crecieron en laboratorio durante cinco meses antes de establecer la plantacioacuten en sitios adyacentes con alta o baja cobertura de malezas Existioacute una muerte gradual de las plaacutentulas durante el primer periacuteodo de crecimiento primeramente por ataque de insectos no siendo evitado por la presencia de una malla cobertora Los iacutendices de sobrevivencia variacutean desde 49 para Microtis media una especie capaz de crecer en un ambiente atiacutepico hasta un 21 para Caladenia arenicola la orquiacutedea nativa maacutes comuacuten de esos sitios Sin embargo no todas las orquiacutedeas sobrevivientes producen tubeacuterculos por lo que la tasa de sobrevivencia despueacutes del primer periacuteodo seco disminuye
La sobrevivencia de las orquiacutedeas sembradas no puede ser comparada con orquiacutedeas de la misma especie que crecieron en los mismos lugares ya que no existioacute la presencia del hongo compatible para estas orquiacutedeas (SCADE et al 2006)
2415 Micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres En India dos orquiacutedeas muy importantes para la horticultura del geacutenero Anoectochilus fueron exitosamente propagadas Noacutedulos aislados de A sikkimensis colectadas en Himalaya y A regalis colectadas en India fueron cultivadas in vitro durante 12 semanas para obtener un maacuteximo de 48 a 56 protocormos y brotes obteniendo como resultado un 95 y 98 de eficiencia respectivamente Durante el repicado de los explantes in vitro de A regalis se observoacute que el nuacutemero total de brotes obtenidos a partir de noacutedulos fue 214 asiacute como tambieacuten 82 puntas de brotes En cambio para A sikkimensis fueron mucho maacutes bajos 123 y 43 respectivamente teniendo un crecimiento maacutes lento pero plantas maacutes fuertes Las raiacuteces de 4 a 6cm crecieron con la presencia de NAA (270 microM ) en el medio asiacute como tambieacuten con carbono activado (02) Durante la aclimatacioacuten la tasa de establecimiento fue entre 95 y 98 Luego de seis meses en invernadero las plantas de A regalis fueron transferidas a bosque nativo donde se obtuvo una tasa de
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sobrevivencia de entre 70 y 95 despueacutes de 12 meses Estas plantas establecidas en bosque nativo estaacuten libres de cualquier defecto morfoloacutegico y de crecimiento (GANGAPRASAD et al 2000) 242 Orquiacutedeas epiacutefitas Estas orquiacutedeas viven en los aacuterboles pero no obtienen de eacuteste su alimento no son paraacutesitas 2421 Preservacioacuten de Cattleya walkeriana usando propagacioacuten in vitro El geacutenero Cattleya se encuentra en Meacutexico y Ameacuterica Central asiacute como tambieacuten en Venezuela Colombia y las laderas de los Andes Esta orquiacutedea tambieacuten se encuentra en varias regiones del Brasil creciendo en aacuterboles rocas cerca de riacuteos lagos y pantanos Las flores de esta orquiacutedea son conocidas debido a su hermosura y a causa de la destruccioacuten de su haacutebitat y a la excesiva coleccioacuten de eacutestas se encuentra en extincioacuten
La composicioacuten del medio de cultivo es esencial para la propagacioacuten in vitro ya que suple todos los nutrientes necesarios para el desarrollo y seraacute distinto dependiendo de cada especie en este caso se utilizoacute la mitad de los macronutrientes del medio Muchos autores sugieren el uso de carboacuten activado en el medio ya que por lo general en muchas especies aumenta el desarrollo de las raiacuteces En este estudio se probaron distintas dosis de carboacuten activado 1 2 4 y 6gL con un pH de 6 (TADEU DE FARIA et al 2002) Las semillas se obtuvieron de flores artificialmente polinizadas en invernadero Plaacutentulas de aproximadamente un centiacutemetro fueron seleccionadas y cultivadas nuevamente en el medio de cultivo Murashige y Skoog pero esta vez con las diferentes dosis de carboacuten activado Se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces el nuacutemero de brotes y el peso de la materia verde total Durante el autoclavado se produce normalmente una hidroacutelisis de sacarina la cual es de 10 aproximadamente este porcentaje aumenta considerablemente al agregar un 1 de carboacuten activado llegando a ser de 95
El desarrollo de las plaacutentulas de C walkeriana aumentan con una mayor concentracioacuten de carboacuten activado asiacute como tambieacuten un mayor tiempo de cultivo El resultado fue que la dosis ideal para el desarrollo de esta orquiacutedea es 2gL de carboacuten activado (TADEU DE FARIA et al 2002) 2422 Establecimiento de cultivos in vitro y micropropagacioacuten de Cattleya aurantiaca (Bateman ex Lindl) Por medio de siembra in vitro se logroacute el establecimiento de C aurantiaca con alto porcentaje de germinacioacuten y desarrollo de protocormos Para la oacuteptima formacioacuten de callo y para la proliferacioacuten de protocormos se determinaron los medios oacuteptimos (MS 10 mgL ANA 10 mgL BA) asiacute como tambieacuten de manera directa sobre explantes de hoja y pseudobulbos (MS 01 mgL ANA 01 mgL GA3)
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Con este uacuteltimo medio tambieacuten se logroacute una oacuteptima regeneracioacuten y desarrollo de plaacutentulas Los medios liacutequidos (sin agitacioacuten) son una buena opcioacuten para conseguir la produccioacuten masiva de protocormos ya que con ellos se optimizoacute la micropropagacioacuten de C aurantiaca Las plaacutentulas micropropagadas presentaron alto porcentaje de sobrevivencia y buen desarrollo despueacutes de su trasplante y aclimatacioacuten lo cual demuestra que es un buen sistema de propagacioacuten para C aurantiaca (GUTIERREZ y SALGADO 2007) En cuanto a transplante y aclimatacioacuten despueacutes de 45 diacuteas de desarrollo in vitro las plaacutentulas de un tamantildeo entre 3 y 5 cm con raiacuteces bien desarrolladas fueron llevadas a condiciones ex vitro eliminando los restos de medio de cultivo con agua potable y ocupando un sustrato de partes iguales de tezontle y corteza de encino cubierta con hojarasca de encino finamente molida Se mantuvieron cubiertas durante 15 diacuteas abriendo cada dos diacuteas hasta poder retirar la tapa en 30 diacuteas Despueacutes de dos meses de haber sido retiradas del cultivo in vitro las plaacutentulas presentaron 70 de sobrevivencia y alcanzaron una altura de hasta 7 cm presentando nuevas hojas y raiacuteces las plantas se muestran vigorosas y capaces de continuar su crecimiento en condiciones ambientales de invernadero (GUTIERREZ y SALGADO 2007)
2423 Establecimiento in vitro y regeneracioacuten de plantas de Laelia autumnalis (Llave y Lex) Lindl Para este estudio se obtuvieron las semillas de una caacutepsula desarrollada despueacutes de 6 meses de la floracioacuten las cuales se sembraron in vitro sin presentar contaminacioacuten ya que la siembra por este meacutetodo es muy eficiente en comparacioacuten al cultivo de semillas libres donde algunas veces se presenta la contaminacioacuten Las observaciones se realizaron cada 15 diacuteas la germinacioacuten se detectoacute en los primeros 15 diacuteas en la mayoriacutea de los medios de cultivos probados con la presencia de protocormos de 1mm de diaacutemetro (HUAPEO y SALGADO 2004) El porcentaje de germinacioacuten que se obtuvo de las semillas cultivadas in vitro de L autumnalis fue de 95 a 100 en todos los medios de cultivo la uacutenica diferencia fue el tiempo entre las germinaciones A excepcioacuten de las semillas cultivadas en el medio MS 100 la germinacioacuten del 100 se obtuvo hasta los 30 diacuteas de cultivo mientras que en el primero la germinacioacuten fue a los 15 diacuteas del cultivo Las plaacutentulas con raiacutez y un par de hojas se lograron a los 90 diacuteas de cultivo en el medio MS 100 alcanzando 07 mm de altura Estas plaacutentulas fueron subcultivadas en medio MS con 05 mgl de ANA y 01 mgl de GA3 para tener plaacutentulas fuente de explante (segmentos de hojas) un medio oacuteptimo de desarrollo de plaacutentulas de L speciosa No fue necesario probar otros medios de cultivos ya que se hicieron pruebas anteriores que demostraron que era el adecuado
Las plaacutentulas de 6 meses de cultivo in vitro despueacutes de su germinacioacuten presentaron una altura promedio de 5 cm con raiacuteces con velamen y hasta dos pares de hojas Segmentos de hoja de eacutestas fueron cultivadas en el medio MS conteniendo ANA BA y GA3 en diferentes concentraciones y se realizaron observaciones cada 30 diacuteas para determinar medios inductores de callo protocormos y raiacuteces La mejor respuesta en formacioacuten de callo fue observada en los segmentos de hoja de plaacutentulas de L autumnalis cultivados en MS con 1 mgl de ANA BA y GA3 iniciando la induccioacuten de
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eacuteste desde los 30 diacuteas de cultivo solamente en un 70 de los explantes cultivados El 100 se logroacute a los 90 diacuteas de cultivo observando callo abundante alrededor de todo el tejido de color blanco con puntos pigmentados de color verde La regeneracioacuten de protocormos de esta orquiacutedea se establecioacute con la siembra de segmentos de hoja de plaacutentulas de 6 meses de edad de manera directa o a partir de callos En callos la produccioacuten fue oacuteptima en el medio MS con 01 mgl de ANABAGA3 ya que a los 60 diacuteas se obtuvieron 50 protocormos por segmento de callo Solamente se produjeron 10 protocormos por explante al cultivarse los segmentos de hoja en MS con 01 mgl de ANABAGA3 a los 120 diacuteas de cultivo (HUAPEO y SALGADO 2004) 25 Aclimatacioacuten Aclimatacioacuten significa que el hombre intercede y guiacutea el proceso de acondicionamiento de las plantas hasta que eacutestas sean aptas para crecer en el campo yo invernadero
Un alto nuacutemero de plantas micropropagadas no sobreviven al cambio desde el cultivo in vitro hacia el ambiente exterior ya sea en campo o invernadero Eacutestos dos uacuteltimos tienen menor humedad relativa niveles maacutes altos de luminosidad y un ambiente seacuteptico los cuales son maacutes estresantes para las plantas micropropagadas La mayoriacutea de las especies que crecen in vitro necesitan un proceso de aclimatacioacuten pudiendo obtener asiacute un nuacutemero suficiente de plantas vivas y vigorosas para trasplantar al suelo (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991)
La aclimatacioacuten no es uacutenicamente para micropropagacioacuten siendo usada ademaacutes en propagacioacuten convencional durante antildeos Despueacutes de cortar las hojas y de haber formado raiacuteces por lo general son aclimatadas antes de ser llevadas al campo o invernadero Ejemplos de dos teacutecnicas comunes son bajar gradualmente la humedad y mantener el nivel de luz con un 50 de sombra antes de trasladarlos al campo Las raiacuteces que han sido cortadas y mal limpiadas muchas veces son focos de infeccioacuten En estos casos las plantas muestran signos de marchitez hojas necrosadas y tambieacuten se puede llegar a la muerte de eacutestas El cultivo in vitro reduce la necesidad de fotosiacutentesis ya que las condiciones de la caacutemara de incubacioacuten proveen a la planta de sacarosa u otro azuacutecar Tambieacuten en estas condiciones se reduce el stress por patoacutegenos al ser un ambiente aseacuteptico Todo esto se traduce en que las plantas micropropagadas no son aptas para el campo yo invernadero (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 251 Stress hiacutedrico El stress hiacutedrico puede ser el resultado de una excesiva transpiracioacuten de las diferentes partes aeacutereas de las plantas especialmente de las hojas o por una inadecuada absorcioacuten de agua por parte de las raiacuteces La cutiacutecula y los estomas son la ruta primaria de peacuterdida de agua desde de las hojas provenientes de esta teacutecnica reproductiva 2511 Cutiacutecula La cutiacutecula es una membrana compuesta por una matriz de cutina que a su vez se encuentra cubierta en su superficie por ceras cuya funcioacuten primaria consiste en limitar la peacuterdida de agua por transpiracioacuten La permeabilidad del agua a traveacutes de la cutiacutecula se ve influenciada principalmente por la estructura y la cantidad de
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ceras cuticulares y epicuticulares no vieacutendose afectada la peacuterdida de agua por el grosor de eacutesta o la naturaleza quiacutemica de la matriz de la cutina La estructura cristalina de la parte encerada de las hojas es distinta en las plantas micropropagadas con respecto a las plantas que crecen en el campo La cera epicuticular de las hojas de plantas in vitro tienen una proporcioacuten maacutes alta de esteres y de componentes polares por el contrario tienen unas cadenas de hidrocarbonos mucho maacutes cortas Esto hace que las plantas in vitro pierdan maacutes agua que las cultivadas en campo o invernadero
Las plantas que han crecido en el campo son naturalmente de color verde pero el color de las plantas cultivadas in vitro es diferente y se puede ver a simple vista Las plantas que son pasadas a invernadero y que tengan un color verde se aclimatan de mejor forma al ambiente exterior (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 2512 Estomas La estructura estomaacutetica y su funcionamiento han sido implicados recurrentemente en el desbalance de agua exhibido por plantas micropropagadas al momento de ser removidas del cultivo in vitro Estudios con microscopiacutea de scanner electroacutenico han indicado que la estructura estomaacutetica presente en algunas especies de plantas cultivadas in vitro difieren marcadamente de las cultivadas en invernadero o en el suelo Debido a que las primeras presentan estomas de mayor tamantildeo y maacutes redondos a diferencia de las plantas cultivadas de manera normal que presentan estomas maacutes pequentildeos y eliacutepticos lo que resulta en una deshidratacioacuten maacutes raacutepida en el caso de las provenientes de cultivo in vitro (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 252 Humedad Debido a la anatomiacutea y la condicioacuten fisioloacutegica de las plantas desarrolladas in vitro donde se ha mantenido una alta humedad relativa es necesario regar al momento del traslado para obtener una alta sobrevivencia Muchos laboratorios aseguran que hay que evitar tener un sistema de aspersioacuten ya que se produce el ambiente necesario (muy huacutemedo) para la aparicioacuten de hongos algas o bacterias Otros meacutetodos incluyen el uso de humidificadores o poner las macetas en un lugar cerrado donde se retenga vapor para esto se pueden usar por ejemplo tapas de polietileno Este meacutetodo es relativamente econoacutemico pero se debe tener control del calor y monitorear la falta de agua (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 253 Luz Durante la etapa in vitro las plantas estaacuten expuestas a altos niveles de luminosidad lo que se traduce en hojas delgadas Antes del traslado se recomienda mantener las plantas con un 50 de sombra para asiacute poder aclimatarlas de mejor manera esto debido a que las plantas micropropagadas tienen un bajo control sobre la transpiracioacuten y un inadecuado mecanismo de fotosiacutentesis La sombra reduce la transpiracioacuten evitando excesivas peacuterdidas de agua asiacute como tambieacuten el exceso de luz destruye las moleacuteculas de clorofila Luego del periacuteodo bajo sombra se deben mover las macetas gradualmente hacia el nivel de luz al cual seraacute llevado para su crecimiento final (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 254 Temperatura La temperatura del aire y del medio o sustrato de crecimiento estaacute generalmente controlado durante el periacuteodo de aclimatacioacuten El calor es necesario en los meses de invierno y el friacuteo (enfriar) es esencial en los meses de verano Ajustando la cantidad de sombra y humedad se obtiene un control sobre la temperatura El
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enfriamiento se puede obtener gracias a ventilacioacuten abanicos niebla o aire acondicionado El calor puede provenir del sistema existente en el edificio o invernadero donde esteacuten ubicadas las macetas o por las laacutemparas ocupadas para el control del fotoperiacuteodo El rango de temperatura que se mantiene por lo general es entre los 13 y 30ordmC y esta determinado principalmente por la especie en cuestioacuten La temperatura de la zona donde se encuentran las raiacuteces es muy importante para el crecimiento lo ideal es que dicho sector tenga una mayor temperatura que el aire fomentando el crecimiento de las raiacuteces e incrementando la humedad alrededor de la planta Durante el verano esto es difiacutecil de obtener ya que la temperatura del aire es muy alta debido a la alta radiacioacuten solar Terminado el proceso de aclimatacioacuten esto ya no es necesario (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 255 Fotosiacutentesis Las plantas sufren un cambio radical cuando son removidas desde cultivo in vitro ya que son forzadas a cambiar de heterotroacuteficas a autotroacuteficas y la fotosiacutentesis se vuelve fundamental para la sobrevivencia Las hojas de las plantas in vitro no estaacuten formadas para hacer fotosiacutentesis ya que en la caacutemara de incubacioacuten no se produce un fuerte intercambio gaseoso esto debido a que la sacarosa es entregada a traveacutes del medio de cultivo Las hojas de las plantas que son trasladadas al campo o invernadero sufren deterioro debido a que no estaacuten formadas para la fijacioacuten de carbono Esto se produce por un tiempo aproximado de cuatro semanas despueacutes de las cuales las hojas nuevas suplen a las viejas Otro punto es que las hojas de las plantas cultivadas in vitro contienen menor proporcioacuten de clorofila que las plantas que han crecido normalmente en el campo En un estudio de coliflor cultivado in vitro se midioacute el CO2 y se obtuvo un balance negativo el cual se mantuvo durante dos semanas despueacutes del transplante Algo similar ocurrioacute con frutilla despueacutes del transplante las hojas se deterioraron raacutepidamente lo que quiere decir que no hubo incremento en la fijacioacuten de carbono indicando falta de desarrollo en la competencia fotosinteacutetica
El bajo nivel de CO2 durante el cultivo in vitro limita el proceso de fotosiacutentesis lo cual se puede compensar usando sacarosa en el medio de cultivo Tambieacuten se puede incrementar el nivel de luz y CO2 obteniendo un fuerte aumento en el crecimiento de varias especies como orquiacutedeas clavel etc (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 256 Sustrato Un sustrato es todo material soacutelido distinto del suelo natural mineral u orgaacutenico que colocado en un contenedor en forma pura o en mezcla permite el anclaje del sistema radicular de la planta desempentildeando por lo tanto un papel de soporte para la planta El sustrato puede intervenir o no en el complejo proceso de la nutricioacuten mineral de la planta (INFOAGRO 2007) El sustrato y los contenedores dentro de los cuales se van a transplantar las plaacutentulas in vitro son importantes para una buena sobrevivencia
Los sustratos ejercen una influencia significativa en la arquitectura del sistema radical de las plantas y en las asociaciones bioloacutegicas de este con el suelo influenciando el
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estado nutricional y la translocacioacuten de agua en el sistema suelo-planta-atmoacutesfera Uno de los requisitos fundamentales que debe cumplir el sustrato para su utilizacioacuten es la sanidad Cuando estos no se elaboran almacenan o manejan correctamente pueden contaminarse y provocar serios dantildeos a las plantas durante la aclimatacioacuten por esta razoacuten son preferidos como componentes para su elaboracioacuten materiales inertes o aquellos en las cuales el proceso de obtencioacuten garantice la mayor desinfeccioacuten posible
Uno de los factores de mayor importancia a la hora de seleccionar los materiales que pueden constituir el sustrato es su disponibilidad tanto en teacuterminos de facilidad de obtencioacuten o suministro como de su costo (VILCHEZ et al 2007)
La presencia de inhibidores o tambieacuten cambios en el pH del sustrato pueden afectar el crecimiento de las raiacuteces y consecuentemente el eacutexito del transplante
Muchos laboratorios y viveros transplantan a un sustrato uniforme debiendo ser eacuteste adecuado en cuanto a soporte de las plantas pH porosidad aireacioacuten y drenaje (DEBERGH y ZIMMERMAN 1991)
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3 MATERIAL Y MEacuteTODO
Para la realizacioacuten de este trabajo se utilizoacute el siguiente material y meacutetodo
31 Material La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio e invernadero de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal pertenecientes a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de Chile
311 Material vegetal Se utilizaron plaacutentulas de C virescens cultivadas in vitro a partir de semillas las cuales fueron proporcionadas por el laboratorio estas plaacutentulas fueron separadas y repicadas para aumentar la poblacioacuten y obtener la cantidad necesaria para el ensayo
FIGURA 2 Plaacutentulas de C virescens en caacutemara de crecimiento in vitro
312 Materiales Los materiales que se utilizaron fueron los siguientes Equipos autoclave caacutemara de flujo laminar dispensador de medios medidor
de pH agitador magneacutetico horno microondas balanza mechero termoacutemetro Materiales vasos de precipitado matraces probetas pipetas papel de
aluminio frascos de vidrio placas Petri pinzas bisturiacute macetas regadera Soluciones soluciones madre (Medio MS) gelificante etanol 70 y 95
32 Meacutetodo A continuacioacuten se da a conocer la metodologiacutea con la cual se trabajoacute 321 Preparacioacuten del medio de cultivo Para la obtencioacuten de plantas a traveacutes de la micropropagacioacuten se ocupoacute el medio basal de MURASHIGE y SKOOG (1962) tambieacuten llamado medio MS Este medio tiene un pH de entre 56-57 Posteriormente se dosificoacute con el dispensador de medios para que cada frasco tenga una cantidad adecuada (25 mL) y se llevoacute a autoclave para esterilizar a 12 atm 120ordm C por 20 min
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322 Obtencioacuten del material vegetal Al tener el medio esterilizado se procedioacute a la separacioacuten y repicado de plaacutentulas existentes en el laboratorio Las siembras se realizaron en el mes de mayo del 2007 Estas siembras se realizaron en la caacutemara de flujo laminar de modo de asegurar que la siembra sea 100 aseacuteptica Estas plaacutentulas fueron mantenidas en la caacutemara de incubacioacuten hasta obtener los tamantildeos requeridos para el ensayo donde las condiciones fueron las siguientes
minus Temperatura ambiental de 23-25ordm C minus Fotoperiacuteodo de 16 horas minus Intensidad lumiacutenica controlada de 50-55 micromol m-2s-1
323 Sustratos Se utilizaron tres tipos de sustratos el primero corresponde a una mezcla de turba + perlita (11) el segundo corresponde a Sphagnum (100) y el tercero corresponde a una mezcla de turba + arena (11) Una vez realizadas las mezclas se procedioacute a una esterilizacioacuten en un autoclave a 121ordm C por 20 minutos a 12 atmoacutesfera De esta forma se trabajoacute con material limpio y sano evitando ataque de hongos o bacterias El anaacutelisis quiacutemico de los sustratos se muestra en el Anexo 2 324 Plantacioacuten Las plaacutentulas con un promedio de cuatro meses en condiciones de caacutemara de crecimiento in vitro obtuvieron el tamantildeo adecuado para ser utilizadas Se sacaron de los frascos y se plantaron en las macetas de plaacutestico transparente con los sustratos Posteriormente fueron dejadas en la sala del laboratorio donde se debioacute asperjar con solucioacuten nutritiva Hoagland y fungicida Captan CUADRO 1 Composicioacuten de solucioacuten nutritiva Hoagland
KNO3 102 gL Ca(NO3) 4 H2 O 0492 gL
NH4H2 (PO4) 023 gL MgSO4 7 H2O 049 gL
H3BO3 286 mgL MnCl2 2 H2O 181 mgL CuSO4 5 H2O 008 mgL ZnSO4 5 H2O 022 mgL Na2MoO4 H2O 009 mgL
FeSO4 7 H2O 05 06 mL FUENTE FINCK 1988 325 Disentildeo de los ensayos Este trabajo de investigacioacuten constoacute de un ensayo con dos etapas Antes que todo se realizoacute la separacioacuten y repicado in vitro de plaacutentulas de C virescens para la obtencioacuten del nuacutemero necesario de plantas En la etapa 1 se utilizaron tres tamantildeos de plaacutentulas obtenidas in vitro de 1-2cm de 2-3cm y de maacutes de 3cm de altura que se transplantaron a tres sustratos turba + perlita 11(vv) Sphagnum (100) y turba + arena 11 (vv) La turba provino de la Sociedad
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Minera Patagonia Peat SA en Hijuelas el Sphagnum de la empresa Lonquen Chile de Puerto Montt y la perlita se obtuvo a traveacutes del sitio web wwwjardisencl (representante legal Walter Rathgeb Penza Ingeniero Agroacutenomo Santiago) Las plaacutentulas se plantaron de acuerdo a su tamantildeo las de maacutes de 3cm se colocaron de 6 por maceta las de 2 a 3cm de a 8 por maceta y las maacutes chicas de a 10 por maceta Estas macetas fueron dejadas en una sala de aclimatacioacuten con una temperatura promedio de 20ordm C intensidad lumiacutenica de 50-55 micromol m-2s-1 y 14-16 hrs de fotoperiacuteodo Se fertilizoacute asperjando cada cinco diacuteas con solucioacuten nutritiva Hoagland Esta etapa se llevoacute a cabo durante dos meses desde el cinco de septiembre hasta el cinco de noviembre de 2007
En la etapa 2 se continuoacute el proceso de aclimatacioacuten en invernadero de las plaacutentulas obtenidas en la etapa 1 que despueacutes de dos meses teniacutean un mayor tamantildeo y se habiacutean acondicionado al ambiente exterior (fuera de la caacutemara de crecimiento) Las plantas se mantuvieron en las macetas durante tres semanas para aclimatarlas y luego las plantas sobrevivientes fueron transplantadas a macetas maacutes grandes individuales durante tres meses aproximadamente hasta el cinco de marzo 2008 Estas nuevas macetas tuvieron como sustrato turba y suelo (trumao) en igual proporcioacuten (Anexo 2) La temperatura promedio de invernadero fluctuoacute de 13 a 35 degC seguacuten el mes En enero el promedio fue de 25 (Anexo 3) Para bajar la temperatura alrededor de 5deg C se instaloacute una malla Rachel 326 Disentildeo experimental El disentildeo experimental utilizado fue completamente al azar ordenado como experimento factorial con dos factores tamantildeo (3) y sustrato (3) Cada tratamiento tuvo tres repeticiones con un miacutenimo de 6 plantas por recipiente 327 Variables a evaluar Durante los dos meses en que las macetas estuvieron en la sala de aclimatacioacuten se evaluoacute el desarrollo foliar contando el nuacutemero de hojas una vez al mes Posteriormente se trasladaron las mismas macetas a invernadero durante tres semanas para continuar con la aclimatacioacuten de las plaacutentulas Transcurrido este tiempo se transplantaron las plaacutentulas sobrevivientes a macetas individuales y continuoacute mensualmente la evaluacioacuten de eacutestas (nuacutemero de hojas) hasta la obtencioacuten de plantas establecidas Al momento del transplante y al final del ensayo se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces asiacute como tambieacuten al final del ensayo de evaluoacute el crecimiento en altura (cm) La sobrevivencia fue evaluada al final del ensayo por maceta
Tanto en la sala de aclimatacioacuten coacutemo en el invernadero se registroacute la temperatura con la ayuda de un termoacutemetro de maacutexima y miacutenima (Anexo 3) 328 Anaacutelisis estadiacutestico Una vez obtenidos los datos se procedioacute a comprobar si estos cumpliacutean con los supuestos de aleatoriedad normalidad y homogeneidad de varianzas que exige este tipo de anaacutelisis En el caso de no cumplirse estos supuestos los datos se transformaron utilizando log10(x+05) raiacutez(x+05) o 1x para normalizarlos
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y enseguida se sometioacute los datos a un anaacutelisis estadiacutestico (ANDEVA) Posteriormente en los casos en que se observoacute diferencias significativas en el ANDEVA se aplicoacute una prueba de rangos muacuteltiples (Tukey) al 5 de significancia Para las variables no parameacutetricas que no cumplieron con los supuestos para un anaacutelisis de varianza se realizoacute la prueba de KruskalndashWallis y las comparaciones muacuteltiples a traveacutes del test de Dunn con un nivel de 5 de significancia
Se utilizaron los programas estadiacutesticos STATGRAPHICS 20 y GRAPHPAD PRISM 5 para el anaacutelisis de datos
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4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
En los siguientes puntos se discuten los resultados obtenidos en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens
En la Figura 3 se observan plaacutentulas de C virescens micropropagadas en medio MS en caacutemara de crecimiento al inicio del ensayo (A) y en invernadero despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten (B)
BA
FIGURA 3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten
A continuacioacuten se presentan los resultados obtenidos para las variables analizadas (Cuadro 2 y 3) de esta manera se pueden visualizar en general los resultados obtenidos en el proceso de aclimatacioacuten durante seis meses
CUADRO 2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de raiacuteces
inicial y final Variables
Hojas finales (nuacutemero)
Raiacuteces iniciales (nuacutemero)
Raiacuteces finales (nuacutemero)
Tamantildeo de plaacutentulas 36 24 37 47 29 46
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 61 43 76
Sustratos 53 36 56 43 29 51
Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 46 27 49
Significa que hay diferencias significativas al 95 Test de Dunn
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Las variables no parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en hojas finales y raiacuteces iniciales en sus rangos de distribucioacuten Las raiacuteces finales no presentaron diferencias seguacuten el sustrato utilizado pero de acuerdo al tamantildeo hubo diferencias en su distribucioacuten
CUADRO 3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas
Variables Altura final de plaacutentulas
(cm) Sobrevivencia
Tamantildeo de plaacutentulas
36 c 567 b 47 b 821 a
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 59 a 908 a
Sustratos 52 a 933 a
41 ab 59 b Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 49 b 772 a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY Las variables parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en altura final de hojas y en sobrevivencia 41 Nuacutemero de hojas finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentulas y de sustratos para la variable nuacutemero final de hojas 411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula Seguacuten el Cuadro 2 y Figura 4 las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero final de hojas Las plaacutentulas pequentildeas de 1-2 cm obtuvieron el nuacutemero maacutes bajo de hojas finales con una media de 36 hojas por plaacutentula lo cual es la mitad de las hojas finales que se obtuvo con las plaacutentulas de mayor tamantildeo (61 hojas aproximado por plaacutentula) Para las plaacutentulas medianas de 2-3 cm se obtuvo una media de 47 hojas por plaacutentula (Figura 4)
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Hojas finales
1-2 cm 2-3cm maacutes de 3 cm0
5
10
15
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn)
BLANCO (2006) sentildeala que plaacutentulas cultivadas in vitro crecen bajo condiciones especiales como alta humedad relativa y baja luminosidad ademaacutes son suplidas con sacarosa Estas condiciones fueron proporcionadas en una caacutemara de crecimiento en el laboratorio donde las plantas micropropagadas no son dependientes por completo de su fotosiacutentesis son heteroacutetrofas Parece ser necesario un estiacutemulo para convertirse en organismos totalmente capaces de sustentar sus propios requisitos de carbono y nitroacutegeno reducido pasando de esta manera a ser autoacutetrofos
Al ser sacadas de un medio in vitro las hojas no estaacuten preparadas para producir su propio alimento y sobreviven gracias a que el medio de cultivo le proporciona los nutrientes necesarios para vivir En este punto muchas de las hojas mueren y nacen hojas nuevas capaces de generar su alimento supliendo asiacute las hojas viejas (SEELYE et al 2003) En este ensayo las plaacutentulas de Chloraea virescens presentaron en general una buena adaptacioacuten al ser sacadas de un medio in vitro
Se observoacute que plaacutentulas con menor tamantildeo al ser aclimatadas y tener menor tejido fue maacutes difiacutecil y maacutes lento que empezaran a generar nuevos tejidos y materia orgaacutenica a partir de dioacutexido de carbono POSPIacuteŠILOVAacute et al (1999) sentildeala que al tener los estomas con desarrollo incompleto maacutes grandes y de forma maacutes redonda pierden maacutes agua lo cual puede provocar una peacuterdida de hojas muriendo asiacute la plaacutentula Por esta razoacuten las plaacutentulas pequentildeas se demoran maacutes tiempo en generar hojas nuevas es por ello que al finalizar este estudio muestran el menor nuacutemero final de hojas 412 Efecto del tipo de sustrato Al analizar la influencia del tipo de sustrato se encontraron diferencias significativas entre los tres sustratos utilizados Seguacuten el Cuadro 2 y la Figura 5 el sustrato donde se obtuvo mejores resultados fue
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turba+perlita en el cual se observoacute un promedio de 53 hojas por plaacutentula siendo Sphagnum el maacutes bajo con 43 hojas por plaacutentula De acuerdo a los resultados del anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados el sustrato turba+perlita tiene mayor cantidad de nitroacutegeno foacutesforo calcio magnesio y azufre disponible comparativamente con los otros dos sustratos (Sphagnum y arena+turba) (Anexo 2)
Hojas finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
Sustratos
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) Para la brotacioacuten y el crecimiento de las plantas se necesita agua y Nitroacutegeno lo que favorece a una mayor tasa de aparicioacuten de hojas lo que se traduce en una mayor cantidad de hojas finales El Nitroacutegeno se encuentra en mayor cantidad en el sustrato turba+perlita debido a lo cual los mejores resultados se obtienen en dicho sustrato 413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Despueacutes de analizados los efectos individuales del tamantildeo y del sustrato al interactuar ambos factores existen diferencias significativas La mejor interaccioacuten se obtuvo con el sustrato turba+perlita y con el mayor tamantildeo de la plaacutentula (Figura 6) Debido a la buena estructura (porosa) de dicho sustrato se podriacutea decir que se favorecioacute la absorcioacuten radicular de nutrientes obteniendo por ello un mayor nuacutemero de hojas finales Para los menores tamantildeos no se observan diferencias significativas obteniendo como promedio 41 hojas por plaacutentula Para el mayor tamantildeo el promedio fue de 6 hojas por plaacutentula
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Hojas finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 42 Raiacuteces iniciales Este paraacutemetro se evaluoacute luego de la primera etapa de aclimatacioacuten la cual se realizoacute en una sala de aclimatacioacuten del laboratorio Se analizoacute la influencia de diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos sobre la variable nuacutemero raiacuteces iniciales (Anaacutelisis de Kruskal-Wallis en Anexo 7)
FIGURA 7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses de pre aclimatacioacuten
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En la Figura 7 se puede observar los resultados de pre aclimatacioacuten en sala de laboratorio En esta etapa ya es posible ver la presencia de raiacuteces desarrolladas 421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula En el Cuadro 2 se puede observar que las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero inicial de raiacuteces y en la Figura 8 se puede comprobar que para los dos tamantildeos de plaacutentula maacutes pequentildeos no se observa gran cantidad de raiacuteces esto no impidioacute el desarrollo posterior de las plaacutentulas las cuales lograron enraizar al final del estudio Esto se contrapone a lo observado en un estudio de Lapageria rosea donde la presencia de raiacutez y brote para lograr una multiplicacioacuten exitosa de plantas es de vital importancia Incluso algunas plaacutentulas de L rosea no brotan en condiciones in vitro en donde tienen las mejores condiciones nutricionales y hormonales para hacerlo Esto se debe a factores internos de la plaacutentula siendo muy difiacutecil que broten inmediatamente en caacutemara de aclimatacioacuten donde ya dejan de recibir los nutrientes necesarios de manera directa y requieren de balances de energiacutea para poder seguir elongando raiacuteces absorber nutrientes y brotar para poder obtener los carbohidratos necesarios para seguir su crecimiento (BLANCO 2006) El tamantildeo de plaacutentula tiene importancia para el desarrollo de raiacuteces se distingue notoriamente que en los tamantildeos maacutes grandes el nuacutemero de raiacuteces es mayor comparativamente con los tamantildeos pequentildeos donde el nuacutemero de raiacuteces fue escaso Debido a la presencia de maacutes hojas existe una mayor cantidad de aacuterea fotosinteacutetica esta situacioacuten estimula el crecimiento de las raiacuteces para la obtencioacuten de agua y nutrientes
Raices iniciales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
2
4
6
8
10
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o inicial de ra
iacuteces
FIGURA 8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn)
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422 Efecto del tipo de sustrato Para el sustrato turba+perlita se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas en el nuacutemero de raiacuteces con respecto a los dos otros sustratos esto se puede ver en el Figura 9 donde se observa que se obtuvieron los mayores resultados En cualquier medio de crecimiento el espacio no ocupado por un soacutelido se llama porosidad este espacio puede ser ocupado en parte para retener agua y en parte para proporcionarle aire a las raiacuteces La ausencia de uno de estos elementos es perjudicial para las plantas La turba es conocida por tener estas propiedades y la perlita tambieacuten por esta razoacuten se sabe que la mezcla turba-perlita provee propiedades fiacutesicas excelentes como medio de crecimiento y propagacioacuten (INFOAGRO 2007) Estos resultados con turba-perlita (298 de materia orgaacutenica) coinciden con los obtenidos por DIAZ et al (2004) quienes al utilizar un sustrato compuesto por 100 de humus de lombriz para aclimatar cantildea de azuacutecar obtuvieron el mayor nuacutemero de raiacuteces Esto puede atribuirse al importante aporte de materia orgaacutenica del humus (47) lo que le confiere una mejor estructura obtenieacutendose una excelente porosidad del sustrato La aireacioacuten del suelo es necesaria para favorecer la maacutexima absorcioacuten de nutrientes por las raiacuteces Esto tambieacuten sucede en el sustrato turba+perlita el cual posee la mayor cantidad de materia orgaacutenica de los tres sustratos utilizados
Raices iniciales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
2
4
6
8
10
Sustratos
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato En los anaacutelisis para la variable nuacutemero de raiacuteces se puede decir que la mejor interaccioacuten se presentoacute para el sustrato de turba+perlita junto con el mayor tamantildeo de plaacutentulas obteniendo los valores maacutes altos entre los nueve tratamientos La presencia de raiacuteces luego de la micropropagacioacuten aumenta la posibilidad de eacutexito en el transplante ya que se crea un favorable balance de agua Pero esto no quiere
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decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
10
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
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En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
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El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
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Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
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Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
V
INDICE DE FIGURAS
Figura Paacutegina
1 C virescens 7
2 Plaacutentulas de C virescens en caacutemara de crecimiento in vitro 20
3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS
B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten 24
4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) 26
5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final
de hojas (Test de Dunn) 27
6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 28
7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses
de pre aclimatacioacuten 28
8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 29
9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final
de raiacuteces (Test de Dunn) 30
10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no
parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 31
11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses
de aclimatacioacuten 31
12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 32
13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final
de raiacuteces (Test de Dunn) 33
14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre para la variable no
parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 34
15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) 35
VI
16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable
parameacutetrica altura final de plaacutentulas 35
17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) 37
18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la
variable parameacutetrica de sobrevivencia 37
VII
INDICE DE ANEXOS
Anexo Paacutegina
1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962)
y suplementos orgaacutenicos 44
2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio 45
3 Registro de temperaturas miacutenimas maacutexima y promedio durante
el estudio 46
4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas
finales 47
5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales 47
6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces
iniciales 48
7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces
iniciales 48
8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces
finales 49
9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales 49
10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en
aclimatacioacuten 50
11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura 50
12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de
plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten 51
13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia 51
14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea 52
1
RESUMEN Dentro del esquema de micropropagacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens la aclimatacioacuten es la etapa final donde la manipulacioacuten debe ser muy cuidadosa ya que es donde se produce el mayor iacutendice de mortandad principalmente en el proceso de trasplante Esta etapa es muy importante ya que gracias a ella se veraacute la eficiencia del proceso y la calidad final de las plantas producidas in vitro por eso el objetivo general de este trabajo es evaluar la influencia del tamantildeo de plaacutentulas y utilizacioacuten de distintos sustratos en la aclimatacioacuten ex vitro de plaacutentulas de C virescens Se utilizaron plaacutentulas de Chloraea virescens obtenidas a partir de la micropropagacioacuten de protocormos provenientes de germinacioacuten asimbioacuteticas de semillas efectuada en el laboratorio de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal de la Universidad Austral de Chile Las plaacutentulas fueron repicadas hasta obtener el nuacutemero adecuado para el ensayo Luego fueron trasladadas a una sala del laboratorio en macetas de seis ocho y diez plaacutentulas dependiendo del tamantildeo de la plaacutentula (maacutes de 3cm 2-3cm y 1-2cm respectivamente) por dos meses posteriormente fueron transferidas a 3 sustratos turba+perlita (11) Sphagnum y turba+arena (11) y fueron llevadas a invernadero durante cuatro meses Las variables evaluadas fueron nuacutemero final de hojas nuacutemero inicial y final de raiacuteces altura y sobrevivencia de las plaacutentulas Los resultados obtenidos demostraron que los tamantildeos y los sustratos ocupados influyen en el crecimiento de las plaacutentulas El mejor tamantildeo para la aclimatacioacuten es de maacutes de 3cm obteniendo con eacuteste los mejores resultados en todas las variables evaluadas Lo mismo ocurrioacute con el sustrato turba+perlita el cual fue el mejor evaluado
2
REacuteSUMEacute Dans le scheacutema de la micropropagation de Chloraea virescens lacclimatation est la derniegravere eacutetape ougrave il faut ecirctre prudent parce que cest agrave ce moment lagrave que les taux de mortaliteacute sont les plus eacuteleveacutes principalement dans le processus de transplantation Cette eacutetape est tregraves importante parce que ce sera gracircce agrave elle quacuteon verra lefficaciteacute du processus et la qualiteacute finale des plantes produites in vitro Lobjectif geacuteneacuteral de cette eacutetude est dacuteeacutevaluer linfluence de la taille des plantes et lutilisation de divers substrats pour lacuteacclimatation de C virescens On a utiliseacute des plantes de C virescens obtenue a partir de la micropropagation de protocormos en provenance du laboratoire de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal de la Universidad Austral de Chile Les plantes ont eacuteteacute subdiviseacutee pour obtenir le nombre approprieacute Elles ont ensuite eacuteteacute transfeacutereacutees agrave des pots dans une piegravece du laboratoire de six huit et dix en fonction de la taille de la plante (plus de 3 cm de 2-3 cm et 1-2 cm respectivement) pour deux mois ensuite elles ont eacuteteacute transfeacutereacutee dans trois substrats tourbe + perlite (11) Sphagnum et tourbe + sable (11) et elles ont eacuteteacute mises dans une serre pour quatre mois Les variables agrave eacutevaluer sont nombre final de feuilles nombre de racines au deacutebut et agrave la fin la hauteur et la survie des plantes Les reacutesultats ont montreacute que la taille et les substrats utiliseacutes ont une influence sur la croissance des jeunes plantes La taille ideacuteale pour lacclimatation est plus de 3cm avec cette derniegravere on a obtenu les meilleurs reacutesultats dans toutes les variables qui ont eacuteteacute eacutevalueacutees Le mecircme reacutesultat sest produit avec le substrat de tourbe + perlite lequel a aussi montreacute les meilleurs reacutesultats
3
1 INTRODUCCION La familia Orchidaceae (Orquiacutedeas) es la que mayor nuacutemero de especies comprende en el Reino Vegetal Se estima que debe haber alrededor de 35000 especies de Orquiacutedeas en todo el mundo pertenecientes a unos 750 geacuteneros ademaacutes de miles de hiacutebridos En Chile esta familia es probablemente el grupo menos estudiado de plantas con flores y soacutelo se han realizado estudios en base a su taxonomiacutea biologiacutea reproductiva fenologiacutea y distribucioacuten
La produccioacuten de flores de orquiacutedeas ha tomado importancia por la belleza de sus flores dada la enorme variedad de formas colores y perfumes Existen orquiacutedeas terrestres y epiacutefitas estas uacuteltimas representan maacutes del 90 del total de especies y son las que mayoritariamente se encuentran a la venta Las flores tienen un alto valor ornamental o como flor cortada ya que eacutestas pueden permanecer separadas de las plantas sin marchitarse hasta tres o cuatro semanas y en la planta permanecen hasta tres meses
La obtencioacuten de plantas de orquiacutedeas a partir de semillas es muy difiacutecil ya que eacutestas son diminutas y de germinacioacuten irregular Como una alternativa de obtencioacuten de plantas aparece la micropropagacioacuten pudiendo asiacute aumentar el nuacutemero de plantas en forma relativamente faacutecil y raacutepida Luego de la etapa de micropropagacioacuten viene la etapa de aclimatacioacuten en la cual la manipulacioacuten debe ser en extremo cuidadosa ya que es donde se produce el mayor iacutendice de mortandad principalmente en el proceso de transplante Esta etapa es muy importante ya que gracias a ella se veraacute la eficiencia del proceso y la calidad final de las plantas producidas in vitro Considerando la produccioacuten de plaacutentulas mediante la micropropagacioacuten en este trabajo se plantea la hipoacutetesis que ldquoel tamantildeo de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro y los distintos sustratos son factores que inciden en el desarrollo y su aclimatacioacutenrdquo El objetivo general de este trabajo es
Evaluar la influencia del tamantildeo de plaacutentulas y utilizacioacuten de distintos sustratos en la aclimatacioacuten ex vitro de plaacutentulas de C virescens
Los objetivos especiacuteficos son
Medir el efecto del tamantildeo de plaacutentulas de C virescens en la sobrevivencia y desarrollo de eacutestas ex vitro
Comparar el uso de tres sustratos en el desarrollo y sobrevivencia de plaacutentulas de C virescens
4
2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA 21 Descripcioacuten general 211 Descripcioacuten geograacutefica Las orquiacutedeas pertenecen a la familia Orchidaceae clase Liliopsida (monocotiledoacuteneas) Son plantas herbaacuteceas perennes originarias de regiones tropicales y subtropicales pero existen tambieacuten en todos los continentes a excepcioacuten de las regiones polares La zona donde se encuentran estas plantas estaacute comprendida entre los 68ordm latitud norte y 56ordm latitud sur Es evidente que en los liacutemites extremos de estas latitudes se encuentran pocos geacuteneros y especies esto va en aumento desde las regiones temperadas hasta las regiones intertropicales donde el nuacutemero es el mayor Los territorios maacutes interesantes por su nuacutemero son
Ameacuterica del Sur y Ameacuterica Central Asia e India Madagascar Australia es el continente menos poblado en orquiacutedeas dentro de las regiones
del globo Por su parte Europa presenta numerosos geacuteneros y especies de orquiacutedeas
terrestres Soacutelo en Francia existen 75 especies repartidas en 16 geacuteneros todas terrestres (LECOUFLE y ROSE 1956)
212 Formas de vida Las zonas donde crecen estas plantas influyen sobre su manera de vivir Algunas orquiacutedeas son terrestres y se encuentran representadas en todas las regiones Tambieacuten existen las epiacutefitas (vegetal que fijado a otro no obtiene de eacuteste su alimento) En este caso se necesita que el grado higromeacutetrico y la temperatura permitan este tipo de adaptacioacuten Ademaacutes existen las orquiacutedeas litofiacuteticas que viven sobre rocas Las raiacuteces de las epiacutefitas y litofiacuteticas estaacuten adaptadas a vivir expuestas al aire o inmersas en materia orgaacutenica ya que tienen un tejido acumulador de agua llamado velo En zonas friacuteas y templado friacuteas todas las orquiacutedeas son terrestres En zonas subtropicales o tropicales la gran mayoriacutea es epiacutefita Otra particularidad debida seguramente a la influencia de estas zonas es la floracioacuten Es en las zonas tropicales y subtropicales que se dan los mayores tamantildeos de flores asiacute como tambieacuten la mayor variedad de colores (LECOUFLE y ROSE 1956)
213 Descripcioacuten morfoloacutegica Las orquiacutedeas se caracterizan por poseer flores muy vistosas hermafroditas (ambos sexos en la misma flor) zigomorfas (con un solo plano de simetriacutea) triacutemeras (tres seacutepalos y tres peacutetalos) y una columna central que sustenta las estructuras reproductivas masculinas anteras y femeninas pistilo llamada ginostemo El peacutetalo inferior se llama labelo y su morfologiacutea define a los distintos geacuteneros de orquiacutedeas Las flores pueden ser aisladas o en inflorescencia y son polinizadas por insectos El polen se encuentra aglomerado formando una masa llamada polinio el que tiene un extremo con un ensanchamiento glandular pegajoso que sirve para que el
5
polinio se adhiera al cuerpo del insecto polinizador El fruto es una caacutepsula seca con muchas semillas pequentildeas sin endosperma y con embrioacuten no diferenciado Tienen dos tipos baacutesicos de crecimiento Simpodial en las que el nuevo crecimiento se produce en sentido horizontal a partir de un tallo subterraacuteneo o rizoma generando una sub-unidad capaz de producir una flor o inflorescencia y de ser eventualmente separada de la planta (ej Cattleya) Monopodial en las que el nuevo crecimiento se produce en sentido vertical con lo cual la planta crece constantemente en altura (ej Phalaenopsis) (ORQUIDEAS 2007) 214 Geacuteneros y especies chilenas Seguacuten NOVOA et al (2006) en la familia Orchidaceae se encuentran 49 especies de flora nativa dentro de las cuales se encuentra Chloraea virescens (Willd) Lindl Los geacuteneros de Orchidaceae en Chile son 7
- Aa Bipinnula Brachystele Codonorchis Chloraea Gavilea y Habenaria
Dentro del geacutenero Chloraea existen 31 especies - Chloraea alpina Poepp - Chloraea barbata Lindl - Chloraea bidendata (Poepp y Endl) Correa - Chloraea bletioides Lindl - Chloraea cuneata Lindl - Chloraea chica Speg - Chloraea chrysantha Poepp - Chloraea crispa Lindl - Chloraea cristata Lindl - Chloraea cylindrostachya Poepp - Chloraea disoides Lindl - Chloraea galeata Lindl - Chloraea gaudichaudii Brongn - Chloraea gavilu Lindl - Chloraea grandiflora Lindl - Chloraea heteroglossa Rchbf - Chloraea incisa Poepp - Chloraea lamellata Lindl - Chloraea lechleri Lindl - Chloraea leptopetala Reiche - Chloraea longipetala Lindl - Chloraea magellanica Hookf - Chloraea multiflora Lindl - Chloraea nudilabia Lindl - Chloraea philippii Reichbf - Chloraea picta Phil - Chloraea prodigiosa Reichbf - Chloraea speciosa Poepp - Chloraea virescens Lindl - Chloraea viridiflora Poepp
6
- Chloraea volkmanni Phil (NOVOA et al 2006) 2141 Chloraea virescens Planta perenne de 40-90 cm de altura Sus hojas son de 5-12cm de largo por 15-25cm de ancho estrechas lanceoladas agudas dispuestas en roseta basal generalmente marchitas al final de la antesis Su escapo floral tiene vainas caulinares lanceoladas agudas y distantes La inflorescencia es de 8-20cm de largo densa con 10-15 flores erguidas Sus flores son blancas con estriacuteas y aacutepices verdes El seacutepalo dorsal es de 16-33mm de largo por 4-6mm de ancho oblongo lanceolado obtuso algo coacutencavo a veces ligeramente estrechado al centro aacutepice algo carnoso Los seacutepalos laterales de 18-33mm de largo por 4-5mm de ancho son ensiformes con aacutepice obtuso engrosado verde negruzco a veces espatulado y dentado a veces verrugoso Los peacutetalos son de 15-23mm de largo por 5-58mm de ancho estrechamente aovados obtusos verrugosos con maacutes frecuencia solo la mitad inferior a veces el borde denticulado y carnoso El labelo de 15-26mm de largo por 10-20mm de ancho es mas o menos romboidal a levemente trilobulado El loacutebulo central tiene 5-7 nervios longitudinales recorridos por laminillas interrumpidas membranaacuteceas con segmentos falciformes de borde carnoso de color verde Los nervios laterales que se ramifican oblicuamente hacia el aacutepice en los loacutebulos laterales tienen pequentildeas laminillas y verrugas y su borde es laciniado inciso en la mitad apical hacia la base denticulado aacutepice generalmente engrosado La columna es de 12-18mm de largo delgada blanca con estriacuteas anaranjada La base de la zona nectariacutefera tiene un color amarillo-limoacuten con maacuteculas anaranjadas orificio nectario verde El ala de la columna es recta y estrecha El estigma es triangular y globoso La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la Vordf (Vintildea del Mar) hasta la XIordf Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile Sin embargo es posible que tenga una distribucioacuten maacutes restringida por que se le ha confundido con Chloraea incisa Su floracioacuten es desde noviembre a febrero y su estado de conservacioacuten no estaacute evaluado (NOVOA et al 2006) En el Anexo 14 se incluyen antecedentes sobre su distribucioacuten y eacutepoca de floracioacuten
7
FIGURA 1 Chloraea virescens FUENTE NOVOA et al (2006) 22 Requerimientos de las orquiacutedeas Para tener eacutexito en el cultivo de orquiacutedeas hay que tomar en cuenta factores de importancia como son 221 Agua El riego correcto es el principio y el fin del cuidado de orquiacutedeas (ROLLKE 2005) Este elemento es primordial para las orquiacutedeas asiacute como tambieacuten para todo tipo de plantas En el caso de eacutestas se dice muchas veces que la calidad del agua usada es el factor maacutes importante en el cultivo de orquiacutedeas ya que el porcentaje maacutes alto de muerte se produce por el exceso de este factor (SHEEHAN 1980) Hay que tomar en cuenta que la mayoriacutea de las orquiacutedeas son epiacutefitas lo que significa que tienen sus raiacuteces a la vista gracias a las cuales absorben el agua de lluvia Se recomienda un sustrato poroso y de reaccioacuten neutra ya que de esta manera el agua escurre sin acumularse no permitiendo la pudricioacuten de las raiacuteces Para las orquiacutedeas terrestres es lo mismo solo que se pueden regar con maacutes frecuencia pero sin mantenerlas saturadas (OSPINA y DRESSLER 1979) Seguacuten DUMOIS (2007) el agua es lo maacutes difiacutecil de controlar ya que depende de muchas variables como por ejemplo humedad relativa tipo de sustrato intensidad luminosa temperatura y circulacioacuten de aire Ademaacutes muchas orquiacutedeas necesitan un periacuteodo de receso vegetativo que si no es respetado resulta en ausencia de floracioacuten En general hay que antildeadir agua en abundancia cuando la planta se encuentra en crecimiento activo y reducirla despueacutes de la floracioacuten
8
Las especies con pseudobulbos almacenan agua y estaacuten preparadas para su periacuteodo de receso Otras que no cuentan con estos oacuterganos requieren de humedad maacutes constante 222 Luz Ninguna planta puede crecer sin la iluminacioacuten adecuada Muchas orquiacutedeas viven en las alturas de los aacuterboles y estaacuten expuestas a plena luz del sol otras crecen en el suelo selvaacutetico protegidas del sol por espesos follajes (ROLLKE 2005) La funcioacuten principal de la luz es activar el proceso de fotosiacutentesis Los cultivadores han estudiado la luz y han descubierto que hay orquiacutedeas que florecen con diacutea largo y otras con diacutea corto (OSPINA y DRESSLER 1979) Gracias a la fotosiacutentesis se convierten los minerales presentes en el ambiente en savia y nutrientes Hojas oscuras y falta de floracioacuten indican falta de luz hojas amarillas e incluso quemadas apuntan hacia un exceso de sol (DUMOIS 2007) 223 Fertilizacioacuten Las orquiacutedeas necesitan los mismos nutrientes que otras plantas Un abono para orquiacutedeas debe contener los nutrientes principales nitroacutegeno (N) foacutesforo (P) y potasio (K) asiacute como tambieacuten oligoelementos como hierro (Fe) magnesio (Mg) zinc (Zn) estantildeo (Sn) y manganeso (Mn) (ROLLKE 2005) Por otra parte la fertilizacioacuten depende de varios factores dentro de los cuales los maacutes criacuteticos son
- El medio utilizado - La edad de las plantas - Estado de las plantas ya sea floracioacuten crecimiento reposo
En cuanto a absorcioacuten se ha demostrado que es igual de eficiente por viacutea foliar como a traveacutes de las raiacuteces Es necesario tener en cuenta algunas reglas baacutesicas a la hora de fertilizar las orquiacutedeas (Asociacioacuten Costarricense de Orquideologiacutea ACO 1970)
1 Regar las plantas antes de fertilizar 2 Fraccionar las dosis 3 Aplicar el fertilizante de forma liacutequida 4 No usar fertilizantes soacutelidos 5 No fertilizar las plantas recieacuten plantadas 6 No fertilizar plantas en reposo 7 No abonar plantas enfermas
224 Temperatura Es conocido el hecho de que cada planta tiene liacutemites de temperatura dentro de los cuales prospera o perece De ahiacute la necesidad de conocer las temperaturas correspondientes al lugar de donde viene cada especie de orquiacutedea pudiendo proporcionarle la temperatura adecuada (OSPINA y DRESSLER 1979) Se puede clasificar a las orquiacutedeas como de clima caacutelido (temperatura nocturna miacutenima de 20ordmC) templado (miacutenimo de 13 a 18ordmC) y de ambiente friacuteo (de 10 a 13ordmC) (DUMOIS 2007)
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Seguacuten SHEEHAN (1980) las temperaturas ideales para las orquiacutedeas de origen tropical son 10ordmC en la noche y entre 21ordm - 24ordmC durante el diacutea 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas La micropropagacioacuten de orquiacutedeas estaacute en vanguardia hoy en diacutea El estudio de cultivo de tejido de orquiacutedeas se lleva a cabo en muchos laboratorios de todo el mundo (ARDITTI and ERNST 1992) 231 Biologiacutea de las semillas Las semillas de orquiacutedeas son conocidas usualmente como semillas polvo porque son minuacutesculas y contienen pocas reservas de alimento Estas semillas por lo general no germinan en el medio natural a menos que sean infectadas por un hongo micorriacutezico Este hongo abastece a las plantas joacutevenes con azuacutecares y nutrientes hasta que sean lo suficientemente grandes para fabricar su propio alimento Cuando la semilla germina produce una masa indiferenciada de ceacutelulas llamada protocormo Manteniendo las condiciones normales el protocormo continuaraacute su crecimiento por varias semanas meses o incluso antildeos dependiendo de la especie hasta que alcance la edad apropiada para producir raiacuteces y hojas En el caso de orquiacutedeas terrestres es de vital importancia que la relacioacuten orquiacutedea-hongo se conserve durante los estados tempranos del ciclo de vida de la planta ya que el protocormo enterrado no puede fabricar alimento por siacute mismo Por otro lado los protocormos de las orquiacutedeas epiacutefitas son comuacutenmente verdes lo que les posibilita producir parte de su alimento La relacioacuten orquiacutedea-hongo no ha sido en su totalidad investigada para el caso de las orquiacutedeas tropicales (McKENDRICK 2000) 232 Germinacioacuten simbioacutetica y no simbioacutetica de semillas Mediante la germinacioacuten in vitro las semillas germinan en frascos de vidrio o plaacutestico Estos frascos contienen en su interior un medio nutritivo solidificado con agar con todos los azuacutecares y minerales necesarios para la germinacioacuten y crecimiento de las semillas Hay dos tipos de germinacioacuten la simbioacutetica y la asimbioacutetica En la germinacioacuten simbioacutetica las semillas se siembran junto con una pequentildea cantidad del hongo micorriza adecuado Dicho hongo crece en el medio coloniza a las semillas que estaacuten en proceso de germinacioacuten y se produce una relacioacuten simbioacutetica la cual alimentaraacute al protocormo hasta que este sea capaz de producir sus hojas y se vuelva autotroacutefico Esta teacutecnica es usada principalmente en propagacioacuten de orquiacutedeas terrestres en zonas templadas La germinacioacuten asimbioacutetica se usa principalmente en propagacioacuten de orquiacutedeas tropicales que crecen maacutes raacutepido que sus parientes de zonas templadas Para este tipo de germinacioacuten se necesita un medio de cultivo maacutes complejo ya que todos los nutrientes orgaacutenicos e inorgaacutenicos asiacute como tambieacuten los azuacutecares deben estar en forma disponible pues no existe la intermediacioacuten del hongo (McKENDRICK 2000) 233 Condiciones de esterilidad Tanto para la germinacioacuten simbioacutetica como para la asimbioacutetica es de vital importancia que los frascos las semillas aparatos y el medio esteacuten esteacuteriles desde el principio del proceso Esto debido a que cualquier hongo o bacteria que se introduzca creceraacute maacutes raacutepido que las semillas ocupando su espacio hasta matarlas Esto se evita gracias al autoclave el cual regulado a 12 atm y 120ordmC por 20 minutos mata hongos o bacterias presentes en el medio (McKENDRICK 2000)
10
2331 Siembra de las semillas Las semillas pueden ser recolectadas desde caacutepsulas verdes o maduras La caacutepsula verde que estaacute madurando estaacute llena de semillas y no se deforma cuando se aprieta con las pinzas Estas semillas pueden ser almacenadas por algunas semanas en un lugar refrigerado con bastante aireacioacuten Las semillas se pueden sembrar a partir de caacutepsulas verdes o semillas secas A continuacioacuten se muestran las ventajas y desventajas de ambos meacutetodos
- Siembra a partir de caacutepsulas verdes Si las caacutepsulas se mantienen intactas el interior (las semillas) se mantiene esteacuteril Por lo tanto si se esteriliza la parte exterior de las mismas donde hongos y bacterias pueden desarrollarse y se abren las caacutepsulas bajo condiciones esteacuteriles y las semillas podraacuten mantenerse desinfectadas
La ventaja de este meacutetodo es que no se requiere de esterilizacioacuten de las semillas lo que provoca su deterioro Otro punto a favor es que algunas semillas podriacutean germinar maacutes raacutepido que las provenientes de caacutepsulas maduras por los mecanismos de dormancia La desventaja es que en este caso todas las semillas deben ser utilizadas o eliminadas mientras que las semillas maduras se pueden almacenar Tambieacuten se debe considerar que las semillas sembradas a partir de caacutepsulas que no han madurado lo suficiente podriacutean germinar lentamente o simplemente no germinar - Siembra a partir de semillas secas En este caso una vez que la caacutepsula es abierta las semillas dejan de ser esteacuteriles y requieren de un proceso de esterilizacioacuten Comuacutenmente se utiliza una solucioacuten de hipoclorito de sodio hipoclorito de calcio o peroacutexido de hidroacutegeno Las semillas se agitan dentro de la solucioacuten que ademaacutes contiene una gota de detergente para ldquohumedecerlasrdquo luego se las enjuaga con agua destilada y se las siembra en el medio preparado La ventaja de este meacutetodo es que las semillas pueden ser colectadas secadas al aire almacenadas por varios meses en el refrigerador y utilizarlas cuando sea necesario Se debe considerar que la siembra ya sea de caacutepsulas verdes o de semillas secas estaacute determinado por la eacutepoca en que se colectan (McKENDRICK 2000) 234 Trasplante En la caacutemara de incubacioacuten las plaacutentulas se han desarrollado en condiciones limpias y en un ambiente cerrado por lo que deben acostumbrase gradualmente al ambiente exterior antes de ser trasplantadas a las macetas Tambieacuten la temperatura y la luz la cual es baja han sido constantes durante el cultivo in vitro En el medio natural la temperatura y la luz variacutean constantemente por lo que las nuevas plantas deben estar protegidas de la fuerte luz solar la cual puede quemar las hojas con soacutelo una pequentildea cantidad de eacutesta La humedad en los frascos es alta y las plantas estaacuten protegidas de ataques por hongos o bacterias Ademaacutes las plaacutentulas han crecido bajo condiciones de alta humedad y por lo tanto tendraacuten cutiacuteculas deacutebiles por lo que necesitan acostumbrase a medios menos huacutemedos antes de ser transplantadas
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Para el trasplante se deben colocar los frascos en un lugar protegido de la lluvia para que se aclimaticen a las nuevas condiciones de luz y temperatura Se deben dejar por 2 a 4 semanas en los frascos tapados Luego se debe ir aflojando las tapas para dejar entrar pequentildeas cantidades de aire hasta el punto de dejarlas descubiertas Se debe revisar si hay hojas marchitas y ver que el sustrato esteacute huacutemedo
Lo ideal es dejarlas sin tapa durante una semana antes de pasarlas a las macetas Para el trasplante se debe elegir un sustrato adecuado para el tipo de planta humedecerlo y transplantar las plantas con cuidado de no dantildear las raiacuteces y evitando la deshidratacioacuten En esta etapa tambieacuten se debe dejar las macetas selladas para evitar una raacutepida deshidratacioacuten e ir abrieacutendolas paulatinamente (McKENDRICK 2000)
24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas 241 Orquiacutedeas terrestres 2411 Cypripedium Esta es una orquiacutedea terrestre de zonas templadas se desarrolla en el Hemisferio Norte como por ejemplo en Guatemala y en Honduras pero donde se encuentra principalmente es en China Su forma maacutes comuacuten de propagacioacuten es in vitro a partir de semillas La forma maacutes eficiente es a partir de semillas inmaduras Existe un intervalo de tiempo entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten eacuteste dependeraacute de la especie y de la zona donde se desarrolle Se asume que existen aproximadamente cuatro semanas entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten El oacuteptimo para una buena germinacioacuten de Cypripedium es entre 42 y 60 diacuteas despueacutes de la polinizacioacuten y entre 14 y 32 diacuteas despueacutes de la fertilizacioacuten La germinacioacuten ocurre entre la segunda y cuarta semana despueacutes de ser sembradas y los protocormos deberiacutean ser cambiados de medio de cultivo cada dos a cuatro meses si no se corre el riesgo de sufrir agotamiento de nutrientes Los rizomas y las raiacuteces se empiezan a desarrollar a partir de los siete meses para luego dar lugar a las primeras hojas Para obtener un buen transplante se deben tener raiacuteces de miacutenimo un centiacutemetro de largo El desarrollo de raiacuteces se ve potenciado al tener un periacuteodo corto de bajas temperaturas (10degC) exposicioacuten a la luz reduccioacuten en la concentracioacuten de iones del medio de cultivo o transferirlas a un compost esteacuteril Al tener raiacuteces suficientes y el tamantildeo adecuado se podraacuten llevar las plantas al lugar donde creceraacuten definitivamente En el momento del transplante las plantas son muy susceptibles al desecamiento por lo cual lo ideal es que los brotes sean maacutes chicos que las raiacuteces El mejor sustrato seriacutea aquel donde crece naturalmente la orquiacutedea (RAumlNNBAumlCK 2007) 2412 Preservacioacuten in vitro de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes Este estudio fue hecho para establecer que parte de tejido es viable para la micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes del noreste de Europa pudiendo asiacute reestablecer dichas orquiacutedeas a sus aacutereas correspondientes La propagacioacuten in vitro de orquiacutedeas
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terrestres de clima templado es maacutes difiacutecil que las orquiacutedeas epiacutefitas de clima subtropical y tropical Las orquiacutedeas terrestres tienen requerimientos maacutes estrictos que las epiacutefitas y se conoce menos sobre sus necesidades especiacuteficas (VAASA y ROSENBERG 2004) En Estonia existen 36 especies de orquiacutedeas terrestres pero solo tres estaacuten bajo proteccioacuten Dactylorhiza baltica Dactylorhiza ruthei Dactylorhiza praetermissa Como explantes para este estudio en el caso de D baltica se ocuparon protocormos en los otros dos casos se utilizaron semillas semi maduras las cuales fueron colectadas siete y diez semanas despueacutes de ser polinizadas Para D baltica se ocupoacute el medio Murashige y Skoog suplementado con 05 mgL de aacutecido naftaleacuten aceacutetico (ANA) y 2 mgL de isonpentenyl adenina Para el caso de las semillas semi maduras se ocuparon los medios de Lindemann de Heller de Norstog y de Murashige y Skoog como control
La composicioacuten del medio y la madurez de las semillas influye mucho en el desarrollo de las orquiacutedeas in vitro Se ha demostrado que se necesita una alta concentracioacuten de microelementos para obtener una correcta germinacioacuten de las semillas Tambieacuten se puede decir que los primeros tres meses son los de mayor crecimiento luego de este tiempo el crecimiento se vuelve maacutes lento (VAASA y ROSENBERG 2004)
Luego de cuatro semanas de crecimiento de D baltica el 60 de los explantes de meristemas apicales empezaron a crecer en cambio los de meristemas laterales no expresaron ninguacuten tipo de crecimiento Las raiacuteces empezaron su desarrollo luego de dos meses despueacutes de la siembra
En el caso de D ruthei y D praetermissa la germinacioacuten se produjo despueacutes de dos meses desde la inoculacioacuten Luego de cuatro y seis meses el mayor crecimiento fue observado en el medio Norstog superando en 14 al medio testigo Murashige y Skoog (VAASA y ROSENBERG 2004)
2413 Longevidad de semillas de orquiacutedeas terrestres Por lo general las orquiacutedeas producen muchas pero pequentildeas semillas que contienen muy pocas reservas de alimento Dichas semillas estaacuten estructuralmente adaptadas para ser dispersadas por el viento pero poco se sabe del destino de eacutestas luego de ser dispersadas Algunos estudios de viabilidad de semillas indican una sobrevivencia de uno a dos antildeos en orquiacutedeas de clima templado Las semillas que son guardadas en laboratorio duran mucho maacutes tiempo Se estudioacute la viabilidad de siete especies de orquiacutedeas norteamericanas dentro de las cuales se encuentran Goodyera pubescens y Liparis liliifolia Las semillas de eacutestas se colocaron en bolsas con suelo y sustratos de bosques provenientes de sus haacutebitats naturales (WHIGHAM et al 2005) En Goodyera pubescens la mayoriacutea de las semillas germinaron en un antildeo Cuatro otras especies germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero algunas semillas no germinadas despueacutes de siete antildeos seguiacutean siendo viables En la especie Liparis liliifolia semillas que han estado cuatro antildeos bajo observacioacuten han tenido una tasa de
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germinacioacuten de un 68 al ser sembradas in vitro junto con el hongo micorriacutezico adecuado Las dos especies restantes no germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero las semillas fueron evaluadas como intactas y testeadas positivamente en cuanto a su viabilidad despueacutes de cuatro antildeos en el suelo Estas observaciones fueron interpretadas como diferentes estrategias para especies especiacuteficas de germinacioacuten in situ (WHIGHAM et al 2005) 2414 Sobrevivencia de orquiacutedeas terrestres transplantadas a sectores urbanos La conservacioacuten de poblaciones de orquiacutedeas silvestres depende del establecimiento de las orquiacutedeas propagadas a los campos Sin embargo se conoce muy poco de los factores bioacuteticos que influencian el establecimiento de orquiacutedeas terrestres a sus haacutebitats naturales Un experimento fue establecido para medir la sobrevivencia de seis especies durante su primer periacuteodo de crecimiento seguido del transplante a un sector urbano en Australia (SCADE et al 2006)
Las orquiacutedeas germinadas simbioacuteticamente crecieron en laboratorio durante cinco meses antes de establecer la plantacioacuten en sitios adyacentes con alta o baja cobertura de malezas Existioacute una muerte gradual de las plaacutentulas durante el primer periacuteodo de crecimiento primeramente por ataque de insectos no siendo evitado por la presencia de una malla cobertora Los iacutendices de sobrevivencia variacutean desde 49 para Microtis media una especie capaz de crecer en un ambiente atiacutepico hasta un 21 para Caladenia arenicola la orquiacutedea nativa maacutes comuacuten de esos sitios Sin embargo no todas las orquiacutedeas sobrevivientes producen tubeacuterculos por lo que la tasa de sobrevivencia despueacutes del primer periacuteodo seco disminuye
La sobrevivencia de las orquiacutedeas sembradas no puede ser comparada con orquiacutedeas de la misma especie que crecieron en los mismos lugares ya que no existioacute la presencia del hongo compatible para estas orquiacutedeas (SCADE et al 2006)
2415 Micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres En India dos orquiacutedeas muy importantes para la horticultura del geacutenero Anoectochilus fueron exitosamente propagadas Noacutedulos aislados de A sikkimensis colectadas en Himalaya y A regalis colectadas en India fueron cultivadas in vitro durante 12 semanas para obtener un maacuteximo de 48 a 56 protocormos y brotes obteniendo como resultado un 95 y 98 de eficiencia respectivamente Durante el repicado de los explantes in vitro de A regalis se observoacute que el nuacutemero total de brotes obtenidos a partir de noacutedulos fue 214 asiacute como tambieacuten 82 puntas de brotes En cambio para A sikkimensis fueron mucho maacutes bajos 123 y 43 respectivamente teniendo un crecimiento maacutes lento pero plantas maacutes fuertes Las raiacuteces de 4 a 6cm crecieron con la presencia de NAA (270 microM ) en el medio asiacute como tambieacuten con carbono activado (02) Durante la aclimatacioacuten la tasa de establecimiento fue entre 95 y 98 Luego de seis meses en invernadero las plantas de A regalis fueron transferidas a bosque nativo donde se obtuvo una tasa de
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sobrevivencia de entre 70 y 95 despueacutes de 12 meses Estas plantas establecidas en bosque nativo estaacuten libres de cualquier defecto morfoloacutegico y de crecimiento (GANGAPRASAD et al 2000) 242 Orquiacutedeas epiacutefitas Estas orquiacutedeas viven en los aacuterboles pero no obtienen de eacuteste su alimento no son paraacutesitas 2421 Preservacioacuten de Cattleya walkeriana usando propagacioacuten in vitro El geacutenero Cattleya se encuentra en Meacutexico y Ameacuterica Central asiacute como tambieacuten en Venezuela Colombia y las laderas de los Andes Esta orquiacutedea tambieacuten se encuentra en varias regiones del Brasil creciendo en aacuterboles rocas cerca de riacuteos lagos y pantanos Las flores de esta orquiacutedea son conocidas debido a su hermosura y a causa de la destruccioacuten de su haacutebitat y a la excesiva coleccioacuten de eacutestas se encuentra en extincioacuten
La composicioacuten del medio de cultivo es esencial para la propagacioacuten in vitro ya que suple todos los nutrientes necesarios para el desarrollo y seraacute distinto dependiendo de cada especie en este caso se utilizoacute la mitad de los macronutrientes del medio Muchos autores sugieren el uso de carboacuten activado en el medio ya que por lo general en muchas especies aumenta el desarrollo de las raiacuteces En este estudio se probaron distintas dosis de carboacuten activado 1 2 4 y 6gL con un pH de 6 (TADEU DE FARIA et al 2002) Las semillas se obtuvieron de flores artificialmente polinizadas en invernadero Plaacutentulas de aproximadamente un centiacutemetro fueron seleccionadas y cultivadas nuevamente en el medio de cultivo Murashige y Skoog pero esta vez con las diferentes dosis de carboacuten activado Se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces el nuacutemero de brotes y el peso de la materia verde total Durante el autoclavado se produce normalmente una hidroacutelisis de sacarina la cual es de 10 aproximadamente este porcentaje aumenta considerablemente al agregar un 1 de carboacuten activado llegando a ser de 95
El desarrollo de las plaacutentulas de C walkeriana aumentan con una mayor concentracioacuten de carboacuten activado asiacute como tambieacuten un mayor tiempo de cultivo El resultado fue que la dosis ideal para el desarrollo de esta orquiacutedea es 2gL de carboacuten activado (TADEU DE FARIA et al 2002) 2422 Establecimiento de cultivos in vitro y micropropagacioacuten de Cattleya aurantiaca (Bateman ex Lindl) Por medio de siembra in vitro se logroacute el establecimiento de C aurantiaca con alto porcentaje de germinacioacuten y desarrollo de protocormos Para la oacuteptima formacioacuten de callo y para la proliferacioacuten de protocormos se determinaron los medios oacuteptimos (MS 10 mgL ANA 10 mgL BA) asiacute como tambieacuten de manera directa sobre explantes de hoja y pseudobulbos (MS 01 mgL ANA 01 mgL GA3)
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Con este uacuteltimo medio tambieacuten se logroacute una oacuteptima regeneracioacuten y desarrollo de plaacutentulas Los medios liacutequidos (sin agitacioacuten) son una buena opcioacuten para conseguir la produccioacuten masiva de protocormos ya que con ellos se optimizoacute la micropropagacioacuten de C aurantiaca Las plaacutentulas micropropagadas presentaron alto porcentaje de sobrevivencia y buen desarrollo despueacutes de su trasplante y aclimatacioacuten lo cual demuestra que es un buen sistema de propagacioacuten para C aurantiaca (GUTIERREZ y SALGADO 2007) En cuanto a transplante y aclimatacioacuten despueacutes de 45 diacuteas de desarrollo in vitro las plaacutentulas de un tamantildeo entre 3 y 5 cm con raiacuteces bien desarrolladas fueron llevadas a condiciones ex vitro eliminando los restos de medio de cultivo con agua potable y ocupando un sustrato de partes iguales de tezontle y corteza de encino cubierta con hojarasca de encino finamente molida Se mantuvieron cubiertas durante 15 diacuteas abriendo cada dos diacuteas hasta poder retirar la tapa en 30 diacuteas Despueacutes de dos meses de haber sido retiradas del cultivo in vitro las plaacutentulas presentaron 70 de sobrevivencia y alcanzaron una altura de hasta 7 cm presentando nuevas hojas y raiacuteces las plantas se muestran vigorosas y capaces de continuar su crecimiento en condiciones ambientales de invernadero (GUTIERREZ y SALGADO 2007)
2423 Establecimiento in vitro y regeneracioacuten de plantas de Laelia autumnalis (Llave y Lex) Lindl Para este estudio se obtuvieron las semillas de una caacutepsula desarrollada despueacutes de 6 meses de la floracioacuten las cuales se sembraron in vitro sin presentar contaminacioacuten ya que la siembra por este meacutetodo es muy eficiente en comparacioacuten al cultivo de semillas libres donde algunas veces se presenta la contaminacioacuten Las observaciones se realizaron cada 15 diacuteas la germinacioacuten se detectoacute en los primeros 15 diacuteas en la mayoriacutea de los medios de cultivos probados con la presencia de protocormos de 1mm de diaacutemetro (HUAPEO y SALGADO 2004) El porcentaje de germinacioacuten que se obtuvo de las semillas cultivadas in vitro de L autumnalis fue de 95 a 100 en todos los medios de cultivo la uacutenica diferencia fue el tiempo entre las germinaciones A excepcioacuten de las semillas cultivadas en el medio MS 100 la germinacioacuten del 100 se obtuvo hasta los 30 diacuteas de cultivo mientras que en el primero la germinacioacuten fue a los 15 diacuteas del cultivo Las plaacutentulas con raiacutez y un par de hojas se lograron a los 90 diacuteas de cultivo en el medio MS 100 alcanzando 07 mm de altura Estas plaacutentulas fueron subcultivadas en medio MS con 05 mgl de ANA y 01 mgl de GA3 para tener plaacutentulas fuente de explante (segmentos de hojas) un medio oacuteptimo de desarrollo de plaacutentulas de L speciosa No fue necesario probar otros medios de cultivos ya que se hicieron pruebas anteriores que demostraron que era el adecuado
Las plaacutentulas de 6 meses de cultivo in vitro despueacutes de su germinacioacuten presentaron una altura promedio de 5 cm con raiacuteces con velamen y hasta dos pares de hojas Segmentos de hoja de eacutestas fueron cultivadas en el medio MS conteniendo ANA BA y GA3 en diferentes concentraciones y se realizaron observaciones cada 30 diacuteas para determinar medios inductores de callo protocormos y raiacuteces La mejor respuesta en formacioacuten de callo fue observada en los segmentos de hoja de plaacutentulas de L autumnalis cultivados en MS con 1 mgl de ANA BA y GA3 iniciando la induccioacuten de
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eacuteste desde los 30 diacuteas de cultivo solamente en un 70 de los explantes cultivados El 100 se logroacute a los 90 diacuteas de cultivo observando callo abundante alrededor de todo el tejido de color blanco con puntos pigmentados de color verde La regeneracioacuten de protocormos de esta orquiacutedea se establecioacute con la siembra de segmentos de hoja de plaacutentulas de 6 meses de edad de manera directa o a partir de callos En callos la produccioacuten fue oacuteptima en el medio MS con 01 mgl de ANABAGA3 ya que a los 60 diacuteas se obtuvieron 50 protocormos por segmento de callo Solamente se produjeron 10 protocormos por explante al cultivarse los segmentos de hoja en MS con 01 mgl de ANABAGA3 a los 120 diacuteas de cultivo (HUAPEO y SALGADO 2004) 25 Aclimatacioacuten Aclimatacioacuten significa que el hombre intercede y guiacutea el proceso de acondicionamiento de las plantas hasta que eacutestas sean aptas para crecer en el campo yo invernadero
Un alto nuacutemero de plantas micropropagadas no sobreviven al cambio desde el cultivo in vitro hacia el ambiente exterior ya sea en campo o invernadero Eacutestos dos uacuteltimos tienen menor humedad relativa niveles maacutes altos de luminosidad y un ambiente seacuteptico los cuales son maacutes estresantes para las plantas micropropagadas La mayoriacutea de las especies que crecen in vitro necesitan un proceso de aclimatacioacuten pudiendo obtener asiacute un nuacutemero suficiente de plantas vivas y vigorosas para trasplantar al suelo (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991)
La aclimatacioacuten no es uacutenicamente para micropropagacioacuten siendo usada ademaacutes en propagacioacuten convencional durante antildeos Despueacutes de cortar las hojas y de haber formado raiacuteces por lo general son aclimatadas antes de ser llevadas al campo o invernadero Ejemplos de dos teacutecnicas comunes son bajar gradualmente la humedad y mantener el nivel de luz con un 50 de sombra antes de trasladarlos al campo Las raiacuteces que han sido cortadas y mal limpiadas muchas veces son focos de infeccioacuten En estos casos las plantas muestran signos de marchitez hojas necrosadas y tambieacuten se puede llegar a la muerte de eacutestas El cultivo in vitro reduce la necesidad de fotosiacutentesis ya que las condiciones de la caacutemara de incubacioacuten proveen a la planta de sacarosa u otro azuacutecar Tambieacuten en estas condiciones se reduce el stress por patoacutegenos al ser un ambiente aseacuteptico Todo esto se traduce en que las plantas micropropagadas no son aptas para el campo yo invernadero (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 251 Stress hiacutedrico El stress hiacutedrico puede ser el resultado de una excesiva transpiracioacuten de las diferentes partes aeacutereas de las plantas especialmente de las hojas o por una inadecuada absorcioacuten de agua por parte de las raiacuteces La cutiacutecula y los estomas son la ruta primaria de peacuterdida de agua desde de las hojas provenientes de esta teacutecnica reproductiva 2511 Cutiacutecula La cutiacutecula es una membrana compuesta por una matriz de cutina que a su vez se encuentra cubierta en su superficie por ceras cuya funcioacuten primaria consiste en limitar la peacuterdida de agua por transpiracioacuten La permeabilidad del agua a traveacutes de la cutiacutecula se ve influenciada principalmente por la estructura y la cantidad de
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ceras cuticulares y epicuticulares no vieacutendose afectada la peacuterdida de agua por el grosor de eacutesta o la naturaleza quiacutemica de la matriz de la cutina La estructura cristalina de la parte encerada de las hojas es distinta en las plantas micropropagadas con respecto a las plantas que crecen en el campo La cera epicuticular de las hojas de plantas in vitro tienen una proporcioacuten maacutes alta de esteres y de componentes polares por el contrario tienen unas cadenas de hidrocarbonos mucho maacutes cortas Esto hace que las plantas in vitro pierdan maacutes agua que las cultivadas en campo o invernadero
Las plantas que han crecido en el campo son naturalmente de color verde pero el color de las plantas cultivadas in vitro es diferente y se puede ver a simple vista Las plantas que son pasadas a invernadero y que tengan un color verde se aclimatan de mejor forma al ambiente exterior (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 2512 Estomas La estructura estomaacutetica y su funcionamiento han sido implicados recurrentemente en el desbalance de agua exhibido por plantas micropropagadas al momento de ser removidas del cultivo in vitro Estudios con microscopiacutea de scanner electroacutenico han indicado que la estructura estomaacutetica presente en algunas especies de plantas cultivadas in vitro difieren marcadamente de las cultivadas en invernadero o en el suelo Debido a que las primeras presentan estomas de mayor tamantildeo y maacutes redondos a diferencia de las plantas cultivadas de manera normal que presentan estomas maacutes pequentildeos y eliacutepticos lo que resulta en una deshidratacioacuten maacutes raacutepida en el caso de las provenientes de cultivo in vitro (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 252 Humedad Debido a la anatomiacutea y la condicioacuten fisioloacutegica de las plantas desarrolladas in vitro donde se ha mantenido una alta humedad relativa es necesario regar al momento del traslado para obtener una alta sobrevivencia Muchos laboratorios aseguran que hay que evitar tener un sistema de aspersioacuten ya que se produce el ambiente necesario (muy huacutemedo) para la aparicioacuten de hongos algas o bacterias Otros meacutetodos incluyen el uso de humidificadores o poner las macetas en un lugar cerrado donde se retenga vapor para esto se pueden usar por ejemplo tapas de polietileno Este meacutetodo es relativamente econoacutemico pero se debe tener control del calor y monitorear la falta de agua (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 253 Luz Durante la etapa in vitro las plantas estaacuten expuestas a altos niveles de luminosidad lo que se traduce en hojas delgadas Antes del traslado se recomienda mantener las plantas con un 50 de sombra para asiacute poder aclimatarlas de mejor manera esto debido a que las plantas micropropagadas tienen un bajo control sobre la transpiracioacuten y un inadecuado mecanismo de fotosiacutentesis La sombra reduce la transpiracioacuten evitando excesivas peacuterdidas de agua asiacute como tambieacuten el exceso de luz destruye las moleacuteculas de clorofila Luego del periacuteodo bajo sombra se deben mover las macetas gradualmente hacia el nivel de luz al cual seraacute llevado para su crecimiento final (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 254 Temperatura La temperatura del aire y del medio o sustrato de crecimiento estaacute generalmente controlado durante el periacuteodo de aclimatacioacuten El calor es necesario en los meses de invierno y el friacuteo (enfriar) es esencial en los meses de verano Ajustando la cantidad de sombra y humedad se obtiene un control sobre la temperatura El
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enfriamiento se puede obtener gracias a ventilacioacuten abanicos niebla o aire acondicionado El calor puede provenir del sistema existente en el edificio o invernadero donde esteacuten ubicadas las macetas o por las laacutemparas ocupadas para el control del fotoperiacuteodo El rango de temperatura que se mantiene por lo general es entre los 13 y 30ordmC y esta determinado principalmente por la especie en cuestioacuten La temperatura de la zona donde se encuentran las raiacuteces es muy importante para el crecimiento lo ideal es que dicho sector tenga una mayor temperatura que el aire fomentando el crecimiento de las raiacuteces e incrementando la humedad alrededor de la planta Durante el verano esto es difiacutecil de obtener ya que la temperatura del aire es muy alta debido a la alta radiacioacuten solar Terminado el proceso de aclimatacioacuten esto ya no es necesario (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 255 Fotosiacutentesis Las plantas sufren un cambio radical cuando son removidas desde cultivo in vitro ya que son forzadas a cambiar de heterotroacuteficas a autotroacuteficas y la fotosiacutentesis se vuelve fundamental para la sobrevivencia Las hojas de las plantas in vitro no estaacuten formadas para hacer fotosiacutentesis ya que en la caacutemara de incubacioacuten no se produce un fuerte intercambio gaseoso esto debido a que la sacarosa es entregada a traveacutes del medio de cultivo Las hojas de las plantas que son trasladadas al campo o invernadero sufren deterioro debido a que no estaacuten formadas para la fijacioacuten de carbono Esto se produce por un tiempo aproximado de cuatro semanas despueacutes de las cuales las hojas nuevas suplen a las viejas Otro punto es que las hojas de las plantas cultivadas in vitro contienen menor proporcioacuten de clorofila que las plantas que han crecido normalmente en el campo En un estudio de coliflor cultivado in vitro se midioacute el CO2 y se obtuvo un balance negativo el cual se mantuvo durante dos semanas despueacutes del transplante Algo similar ocurrioacute con frutilla despueacutes del transplante las hojas se deterioraron raacutepidamente lo que quiere decir que no hubo incremento en la fijacioacuten de carbono indicando falta de desarrollo en la competencia fotosinteacutetica
El bajo nivel de CO2 durante el cultivo in vitro limita el proceso de fotosiacutentesis lo cual se puede compensar usando sacarosa en el medio de cultivo Tambieacuten se puede incrementar el nivel de luz y CO2 obteniendo un fuerte aumento en el crecimiento de varias especies como orquiacutedeas clavel etc (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 256 Sustrato Un sustrato es todo material soacutelido distinto del suelo natural mineral u orgaacutenico que colocado en un contenedor en forma pura o en mezcla permite el anclaje del sistema radicular de la planta desempentildeando por lo tanto un papel de soporte para la planta El sustrato puede intervenir o no en el complejo proceso de la nutricioacuten mineral de la planta (INFOAGRO 2007) El sustrato y los contenedores dentro de los cuales se van a transplantar las plaacutentulas in vitro son importantes para una buena sobrevivencia
Los sustratos ejercen una influencia significativa en la arquitectura del sistema radical de las plantas y en las asociaciones bioloacutegicas de este con el suelo influenciando el
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estado nutricional y la translocacioacuten de agua en el sistema suelo-planta-atmoacutesfera Uno de los requisitos fundamentales que debe cumplir el sustrato para su utilizacioacuten es la sanidad Cuando estos no se elaboran almacenan o manejan correctamente pueden contaminarse y provocar serios dantildeos a las plantas durante la aclimatacioacuten por esta razoacuten son preferidos como componentes para su elaboracioacuten materiales inertes o aquellos en las cuales el proceso de obtencioacuten garantice la mayor desinfeccioacuten posible
Uno de los factores de mayor importancia a la hora de seleccionar los materiales que pueden constituir el sustrato es su disponibilidad tanto en teacuterminos de facilidad de obtencioacuten o suministro como de su costo (VILCHEZ et al 2007)
La presencia de inhibidores o tambieacuten cambios en el pH del sustrato pueden afectar el crecimiento de las raiacuteces y consecuentemente el eacutexito del transplante
Muchos laboratorios y viveros transplantan a un sustrato uniforme debiendo ser eacuteste adecuado en cuanto a soporte de las plantas pH porosidad aireacioacuten y drenaje (DEBERGH y ZIMMERMAN 1991)
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3 MATERIAL Y MEacuteTODO
Para la realizacioacuten de este trabajo se utilizoacute el siguiente material y meacutetodo
31 Material La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio e invernadero de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal pertenecientes a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de Chile
311 Material vegetal Se utilizaron plaacutentulas de C virescens cultivadas in vitro a partir de semillas las cuales fueron proporcionadas por el laboratorio estas plaacutentulas fueron separadas y repicadas para aumentar la poblacioacuten y obtener la cantidad necesaria para el ensayo
FIGURA 2 Plaacutentulas de C virescens en caacutemara de crecimiento in vitro
312 Materiales Los materiales que se utilizaron fueron los siguientes Equipos autoclave caacutemara de flujo laminar dispensador de medios medidor
de pH agitador magneacutetico horno microondas balanza mechero termoacutemetro Materiales vasos de precipitado matraces probetas pipetas papel de
aluminio frascos de vidrio placas Petri pinzas bisturiacute macetas regadera Soluciones soluciones madre (Medio MS) gelificante etanol 70 y 95
32 Meacutetodo A continuacioacuten se da a conocer la metodologiacutea con la cual se trabajoacute 321 Preparacioacuten del medio de cultivo Para la obtencioacuten de plantas a traveacutes de la micropropagacioacuten se ocupoacute el medio basal de MURASHIGE y SKOOG (1962) tambieacuten llamado medio MS Este medio tiene un pH de entre 56-57 Posteriormente se dosificoacute con el dispensador de medios para que cada frasco tenga una cantidad adecuada (25 mL) y se llevoacute a autoclave para esterilizar a 12 atm 120ordm C por 20 min
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322 Obtencioacuten del material vegetal Al tener el medio esterilizado se procedioacute a la separacioacuten y repicado de plaacutentulas existentes en el laboratorio Las siembras se realizaron en el mes de mayo del 2007 Estas siembras se realizaron en la caacutemara de flujo laminar de modo de asegurar que la siembra sea 100 aseacuteptica Estas plaacutentulas fueron mantenidas en la caacutemara de incubacioacuten hasta obtener los tamantildeos requeridos para el ensayo donde las condiciones fueron las siguientes
minus Temperatura ambiental de 23-25ordm C minus Fotoperiacuteodo de 16 horas minus Intensidad lumiacutenica controlada de 50-55 micromol m-2s-1
323 Sustratos Se utilizaron tres tipos de sustratos el primero corresponde a una mezcla de turba + perlita (11) el segundo corresponde a Sphagnum (100) y el tercero corresponde a una mezcla de turba + arena (11) Una vez realizadas las mezclas se procedioacute a una esterilizacioacuten en un autoclave a 121ordm C por 20 minutos a 12 atmoacutesfera De esta forma se trabajoacute con material limpio y sano evitando ataque de hongos o bacterias El anaacutelisis quiacutemico de los sustratos se muestra en el Anexo 2 324 Plantacioacuten Las plaacutentulas con un promedio de cuatro meses en condiciones de caacutemara de crecimiento in vitro obtuvieron el tamantildeo adecuado para ser utilizadas Se sacaron de los frascos y se plantaron en las macetas de plaacutestico transparente con los sustratos Posteriormente fueron dejadas en la sala del laboratorio donde se debioacute asperjar con solucioacuten nutritiva Hoagland y fungicida Captan CUADRO 1 Composicioacuten de solucioacuten nutritiva Hoagland
KNO3 102 gL Ca(NO3) 4 H2 O 0492 gL
NH4H2 (PO4) 023 gL MgSO4 7 H2O 049 gL
H3BO3 286 mgL MnCl2 2 H2O 181 mgL CuSO4 5 H2O 008 mgL ZnSO4 5 H2O 022 mgL Na2MoO4 H2O 009 mgL
FeSO4 7 H2O 05 06 mL FUENTE FINCK 1988 325 Disentildeo de los ensayos Este trabajo de investigacioacuten constoacute de un ensayo con dos etapas Antes que todo se realizoacute la separacioacuten y repicado in vitro de plaacutentulas de C virescens para la obtencioacuten del nuacutemero necesario de plantas En la etapa 1 se utilizaron tres tamantildeos de plaacutentulas obtenidas in vitro de 1-2cm de 2-3cm y de maacutes de 3cm de altura que se transplantaron a tres sustratos turba + perlita 11(vv) Sphagnum (100) y turba + arena 11 (vv) La turba provino de la Sociedad
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Minera Patagonia Peat SA en Hijuelas el Sphagnum de la empresa Lonquen Chile de Puerto Montt y la perlita se obtuvo a traveacutes del sitio web wwwjardisencl (representante legal Walter Rathgeb Penza Ingeniero Agroacutenomo Santiago) Las plaacutentulas se plantaron de acuerdo a su tamantildeo las de maacutes de 3cm se colocaron de 6 por maceta las de 2 a 3cm de a 8 por maceta y las maacutes chicas de a 10 por maceta Estas macetas fueron dejadas en una sala de aclimatacioacuten con una temperatura promedio de 20ordm C intensidad lumiacutenica de 50-55 micromol m-2s-1 y 14-16 hrs de fotoperiacuteodo Se fertilizoacute asperjando cada cinco diacuteas con solucioacuten nutritiva Hoagland Esta etapa se llevoacute a cabo durante dos meses desde el cinco de septiembre hasta el cinco de noviembre de 2007
En la etapa 2 se continuoacute el proceso de aclimatacioacuten en invernadero de las plaacutentulas obtenidas en la etapa 1 que despueacutes de dos meses teniacutean un mayor tamantildeo y se habiacutean acondicionado al ambiente exterior (fuera de la caacutemara de crecimiento) Las plantas se mantuvieron en las macetas durante tres semanas para aclimatarlas y luego las plantas sobrevivientes fueron transplantadas a macetas maacutes grandes individuales durante tres meses aproximadamente hasta el cinco de marzo 2008 Estas nuevas macetas tuvieron como sustrato turba y suelo (trumao) en igual proporcioacuten (Anexo 2) La temperatura promedio de invernadero fluctuoacute de 13 a 35 degC seguacuten el mes En enero el promedio fue de 25 (Anexo 3) Para bajar la temperatura alrededor de 5deg C se instaloacute una malla Rachel 326 Disentildeo experimental El disentildeo experimental utilizado fue completamente al azar ordenado como experimento factorial con dos factores tamantildeo (3) y sustrato (3) Cada tratamiento tuvo tres repeticiones con un miacutenimo de 6 plantas por recipiente 327 Variables a evaluar Durante los dos meses en que las macetas estuvieron en la sala de aclimatacioacuten se evaluoacute el desarrollo foliar contando el nuacutemero de hojas una vez al mes Posteriormente se trasladaron las mismas macetas a invernadero durante tres semanas para continuar con la aclimatacioacuten de las plaacutentulas Transcurrido este tiempo se transplantaron las plaacutentulas sobrevivientes a macetas individuales y continuoacute mensualmente la evaluacioacuten de eacutestas (nuacutemero de hojas) hasta la obtencioacuten de plantas establecidas Al momento del transplante y al final del ensayo se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces asiacute como tambieacuten al final del ensayo de evaluoacute el crecimiento en altura (cm) La sobrevivencia fue evaluada al final del ensayo por maceta
Tanto en la sala de aclimatacioacuten coacutemo en el invernadero se registroacute la temperatura con la ayuda de un termoacutemetro de maacutexima y miacutenima (Anexo 3) 328 Anaacutelisis estadiacutestico Una vez obtenidos los datos se procedioacute a comprobar si estos cumpliacutean con los supuestos de aleatoriedad normalidad y homogeneidad de varianzas que exige este tipo de anaacutelisis En el caso de no cumplirse estos supuestos los datos se transformaron utilizando log10(x+05) raiacutez(x+05) o 1x para normalizarlos
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y enseguida se sometioacute los datos a un anaacutelisis estadiacutestico (ANDEVA) Posteriormente en los casos en que se observoacute diferencias significativas en el ANDEVA se aplicoacute una prueba de rangos muacuteltiples (Tukey) al 5 de significancia Para las variables no parameacutetricas que no cumplieron con los supuestos para un anaacutelisis de varianza se realizoacute la prueba de KruskalndashWallis y las comparaciones muacuteltiples a traveacutes del test de Dunn con un nivel de 5 de significancia
Se utilizaron los programas estadiacutesticos STATGRAPHICS 20 y GRAPHPAD PRISM 5 para el anaacutelisis de datos
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4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
En los siguientes puntos se discuten los resultados obtenidos en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens
En la Figura 3 se observan plaacutentulas de C virescens micropropagadas en medio MS en caacutemara de crecimiento al inicio del ensayo (A) y en invernadero despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten (B)
BA
FIGURA 3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten
A continuacioacuten se presentan los resultados obtenidos para las variables analizadas (Cuadro 2 y 3) de esta manera se pueden visualizar en general los resultados obtenidos en el proceso de aclimatacioacuten durante seis meses
CUADRO 2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de raiacuteces
inicial y final Variables
Hojas finales (nuacutemero)
Raiacuteces iniciales (nuacutemero)
Raiacuteces finales (nuacutemero)
Tamantildeo de plaacutentulas 36 24 37 47 29 46
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 61 43 76
Sustratos 53 36 56 43 29 51
Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 46 27 49
Significa que hay diferencias significativas al 95 Test de Dunn
25
Las variables no parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en hojas finales y raiacuteces iniciales en sus rangos de distribucioacuten Las raiacuteces finales no presentaron diferencias seguacuten el sustrato utilizado pero de acuerdo al tamantildeo hubo diferencias en su distribucioacuten
CUADRO 3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas
Variables Altura final de plaacutentulas
(cm) Sobrevivencia
Tamantildeo de plaacutentulas
36 c 567 b 47 b 821 a
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 59 a 908 a
Sustratos 52 a 933 a
41 ab 59 b Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 49 b 772 a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY Las variables parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en altura final de hojas y en sobrevivencia 41 Nuacutemero de hojas finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentulas y de sustratos para la variable nuacutemero final de hojas 411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula Seguacuten el Cuadro 2 y Figura 4 las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero final de hojas Las plaacutentulas pequentildeas de 1-2 cm obtuvieron el nuacutemero maacutes bajo de hojas finales con una media de 36 hojas por plaacutentula lo cual es la mitad de las hojas finales que se obtuvo con las plaacutentulas de mayor tamantildeo (61 hojas aproximado por plaacutentula) Para las plaacutentulas medianas de 2-3 cm se obtuvo una media de 47 hojas por plaacutentula (Figura 4)
26
Hojas finales
1-2 cm 2-3cm maacutes de 3 cm0
5
10
15
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn)
BLANCO (2006) sentildeala que plaacutentulas cultivadas in vitro crecen bajo condiciones especiales como alta humedad relativa y baja luminosidad ademaacutes son suplidas con sacarosa Estas condiciones fueron proporcionadas en una caacutemara de crecimiento en el laboratorio donde las plantas micropropagadas no son dependientes por completo de su fotosiacutentesis son heteroacutetrofas Parece ser necesario un estiacutemulo para convertirse en organismos totalmente capaces de sustentar sus propios requisitos de carbono y nitroacutegeno reducido pasando de esta manera a ser autoacutetrofos
Al ser sacadas de un medio in vitro las hojas no estaacuten preparadas para producir su propio alimento y sobreviven gracias a que el medio de cultivo le proporciona los nutrientes necesarios para vivir En este punto muchas de las hojas mueren y nacen hojas nuevas capaces de generar su alimento supliendo asiacute las hojas viejas (SEELYE et al 2003) En este ensayo las plaacutentulas de Chloraea virescens presentaron en general una buena adaptacioacuten al ser sacadas de un medio in vitro
Se observoacute que plaacutentulas con menor tamantildeo al ser aclimatadas y tener menor tejido fue maacutes difiacutecil y maacutes lento que empezaran a generar nuevos tejidos y materia orgaacutenica a partir de dioacutexido de carbono POSPIacuteŠILOVAacute et al (1999) sentildeala que al tener los estomas con desarrollo incompleto maacutes grandes y de forma maacutes redonda pierden maacutes agua lo cual puede provocar una peacuterdida de hojas muriendo asiacute la plaacutentula Por esta razoacuten las plaacutentulas pequentildeas se demoran maacutes tiempo en generar hojas nuevas es por ello que al finalizar este estudio muestran el menor nuacutemero final de hojas 412 Efecto del tipo de sustrato Al analizar la influencia del tipo de sustrato se encontraron diferencias significativas entre los tres sustratos utilizados Seguacuten el Cuadro 2 y la Figura 5 el sustrato donde se obtuvo mejores resultados fue
27
turba+perlita en el cual se observoacute un promedio de 53 hojas por plaacutentula siendo Sphagnum el maacutes bajo con 43 hojas por plaacutentula De acuerdo a los resultados del anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados el sustrato turba+perlita tiene mayor cantidad de nitroacutegeno foacutesforo calcio magnesio y azufre disponible comparativamente con los otros dos sustratos (Sphagnum y arena+turba) (Anexo 2)
Hojas finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
Sustratos
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) Para la brotacioacuten y el crecimiento de las plantas se necesita agua y Nitroacutegeno lo que favorece a una mayor tasa de aparicioacuten de hojas lo que se traduce en una mayor cantidad de hojas finales El Nitroacutegeno se encuentra en mayor cantidad en el sustrato turba+perlita debido a lo cual los mejores resultados se obtienen en dicho sustrato 413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Despueacutes de analizados los efectos individuales del tamantildeo y del sustrato al interactuar ambos factores existen diferencias significativas La mejor interaccioacuten se obtuvo con el sustrato turba+perlita y con el mayor tamantildeo de la plaacutentula (Figura 6) Debido a la buena estructura (porosa) de dicho sustrato se podriacutea decir que se favorecioacute la absorcioacuten radicular de nutrientes obteniendo por ello un mayor nuacutemero de hojas finales Para los menores tamantildeos no se observan diferencias significativas obteniendo como promedio 41 hojas por plaacutentula Para el mayor tamantildeo el promedio fue de 6 hojas por plaacutentula
28
Hojas finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 42 Raiacuteces iniciales Este paraacutemetro se evaluoacute luego de la primera etapa de aclimatacioacuten la cual se realizoacute en una sala de aclimatacioacuten del laboratorio Se analizoacute la influencia de diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos sobre la variable nuacutemero raiacuteces iniciales (Anaacutelisis de Kruskal-Wallis en Anexo 7)
FIGURA 7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses de pre aclimatacioacuten
29
En la Figura 7 se puede observar los resultados de pre aclimatacioacuten en sala de laboratorio En esta etapa ya es posible ver la presencia de raiacuteces desarrolladas 421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula En el Cuadro 2 se puede observar que las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero inicial de raiacuteces y en la Figura 8 se puede comprobar que para los dos tamantildeos de plaacutentula maacutes pequentildeos no se observa gran cantidad de raiacuteces esto no impidioacute el desarrollo posterior de las plaacutentulas las cuales lograron enraizar al final del estudio Esto se contrapone a lo observado en un estudio de Lapageria rosea donde la presencia de raiacutez y brote para lograr una multiplicacioacuten exitosa de plantas es de vital importancia Incluso algunas plaacutentulas de L rosea no brotan en condiciones in vitro en donde tienen las mejores condiciones nutricionales y hormonales para hacerlo Esto se debe a factores internos de la plaacutentula siendo muy difiacutecil que broten inmediatamente en caacutemara de aclimatacioacuten donde ya dejan de recibir los nutrientes necesarios de manera directa y requieren de balances de energiacutea para poder seguir elongando raiacuteces absorber nutrientes y brotar para poder obtener los carbohidratos necesarios para seguir su crecimiento (BLANCO 2006) El tamantildeo de plaacutentula tiene importancia para el desarrollo de raiacuteces se distingue notoriamente que en los tamantildeos maacutes grandes el nuacutemero de raiacuteces es mayor comparativamente con los tamantildeos pequentildeos donde el nuacutemero de raiacuteces fue escaso Debido a la presencia de maacutes hojas existe una mayor cantidad de aacuterea fotosinteacutetica esta situacioacuten estimula el crecimiento de las raiacuteces para la obtencioacuten de agua y nutrientes
Raices iniciales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
2
4
6
8
10
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o inicial de ra
iacuteces
FIGURA 8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn)
30
422 Efecto del tipo de sustrato Para el sustrato turba+perlita se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas en el nuacutemero de raiacuteces con respecto a los dos otros sustratos esto se puede ver en el Figura 9 donde se observa que se obtuvieron los mayores resultados En cualquier medio de crecimiento el espacio no ocupado por un soacutelido se llama porosidad este espacio puede ser ocupado en parte para retener agua y en parte para proporcionarle aire a las raiacuteces La ausencia de uno de estos elementos es perjudicial para las plantas La turba es conocida por tener estas propiedades y la perlita tambieacuten por esta razoacuten se sabe que la mezcla turba-perlita provee propiedades fiacutesicas excelentes como medio de crecimiento y propagacioacuten (INFOAGRO 2007) Estos resultados con turba-perlita (298 de materia orgaacutenica) coinciden con los obtenidos por DIAZ et al (2004) quienes al utilizar un sustrato compuesto por 100 de humus de lombriz para aclimatar cantildea de azuacutecar obtuvieron el mayor nuacutemero de raiacuteces Esto puede atribuirse al importante aporte de materia orgaacutenica del humus (47) lo que le confiere una mejor estructura obtenieacutendose una excelente porosidad del sustrato La aireacioacuten del suelo es necesaria para favorecer la maacutexima absorcioacuten de nutrientes por las raiacuteces Esto tambieacuten sucede en el sustrato turba+perlita el cual posee la mayor cantidad de materia orgaacutenica de los tres sustratos utilizados
Raices iniciales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
2
4
6
8
10
Sustratos
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato En los anaacutelisis para la variable nuacutemero de raiacuteces se puede decir que la mejor interaccioacuten se presentoacute para el sustrato de turba+perlita junto con el mayor tamantildeo de plaacutentulas obteniendo los valores maacutes altos entre los nueve tratamientos La presencia de raiacuteces luego de la micropropagacioacuten aumenta la posibilidad de eacutexito en el transplante ya que se crea un favorable balance de agua Pero esto no quiere
31
decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
10
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
32
En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
33
El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
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Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
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Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
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5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
VI
16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable
parameacutetrica altura final de plaacutentulas 35
17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) 37
18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la
variable parameacutetrica de sobrevivencia 37
VII
INDICE DE ANEXOS
Anexo Paacutegina
1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962)
y suplementos orgaacutenicos 44
2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio 45
3 Registro de temperaturas miacutenimas maacutexima y promedio durante
el estudio 46
4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas
finales 47
5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales 47
6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces
iniciales 48
7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces
iniciales 48
8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces
finales 49
9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales 49
10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en
aclimatacioacuten 50
11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura 50
12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de
plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten 51
13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia 51
14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea 52
1
RESUMEN Dentro del esquema de micropropagacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens la aclimatacioacuten es la etapa final donde la manipulacioacuten debe ser muy cuidadosa ya que es donde se produce el mayor iacutendice de mortandad principalmente en el proceso de trasplante Esta etapa es muy importante ya que gracias a ella se veraacute la eficiencia del proceso y la calidad final de las plantas producidas in vitro por eso el objetivo general de este trabajo es evaluar la influencia del tamantildeo de plaacutentulas y utilizacioacuten de distintos sustratos en la aclimatacioacuten ex vitro de plaacutentulas de C virescens Se utilizaron plaacutentulas de Chloraea virescens obtenidas a partir de la micropropagacioacuten de protocormos provenientes de germinacioacuten asimbioacuteticas de semillas efectuada en el laboratorio de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal de la Universidad Austral de Chile Las plaacutentulas fueron repicadas hasta obtener el nuacutemero adecuado para el ensayo Luego fueron trasladadas a una sala del laboratorio en macetas de seis ocho y diez plaacutentulas dependiendo del tamantildeo de la plaacutentula (maacutes de 3cm 2-3cm y 1-2cm respectivamente) por dos meses posteriormente fueron transferidas a 3 sustratos turba+perlita (11) Sphagnum y turba+arena (11) y fueron llevadas a invernadero durante cuatro meses Las variables evaluadas fueron nuacutemero final de hojas nuacutemero inicial y final de raiacuteces altura y sobrevivencia de las plaacutentulas Los resultados obtenidos demostraron que los tamantildeos y los sustratos ocupados influyen en el crecimiento de las plaacutentulas El mejor tamantildeo para la aclimatacioacuten es de maacutes de 3cm obteniendo con eacuteste los mejores resultados en todas las variables evaluadas Lo mismo ocurrioacute con el sustrato turba+perlita el cual fue el mejor evaluado
2
REacuteSUMEacute Dans le scheacutema de la micropropagation de Chloraea virescens lacclimatation est la derniegravere eacutetape ougrave il faut ecirctre prudent parce que cest agrave ce moment lagrave que les taux de mortaliteacute sont les plus eacuteleveacutes principalement dans le processus de transplantation Cette eacutetape est tregraves importante parce que ce sera gracircce agrave elle quacuteon verra lefficaciteacute du processus et la qualiteacute finale des plantes produites in vitro Lobjectif geacuteneacuteral de cette eacutetude est dacuteeacutevaluer linfluence de la taille des plantes et lutilisation de divers substrats pour lacuteacclimatation de C virescens On a utiliseacute des plantes de C virescens obtenue a partir de la micropropagation de protocormos en provenance du laboratoire de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal de la Universidad Austral de Chile Les plantes ont eacuteteacute subdiviseacutee pour obtenir le nombre approprieacute Elles ont ensuite eacuteteacute transfeacutereacutees agrave des pots dans une piegravece du laboratoire de six huit et dix en fonction de la taille de la plante (plus de 3 cm de 2-3 cm et 1-2 cm respectivement) pour deux mois ensuite elles ont eacuteteacute transfeacutereacutee dans trois substrats tourbe + perlite (11) Sphagnum et tourbe + sable (11) et elles ont eacuteteacute mises dans une serre pour quatre mois Les variables agrave eacutevaluer sont nombre final de feuilles nombre de racines au deacutebut et agrave la fin la hauteur et la survie des plantes Les reacutesultats ont montreacute que la taille et les substrats utiliseacutes ont une influence sur la croissance des jeunes plantes La taille ideacuteale pour lacclimatation est plus de 3cm avec cette derniegravere on a obtenu les meilleurs reacutesultats dans toutes les variables qui ont eacuteteacute eacutevalueacutees Le mecircme reacutesultat sest produit avec le substrat de tourbe + perlite lequel a aussi montreacute les meilleurs reacutesultats
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1 INTRODUCCION La familia Orchidaceae (Orquiacutedeas) es la que mayor nuacutemero de especies comprende en el Reino Vegetal Se estima que debe haber alrededor de 35000 especies de Orquiacutedeas en todo el mundo pertenecientes a unos 750 geacuteneros ademaacutes de miles de hiacutebridos En Chile esta familia es probablemente el grupo menos estudiado de plantas con flores y soacutelo se han realizado estudios en base a su taxonomiacutea biologiacutea reproductiva fenologiacutea y distribucioacuten
La produccioacuten de flores de orquiacutedeas ha tomado importancia por la belleza de sus flores dada la enorme variedad de formas colores y perfumes Existen orquiacutedeas terrestres y epiacutefitas estas uacuteltimas representan maacutes del 90 del total de especies y son las que mayoritariamente se encuentran a la venta Las flores tienen un alto valor ornamental o como flor cortada ya que eacutestas pueden permanecer separadas de las plantas sin marchitarse hasta tres o cuatro semanas y en la planta permanecen hasta tres meses
La obtencioacuten de plantas de orquiacutedeas a partir de semillas es muy difiacutecil ya que eacutestas son diminutas y de germinacioacuten irregular Como una alternativa de obtencioacuten de plantas aparece la micropropagacioacuten pudiendo asiacute aumentar el nuacutemero de plantas en forma relativamente faacutecil y raacutepida Luego de la etapa de micropropagacioacuten viene la etapa de aclimatacioacuten en la cual la manipulacioacuten debe ser en extremo cuidadosa ya que es donde se produce el mayor iacutendice de mortandad principalmente en el proceso de transplante Esta etapa es muy importante ya que gracias a ella se veraacute la eficiencia del proceso y la calidad final de las plantas producidas in vitro Considerando la produccioacuten de plaacutentulas mediante la micropropagacioacuten en este trabajo se plantea la hipoacutetesis que ldquoel tamantildeo de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro y los distintos sustratos son factores que inciden en el desarrollo y su aclimatacioacutenrdquo El objetivo general de este trabajo es
Evaluar la influencia del tamantildeo de plaacutentulas y utilizacioacuten de distintos sustratos en la aclimatacioacuten ex vitro de plaacutentulas de C virescens
Los objetivos especiacuteficos son
Medir el efecto del tamantildeo de plaacutentulas de C virescens en la sobrevivencia y desarrollo de eacutestas ex vitro
Comparar el uso de tres sustratos en el desarrollo y sobrevivencia de plaacutentulas de C virescens
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2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA 21 Descripcioacuten general 211 Descripcioacuten geograacutefica Las orquiacutedeas pertenecen a la familia Orchidaceae clase Liliopsida (monocotiledoacuteneas) Son plantas herbaacuteceas perennes originarias de regiones tropicales y subtropicales pero existen tambieacuten en todos los continentes a excepcioacuten de las regiones polares La zona donde se encuentran estas plantas estaacute comprendida entre los 68ordm latitud norte y 56ordm latitud sur Es evidente que en los liacutemites extremos de estas latitudes se encuentran pocos geacuteneros y especies esto va en aumento desde las regiones temperadas hasta las regiones intertropicales donde el nuacutemero es el mayor Los territorios maacutes interesantes por su nuacutemero son
Ameacuterica del Sur y Ameacuterica Central Asia e India Madagascar Australia es el continente menos poblado en orquiacutedeas dentro de las regiones
del globo Por su parte Europa presenta numerosos geacuteneros y especies de orquiacutedeas
terrestres Soacutelo en Francia existen 75 especies repartidas en 16 geacuteneros todas terrestres (LECOUFLE y ROSE 1956)
212 Formas de vida Las zonas donde crecen estas plantas influyen sobre su manera de vivir Algunas orquiacutedeas son terrestres y se encuentran representadas en todas las regiones Tambieacuten existen las epiacutefitas (vegetal que fijado a otro no obtiene de eacuteste su alimento) En este caso se necesita que el grado higromeacutetrico y la temperatura permitan este tipo de adaptacioacuten Ademaacutes existen las orquiacutedeas litofiacuteticas que viven sobre rocas Las raiacuteces de las epiacutefitas y litofiacuteticas estaacuten adaptadas a vivir expuestas al aire o inmersas en materia orgaacutenica ya que tienen un tejido acumulador de agua llamado velo En zonas friacuteas y templado friacuteas todas las orquiacutedeas son terrestres En zonas subtropicales o tropicales la gran mayoriacutea es epiacutefita Otra particularidad debida seguramente a la influencia de estas zonas es la floracioacuten Es en las zonas tropicales y subtropicales que se dan los mayores tamantildeos de flores asiacute como tambieacuten la mayor variedad de colores (LECOUFLE y ROSE 1956)
213 Descripcioacuten morfoloacutegica Las orquiacutedeas se caracterizan por poseer flores muy vistosas hermafroditas (ambos sexos en la misma flor) zigomorfas (con un solo plano de simetriacutea) triacutemeras (tres seacutepalos y tres peacutetalos) y una columna central que sustenta las estructuras reproductivas masculinas anteras y femeninas pistilo llamada ginostemo El peacutetalo inferior se llama labelo y su morfologiacutea define a los distintos geacuteneros de orquiacutedeas Las flores pueden ser aisladas o en inflorescencia y son polinizadas por insectos El polen se encuentra aglomerado formando una masa llamada polinio el que tiene un extremo con un ensanchamiento glandular pegajoso que sirve para que el
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polinio se adhiera al cuerpo del insecto polinizador El fruto es una caacutepsula seca con muchas semillas pequentildeas sin endosperma y con embrioacuten no diferenciado Tienen dos tipos baacutesicos de crecimiento Simpodial en las que el nuevo crecimiento se produce en sentido horizontal a partir de un tallo subterraacuteneo o rizoma generando una sub-unidad capaz de producir una flor o inflorescencia y de ser eventualmente separada de la planta (ej Cattleya) Monopodial en las que el nuevo crecimiento se produce en sentido vertical con lo cual la planta crece constantemente en altura (ej Phalaenopsis) (ORQUIDEAS 2007) 214 Geacuteneros y especies chilenas Seguacuten NOVOA et al (2006) en la familia Orchidaceae se encuentran 49 especies de flora nativa dentro de las cuales se encuentra Chloraea virescens (Willd) Lindl Los geacuteneros de Orchidaceae en Chile son 7
- Aa Bipinnula Brachystele Codonorchis Chloraea Gavilea y Habenaria
Dentro del geacutenero Chloraea existen 31 especies - Chloraea alpina Poepp - Chloraea barbata Lindl - Chloraea bidendata (Poepp y Endl) Correa - Chloraea bletioides Lindl - Chloraea cuneata Lindl - Chloraea chica Speg - Chloraea chrysantha Poepp - Chloraea crispa Lindl - Chloraea cristata Lindl - Chloraea cylindrostachya Poepp - Chloraea disoides Lindl - Chloraea galeata Lindl - Chloraea gaudichaudii Brongn - Chloraea gavilu Lindl - Chloraea grandiflora Lindl - Chloraea heteroglossa Rchbf - Chloraea incisa Poepp - Chloraea lamellata Lindl - Chloraea lechleri Lindl - Chloraea leptopetala Reiche - Chloraea longipetala Lindl - Chloraea magellanica Hookf - Chloraea multiflora Lindl - Chloraea nudilabia Lindl - Chloraea philippii Reichbf - Chloraea picta Phil - Chloraea prodigiosa Reichbf - Chloraea speciosa Poepp - Chloraea virescens Lindl - Chloraea viridiflora Poepp
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- Chloraea volkmanni Phil (NOVOA et al 2006) 2141 Chloraea virescens Planta perenne de 40-90 cm de altura Sus hojas son de 5-12cm de largo por 15-25cm de ancho estrechas lanceoladas agudas dispuestas en roseta basal generalmente marchitas al final de la antesis Su escapo floral tiene vainas caulinares lanceoladas agudas y distantes La inflorescencia es de 8-20cm de largo densa con 10-15 flores erguidas Sus flores son blancas con estriacuteas y aacutepices verdes El seacutepalo dorsal es de 16-33mm de largo por 4-6mm de ancho oblongo lanceolado obtuso algo coacutencavo a veces ligeramente estrechado al centro aacutepice algo carnoso Los seacutepalos laterales de 18-33mm de largo por 4-5mm de ancho son ensiformes con aacutepice obtuso engrosado verde negruzco a veces espatulado y dentado a veces verrugoso Los peacutetalos son de 15-23mm de largo por 5-58mm de ancho estrechamente aovados obtusos verrugosos con maacutes frecuencia solo la mitad inferior a veces el borde denticulado y carnoso El labelo de 15-26mm de largo por 10-20mm de ancho es mas o menos romboidal a levemente trilobulado El loacutebulo central tiene 5-7 nervios longitudinales recorridos por laminillas interrumpidas membranaacuteceas con segmentos falciformes de borde carnoso de color verde Los nervios laterales que se ramifican oblicuamente hacia el aacutepice en los loacutebulos laterales tienen pequentildeas laminillas y verrugas y su borde es laciniado inciso en la mitad apical hacia la base denticulado aacutepice generalmente engrosado La columna es de 12-18mm de largo delgada blanca con estriacuteas anaranjada La base de la zona nectariacutefera tiene un color amarillo-limoacuten con maacuteculas anaranjadas orificio nectario verde El ala de la columna es recta y estrecha El estigma es triangular y globoso La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la Vordf (Vintildea del Mar) hasta la XIordf Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile Sin embargo es posible que tenga una distribucioacuten maacutes restringida por que se le ha confundido con Chloraea incisa Su floracioacuten es desde noviembre a febrero y su estado de conservacioacuten no estaacute evaluado (NOVOA et al 2006) En el Anexo 14 se incluyen antecedentes sobre su distribucioacuten y eacutepoca de floracioacuten
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FIGURA 1 Chloraea virescens FUENTE NOVOA et al (2006) 22 Requerimientos de las orquiacutedeas Para tener eacutexito en el cultivo de orquiacutedeas hay que tomar en cuenta factores de importancia como son 221 Agua El riego correcto es el principio y el fin del cuidado de orquiacutedeas (ROLLKE 2005) Este elemento es primordial para las orquiacutedeas asiacute como tambieacuten para todo tipo de plantas En el caso de eacutestas se dice muchas veces que la calidad del agua usada es el factor maacutes importante en el cultivo de orquiacutedeas ya que el porcentaje maacutes alto de muerte se produce por el exceso de este factor (SHEEHAN 1980) Hay que tomar en cuenta que la mayoriacutea de las orquiacutedeas son epiacutefitas lo que significa que tienen sus raiacuteces a la vista gracias a las cuales absorben el agua de lluvia Se recomienda un sustrato poroso y de reaccioacuten neutra ya que de esta manera el agua escurre sin acumularse no permitiendo la pudricioacuten de las raiacuteces Para las orquiacutedeas terrestres es lo mismo solo que se pueden regar con maacutes frecuencia pero sin mantenerlas saturadas (OSPINA y DRESSLER 1979) Seguacuten DUMOIS (2007) el agua es lo maacutes difiacutecil de controlar ya que depende de muchas variables como por ejemplo humedad relativa tipo de sustrato intensidad luminosa temperatura y circulacioacuten de aire Ademaacutes muchas orquiacutedeas necesitan un periacuteodo de receso vegetativo que si no es respetado resulta en ausencia de floracioacuten En general hay que antildeadir agua en abundancia cuando la planta se encuentra en crecimiento activo y reducirla despueacutes de la floracioacuten
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Las especies con pseudobulbos almacenan agua y estaacuten preparadas para su periacuteodo de receso Otras que no cuentan con estos oacuterganos requieren de humedad maacutes constante 222 Luz Ninguna planta puede crecer sin la iluminacioacuten adecuada Muchas orquiacutedeas viven en las alturas de los aacuterboles y estaacuten expuestas a plena luz del sol otras crecen en el suelo selvaacutetico protegidas del sol por espesos follajes (ROLLKE 2005) La funcioacuten principal de la luz es activar el proceso de fotosiacutentesis Los cultivadores han estudiado la luz y han descubierto que hay orquiacutedeas que florecen con diacutea largo y otras con diacutea corto (OSPINA y DRESSLER 1979) Gracias a la fotosiacutentesis se convierten los minerales presentes en el ambiente en savia y nutrientes Hojas oscuras y falta de floracioacuten indican falta de luz hojas amarillas e incluso quemadas apuntan hacia un exceso de sol (DUMOIS 2007) 223 Fertilizacioacuten Las orquiacutedeas necesitan los mismos nutrientes que otras plantas Un abono para orquiacutedeas debe contener los nutrientes principales nitroacutegeno (N) foacutesforo (P) y potasio (K) asiacute como tambieacuten oligoelementos como hierro (Fe) magnesio (Mg) zinc (Zn) estantildeo (Sn) y manganeso (Mn) (ROLLKE 2005) Por otra parte la fertilizacioacuten depende de varios factores dentro de los cuales los maacutes criacuteticos son
- El medio utilizado - La edad de las plantas - Estado de las plantas ya sea floracioacuten crecimiento reposo
En cuanto a absorcioacuten se ha demostrado que es igual de eficiente por viacutea foliar como a traveacutes de las raiacuteces Es necesario tener en cuenta algunas reglas baacutesicas a la hora de fertilizar las orquiacutedeas (Asociacioacuten Costarricense de Orquideologiacutea ACO 1970)
1 Regar las plantas antes de fertilizar 2 Fraccionar las dosis 3 Aplicar el fertilizante de forma liacutequida 4 No usar fertilizantes soacutelidos 5 No fertilizar las plantas recieacuten plantadas 6 No fertilizar plantas en reposo 7 No abonar plantas enfermas
224 Temperatura Es conocido el hecho de que cada planta tiene liacutemites de temperatura dentro de los cuales prospera o perece De ahiacute la necesidad de conocer las temperaturas correspondientes al lugar de donde viene cada especie de orquiacutedea pudiendo proporcionarle la temperatura adecuada (OSPINA y DRESSLER 1979) Se puede clasificar a las orquiacutedeas como de clima caacutelido (temperatura nocturna miacutenima de 20ordmC) templado (miacutenimo de 13 a 18ordmC) y de ambiente friacuteo (de 10 a 13ordmC) (DUMOIS 2007)
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Seguacuten SHEEHAN (1980) las temperaturas ideales para las orquiacutedeas de origen tropical son 10ordmC en la noche y entre 21ordm - 24ordmC durante el diacutea 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas La micropropagacioacuten de orquiacutedeas estaacute en vanguardia hoy en diacutea El estudio de cultivo de tejido de orquiacutedeas se lleva a cabo en muchos laboratorios de todo el mundo (ARDITTI and ERNST 1992) 231 Biologiacutea de las semillas Las semillas de orquiacutedeas son conocidas usualmente como semillas polvo porque son minuacutesculas y contienen pocas reservas de alimento Estas semillas por lo general no germinan en el medio natural a menos que sean infectadas por un hongo micorriacutezico Este hongo abastece a las plantas joacutevenes con azuacutecares y nutrientes hasta que sean lo suficientemente grandes para fabricar su propio alimento Cuando la semilla germina produce una masa indiferenciada de ceacutelulas llamada protocormo Manteniendo las condiciones normales el protocormo continuaraacute su crecimiento por varias semanas meses o incluso antildeos dependiendo de la especie hasta que alcance la edad apropiada para producir raiacuteces y hojas En el caso de orquiacutedeas terrestres es de vital importancia que la relacioacuten orquiacutedea-hongo se conserve durante los estados tempranos del ciclo de vida de la planta ya que el protocormo enterrado no puede fabricar alimento por siacute mismo Por otro lado los protocormos de las orquiacutedeas epiacutefitas son comuacutenmente verdes lo que les posibilita producir parte de su alimento La relacioacuten orquiacutedea-hongo no ha sido en su totalidad investigada para el caso de las orquiacutedeas tropicales (McKENDRICK 2000) 232 Germinacioacuten simbioacutetica y no simbioacutetica de semillas Mediante la germinacioacuten in vitro las semillas germinan en frascos de vidrio o plaacutestico Estos frascos contienen en su interior un medio nutritivo solidificado con agar con todos los azuacutecares y minerales necesarios para la germinacioacuten y crecimiento de las semillas Hay dos tipos de germinacioacuten la simbioacutetica y la asimbioacutetica En la germinacioacuten simbioacutetica las semillas se siembran junto con una pequentildea cantidad del hongo micorriza adecuado Dicho hongo crece en el medio coloniza a las semillas que estaacuten en proceso de germinacioacuten y se produce una relacioacuten simbioacutetica la cual alimentaraacute al protocormo hasta que este sea capaz de producir sus hojas y se vuelva autotroacutefico Esta teacutecnica es usada principalmente en propagacioacuten de orquiacutedeas terrestres en zonas templadas La germinacioacuten asimbioacutetica se usa principalmente en propagacioacuten de orquiacutedeas tropicales que crecen maacutes raacutepido que sus parientes de zonas templadas Para este tipo de germinacioacuten se necesita un medio de cultivo maacutes complejo ya que todos los nutrientes orgaacutenicos e inorgaacutenicos asiacute como tambieacuten los azuacutecares deben estar en forma disponible pues no existe la intermediacioacuten del hongo (McKENDRICK 2000) 233 Condiciones de esterilidad Tanto para la germinacioacuten simbioacutetica como para la asimbioacutetica es de vital importancia que los frascos las semillas aparatos y el medio esteacuten esteacuteriles desde el principio del proceso Esto debido a que cualquier hongo o bacteria que se introduzca creceraacute maacutes raacutepido que las semillas ocupando su espacio hasta matarlas Esto se evita gracias al autoclave el cual regulado a 12 atm y 120ordmC por 20 minutos mata hongos o bacterias presentes en el medio (McKENDRICK 2000)
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2331 Siembra de las semillas Las semillas pueden ser recolectadas desde caacutepsulas verdes o maduras La caacutepsula verde que estaacute madurando estaacute llena de semillas y no se deforma cuando se aprieta con las pinzas Estas semillas pueden ser almacenadas por algunas semanas en un lugar refrigerado con bastante aireacioacuten Las semillas se pueden sembrar a partir de caacutepsulas verdes o semillas secas A continuacioacuten se muestran las ventajas y desventajas de ambos meacutetodos
- Siembra a partir de caacutepsulas verdes Si las caacutepsulas se mantienen intactas el interior (las semillas) se mantiene esteacuteril Por lo tanto si se esteriliza la parte exterior de las mismas donde hongos y bacterias pueden desarrollarse y se abren las caacutepsulas bajo condiciones esteacuteriles y las semillas podraacuten mantenerse desinfectadas
La ventaja de este meacutetodo es que no se requiere de esterilizacioacuten de las semillas lo que provoca su deterioro Otro punto a favor es que algunas semillas podriacutean germinar maacutes raacutepido que las provenientes de caacutepsulas maduras por los mecanismos de dormancia La desventaja es que en este caso todas las semillas deben ser utilizadas o eliminadas mientras que las semillas maduras se pueden almacenar Tambieacuten se debe considerar que las semillas sembradas a partir de caacutepsulas que no han madurado lo suficiente podriacutean germinar lentamente o simplemente no germinar - Siembra a partir de semillas secas En este caso una vez que la caacutepsula es abierta las semillas dejan de ser esteacuteriles y requieren de un proceso de esterilizacioacuten Comuacutenmente se utiliza una solucioacuten de hipoclorito de sodio hipoclorito de calcio o peroacutexido de hidroacutegeno Las semillas se agitan dentro de la solucioacuten que ademaacutes contiene una gota de detergente para ldquohumedecerlasrdquo luego se las enjuaga con agua destilada y se las siembra en el medio preparado La ventaja de este meacutetodo es que las semillas pueden ser colectadas secadas al aire almacenadas por varios meses en el refrigerador y utilizarlas cuando sea necesario Se debe considerar que la siembra ya sea de caacutepsulas verdes o de semillas secas estaacute determinado por la eacutepoca en que se colectan (McKENDRICK 2000) 234 Trasplante En la caacutemara de incubacioacuten las plaacutentulas se han desarrollado en condiciones limpias y en un ambiente cerrado por lo que deben acostumbrase gradualmente al ambiente exterior antes de ser trasplantadas a las macetas Tambieacuten la temperatura y la luz la cual es baja han sido constantes durante el cultivo in vitro En el medio natural la temperatura y la luz variacutean constantemente por lo que las nuevas plantas deben estar protegidas de la fuerte luz solar la cual puede quemar las hojas con soacutelo una pequentildea cantidad de eacutesta La humedad en los frascos es alta y las plantas estaacuten protegidas de ataques por hongos o bacterias Ademaacutes las plaacutentulas han crecido bajo condiciones de alta humedad y por lo tanto tendraacuten cutiacuteculas deacutebiles por lo que necesitan acostumbrase a medios menos huacutemedos antes de ser transplantadas
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Para el trasplante se deben colocar los frascos en un lugar protegido de la lluvia para que se aclimaticen a las nuevas condiciones de luz y temperatura Se deben dejar por 2 a 4 semanas en los frascos tapados Luego se debe ir aflojando las tapas para dejar entrar pequentildeas cantidades de aire hasta el punto de dejarlas descubiertas Se debe revisar si hay hojas marchitas y ver que el sustrato esteacute huacutemedo
Lo ideal es dejarlas sin tapa durante una semana antes de pasarlas a las macetas Para el trasplante se debe elegir un sustrato adecuado para el tipo de planta humedecerlo y transplantar las plantas con cuidado de no dantildear las raiacuteces y evitando la deshidratacioacuten En esta etapa tambieacuten se debe dejar las macetas selladas para evitar una raacutepida deshidratacioacuten e ir abrieacutendolas paulatinamente (McKENDRICK 2000)
24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas 241 Orquiacutedeas terrestres 2411 Cypripedium Esta es una orquiacutedea terrestre de zonas templadas se desarrolla en el Hemisferio Norte como por ejemplo en Guatemala y en Honduras pero donde se encuentra principalmente es en China Su forma maacutes comuacuten de propagacioacuten es in vitro a partir de semillas La forma maacutes eficiente es a partir de semillas inmaduras Existe un intervalo de tiempo entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten eacuteste dependeraacute de la especie y de la zona donde se desarrolle Se asume que existen aproximadamente cuatro semanas entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten El oacuteptimo para una buena germinacioacuten de Cypripedium es entre 42 y 60 diacuteas despueacutes de la polinizacioacuten y entre 14 y 32 diacuteas despueacutes de la fertilizacioacuten La germinacioacuten ocurre entre la segunda y cuarta semana despueacutes de ser sembradas y los protocormos deberiacutean ser cambiados de medio de cultivo cada dos a cuatro meses si no se corre el riesgo de sufrir agotamiento de nutrientes Los rizomas y las raiacuteces se empiezan a desarrollar a partir de los siete meses para luego dar lugar a las primeras hojas Para obtener un buen transplante se deben tener raiacuteces de miacutenimo un centiacutemetro de largo El desarrollo de raiacuteces se ve potenciado al tener un periacuteodo corto de bajas temperaturas (10degC) exposicioacuten a la luz reduccioacuten en la concentracioacuten de iones del medio de cultivo o transferirlas a un compost esteacuteril Al tener raiacuteces suficientes y el tamantildeo adecuado se podraacuten llevar las plantas al lugar donde creceraacuten definitivamente En el momento del transplante las plantas son muy susceptibles al desecamiento por lo cual lo ideal es que los brotes sean maacutes chicos que las raiacuteces El mejor sustrato seriacutea aquel donde crece naturalmente la orquiacutedea (RAumlNNBAumlCK 2007) 2412 Preservacioacuten in vitro de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes Este estudio fue hecho para establecer que parte de tejido es viable para la micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes del noreste de Europa pudiendo asiacute reestablecer dichas orquiacutedeas a sus aacutereas correspondientes La propagacioacuten in vitro de orquiacutedeas
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terrestres de clima templado es maacutes difiacutecil que las orquiacutedeas epiacutefitas de clima subtropical y tropical Las orquiacutedeas terrestres tienen requerimientos maacutes estrictos que las epiacutefitas y se conoce menos sobre sus necesidades especiacuteficas (VAASA y ROSENBERG 2004) En Estonia existen 36 especies de orquiacutedeas terrestres pero solo tres estaacuten bajo proteccioacuten Dactylorhiza baltica Dactylorhiza ruthei Dactylorhiza praetermissa Como explantes para este estudio en el caso de D baltica se ocuparon protocormos en los otros dos casos se utilizaron semillas semi maduras las cuales fueron colectadas siete y diez semanas despueacutes de ser polinizadas Para D baltica se ocupoacute el medio Murashige y Skoog suplementado con 05 mgL de aacutecido naftaleacuten aceacutetico (ANA) y 2 mgL de isonpentenyl adenina Para el caso de las semillas semi maduras se ocuparon los medios de Lindemann de Heller de Norstog y de Murashige y Skoog como control
La composicioacuten del medio y la madurez de las semillas influye mucho en el desarrollo de las orquiacutedeas in vitro Se ha demostrado que se necesita una alta concentracioacuten de microelementos para obtener una correcta germinacioacuten de las semillas Tambieacuten se puede decir que los primeros tres meses son los de mayor crecimiento luego de este tiempo el crecimiento se vuelve maacutes lento (VAASA y ROSENBERG 2004)
Luego de cuatro semanas de crecimiento de D baltica el 60 de los explantes de meristemas apicales empezaron a crecer en cambio los de meristemas laterales no expresaron ninguacuten tipo de crecimiento Las raiacuteces empezaron su desarrollo luego de dos meses despueacutes de la siembra
En el caso de D ruthei y D praetermissa la germinacioacuten se produjo despueacutes de dos meses desde la inoculacioacuten Luego de cuatro y seis meses el mayor crecimiento fue observado en el medio Norstog superando en 14 al medio testigo Murashige y Skoog (VAASA y ROSENBERG 2004)
2413 Longevidad de semillas de orquiacutedeas terrestres Por lo general las orquiacutedeas producen muchas pero pequentildeas semillas que contienen muy pocas reservas de alimento Dichas semillas estaacuten estructuralmente adaptadas para ser dispersadas por el viento pero poco se sabe del destino de eacutestas luego de ser dispersadas Algunos estudios de viabilidad de semillas indican una sobrevivencia de uno a dos antildeos en orquiacutedeas de clima templado Las semillas que son guardadas en laboratorio duran mucho maacutes tiempo Se estudioacute la viabilidad de siete especies de orquiacutedeas norteamericanas dentro de las cuales se encuentran Goodyera pubescens y Liparis liliifolia Las semillas de eacutestas se colocaron en bolsas con suelo y sustratos de bosques provenientes de sus haacutebitats naturales (WHIGHAM et al 2005) En Goodyera pubescens la mayoriacutea de las semillas germinaron en un antildeo Cuatro otras especies germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero algunas semillas no germinadas despueacutes de siete antildeos seguiacutean siendo viables En la especie Liparis liliifolia semillas que han estado cuatro antildeos bajo observacioacuten han tenido una tasa de
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germinacioacuten de un 68 al ser sembradas in vitro junto con el hongo micorriacutezico adecuado Las dos especies restantes no germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero las semillas fueron evaluadas como intactas y testeadas positivamente en cuanto a su viabilidad despueacutes de cuatro antildeos en el suelo Estas observaciones fueron interpretadas como diferentes estrategias para especies especiacuteficas de germinacioacuten in situ (WHIGHAM et al 2005) 2414 Sobrevivencia de orquiacutedeas terrestres transplantadas a sectores urbanos La conservacioacuten de poblaciones de orquiacutedeas silvestres depende del establecimiento de las orquiacutedeas propagadas a los campos Sin embargo se conoce muy poco de los factores bioacuteticos que influencian el establecimiento de orquiacutedeas terrestres a sus haacutebitats naturales Un experimento fue establecido para medir la sobrevivencia de seis especies durante su primer periacuteodo de crecimiento seguido del transplante a un sector urbano en Australia (SCADE et al 2006)
Las orquiacutedeas germinadas simbioacuteticamente crecieron en laboratorio durante cinco meses antes de establecer la plantacioacuten en sitios adyacentes con alta o baja cobertura de malezas Existioacute una muerte gradual de las plaacutentulas durante el primer periacuteodo de crecimiento primeramente por ataque de insectos no siendo evitado por la presencia de una malla cobertora Los iacutendices de sobrevivencia variacutean desde 49 para Microtis media una especie capaz de crecer en un ambiente atiacutepico hasta un 21 para Caladenia arenicola la orquiacutedea nativa maacutes comuacuten de esos sitios Sin embargo no todas las orquiacutedeas sobrevivientes producen tubeacuterculos por lo que la tasa de sobrevivencia despueacutes del primer periacuteodo seco disminuye
La sobrevivencia de las orquiacutedeas sembradas no puede ser comparada con orquiacutedeas de la misma especie que crecieron en los mismos lugares ya que no existioacute la presencia del hongo compatible para estas orquiacutedeas (SCADE et al 2006)
2415 Micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres En India dos orquiacutedeas muy importantes para la horticultura del geacutenero Anoectochilus fueron exitosamente propagadas Noacutedulos aislados de A sikkimensis colectadas en Himalaya y A regalis colectadas en India fueron cultivadas in vitro durante 12 semanas para obtener un maacuteximo de 48 a 56 protocormos y brotes obteniendo como resultado un 95 y 98 de eficiencia respectivamente Durante el repicado de los explantes in vitro de A regalis se observoacute que el nuacutemero total de brotes obtenidos a partir de noacutedulos fue 214 asiacute como tambieacuten 82 puntas de brotes En cambio para A sikkimensis fueron mucho maacutes bajos 123 y 43 respectivamente teniendo un crecimiento maacutes lento pero plantas maacutes fuertes Las raiacuteces de 4 a 6cm crecieron con la presencia de NAA (270 microM ) en el medio asiacute como tambieacuten con carbono activado (02) Durante la aclimatacioacuten la tasa de establecimiento fue entre 95 y 98 Luego de seis meses en invernadero las plantas de A regalis fueron transferidas a bosque nativo donde se obtuvo una tasa de
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sobrevivencia de entre 70 y 95 despueacutes de 12 meses Estas plantas establecidas en bosque nativo estaacuten libres de cualquier defecto morfoloacutegico y de crecimiento (GANGAPRASAD et al 2000) 242 Orquiacutedeas epiacutefitas Estas orquiacutedeas viven en los aacuterboles pero no obtienen de eacuteste su alimento no son paraacutesitas 2421 Preservacioacuten de Cattleya walkeriana usando propagacioacuten in vitro El geacutenero Cattleya se encuentra en Meacutexico y Ameacuterica Central asiacute como tambieacuten en Venezuela Colombia y las laderas de los Andes Esta orquiacutedea tambieacuten se encuentra en varias regiones del Brasil creciendo en aacuterboles rocas cerca de riacuteos lagos y pantanos Las flores de esta orquiacutedea son conocidas debido a su hermosura y a causa de la destruccioacuten de su haacutebitat y a la excesiva coleccioacuten de eacutestas se encuentra en extincioacuten
La composicioacuten del medio de cultivo es esencial para la propagacioacuten in vitro ya que suple todos los nutrientes necesarios para el desarrollo y seraacute distinto dependiendo de cada especie en este caso se utilizoacute la mitad de los macronutrientes del medio Muchos autores sugieren el uso de carboacuten activado en el medio ya que por lo general en muchas especies aumenta el desarrollo de las raiacuteces En este estudio se probaron distintas dosis de carboacuten activado 1 2 4 y 6gL con un pH de 6 (TADEU DE FARIA et al 2002) Las semillas se obtuvieron de flores artificialmente polinizadas en invernadero Plaacutentulas de aproximadamente un centiacutemetro fueron seleccionadas y cultivadas nuevamente en el medio de cultivo Murashige y Skoog pero esta vez con las diferentes dosis de carboacuten activado Se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces el nuacutemero de brotes y el peso de la materia verde total Durante el autoclavado se produce normalmente una hidroacutelisis de sacarina la cual es de 10 aproximadamente este porcentaje aumenta considerablemente al agregar un 1 de carboacuten activado llegando a ser de 95
El desarrollo de las plaacutentulas de C walkeriana aumentan con una mayor concentracioacuten de carboacuten activado asiacute como tambieacuten un mayor tiempo de cultivo El resultado fue que la dosis ideal para el desarrollo de esta orquiacutedea es 2gL de carboacuten activado (TADEU DE FARIA et al 2002) 2422 Establecimiento de cultivos in vitro y micropropagacioacuten de Cattleya aurantiaca (Bateman ex Lindl) Por medio de siembra in vitro se logroacute el establecimiento de C aurantiaca con alto porcentaje de germinacioacuten y desarrollo de protocormos Para la oacuteptima formacioacuten de callo y para la proliferacioacuten de protocormos se determinaron los medios oacuteptimos (MS 10 mgL ANA 10 mgL BA) asiacute como tambieacuten de manera directa sobre explantes de hoja y pseudobulbos (MS 01 mgL ANA 01 mgL GA3)
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Con este uacuteltimo medio tambieacuten se logroacute una oacuteptima regeneracioacuten y desarrollo de plaacutentulas Los medios liacutequidos (sin agitacioacuten) son una buena opcioacuten para conseguir la produccioacuten masiva de protocormos ya que con ellos se optimizoacute la micropropagacioacuten de C aurantiaca Las plaacutentulas micropropagadas presentaron alto porcentaje de sobrevivencia y buen desarrollo despueacutes de su trasplante y aclimatacioacuten lo cual demuestra que es un buen sistema de propagacioacuten para C aurantiaca (GUTIERREZ y SALGADO 2007) En cuanto a transplante y aclimatacioacuten despueacutes de 45 diacuteas de desarrollo in vitro las plaacutentulas de un tamantildeo entre 3 y 5 cm con raiacuteces bien desarrolladas fueron llevadas a condiciones ex vitro eliminando los restos de medio de cultivo con agua potable y ocupando un sustrato de partes iguales de tezontle y corteza de encino cubierta con hojarasca de encino finamente molida Se mantuvieron cubiertas durante 15 diacuteas abriendo cada dos diacuteas hasta poder retirar la tapa en 30 diacuteas Despueacutes de dos meses de haber sido retiradas del cultivo in vitro las plaacutentulas presentaron 70 de sobrevivencia y alcanzaron una altura de hasta 7 cm presentando nuevas hojas y raiacuteces las plantas se muestran vigorosas y capaces de continuar su crecimiento en condiciones ambientales de invernadero (GUTIERREZ y SALGADO 2007)
2423 Establecimiento in vitro y regeneracioacuten de plantas de Laelia autumnalis (Llave y Lex) Lindl Para este estudio se obtuvieron las semillas de una caacutepsula desarrollada despueacutes de 6 meses de la floracioacuten las cuales se sembraron in vitro sin presentar contaminacioacuten ya que la siembra por este meacutetodo es muy eficiente en comparacioacuten al cultivo de semillas libres donde algunas veces se presenta la contaminacioacuten Las observaciones se realizaron cada 15 diacuteas la germinacioacuten se detectoacute en los primeros 15 diacuteas en la mayoriacutea de los medios de cultivos probados con la presencia de protocormos de 1mm de diaacutemetro (HUAPEO y SALGADO 2004) El porcentaje de germinacioacuten que se obtuvo de las semillas cultivadas in vitro de L autumnalis fue de 95 a 100 en todos los medios de cultivo la uacutenica diferencia fue el tiempo entre las germinaciones A excepcioacuten de las semillas cultivadas en el medio MS 100 la germinacioacuten del 100 se obtuvo hasta los 30 diacuteas de cultivo mientras que en el primero la germinacioacuten fue a los 15 diacuteas del cultivo Las plaacutentulas con raiacutez y un par de hojas se lograron a los 90 diacuteas de cultivo en el medio MS 100 alcanzando 07 mm de altura Estas plaacutentulas fueron subcultivadas en medio MS con 05 mgl de ANA y 01 mgl de GA3 para tener plaacutentulas fuente de explante (segmentos de hojas) un medio oacuteptimo de desarrollo de plaacutentulas de L speciosa No fue necesario probar otros medios de cultivos ya que se hicieron pruebas anteriores que demostraron que era el adecuado
Las plaacutentulas de 6 meses de cultivo in vitro despueacutes de su germinacioacuten presentaron una altura promedio de 5 cm con raiacuteces con velamen y hasta dos pares de hojas Segmentos de hoja de eacutestas fueron cultivadas en el medio MS conteniendo ANA BA y GA3 en diferentes concentraciones y se realizaron observaciones cada 30 diacuteas para determinar medios inductores de callo protocormos y raiacuteces La mejor respuesta en formacioacuten de callo fue observada en los segmentos de hoja de plaacutentulas de L autumnalis cultivados en MS con 1 mgl de ANA BA y GA3 iniciando la induccioacuten de
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eacuteste desde los 30 diacuteas de cultivo solamente en un 70 de los explantes cultivados El 100 se logroacute a los 90 diacuteas de cultivo observando callo abundante alrededor de todo el tejido de color blanco con puntos pigmentados de color verde La regeneracioacuten de protocormos de esta orquiacutedea se establecioacute con la siembra de segmentos de hoja de plaacutentulas de 6 meses de edad de manera directa o a partir de callos En callos la produccioacuten fue oacuteptima en el medio MS con 01 mgl de ANABAGA3 ya que a los 60 diacuteas se obtuvieron 50 protocormos por segmento de callo Solamente se produjeron 10 protocormos por explante al cultivarse los segmentos de hoja en MS con 01 mgl de ANABAGA3 a los 120 diacuteas de cultivo (HUAPEO y SALGADO 2004) 25 Aclimatacioacuten Aclimatacioacuten significa que el hombre intercede y guiacutea el proceso de acondicionamiento de las plantas hasta que eacutestas sean aptas para crecer en el campo yo invernadero
Un alto nuacutemero de plantas micropropagadas no sobreviven al cambio desde el cultivo in vitro hacia el ambiente exterior ya sea en campo o invernadero Eacutestos dos uacuteltimos tienen menor humedad relativa niveles maacutes altos de luminosidad y un ambiente seacuteptico los cuales son maacutes estresantes para las plantas micropropagadas La mayoriacutea de las especies que crecen in vitro necesitan un proceso de aclimatacioacuten pudiendo obtener asiacute un nuacutemero suficiente de plantas vivas y vigorosas para trasplantar al suelo (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991)
La aclimatacioacuten no es uacutenicamente para micropropagacioacuten siendo usada ademaacutes en propagacioacuten convencional durante antildeos Despueacutes de cortar las hojas y de haber formado raiacuteces por lo general son aclimatadas antes de ser llevadas al campo o invernadero Ejemplos de dos teacutecnicas comunes son bajar gradualmente la humedad y mantener el nivel de luz con un 50 de sombra antes de trasladarlos al campo Las raiacuteces que han sido cortadas y mal limpiadas muchas veces son focos de infeccioacuten En estos casos las plantas muestran signos de marchitez hojas necrosadas y tambieacuten se puede llegar a la muerte de eacutestas El cultivo in vitro reduce la necesidad de fotosiacutentesis ya que las condiciones de la caacutemara de incubacioacuten proveen a la planta de sacarosa u otro azuacutecar Tambieacuten en estas condiciones se reduce el stress por patoacutegenos al ser un ambiente aseacuteptico Todo esto se traduce en que las plantas micropropagadas no son aptas para el campo yo invernadero (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 251 Stress hiacutedrico El stress hiacutedrico puede ser el resultado de una excesiva transpiracioacuten de las diferentes partes aeacutereas de las plantas especialmente de las hojas o por una inadecuada absorcioacuten de agua por parte de las raiacuteces La cutiacutecula y los estomas son la ruta primaria de peacuterdida de agua desde de las hojas provenientes de esta teacutecnica reproductiva 2511 Cutiacutecula La cutiacutecula es una membrana compuesta por una matriz de cutina que a su vez se encuentra cubierta en su superficie por ceras cuya funcioacuten primaria consiste en limitar la peacuterdida de agua por transpiracioacuten La permeabilidad del agua a traveacutes de la cutiacutecula se ve influenciada principalmente por la estructura y la cantidad de
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ceras cuticulares y epicuticulares no vieacutendose afectada la peacuterdida de agua por el grosor de eacutesta o la naturaleza quiacutemica de la matriz de la cutina La estructura cristalina de la parte encerada de las hojas es distinta en las plantas micropropagadas con respecto a las plantas que crecen en el campo La cera epicuticular de las hojas de plantas in vitro tienen una proporcioacuten maacutes alta de esteres y de componentes polares por el contrario tienen unas cadenas de hidrocarbonos mucho maacutes cortas Esto hace que las plantas in vitro pierdan maacutes agua que las cultivadas en campo o invernadero
Las plantas que han crecido en el campo son naturalmente de color verde pero el color de las plantas cultivadas in vitro es diferente y se puede ver a simple vista Las plantas que son pasadas a invernadero y que tengan un color verde se aclimatan de mejor forma al ambiente exterior (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 2512 Estomas La estructura estomaacutetica y su funcionamiento han sido implicados recurrentemente en el desbalance de agua exhibido por plantas micropropagadas al momento de ser removidas del cultivo in vitro Estudios con microscopiacutea de scanner electroacutenico han indicado que la estructura estomaacutetica presente en algunas especies de plantas cultivadas in vitro difieren marcadamente de las cultivadas en invernadero o en el suelo Debido a que las primeras presentan estomas de mayor tamantildeo y maacutes redondos a diferencia de las plantas cultivadas de manera normal que presentan estomas maacutes pequentildeos y eliacutepticos lo que resulta en una deshidratacioacuten maacutes raacutepida en el caso de las provenientes de cultivo in vitro (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 252 Humedad Debido a la anatomiacutea y la condicioacuten fisioloacutegica de las plantas desarrolladas in vitro donde se ha mantenido una alta humedad relativa es necesario regar al momento del traslado para obtener una alta sobrevivencia Muchos laboratorios aseguran que hay que evitar tener un sistema de aspersioacuten ya que se produce el ambiente necesario (muy huacutemedo) para la aparicioacuten de hongos algas o bacterias Otros meacutetodos incluyen el uso de humidificadores o poner las macetas en un lugar cerrado donde se retenga vapor para esto se pueden usar por ejemplo tapas de polietileno Este meacutetodo es relativamente econoacutemico pero se debe tener control del calor y monitorear la falta de agua (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 253 Luz Durante la etapa in vitro las plantas estaacuten expuestas a altos niveles de luminosidad lo que se traduce en hojas delgadas Antes del traslado se recomienda mantener las plantas con un 50 de sombra para asiacute poder aclimatarlas de mejor manera esto debido a que las plantas micropropagadas tienen un bajo control sobre la transpiracioacuten y un inadecuado mecanismo de fotosiacutentesis La sombra reduce la transpiracioacuten evitando excesivas peacuterdidas de agua asiacute como tambieacuten el exceso de luz destruye las moleacuteculas de clorofila Luego del periacuteodo bajo sombra se deben mover las macetas gradualmente hacia el nivel de luz al cual seraacute llevado para su crecimiento final (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 254 Temperatura La temperatura del aire y del medio o sustrato de crecimiento estaacute generalmente controlado durante el periacuteodo de aclimatacioacuten El calor es necesario en los meses de invierno y el friacuteo (enfriar) es esencial en los meses de verano Ajustando la cantidad de sombra y humedad se obtiene un control sobre la temperatura El
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enfriamiento se puede obtener gracias a ventilacioacuten abanicos niebla o aire acondicionado El calor puede provenir del sistema existente en el edificio o invernadero donde esteacuten ubicadas las macetas o por las laacutemparas ocupadas para el control del fotoperiacuteodo El rango de temperatura que se mantiene por lo general es entre los 13 y 30ordmC y esta determinado principalmente por la especie en cuestioacuten La temperatura de la zona donde se encuentran las raiacuteces es muy importante para el crecimiento lo ideal es que dicho sector tenga una mayor temperatura que el aire fomentando el crecimiento de las raiacuteces e incrementando la humedad alrededor de la planta Durante el verano esto es difiacutecil de obtener ya que la temperatura del aire es muy alta debido a la alta radiacioacuten solar Terminado el proceso de aclimatacioacuten esto ya no es necesario (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 255 Fotosiacutentesis Las plantas sufren un cambio radical cuando son removidas desde cultivo in vitro ya que son forzadas a cambiar de heterotroacuteficas a autotroacuteficas y la fotosiacutentesis se vuelve fundamental para la sobrevivencia Las hojas de las plantas in vitro no estaacuten formadas para hacer fotosiacutentesis ya que en la caacutemara de incubacioacuten no se produce un fuerte intercambio gaseoso esto debido a que la sacarosa es entregada a traveacutes del medio de cultivo Las hojas de las plantas que son trasladadas al campo o invernadero sufren deterioro debido a que no estaacuten formadas para la fijacioacuten de carbono Esto se produce por un tiempo aproximado de cuatro semanas despueacutes de las cuales las hojas nuevas suplen a las viejas Otro punto es que las hojas de las plantas cultivadas in vitro contienen menor proporcioacuten de clorofila que las plantas que han crecido normalmente en el campo En un estudio de coliflor cultivado in vitro se midioacute el CO2 y se obtuvo un balance negativo el cual se mantuvo durante dos semanas despueacutes del transplante Algo similar ocurrioacute con frutilla despueacutes del transplante las hojas se deterioraron raacutepidamente lo que quiere decir que no hubo incremento en la fijacioacuten de carbono indicando falta de desarrollo en la competencia fotosinteacutetica
El bajo nivel de CO2 durante el cultivo in vitro limita el proceso de fotosiacutentesis lo cual se puede compensar usando sacarosa en el medio de cultivo Tambieacuten se puede incrementar el nivel de luz y CO2 obteniendo un fuerte aumento en el crecimiento de varias especies como orquiacutedeas clavel etc (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 256 Sustrato Un sustrato es todo material soacutelido distinto del suelo natural mineral u orgaacutenico que colocado en un contenedor en forma pura o en mezcla permite el anclaje del sistema radicular de la planta desempentildeando por lo tanto un papel de soporte para la planta El sustrato puede intervenir o no en el complejo proceso de la nutricioacuten mineral de la planta (INFOAGRO 2007) El sustrato y los contenedores dentro de los cuales se van a transplantar las plaacutentulas in vitro son importantes para una buena sobrevivencia
Los sustratos ejercen una influencia significativa en la arquitectura del sistema radical de las plantas y en las asociaciones bioloacutegicas de este con el suelo influenciando el
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estado nutricional y la translocacioacuten de agua en el sistema suelo-planta-atmoacutesfera Uno de los requisitos fundamentales que debe cumplir el sustrato para su utilizacioacuten es la sanidad Cuando estos no se elaboran almacenan o manejan correctamente pueden contaminarse y provocar serios dantildeos a las plantas durante la aclimatacioacuten por esta razoacuten son preferidos como componentes para su elaboracioacuten materiales inertes o aquellos en las cuales el proceso de obtencioacuten garantice la mayor desinfeccioacuten posible
Uno de los factores de mayor importancia a la hora de seleccionar los materiales que pueden constituir el sustrato es su disponibilidad tanto en teacuterminos de facilidad de obtencioacuten o suministro como de su costo (VILCHEZ et al 2007)
La presencia de inhibidores o tambieacuten cambios en el pH del sustrato pueden afectar el crecimiento de las raiacuteces y consecuentemente el eacutexito del transplante
Muchos laboratorios y viveros transplantan a un sustrato uniforme debiendo ser eacuteste adecuado en cuanto a soporte de las plantas pH porosidad aireacioacuten y drenaje (DEBERGH y ZIMMERMAN 1991)
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3 MATERIAL Y MEacuteTODO
Para la realizacioacuten de este trabajo se utilizoacute el siguiente material y meacutetodo
31 Material La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio e invernadero de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal pertenecientes a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de Chile
311 Material vegetal Se utilizaron plaacutentulas de C virescens cultivadas in vitro a partir de semillas las cuales fueron proporcionadas por el laboratorio estas plaacutentulas fueron separadas y repicadas para aumentar la poblacioacuten y obtener la cantidad necesaria para el ensayo
FIGURA 2 Plaacutentulas de C virescens en caacutemara de crecimiento in vitro
312 Materiales Los materiales que se utilizaron fueron los siguientes Equipos autoclave caacutemara de flujo laminar dispensador de medios medidor
de pH agitador magneacutetico horno microondas balanza mechero termoacutemetro Materiales vasos de precipitado matraces probetas pipetas papel de
aluminio frascos de vidrio placas Petri pinzas bisturiacute macetas regadera Soluciones soluciones madre (Medio MS) gelificante etanol 70 y 95
32 Meacutetodo A continuacioacuten se da a conocer la metodologiacutea con la cual se trabajoacute 321 Preparacioacuten del medio de cultivo Para la obtencioacuten de plantas a traveacutes de la micropropagacioacuten se ocupoacute el medio basal de MURASHIGE y SKOOG (1962) tambieacuten llamado medio MS Este medio tiene un pH de entre 56-57 Posteriormente se dosificoacute con el dispensador de medios para que cada frasco tenga una cantidad adecuada (25 mL) y se llevoacute a autoclave para esterilizar a 12 atm 120ordm C por 20 min
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322 Obtencioacuten del material vegetal Al tener el medio esterilizado se procedioacute a la separacioacuten y repicado de plaacutentulas existentes en el laboratorio Las siembras se realizaron en el mes de mayo del 2007 Estas siembras se realizaron en la caacutemara de flujo laminar de modo de asegurar que la siembra sea 100 aseacuteptica Estas plaacutentulas fueron mantenidas en la caacutemara de incubacioacuten hasta obtener los tamantildeos requeridos para el ensayo donde las condiciones fueron las siguientes
minus Temperatura ambiental de 23-25ordm C minus Fotoperiacuteodo de 16 horas minus Intensidad lumiacutenica controlada de 50-55 micromol m-2s-1
323 Sustratos Se utilizaron tres tipos de sustratos el primero corresponde a una mezcla de turba + perlita (11) el segundo corresponde a Sphagnum (100) y el tercero corresponde a una mezcla de turba + arena (11) Una vez realizadas las mezclas se procedioacute a una esterilizacioacuten en un autoclave a 121ordm C por 20 minutos a 12 atmoacutesfera De esta forma se trabajoacute con material limpio y sano evitando ataque de hongos o bacterias El anaacutelisis quiacutemico de los sustratos se muestra en el Anexo 2 324 Plantacioacuten Las plaacutentulas con un promedio de cuatro meses en condiciones de caacutemara de crecimiento in vitro obtuvieron el tamantildeo adecuado para ser utilizadas Se sacaron de los frascos y se plantaron en las macetas de plaacutestico transparente con los sustratos Posteriormente fueron dejadas en la sala del laboratorio donde se debioacute asperjar con solucioacuten nutritiva Hoagland y fungicida Captan CUADRO 1 Composicioacuten de solucioacuten nutritiva Hoagland
KNO3 102 gL Ca(NO3) 4 H2 O 0492 gL
NH4H2 (PO4) 023 gL MgSO4 7 H2O 049 gL
H3BO3 286 mgL MnCl2 2 H2O 181 mgL CuSO4 5 H2O 008 mgL ZnSO4 5 H2O 022 mgL Na2MoO4 H2O 009 mgL
FeSO4 7 H2O 05 06 mL FUENTE FINCK 1988 325 Disentildeo de los ensayos Este trabajo de investigacioacuten constoacute de un ensayo con dos etapas Antes que todo se realizoacute la separacioacuten y repicado in vitro de plaacutentulas de C virescens para la obtencioacuten del nuacutemero necesario de plantas En la etapa 1 se utilizaron tres tamantildeos de plaacutentulas obtenidas in vitro de 1-2cm de 2-3cm y de maacutes de 3cm de altura que se transplantaron a tres sustratos turba + perlita 11(vv) Sphagnum (100) y turba + arena 11 (vv) La turba provino de la Sociedad
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Minera Patagonia Peat SA en Hijuelas el Sphagnum de la empresa Lonquen Chile de Puerto Montt y la perlita se obtuvo a traveacutes del sitio web wwwjardisencl (representante legal Walter Rathgeb Penza Ingeniero Agroacutenomo Santiago) Las plaacutentulas se plantaron de acuerdo a su tamantildeo las de maacutes de 3cm se colocaron de 6 por maceta las de 2 a 3cm de a 8 por maceta y las maacutes chicas de a 10 por maceta Estas macetas fueron dejadas en una sala de aclimatacioacuten con una temperatura promedio de 20ordm C intensidad lumiacutenica de 50-55 micromol m-2s-1 y 14-16 hrs de fotoperiacuteodo Se fertilizoacute asperjando cada cinco diacuteas con solucioacuten nutritiva Hoagland Esta etapa se llevoacute a cabo durante dos meses desde el cinco de septiembre hasta el cinco de noviembre de 2007
En la etapa 2 se continuoacute el proceso de aclimatacioacuten en invernadero de las plaacutentulas obtenidas en la etapa 1 que despueacutes de dos meses teniacutean un mayor tamantildeo y se habiacutean acondicionado al ambiente exterior (fuera de la caacutemara de crecimiento) Las plantas se mantuvieron en las macetas durante tres semanas para aclimatarlas y luego las plantas sobrevivientes fueron transplantadas a macetas maacutes grandes individuales durante tres meses aproximadamente hasta el cinco de marzo 2008 Estas nuevas macetas tuvieron como sustrato turba y suelo (trumao) en igual proporcioacuten (Anexo 2) La temperatura promedio de invernadero fluctuoacute de 13 a 35 degC seguacuten el mes En enero el promedio fue de 25 (Anexo 3) Para bajar la temperatura alrededor de 5deg C se instaloacute una malla Rachel 326 Disentildeo experimental El disentildeo experimental utilizado fue completamente al azar ordenado como experimento factorial con dos factores tamantildeo (3) y sustrato (3) Cada tratamiento tuvo tres repeticiones con un miacutenimo de 6 plantas por recipiente 327 Variables a evaluar Durante los dos meses en que las macetas estuvieron en la sala de aclimatacioacuten se evaluoacute el desarrollo foliar contando el nuacutemero de hojas una vez al mes Posteriormente se trasladaron las mismas macetas a invernadero durante tres semanas para continuar con la aclimatacioacuten de las plaacutentulas Transcurrido este tiempo se transplantaron las plaacutentulas sobrevivientes a macetas individuales y continuoacute mensualmente la evaluacioacuten de eacutestas (nuacutemero de hojas) hasta la obtencioacuten de plantas establecidas Al momento del transplante y al final del ensayo se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces asiacute como tambieacuten al final del ensayo de evaluoacute el crecimiento en altura (cm) La sobrevivencia fue evaluada al final del ensayo por maceta
Tanto en la sala de aclimatacioacuten coacutemo en el invernadero se registroacute la temperatura con la ayuda de un termoacutemetro de maacutexima y miacutenima (Anexo 3) 328 Anaacutelisis estadiacutestico Una vez obtenidos los datos se procedioacute a comprobar si estos cumpliacutean con los supuestos de aleatoriedad normalidad y homogeneidad de varianzas que exige este tipo de anaacutelisis En el caso de no cumplirse estos supuestos los datos se transformaron utilizando log10(x+05) raiacutez(x+05) o 1x para normalizarlos
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y enseguida se sometioacute los datos a un anaacutelisis estadiacutestico (ANDEVA) Posteriormente en los casos en que se observoacute diferencias significativas en el ANDEVA se aplicoacute una prueba de rangos muacuteltiples (Tukey) al 5 de significancia Para las variables no parameacutetricas que no cumplieron con los supuestos para un anaacutelisis de varianza se realizoacute la prueba de KruskalndashWallis y las comparaciones muacuteltiples a traveacutes del test de Dunn con un nivel de 5 de significancia
Se utilizaron los programas estadiacutesticos STATGRAPHICS 20 y GRAPHPAD PRISM 5 para el anaacutelisis de datos
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4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
En los siguientes puntos se discuten los resultados obtenidos en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens
En la Figura 3 se observan plaacutentulas de C virescens micropropagadas en medio MS en caacutemara de crecimiento al inicio del ensayo (A) y en invernadero despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten (B)
BA
FIGURA 3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten
A continuacioacuten se presentan los resultados obtenidos para las variables analizadas (Cuadro 2 y 3) de esta manera se pueden visualizar en general los resultados obtenidos en el proceso de aclimatacioacuten durante seis meses
CUADRO 2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de raiacuteces
inicial y final Variables
Hojas finales (nuacutemero)
Raiacuteces iniciales (nuacutemero)
Raiacuteces finales (nuacutemero)
Tamantildeo de plaacutentulas 36 24 37 47 29 46
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 61 43 76
Sustratos 53 36 56 43 29 51
Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 46 27 49
Significa que hay diferencias significativas al 95 Test de Dunn
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Las variables no parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en hojas finales y raiacuteces iniciales en sus rangos de distribucioacuten Las raiacuteces finales no presentaron diferencias seguacuten el sustrato utilizado pero de acuerdo al tamantildeo hubo diferencias en su distribucioacuten
CUADRO 3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas
Variables Altura final de plaacutentulas
(cm) Sobrevivencia
Tamantildeo de plaacutentulas
36 c 567 b 47 b 821 a
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 59 a 908 a
Sustratos 52 a 933 a
41 ab 59 b Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 49 b 772 a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY Las variables parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en altura final de hojas y en sobrevivencia 41 Nuacutemero de hojas finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentulas y de sustratos para la variable nuacutemero final de hojas 411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula Seguacuten el Cuadro 2 y Figura 4 las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero final de hojas Las plaacutentulas pequentildeas de 1-2 cm obtuvieron el nuacutemero maacutes bajo de hojas finales con una media de 36 hojas por plaacutentula lo cual es la mitad de las hojas finales que se obtuvo con las plaacutentulas de mayor tamantildeo (61 hojas aproximado por plaacutentula) Para las plaacutentulas medianas de 2-3 cm se obtuvo una media de 47 hojas por plaacutentula (Figura 4)
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Hojas finales
1-2 cm 2-3cm maacutes de 3 cm0
5
10
15
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn)
BLANCO (2006) sentildeala que plaacutentulas cultivadas in vitro crecen bajo condiciones especiales como alta humedad relativa y baja luminosidad ademaacutes son suplidas con sacarosa Estas condiciones fueron proporcionadas en una caacutemara de crecimiento en el laboratorio donde las plantas micropropagadas no son dependientes por completo de su fotosiacutentesis son heteroacutetrofas Parece ser necesario un estiacutemulo para convertirse en organismos totalmente capaces de sustentar sus propios requisitos de carbono y nitroacutegeno reducido pasando de esta manera a ser autoacutetrofos
Al ser sacadas de un medio in vitro las hojas no estaacuten preparadas para producir su propio alimento y sobreviven gracias a que el medio de cultivo le proporciona los nutrientes necesarios para vivir En este punto muchas de las hojas mueren y nacen hojas nuevas capaces de generar su alimento supliendo asiacute las hojas viejas (SEELYE et al 2003) En este ensayo las plaacutentulas de Chloraea virescens presentaron en general una buena adaptacioacuten al ser sacadas de un medio in vitro
Se observoacute que plaacutentulas con menor tamantildeo al ser aclimatadas y tener menor tejido fue maacutes difiacutecil y maacutes lento que empezaran a generar nuevos tejidos y materia orgaacutenica a partir de dioacutexido de carbono POSPIacuteŠILOVAacute et al (1999) sentildeala que al tener los estomas con desarrollo incompleto maacutes grandes y de forma maacutes redonda pierden maacutes agua lo cual puede provocar una peacuterdida de hojas muriendo asiacute la plaacutentula Por esta razoacuten las plaacutentulas pequentildeas se demoran maacutes tiempo en generar hojas nuevas es por ello que al finalizar este estudio muestran el menor nuacutemero final de hojas 412 Efecto del tipo de sustrato Al analizar la influencia del tipo de sustrato se encontraron diferencias significativas entre los tres sustratos utilizados Seguacuten el Cuadro 2 y la Figura 5 el sustrato donde se obtuvo mejores resultados fue
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turba+perlita en el cual se observoacute un promedio de 53 hojas por plaacutentula siendo Sphagnum el maacutes bajo con 43 hojas por plaacutentula De acuerdo a los resultados del anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados el sustrato turba+perlita tiene mayor cantidad de nitroacutegeno foacutesforo calcio magnesio y azufre disponible comparativamente con los otros dos sustratos (Sphagnum y arena+turba) (Anexo 2)
Hojas finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
Sustratos
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) Para la brotacioacuten y el crecimiento de las plantas se necesita agua y Nitroacutegeno lo que favorece a una mayor tasa de aparicioacuten de hojas lo que se traduce en una mayor cantidad de hojas finales El Nitroacutegeno se encuentra en mayor cantidad en el sustrato turba+perlita debido a lo cual los mejores resultados se obtienen en dicho sustrato 413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Despueacutes de analizados los efectos individuales del tamantildeo y del sustrato al interactuar ambos factores existen diferencias significativas La mejor interaccioacuten se obtuvo con el sustrato turba+perlita y con el mayor tamantildeo de la plaacutentula (Figura 6) Debido a la buena estructura (porosa) de dicho sustrato se podriacutea decir que se favorecioacute la absorcioacuten radicular de nutrientes obteniendo por ello un mayor nuacutemero de hojas finales Para los menores tamantildeos no se observan diferencias significativas obteniendo como promedio 41 hojas por plaacutentula Para el mayor tamantildeo el promedio fue de 6 hojas por plaacutentula
28
Hojas finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 42 Raiacuteces iniciales Este paraacutemetro se evaluoacute luego de la primera etapa de aclimatacioacuten la cual se realizoacute en una sala de aclimatacioacuten del laboratorio Se analizoacute la influencia de diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos sobre la variable nuacutemero raiacuteces iniciales (Anaacutelisis de Kruskal-Wallis en Anexo 7)
FIGURA 7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses de pre aclimatacioacuten
29
En la Figura 7 se puede observar los resultados de pre aclimatacioacuten en sala de laboratorio En esta etapa ya es posible ver la presencia de raiacuteces desarrolladas 421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula En el Cuadro 2 se puede observar que las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero inicial de raiacuteces y en la Figura 8 se puede comprobar que para los dos tamantildeos de plaacutentula maacutes pequentildeos no se observa gran cantidad de raiacuteces esto no impidioacute el desarrollo posterior de las plaacutentulas las cuales lograron enraizar al final del estudio Esto se contrapone a lo observado en un estudio de Lapageria rosea donde la presencia de raiacutez y brote para lograr una multiplicacioacuten exitosa de plantas es de vital importancia Incluso algunas plaacutentulas de L rosea no brotan en condiciones in vitro en donde tienen las mejores condiciones nutricionales y hormonales para hacerlo Esto se debe a factores internos de la plaacutentula siendo muy difiacutecil que broten inmediatamente en caacutemara de aclimatacioacuten donde ya dejan de recibir los nutrientes necesarios de manera directa y requieren de balances de energiacutea para poder seguir elongando raiacuteces absorber nutrientes y brotar para poder obtener los carbohidratos necesarios para seguir su crecimiento (BLANCO 2006) El tamantildeo de plaacutentula tiene importancia para el desarrollo de raiacuteces se distingue notoriamente que en los tamantildeos maacutes grandes el nuacutemero de raiacuteces es mayor comparativamente con los tamantildeos pequentildeos donde el nuacutemero de raiacuteces fue escaso Debido a la presencia de maacutes hojas existe una mayor cantidad de aacuterea fotosinteacutetica esta situacioacuten estimula el crecimiento de las raiacuteces para la obtencioacuten de agua y nutrientes
Raices iniciales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
2
4
6
8
10
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o inicial de ra
iacuteces
FIGURA 8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn)
30
422 Efecto del tipo de sustrato Para el sustrato turba+perlita se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas en el nuacutemero de raiacuteces con respecto a los dos otros sustratos esto se puede ver en el Figura 9 donde se observa que se obtuvieron los mayores resultados En cualquier medio de crecimiento el espacio no ocupado por un soacutelido se llama porosidad este espacio puede ser ocupado en parte para retener agua y en parte para proporcionarle aire a las raiacuteces La ausencia de uno de estos elementos es perjudicial para las plantas La turba es conocida por tener estas propiedades y la perlita tambieacuten por esta razoacuten se sabe que la mezcla turba-perlita provee propiedades fiacutesicas excelentes como medio de crecimiento y propagacioacuten (INFOAGRO 2007) Estos resultados con turba-perlita (298 de materia orgaacutenica) coinciden con los obtenidos por DIAZ et al (2004) quienes al utilizar un sustrato compuesto por 100 de humus de lombriz para aclimatar cantildea de azuacutecar obtuvieron el mayor nuacutemero de raiacuteces Esto puede atribuirse al importante aporte de materia orgaacutenica del humus (47) lo que le confiere una mejor estructura obtenieacutendose una excelente porosidad del sustrato La aireacioacuten del suelo es necesaria para favorecer la maacutexima absorcioacuten de nutrientes por las raiacuteces Esto tambieacuten sucede en el sustrato turba+perlita el cual posee la mayor cantidad de materia orgaacutenica de los tres sustratos utilizados
Raices iniciales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
2
4
6
8
10
Sustratos
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato En los anaacutelisis para la variable nuacutemero de raiacuteces se puede decir que la mejor interaccioacuten se presentoacute para el sustrato de turba+perlita junto con el mayor tamantildeo de plaacutentulas obteniendo los valores maacutes altos entre los nueve tratamientos La presencia de raiacuteces luego de la micropropagacioacuten aumenta la posibilidad de eacutexito en el transplante ya que se crea un favorable balance de agua Pero esto no quiere
31
decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
10
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
32
En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
33
El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
34
Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
VII
INDICE DE ANEXOS
Anexo Paacutegina
1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962)
y suplementos orgaacutenicos 44
2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio 45
3 Registro de temperaturas miacutenimas maacutexima y promedio durante
el estudio 46
4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas
finales 47
5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales 47
6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces
iniciales 48
7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces
iniciales 48
8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces
finales 49
9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales 49
10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en
aclimatacioacuten 50
11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura 50
12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de
plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten 51
13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia 51
14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea 52
1
RESUMEN Dentro del esquema de micropropagacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens la aclimatacioacuten es la etapa final donde la manipulacioacuten debe ser muy cuidadosa ya que es donde se produce el mayor iacutendice de mortandad principalmente en el proceso de trasplante Esta etapa es muy importante ya que gracias a ella se veraacute la eficiencia del proceso y la calidad final de las plantas producidas in vitro por eso el objetivo general de este trabajo es evaluar la influencia del tamantildeo de plaacutentulas y utilizacioacuten de distintos sustratos en la aclimatacioacuten ex vitro de plaacutentulas de C virescens Se utilizaron plaacutentulas de Chloraea virescens obtenidas a partir de la micropropagacioacuten de protocormos provenientes de germinacioacuten asimbioacuteticas de semillas efectuada en el laboratorio de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal de la Universidad Austral de Chile Las plaacutentulas fueron repicadas hasta obtener el nuacutemero adecuado para el ensayo Luego fueron trasladadas a una sala del laboratorio en macetas de seis ocho y diez plaacutentulas dependiendo del tamantildeo de la plaacutentula (maacutes de 3cm 2-3cm y 1-2cm respectivamente) por dos meses posteriormente fueron transferidas a 3 sustratos turba+perlita (11) Sphagnum y turba+arena (11) y fueron llevadas a invernadero durante cuatro meses Las variables evaluadas fueron nuacutemero final de hojas nuacutemero inicial y final de raiacuteces altura y sobrevivencia de las plaacutentulas Los resultados obtenidos demostraron que los tamantildeos y los sustratos ocupados influyen en el crecimiento de las plaacutentulas El mejor tamantildeo para la aclimatacioacuten es de maacutes de 3cm obteniendo con eacuteste los mejores resultados en todas las variables evaluadas Lo mismo ocurrioacute con el sustrato turba+perlita el cual fue el mejor evaluado
2
REacuteSUMEacute Dans le scheacutema de la micropropagation de Chloraea virescens lacclimatation est la derniegravere eacutetape ougrave il faut ecirctre prudent parce que cest agrave ce moment lagrave que les taux de mortaliteacute sont les plus eacuteleveacutes principalement dans le processus de transplantation Cette eacutetape est tregraves importante parce que ce sera gracircce agrave elle quacuteon verra lefficaciteacute du processus et la qualiteacute finale des plantes produites in vitro Lobjectif geacuteneacuteral de cette eacutetude est dacuteeacutevaluer linfluence de la taille des plantes et lutilisation de divers substrats pour lacuteacclimatation de C virescens On a utiliseacute des plantes de C virescens obtenue a partir de la micropropagation de protocormos en provenance du laboratoire de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal de la Universidad Austral de Chile Les plantes ont eacuteteacute subdiviseacutee pour obtenir le nombre approprieacute Elles ont ensuite eacuteteacute transfeacutereacutees agrave des pots dans une piegravece du laboratoire de six huit et dix en fonction de la taille de la plante (plus de 3 cm de 2-3 cm et 1-2 cm respectivement) pour deux mois ensuite elles ont eacuteteacute transfeacutereacutee dans trois substrats tourbe + perlite (11) Sphagnum et tourbe + sable (11) et elles ont eacuteteacute mises dans une serre pour quatre mois Les variables agrave eacutevaluer sont nombre final de feuilles nombre de racines au deacutebut et agrave la fin la hauteur et la survie des plantes Les reacutesultats ont montreacute que la taille et les substrats utiliseacutes ont une influence sur la croissance des jeunes plantes La taille ideacuteale pour lacclimatation est plus de 3cm avec cette derniegravere on a obtenu les meilleurs reacutesultats dans toutes les variables qui ont eacuteteacute eacutevalueacutees Le mecircme reacutesultat sest produit avec le substrat de tourbe + perlite lequel a aussi montreacute les meilleurs reacutesultats
3
1 INTRODUCCION La familia Orchidaceae (Orquiacutedeas) es la que mayor nuacutemero de especies comprende en el Reino Vegetal Se estima que debe haber alrededor de 35000 especies de Orquiacutedeas en todo el mundo pertenecientes a unos 750 geacuteneros ademaacutes de miles de hiacutebridos En Chile esta familia es probablemente el grupo menos estudiado de plantas con flores y soacutelo se han realizado estudios en base a su taxonomiacutea biologiacutea reproductiva fenologiacutea y distribucioacuten
La produccioacuten de flores de orquiacutedeas ha tomado importancia por la belleza de sus flores dada la enorme variedad de formas colores y perfumes Existen orquiacutedeas terrestres y epiacutefitas estas uacuteltimas representan maacutes del 90 del total de especies y son las que mayoritariamente se encuentran a la venta Las flores tienen un alto valor ornamental o como flor cortada ya que eacutestas pueden permanecer separadas de las plantas sin marchitarse hasta tres o cuatro semanas y en la planta permanecen hasta tres meses
La obtencioacuten de plantas de orquiacutedeas a partir de semillas es muy difiacutecil ya que eacutestas son diminutas y de germinacioacuten irregular Como una alternativa de obtencioacuten de plantas aparece la micropropagacioacuten pudiendo asiacute aumentar el nuacutemero de plantas en forma relativamente faacutecil y raacutepida Luego de la etapa de micropropagacioacuten viene la etapa de aclimatacioacuten en la cual la manipulacioacuten debe ser en extremo cuidadosa ya que es donde se produce el mayor iacutendice de mortandad principalmente en el proceso de transplante Esta etapa es muy importante ya que gracias a ella se veraacute la eficiencia del proceso y la calidad final de las plantas producidas in vitro Considerando la produccioacuten de plaacutentulas mediante la micropropagacioacuten en este trabajo se plantea la hipoacutetesis que ldquoel tamantildeo de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro y los distintos sustratos son factores que inciden en el desarrollo y su aclimatacioacutenrdquo El objetivo general de este trabajo es
Evaluar la influencia del tamantildeo de plaacutentulas y utilizacioacuten de distintos sustratos en la aclimatacioacuten ex vitro de plaacutentulas de C virescens
Los objetivos especiacuteficos son
Medir el efecto del tamantildeo de plaacutentulas de C virescens en la sobrevivencia y desarrollo de eacutestas ex vitro
Comparar el uso de tres sustratos en el desarrollo y sobrevivencia de plaacutentulas de C virescens
4
2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA 21 Descripcioacuten general 211 Descripcioacuten geograacutefica Las orquiacutedeas pertenecen a la familia Orchidaceae clase Liliopsida (monocotiledoacuteneas) Son plantas herbaacuteceas perennes originarias de regiones tropicales y subtropicales pero existen tambieacuten en todos los continentes a excepcioacuten de las regiones polares La zona donde se encuentran estas plantas estaacute comprendida entre los 68ordm latitud norte y 56ordm latitud sur Es evidente que en los liacutemites extremos de estas latitudes se encuentran pocos geacuteneros y especies esto va en aumento desde las regiones temperadas hasta las regiones intertropicales donde el nuacutemero es el mayor Los territorios maacutes interesantes por su nuacutemero son
Ameacuterica del Sur y Ameacuterica Central Asia e India Madagascar Australia es el continente menos poblado en orquiacutedeas dentro de las regiones
del globo Por su parte Europa presenta numerosos geacuteneros y especies de orquiacutedeas
terrestres Soacutelo en Francia existen 75 especies repartidas en 16 geacuteneros todas terrestres (LECOUFLE y ROSE 1956)
212 Formas de vida Las zonas donde crecen estas plantas influyen sobre su manera de vivir Algunas orquiacutedeas son terrestres y se encuentran representadas en todas las regiones Tambieacuten existen las epiacutefitas (vegetal que fijado a otro no obtiene de eacuteste su alimento) En este caso se necesita que el grado higromeacutetrico y la temperatura permitan este tipo de adaptacioacuten Ademaacutes existen las orquiacutedeas litofiacuteticas que viven sobre rocas Las raiacuteces de las epiacutefitas y litofiacuteticas estaacuten adaptadas a vivir expuestas al aire o inmersas en materia orgaacutenica ya que tienen un tejido acumulador de agua llamado velo En zonas friacuteas y templado friacuteas todas las orquiacutedeas son terrestres En zonas subtropicales o tropicales la gran mayoriacutea es epiacutefita Otra particularidad debida seguramente a la influencia de estas zonas es la floracioacuten Es en las zonas tropicales y subtropicales que se dan los mayores tamantildeos de flores asiacute como tambieacuten la mayor variedad de colores (LECOUFLE y ROSE 1956)
213 Descripcioacuten morfoloacutegica Las orquiacutedeas se caracterizan por poseer flores muy vistosas hermafroditas (ambos sexos en la misma flor) zigomorfas (con un solo plano de simetriacutea) triacutemeras (tres seacutepalos y tres peacutetalos) y una columna central que sustenta las estructuras reproductivas masculinas anteras y femeninas pistilo llamada ginostemo El peacutetalo inferior se llama labelo y su morfologiacutea define a los distintos geacuteneros de orquiacutedeas Las flores pueden ser aisladas o en inflorescencia y son polinizadas por insectos El polen se encuentra aglomerado formando una masa llamada polinio el que tiene un extremo con un ensanchamiento glandular pegajoso que sirve para que el
5
polinio se adhiera al cuerpo del insecto polinizador El fruto es una caacutepsula seca con muchas semillas pequentildeas sin endosperma y con embrioacuten no diferenciado Tienen dos tipos baacutesicos de crecimiento Simpodial en las que el nuevo crecimiento se produce en sentido horizontal a partir de un tallo subterraacuteneo o rizoma generando una sub-unidad capaz de producir una flor o inflorescencia y de ser eventualmente separada de la planta (ej Cattleya) Monopodial en las que el nuevo crecimiento se produce en sentido vertical con lo cual la planta crece constantemente en altura (ej Phalaenopsis) (ORQUIDEAS 2007) 214 Geacuteneros y especies chilenas Seguacuten NOVOA et al (2006) en la familia Orchidaceae se encuentran 49 especies de flora nativa dentro de las cuales se encuentra Chloraea virescens (Willd) Lindl Los geacuteneros de Orchidaceae en Chile son 7
- Aa Bipinnula Brachystele Codonorchis Chloraea Gavilea y Habenaria
Dentro del geacutenero Chloraea existen 31 especies - Chloraea alpina Poepp - Chloraea barbata Lindl - Chloraea bidendata (Poepp y Endl) Correa - Chloraea bletioides Lindl - Chloraea cuneata Lindl - Chloraea chica Speg - Chloraea chrysantha Poepp - Chloraea crispa Lindl - Chloraea cristata Lindl - Chloraea cylindrostachya Poepp - Chloraea disoides Lindl - Chloraea galeata Lindl - Chloraea gaudichaudii Brongn - Chloraea gavilu Lindl - Chloraea grandiflora Lindl - Chloraea heteroglossa Rchbf - Chloraea incisa Poepp - Chloraea lamellata Lindl - Chloraea lechleri Lindl - Chloraea leptopetala Reiche - Chloraea longipetala Lindl - Chloraea magellanica Hookf - Chloraea multiflora Lindl - Chloraea nudilabia Lindl - Chloraea philippii Reichbf - Chloraea picta Phil - Chloraea prodigiosa Reichbf - Chloraea speciosa Poepp - Chloraea virescens Lindl - Chloraea viridiflora Poepp
6
- Chloraea volkmanni Phil (NOVOA et al 2006) 2141 Chloraea virescens Planta perenne de 40-90 cm de altura Sus hojas son de 5-12cm de largo por 15-25cm de ancho estrechas lanceoladas agudas dispuestas en roseta basal generalmente marchitas al final de la antesis Su escapo floral tiene vainas caulinares lanceoladas agudas y distantes La inflorescencia es de 8-20cm de largo densa con 10-15 flores erguidas Sus flores son blancas con estriacuteas y aacutepices verdes El seacutepalo dorsal es de 16-33mm de largo por 4-6mm de ancho oblongo lanceolado obtuso algo coacutencavo a veces ligeramente estrechado al centro aacutepice algo carnoso Los seacutepalos laterales de 18-33mm de largo por 4-5mm de ancho son ensiformes con aacutepice obtuso engrosado verde negruzco a veces espatulado y dentado a veces verrugoso Los peacutetalos son de 15-23mm de largo por 5-58mm de ancho estrechamente aovados obtusos verrugosos con maacutes frecuencia solo la mitad inferior a veces el borde denticulado y carnoso El labelo de 15-26mm de largo por 10-20mm de ancho es mas o menos romboidal a levemente trilobulado El loacutebulo central tiene 5-7 nervios longitudinales recorridos por laminillas interrumpidas membranaacuteceas con segmentos falciformes de borde carnoso de color verde Los nervios laterales que se ramifican oblicuamente hacia el aacutepice en los loacutebulos laterales tienen pequentildeas laminillas y verrugas y su borde es laciniado inciso en la mitad apical hacia la base denticulado aacutepice generalmente engrosado La columna es de 12-18mm de largo delgada blanca con estriacuteas anaranjada La base de la zona nectariacutefera tiene un color amarillo-limoacuten con maacuteculas anaranjadas orificio nectario verde El ala de la columna es recta y estrecha El estigma es triangular y globoso La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la Vordf (Vintildea del Mar) hasta la XIordf Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile Sin embargo es posible que tenga una distribucioacuten maacutes restringida por que se le ha confundido con Chloraea incisa Su floracioacuten es desde noviembre a febrero y su estado de conservacioacuten no estaacute evaluado (NOVOA et al 2006) En el Anexo 14 se incluyen antecedentes sobre su distribucioacuten y eacutepoca de floracioacuten
7
FIGURA 1 Chloraea virescens FUENTE NOVOA et al (2006) 22 Requerimientos de las orquiacutedeas Para tener eacutexito en el cultivo de orquiacutedeas hay que tomar en cuenta factores de importancia como son 221 Agua El riego correcto es el principio y el fin del cuidado de orquiacutedeas (ROLLKE 2005) Este elemento es primordial para las orquiacutedeas asiacute como tambieacuten para todo tipo de plantas En el caso de eacutestas se dice muchas veces que la calidad del agua usada es el factor maacutes importante en el cultivo de orquiacutedeas ya que el porcentaje maacutes alto de muerte se produce por el exceso de este factor (SHEEHAN 1980) Hay que tomar en cuenta que la mayoriacutea de las orquiacutedeas son epiacutefitas lo que significa que tienen sus raiacuteces a la vista gracias a las cuales absorben el agua de lluvia Se recomienda un sustrato poroso y de reaccioacuten neutra ya que de esta manera el agua escurre sin acumularse no permitiendo la pudricioacuten de las raiacuteces Para las orquiacutedeas terrestres es lo mismo solo que se pueden regar con maacutes frecuencia pero sin mantenerlas saturadas (OSPINA y DRESSLER 1979) Seguacuten DUMOIS (2007) el agua es lo maacutes difiacutecil de controlar ya que depende de muchas variables como por ejemplo humedad relativa tipo de sustrato intensidad luminosa temperatura y circulacioacuten de aire Ademaacutes muchas orquiacutedeas necesitan un periacuteodo de receso vegetativo que si no es respetado resulta en ausencia de floracioacuten En general hay que antildeadir agua en abundancia cuando la planta se encuentra en crecimiento activo y reducirla despueacutes de la floracioacuten
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Las especies con pseudobulbos almacenan agua y estaacuten preparadas para su periacuteodo de receso Otras que no cuentan con estos oacuterganos requieren de humedad maacutes constante 222 Luz Ninguna planta puede crecer sin la iluminacioacuten adecuada Muchas orquiacutedeas viven en las alturas de los aacuterboles y estaacuten expuestas a plena luz del sol otras crecen en el suelo selvaacutetico protegidas del sol por espesos follajes (ROLLKE 2005) La funcioacuten principal de la luz es activar el proceso de fotosiacutentesis Los cultivadores han estudiado la luz y han descubierto que hay orquiacutedeas que florecen con diacutea largo y otras con diacutea corto (OSPINA y DRESSLER 1979) Gracias a la fotosiacutentesis se convierten los minerales presentes en el ambiente en savia y nutrientes Hojas oscuras y falta de floracioacuten indican falta de luz hojas amarillas e incluso quemadas apuntan hacia un exceso de sol (DUMOIS 2007) 223 Fertilizacioacuten Las orquiacutedeas necesitan los mismos nutrientes que otras plantas Un abono para orquiacutedeas debe contener los nutrientes principales nitroacutegeno (N) foacutesforo (P) y potasio (K) asiacute como tambieacuten oligoelementos como hierro (Fe) magnesio (Mg) zinc (Zn) estantildeo (Sn) y manganeso (Mn) (ROLLKE 2005) Por otra parte la fertilizacioacuten depende de varios factores dentro de los cuales los maacutes criacuteticos son
- El medio utilizado - La edad de las plantas - Estado de las plantas ya sea floracioacuten crecimiento reposo
En cuanto a absorcioacuten se ha demostrado que es igual de eficiente por viacutea foliar como a traveacutes de las raiacuteces Es necesario tener en cuenta algunas reglas baacutesicas a la hora de fertilizar las orquiacutedeas (Asociacioacuten Costarricense de Orquideologiacutea ACO 1970)
1 Regar las plantas antes de fertilizar 2 Fraccionar las dosis 3 Aplicar el fertilizante de forma liacutequida 4 No usar fertilizantes soacutelidos 5 No fertilizar las plantas recieacuten plantadas 6 No fertilizar plantas en reposo 7 No abonar plantas enfermas
224 Temperatura Es conocido el hecho de que cada planta tiene liacutemites de temperatura dentro de los cuales prospera o perece De ahiacute la necesidad de conocer las temperaturas correspondientes al lugar de donde viene cada especie de orquiacutedea pudiendo proporcionarle la temperatura adecuada (OSPINA y DRESSLER 1979) Se puede clasificar a las orquiacutedeas como de clima caacutelido (temperatura nocturna miacutenima de 20ordmC) templado (miacutenimo de 13 a 18ordmC) y de ambiente friacuteo (de 10 a 13ordmC) (DUMOIS 2007)
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Seguacuten SHEEHAN (1980) las temperaturas ideales para las orquiacutedeas de origen tropical son 10ordmC en la noche y entre 21ordm - 24ordmC durante el diacutea 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas La micropropagacioacuten de orquiacutedeas estaacute en vanguardia hoy en diacutea El estudio de cultivo de tejido de orquiacutedeas se lleva a cabo en muchos laboratorios de todo el mundo (ARDITTI and ERNST 1992) 231 Biologiacutea de las semillas Las semillas de orquiacutedeas son conocidas usualmente como semillas polvo porque son minuacutesculas y contienen pocas reservas de alimento Estas semillas por lo general no germinan en el medio natural a menos que sean infectadas por un hongo micorriacutezico Este hongo abastece a las plantas joacutevenes con azuacutecares y nutrientes hasta que sean lo suficientemente grandes para fabricar su propio alimento Cuando la semilla germina produce una masa indiferenciada de ceacutelulas llamada protocormo Manteniendo las condiciones normales el protocormo continuaraacute su crecimiento por varias semanas meses o incluso antildeos dependiendo de la especie hasta que alcance la edad apropiada para producir raiacuteces y hojas En el caso de orquiacutedeas terrestres es de vital importancia que la relacioacuten orquiacutedea-hongo se conserve durante los estados tempranos del ciclo de vida de la planta ya que el protocormo enterrado no puede fabricar alimento por siacute mismo Por otro lado los protocormos de las orquiacutedeas epiacutefitas son comuacutenmente verdes lo que les posibilita producir parte de su alimento La relacioacuten orquiacutedea-hongo no ha sido en su totalidad investigada para el caso de las orquiacutedeas tropicales (McKENDRICK 2000) 232 Germinacioacuten simbioacutetica y no simbioacutetica de semillas Mediante la germinacioacuten in vitro las semillas germinan en frascos de vidrio o plaacutestico Estos frascos contienen en su interior un medio nutritivo solidificado con agar con todos los azuacutecares y minerales necesarios para la germinacioacuten y crecimiento de las semillas Hay dos tipos de germinacioacuten la simbioacutetica y la asimbioacutetica En la germinacioacuten simbioacutetica las semillas se siembran junto con una pequentildea cantidad del hongo micorriza adecuado Dicho hongo crece en el medio coloniza a las semillas que estaacuten en proceso de germinacioacuten y se produce una relacioacuten simbioacutetica la cual alimentaraacute al protocormo hasta que este sea capaz de producir sus hojas y se vuelva autotroacutefico Esta teacutecnica es usada principalmente en propagacioacuten de orquiacutedeas terrestres en zonas templadas La germinacioacuten asimbioacutetica se usa principalmente en propagacioacuten de orquiacutedeas tropicales que crecen maacutes raacutepido que sus parientes de zonas templadas Para este tipo de germinacioacuten se necesita un medio de cultivo maacutes complejo ya que todos los nutrientes orgaacutenicos e inorgaacutenicos asiacute como tambieacuten los azuacutecares deben estar en forma disponible pues no existe la intermediacioacuten del hongo (McKENDRICK 2000) 233 Condiciones de esterilidad Tanto para la germinacioacuten simbioacutetica como para la asimbioacutetica es de vital importancia que los frascos las semillas aparatos y el medio esteacuten esteacuteriles desde el principio del proceso Esto debido a que cualquier hongo o bacteria que se introduzca creceraacute maacutes raacutepido que las semillas ocupando su espacio hasta matarlas Esto se evita gracias al autoclave el cual regulado a 12 atm y 120ordmC por 20 minutos mata hongos o bacterias presentes en el medio (McKENDRICK 2000)
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2331 Siembra de las semillas Las semillas pueden ser recolectadas desde caacutepsulas verdes o maduras La caacutepsula verde que estaacute madurando estaacute llena de semillas y no se deforma cuando se aprieta con las pinzas Estas semillas pueden ser almacenadas por algunas semanas en un lugar refrigerado con bastante aireacioacuten Las semillas se pueden sembrar a partir de caacutepsulas verdes o semillas secas A continuacioacuten se muestran las ventajas y desventajas de ambos meacutetodos
- Siembra a partir de caacutepsulas verdes Si las caacutepsulas se mantienen intactas el interior (las semillas) se mantiene esteacuteril Por lo tanto si se esteriliza la parte exterior de las mismas donde hongos y bacterias pueden desarrollarse y se abren las caacutepsulas bajo condiciones esteacuteriles y las semillas podraacuten mantenerse desinfectadas
La ventaja de este meacutetodo es que no se requiere de esterilizacioacuten de las semillas lo que provoca su deterioro Otro punto a favor es que algunas semillas podriacutean germinar maacutes raacutepido que las provenientes de caacutepsulas maduras por los mecanismos de dormancia La desventaja es que en este caso todas las semillas deben ser utilizadas o eliminadas mientras que las semillas maduras se pueden almacenar Tambieacuten se debe considerar que las semillas sembradas a partir de caacutepsulas que no han madurado lo suficiente podriacutean germinar lentamente o simplemente no germinar - Siembra a partir de semillas secas En este caso una vez que la caacutepsula es abierta las semillas dejan de ser esteacuteriles y requieren de un proceso de esterilizacioacuten Comuacutenmente se utiliza una solucioacuten de hipoclorito de sodio hipoclorito de calcio o peroacutexido de hidroacutegeno Las semillas se agitan dentro de la solucioacuten que ademaacutes contiene una gota de detergente para ldquohumedecerlasrdquo luego se las enjuaga con agua destilada y se las siembra en el medio preparado La ventaja de este meacutetodo es que las semillas pueden ser colectadas secadas al aire almacenadas por varios meses en el refrigerador y utilizarlas cuando sea necesario Se debe considerar que la siembra ya sea de caacutepsulas verdes o de semillas secas estaacute determinado por la eacutepoca en que se colectan (McKENDRICK 2000) 234 Trasplante En la caacutemara de incubacioacuten las plaacutentulas se han desarrollado en condiciones limpias y en un ambiente cerrado por lo que deben acostumbrase gradualmente al ambiente exterior antes de ser trasplantadas a las macetas Tambieacuten la temperatura y la luz la cual es baja han sido constantes durante el cultivo in vitro En el medio natural la temperatura y la luz variacutean constantemente por lo que las nuevas plantas deben estar protegidas de la fuerte luz solar la cual puede quemar las hojas con soacutelo una pequentildea cantidad de eacutesta La humedad en los frascos es alta y las plantas estaacuten protegidas de ataques por hongos o bacterias Ademaacutes las plaacutentulas han crecido bajo condiciones de alta humedad y por lo tanto tendraacuten cutiacuteculas deacutebiles por lo que necesitan acostumbrase a medios menos huacutemedos antes de ser transplantadas
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Para el trasplante se deben colocar los frascos en un lugar protegido de la lluvia para que se aclimaticen a las nuevas condiciones de luz y temperatura Se deben dejar por 2 a 4 semanas en los frascos tapados Luego se debe ir aflojando las tapas para dejar entrar pequentildeas cantidades de aire hasta el punto de dejarlas descubiertas Se debe revisar si hay hojas marchitas y ver que el sustrato esteacute huacutemedo
Lo ideal es dejarlas sin tapa durante una semana antes de pasarlas a las macetas Para el trasplante se debe elegir un sustrato adecuado para el tipo de planta humedecerlo y transplantar las plantas con cuidado de no dantildear las raiacuteces y evitando la deshidratacioacuten En esta etapa tambieacuten se debe dejar las macetas selladas para evitar una raacutepida deshidratacioacuten e ir abrieacutendolas paulatinamente (McKENDRICK 2000)
24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas 241 Orquiacutedeas terrestres 2411 Cypripedium Esta es una orquiacutedea terrestre de zonas templadas se desarrolla en el Hemisferio Norte como por ejemplo en Guatemala y en Honduras pero donde se encuentra principalmente es en China Su forma maacutes comuacuten de propagacioacuten es in vitro a partir de semillas La forma maacutes eficiente es a partir de semillas inmaduras Existe un intervalo de tiempo entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten eacuteste dependeraacute de la especie y de la zona donde se desarrolle Se asume que existen aproximadamente cuatro semanas entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten El oacuteptimo para una buena germinacioacuten de Cypripedium es entre 42 y 60 diacuteas despueacutes de la polinizacioacuten y entre 14 y 32 diacuteas despueacutes de la fertilizacioacuten La germinacioacuten ocurre entre la segunda y cuarta semana despueacutes de ser sembradas y los protocormos deberiacutean ser cambiados de medio de cultivo cada dos a cuatro meses si no se corre el riesgo de sufrir agotamiento de nutrientes Los rizomas y las raiacuteces se empiezan a desarrollar a partir de los siete meses para luego dar lugar a las primeras hojas Para obtener un buen transplante se deben tener raiacuteces de miacutenimo un centiacutemetro de largo El desarrollo de raiacuteces se ve potenciado al tener un periacuteodo corto de bajas temperaturas (10degC) exposicioacuten a la luz reduccioacuten en la concentracioacuten de iones del medio de cultivo o transferirlas a un compost esteacuteril Al tener raiacuteces suficientes y el tamantildeo adecuado se podraacuten llevar las plantas al lugar donde creceraacuten definitivamente En el momento del transplante las plantas son muy susceptibles al desecamiento por lo cual lo ideal es que los brotes sean maacutes chicos que las raiacuteces El mejor sustrato seriacutea aquel donde crece naturalmente la orquiacutedea (RAumlNNBAumlCK 2007) 2412 Preservacioacuten in vitro de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes Este estudio fue hecho para establecer que parte de tejido es viable para la micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes del noreste de Europa pudiendo asiacute reestablecer dichas orquiacutedeas a sus aacutereas correspondientes La propagacioacuten in vitro de orquiacutedeas
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terrestres de clima templado es maacutes difiacutecil que las orquiacutedeas epiacutefitas de clima subtropical y tropical Las orquiacutedeas terrestres tienen requerimientos maacutes estrictos que las epiacutefitas y se conoce menos sobre sus necesidades especiacuteficas (VAASA y ROSENBERG 2004) En Estonia existen 36 especies de orquiacutedeas terrestres pero solo tres estaacuten bajo proteccioacuten Dactylorhiza baltica Dactylorhiza ruthei Dactylorhiza praetermissa Como explantes para este estudio en el caso de D baltica se ocuparon protocormos en los otros dos casos se utilizaron semillas semi maduras las cuales fueron colectadas siete y diez semanas despueacutes de ser polinizadas Para D baltica se ocupoacute el medio Murashige y Skoog suplementado con 05 mgL de aacutecido naftaleacuten aceacutetico (ANA) y 2 mgL de isonpentenyl adenina Para el caso de las semillas semi maduras se ocuparon los medios de Lindemann de Heller de Norstog y de Murashige y Skoog como control
La composicioacuten del medio y la madurez de las semillas influye mucho en el desarrollo de las orquiacutedeas in vitro Se ha demostrado que se necesita una alta concentracioacuten de microelementos para obtener una correcta germinacioacuten de las semillas Tambieacuten se puede decir que los primeros tres meses son los de mayor crecimiento luego de este tiempo el crecimiento se vuelve maacutes lento (VAASA y ROSENBERG 2004)
Luego de cuatro semanas de crecimiento de D baltica el 60 de los explantes de meristemas apicales empezaron a crecer en cambio los de meristemas laterales no expresaron ninguacuten tipo de crecimiento Las raiacuteces empezaron su desarrollo luego de dos meses despueacutes de la siembra
En el caso de D ruthei y D praetermissa la germinacioacuten se produjo despueacutes de dos meses desde la inoculacioacuten Luego de cuatro y seis meses el mayor crecimiento fue observado en el medio Norstog superando en 14 al medio testigo Murashige y Skoog (VAASA y ROSENBERG 2004)
2413 Longevidad de semillas de orquiacutedeas terrestres Por lo general las orquiacutedeas producen muchas pero pequentildeas semillas que contienen muy pocas reservas de alimento Dichas semillas estaacuten estructuralmente adaptadas para ser dispersadas por el viento pero poco se sabe del destino de eacutestas luego de ser dispersadas Algunos estudios de viabilidad de semillas indican una sobrevivencia de uno a dos antildeos en orquiacutedeas de clima templado Las semillas que son guardadas en laboratorio duran mucho maacutes tiempo Se estudioacute la viabilidad de siete especies de orquiacutedeas norteamericanas dentro de las cuales se encuentran Goodyera pubescens y Liparis liliifolia Las semillas de eacutestas se colocaron en bolsas con suelo y sustratos de bosques provenientes de sus haacutebitats naturales (WHIGHAM et al 2005) En Goodyera pubescens la mayoriacutea de las semillas germinaron en un antildeo Cuatro otras especies germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero algunas semillas no germinadas despueacutes de siete antildeos seguiacutean siendo viables En la especie Liparis liliifolia semillas que han estado cuatro antildeos bajo observacioacuten han tenido una tasa de
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germinacioacuten de un 68 al ser sembradas in vitro junto con el hongo micorriacutezico adecuado Las dos especies restantes no germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero las semillas fueron evaluadas como intactas y testeadas positivamente en cuanto a su viabilidad despueacutes de cuatro antildeos en el suelo Estas observaciones fueron interpretadas como diferentes estrategias para especies especiacuteficas de germinacioacuten in situ (WHIGHAM et al 2005) 2414 Sobrevivencia de orquiacutedeas terrestres transplantadas a sectores urbanos La conservacioacuten de poblaciones de orquiacutedeas silvestres depende del establecimiento de las orquiacutedeas propagadas a los campos Sin embargo se conoce muy poco de los factores bioacuteticos que influencian el establecimiento de orquiacutedeas terrestres a sus haacutebitats naturales Un experimento fue establecido para medir la sobrevivencia de seis especies durante su primer periacuteodo de crecimiento seguido del transplante a un sector urbano en Australia (SCADE et al 2006)
Las orquiacutedeas germinadas simbioacuteticamente crecieron en laboratorio durante cinco meses antes de establecer la plantacioacuten en sitios adyacentes con alta o baja cobertura de malezas Existioacute una muerte gradual de las plaacutentulas durante el primer periacuteodo de crecimiento primeramente por ataque de insectos no siendo evitado por la presencia de una malla cobertora Los iacutendices de sobrevivencia variacutean desde 49 para Microtis media una especie capaz de crecer en un ambiente atiacutepico hasta un 21 para Caladenia arenicola la orquiacutedea nativa maacutes comuacuten de esos sitios Sin embargo no todas las orquiacutedeas sobrevivientes producen tubeacuterculos por lo que la tasa de sobrevivencia despueacutes del primer periacuteodo seco disminuye
La sobrevivencia de las orquiacutedeas sembradas no puede ser comparada con orquiacutedeas de la misma especie que crecieron en los mismos lugares ya que no existioacute la presencia del hongo compatible para estas orquiacutedeas (SCADE et al 2006)
2415 Micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres En India dos orquiacutedeas muy importantes para la horticultura del geacutenero Anoectochilus fueron exitosamente propagadas Noacutedulos aislados de A sikkimensis colectadas en Himalaya y A regalis colectadas en India fueron cultivadas in vitro durante 12 semanas para obtener un maacuteximo de 48 a 56 protocormos y brotes obteniendo como resultado un 95 y 98 de eficiencia respectivamente Durante el repicado de los explantes in vitro de A regalis se observoacute que el nuacutemero total de brotes obtenidos a partir de noacutedulos fue 214 asiacute como tambieacuten 82 puntas de brotes En cambio para A sikkimensis fueron mucho maacutes bajos 123 y 43 respectivamente teniendo un crecimiento maacutes lento pero plantas maacutes fuertes Las raiacuteces de 4 a 6cm crecieron con la presencia de NAA (270 microM ) en el medio asiacute como tambieacuten con carbono activado (02) Durante la aclimatacioacuten la tasa de establecimiento fue entre 95 y 98 Luego de seis meses en invernadero las plantas de A regalis fueron transferidas a bosque nativo donde se obtuvo una tasa de
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sobrevivencia de entre 70 y 95 despueacutes de 12 meses Estas plantas establecidas en bosque nativo estaacuten libres de cualquier defecto morfoloacutegico y de crecimiento (GANGAPRASAD et al 2000) 242 Orquiacutedeas epiacutefitas Estas orquiacutedeas viven en los aacuterboles pero no obtienen de eacuteste su alimento no son paraacutesitas 2421 Preservacioacuten de Cattleya walkeriana usando propagacioacuten in vitro El geacutenero Cattleya se encuentra en Meacutexico y Ameacuterica Central asiacute como tambieacuten en Venezuela Colombia y las laderas de los Andes Esta orquiacutedea tambieacuten se encuentra en varias regiones del Brasil creciendo en aacuterboles rocas cerca de riacuteos lagos y pantanos Las flores de esta orquiacutedea son conocidas debido a su hermosura y a causa de la destruccioacuten de su haacutebitat y a la excesiva coleccioacuten de eacutestas se encuentra en extincioacuten
La composicioacuten del medio de cultivo es esencial para la propagacioacuten in vitro ya que suple todos los nutrientes necesarios para el desarrollo y seraacute distinto dependiendo de cada especie en este caso se utilizoacute la mitad de los macronutrientes del medio Muchos autores sugieren el uso de carboacuten activado en el medio ya que por lo general en muchas especies aumenta el desarrollo de las raiacuteces En este estudio se probaron distintas dosis de carboacuten activado 1 2 4 y 6gL con un pH de 6 (TADEU DE FARIA et al 2002) Las semillas se obtuvieron de flores artificialmente polinizadas en invernadero Plaacutentulas de aproximadamente un centiacutemetro fueron seleccionadas y cultivadas nuevamente en el medio de cultivo Murashige y Skoog pero esta vez con las diferentes dosis de carboacuten activado Se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces el nuacutemero de brotes y el peso de la materia verde total Durante el autoclavado se produce normalmente una hidroacutelisis de sacarina la cual es de 10 aproximadamente este porcentaje aumenta considerablemente al agregar un 1 de carboacuten activado llegando a ser de 95
El desarrollo de las plaacutentulas de C walkeriana aumentan con una mayor concentracioacuten de carboacuten activado asiacute como tambieacuten un mayor tiempo de cultivo El resultado fue que la dosis ideal para el desarrollo de esta orquiacutedea es 2gL de carboacuten activado (TADEU DE FARIA et al 2002) 2422 Establecimiento de cultivos in vitro y micropropagacioacuten de Cattleya aurantiaca (Bateman ex Lindl) Por medio de siembra in vitro se logroacute el establecimiento de C aurantiaca con alto porcentaje de germinacioacuten y desarrollo de protocormos Para la oacuteptima formacioacuten de callo y para la proliferacioacuten de protocormos se determinaron los medios oacuteptimos (MS 10 mgL ANA 10 mgL BA) asiacute como tambieacuten de manera directa sobre explantes de hoja y pseudobulbos (MS 01 mgL ANA 01 mgL GA3)
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Con este uacuteltimo medio tambieacuten se logroacute una oacuteptima regeneracioacuten y desarrollo de plaacutentulas Los medios liacutequidos (sin agitacioacuten) son una buena opcioacuten para conseguir la produccioacuten masiva de protocormos ya que con ellos se optimizoacute la micropropagacioacuten de C aurantiaca Las plaacutentulas micropropagadas presentaron alto porcentaje de sobrevivencia y buen desarrollo despueacutes de su trasplante y aclimatacioacuten lo cual demuestra que es un buen sistema de propagacioacuten para C aurantiaca (GUTIERREZ y SALGADO 2007) En cuanto a transplante y aclimatacioacuten despueacutes de 45 diacuteas de desarrollo in vitro las plaacutentulas de un tamantildeo entre 3 y 5 cm con raiacuteces bien desarrolladas fueron llevadas a condiciones ex vitro eliminando los restos de medio de cultivo con agua potable y ocupando un sustrato de partes iguales de tezontle y corteza de encino cubierta con hojarasca de encino finamente molida Se mantuvieron cubiertas durante 15 diacuteas abriendo cada dos diacuteas hasta poder retirar la tapa en 30 diacuteas Despueacutes de dos meses de haber sido retiradas del cultivo in vitro las plaacutentulas presentaron 70 de sobrevivencia y alcanzaron una altura de hasta 7 cm presentando nuevas hojas y raiacuteces las plantas se muestran vigorosas y capaces de continuar su crecimiento en condiciones ambientales de invernadero (GUTIERREZ y SALGADO 2007)
2423 Establecimiento in vitro y regeneracioacuten de plantas de Laelia autumnalis (Llave y Lex) Lindl Para este estudio se obtuvieron las semillas de una caacutepsula desarrollada despueacutes de 6 meses de la floracioacuten las cuales se sembraron in vitro sin presentar contaminacioacuten ya que la siembra por este meacutetodo es muy eficiente en comparacioacuten al cultivo de semillas libres donde algunas veces se presenta la contaminacioacuten Las observaciones se realizaron cada 15 diacuteas la germinacioacuten se detectoacute en los primeros 15 diacuteas en la mayoriacutea de los medios de cultivos probados con la presencia de protocormos de 1mm de diaacutemetro (HUAPEO y SALGADO 2004) El porcentaje de germinacioacuten que se obtuvo de las semillas cultivadas in vitro de L autumnalis fue de 95 a 100 en todos los medios de cultivo la uacutenica diferencia fue el tiempo entre las germinaciones A excepcioacuten de las semillas cultivadas en el medio MS 100 la germinacioacuten del 100 se obtuvo hasta los 30 diacuteas de cultivo mientras que en el primero la germinacioacuten fue a los 15 diacuteas del cultivo Las plaacutentulas con raiacutez y un par de hojas se lograron a los 90 diacuteas de cultivo en el medio MS 100 alcanzando 07 mm de altura Estas plaacutentulas fueron subcultivadas en medio MS con 05 mgl de ANA y 01 mgl de GA3 para tener plaacutentulas fuente de explante (segmentos de hojas) un medio oacuteptimo de desarrollo de plaacutentulas de L speciosa No fue necesario probar otros medios de cultivos ya que se hicieron pruebas anteriores que demostraron que era el adecuado
Las plaacutentulas de 6 meses de cultivo in vitro despueacutes de su germinacioacuten presentaron una altura promedio de 5 cm con raiacuteces con velamen y hasta dos pares de hojas Segmentos de hoja de eacutestas fueron cultivadas en el medio MS conteniendo ANA BA y GA3 en diferentes concentraciones y se realizaron observaciones cada 30 diacuteas para determinar medios inductores de callo protocormos y raiacuteces La mejor respuesta en formacioacuten de callo fue observada en los segmentos de hoja de plaacutentulas de L autumnalis cultivados en MS con 1 mgl de ANA BA y GA3 iniciando la induccioacuten de
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eacuteste desde los 30 diacuteas de cultivo solamente en un 70 de los explantes cultivados El 100 se logroacute a los 90 diacuteas de cultivo observando callo abundante alrededor de todo el tejido de color blanco con puntos pigmentados de color verde La regeneracioacuten de protocormos de esta orquiacutedea se establecioacute con la siembra de segmentos de hoja de plaacutentulas de 6 meses de edad de manera directa o a partir de callos En callos la produccioacuten fue oacuteptima en el medio MS con 01 mgl de ANABAGA3 ya que a los 60 diacuteas se obtuvieron 50 protocormos por segmento de callo Solamente se produjeron 10 protocormos por explante al cultivarse los segmentos de hoja en MS con 01 mgl de ANABAGA3 a los 120 diacuteas de cultivo (HUAPEO y SALGADO 2004) 25 Aclimatacioacuten Aclimatacioacuten significa que el hombre intercede y guiacutea el proceso de acondicionamiento de las plantas hasta que eacutestas sean aptas para crecer en el campo yo invernadero
Un alto nuacutemero de plantas micropropagadas no sobreviven al cambio desde el cultivo in vitro hacia el ambiente exterior ya sea en campo o invernadero Eacutestos dos uacuteltimos tienen menor humedad relativa niveles maacutes altos de luminosidad y un ambiente seacuteptico los cuales son maacutes estresantes para las plantas micropropagadas La mayoriacutea de las especies que crecen in vitro necesitan un proceso de aclimatacioacuten pudiendo obtener asiacute un nuacutemero suficiente de plantas vivas y vigorosas para trasplantar al suelo (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991)
La aclimatacioacuten no es uacutenicamente para micropropagacioacuten siendo usada ademaacutes en propagacioacuten convencional durante antildeos Despueacutes de cortar las hojas y de haber formado raiacuteces por lo general son aclimatadas antes de ser llevadas al campo o invernadero Ejemplos de dos teacutecnicas comunes son bajar gradualmente la humedad y mantener el nivel de luz con un 50 de sombra antes de trasladarlos al campo Las raiacuteces que han sido cortadas y mal limpiadas muchas veces son focos de infeccioacuten En estos casos las plantas muestran signos de marchitez hojas necrosadas y tambieacuten se puede llegar a la muerte de eacutestas El cultivo in vitro reduce la necesidad de fotosiacutentesis ya que las condiciones de la caacutemara de incubacioacuten proveen a la planta de sacarosa u otro azuacutecar Tambieacuten en estas condiciones se reduce el stress por patoacutegenos al ser un ambiente aseacuteptico Todo esto se traduce en que las plantas micropropagadas no son aptas para el campo yo invernadero (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 251 Stress hiacutedrico El stress hiacutedrico puede ser el resultado de una excesiva transpiracioacuten de las diferentes partes aeacutereas de las plantas especialmente de las hojas o por una inadecuada absorcioacuten de agua por parte de las raiacuteces La cutiacutecula y los estomas son la ruta primaria de peacuterdida de agua desde de las hojas provenientes de esta teacutecnica reproductiva 2511 Cutiacutecula La cutiacutecula es una membrana compuesta por una matriz de cutina que a su vez se encuentra cubierta en su superficie por ceras cuya funcioacuten primaria consiste en limitar la peacuterdida de agua por transpiracioacuten La permeabilidad del agua a traveacutes de la cutiacutecula se ve influenciada principalmente por la estructura y la cantidad de
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ceras cuticulares y epicuticulares no vieacutendose afectada la peacuterdida de agua por el grosor de eacutesta o la naturaleza quiacutemica de la matriz de la cutina La estructura cristalina de la parte encerada de las hojas es distinta en las plantas micropropagadas con respecto a las plantas que crecen en el campo La cera epicuticular de las hojas de plantas in vitro tienen una proporcioacuten maacutes alta de esteres y de componentes polares por el contrario tienen unas cadenas de hidrocarbonos mucho maacutes cortas Esto hace que las plantas in vitro pierdan maacutes agua que las cultivadas en campo o invernadero
Las plantas que han crecido en el campo son naturalmente de color verde pero el color de las plantas cultivadas in vitro es diferente y se puede ver a simple vista Las plantas que son pasadas a invernadero y que tengan un color verde se aclimatan de mejor forma al ambiente exterior (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 2512 Estomas La estructura estomaacutetica y su funcionamiento han sido implicados recurrentemente en el desbalance de agua exhibido por plantas micropropagadas al momento de ser removidas del cultivo in vitro Estudios con microscopiacutea de scanner electroacutenico han indicado que la estructura estomaacutetica presente en algunas especies de plantas cultivadas in vitro difieren marcadamente de las cultivadas en invernadero o en el suelo Debido a que las primeras presentan estomas de mayor tamantildeo y maacutes redondos a diferencia de las plantas cultivadas de manera normal que presentan estomas maacutes pequentildeos y eliacutepticos lo que resulta en una deshidratacioacuten maacutes raacutepida en el caso de las provenientes de cultivo in vitro (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 252 Humedad Debido a la anatomiacutea y la condicioacuten fisioloacutegica de las plantas desarrolladas in vitro donde se ha mantenido una alta humedad relativa es necesario regar al momento del traslado para obtener una alta sobrevivencia Muchos laboratorios aseguran que hay que evitar tener un sistema de aspersioacuten ya que se produce el ambiente necesario (muy huacutemedo) para la aparicioacuten de hongos algas o bacterias Otros meacutetodos incluyen el uso de humidificadores o poner las macetas en un lugar cerrado donde se retenga vapor para esto se pueden usar por ejemplo tapas de polietileno Este meacutetodo es relativamente econoacutemico pero se debe tener control del calor y monitorear la falta de agua (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 253 Luz Durante la etapa in vitro las plantas estaacuten expuestas a altos niveles de luminosidad lo que se traduce en hojas delgadas Antes del traslado se recomienda mantener las plantas con un 50 de sombra para asiacute poder aclimatarlas de mejor manera esto debido a que las plantas micropropagadas tienen un bajo control sobre la transpiracioacuten y un inadecuado mecanismo de fotosiacutentesis La sombra reduce la transpiracioacuten evitando excesivas peacuterdidas de agua asiacute como tambieacuten el exceso de luz destruye las moleacuteculas de clorofila Luego del periacuteodo bajo sombra se deben mover las macetas gradualmente hacia el nivel de luz al cual seraacute llevado para su crecimiento final (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 254 Temperatura La temperatura del aire y del medio o sustrato de crecimiento estaacute generalmente controlado durante el periacuteodo de aclimatacioacuten El calor es necesario en los meses de invierno y el friacuteo (enfriar) es esencial en los meses de verano Ajustando la cantidad de sombra y humedad se obtiene un control sobre la temperatura El
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enfriamiento se puede obtener gracias a ventilacioacuten abanicos niebla o aire acondicionado El calor puede provenir del sistema existente en el edificio o invernadero donde esteacuten ubicadas las macetas o por las laacutemparas ocupadas para el control del fotoperiacuteodo El rango de temperatura que se mantiene por lo general es entre los 13 y 30ordmC y esta determinado principalmente por la especie en cuestioacuten La temperatura de la zona donde se encuentran las raiacuteces es muy importante para el crecimiento lo ideal es que dicho sector tenga una mayor temperatura que el aire fomentando el crecimiento de las raiacuteces e incrementando la humedad alrededor de la planta Durante el verano esto es difiacutecil de obtener ya que la temperatura del aire es muy alta debido a la alta radiacioacuten solar Terminado el proceso de aclimatacioacuten esto ya no es necesario (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 255 Fotosiacutentesis Las plantas sufren un cambio radical cuando son removidas desde cultivo in vitro ya que son forzadas a cambiar de heterotroacuteficas a autotroacuteficas y la fotosiacutentesis se vuelve fundamental para la sobrevivencia Las hojas de las plantas in vitro no estaacuten formadas para hacer fotosiacutentesis ya que en la caacutemara de incubacioacuten no se produce un fuerte intercambio gaseoso esto debido a que la sacarosa es entregada a traveacutes del medio de cultivo Las hojas de las plantas que son trasladadas al campo o invernadero sufren deterioro debido a que no estaacuten formadas para la fijacioacuten de carbono Esto se produce por un tiempo aproximado de cuatro semanas despueacutes de las cuales las hojas nuevas suplen a las viejas Otro punto es que las hojas de las plantas cultivadas in vitro contienen menor proporcioacuten de clorofila que las plantas que han crecido normalmente en el campo En un estudio de coliflor cultivado in vitro se midioacute el CO2 y se obtuvo un balance negativo el cual se mantuvo durante dos semanas despueacutes del transplante Algo similar ocurrioacute con frutilla despueacutes del transplante las hojas se deterioraron raacutepidamente lo que quiere decir que no hubo incremento en la fijacioacuten de carbono indicando falta de desarrollo en la competencia fotosinteacutetica
El bajo nivel de CO2 durante el cultivo in vitro limita el proceso de fotosiacutentesis lo cual se puede compensar usando sacarosa en el medio de cultivo Tambieacuten se puede incrementar el nivel de luz y CO2 obteniendo un fuerte aumento en el crecimiento de varias especies como orquiacutedeas clavel etc (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 256 Sustrato Un sustrato es todo material soacutelido distinto del suelo natural mineral u orgaacutenico que colocado en un contenedor en forma pura o en mezcla permite el anclaje del sistema radicular de la planta desempentildeando por lo tanto un papel de soporte para la planta El sustrato puede intervenir o no en el complejo proceso de la nutricioacuten mineral de la planta (INFOAGRO 2007) El sustrato y los contenedores dentro de los cuales se van a transplantar las plaacutentulas in vitro son importantes para una buena sobrevivencia
Los sustratos ejercen una influencia significativa en la arquitectura del sistema radical de las plantas y en las asociaciones bioloacutegicas de este con el suelo influenciando el
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estado nutricional y la translocacioacuten de agua en el sistema suelo-planta-atmoacutesfera Uno de los requisitos fundamentales que debe cumplir el sustrato para su utilizacioacuten es la sanidad Cuando estos no se elaboran almacenan o manejan correctamente pueden contaminarse y provocar serios dantildeos a las plantas durante la aclimatacioacuten por esta razoacuten son preferidos como componentes para su elaboracioacuten materiales inertes o aquellos en las cuales el proceso de obtencioacuten garantice la mayor desinfeccioacuten posible
Uno de los factores de mayor importancia a la hora de seleccionar los materiales que pueden constituir el sustrato es su disponibilidad tanto en teacuterminos de facilidad de obtencioacuten o suministro como de su costo (VILCHEZ et al 2007)
La presencia de inhibidores o tambieacuten cambios en el pH del sustrato pueden afectar el crecimiento de las raiacuteces y consecuentemente el eacutexito del transplante
Muchos laboratorios y viveros transplantan a un sustrato uniforme debiendo ser eacuteste adecuado en cuanto a soporte de las plantas pH porosidad aireacioacuten y drenaje (DEBERGH y ZIMMERMAN 1991)
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3 MATERIAL Y MEacuteTODO
Para la realizacioacuten de este trabajo se utilizoacute el siguiente material y meacutetodo
31 Material La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio e invernadero de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal pertenecientes a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de Chile
311 Material vegetal Se utilizaron plaacutentulas de C virescens cultivadas in vitro a partir de semillas las cuales fueron proporcionadas por el laboratorio estas plaacutentulas fueron separadas y repicadas para aumentar la poblacioacuten y obtener la cantidad necesaria para el ensayo
FIGURA 2 Plaacutentulas de C virescens en caacutemara de crecimiento in vitro
312 Materiales Los materiales que se utilizaron fueron los siguientes Equipos autoclave caacutemara de flujo laminar dispensador de medios medidor
de pH agitador magneacutetico horno microondas balanza mechero termoacutemetro Materiales vasos de precipitado matraces probetas pipetas papel de
aluminio frascos de vidrio placas Petri pinzas bisturiacute macetas regadera Soluciones soluciones madre (Medio MS) gelificante etanol 70 y 95
32 Meacutetodo A continuacioacuten se da a conocer la metodologiacutea con la cual se trabajoacute 321 Preparacioacuten del medio de cultivo Para la obtencioacuten de plantas a traveacutes de la micropropagacioacuten se ocupoacute el medio basal de MURASHIGE y SKOOG (1962) tambieacuten llamado medio MS Este medio tiene un pH de entre 56-57 Posteriormente se dosificoacute con el dispensador de medios para que cada frasco tenga una cantidad adecuada (25 mL) y se llevoacute a autoclave para esterilizar a 12 atm 120ordm C por 20 min
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322 Obtencioacuten del material vegetal Al tener el medio esterilizado se procedioacute a la separacioacuten y repicado de plaacutentulas existentes en el laboratorio Las siembras se realizaron en el mes de mayo del 2007 Estas siembras se realizaron en la caacutemara de flujo laminar de modo de asegurar que la siembra sea 100 aseacuteptica Estas plaacutentulas fueron mantenidas en la caacutemara de incubacioacuten hasta obtener los tamantildeos requeridos para el ensayo donde las condiciones fueron las siguientes
minus Temperatura ambiental de 23-25ordm C minus Fotoperiacuteodo de 16 horas minus Intensidad lumiacutenica controlada de 50-55 micromol m-2s-1
323 Sustratos Se utilizaron tres tipos de sustratos el primero corresponde a una mezcla de turba + perlita (11) el segundo corresponde a Sphagnum (100) y el tercero corresponde a una mezcla de turba + arena (11) Una vez realizadas las mezclas se procedioacute a una esterilizacioacuten en un autoclave a 121ordm C por 20 minutos a 12 atmoacutesfera De esta forma se trabajoacute con material limpio y sano evitando ataque de hongos o bacterias El anaacutelisis quiacutemico de los sustratos se muestra en el Anexo 2 324 Plantacioacuten Las plaacutentulas con un promedio de cuatro meses en condiciones de caacutemara de crecimiento in vitro obtuvieron el tamantildeo adecuado para ser utilizadas Se sacaron de los frascos y se plantaron en las macetas de plaacutestico transparente con los sustratos Posteriormente fueron dejadas en la sala del laboratorio donde se debioacute asperjar con solucioacuten nutritiva Hoagland y fungicida Captan CUADRO 1 Composicioacuten de solucioacuten nutritiva Hoagland
KNO3 102 gL Ca(NO3) 4 H2 O 0492 gL
NH4H2 (PO4) 023 gL MgSO4 7 H2O 049 gL
H3BO3 286 mgL MnCl2 2 H2O 181 mgL CuSO4 5 H2O 008 mgL ZnSO4 5 H2O 022 mgL Na2MoO4 H2O 009 mgL
FeSO4 7 H2O 05 06 mL FUENTE FINCK 1988 325 Disentildeo de los ensayos Este trabajo de investigacioacuten constoacute de un ensayo con dos etapas Antes que todo se realizoacute la separacioacuten y repicado in vitro de plaacutentulas de C virescens para la obtencioacuten del nuacutemero necesario de plantas En la etapa 1 se utilizaron tres tamantildeos de plaacutentulas obtenidas in vitro de 1-2cm de 2-3cm y de maacutes de 3cm de altura que se transplantaron a tres sustratos turba + perlita 11(vv) Sphagnum (100) y turba + arena 11 (vv) La turba provino de la Sociedad
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Minera Patagonia Peat SA en Hijuelas el Sphagnum de la empresa Lonquen Chile de Puerto Montt y la perlita se obtuvo a traveacutes del sitio web wwwjardisencl (representante legal Walter Rathgeb Penza Ingeniero Agroacutenomo Santiago) Las plaacutentulas se plantaron de acuerdo a su tamantildeo las de maacutes de 3cm se colocaron de 6 por maceta las de 2 a 3cm de a 8 por maceta y las maacutes chicas de a 10 por maceta Estas macetas fueron dejadas en una sala de aclimatacioacuten con una temperatura promedio de 20ordm C intensidad lumiacutenica de 50-55 micromol m-2s-1 y 14-16 hrs de fotoperiacuteodo Se fertilizoacute asperjando cada cinco diacuteas con solucioacuten nutritiva Hoagland Esta etapa se llevoacute a cabo durante dos meses desde el cinco de septiembre hasta el cinco de noviembre de 2007
En la etapa 2 se continuoacute el proceso de aclimatacioacuten en invernadero de las plaacutentulas obtenidas en la etapa 1 que despueacutes de dos meses teniacutean un mayor tamantildeo y se habiacutean acondicionado al ambiente exterior (fuera de la caacutemara de crecimiento) Las plantas se mantuvieron en las macetas durante tres semanas para aclimatarlas y luego las plantas sobrevivientes fueron transplantadas a macetas maacutes grandes individuales durante tres meses aproximadamente hasta el cinco de marzo 2008 Estas nuevas macetas tuvieron como sustrato turba y suelo (trumao) en igual proporcioacuten (Anexo 2) La temperatura promedio de invernadero fluctuoacute de 13 a 35 degC seguacuten el mes En enero el promedio fue de 25 (Anexo 3) Para bajar la temperatura alrededor de 5deg C se instaloacute una malla Rachel 326 Disentildeo experimental El disentildeo experimental utilizado fue completamente al azar ordenado como experimento factorial con dos factores tamantildeo (3) y sustrato (3) Cada tratamiento tuvo tres repeticiones con un miacutenimo de 6 plantas por recipiente 327 Variables a evaluar Durante los dos meses en que las macetas estuvieron en la sala de aclimatacioacuten se evaluoacute el desarrollo foliar contando el nuacutemero de hojas una vez al mes Posteriormente se trasladaron las mismas macetas a invernadero durante tres semanas para continuar con la aclimatacioacuten de las plaacutentulas Transcurrido este tiempo se transplantaron las plaacutentulas sobrevivientes a macetas individuales y continuoacute mensualmente la evaluacioacuten de eacutestas (nuacutemero de hojas) hasta la obtencioacuten de plantas establecidas Al momento del transplante y al final del ensayo se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces asiacute como tambieacuten al final del ensayo de evaluoacute el crecimiento en altura (cm) La sobrevivencia fue evaluada al final del ensayo por maceta
Tanto en la sala de aclimatacioacuten coacutemo en el invernadero se registroacute la temperatura con la ayuda de un termoacutemetro de maacutexima y miacutenima (Anexo 3) 328 Anaacutelisis estadiacutestico Una vez obtenidos los datos se procedioacute a comprobar si estos cumpliacutean con los supuestos de aleatoriedad normalidad y homogeneidad de varianzas que exige este tipo de anaacutelisis En el caso de no cumplirse estos supuestos los datos se transformaron utilizando log10(x+05) raiacutez(x+05) o 1x para normalizarlos
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y enseguida se sometioacute los datos a un anaacutelisis estadiacutestico (ANDEVA) Posteriormente en los casos en que se observoacute diferencias significativas en el ANDEVA se aplicoacute una prueba de rangos muacuteltiples (Tukey) al 5 de significancia Para las variables no parameacutetricas que no cumplieron con los supuestos para un anaacutelisis de varianza se realizoacute la prueba de KruskalndashWallis y las comparaciones muacuteltiples a traveacutes del test de Dunn con un nivel de 5 de significancia
Se utilizaron los programas estadiacutesticos STATGRAPHICS 20 y GRAPHPAD PRISM 5 para el anaacutelisis de datos
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4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
En los siguientes puntos se discuten los resultados obtenidos en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens
En la Figura 3 se observan plaacutentulas de C virescens micropropagadas en medio MS en caacutemara de crecimiento al inicio del ensayo (A) y en invernadero despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten (B)
BA
FIGURA 3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten
A continuacioacuten se presentan los resultados obtenidos para las variables analizadas (Cuadro 2 y 3) de esta manera se pueden visualizar en general los resultados obtenidos en el proceso de aclimatacioacuten durante seis meses
CUADRO 2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de raiacuteces
inicial y final Variables
Hojas finales (nuacutemero)
Raiacuteces iniciales (nuacutemero)
Raiacuteces finales (nuacutemero)
Tamantildeo de plaacutentulas 36 24 37 47 29 46
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 61 43 76
Sustratos 53 36 56 43 29 51
Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 46 27 49
Significa que hay diferencias significativas al 95 Test de Dunn
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Las variables no parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en hojas finales y raiacuteces iniciales en sus rangos de distribucioacuten Las raiacuteces finales no presentaron diferencias seguacuten el sustrato utilizado pero de acuerdo al tamantildeo hubo diferencias en su distribucioacuten
CUADRO 3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas
Variables Altura final de plaacutentulas
(cm) Sobrevivencia
Tamantildeo de plaacutentulas
36 c 567 b 47 b 821 a
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 59 a 908 a
Sustratos 52 a 933 a
41 ab 59 b Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 49 b 772 a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY Las variables parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en altura final de hojas y en sobrevivencia 41 Nuacutemero de hojas finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentulas y de sustratos para la variable nuacutemero final de hojas 411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula Seguacuten el Cuadro 2 y Figura 4 las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero final de hojas Las plaacutentulas pequentildeas de 1-2 cm obtuvieron el nuacutemero maacutes bajo de hojas finales con una media de 36 hojas por plaacutentula lo cual es la mitad de las hojas finales que se obtuvo con las plaacutentulas de mayor tamantildeo (61 hojas aproximado por plaacutentula) Para las plaacutentulas medianas de 2-3 cm se obtuvo una media de 47 hojas por plaacutentula (Figura 4)
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Hojas finales
1-2 cm 2-3cm maacutes de 3 cm0
5
10
15
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn)
BLANCO (2006) sentildeala que plaacutentulas cultivadas in vitro crecen bajo condiciones especiales como alta humedad relativa y baja luminosidad ademaacutes son suplidas con sacarosa Estas condiciones fueron proporcionadas en una caacutemara de crecimiento en el laboratorio donde las plantas micropropagadas no son dependientes por completo de su fotosiacutentesis son heteroacutetrofas Parece ser necesario un estiacutemulo para convertirse en organismos totalmente capaces de sustentar sus propios requisitos de carbono y nitroacutegeno reducido pasando de esta manera a ser autoacutetrofos
Al ser sacadas de un medio in vitro las hojas no estaacuten preparadas para producir su propio alimento y sobreviven gracias a que el medio de cultivo le proporciona los nutrientes necesarios para vivir En este punto muchas de las hojas mueren y nacen hojas nuevas capaces de generar su alimento supliendo asiacute las hojas viejas (SEELYE et al 2003) En este ensayo las plaacutentulas de Chloraea virescens presentaron en general una buena adaptacioacuten al ser sacadas de un medio in vitro
Se observoacute que plaacutentulas con menor tamantildeo al ser aclimatadas y tener menor tejido fue maacutes difiacutecil y maacutes lento que empezaran a generar nuevos tejidos y materia orgaacutenica a partir de dioacutexido de carbono POSPIacuteŠILOVAacute et al (1999) sentildeala que al tener los estomas con desarrollo incompleto maacutes grandes y de forma maacutes redonda pierden maacutes agua lo cual puede provocar una peacuterdida de hojas muriendo asiacute la plaacutentula Por esta razoacuten las plaacutentulas pequentildeas se demoran maacutes tiempo en generar hojas nuevas es por ello que al finalizar este estudio muestran el menor nuacutemero final de hojas 412 Efecto del tipo de sustrato Al analizar la influencia del tipo de sustrato se encontraron diferencias significativas entre los tres sustratos utilizados Seguacuten el Cuadro 2 y la Figura 5 el sustrato donde se obtuvo mejores resultados fue
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turba+perlita en el cual se observoacute un promedio de 53 hojas por plaacutentula siendo Sphagnum el maacutes bajo con 43 hojas por plaacutentula De acuerdo a los resultados del anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados el sustrato turba+perlita tiene mayor cantidad de nitroacutegeno foacutesforo calcio magnesio y azufre disponible comparativamente con los otros dos sustratos (Sphagnum y arena+turba) (Anexo 2)
Hojas finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
Sustratos
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) Para la brotacioacuten y el crecimiento de las plantas se necesita agua y Nitroacutegeno lo que favorece a una mayor tasa de aparicioacuten de hojas lo que se traduce en una mayor cantidad de hojas finales El Nitroacutegeno se encuentra en mayor cantidad en el sustrato turba+perlita debido a lo cual los mejores resultados se obtienen en dicho sustrato 413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Despueacutes de analizados los efectos individuales del tamantildeo y del sustrato al interactuar ambos factores existen diferencias significativas La mejor interaccioacuten se obtuvo con el sustrato turba+perlita y con el mayor tamantildeo de la plaacutentula (Figura 6) Debido a la buena estructura (porosa) de dicho sustrato se podriacutea decir que se favorecioacute la absorcioacuten radicular de nutrientes obteniendo por ello un mayor nuacutemero de hojas finales Para los menores tamantildeos no se observan diferencias significativas obteniendo como promedio 41 hojas por plaacutentula Para el mayor tamantildeo el promedio fue de 6 hojas por plaacutentula
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Hojas finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 42 Raiacuteces iniciales Este paraacutemetro se evaluoacute luego de la primera etapa de aclimatacioacuten la cual se realizoacute en una sala de aclimatacioacuten del laboratorio Se analizoacute la influencia de diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos sobre la variable nuacutemero raiacuteces iniciales (Anaacutelisis de Kruskal-Wallis en Anexo 7)
FIGURA 7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses de pre aclimatacioacuten
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En la Figura 7 se puede observar los resultados de pre aclimatacioacuten en sala de laboratorio En esta etapa ya es posible ver la presencia de raiacuteces desarrolladas 421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula En el Cuadro 2 se puede observar que las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero inicial de raiacuteces y en la Figura 8 se puede comprobar que para los dos tamantildeos de plaacutentula maacutes pequentildeos no se observa gran cantidad de raiacuteces esto no impidioacute el desarrollo posterior de las plaacutentulas las cuales lograron enraizar al final del estudio Esto se contrapone a lo observado en un estudio de Lapageria rosea donde la presencia de raiacutez y brote para lograr una multiplicacioacuten exitosa de plantas es de vital importancia Incluso algunas plaacutentulas de L rosea no brotan en condiciones in vitro en donde tienen las mejores condiciones nutricionales y hormonales para hacerlo Esto se debe a factores internos de la plaacutentula siendo muy difiacutecil que broten inmediatamente en caacutemara de aclimatacioacuten donde ya dejan de recibir los nutrientes necesarios de manera directa y requieren de balances de energiacutea para poder seguir elongando raiacuteces absorber nutrientes y brotar para poder obtener los carbohidratos necesarios para seguir su crecimiento (BLANCO 2006) El tamantildeo de plaacutentula tiene importancia para el desarrollo de raiacuteces se distingue notoriamente que en los tamantildeos maacutes grandes el nuacutemero de raiacuteces es mayor comparativamente con los tamantildeos pequentildeos donde el nuacutemero de raiacuteces fue escaso Debido a la presencia de maacutes hojas existe una mayor cantidad de aacuterea fotosinteacutetica esta situacioacuten estimula el crecimiento de las raiacuteces para la obtencioacuten de agua y nutrientes
Raices iniciales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
2
4
6
8
10
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o inicial de ra
iacuteces
FIGURA 8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn)
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422 Efecto del tipo de sustrato Para el sustrato turba+perlita se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas en el nuacutemero de raiacuteces con respecto a los dos otros sustratos esto se puede ver en el Figura 9 donde se observa que se obtuvieron los mayores resultados En cualquier medio de crecimiento el espacio no ocupado por un soacutelido se llama porosidad este espacio puede ser ocupado en parte para retener agua y en parte para proporcionarle aire a las raiacuteces La ausencia de uno de estos elementos es perjudicial para las plantas La turba es conocida por tener estas propiedades y la perlita tambieacuten por esta razoacuten se sabe que la mezcla turba-perlita provee propiedades fiacutesicas excelentes como medio de crecimiento y propagacioacuten (INFOAGRO 2007) Estos resultados con turba-perlita (298 de materia orgaacutenica) coinciden con los obtenidos por DIAZ et al (2004) quienes al utilizar un sustrato compuesto por 100 de humus de lombriz para aclimatar cantildea de azuacutecar obtuvieron el mayor nuacutemero de raiacuteces Esto puede atribuirse al importante aporte de materia orgaacutenica del humus (47) lo que le confiere una mejor estructura obtenieacutendose una excelente porosidad del sustrato La aireacioacuten del suelo es necesaria para favorecer la maacutexima absorcioacuten de nutrientes por las raiacuteces Esto tambieacuten sucede en el sustrato turba+perlita el cual posee la mayor cantidad de materia orgaacutenica de los tres sustratos utilizados
Raices iniciales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
2
4
6
8
10
Sustratos
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato En los anaacutelisis para la variable nuacutemero de raiacuteces se puede decir que la mejor interaccioacuten se presentoacute para el sustrato de turba+perlita junto con el mayor tamantildeo de plaacutentulas obteniendo los valores maacutes altos entre los nueve tratamientos La presencia de raiacuteces luego de la micropropagacioacuten aumenta la posibilidad de eacutexito en el transplante ya que se crea un favorable balance de agua Pero esto no quiere
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decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
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Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
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En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
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El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
34
Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
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Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
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Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
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Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
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- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
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- INDICES
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- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
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- RESUMEN
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- Reacutesumeacute
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- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
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- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
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- 3 MATERIAL Y METODO
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- 31 Material
- 32 Meacutetodo
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- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
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- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
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- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
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- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
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RESUMEN Dentro del esquema de micropropagacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens la aclimatacioacuten es la etapa final donde la manipulacioacuten debe ser muy cuidadosa ya que es donde se produce el mayor iacutendice de mortandad principalmente en el proceso de trasplante Esta etapa es muy importante ya que gracias a ella se veraacute la eficiencia del proceso y la calidad final de las plantas producidas in vitro por eso el objetivo general de este trabajo es evaluar la influencia del tamantildeo de plaacutentulas y utilizacioacuten de distintos sustratos en la aclimatacioacuten ex vitro de plaacutentulas de C virescens Se utilizaron plaacutentulas de Chloraea virescens obtenidas a partir de la micropropagacioacuten de protocormos provenientes de germinacioacuten asimbioacuteticas de semillas efectuada en el laboratorio de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal de la Universidad Austral de Chile Las plaacutentulas fueron repicadas hasta obtener el nuacutemero adecuado para el ensayo Luego fueron trasladadas a una sala del laboratorio en macetas de seis ocho y diez plaacutentulas dependiendo del tamantildeo de la plaacutentula (maacutes de 3cm 2-3cm y 1-2cm respectivamente) por dos meses posteriormente fueron transferidas a 3 sustratos turba+perlita (11) Sphagnum y turba+arena (11) y fueron llevadas a invernadero durante cuatro meses Las variables evaluadas fueron nuacutemero final de hojas nuacutemero inicial y final de raiacuteces altura y sobrevivencia de las plaacutentulas Los resultados obtenidos demostraron que los tamantildeos y los sustratos ocupados influyen en el crecimiento de las plaacutentulas El mejor tamantildeo para la aclimatacioacuten es de maacutes de 3cm obteniendo con eacuteste los mejores resultados en todas las variables evaluadas Lo mismo ocurrioacute con el sustrato turba+perlita el cual fue el mejor evaluado
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REacuteSUMEacute Dans le scheacutema de la micropropagation de Chloraea virescens lacclimatation est la derniegravere eacutetape ougrave il faut ecirctre prudent parce que cest agrave ce moment lagrave que les taux de mortaliteacute sont les plus eacuteleveacutes principalement dans le processus de transplantation Cette eacutetape est tregraves importante parce que ce sera gracircce agrave elle quacuteon verra lefficaciteacute du processus et la qualiteacute finale des plantes produites in vitro Lobjectif geacuteneacuteral de cette eacutetude est dacuteeacutevaluer linfluence de la taille des plantes et lutilisation de divers substrats pour lacuteacclimatation de C virescens On a utiliseacute des plantes de C virescens obtenue a partir de la micropropagation de protocormos en provenance du laboratoire de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal de la Universidad Austral de Chile Les plantes ont eacuteteacute subdiviseacutee pour obtenir le nombre approprieacute Elles ont ensuite eacuteteacute transfeacutereacutees agrave des pots dans une piegravece du laboratoire de six huit et dix en fonction de la taille de la plante (plus de 3 cm de 2-3 cm et 1-2 cm respectivement) pour deux mois ensuite elles ont eacuteteacute transfeacutereacutee dans trois substrats tourbe + perlite (11) Sphagnum et tourbe + sable (11) et elles ont eacuteteacute mises dans une serre pour quatre mois Les variables agrave eacutevaluer sont nombre final de feuilles nombre de racines au deacutebut et agrave la fin la hauteur et la survie des plantes Les reacutesultats ont montreacute que la taille et les substrats utiliseacutes ont une influence sur la croissance des jeunes plantes La taille ideacuteale pour lacclimatation est plus de 3cm avec cette derniegravere on a obtenu les meilleurs reacutesultats dans toutes les variables qui ont eacuteteacute eacutevalueacutees Le mecircme reacutesultat sest produit avec le substrat de tourbe + perlite lequel a aussi montreacute les meilleurs reacutesultats
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1 INTRODUCCION La familia Orchidaceae (Orquiacutedeas) es la que mayor nuacutemero de especies comprende en el Reino Vegetal Se estima que debe haber alrededor de 35000 especies de Orquiacutedeas en todo el mundo pertenecientes a unos 750 geacuteneros ademaacutes de miles de hiacutebridos En Chile esta familia es probablemente el grupo menos estudiado de plantas con flores y soacutelo se han realizado estudios en base a su taxonomiacutea biologiacutea reproductiva fenologiacutea y distribucioacuten
La produccioacuten de flores de orquiacutedeas ha tomado importancia por la belleza de sus flores dada la enorme variedad de formas colores y perfumes Existen orquiacutedeas terrestres y epiacutefitas estas uacuteltimas representan maacutes del 90 del total de especies y son las que mayoritariamente se encuentran a la venta Las flores tienen un alto valor ornamental o como flor cortada ya que eacutestas pueden permanecer separadas de las plantas sin marchitarse hasta tres o cuatro semanas y en la planta permanecen hasta tres meses
La obtencioacuten de plantas de orquiacutedeas a partir de semillas es muy difiacutecil ya que eacutestas son diminutas y de germinacioacuten irregular Como una alternativa de obtencioacuten de plantas aparece la micropropagacioacuten pudiendo asiacute aumentar el nuacutemero de plantas en forma relativamente faacutecil y raacutepida Luego de la etapa de micropropagacioacuten viene la etapa de aclimatacioacuten en la cual la manipulacioacuten debe ser en extremo cuidadosa ya que es donde se produce el mayor iacutendice de mortandad principalmente en el proceso de transplante Esta etapa es muy importante ya que gracias a ella se veraacute la eficiencia del proceso y la calidad final de las plantas producidas in vitro Considerando la produccioacuten de plaacutentulas mediante la micropropagacioacuten en este trabajo se plantea la hipoacutetesis que ldquoel tamantildeo de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro y los distintos sustratos son factores que inciden en el desarrollo y su aclimatacioacutenrdquo El objetivo general de este trabajo es
Evaluar la influencia del tamantildeo de plaacutentulas y utilizacioacuten de distintos sustratos en la aclimatacioacuten ex vitro de plaacutentulas de C virescens
Los objetivos especiacuteficos son
Medir el efecto del tamantildeo de plaacutentulas de C virescens en la sobrevivencia y desarrollo de eacutestas ex vitro
Comparar el uso de tres sustratos en el desarrollo y sobrevivencia de plaacutentulas de C virescens
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2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA 21 Descripcioacuten general 211 Descripcioacuten geograacutefica Las orquiacutedeas pertenecen a la familia Orchidaceae clase Liliopsida (monocotiledoacuteneas) Son plantas herbaacuteceas perennes originarias de regiones tropicales y subtropicales pero existen tambieacuten en todos los continentes a excepcioacuten de las regiones polares La zona donde se encuentran estas plantas estaacute comprendida entre los 68ordm latitud norte y 56ordm latitud sur Es evidente que en los liacutemites extremos de estas latitudes se encuentran pocos geacuteneros y especies esto va en aumento desde las regiones temperadas hasta las regiones intertropicales donde el nuacutemero es el mayor Los territorios maacutes interesantes por su nuacutemero son
Ameacuterica del Sur y Ameacuterica Central Asia e India Madagascar Australia es el continente menos poblado en orquiacutedeas dentro de las regiones
del globo Por su parte Europa presenta numerosos geacuteneros y especies de orquiacutedeas
terrestres Soacutelo en Francia existen 75 especies repartidas en 16 geacuteneros todas terrestres (LECOUFLE y ROSE 1956)
212 Formas de vida Las zonas donde crecen estas plantas influyen sobre su manera de vivir Algunas orquiacutedeas son terrestres y se encuentran representadas en todas las regiones Tambieacuten existen las epiacutefitas (vegetal que fijado a otro no obtiene de eacuteste su alimento) En este caso se necesita que el grado higromeacutetrico y la temperatura permitan este tipo de adaptacioacuten Ademaacutes existen las orquiacutedeas litofiacuteticas que viven sobre rocas Las raiacuteces de las epiacutefitas y litofiacuteticas estaacuten adaptadas a vivir expuestas al aire o inmersas en materia orgaacutenica ya que tienen un tejido acumulador de agua llamado velo En zonas friacuteas y templado friacuteas todas las orquiacutedeas son terrestres En zonas subtropicales o tropicales la gran mayoriacutea es epiacutefita Otra particularidad debida seguramente a la influencia de estas zonas es la floracioacuten Es en las zonas tropicales y subtropicales que se dan los mayores tamantildeos de flores asiacute como tambieacuten la mayor variedad de colores (LECOUFLE y ROSE 1956)
213 Descripcioacuten morfoloacutegica Las orquiacutedeas se caracterizan por poseer flores muy vistosas hermafroditas (ambos sexos en la misma flor) zigomorfas (con un solo plano de simetriacutea) triacutemeras (tres seacutepalos y tres peacutetalos) y una columna central que sustenta las estructuras reproductivas masculinas anteras y femeninas pistilo llamada ginostemo El peacutetalo inferior se llama labelo y su morfologiacutea define a los distintos geacuteneros de orquiacutedeas Las flores pueden ser aisladas o en inflorescencia y son polinizadas por insectos El polen se encuentra aglomerado formando una masa llamada polinio el que tiene un extremo con un ensanchamiento glandular pegajoso que sirve para que el
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polinio se adhiera al cuerpo del insecto polinizador El fruto es una caacutepsula seca con muchas semillas pequentildeas sin endosperma y con embrioacuten no diferenciado Tienen dos tipos baacutesicos de crecimiento Simpodial en las que el nuevo crecimiento se produce en sentido horizontal a partir de un tallo subterraacuteneo o rizoma generando una sub-unidad capaz de producir una flor o inflorescencia y de ser eventualmente separada de la planta (ej Cattleya) Monopodial en las que el nuevo crecimiento se produce en sentido vertical con lo cual la planta crece constantemente en altura (ej Phalaenopsis) (ORQUIDEAS 2007) 214 Geacuteneros y especies chilenas Seguacuten NOVOA et al (2006) en la familia Orchidaceae se encuentran 49 especies de flora nativa dentro de las cuales se encuentra Chloraea virescens (Willd) Lindl Los geacuteneros de Orchidaceae en Chile son 7
- Aa Bipinnula Brachystele Codonorchis Chloraea Gavilea y Habenaria
Dentro del geacutenero Chloraea existen 31 especies - Chloraea alpina Poepp - Chloraea barbata Lindl - Chloraea bidendata (Poepp y Endl) Correa - Chloraea bletioides Lindl - Chloraea cuneata Lindl - Chloraea chica Speg - Chloraea chrysantha Poepp - Chloraea crispa Lindl - Chloraea cristata Lindl - Chloraea cylindrostachya Poepp - Chloraea disoides Lindl - Chloraea galeata Lindl - Chloraea gaudichaudii Brongn - Chloraea gavilu Lindl - Chloraea grandiflora Lindl - Chloraea heteroglossa Rchbf - Chloraea incisa Poepp - Chloraea lamellata Lindl - Chloraea lechleri Lindl - Chloraea leptopetala Reiche - Chloraea longipetala Lindl - Chloraea magellanica Hookf - Chloraea multiflora Lindl - Chloraea nudilabia Lindl - Chloraea philippii Reichbf - Chloraea picta Phil - Chloraea prodigiosa Reichbf - Chloraea speciosa Poepp - Chloraea virescens Lindl - Chloraea viridiflora Poepp
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- Chloraea volkmanni Phil (NOVOA et al 2006) 2141 Chloraea virescens Planta perenne de 40-90 cm de altura Sus hojas son de 5-12cm de largo por 15-25cm de ancho estrechas lanceoladas agudas dispuestas en roseta basal generalmente marchitas al final de la antesis Su escapo floral tiene vainas caulinares lanceoladas agudas y distantes La inflorescencia es de 8-20cm de largo densa con 10-15 flores erguidas Sus flores son blancas con estriacuteas y aacutepices verdes El seacutepalo dorsal es de 16-33mm de largo por 4-6mm de ancho oblongo lanceolado obtuso algo coacutencavo a veces ligeramente estrechado al centro aacutepice algo carnoso Los seacutepalos laterales de 18-33mm de largo por 4-5mm de ancho son ensiformes con aacutepice obtuso engrosado verde negruzco a veces espatulado y dentado a veces verrugoso Los peacutetalos son de 15-23mm de largo por 5-58mm de ancho estrechamente aovados obtusos verrugosos con maacutes frecuencia solo la mitad inferior a veces el borde denticulado y carnoso El labelo de 15-26mm de largo por 10-20mm de ancho es mas o menos romboidal a levemente trilobulado El loacutebulo central tiene 5-7 nervios longitudinales recorridos por laminillas interrumpidas membranaacuteceas con segmentos falciformes de borde carnoso de color verde Los nervios laterales que se ramifican oblicuamente hacia el aacutepice en los loacutebulos laterales tienen pequentildeas laminillas y verrugas y su borde es laciniado inciso en la mitad apical hacia la base denticulado aacutepice generalmente engrosado La columna es de 12-18mm de largo delgada blanca con estriacuteas anaranjada La base de la zona nectariacutefera tiene un color amarillo-limoacuten con maacuteculas anaranjadas orificio nectario verde El ala de la columna es recta y estrecha El estigma es triangular y globoso La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la Vordf (Vintildea del Mar) hasta la XIordf Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile Sin embargo es posible que tenga una distribucioacuten maacutes restringida por que se le ha confundido con Chloraea incisa Su floracioacuten es desde noviembre a febrero y su estado de conservacioacuten no estaacute evaluado (NOVOA et al 2006) En el Anexo 14 se incluyen antecedentes sobre su distribucioacuten y eacutepoca de floracioacuten
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FIGURA 1 Chloraea virescens FUENTE NOVOA et al (2006) 22 Requerimientos de las orquiacutedeas Para tener eacutexito en el cultivo de orquiacutedeas hay que tomar en cuenta factores de importancia como son 221 Agua El riego correcto es el principio y el fin del cuidado de orquiacutedeas (ROLLKE 2005) Este elemento es primordial para las orquiacutedeas asiacute como tambieacuten para todo tipo de plantas En el caso de eacutestas se dice muchas veces que la calidad del agua usada es el factor maacutes importante en el cultivo de orquiacutedeas ya que el porcentaje maacutes alto de muerte se produce por el exceso de este factor (SHEEHAN 1980) Hay que tomar en cuenta que la mayoriacutea de las orquiacutedeas son epiacutefitas lo que significa que tienen sus raiacuteces a la vista gracias a las cuales absorben el agua de lluvia Se recomienda un sustrato poroso y de reaccioacuten neutra ya que de esta manera el agua escurre sin acumularse no permitiendo la pudricioacuten de las raiacuteces Para las orquiacutedeas terrestres es lo mismo solo que se pueden regar con maacutes frecuencia pero sin mantenerlas saturadas (OSPINA y DRESSLER 1979) Seguacuten DUMOIS (2007) el agua es lo maacutes difiacutecil de controlar ya que depende de muchas variables como por ejemplo humedad relativa tipo de sustrato intensidad luminosa temperatura y circulacioacuten de aire Ademaacutes muchas orquiacutedeas necesitan un periacuteodo de receso vegetativo que si no es respetado resulta en ausencia de floracioacuten En general hay que antildeadir agua en abundancia cuando la planta se encuentra en crecimiento activo y reducirla despueacutes de la floracioacuten
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Las especies con pseudobulbos almacenan agua y estaacuten preparadas para su periacuteodo de receso Otras que no cuentan con estos oacuterganos requieren de humedad maacutes constante 222 Luz Ninguna planta puede crecer sin la iluminacioacuten adecuada Muchas orquiacutedeas viven en las alturas de los aacuterboles y estaacuten expuestas a plena luz del sol otras crecen en el suelo selvaacutetico protegidas del sol por espesos follajes (ROLLKE 2005) La funcioacuten principal de la luz es activar el proceso de fotosiacutentesis Los cultivadores han estudiado la luz y han descubierto que hay orquiacutedeas que florecen con diacutea largo y otras con diacutea corto (OSPINA y DRESSLER 1979) Gracias a la fotosiacutentesis se convierten los minerales presentes en el ambiente en savia y nutrientes Hojas oscuras y falta de floracioacuten indican falta de luz hojas amarillas e incluso quemadas apuntan hacia un exceso de sol (DUMOIS 2007) 223 Fertilizacioacuten Las orquiacutedeas necesitan los mismos nutrientes que otras plantas Un abono para orquiacutedeas debe contener los nutrientes principales nitroacutegeno (N) foacutesforo (P) y potasio (K) asiacute como tambieacuten oligoelementos como hierro (Fe) magnesio (Mg) zinc (Zn) estantildeo (Sn) y manganeso (Mn) (ROLLKE 2005) Por otra parte la fertilizacioacuten depende de varios factores dentro de los cuales los maacutes criacuteticos son
- El medio utilizado - La edad de las plantas - Estado de las plantas ya sea floracioacuten crecimiento reposo
En cuanto a absorcioacuten se ha demostrado que es igual de eficiente por viacutea foliar como a traveacutes de las raiacuteces Es necesario tener en cuenta algunas reglas baacutesicas a la hora de fertilizar las orquiacutedeas (Asociacioacuten Costarricense de Orquideologiacutea ACO 1970)
1 Regar las plantas antes de fertilizar 2 Fraccionar las dosis 3 Aplicar el fertilizante de forma liacutequida 4 No usar fertilizantes soacutelidos 5 No fertilizar las plantas recieacuten plantadas 6 No fertilizar plantas en reposo 7 No abonar plantas enfermas
224 Temperatura Es conocido el hecho de que cada planta tiene liacutemites de temperatura dentro de los cuales prospera o perece De ahiacute la necesidad de conocer las temperaturas correspondientes al lugar de donde viene cada especie de orquiacutedea pudiendo proporcionarle la temperatura adecuada (OSPINA y DRESSLER 1979) Se puede clasificar a las orquiacutedeas como de clima caacutelido (temperatura nocturna miacutenima de 20ordmC) templado (miacutenimo de 13 a 18ordmC) y de ambiente friacuteo (de 10 a 13ordmC) (DUMOIS 2007)
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Seguacuten SHEEHAN (1980) las temperaturas ideales para las orquiacutedeas de origen tropical son 10ordmC en la noche y entre 21ordm - 24ordmC durante el diacutea 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas La micropropagacioacuten de orquiacutedeas estaacute en vanguardia hoy en diacutea El estudio de cultivo de tejido de orquiacutedeas se lleva a cabo en muchos laboratorios de todo el mundo (ARDITTI and ERNST 1992) 231 Biologiacutea de las semillas Las semillas de orquiacutedeas son conocidas usualmente como semillas polvo porque son minuacutesculas y contienen pocas reservas de alimento Estas semillas por lo general no germinan en el medio natural a menos que sean infectadas por un hongo micorriacutezico Este hongo abastece a las plantas joacutevenes con azuacutecares y nutrientes hasta que sean lo suficientemente grandes para fabricar su propio alimento Cuando la semilla germina produce una masa indiferenciada de ceacutelulas llamada protocormo Manteniendo las condiciones normales el protocormo continuaraacute su crecimiento por varias semanas meses o incluso antildeos dependiendo de la especie hasta que alcance la edad apropiada para producir raiacuteces y hojas En el caso de orquiacutedeas terrestres es de vital importancia que la relacioacuten orquiacutedea-hongo se conserve durante los estados tempranos del ciclo de vida de la planta ya que el protocormo enterrado no puede fabricar alimento por siacute mismo Por otro lado los protocormos de las orquiacutedeas epiacutefitas son comuacutenmente verdes lo que les posibilita producir parte de su alimento La relacioacuten orquiacutedea-hongo no ha sido en su totalidad investigada para el caso de las orquiacutedeas tropicales (McKENDRICK 2000) 232 Germinacioacuten simbioacutetica y no simbioacutetica de semillas Mediante la germinacioacuten in vitro las semillas germinan en frascos de vidrio o plaacutestico Estos frascos contienen en su interior un medio nutritivo solidificado con agar con todos los azuacutecares y minerales necesarios para la germinacioacuten y crecimiento de las semillas Hay dos tipos de germinacioacuten la simbioacutetica y la asimbioacutetica En la germinacioacuten simbioacutetica las semillas se siembran junto con una pequentildea cantidad del hongo micorriza adecuado Dicho hongo crece en el medio coloniza a las semillas que estaacuten en proceso de germinacioacuten y se produce una relacioacuten simbioacutetica la cual alimentaraacute al protocormo hasta que este sea capaz de producir sus hojas y se vuelva autotroacutefico Esta teacutecnica es usada principalmente en propagacioacuten de orquiacutedeas terrestres en zonas templadas La germinacioacuten asimbioacutetica se usa principalmente en propagacioacuten de orquiacutedeas tropicales que crecen maacutes raacutepido que sus parientes de zonas templadas Para este tipo de germinacioacuten se necesita un medio de cultivo maacutes complejo ya que todos los nutrientes orgaacutenicos e inorgaacutenicos asiacute como tambieacuten los azuacutecares deben estar en forma disponible pues no existe la intermediacioacuten del hongo (McKENDRICK 2000) 233 Condiciones de esterilidad Tanto para la germinacioacuten simbioacutetica como para la asimbioacutetica es de vital importancia que los frascos las semillas aparatos y el medio esteacuten esteacuteriles desde el principio del proceso Esto debido a que cualquier hongo o bacteria que se introduzca creceraacute maacutes raacutepido que las semillas ocupando su espacio hasta matarlas Esto se evita gracias al autoclave el cual regulado a 12 atm y 120ordmC por 20 minutos mata hongos o bacterias presentes en el medio (McKENDRICK 2000)
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2331 Siembra de las semillas Las semillas pueden ser recolectadas desde caacutepsulas verdes o maduras La caacutepsula verde que estaacute madurando estaacute llena de semillas y no se deforma cuando se aprieta con las pinzas Estas semillas pueden ser almacenadas por algunas semanas en un lugar refrigerado con bastante aireacioacuten Las semillas se pueden sembrar a partir de caacutepsulas verdes o semillas secas A continuacioacuten se muestran las ventajas y desventajas de ambos meacutetodos
- Siembra a partir de caacutepsulas verdes Si las caacutepsulas se mantienen intactas el interior (las semillas) se mantiene esteacuteril Por lo tanto si se esteriliza la parte exterior de las mismas donde hongos y bacterias pueden desarrollarse y se abren las caacutepsulas bajo condiciones esteacuteriles y las semillas podraacuten mantenerse desinfectadas
La ventaja de este meacutetodo es que no se requiere de esterilizacioacuten de las semillas lo que provoca su deterioro Otro punto a favor es que algunas semillas podriacutean germinar maacutes raacutepido que las provenientes de caacutepsulas maduras por los mecanismos de dormancia La desventaja es que en este caso todas las semillas deben ser utilizadas o eliminadas mientras que las semillas maduras se pueden almacenar Tambieacuten se debe considerar que las semillas sembradas a partir de caacutepsulas que no han madurado lo suficiente podriacutean germinar lentamente o simplemente no germinar - Siembra a partir de semillas secas En este caso una vez que la caacutepsula es abierta las semillas dejan de ser esteacuteriles y requieren de un proceso de esterilizacioacuten Comuacutenmente se utiliza una solucioacuten de hipoclorito de sodio hipoclorito de calcio o peroacutexido de hidroacutegeno Las semillas se agitan dentro de la solucioacuten que ademaacutes contiene una gota de detergente para ldquohumedecerlasrdquo luego se las enjuaga con agua destilada y se las siembra en el medio preparado La ventaja de este meacutetodo es que las semillas pueden ser colectadas secadas al aire almacenadas por varios meses en el refrigerador y utilizarlas cuando sea necesario Se debe considerar que la siembra ya sea de caacutepsulas verdes o de semillas secas estaacute determinado por la eacutepoca en que se colectan (McKENDRICK 2000) 234 Trasplante En la caacutemara de incubacioacuten las plaacutentulas se han desarrollado en condiciones limpias y en un ambiente cerrado por lo que deben acostumbrase gradualmente al ambiente exterior antes de ser trasplantadas a las macetas Tambieacuten la temperatura y la luz la cual es baja han sido constantes durante el cultivo in vitro En el medio natural la temperatura y la luz variacutean constantemente por lo que las nuevas plantas deben estar protegidas de la fuerte luz solar la cual puede quemar las hojas con soacutelo una pequentildea cantidad de eacutesta La humedad en los frascos es alta y las plantas estaacuten protegidas de ataques por hongos o bacterias Ademaacutes las plaacutentulas han crecido bajo condiciones de alta humedad y por lo tanto tendraacuten cutiacuteculas deacutebiles por lo que necesitan acostumbrase a medios menos huacutemedos antes de ser transplantadas
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Para el trasplante se deben colocar los frascos en un lugar protegido de la lluvia para que se aclimaticen a las nuevas condiciones de luz y temperatura Se deben dejar por 2 a 4 semanas en los frascos tapados Luego se debe ir aflojando las tapas para dejar entrar pequentildeas cantidades de aire hasta el punto de dejarlas descubiertas Se debe revisar si hay hojas marchitas y ver que el sustrato esteacute huacutemedo
Lo ideal es dejarlas sin tapa durante una semana antes de pasarlas a las macetas Para el trasplante se debe elegir un sustrato adecuado para el tipo de planta humedecerlo y transplantar las plantas con cuidado de no dantildear las raiacuteces y evitando la deshidratacioacuten En esta etapa tambieacuten se debe dejar las macetas selladas para evitar una raacutepida deshidratacioacuten e ir abrieacutendolas paulatinamente (McKENDRICK 2000)
24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas 241 Orquiacutedeas terrestres 2411 Cypripedium Esta es una orquiacutedea terrestre de zonas templadas se desarrolla en el Hemisferio Norte como por ejemplo en Guatemala y en Honduras pero donde se encuentra principalmente es en China Su forma maacutes comuacuten de propagacioacuten es in vitro a partir de semillas La forma maacutes eficiente es a partir de semillas inmaduras Existe un intervalo de tiempo entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten eacuteste dependeraacute de la especie y de la zona donde se desarrolle Se asume que existen aproximadamente cuatro semanas entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten El oacuteptimo para una buena germinacioacuten de Cypripedium es entre 42 y 60 diacuteas despueacutes de la polinizacioacuten y entre 14 y 32 diacuteas despueacutes de la fertilizacioacuten La germinacioacuten ocurre entre la segunda y cuarta semana despueacutes de ser sembradas y los protocormos deberiacutean ser cambiados de medio de cultivo cada dos a cuatro meses si no se corre el riesgo de sufrir agotamiento de nutrientes Los rizomas y las raiacuteces se empiezan a desarrollar a partir de los siete meses para luego dar lugar a las primeras hojas Para obtener un buen transplante se deben tener raiacuteces de miacutenimo un centiacutemetro de largo El desarrollo de raiacuteces se ve potenciado al tener un periacuteodo corto de bajas temperaturas (10degC) exposicioacuten a la luz reduccioacuten en la concentracioacuten de iones del medio de cultivo o transferirlas a un compost esteacuteril Al tener raiacuteces suficientes y el tamantildeo adecuado se podraacuten llevar las plantas al lugar donde creceraacuten definitivamente En el momento del transplante las plantas son muy susceptibles al desecamiento por lo cual lo ideal es que los brotes sean maacutes chicos que las raiacuteces El mejor sustrato seriacutea aquel donde crece naturalmente la orquiacutedea (RAumlNNBAumlCK 2007) 2412 Preservacioacuten in vitro de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes Este estudio fue hecho para establecer que parte de tejido es viable para la micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes del noreste de Europa pudiendo asiacute reestablecer dichas orquiacutedeas a sus aacutereas correspondientes La propagacioacuten in vitro de orquiacutedeas
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terrestres de clima templado es maacutes difiacutecil que las orquiacutedeas epiacutefitas de clima subtropical y tropical Las orquiacutedeas terrestres tienen requerimientos maacutes estrictos que las epiacutefitas y se conoce menos sobre sus necesidades especiacuteficas (VAASA y ROSENBERG 2004) En Estonia existen 36 especies de orquiacutedeas terrestres pero solo tres estaacuten bajo proteccioacuten Dactylorhiza baltica Dactylorhiza ruthei Dactylorhiza praetermissa Como explantes para este estudio en el caso de D baltica se ocuparon protocormos en los otros dos casos se utilizaron semillas semi maduras las cuales fueron colectadas siete y diez semanas despueacutes de ser polinizadas Para D baltica se ocupoacute el medio Murashige y Skoog suplementado con 05 mgL de aacutecido naftaleacuten aceacutetico (ANA) y 2 mgL de isonpentenyl adenina Para el caso de las semillas semi maduras se ocuparon los medios de Lindemann de Heller de Norstog y de Murashige y Skoog como control
La composicioacuten del medio y la madurez de las semillas influye mucho en el desarrollo de las orquiacutedeas in vitro Se ha demostrado que se necesita una alta concentracioacuten de microelementos para obtener una correcta germinacioacuten de las semillas Tambieacuten se puede decir que los primeros tres meses son los de mayor crecimiento luego de este tiempo el crecimiento se vuelve maacutes lento (VAASA y ROSENBERG 2004)
Luego de cuatro semanas de crecimiento de D baltica el 60 de los explantes de meristemas apicales empezaron a crecer en cambio los de meristemas laterales no expresaron ninguacuten tipo de crecimiento Las raiacuteces empezaron su desarrollo luego de dos meses despueacutes de la siembra
En el caso de D ruthei y D praetermissa la germinacioacuten se produjo despueacutes de dos meses desde la inoculacioacuten Luego de cuatro y seis meses el mayor crecimiento fue observado en el medio Norstog superando en 14 al medio testigo Murashige y Skoog (VAASA y ROSENBERG 2004)
2413 Longevidad de semillas de orquiacutedeas terrestres Por lo general las orquiacutedeas producen muchas pero pequentildeas semillas que contienen muy pocas reservas de alimento Dichas semillas estaacuten estructuralmente adaptadas para ser dispersadas por el viento pero poco se sabe del destino de eacutestas luego de ser dispersadas Algunos estudios de viabilidad de semillas indican una sobrevivencia de uno a dos antildeos en orquiacutedeas de clima templado Las semillas que son guardadas en laboratorio duran mucho maacutes tiempo Se estudioacute la viabilidad de siete especies de orquiacutedeas norteamericanas dentro de las cuales se encuentran Goodyera pubescens y Liparis liliifolia Las semillas de eacutestas se colocaron en bolsas con suelo y sustratos de bosques provenientes de sus haacutebitats naturales (WHIGHAM et al 2005) En Goodyera pubescens la mayoriacutea de las semillas germinaron en un antildeo Cuatro otras especies germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero algunas semillas no germinadas despueacutes de siete antildeos seguiacutean siendo viables En la especie Liparis liliifolia semillas que han estado cuatro antildeos bajo observacioacuten han tenido una tasa de
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germinacioacuten de un 68 al ser sembradas in vitro junto con el hongo micorriacutezico adecuado Las dos especies restantes no germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero las semillas fueron evaluadas como intactas y testeadas positivamente en cuanto a su viabilidad despueacutes de cuatro antildeos en el suelo Estas observaciones fueron interpretadas como diferentes estrategias para especies especiacuteficas de germinacioacuten in situ (WHIGHAM et al 2005) 2414 Sobrevivencia de orquiacutedeas terrestres transplantadas a sectores urbanos La conservacioacuten de poblaciones de orquiacutedeas silvestres depende del establecimiento de las orquiacutedeas propagadas a los campos Sin embargo se conoce muy poco de los factores bioacuteticos que influencian el establecimiento de orquiacutedeas terrestres a sus haacutebitats naturales Un experimento fue establecido para medir la sobrevivencia de seis especies durante su primer periacuteodo de crecimiento seguido del transplante a un sector urbano en Australia (SCADE et al 2006)
Las orquiacutedeas germinadas simbioacuteticamente crecieron en laboratorio durante cinco meses antes de establecer la plantacioacuten en sitios adyacentes con alta o baja cobertura de malezas Existioacute una muerte gradual de las plaacutentulas durante el primer periacuteodo de crecimiento primeramente por ataque de insectos no siendo evitado por la presencia de una malla cobertora Los iacutendices de sobrevivencia variacutean desde 49 para Microtis media una especie capaz de crecer en un ambiente atiacutepico hasta un 21 para Caladenia arenicola la orquiacutedea nativa maacutes comuacuten de esos sitios Sin embargo no todas las orquiacutedeas sobrevivientes producen tubeacuterculos por lo que la tasa de sobrevivencia despueacutes del primer periacuteodo seco disminuye
La sobrevivencia de las orquiacutedeas sembradas no puede ser comparada con orquiacutedeas de la misma especie que crecieron en los mismos lugares ya que no existioacute la presencia del hongo compatible para estas orquiacutedeas (SCADE et al 2006)
2415 Micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres En India dos orquiacutedeas muy importantes para la horticultura del geacutenero Anoectochilus fueron exitosamente propagadas Noacutedulos aislados de A sikkimensis colectadas en Himalaya y A regalis colectadas en India fueron cultivadas in vitro durante 12 semanas para obtener un maacuteximo de 48 a 56 protocormos y brotes obteniendo como resultado un 95 y 98 de eficiencia respectivamente Durante el repicado de los explantes in vitro de A regalis se observoacute que el nuacutemero total de brotes obtenidos a partir de noacutedulos fue 214 asiacute como tambieacuten 82 puntas de brotes En cambio para A sikkimensis fueron mucho maacutes bajos 123 y 43 respectivamente teniendo un crecimiento maacutes lento pero plantas maacutes fuertes Las raiacuteces de 4 a 6cm crecieron con la presencia de NAA (270 microM ) en el medio asiacute como tambieacuten con carbono activado (02) Durante la aclimatacioacuten la tasa de establecimiento fue entre 95 y 98 Luego de seis meses en invernadero las plantas de A regalis fueron transferidas a bosque nativo donde se obtuvo una tasa de
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sobrevivencia de entre 70 y 95 despueacutes de 12 meses Estas plantas establecidas en bosque nativo estaacuten libres de cualquier defecto morfoloacutegico y de crecimiento (GANGAPRASAD et al 2000) 242 Orquiacutedeas epiacutefitas Estas orquiacutedeas viven en los aacuterboles pero no obtienen de eacuteste su alimento no son paraacutesitas 2421 Preservacioacuten de Cattleya walkeriana usando propagacioacuten in vitro El geacutenero Cattleya se encuentra en Meacutexico y Ameacuterica Central asiacute como tambieacuten en Venezuela Colombia y las laderas de los Andes Esta orquiacutedea tambieacuten se encuentra en varias regiones del Brasil creciendo en aacuterboles rocas cerca de riacuteos lagos y pantanos Las flores de esta orquiacutedea son conocidas debido a su hermosura y a causa de la destruccioacuten de su haacutebitat y a la excesiva coleccioacuten de eacutestas se encuentra en extincioacuten
La composicioacuten del medio de cultivo es esencial para la propagacioacuten in vitro ya que suple todos los nutrientes necesarios para el desarrollo y seraacute distinto dependiendo de cada especie en este caso se utilizoacute la mitad de los macronutrientes del medio Muchos autores sugieren el uso de carboacuten activado en el medio ya que por lo general en muchas especies aumenta el desarrollo de las raiacuteces En este estudio se probaron distintas dosis de carboacuten activado 1 2 4 y 6gL con un pH de 6 (TADEU DE FARIA et al 2002) Las semillas se obtuvieron de flores artificialmente polinizadas en invernadero Plaacutentulas de aproximadamente un centiacutemetro fueron seleccionadas y cultivadas nuevamente en el medio de cultivo Murashige y Skoog pero esta vez con las diferentes dosis de carboacuten activado Se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces el nuacutemero de brotes y el peso de la materia verde total Durante el autoclavado se produce normalmente una hidroacutelisis de sacarina la cual es de 10 aproximadamente este porcentaje aumenta considerablemente al agregar un 1 de carboacuten activado llegando a ser de 95
El desarrollo de las plaacutentulas de C walkeriana aumentan con una mayor concentracioacuten de carboacuten activado asiacute como tambieacuten un mayor tiempo de cultivo El resultado fue que la dosis ideal para el desarrollo de esta orquiacutedea es 2gL de carboacuten activado (TADEU DE FARIA et al 2002) 2422 Establecimiento de cultivos in vitro y micropropagacioacuten de Cattleya aurantiaca (Bateman ex Lindl) Por medio de siembra in vitro se logroacute el establecimiento de C aurantiaca con alto porcentaje de germinacioacuten y desarrollo de protocormos Para la oacuteptima formacioacuten de callo y para la proliferacioacuten de protocormos se determinaron los medios oacuteptimos (MS 10 mgL ANA 10 mgL BA) asiacute como tambieacuten de manera directa sobre explantes de hoja y pseudobulbos (MS 01 mgL ANA 01 mgL GA3)
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Con este uacuteltimo medio tambieacuten se logroacute una oacuteptima regeneracioacuten y desarrollo de plaacutentulas Los medios liacutequidos (sin agitacioacuten) son una buena opcioacuten para conseguir la produccioacuten masiva de protocormos ya que con ellos se optimizoacute la micropropagacioacuten de C aurantiaca Las plaacutentulas micropropagadas presentaron alto porcentaje de sobrevivencia y buen desarrollo despueacutes de su trasplante y aclimatacioacuten lo cual demuestra que es un buen sistema de propagacioacuten para C aurantiaca (GUTIERREZ y SALGADO 2007) En cuanto a transplante y aclimatacioacuten despueacutes de 45 diacuteas de desarrollo in vitro las plaacutentulas de un tamantildeo entre 3 y 5 cm con raiacuteces bien desarrolladas fueron llevadas a condiciones ex vitro eliminando los restos de medio de cultivo con agua potable y ocupando un sustrato de partes iguales de tezontle y corteza de encino cubierta con hojarasca de encino finamente molida Se mantuvieron cubiertas durante 15 diacuteas abriendo cada dos diacuteas hasta poder retirar la tapa en 30 diacuteas Despueacutes de dos meses de haber sido retiradas del cultivo in vitro las plaacutentulas presentaron 70 de sobrevivencia y alcanzaron una altura de hasta 7 cm presentando nuevas hojas y raiacuteces las plantas se muestran vigorosas y capaces de continuar su crecimiento en condiciones ambientales de invernadero (GUTIERREZ y SALGADO 2007)
2423 Establecimiento in vitro y regeneracioacuten de plantas de Laelia autumnalis (Llave y Lex) Lindl Para este estudio se obtuvieron las semillas de una caacutepsula desarrollada despueacutes de 6 meses de la floracioacuten las cuales se sembraron in vitro sin presentar contaminacioacuten ya que la siembra por este meacutetodo es muy eficiente en comparacioacuten al cultivo de semillas libres donde algunas veces se presenta la contaminacioacuten Las observaciones se realizaron cada 15 diacuteas la germinacioacuten se detectoacute en los primeros 15 diacuteas en la mayoriacutea de los medios de cultivos probados con la presencia de protocormos de 1mm de diaacutemetro (HUAPEO y SALGADO 2004) El porcentaje de germinacioacuten que se obtuvo de las semillas cultivadas in vitro de L autumnalis fue de 95 a 100 en todos los medios de cultivo la uacutenica diferencia fue el tiempo entre las germinaciones A excepcioacuten de las semillas cultivadas en el medio MS 100 la germinacioacuten del 100 se obtuvo hasta los 30 diacuteas de cultivo mientras que en el primero la germinacioacuten fue a los 15 diacuteas del cultivo Las plaacutentulas con raiacutez y un par de hojas se lograron a los 90 diacuteas de cultivo en el medio MS 100 alcanzando 07 mm de altura Estas plaacutentulas fueron subcultivadas en medio MS con 05 mgl de ANA y 01 mgl de GA3 para tener plaacutentulas fuente de explante (segmentos de hojas) un medio oacuteptimo de desarrollo de plaacutentulas de L speciosa No fue necesario probar otros medios de cultivos ya que se hicieron pruebas anteriores que demostraron que era el adecuado
Las plaacutentulas de 6 meses de cultivo in vitro despueacutes de su germinacioacuten presentaron una altura promedio de 5 cm con raiacuteces con velamen y hasta dos pares de hojas Segmentos de hoja de eacutestas fueron cultivadas en el medio MS conteniendo ANA BA y GA3 en diferentes concentraciones y se realizaron observaciones cada 30 diacuteas para determinar medios inductores de callo protocormos y raiacuteces La mejor respuesta en formacioacuten de callo fue observada en los segmentos de hoja de plaacutentulas de L autumnalis cultivados en MS con 1 mgl de ANA BA y GA3 iniciando la induccioacuten de
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eacuteste desde los 30 diacuteas de cultivo solamente en un 70 de los explantes cultivados El 100 se logroacute a los 90 diacuteas de cultivo observando callo abundante alrededor de todo el tejido de color blanco con puntos pigmentados de color verde La regeneracioacuten de protocormos de esta orquiacutedea se establecioacute con la siembra de segmentos de hoja de plaacutentulas de 6 meses de edad de manera directa o a partir de callos En callos la produccioacuten fue oacuteptima en el medio MS con 01 mgl de ANABAGA3 ya que a los 60 diacuteas se obtuvieron 50 protocormos por segmento de callo Solamente se produjeron 10 protocormos por explante al cultivarse los segmentos de hoja en MS con 01 mgl de ANABAGA3 a los 120 diacuteas de cultivo (HUAPEO y SALGADO 2004) 25 Aclimatacioacuten Aclimatacioacuten significa que el hombre intercede y guiacutea el proceso de acondicionamiento de las plantas hasta que eacutestas sean aptas para crecer en el campo yo invernadero
Un alto nuacutemero de plantas micropropagadas no sobreviven al cambio desde el cultivo in vitro hacia el ambiente exterior ya sea en campo o invernadero Eacutestos dos uacuteltimos tienen menor humedad relativa niveles maacutes altos de luminosidad y un ambiente seacuteptico los cuales son maacutes estresantes para las plantas micropropagadas La mayoriacutea de las especies que crecen in vitro necesitan un proceso de aclimatacioacuten pudiendo obtener asiacute un nuacutemero suficiente de plantas vivas y vigorosas para trasplantar al suelo (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991)
La aclimatacioacuten no es uacutenicamente para micropropagacioacuten siendo usada ademaacutes en propagacioacuten convencional durante antildeos Despueacutes de cortar las hojas y de haber formado raiacuteces por lo general son aclimatadas antes de ser llevadas al campo o invernadero Ejemplos de dos teacutecnicas comunes son bajar gradualmente la humedad y mantener el nivel de luz con un 50 de sombra antes de trasladarlos al campo Las raiacuteces que han sido cortadas y mal limpiadas muchas veces son focos de infeccioacuten En estos casos las plantas muestran signos de marchitez hojas necrosadas y tambieacuten se puede llegar a la muerte de eacutestas El cultivo in vitro reduce la necesidad de fotosiacutentesis ya que las condiciones de la caacutemara de incubacioacuten proveen a la planta de sacarosa u otro azuacutecar Tambieacuten en estas condiciones se reduce el stress por patoacutegenos al ser un ambiente aseacuteptico Todo esto se traduce en que las plantas micropropagadas no son aptas para el campo yo invernadero (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 251 Stress hiacutedrico El stress hiacutedrico puede ser el resultado de una excesiva transpiracioacuten de las diferentes partes aeacutereas de las plantas especialmente de las hojas o por una inadecuada absorcioacuten de agua por parte de las raiacuteces La cutiacutecula y los estomas son la ruta primaria de peacuterdida de agua desde de las hojas provenientes de esta teacutecnica reproductiva 2511 Cutiacutecula La cutiacutecula es una membrana compuesta por una matriz de cutina que a su vez se encuentra cubierta en su superficie por ceras cuya funcioacuten primaria consiste en limitar la peacuterdida de agua por transpiracioacuten La permeabilidad del agua a traveacutes de la cutiacutecula se ve influenciada principalmente por la estructura y la cantidad de
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ceras cuticulares y epicuticulares no vieacutendose afectada la peacuterdida de agua por el grosor de eacutesta o la naturaleza quiacutemica de la matriz de la cutina La estructura cristalina de la parte encerada de las hojas es distinta en las plantas micropropagadas con respecto a las plantas que crecen en el campo La cera epicuticular de las hojas de plantas in vitro tienen una proporcioacuten maacutes alta de esteres y de componentes polares por el contrario tienen unas cadenas de hidrocarbonos mucho maacutes cortas Esto hace que las plantas in vitro pierdan maacutes agua que las cultivadas en campo o invernadero
Las plantas que han crecido en el campo son naturalmente de color verde pero el color de las plantas cultivadas in vitro es diferente y se puede ver a simple vista Las plantas que son pasadas a invernadero y que tengan un color verde se aclimatan de mejor forma al ambiente exterior (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 2512 Estomas La estructura estomaacutetica y su funcionamiento han sido implicados recurrentemente en el desbalance de agua exhibido por plantas micropropagadas al momento de ser removidas del cultivo in vitro Estudios con microscopiacutea de scanner electroacutenico han indicado que la estructura estomaacutetica presente en algunas especies de plantas cultivadas in vitro difieren marcadamente de las cultivadas en invernadero o en el suelo Debido a que las primeras presentan estomas de mayor tamantildeo y maacutes redondos a diferencia de las plantas cultivadas de manera normal que presentan estomas maacutes pequentildeos y eliacutepticos lo que resulta en una deshidratacioacuten maacutes raacutepida en el caso de las provenientes de cultivo in vitro (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 252 Humedad Debido a la anatomiacutea y la condicioacuten fisioloacutegica de las plantas desarrolladas in vitro donde se ha mantenido una alta humedad relativa es necesario regar al momento del traslado para obtener una alta sobrevivencia Muchos laboratorios aseguran que hay que evitar tener un sistema de aspersioacuten ya que se produce el ambiente necesario (muy huacutemedo) para la aparicioacuten de hongos algas o bacterias Otros meacutetodos incluyen el uso de humidificadores o poner las macetas en un lugar cerrado donde se retenga vapor para esto se pueden usar por ejemplo tapas de polietileno Este meacutetodo es relativamente econoacutemico pero se debe tener control del calor y monitorear la falta de agua (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 253 Luz Durante la etapa in vitro las plantas estaacuten expuestas a altos niveles de luminosidad lo que se traduce en hojas delgadas Antes del traslado se recomienda mantener las plantas con un 50 de sombra para asiacute poder aclimatarlas de mejor manera esto debido a que las plantas micropropagadas tienen un bajo control sobre la transpiracioacuten y un inadecuado mecanismo de fotosiacutentesis La sombra reduce la transpiracioacuten evitando excesivas peacuterdidas de agua asiacute como tambieacuten el exceso de luz destruye las moleacuteculas de clorofila Luego del periacuteodo bajo sombra se deben mover las macetas gradualmente hacia el nivel de luz al cual seraacute llevado para su crecimiento final (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 254 Temperatura La temperatura del aire y del medio o sustrato de crecimiento estaacute generalmente controlado durante el periacuteodo de aclimatacioacuten El calor es necesario en los meses de invierno y el friacuteo (enfriar) es esencial en los meses de verano Ajustando la cantidad de sombra y humedad se obtiene un control sobre la temperatura El
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enfriamiento se puede obtener gracias a ventilacioacuten abanicos niebla o aire acondicionado El calor puede provenir del sistema existente en el edificio o invernadero donde esteacuten ubicadas las macetas o por las laacutemparas ocupadas para el control del fotoperiacuteodo El rango de temperatura que se mantiene por lo general es entre los 13 y 30ordmC y esta determinado principalmente por la especie en cuestioacuten La temperatura de la zona donde se encuentran las raiacuteces es muy importante para el crecimiento lo ideal es que dicho sector tenga una mayor temperatura que el aire fomentando el crecimiento de las raiacuteces e incrementando la humedad alrededor de la planta Durante el verano esto es difiacutecil de obtener ya que la temperatura del aire es muy alta debido a la alta radiacioacuten solar Terminado el proceso de aclimatacioacuten esto ya no es necesario (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 255 Fotosiacutentesis Las plantas sufren un cambio radical cuando son removidas desde cultivo in vitro ya que son forzadas a cambiar de heterotroacuteficas a autotroacuteficas y la fotosiacutentesis se vuelve fundamental para la sobrevivencia Las hojas de las plantas in vitro no estaacuten formadas para hacer fotosiacutentesis ya que en la caacutemara de incubacioacuten no se produce un fuerte intercambio gaseoso esto debido a que la sacarosa es entregada a traveacutes del medio de cultivo Las hojas de las plantas que son trasladadas al campo o invernadero sufren deterioro debido a que no estaacuten formadas para la fijacioacuten de carbono Esto se produce por un tiempo aproximado de cuatro semanas despueacutes de las cuales las hojas nuevas suplen a las viejas Otro punto es que las hojas de las plantas cultivadas in vitro contienen menor proporcioacuten de clorofila que las plantas que han crecido normalmente en el campo En un estudio de coliflor cultivado in vitro se midioacute el CO2 y se obtuvo un balance negativo el cual se mantuvo durante dos semanas despueacutes del transplante Algo similar ocurrioacute con frutilla despueacutes del transplante las hojas se deterioraron raacutepidamente lo que quiere decir que no hubo incremento en la fijacioacuten de carbono indicando falta de desarrollo en la competencia fotosinteacutetica
El bajo nivel de CO2 durante el cultivo in vitro limita el proceso de fotosiacutentesis lo cual se puede compensar usando sacarosa en el medio de cultivo Tambieacuten se puede incrementar el nivel de luz y CO2 obteniendo un fuerte aumento en el crecimiento de varias especies como orquiacutedeas clavel etc (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 256 Sustrato Un sustrato es todo material soacutelido distinto del suelo natural mineral u orgaacutenico que colocado en un contenedor en forma pura o en mezcla permite el anclaje del sistema radicular de la planta desempentildeando por lo tanto un papel de soporte para la planta El sustrato puede intervenir o no en el complejo proceso de la nutricioacuten mineral de la planta (INFOAGRO 2007) El sustrato y los contenedores dentro de los cuales se van a transplantar las plaacutentulas in vitro son importantes para una buena sobrevivencia
Los sustratos ejercen una influencia significativa en la arquitectura del sistema radical de las plantas y en las asociaciones bioloacutegicas de este con el suelo influenciando el
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estado nutricional y la translocacioacuten de agua en el sistema suelo-planta-atmoacutesfera Uno de los requisitos fundamentales que debe cumplir el sustrato para su utilizacioacuten es la sanidad Cuando estos no se elaboran almacenan o manejan correctamente pueden contaminarse y provocar serios dantildeos a las plantas durante la aclimatacioacuten por esta razoacuten son preferidos como componentes para su elaboracioacuten materiales inertes o aquellos en las cuales el proceso de obtencioacuten garantice la mayor desinfeccioacuten posible
Uno de los factores de mayor importancia a la hora de seleccionar los materiales que pueden constituir el sustrato es su disponibilidad tanto en teacuterminos de facilidad de obtencioacuten o suministro como de su costo (VILCHEZ et al 2007)
La presencia de inhibidores o tambieacuten cambios en el pH del sustrato pueden afectar el crecimiento de las raiacuteces y consecuentemente el eacutexito del transplante
Muchos laboratorios y viveros transplantan a un sustrato uniforme debiendo ser eacuteste adecuado en cuanto a soporte de las plantas pH porosidad aireacioacuten y drenaje (DEBERGH y ZIMMERMAN 1991)
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3 MATERIAL Y MEacuteTODO
Para la realizacioacuten de este trabajo se utilizoacute el siguiente material y meacutetodo
31 Material La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio e invernadero de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal pertenecientes a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de Chile
311 Material vegetal Se utilizaron plaacutentulas de C virescens cultivadas in vitro a partir de semillas las cuales fueron proporcionadas por el laboratorio estas plaacutentulas fueron separadas y repicadas para aumentar la poblacioacuten y obtener la cantidad necesaria para el ensayo
FIGURA 2 Plaacutentulas de C virescens en caacutemara de crecimiento in vitro
312 Materiales Los materiales que se utilizaron fueron los siguientes Equipos autoclave caacutemara de flujo laminar dispensador de medios medidor
de pH agitador magneacutetico horno microondas balanza mechero termoacutemetro Materiales vasos de precipitado matraces probetas pipetas papel de
aluminio frascos de vidrio placas Petri pinzas bisturiacute macetas regadera Soluciones soluciones madre (Medio MS) gelificante etanol 70 y 95
32 Meacutetodo A continuacioacuten se da a conocer la metodologiacutea con la cual se trabajoacute 321 Preparacioacuten del medio de cultivo Para la obtencioacuten de plantas a traveacutes de la micropropagacioacuten se ocupoacute el medio basal de MURASHIGE y SKOOG (1962) tambieacuten llamado medio MS Este medio tiene un pH de entre 56-57 Posteriormente se dosificoacute con el dispensador de medios para que cada frasco tenga una cantidad adecuada (25 mL) y se llevoacute a autoclave para esterilizar a 12 atm 120ordm C por 20 min
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322 Obtencioacuten del material vegetal Al tener el medio esterilizado se procedioacute a la separacioacuten y repicado de plaacutentulas existentes en el laboratorio Las siembras se realizaron en el mes de mayo del 2007 Estas siembras se realizaron en la caacutemara de flujo laminar de modo de asegurar que la siembra sea 100 aseacuteptica Estas plaacutentulas fueron mantenidas en la caacutemara de incubacioacuten hasta obtener los tamantildeos requeridos para el ensayo donde las condiciones fueron las siguientes
minus Temperatura ambiental de 23-25ordm C minus Fotoperiacuteodo de 16 horas minus Intensidad lumiacutenica controlada de 50-55 micromol m-2s-1
323 Sustratos Se utilizaron tres tipos de sustratos el primero corresponde a una mezcla de turba + perlita (11) el segundo corresponde a Sphagnum (100) y el tercero corresponde a una mezcla de turba + arena (11) Una vez realizadas las mezclas se procedioacute a una esterilizacioacuten en un autoclave a 121ordm C por 20 minutos a 12 atmoacutesfera De esta forma se trabajoacute con material limpio y sano evitando ataque de hongos o bacterias El anaacutelisis quiacutemico de los sustratos se muestra en el Anexo 2 324 Plantacioacuten Las plaacutentulas con un promedio de cuatro meses en condiciones de caacutemara de crecimiento in vitro obtuvieron el tamantildeo adecuado para ser utilizadas Se sacaron de los frascos y se plantaron en las macetas de plaacutestico transparente con los sustratos Posteriormente fueron dejadas en la sala del laboratorio donde se debioacute asperjar con solucioacuten nutritiva Hoagland y fungicida Captan CUADRO 1 Composicioacuten de solucioacuten nutritiva Hoagland
KNO3 102 gL Ca(NO3) 4 H2 O 0492 gL
NH4H2 (PO4) 023 gL MgSO4 7 H2O 049 gL
H3BO3 286 mgL MnCl2 2 H2O 181 mgL CuSO4 5 H2O 008 mgL ZnSO4 5 H2O 022 mgL Na2MoO4 H2O 009 mgL
FeSO4 7 H2O 05 06 mL FUENTE FINCK 1988 325 Disentildeo de los ensayos Este trabajo de investigacioacuten constoacute de un ensayo con dos etapas Antes que todo se realizoacute la separacioacuten y repicado in vitro de plaacutentulas de C virescens para la obtencioacuten del nuacutemero necesario de plantas En la etapa 1 se utilizaron tres tamantildeos de plaacutentulas obtenidas in vitro de 1-2cm de 2-3cm y de maacutes de 3cm de altura que se transplantaron a tres sustratos turba + perlita 11(vv) Sphagnum (100) y turba + arena 11 (vv) La turba provino de la Sociedad
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Minera Patagonia Peat SA en Hijuelas el Sphagnum de la empresa Lonquen Chile de Puerto Montt y la perlita se obtuvo a traveacutes del sitio web wwwjardisencl (representante legal Walter Rathgeb Penza Ingeniero Agroacutenomo Santiago) Las plaacutentulas se plantaron de acuerdo a su tamantildeo las de maacutes de 3cm se colocaron de 6 por maceta las de 2 a 3cm de a 8 por maceta y las maacutes chicas de a 10 por maceta Estas macetas fueron dejadas en una sala de aclimatacioacuten con una temperatura promedio de 20ordm C intensidad lumiacutenica de 50-55 micromol m-2s-1 y 14-16 hrs de fotoperiacuteodo Se fertilizoacute asperjando cada cinco diacuteas con solucioacuten nutritiva Hoagland Esta etapa se llevoacute a cabo durante dos meses desde el cinco de septiembre hasta el cinco de noviembre de 2007
En la etapa 2 se continuoacute el proceso de aclimatacioacuten en invernadero de las plaacutentulas obtenidas en la etapa 1 que despueacutes de dos meses teniacutean un mayor tamantildeo y se habiacutean acondicionado al ambiente exterior (fuera de la caacutemara de crecimiento) Las plantas se mantuvieron en las macetas durante tres semanas para aclimatarlas y luego las plantas sobrevivientes fueron transplantadas a macetas maacutes grandes individuales durante tres meses aproximadamente hasta el cinco de marzo 2008 Estas nuevas macetas tuvieron como sustrato turba y suelo (trumao) en igual proporcioacuten (Anexo 2) La temperatura promedio de invernadero fluctuoacute de 13 a 35 degC seguacuten el mes En enero el promedio fue de 25 (Anexo 3) Para bajar la temperatura alrededor de 5deg C se instaloacute una malla Rachel 326 Disentildeo experimental El disentildeo experimental utilizado fue completamente al azar ordenado como experimento factorial con dos factores tamantildeo (3) y sustrato (3) Cada tratamiento tuvo tres repeticiones con un miacutenimo de 6 plantas por recipiente 327 Variables a evaluar Durante los dos meses en que las macetas estuvieron en la sala de aclimatacioacuten se evaluoacute el desarrollo foliar contando el nuacutemero de hojas una vez al mes Posteriormente se trasladaron las mismas macetas a invernadero durante tres semanas para continuar con la aclimatacioacuten de las plaacutentulas Transcurrido este tiempo se transplantaron las plaacutentulas sobrevivientes a macetas individuales y continuoacute mensualmente la evaluacioacuten de eacutestas (nuacutemero de hojas) hasta la obtencioacuten de plantas establecidas Al momento del transplante y al final del ensayo se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces asiacute como tambieacuten al final del ensayo de evaluoacute el crecimiento en altura (cm) La sobrevivencia fue evaluada al final del ensayo por maceta
Tanto en la sala de aclimatacioacuten coacutemo en el invernadero se registroacute la temperatura con la ayuda de un termoacutemetro de maacutexima y miacutenima (Anexo 3) 328 Anaacutelisis estadiacutestico Una vez obtenidos los datos se procedioacute a comprobar si estos cumpliacutean con los supuestos de aleatoriedad normalidad y homogeneidad de varianzas que exige este tipo de anaacutelisis En el caso de no cumplirse estos supuestos los datos se transformaron utilizando log10(x+05) raiacutez(x+05) o 1x para normalizarlos
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y enseguida se sometioacute los datos a un anaacutelisis estadiacutestico (ANDEVA) Posteriormente en los casos en que se observoacute diferencias significativas en el ANDEVA se aplicoacute una prueba de rangos muacuteltiples (Tukey) al 5 de significancia Para las variables no parameacutetricas que no cumplieron con los supuestos para un anaacutelisis de varianza se realizoacute la prueba de KruskalndashWallis y las comparaciones muacuteltiples a traveacutes del test de Dunn con un nivel de 5 de significancia
Se utilizaron los programas estadiacutesticos STATGRAPHICS 20 y GRAPHPAD PRISM 5 para el anaacutelisis de datos
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4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
En los siguientes puntos se discuten los resultados obtenidos en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens
En la Figura 3 se observan plaacutentulas de C virescens micropropagadas en medio MS en caacutemara de crecimiento al inicio del ensayo (A) y en invernadero despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten (B)
BA
FIGURA 3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten
A continuacioacuten se presentan los resultados obtenidos para las variables analizadas (Cuadro 2 y 3) de esta manera se pueden visualizar en general los resultados obtenidos en el proceso de aclimatacioacuten durante seis meses
CUADRO 2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de raiacuteces
inicial y final Variables
Hojas finales (nuacutemero)
Raiacuteces iniciales (nuacutemero)
Raiacuteces finales (nuacutemero)
Tamantildeo de plaacutentulas 36 24 37 47 29 46
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 61 43 76
Sustratos 53 36 56 43 29 51
Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 46 27 49
Significa que hay diferencias significativas al 95 Test de Dunn
25
Las variables no parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en hojas finales y raiacuteces iniciales en sus rangos de distribucioacuten Las raiacuteces finales no presentaron diferencias seguacuten el sustrato utilizado pero de acuerdo al tamantildeo hubo diferencias en su distribucioacuten
CUADRO 3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas
Variables Altura final de plaacutentulas
(cm) Sobrevivencia
Tamantildeo de plaacutentulas
36 c 567 b 47 b 821 a
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 59 a 908 a
Sustratos 52 a 933 a
41 ab 59 b Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 49 b 772 a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY Las variables parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en altura final de hojas y en sobrevivencia 41 Nuacutemero de hojas finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentulas y de sustratos para la variable nuacutemero final de hojas 411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula Seguacuten el Cuadro 2 y Figura 4 las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero final de hojas Las plaacutentulas pequentildeas de 1-2 cm obtuvieron el nuacutemero maacutes bajo de hojas finales con una media de 36 hojas por plaacutentula lo cual es la mitad de las hojas finales que se obtuvo con las plaacutentulas de mayor tamantildeo (61 hojas aproximado por plaacutentula) Para las plaacutentulas medianas de 2-3 cm se obtuvo una media de 47 hojas por plaacutentula (Figura 4)
26
Hojas finales
1-2 cm 2-3cm maacutes de 3 cm0
5
10
15
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn)
BLANCO (2006) sentildeala que plaacutentulas cultivadas in vitro crecen bajo condiciones especiales como alta humedad relativa y baja luminosidad ademaacutes son suplidas con sacarosa Estas condiciones fueron proporcionadas en una caacutemara de crecimiento en el laboratorio donde las plantas micropropagadas no son dependientes por completo de su fotosiacutentesis son heteroacutetrofas Parece ser necesario un estiacutemulo para convertirse en organismos totalmente capaces de sustentar sus propios requisitos de carbono y nitroacutegeno reducido pasando de esta manera a ser autoacutetrofos
Al ser sacadas de un medio in vitro las hojas no estaacuten preparadas para producir su propio alimento y sobreviven gracias a que el medio de cultivo le proporciona los nutrientes necesarios para vivir En este punto muchas de las hojas mueren y nacen hojas nuevas capaces de generar su alimento supliendo asiacute las hojas viejas (SEELYE et al 2003) En este ensayo las plaacutentulas de Chloraea virescens presentaron en general una buena adaptacioacuten al ser sacadas de un medio in vitro
Se observoacute que plaacutentulas con menor tamantildeo al ser aclimatadas y tener menor tejido fue maacutes difiacutecil y maacutes lento que empezaran a generar nuevos tejidos y materia orgaacutenica a partir de dioacutexido de carbono POSPIacuteŠILOVAacute et al (1999) sentildeala que al tener los estomas con desarrollo incompleto maacutes grandes y de forma maacutes redonda pierden maacutes agua lo cual puede provocar una peacuterdida de hojas muriendo asiacute la plaacutentula Por esta razoacuten las plaacutentulas pequentildeas se demoran maacutes tiempo en generar hojas nuevas es por ello que al finalizar este estudio muestran el menor nuacutemero final de hojas 412 Efecto del tipo de sustrato Al analizar la influencia del tipo de sustrato se encontraron diferencias significativas entre los tres sustratos utilizados Seguacuten el Cuadro 2 y la Figura 5 el sustrato donde se obtuvo mejores resultados fue
27
turba+perlita en el cual se observoacute un promedio de 53 hojas por plaacutentula siendo Sphagnum el maacutes bajo con 43 hojas por plaacutentula De acuerdo a los resultados del anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados el sustrato turba+perlita tiene mayor cantidad de nitroacutegeno foacutesforo calcio magnesio y azufre disponible comparativamente con los otros dos sustratos (Sphagnum y arena+turba) (Anexo 2)
Hojas finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
Sustratos
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) Para la brotacioacuten y el crecimiento de las plantas se necesita agua y Nitroacutegeno lo que favorece a una mayor tasa de aparicioacuten de hojas lo que se traduce en una mayor cantidad de hojas finales El Nitroacutegeno se encuentra en mayor cantidad en el sustrato turba+perlita debido a lo cual los mejores resultados se obtienen en dicho sustrato 413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Despueacutes de analizados los efectos individuales del tamantildeo y del sustrato al interactuar ambos factores existen diferencias significativas La mejor interaccioacuten se obtuvo con el sustrato turba+perlita y con el mayor tamantildeo de la plaacutentula (Figura 6) Debido a la buena estructura (porosa) de dicho sustrato se podriacutea decir que se favorecioacute la absorcioacuten radicular de nutrientes obteniendo por ello un mayor nuacutemero de hojas finales Para los menores tamantildeos no se observan diferencias significativas obteniendo como promedio 41 hojas por plaacutentula Para el mayor tamantildeo el promedio fue de 6 hojas por plaacutentula
28
Hojas finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 42 Raiacuteces iniciales Este paraacutemetro se evaluoacute luego de la primera etapa de aclimatacioacuten la cual se realizoacute en una sala de aclimatacioacuten del laboratorio Se analizoacute la influencia de diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos sobre la variable nuacutemero raiacuteces iniciales (Anaacutelisis de Kruskal-Wallis en Anexo 7)
FIGURA 7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses de pre aclimatacioacuten
29
En la Figura 7 se puede observar los resultados de pre aclimatacioacuten en sala de laboratorio En esta etapa ya es posible ver la presencia de raiacuteces desarrolladas 421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula En el Cuadro 2 se puede observar que las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero inicial de raiacuteces y en la Figura 8 se puede comprobar que para los dos tamantildeos de plaacutentula maacutes pequentildeos no se observa gran cantidad de raiacuteces esto no impidioacute el desarrollo posterior de las plaacutentulas las cuales lograron enraizar al final del estudio Esto se contrapone a lo observado en un estudio de Lapageria rosea donde la presencia de raiacutez y brote para lograr una multiplicacioacuten exitosa de plantas es de vital importancia Incluso algunas plaacutentulas de L rosea no brotan en condiciones in vitro en donde tienen las mejores condiciones nutricionales y hormonales para hacerlo Esto se debe a factores internos de la plaacutentula siendo muy difiacutecil que broten inmediatamente en caacutemara de aclimatacioacuten donde ya dejan de recibir los nutrientes necesarios de manera directa y requieren de balances de energiacutea para poder seguir elongando raiacuteces absorber nutrientes y brotar para poder obtener los carbohidratos necesarios para seguir su crecimiento (BLANCO 2006) El tamantildeo de plaacutentula tiene importancia para el desarrollo de raiacuteces se distingue notoriamente que en los tamantildeos maacutes grandes el nuacutemero de raiacuteces es mayor comparativamente con los tamantildeos pequentildeos donde el nuacutemero de raiacuteces fue escaso Debido a la presencia de maacutes hojas existe una mayor cantidad de aacuterea fotosinteacutetica esta situacioacuten estimula el crecimiento de las raiacuteces para la obtencioacuten de agua y nutrientes
Raices iniciales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
2
4
6
8
10
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o inicial de ra
iacuteces
FIGURA 8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn)
30
422 Efecto del tipo de sustrato Para el sustrato turba+perlita se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas en el nuacutemero de raiacuteces con respecto a los dos otros sustratos esto se puede ver en el Figura 9 donde se observa que se obtuvieron los mayores resultados En cualquier medio de crecimiento el espacio no ocupado por un soacutelido se llama porosidad este espacio puede ser ocupado en parte para retener agua y en parte para proporcionarle aire a las raiacuteces La ausencia de uno de estos elementos es perjudicial para las plantas La turba es conocida por tener estas propiedades y la perlita tambieacuten por esta razoacuten se sabe que la mezcla turba-perlita provee propiedades fiacutesicas excelentes como medio de crecimiento y propagacioacuten (INFOAGRO 2007) Estos resultados con turba-perlita (298 de materia orgaacutenica) coinciden con los obtenidos por DIAZ et al (2004) quienes al utilizar un sustrato compuesto por 100 de humus de lombriz para aclimatar cantildea de azuacutecar obtuvieron el mayor nuacutemero de raiacuteces Esto puede atribuirse al importante aporte de materia orgaacutenica del humus (47) lo que le confiere una mejor estructura obtenieacutendose una excelente porosidad del sustrato La aireacioacuten del suelo es necesaria para favorecer la maacutexima absorcioacuten de nutrientes por las raiacuteces Esto tambieacuten sucede en el sustrato turba+perlita el cual posee la mayor cantidad de materia orgaacutenica de los tres sustratos utilizados
Raices iniciales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
2
4
6
8
10
Sustratos
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato En los anaacutelisis para la variable nuacutemero de raiacuteces se puede decir que la mejor interaccioacuten se presentoacute para el sustrato de turba+perlita junto con el mayor tamantildeo de plaacutentulas obteniendo los valores maacutes altos entre los nueve tratamientos La presencia de raiacuteces luego de la micropropagacioacuten aumenta la posibilidad de eacutexito en el transplante ya que se crea un favorable balance de agua Pero esto no quiere
31
decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
10
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
32
En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
33
El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
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Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
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Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
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5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
2
REacuteSUMEacute Dans le scheacutema de la micropropagation de Chloraea virescens lacclimatation est la derniegravere eacutetape ougrave il faut ecirctre prudent parce que cest agrave ce moment lagrave que les taux de mortaliteacute sont les plus eacuteleveacutes principalement dans le processus de transplantation Cette eacutetape est tregraves importante parce que ce sera gracircce agrave elle quacuteon verra lefficaciteacute du processus et la qualiteacute finale des plantes produites in vitro Lobjectif geacuteneacuteral de cette eacutetude est dacuteeacutevaluer linfluence de la taille des plantes et lutilisation de divers substrats pour lacuteacclimatation de C virescens On a utiliseacute des plantes de C virescens obtenue a partir de la micropropagation de protocormos en provenance du laboratoire de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal de la Universidad Austral de Chile Les plantes ont eacuteteacute subdiviseacutee pour obtenir le nombre approprieacute Elles ont ensuite eacuteteacute transfeacutereacutees agrave des pots dans une piegravece du laboratoire de six huit et dix en fonction de la taille de la plante (plus de 3 cm de 2-3 cm et 1-2 cm respectivement) pour deux mois ensuite elles ont eacuteteacute transfeacutereacutee dans trois substrats tourbe + perlite (11) Sphagnum et tourbe + sable (11) et elles ont eacuteteacute mises dans une serre pour quatre mois Les variables agrave eacutevaluer sont nombre final de feuilles nombre de racines au deacutebut et agrave la fin la hauteur et la survie des plantes Les reacutesultats ont montreacute que la taille et les substrats utiliseacutes ont une influence sur la croissance des jeunes plantes La taille ideacuteale pour lacclimatation est plus de 3cm avec cette derniegravere on a obtenu les meilleurs reacutesultats dans toutes les variables qui ont eacuteteacute eacutevalueacutees Le mecircme reacutesultat sest produit avec le substrat de tourbe + perlite lequel a aussi montreacute les meilleurs reacutesultats
3
1 INTRODUCCION La familia Orchidaceae (Orquiacutedeas) es la que mayor nuacutemero de especies comprende en el Reino Vegetal Se estima que debe haber alrededor de 35000 especies de Orquiacutedeas en todo el mundo pertenecientes a unos 750 geacuteneros ademaacutes de miles de hiacutebridos En Chile esta familia es probablemente el grupo menos estudiado de plantas con flores y soacutelo se han realizado estudios en base a su taxonomiacutea biologiacutea reproductiva fenologiacutea y distribucioacuten
La produccioacuten de flores de orquiacutedeas ha tomado importancia por la belleza de sus flores dada la enorme variedad de formas colores y perfumes Existen orquiacutedeas terrestres y epiacutefitas estas uacuteltimas representan maacutes del 90 del total de especies y son las que mayoritariamente se encuentran a la venta Las flores tienen un alto valor ornamental o como flor cortada ya que eacutestas pueden permanecer separadas de las plantas sin marchitarse hasta tres o cuatro semanas y en la planta permanecen hasta tres meses
La obtencioacuten de plantas de orquiacutedeas a partir de semillas es muy difiacutecil ya que eacutestas son diminutas y de germinacioacuten irregular Como una alternativa de obtencioacuten de plantas aparece la micropropagacioacuten pudiendo asiacute aumentar el nuacutemero de plantas en forma relativamente faacutecil y raacutepida Luego de la etapa de micropropagacioacuten viene la etapa de aclimatacioacuten en la cual la manipulacioacuten debe ser en extremo cuidadosa ya que es donde se produce el mayor iacutendice de mortandad principalmente en el proceso de transplante Esta etapa es muy importante ya que gracias a ella se veraacute la eficiencia del proceso y la calidad final de las plantas producidas in vitro Considerando la produccioacuten de plaacutentulas mediante la micropropagacioacuten en este trabajo se plantea la hipoacutetesis que ldquoel tamantildeo de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro y los distintos sustratos son factores que inciden en el desarrollo y su aclimatacioacutenrdquo El objetivo general de este trabajo es
Evaluar la influencia del tamantildeo de plaacutentulas y utilizacioacuten de distintos sustratos en la aclimatacioacuten ex vitro de plaacutentulas de C virescens
Los objetivos especiacuteficos son
Medir el efecto del tamantildeo de plaacutentulas de C virescens en la sobrevivencia y desarrollo de eacutestas ex vitro
Comparar el uso de tres sustratos en el desarrollo y sobrevivencia de plaacutentulas de C virescens
4
2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA 21 Descripcioacuten general 211 Descripcioacuten geograacutefica Las orquiacutedeas pertenecen a la familia Orchidaceae clase Liliopsida (monocotiledoacuteneas) Son plantas herbaacuteceas perennes originarias de regiones tropicales y subtropicales pero existen tambieacuten en todos los continentes a excepcioacuten de las regiones polares La zona donde se encuentran estas plantas estaacute comprendida entre los 68ordm latitud norte y 56ordm latitud sur Es evidente que en los liacutemites extremos de estas latitudes se encuentran pocos geacuteneros y especies esto va en aumento desde las regiones temperadas hasta las regiones intertropicales donde el nuacutemero es el mayor Los territorios maacutes interesantes por su nuacutemero son
Ameacuterica del Sur y Ameacuterica Central Asia e India Madagascar Australia es el continente menos poblado en orquiacutedeas dentro de las regiones
del globo Por su parte Europa presenta numerosos geacuteneros y especies de orquiacutedeas
terrestres Soacutelo en Francia existen 75 especies repartidas en 16 geacuteneros todas terrestres (LECOUFLE y ROSE 1956)
212 Formas de vida Las zonas donde crecen estas plantas influyen sobre su manera de vivir Algunas orquiacutedeas son terrestres y se encuentran representadas en todas las regiones Tambieacuten existen las epiacutefitas (vegetal que fijado a otro no obtiene de eacuteste su alimento) En este caso se necesita que el grado higromeacutetrico y la temperatura permitan este tipo de adaptacioacuten Ademaacutes existen las orquiacutedeas litofiacuteticas que viven sobre rocas Las raiacuteces de las epiacutefitas y litofiacuteticas estaacuten adaptadas a vivir expuestas al aire o inmersas en materia orgaacutenica ya que tienen un tejido acumulador de agua llamado velo En zonas friacuteas y templado friacuteas todas las orquiacutedeas son terrestres En zonas subtropicales o tropicales la gran mayoriacutea es epiacutefita Otra particularidad debida seguramente a la influencia de estas zonas es la floracioacuten Es en las zonas tropicales y subtropicales que se dan los mayores tamantildeos de flores asiacute como tambieacuten la mayor variedad de colores (LECOUFLE y ROSE 1956)
213 Descripcioacuten morfoloacutegica Las orquiacutedeas se caracterizan por poseer flores muy vistosas hermafroditas (ambos sexos en la misma flor) zigomorfas (con un solo plano de simetriacutea) triacutemeras (tres seacutepalos y tres peacutetalos) y una columna central que sustenta las estructuras reproductivas masculinas anteras y femeninas pistilo llamada ginostemo El peacutetalo inferior se llama labelo y su morfologiacutea define a los distintos geacuteneros de orquiacutedeas Las flores pueden ser aisladas o en inflorescencia y son polinizadas por insectos El polen se encuentra aglomerado formando una masa llamada polinio el que tiene un extremo con un ensanchamiento glandular pegajoso que sirve para que el
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polinio se adhiera al cuerpo del insecto polinizador El fruto es una caacutepsula seca con muchas semillas pequentildeas sin endosperma y con embrioacuten no diferenciado Tienen dos tipos baacutesicos de crecimiento Simpodial en las que el nuevo crecimiento se produce en sentido horizontal a partir de un tallo subterraacuteneo o rizoma generando una sub-unidad capaz de producir una flor o inflorescencia y de ser eventualmente separada de la planta (ej Cattleya) Monopodial en las que el nuevo crecimiento se produce en sentido vertical con lo cual la planta crece constantemente en altura (ej Phalaenopsis) (ORQUIDEAS 2007) 214 Geacuteneros y especies chilenas Seguacuten NOVOA et al (2006) en la familia Orchidaceae se encuentran 49 especies de flora nativa dentro de las cuales se encuentra Chloraea virescens (Willd) Lindl Los geacuteneros de Orchidaceae en Chile son 7
- Aa Bipinnula Brachystele Codonorchis Chloraea Gavilea y Habenaria
Dentro del geacutenero Chloraea existen 31 especies - Chloraea alpina Poepp - Chloraea barbata Lindl - Chloraea bidendata (Poepp y Endl) Correa - Chloraea bletioides Lindl - Chloraea cuneata Lindl - Chloraea chica Speg - Chloraea chrysantha Poepp - Chloraea crispa Lindl - Chloraea cristata Lindl - Chloraea cylindrostachya Poepp - Chloraea disoides Lindl - Chloraea galeata Lindl - Chloraea gaudichaudii Brongn - Chloraea gavilu Lindl - Chloraea grandiflora Lindl - Chloraea heteroglossa Rchbf - Chloraea incisa Poepp - Chloraea lamellata Lindl - Chloraea lechleri Lindl - Chloraea leptopetala Reiche - Chloraea longipetala Lindl - Chloraea magellanica Hookf - Chloraea multiflora Lindl - Chloraea nudilabia Lindl - Chloraea philippii Reichbf - Chloraea picta Phil - Chloraea prodigiosa Reichbf - Chloraea speciosa Poepp - Chloraea virescens Lindl - Chloraea viridiflora Poepp
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- Chloraea volkmanni Phil (NOVOA et al 2006) 2141 Chloraea virescens Planta perenne de 40-90 cm de altura Sus hojas son de 5-12cm de largo por 15-25cm de ancho estrechas lanceoladas agudas dispuestas en roseta basal generalmente marchitas al final de la antesis Su escapo floral tiene vainas caulinares lanceoladas agudas y distantes La inflorescencia es de 8-20cm de largo densa con 10-15 flores erguidas Sus flores son blancas con estriacuteas y aacutepices verdes El seacutepalo dorsal es de 16-33mm de largo por 4-6mm de ancho oblongo lanceolado obtuso algo coacutencavo a veces ligeramente estrechado al centro aacutepice algo carnoso Los seacutepalos laterales de 18-33mm de largo por 4-5mm de ancho son ensiformes con aacutepice obtuso engrosado verde negruzco a veces espatulado y dentado a veces verrugoso Los peacutetalos son de 15-23mm de largo por 5-58mm de ancho estrechamente aovados obtusos verrugosos con maacutes frecuencia solo la mitad inferior a veces el borde denticulado y carnoso El labelo de 15-26mm de largo por 10-20mm de ancho es mas o menos romboidal a levemente trilobulado El loacutebulo central tiene 5-7 nervios longitudinales recorridos por laminillas interrumpidas membranaacuteceas con segmentos falciformes de borde carnoso de color verde Los nervios laterales que se ramifican oblicuamente hacia el aacutepice en los loacutebulos laterales tienen pequentildeas laminillas y verrugas y su borde es laciniado inciso en la mitad apical hacia la base denticulado aacutepice generalmente engrosado La columna es de 12-18mm de largo delgada blanca con estriacuteas anaranjada La base de la zona nectariacutefera tiene un color amarillo-limoacuten con maacuteculas anaranjadas orificio nectario verde El ala de la columna es recta y estrecha El estigma es triangular y globoso La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la Vordf (Vintildea del Mar) hasta la XIordf Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile Sin embargo es posible que tenga una distribucioacuten maacutes restringida por que se le ha confundido con Chloraea incisa Su floracioacuten es desde noviembre a febrero y su estado de conservacioacuten no estaacute evaluado (NOVOA et al 2006) En el Anexo 14 se incluyen antecedentes sobre su distribucioacuten y eacutepoca de floracioacuten
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FIGURA 1 Chloraea virescens FUENTE NOVOA et al (2006) 22 Requerimientos de las orquiacutedeas Para tener eacutexito en el cultivo de orquiacutedeas hay que tomar en cuenta factores de importancia como son 221 Agua El riego correcto es el principio y el fin del cuidado de orquiacutedeas (ROLLKE 2005) Este elemento es primordial para las orquiacutedeas asiacute como tambieacuten para todo tipo de plantas En el caso de eacutestas se dice muchas veces que la calidad del agua usada es el factor maacutes importante en el cultivo de orquiacutedeas ya que el porcentaje maacutes alto de muerte se produce por el exceso de este factor (SHEEHAN 1980) Hay que tomar en cuenta que la mayoriacutea de las orquiacutedeas son epiacutefitas lo que significa que tienen sus raiacuteces a la vista gracias a las cuales absorben el agua de lluvia Se recomienda un sustrato poroso y de reaccioacuten neutra ya que de esta manera el agua escurre sin acumularse no permitiendo la pudricioacuten de las raiacuteces Para las orquiacutedeas terrestres es lo mismo solo que se pueden regar con maacutes frecuencia pero sin mantenerlas saturadas (OSPINA y DRESSLER 1979) Seguacuten DUMOIS (2007) el agua es lo maacutes difiacutecil de controlar ya que depende de muchas variables como por ejemplo humedad relativa tipo de sustrato intensidad luminosa temperatura y circulacioacuten de aire Ademaacutes muchas orquiacutedeas necesitan un periacuteodo de receso vegetativo que si no es respetado resulta en ausencia de floracioacuten En general hay que antildeadir agua en abundancia cuando la planta se encuentra en crecimiento activo y reducirla despueacutes de la floracioacuten
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Las especies con pseudobulbos almacenan agua y estaacuten preparadas para su periacuteodo de receso Otras que no cuentan con estos oacuterganos requieren de humedad maacutes constante 222 Luz Ninguna planta puede crecer sin la iluminacioacuten adecuada Muchas orquiacutedeas viven en las alturas de los aacuterboles y estaacuten expuestas a plena luz del sol otras crecen en el suelo selvaacutetico protegidas del sol por espesos follajes (ROLLKE 2005) La funcioacuten principal de la luz es activar el proceso de fotosiacutentesis Los cultivadores han estudiado la luz y han descubierto que hay orquiacutedeas que florecen con diacutea largo y otras con diacutea corto (OSPINA y DRESSLER 1979) Gracias a la fotosiacutentesis se convierten los minerales presentes en el ambiente en savia y nutrientes Hojas oscuras y falta de floracioacuten indican falta de luz hojas amarillas e incluso quemadas apuntan hacia un exceso de sol (DUMOIS 2007) 223 Fertilizacioacuten Las orquiacutedeas necesitan los mismos nutrientes que otras plantas Un abono para orquiacutedeas debe contener los nutrientes principales nitroacutegeno (N) foacutesforo (P) y potasio (K) asiacute como tambieacuten oligoelementos como hierro (Fe) magnesio (Mg) zinc (Zn) estantildeo (Sn) y manganeso (Mn) (ROLLKE 2005) Por otra parte la fertilizacioacuten depende de varios factores dentro de los cuales los maacutes criacuteticos son
- El medio utilizado - La edad de las plantas - Estado de las plantas ya sea floracioacuten crecimiento reposo
En cuanto a absorcioacuten se ha demostrado que es igual de eficiente por viacutea foliar como a traveacutes de las raiacuteces Es necesario tener en cuenta algunas reglas baacutesicas a la hora de fertilizar las orquiacutedeas (Asociacioacuten Costarricense de Orquideologiacutea ACO 1970)
1 Regar las plantas antes de fertilizar 2 Fraccionar las dosis 3 Aplicar el fertilizante de forma liacutequida 4 No usar fertilizantes soacutelidos 5 No fertilizar las plantas recieacuten plantadas 6 No fertilizar plantas en reposo 7 No abonar plantas enfermas
224 Temperatura Es conocido el hecho de que cada planta tiene liacutemites de temperatura dentro de los cuales prospera o perece De ahiacute la necesidad de conocer las temperaturas correspondientes al lugar de donde viene cada especie de orquiacutedea pudiendo proporcionarle la temperatura adecuada (OSPINA y DRESSLER 1979) Se puede clasificar a las orquiacutedeas como de clima caacutelido (temperatura nocturna miacutenima de 20ordmC) templado (miacutenimo de 13 a 18ordmC) y de ambiente friacuteo (de 10 a 13ordmC) (DUMOIS 2007)
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Seguacuten SHEEHAN (1980) las temperaturas ideales para las orquiacutedeas de origen tropical son 10ordmC en la noche y entre 21ordm - 24ordmC durante el diacutea 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas La micropropagacioacuten de orquiacutedeas estaacute en vanguardia hoy en diacutea El estudio de cultivo de tejido de orquiacutedeas se lleva a cabo en muchos laboratorios de todo el mundo (ARDITTI and ERNST 1992) 231 Biologiacutea de las semillas Las semillas de orquiacutedeas son conocidas usualmente como semillas polvo porque son minuacutesculas y contienen pocas reservas de alimento Estas semillas por lo general no germinan en el medio natural a menos que sean infectadas por un hongo micorriacutezico Este hongo abastece a las plantas joacutevenes con azuacutecares y nutrientes hasta que sean lo suficientemente grandes para fabricar su propio alimento Cuando la semilla germina produce una masa indiferenciada de ceacutelulas llamada protocormo Manteniendo las condiciones normales el protocormo continuaraacute su crecimiento por varias semanas meses o incluso antildeos dependiendo de la especie hasta que alcance la edad apropiada para producir raiacuteces y hojas En el caso de orquiacutedeas terrestres es de vital importancia que la relacioacuten orquiacutedea-hongo se conserve durante los estados tempranos del ciclo de vida de la planta ya que el protocormo enterrado no puede fabricar alimento por siacute mismo Por otro lado los protocormos de las orquiacutedeas epiacutefitas son comuacutenmente verdes lo que les posibilita producir parte de su alimento La relacioacuten orquiacutedea-hongo no ha sido en su totalidad investigada para el caso de las orquiacutedeas tropicales (McKENDRICK 2000) 232 Germinacioacuten simbioacutetica y no simbioacutetica de semillas Mediante la germinacioacuten in vitro las semillas germinan en frascos de vidrio o plaacutestico Estos frascos contienen en su interior un medio nutritivo solidificado con agar con todos los azuacutecares y minerales necesarios para la germinacioacuten y crecimiento de las semillas Hay dos tipos de germinacioacuten la simbioacutetica y la asimbioacutetica En la germinacioacuten simbioacutetica las semillas se siembran junto con una pequentildea cantidad del hongo micorriza adecuado Dicho hongo crece en el medio coloniza a las semillas que estaacuten en proceso de germinacioacuten y se produce una relacioacuten simbioacutetica la cual alimentaraacute al protocormo hasta que este sea capaz de producir sus hojas y se vuelva autotroacutefico Esta teacutecnica es usada principalmente en propagacioacuten de orquiacutedeas terrestres en zonas templadas La germinacioacuten asimbioacutetica se usa principalmente en propagacioacuten de orquiacutedeas tropicales que crecen maacutes raacutepido que sus parientes de zonas templadas Para este tipo de germinacioacuten se necesita un medio de cultivo maacutes complejo ya que todos los nutrientes orgaacutenicos e inorgaacutenicos asiacute como tambieacuten los azuacutecares deben estar en forma disponible pues no existe la intermediacioacuten del hongo (McKENDRICK 2000) 233 Condiciones de esterilidad Tanto para la germinacioacuten simbioacutetica como para la asimbioacutetica es de vital importancia que los frascos las semillas aparatos y el medio esteacuten esteacuteriles desde el principio del proceso Esto debido a que cualquier hongo o bacteria que se introduzca creceraacute maacutes raacutepido que las semillas ocupando su espacio hasta matarlas Esto se evita gracias al autoclave el cual regulado a 12 atm y 120ordmC por 20 minutos mata hongos o bacterias presentes en el medio (McKENDRICK 2000)
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2331 Siembra de las semillas Las semillas pueden ser recolectadas desde caacutepsulas verdes o maduras La caacutepsula verde que estaacute madurando estaacute llena de semillas y no se deforma cuando se aprieta con las pinzas Estas semillas pueden ser almacenadas por algunas semanas en un lugar refrigerado con bastante aireacioacuten Las semillas se pueden sembrar a partir de caacutepsulas verdes o semillas secas A continuacioacuten se muestran las ventajas y desventajas de ambos meacutetodos
- Siembra a partir de caacutepsulas verdes Si las caacutepsulas se mantienen intactas el interior (las semillas) se mantiene esteacuteril Por lo tanto si se esteriliza la parte exterior de las mismas donde hongos y bacterias pueden desarrollarse y se abren las caacutepsulas bajo condiciones esteacuteriles y las semillas podraacuten mantenerse desinfectadas
La ventaja de este meacutetodo es que no se requiere de esterilizacioacuten de las semillas lo que provoca su deterioro Otro punto a favor es que algunas semillas podriacutean germinar maacutes raacutepido que las provenientes de caacutepsulas maduras por los mecanismos de dormancia La desventaja es que en este caso todas las semillas deben ser utilizadas o eliminadas mientras que las semillas maduras se pueden almacenar Tambieacuten se debe considerar que las semillas sembradas a partir de caacutepsulas que no han madurado lo suficiente podriacutean germinar lentamente o simplemente no germinar - Siembra a partir de semillas secas En este caso una vez que la caacutepsula es abierta las semillas dejan de ser esteacuteriles y requieren de un proceso de esterilizacioacuten Comuacutenmente se utiliza una solucioacuten de hipoclorito de sodio hipoclorito de calcio o peroacutexido de hidroacutegeno Las semillas se agitan dentro de la solucioacuten que ademaacutes contiene una gota de detergente para ldquohumedecerlasrdquo luego se las enjuaga con agua destilada y se las siembra en el medio preparado La ventaja de este meacutetodo es que las semillas pueden ser colectadas secadas al aire almacenadas por varios meses en el refrigerador y utilizarlas cuando sea necesario Se debe considerar que la siembra ya sea de caacutepsulas verdes o de semillas secas estaacute determinado por la eacutepoca en que se colectan (McKENDRICK 2000) 234 Trasplante En la caacutemara de incubacioacuten las plaacutentulas se han desarrollado en condiciones limpias y en un ambiente cerrado por lo que deben acostumbrase gradualmente al ambiente exterior antes de ser trasplantadas a las macetas Tambieacuten la temperatura y la luz la cual es baja han sido constantes durante el cultivo in vitro En el medio natural la temperatura y la luz variacutean constantemente por lo que las nuevas plantas deben estar protegidas de la fuerte luz solar la cual puede quemar las hojas con soacutelo una pequentildea cantidad de eacutesta La humedad en los frascos es alta y las plantas estaacuten protegidas de ataques por hongos o bacterias Ademaacutes las plaacutentulas han crecido bajo condiciones de alta humedad y por lo tanto tendraacuten cutiacuteculas deacutebiles por lo que necesitan acostumbrase a medios menos huacutemedos antes de ser transplantadas
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Para el trasplante se deben colocar los frascos en un lugar protegido de la lluvia para que se aclimaticen a las nuevas condiciones de luz y temperatura Se deben dejar por 2 a 4 semanas en los frascos tapados Luego se debe ir aflojando las tapas para dejar entrar pequentildeas cantidades de aire hasta el punto de dejarlas descubiertas Se debe revisar si hay hojas marchitas y ver que el sustrato esteacute huacutemedo
Lo ideal es dejarlas sin tapa durante una semana antes de pasarlas a las macetas Para el trasplante se debe elegir un sustrato adecuado para el tipo de planta humedecerlo y transplantar las plantas con cuidado de no dantildear las raiacuteces y evitando la deshidratacioacuten En esta etapa tambieacuten se debe dejar las macetas selladas para evitar una raacutepida deshidratacioacuten e ir abrieacutendolas paulatinamente (McKENDRICK 2000)
24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas 241 Orquiacutedeas terrestres 2411 Cypripedium Esta es una orquiacutedea terrestre de zonas templadas se desarrolla en el Hemisferio Norte como por ejemplo en Guatemala y en Honduras pero donde se encuentra principalmente es en China Su forma maacutes comuacuten de propagacioacuten es in vitro a partir de semillas La forma maacutes eficiente es a partir de semillas inmaduras Existe un intervalo de tiempo entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten eacuteste dependeraacute de la especie y de la zona donde se desarrolle Se asume que existen aproximadamente cuatro semanas entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten El oacuteptimo para una buena germinacioacuten de Cypripedium es entre 42 y 60 diacuteas despueacutes de la polinizacioacuten y entre 14 y 32 diacuteas despueacutes de la fertilizacioacuten La germinacioacuten ocurre entre la segunda y cuarta semana despueacutes de ser sembradas y los protocormos deberiacutean ser cambiados de medio de cultivo cada dos a cuatro meses si no se corre el riesgo de sufrir agotamiento de nutrientes Los rizomas y las raiacuteces se empiezan a desarrollar a partir de los siete meses para luego dar lugar a las primeras hojas Para obtener un buen transplante se deben tener raiacuteces de miacutenimo un centiacutemetro de largo El desarrollo de raiacuteces se ve potenciado al tener un periacuteodo corto de bajas temperaturas (10degC) exposicioacuten a la luz reduccioacuten en la concentracioacuten de iones del medio de cultivo o transferirlas a un compost esteacuteril Al tener raiacuteces suficientes y el tamantildeo adecuado se podraacuten llevar las plantas al lugar donde creceraacuten definitivamente En el momento del transplante las plantas son muy susceptibles al desecamiento por lo cual lo ideal es que los brotes sean maacutes chicos que las raiacuteces El mejor sustrato seriacutea aquel donde crece naturalmente la orquiacutedea (RAumlNNBAumlCK 2007) 2412 Preservacioacuten in vitro de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes Este estudio fue hecho para establecer que parte de tejido es viable para la micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes del noreste de Europa pudiendo asiacute reestablecer dichas orquiacutedeas a sus aacutereas correspondientes La propagacioacuten in vitro de orquiacutedeas
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terrestres de clima templado es maacutes difiacutecil que las orquiacutedeas epiacutefitas de clima subtropical y tropical Las orquiacutedeas terrestres tienen requerimientos maacutes estrictos que las epiacutefitas y se conoce menos sobre sus necesidades especiacuteficas (VAASA y ROSENBERG 2004) En Estonia existen 36 especies de orquiacutedeas terrestres pero solo tres estaacuten bajo proteccioacuten Dactylorhiza baltica Dactylorhiza ruthei Dactylorhiza praetermissa Como explantes para este estudio en el caso de D baltica se ocuparon protocormos en los otros dos casos se utilizaron semillas semi maduras las cuales fueron colectadas siete y diez semanas despueacutes de ser polinizadas Para D baltica se ocupoacute el medio Murashige y Skoog suplementado con 05 mgL de aacutecido naftaleacuten aceacutetico (ANA) y 2 mgL de isonpentenyl adenina Para el caso de las semillas semi maduras se ocuparon los medios de Lindemann de Heller de Norstog y de Murashige y Skoog como control
La composicioacuten del medio y la madurez de las semillas influye mucho en el desarrollo de las orquiacutedeas in vitro Se ha demostrado que se necesita una alta concentracioacuten de microelementos para obtener una correcta germinacioacuten de las semillas Tambieacuten se puede decir que los primeros tres meses son los de mayor crecimiento luego de este tiempo el crecimiento se vuelve maacutes lento (VAASA y ROSENBERG 2004)
Luego de cuatro semanas de crecimiento de D baltica el 60 de los explantes de meristemas apicales empezaron a crecer en cambio los de meristemas laterales no expresaron ninguacuten tipo de crecimiento Las raiacuteces empezaron su desarrollo luego de dos meses despueacutes de la siembra
En el caso de D ruthei y D praetermissa la germinacioacuten se produjo despueacutes de dos meses desde la inoculacioacuten Luego de cuatro y seis meses el mayor crecimiento fue observado en el medio Norstog superando en 14 al medio testigo Murashige y Skoog (VAASA y ROSENBERG 2004)
2413 Longevidad de semillas de orquiacutedeas terrestres Por lo general las orquiacutedeas producen muchas pero pequentildeas semillas que contienen muy pocas reservas de alimento Dichas semillas estaacuten estructuralmente adaptadas para ser dispersadas por el viento pero poco se sabe del destino de eacutestas luego de ser dispersadas Algunos estudios de viabilidad de semillas indican una sobrevivencia de uno a dos antildeos en orquiacutedeas de clima templado Las semillas que son guardadas en laboratorio duran mucho maacutes tiempo Se estudioacute la viabilidad de siete especies de orquiacutedeas norteamericanas dentro de las cuales se encuentran Goodyera pubescens y Liparis liliifolia Las semillas de eacutestas se colocaron en bolsas con suelo y sustratos de bosques provenientes de sus haacutebitats naturales (WHIGHAM et al 2005) En Goodyera pubescens la mayoriacutea de las semillas germinaron en un antildeo Cuatro otras especies germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero algunas semillas no germinadas despueacutes de siete antildeos seguiacutean siendo viables En la especie Liparis liliifolia semillas que han estado cuatro antildeos bajo observacioacuten han tenido una tasa de
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germinacioacuten de un 68 al ser sembradas in vitro junto con el hongo micorriacutezico adecuado Las dos especies restantes no germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero las semillas fueron evaluadas como intactas y testeadas positivamente en cuanto a su viabilidad despueacutes de cuatro antildeos en el suelo Estas observaciones fueron interpretadas como diferentes estrategias para especies especiacuteficas de germinacioacuten in situ (WHIGHAM et al 2005) 2414 Sobrevivencia de orquiacutedeas terrestres transplantadas a sectores urbanos La conservacioacuten de poblaciones de orquiacutedeas silvestres depende del establecimiento de las orquiacutedeas propagadas a los campos Sin embargo se conoce muy poco de los factores bioacuteticos que influencian el establecimiento de orquiacutedeas terrestres a sus haacutebitats naturales Un experimento fue establecido para medir la sobrevivencia de seis especies durante su primer periacuteodo de crecimiento seguido del transplante a un sector urbano en Australia (SCADE et al 2006)
Las orquiacutedeas germinadas simbioacuteticamente crecieron en laboratorio durante cinco meses antes de establecer la plantacioacuten en sitios adyacentes con alta o baja cobertura de malezas Existioacute una muerte gradual de las plaacutentulas durante el primer periacuteodo de crecimiento primeramente por ataque de insectos no siendo evitado por la presencia de una malla cobertora Los iacutendices de sobrevivencia variacutean desde 49 para Microtis media una especie capaz de crecer en un ambiente atiacutepico hasta un 21 para Caladenia arenicola la orquiacutedea nativa maacutes comuacuten de esos sitios Sin embargo no todas las orquiacutedeas sobrevivientes producen tubeacuterculos por lo que la tasa de sobrevivencia despueacutes del primer periacuteodo seco disminuye
La sobrevivencia de las orquiacutedeas sembradas no puede ser comparada con orquiacutedeas de la misma especie que crecieron en los mismos lugares ya que no existioacute la presencia del hongo compatible para estas orquiacutedeas (SCADE et al 2006)
2415 Micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres En India dos orquiacutedeas muy importantes para la horticultura del geacutenero Anoectochilus fueron exitosamente propagadas Noacutedulos aislados de A sikkimensis colectadas en Himalaya y A regalis colectadas en India fueron cultivadas in vitro durante 12 semanas para obtener un maacuteximo de 48 a 56 protocormos y brotes obteniendo como resultado un 95 y 98 de eficiencia respectivamente Durante el repicado de los explantes in vitro de A regalis se observoacute que el nuacutemero total de brotes obtenidos a partir de noacutedulos fue 214 asiacute como tambieacuten 82 puntas de brotes En cambio para A sikkimensis fueron mucho maacutes bajos 123 y 43 respectivamente teniendo un crecimiento maacutes lento pero plantas maacutes fuertes Las raiacuteces de 4 a 6cm crecieron con la presencia de NAA (270 microM ) en el medio asiacute como tambieacuten con carbono activado (02) Durante la aclimatacioacuten la tasa de establecimiento fue entre 95 y 98 Luego de seis meses en invernadero las plantas de A regalis fueron transferidas a bosque nativo donde se obtuvo una tasa de
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sobrevivencia de entre 70 y 95 despueacutes de 12 meses Estas plantas establecidas en bosque nativo estaacuten libres de cualquier defecto morfoloacutegico y de crecimiento (GANGAPRASAD et al 2000) 242 Orquiacutedeas epiacutefitas Estas orquiacutedeas viven en los aacuterboles pero no obtienen de eacuteste su alimento no son paraacutesitas 2421 Preservacioacuten de Cattleya walkeriana usando propagacioacuten in vitro El geacutenero Cattleya se encuentra en Meacutexico y Ameacuterica Central asiacute como tambieacuten en Venezuela Colombia y las laderas de los Andes Esta orquiacutedea tambieacuten se encuentra en varias regiones del Brasil creciendo en aacuterboles rocas cerca de riacuteos lagos y pantanos Las flores de esta orquiacutedea son conocidas debido a su hermosura y a causa de la destruccioacuten de su haacutebitat y a la excesiva coleccioacuten de eacutestas se encuentra en extincioacuten
La composicioacuten del medio de cultivo es esencial para la propagacioacuten in vitro ya que suple todos los nutrientes necesarios para el desarrollo y seraacute distinto dependiendo de cada especie en este caso se utilizoacute la mitad de los macronutrientes del medio Muchos autores sugieren el uso de carboacuten activado en el medio ya que por lo general en muchas especies aumenta el desarrollo de las raiacuteces En este estudio se probaron distintas dosis de carboacuten activado 1 2 4 y 6gL con un pH de 6 (TADEU DE FARIA et al 2002) Las semillas se obtuvieron de flores artificialmente polinizadas en invernadero Plaacutentulas de aproximadamente un centiacutemetro fueron seleccionadas y cultivadas nuevamente en el medio de cultivo Murashige y Skoog pero esta vez con las diferentes dosis de carboacuten activado Se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces el nuacutemero de brotes y el peso de la materia verde total Durante el autoclavado se produce normalmente una hidroacutelisis de sacarina la cual es de 10 aproximadamente este porcentaje aumenta considerablemente al agregar un 1 de carboacuten activado llegando a ser de 95
El desarrollo de las plaacutentulas de C walkeriana aumentan con una mayor concentracioacuten de carboacuten activado asiacute como tambieacuten un mayor tiempo de cultivo El resultado fue que la dosis ideal para el desarrollo de esta orquiacutedea es 2gL de carboacuten activado (TADEU DE FARIA et al 2002) 2422 Establecimiento de cultivos in vitro y micropropagacioacuten de Cattleya aurantiaca (Bateman ex Lindl) Por medio de siembra in vitro se logroacute el establecimiento de C aurantiaca con alto porcentaje de germinacioacuten y desarrollo de protocormos Para la oacuteptima formacioacuten de callo y para la proliferacioacuten de protocormos se determinaron los medios oacuteptimos (MS 10 mgL ANA 10 mgL BA) asiacute como tambieacuten de manera directa sobre explantes de hoja y pseudobulbos (MS 01 mgL ANA 01 mgL GA3)
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Con este uacuteltimo medio tambieacuten se logroacute una oacuteptima regeneracioacuten y desarrollo de plaacutentulas Los medios liacutequidos (sin agitacioacuten) son una buena opcioacuten para conseguir la produccioacuten masiva de protocormos ya que con ellos se optimizoacute la micropropagacioacuten de C aurantiaca Las plaacutentulas micropropagadas presentaron alto porcentaje de sobrevivencia y buen desarrollo despueacutes de su trasplante y aclimatacioacuten lo cual demuestra que es un buen sistema de propagacioacuten para C aurantiaca (GUTIERREZ y SALGADO 2007) En cuanto a transplante y aclimatacioacuten despueacutes de 45 diacuteas de desarrollo in vitro las plaacutentulas de un tamantildeo entre 3 y 5 cm con raiacuteces bien desarrolladas fueron llevadas a condiciones ex vitro eliminando los restos de medio de cultivo con agua potable y ocupando un sustrato de partes iguales de tezontle y corteza de encino cubierta con hojarasca de encino finamente molida Se mantuvieron cubiertas durante 15 diacuteas abriendo cada dos diacuteas hasta poder retirar la tapa en 30 diacuteas Despueacutes de dos meses de haber sido retiradas del cultivo in vitro las plaacutentulas presentaron 70 de sobrevivencia y alcanzaron una altura de hasta 7 cm presentando nuevas hojas y raiacuteces las plantas se muestran vigorosas y capaces de continuar su crecimiento en condiciones ambientales de invernadero (GUTIERREZ y SALGADO 2007)
2423 Establecimiento in vitro y regeneracioacuten de plantas de Laelia autumnalis (Llave y Lex) Lindl Para este estudio se obtuvieron las semillas de una caacutepsula desarrollada despueacutes de 6 meses de la floracioacuten las cuales se sembraron in vitro sin presentar contaminacioacuten ya que la siembra por este meacutetodo es muy eficiente en comparacioacuten al cultivo de semillas libres donde algunas veces se presenta la contaminacioacuten Las observaciones se realizaron cada 15 diacuteas la germinacioacuten se detectoacute en los primeros 15 diacuteas en la mayoriacutea de los medios de cultivos probados con la presencia de protocormos de 1mm de diaacutemetro (HUAPEO y SALGADO 2004) El porcentaje de germinacioacuten que se obtuvo de las semillas cultivadas in vitro de L autumnalis fue de 95 a 100 en todos los medios de cultivo la uacutenica diferencia fue el tiempo entre las germinaciones A excepcioacuten de las semillas cultivadas en el medio MS 100 la germinacioacuten del 100 se obtuvo hasta los 30 diacuteas de cultivo mientras que en el primero la germinacioacuten fue a los 15 diacuteas del cultivo Las plaacutentulas con raiacutez y un par de hojas se lograron a los 90 diacuteas de cultivo en el medio MS 100 alcanzando 07 mm de altura Estas plaacutentulas fueron subcultivadas en medio MS con 05 mgl de ANA y 01 mgl de GA3 para tener plaacutentulas fuente de explante (segmentos de hojas) un medio oacuteptimo de desarrollo de plaacutentulas de L speciosa No fue necesario probar otros medios de cultivos ya que se hicieron pruebas anteriores que demostraron que era el adecuado
Las plaacutentulas de 6 meses de cultivo in vitro despueacutes de su germinacioacuten presentaron una altura promedio de 5 cm con raiacuteces con velamen y hasta dos pares de hojas Segmentos de hoja de eacutestas fueron cultivadas en el medio MS conteniendo ANA BA y GA3 en diferentes concentraciones y se realizaron observaciones cada 30 diacuteas para determinar medios inductores de callo protocormos y raiacuteces La mejor respuesta en formacioacuten de callo fue observada en los segmentos de hoja de plaacutentulas de L autumnalis cultivados en MS con 1 mgl de ANA BA y GA3 iniciando la induccioacuten de
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eacuteste desde los 30 diacuteas de cultivo solamente en un 70 de los explantes cultivados El 100 se logroacute a los 90 diacuteas de cultivo observando callo abundante alrededor de todo el tejido de color blanco con puntos pigmentados de color verde La regeneracioacuten de protocormos de esta orquiacutedea se establecioacute con la siembra de segmentos de hoja de plaacutentulas de 6 meses de edad de manera directa o a partir de callos En callos la produccioacuten fue oacuteptima en el medio MS con 01 mgl de ANABAGA3 ya que a los 60 diacuteas se obtuvieron 50 protocormos por segmento de callo Solamente se produjeron 10 protocormos por explante al cultivarse los segmentos de hoja en MS con 01 mgl de ANABAGA3 a los 120 diacuteas de cultivo (HUAPEO y SALGADO 2004) 25 Aclimatacioacuten Aclimatacioacuten significa que el hombre intercede y guiacutea el proceso de acondicionamiento de las plantas hasta que eacutestas sean aptas para crecer en el campo yo invernadero
Un alto nuacutemero de plantas micropropagadas no sobreviven al cambio desde el cultivo in vitro hacia el ambiente exterior ya sea en campo o invernadero Eacutestos dos uacuteltimos tienen menor humedad relativa niveles maacutes altos de luminosidad y un ambiente seacuteptico los cuales son maacutes estresantes para las plantas micropropagadas La mayoriacutea de las especies que crecen in vitro necesitan un proceso de aclimatacioacuten pudiendo obtener asiacute un nuacutemero suficiente de plantas vivas y vigorosas para trasplantar al suelo (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991)
La aclimatacioacuten no es uacutenicamente para micropropagacioacuten siendo usada ademaacutes en propagacioacuten convencional durante antildeos Despueacutes de cortar las hojas y de haber formado raiacuteces por lo general son aclimatadas antes de ser llevadas al campo o invernadero Ejemplos de dos teacutecnicas comunes son bajar gradualmente la humedad y mantener el nivel de luz con un 50 de sombra antes de trasladarlos al campo Las raiacuteces que han sido cortadas y mal limpiadas muchas veces son focos de infeccioacuten En estos casos las plantas muestran signos de marchitez hojas necrosadas y tambieacuten se puede llegar a la muerte de eacutestas El cultivo in vitro reduce la necesidad de fotosiacutentesis ya que las condiciones de la caacutemara de incubacioacuten proveen a la planta de sacarosa u otro azuacutecar Tambieacuten en estas condiciones se reduce el stress por patoacutegenos al ser un ambiente aseacuteptico Todo esto se traduce en que las plantas micropropagadas no son aptas para el campo yo invernadero (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 251 Stress hiacutedrico El stress hiacutedrico puede ser el resultado de una excesiva transpiracioacuten de las diferentes partes aeacutereas de las plantas especialmente de las hojas o por una inadecuada absorcioacuten de agua por parte de las raiacuteces La cutiacutecula y los estomas son la ruta primaria de peacuterdida de agua desde de las hojas provenientes de esta teacutecnica reproductiva 2511 Cutiacutecula La cutiacutecula es una membrana compuesta por una matriz de cutina que a su vez se encuentra cubierta en su superficie por ceras cuya funcioacuten primaria consiste en limitar la peacuterdida de agua por transpiracioacuten La permeabilidad del agua a traveacutes de la cutiacutecula se ve influenciada principalmente por la estructura y la cantidad de
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ceras cuticulares y epicuticulares no vieacutendose afectada la peacuterdida de agua por el grosor de eacutesta o la naturaleza quiacutemica de la matriz de la cutina La estructura cristalina de la parte encerada de las hojas es distinta en las plantas micropropagadas con respecto a las plantas que crecen en el campo La cera epicuticular de las hojas de plantas in vitro tienen una proporcioacuten maacutes alta de esteres y de componentes polares por el contrario tienen unas cadenas de hidrocarbonos mucho maacutes cortas Esto hace que las plantas in vitro pierdan maacutes agua que las cultivadas en campo o invernadero
Las plantas que han crecido en el campo son naturalmente de color verde pero el color de las plantas cultivadas in vitro es diferente y se puede ver a simple vista Las plantas que son pasadas a invernadero y que tengan un color verde se aclimatan de mejor forma al ambiente exterior (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 2512 Estomas La estructura estomaacutetica y su funcionamiento han sido implicados recurrentemente en el desbalance de agua exhibido por plantas micropropagadas al momento de ser removidas del cultivo in vitro Estudios con microscopiacutea de scanner electroacutenico han indicado que la estructura estomaacutetica presente en algunas especies de plantas cultivadas in vitro difieren marcadamente de las cultivadas en invernadero o en el suelo Debido a que las primeras presentan estomas de mayor tamantildeo y maacutes redondos a diferencia de las plantas cultivadas de manera normal que presentan estomas maacutes pequentildeos y eliacutepticos lo que resulta en una deshidratacioacuten maacutes raacutepida en el caso de las provenientes de cultivo in vitro (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 252 Humedad Debido a la anatomiacutea y la condicioacuten fisioloacutegica de las plantas desarrolladas in vitro donde se ha mantenido una alta humedad relativa es necesario regar al momento del traslado para obtener una alta sobrevivencia Muchos laboratorios aseguran que hay que evitar tener un sistema de aspersioacuten ya que se produce el ambiente necesario (muy huacutemedo) para la aparicioacuten de hongos algas o bacterias Otros meacutetodos incluyen el uso de humidificadores o poner las macetas en un lugar cerrado donde se retenga vapor para esto se pueden usar por ejemplo tapas de polietileno Este meacutetodo es relativamente econoacutemico pero se debe tener control del calor y monitorear la falta de agua (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 253 Luz Durante la etapa in vitro las plantas estaacuten expuestas a altos niveles de luminosidad lo que se traduce en hojas delgadas Antes del traslado se recomienda mantener las plantas con un 50 de sombra para asiacute poder aclimatarlas de mejor manera esto debido a que las plantas micropropagadas tienen un bajo control sobre la transpiracioacuten y un inadecuado mecanismo de fotosiacutentesis La sombra reduce la transpiracioacuten evitando excesivas peacuterdidas de agua asiacute como tambieacuten el exceso de luz destruye las moleacuteculas de clorofila Luego del periacuteodo bajo sombra se deben mover las macetas gradualmente hacia el nivel de luz al cual seraacute llevado para su crecimiento final (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 254 Temperatura La temperatura del aire y del medio o sustrato de crecimiento estaacute generalmente controlado durante el periacuteodo de aclimatacioacuten El calor es necesario en los meses de invierno y el friacuteo (enfriar) es esencial en los meses de verano Ajustando la cantidad de sombra y humedad se obtiene un control sobre la temperatura El
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enfriamiento se puede obtener gracias a ventilacioacuten abanicos niebla o aire acondicionado El calor puede provenir del sistema existente en el edificio o invernadero donde esteacuten ubicadas las macetas o por las laacutemparas ocupadas para el control del fotoperiacuteodo El rango de temperatura que se mantiene por lo general es entre los 13 y 30ordmC y esta determinado principalmente por la especie en cuestioacuten La temperatura de la zona donde se encuentran las raiacuteces es muy importante para el crecimiento lo ideal es que dicho sector tenga una mayor temperatura que el aire fomentando el crecimiento de las raiacuteces e incrementando la humedad alrededor de la planta Durante el verano esto es difiacutecil de obtener ya que la temperatura del aire es muy alta debido a la alta radiacioacuten solar Terminado el proceso de aclimatacioacuten esto ya no es necesario (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 255 Fotosiacutentesis Las plantas sufren un cambio radical cuando son removidas desde cultivo in vitro ya que son forzadas a cambiar de heterotroacuteficas a autotroacuteficas y la fotosiacutentesis se vuelve fundamental para la sobrevivencia Las hojas de las plantas in vitro no estaacuten formadas para hacer fotosiacutentesis ya que en la caacutemara de incubacioacuten no se produce un fuerte intercambio gaseoso esto debido a que la sacarosa es entregada a traveacutes del medio de cultivo Las hojas de las plantas que son trasladadas al campo o invernadero sufren deterioro debido a que no estaacuten formadas para la fijacioacuten de carbono Esto se produce por un tiempo aproximado de cuatro semanas despueacutes de las cuales las hojas nuevas suplen a las viejas Otro punto es que las hojas de las plantas cultivadas in vitro contienen menor proporcioacuten de clorofila que las plantas que han crecido normalmente en el campo En un estudio de coliflor cultivado in vitro se midioacute el CO2 y se obtuvo un balance negativo el cual se mantuvo durante dos semanas despueacutes del transplante Algo similar ocurrioacute con frutilla despueacutes del transplante las hojas se deterioraron raacutepidamente lo que quiere decir que no hubo incremento en la fijacioacuten de carbono indicando falta de desarrollo en la competencia fotosinteacutetica
El bajo nivel de CO2 durante el cultivo in vitro limita el proceso de fotosiacutentesis lo cual se puede compensar usando sacarosa en el medio de cultivo Tambieacuten se puede incrementar el nivel de luz y CO2 obteniendo un fuerte aumento en el crecimiento de varias especies como orquiacutedeas clavel etc (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 256 Sustrato Un sustrato es todo material soacutelido distinto del suelo natural mineral u orgaacutenico que colocado en un contenedor en forma pura o en mezcla permite el anclaje del sistema radicular de la planta desempentildeando por lo tanto un papel de soporte para la planta El sustrato puede intervenir o no en el complejo proceso de la nutricioacuten mineral de la planta (INFOAGRO 2007) El sustrato y los contenedores dentro de los cuales se van a transplantar las plaacutentulas in vitro son importantes para una buena sobrevivencia
Los sustratos ejercen una influencia significativa en la arquitectura del sistema radical de las plantas y en las asociaciones bioloacutegicas de este con el suelo influenciando el
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estado nutricional y la translocacioacuten de agua en el sistema suelo-planta-atmoacutesfera Uno de los requisitos fundamentales que debe cumplir el sustrato para su utilizacioacuten es la sanidad Cuando estos no se elaboran almacenan o manejan correctamente pueden contaminarse y provocar serios dantildeos a las plantas durante la aclimatacioacuten por esta razoacuten son preferidos como componentes para su elaboracioacuten materiales inertes o aquellos en las cuales el proceso de obtencioacuten garantice la mayor desinfeccioacuten posible
Uno de los factores de mayor importancia a la hora de seleccionar los materiales que pueden constituir el sustrato es su disponibilidad tanto en teacuterminos de facilidad de obtencioacuten o suministro como de su costo (VILCHEZ et al 2007)
La presencia de inhibidores o tambieacuten cambios en el pH del sustrato pueden afectar el crecimiento de las raiacuteces y consecuentemente el eacutexito del transplante
Muchos laboratorios y viveros transplantan a un sustrato uniforme debiendo ser eacuteste adecuado en cuanto a soporte de las plantas pH porosidad aireacioacuten y drenaje (DEBERGH y ZIMMERMAN 1991)
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3 MATERIAL Y MEacuteTODO
Para la realizacioacuten de este trabajo se utilizoacute el siguiente material y meacutetodo
31 Material La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio e invernadero de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal pertenecientes a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de Chile
311 Material vegetal Se utilizaron plaacutentulas de C virescens cultivadas in vitro a partir de semillas las cuales fueron proporcionadas por el laboratorio estas plaacutentulas fueron separadas y repicadas para aumentar la poblacioacuten y obtener la cantidad necesaria para el ensayo
FIGURA 2 Plaacutentulas de C virescens en caacutemara de crecimiento in vitro
312 Materiales Los materiales que se utilizaron fueron los siguientes Equipos autoclave caacutemara de flujo laminar dispensador de medios medidor
de pH agitador magneacutetico horno microondas balanza mechero termoacutemetro Materiales vasos de precipitado matraces probetas pipetas papel de
aluminio frascos de vidrio placas Petri pinzas bisturiacute macetas regadera Soluciones soluciones madre (Medio MS) gelificante etanol 70 y 95
32 Meacutetodo A continuacioacuten se da a conocer la metodologiacutea con la cual se trabajoacute 321 Preparacioacuten del medio de cultivo Para la obtencioacuten de plantas a traveacutes de la micropropagacioacuten se ocupoacute el medio basal de MURASHIGE y SKOOG (1962) tambieacuten llamado medio MS Este medio tiene un pH de entre 56-57 Posteriormente se dosificoacute con el dispensador de medios para que cada frasco tenga una cantidad adecuada (25 mL) y se llevoacute a autoclave para esterilizar a 12 atm 120ordm C por 20 min
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322 Obtencioacuten del material vegetal Al tener el medio esterilizado se procedioacute a la separacioacuten y repicado de plaacutentulas existentes en el laboratorio Las siembras se realizaron en el mes de mayo del 2007 Estas siembras se realizaron en la caacutemara de flujo laminar de modo de asegurar que la siembra sea 100 aseacuteptica Estas plaacutentulas fueron mantenidas en la caacutemara de incubacioacuten hasta obtener los tamantildeos requeridos para el ensayo donde las condiciones fueron las siguientes
minus Temperatura ambiental de 23-25ordm C minus Fotoperiacuteodo de 16 horas minus Intensidad lumiacutenica controlada de 50-55 micromol m-2s-1
323 Sustratos Se utilizaron tres tipos de sustratos el primero corresponde a una mezcla de turba + perlita (11) el segundo corresponde a Sphagnum (100) y el tercero corresponde a una mezcla de turba + arena (11) Una vez realizadas las mezclas se procedioacute a una esterilizacioacuten en un autoclave a 121ordm C por 20 minutos a 12 atmoacutesfera De esta forma se trabajoacute con material limpio y sano evitando ataque de hongos o bacterias El anaacutelisis quiacutemico de los sustratos se muestra en el Anexo 2 324 Plantacioacuten Las plaacutentulas con un promedio de cuatro meses en condiciones de caacutemara de crecimiento in vitro obtuvieron el tamantildeo adecuado para ser utilizadas Se sacaron de los frascos y se plantaron en las macetas de plaacutestico transparente con los sustratos Posteriormente fueron dejadas en la sala del laboratorio donde se debioacute asperjar con solucioacuten nutritiva Hoagland y fungicida Captan CUADRO 1 Composicioacuten de solucioacuten nutritiva Hoagland
KNO3 102 gL Ca(NO3) 4 H2 O 0492 gL
NH4H2 (PO4) 023 gL MgSO4 7 H2O 049 gL
H3BO3 286 mgL MnCl2 2 H2O 181 mgL CuSO4 5 H2O 008 mgL ZnSO4 5 H2O 022 mgL Na2MoO4 H2O 009 mgL
FeSO4 7 H2O 05 06 mL FUENTE FINCK 1988 325 Disentildeo de los ensayos Este trabajo de investigacioacuten constoacute de un ensayo con dos etapas Antes que todo se realizoacute la separacioacuten y repicado in vitro de plaacutentulas de C virescens para la obtencioacuten del nuacutemero necesario de plantas En la etapa 1 se utilizaron tres tamantildeos de plaacutentulas obtenidas in vitro de 1-2cm de 2-3cm y de maacutes de 3cm de altura que se transplantaron a tres sustratos turba + perlita 11(vv) Sphagnum (100) y turba + arena 11 (vv) La turba provino de la Sociedad
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Minera Patagonia Peat SA en Hijuelas el Sphagnum de la empresa Lonquen Chile de Puerto Montt y la perlita se obtuvo a traveacutes del sitio web wwwjardisencl (representante legal Walter Rathgeb Penza Ingeniero Agroacutenomo Santiago) Las plaacutentulas se plantaron de acuerdo a su tamantildeo las de maacutes de 3cm se colocaron de 6 por maceta las de 2 a 3cm de a 8 por maceta y las maacutes chicas de a 10 por maceta Estas macetas fueron dejadas en una sala de aclimatacioacuten con una temperatura promedio de 20ordm C intensidad lumiacutenica de 50-55 micromol m-2s-1 y 14-16 hrs de fotoperiacuteodo Se fertilizoacute asperjando cada cinco diacuteas con solucioacuten nutritiva Hoagland Esta etapa se llevoacute a cabo durante dos meses desde el cinco de septiembre hasta el cinco de noviembre de 2007
En la etapa 2 se continuoacute el proceso de aclimatacioacuten en invernadero de las plaacutentulas obtenidas en la etapa 1 que despueacutes de dos meses teniacutean un mayor tamantildeo y se habiacutean acondicionado al ambiente exterior (fuera de la caacutemara de crecimiento) Las plantas se mantuvieron en las macetas durante tres semanas para aclimatarlas y luego las plantas sobrevivientes fueron transplantadas a macetas maacutes grandes individuales durante tres meses aproximadamente hasta el cinco de marzo 2008 Estas nuevas macetas tuvieron como sustrato turba y suelo (trumao) en igual proporcioacuten (Anexo 2) La temperatura promedio de invernadero fluctuoacute de 13 a 35 degC seguacuten el mes En enero el promedio fue de 25 (Anexo 3) Para bajar la temperatura alrededor de 5deg C se instaloacute una malla Rachel 326 Disentildeo experimental El disentildeo experimental utilizado fue completamente al azar ordenado como experimento factorial con dos factores tamantildeo (3) y sustrato (3) Cada tratamiento tuvo tres repeticiones con un miacutenimo de 6 plantas por recipiente 327 Variables a evaluar Durante los dos meses en que las macetas estuvieron en la sala de aclimatacioacuten se evaluoacute el desarrollo foliar contando el nuacutemero de hojas una vez al mes Posteriormente se trasladaron las mismas macetas a invernadero durante tres semanas para continuar con la aclimatacioacuten de las plaacutentulas Transcurrido este tiempo se transplantaron las plaacutentulas sobrevivientes a macetas individuales y continuoacute mensualmente la evaluacioacuten de eacutestas (nuacutemero de hojas) hasta la obtencioacuten de plantas establecidas Al momento del transplante y al final del ensayo se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces asiacute como tambieacuten al final del ensayo de evaluoacute el crecimiento en altura (cm) La sobrevivencia fue evaluada al final del ensayo por maceta
Tanto en la sala de aclimatacioacuten coacutemo en el invernadero se registroacute la temperatura con la ayuda de un termoacutemetro de maacutexima y miacutenima (Anexo 3) 328 Anaacutelisis estadiacutestico Una vez obtenidos los datos se procedioacute a comprobar si estos cumpliacutean con los supuestos de aleatoriedad normalidad y homogeneidad de varianzas que exige este tipo de anaacutelisis En el caso de no cumplirse estos supuestos los datos se transformaron utilizando log10(x+05) raiacutez(x+05) o 1x para normalizarlos
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y enseguida se sometioacute los datos a un anaacutelisis estadiacutestico (ANDEVA) Posteriormente en los casos en que se observoacute diferencias significativas en el ANDEVA se aplicoacute una prueba de rangos muacuteltiples (Tukey) al 5 de significancia Para las variables no parameacutetricas que no cumplieron con los supuestos para un anaacutelisis de varianza se realizoacute la prueba de KruskalndashWallis y las comparaciones muacuteltiples a traveacutes del test de Dunn con un nivel de 5 de significancia
Se utilizaron los programas estadiacutesticos STATGRAPHICS 20 y GRAPHPAD PRISM 5 para el anaacutelisis de datos
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4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
En los siguientes puntos se discuten los resultados obtenidos en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens
En la Figura 3 se observan plaacutentulas de C virescens micropropagadas en medio MS en caacutemara de crecimiento al inicio del ensayo (A) y en invernadero despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten (B)
BA
FIGURA 3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten
A continuacioacuten se presentan los resultados obtenidos para las variables analizadas (Cuadro 2 y 3) de esta manera se pueden visualizar en general los resultados obtenidos en el proceso de aclimatacioacuten durante seis meses
CUADRO 2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de raiacuteces
inicial y final Variables
Hojas finales (nuacutemero)
Raiacuteces iniciales (nuacutemero)
Raiacuteces finales (nuacutemero)
Tamantildeo de plaacutentulas 36 24 37 47 29 46
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 61 43 76
Sustratos 53 36 56 43 29 51
Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 46 27 49
Significa que hay diferencias significativas al 95 Test de Dunn
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Las variables no parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en hojas finales y raiacuteces iniciales en sus rangos de distribucioacuten Las raiacuteces finales no presentaron diferencias seguacuten el sustrato utilizado pero de acuerdo al tamantildeo hubo diferencias en su distribucioacuten
CUADRO 3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas
Variables Altura final de plaacutentulas
(cm) Sobrevivencia
Tamantildeo de plaacutentulas
36 c 567 b 47 b 821 a
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 59 a 908 a
Sustratos 52 a 933 a
41 ab 59 b Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 49 b 772 a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY Las variables parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en altura final de hojas y en sobrevivencia 41 Nuacutemero de hojas finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentulas y de sustratos para la variable nuacutemero final de hojas 411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula Seguacuten el Cuadro 2 y Figura 4 las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero final de hojas Las plaacutentulas pequentildeas de 1-2 cm obtuvieron el nuacutemero maacutes bajo de hojas finales con una media de 36 hojas por plaacutentula lo cual es la mitad de las hojas finales que se obtuvo con las plaacutentulas de mayor tamantildeo (61 hojas aproximado por plaacutentula) Para las plaacutentulas medianas de 2-3 cm se obtuvo una media de 47 hojas por plaacutentula (Figura 4)
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Hojas finales
1-2 cm 2-3cm maacutes de 3 cm0
5
10
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Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn)
BLANCO (2006) sentildeala que plaacutentulas cultivadas in vitro crecen bajo condiciones especiales como alta humedad relativa y baja luminosidad ademaacutes son suplidas con sacarosa Estas condiciones fueron proporcionadas en una caacutemara de crecimiento en el laboratorio donde las plantas micropropagadas no son dependientes por completo de su fotosiacutentesis son heteroacutetrofas Parece ser necesario un estiacutemulo para convertirse en organismos totalmente capaces de sustentar sus propios requisitos de carbono y nitroacutegeno reducido pasando de esta manera a ser autoacutetrofos
Al ser sacadas de un medio in vitro las hojas no estaacuten preparadas para producir su propio alimento y sobreviven gracias a que el medio de cultivo le proporciona los nutrientes necesarios para vivir En este punto muchas de las hojas mueren y nacen hojas nuevas capaces de generar su alimento supliendo asiacute las hojas viejas (SEELYE et al 2003) En este ensayo las plaacutentulas de Chloraea virescens presentaron en general una buena adaptacioacuten al ser sacadas de un medio in vitro
Se observoacute que plaacutentulas con menor tamantildeo al ser aclimatadas y tener menor tejido fue maacutes difiacutecil y maacutes lento que empezaran a generar nuevos tejidos y materia orgaacutenica a partir de dioacutexido de carbono POSPIacuteŠILOVAacute et al (1999) sentildeala que al tener los estomas con desarrollo incompleto maacutes grandes y de forma maacutes redonda pierden maacutes agua lo cual puede provocar una peacuterdida de hojas muriendo asiacute la plaacutentula Por esta razoacuten las plaacutentulas pequentildeas se demoran maacutes tiempo en generar hojas nuevas es por ello que al finalizar este estudio muestran el menor nuacutemero final de hojas 412 Efecto del tipo de sustrato Al analizar la influencia del tipo de sustrato se encontraron diferencias significativas entre los tres sustratos utilizados Seguacuten el Cuadro 2 y la Figura 5 el sustrato donde se obtuvo mejores resultados fue
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turba+perlita en el cual se observoacute un promedio de 53 hojas por plaacutentula siendo Sphagnum el maacutes bajo con 43 hojas por plaacutentula De acuerdo a los resultados del anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados el sustrato turba+perlita tiene mayor cantidad de nitroacutegeno foacutesforo calcio magnesio y azufre disponible comparativamente con los otros dos sustratos (Sphagnum y arena+turba) (Anexo 2)
Hojas finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
Sustratos
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) Para la brotacioacuten y el crecimiento de las plantas se necesita agua y Nitroacutegeno lo que favorece a una mayor tasa de aparicioacuten de hojas lo que se traduce en una mayor cantidad de hojas finales El Nitroacutegeno se encuentra en mayor cantidad en el sustrato turba+perlita debido a lo cual los mejores resultados se obtienen en dicho sustrato 413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Despueacutes de analizados los efectos individuales del tamantildeo y del sustrato al interactuar ambos factores existen diferencias significativas La mejor interaccioacuten se obtuvo con el sustrato turba+perlita y con el mayor tamantildeo de la plaacutentula (Figura 6) Debido a la buena estructura (porosa) de dicho sustrato se podriacutea decir que se favorecioacute la absorcioacuten radicular de nutrientes obteniendo por ello un mayor nuacutemero de hojas finales Para los menores tamantildeos no se observan diferencias significativas obteniendo como promedio 41 hojas por plaacutentula Para el mayor tamantildeo el promedio fue de 6 hojas por plaacutentula
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Hojas finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
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Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 42 Raiacuteces iniciales Este paraacutemetro se evaluoacute luego de la primera etapa de aclimatacioacuten la cual se realizoacute en una sala de aclimatacioacuten del laboratorio Se analizoacute la influencia de diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos sobre la variable nuacutemero raiacuteces iniciales (Anaacutelisis de Kruskal-Wallis en Anexo 7)
FIGURA 7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses de pre aclimatacioacuten
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En la Figura 7 se puede observar los resultados de pre aclimatacioacuten en sala de laboratorio En esta etapa ya es posible ver la presencia de raiacuteces desarrolladas 421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula En el Cuadro 2 se puede observar que las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero inicial de raiacuteces y en la Figura 8 se puede comprobar que para los dos tamantildeos de plaacutentula maacutes pequentildeos no se observa gran cantidad de raiacuteces esto no impidioacute el desarrollo posterior de las plaacutentulas las cuales lograron enraizar al final del estudio Esto se contrapone a lo observado en un estudio de Lapageria rosea donde la presencia de raiacutez y brote para lograr una multiplicacioacuten exitosa de plantas es de vital importancia Incluso algunas plaacutentulas de L rosea no brotan en condiciones in vitro en donde tienen las mejores condiciones nutricionales y hormonales para hacerlo Esto se debe a factores internos de la plaacutentula siendo muy difiacutecil que broten inmediatamente en caacutemara de aclimatacioacuten donde ya dejan de recibir los nutrientes necesarios de manera directa y requieren de balances de energiacutea para poder seguir elongando raiacuteces absorber nutrientes y brotar para poder obtener los carbohidratos necesarios para seguir su crecimiento (BLANCO 2006) El tamantildeo de plaacutentula tiene importancia para el desarrollo de raiacuteces se distingue notoriamente que en los tamantildeos maacutes grandes el nuacutemero de raiacuteces es mayor comparativamente con los tamantildeos pequentildeos donde el nuacutemero de raiacuteces fue escaso Debido a la presencia de maacutes hojas existe una mayor cantidad de aacuterea fotosinteacutetica esta situacioacuten estimula el crecimiento de las raiacuteces para la obtencioacuten de agua y nutrientes
Raices iniciales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
2
4
6
8
10
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o inicial de ra
iacuteces
FIGURA 8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn)
30
422 Efecto del tipo de sustrato Para el sustrato turba+perlita se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas en el nuacutemero de raiacuteces con respecto a los dos otros sustratos esto se puede ver en el Figura 9 donde se observa que se obtuvieron los mayores resultados En cualquier medio de crecimiento el espacio no ocupado por un soacutelido se llama porosidad este espacio puede ser ocupado en parte para retener agua y en parte para proporcionarle aire a las raiacuteces La ausencia de uno de estos elementos es perjudicial para las plantas La turba es conocida por tener estas propiedades y la perlita tambieacuten por esta razoacuten se sabe que la mezcla turba-perlita provee propiedades fiacutesicas excelentes como medio de crecimiento y propagacioacuten (INFOAGRO 2007) Estos resultados con turba-perlita (298 de materia orgaacutenica) coinciden con los obtenidos por DIAZ et al (2004) quienes al utilizar un sustrato compuesto por 100 de humus de lombriz para aclimatar cantildea de azuacutecar obtuvieron el mayor nuacutemero de raiacuteces Esto puede atribuirse al importante aporte de materia orgaacutenica del humus (47) lo que le confiere una mejor estructura obtenieacutendose una excelente porosidad del sustrato La aireacioacuten del suelo es necesaria para favorecer la maacutexima absorcioacuten de nutrientes por las raiacuteces Esto tambieacuten sucede en el sustrato turba+perlita el cual posee la mayor cantidad de materia orgaacutenica de los tres sustratos utilizados
Raices iniciales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
2
4
6
8
10
Sustratos
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato En los anaacutelisis para la variable nuacutemero de raiacuteces se puede decir que la mejor interaccioacuten se presentoacute para el sustrato de turba+perlita junto con el mayor tamantildeo de plaacutentulas obteniendo los valores maacutes altos entre los nueve tratamientos La presencia de raiacuteces luego de la micropropagacioacuten aumenta la posibilidad de eacutexito en el transplante ya que se crea un favorable balance de agua Pero esto no quiere
31
decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
10
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
32
En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
33
El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
34
Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
3
1 INTRODUCCION La familia Orchidaceae (Orquiacutedeas) es la que mayor nuacutemero de especies comprende en el Reino Vegetal Se estima que debe haber alrededor de 35000 especies de Orquiacutedeas en todo el mundo pertenecientes a unos 750 geacuteneros ademaacutes de miles de hiacutebridos En Chile esta familia es probablemente el grupo menos estudiado de plantas con flores y soacutelo se han realizado estudios en base a su taxonomiacutea biologiacutea reproductiva fenologiacutea y distribucioacuten
La produccioacuten de flores de orquiacutedeas ha tomado importancia por la belleza de sus flores dada la enorme variedad de formas colores y perfumes Existen orquiacutedeas terrestres y epiacutefitas estas uacuteltimas representan maacutes del 90 del total de especies y son las que mayoritariamente se encuentran a la venta Las flores tienen un alto valor ornamental o como flor cortada ya que eacutestas pueden permanecer separadas de las plantas sin marchitarse hasta tres o cuatro semanas y en la planta permanecen hasta tres meses
La obtencioacuten de plantas de orquiacutedeas a partir de semillas es muy difiacutecil ya que eacutestas son diminutas y de germinacioacuten irregular Como una alternativa de obtencioacuten de plantas aparece la micropropagacioacuten pudiendo asiacute aumentar el nuacutemero de plantas en forma relativamente faacutecil y raacutepida Luego de la etapa de micropropagacioacuten viene la etapa de aclimatacioacuten en la cual la manipulacioacuten debe ser en extremo cuidadosa ya que es donde se produce el mayor iacutendice de mortandad principalmente en el proceso de transplante Esta etapa es muy importante ya que gracias a ella se veraacute la eficiencia del proceso y la calidad final de las plantas producidas in vitro Considerando la produccioacuten de plaacutentulas mediante la micropropagacioacuten en este trabajo se plantea la hipoacutetesis que ldquoel tamantildeo de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro y los distintos sustratos son factores que inciden en el desarrollo y su aclimatacioacutenrdquo El objetivo general de este trabajo es
Evaluar la influencia del tamantildeo de plaacutentulas y utilizacioacuten de distintos sustratos en la aclimatacioacuten ex vitro de plaacutentulas de C virescens
Los objetivos especiacuteficos son
Medir el efecto del tamantildeo de plaacutentulas de C virescens en la sobrevivencia y desarrollo de eacutestas ex vitro
Comparar el uso de tres sustratos en el desarrollo y sobrevivencia de plaacutentulas de C virescens
4
2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA 21 Descripcioacuten general 211 Descripcioacuten geograacutefica Las orquiacutedeas pertenecen a la familia Orchidaceae clase Liliopsida (monocotiledoacuteneas) Son plantas herbaacuteceas perennes originarias de regiones tropicales y subtropicales pero existen tambieacuten en todos los continentes a excepcioacuten de las regiones polares La zona donde se encuentran estas plantas estaacute comprendida entre los 68ordm latitud norte y 56ordm latitud sur Es evidente que en los liacutemites extremos de estas latitudes se encuentran pocos geacuteneros y especies esto va en aumento desde las regiones temperadas hasta las regiones intertropicales donde el nuacutemero es el mayor Los territorios maacutes interesantes por su nuacutemero son
Ameacuterica del Sur y Ameacuterica Central Asia e India Madagascar Australia es el continente menos poblado en orquiacutedeas dentro de las regiones
del globo Por su parte Europa presenta numerosos geacuteneros y especies de orquiacutedeas
terrestres Soacutelo en Francia existen 75 especies repartidas en 16 geacuteneros todas terrestres (LECOUFLE y ROSE 1956)
212 Formas de vida Las zonas donde crecen estas plantas influyen sobre su manera de vivir Algunas orquiacutedeas son terrestres y se encuentran representadas en todas las regiones Tambieacuten existen las epiacutefitas (vegetal que fijado a otro no obtiene de eacuteste su alimento) En este caso se necesita que el grado higromeacutetrico y la temperatura permitan este tipo de adaptacioacuten Ademaacutes existen las orquiacutedeas litofiacuteticas que viven sobre rocas Las raiacuteces de las epiacutefitas y litofiacuteticas estaacuten adaptadas a vivir expuestas al aire o inmersas en materia orgaacutenica ya que tienen un tejido acumulador de agua llamado velo En zonas friacuteas y templado friacuteas todas las orquiacutedeas son terrestres En zonas subtropicales o tropicales la gran mayoriacutea es epiacutefita Otra particularidad debida seguramente a la influencia de estas zonas es la floracioacuten Es en las zonas tropicales y subtropicales que se dan los mayores tamantildeos de flores asiacute como tambieacuten la mayor variedad de colores (LECOUFLE y ROSE 1956)
213 Descripcioacuten morfoloacutegica Las orquiacutedeas se caracterizan por poseer flores muy vistosas hermafroditas (ambos sexos en la misma flor) zigomorfas (con un solo plano de simetriacutea) triacutemeras (tres seacutepalos y tres peacutetalos) y una columna central que sustenta las estructuras reproductivas masculinas anteras y femeninas pistilo llamada ginostemo El peacutetalo inferior se llama labelo y su morfologiacutea define a los distintos geacuteneros de orquiacutedeas Las flores pueden ser aisladas o en inflorescencia y son polinizadas por insectos El polen se encuentra aglomerado formando una masa llamada polinio el que tiene un extremo con un ensanchamiento glandular pegajoso que sirve para que el
5
polinio se adhiera al cuerpo del insecto polinizador El fruto es una caacutepsula seca con muchas semillas pequentildeas sin endosperma y con embrioacuten no diferenciado Tienen dos tipos baacutesicos de crecimiento Simpodial en las que el nuevo crecimiento se produce en sentido horizontal a partir de un tallo subterraacuteneo o rizoma generando una sub-unidad capaz de producir una flor o inflorescencia y de ser eventualmente separada de la planta (ej Cattleya) Monopodial en las que el nuevo crecimiento se produce en sentido vertical con lo cual la planta crece constantemente en altura (ej Phalaenopsis) (ORQUIDEAS 2007) 214 Geacuteneros y especies chilenas Seguacuten NOVOA et al (2006) en la familia Orchidaceae se encuentran 49 especies de flora nativa dentro de las cuales se encuentra Chloraea virescens (Willd) Lindl Los geacuteneros de Orchidaceae en Chile son 7
- Aa Bipinnula Brachystele Codonorchis Chloraea Gavilea y Habenaria
Dentro del geacutenero Chloraea existen 31 especies - Chloraea alpina Poepp - Chloraea barbata Lindl - Chloraea bidendata (Poepp y Endl) Correa - Chloraea bletioides Lindl - Chloraea cuneata Lindl - Chloraea chica Speg - Chloraea chrysantha Poepp - Chloraea crispa Lindl - Chloraea cristata Lindl - Chloraea cylindrostachya Poepp - Chloraea disoides Lindl - Chloraea galeata Lindl - Chloraea gaudichaudii Brongn - Chloraea gavilu Lindl - Chloraea grandiflora Lindl - Chloraea heteroglossa Rchbf - Chloraea incisa Poepp - Chloraea lamellata Lindl - Chloraea lechleri Lindl - Chloraea leptopetala Reiche - Chloraea longipetala Lindl - Chloraea magellanica Hookf - Chloraea multiflora Lindl - Chloraea nudilabia Lindl - Chloraea philippii Reichbf - Chloraea picta Phil - Chloraea prodigiosa Reichbf - Chloraea speciosa Poepp - Chloraea virescens Lindl - Chloraea viridiflora Poepp
6
- Chloraea volkmanni Phil (NOVOA et al 2006) 2141 Chloraea virescens Planta perenne de 40-90 cm de altura Sus hojas son de 5-12cm de largo por 15-25cm de ancho estrechas lanceoladas agudas dispuestas en roseta basal generalmente marchitas al final de la antesis Su escapo floral tiene vainas caulinares lanceoladas agudas y distantes La inflorescencia es de 8-20cm de largo densa con 10-15 flores erguidas Sus flores son blancas con estriacuteas y aacutepices verdes El seacutepalo dorsal es de 16-33mm de largo por 4-6mm de ancho oblongo lanceolado obtuso algo coacutencavo a veces ligeramente estrechado al centro aacutepice algo carnoso Los seacutepalos laterales de 18-33mm de largo por 4-5mm de ancho son ensiformes con aacutepice obtuso engrosado verde negruzco a veces espatulado y dentado a veces verrugoso Los peacutetalos son de 15-23mm de largo por 5-58mm de ancho estrechamente aovados obtusos verrugosos con maacutes frecuencia solo la mitad inferior a veces el borde denticulado y carnoso El labelo de 15-26mm de largo por 10-20mm de ancho es mas o menos romboidal a levemente trilobulado El loacutebulo central tiene 5-7 nervios longitudinales recorridos por laminillas interrumpidas membranaacuteceas con segmentos falciformes de borde carnoso de color verde Los nervios laterales que se ramifican oblicuamente hacia el aacutepice en los loacutebulos laterales tienen pequentildeas laminillas y verrugas y su borde es laciniado inciso en la mitad apical hacia la base denticulado aacutepice generalmente engrosado La columna es de 12-18mm de largo delgada blanca con estriacuteas anaranjada La base de la zona nectariacutefera tiene un color amarillo-limoacuten con maacuteculas anaranjadas orificio nectario verde El ala de la columna es recta y estrecha El estigma es triangular y globoso La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la Vordf (Vintildea del Mar) hasta la XIordf Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile Sin embargo es posible que tenga una distribucioacuten maacutes restringida por que se le ha confundido con Chloraea incisa Su floracioacuten es desde noviembre a febrero y su estado de conservacioacuten no estaacute evaluado (NOVOA et al 2006) En el Anexo 14 se incluyen antecedentes sobre su distribucioacuten y eacutepoca de floracioacuten
7
FIGURA 1 Chloraea virescens FUENTE NOVOA et al (2006) 22 Requerimientos de las orquiacutedeas Para tener eacutexito en el cultivo de orquiacutedeas hay que tomar en cuenta factores de importancia como son 221 Agua El riego correcto es el principio y el fin del cuidado de orquiacutedeas (ROLLKE 2005) Este elemento es primordial para las orquiacutedeas asiacute como tambieacuten para todo tipo de plantas En el caso de eacutestas se dice muchas veces que la calidad del agua usada es el factor maacutes importante en el cultivo de orquiacutedeas ya que el porcentaje maacutes alto de muerte se produce por el exceso de este factor (SHEEHAN 1980) Hay que tomar en cuenta que la mayoriacutea de las orquiacutedeas son epiacutefitas lo que significa que tienen sus raiacuteces a la vista gracias a las cuales absorben el agua de lluvia Se recomienda un sustrato poroso y de reaccioacuten neutra ya que de esta manera el agua escurre sin acumularse no permitiendo la pudricioacuten de las raiacuteces Para las orquiacutedeas terrestres es lo mismo solo que se pueden regar con maacutes frecuencia pero sin mantenerlas saturadas (OSPINA y DRESSLER 1979) Seguacuten DUMOIS (2007) el agua es lo maacutes difiacutecil de controlar ya que depende de muchas variables como por ejemplo humedad relativa tipo de sustrato intensidad luminosa temperatura y circulacioacuten de aire Ademaacutes muchas orquiacutedeas necesitan un periacuteodo de receso vegetativo que si no es respetado resulta en ausencia de floracioacuten En general hay que antildeadir agua en abundancia cuando la planta se encuentra en crecimiento activo y reducirla despueacutes de la floracioacuten
8
Las especies con pseudobulbos almacenan agua y estaacuten preparadas para su periacuteodo de receso Otras que no cuentan con estos oacuterganos requieren de humedad maacutes constante 222 Luz Ninguna planta puede crecer sin la iluminacioacuten adecuada Muchas orquiacutedeas viven en las alturas de los aacuterboles y estaacuten expuestas a plena luz del sol otras crecen en el suelo selvaacutetico protegidas del sol por espesos follajes (ROLLKE 2005) La funcioacuten principal de la luz es activar el proceso de fotosiacutentesis Los cultivadores han estudiado la luz y han descubierto que hay orquiacutedeas que florecen con diacutea largo y otras con diacutea corto (OSPINA y DRESSLER 1979) Gracias a la fotosiacutentesis se convierten los minerales presentes en el ambiente en savia y nutrientes Hojas oscuras y falta de floracioacuten indican falta de luz hojas amarillas e incluso quemadas apuntan hacia un exceso de sol (DUMOIS 2007) 223 Fertilizacioacuten Las orquiacutedeas necesitan los mismos nutrientes que otras plantas Un abono para orquiacutedeas debe contener los nutrientes principales nitroacutegeno (N) foacutesforo (P) y potasio (K) asiacute como tambieacuten oligoelementos como hierro (Fe) magnesio (Mg) zinc (Zn) estantildeo (Sn) y manganeso (Mn) (ROLLKE 2005) Por otra parte la fertilizacioacuten depende de varios factores dentro de los cuales los maacutes criacuteticos son
- El medio utilizado - La edad de las plantas - Estado de las plantas ya sea floracioacuten crecimiento reposo
En cuanto a absorcioacuten se ha demostrado que es igual de eficiente por viacutea foliar como a traveacutes de las raiacuteces Es necesario tener en cuenta algunas reglas baacutesicas a la hora de fertilizar las orquiacutedeas (Asociacioacuten Costarricense de Orquideologiacutea ACO 1970)
1 Regar las plantas antes de fertilizar 2 Fraccionar las dosis 3 Aplicar el fertilizante de forma liacutequida 4 No usar fertilizantes soacutelidos 5 No fertilizar las plantas recieacuten plantadas 6 No fertilizar plantas en reposo 7 No abonar plantas enfermas
224 Temperatura Es conocido el hecho de que cada planta tiene liacutemites de temperatura dentro de los cuales prospera o perece De ahiacute la necesidad de conocer las temperaturas correspondientes al lugar de donde viene cada especie de orquiacutedea pudiendo proporcionarle la temperatura adecuada (OSPINA y DRESSLER 1979) Se puede clasificar a las orquiacutedeas como de clima caacutelido (temperatura nocturna miacutenima de 20ordmC) templado (miacutenimo de 13 a 18ordmC) y de ambiente friacuteo (de 10 a 13ordmC) (DUMOIS 2007)
9
Seguacuten SHEEHAN (1980) las temperaturas ideales para las orquiacutedeas de origen tropical son 10ordmC en la noche y entre 21ordm - 24ordmC durante el diacutea 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas La micropropagacioacuten de orquiacutedeas estaacute en vanguardia hoy en diacutea El estudio de cultivo de tejido de orquiacutedeas se lleva a cabo en muchos laboratorios de todo el mundo (ARDITTI and ERNST 1992) 231 Biologiacutea de las semillas Las semillas de orquiacutedeas son conocidas usualmente como semillas polvo porque son minuacutesculas y contienen pocas reservas de alimento Estas semillas por lo general no germinan en el medio natural a menos que sean infectadas por un hongo micorriacutezico Este hongo abastece a las plantas joacutevenes con azuacutecares y nutrientes hasta que sean lo suficientemente grandes para fabricar su propio alimento Cuando la semilla germina produce una masa indiferenciada de ceacutelulas llamada protocormo Manteniendo las condiciones normales el protocormo continuaraacute su crecimiento por varias semanas meses o incluso antildeos dependiendo de la especie hasta que alcance la edad apropiada para producir raiacuteces y hojas En el caso de orquiacutedeas terrestres es de vital importancia que la relacioacuten orquiacutedea-hongo se conserve durante los estados tempranos del ciclo de vida de la planta ya que el protocormo enterrado no puede fabricar alimento por siacute mismo Por otro lado los protocormos de las orquiacutedeas epiacutefitas son comuacutenmente verdes lo que les posibilita producir parte de su alimento La relacioacuten orquiacutedea-hongo no ha sido en su totalidad investigada para el caso de las orquiacutedeas tropicales (McKENDRICK 2000) 232 Germinacioacuten simbioacutetica y no simbioacutetica de semillas Mediante la germinacioacuten in vitro las semillas germinan en frascos de vidrio o plaacutestico Estos frascos contienen en su interior un medio nutritivo solidificado con agar con todos los azuacutecares y minerales necesarios para la germinacioacuten y crecimiento de las semillas Hay dos tipos de germinacioacuten la simbioacutetica y la asimbioacutetica En la germinacioacuten simbioacutetica las semillas se siembran junto con una pequentildea cantidad del hongo micorriza adecuado Dicho hongo crece en el medio coloniza a las semillas que estaacuten en proceso de germinacioacuten y se produce una relacioacuten simbioacutetica la cual alimentaraacute al protocormo hasta que este sea capaz de producir sus hojas y se vuelva autotroacutefico Esta teacutecnica es usada principalmente en propagacioacuten de orquiacutedeas terrestres en zonas templadas La germinacioacuten asimbioacutetica se usa principalmente en propagacioacuten de orquiacutedeas tropicales que crecen maacutes raacutepido que sus parientes de zonas templadas Para este tipo de germinacioacuten se necesita un medio de cultivo maacutes complejo ya que todos los nutrientes orgaacutenicos e inorgaacutenicos asiacute como tambieacuten los azuacutecares deben estar en forma disponible pues no existe la intermediacioacuten del hongo (McKENDRICK 2000) 233 Condiciones de esterilidad Tanto para la germinacioacuten simbioacutetica como para la asimbioacutetica es de vital importancia que los frascos las semillas aparatos y el medio esteacuten esteacuteriles desde el principio del proceso Esto debido a que cualquier hongo o bacteria que se introduzca creceraacute maacutes raacutepido que las semillas ocupando su espacio hasta matarlas Esto se evita gracias al autoclave el cual regulado a 12 atm y 120ordmC por 20 minutos mata hongos o bacterias presentes en el medio (McKENDRICK 2000)
10
2331 Siembra de las semillas Las semillas pueden ser recolectadas desde caacutepsulas verdes o maduras La caacutepsula verde que estaacute madurando estaacute llena de semillas y no se deforma cuando se aprieta con las pinzas Estas semillas pueden ser almacenadas por algunas semanas en un lugar refrigerado con bastante aireacioacuten Las semillas se pueden sembrar a partir de caacutepsulas verdes o semillas secas A continuacioacuten se muestran las ventajas y desventajas de ambos meacutetodos
- Siembra a partir de caacutepsulas verdes Si las caacutepsulas se mantienen intactas el interior (las semillas) se mantiene esteacuteril Por lo tanto si se esteriliza la parte exterior de las mismas donde hongos y bacterias pueden desarrollarse y se abren las caacutepsulas bajo condiciones esteacuteriles y las semillas podraacuten mantenerse desinfectadas
La ventaja de este meacutetodo es que no se requiere de esterilizacioacuten de las semillas lo que provoca su deterioro Otro punto a favor es que algunas semillas podriacutean germinar maacutes raacutepido que las provenientes de caacutepsulas maduras por los mecanismos de dormancia La desventaja es que en este caso todas las semillas deben ser utilizadas o eliminadas mientras que las semillas maduras se pueden almacenar Tambieacuten se debe considerar que las semillas sembradas a partir de caacutepsulas que no han madurado lo suficiente podriacutean germinar lentamente o simplemente no germinar - Siembra a partir de semillas secas En este caso una vez que la caacutepsula es abierta las semillas dejan de ser esteacuteriles y requieren de un proceso de esterilizacioacuten Comuacutenmente se utiliza una solucioacuten de hipoclorito de sodio hipoclorito de calcio o peroacutexido de hidroacutegeno Las semillas se agitan dentro de la solucioacuten que ademaacutes contiene una gota de detergente para ldquohumedecerlasrdquo luego se las enjuaga con agua destilada y se las siembra en el medio preparado La ventaja de este meacutetodo es que las semillas pueden ser colectadas secadas al aire almacenadas por varios meses en el refrigerador y utilizarlas cuando sea necesario Se debe considerar que la siembra ya sea de caacutepsulas verdes o de semillas secas estaacute determinado por la eacutepoca en que se colectan (McKENDRICK 2000) 234 Trasplante En la caacutemara de incubacioacuten las plaacutentulas se han desarrollado en condiciones limpias y en un ambiente cerrado por lo que deben acostumbrase gradualmente al ambiente exterior antes de ser trasplantadas a las macetas Tambieacuten la temperatura y la luz la cual es baja han sido constantes durante el cultivo in vitro En el medio natural la temperatura y la luz variacutean constantemente por lo que las nuevas plantas deben estar protegidas de la fuerte luz solar la cual puede quemar las hojas con soacutelo una pequentildea cantidad de eacutesta La humedad en los frascos es alta y las plantas estaacuten protegidas de ataques por hongos o bacterias Ademaacutes las plaacutentulas han crecido bajo condiciones de alta humedad y por lo tanto tendraacuten cutiacuteculas deacutebiles por lo que necesitan acostumbrase a medios menos huacutemedos antes de ser transplantadas
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Para el trasplante se deben colocar los frascos en un lugar protegido de la lluvia para que se aclimaticen a las nuevas condiciones de luz y temperatura Se deben dejar por 2 a 4 semanas en los frascos tapados Luego se debe ir aflojando las tapas para dejar entrar pequentildeas cantidades de aire hasta el punto de dejarlas descubiertas Se debe revisar si hay hojas marchitas y ver que el sustrato esteacute huacutemedo
Lo ideal es dejarlas sin tapa durante una semana antes de pasarlas a las macetas Para el trasplante se debe elegir un sustrato adecuado para el tipo de planta humedecerlo y transplantar las plantas con cuidado de no dantildear las raiacuteces y evitando la deshidratacioacuten En esta etapa tambieacuten se debe dejar las macetas selladas para evitar una raacutepida deshidratacioacuten e ir abrieacutendolas paulatinamente (McKENDRICK 2000)
24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas 241 Orquiacutedeas terrestres 2411 Cypripedium Esta es una orquiacutedea terrestre de zonas templadas se desarrolla en el Hemisferio Norte como por ejemplo en Guatemala y en Honduras pero donde se encuentra principalmente es en China Su forma maacutes comuacuten de propagacioacuten es in vitro a partir de semillas La forma maacutes eficiente es a partir de semillas inmaduras Existe un intervalo de tiempo entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten eacuteste dependeraacute de la especie y de la zona donde se desarrolle Se asume que existen aproximadamente cuatro semanas entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten El oacuteptimo para una buena germinacioacuten de Cypripedium es entre 42 y 60 diacuteas despueacutes de la polinizacioacuten y entre 14 y 32 diacuteas despueacutes de la fertilizacioacuten La germinacioacuten ocurre entre la segunda y cuarta semana despueacutes de ser sembradas y los protocormos deberiacutean ser cambiados de medio de cultivo cada dos a cuatro meses si no se corre el riesgo de sufrir agotamiento de nutrientes Los rizomas y las raiacuteces se empiezan a desarrollar a partir de los siete meses para luego dar lugar a las primeras hojas Para obtener un buen transplante se deben tener raiacuteces de miacutenimo un centiacutemetro de largo El desarrollo de raiacuteces se ve potenciado al tener un periacuteodo corto de bajas temperaturas (10degC) exposicioacuten a la luz reduccioacuten en la concentracioacuten de iones del medio de cultivo o transferirlas a un compost esteacuteril Al tener raiacuteces suficientes y el tamantildeo adecuado se podraacuten llevar las plantas al lugar donde creceraacuten definitivamente En el momento del transplante las plantas son muy susceptibles al desecamiento por lo cual lo ideal es que los brotes sean maacutes chicos que las raiacuteces El mejor sustrato seriacutea aquel donde crece naturalmente la orquiacutedea (RAumlNNBAumlCK 2007) 2412 Preservacioacuten in vitro de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes Este estudio fue hecho para establecer que parte de tejido es viable para la micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes del noreste de Europa pudiendo asiacute reestablecer dichas orquiacutedeas a sus aacutereas correspondientes La propagacioacuten in vitro de orquiacutedeas
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terrestres de clima templado es maacutes difiacutecil que las orquiacutedeas epiacutefitas de clima subtropical y tropical Las orquiacutedeas terrestres tienen requerimientos maacutes estrictos que las epiacutefitas y se conoce menos sobre sus necesidades especiacuteficas (VAASA y ROSENBERG 2004) En Estonia existen 36 especies de orquiacutedeas terrestres pero solo tres estaacuten bajo proteccioacuten Dactylorhiza baltica Dactylorhiza ruthei Dactylorhiza praetermissa Como explantes para este estudio en el caso de D baltica se ocuparon protocormos en los otros dos casos se utilizaron semillas semi maduras las cuales fueron colectadas siete y diez semanas despueacutes de ser polinizadas Para D baltica se ocupoacute el medio Murashige y Skoog suplementado con 05 mgL de aacutecido naftaleacuten aceacutetico (ANA) y 2 mgL de isonpentenyl adenina Para el caso de las semillas semi maduras se ocuparon los medios de Lindemann de Heller de Norstog y de Murashige y Skoog como control
La composicioacuten del medio y la madurez de las semillas influye mucho en el desarrollo de las orquiacutedeas in vitro Se ha demostrado que se necesita una alta concentracioacuten de microelementos para obtener una correcta germinacioacuten de las semillas Tambieacuten se puede decir que los primeros tres meses son los de mayor crecimiento luego de este tiempo el crecimiento se vuelve maacutes lento (VAASA y ROSENBERG 2004)
Luego de cuatro semanas de crecimiento de D baltica el 60 de los explantes de meristemas apicales empezaron a crecer en cambio los de meristemas laterales no expresaron ninguacuten tipo de crecimiento Las raiacuteces empezaron su desarrollo luego de dos meses despueacutes de la siembra
En el caso de D ruthei y D praetermissa la germinacioacuten se produjo despueacutes de dos meses desde la inoculacioacuten Luego de cuatro y seis meses el mayor crecimiento fue observado en el medio Norstog superando en 14 al medio testigo Murashige y Skoog (VAASA y ROSENBERG 2004)
2413 Longevidad de semillas de orquiacutedeas terrestres Por lo general las orquiacutedeas producen muchas pero pequentildeas semillas que contienen muy pocas reservas de alimento Dichas semillas estaacuten estructuralmente adaptadas para ser dispersadas por el viento pero poco se sabe del destino de eacutestas luego de ser dispersadas Algunos estudios de viabilidad de semillas indican una sobrevivencia de uno a dos antildeos en orquiacutedeas de clima templado Las semillas que son guardadas en laboratorio duran mucho maacutes tiempo Se estudioacute la viabilidad de siete especies de orquiacutedeas norteamericanas dentro de las cuales se encuentran Goodyera pubescens y Liparis liliifolia Las semillas de eacutestas se colocaron en bolsas con suelo y sustratos de bosques provenientes de sus haacutebitats naturales (WHIGHAM et al 2005) En Goodyera pubescens la mayoriacutea de las semillas germinaron en un antildeo Cuatro otras especies germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero algunas semillas no germinadas despueacutes de siete antildeos seguiacutean siendo viables En la especie Liparis liliifolia semillas que han estado cuatro antildeos bajo observacioacuten han tenido una tasa de
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germinacioacuten de un 68 al ser sembradas in vitro junto con el hongo micorriacutezico adecuado Las dos especies restantes no germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero las semillas fueron evaluadas como intactas y testeadas positivamente en cuanto a su viabilidad despueacutes de cuatro antildeos en el suelo Estas observaciones fueron interpretadas como diferentes estrategias para especies especiacuteficas de germinacioacuten in situ (WHIGHAM et al 2005) 2414 Sobrevivencia de orquiacutedeas terrestres transplantadas a sectores urbanos La conservacioacuten de poblaciones de orquiacutedeas silvestres depende del establecimiento de las orquiacutedeas propagadas a los campos Sin embargo se conoce muy poco de los factores bioacuteticos que influencian el establecimiento de orquiacutedeas terrestres a sus haacutebitats naturales Un experimento fue establecido para medir la sobrevivencia de seis especies durante su primer periacuteodo de crecimiento seguido del transplante a un sector urbano en Australia (SCADE et al 2006)
Las orquiacutedeas germinadas simbioacuteticamente crecieron en laboratorio durante cinco meses antes de establecer la plantacioacuten en sitios adyacentes con alta o baja cobertura de malezas Existioacute una muerte gradual de las plaacutentulas durante el primer periacuteodo de crecimiento primeramente por ataque de insectos no siendo evitado por la presencia de una malla cobertora Los iacutendices de sobrevivencia variacutean desde 49 para Microtis media una especie capaz de crecer en un ambiente atiacutepico hasta un 21 para Caladenia arenicola la orquiacutedea nativa maacutes comuacuten de esos sitios Sin embargo no todas las orquiacutedeas sobrevivientes producen tubeacuterculos por lo que la tasa de sobrevivencia despueacutes del primer periacuteodo seco disminuye
La sobrevivencia de las orquiacutedeas sembradas no puede ser comparada con orquiacutedeas de la misma especie que crecieron en los mismos lugares ya que no existioacute la presencia del hongo compatible para estas orquiacutedeas (SCADE et al 2006)
2415 Micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres En India dos orquiacutedeas muy importantes para la horticultura del geacutenero Anoectochilus fueron exitosamente propagadas Noacutedulos aislados de A sikkimensis colectadas en Himalaya y A regalis colectadas en India fueron cultivadas in vitro durante 12 semanas para obtener un maacuteximo de 48 a 56 protocormos y brotes obteniendo como resultado un 95 y 98 de eficiencia respectivamente Durante el repicado de los explantes in vitro de A regalis se observoacute que el nuacutemero total de brotes obtenidos a partir de noacutedulos fue 214 asiacute como tambieacuten 82 puntas de brotes En cambio para A sikkimensis fueron mucho maacutes bajos 123 y 43 respectivamente teniendo un crecimiento maacutes lento pero plantas maacutes fuertes Las raiacuteces de 4 a 6cm crecieron con la presencia de NAA (270 microM ) en el medio asiacute como tambieacuten con carbono activado (02) Durante la aclimatacioacuten la tasa de establecimiento fue entre 95 y 98 Luego de seis meses en invernadero las plantas de A regalis fueron transferidas a bosque nativo donde se obtuvo una tasa de
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sobrevivencia de entre 70 y 95 despueacutes de 12 meses Estas plantas establecidas en bosque nativo estaacuten libres de cualquier defecto morfoloacutegico y de crecimiento (GANGAPRASAD et al 2000) 242 Orquiacutedeas epiacutefitas Estas orquiacutedeas viven en los aacuterboles pero no obtienen de eacuteste su alimento no son paraacutesitas 2421 Preservacioacuten de Cattleya walkeriana usando propagacioacuten in vitro El geacutenero Cattleya se encuentra en Meacutexico y Ameacuterica Central asiacute como tambieacuten en Venezuela Colombia y las laderas de los Andes Esta orquiacutedea tambieacuten se encuentra en varias regiones del Brasil creciendo en aacuterboles rocas cerca de riacuteos lagos y pantanos Las flores de esta orquiacutedea son conocidas debido a su hermosura y a causa de la destruccioacuten de su haacutebitat y a la excesiva coleccioacuten de eacutestas se encuentra en extincioacuten
La composicioacuten del medio de cultivo es esencial para la propagacioacuten in vitro ya que suple todos los nutrientes necesarios para el desarrollo y seraacute distinto dependiendo de cada especie en este caso se utilizoacute la mitad de los macronutrientes del medio Muchos autores sugieren el uso de carboacuten activado en el medio ya que por lo general en muchas especies aumenta el desarrollo de las raiacuteces En este estudio se probaron distintas dosis de carboacuten activado 1 2 4 y 6gL con un pH de 6 (TADEU DE FARIA et al 2002) Las semillas se obtuvieron de flores artificialmente polinizadas en invernadero Plaacutentulas de aproximadamente un centiacutemetro fueron seleccionadas y cultivadas nuevamente en el medio de cultivo Murashige y Skoog pero esta vez con las diferentes dosis de carboacuten activado Se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces el nuacutemero de brotes y el peso de la materia verde total Durante el autoclavado se produce normalmente una hidroacutelisis de sacarina la cual es de 10 aproximadamente este porcentaje aumenta considerablemente al agregar un 1 de carboacuten activado llegando a ser de 95
El desarrollo de las plaacutentulas de C walkeriana aumentan con una mayor concentracioacuten de carboacuten activado asiacute como tambieacuten un mayor tiempo de cultivo El resultado fue que la dosis ideal para el desarrollo de esta orquiacutedea es 2gL de carboacuten activado (TADEU DE FARIA et al 2002) 2422 Establecimiento de cultivos in vitro y micropropagacioacuten de Cattleya aurantiaca (Bateman ex Lindl) Por medio de siembra in vitro se logroacute el establecimiento de C aurantiaca con alto porcentaje de germinacioacuten y desarrollo de protocormos Para la oacuteptima formacioacuten de callo y para la proliferacioacuten de protocormos se determinaron los medios oacuteptimos (MS 10 mgL ANA 10 mgL BA) asiacute como tambieacuten de manera directa sobre explantes de hoja y pseudobulbos (MS 01 mgL ANA 01 mgL GA3)
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Con este uacuteltimo medio tambieacuten se logroacute una oacuteptima regeneracioacuten y desarrollo de plaacutentulas Los medios liacutequidos (sin agitacioacuten) son una buena opcioacuten para conseguir la produccioacuten masiva de protocormos ya que con ellos se optimizoacute la micropropagacioacuten de C aurantiaca Las plaacutentulas micropropagadas presentaron alto porcentaje de sobrevivencia y buen desarrollo despueacutes de su trasplante y aclimatacioacuten lo cual demuestra que es un buen sistema de propagacioacuten para C aurantiaca (GUTIERREZ y SALGADO 2007) En cuanto a transplante y aclimatacioacuten despueacutes de 45 diacuteas de desarrollo in vitro las plaacutentulas de un tamantildeo entre 3 y 5 cm con raiacuteces bien desarrolladas fueron llevadas a condiciones ex vitro eliminando los restos de medio de cultivo con agua potable y ocupando un sustrato de partes iguales de tezontle y corteza de encino cubierta con hojarasca de encino finamente molida Se mantuvieron cubiertas durante 15 diacuteas abriendo cada dos diacuteas hasta poder retirar la tapa en 30 diacuteas Despueacutes de dos meses de haber sido retiradas del cultivo in vitro las plaacutentulas presentaron 70 de sobrevivencia y alcanzaron una altura de hasta 7 cm presentando nuevas hojas y raiacuteces las plantas se muestran vigorosas y capaces de continuar su crecimiento en condiciones ambientales de invernadero (GUTIERREZ y SALGADO 2007)
2423 Establecimiento in vitro y regeneracioacuten de plantas de Laelia autumnalis (Llave y Lex) Lindl Para este estudio se obtuvieron las semillas de una caacutepsula desarrollada despueacutes de 6 meses de la floracioacuten las cuales se sembraron in vitro sin presentar contaminacioacuten ya que la siembra por este meacutetodo es muy eficiente en comparacioacuten al cultivo de semillas libres donde algunas veces se presenta la contaminacioacuten Las observaciones se realizaron cada 15 diacuteas la germinacioacuten se detectoacute en los primeros 15 diacuteas en la mayoriacutea de los medios de cultivos probados con la presencia de protocormos de 1mm de diaacutemetro (HUAPEO y SALGADO 2004) El porcentaje de germinacioacuten que se obtuvo de las semillas cultivadas in vitro de L autumnalis fue de 95 a 100 en todos los medios de cultivo la uacutenica diferencia fue el tiempo entre las germinaciones A excepcioacuten de las semillas cultivadas en el medio MS 100 la germinacioacuten del 100 se obtuvo hasta los 30 diacuteas de cultivo mientras que en el primero la germinacioacuten fue a los 15 diacuteas del cultivo Las plaacutentulas con raiacutez y un par de hojas se lograron a los 90 diacuteas de cultivo en el medio MS 100 alcanzando 07 mm de altura Estas plaacutentulas fueron subcultivadas en medio MS con 05 mgl de ANA y 01 mgl de GA3 para tener plaacutentulas fuente de explante (segmentos de hojas) un medio oacuteptimo de desarrollo de plaacutentulas de L speciosa No fue necesario probar otros medios de cultivos ya que se hicieron pruebas anteriores que demostraron que era el adecuado
Las plaacutentulas de 6 meses de cultivo in vitro despueacutes de su germinacioacuten presentaron una altura promedio de 5 cm con raiacuteces con velamen y hasta dos pares de hojas Segmentos de hoja de eacutestas fueron cultivadas en el medio MS conteniendo ANA BA y GA3 en diferentes concentraciones y se realizaron observaciones cada 30 diacuteas para determinar medios inductores de callo protocormos y raiacuteces La mejor respuesta en formacioacuten de callo fue observada en los segmentos de hoja de plaacutentulas de L autumnalis cultivados en MS con 1 mgl de ANA BA y GA3 iniciando la induccioacuten de
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eacuteste desde los 30 diacuteas de cultivo solamente en un 70 de los explantes cultivados El 100 se logroacute a los 90 diacuteas de cultivo observando callo abundante alrededor de todo el tejido de color blanco con puntos pigmentados de color verde La regeneracioacuten de protocormos de esta orquiacutedea se establecioacute con la siembra de segmentos de hoja de plaacutentulas de 6 meses de edad de manera directa o a partir de callos En callos la produccioacuten fue oacuteptima en el medio MS con 01 mgl de ANABAGA3 ya que a los 60 diacuteas se obtuvieron 50 protocormos por segmento de callo Solamente se produjeron 10 protocormos por explante al cultivarse los segmentos de hoja en MS con 01 mgl de ANABAGA3 a los 120 diacuteas de cultivo (HUAPEO y SALGADO 2004) 25 Aclimatacioacuten Aclimatacioacuten significa que el hombre intercede y guiacutea el proceso de acondicionamiento de las plantas hasta que eacutestas sean aptas para crecer en el campo yo invernadero
Un alto nuacutemero de plantas micropropagadas no sobreviven al cambio desde el cultivo in vitro hacia el ambiente exterior ya sea en campo o invernadero Eacutestos dos uacuteltimos tienen menor humedad relativa niveles maacutes altos de luminosidad y un ambiente seacuteptico los cuales son maacutes estresantes para las plantas micropropagadas La mayoriacutea de las especies que crecen in vitro necesitan un proceso de aclimatacioacuten pudiendo obtener asiacute un nuacutemero suficiente de plantas vivas y vigorosas para trasplantar al suelo (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991)
La aclimatacioacuten no es uacutenicamente para micropropagacioacuten siendo usada ademaacutes en propagacioacuten convencional durante antildeos Despueacutes de cortar las hojas y de haber formado raiacuteces por lo general son aclimatadas antes de ser llevadas al campo o invernadero Ejemplos de dos teacutecnicas comunes son bajar gradualmente la humedad y mantener el nivel de luz con un 50 de sombra antes de trasladarlos al campo Las raiacuteces que han sido cortadas y mal limpiadas muchas veces son focos de infeccioacuten En estos casos las plantas muestran signos de marchitez hojas necrosadas y tambieacuten se puede llegar a la muerte de eacutestas El cultivo in vitro reduce la necesidad de fotosiacutentesis ya que las condiciones de la caacutemara de incubacioacuten proveen a la planta de sacarosa u otro azuacutecar Tambieacuten en estas condiciones se reduce el stress por patoacutegenos al ser un ambiente aseacuteptico Todo esto se traduce en que las plantas micropropagadas no son aptas para el campo yo invernadero (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 251 Stress hiacutedrico El stress hiacutedrico puede ser el resultado de una excesiva transpiracioacuten de las diferentes partes aeacutereas de las plantas especialmente de las hojas o por una inadecuada absorcioacuten de agua por parte de las raiacuteces La cutiacutecula y los estomas son la ruta primaria de peacuterdida de agua desde de las hojas provenientes de esta teacutecnica reproductiva 2511 Cutiacutecula La cutiacutecula es una membrana compuesta por una matriz de cutina que a su vez se encuentra cubierta en su superficie por ceras cuya funcioacuten primaria consiste en limitar la peacuterdida de agua por transpiracioacuten La permeabilidad del agua a traveacutes de la cutiacutecula se ve influenciada principalmente por la estructura y la cantidad de
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ceras cuticulares y epicuticulares no vieacutendose afectada la peacuterdida de agua por el grosor de eacutesta o la naturaleza quiacutemica de la matriz de la cutina La estructura cristalina de la parte encerada de las hojas es distinta en las plantas micropropagadas con respecto a las plantas que crecen en el campo La cera epicuticular de las hojas de plantas in vitro tienen una proporcioacuten maacutes alta de esteres y de componentes polares por el contrario tienen unas cadenas de hidrocarbonos mucho maacutes cortas Esto hace que las plantas in vitro pierdan maacutes agua que las cultivadas en campo o invernadero
Las plantas que han crecido en el campo son naturalmente de color verde pero el color de las plantas cultivadas in vitro es diferente y se puede ver a simple vista Las plantas que son pasadas a invernadero y que tengan un color verde se aclimatan de mejor forma al ambiente exterior (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 2512 Estomas La estructura estomaacutetica y su funcionamiento han sido implicados recurrentemente en el desbalance de agua exhibido por plantas micropropagadas al momento de ser removidas del cultivo in vitro Estudios con microscopiacutea de scanner electroacutenico han indicado que la estructura estomaacutetica presente en algunas especies de plantas cultivadas in vitro difieren marcadamente de las cultivadas en invernadero o en el suelo Debido a que las primeras presentan estomas de mayor tamantildeo y maacutes redondos a diferencia de las plantas cultivadas de manera normal que presentan estomas maacutes pequentildeos y eliacutepticos lo que resulta en una deshidratacioacuten maacutes raacutepida en el caso de las provenientes de cultivo in vitro (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 252 Humedad Debido a la anatomiacutea y la condicioacuten fisioloacutegica de las plantas desarrolladas in vitro donde se ha mantenido una alta humedad relativa es necesario regar al momento del traslado para obtener una alta sobrevivencia Muchos laboratorios aseguran que hay que evitar tener un sistema de aspersioacuten ya que se produce el ambiente necesario (muy huacutemedo) para la aparicioacuten de hongos algas o bacterias Otros meacutetodos incluyen el uso de humidificadores o poner las macetas en un lugar cerrado donde se retenga vapor para esto se pueden usar por ejemplo tapas de polietileno Este meacutetodo es relativamente econoacutemico pero se debe tener control del calor y monitorear la falta de agua (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 253 Luz Durante la etapa in vitro las plantas estaacuten expuestas a altos niveles de luminosidad lo que se traduce en hojas delgadas Antes del traslado se recomienda mantener las plantas con un 50 de sombra para asiacute poder aclimatarlas de mejor manera esto debido a que las plantas micropropagadas tienen un bajo control sobre la transpiracioacuten y un inadecuado mecanismo de fotosiacutentesis La sombra reduce la transpiracioacuten evitando excesivas peacuterdidas de agua asiacute como tambieacuten el exceso de luz destruye las moleacuteculas de clorofila Luego del periacuteodo bajo sombra se deben mover las macetas gradualmente hacia el nivel de luz al cual seraacute llevado para su crecimiento final (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 254 Temperatura La temperatura del aire y del medio o sustrato de crecimiento estaacute generalmente controlado durante el periacuteodo de aclimatacioacuten El calor es necesario en los meses de invierno y el friacuteo (enfriar) es esencial en los meses de verano Ajustando la cantidad de sombra y humedad se obtiene un control sobre la temperatura El
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enfriamiento se puede obtener gracias a ventilacioacuten abanicos niebla o aire acondicionado El calor puede provenir del sistema existente en el edificio o invernadero donde esteacuten ubicadas las macetas o por las laacutemparas ocupadas para el control del fotoperiacuteodo El rango de temperatura que se mantiene por lo general es entre los 13 y 30ordmC y esta determinado principalmente por la especie en cuestioacuten La temperatura de la zona donde se encuentran las raiacuteces es muy importante para el crecimiento lo ideal es que dicho sector tenga una mayor temperatura que el aire fomentando el crecimiento de las raiacuteces e incrementando la humedad alrededor de la planta Durante el verano esto es difiacutecil de obtener ya que la temperatura del aire es muy alta debido a la alta radiacioacuten solar Terminado el proceso de aclimatacioacuten esto ya no es necesario (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 255 Fotosiacutentesis Las plantas sufren un cambio radical cuando son removidas desde cultivo in vitro ya que son forzadas a cambiar de heterotroacuteficas a autotroacuteficas y la fotosiacutentesis se vuelve fundamental para la sobrevivencia Las hojas de las plantas in vitro no estaacuten formadas para hacer fotosiacutentesis ya que en la caacutemara de incubacioacuten no se produce un fuerte intercambio gaseoso esto debido a que la sacarosa es entregada a traveacutes del medio de cultivo Las hojas de las plantas que son trasladadas al campo o invernadero sufren deterioro debido a que no estaacuten formadas para la fijacioacuten de carbono Esto se produce por un tiempo aproximado de cuatro semanas despueacutes de las cuales las hojas nuevas suplen a las viejas Otro punto es que las hojas de las plantas cultivadas in vitro contienen menor proporcioacuten de clorofila que las plantas que han crecido normalmente en el campo En un estudio de coliflor cultivado in vitro se midioacute el CO2 y se obtuvo un balance negativo el cual se mantuvo durante dos semanas despueacutes del transplante Algo similar ocurrioacute con frutilla despueacutes del transplante las hojas se deterioraron raacutepidamente lo que quiere decir que no hubo incremento en la fijacioacuten de carbono indicando falta de desarrollo en la competencia fotosinteacutetica
El bajo nivel de CO2 durante el cultivo in vitro limita el proceso de fotosiacutentesis lo cual se puede compensar usando sacarosa en el medio de cultivo Tambieacuten se puede incrementar el nivel de luz y CO2 obteniendo un fuerte aumento en el crecimiento de varias especies como orquiacutedeas clavel etc (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 256 Sustrato Un sustrato es todo material soacutelido distinto del suelo natural mineral u orgaacutenico que colocado en un contenedor en forma pura o en mezcla permite el anclaje del sistema radicular de la planta desempentildeando por lo tanto un papel de soporte para la planta El sustrato puede intervenir o no en el complejo proceso de la nutricioacuten mineral de la planta (INFOAGRO 2007) El sustrato y los contenedores dentro de los cuales se van a transplantar las plaacutentulas in vitro son importantes para una buena sobrevivencia
Los sustratos ejercen una influencia significativa en la arquitectura del sistema radical de las plantas y en las asociaciones bioloacutegicas de este con el suelo influenciando el
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estado nutricional y la translocacioacuten de agua en el sistema suelo-planta-atmoacutesfera Uno de los requisitos fundamentales que debe cumplir el sustrato para su utilizacioacuten es la sanidad Cuando estos no se elaboran almacenan o manejan correctamente pueden contaminarse y provocar serios dantildeos a las plantas durante la aclimatacioacuten por esta razoacuten son preferidos como componentes para su elaboracioacuten materiales inertes o aquellos en las cuales el proceso de obtencioacuten garantice la mayor desinfeccioacuten posible
Uno de los factores de mayor importancia a la hora de seleccionar los materiales que pueden constituir el sustrato es su disponibilidad tanto en teacuterminos de facilidad de obtencioacuten o suministro como de su costo (VILCHEZ et al 2007)
La presencia de inhibidores o tambieacuten cambios en el pH del sustrato pueden afectar el crecimiento de las raiacuteces y consecuentemente el eacutexito del transplante
Muchos laboratorios y viveros transplantan a un sustrato uniforme debiendo ser eacuteste adecuado en cuanto a soporte de las plantas pH porosidad aireacioacuten y drenaje (DEBERGH y ZIMMERMAN 1991)
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3 MATERIAL Y MEacuteTODO
Para la realizacioacuten de este trabajo se utilizoacute el siguiente material y meacutetodo
31 Material La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio e invernadero de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal pertenecientes a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de Chile
311 Material vegetal Se utilizaron plaacutentulas de C virescens cultivadas in vitro a partir de semillas las cuales fueron proporcionadas por el laboratorio estas plaacutentulas fueron separadas y repicadas para aumentar la poblacioacuten y obtener la cantidad necesaria para el ensayo
FIGURA 2 Plaacutentulas de C virescens en caacutemara de crecimiento in vitro
312 Materiales Los materiales que se utilizaron fueron los siguientes Equipos autoclave caacutemara de flujo laminar dispensador de medios medidor
de pH agitador magneacutetico horno microondas balanza mechero termoacutemetro Materiales vasos de precipitado matraces probetas pipetas papel de
aluminio frascos de vidrio placas Petri pinzas bisturiacute macetas regadera Soluciones soluciones madre (Medio MS) gelificante etanol 70 y 95
32 Meacutetodo A continuacioacuten se da a conocer la metodologiacutea con la cual se trabajoacute 321 Preparacioacuten del medio de cultivo Para la obtencioacuten de plantas a traveacutes de la micropropagacioacuten se ocupoacute el medio basal de MURASHIGE y SKOOG (1962) tambieacuten llamado medio MS Este medio tiene un pH de entre 56-57 Posteriormente se dosificoacute con el dispensador de medios para que cada frasco tenga una cantidad adecuada (25 mL) y se llevoacute a autoclave para esterilizar a 12 atm 120ordm C por 20 min
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322 Obtencioacuten del material vegetal Al tener el medio esterilizado se procedioacute a la separacioacuten y repicado de plaacutentulas existentes en el laboratorio Las siembras se realizaron en el mes de mayo del 2007 Estas siembras se realizaron en la caacutemara de flujo laminar de modo de asegurar que la siembra sea 100 aseacuteptica Estas plaacutentulas fueron mantenidas en la caacutemara de incubacioacuten hasta obtener los tamantildeos requeridos para el ensayo donde las condiciones fueron las siguientes
minus Temperatura ambiental de 23-25ordm C minus Fotoperiacuteodo de 16 horas minus Intensidad lumiacutenica controlada de 50-55 micromol m-2s-1
323 Sustratos Se utilizaron tres tipos de sustratos el primero corresponde a una mezcla de turba + perlita (11) el segundo corresponde a Sphagnum (100) y el tercero corresponde a una mezcla de turba + arena (11) Una vez realizadas las mezclas se procedioacute a una esterilizacioacuten en un autoclave a 121ordm C por 20 minutos a 12 atmoacutesfera De esta forma se trabajoacute con material limpio y sano evitando ataque de hongos o bacterias El anaacutelisis quiacutemico de los sustratos se muestra en el Anexo 2 324 Plantacioacuten Las plaacutentulas con un promedio de cuatro meses en condiciones de caacutemara de crecimiento in vitro obtuvieron el tamantildeo adecuado para ser utilizadas Se sacaron de los frascos y se plantaron en las macetas de plaacutestico transparente con los sustratos Posteriormente fueron dejadas en la sala del laboratorio donde se debioacute asperjar con solucioacuten nutritiva Hoagland y fungicida Captan CUADRO 1 Composicioacuten de solucioacuten nutritiva Hoagland
KNO3 102 gL Ca(NO3) 4 H2 O 0492 gL
NH4H2 (PO4) 023 gL MgSO4 7 H2O 049 gL
H3BO3 286 mgL MnCl2 2 H2O 181 mgL CuSO4 5 H2O 008 mgL ZnSO4 5 H2O 022 mgL Na2MoO4 H2O 009 mgL
FeSO4 7 H2O 05 06 mL FUENTE FINCK 1988 325 Disentildeo de los ensayos Este trabajo de investigacioacuten constoacute de un ensayo con dos etapas Antes que todo se realizoacute la separacioacuten y repicado in vitro de plaacutentulas de C virescens para la obtencioacuten del nuacutemero necesario de plantas En la etapa 1 se utilizaron tres tamantildeos de plaacutentulas obtenidas in vitro de 1-2cm de 2-3cm y de maacutes de 3cm de altura que se transplantaron a tres sustratos turba + perlita 11(vv) Sphagnum (100) y turba + arena 11 (vv) La turba provino de la Sociedad
22
Minera Patagonia Peat SA en Hijuelas el Sphagnum de la empresa Lonquen Chile de Puerto Montt y la perlita se obtuvo a traveacutes del sitio web wwwjardisencl (representante legal Walter Rathgeb Penza Ingeniero Agroacutenomo Santiago) Las plaacutentulas se plantaron de acuerdo a su tamantildeo las de maacutes de 3cm se colocaron de 6 por maceta las de 2 a 3cm de a 8 por maceta y las maacutes chicas de a 10 por maceta Estas macetas fueron dejadas en una sala de aclimatacioacuten con una temperatura promedio de 20ordm C intensidad lumiacutenica de 50-55 micromol m-2s-1 y 14-16 hrs de fotoperiacuteodo Se fertilizoacute asperjando cada cinco diacuteas con solucioacuten nutritiva Hoagland Esta etapa se llevoacute a cabo durante dos meses desde el cinco de septiembre hasta el cinco de noviembre de 2007
En la etapa 2 se continuoacute el proceso de aclimatacioacuten en invernadero de las plaacutentulas obtenidas en la etapa 1 que despueacutes de dos meses teniacutean un mayor tamantildeo y se habiacutean acondicionado al ambiente exterior (fuera de la caacutemara de crecimiento) Las plantas se mantuvieron en las macetas durante tres semanas para aclimatarlas y luego las plantas sobrevivientes fueron transplantadas a macetas maacutes grandes individuales durante tres meses aproximadamente hasta el cinco de marzo 2008 Estas nuevas macetas tuvieron como sustrato turba y suelo (trumao) en igual proporcioacuten (Anexo 2) La temperatura promedio de invernadero fluctuoacute de 13 a 35 degC seguacuten el mes En enero el promedio fue de 25 (Anexo 3) Para bajar la temperatura alrededor de 5deg C se instaloacute una malla Rachel 326 Disentildeo experimental El disentildeo experimental utilizado fue completamente al azar ordenado como experimento factorial con dos factores tamantildeo (3) y sustrato (3) Cada tratamiento tuvo tres repeticiones con un miacutenimo de 6 plantas por recipiente 327 Variables a evaluar Durante los dos meses en que las macetas estuvieron en la sala de aclimatacioacuten se evaluoacute el desarrollo foliar contando el nuacutemero de hojas una vez al mes Posteriormente se trasladaron las mismas macetas a invernadero durante tres semanas para continuar con la aclimatacioacuten de las plaacutentulas Transcurrido este tiempo se transplantaron las plaacutentulas sobrevivientes a macetas individuales y continuoacute mensualmente la evaluacioacuten de eacutestas (nuacutemero de hojas) hasta la obtencioacuten de plantas establecidas Al momento del transplante y al final del ensayo se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces asiacute como tambieacuten al final del ensayo de evaluoacute el crecimiento en altura (cm) La sobrevivencia fue evaluada al final del ensayo por maceta
Tanto en la sala de aclimatacioacuten coacutemo en el invernadero se registroacute la temperatura con la ayuda de un termoacutemetro de maacutexima y miacutenima (Anexo 3) 328 Anaacutelisis estadiacutestico Una vez obtenidos los datos se procedioacute a comprobar si estos cumpliacutean con los supuestos de aleatoriedad normalidad y homogeneidad de varianzas que exige este tipo de anaacutelisis En el caso de no cumplirse estos supuestos los datos se transformaron utilizando log10(x+05) raiacutez(x+05) o 1x para normalizarlos
23
y enseguida se sometioacute los datos a un anaacutelisis estadiacutestico (ANDEVA) Posteriormente en los casos en que se observoacute diferencias significativas en el ANDEVA se aplicoacute una prueba de rangos muacuteltiples (Tukey) al 5 de significancia Para las variables no parameacutetricas que no cumplieron con los supuestos para un anaacutelisis de varianza se realizoacute la prueba de KruskalndashWallis y las comparaciones muacuteltiples a traveacutes del test de Dunn con un nivel de 5 de significancia
Se utilizaron los programas estadiacutesticos STATGRAPHICS 20 y GRAPHPAD PRISM 5 para el anaacutelisis de datos
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4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
En los siguientes puntos se discuten los resultados obtenidos en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens
En la Figura 3 se observan plaacutentulas de C virescens micropropagadas en medio MS en caacutemara de crecimiento al inicio del ensayo (A) y en invernadero despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten (B)
BA
FIGURA 3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten
A continuacioacuten se presentan los resultados obtenidos para las variables analizadas (Cuadro 2 y 3) de esta manera se pueden visualizar en general los resultados obtenidos en el proceso de aclimatacioacuten durante seis meses
CUADRO 2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de raiacuteces
inicial y final Variables
Hojas finales (nuacutemero)
Raiacuteces iniciales (nuacutemero)
Raiacuteces finales (nuacutemero)
Tamantildeo de plaacutentulas 36 24 37 47 29 46
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 61 43 76
Sustratos 53 36 56 43 29 51
Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 46 27 49
Significa que hay diferencias significativas al 95 Test de Dunn
25
Las variables no parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en hojas finales y raiacuteces iniciales en sus rangos de distribucioacuten Las raiacuteces finales no presentaron diferencias seguacuten el sustrato utilizado pero de acuerdo al tamantildeo hubo diferencias en su distribucioacuten
CUADRO 3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas
Variables Altura final de plaacutentulas
(cm) Sobrevivencia
Tamantildeo de plaacutentulas
36 c 567 b 47 b 821 a
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 59 a 908 a
Sustratos 52 a 933 a
41 ab 59 b Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 49 b 772 a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY Las variables parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en altura final de hojas y en sobrevivencia 41 Nuacutemero de hojas finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentulas y de sustratos para la variable nuacutemero final de hojas 411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula Seguacuten el Cuadro 2 y Figura 4 las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero final de hojas Las plaacutentulas pequentildeas de 1-2 cm obtuvieron el nuacutemero maacutes bajo de hojas finales con una media de 36 hojas por plaacutentula lo cual es la mitad de las hojas finales que se obtuvo con las plaacutentulas de mayor tamantildeo (61 hojas aproximado por plaacutentula) Para las plaacutentulas medianas de 2-3 cm se obtuvo una media de 47 hojas por plaacutentula (Figura 4)
26
Hojas finales
1-2 cm 2-3cm maacutes de 3 cm0
5
10
15
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn)
BLANCO (2006) sentildeala que plaacutentulas cultivadas in vitro crecen bajo condiciones especiales como alta humedad relativa y baja luminosidad ademaacutes son suplidas con sacarosa Estas condiciones fueron proporcionadas en una caacutemara de crecimiento en el laboratorio donde las plantas micropropagadas no son dependientes por completo de su fotosiacutentesis son heteroacutetrofas Parece ser necesario un estiacutemulo para convertirse en organismos totalmente capaces de sustentar sus propios requisitos de carbono y nitroacutegeno reducido pasando de esta manera a ser autoacutetrofos
Al ser sacadas de un medio in vitro las hojas no estaacuten preparadas para producir su propio alimento y sobreviven gracias a que el medio de cultivo le proporciona los nutrientes necesarios para vivir En este punto muchas de las hojas mueren y nacen hojas nuevas capaces de generar su alimento supliendo asiacute las hojas viejas (SEELYE et al 2003) En este ensayo las plaacutentulas de Chloraea virescens presentaron en general una buena adaptacioacuten al ser sacadas de un medio in vitro
Se observoacute que plaacutentulas con menor tamantildeo al ser aclimatadas y tener menor tejido fue maacutes difiacutecil y maacutes lento que empezaran a generar nuevos tejidos y materia orgaacutenica a partir de dioacutexido de carbono POSPIacuteŠILOVAacute et al (1999) sentildeala que al tener los estomas con desarrollo incompleto maacutes grandes y de forma maacutes redonda pierden maacutes agua lo cual puede provocar una peacuterdida de hojas muriendo asiacute la plaacutentula Por esta razoacuten las plaacutentulas pequentildeas se demoran maacutes tiempo en generar hojas nuevas es por ello que al finalizar este estudio muestran el menor nuacutemero final de hojas 412 Efecto del tipo de sustrato Al analizar la influencia del tipo de sustrato se encontraron diferencias significativas entre los tres sustratos utilizados Seguacuten el Cuadro 2 y la Figura 5 el sustrato donde se obtuvo mejores resultados fue
27
turba+perlita en el cual se observoacute un promedio de 53 hojas por plaacutentula siendo Sphagnum el maacutes bajo con 43 hojas por plaacutentula De acuerdo a los resultados del anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados el sustrato turba+perlita tiene mayor cantidad de nitroacutegeno foacutesforo calcio magnesio y azufre disponible comparativamente con los otros dos sustratos (Sphagnum y arena+turba) (Anexo 2)
Hojas finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
Sustratos
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) Para la brotacioacuten y el crecimiento de las plantas se necesita agua y Nitroacutegeno lo que favorece a una mayor tasa de aparicioacuten de hojas lo que se traduce en una mayor cantidad de hojas finales El Nitroacutegeno se encuentra en mayor cantidad en el sustrato turba+perlita debido a lo cual los mejores resultados se obtienen en dicho sustrato 413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Despueacutes de analizados los efectos individuales del tamantildeo y del sustrato al interactuar ambos factores existen diferencias significativas La mejor interaccioacuten se obtuvo con el sustrato turba+perlita y con el mayor tamantildeo de la plaacutentula (Figura 6) Debido a la buena estructura (porosa) de dicho sustrato se podriacutea decir que se favorecioacute la absorcioacuten radicular de nutrientes obteniendo por ello un mayor nuacutemero de hojas finales Para los menores tamantildeos no se observan diferencias significativas obteniendo como promedio 41 hojas por plaacutentula Para el mayor tamantildeo el promedio fue de 6 hojas por plaacutentula
28
Hojas finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 42 Raiacuteces iniciales Este paraacutemetro se evaluoacute luego de la primera etapa de aclimatacioacuten la cual se realizoacute en una sala de aclimatacioacuten del laboratorio Se analizoacute la influencia de diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos sobre la variable nuacutemero raiacuteces iniciales (Anaacutelisis de Kruskal-Wallis en Anexo 7)
FIGURA 7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses de pre aclimatacioacuten
29
En la Figura 7 se puede observar los resultados de pre aclimatacioacuten en sala de laboratorio En esta etapa ya es posible ver la presencia de raiacuteces desarrolladas 421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula En el Cuadro 2 se puede observar que las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero inicial de raiacuteces y en la Figura 8 se puede comprobar que para los dos tamantildeos de plaacutentula maacutes pequentildeos no se observa gran cantidad de raiacuteces esto no impidioacute el desarrollo posterior de las plaacutentulas las cuales lograron enraizar al final del estudio Esto se contrapone a lo observado en un estudio de Lapageria rosea donde la presencia de raiacutez y brote para lograr una multiplicacioacuten exitosa de plantas es de vital importancia Incluso algunas plaacutentulas de L rosea no brotan en condiciones in vitro en donde tienen las mejores condiciones nutricionales y hormonales para hacerlo Esto se debe a factores internos de la plaacutentula siendo muy difiacutecil que broten inmediatamente en caacutemara de aclimatacioacuten donde ya dejan de recibir los nutrientes necesarios de manera directa y requieren de balances de energiacutea para poder seguir elongando raiacuteces absorber nutrientes y brotar para poder obtener los carbohidratos necesarios para seguir su crecimiento (BLANCO 2006) El tamantildeo de plaacutentula tiene importancia para el desarrollo de raiacuteces se distingue notoriamente que en los tamantildeos maacutes grandes el nuacutemero de raiacuteces es mayor comparativamente con los tamantildeos pequentildeos donde el nuacutemero de raiacuteces fue escaso Debido a la presencia de maacutes hojas existe una mayor cantidad de aacuterea fotosinteacutetica esta situacioacuten estimula el crecimiento de las raiacuteces para la obtencioacuten de agua y nutrientes
Raices iniciales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
2
4
6
8
10
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o inicial de ra
iacuteces
FIGURA 8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn)
30
422 Efecto del tipo de sustrato Para el sustrato turba+perlita se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas en el nuacutemero de raiacuteces con respecto a los dos otros sustratos esto se puede ver en el Figura 9 donde se observa que se obtuvieron los mayores resultados En cualquier medio de crecimiento el espacio no ocupado por un soacutelido se llama porosidad este espacio puede ser ocupado en parte para retener agua y en parte para proporcionarle aire a las raiacuteces La ausencia de uno de estos elementos es perjudicial para las plantas La turba es conocida por tener estas propiedades y la perlita tambieacuten por esta razoacuten se sabe que la mezcla turba-perlita provee propiedades fiacutesicas excelentes como medio de crecimiento y propagacioacuten (INFOAGRO 2007) Estos resultados con turba-perlita (298 de materia orgaacutenica) coinciden con los obtenidos por DIAZ et al (2004) quienes al utilizar un sustrato compuesto por 100 de humus de lombriz para aclimatar cantildea de azuacutecar obtuvieron el mayor nuacutemero de raiacuteces Esto puede atribuirse al importante aporte de materia orgaacutenica del humus (47) lo que le confiere una mejor estructura obtenieacutendose una excelente porosidad del sustrato La aireacioacuten del suelo es necesaria para favorecer la maacutexima absorcioacuten de nutrientes por las raiacuteces Esto tambieacuten sucede en el sustrato turba+perlita el cual posee la mayor cantidad de materia orgaacutenica de los tres sustratos utilizados
Raices iniciales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
2
4
6
8
10
Sustratos
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato En los anaacutelisis para la variable nuacutemero de raiacuteces se puede decir que la mejor interaccioacuten se presentoacute para el sustrato de turba+perlita junto con el mayor tamantildeo de plaacutentulas obteniendo los valores maacutes altos entre los nueve tratamientos La presencia de raiacuteces luego de la micropropagacioacuten aumenta la posibilidad de eacutexito en el transplante ya que se crea un favorable balance de agua Pero esto no quiere
31
decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
10
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
32
En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
33
El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
34
Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
4
2 REVISIOacuteN BIBLIOGRAacuteFICA 21 Descripcioacuten general 211 Descripcioacuten geograacutefica Las orquiacutedeas pertenecen a la familia Orchidaceae clase Liliopsida (monocotiledoacuteneas) Son plantas herbaacuteceas perennes originarias de regiones tropicales y subtropicales pero existen tambieacuten en todos los continentes a excepcioacuten de las regiones polares La zona donde se encuentran estas plantas estaacute comprendida entre los 68ordm latitud norte y 56ordm latitud sur Es evidente que en los liacutemites extremos de estas latitudes se encuentran pocos geacuteneros y especies esto va en aumento desde las regiones temperadas hasta las regiones intertropicales donde el nuacutemero es el mayor Los territorios maacutes interesantes por su nuacutemero son
Ameacuterica del Sur y Ameacuterica Central Asia e India Madagascar Australia es el continente menos poblado en orquiacutedeas dentro de las regiones
del globo Por su parte Europa presenta numerosos geacuteneros y especies de orquiacutedeas
terrestres Soacutelo en Francia existen 75 especies repartidas en 16 geacuteneros todas terrestres (LECOUFLE y ROSE 1956)
212 Formas de vida Las zonas donde crecen estas plantas influyen sobre su manera de vivir Algunas orquiacutedeas son terrestres y se encuentran representadas en todas las regiones Tambieacuten existen las epiacutefitas (vegetal que fijado a otro no obtiene de eacuteste su alimento) En este caso se necesita que el grado higromeacutetrico y la temperatura permitan este tipo de adaptacioacuten Ademaacutes existen las orquiacutedeas litofiacuteticas que viven sobre rocas Las raiacuteces de las epiacutefitas y litofiacuteticas estaacuten adaptadas a vivir expuestas al aire o inmersas en materia orgaacutenica ya que tienen un tejido acumulador de agua llamado velo En zonas friacuteas y templado friacuteas todas las orquiacutedeas son terrestres En zonas subtropicales o tropicales la gran mayoriacutea es epiacutefita Otra particularidad debida seguramente a la influencia de estas zonas es la floracioacuten Es en las zonas tropicales y subtropicales que se dan los mayores tamantildeos de flores asiacute como tambieacuten la mayor variedad de colores (LECOUFLE y ROSE 1956)
213 Descripcioacuten morfoloacutegica Las orquiacutedeas se caracterizan por poseer flores muy vistosas hermafroditas (ambos sexos en la misma flor) zigomorfas (con un solo plano de simetriacutea) triacutemeras (tres seacutepalos y tres peacutetalos) y una columna central que sustenta las estructuras reproductivas masculinas anteras y femeninas pistilo llamada ginostemo El peacutetalo inferior se llama labelo y su morfologiacutea define a los distintos geacuteneros de orquiacutedeas Las flores pueden ser aisladas o en inflorescencia y son polinizadas por insectos El polen se encuentra aglomerado formando una masa llamada polinio el que tiene un extremo con un ensanchamiento glandular pegajoso que sirve para que el
5
polinio se adhiera al cuerpo del insecto polinizador El fruto es una caacutepsula seca con muchas semillas pequentildeas sin endosperma y con embrioacuten no diferenciado Tienen dos tipos baacutesicos de crecimiento Simpodial en las que el nuevo crecimiento se produce en sentido horizontal a partir de un tallo subterraacuteneo o rizoma generando una sub-unidad capaz de producir una flor o inflorescencia y de ser eventualmente separada de la planta (ej Cattleya) Monopodial en las que el nuevo crecimiento se produce en sentido vertical con lo cual la planta crece constantemente en altura (ej Phalaenopsis) (ORQUIDEAS 2007) 214 Geacuteneros y especies chilenas Seguacuten NOVOA et al (2006) en la familia Orchidaceae se encuentran 49 especies de flora nativa dentro de las cuales se encuentra Chloraea virescens (Willd) Lindl Los geacuteneros de Orchidaceae en Chile son 7
- Aa Bipinnula Brachystele Codonorchis Chloraea Gavilea y Habenaria
Dentro del geacutenero Chloraea existen 31 especies - Chloraea alpina Poepp - Chloraea barbata Lindl - Chloraea bidendata (Poepp y Endl) Correa - Chloraea bletioides Lindl - Chloraea cuneata Lindl - Chloraea chica Speg - Chloraea chrysantha Poepp - Chloraea crispa Lindl - Chloraea cristata Lindl - Chloraea cylindrostachya Poepp - Chloraea disoides Lindl - Chloraea galeata Lindl - Chloraea gaudichaudii Brongn - Chloraea gavilu Lindl - Chloraea grandiflora Lindl - Chloraea heteroglossa Rchbf - Chloraea incisa Poepp - Chloraea lamellata Lindl - Chloraea lechleri Lindl - Chloraea leptopetala Reiche - Chloraea longipetala Lindl - Chloraea magellanica Hookf - Chloraea multiflora Lindl - Chloraea nudilabia Lindl - Chloraea philippii Reichbf - Chloraea picta Phil - Chloraea prodigiosa Reichbf - Chloraea speciosa Poepp - Chloraea virescens Lindl - Chloraea viridiflora Poepp
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- Chloraea volkmanni Phil (NOVOA et al 2006) 2141 Chloraea virescens Planta perenne de 40-90 cm de altura Sus hojas son de 5-12cm de largo por 15-25cm de ancho estrechas lanceoladas agudas dispuestas en roseta basal generalmente marchitas al final de la antesis Su escapo floral tiene vainas caulinares lanceoladas agudas y distantes La inflorescencia es de 8-20cm de largo densa con 10-15 flores erguidas Sus flores son blancas con estriacuteas y aacutepices verdes El seacutepalo dorsal es de 16-33mm de largo por 4-6mm de ancho oblongo lanceolado obtuso algo coacutencavo a veces ligeramente estrechado al centro aacutepice algo carnoso Los seacutepalos laterales de 18-33mm de largo por 4-5mm de ancho son ensiformes con aacutepice obtuso engrosado verde negruzco a veces espatulado y dentado a veces verrugoso Los peacutetalos son de 15-23mm de largo por 5-58mm de ancho estrechamente aovados obtusos verrugosos con maacutes frecuencia solo la mitad inferior a veces el borde denticulado y carnoso El labelo de 15-26mm de largo por 10-20mm de ancho es mas o menos romboidal a levemente trilobulado El loacutebulo central tiene 5-7 nervios longitudinales recorridos por laminillas interrumpidas membranaacuteceas con segmentos falciformes de borde carnoso de color verde Los nervios laterales que se ramifican oblicuamente hacia el aacutepice en los loacutebulos laterales tienen pequentildeas laminillas y verrugas y su borde es laciniado inciso en la mitad apical hacia la base denticulado aacutepice generalmente engrosado La columna es de 12-18mm de largo delgada blanca con estriacuteas anaranjada La base de la zona nectariacutefera tiene un color amarillo-limoacuten con maacuteculas anaranjadas orificio nectario verde El ala de la columna es recta y estrecha El estigma es triangular y globoso La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la Vordf (Vintildea del Mar) hasta la XIordf Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile Sin embargo es posible que tenga una distribucioacuten maacutes restringida por que se le ha confundido con Chloraea incisa Su floracioacuten es desde noviembre a febrero y su estado de conservacioacuten no estaacute evaluado (NOVOA et al 2006) En el Anexo 14 se incluyen antecedentes sobre su distribucioacuten y eacutepoca de floracioacuten
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FIGURA 1 Chloraea virescens FUENTE NOVOA et al (2006) 22 Requerimientos de las orquiacutedeas Para tener eacutexito en el cultivo de orquiacutedeas hay que tomar en cuenta factores de importancia como son 221 Agua El riego correcto es el principio y el fin del cuidado de orquiacutedeas (ROLLKE 2005) Este elemento es primordial para las orquiacutedeas asiacute como tambieacuten para todo tipo de plantas En el caso de eacutestas se dice muchas veces que la calidad del agua usada es el factor maacutes importante en el cultivo de orquiacutedeas ya que el porcentaje maacutes alto de muerte se produce por el exceso de este factor (SHEEHAN 1980) Hay que tomar en cuenta que la mayoriacutea de las orquiacutedeas son epiacutefitas lo que significa que tienen sus raiacuteces a la vista gracias a las cuales absorben el agua de lluvia Se recomienda un sustrato poroso y de reaccioacuten neutra ya que de esta manera el agua escurre sin acumularse no permitiendo la pudricioacuten de las raiacuteces Para las orquiacutedeas terrestres es lo mismo solo que se pueden regar con maacutes frecuencia pero sin mantenerlas saturadas (OSPINA y DRESSLER 1979) Seguacuten DUMOIS (2007) el agua es lo maacutes difiacutecil de controlar ya que depende de muchas variables como por ejemplo humedad relativa tipo de sustrato intensidad luminosa temperatura y circulacioacuten de aire Ademaacutes muchas orquiacutedeas necesitan un periacuteodo de receso vegetativo que si no es respetado resulta en ausencia de floracioacuten En general hay que antildeadir agua en abundancia cuando la planta se encuentra en crecimiento activo y reducirla despueacutes de la floracioacuten
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Las especies con pseudobulbos almacenan agua y estaacuten preparadas para su periacuteodo de receso Otras que no cuentan con estos oacuterganos requieren de humedad maacutes constante 222 Luz Ninguna planta puede crecer sin la iluminacioacuten adecuada Muchas orquiacutedeas viven en las alturas de los aacuterboles y estaacuten expuestas a plena luz del sol otras crecen en el suelo selvaacutetico protegidas del sol por espesos follajes (ROLLKE 2005) La funcioacuten principal de la luz es activar el proceso de fotosiacutentesis Los cultivadores han estudiado la luz y han descubierto que hay orquiacutedeas que florecen con diacutea largo y otras con diacutea corto (OSPINA y DRESSLER 1979) Gracias a la fotosiacutentesis se convierten los minerales presentes en el ambiente en savia y nutrientes Hojas oscuras y falta de floracioacuten indican falta de luz hojas amarillas e incluso quemadas apuntan hacia un exceso de sol (DUMOIS 2007) 223 Fertilizacioacuten Las orquiacutedeas necesitan los mismos nutrientes que otras plantas Un abono para orquiacutedeas debe contener los nutrientes principales nitroacutegeno (N) foacutesforo (P) y potasio (K) asiacute como tambieacuten oligoelementos como hierro (Fe) magnesio (Mg) zinc (Zn) estantildeo (Sn) y manganeso (Mn) (ROLLKE 2005) Por otra parte la fertilizacioacuten depende de varios factores dentro de los cuales los maacutes criacuteticos son
- El medio utilizado - La edad de las plantas - Estado de las plantas ya sea floracioacuten crecimiento reposo
En cuanto a absorcioacuten se ha demostrado que es igual de eficiente por viacutea foliar como a traveacutes de las raiacuteces Es necesario tener en cuenta algunas reglas baacutesicas a la hora de fertilizar las orquiacutedeas (Asociacioacuten Costarricense de Orquideologiacutea ACO 1970)
1 Regar las plantas antes de fertilizar 2 Fraccionar las dosis 3 Aplicar el fertilizante de forma liacutequida 4 No usar fertilizantes soacutelidos 5 No fertilizar las plantas recieacuten plantadas 6 No fertilizar plantas en reposo 7 No abonar plantas enfermas
224 Temperatura Es conocido el hecho de que cada planta tiene liacutemites de temperatura dentro de los cuales prospera o perece De ahiacute la necesidad de conocer las temperaturas correspondientes al lugar de donde viene cada especie de orquiacutedea pudiendo proporcionarle la temperatura adecuada (OSPINA y DRESSLER 1979) Se puede clasificar a las orquiacutedeas como de clima caacutelido (temperatura nocturna miacutenima de 20ordmC) templado (miacutenimo de 13 a 18ordmC) y de ambiente friacuteo (de 10 a 13ordmC) (DUMOIS 2007)
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Seguacuten SHEEHAN (1980) las temperaturas ideales para las orquiacutedeas de origen tropical son 10ordmC en la noche y entre 21ordm - 24ordmC durante el diacutea 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas La micropropagacioacuten de orquiacutedeas estaacute en vanguardia hoy en diacutea El estudio de cultivo de tejido de orquiacutedeas se lleva a cabo en muchos laboratorios de todo el mundo (ARDITTI and ERNST 1992) 231 Biologiacutea de las semillas Las semillas de orquiacutedeas son conocidas usualmente como semillas polvo porque son minuacutesculas y contienen pocas reservas de alimento Estas semillas por lo general no germinan en el medio natural a menos que sean infectadas por un hongo micorriacutezico Este hongo abastece a las plantas joacutevenes con azuacutecares y nutrientes hasta que sean lo suficientemente grandes para fabricar su propio alimento Cuando la semilla germina produce una masa indiferenciada de ceacutelulas llamada protocormo Manteniendo las condiciones normales el protocormo continuaraacute su crecimiento por varias semanas meses o incluso antildeos dependiendo de la especie hasta que alcance la edad apropiada para producir raiacuteces y hojas En el caso de orquiacutedeas terrestres es de vital importancia que la relacioacuten orquiacutedea-hongo se conserve durante los estados tempranos del ciclo de vida de la planta ya que el protocormo enterrado no puede fabricar alimento por siacute mismo Por otro lado los protocormos de las orquiacutedeas epiacutefitas son comuacutenmente verdes lo que les posibilita producir parte de su alimento La relacioacuten orquiacutedea-hongo no ha sido en su totalidad investigada para el caso de las orquiacutedeas tropicales (McKENDRICK 2000) 232 Germinacioacuten simbioacutetica y no simbioacutetica de semillas Mediante la germinacioacuten in vitro las semillas germinan en frascos de vidrio o plaacutestico Estos frascos contienen en su interior un medio nutritivo solidificado con agar con todos los azuacutecares y minerales necesarios para la germinacioacuten y crecimiento de las semillas Hay dos tipos de germinacioacuten la simbioacutetica y la asimbioacutetica En la germinacioacuten simbioacutetica las semillas se siembran junto con una pequentildea cantidad del hongo micorriza adecuado Dicho hongo crece en el medio coloniza a las semillas que estaacuten en proceso de germinacioacuten y se produce una relacioacuten simbioacutetica la cual alimentaraacute al protocormo hasta que este sea capaz de producir sus hojas y se vuelva autotroacutefico Esta teacutecnica es usada principalmente en propagacioacuten de orquiacutedeas terrestres en zonas templadas La germinacioacuten asimbioacutetica se usa principalmente en propagacioacuten de orquiacutedeas tropicales que crecen maacutes raacutepido que sus parientes de zonas templadas Para este tipo de germinacioacuten se necesita un medio de cultivo maacutes complejo ya que todos los nutrientes orgaacutenicos e inorgaacutenicos asiacute como tambieacuten los azuacutecares deben estar en forma disponible pues no existe la intermediacioacuten del hongo (McKENDRICK 2000) 233 Condiciones de esterilidad Tanto para la germinacioacuten simbioacutetica como para la asimbioacutetica es de vital importancia que los frascos las semillas aparatos y el medio esteacuten esteacuteriles desde el principio del proceso Esto debido a que cualquier hongo o bacteria que se introduzca creceraacute maacutes raacutepido que las semillas ocupando su espacio hasta matarlas Esto se evita gracias al autoclave el cual regulado a 12 atm y 120ordmC por 20 minutos mata hongos o bacterias presentes en el medio (McKENDRICK 2000)
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2331 Siembra de las semillas Las semillas pueden ser recolectadas desde caacutepsulas verdes o maduras La caacutepsula verde que estaacute madurando estaacute llena de semillas y no se deforma cuando se aprieta con las pinzas Estas semillas pueden ser almacenadas por algunas semanas en un lugar refrigerado con bastante aireacioacuten Las semillas se pueden sembrar a partir de caacutepsulas verdes o semillas secas A continuacioacuten se muestran las ventajas y desventajas de ambos meacutetodos
- Siembra a partir de caacutepsulas verdes Si las caacutepsulas se mantienen intactas el interior (las semillas) se mantiene esteacuteril Por lo tanto si se esteriliza la parte exterior de las mismas donde hongos y bacterias pueden desarrollarse y se abren las caacutepsulas bajo condiciones esteacuteriles y las semillas podraacuten mantenerse desinfectadas
La ventaja de este meacutetodo es que no se requiere de esterilizacioacuten de las semillas lo que provoca su deterioro Otro punto a favor es que algunas semillas podriacutean germinar maacutes raacutepido que las provenientes de caacutepsulas maduras por los mecanismos de dormancia La desventaja es que en este caso todas las semillas deben ser utilizadas o eliminadas mientras que las semillas maduras se pueden almacenar Tambieacuten se debe considerar que las semillas sembradas a partir de caacutepsulas que no han madurado lo suficiente podriacutean germinar lentamente o simplemente no germinar - Siembra a partir de semillas secas En este caso una vez que la caacutepsula es abierta las semillas dejan de ser esteacuteriles y requieren de un proceso de esterilizacioacuten Comuacutenmente se utiliza una solucioacuten de hipoclorito de sodio hipoclorito de calcio o peroacutexido de hidroacutegeno Las semillas se agitan dentro de la solucioacuten que ademaacutes contiene una gota de detergente para ldquohumedecerlasrdquo luego se las enjuaga con agua destilada y se las siembra en el medio preparado La ventaja de este meacutetodo es que las semillas pueden ser colectadas secadas al aire almacenadas por varios meses en el refrigerador y utilizarlas cuando sea necesario Se debe considerar que la siembra ya sea de caacutepsulas verdes o de semillas secas estaacute determinado por la eacutepoca en que se colectan (McKENDRICK 2000) 234 Trasplante En la caacutemara de incubacioacuten las plaacutentulas se han desarrollado en condiciones limpias y en un ambiente cerrado por lo que deben acostumbrase gradualmente al ambiente exterior antes de ser trasplantadas a las macetas Tambieacuten la temperatura y la luz la cual es baja han sido constantes durante el cultivo in vitro En el medio natural la temperatura y la luz variacutean constantemente por lo que las nuevas plantas deben estar protegidas de la fuerte luz solar la cual puede quemar las hojas con soacutelo una pequentildea cantidad de eacutesta La humedad en los frascos es alta y las plantas estaacuten protegidas de ataques por hongos o bacterias Ademaacutes las plaacutentulas han crecido bajo condiciones de alta humedad y por lo tanto tendraacuten cutiacuteculas deacutebiles por lo que necesitan acostumbrase a medios menos huacutemedos antes de ser transplantadas
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Para el trasplante se deben colocar los frascos en un lugar protegido de la lluvia para que se aclimaticen a las nuevas condiciones de luz y temperatura Se deben dejar por 2 a 4 semanas en los frascos tapados Luego se debe ir aflojando las tapas para dejar entrar pequentildeas cantidades de aire hasta el punto de dejarlas descubiertas Se debe revisar si hay hojas marchitas y ver que el sustrato esteacute huacutemedo
Lo ideal es dejarlas sin tapa durante una semana antes de pasarlas a las macetas Para el trasplante se debe elegir un sustrato adecuado para el tipo de planta humedecerlo y transplantar las plantas con cuidado de no dantildear las raiacuteces y evitando la deshidratacioacuten En esta etapa tambieacuten se debe dejar las macetas selladas para evitar una raacutepida deshidratacioacuten e ir abrieacutendolas paulatinamente (McKENDRICK 2000)
24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas 241 Orquiacutedeas terrestres 2411 Cypripedium Esta es una orquiacutedea terrestre de zonas templadas se desarrolla en el Hemisferio Norte como por ejemplo en Guatemala y en Honduras pero donde se encuentra principalmente es en China Su forma maacutes comuacuten de propagacioacuten es in vitro a partir de semillas La forma maacutes eficiente es a partir de semillas inmaduras Existe un intervalo de tiempo entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten eacuteste dependeraacute de la especie y de la zona donde se desarrolle Se asume que existen aproximadamente cuatro semanas entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten El oacuteptimo para una buena germinacioacuten de Cypripedium es entre 42 y 60 diacuteas despueacutes de la polinizacioacuten y entre 14 y 32 diacuteas despueacutes de la fertilizacioacuten La germinacioacuten ocurre entre la segunda y cuarta semana despueacutes de ser sembradas y los protocormos deberiacutean ser cambiados de medio de cultivo cada dos a cuatro meses si no se corre el riesgo de sufrir agotamiento de nutrientes Los rizomas y las raiacuteces se empiezan a desarrollar a partir de los siete meses para luego dar lugar a las primeras hojas Para obtener un buen transplante se deben tener raiacuteces de miacutenimo un centiacutemetro de largo El desarrollo de raiacuteces se ve potenciado al tener un periacuteodo corto de bajas temperaturas (10degC) exposicioacuten a la luz reduccioacuten en la concentracioacuten de iones del medio de cultivo o transferirlas a un compost esteacuteril Al tener raiacuteces suficientes y el tamantildeo adecuado se podraacuten llevar las plantas al lugar donde creceraacuten definitivamente En el momento del transplante las plantas son muy susceptibles al desecamiento por lo cual lo ideal es que los brotes sean maacutes chicos que las raiacuteces El mejor sustrato seriacutea aquel donde crece naturalmente la orquiacutedea (RAumlNNBAumlCK 2007) 2412 Preservacioacuten in vitro de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes Este estudio fue hecho para establecer que parte de tejido es viable para la micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes del noreste de Europa pudiendo asiacute reestablecer dichas orquiacutedeas a sus aacutereas correspondientes La propagacioacuten in vitro de orquiacutedeas
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terrestres de clima templado es maacutes difiacutecil que las orquiacutedeas epiacutefitas de clima subtropical y tropical Las orquiacutedeas terrestres tienen requerimientos maacutes estrictos que las epiacutefitas y se conoce menos sobre sus necesidades especiacuteficas (VAASA y ROSENBERG 2004) En Estonia existen 36 especies de orquiacutedeas terrestres pero solo tres estaacuten bajo proteccioacuten Dactylorhiza baltica Dactylorhiza ruthei Dactylorhiza praetermissa Como explantes para este estudio en el caso de D baltica se ocuparon protocormos en los otros dos casos se utilizaron semillas semi maduras las cuales fueron colectadas siete y diez semanas despueacutes de ser polinizadas Para D baltica se ocupoacute el medio Murashige y Skoog suplementado con 05 mgL de aacutecido naftaleacuten aceacutetico (ANA) y 2 mgL de isonpentenyl adenina Para el caso de las semillas semi maduras se ocuparon los medios de Lindemann de Heller de Norstog y de Murashige y Skoog como control
La composicioacuten del medio y la madurez de las semillas influye mucho en el desarrollo de las orquiacutedeas in vitro Se ha demostrado que se necesita una alta concentracioacuten de microelementos para obtener una correcta germinacioacuten de las semillas Tambieacuten se puede decir que los primeros tres meses son los de mayor crecimiento luego de este tiempo el crecimiento se vuelve maacutes lento (VAASA y ROSENBERG 2004)
Luego de cuatro semanas de crecimiento de D baltica el 60 de los explantes de meristemas apicales empezaron a crecer en cambio los de meristemas laterales no expresaron ninguacuten tipo de crecimiento Las raiacuteces empezaron su desarrollo luego de dos meses despueacutes de la siembra
En el caso de D ruthei y D praetermissa la germinacioacuten se produjo despueacutes de dos meses desde la inoculacioacuten Luego de cuatro y seis meses el mayor crecimiento fue observado en el medio Norstog superando en 14 al medio testigo Murashige y Skoog (VAASA y ROSENBERG 2004)
2413 Longevidad de semillas de orquiacutedeas terrestres Por lo general las orquiacutedeas producen muchas pero pequentildeas semillas que contienen muy pocas reservas de alimento Dichas semillas estaacuten estructuralmente adaptadas para ser dispersadas por el viento pero poco se sabe del destino de eacutestas luego de ser dispersadas Algunos estudios de viabilidad de semillas indican una sobrevivencia de uno a dos antildeos en orquiacutedeas de clima templado Las semillas que son guardadas en laboratorio duran mucho maacutes tiempo Se estudioacute la viabilidad de siete especies de orquiacutedeas norteamericanas dentro de las cuales se encuentran Goodyera pubescens y Liparis liliifolia Las semillas de eacutestas se colocaron en bolsas con suelo y sustratos de bosques provenientes de sus haacutebitats naturales (WHIGHAM et al 2005) En Goodyera pubescens la mayoriacutea de las semillas germinaron en un antildeo Cuatro otras especies germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero algunas semillas no germinadas despueacutes de siete antildeos seguiacutean siendo viables En la especie Liparis liliifolia semillas que han estado cuatro antildeos bajo observacioacuten han tenido una tasa de
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germinacioacuten de un 68 al ser sembradas in vitro junto con el hongo micorriacutezico adecuado Las dos especies restantes no germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero las semillas fueron evaluadas como intactas y testeadas positivamente en cuanto a su viabilidad despueacutes de cuatro antildeos en el suelo Estas observaciones fueron interpretadas como diferentes estrategias para especies especiacuteficas de germinacioacuten in situ (WHIGHAM et al 2005) 2414 Sobrevivencia de orquiacutedeas terrestres transplantadas a sectores urbanos La conservacioacuten de poblaciones de orquiacutedeas silvestres depende del establecimiento de las orquiacutedeas propagadas a los campos Sin embargo se conoce muy poco de los factores bioacuteticos que influencian el establecimiento de orquiacutedeas terrestres a sus haacutebitats naturales Un experimento fue establecido para medir la sobrevivencia de seis especies durante su primer periacuteodo de crecimiento seguido del transplante a un sector urbano en Australia (SCADE et al 2006)
Las orquiacutedeas germinadas simbioacuteticamente crecieron en laboratorio durante cinco meses antes de establecer la plantacioacuten en sitios adyacentes con alta o baja cobertura de malezas Existioacute una muerte gradual de las plaacutentulas durante el primer periacuteodo de crecimiento primeramente por ataque de insectos no siendo evitado por la presencia de una malla cobertora Los iacutendices de sobrevivencia variacutean desde 49 para Microtis media una especie capaz de crecer en un ambiente atiacutepico hasta un 21 para Caladenia arenicola la orquiacutedea nativa maacutes comuacuten de esos sitios Sin embargo no todas las orquiacutedeas sobrevivientes producen tubeacuterculos por lo que la tasa de sobrevivencia despueacutes del primer periacuteodo seco disminuye
La sobrevivencia de las orquiacutedeas sembradas no puede ser comparada con orquiacutedeas de la misma especie que crecieron en los mismos lugares ya que no existioacute la presencia del hongo compatible para estas orquiacutedeas (SCADE et al 2006)
2415 Micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres En India dos orquiacutedeas muy importantes para la horticultura del geacutenero Anoectochilus fueron exitosamente propagadas Noacutedulos aislados de A sikkimensis colectadas en Himalaya y A regalis colectadas en India fueron cultivadas in vitro durante 12 semanas para obtener un maacuteximo de 48 a 56 protocormos y brotes obteniendo como resultado un 95 y 98 de eficiencia respectivamente Durante el repicado de los explantes in vitro de A regalis se observoacute que el nuacutemero total de brotes obtenidos a partir de noacutedulos fue 214 asiacute como tambieacuten 82 puntas de brotes En cambio para A sikkimensis fueron mucho maacutes bajos 123 y 43 respectivamente teniendo un crecimiento maacutes lento pero plantas maacutes fuertes Las raiacuteces de 4 a 6cm crecieron con la presencia de NAA (270 microM ) en el medio asiacute como tambieacuten con carbono activado (02) Durante la aclimatacioacuten la tasa de establecimiento fue entre 95 y 98 Luego de seis meses en invernadero las plantas de A regalis fueron transferidas a bosque nativo donde se obtuvo una tasa de
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sobrevivencia de entre 70 y 95 despueacutes de 12 meses Estas plantas establecidas en bosque nativo estaacuten libres de cualquier defecto morfoloacutegico y de crecimiento (GANGAPRASAD et al 2000) 242 Orquiacutedeas epiacutefitas Estas orquiacutedeas viven en los aacuterboles pero no obtienen de eacuteste su alimento no son paraacutesitas 2421 Preservacioacuten de Cattleya walkeriana usando propagacioacuten in vitro El geacutenero Cattleya se encuentra en Meacutexico y Ameacuterica Central asiacute como tambieacuten en Venezuela Colombia y las laderas de los Andes Esta orquiacutedea tambieacuten se encuentra en varias regiones del Brasil creciendo en aacuterboles rocas cerca de riacuteos lagos y pantanos Las flores de esta orquiacutedea son conocidas debido a su hermosura y a causa de la destruccioacuten de su haacutebitat y a la excesiva coleccioacuten de eacutestas se encuentra en extincioacuten
La composicioacuten del medio de cultivo es esencial para la propagacioacuten in vitro ya que suple todos los nutrientes necesarios para el desarrollo y seraacute distinto dependiendo de cada especie en este caso se utilizoacute la mitad de los macronutrientes del medio Muchos autores sugieren el uso de carboacuten activado en el medio ya que por lo general en muchas especies aumenta el desarrollo de las raiacuteces En este estudio se probaron distintas dosis de carboacuten activado 1 2 4 y 6gL con un pH de 6 (TADEU DE FARIA et al 2002) Las semillas se obtuvieron de flores artificialmente polinizadas en invernadero Plaacutentulas de aproximadamente un centiacutemetro fueron seleccionadas y cultivadas nuevamente en el medio de cultivo Murashige y Skoog pero esta vez con las diferentes dosis de carboacuten activado Se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces el nuacutemero de brotes y el peso de la materia verde total Durante el autoclavado se produce normalmente una hidroacutelisis de sacarina la cual es de 10 aproximadamente este porcentaje aumenta considerablemente al agregar un 1 de carboacuten activado llegando a ser de 95
El desarrollo de las plaacutentulas de C walkeriana aumentan con una mayor concentracioacuten de carboacuten activado asiacute como tambieacuten un mayor tiempo de cultivo El resultado fue que la dosis ideal para el desarrollo de esta orquiacutedea es 2gL de carboacuten activado (TADEU DE FARIA et al 2002) 2422 Establecimiento de cultivos in vitro y micropropagacioacuten de Cattleya aurantiaca (Bateman ex Lindl) Por medio de siembra in vitro se logroacute el establecimiento de C aurantiaca con alto porcentaje de germinacioacuten y desarrollo de protocormos Para la oacuteptima formacioacuten de callo y para la proliferacioacuten de protocormos se determinaron los medios oacuteptimos (MS 10 mgL ANA 10 mgL BA) asiacute como tambieacuten de manera directa sobre explantes de hoja y pseudobulbos (MS 01 mgL ANA 01 mgL GA3)
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Con este uacuteltimo medio tambieacuten se logroacute una oacuteptima regeneracioacuten y desarrollo de plaacutentulas Los medios liacutequidos (sin agitacioacuten) son una buena opcioacuten para conseguir la produccioacuten masiva de protocormos ya que con ellos se optimizoacute la micropropagacioacuten de C aurantiaca Las plaacutentulas micropropagadas presentaron alto porcentaje de sobrevivencia y buen desarrollo despueacutes de su trasplante y aclimatacioacuten lo cual demuestra que es un buen sistema de propagacioacuten para C aurantiaca (GUTIERREZ y SALGADO 2007) En cuanto a transplante y aclimatacioacuten despueacutes de 45 diacuteas de desarrollo in vitro las plaacutentulas de un tamantildeo entre 3 y 5 cm con raiacuteces bien desarrolladas fueron llevadas a condiciones ex vitro eliminando los restos de medio de cultivo con agua potable y ocupando un sustrato de partes iguales de tezontle y corteza de encino cubierta con hojarasca de encino finamente molida Se mantuvieron cubiertas durante 15 diacuteas abriendo cada dos diacuteas hasta poder retirar la tapa en 30 diacuteas Despueacutes de dos meses de haber sido retiradas del cultivo in vitro las plaacutentulas presentaron 70 de sobrevivencia y alcanzaron una altura de hasta 7 cm presentando nuevas hojas y raiacuteces las plantas se muestran vigorosas y capaces de continuar su crecimiento en condiciones ambientales de invernadero (GUTIERREZ y SALGADO 2007)
2423 Establecimiento in vitro y regeneracioacuten de plantas de Laelia autumnalis (Llave y Lex) Lindl Para este estudio se obtuvieron las semillas de una caacutepsula desarrollada despueacutes de 6 meses de la floracioacuten las cuales se sembraron in vitro sin presentar contaminacioacuten ya que la siembra por este meacutetodo es muy eficiente en comparacioacuten al cultivo de semillas libres donde algunas veces se presenta la contaminacioacuten Las observaciones se realizaron cada 15 diacuteas la germinacioacuten se detectoacute en los primeros 15 diacuteas en la mayoriacutea de los medios de cultivos probados con la presencia de protocormos de 1mm de diaacutemetro (HUAPEO y SALGADO 2004) El porcentaje de germinacioacuten que se obtuvo de las semillas cultivadas in vitro de L autumnalis fue de 95 a 100 en todos los medios de cultivo la uacutenica diferencia fue el tiempo entre las germinaciones A excepcioacuten de las semillas cultivadas en el medio MS 100 la germinacioacuten del 100 se obtuvo hasta los 30 diacuteas de cultivo mientras que en el primero la germinacioacuten fue a los 15 diacuteas del cultivo Las plaacutentulas con raiacutez y un par de hojas se lograron a los 90 diacuteas de cultivo en el medio MS 100 alcanzando 07 mm de altura Estas plaacutentulas fueron subcultivadas en medio MS con 05 mgl de ANA y 01 mgl de GA3 para tener plaacutentulas fuente de explante (segmentos de hojas) un medio oacuteptimo de desarrollo de plaacutentulas de L speciosa No fue necesario probar otros medios de cultivos ya que se hicieron pruebas anteriores que demostraron que era el adecuado
Las plaacutentulas de 6 meses de cultivo in vitro despueacutes de su germinacioacuten presentaron una altura promedio de 5 cm con raiacuteces con velamen y hasta dos pares de hojas Segmentos de hoja de eacutestas fueron cultivadas en el medio MS conteniendo ANA BA y GA3 en diferentes concentraciones y se realizaron observaciones cada 30 diacuteas para determinar medios inductores de callo protocormos y raiacuteces La mejor respuesta en formacioacuten de callo fue observada en los segmentos de hoja de plaacutentulas de L autumnalis cultivados en MS con 1 mgl de ANA BA y GA3 iniciando la induccioacuten de
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eacuteste desde los 30 diacuteas de cultivo solamente en un 70 de los explantes cultivados El 100 se logroacute a los 90 diacuteas de cultivo observando callo abundante alrededor de todo el tejido de color blanco con puntos pigmentados de color verde La regeneracioacuten de protocormos de esta orquiacutedea se establecioacute con la siembra de segmentos de hoja de plaacutentulas de 6 meses de edad de manera directa o a partir de callos En callos la produccioacuten fue oacuteptima en el medio MS con 01 mgl de ANABAGA3 ya que a los 60 diacuteas se obtuvieron 50 protocormos por segmento de callo Solamente se produjeron 10 protocormos por explante al cultivarse los segmentos de hoja en MS con 01 mgl de ANABAGA3 a los 120 diacuteas de cultivo (HUAPEO y SALGADO 2004) 25 Aclimatacioacuten Aclimatacioacuten significa que el hombre intercede y guiacutea el proceso de acondicionamiento de las plantas hasta que eacutestas sean aptas para crecer en el campo yo invernadero
Un alto nuacutemero de plantas micropropagadas no sobreviven al cambio desde el cultivo in vitro hacia el ambiente exterior ya sea en campo o invernadero Eacutestos dos uacuteltimos tienen menor humedad relativa niveles maacutes altos de luminosidad y un ambiente seacuteptico los cuales son maacutes estresantes para las plantas micropropagadas La mayoriacutea de las especies que crecen in vitro necesitan un proceso de aclimatacioacuten pudiendo obtener asiacute un nuacutemero suficiente de plantas vivas y vigorosas para trasplantar al suelo (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991)
La aclimatacioacuten no es uacutenicamente para micropropagacioacuten siendo usada ademaacutes en propagacioacuten convencional durante antildeos Despueacutes de cortar las hojas y de haber formado raiacuteces por lo general son aclimatadas antes de ser llevadas al campo o invernadero Ejemplos de dos teacutecnicas comunes son bajar gradualmente la humedad y mantener el nivel de luz con un 50 de sombra antes de trasladarlos al campo Las raiacuteces que han sido cortadas y mal limpiadas muchas veces son focos de infeccioacuten En estos casos las plantas muestran signos de marchitez hojas necrosadas y tambieacuten se puede llegar a la muerte de eacutestas El cultivo in vitro reduce la necesidad de fotosiacutentesis ya que las condiciones de la caacutemara de incubacioacuten proveen a la planta de sacarosa u otro azuacutecar Tambieacuten en estas condiciones se reduce el stress por patoacutegenos al ser un ambiente aseacuteptico Todo esto se traduce en que las plantas micropropagadas no son aptas para el campo yo invernadero (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 251 Stress hiacutedrico El stress hiacutedrico puede ser el resultado de una excesiva transpiracioacuten de las diferentes partes aeacutereas de las plantas especialmente de las hojas o por una inadecuada absorcioacuten de agua por parte de las raiacuteces La cutiacutecula y los estomas son la ruta primaria de peacuterdida de agua desde de las hojas provenientes de esta teacutecnica reproductiva 2511 Cutiacutecula La cutiacutecula es una membrana compuesta por una matriz de cutina que a su vez se encuentra cubierta en su superficie por ceras cuya funcioacuten primaria consiste en limitar la peacuterdida de agua por transpiracioacuten La permeabilidad del agua a traveacutes de la cutiacutecula se ve influenciada principalmente por la estructura y la cantidad de
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ceras cuticulares y epicuticulares no vieacutendose afectada la peacuterdida de agua por el grosor de eacutesta o la naturaleza quiacutemica de la matriz de la cutina La estructura cristalina de la parte encerada de las hojas es distinta en las plantas micropropagadas con respecto a las plantas que crecen en el campo La cera epicuticular de las hojas de plantas in vitro tienen una proporcioacuten maacutes alta de esteres y de componentes polares por el contrario tienen unas cadenas de hidrocarbonos mucho maacutes cortas Esto hace que las plantas in vitro pierdan maacutes agua que las cultivadas en campo o invernadero
Las plantas que han crecido en el campo son naturalmente de color verde pero el color de las plantas cultivadas in vitro es diferente y se puede ver a simple vista Las plantas que son pasadas a invernadero y que tengan un color verde se aclimatan de mejor forma al ambiente exterior (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 2512 Estomas La estructura estomaacutetica y su funcionamiento han sido implicados recurrentemente en el desbalance de agua exhibido por plantas micropropagadas al momento de ser removidas del cultivo in vitro Estudios con microscopiacutea de scanner electroacutenico han indicado que la estructura estomaacutetica presente en algunas especies de plantas cultivadas in vitro difieren marcadamente de las cultivadas en invernadero o en el suelo Debido a que las primeras presentan estomas de mayor tamantildeo y maacutes redondos a diferencia de las plantas cultivadas de manera normal que presentan estomas maacutes pequentildeos y eliacutepticos lo que resulta en una deshidratacioacuten maacutes raacutepida en el caso de las provenientes de cultivo in vitro (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 252 Humedad Debido a la anatomiacutea y la condicioacuten fisioloacutegica de las plantas desarrolladas in vitro donde se ha mantenido una alta humedad relativa es necesario regar al momento del traslado para obtener una alta sobrevivencia Muchos laboratorios aseguran que hay que evitar tener un sistema de aspersioacuten ya que se produce el ambiente necesario (muy huacutemedo) para la aparicioacuten de hongos algas o bacterias Otros meacutetodos incluyen el uso de humidificadores o poner las macetas en un lugar cerrado donde se retenga vapor para esto se pueden usar por ejemplo tapas de polietileno Este meacutetodo es relativamente econoacutemico pero se debe tener control del calor y monitorear la falta de agua (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 253 Luz Durante la etapa in vitro las plantas estaacuten expuestas a altos niveles de luminosidad lo que se traduce en hojas delgadas Antes del traslado se recomienda mantener las plantas con un 50 de sombra para asiacute poder aclimatarlas de mejor manera esto debido a que las plantas micropropagadas tienen un bajo control sobre la transpiracioacuten y un inadecuado mecanismo de fotosiacutentesis La sombra reduce la transpiracioacuten evitando excesivas peacuterdidas de agua asiacute como tambieacuten el exceso de luz destruye las moleacuteculas de clorofila Luego del periacuteodo bajo sombra se deben mover las macetas gradualmente hacia el nivel de luz al cual seraacute llevado para su crecimiento final (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 254 Temperatura La temperatura del aire y del medio o sustrato de crecimiento estaacute generalmente controlado durante el periacuteodo de aclimatacioacuten El calor es necesario en los meses de invierno y el friacuteo (enfriar) es esencial en los meses de verano Ajustando la cantidad de sombra y humedad se obtiene un control sobre la temperatura El
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enfriamiento se puede obtener gracias a ventilacioacuten abanicos niebla o aire acondicionado El calor puede provenir del sistema existente en el edificio o invernadero donde esteacuten ubicadas las macetas o por las laacutemparas ocupadas para el control del fotoperiacuteodo El rango de temperatura que se mantiene por lo general es entre los 13 y 30ordmC y esta determinado principalmente por la especie en cuestioacuten La temperatura de la zona donde se encuentran las raiacuteces es muy importante para el crecimiento lo ideal es que dicho sector tenga una mayor temperatura que el aire fomentando el crecimiento de las raiacuteces e incrementando la humedad alrededor de la planta Durante el verano esto es difiacutecil de obtener ya que la temperatura del aire es muy alta debido a la alta radiacioacuten solar Terminado el proceso de aclimatacioacuten esto ya no es necesario (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 255 Fotosiacutentesis Las plantas sufren un cambio radical cuando son removidas desde cultivo in vitro ya que son forzadas a cambiar de heterotroacuteficas a autotroacuteficas y la fotosiacutentesis se vuelve fundamental para la sobrevivencia Las hojas de las plantas in vitro no estaacuten formadas para hacer fotosiacutentesis ya que en la caacutemara de incubacioacuten no se produce un fuerte intercambio gaseoso esto debido a que la sacarosa es entregada a traveacutes del medio de cultivo Las hojas de las plantas que son trasladadas al campo o invernadero sufren deterioro debido a que no estaacuten formadas para la fijacioacuten de carbono Esto se produce por un tiempo aproximado de cuatro semanas despueacutes de las cuales las hojas nuevas suplen a las viejas Otro punto es que las hojas de las plantas cultivadas in vitro contienen menor proporcioacuten de clorofila que las plantas que han crecido normalmente en el campo En un estudio de coliflor cultivado in vitro se midioacute el CO2 y se obtuvo un balance negativo el cual se mantuvo durante dos semanas despueacutes del transplante Algo similar ocurrioacute con frutilla despueacutes del transplante las hojas se deterioraron raacutepidamente lo que quiere decir que no hubo incremento en la fijacioacuten de carbono indicando falta de desarrollo en la competencia fotosinteacutetica
El bajo nivel de CO2 durante el cultivo in vitro limita el proceso de fotosiacutentesis lo cual se puede compensar usando sacarosa en el medio de cultivo Tambieacuten se puede incrementar el nivel de luz y CO2 obteniendo un fuerte aumento en el crecimiento de varias especies como orquiacutedeas clavel etc (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 256 Sustrato Un sustrato es todo material soacutelido distinto del suelo natural mineral u orgaacutenico que colocado en un contenedor en forma pura o en mezcla permite el anclaje del sistema radicular de la planta desempentildeando por lo tanto un papel de soporte para la planta El sustrato puede intervenir o no en el complejo proceso de la nutricioacuten mineral de la planta (INFOAGRO 2007) El sustrato y los contenedores dentro de los cuales se van a transplantar las plaacutentulas in vitro son importantes para una buena sobrevivencia
Los sustratos ejercen una influencia significativa en la arquitectura del sistema radical de las plantas y en las asociaciones bioloacutegicas de este con el suelo influenciando el
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estado nutricional y la translocacioacuten de agua en el sistema suelo-planta-atmoacutesfera Uno de los requisitos fundamentales que debe cumplir el sustrato para su utilizacioacuten es la sanidad Cuando estos no se elaboran almacenan o manejan correctamente pueden contaminarse y provocar serios dantildeos a las plantas durante la aclimatacioacuten por esta razoacuten son preferidos como componentes para su elaboracioacuten materiales inertes o aquellos en las cuales el proceso de obtencioacuten garantice la mayor desinfeccioacuten posible
Uno de los factores de mayor importancia a la hora de seleccionar los materiales que pueden constituir el sustrato es su disponibilidad tanto en teacuterminos de facilidad de obtencioacuten o suministro como de su costo (VILCHEZ et al 2007)
La presencia de inhibidores o tambieacuten cambios en el pH del sustrato pueden afectar el crecimiento de las raiacuteces y consecuentemente el eacutexito del transplante
Muchos laboratorios y viveros transplantan a un sustrato uniforme debiendo ser eacuteste adecuado en cuanto a soporte de las plantas pH porosidad aireacioacuten y drenaje (DEBERGH y ZIMMERMAN 1991)
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3 MATERIAL Y MEacuteTODO
Para la realizacioacuten de este trabajo se utilizoacute el siguiente material y meacutetodo
31 Material La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio e invernadero de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal pertenecientes a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de Chile
311 Material vegetal Se utilizaron plaacutentulas de C virescens cultivadas in vitro a partir de semillas las cuales fueron proporcionadas por el laboratorio estas plaacutentulas fueron separadas y repicadas para aumentar la poblacioacuten y obtener la cantidad necesaria para el ensayo
FIGURA 2 Plaacutentulas de C virescens en caacutemara de crecimiento in vitro
312 Materiales Los materiales que se utilizaron fueron los siguientes Equipos autoclave caacutemara de flujo laminar dispensador de medios medidor
de pH agitador magneacutetico horno microondas balanza mechero termoacutemetro Materiales vasos de precipitado matraces probetas pipetas papel de
aluminio frascos de vidrio placas Petri pinzas bisturiacute macetas regadera Soluciones soluciones madre (Medio MS) gelificante etanol 70 y 95
32 Meacutetodo A continuacioacuten se da a conocer la metodologiacutea con la cual se trabajoacute 321 Preparacioacuten del medio de cultivo Para la obtencioacuten de plantas a traveacutes de la micropropagacioacuten se ocupoacute el medio basal de MURASHIGE y SKOOG (1962) tambieacuten llamado medio MS Este medio tiene un pH de entre 56-57 Posteriormente se dosificoacute con el dispensador de medios para que cada frasco tenga una cantidad adecuada (25 mL) y se llevoacute a autoclave para esterilizar a 12 atm 120ordm C por 20 min
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322 Obtencioacuten del material vegetal Al tener el medio esterilizado se procedioacute a la separacioacuten y repicado de plaacutentulas existentes en el laboratorio Las siembras se realizaron en el mes de mayo del 2007 Estas siembras se realizaron en la caacutemara de flujo laminar de modo de asegurar que la siembra sea 100 aseacuteptica Estas plaacutentulas fueron mantenidas en la caacutemara de incubacioacuten hasta obtener los tamantildeos requeridos para el ensayo donde las condiciones fueron las siguientes
minus Temperatura ambiental de 23-25ordm C minus Fotoperiacuteodo de 16 horas minus Intensidad lumiacutenica controlada de 50-55 micromol m-2s-1
323 Sustratos Se utilizaron tres tipos de sustratos el primero corresponde a una mezcla de turba + perlita (11) el segundo corresponde a Sphagnum (100) y el tercero corresponde a una mezcla de turba + arena (11) Una vez realizadas las mezclas se procedioacute a una esterilizacioacuten en un autoclave a 121ordm C por 20 minutos a 12 atmoacutesfera De esta forma se trabajoacute con material limpio y sano evitando ataque de hongos o bacterias El anaacutelisis quiacutemico de los sustratos se muestra en el Anexo 2 324 Plantacioacuten Las plaacutentulas con un promedio de cuatro meses en condiciones de caacutemara de crecimiento in vitro obtuvieron el tamantildeo adecuado para ser utilizadas Se sacaron de los frascos y se plantaron en las macetas de plaacutestico transparente con los sustratos Posteriormente fueron dejadas en la sala del laboratorio donde se debioacute asperjar con solucioacuten nutritiva Hoagland y fungicida Captan CUADRO 1 Composicioacuten de solucioacuten nutritiva Hoagland
KNO3 102 gL Ca(NO3) 4 H2 O 0492 gL
NH4H2 (PO4) 023 gL MgSO4 7 H2O 049 gL
H3BO3 286 mgL MnCl2 2 H2O 181 mgL CuSO4 5 H2O 008 mgL ZnSO4 5 H2O 022 mgL Na2MoO4 H2O 009 mgL
FeSO4 7 H2O 05 06 mL FUENTE FINCK 1988 325 Disentildeo de los ensayos Este trabajo de investigacioacuten constoacute de un ensayo con dos etapas Antes que todo se realizoacute la separacioacuten y repicado in vitro de plaacutentulas de C virescens para la obtencioacuten del nuacutemero necesario de plantas En la etapa 1 se utilizaron tres tamantildeos de plaacutentulas obtenidas in vitro de 1-2cm de 2-3cm y de maacutes de 3cm de altura que se transplantaron a tres sustratos turba + perlita 11(vv) Sphagnum (100) y turba + arena 11 (vv) La turba provino de la Sociedad
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Minera Patagonia Peat SA en Hijuelas el Sphagnum de la empresa Lonquen Chile de Puerto Montt y la perlita se obtuvo a traveacutes del sitio web wwwjardisencl (representante legal Walter Rathgeb Penza Ingeniero Agroacutenomo Santiago) Las plaacutentulas se plantaron de acuerdo a su tamantildeo las de maacutes de 3cm se colocaron de 6 por maceta las de 2 a 3cm de a 8 por maceta y las maacutes chicas de a 10 por maceta Estas macetas fueron dejadas en una sala de aclimatacioacuten con una temperatura promedio de 20ordm C intensidad lumiacutenica de 50-55 micromol m-2s-1 y 14-16 hrs de fotoperiacuteodo Se fertilizoacute asperjando cada cinco diacuteas con solucioacuten nutritiva Hoagland Esta etapa se llevoacute a cabo durante dos meses desde el cinco de septiembre hasta el cinco de noviembre de 2007
En la etapa 2 se continuoacute el proceso de aclimatacioacuten en invernadero de las plaacutentulas obtenidas en la etapa 1 que despueacutes de dos meses teniacutean un mayor tamantildeo y se habiacutean acondicionado al ambiente exterior (fuera de la caacutemara de crecimiento) Las plantas se mantuvieron en las macetas durante tres semanas para aclimatarlas y luego las plantas sobrevivientes fueron transplantadas a macetas maacutes grandes individuales durante tres meses aproximadamente hasta el cinco de marzo 2008 Estas nuevas macetas tuvieron como sustrato turba y suelo (trumao) en igual proporcioacuten (Anexo 2) La temperatura promedio de invernadero fluctuoacute de 13 a 35 degC seguacuten el mes En enero el promedio fue de 25 (Anexo 3) Para bajar la temperatura alrededor de 5deg C se instaloacute una malla Rachel 326 Disentildeo experimental El disentildeo experimental utilizado fue completamente al azar ordenado como experimento factorial con dos factores tamantildeo (3) y sustrato (3) Cada tratamiento tuvo tres repeticiones con un miacutenimo de 6 plantas por recipiente 327 Variables a evaluar Durante los dos meses en que las macetas estuvieron en la sala de aclimatacioacuten se evaluoacute el desarrollo foliar contando el nuacutemero de hojas una vez al mes Posteriormente se trasladaron las mismas macetas a invernadero durante tres semanas para continuar con la aclimatacioacuten de las plaacutentulas Transcurrido este tiempo se transplantaron las plaacutentulas sobrevivientes a macetas individuales y continuoacute mensualmente la evaluacioacuten de eacutestas (nuacutemero de hojas) hasta la obtencioacuten de plantas establecidas Al momento del transplante y al final del ensayo se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces asiacute como tambieacuten al final del ensayo de evaluoacute el crecimiento en altura (cm) La sobrevivencia fue evaluada al final del ensayo por maceta
Tanto en la sala de aclimatacioacuten coacutemo en el invernadero se registroacute la temperatura con la ayuda de un termoacutemetro de maacutexima y miacutenima (Anexo 3) 328 Anaacutelisis estadiacutestico Una vez obtenidos los datos se procedioacute a comprobar si estos cumpliacutean con los supuestos de aleatoriedad normalidad y homogeneidad de varianzas que exige este tipo de anaacutelisis En el caso de no cumplirse estos supuestos los datos se transformaron utilizando log10(x+05) raiacutez(x+05) o 1x para normalizarlos
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y enseguida se sometioacute los datos a un anaacutelisis estadiacutestico (ANDEVA) Posteriormente en los casos en que se observoacute diferencias significativas en el ANDEVA se aplicoacute una prueba de rangos muacuteltiples (Tukey) al 5 de significancia Para las variables no parameacutetricas que no cumplieron con los supuestos para un anaacutelisis de varianza se realizoacute la prueba de KruskalndashWallis y las comparaciones muacuteltiples a traveacutes del test de Dunn con un nivel de 5 de significancia
Se utilizaron los programas estadiacutesticos STATGRAPHICS 20 y GRAPHPAD PRISM 5 para el anaacutelisis de datos
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4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
En los siguientes puntos se discuten los resultados obtenidos en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens
En la Figura 3 se observan plaacutentulas de C virescens micropropagadas en medio MS en caacutemara de crecimiento al inicio del ensayo (A) y en invernadero despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten (B)
BA
FIGURA 3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten
A continuacioacuten se presentan los resultados obtenidos para las variables analizadas (Cuadro 2 y 3) de esta manera se pueden visualizar en general los resultados obtenidos en el proceso de aclimatacioacuten durante seis meses
CUADRO 2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de raiacuteces
inicial y final Variables
Hojas finales (nuacutemero)
Raiacuteces iniciales (nuacutemero)
Raiacuteces finales (nuacutemero)
Tamantildeo de plaacutentulas 36 24 37 47 29 46
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 61 43 76
Sustratos 53 36 56 43 29 51
Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 46 27 49
Significa que hay diferencias significativas al 95 Test de Dunn
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Las variables no parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en hojas finales y raiacuteces iniciales en sus rangos de distribucioacuten Las raiacuteces finales no presentaron diferencias seguacuten el sustrato utilizado pero de acuerdo al tamantildeo hubo diferencias en su distribucioacuten
CUADRO 3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas
Variables Altura final de plaacutentulas
(cm) Sobrevivencia
Tamantildeo de plaacutentulas
36 c 567 b 47 b 821 a
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 59 a 908 a
Sustratos 52 a 933 a
41 ab 59 b Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 49 b 772 a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY Las variables parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en altura final de hojas y en sobrevivencia 41 Nuacutemero de hojas finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentulas y de sustratos para la variable nuacutemero final de hojas 411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula Seguacuten el Cuadro 2 y Figura 4 las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero final de hojas Las plaacutentulas pequentildeas de 1-2 cm obtuvieron el nuacutemero maacutes bajo de hojas finales con una media de 36 hojas por plaacutentula lo cual es la mitad de las hojas finales que se obtuvo con las plaacutentulas de mayor tamantildeo (61 hojas aproximado por plaacutentula) Para las plaacutentulas medianas de 2-3 cm se obtuvo una media de 47 hojas por plaacutentula (Figura 4)
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Hojas finales
1-2 cm 2-3cm maacutes de 3 cm0
5
10
15
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn)
BLANCO (2006) sentildeala que plaacutentulas cultivadas in vitro crecen bajo condiciones especiales como alta humedad relativa y baja luminosidad ademaacutes son suplidas con sacarosa Estas condiciones fueron proporcionadas en una caacutemara de crecimiento en el laboratorio donde las plantas micropropagadas no son dependientes por completo de su fotosiacutentesis son heteroacutetrofas Parece ser necesario un estiacutemulo para convertirse en organismos totalmente capaces de sustentar sus propios requisitos de carbono y nitroacutegeno reducido pasando de esta manera a ser autoacutetrofos
Al ser sacadas de un medio in vitro las hojas no estaacuten preparadas para producir su propio alimento y sobreviven gracias a que el medio de cultivo le proporciona los nutrientes necesarios para vivir En este punto muchas de las hojas mueren y nacen hojas nuevas capaces de generar su alimento supliendo asiacute las hojas viejas (SEELYE et al 2003) En este ensayo las plaacutentulas de Chloraea virescens presentaron en general una buena adaptacioacuten al ser sacadas de un medio in vitro
Se observoacute que plaacutentulas con menor tamantildeo al ser aclimatadas y tener menor tejido fue maacutes difiacutecil y maacutes lento que empezaran a generar nuevos tejidos y materia orgaacutenica a partir de dioacutexido de carbono POSPIacuteŠILOVAacute et al (1999) sentildeala que al tener los estomas con desarrollo incompleto maacutes grandes y de forma maacutes redonda pierden maacutes agua lo cual puede provocar una peacuterdida de hojas muriendo asiacute la plaacutentula Por esta razoacuten las plaacutentulas pequentildeas se demoran maacutes tiempo en generar hojas nuevas es por ello que al finalizar este estudio muestran el menor nuacutemero final de hojas 412 Efecto del tipo de sustrato Al analizar la influencia del tipo de sustrato se encontraron diferencias significativas entre los tres sustratos utilizados Seguacuten el Cuadro 2 y la Figura 5 el sustrato donde se obtuvo mejores resultados fue
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turba+perlita en el cual se observoacute un promedio de 53 hojas por plaacutentula siendo Sphagnum el maacutes bajo con 43 hojas por plaacutentula De acuerdo a los resultados del anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados el sustrato turba+perlita tiene mayor cantidad de nitroacutegeno foacutesforo calcio magnesio y azufre disponible comparativamente con los otros dos sustratos (Sphagnum y arena+turba) (Anexo 2)
Hojas finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
Sustratos
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) Para la brotacioacuten y el crecimiento de las plantas se necesita agua y Nitroacutegeno lo que favorece a una mayor tasa de aparicioacuten de hojas lo que se traduce en una mayor cantidad de hojas finales El Nitroacutegeno se encuentra en mayor cantidad en el sustrato turba+perlita debido a lo cual los mejores resultados se obtienen en dicho sustrato 413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Despueacutes de analizados los efectos individuales del tamantildeo y del sustrato al interactuar ambos factores existen diferencias significativas La mejor interaccioacuten se obtuvo con el sustrato turba+perlita y con el mayor tamantildeo de la plaacutentula (Figura 6) Debido a la buena estructura (porosa) de dicho sustrato se podriacutea decir que se favorecioacute la absorcioacuten radicular de nutrientes obteniendo por ello un mayor nuacutemero de hojas finales Para los menores tamantildeos no se observan diferencias significativas obteniendo como promedio 41 hojas por plaacutentula Para el mayor tamantildeo el promedio fue de 6 hojas por plaacutentula
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Hojas finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
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Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 42 Raiacuteces iniciales Este paraacutemetro se evaluoacute luego de la primera etapa de aclimatacioacuten la cual se realizoacute en una sala de aclimatacioacuten del laboratorio Se analizoacute la influencia de diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos sobre la variable nuacutemero raiacuteces iniciales (Anaacutelisis de Kruskal-Wallis en Anexo 7)
FIGURA 7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses de pre aclimatacioacuten
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En la Figura 7 se puede observar los resultados de pre aclimatacioacuten en sala de laboratorio En esta etapa ya es posible ver la presencia de raiacuteces desarrolladas 421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula En el Cuadro 2 se puede observar que las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero inicial de raiacuteces y en la Figura 8 se puede comprobar que para los dos tamantildeos de plaacutentula maacutes pequentildeos no se observa gran cantidad de raiacuteces esto no impidioacute el desarrollo posterior de las plaacutentulas las cuales lograron enraizar al final del estudio Esto se contrapone a lo observado en un estudio de Lapageria rosea donde la presencia de raiacutez y brote para lograr una multiplicacioacuten exitosa de plantas es de vital importancia Incluso algunas plaacutentulas de L rosea no brotan en condiciones in vitro en donde tienen las mejores condiciones nutricionales y hormonales para hacerlo Esto se debe a factores internos de la plaacutentula siendo muy difiacutecil que broten inmediatamente en caacutemara de aclimatacioacuten donde ya dejan de recibir los nutrientes necesarios de manera directa y requieren de balances de energiacutea para poder seguir elongando raiacuteces absorber nutrientes y brotar para poder obtener los carbohidratos necesarios para seguir su crecimiento (BLANCO 2006) El tamantildeo de plaacutentula tiene importancia para el desarrollo de raiacuteces se distingue notoriamente que en los tamantildeos maacutes grandes el nuacutemero de raiacuteces es mayor comparativamente con los tamantildeos pequentildeos donde el nuacutemero de raiacuteces fue escaso Debido a la presencia de maacutes hojas existe una mayor cantidad de aacuterea fotosinteacutetica esta situacioacuten estimula el crecimiento de las raiacuteces para la obtencioacuten de agua y nutrientes
Raices iniciales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
2
4
6
8
10
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o inicial de ra
iacuteces
FIGURA 8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn)
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422 Efecto del tipo de sustrato Para el sustrato turba+perlita se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas en el nuacutemero de raiacuteces con respecto a los dos otros sustratos esto se puede ver en el Figura 9 donde se observa que se obtuvieron los mayores resultados En cualquier medio de crecimiento el espacio no ocupado por un soacutelido se llama porosidad este espacio puede ser ocupado en parte para retener agua y en parte para proporcionarle aire a las raiacuteces La ausencia de uno de estos elementos es perjudicial para las plantas La turba es conocida por tener estas propiedades y la perlita tambieacuten por esta razoacuten se sabe que la mezcla turba-perlita provee propiedades fiacutesicas excelentes como medio de crecimiento y propagacioacuten (INFOAGRO 2007) Estos resultados con turba-perlita (298 de materia orgaacutenica) coinciden con los obtenidos por DIAZ et al (2004) quienes al utilizar un sustrato compuesto por 100 de humus de lombriz para aclimatar cantildea de azuacutecar obtuvieron el mayor nuacutemero de raiacuteces Esto puede atribuirse al importante aporte de materia orgaacutenica del humus (47) lo que le confiere una mejor estructura obtenieacutendose una excelente porosidad del sustrato La aireacioacuten del suelo es necesaria para favorecer la maacutexima absorcioacuten de nutrientes por las raiacuteces Esto tambieacuten sucede en el sustrato turba+perlita el cual posee la mayor cantidad de materia orgaacutenica de los tres sustratos utilizados
Raices iniciales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
2
4
6
8
10
Sustratos
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato En los anaacutelisis para la variable nuacutemero de raiacuteces se puede decir que la mejor interaccioacuten se presentoacute para el sustrato de turba+perlita junto con el mayor tamantildeo de plaacutentulas obteniendo los valores maacutes altos entre los nueve tratamientos La presencia de raiacuteces luego de la micropropagacioacuten aumenta la posibilidad de eacutexito en el transplante ya que se crea un favorable balance de agua Pero esto no quiere
31
decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
10
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
32
En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
33
El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
34
Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
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- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
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- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
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- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
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- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
5
polinio se adhiera al cuerpo del insecto polinizador El fruto es una caacutepsula seca con muchas semillas pequentildeas sin endosperma y con embrioacuten no diferenciado Tienen dos tipos baacutesicos de crecimiento Simpodial en las que el nuevo crecimiento se produce en sentido horizontal a partir de un tallo subterraacuteneo o rizoma generando una sub-unidad capaz de producir una flor o inflorescencia y de ser eventualmente separada de la planta (ej Cattleya) Monopodial en las que el nuevo crecimiento se produce en sentido vertical con lo cual la planta crece constantemente en altura (ej Phalaenopsis) (ORQUIDEAS 2007) 214 Geacuteneros y especies chilenas Seguacuten NOVOA et al (2006) en la familia Orchidaceae se encuentran 49 especies de flora nativa dentro de las cuales se encuentra Chloraea virescens (Willd) Lindl Los geacuteneros de Orchidaceae en Chile son 7
- Aa Bipinnula Brachystele Codonorchis Chloraea Gavilea y Habenaria
Dentro del geacutenero Chloraea existen 31 especies - Chloraea alpina Poepp - Chloraea barbata Lindl - Chloraea bidendata (Poepp y Endl) Correa - Chloraea bletioides Lindl - Chloraea cuneata Lindl - Chloraea chica Speg - Chloraea chrysantha Poepp - Chloraea crispa Lindl - Chloraea cristata Lindl - Chloraea cylindrostachya Poepp - Chloraea disoides Lindl - Chloraea galeata Lindl - Chloraea gaudichaudii Brongn - Chloraea gavilu Lindl - Chloraea grandiflora Lindl - Chloraea heteroglossa Rchbf - Chloraea incisa Poepp - Chloraea lamellata Lindl - Chloraea lechleri Lindl - Chloraea leptopetala Reiche - Chloraea longipetala Lindl - Chloraea magellanica Hookf - Chloraea multiflora Lindl - Chloraea nudilabia Lindl - Chloraea philippii Reichbf - Chloraea picta Phil - Chloraea prodigiosa Reichbf - Chloraea speciosa Poepp - Chloraea virescens Lindl - Chloraea viridiflora Poepp
6
- Chloraea volkmanni Phil (NOVOA et al 2006) 2141 Chloraea virescens Planta perenne de 40-90 cm de altura Sus hojas son de 5-12cm de largo por 15-25cm de ancho estrechas lanceoladas agudas dispuestas en roseta basal generalmente marchitas al final de la antesis Su escapo floral tiene vainas caulinares lanceoladas agudas y distantes La inflorescencia es de 8-20cm de largo densa con 10-15 flores erguidas Sus flores son blancas con estriacuteas y aacutepices verdes El seacutepalo dorsal es de 16-33mm de largo por 4-6mm de ancho oblongo lanceolado obtuso algo coacutencavo a veces ligeramente estrechado al centro aacutepice algo carnoso Los seacutepalos laterales de 18-33mm de largo por 4-5mm de ancho son ensiformes con aacutepice obtuso engrosado verde negruzco a veces espatulado y dentado a veces verrugoso Los peacutetalos son de 15-23mm de largo por 5-58mm de ancho estrechamente aovados obtusos verrugosos con maacutes frecuencia solo la mitad inferior a veces el borde denticulado y carnoso El labelo de 15-26mm de largo por 10-20mm de ancho es mas o menos romboidal a levemente trilobulado El loacutebulo central tiene 5-7 nervios longitudinales recorridos por laminillas interrumpidas membranaacuteceas con segmentos falciformes de borde carnoso de color verde Los nervios laterales que se ramifican oblicuamente hacia el aacutepice en los loacutebulos laterales tienen pequentildeas laminillas y verrugas y su borde es laciniado inciso en la mitad apical hacia la base denticulado aacutepice generalmente engrosado La columna es de 12-18mm de largo delgada blanca con estriacuteas anaranjada La base de la zona nectariacutefera tiene un color amarillo-limoacuten con maacuteculas anaranjadas orificio nectario verde El ala de la columna es recta y estrecha El estigma es triangular y globoso La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la Vordf (Vintildea del Mar) hasta la XIordf Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile Sin embargo es posible que tenga una distribucioacuten maacutes restringida por que se le ha confundido con Chloraea incisa Su floracioacuten es desde noviembre a febrero y su estado de conservacioacuten no estaacute evaluado (NOVOA et al 2006) En el Anexo 14 se incluyen antecedentes sobre su distribucioacuten y eacutepoca de floracioacuten
7
FIGURA 1 Chloraea virescens FUENTE NOVOA et al (2006) 22 Requerimientos de las orquiacutedeas Para tener eacutexito en el cultivo de orquiacutedeas hay que tomar en cuenta factores de importancia como son 221 Agua El riego correcto es el principio y el fin del cuidado de orquiacutedeas (ROLLKE 2005) Este elemento es primordial para las orquiacutedeas asiacute como tambieacuten para todo tipo de plantas En el caso de eacutestas se dice muchas veces que la calidad del agua usada es el factor maacutes importante en el cultivo de orquiacutedeas ya que el porcentaje maacutes alto de muerte se produce por el exceso de este factor (SHEEHAN 1980) Hay que tomar en cuenta que la mayoriacutea de las orquiacutedeas son epiacutefitas lo que significa que tienen sus raiacuteces a la vista gracias a las cuales absorben el agua de lluvia Se recomienda un sustrato poroso y de reaccioacuten neutra ya que de esta manera el agua escurre sin acumularse no permitiendo la pudricioacuten de las raiacuteces Para las orquiacutedeas terrestres es lo mismo solo que se pueden regar con maacutes frecuencia pero sin mantenerlas saturadas (OSPINA y DRESSLER 1979) Seguacuten DUMOIS (2007) el agua es lo maacutes difiacutecil de controlar ya que depende de muchas variables como por ejemplo humedad relativa tipo de sustrato intensidad luminosa temperatura y circulacioacuten de aire Ademaacutes muchas orquiacutedeas necesitan un periacuteodo de receso vegetativo que si no es respetado resulta en ausencia de floracioacuten En general hay que antildeadir agua en abundancia cuando la planta se encuentra en crecimiento activo y reducirla despueacutes de la floracioacuten
8
Las especies con pseudobulbos almacenan agua y estaacuten preparadas para su periacuteodo de receso Otras que no cuentan con estos oacuterganos requieren de humedad maacutes constante 222 Luz Ninguna planta puede crecer sin la iluminacioacuten adecuada Muchas orquiacutedeas viven en las alturas de los aacuterboles y estaacuten expuestas a plena luz del sol otras crecen en el suelo selvaacutetico protegidas del sol por espesos follajes (ROLLKE 2005) La funcioacuten principal de la luz es activar el proceso de fotosiacutentesis Los cultivadores han estudiado la luz y han descubierto que hay orquiacutedeas que florecen con diacutea largo y otras con diacutea corto (OSPINA y DRESSLER 1979) Gracias a la fotosiacutentesis se convierten los minerales presentes en el ambiente en savia y nutrientes Hojas oscuras y falta de floracioacuten indican falta de luz hojas amarillas e incluso quemadas apuntan hacia un exceso de sol (DUMOIS 2007) 223 Fertilizacioacuten Las orquiacutedeas necesitan los mismos nutrientes que otras plantas Un abono para orquiacutedeas debe contener los nutrientes principales nitroacutegeno (N) foacutesforo (P) y potasio (K) asiacute como tambieacuten oligoelementos como hierro (Fe) magnesio (Mg) zinc (Zn) estantildeo (Sn) y manganeso (Mn) (ROLLKE 2005) Por otra parte la fertilizacioacuten depende de varios factores dentro de los cuales los maacutes criacuteticos son
- El medio utilizado - La edad de las plantas - Estado de las plantas ya sea floracioacuten crecimiento reposo
En cuanto a absorcioacuten se ha demostrado que es igual de eficiente por viacutea foliar como a traveacutes de las raiacuteces Es necesario tener en cuenta algunas reglas baacutesicas a la hora de fertilizar las orquiacutedeas (Asociacioacuten Costarricense de Orquideologiacutea ACO 1970)
1 Regar las plantas antes de fertilizar 2 Fraccionar las dosis 3 Aplicar el fertilizante de forma liacutequida 4 No usar fertilizantes soacutelidos 5 No fertilizar las plantas recieacuten plantadas 6 No fertilizar plantas en reposo 7 No abonar plantas enfermas
224 Temperatura Es conocido el hecho de que cada planta tiene liacutemites de temperatura dentro de los cuales prospera o perece De ahiacute la necesidad de conocer las temperaturas correspondientes al lugar de donde viene cada especie de orquiacutedea pudiendo proporcionarle la temperatura adecuada (OSPINA y DRESSLER 1979) Se puede clasificar a las orquiacutedeas como de clima caacutelido (temperatura nocturna miacutenima de 20ordmC) templado (miacutenimo de 13 a 18ordmC) y de ambiente friacuteo (de 10 a 13ordmC) (DUMOIS 2007)
9
Seguacuten SHEEHAN (1980) las temperaturas ideales para las orquiacutedeas de origen tropical son 10ordmC en la noche y entre 21ordm - 24ordmC durante el diacutea 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas La micropropagacioacuten de orquiacutedeas estaacute en vanguardia hoy en diacutea El estudio de cultivo de tejido de orquiacutedeas se lleva a cabo en muchos laboratorios de todo el mundo (ARDITTI and ERNST 1992) 231 Biologiacutea de las semillas Las semillas de orquiacutedeas son conocidas usualmente como semillas polvo porque son minuacutesculas y contienen pocas reservas de alimento Estas semillas por lo general no germinan en el medio natural a menos que sean infectadas por un hongo micorriacutezico Este hongo abastece a las plantas joacutevenes con azuacutecares y nutrientes hasta que sean lo suficientemente grandes para fabricar su propio alimento Cuando la semilla germina produce una masa indiferenciada de ceacutelulas llamada protocormo Manteniendo las condiciones normales el protocormo continuaraacute su crecimiento por varias semanas meses o incluso antildeos dependiendo de la especie hasta que alcance la edad apropiada para producir raiacuteces y hojas En el caso de orquiacutedeas terrestres es de vital importancia que la relacioacuten orquiacutedea-hongo se conserve durante los estados tempranos del ciclo de vida de la planta ya que el protocormo enterrado no puede fabricar alimento por siacute mismo Por otro lado los protocormos de las orquiacutedeas epiacutefitas son comuacutenmente verdes lo que les posibilita producir parte de su alimento La relacioacuten orquiacutedea-hongo no ha sido en su totalidad investigada para el caso de las orquiacutedeas tropicales (McKENDRICK 2000) 232 Germinacioacuten simbioacutetica y no simbioacutetica de semillas Mediante la germinacioacuten in vitro las semillas germinan en frascos de vidrio o plaacutestico Estos frascos contienen en su interior un medio nutritivo solidificado con agar con todos los azuacutecares y minerales necesarios para la germinacioacuten y crecimiento de las semillas Hay dos tipos de germinacioacuten la simbioacutetica y la asimbioacutetica En la germinacioacuten simbioacutetica las semillas se siembran junto con una pequentildea cantidad del hongo micorriza adecuado Dicho hongo crece en el medio coloniza a las semillas que estaacuten en proceso de germinacioacuten y se produce una relacioacuten simbioacutetica la cual alimentaraacute al protocormo hasta que este sea capaz de producir sus hojas y se vuelva autotroacutefico Esta teacutecnica es usada principalmente en propagacioacuten de orquiacutedeas terrestres en zonas templadas La germinacioacuten asimbioacutetica se usa principalmente en propagacioacuten de orquiacutedeas tropicales que crecen maacutes raacutepido que sus parientes de zonas templadas Para este tipo de germinacioacuten se necesita un medio de cultivo maacutes complejo ya que todos los nutrientes orgaacutenicos e inorgaacutenicos asiacute como tambieacuten los azuacutecares deben estar en forma disponible pues no existe la intermediacioacuten del hongo (McKENDRICK 2000) 233 Condiciones de esterilidad Tanto para la germinacioacuten simbioacutetica como para la asimbioacutetica es de vital importancia que los frascos las semillas aparatos y el medio esteacuten esteacuteriles desde el principio del proceso Esto debido a que cualquier hongo o bacteria que se introduzca creceraacute maacutes raacutepido que las semillas ocupando su espacio hasta matarlas Esto se evita gracias al autoclave el cual regulado a 12 atm y 120ordmC por 20 minutos mata hongos o bacterias presentes en el medio (McKENDRICK 2000)
10
2331 Siembra de las semillas Las semillas pueden ser recolectadas desde caacutepsulas verdes o maduras La caacutepsula verde que estaacute madurando estaacute llena de semillas y no se deforma cuando se aprieta con las pinzas Estas semillas pueden ser almacenadas por algunas semanas en un lugar refrigerado con bastante aireacioacuten Las semillas se pueden sembrar a partir de caacutepsulas verdes o semillas secas A continuacioacuten se muestran las ventajas y desventajas de ambos meacutetodos
- Siembra a partir de caacutepsulas verdes Si las caacutepsulas se mantienen intactas el interior (las semillas) se mantiene esteacuteril Por lo tanto si se esteriliza la parte exterior de las mismas donde hongos y bacterias pueden desarrollarse y se abren las caacutepsulas bajo condiciones esteacuteriles y las semillas podraacuten mantenerse desinfectadas
La ventaja de este meacutetodo es que no se requiere de esterilizacioacuten de las semillas lo que provoca su deterioro Otro punto a favor es que algunas semillas podriacutean germinar maacutes raacutepido que las provenientes de caacutepsulas maduras por los mecanismos de dormancia La desventaja es que en este caso todas las semillas deben ser utilizadas o eliminadas mientras que las semillas maduras se pueden almacenar Tambieacuten se debe considerar que las semillas sembradas a partir de caacutepsulas que no han madurado lo suficiente podriacutean germinar lentamente o simplemente no germinar - Siembra a partir de semillas secas En este caso una vez que la caacutepsula es abierta las semillas dejan de ser esteacuteriles y requieren de un proceso de esterilizacioacuten Comuacutenmente se utiliza una solucioacuten de hipoclorito de sodio hipoclorito de calcio o peroacutexido de hidroacutegeno Las semillas se agitan dentro de la solucioacuten que ademaacutes contiene una gota de detergente para ldquohumedecerlasrdquo luego se las enjuaga con agua destilada y se las siembra en el medio preparado La ventaja de este meacutetodo es que las semillas pueden ser colectadas secadas al aire almacenadas por varios meses en el refrigerador y utilizarlas cuando sea necesario Se debe considerar que la siembra ya sea de caacutepsulas verdes o de semillas secas estaacute determinado por la eacutepoca en que se colectan (McKENDRICK 2000) 234 Trasplante En la caacutemara de incubacioacuten las plaacutentulas se han desarrollado en condiciones limpias y en un ambiente cerrado por lo que deben acostumbrase gradualmente al ambiente exterior antes de ser trasplantadas a las macetas Tambieacuten la temperatura y la luz la cual es baja han sido constantes durante el cultivo in vitro En el medio natural la temperatura y la luz variacutean constantemente por lo que las nuevas plantas deben estar protegidas de la fuerte luz solar la cual puede quemar las hojas con soacutelo una pequentildea cantidad de eacutesta La humedad en los frascos es alta y las plantas estaacuten protegidas de ataques por hongos o bacterias Ademaacutes las plaacutentulas han crecido bajo condiciones de alta humedad y por lo tanto tendraacuten cutiacuteculas deacutebiles por lo que necesitan acostumbrase a medios menos huacutemedos antes de ser transplantadas
11
Para el trasplante se deben colocar los frascos en un lugar protegido de la lluvia para que se aclimaticen a las nuevas condiciones de luz y temperatura Se deben dejar por 2 a 4 semanas en los frascos tapados Luego se debe ir aflojando las tapas para dejar entrar pequentildeas cantidades de aire hasta el punto de dejarlas descubiertas Se debe revisar si hay hojas marchitas y ver que el sustrato esteacute huacutemedo
Lo ideal es dejarlas sin tapa durante una semana antes de pasarlas a las macetas Para el trasplante se debe elegir un sustrato adecuado para el tipo de planta humedecerlo y transplantar las plantas con cuidado de no dantildear las raiacuteces y evitando la deshidratacioacuten En esta etapa tambieacuten se debe dejar las macetas selladas para evitar una raacutepida deshidratacioacuten e ir abrieacutendolas paulatinamente (McKENDRICK 2000)
24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas 241 Orquiacutedeas terrestres 2411 Cypripedium Esta es una orquiacutedea terrestre de zonas templadas se desarrolla en el Hemisferio Norte como por ejemplo en Guatemala y en Honduras pero donde se encuentra principalmente es en China Su forma maacutes comuacuten de propagacioacuten es in vitro a partir de semillas La forma maacutes eficiente es a partir de semillas inmaduras Existe un intervalo de tiempo entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten eacuteste dependeraacute de la especie y de la zona donde se desarrolle Se asume que existen aproximadamente cuatro semanas entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten El oacuteptimo para una buena germinacioacuten de Cypripedium es entre 42 y 60 diacuteas despueacutes de la polinizacioacuten y entre 14 y 32 diacuteas despueacutes de la fertilizacioacuten La germinacioacuten ocurre entre la segunda y cuarta semana despueacutes de ser sembradas y los protocormos deberiacutean ser cambiados de medio de cultivo cada dos a cuatro meses si no se corre el riesgo de sufrir agotamiento de nutrientes Los rizomas y las raiacuteces se empiezan a desarrollar a partir de los siete meses para luego dar lugar a las primeras hojas Para obtener un buen transplante se deben tener raiacuteces de miacutenimo un centiacutemetro de largo El desarrollo de raiacuteces se ve potenciado al tener un periacuteodo corto de bajas temperaturas (10degC) exposicioacuten a la luz reduccioacuten en la concentracioacuten de iones del medio de cultivo o transferirlas a un compost esteacuteril Al tener raiacuteces suficientes y el tamantildeo adecuado se podraacuten llevar las plantas al lugar donde creceraacuten definitivamente En el momento del transplante las plantas son muy susceptibles al desecamiento por lo cual lo ideal es que los brotes sean maacutes chicos que las raiacuteces El mejor sustrato seriacutea aquel donde crece naturalmente la orquiacutedea (RAumlNNBAumlCK 2007) 2412 Preservacioacuten in vitro de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes Este estudio fue hecho para establecer que parte de tejido es viable para la micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes del noreste de Europa pudiendo asiacute reestablecer dichas orquiacutedeas a sus aacutereas correspondientes La propagacioacuten in vitro de orquiacutedeas
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terrestres de clima templado es maacutes difiacutecil que las orquiacutedeas epiacutefitas de clima subtropical y tropical Las orquiacutedeas terrestres tienen requerimientos maacutes estrictos que las epiacutefitas y se conoce menos sobre sus necesidades especiacuteficas (VAASA y ROSENBERG 2004) En Estonia existen 36 especies de orquiacutedeas terrestres pero solo tres estaacuten bajo proteccioacuten Dactylorhiza baltica Dactylorhiza ruthei Dactylorhiza praetermissa Como explantes para este estudio en el caso de D baltica se ocuparon protocormos en los otros dos casos se utilizaron semillas semi maduras las cuales fueron colectadas siete y diez semanas despueacutes de ser polinizadas Para D baltica se ocupoacute el medio Murashige y Skoog suplementado con 05 mgL de aacutecido naftaleacuten aceacutetico (ANA) y 2 mgL de isonpentenyl adenina Para el caso de las semillas semi maduras se ocuparon los medios de Lindemann de Heller de Norstog y de Murashige y Skoog como control
La composicioacuten del medio y la madurez de las semillas influye mucho en el desarrollo de las orquiacutedeas in vitro Se ha demostrado que se necesita una alta concentracioacuten de microelementos para obtener una correcta germinacioacuten de las semillas Tambieacuten se puede decir que los primeros tres meses son los de mayor crecimiento luego de este tiempo el crecimiento se vuelve maacutes lento (VAASA y ROSENBERG 2004)
Luego de cuatro semanas de crecimiento de D baltica el 60 de los explantes de meristemas apicales empezaron a crecer en cambio los de meristemas laterales no expresaron ninguacuten tipo de crecimiento Las raiacuteces empezaron su desarrollo luego de dos meses despueacutes de la siembra
En el caso de D ruthei y D praetermissa la germinacioacuten se produjo despueacutes de dos meses desde la inoculacioacuten Luego de cuatro y seis meses el mayor crecimiento fue observado en el medio Norstog superando en 14 al medio testigo Murashige y Skoog (VAASA y ROSENBERG 2004)
2413 Longevidad de semillas de orquiacutedeas terrestres Por lo general las orquiacutedeas producen muchas pero pequentildeas semillas que contienen muy pocas reservas de alimento Dichas semillas estaacuten estructuralmente adaptadas para ser dispersadas por el viento pero poco se sabe del destino de eacutestas luego de ser dispersadas Algunos estudios de viabilidad de semillas indican una sobrevivencia de uno a dos antildeos en orquiacutedeas de clima templado Las semillas que son guardadas en laboratorio duran mucho maacutes tiempo Se estudioacute la viabilidad de siete especies de orquiacutedeas norteamericanas dentro de las cuales se encuentran Goodyera pubescens y Liparis liliifolia Las semillas de eacutestas se colocaron en bolsas con suelo y sustratos de bosques provenientes de sus haacutebitats naturales (WHIGHAM et al 2005) En Goodyera pubescens la mayoriacutea de las semillas germinaron en un antildeo Cuatro otras especies germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero algunas semillas no germinadas despueacutes de siete antildeos seguiacutean siendo viables En la especie Liparis liliifolia semillas que han estado cuatro antildeos bajo observacioacuten han tenido una tasa de
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germinacioacuten de un 68 al ser sembradas in vitro junto con el hongo micorriacutezico adecuado Las dos especies restantes no germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero las semillas fueron evaluadas como intactas y testeadas positivamente en cuanto a su viabilidad despueacutes de cuatro antildeos en el suelo Estas observaciones fueron interpretadas como diferentes estrategias para especies especiacuteficas de germinacioacuten in situ (WHIGHAM et al 2005) 2414 Sobrevivencia de orquiacutedeas terrestres transplantadas a sectores urbanos La conservacioacuten de poblaciones de orquiacutedeas silvestres depende del establecimiento de las orquiacutedeas propagadas a los campos Sin embargo se conoce muy poco de los factores bioacuteticos que influencian el establecimiento de orquiacutedeas terrestres a sus haacutebitats naturales Un experimento fue establecido para medir la sobrevivencia de seis especies durante su primer periacuteodo de crecimiento seguido del transplante a un sector urbano en Australia (SCADE et al 2006)
Las orquiacutedeas germinadas simbioacuteticamente crecieron en laboratorio durante cinco meses antes de establecer la plantacioacuten en sitios adyacentes con alta o baja cobertura de malezas Existioacute una muerte gradual de las plaacutentulas durante el primer periacuteodo de crecimiento primeramente por ataque de insectos no siendo evitado por la presencia de una malla cobertora Los iacutendices de sobrevivencia variacutean desde 49 para Microtis media una especie capaz de crecer en un ambiente atiacutepico hasta un 21 para Caladenia arenicola la orquiacutedea nativa maacutes comuacuten de esos sitios Sin embargo no todas las orquiacutedeas sobrevivientes producen tubeacuterculos por lo que la tasa de sobrevivencia despueacutes del primer periacuteodo seco disminuye
La sobrevivencia de las orquiacutedeas sembradas no puede ser comparada con orquiacutedeas de la misma especie que crecieron en los mismos lugares ya que no existioacute la presencia del hongo compatible para estas orquiacutedeas (SCADE et al 2006)
2415 Micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres En India dos orquiacutedeas muy importantes para la horticultura del geacutenero Anoectochilus fueron exitosamente propagadas Noacutedulos aislados de A sikkimensis colectadas en Himalaya y A regalis colectadas en India fueron cultivadas in vitro durante 12 semanas para obtener un maacuteximo de 48 a 56 protocormos y brotes obteniendo como resultado un 95 y 98 de eficiencia respectivamente Durante el repicado de los explantes in vitro de A regalis se observoacute que el nuacutemero total de brotes obtenidos a partir de noacutedulos fue 214 asiacute como tambieacuten 82 puntas de brotes En cambio para A sikkimensis fueron mucho maacutes bajos 123 y 43 respectivamente teniendo un crecimiento maacutes lento pero plantas maacutes fuertes Las raiacuteces de 4 a 6cm crecieron con la presencia de NAA (270 microM ) en el medio asiacute como tambieacuten con carbono activado (02) Durante la aclimatacioacuten la tasa de establecimiento fue entre 95 y 98 Luego de seis meses en invernadero las plantas de A regalis fueron transferidas a bosque nativo donde se obtuvo una tasa de
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sobrevivencia de entre 70 y 95 despueacutes de 12 meses Estas plantas establecidas en bosque nativo estaacuten libres de cualquier defecto morfoloacutegico y de crecimiento (GANGAPRASAD et al 2000) 242 Orquiacutedeas epiacutefitas Estas orquiacutedeas viven en los aacuterboles pero no obtienen de eacuteste su alimento no son paraacutesitas 2421 Preservacioacuten de Cattleya walkeriana usando propagacioacuten in vitro El geacutenero Cattleya se encuentra en Meacutexico y Ameacuterica Central asiacute como tambieacuten en Venezuela Colombia y las laderas de los Andes Esta orquiacutedea tambieacuten se encuentra en varias regiones del Brasil creciendo en aacuterboles rocas cerca de riacuteos lagos y pantanos Las flores de esta orquiacutedea son conocidas debido a su hermosura y a causa de la destruccioacuten de su haacutebitat y a la excesiva coleccioacuten de eacutestas se encuentra en extincioacuten
La composicioacuten del medio de cultivo es esencial para la propagacioacuten in vitro ya que suple todos los nutrientes necesarios para el desarrollo y seraacute distinto dependiendo de cada especie en este caso se utilizoacute la mitad de los macronutrientes del medio Muchos autores sugieren el uso de carboacuten activado en el medio ya que por lo general en muchas especies aumenta el desarrollo de las raiacuteces En este estudio se probaron distintas dosis de carboacuten activado 1 2 4 y 6gL con un pH de 6 (TADEU DE FARIA et al 2002) Las semillas se obtuvieron de flores artificialmente polinizadas en invernadero Plaacutentulas de aproximadamente un centiacutemetro fueron seleccionadas y cultivadas nuevamente en el medio de cultivo Murashige y Skoog pero esta vez con las diferentes dosis de carboacuten activado Se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces el nuacutemero de brotes y el peso de la materia verde total Durante el autoclavado se produce normalmente una hidroacutelisis de sacarina la cual es de 10 aproximadamente este porcentaje aumenta considerablemente al agregar un 1 de carboacuten activado llegando a ser de 95
El desarrollo de las plaacutentulas de C walkeriana aumentan con una mayor concentracioacuten de carboacuten activado asiacute como tambieacuten un mayor tiempo de cultivo El resultado fue que la dosis ideal para el desarrollo de esta orquiacutedea es 2gL de carboacuten activado (TADEU DE FARIA et al 2002) 2422 Establecimiento de cultivos in vitro y micropropagacioacuten de Cattleya aurantiaca (Bateman ex Lindl) Por medio de siembra in vitro se logroacute el establecimiento de C aurantiaca con alto porcentaje de germinacioacuten y desarrollo de protocormos Para la oacuteptima formacioacuten de callo y para la proliferacioacuten de protocormos se determinaron los medios oacuteptimos (MS 10 mgL ANA 10 mgL BA) asiacute como tambieacuten de manera directa sobre explantes de hoja y pseudobulbos (MS 01 mgL ANA 01 mgL GA3)
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Con este uacuteltimo medio tambieacuten se logroacute una oacuteptima regeneracioacuten y desarrollo de plaacutentulas Los medios liacutequidos (sin agitacioacuten) son una buena opcioacuten para conseguir la produccioacuten masiva de protocormos ya que con ellos se optimizoacute la micropropagacioacuten de C aurantiaca Las plaacutentulas micropropagadas presentaron alto porcentaje de sobrevivencia y buen desarrollo despueacutes de su trasplante y aclimatacioacuten lo cual demuestra que es un buen sistema de propagacioacuten para C aurantiaca (GUTIERREZ y SALGADO 2007) En cuanto a transplante y aclimatacioacuten despueacutes de 45 diacuteas de desarrollo in vitro las plaacutentulas de un tamantildeo entre 3 y 5 cm con raiacuteces bien desarrolladas fueron llevadas a condiciones ex vitro eliminando los restos de medio de cultivo con agua potable y ocupando un sustrato de partes iguales de tezontle y corteza de encino cubierta con hojarasca de encino finamente molida Se mantuvieron cubiertas durante 15 diacuteas abriendo cada dos diacuteas hasta poder retirar la tapa en 30 diacuteas Despueacutes de dos meses de haber sido retiradas del cultivo in vitro las plaacutentulas presentaron 70 de sobrevivencia y alcanzaron una altura de hasta 7 cm presentando nuevas hojas y raiacuteces las plantas se muestran vigorosas y capaces de continuar su crecimiento en condiciones ambientales de invernadero (GUTIERREZ y SALGADO 2007)
2423 Establecimiento in vitro y regeneracioacuten de plantas de Laelia autumnalis (Llave y Lex) Lindl Para este estudio se obtuvieron las semillas de una caacutepsula desarrollada despueacutes de 6 meses de la floracioacuten las cuales se sembraron in vitro sin presentar contaminacioacuten ya que la siembra por este meacutetodo es muy eficiente en comparacioacuten al cultivo de semillas libres donde algunas veces se presenta la contaminacioacuten Las observaciones se realizaron cada 15 diacuteas la germinacioacuten se detectoacute en los primeros 15 diacuteas en la mayoriacutea de los medios de cultivos probados con la presencia de protocormos de 1mm de diaacutemetro (HUAPEO y SALGADO 2004) El porcentaje de germinacioacuten que se obtuvo de las semillas cultivadas in vitro de L autumnalis fue de 95 a 100 en todos los medios de cultivo la uacutenica diferencia fue el tiempo entre las germinaciones A excepcioacuten de las semillas cultivadas en el medio MS 100 la germinacioacuten del 100 se obtuvo hasta los 30 diacuteas de cultivo mientras que en el primero la germinacioacuten fue a los 15 diacuteas del cultivo Las plaacutentulas con raiacutez y un par de hojas se lograron a los 90 diacuteas de cultivo en el medio MS 100 alcanzando 07 mm de altura Estas plaacutentulas fueron subcultivadas en medio MS con 05 mgl de ANA y 01 mgl de GA3 para tener plaacutentulas fuente de explante (segmentos de hojas) un medio oacuteptimo de desarrollo de plaacutentulas de L speciosa No fue necesario probar otros medios de cultivos ya que se hicieron pruebas anteriores que demostraron que era el adecuado
Las plaacutentulas de 6 meses de cultivo in vitro despueacutes de su germinacioacuten presentaron una altura promedio de 5 cm con raiacuteces con velamen y hasta dos pares de hojas Segmentos de hoja de eacutestas fueron cultivadas en el medio MS conteniendo ANA BA y GA3 en diferentes concentraciones y se realizaron observaciones cada 30 diacuteas para determinar medios inductores de callo protocormos y raiacuteces La mejor respuesta en formacioacuten de callo fue observada en los segmentos de hoja de plaacutentulas de L autumnalis cultivados en MS con 1 mgl de ANA BA y GA3 iniciando la induccioacuten de
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eacuteste desde los 30 diacuteas de cultivo solamente en un 70 de los explantes cultivados El 100 se logroacute a los 90 diacuteas de cultivo observando callo abundante alrededor de todo el tejido de color blanco con puntos pigmentados de color verde La regeneracioacuten de protocormos de esta orquiacutedea se establecioacute con la siembra de segmentos de hoja de plaacutentulas de 6 meses de edad de manera directa o a partir de callos En callos la produccioacuten fue oacuteptima en el medio MS con 01 mgl de ANABAGA3 ya que a los 60 diacuteas se obtuvieron 50 protocormos por segmento de callo Solamente se produjeron 10 protocormos por explante al cultivarse los segmentos de hoja en MS con 01 mgl de ANABAGA3 a los 120 diacuteas de cultivo (HUAPEO y SALGADO 2004) 25 Aclimatacioacuten Aclimatacioacuten significa que el hombre intercede y guiacutea el proceso de acondicionamiento de las plantas hasta que eacutestas sean aptas para crecer en el campo yo invernadero
Un alto nuacutemero de plantas micropropagadas no sobreviven al cambio desde el cultivo in vitro hacia el ambiente exterior ya sea en campo o invernadero Eacutestos dos uacuteltimos tienen menor humedad relativa niveles maacutes altos de luminosidad y un ambiente seacuteptico los cuales son maacutes estresantes para las plantas micropropagadas La mayoriacutea de las especies que crecen in vitro necesitan un proceso de aclimatacioacuten pudiendo obtener asiacute un nuacutemero suficiente de plantas vivas y vigorosas para trasplantar al suelo (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991)
La aclimatacioacuten no es uacutenicamente para micropropagacioacuten siendo usada ademaacutes en propagacioacuten convencional durante antildeos Despueacutes de cortar las hojas y de haber formado raiacuteces por lo general son aclimatadas antes de ser llevadas al campo o invernadero Ejemplos de dos teacutecnicas comunes son bajar gradualmente la humedad y mantener el nivel de luz con un 50 de sombra antes de trasladarlos al campo Las raiacuteces que han sido cortadas y mal limpiadas muchas veces son focos de infeccioacuten En estos casos las plantas muestran signos de marchitez hojas necrosadas y tambieacuten se puede llegar a la muerte de eacutestas El cultivo in vitro reduce la necesidad de fotosiacutentesis ya que las condiciones de la caacutemara de incubacioacuten proveen a la planta de sacarosa u otro azuacutecar Tambieacuten en estas condiciones se reduce el stress por patoacutegenos al ser un ambiente aseacuteptico Todo esto se traduce en que las plantas micropropagadas no son aptas para el campo yo invernadero (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 251 Stress hiacutedrico El stress hiacutedrico puede ser el resultado de una excesiva transpiracioacuten de las diferentes partes aeacutereas de las plantas especialmente de las hojas o por una inadecuada absorcioacuten de agua por parte de las raiacuteces La cutiacutecula y los estomas son la ruta primaria de peacuterdida de agua desde de las hojas provenientes de esta teacutecnica reproductiva 2511 Cutiacutecula La cutiacutecula es una membrana compuesta por una matriz de cutina que a su vez se encuentra cubierta en su superficie por ceras cuya funcioacuten primaria consiste en limitar la peacuterdida de agua por transpiracioacuten La permeabilidad del agua a traveacutes de la cutiacutecula se ve influenciada principalmente por la estructura y la cantidad de
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ceras cuticulares y epicuticulares no vieacutendose afectada la peacuterdida de agua por el grosor de eacutesta o la naturaleza quiacutemica de la matriz de la cutina La estructura cristalina de la parte encerada de las hojas es distinta en las plantas micropropagadas con respecto a las plantas que crecen en el campo La cera epicuticular de las hojas de plantas in vitro tienen una proporcioacuten maacutes alta de esteres y de componentes polares por el contrario tienen unas cadenas de hidrocarbonos mucho maacutes cortas Esto hace que las plantas in vitro pierdan maacutes agua que las cultivadas en campo o invernadero
Las plantas que han crecido en el campo son naturalmente de color verde pero el color de las plantas cultivadas in vitro es diferente y se puede ver a simple vista Las plantas que son pasadas a invernadero y que tengan un color verde se aclimatan de mejor forma al ambiente exterior (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 2512 Estomas La estructura estomaacutetica y su funcionamiento han sido implicados recurrentemente en el desbalance de agua exhibido por plantas micropropagadas al momento de ser removidas del cultivo in vitro Estudios con microscopiacutea de scanner electroacutenico han indicado que la estructura estomaacutetica presente en algunas especies de plantas cultivadas in vitro difieren marcadamente de las cultivadas en invernadero o en el suelo Debido a que las primeras presentan estomas de mayor tamantildeo y maacutes redondos a diferencia de las plantas cultivadas de manera normal que presentan estomas maacutes pequentildeos y eliacutepticos lo que resulta en una deshidratacioacuten maacutes raacutepida en el caso de las provenientes de cultivo in vitro (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 252 Humedad Debido a la anatomiacutea y la condicioacuten fisioloacutegica de las plantas desarrolladas in vitro donde se ha mantenido una alta humedad relativa es necesario regar al momento del traslado para obtener una alta sobrevivencia Muchos laboratorios aseguran que hay que evitar tener un sistema de aspersioacuten ya que se produce el ambiente necesario (muy huacutemedo) para la aparicioacuten de hongos algas o bacterias Otros meacutetodos incluyen el uso de humidificadores o poner las macetas en un lugar cerrado donde se retenga vapor para esto se pueden usar por ejemplo tapas de polietileno Este meacutetodo es relativamente econoacutemico pero se debe tener control del calor y monitorear la falta de agua (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 253 Luz Durante la etapa in vitro las plantas estaacuten expuestas a altos niveles de luminosidad lo que se traduce en hojas delgadas Antes del traslado se recomienda mantener las plantas con un 50 de sombra para asiacute poder aclimatarlas de mejor manera esto debido a que las plantas micropropagadas tienen un bajo control sobre la transpiracioacuten y un inadecuado mecanismo de fotosiacutentesis La sombra reduce la transpiracioacuten evitando excesivas peacuterdidas de agua asiacute como tambieacuten el exceso de luz destruye las moleacuteculas de clorofila Luego del periacuteodo bajo sombra se deben mover las macetas gradualmente hacia el nivel de luz al cual seraacute llevado para su crecimiento final (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 254 Temperatura La temperatura del aire y del medio o sustrato de crecimiento estaacute generalmente controlado durante el periacuteodo de aclimatacioacuten El calor es necesario en los meses de invierno y el friacuteo (enfriar) es esencial en los meses de verano Ajustando la cantidad de sombra y humedad se obtiene un control sobre la temperatura El
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enfriamiento se puede obtener gracias a ventilacioacuten abanicos niebla o aire acondicionado El calor puede provenir del sistema existente en el edificio o invernadero donde esteacuten ubicadas las macetas o por las laacutemparas ocupadas para el control del fotoperiacuteodo El rango de temperatura que se mantiene por lo general es entre los 13 y 30ordmC y esta determinado principalmente por la especie en cuestioacuten La temperatura de la zona donde se encuentran las raiacuteces es muy importante para el crecimiento lo ideal es que dicho sector tenga una mayor temperatura que el aire fomentando el crecimiento de las raiacuteces e incrementando la humedad alrededor de la planta Durante el verano esto es difiacutecil de obtener ya que la temperatura del aire es muy alta debido a la alta radiacioacuten solar Terminado el proceso de aclimatacioacuten esto ya no es necesario (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 255 Fotosiacutentesis Las plantas sufren un cambio radical cuando son removidas desde cultivo in vitro ya que son forzadas a cambiar de heterotroacuteficas a autotroacuteficas y la fotosiacutentesis se vuelve fundamental para la sobrevivencia Las hojas de las plantas in vitro no estaacuten formadas para hacer fotosiacutentesis ya que en la caacutemara de incubacioacuten no se produce un fuerte intercambio gaseoso esto debido a que la sacarosa es entregada a traveacutes del medio de cultivo Las hojas de las plantas que son trasladadas al campo o invernadero sufren deterioro debido a que no estaacuten formadas para la fijacioacuten de carbono Esto se produce por un tiempo aproximado de cuatro semanas despueacutes de las cuales las hojas nuevas suplen a las viejas Otro punto es que las hojas de las plantas cultivadas in vitro contienen menor proporcioacuten de clorofila que las plantas que han crecido normalmente en el campo En un estudio de coliflor cultivado in vitro se midioacute el CO2 y se obtuvo un balance negativo el cual se mantuvo durante dos semanas despueacutes del transplante Algo similar ocurrioacute con frutilla despueacutes del transplante las hojas se deterioraron raacutepidamente lo que quiere decir que no hubo incremento en la fijacioacuten de carbono indicando falta de desarrollo en la competencia fotosinteacutetica
El bajo nivel de CO2 durante el cultivo in vitro limita el proceso de fotosiacutentesis lo cual se puede compensar usando sacarosa en el medio de cultivo Tambieacuten se puede incrementar el nivel de luz y CO2 obteniendo un fuerte aumento en el crecimiento de varias especies como orquiacutedeas clavel etc (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 256 Sustrato Un sustrato es todo material soacutelido distinto del suelo natural mineral u orgaacutenico que colocado en un contenedor en forma pura o en mezcla permite el anclaje del sistema radicular de la planta desempentildeando por lo tanto un papel de soporte para la planta El sustrato puede intervenir o no en el complejo proceso de la nutricioacuten mineral de la planta (INFOAGRO 2007) El sustrato y los contenedores dentro de los cuales se van a transplantar las plaacutentulas in vitro son importantes para una buena sobrevivencia
Los sustratos ejercen una influencia significativa en la arquitectura del sistema radical de las plantas y en las asociaciones bioloacutegicas de este con el suelo influenciando el
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estado nutricional y la translocacioacuten de agua en el sistema suelo-planta-atmoacutesfera Uno de los requisitos fundamentales que debe cumplir el sustrato para su utilizacioacuten es la sanidad Cuando estos no se elaboran almacenan o manejan correctamente pueden contaminarse y provocar serios dantildeos a las plantas durante la aclimatacioacuten por esta razoacuten son preferidos como componentes para su elaboracioacuten materiales inertes o aquellos en las cuales el proceso de obtencioacuten garantice la mayor desinfeccioacuten posible
Uno de los factores de mayor importancia a la hora de seleccionar los materiales que pueden constituir el sustrato es su disponibilidad tanto en teacuterminos de facilidad de obtencioacuten o suministro como de su costo (VILCHEZ et al 2007)
La presencia de inhibidores o tambieacuten cambios en el pH del sustrato pueden afectar el crecimiento de las raiacuteces y consecuentemente el eacutexito del transplante
Muchos laboratorios y viveros transplantan a un sustrato uniforme debiendo ser eacuteste adecuado en cuanto a soporte de las plantas pH porosidad aireacioacuten y drenaje (DEBERGH y ZIMMERMAN 1991)
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3 MATERIAL Y MEacuteTODO
Para la realizacioacuten de este trabajo se utilizoacute el siguiente material y meacutetodo
31 Material La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio e invernadero de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal pertenecientes a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de Chile
311 Material vegetal Se utilizaron plaacutentulas de C virescens cultivadas in vitro a partir de semillas las cuales fueron proporcionadas por el laboratorio estas plaacutentulas fueron separadas y repicadas para aumentar la poblacioacuten y obtener la cantidad necesaria para el ensayo
FIGURA 2 Plaacutentulas de C virescens en caacutemara de crecimiento in vitro
312 Materiales Los materiales que se utilizaron fueron los siguientes Equipos autoclave caacutemara de flujo laminar dispensador de medios medidor
de pH agitador magneacutetico horno microondas balanza mechero termoacutemetro Materiales vasos de precipitado matraces probetas pipetas papel de
aluminio frascos de vidrio placas Petri pinzas bisturiacute macetas regadera Soluciones soluciones madre (Medio MS) gelificante etanol 70 y 95
32 Meacutetodo A continuacioacuten se da a conocer la metodologiacutea con la cual se trabajoacute 321 Preparacioacuten del medio de cultivo Para la obtencioacuten de plantas a traveacutes de la micropropagacioacuten se ocupoacute el medio basal de MURASHIGE y SKOOG (1962) tambieacuten llamado medio MS Este medio tiene un pH de entre 56-57 Posteriormente se dosificoacute con el dispensador de medios para que cada frasco tenga una cantidad adecuada (25 mL) y se llevoacute a autoclave para esterilizar a 12 atm 120ordm C por 20 min
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322 Obtencioacuten del material vegetal Al tener el medio esterilizado se procedioacute a la separacioacuten y repicado de plaacutentulas existentes en el laboratorio Las siembras se realizaron en el mes de mayo del 2007 Estas siembras se realizaron en la caacutemara de flujo laminar de modo de asegurar que la siembra sea 100 aseacuteptica Estas plaacutentulas fueron mantenidas en la caacutemara de incubacioacuten hasta obtener los tamantildeos requeridos para el ensayo donde las condiciones fueron las siguientes
minus Temperatura ambiental de 23-25ordm C minus Fotoperiacuteodo de 16 horas minus Intensidad lumiacutenica controlada de 50-55 micromol m-2s-1
323 Sustratos Se utilizaron tres tipos de sustratos el primero corresponde a una mezcla de turba + perlita (11) el segundo corresponde a Sphagnum (100) y el tercero corresponde a una mezcla de turba + arena (11) Una vez realizadas las mezclas se procedioacute a una esterilizacioacuten en un autoclave a 121ordm C por 20 minutos a 12 atmoacutesfera De esta forma se trabajoacute con material limpio y sano evitando ataque de hongos o bacterias El anaacutelisis quiacutemico de los sustratos se muestra en el Anexo 2 324 Plantacioacuten Las plaacutentulas con un promedio de cuatro meses en condiciones de caacutemara de crecimiento in vitro obtuvieron el tamantildeo adecuado para ser utilizadas Se sacaron de los frascos y se plantaron en las macetas de plaacutestico transparente con los sustratos Posteriormente fueron dejadas en la sala del laboratorio donde se debioacute asperjar con solucioacuten nutritiva Hoagland y fungicida Captan CUADRO 1 Composicioacuten de solucioacuten nutritiva Hoagland
KNO3 102 gL Ca(NO3) 4 H2 O 0492 gL
NH4H2 (PO4) 023 gL MgSO4 7 H2O 049 gL
H3BO3 286 mgL MnCl2 2 H2O 181 mgL CuSO4 5 H2O 008 mgL ZnSO4 5 H2O 022 mgL Na2MoO4 H2O 009 mgL
FeSO4 7 H2O 05 06 mL FUENTE FINCK 1988 325 Disentildeo de los ensayos Este trabajo de investigacioacuten constoacute de un ensayo con dos etapas Antes que todo se realizoacute la separacioacuten y repicado in vitro de plaacutentulas de C virescens para la obtencioacuten del nuacutemero necesario de plantas En la etapa 1 se utilizaron tres tamantildeos de plaacutentulas obtenidas in vitro de 1-2cm de 2-3cm y de maacutes de 3cm de altura que se transplantaron a tres sustratos turba + perlita 11(vv) Sphagnum (100) y turba + arena 11 (vv) La turba provino de la Sociedad
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Minera Patagonia Peat SA en Hijuelas el Sphagnum de la empresa Lonquen Chile de Puerto Montt y la perlita se obtuvo a traveacutes del sitio web wwwjardisencl (representante legal Walter Rathgeb Penza Ingeniero Agroacutenomo Santiago) Las plaacutentulas se plantaron de acuerdo a su tamantildeo las de maacutes de 3cm se colocaron de 6 por maceta las de 2 a 3cm de a 8 por maceta y las maacutes chicas de a 10 por maceta Estas macetas fueron dejadas en una sala de aclimatacioacuten con una temperatura promedio de 20ordm C intensidad lumiacutenica de 50-55 micromol m-2s-1 y 14-16 hrs de fotoperiacuteodo Se fertilizoacute asperjando cada cinco diacuteas con solucioacuten nutritiva Hoagland Esta etapa se llevoacute a cabo durante dos meses desde el cinco de septiembre hasta el cinco de noviembre de 2007
En la etapa 2 se continuoacute el proceso de aclimatacioacuten en invernadero de las plaacutentulas obtenidas en la etapa 1 que despueacutes de dos meses teniacutean un mayor tamantildeo y se habiacutean acondicionado al ambiente exterior (fuera de la caacutemara de crecimiento) Las plantas se mantuvieron en las macetas durante tres semanas para aclimatarlas y luego las plantas sobrevivientes fueron transplantadas a macetas maacutes grandes individuales durante tres meses aproximadamente hasta el cinco de marzo 2008 Estas nuevas macetas tuvieron como sustrato turba y suelo (trumao) en igual proporcioacuten (Anexo 2) La temperatura promedio de invernadero fluctuoacute de 13 a 35 degC seguacuten el mes En enero el promedio fue de 25 (Anexo 3) Para bajar la temperatura alrededor de 5deg C se instaloacute una malla Rachel 326 Disentildeo experimental El disentildeo experimental utilizado fue completamente al azar ordenado como experimento factorial con dos factores tamantildeo (3) y sustrato (3) Cada tratamiento tuvo tres repeticiones con un miacutenimo de 6 plantas por recipiente 327 Variables a evaluar Durante los dos meses en que las macetas estuvieron en la sala de aclimatacioacuten se evaluoacute el desarrollo foliar contando el nuacutemero de hojas una vez al mes Posteriormente se trasladaron las mismas macetas a invernadero durante tres semanas para continuar con la aclimatacioacuten de las plaacutentulas Transcurrido este tiempo se transplantaron las plaacutentulas sobrevivientes a macetas individuales y continuoacute mensualmente la evaluacioacuten de eacutestas (nuacutemero de hojas) hasta la obtencioacuten de plantas establecidas Al momento del transplante y al final del ensayo se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces asiacute como tambieacuten al final del ensayo de evaluoacute el crecimiento en altura (cm) La sobrevivencia fue evaluada al final del ensayo por maceta
Tanto en la sala de aclimatacioacuten coacutemo en el invernadero se registroacute la temperatura con la ayuda de un termoacutemetro de maacutexima y miacutenima (Anexo 3) 328 Anaacutelisis estadiacutestico Una vez obtenidos los datos se procedioacute a comprobar si estos cumpliacutean con los supuestos de aleatoriedad normalidad y homogeneidad de varianzas que exige este tipo de anaacutelisis En el caso de no cumplirse estos supuestos los datos se transformaron utilizando log10(x+05) raiacutez(x+05) o 1x para normalizarlos
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y enseguida se sometioacute los datos a un anaacutelisis estadiacutestico (ANDEVA) Posteriormente en los casos en que se observoacute diferencias significativas en el ANDEVA se aplicoacute una prueba de rangos muacuteltiples (Tukey) al 5 de significancia Para las variables no parameacutetricas que no cumplieron con los supuestos para un anaacutelisis de varianza se realizoacute la prueba de KruskalndashWallis y las comparaciones muacuteltiples a traveacutes del test de Dunn con un nivel de 5 de significancia
Se utilizaron los programas estadiacutesticos STATGRAPHICS 20 y GRAPHPAD PRISM 5 para el anaacutelisis de datos
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4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
En los siguientes puntos se discuten los resultados obtenidos en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens
En la Figura 3 se observan plaacutentulas de C virescens micropropagadas en medio MS en caacutemara de crecimiento al inicio del ensayo (A) y en invernadero despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten (B)
BA
FIGURA 3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten
A continuacioacuten se presentan los resultados obtenidos para las variables analizadas (Cuadro 2 y 3) de esta manera se pueden visualizar en general los resultados obtenidos en el proceso de aclimatacioacuten durante seis meses
CUADRO 2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de raiacuteces
inicial y final Variables
Hojas finales (nuacutemero)
Raiacuteces iniciales (nuacutemero)
Raiacuteces finales (nuacutemero)
Tamantildeo de plaacutentulas 36 24 37 47 29 46
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 61 43 76
Sustratos 53 36 56 43 29 51
Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 46 27 49
Significa que hay diferencias significativas al 95 Test de Dunn
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Las variables no parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en hojas finales y raiacuteces iniciales en sus rangos de distribucioacuten Las raiacuteces finales no presentaron diferencias seguacuten el sustrato utilizado pero de acuerdo al tamantildeo hubo diferencias en su distribucioacuten
CUADRO 3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas
Variables Altura final de plaacutentulas
(cm) Sobrevivencia
Tamantildeo de plaacutentulas
36 c 567 b 47 b 821 a
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 59 a 908 a
Sustratos 52 a 933 a
41 ab 59 b Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 49 b 772 a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY Las variables parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en altura final de hojas y en sobrevivencia 41 Nuacutemero de hojas finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentulas y de sustratos para la variable nuacutemero final de hojas 411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula Seguacuten el Cuadro 2 y Figura 4 las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero final de hojas Las plaacutentulas pequentildeas de 1-2 cm obtuvieron el nuacutemero maacutes bajo de hojas finales con una media de 36 hojas por plaacutentula lo cual es la mitad de las hojas finales que se obtuvo con las plaacutentulas de mayor tamantildeo (61 hojas aproximado por plaacutentula) Para las plaacutentulas medianas de 2-3 cm se obtuvo una media de 47 hojas por plaacutentula (Figura 4)
26
Hojas finales
1-2 cm 2-3cm maacutes de 3 cm0
5
10
15
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn)
BLANCO (2006) sentildeala que plaacutentulas cultivadas in vitro crecen bajo condiciones especiales como alta humedad relativa y baja luminosidad ademaacutes son suplidas con sacarosa Estas condiciones fueron proporcionadas en una caacutemara de crecimiento en el laboratorio donde las plantas micropropagadas no son dependientes por completo de su fotosiacutentesis son heteroacutetrofas Parece ser necesario un estiacutemulo para convertirse en organismos totalmente capaces de sustentar sus propios requisitos de carbono y nitroacutegeno reducido pasando de esta manera a ser autoacutetrofos
Al ser sacadas de un medio in vitro las hojas no estaacuten preparadas para producir su propio alimento y sobreviven gracias a que el medio de cultivo le proporciona los nutrientes necesarios para vivir En este punto muchas de las hojas mueren y nacen hojas nuevas capaces de generar su alimento supliendo asiacute las hojas viejas (SEELYE et al 2003) En este ensayo las plaacutentulas de Chloraea virescens presentaron en general una buena adaptacioacuten al ser sacadas de un medio in vitro
Se observoacute que plaacutentulas con menor tamantildeo al ser aclimatadas y tener menor tejido fue maacutes difiacutecil y maacutes lento que empezaran a generar nuevos tejidos y materia orgaacutenica a partir de dioacutexido de carbono POSPIacuteŠILOVAacute et al (1999) sentildeala que al tener los estomas con desarrollo incompleto maacutes grandes y de forma maacutes redonda pierden maacutes agua lo cual puede provocar una peacuterdida de hojas muriendo asiacute la plaacutentula Por esta razoacuten las plaacutentulas pequentildeas se demoran maacutes tiempo en generar hojas nuevas es por ello que al finalizar este estudio muestran el menor nuacutemero final de hojas 412 Efecto del tipo de sustrato Al analizar la influencia del tipo de sustrato se encontraron diferencias significativas entre los tres sustratos utilizados Seguacuten el Cuadro 2 y la Figura 5 el sustrato donde se obtuvo mejores resultados fue
27
turba+perlita en el cual se observoacute un promedio de 53 hojas por plaacutentula siendo Sphagnum el maacutes bajo con 43 hojas por plaacutentula De acuerdo a los resultados del anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados el sustrato turba+perlita tiene mayor cantidad de nitroacutegeno foacutesforo calcio magnesio y azufre disponible comparativamente con los otros dos sustratos (Sphagnum y arena+turba) (Anexo 2)
Hojas finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
Sustratos
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) Para la brotacioacuten y el crecimiento de las plantas se necesita agua y Nitroacutegeno lo que favorece a una mayor tasa de aparicioacuten de hojas lo que se traduce en una mayor cantidad de hojas finales El Nitroacutegeno se encuentra en mayor cantidad en el sustrato turba+perlita debido a lo cual los mejores resultados se obtienen en dicho sustrato 413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Despueacutes de analizados los efectos individuales del tamantildeo y del sustrato al interactuar ambos factores existen diferencias significativas La mejor interaccioacuten se obtuvo con el sustrato turba+perlita y con el mayor tamantildeo de la plaacutentula (Figura 6) Debido a la buena estructura (porosa) de dicho sustrato se podriacutea decir que se favorecioacute la absorcioacuten radicular de nutrientes obteniendo por ello un mayor nuacutemero de hojas finales Para los menores tamantildeos no se observan diferencias significativas obteniendo como promedio 41 hojas por plaacutentula Para el mayor tamantildeo el promedio fue de 6 hojas por plaacutentula
28
Hojas finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 42 Raiacuteces iniciales Este paraacutemetro se evaluoacute luego de la primera etapa de aclimatacioacuten la cual se realizoacute en una sala de aclimatacioacuten del laboratorio Se analizoacute la influencia de diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos sobre la variable nuacutemero raiacuteces iniciales (Anaacutelisis de Kruskal-Wallis en Anexo 7)
FIGURA 7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses de pre aclimatacioacuten
29
En la Figura 7 se puede observar los resultados de pre aclimatacioacuten en sala de laboratorio En esta etapa ya es posible ver la presencia de raiacuteces desarrolladas 421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula En el Cuadro 2 se puede observar que las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero inicial de raiacuteces y en la Figura 8 se puede comprobar que para los dos tamantildeos de plaacutentula maacutes pequentildeos no se observa gran cantidad de raiacuteces esto no impidioacute el desarrollo posterior de las plaacutentulas las cuales lograron enraizar al final del estudio Esto se contrapone a lo observado en un estudio de Lapageria rosea donde la presencia de raiacutez y brote para lograr una multiplicacioacuten exitosa de plantas es de vital importancia Incluso algunas plaacutentulas de L rosea no brotan en condiciones in vitro en donde tienen las mejores condiciones nutricionales y hormonales para hacerlo Esto se debe a factores internos de la plaacutentula siendo muy difiacutecil que broten inmediatamente en caacutemara de aclimatacioacuten donde ya dejan de recibir los nutrientes necesarios de manera directa y requieren de balances de energiacutea para poder seguir elongando raiacuteces absorber nutrientes y brotar para poder obtener los carbohidratos necesarios para seguir su crecimiento (BLANCO 2006) El tamantildeo de plaacutentula tiene importancia para el desarrollo de raiacuteces se distingue notoriamente que en los tamantildeos maacutes grandes el nuacutemero de raiacuteces es mayor comparativamente con los tamantildeos pequentildeos donde el nuacutemero de raiacuteces fue escaso Debido a la presencia de maacutes hojas existe una mayor cantidad de aacuterea fotosinteacutetica esta situacioacuten estimula el crecimiento de las raiacuteces para la obtencioacuten de agua y nutrientes
Raices iniciales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
2
4
6
8
10
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o inicial de ra
iacuteces
FIGURA 8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn)
30
422 Efecto del tipo de sustrato Para el sustrato turba+perlita se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas en el nuacutemero de raiacuteces con respecto a los dos otros sustratos esto se puede ver en el Figura 9 donde se observa que se obtuvieron los mayores resultados En cualquier medio de crecimiento el espacio no ocupado por un soacutelido se llama porosidad este espacio puede ser ocupado en parte para retener agua y en parte para proporcionarle aire a las raiacuteces La ausencia de uno de estos elementos es perjudicial para las plantas La turba es conocida por tener estas propiedades y la perlita tambieacuten por esta razoacuten se sabe que la mezcla turba-perlita provee propiedades fiacutesicas excelentes como medio de crecimiento y propagacioacuten (INFOAGRO 2007) Estos resultados con turba-perlita (298 de materia orgaacutenica) coinciden con los obtenidos por DIAZ et al (2004) quienes al utilizar un sustrato compuesto por 100 de humus de lombriz para aclimatar cantildea de azuacutecar obtuvieron el mayor nuacutemero de raiacuteces Esto puede atribuirse al importante aporte de materia orgaacutenica del humus (47) lo que le confiere una mejor estructura obtenieacutendose una excelente porosidad del sustrato La aireacioacuten del suelo es necesaria para favorecer la maacutexima absorcioacuten de nutrientes por las raiacuteces Esto tambieacuten sucede en el sustrato turba+perlita el cual posee la mayor cantidad de materia orgaacutenica de los tres sustratos utilizados
Raices iniciales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
2
4
6
8
10
Sustratos
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato En los anaacutelisis para la variable nuacutemero de raiacuteces se puede decir que la mejor interaccioacuten se presentoacute para el sustrato de turba+perlita junto con el mayor tamantildeo de plaacutentulas obteniendo los valores maacutes altos entre los nueve tratamientos La presencia de raiacuteces luego de la micropropagacioacuten aumenta la posibilidad de eacutexito en el transplante ya que se crea un favorable balance de agua Pero esto no quiere
31
decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
10
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
32
En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
33
El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
34
Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
6
- Chloraea volkmanni Phil (NOVOA et al 2006) 2141 Chloraea virescens Planta perenne de 40-90 cm de altura Sus hojas son de 5-12cm de largo por 15-25cm de ancho estrechas lanceoladas agudas dispuestas en roseta basal generalmente marchitas al final de la antesis Su escapo floral tiene vainas caulinares lanceoladas agudas y distantes La inflorescencia es de 8-20cm de largo densa con 10-15 flores erguidas Sus flores son blancas con estriacuteas y aacutepices verdes El seacutepalo dorsal es de 16-33mm de largo por 4-6mm de ancho oblongo lanceolado obtuso algo coacutencavo a veces ligeramente estrechado al centro aacutepice algo carnoso Los seacutepalos laterales de 18-33mm de largo por 4-5mm de ancho son ensiformes con aacutepice obtuso engrosado verde negruzco a veces espatulado y dentado a veces verrugoso Los peacutetalos son de 15-23mm de largo por 5-58mm de ancho estrechamente aovados obtusos verrugosos con maacutes frecuencia solo la mitad inferior a veces el borde denticulado y carnoso El labelo de 15-26mm de largo por 10-20mm de ancho es mas o menos romboidal a levemente trilobulado El loacutebulo central tiene 5-7 nervios longitudinales recorridos por laminillas interrumpidas membranaacuteceas con segmentos falciformes de borde carnoso de color verde Los nervios laterales que se ramifican oblicuamente hacia el aacutepice en los loacutebulos laterales tienen pequentildeas laminillas y verrugas y su borde es laciniado inciso en la mitad apical hacia la base denticulado aacutepice generalmente engrosado La columna es de 12-18mm de largo delgada blanca con estriacuteas anaranjada La base de la zona nectariacutefera tiene un color amarillo-limoacuten con maacuteculas anaranjadas orificio nectario verde El ala de la columna es recta y estrecha El estigma es triangular y globoso La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la Vordf (Vintildea del Mar) hasta la XIordf Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile Sin embargo es posible que tenga una distribucioacuten maacutes restringida por que se le ha confundido con Chloraea incisa Su floracioacuten es desde noviembre a febrero y su estado de conservacioacuten no estaacute evaluado (NOVOA et al 2006) En el Anexo 14 se incluyen antecedentes sobre su distribucioacuten y eacutepoca de floracioacuten
7
FIGURA 1 Chloraea virescens FUENTE NOVOA et al (2006) 22 Requerimientos de las orquiacutedeas Para tener eacutexito en el cultivo de orquiacutedeas hay que tomar en cuenta factores de importancia como son 221 Agua El riego correcto es el principio y el fin del cuidado de orquiacutedeas (ROLLKE 2005) Este elemento es primordial para las orquiacutedeas asiacute como tambieacuten para todo tipo de plantas En el caso de eacutestas se dice muchas veces que la calidad del agua usada es el factor maacutes importante en el cultivo de orquiacutedeas ya que el porcentaje maacutes alto de muerte se produce por el exceso de este factor (SHEEHAN 1980) Hay que tomar en cuenta que la mayoriacutea de las orquiacutedeas son epiacutefitas lo que significa que tienen sus raiacuteces a la vista gracias a las cuales absorben el agua de lluvia Se recomienda un sustrato poroso y de reaccioacuten neutra ya que de esta manera el agua escurre sin acumularse no permitiendo la pudricioacuten de las raiacuteces Para las orquiacutedeas terrestres es lo mismo solo que se pueden regar con maacutes frecuencia pero sin mantenerlas saturadas (OSPINA y DRESSLER 1979) Seguacuten DUMOIS (2007) el agua es lo maacutes difiacutecil de controlar ya que depende de muchas variables como por ejemplo humedad relativa tipo de sustrato intensidad luminosa temperatura y circulacioacuten de aire Ademaacutes muchas orquiacutedeas necesitan un periacuteodo de receso vegetativo que si no es respetado resulta en ausencia de floracioacuten En general hay que antildeadir agua en abundancia cuando la planta se encuentra en crecimiento activo y reducirla despueacutes de la floracioacuten
8
Las especies con pseudobulbos almacenan agua y estaacuten preparadas para su periacuteodo de receso Otras que no cuentan con estos oacuterganos requieren de humedad maacutes constante 222 Luz Ninguna planta puede crecer sin la iluminacioacuten adecuada Muchas orquiacutedeas viven en las alturas de los aacuterboles y estaacuten expuestas a plena luz del sol otras crecen en el suelo selvaacutetico protegidas del sol por espesos follajes (ROLLKE 2005) La funcioacuten principal de la luz es activar el proceso de fotosiacutentesis Los cultivadores han estudiado la luz y han descubierto que hay orquiacutedeas que florecen con diacutea largo y otras con diacutea corto (OSPINA y DRESSLER 1979) Gracias a la fotosiacutentesis se convierten los minerales presentes en el ambiente en savia y nutrientes Hojas oscuras y falta de floracioacuten indican falta de luz hojas amarillas e incluso quemadas apuntan hacia un exceso de sol (DUMOIS 2007) 223 Fertilizacioacuten Las orquiacutedeas necesitan los mismos nutrientes que otras plantas Un abono para orquiacutedeas debe contener los nutrientes principales nitroacutegeno (N) foacutesforo (P) y potasio (K) asiacute como tambieacuten oligoelementos como hierro (Fe) magnesio (Mg) zinc (Zn) estantildeo (Sn) y manganeso (Mn) (ROLLKE 2005) Por otra parte la fertilizacioacuten depende de varios factores dentro de los cuales los maacutes criacuteticos son
- El medio utilizado - La edad de las plantas - Estado de las plantas ya sea floracioacuten crecimiento reposo
En cuanto a absorcioacuten se ha demostrado que es igual de eficiente por viacutea foliar como a traveacutes de las raiacuteces Es necesario tener en cuenta algunas reglas baacutesicas a la hora de fertilizar las orquiacutedeas (Asociacioacuten Costarricense de Orquideologiacutea ACO 1970)
1 Regar las plantas antes de fertilizar 2 Fraccionar las dosis 3 Aplicar el fertilizante de forma liacutequida 4 No usar fertilizantes soacutelidos 5 No fertilizar las plantas recieacuten plantadas 6 No fertilizar plantas en reposo 7 No abonar plantas enfermas
224 Temperatura Es conocido el hecho de que cada planta tiene liacutemites de temperatura dentro de los cuales prospera o perece De ahiacute la necesidad de conocer las temperaturas correspondientes al lugar de donde viene cada especie de orquiacutedea pudiendo proporcionarle la temperatura adecuada (OSPINA y DRESSLER 1979) Se puede clasificar a las orquiacutedeas como de clima caacutelido (temperatura nocturna miacutenima de 20ordmC) templado (miacutenimo de 13 a 18ordmC) y de ambiente friacuteo (de 10 a 13ordmC) (DUMOIS 2007)
9
Seguacuten SHEEHAN (1980) las temperaturas ideales para las orquiacutedeas de origen tropical son 10ordmC en la noche y entre 21ordm - 24ordmC durante el diacutea 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas La micropropagacioacuten de orquiacutedeas estaacute en vanguardia hoy en diacutea El estudio de cultivo de tejido de orquiacutedeas se lleva a cabo en muchos laboratorios de todo el mundo (ARDITTI and ERNST 1992) 231 Biologiacutea de las semillas Las semillas de orquiacutedeas son conocidas usualmente como semillas polvo porque son minuacutesculas y contienen pocas reservas de alimento Estas semillas por lo general no germinan en el medio natural a menos que sean infectadas por un hongo micorriacutezico Este hongo abastece a las plantas joacutevenes con azuacutecares y nutrientes hasta que sean lo suficientemente grandes para fabricar su propio alimento Cuando la semilla germina produce una masa indiferenciada de ceacutelulas llamada protocormo Manteniendo las condiciones normales el protocormo continuaraacute su crecimiento por varias semanas meses o incluso antildeos dependiendo de la especie hasta que alcance la edad apropiada para producir raiacuteces y hojas En el caso de orquiacutedeas terrestres es de vital importancia que la relacioacuten orquiacutedea-hongo se conserve durante los estados tempranos del ciclo de vida de la planta ya que el protocormo enterrado no puede fabricar alimento por siacute mismo Por otro lado los protocormos de las orquiacutedeas epiacutefitas son comuacutenmente verdes lo que les posibilita producir parte de su alimento La relacioacuten orquiacutedea-hongo no ha sido en su totalidad investigada para el caso de las orquiacutedeas tropicales (McKENDRICK 2000) 232 Germinacioacuten simbioacutetica y no simbioacutetica de semillas Mediante la germinacioacuten in vitro las semillas germinan en frascos de vidrio o plaacutestico Estos frascos contienen en su interior un medio nutritivo solidificado con agar con todos los azuacutecares y minerales necesarios para la germinacioacuten y crecimiento de las semillas Hay dos tipos de germinacioacuten la simbioacutetica y la asimbioacutetica En la germinacioacuten simbioacutetica las semillas se siembran junto con una pequentildea cantidad del hongo micorriza adecuado Dicho hongo crece en el medio coloniza a las semillas que estaacuten en proceso de germinacioacuten y se produce una relacioacuten simbioacutetica la cual alimentaraacute al protocormo hasta que este sea capaz de producir sus hojas y se vuelva autotroacutefico Esta teacutecnica es usada principalmente en propagacioacuten de orquiacutedeas terrestres en zonas templadas La germinacioacuten asimbioacutetica se usa principalmente en propagacioacuten de orquiacutedeas tropicales que crecen maacutes raacutepido que sus parientes de zonas templadas Para este tipo de germinacioacuten se necesita un medio de cultivo maacutes complejo ya que todos los nutrientes orgaacutenicos e inorgaacutenicos asiacute como tambieacuten los azuacutecares deben estar en forma disponible pues no existe la intermediacioacuten del hongo (McKENDRICK 2000) 233 Condiciones de esterilidad Tanto para la germinacioacuten simbioacutetica como para la asimbioacutetica es de vital importancia que los frascos las semillas aparatos y el medio esteacuten esteacuteriles desde el principio del proceso Esto debido a que cualquier hongo o bacteria que se introduzca creceraacute maacutes raacutepido que las semillas ocupando su espacio hasta matarlas Esto se evita gracias al autoclave el cual regulado a 12 atm y 120ordmC por 20 minutos mata hongos o bacterias presentes en el medio (McKENDRICK 2000)
10
2331 Siembra de las semillas Las semillas pueden ser recolectadas desde caacutepsulas verdes o maduras La caacutepsula verde que estaacute madurando estaacute llena de semillas y no se deforma cuando se aprieta con las pinzas Estas semillas pueden ser almacenadas por algunas semanas en un lugar refrigerado con bastante aireacioacuten Las semillas se pueden sembrar a partir de caacutepsulas verdes o semillas secas A continuacioacuten se muestran las ventajas y desventajas de ambos meacutetodos
- Siembra a partir de caacutepsulas verdes Si las caacutepsulas se mantienen intactas el interior (las semillas) se mantiene esteacuteril Por lo tanto si se esteriliza la parte exterior de las mismas donde hongos y bacterias pueden desarrollarse y se abren las caacutepsulas bajo condiciones esteacuteriles y las semillas podraacuten mantenerse desinfectadas
La ventaja de este meacutetodo es que no se requiere de esterilizacioacuten de las semillas lo que provoca su deterioro Otro punto a favor es que algunas semillas podriacutean germinar maacutes raacutepido que las provenientes de caacutepsulas maduras por los mecanismos de dormancia La desventaja es que en este caso todas las semillas deben ser utilizadas o eliminadas mientras que las semillas maduras se pueden almacenar Tambieacuten se debe considerar que las semillas sembradas a partir de caacutepsulas que no han madurado lo suficiente podriacutean germinar lentamente o simplemente no germinar - Siembra a partir de semillas secas En este caso una vez que la caacutepsula es abierta las semillas dejan de ser esteacuteriles y requieren de un proceso de esterilizacioacuten Comuacutenmente se utiliza una solucioacuten de hipoclorito de sodio hipoclorito de calcio o peroacutexido de hidroacutegeno Las semillas se agitan dentro de la solucioacuten que ademaacutes contiene una gota de detergente para ldquohumedecerlasrdquo luego se las enjuaga con agua destilada y se las siembra en el medio preparado La ventaja de este meacutetodo es que las semillas pueden ser colectadas secadas al aire almacenadas por varios meses en el refrigerador y utilizarlas cuando sea necesario Se debe considerar que la siembra ya sea de caacutepsulas verdes o de semillas secas estaacute determinado por la eacutepoca en que se colectan (McKENDRICK 2000) 234 Trasplante En la caacutemara de incubacioacuten las plaacutentulas se han desarrollado en condiciones limpias y en un ambiente cerrado por lo que deben acostumbrase gradualmente al ambiente exterior antes de ser trasplantadas a las macetas Tambieacuten la temperatura y la luz la cual es baja han sido constantes durante el cultivo in vitro En el medio natural la temperatura y la luz variacutean constantemente por lo que las nuevas plantas deben estar protegidas de la fuerte luz solar la cual puede quemar las hojas con soacutelo una pequentildea cantidad de eacutesta La humedad en los frascos es alta y las plantas estaacuten protegidas de ataques por hongos o bacterias Ademaacutes las plaacutentulas han crecido bajo condiciones de alta humedad y por lo tanto tendraacuten cutiacuteculas deacutebiles por lo que necesitan acostumbrase a medios menos huacutemedos antes de ser transplantadas
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Para el trasplante se deben colocar los frascos en un lugar protegido de la lluvia para que se aclimaticen a las nuevas condiciones de luz y temperatura Se deben dejar por 2 a 4 semanas en los frascos tapados Luego se debe ir aflojando las tapas para dejar entrar pequentildeas cantidades de aire hasta el punto de dejarlas descubiertas Se debe revisar si hay hojas marchitas y ver que el sustrato esteacute huacutemedo
Lo ideal es dejarlas sin tapa durante una semana antes de pasarlas a las macetas Para el trasplante se debe elegir un sustrato adecuado para el tipo de planta humedecerlo y transplantar las plantas con cuidado de no dantildear las raiacuteces y evitando la deshidratacioacuten En esta etapa tambieacuten se debe dejar las macetas selladas para evitar una raacutepida deshidratacioacuten e ir abrieacutendolas paulatinamente (McKENDRICK 2000)
24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas 241 Orquiacutedeas terrestres 2411 Cypripedium Esta es una orquiacutedea terrestre de zonas templadas se desarrolla en el Hemisferio Norte como por ejemplo en Guatemala y en Honduras pero donde se encuentra principalmente es en China Su forma maacutes comuacuten de propagacioacuten es in vitro a partir de semillas La forma maacutes eficiente es a partir de semillas inmaduras Existe un intervalo de tiempo entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten eacuteste dependeraacute de la especie y de la zona donde se desarrolle Se asume que existen aproximadamente cuatro semanas entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten El oacuteptimo para una buena germinacioacuten de Cypripedium es entre 42 y 60 diacuteas despueacutes de la polinizacioacuten y entre 14 y 32 diacuteas despueacutes de la fertilizacioacuten La germinacioacuten ocurre entre la segunda y cuarta semana despueacutes de ser sembradas y los protocormos deberiacutean ser cambiados de medio de cultivo cada dos a cuatro meses si no se corre el riesgo de sufrir agotamiento de nutrientes Los rizomas y las raiacuteces se empiezan a desarrollar a partir de los siete meses para luego dar lugar a las primeras hojas Para obtener un buen transplante se deben tener raiacuteces de miacutenimo un centiacutemetro de largo El desarrollo de raiacuteces se ve potenciado al tener un periacuteodo corto de bajas temperaturas (10degC) exposicioacuten a la luz reduccioacuten en la concentracioacuten de iones del medio de cultivo o transferirlas a un compost esteacuteril Al tener raiacuteces suficientes y el tamantildeo adecuado se podraacuten llevar las plantas al lugar donde creceraacuten definitivamente En el momento del transplante las plantas son muy susceptibles al desecamiento por lo cual lo ideal es que los brotes sean maacutes chicos que las raiacuteces El mejor sustrato seriacutea aquel donde crece naturalmente la orquiacutedea (RAumlNNBAumlCK 2007) 2412 Preservacioacuten in vitro de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes Este estudio fue hecho para establecer que parte de tejido es viable para la micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes del noreste de Europa pudiendo asiacute reestablecer dichas orquiacutedeas a sus aacutereas correspondientes La propagacioacuten in vitro de orquiacutedeas
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terrestres de clima templado es maacutes difiacutecil que las orquiacutedeas epiacutefitas de clima subtropical y tropical Las orquiacutedeas terrestres tienen requerimientos maacutes estrictos que las epiacutefitas y se conoce menos sobre sus necesidades especiacuteficas (VAASA y ROSENBERG 2004) En Estonia existen 36 especies de orquiacutedeas terrestres pero solo tres estaacuten bajo proteccioacuten Dactylorhiza baltica Dactylorhiza ruthei Dactylorhiza praetermissa Como explantes para este estudio en el caso de D baltica se ocuparon protocormos en los otros dos casos se utilizaron semillas semi maduras las cuales fueron colectadas siete y diez semanas despueacutes de ser polinizadas Para D baltica se ocupoacute el medio Murashige y Skoog suplementado con 05 mgL de aacutecido naftaleacuten aceacutetico (ANA) y 2 mgL de isonpentenyl adenina Para el caso de las semillas semi maduras se ocuparon los medios de Lindemann de Heller de Norstog y de Murashige y Skoog como control
La composicioacuten del medio y la madurez de las semillas influye mucho en el desarrollo de las orquiacutedeas in vitro Se ha demostrado que se necesita una alta concentracioacuten de microelementos para obtener una correcta germinacioacuten de las semillas Tambieacuten se puede decir que los primeros tres meses son los de mayor crecimiento luego de este tiempo el crecimiento se vuelve maacutes lento (VAASA y ROSENBERG 2004)
Luego de cuatro semanas de crecimiento de D baltica el 60 de los explantes de meristemas apicales empezaron a crecer en cambio los de meristemas laterales no expresaron ninguacuten tipo de crecimiento Las raiacuteces empezaron su desarrollo luego de dos meses despueacutes de la siembra
En el caso de D ruthei y D praetermissa la germinacioacuten se produjo despueacutes de dos meses desde la inoculacioacuten Luego de cuatro y seis meses el mayor crecimiento fue observado en el medio Norstog superando en 14 al medio testigo Murashige y Skoog (VAASA y ROSENBERG 2004)
2413 Longevidad de semillas de orquiacutedeas terrestres Por lo general las orquiacutedeas producen muchas pero pequentildeas semillas que contienen muy pocas reservas de alimento Dichas semillas estaacuten estructuralmente adaptadas para ser dispersadas por el viento pero poco se sabe del destino de eacutestas luego de ser dispersadas Algunos estudios de viabilidad de semillas indican una sobrevivencia de uno a dos antildeos en orquiacutedeas de clima templado Las semillas que son guardadas en laboratorio duran mucho maacutes tiempo Se estudioacute la viabilidad de siete especies de orquiacutedeas norteamericanas dentro de las cuales se encuentran Goodyera pubescens y Liparis liliifolia Las semillas de eacutestas se colocaron en bolsas con suelo y sustratos de bosques provenientes de sus haacutebitats naturales (WHIGHAM et al 2005) En Goodyera pubescens la mayoriacutea de las semillas germinaron en un antildeo Cuatro otras especies germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero algunas semillas no germinadas despueacutes de siete antildeos seguiacutean siendo viables En la especie Liparis liliifolia semillas que han estado cuatro antildeos bajo observacioacuten han tenido una tasa de
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germinacioacuten de un 68 al ser sembradas in vitro junto con el hongo micorriacutezico adecuado Las dos especies restantes no germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero las semillas fueron evaluadas como intactas y testeadas positivamente en cuanto a su viabilidad despueacutes de cuatro antildeos en el suelo Estas observaciones fueron interpretadas como diferentes estrategias para especies especiacuteficas de germinacioacuten in situ (WHIGHAM et al 2005) 2414 Sobrevivencia de orquiacutedeas terrestres transplantadas a sectores urbanos La conservacioacuten de poblaciones de orquiacutedeas silvestres depende del establecimiento de las orquiacutedeas propagadas a los campos Sin embargo se conoce muy poco de los factores bioacuteticos que influencian el establecimiento de orquiacutedeas terrestres a sus haacutebitats naturales Un experimento fue establecido para medir la sobrevivencia de seis especies durante su primer periacuteodo de crecimiento seguido del transplante a un sector urbano en Australia (SCADE et al 2006)
Las orquiacutedeas germinadas simbioacuteticamente crecieron en laboratorio durante cinco meses antes de establecer la plantacioacuten en sitios adyacentes con alta o baja cobertura de malezas Existioacute una muerte gradual de las plaacutentulas durante el primer periacuteodo de crecimiento primeramente por ataque de insectos no siendo evitado por la presencia de una malla cobertora Los iacutendices de sobrevivencia variacutean desde 49 para Microtis media una especie capaz de crecer en un ambiente atiacutepico hasta un 21 para Caladenia arenicola la orquiacutedea nativa maacutes comuacuten de esos sitios Sin embargo no todas las orquiacutedeas sobrevivientes producen tubeacuterculos por lo que la tasa de sobrevivencia despueacutes del primer periacuteodo seco disminuye
La sobrevivencia de las orquiacutedeas sembradas no puede ser comparada con orquiacutedeas de la misma especie que crecieron en los mismos lugares ya que no existioacute la presencia del hongo compatible para estas orquiacutedeas (SCADE et al 2006)
2415 Micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres En India dos orquiacutedeas muy importantes para la horticultura del geacutenero Anoectochilus fueron exitosamente propagadas Noacutedulos aislados de A sikkimensis colectadas en Himalaya y A regalis colectadas en India fueron cultivadas in vitro durante 12 semanas para obtener un maacuteximo de 48 a 56 protocormos y brotes obteniendo como resultado un 95 y 98 de eficiencia respectivamente Durante el repicado de los explantes in vitro de A regalis se observoacute que el nuacutemero total de brotes obtenidos a partir de noacutedulos fue 214 asiacute como tambieacuten 82 puntas de brotes En cambio para A sikkimensis fueron mucho maacutes bajos 123 y 43 respectivamente teniendo un crecimiento maacutes lento pero plantas maacutes fuertes Las raiacuteces de 4 a 6cm crecieron con la presencia de NAA (270 microM ) en el medio asiacute como tambieacuten con carbono activado (02) Durante la aclimatacioacuten la tasa de establecimiento fue entre 95 y 98 Luego de seis meses en invernadero las plantas de A regalis fueron transferidas a bosque nativo donde se obtuvo una tasa de
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sobrevivencia de entre 70 y 95 despueacutes de 12 meses Estas plantas establecidas en bosque nativo estaacuten libres de cualquier defecto morfoloacutegico y de crecimiento (GANGAPRASAD et al 2000) 242 Orquiacutedeas epiacutefitas Estas orquiacutedeas viven en los aacuterboles pero no obtienen de eacuteste su alimento no son paraacutesitas 2421 Preservacioacuten de Cattleya walkeriana usando propagacioacuten in vitro El geacutenero Cattleya se encuentra en Meacutexico y Ameacuterica Central asiacute como tambieacuten en Venezuela Colombia y las laderas de los Andes Esta orquiacutedea tambieacuten se encuentra en varias regiones del Brasil creciendo en aacuterboles rocas cerca de riacuteos lagos y pantanos Las flores de esta orquiacutedea son conocidas debido a su hermosura y a causa de la destruccioacuten de su haacutebitat y a la excesiva coleccioacuten de eacutestas se encuentra en extincioacuten
La composicioacuten del medio de cultivo es esencial para la propagacioacuten in vitro ya que suple todos los nutrientes necesarios para el desarrollo y seraacute distinto dependiendo de cada especie en este caso se utilizoacute la mitad de los macronutrientes del medio Muchos autores sugieren el uso de carboacuten activado en el medio ya que por lo general en muchas especies aumenta el desarrollo de las raiacuteces En este estudio se probaron distintas dosis de carboacuten activado 1 2 4 y 6gL con un pH de 6 (TADEU DE FARIA et al 2002) Las semillas se obtuvieron de flores artificialmente polinizadas en invernadero Plaacutentulas de aproximadamente un centiacutemetro fueron seleccionadas y cultivadas nuevamente en el medio de cultivo Murashige y Skoog pero esta vez con las diferentes dosis de carboacuten activado Se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces el nuacutemero de brotes y el peso de la materia verde total Durante el autoclavado se produce normalmente una hidroacutelisis de sacarina la cual es de 10 aproximadamente este porcentaje aumenta considerablemente al agregar un 1 de carboacuten activado llegando a ser de 95
El desarrollo de las plaacutentulas de C walkeriana aumentan con una mayor concentracioacuten de carboacuten activado asiacute como tambieacuten un mayor tiempo de cultivo El resultado fue que la dosis ideal para el desarrollo de esta orquiacutedea es 2gL de carboacuten activado (TADEU DE FARIA et al 2002) 2422 Establecimiento de cultivos in vitro y micropropagacioacuten de Cattleya aurantiaca (Bateman ex Lindl) Por medio de siembra in vitro se logroacute el establecimiento de C aurantiaca con alto porcentaje de germinacioacuten y desarrollo de protocormos Para la oacuteptima formacioacuten de callo y para la proliferacioacuten de protocormos se determinaron los medios oacuteptimos (MS 10 mgL ANA 10 mgL BA) asiacute como tambieacuten de manera directa sobre explantes de hoja y pseudobulbos (MS 01 mgL ANA 01 mgL GA3)
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Con este uacuteltimo medio tambieacuten se logroacute una oacuteptima regeneracioacuten y desarrollo de plaacutentulas Los medios liacutequidos (sin agitacioacuten) son una buena opcioacuten para conseguir la produccioacuten masiva de protocormos ya que con ellos se optimizoacute la micropropagacioacuten de C aurantiaca Las plaacutentulas micropropagadas presentaron alto porcentaje de sobrevivencia y buen desarrollo despueacutes de su trasplante y aclimatacioacuten lo cual demuestra que es un buen sistema de propagacioacuten para C aurantiaca (GUTIERREZ y SALGADO 2007) En cuanto a transplante y aclimatacioacuten despueacutes de 45 diacuteas de desarrollo in vitro las plaacutentulas de un tamantildeo entre 3 y 5 cm con raiacuteces bien desarrolladas fueron llevadas a condiciones ex vitro eliminando los restos de medio de cultivo con agua potable y ocupando un sustrato de partes iguales de tezontle y corteza de encino cubierta con hojarasca de encino finamente molida Se mantuvieron cubiertas durante 15 diacuteas abriendo cada dos diacuteas hasta poder retirar la tapa en 30 diacuteas Despueacutes de dos meses de haber sido retiradas del cultivo in vitro las plaacutentulas presentaron 70 de sobrevivencia y alcanzaron una altura de hasta 7 cm presentando nuevas hojas y raiacuteces las plantas se muestran vigorosas y capaces de continuar su crecimiento en condiciones ambientales de invernadero (GUTIERREZ y SALGADO 2007)
2423 Establecimiento in vitro y regeneracioacuten de plantas de Laelia autumnalis (Llave y Lex) Lindl Para este estudio se obtuvieron las semillas de una caacutepsula desarrollada despueacutes de 6 meses de la floracioacuten las cuales se sembraron in vitro sin presentar contaminacioacuten ya que la siembra por este meacutetodo es muy eficiente en comparacioacuten al cultivo de semillas libres donde algunas veces se presenta la contaminacioacuten Las observaciones se realizaron cada 15 diacuteas la germinacioacuten se detectoacute en los primeros 15 diacuteas en la mayoriacutea de los medios de cultivos probados con la presencia de protocormos de 1mm de diaacutemetro (HUAPEO y SALGADO 2004) El porcentaje de germinacioacuten que se obtuvo de las semillas cultivadas in vitro de L autumnalis fue de 95 a 100 en todos los medios de cultivo la uacutenica diferencia fue el tiempo entre las germinaciones A excepcioacuten de las semillas cultivadas en el medio MS 100 la germinacioacuten del 100 se obtuvo hasta los 30 diacuteas de cultivo mientras que en el primero la germinacioacuten fue a los 15 diacuteas del cultivo Las plaacutentulas con raiacutez y un par de hojas se lograron a los 90 diacuteas de cultivo en el medio MS 100 alcanzando 07 mm de altura Estas plaacutentulas fueron subcultivadas en medio MS con 05 mgl de ANA y 01 mgl de GA3 para tener plaacutentulas fuente de explante (segmentos de hojas) un medio oacuteptimo de desarrollo de plaacutentulas de L speciosa No fue necesario probar otros medios de cultivos ya que se hicieron pruebas anteriores que demostraron que era el adecuado
Las plaacutentulas de 6 meses de cultivo in vitro despueacutes de su germinacioacuten presentaron una altura promedio de 5 cm con raiacuteces con velamen y hasta dos pares de hojas Segmentos de hoja de eacutestas fueron cultivadas en el medio MS conteniendo ANA BA y GA3 en diferentes concentraciones y se realizaron observaciones cada 30 diacuteas para determinar medios inductores de callo protocormos y raiacuteces La mejor respuesta en formacioacuten de callo fue observada en los segmentos de hoja de plaacutentulas de L autumnalis cultivados en MS con 1 mgl de ANA BA y GA3 iniciando la induccioacuten de
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eacuteste desde los 30 diacuteas de cultivo solamente en un 70 de los explantes cultivados El 100 se logroacute a los 90 diacuteas de cultivo observando callo abundante alrededor de todo el tejido de color blanco con puntos pigmentados de color verde La regeneracioacuten de protocormos de esta orquiacutedea se establecioacute con la siembra de segmentos de hoja de plaacutentulas de 6 meses de edad de manera directa o a partir de callos En callos la produccioacuten fue oacuteptima en el medio MS con 01 mgl de ANABAGA3 ya que a los 60 diacuteas se obtuvieron 50 protocormos por segmento de callo Solamente se produjeron 10 protocormos por explante al cultivarse los segmentos de hoja en MS con 01 mgl de ANABAGA3 a los 120 diacuteas de cultivo (HUAPEO y SALGADO 2004) 25 Aclimatacioacuten Aclimatacioacuten significa que el hombre intercede y guiacutea el proceso de acondicionamiento de las plantas hasta que eacutestas sean aptas para crecer en el campo yo invernadero
Un alto nuacutemero de plantas micropropagadas no sobreviven al cambio desde el cultivo in vitro hacia el ambiente exterior ya sea en campo o invernadero Eacutestos dos uacuteltimos tienen menor humedad relativa niveles maacutes altos de luminosidad y un ambiente seacuteptico los cuales son maacutes estresantes para las plantas micropropagadas La mayoriacutea de las especies que crecen in vitro necesitan un proceso de aclimatacioacuten pudiendo obtener asiacute un nuacutemero suficiente de plantas vivas y vigorosas para trasplantar al suelo (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991)
La aclimatacioacuten no es uacutenicamente para micropropagacioacuten siendo usada ademaacutes en propagacioacuten convencional durante antildeos Despueacutes de cortar las hojas y de haber formado raiacuteces por lo general son aclimatadas antes de ser llevadas al campo o invernadero Ejemplos de dos teacutecnicas comunes son bajar gradualmente la humedad y mantener el nivel de luz con un 50 de sombra antes de trasladarlos al campo Las raiacuteces que han sido cortadas y mal limpiadas muchas veces son focos de infeccioacuten En estos casos las plantas muestran signos de marchitez hojas necrosadas y tambieacuten se puede llegar a la muerte de eacutestas El cultivo in vitro reduce la necesidad de fotosiacutentesis ya que las condiciones de la caacutemara de incubacioacuten proveen a la planta de sacarosa u otro azuacutecar Tambieacuten en estas condiciones se reduce el stress por patoacutegenos al ser un ambiente aseacuteptico Todo esto se traduce en que las plantas micropropagadas no son aptas para el campo yo invernadero (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 251 Stress hiacutedrico El stress hiacutedrico puede ser el resultado de una excesiva transpiracioacuten de las diferentes partes aeacutereas de las plantas especialmente de las hojas o por una inadecuada absorcioacuten de agua por parte de las raiacuteces La cutiacutecula y los estomas son la ruta primaria de peacuterdida de agua desde de las hojas provenientes de esta teacutecnica reproductiva 2511 Cutiacutecula La cutiacutecula es una membrana compuesta por una matriz de cutina que a su vez se encuentra cubierta en su superficie por ceras cuya funcioacuten primaria consiste en limitar la peacuterdida de agua por transpiracioacuten La permeabilidad del agua a traveacutes de la cutiacutecula se ve influenciada principalmente por la estructura y la cantidad de
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ceras cuticulares y epicuticulares no vieacutendose afectada la peacuterdida de agua por el grosor de eacutesta o la naturaleza quiacutemica de la matriz de la cutina La estructura cristalina de la parte encerada de las hojas es distinta en las plantas micropropagadas con respecto a las plantas que crecen en el campo La cera epicuticular de las hojas de plantas in vitro tienen una proporcioacuten maacutes alta de esteres y de componentes polares por el contrario tienen unas cadenas de hidrocarbonos mucho maacutes cortas Esto hace que las plantas in vitro pierdan maacutes agua que las cultivadas en campo o invernadero
Las plantas que han crecido en el campo son naturalmente de color verde pero el color de las plantas cultivadas in vitro es diferente y se puede ver a simple vista Las plantas que son pasadas a invernadero y que tengan un color verde se aclimatan de mejor forma al ambiente exterior (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 2512 Estomas La estructura estomaacutetica y su funcionamiento han sido implicados recurrentemente en el desbalance de agua exhibido por plantas micropropagadas al momento de ser removidas del cultivo in vitro Estudios con microscopiacutea de scanner electroacutenico han indicado que la estructura estomaacutetica presente en algunas especies de plantas cultivadas in vitro difieren marcadamente de las cultivadas en invernadero o en el suelo Debido a que las primeras presentan estomas de mayor tamantildeo y maacutes redondos a diferencia de las plantas cultivadas de manera normal que presentan estomas maacutes pequentildeos y eliacutepticos lo que resulta en una deshidratacioacuten maacutes raacutepida en el caso de las provenientes de cultivo in vitro (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 252 Humedad Debido a la anatomiacutea y la condicioacuten fisioloacutegica de las plantas desarrolladas in vitro donde se ha mantenido una alta humedad relativa es necesario regar al momento del traslado para obtener una alta sobrevivencia Muchos laboratorios aseguran que hay que evitar tener un sistema de aspersioacuten ya que se produce el ambiente necesario (muy huacutemedo) para la aparicioacuten de hongos algas o bacterias Otros meacutetodos incluyen el uso de humidificadores o poner las macetas en un lugar cerrado donde se retenga vapor para esto se pueden usar por ejemplo tapas de polietileno Este meacutetodo es relativamente econoacutemico pero se debe tener control del calor y monitorear la falta de agua (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 253 Luz Durante la etapa in vitro las plantas estaacuten expuestas a altos niveles de luminosidad lo que se traduce en hojas delgadas Antes del traslado se recomienda mantener las plantas con un 50 de sombra para asiacute poder aclimatarlas de mejor manera esto debido a que las plantas micropropagadas tienen un bajo control sobre la transpiracioacuten y un inadecuado mecanismo de fotosiacutentesis La sombra reduce la transpiracioacuten evitando excesivas peacuterdidas de agua asiacute como tambieacuten el exceso de luz destruye las moleacuteculas de clorofila Luego del periacuteodo bajo sombra se deben mover las macetas gradualmente hacia el nivel de luz al cual seraacute llevado para su crecimiento final (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 254 Temperatura La temperatura del aire y del medio o sustrato de crecimiento estaacute generalmente controlado durante el periacuteodo de aclimatacioacuten El calor es necesario en los meses de invierno y el friacuteo (enfriar) es esencial en los meses de verano Ajustando la cantidad de sombra y humedad se obtiene un control sobre la temperatura El
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enfriamiento se puede obtener gracias a ventilacioacuten abanicos niebla o aire acondicionado El calor puede provenir del sistema existente en el edificio o invernadero donde esteacuten ubicadas las macetas o por las laacutemparas ocupadas para el control del fotoperiacuteodo El rango de temperatura que se mantiene por lo general es entre los 13 y 30ordmC y esta determinado principalmente por la especie en cuestioacuten La temperatura de la zona donde se encuentran las raiacuteces es muy importante para el crecimiento lo ideal es que dicho sector tenga una mayor temperatura que el aire fomentando el crecimiento de las raiacuteces e incrementando la humedad alrededor de la planta Durante el verano esto es difiacutecil de obtener ya que la temperatura del aire es muy alta debido a la alta radiacioacuten solar Terminado el proceso de aclimatacioacuten esto ya no es necesario (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 255 Fotosiacutentesis Las plantas sufren un cambio radical cuando son removidas desde cultivo in vitro ya que son forzadas a cambiar de heterotroacuteficas a autotroacuteficas y la fotosiacutentesis se vuelve fundamental para la sobrevivencia Las hojas de las plantas in vitro no estaacuten formadas para hacer fotosiacutentesis ya que en la caacutemara de incubacioacuten no se produce un fuerte intercambio gaseoso esto debido a que la sacarosa es entregada a traveacutes del medio de cultivo Las hojas de las plantas que son trasladadas al campo o invernadero sufren deterioro debido a que no estaacuten formadas para la fijacioacuten de carbono Esto se produce por un tiempo aproximado de cuatro semanas despueacutes de las cuales las hojas nuevas suplen a las viejas Otro punto es que las hojas de las plantas cultivadas in vitro contienen menor proporcioacuten de clorofila que las plantas que han crecido normalmente en el campo En un estudio de coliflor cultivado in vitro se midioacute el CO2 y se obtuvo un balance negativo el cual se mantuvo durante dos semanas despueacutes del transplante Algo similar ocurrioacute con frutilla despueacutes del transplante las hojas se deterioraron raacutepidamente lo que quiere decir que no hubo incremento en la fijacioacuten de carbono indicando falta de desarrollo en la competencia fotosinteacutetica
El bajo nivel de CO2 durante el cultivo in vitro limita el proceso de fotosiacutentesis lo cual se puede compensar usando sacarosa en el medio de cultivo Tambieacuten se puede incrementar el nivel de luz y CO2 obteniendo un fuerte aumento en el crecimiento de varias especies como orquiacutedeas clavel etc (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 256 Sustrato Un sustrato es todo material soacutelido distinto del suelo natural mineral u orgaacutenico que colocado en un contenedor en forma pura o en mezcla permite el anclaje del sistema radicular de la planta desempentildeando por lo tanto un papel de soporte para la planta El sustrato puede intervenir o no en el complejo proceso de la nutricioacuten mineral de la planta (INFOAGRO 2007) El sustrato y los contenedores dentro de los cuales se van a transplantar las plaacutentulas in vitro son importantes para una buena sobrevivencia
Los sustratos ejercen una influencia significativa en la arquitectura del sistema radical de las plantas y en las asociaciones bioloacutegicas de este con el suelo influenciando el
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estado nutricional y la translocacioacuten de agua en el sistema suelo-planta-atmoacutesfera Uno de los requisitos fundamentales que debe cumplir el sustrato para su utilizacioacuten es la sanidad Cuando estos no se elaboran almacenan o manejan correctamente pueden contaminarse y provocar serios dantildeos a las plantas durante la aclimatacioacuten por esta razoacuten son preferidos como componentes para su elaboracioacuten materiales inertes o aquellos en las cuales el proceso de obtencioacuten garantice la mayor desinfeccioacuten posible
Uno de los factores de mayor importancia a la hora de seleccionar los materiales que pueden constituir el sustrato es su disponibilidad tanto en teacuterminos de facilidad de obtencioacuten o suministro como de su costo (VILCHEZ et al 2007)
La presencia de inhibidores o tambieacuten cambios en el pH del sustrato pueden afectar el crecimiento de las raiacuteces y consecuentemente el eacutexito del transplante
Muchos laboratorios y viveros transplantan a un sustrato uniforme debiendo ser eacuteste adecuado en cuanto a soporte de las plantas pH porosidad aireacioacuten y drenaje (DEBERGH y ZIMMERMAN 1991)
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3 MATERIAL Y MEacuteTODO
Para la realizacioacuten de este trabajo se utilizoacute el siguiente material y meacutetodo
31 Material La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio e invernadero de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal pertenecientes a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de Chile
311 Material vegetal Se utilizaron plaacutentulas de C virescens cultivadas in vitro a partir de semillas las cuales fueron proporcionadas por el laboratorio estas plaacutentulas fueron separadas y repicadas para aumentar la poblacioacuten y obtener la cantidad necesaria para el ensayo
FIGURA 2 Plaacutentulas de C virescens en caacutemara de crecimiento in vitro
312 Materiales Los materiales que se utilizaron fueron los siguientes Equipos autoclave caacutemara de flujo laminar dispensador de medios medidor
de pH agitador magneacutetico horno microondas balanza mechero termoacutemetro Materiales vasos de precipitado matraces probetas pipetas papel de
aluminio frascos de vidrio placas Petri pinzas bisturiacute macetas regadera Soluciones soluciones madre (Medio MS) gelificante etanol 70 y 95
32 Meacutetodo A continuacioacuten se da a conocer la metodologiacutea con la cual se trabajoacute 321 Preparacioacuten del medio de cultivo Para la obtencioacuten de plantas a traveacutes de la micropropagacioacuten se ocupoacute el medio basal de MURASHIGE y SKOOG (1962) tambieacuten llamado medio MS Este medio tiene un pH de entre 56-57 Posteriormente se dosificoacute con el dispensador de medios para que cada frasco tenga una cantidad adecuada (25 mL) y se llevoacute a autoclave para esterilizar a 12 atm 120ordm C por 20 min
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322 Obtencioacuten del material vegetal Al tener el medio esterilizado se procedioacute a la separacioacuten y repicado de plaacutentulas existentes en el laboratorio Las siembras se realizaron en el mes de mayo del 2007 Estas siembras se realizaron en la caacutemara de flujo laminar de modo de asegurar que la siembra sea 100 aseacuteptica Estas plaacutentulas fueron mantenidas en la caacutemara de incubacioacuten hasta obtener los tamantildeos requeridos para el ensayo donde las condiciones fueron las siguientes
minus Temperatura ambiental de 23-25ordm C minus Fotoperiacuteodo de 16 horas minus Intensidad lumiacutenica controlada de 50-55 micromol m-2s-1
323 Sustratos Se utilizaron tres tipos de sustratos el primero corresponde a una mezcla de turba + perlita (11) el segundo corresponde a Sphagnum (100) y el tercero corresponde a una mezcla de turba + arena (11) Una vez realizadas las mezclas se procedioacute a una esterilizacioacuten en un autoclave a 121ordm C por 20 minutos a 12 atmoacutesfera De esta forma se trabajoacute con material limpio y sano evitando ataque de hongos o bacterias El anaacutelisis quiacutemico de los sustratos se muestra en el Anexo 2 324 Plantacioacuten Las plaacutentulas con un promedio de cuatro meses en condiciones de caacutemara de crecimiento in vitro obtuvieron el tamantildeo adecuado para ser utilizadas Se sacaron de los frascos y se plantaron en las macetas de plaacutestico transparente con los sustratos Posteriormente fueron dejadas en la sala del laboratorio donde se debioacute asperjar con solucioacuten nutritiva Hoagland y fungicida Captan CUADRO 1 Composicioacuten de solucioacuten nutritiva Hoagland
KNO3 102 gL Ca(NO3) 4 H2 O 0492 gL
NH4H2 (PO4) 023 gL MgSO4 7 H2O 049 gL
H3BO3 286 mgL MnCl2 2 H2O 181 mgL CuSO4 5 H2O 008 mgL ZnSO4 5 H2O 022 mgL Na2MoO4 H2O 009 mgL
FeSO4 7 H2O 05 06 mL FUENTE FINCK 1988 325 Disentildeo de los ensayos Este trabajo de investigacioacuten constoacute de un ensayo con dos etapas Antes que todo se realizoacute la separacioacuten y repicado in vitro de plaacutentulas de C virescens para la obtencioacuten del nuacutemero necesario de plantas En la etapa 1 se utilizaron tres tamantildeos de plaacutentulas obtenidas in vitro de 1-2cm de 2-3cm y de maacutes de 3cm de altura que se transplantaron a tres sustratos turba + perlita 11(vv) Sphagnum (100) y turba + arena 11 (vv) La turba provino de la Sociedad
22
Minera Patagonia Peat SA en Hijuelas el Sphagnum de la empresa Lonquen Chile de Puerto Montt y la perlita se obtuvo a traveacutes del sitio web wwwjardisencl (representante legal Walter Rathgeb Penza Ingeniero Agroacutenomo Santiago) Las plaacutentulas se plantaron de acuerdo a su tamantildeo las de maacutes de 3cm se colocaron de 6 por maceta las de 2 a 3cm de a 8 por maceta y las maacutes chicas de a 10 por maceta Estas macetas fueron dejadas en una sala de aclimatacioacuten con una temperatura promedio de 20ordm C intensidad lumiacutenica de 50-55 micromol m-2s-1 y 14-16 hrs de fotoperiacuteodo Se fertilizoacute asperjando cada cinco diacuteas con solucioacuten nutritiva Hoagland Esta etapa se llevoacute a cabo durante dos meses desde el cinco de septiembre hasta el cinco de noviembre de 2007
En la etapa 2 se continuoacute el proceso de aclimatacioacuten en invernadero de las plaacutentulas obtenidas en la etapa 1 que despueacutes de dos meses teniacutean un mayor tamantildeo y se habiacutean acondicionado al ambiente exterior (fuera de la caacutemara de crecimiento) Las plantas se mantuvieron en las macetas durante tres semanas para aclimatarlas y luego las plantas sobrevivientes fueron transplantadas a macetas maacutes grandes individuales durante tres meses aproximadamente hasta el cinco de marzo 2008 Estas nuevas macetas tuvieron como sustrato turba y suelo (trumao) en igual proporcioacuten (Anexo 2) La temperatura promedio de invernadero fluctuoacute de 13 a 35 degC seguacuten el mes En enero el promedio fue de 25 (Anexo 3) Para bajar la temperatura alrededor de 5deg C se instaloacute una malla Rachel 326 Disentildeo experimental El disentildeo experimental utilizado fue completamente al azar ordenado como experimento factorial con dos factores tamantildeo (3) y sustrato (3) Cada tratamiento tuvo tres repeticiones con un miacutenimo de 6 plantas por recipiente 327 Variables a evaluar Durante los dos meses en que las macetas estuvieron en la sala de aclimatacioacuten se evaluoacute el desarrollo foliar contando el nuacutemero de hojas una vez al mes Posteriormente se trasladaron las mismas macetas a invernadero durante tres semanas para continuar con la aclimatacioacuten de las plaacutentulas Transcurrido este tiempo se transplantaron las plaacutentulas sobrevivientes a macetas individuales y continuoacute mensualmente la evaluacioacuten de eacutestas (nuacutemero de hojas) hasta la obtencioacuten de plantas establecidas Al momento del transplante y al final del ensayo se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces asiacute como tambieacuten al final del ensayo de evaluoacute el crecimiento en altura (cm) La sobrevivencia fue evaluada al final del ensayo por maceta
Tanto en la sala de aclimatacioacuten coacutemo en el invernadero se registroacute la temperatura con la ayuda de un termoacutemetro de maacutexima y miacutenima (Anexo 3) 328 Anaacutelisis estadiacutestico Una vez obtenidos los datos se procedioacute a comprobar si estos cumpliacutean con los supuestos de aleatoriedad normalidad y homogeneidad de varianzas que exige este tipo de anaacutelisis En el caso de no cumplirse estos supuestos los datos se transformaron utilizando log10(x+05) raiacutez(x+05) o 1x para normalizarlos
23
y enseguida se sometioacute los datos a un anaacutelisis estadiacutestico (ANDEVA) Posteriormente en los casos en que se observoacute diferencias significativas en el ANDEVA se aplicoacute una prueba de rangos muacuteltiples (Tukey) al 5 de significancia Para las variables no parameacutetricas que no cumplieron con los supuestos para un anaacutelisis de varianza se realizoacute la prueba de KruskalndashWallis y las comparaciones muacuteltiples a traveacutes del test de Dunn con un nivel de 5 de significancia
Se utilizaron los programas estadiacutesticos STATGRAPHICS 20 y GRAPHPAD PRISM 5 para el anaacutelisis de datos
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4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
En los siguientes puntos se discuten los resultados obtenidos en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens
En la Figura 3 se observan plaacutentulas de C virescens micropropagadas en medio MS en caacutemara de crecimiento al inicio del ensayo (A) y en invernadero despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten (B)
BA
FIGURA 3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten
A continuacioacuten se presentan los resultados obtenidos para las variables analizadas (Cuadro 2 y 3) de esta manera se pueden visualizar en general los resultados obtenidos en el proceso de aclimatacioacuten durante seis meses
CUADRO 2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de raiacuteces
inicial y final Variables
Hojas finales (nuacutemero)
Raiacuteces iniciales (nuacutemero)
Raiacuteces finales (nuacutemero)
Tamantildeo de plaacutentulas 36 24 37 47 29 46
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 61 43 76
Sustratos 53 36 56 43 29 51
Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 46 27 49
Significa que hay diferencias significativas al 95 Test de Dunn
25
Las variables no parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en hojas finales y raiacuteces iniciales en sus rangos de distribucioacuten Las raiacuteces finales no presentaron diferencias seguacuten el sustrato utilizado pero de acuerdo al tamantildeo hubo diferencias en su distribucioacuten
CUADRO 3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas
Variables Altura final de plaacutentulas
(cm) Sobrevivencia
Tamantildeo de plaacutentulas
36 c 567 b 47 b 821 a
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 59 a 908 a
Sustratos 52 a 933 a
41 ab 59 b Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 49 b 772 a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY Las variables parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en altura final de hojas y en sobrevivencia 41 Nuacutemero de hojas finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentulas y de sustratos para la variable nuacutemero final de hojas 411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula Seguacuten el Cuadro 2 y Figura 4 las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero final de hojas Las plaacutentulas pequentildeas de 1-2 cm obtuvieron el nuacutemero maacutes bajo de hojas finales con una media de 36 hojas por plaacutentula lo cual es la mitad de las hojas finales que se obtuvo con las plaacutentulas de mayor tamantildeo (61 hojas aproximado por plaacutentula) Para las plaacutentulas medianas de 2-3 cm se obtuvo una media de 47 hojas por plaacutentula (Figura 4)
26
Hojas finales
1-2 cm 2-3cm maacutes de 3 cm0
5
10
15
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn)
BLANCO (2006) sentildeala que plaacutentulas cultivadas in vitro crecen bajo condiciones especiales como alta humedad relativa y baja luminosidad ademaacutes son suplidas con sacarosa Estas condiciones fueron proporcionadas en una caacutemara de crecimiento en el laboratorio donde las plantas micropropagadas no son dependientes por completo de su fotosiacutentesis son heteroacutetrofas Parece ser necesario un estiacutemulo para convertirse en organismos totalmente capaces de sustentar sus propios requisitos de carbono y nitroacutegeno reducido pasando de esta manera a ser autoacutetrofos
Al ser sacadas de un medio in vitro las hojas no estaacuten preparadas para producir su propio alimento y sobreviven gracias a que el medio de cultivo le proporciona los nutrientes necesarios para vivir En este punto muchas de las hojas mueren y nacen hojas nuevas capaces de generar su alimento supliendo asiacute las hojas viejas (SEELYE et al 2003) En este ensayo las plaacutentulas de Chloraea virescens presentaron en general una buena adaptacioacuten al ser sacadas de un medio in vitro
Se observoacute que plaacutentulas con menor tamantildeo al ser aclimatadas y tener menor tejido fue maacutes difiacutecil y maacutes lento que empezaran a generar nuevos tejidos y materia orgaacutenica a partir de dioacutexido de carbono POSPIacuteŠILOVAacute et al (1999) sentildeala que al tener los estomas con desarrollo incompleto maacutes grandes y de forma maacutes redonda pierden maacutes agua lo cual puede provocar una peacuterdida de hojas muriendo asiacute la plaacutentula Por esta razoacuten las plaacutentulas pequentildeas se demoran maacutes tiempo en generar hojas nuevas es por ello que al finalizar este estudio muestran el menor nuacutemero final de hojas 412 Efecto del tipo de sustrato Al analizar la influencia del tipo de sustrato se encontraron diferencias significativas entre los tres sustratos utilizados Seguacuten el Cuadro 2 y la Figura 5 el sustrato donde se obtuvo mejores resultados fue
27
turba+perlita en el cual se observoacute un promedio de 53 hojas por plaacutentula siendo Sphagnum el maacutes bajo con 43 hojas por plaacutentula De acuerdo a los resultados del anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados el sustrato turba+perlita tiene mayor cantidad de nitroacutegeno foacutesforo calcio magnesio y azufre disponible comparativamente con los otros dos sustratos (Sphagnum y arena+turba) (Anexo 2)
Hojas finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
Sustratos
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) Para la brotacioacuten y el crecimiento de las plantas se necesita agua y Nitroacutegeno lo que favorece a una mayor tasa de aparicioacuten de hojas lo que se traduce en una mayor cantidad de hojas finales El Nitroacutegeno se encuentra en mayor cantidad en el sustrato turba+perlita debido a lo cual los mejores resultados se obtienen en dicho sustrato 413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Despueacutes de analizados los efectos individuales del tamantildeo y del sustrato al interactuar ambos factores existen diferencias significativas La mejor interaccioacuten se obtuvo con el sustrato turba+perlita y con el mayor tamantildeo de la plaacutentula (Figura 6) Debido a la buena estructura (porosa) de dicho sustrato se podriacutea decir que se favorecioacute la absorcioacuten radicular de nutrientes obteniendo por ello un mayor nuacutemero de hojas finales Para los menores tamantildeos no se observan diferencias significativas obteniendo como promedio 41 hojas por plaacutentula Para el mayor tamantildeo el promedio fue de 6 hojas por plaacutentula
28
Hojas finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 42 Raiacuteces iniciales Este paraacutemetro se evaluoacute luego de la primera etapa de aclimatacioacuten la cual se realizoacute en una sala de aclimatacioacuten del laboratorio Se analizoacute la influencia de diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos sobre la variable nuacutemero raiacuteces iniciales (Anaacutelisis de Kruskal-Wallis en Anexo 7)
FIGURA 7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses de pre aclimatacioacuten
29
En la Figura 7 se puede observar los resultados de pre aclimatacioacuten en sala de laboratorio En esta etapa ya es posible ver la presencia de raiacuteces desarrolladas 421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula En el Cuadro 2 se puede observar que las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero inicial de raiacuteces y en la Figura 8 se puede comprobar que para los dos tamantildeos de plaacutentula maacutes pequentildeos no se observa gran cantidad de raiacuteces esto no impidioacute el desarrollo posterior de las plaacutentulas las cuales lograron enraizar al final del estudio Esto se contrapone a lo observado en un estudio de Lapageria rosea donde la presencia de raiacutez y brote para lograr una multiplicacioacuten exitosa de plantas es de vital importancia Incluso algunas plaacutentulas de L rosea no brotan en condiciones in vitro en donde tienen las mejores condiciones nutricionales y hormonales para hacerlo Esto se debe a factores internos de la plaacutentula siendo muy difiacutecil que broten inmediatamente en caacutemara de aclimatacioacuten donde ya dejan de recibir los nutrientes necesarios de manera directa y requieren de balances de energiacutea para poder seguir elongando raiacuteces absorber nutrientes y brotar para poder obtener los carbohidratos necesarios para seguir su crecimiento (BLANCO 2006) El tamantildeo de plaacutentula tiene importancia para el desarrollo de raiacuteces se distingue notoriamente que en los tamantildeos maacutes grandes el nuacutemero de raiacuteces es mayor comparativamente con los tamantildeos pequentildeos donde el nuacutemero de raiacuteces fue escaso Debido a la presencia de maacutes hojas existe una mayor cantidad de aacuterea fotosinteacutetica esta situacioacuten estimula el crecimiento de las raiacuteces para la obtencioacuten de agua y nutrientes
Raices iniciales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
2
4
6
8
10
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o inicial de ra
iacuteces
FIGURA 8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn)
30
422 Efecto del tipo de sustrato Para el sustrato turba+perlita se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas en el nuacutemero de raiacuteces con respecto a los dos otros sustratos esto se puede ver en el Figura 9 donde se observa que se obtuvieron los mayores resultados En cualquier medio de crecimiento el espacio no ocupado por un soacutelido se llama porosidad este espacio puede ser ocupado en parte para retener agua y en parte para proporcionarle aire a las raiacuteces La ausencia de uno de estos elementos es perjudicial para las plantas La turba es conocida por tener estas propiedades y la perlita tambieacuten por esta razoacuten se sabe que la mezcla turba-perlita provee propiedades fiacutesicas excelentes como medio de crecimiento y propagacioacuten (INFOAGRO 2007) Estos resultados con turba-perlita (298 de materia orgaacutenica) coinciden con los obtenidos por DIAZ et al (2004) quienes al utilizar un sustrato compuesto por 100 de humus de lombriz para aclimatar cantildea de azuacutecar obtuvieron el mayor nuacutemero de raiacuteces Esto puede atribuirse al importante aporte de materia orgaacutenica del humus (47) lo que le confiere una mejor estructura obtenieacutendose una excelente porosidad del sustrato La aireacioacuten del suelo es necesaria para favorecer la maacutexima absorcioacuten de nutrientes por las raiacuteces Esto tambieacuten sucede en el sustrato turba+perlita el cual posee la mayor cantidad de materia orgaacutenica de los tres sustratos utilizados
Raices iniciales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
2
4
6
8
10
Sustratos
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato En los anaacutelisis para la variable nuacutemero de raiacuteces se puede decir que la mejor interaccioacuten se presentoacute para el sustrato de turba+perlita junto con el mayor tamantildeo de plaacutentulas obteniendo los valores maacutes altos entre los nueve tratamientos La presencia de raiacuteces luego de la micropropagacioacuten aumenta la posibilidad de eacutexito en el transplante ya que se crea un favorable balance de agua Pero esto no quiere
31
decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
10
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
32
En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
33
El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
34
Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
7
FIGURA 1 Chloraea virescens FUENTE NOVOA et al (2006) 22 Requerimientos de las orquiacutedeas Para tener eacutexito en el cultivo de orquiacutedeas hay que tomar en cuenta factores de importancia como son 221 Agua El riego correcto es el principio y el fin del cuidado de orquiacutedeas (ROLLKE 2005) Este elemento es primordial para las orquiacutedeas asiacute como tambieacuten para todo tipo de plantas En el caso de eacutestas se dice muchas veces que la calidad del agua usada es el factor maacutes importante en el cultivo de orquiacutedeas ya que el porcentaje maacutes alto de muerte se produce por el exceso de este factor (SHEEHAN 1980) Hay que tomar en cuenta que la mayoriacutea de las orquiacutedeas son epiacutefitas lo que significa que tienen sus raiacuteces a la vista gracias a las cuales absorben el agua de lluvia Se recomienda un sustrato poroso y de reaccioacuten neutra ya que de esta manera el agua escurre sin acumularse no permitiendo la pudricioacuten de las raiacuteces Para las orquiacutedeas terrestres es lo mismo solo que se pueden regar con maacutes frecuencia pero sin mantenerlas saturadas (OSPINA y DRESSLER 1979) Seguacuten DUMOIS (2007) el agua es lo maacutes difiacutecil de controlar ya que depende de muchas variables como por ejemplo humedad relativa tipo de sustrato intensidad luminosa temperatura y circulacioacuten de aire Ademaacutes muchas orquiacutedeas necesitan un periacuteodo de receso vegetativo que si no es respetado resulta en ausencia de floracioacuten En general hay que antildeadir agua en abundancia cuando la planta se encuentra en crecimiento activo y reducirla despueacutes de la floracioacuten
8
Las especies con pseudobulbos almacenan agua y estaacuten preparadas para su periacuteodo de receso Otras que no cuentan con estos oacuterganos requieren de humedad maacutes constante 222 Luz Ninguna planta puede crecer sin la iluminacioacuten adecuada Muchas orquiacutedeas viven en las alturas de los aacuterboles y estaacuten expuestas a plena luz del sol otras crecen en el suelo selvaacutetico protegidas del sol por espesos follajes (ROLLKE 2005) La funcioacuten principal de la luz es activar el proceso de fotosiacutentesis Los cultivadores han estudiado la luz y han descubierto que hay orquiacutedeas que florecen con diacutea largo y otras con diacutea corto (OSPINA y DRESSLER 1979) Gracias a la fotosiacutentesis se convierten los minerales presentes en el ambiente en savia y nutrientes Hojas oscuras y falta de floracioacuten indican falta de luz hojas amarillas e incluso quemadas apuntan hacia un exceso de sol (DUMOIS 2007) 223 Fertilizacioacuten Las orquiacutedeas necesitan los mismos nutrientes que otras plantas Un abono para orquiacutedeas debe contener los nutrientes principales nitroacutegeno (N) foacutesforo (P) y potasio (K) asiacute como tambieacuten oligoelementos como hierro (Fe) magnesio (Mg) zinc (Zn) estantildeo (Sn) y manganeso (Mn) (ROLLKE 2005) Por otra parte la fertilizacioacuten depende de varios factores dentro de los cuales los maacutes criacuteticos son
- El medio utilizado - La edad de las plantas - Estado de las plantas ya sea floracioacuten crecimiento reposo
En cuanto a absorcioacuten se ha demostrado que es igual de eficiente por viacutea foliar como a traveacutes de las raiacuteces Es necesario tener en cuenta algunas reglas baacutesicas a la hora de fertilizar las orquiacutedeas (Asociacioacuten Costarricense de Orquideologiacutea ACO 1970)
1 Regar las plantas antes de fertilizar 2 Fraccionar las dosis 3 Aplicar el fertilizante de forma liacutequida 4 No usar fertilizantes soacutelidos 5 No fertilizar las plantas recieacuten plantadas 6 No fertilizar plantas en reposo 7 No abonar plantas enfermas
224 Temperatura Es conocido el hecho de que cada planta tiene liacutemites de temperatura dentro de los cuales prospera o perece De ahiacute la necesidad de conocer las temperaturas correspondientes al lugar de donde viene cada especie de orquiacutedea pudiendo proporcionarle la temperatura adecuada (OSPINA y DRESSLER 1979) Se puede clasificar a las orquiacutedeas como de clima caacutelido (temperatura nocturna miacutenima de 20ordmC) templado (miacutenimo de 13 a 18ordmC) y de ambiente friacuteo (de 10 a 13ordmC) (DUMOIS 2007)
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Seguacuten SHEEHAN (1980) las temperaturas ideales para las orquiacutedeas de origen tropical son 10ordmC en la noche y entre 21ordm - 24ordmC durante el diacutea 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas La micropropagacioacuten de orquiacutedeas estaacute en vanguardia hoy en diacutea El estudio de cultivo de tejido de orquiacutedeas se lleva a cabo en muchos laboratorios de todo el mundo (ARDITTI and ERNST 1992) 231 Biologiacutea de las semillas Las semillas de orquiacutedeas son conocidas usualmente como semillas polvo porque son minuacutesculas y contienen pocas reservas de alimento Estas semillas por lo general no germinan en el medio natural a menos que sean infectadas por un hongo micorriacutezico Este hongo abastece a las plantas joacutevenes con azuacutecares y nutrientes hasta que sean lo suficientemente grandes para fabricar su propio alimento Cuando la semilla germina produce una masa indiferenciada de ceacutelulas llamada protocormo Manteniendo las condiciones normales el protocormo continuaraacute su crecimiento por varias semanas meses o incluso antildeos dependiendo de la especie hasta que alcance la edad apropiada para producir raiacuteces y hojas En el caso de orquiacutedeas terrestres es de vital importancia que la relacioacuten orquiacutedea-hongo se conserve durante los estados tempranos del ciclo de vida de la planta ya que el protocormo enterrado no puede fabricar alimento por siacute mismo Por otro lado los protocormos de las orquiacutedeas epiacutefitas son comuacutenmente verdes lo que les posibilita producir parte de su alimento La relacioacuten orquiacutedea-hongo no ha sido en su totalidad investigada para el caso de las orquiacutedeas tropicales (McKENDRICK 2000) 232 Germinacioacuten simbioacutetica y no simbioacutetica de semillas Mediante la germinacioacuten in vitro las semillas germinan en frascos de vidrio o plaacutestico Estos frascos contienen en su interior un medio nutritivo solidificado con agar con todos los azuacutecares y minerales necesarios para la germinacioacuten y crecimiento de las semillas Hay dos tipos de germinacioacuten la simbioacutetica y la asimbioacutetica En la germinacioacuten simbioacutetica las semillas se siembran junto con una pequentildea cantidad del hongo micorriza adecuado Dicho hongo crece en el medio coloniza a las semillas que estaacuten en proceso de germinacioacuten y se produce una relacioacuten simbioacutetica la cual alimentaraacute al protocormo hasta que este sea capaz de producir sus hojas y se vuelva autotroacutefico Esta teacutecnica es usada principalmente en propagacioacuten de orquiacutedeas terrestres en zonas templadas La germinacioacuten asimbioacutetica se usa principalmente en propagacioacuten de orquiacutedeas tropicales que crecen maacutes raacutepido que sus parientes de zonas templadas Para este tipo de germinacioacuten se necesita un medio de cultivo maacutes complejo ya que todos los nutrientes orgaacutenicos e inorgaacutenicos asiacute como tambieacuten los azuacutecares deben estar en forma disponible pues no existe la intermediacioacuten del hongo (McKENDRICK 2000) 233 Condiciones de esterilidad Tanto para la germinacioacuten simbioacutetica como para la asimbioacutetica es de vital importancia que los frascos las semillas aparatos y el medio esteacuten esteacuteriles desde el principio del proceso Esto debido a que cualquier hongo o bacteria que se introduzca creceraacute maacutes raacutepido que las semillas ocupando su espacio hasta matarlas Esto se evita gracias al autoclave el cual regulado a 12 atm y 120ordmC por 20 minutos mata hongos o bacterias presentes en el medio (McKENDRICK 2000)
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2331 Siembra de las semillas Las semillas pueden ser recolectadas desde caacutepsulas verdes o maduras La caacutepsula verde que estaacute madurando estaacute llena de semillas y no se deforma cuando se aprieta con las pinzas Estas semillas pueden ser almacenadas por algunas semanas en un lugar refrigerado con bastante aireacioacuten Las semillas se pueden sembrar a partir de caacutepsulas verdes o semillas secas A continuacioacuten se muestran las ventajas y desventajas de ambos meacutetodos
- Siembra a partir de caacutepsulas verdes Si las caacutepsulas se mantienen intactas el interior (las semillas) se mantiene esteacuteril Por lo tanto si se esteriliza la parte exterior de las mismas donde hongos y bacterias pueden desarrollarse y se abren las caacutepsulas bajo condiciones esteacuteriles y las semillas podraacuten mantenerse desinfectadas
La ventaja de este meacutetodo es que no se requiere de esterilizacioacuten de las semillas lo que provoca su deterioro Otro punto a favor es que algunas semillas podriacutean germinar maacutes raacutepido que las provenientes de caacutepsulas maduras por los mecanismos de dormancia La desventaja es que en este caso todas las semillas deben ser utilizadas o eliminadas mientras que las semillas maduras se pueden almacenar Tambieacuten se debe considerar que las semillas sembradas a partir de caacutepsulas que no han madurado lo suficiente podriacutean germinar lentamente o simplemente no germinar - Siembra a partir de semillas secas En este caso una vez que la caacutepsula es abierta las semillas dejan de ser esteacuteriles y requieren de un proceso de esterilizacioacuten Comuacutenmente se utiliza una solucioacuten de hipoclorito de sodio hipoclorito de calcio o peroacutexido de hidroacutegeno Las semillas se agitan dentro de la solucioacuten que ademaacutes contiene una gota de detergente para ldquohumedecerlasrdquo luego se las enjuaga con agua destilada y se las siembra en el medio preparado La ventaja de este meacutetodo es que las semillas pueden ser colectadas secadas al aire almacenadas por varios meses en el refrigerador y utilizarlas cuando sea necesario Se debe considerar que la siembra ya sea de caacutepsulas verdes o de semillas secas estaacute determinado por la eacutepoca en que se colectan (McKENDRICK 2000) 234 Trasplante En la caacutemara de incubacioacuten las plaacutentulas se han desarrollado en condiciones limpias y en un ambiente cerrado por lo que deben acostumbrase gradualmente al ambiente exterior antes de ser trasplantadas a las macetas Tambieacuten la temperatura y la luz la cual es baja han sido constantes durante el cultivo in vitro En el medio natural la temperatura y la luz variacutean constantemente por lo que las nuevas plantas deben estar protegidas de la fuerte luz solar la cual puede quemar las hojas con soacutelo una pequentildea cantidad de eacutesta La humedad en los frascos es alta y las plantas estaacuten protegidas de ataques por hongos o bacterias Ademaacutes las plaacutentulas han crecido bajo condiciones de alta humedad y por lo tanto tendraacuten cutiacuteculas deacutebiles por lo que necesitan acostumbrase a medios menos huacutemedos antes de ser transplantadas
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Para el trasplante se deben colocar los frascos en un lugar protegido de la lluvia para que se aclimaticen a las nuevas condiciones de luz y temperatura Se deben dejar por 2 a 4 semanas en los frascos tapados Luego se debe ir aflojando las tapas para dejar entrar pequentildeas cantidades de aire hasta el punto de dejarlas descubiertas Se debe revisar si hay hojas marchitas y ver que el sustrato esteacute huacutemedo
Lo ideal es dejarlas sin tapa durante una semana antes de pasarlas a las macetas Para el trasplante se debe elegir un sustrato adecuado para el tipo de planta humedecerlo y transplantar las plantas con cuidado de no dantildear las raiacuteces y evitando la deshidratacioacuten En esta etapa tambieacuten se debe dejar las macetas selladas para evitar una raacutepida deshidratacioacuten e ir abrieacutendolas paulatinamente (McKENDRICK 2000)
24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas 241 Orquiacutedeas terrestres 2411 Cypripedium Esta es una orquiacutedea terrestre de zonas templadas se desarrolla en el Hemisferio Norte como por ejemplo en Guatemala y en Honduras pero donde se encuentra principalmente es en China Su forma maacutes comuacuten de propagacioacuten es in vitro a partir de semillas La forma maacutes eficiente es a partir de semillas inmaduras Existe un intervalo de tiempo entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten eacuteste dependeraacute de la especie y de la zona donde se desarrolle Se asume que existen aproximadamente cuatro semanas entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten El oacuteptimo para una buena germinacioacuten de Cypripedium es entre 42 y 60 diacuteas despueacutes de la polinizacioacuten y entre 14 y 32 diacuteas despueacutes de la fertilizacioacuten La germinacioacuten ocurre entre la segunda y cuarta semana despueacutes de ser sembradas y los protocormos deberiacutean ser cambiados de medio de cultivo cada dos a cuatro meses si no se corre el riesgo de sufrir agotamiento de nutrientes Los rizomas y las raiacuteces se empiezan a desarrollar a partir de los siete meses para luego dar lugar a las primeras hojas Para obtener un buen transplante se deben tener raiacuteces de miacutenimo un centiacutemetro de largo El desarrollo de raiacuteces se ve potenciado al tener un periacuteodo corto de bajas temperaturas (10degC) exposicioacuten a la luz reduccioacuten en la concentracioacuten de iones del medio de cultivo o transferirlas a un compost esteacuteril Al tener raiacuteces suficientes y el tamantildeo adecuado se podraacuten llevar las plantas al lugar donde creceraacuten definitivamente En el momento del transplante las plantas son muy susceptibles al desecamiento por lo cual lo ideal es que los brotes sean maacutes chicos que las raiacuteces El mejor sustrato seriacutea aquel donde crece naturalmente la orquiacutedea (RAumlNNBAumlCK 2007) 2412 Preservacioacuten in vitro de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes Este estudio fue hecho para establecer que parte de tejido es viable para la micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes del noreste de Europa pudiendo asiacute reestablecer dichas orquiacutedeas a sus aacutereas correspondientes La propagacioacuten in vitro de orquiacutedeas
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terrestres de clima templado es maacutes difiacutecil que las orquiacutedeas epiacutefitas de clima subtropical y tropical Las orquiacutedeas terrestres tienen requerimientos maacutes estrictos que las epiacutefitas y se conoce menos sobre sus necesidades especiacuteficas (VAASA y ROSENBERG 2004) En Estonia existen 36 especies de orquiacutedeas terrestres pero solo tres estaacuten bajo proteccioacuten Dactylorhiza baltica Dactylorhiza ruthei Dactylorhiza praetermissa Como explantes para este estudio en el caso de D baltica se ocuparon protocormos en los otros dos casos se utilizaron semillas semi maduras las cuales fueron colectadas siete y diez semanas despueacutes de ser polinizadas Para D baltica se ocupoacute el medio Murashige y Skoog suplementado con 05 mgL de aacutecido naftaleacuten aceacutetico (ANA) y 2 mgL de isonpentenyl adenina Para el caso de las semillas semi maduras se ocuparon los medios de Lindemann de Heller de Norstog y de Murashige y Skoog como control
La composicioacuten del medio y la madurez de las semillas influye mucho en el desarrollo de las orquiacutedeas in vitro Se ha demostrado que se necesita una alta concentracioacuten de microelementos para obtener una correcta germinacioacuten de las semillas Tambieacuten se puede decir que los primeros tres meses son los de mayor crecimiento luego de este tiempo el crecimiento se vuelve maacutes lento (VAASA y ROSENBERG 2004)
Luego de cuatro semanas de crecimiento de D baltica el 60 de los explantes de meristemas apicales empezaron a crecer en cambio los de meristemas laterales no expresaron ninguacuten tipo de crecimiento Las raiacuteces empezaron su desarrollo luego de dos meses despueacutes de la siembra
En el caso de D ruthei y D praetermissa la germinacioacuten se produjo despueacutes de dos meses desde la inoculacioacuten Luego de cuatro y seis meses el mayor crecimiento fue observado en el medio Norstog superando en 14 al medio testigo Murashige y Skoog (VAASA y ROSENBERG 2004)
2413 Longevidad de semillas de orquiacutedeas terrestres Por lo general las orquiacutedeas producen muchas pero pequentildeas semillas que contienen muy pocas reservas de alimento Dichas semillas estaacuten estructuralmente adaptadas para ser dispersadas por el viento pero poco se sabe del destino de eacutestas luego de ser dispersadas Algunos estudios de viabilidad de semillas indican una sobrevivencia de uno a dos antildeos en orquiacutedeas de clima templado Las semillas que son guardadas en laboratorio duran mucho maacutes tiempo Se estudioacute la viabilidad de siete especies de orquiacutedeas norteamericanas dentro de las cuales se encuentran Goodyera pubescens y Liparis liliifolia Las semillas de eacutestas se colocaron en bolsas con suelo y sustratos de bosques provenientes de sus haacutebitats naturales (WHIGHAM et al 2005) En Goodyera pubescens la mayoriacutea de las semillas germinaron en un antildeo Cuatro otras especies germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero algunas semillas no germinadas despueacutes de siete antildeos seguiacutean siendo viables En la especie Liparis liliifolia semillas que han estado cuatro antildeos bajo observacioacuten han tenido una tasa de
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germinacioacuten de un 68 al ser sembradas in vitro junto con el hongo micorriacutezico adecuado Las dos especies restantes no germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero las semillas fueron evaluadas como intactas y testeadas positivamente en cuanto a su viabilidad despueacutes de cuatro antildeos en el suelo Estas observaciones fueron interpretadas como diferentes estrategias para especies especiacuteficas de germinacioacuten in situ (WHIGHAM et al 2005) 2414 Sobrevivencia de orquiacutedeas terrestres transplantadas a sectores urbanos La conservacioacuten de poblaciones de orquiacutedeas silvestres depende del establecimiento de las orquiacutedeas propagadas a los campos Sin embargo se conoce muy poco de los factores bioacuteticos que influencian el establecimiento de orquiacutedeas terrestres a sus haacutebitats naturales Un experimento fue establecido para medir la sobrevivencia de seis especies durante su primer periacuteodo de crecimiento seguido del transplante a un sector urbano en Australia (SCADE et al 2006)
Las orquiacutedeas germinadas simbioacuteticamente crecieron en laboratorio durante cinco meses antes de establecer la plantacioacuten en sitios adyacentes con alta o baja cobertura de malezas Existioacute una muerte gradual de las plaacutentulas durante el primer periacuteodo de crecimiento primeramente por ataque de insectos no siendo evitado por la presencia de una malla cobertora Los iacutendices de sobrevivencia variacutean desde 49 para Microtis media una especie capaz de crecer en un ambiente atiacutepico hasta un 21 para Caladenia arenicola la orquiacutedea nativa maacutes comuacuten de esos sitios Sin embargo no todas las orquiacutedeas sobrevivientes producen tubeacuterculos por lo que la tasa de sobrevivencia despueacutes del primer periacuteodo seco disminuye
La sobrevivencia de las orquiacutedeas sembradas no puede ser comparada con orquiacutedeas de la misma especie que crecieron en los mismos lugares ya que no existioacute la presencia del hongo compatible para estas orquiacutedeas (SCADE et al 2006)
2415 Micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres En India dos orquiacutedeas muy importantes para la horticultura del geacutenero Anoectochilus fueron exitosamente propagadas Noacutedulos aislados de A sikkimensis colectadas en Himalaya y A regalis colectadas en India fueron cultivadas in vitro durante 12 semanas para obtener un maacuteximo de 48 a 56 protocormos y brotes obteniendo como resultado un 95 y 98 de eficiencia respectivamente Durante el repicado de los explantes in vitro de A regalis se observoacute que el nuacutemero total de brotes obtenidos a partir de noacutedulos fue 214 asiacute como tambieacuten 82 puntas de brotes En cambio para A sikkimensis fueron mucho maacutes bajos 123 y 43 respectivamente teniendo un crecimiento maacutes lento pero plantas maacutes fuertes Las raiacuteces de 4 a 6cm crecieron con la presencia de NAA (270 microM ) en el medio asiacute como tambieacuten con carbono activado (02) Durante la aclimatacioacuten la tasa de establecimiento fue entre 95 y 98 Luego de seis meses en invernadero las plantas de A regalis fueron transferidas a bosque nativo donde se obtuvo una tasa de
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sobrevivencia de entre 70 y 95 despueacutes de 12 meses Estas plantas establecidas en bosque nativo estaacuten libres de cualquier defecto morfoloacutegico y de crecimiento (GANGAPRASAD et al 2000) 242 Orquiacutedeas epiacutefitas Estas orquiacutedeas viven en los aacuterboles pero no obtienen de eacuteste su alimento no son paraacutesitas 2421 Preservacioacuten de Cattleya walkeriana usando propagacioacuten in vitro El geacutenero Cattleya se encuentra en Meacutexico y Ameacuterica Central asiacute como tambieacuten en Venezuela Colombia y las laderas de los Andes Esta orquiacutedea tambieacuten se encuentra en varias regiones del Brasil creciendo en aacuterboles rocas cerca de riacuteos lagos y pantanos Las flores de esta orquiacutedea son conocidas debido a su hermosura y a causa de la destruccioacuten de su haacutebitat y a la excesiva coleccioacuten de eacutestas se encuentra en extincioacuten
La composicioacuten del medio de cultivo es esencial para la propagacioacuten in vitro ya que suple todos los nutrientes necesarios para el desarrollo y seraacute distinto dependiendo de cada especie en este caso se utilizoacute la mitad de los macronutrientes del medio Muchos autores sugieren el uso de carboacuten activado en el medio ya que por lo general en muchas especies aumenta el desarrollo de las raiacuteces En este estudio se probaron distintas dosis de carboacuten activado 1 2 4 y 6gL con un pH de 6 (TADEU DE FARIA et al 2002) Las semillas se obtuvieron de flores artificialmente polinizadas en invernadero Plaacutentulas de aproximadamente un centiacutemetro fueron seleccionadas y cultivadas nuevamente en el medio de cultivo Murashige y Skoog pero esta vez con las diferentes dosis de carboacuten activado Se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces el nuacutemero de brotes y el peso de la materia verde total Durante el autoclavado se produce normalmente una hidroacutelisis de sacarina la cual es de 10 aproximadamente este porcentaje aumenta considerablemente al agregar un 1 de carboacuten activado llegando a ser de 95
El desarrollo de las plaacutentulas de C walkeriana aumentan con una mayor concentracioacuten de carboacuten activado asiacute como tambieacuten un mayor tiempo de cultivo El resultado fue que la dosis ideal para el desarrollo de esta orquiacutedea es 2gL de carboacuten activado (TADEU DE FARIA et al 2002) 2422 Establecimiento de cultivos in vitro y micropropagacioacuten de Cattleya aurantiaca (Bateman ex Lindl) Por medio de siembra in vitro se logroacute el establecimiento de C aurantiaca con alto porcentaje de germinacioacuten y desarrollo de protocormos Para la oacuteptima formacioacuten de callo y para la proliferacioacuten de protocormos se determinaron los medios oacuteptimos (MS 10 mgL ANA 10 mgL BA) asiacute como tambieacuten de manera directa sobre explantes de hoja y pseudobulbos (MS 01 mgL ANA 01 mgL GA3)
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Con este uacuteltimo medio tambieacuten se logroacute una oacuteptima regeneracioacuten y desarrollo de plaacutentulas Los medios liacutequidos (sin agitacioacuten) son una buena opcioacuten para conseguir la produccioacuten masiva de protocormos ya que con ellos se optimizoacute la micropropagacioacuten de C aurantiaca Las plaacutentulas micropropagadas presentaron alto porcentaje de sobrevivencia y buen desarrollo despueacutes de su trasplante y aclimatacioacuten lo cual demuestra que es un buen sistema de propagacioacuten para C aurantiaca (GUTIERREZ y SALGADO 2007) En cuanto a transplante y aclimatacioacuten despueacutes de 45 diacuteas de desarrollo in vitro las plaacutentulas de un tamantildeo entre 3 y 5 cm con raiacuteces bien desarrolladas fueron llevadas a condiciones ex vitro eliminando los restos de medio de cultivo con agua potable y ocupando un sustrato de partes iguales de tezontle y corteza de encino cubierta con hojarasca de encino finamente molida Se mantuvieron cubiertas durante 15 diacuteas abriendo cada dos diacuteas hasta poder retirar la tapa en 30 diacuteas Despueacutes de dos meses de haber sido retiradas del cultivo in vitro las plaacutentulas presentaron 70 de sobrevivencia y alcanzaron una altura de hasta 7 cm presentando nuevas hojas y raiacuteces las plantas se muestran vigorosas y capaces de continuar su crecimiento en condiciones ambientales de invernadero (GUTIERREZ y SALGADO 2007)
2423 Establecimiento in vitro y regeneracioacuten de plantas de Laelia autumnalis (Llave y Lex) Lindl Para este estudio se obtuvieron las semillas de una caacutepsula desarrollada despueacutes de 6 meses de la floracioacuten las cuales se sembraron in vitro sin presentar contaminacioacuten ya que la siembra por este meacutetodo es muy eficiente en comparacioacuten al cultivo de semillas libres donde algunas veces se presenta la contaminacioacuten Las observaciones se realizaron cada 15 diacuteas la germinacioacuten se detectoacute en los primeros 15 diacuteas en la mayoriacutea de los medios de cultivos probados con la presencia de protocormos de 1mm de diaacutemetro (HUAPEO y SALGADO 2004) El porcentaje de germinacioacuten que se obtuvo de las semillas cultivadas in vitro de L autumnalis fue de 95 a 100 en todos los medios de cultivo la uacutenica diferencia fue el tiempo entre las germinaciones A excepcioacuten de las semillas cultivadas en el medio MS 100 la germinacioacuten del 100 se obtuvo hasta los 30 diacuteas de cultivo mientras que en el primero la germinacioacuten fue a los 15 diacuteas del cultivo Las plaacutentulas con raiacutez y un par de hojas se lograron a los 90 diacuteas de cultivo en el medio MS 100 alcanzando 07 mm de altura Estas plaacutentulas fueron subcultivadas en medio MS con 05 mgl de ANA y 01 mgl de GA3 para tener plaacutentulas fuente de explante (segmentos de hojas) un medio oacuteptimo de desarrollo de plaacutentulas de L speciosa No fue necesario probar otros medios de cultivos ya que se hicieron pruebas anteriores que demostraron que era el adecuado
Las plaacutentulas de 6 meses de cultivo in vitro despueacutes de su germinacioacuten presentaron una altura promedio de 5 cm con raiacuteces con velamen y hasta dos pares de hojas Segmentos de hoja de eacutestas fueron cultivadas en el medio MS conteniendo ANA BA y GA3 en diferentes concentraciones y se realizaron observaciones cada 30 diacuteas para determinar medios inductores de callo protocormos y raiacuteces La mejor respuesta en formacioacuten de callo fue observada en los segmentos de hoja de plaacutentulas de L autumnalis cultivados en MS con 1 mgl de ANA BA y GA3 iniciando la induccioacuten de
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eacuteste desde los 30 diacuteas de cultivo solamente en un 70 de los explantes cultivados El 100 se logroacute a los 90 diacuteas de cultivo observando callo abundante alrededor de todo el tejido de color blanco con puntos pigmentados de color verde La regeneracioacuten de protocormos de esta orquiacutedea se establecioacute con la siembra de segmentos de hoja de plaacutentulas de 6 meses de edad de manera directa o a partir de callos En callos la produccioacuten fue oacuteptima en el medio MS con 01 mgl de ANABAGA3 ya que a los 60 diacuteas se obtuvieron 50 protocormos por segmento de callo Solamente se produjeron 10 protocormos por explante al cultivarse los segmentos de hoja en MS con 01 mgl de ANABAGA3 a los 120 diacuteas de cultivo (HUAPEO y SALGADO 2004) 25 Aclimatacioacuten Aclimatacioacuten significa que el hombre intercede y guiacutea el proceso de acondicionamiento de las plantas hasta que eacutestas sean aptas para crecer en el campo yo invernadero
Un alto nuacutemero de plantas micropropagadas no sobreviven al cambio desde el cultivo in vitro hacia el ambiente exterior ya sea en campo o invernadero Eacutestos dos uacuteltimos tienen menor humedad relativa niveles maacutes altos de luminosidad y un ambiente seacuteptico los cuales son maacutes estresantes para las plantas micropropagadas La mayoriacutea de las especies que crecen in vitro necesitan un proceso de aclimatacioacuten pudiendo obtener asiacute un nuacutemero suficiente de plantas vivas y vigorosas para trasplantar al suelo (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991)
La aclimatacioacuten no es uacutenicamente para micropropagacioacuten siendo usada ademaacutes en propagacioacuten convencional durante antildeos Despueacutes de cortar las hojas y de haber formado raiacuteces por lo general son aclimatadas antes de ser llevadas al campo o invernadero Ejemplos de dos teacutecnicas comunes son bajar gradualmente la humedad y mantener el nivel de luz con un 50 de sombra antes de trasladarlos al campo Las raiacuteces que han sido cortadas y mal limpiadas muchas veces son focos de infeccioacuten En estos casos las plantas muestran signos de marchitez hojas necrosadas y tambieacuten se puede llegar a la muerte de eacutestas El cultivo in vitro reduce la necesidad de fotosiacutentesis ya que las condiciones de la caacutemara de incubacioacuten proveen a la planta de sacarosa u otro azuacutecar Tambieacuten en estas condiciones se reduce el stress por patoacutegenos al ser un ambiente aseacuteptico Todo esto se traduce en que las plantas micropropagadas no son aptas para el campo yo invernadero (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 251 Stress hiacutedrico El stress hiacutedrico puede ser el resultado de una excesiva transpiracioacuten de las diferentes partes aeacutereas de las plantas especialmente de las hojas o por una inadecuada absorcioacuten de agua por parte de las raiacuteces La cutiacutecula y los estomas son la ruta primaria de peacuterdida de agua desde de las hojas provenientes de esta teacutecnica reproductiva 2511 Cutiacutecula La cutiacutecula es una membrana compuesta por una matriz de cutina que a su vez se encuentra cubierta en su superficie por ceras cuya funcioacuten primaria consiste en limitar la peacuterdida de agua por transpiracioacuten La permeabilidad del agua a traveacutes de la cutiacutecula se ve influenciada principalmente por la estructura y la cantidad de
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ceras cuticulares y epicuticulares no vieacutendose afectada la peacuterdida de agua por el grosor de eacutesta o la naturaleza quiacutemica de la matriz de la cutina La estructura cristalina de la parte encerada de las hojas es distinta en las plantas micropropagadas con respecto a las plantas que crecen en el campo La cera epicuticular de las hojas de plantas in vitro tienen una proporcioacuten maacutes alta de esteres y de componentes polares por el contrario tienen unas cadenas de hidrocarbonos mucho maacutes cortas Esto hace que las plantas in vitro pierdan maacutes agua que las cultivadas en campo o invernadero
Las plantas que han crecido en el campo son naturalmente de color verde pero el color de las plantas cultivadas in vitro es diferente y se puede ver a simple vista Las plantas que son pasadas a invernadero y que tengan un color verde se aclimatan de mejor forma al ambiente exterior (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 2512 Estomas La estructura estomaacutetica y su funcionamiento han sido implicados recurrentemente en el desbalance de agua exhibido por plantas micropropagadas al momento de ser removidas del cultivo in vitro Estudios con microscopiacutea de scanner electroacutenico han indicado que la estructura estomaacutetica presente en algunas especies de plantas cultivadas in vitro difieren marcadamente de las cultivadas en invernadero o en el suelo Debido a que las primeras presentan estomas de mayor tamantildeo y maacutes redondos a diferencia de las plantas cultivadas de manera normal que presentan estomas maacutes pequentildeos y eliacutepticos lo que resulta en una deshidratacioacuten maacutes raacutepida en el caso de las provenientes de cultivo in vitro (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 252 Humedad Debido a la anatomiacutea y la condicioacuten fisioloacutegica de las plantas desarrolladas in vitro donde se ha mantenido una alta humedad relativa es necesario regar al momento del traslado para obtener una alta sobrevivencia Muchos laboratorios aseguran que hay que evitar tener un sistema de aspersioacuten ya que se produce el ambiente necesario (muy huacutemedo) para la aparicioacuten de hongos algas o bacterias Otros meacutetodos incluyen el uso de humidificadores o poner las macetas en un lugar cerrado donde se retenga vapor para esto se pueden usar por ejemplo tapas de polietileno Este meacutetodo es relativamente econoacutemico pero se debe tener control del calor y monitorear la falta de agua (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 253 Luz Durante la etapa in vitro las plantas estaacuten expuestas a altos niveles de luminosidad lo que se traduce en hojas delgadas Antes del traslado se recomienda mantener las plantas con un 50 de sombra para asiacute poder aclimatarlas de mejor manera esto debido a que las plantas micropropagadas tienen un bajo control sobre la transpiracioacuten y un inadecuado mecanismo de fotosiacutentesis La sombra reduce la transpiracioacuten evitando excesivas peacuterdidas de agua asiacute como tambieacuten el exceso de luz destruye las moleacuteculas de clorofila Luego del periacuteodo bajo sombra se deben mover las macetas gradualmente hacia el nivel de luz al cual seraacute llevado para su crecimiento final (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 254 Temperatura La temperatura del aire y del medio o sustrato de crecimiento estaacute generalmente controlado durante el periacuteodo de aclimatacioacuten El calor es necesario en los meses de invierno y el friacuteo (enfriar) es esencial en los meses de verano Ajustando la cantidad de sombra y humedad se obtiene un control sobre la temperatura El
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enfriamiento se puede obtener gracias a ventilacioacuten abanicos niebla o aire acondicionado El calor puede provenir del sistema existente en el edificio o invernadero donde esteacuten ubicadas las macetas o por las laacutemparas ocupadas para el control del fotoperiacuteodo El rango de temperatura que se mantiene por lo general es entre los 13 y 30ordmC y esta determinado principalmente por la especie en cuestioacuten La temperatura de la zona donde se encuentran las raiacuteces es muy importante para el crecimiento lo ideal es que dicho sector tenga una mayor temperatura que el aire fomentando el crecimiento de las raiacuteces e incrementando la humedad alrededor de la planta Durante el verano esto es difiacutecil de obtener ya que la temperatura del aire es muy alta debido a la alta radiacioacuten solar Terminado el proceso de aclimatacioacuten esto ya no es necesario (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 255 Fotosiacutentesis Las plantas sufren un cambio radical cuando son removidas desde cultivo in vitro ya que son forzadas a cambiar de heterotroacuteficas a autotroacuteficas y la fotosiacutentesis se vuelve fundamental para la sobrevivencia Las hojas de las plantas in vitro no estaacuten formadas para hacer fotosiacutentesis ya que en la caacutemara de incubacioacuten no se produce un fuerte intercambio gaseoso esto debido a que la sacarosa es entregada a traveacutes del medio de cultivo Las hojas de las plantas que son trasladadas al campo o invernadero sufren deterioro debido a que no estaacuten formadas para la fijacioacuten de carbono Esto se produce por un tiempo aproximado de cuatro semanas despueacutes de las cuales las hojas nuevas suplen a las viejas Otro punto es que las hojas de las plantas cultivadas in vitro contienen menor proporcioacuten de clorofila que las plantas que han crecido normalmente en el campo En un estudio de coliflor cultivado in vitro se midioacute el CO2 y se obtuvo un balance negativo el cual se mantuvo durante dos semanas despueacutes del transplante Algo similar ocurrioacute con frutilla despueacutes del transplante las hojas se deterioraron raacutepidamente lo que quiere decir que no hubo incremento en la fijacioacuten de carbono indicando falta de desarrollo en la competencia fotosinteacutetica
El bajo nivel de CO2 durante el cultivo in vitro limita el proceso de fotosiacutentesis lo cual se puede compensar usando sacarosa en el medio de cultivo Tambieacuten se puede incrementar el nivel de luz y CO2 obteniendo un fuerte aumento en el crecimiento de varias especies como orquiacutedeas clavel etc (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 256 Sustrato Un sustrato es todo material soacutelido distinto del suelo natural mineral u orgaacutenico que colocado en un contenedor en forma pura o en mezcla permite el anclaje del sistema radicular de la planta desempentildeando por lo tanto un papel de soporte para la planta El sustrato puede intervenir o no en el complejo proceso de la nutricioacuten mineral de la planta (INFOAGRO 2007) El sustrato y los contenedores dentro de los cuales se van a transplantar las plaacutentulas in vitro son importantes para una buena sobrevivencia
Los sustratos ejercen una influencia significativa en la arquitectura del sistema radical de las plantas y en las asociaciones bioloacutegicas de este con el suelo influenciando el
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estado nutricional y la translocacioacuten de agua en el sistema suelo-planta-atmoacutesfera Uno de los requisitos fundamentales que debe cumplir el sustrato para su utilizacioacuten es la sanidad Cuando estos no se elaboran almacenan o manejan correctamente pueden contaminarse y provocar serios dantildeos a las plantas durante la aclimatacioacuten por esta razoacuten son preferidos como componentes para su elaboracioacuten materiales inertes o aquellos en las cuales el proceso de obtencioacuten garantice la mayor desinfeccioacuten posible
Uno de los factores de mayor importancia a la hora de seleccionar los materiales que pueden constituir el sustrato es su disponibilidad tanto en teacuterminos de facilidad de obtencioacuten o suministro como de su costo (VILCHEZ et al 2007)
La presencia de inhibidores o tambieacuten cambios en el pH del sustrato pueden afectar el crecimiento de las raiacuteces y consecuentemente el eacutexito del transplante
Muchos laboratorios y viveros transplantan a un sustrato uniforme debiendo ser eacuteste adecuado en cuanto a soporte de las plantas pH porosidad aireacioacuten y drenaje (DEBERGH y ZIMMERMAN 1991)
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3 MATERIAL Y MEacuteTODO
Para la realizacioacuten de este trabajo se utilizoacute el siguiente material y meacutetodo
31 Material La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio e invernadero de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal pertenecientes a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de Chile
311 Material vegetal Se utilizaron plaacutentulas de C virescens cultivadas in vitro a partir de semillas las cuales fueron proporcionadas por el laboratorio estas plaacutentulas fueron separadas y repicadas para aumentar la poblacioacuten y obtener la cantidad necesaria para el ensayo
FIGURA 2 Plaacutentulas de C virescens en caacutemara de crecimiento in vitro
312 Materiales Los materiales que se utilizaron fueron los siguientes Equipos autoclave caacutemara de flujo laminar dispensador de medios medidor
de pH agitador magneacutetico horno microondas balanza mechero termoacutemetro Materiales vasos de precipitado matraces probetas pipetas papel de
aluminio frascos de vidrio placas Petri pinzas bisturiacute macetas regadera Soluciones soluciones madre (Medio MS) gelificante etanol 70 y 95
32 Meacutetodo A continuacioacuten se da a conocer la metodologiacutea con la cual se trabajoacute 321 Preparacioacuten del medio de cultivo Para la obtencioacuten de plantas a traveacutes de la micropropagacioacuten se ocupoacute el medio basal de MURASHIGE y SKOOG (1962) tambieacuten llamado medio MS Este medio tiene un pH de entre 56-57 Posteriormente se dosificoacute con el dispensador de medios para que cada frasco tenga una cantidad adecuada (25 mL) y se llevoacute a autoclave para esterilizar a 12 atm 120ordm C por 20 min
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322 Obtencioacuten del material vegetal Al tener el medio esterilizado se procedioacute a la separacioacuten y repicado de plaacutentulas existentes en el laboratorio Las siembras se realizaron en el mes de mayo del 2007 Estas siembras se realizaron en la caacutemara de flujo laminar de modo de asegurar que la siembra sea 100 aseacuteptica Estas plaacutentulas fueron mantenidas en la caacutemara de incubacioacuten hasta obtener los tamantildeos requeridos para el ensayo donde las condiciones fueron las siguientes
minus Temperatura ambiental de 23-25ordm C minus Fotoperiacuteodo de 16 horas minus Intensidad lumiacutenica controlada de 50-55 micromol m-2s-1
323 Sustratos Se utilizaron tres tipos de sustratos el primero corresponde a una mezcla de turba + perlita (11) el segundo corresponde a Sphagnum (100) y el tercero corresponde a una mezcla de turba + arena (11) Una vez realizadas las mezclas se procedioacute a una esterilizacioacuten en un autoclave a 121ordm C por 20 minutos a 12 atmoacutesfera De esta forma se trabajoacute con material limpio y sano evitando ataque de hongos o bacterias El anaacutelisis quiacutemico de los sustratos se muestra en el Anexo 2 324 Plantacioacuten Las plaacutentulas con un promedio de cuatro meses en condiciones de caacutemara de crecimiento in vitro obtuvieron el tamantildeo adecuado para ser utilizadas Se sacaron de los frascos y se plantaron en las macetas de plaacutestico transparente con los sustratos Posteriormente fueron dejadas en la sala del laboratorio donde se debioacute asperjar con solucioacuten nutritiva Hoagland y fungicida Captan CUADRO 1 Composicioacuten de solucioacuten nutritiva Hoagland
KNO3 102 gL Ca(NO3) 4 H2 O 0492 gL
NH4H2 (PO4) 023 gL MgSO4 7 H2O 049 gL
H3BO3 286 mgL MnCl2 2 H2O 181 mgL CuSO4 5 H2O 008 mgL ZnSO4 5 H2O 022 mgL Na2MoO4 H2O 009 mgL
FeSO4 7 H2O 05 06 mL FUENTE FINCK 1988 325 Disentildeo de los ensayos Este trabajo de investigacioacuten constoacute de un ensayo con dos etapas Antes que todo se realizoacute la separacioacuten y repicado in vitro de plaacutentulas de C virescens para la obtencioacuten del nuacutemero necesario de plantas En la etapa 1 se utilizaron tres tamantildeos de plaacutentulas obtenidas in vitro de 1-2cm de 2-3cm y de maacutes de 3cm de altura que se transplantaron a tres sustratos turba + perlita 11(vv) Sphagnum (100) y turba + arena 11 (vv) La turba provino de la Sociedad
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Minera Patagonia Peat SA en Hijuelas el Sphagnum de la empresa Lonquen Chile de Puerto Montt y la perlita se obtuvo a traveacutes del sitio web wwwjardisencl (representante legal Walter Rathgeb Penza Ingeniero Agroacutenomo Santiago) Las plaacutentulas se plantaron de acuerdo a su tamantildeo las de maacutes de 3cm se colocaron de 6 por maceta las de 2 a 3cm de a 8 por maceta y las maacutes chicas de a 10 por maceta Estas macetas fueron dejadas en una sala de aclimatacioacuten con una temperatura promedio de 20ordm C intensidad lumiacutenica de 50-55 micromol m-2s-1 y 14-16 hrs de fotoperiacuteodo Se fertilizoacute asperjando cada cinco diacuteas con solucioacuten nutritiva Hoagland Esta etapa se llevoacute a cabo durante dos meses desde el cinco de septiembre hasta el cinco de noviembre de 2007
En la etapa 2 se continuoacute el proceso de aclimatacioacuten en invernadero de las plaacutentulas obtenidas en la etapa 1 que despueacutes de dos meses teniacutean un mayor tamantildeo y se habiacutean acondicionado al ambiente exterior (fuera de la caacutemara de crecimiento) Las plantas se mantuvieron en las macetas durante tres semanas para aclimatarlas y luego las plantas sobrevivientes fueron transplantadas a macetas maacutes grandes individuales durante tres meses aproximadamente hasta el cinco de marzo 2008 Estas nuevas macetas tuvieron como sustrato turba y suelo (trumao) en igual proporcioacuten (Anexo 2) La temperatura promedio de invernadero fluctuoacute de 13 a 35 degC seguacuten el mes En enero el promedio fue de 25 (Anexo 3) Para bajar la temperatura alrededor de 5deg C se instaloacute una malla Rachel 326 Disentildeo experimental El disentildeo experimental utilizado fue completamente al azar ordenado como experimento factorial con dos factores tamantildeo (3) y sustrato (3) Cada tratamiento tuvo tres repeticiones con un miacutenimo de 6 plantas por recipiente 327 Variables a evaluar Durante los dos meses en que las macetas estuvieron en la sala de aclimatacioacuten se evaluoacute el desarrollo foliar contando el nuacutemero de hojas una vez al mes Posteriormente se trasladaron las mismas macetas a invernadero durante tres semanas para continuar con la aclimatacioacuten de las plaacutentulas Transcurrido este tiempo se transplantaron las plaacutentulas sobrevivientes a macetas individuales y continuoacute mensualmente la evaluacioacuten de eacutestas (nuacutemero de hojas) hasta la obtencioacuten de plantas establecidas Al momento del transplante y al final del ensayo se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces asiacute como tambieacuten al final del ensayo de evaluoacute el crecimiento en altura (cm) La sobrevivencia fue evaluada al final del ensayo por maceta
Tanto en la sala de aclimatacioacuten coacutemo en el invernadero se registroacute la temperatura con la ayuda de un termoacutemetro de maacutexima y miacutenima (Anexo 3) 328 Anaacutelisis estadiacutestico Una vez obtenidos los datos se procedioacute a comprobar si estos cumpliacutean con los supuestos de aleatoriedad normalidad y homogeneidad de varianzas que exige este tipo de anaacutelisis En el caso de no cumplirse estos supuestos los datos se transformaron utilizando log10(x+05) raiacutez(x+05) o 1x para normalizarlos
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y enseguida se sometioacute los datos a un anaacutelisis estadiacutestico (ANDEVA) Posteriormente en los casos en que se observoacute diferencias significativas en el ANDEVA se aplicoacute una prueba de rangos muacuteltiples (Tukey) al 5 de significancia Para las variables no parameacutetricas que no cumplieron con los supuestos para un anaacutelisis de varianza se realizoacute la prueba de KruskalndashWallis y las comparaciones muacuteltiples a traveacutes del test de Dunn con un nivel de 5 de significancia
Se utilizaron los programas estadiacutesticos STATGRAPHICS 20 y GRAPHPAD PRISM 5 para el anaacutelisis de datos
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4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
En los siguientes puntos se discuten los resultados obtenidos en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens
En la Figura 3 se observan plaacutentulas de C virescens micropropagadas en medio MS en caacutemara de crecimiento al inicio del ensayo (A) y en invernadero despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten (B)
BA
FIGURA 3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten
A continuacioacuten se presentan los resultados obtenidos para las variables analizadas (Cuadro 2 y 3) de esta manera se pueden visualizar en general los resultados obtenidos en el proceso de aclimatacioacuten durante seis meses
CUADRO 2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de raiacuteces
inicial y final Variables
Hojas finales (nuacutemero)
Raiacuteces iniciales (nuacutemero)
Raiacuteces finales (nuacutemero)
Tamantildeo de plaacutentulas 36 24 37 47 29 46
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 61 43 76
Sustratos 53 36 56 43 29 51
Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 46 27 49
Significa que hay diferencias significativas al 95 Test de Dunn
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Las variables no parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en hojas finales y raiacuteces iniciales en sus rangos de distribucioacuten Las raiacuteces finales no presentaron diferencias seguacuten el sustrato utilizado pero de acuerdo al tamantildeo hubo diferencias en su distribucioacuten
CUADRO 3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas
Variables Altura final de plaacutentulas
(cm) Sobrevivencia
Tamantildeo de plaacutentulas
36 c 567 b 47 b 821 a
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 59 a 908 a
Sustratos 52 a 933 a
41 ab 59 b Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 49 b 772 a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY Las variables parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en altura final de hojas y en sobrevivencia 41 Nuacutemero de hojas finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentulas y de sustratos para la variable nuacutemero final de hojas 411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula Seguacuten el Cuadro 2 y Figura 4 las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero final de hojas Las plaacutentulas pequentildeas de 1-2 cm obtuvieron el nuacutemero maacutes bajo de hojas finales con una media de 36 hojas por plaacutentula lo cual es la mitad de las hojas finales que se obtuvo con las plaacutentulas de mayor tamantildeo (61 hojas aproximado por plaacutentula) Para las plaacutentulas medianas de 2-3 cm se obtuvo una media de 47 hojas por plaacutentula (Figura 4)
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Hojas finales
1-2 cm 2-3cm maacutes de 3 cm0
5
10
15
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn)
BLANCO (2006) sentildeala que plaacutentulas cultivadas in vitro crecen bajo condiciones especiales como alta humedad relativa y baja luminosidad ademaacutes son suplidas con sacarosa Estas condiciones fueron proporcionadas en una caacutemara de crecimiento en el laboratorio donde las plantas micropropagadas no son dependientes por completo de su fotosiacutentesis son heteroacutetrofas Parece ser necesario un estiacutemulo para convertirse en organismos totalmente capaces de sustentar sus propios requisitos de carbono y nitroacutegeno reducido pasando de esta manera a ser autoacutetrofos
Al ser sacadas de un medio in vitro las hojas no estaacuten preparadas para producir su propio alimento y sobreviven gracias a que el medio de cultivo le proporciona los nutrientes necesarios para vivir En este punto muchas de las hojas mueren y nacen hojas nuevas capaces de generar su alimento supliendo asiacute las hojas viejas (SEELYE et al 2003) En este ensayo las plaacutentulas de Chloraea virescens presentaron en general una buena adaptacioacuten al ser sacadas de un medio in vitro
Se observoacute que plaacutentulas con menor tamantildeo al ser aclimatadas y tener menor tejido fue maacutes difiacutecil y maacutes lento que empezaran a generar nuevos tejidos y materia orgaacutenica a partir de dioacutexido de carbono POSPIacuteŠILOVAacute et al (1999) sentildeala que al tener los estomas con desarrollo incompleto maacutes grandes y de forma maacutes redonda pierden maacutes agua lo cual puede provocar una peacuterdida de hojas muriendo asiacute la plaacutentula Por esta razoacuten las plaacutentulas pequentildeas se demoran maacutes tiempo en generar hojas nuevas es por ello que al finalizar este estudio muestran el menor nuacutemero final de hojas 412 Efecto del tipo de sustrato Al analizar la influencia del tipo de sustrato se encontraron diferencias significativas entre los tres sustratos utilizados Seguacuten el Cuadro 2 y la Figura 5 el sustrato donde se obtuvo mejores resultados fue
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turba+perlita en el cual se observoacute un promedio de 53 hojas por plaacutentula siendo Sphagnum el maacutes bajo con 43 hojas por plaacutentula De acuerdo a los resultados del anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados el sustrato turba+perlita tiene mayor cantidad de nitroacutegeno foacutesforo calcio magnesio y azufre disponible comparativamente con los otros dos sustratos (Sphagnum y arena+turba) (Anexo 2)
Hojas finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
Sustratos
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) Para la brotacioacuten y el crecimiento de las plantas se necesita agua y Nitroacutegeno lo que favorece a una mayor tasa de aparicioacuten de hojas lo que se traduce en una mayor cantidad de hojas finales El Nitroacutegeno se encuentra en mayor cantidad en el sustrato turba+perlita debido a lo cual los mejores resultados se obtienen en dicho sustrato 413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Despueacutes de analizados los efectos individuales del tamantildeo y del sustrato al interactuar ambos factores existen diferencias significativas La mejor interaccioacuten se obtuvo con el sustrato turba+perlita y con el mayor tamantildeo de la plaacutentula (Figura 6) Debido a la buena estructura (porosa) de dicho sustrato se podriacutea decir que se favorecioacute la absorcioacuten radicular de nutrientes obteniendo por ello un mayor nuacutemero de hojas finales Para los menores tamantildeos no se observan diferencias significativas obteniendo como promedio 41 hojas por plaacutentula Para el mayor tamantildeo el promedio fue de 6 hojas por plaacutentula
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Hojas finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 42 Raiacuteces iniciales Este paraacutemetro se evaluoacute luego de la primera etapa de aclimatacioacuten la cual se realizoacute en una sala de aclimatacioacuten del laboratorio Se analizoacute la influencia de diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos sobre la variable nuacutemero raiacuteces iniciales (Anaacutelisis de Kruskal-Wallis en Anexo 7)
FIGURA 7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses de pre aclimatacioacuten
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En la Figura 7 se puede observar los resultados de pre aclimatacioacuten en sala de laboratorio En esta etapa ya es posible ver la presencia de raiacuteces desarrolladas 421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula En el Cuadro 2 se puede observar que las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero inicial de raiacuteces y en la Figura 8 se puede comprobar que para los dos tamantildeos de plaacutentula maacutes pequentildeos no se observa gran cantidad de raiacuteces esto no impidioacute el desarrollo posterior de las plaacutentulas las cuales lograron enraizar al final del estudio Esto se contrapone a lo observado en un estudio de Lapageria rosea donde la presencia de raiacutez y brote para lograr una multiplicacioacuten exitosa de plantas es de vital importancia Incluso algunas plaacutentulas de L rosea no brotan en condiciones in vitro en donde tienen las mejores condiciones nutricionales y hormonales para hacerlo Esto se debe a factores internos de la plaacutentula siendo muy difiacutecil que broten inmediatamente en caacutemara de aclimatacioacuten donde ya dejan de recibir los nutrientes necesarios de manera directa y requieren de balances de energiacutea para poder seguir elongando raiacuteces absorber nutrientes y brotar para poder obtener los carbohidratos necesarios para seguir su crecimiento (BLANCO 2006) El tamantildeo de plaacutentula tiene importancia para el desarrollo de raiacuteces se distingue notoriamente que en los tamantildeos maacutes grandes el nuacutemero de raiacuteces es mayor comparativamente con los tamantildeos pequentildeos donde el nuacutemero de raiacuteces fue escaso Debido a la presencia de maacutes hojas existe una mayor cantidad de aacuterea fotosinteacutetica esta situacioacuten estimula el crecimiento de las raiacuteces para la obtencioacuten de agua y nutrientes
Raices iniciales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
2
4
6
8
10
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o inicial de ra
iacuteces
FIGURA 8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn)
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422 Efecto del tipo de sustrato Para el sustrato turba+perlita se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas en el nuacutemero de raiacuteces con respecto a los dos otros sustratos esto se puede ver en el Figura 9 donde se observa que se obtuvieron los mayores resultados En cualquier medio de crecimiento el espacio no ocupado por un soacutelido se llama porosidad este espacio puede ser ocupado en parte para retener agua y en parte para proporcionarle aire a las raiacuteces La ausencia de uno de estos elementos es perjudicial para las plantas La turba es conocida por tener estas propiedades y la perlita tambieacuten por esta razoacuten se sabe que la mezcla turba-perlita provee propiedades fiacutesicas excelentes como medio de crecimiento y propagacioacuten (INFOAGRO 2007) Estos resultados con turba-perlita (298 de materia orgaacutenica) coinciden con los obtenidos por DIAZ et al (2004) quienes al utilizar un sustrato compuesto por 100 de humus de lombriz para aclimatar cantildea de azuacutecar obtuvieron el mayor nuacutemero de raiacuteces Esto puede atribuirse al importante aporte de materia orgaacutenica del humus (47) lo que le confiere una mejor estructura obtenieacutendose una excelente porosidad del sustrato La aireacioacuten del suelo es necesaria para favorecer la maacutexima absorcioacuten de nutrientes por las raiacuteces Esto tambieacuten sucede en el sustrato turba+perlita el cual posee la mayor cantidad de materia orgaacutenica de los tres sustratos utilizados
Raices iniciales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
2
4
6
8
10
Sustratos
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato En los anaacutelisis para la variable nuacutemero de raiacuteces se puede decir que la mejor interaccioacuten se presentoacute para el sustrato de turba+perlita junto con el mayor tamantildeo de plaacutentulas obteniendo los valores maacutes altos entre los nueve tratamientos La presencia de raiacuteces luego de la micropropagacioacuten aumenta la posibilidad de eacutexito en el transplante ya que se crea un favorable balance de agua Pero esto no quiere
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decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
10
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
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En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
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El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
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Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
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Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
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- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
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- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
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- 3 MATERIAL Y METODO
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- 31 Material
- 32 Meacutetodo
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- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
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- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
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- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
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- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
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Las especies con pseudobulbos almacenan agua y estaacuten preparadas para su periacuteodo de receso Otras que no cuentan con estos oacuterganos requieren de humedad maacutes constante 222 Luz Ninguna planta puede crecer sin la iluminacioacuten adecuada Muchas orquiacutedeas viven en las alturas de los aacuterboles y estaacuten expuestas a plena luz del sol otras crecen en el suelo selvaacutetico protegidas del sol por espesos follajes (ROLLKE 2005) La funcioacuten principal de la luz es activar el proceso de fotosiacutentesis Los cultivadores han estudiado la luz y han descubierto que hay orquiacutedeas que florecen con diacutea largo y otras con diacutea corto (OSPINA y DRESSLER 1979) Gracias a la fotosiacutentesis se convierten los minerales presentes en el ambiente en savia y nutrientes Hojas oscuras y falta de floracioacuten indican falta de luz hojas amarillas e incluso quemadas apuntan hacia un exceso de sol (DUMOIS 2007) 223 Fertilizacioacuten Las orquiacutedeas necesitan los mismos nutrientes que otras plantas Un abono para orquiacutedeas debe contener los nutrientes principales nitroacutegeno (N) foacutesforo (P) y potasio (K) asiacute como tambieacuten oligoelementos como hierro (Fe) magnesio (Mg) zinc (Zn) estantildeo (Sn) y manganeso (Mn) (ROLLKE 2005) Por otra parte la fertilizacioacuten depende de varios factores dentro de los cuales los maacutes criacuteticos son
- El medio utilizado - La edad de las plantas - Estado de las plantas ya sea floracioacuten crecimiento reposo
En cuanto a absorcioacuten se ha demostrado que es igual de eficiente por viacutea foliar como a traveacutes de las raiacuteces Es necesario tener en cuenta algunas reglas baacutesicas a la hora de fertilizar las orquiacutedeas (Asociacioacuten Costarricense de Orquideologiacutea ACO 1970)
1 Regar las plantas antes de fertilizar 2 Fraccionar las dosis 3 Aplicar el fertilizante de forma liacutequida 4 No usar fertilizantes soacutelidos 5 No fertilizar las plantas recieacuten plantadas 6 No fertilizar plantas en reposo 7 No abonar plantas enfermas
224 Temperatura Es conocido el hecho de que cada planta tiene liacutemites de temperatura dentro de los cuales prospera o perece De ahiacute la necesidad de conocer las temperaturas correspondientes al lugar de donde viene cada especie de orquiacutedea pudiendo proporcionarle la temperatura adecuada (OSPINA y DRESSLER 1979) Se puede clasificar a las orquiacutedeas como de clima caacutelido (temperatura nocturna miacutenima de 20ordmC) templado (miacutenimo de 13 a 18ordmC) y de ambiente friacuteo (de 10 a 13ordmC) (DUMOIS 2007)
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Seguacuten SHEEHAN (1980) las temperaturas ideales para las orquiacutedeas de origen tropical son 10ordmC en la noche y entre 21ordm - 24ordmC durante el diacutea 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas La micropropagacioacuten de orquiacutedeas estaacute en vanguardia hoy en diacutea El estudio de cultivo de tejido de orquiacutedeas se lleva a cabo en muchos laboratorios de todo el mundo (ARDITTI and ERNST 1992) 231 Biologiacutea de las semillas Las semillas de orquiacutedeas son conocidas usualmente como semillas polvo porque son minuacutesculas y contienen pocas reservas de alimento Estas semillas por lo general no germinan en el medio natural a menos que sean infectadas por un hongo micorriacutezico Este hongo abastece a las plantas joacutevenes con azuacutecares y nutrientes hasta que sean lo suficientemente grandes para fabricar su propio alimento Cuando la semilla germina produce una masa indiferenciada de ceacutelulas llamada protocormo Manteniendo las condiciones normales el protocormo continuaraacute su crecimiento por varias semanas meses o incluso antildeos dependiendo de la especie hasta que alcance la edad apropiada para producir raiacuteces y hojas En el caso de orquiacutedeas terrestres es de vital importancia que la relacioacuten orquiacutedea-hongo se conserve durante los estados tempranos del ciclo de vida de la planta ya que el protocormo enterrado no puede fabricar alimento por siacute mismo Por otro lado los protocormos de las orquiacutedeas epiacutefitas son comuacutenmente verdes lo que les posibilita producir parte de su alimento La relacioacuten orquiacutedea-hongo no ha sido en su totalidad investigada para el caso de las orquiacutedeas tropicales (McKENDRICK 2000) 232 Germinacioacuten simbioacutetica y no simbioacutetica de semillas Mediante la germinacioacuten in vitro las semillas germinan en frascos de vidrio o plaacutestico Estos frascos contienen en su interior un medio nutritivo solidificado con agar con todos los azuacutecares y minerales necesarios para la germinacioacuten y crecimiento de las semillas Hay dos tipos de germinacioacuten la simbioacutetica y la asimbioacutetica En la germinacioacuten simbioacutetica las semillas se siembran junto con una pequentildea cantidad del hongo micorriza adecuado Dicho hongo crece en el medio coloniza a las semillas que estaacuten en proceso de germinacioacuten y se produce una relacioacuten simbioacutetica la cual alimentaraacute al protocormo hasta que este sea capaz de producir sus hojas y se vuelva autotroacutefico Esta teacutecnica es usada principalmente en propagacioacuten de orquiacutedeas terrestres en zonas templadas La germinacioacuten asimbioacutetica se usa principalmente en propagacioacuten de orquiacutedeas tropicales que crecen maacutes raacutepido que sus parientes de zonas templadas Para este tipo de germinacioacuten se necesita un medio de cultivo maacutes complejo ya que todos los nutrientes orgaacutenicos e inorgaacutenicos asiacute como tambieacuten los azuacutecares deben estar en forma disponible pues no existe la intermediacioacuten del hongo (McKENDRICK 2000) 233 Condiciones de esterilidad Tanto para la germinacioacuten simbioacutetica como para la asimbioacutetica es de vital importancia que los frascos las semillas aparatos y el medio esteacuten esteacuteriles desde el principio del proceso Esto debido a que cualquier hongo o bacteria que se introduzca creceraacute maacutes raacutepido que las semillas ocupando su espacio hasta matarlas Esto se evita gracias al autoclave el cual regulado a 12 atm y 120ordmC por 20 minutos mata hongos o bacterias presentes en el medio (McKENDRICK 2000)
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2331 Siembra de las semillas Las semillas pueden ser recolectadas desde caacutepsulas verdes o maduras La caacutepsula verde que estaacute madurando estaacute llena de semillas y no se deforma cuando se aprieta con las pinzas Estas semillas pueden ser almacenadas por algunas semanas en un lugar refrigerado con bastante aireacioacuten Las semillas se pueden sembrar a partir de caacutepsulas verdes o semillas secas A continuacioacuten se muestran las ventajas y desventajas de ambos meacutetodos
- Siembra a partir de caacutepsulas verdes Si las caacutepsulas se mantienen intactas el interior (las semillas) se mantiene esteacuteril Por lo tanto si se esteriliza la parte exterior de las mismas donde hongos y bacterias pueden desarrollarse y se abren las caacutepsulas bajo condiciones esteacuteriles y las semillas podraacuten mantenerse desinfectadas
La ventaja de este meacutetodo es que no se requiere de esterilizacioacuten de las semillas lo que provoca su deterioro Otro punto a favor es que algunas semillas podriacutean germinar maacutes raacutepido que las provenientes de caacutepsulas maduras por los mecanismos de dormancia La desventaja es que en este caso todas las semillas deben ser utilizadas o eliminadas mientras que las semillas maduras se pueden almacenar Tambieacuten se debe considerar que las semillas sembradas a partir de caacutepsulas que no han madurado lo suficiente podriacutean germinar lentamente o simplemente no germinar - Siembra a partir de semillas secas En este caso una vez que la caacutepsula es abierta las semillas dejan de ser esteacuteriles y requieren de un proceso de esterilizacioacuten Comuacutenmente se utiliza una solucioacuten de hipoclorito de sodio hipoclorito de calcio o peroacutexido de hidroacutegeno Las semillas se agitan dentro de la solucioacuten que ademaacutes contiene una gota de detergente para ldquohumedecerlasrdquo luego se las enjuaga con agua destilada y se las siembra en el medio preparado La ventaja de este meacutetodo es que las semillas pueden ser colectadas secadas al aire almacenadas por varios meses en el refrigerador y utilizarlas cuando sea necesario Se debe considerar que la siembra ya sea de caacutepsulas verdes o de semillas secas estaacute determinado por la eacutepoca en que se colectan (McKENDRICK 2000) 234 Trasplante En la caacutemara de incubacioacuten las plaacutentulas se han desarrollado en condiciones limpias y en un ambiente cerrado por lo que deben acostumbrase gradualmente al ambiente exterior antes de ser trasplantadas a las macetas Tambieacuten la temperatura y la luz la cual es baja han sido constantes durante el cultivo in vitro En el medio natural la temperatura y la luz variacutean constantemente por lo que las nuevas plantas deben estar protegidas de la fuerte luz solar la cual puede quemar las hojas con soacutelo una pequentildea cantidad de eacutesta La humedad en los frascos es alta y las plantas estaacuten protegidas de ataques por hongos o bacterias Ademaacutes las plaacutentulas han crecido bajo condiciones de alta humedad y por lo tanto tendraacuten cutiacuteculas deacutebiles por lo que necesitan acostumbrase a medios menos huacutemedos antes de ser transplantadas
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Para el trasplante se deben colocar los frascos en un lugar protegido de la lluvia para que se aclimaticen a las nuevas condiciones de luz y temperatura Se deben dejar por 2 a 4 semanas en los frascos tapados Luego se debe ir aflojando las tapas para dejar entrar pequentildeas cantidades de aire hasta el punto de dejarlas descubiertas Se debe revisar si hay hojas marchitas y ver que el sustrato esteacute huacutemedo
Lo ideal es dejarlas sin tapa durante una semana antes de pasarlas a las macetas Para el trasplante se debe elegir un sustrato adecuado para el tipo de planta humedecerlo y transplantar las plantas con cuidado de no dantildear las raiacuteces y evitando la deshidratacioacuten En esta etapa tambieacuten se debe dejar las macetas selladas para evitar una raacutepida deshidratacioacuten e ir abrieacutendolas paulatinamente (McKENDRICK 2000)
24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas 241 Orquiacutedeas terrestres 2411 Cypripedium Esta es una orquiacutedea terrestre de zonas templadas se desarrolla en el Hemisferio Norte como por ejemplo en Guatemala y en Honduras pero donde se encuentra principalmente es en China Su forma maacutes comuacuten de propagacioacuten es in vitro a partir de semillas La forma maacutes eficiente es a partir de semillas inmaduras Existe un intervalo de tiempo entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten eacuteste dependeraacute de la especie y de la zona donde se desarrolle Se asume que existen aproximadamente cuatro semanas entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten El oacuteptimo para una buena germinacioacuten de Cypripedium es entre 42 y 60 diacuteas despueacutes de la polinizacioacuten y entre 14 y 32 diacuteas despueacutes de la fertilizacioacuten La germinacioacuten ocurre entre la segunda y cuarta semana despueacutes de ser sembradas y los protocormos deberiacutean ser cambiados de medio de cultivo cada dos a cuatro meses si no se corre el riesgo de sufrir agotamiento de nutrientes Los rizomas y las raiacuteces se empiezan a desarrollar a partir de los siete meses para luego dar lugar a las primeras hojas Para obtener un buen transplante se deben tener raiacuteces de miacutenimo un centiacutemetro de largo El desarrollo de raiacuteces se ve potenciado al tener un periacuteodo corto de bajas temperaturas (10degC) exposicioacuten a la luz reduccioacuten en la concentracioacuten de iones del medio de cultivo o transferirlas a un compost esteacuteril Al tener raiacuteces suficientes y el tamantildeo adecuado se podraacuten llevar las plantas al lugar donde creceraacuten definitivamente En el momento del transplante las plantas son muy susceptibles al desecamiento por lo cual lo ideal es que los brotes sean maacutes chicos que las raiacuteces El mejor sustrato seriacutea aquel donde crece naturalmente la orquiacutedea (RAumlNNBAumlCK 2007) 2412 Preservacioacuten in vitro de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes Este estudio fue hecho para establecer que parte de tejido es viable para la micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes del noreste de Europa pudiendo asiacute reestablecer dichas orquiacutedeas a sus aacutereas correspondientes La propagacioacuten in vitro de orquiacutedeas
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terrestres de clima templado es maacutes difiacutecil que las orquiacutedeas epiacutefitas de clima subtropical y tropical Las orquiacutedeas terrestres tienen requerimientos maacutes estrictos que las epiacutefitas y se conoce menos sobre sus necesidades especiacuteficas (VAASA y ROSENBERG 2004) En Estonia existen 36 especies de orquiacutedeas terrestres pero solo tres estaacuten bajo proteccioacuten Dactylorhiza baltica Dactylorhiza ruthei Dactylorhiza praetermissa Como explantes para este estudio en el caso de D baltica se ocuparon protocormos en los otros dos casos se utilizaron semillas semi maduras las cuales fueron colectadas siete y diez semanas despueacutes de ser polinizadas Para D baltica se ocupoacute el medio Murashige y Skoog suplementado con 05 mgL de aacutecido naftaleacuten aceacutetico (ANA) y 2 mgL de isonpentenyl adenina Para el caso de las semillas semi maduras se ocuparon los medios de Lindemann de Heller de Norstog y de Murashige y Skoog como control
La composicioacuten del medio y la madurez de las semillas influye mucho en el desarrollo de las orquiacutedeas in vitro Se ha demostrado que se necesita una alta concentracioacuten de microelementos para obtener una correcta germinacioacuten de las semillas Tambieacuten se puede decir que los primeros tres meses son los de mayor crecimiento luego de este tiempo el crecimiento se vuelve maacutes lento (VAASA y ROSENBERG 2004)
Luego de cuatro semanas de crecimiento de D baltica el 60 de los explantes de meristemas apicales empezaron a crecer en cambio los de meristemas laterales no expresaron ninguacuten tipo de crecimiento Las raiacuteces empezaron su desarrollo luego de dos meses despueacutes de la siembra
En el caso de D ruthei y D praetermissa la germinacioacuten se produjo despueacutes de dos meses desde la inoculacioacuten Luego de cuatro y seis meses el mayor crecimiento fue observado en el medio Norstog superando en 14 al medio testigo Murashige y Skoog (VAASA y ROSENBERG 2004)
2413 Longevidad de semillas de orquiacutedeas terrestres Por lo general las orquiacutedeas producen muchas pero pequentildeas semillas que contienen muy pocas reservas de alimento Dichas semillas estaacuten estructuralmente adaptadas para ser dispersadas por el viento pero poco se sabe del destino de eacutestas luego de ser dispersadas Algunos estudios de viabilidad de semillas indican una sobrevivencia de uno a dos antildeos en orquiacutedeas de clima templado Las semillas que son guardadas en laboratorio duran mucho maacutes tiempo Se estudioacute la viabilidad de siete especies de orquiacutedeas norteamericanas dentro de las cuales se encuentran Goodyera pubescens y Liparis liliifolia Las semillas de eacutestas se colocaron en bolsas con suelo y sustratos de bosques provenientes de sus haacutebitats naturales (WHIGHAM et al 2005) En Goodyera pubescens la mayoriacutea de las semillas germinaron en un antildeo Cuatro otras especies germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero algunas semillas no germinadas despueacutes de siete antildeos seguiacutean siendo viables En la especie Liparis liliifolia semillas que han estado cuatro antildeos bajo observacioacuten han tenido una tasa de
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germinacioacuten de un 68 al ser sembradas in vitro junto con el hongo micorriacutezico adecuado Las dos especies restantes no germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero las semillas fueron evaluadas como intactas y testeadas positivamente en cuanto a su viabilidad despueacutes de cuatro antildeos en el suelo Estas observaciones fueron interpretadas como diferentes estrategias para especies especiacuteficas de germinacioacuten in situ (WHIGHAM et al 2005) 2414 Sobrevivencia de orquiacutedeas terrestres transplantadas a sectores urbanos La conservacioacuten de poblaciones de orquiacutedeas silvestres depende del establecimiento de las orquiacutedeas propagadas a los campos Sin embargo se conoce muy poco de los factores bioacuteticos que influencian el establecimiento de orquiacutedeas terrestres a sus haacutebitats naturales Un experimento fue establecido para medir la sobrevivencia de seis especies durante su primer periacuteodo de crecimiento seguido del transplante a un sector urbano en Australia (SCADE et al 2006)
Las orquiacutedeas germinadas simbioacuteticamente crecieron en laboratorio durante cinco meses antes de establecer la plantacioacuten en sitios adyacentes con alta o baja cobertura de malezas Existioacute una muerte gradual de las plaacutentulas durante el primer periacuteodo de crecimiento primeramente por ataque de insectos no siendo evitado por la presencia de una malla cobertora Los iacutendices de sobrevivencia variacutean desde 49 para Microtis media una especie capaz de crecer en un ambiente atiacutepico hasta un 21 para Caladenia arenicola la orquiacutedea nativa maacutes comuacuten de esos sitios Sin embargo no todas las orquiacutedeas sobrevivientes producen tubeacuterculos por lo que la tasa de sobrevivencia despueacutes del primer periacuteodo seco disminuye
La sobrevivencia de las orquiacutedeas sembradas no puede ser comparada con orquiacutedeas de la misma especie que crecieron en los mismos lugares ya que no existioacute la presencia del hongo compatible para estas orquiacutedeas (SCADE et al 2006)
2415 Micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres En India dos orquiacutedeas muy importantes para la horticultura del geacutenero Anoectochilus fueron exitosamente propagadas Noacutedulos aislados de A sikkimensis colectadas en Himalaya y A regalis colectadas en India fueron cultivadas in vitro durante 12 semanas para obtener un maacuteximo de 48 a 56 protocormos y brotes obteniendo como resultado un 95 y 98 de eficiencia respectivamente Durante el repicado de los explantes in vitro de A regalis se observoacute que el nuacutemero total de brotes obtenidos a partir de noacutedulos fue 214 asiacute como tambieacuten 82 puntas de brotes En cambio para A sikkimensis fueron mucho maacutes bajos 123 y 43 respectivamente teniendo un crecimiento maacutes lento pero plantas maacutes fuertes Las raiacuteces de 4 a 6cm crecieron con la presencia de NAA (270 microM ) en el medio asiacute como tambieacuten con carbono activado (02) Durante la aclimatacioacuten la tasa de establecimiento fue entre 95 y 98 Luego de seis meses en invernadero las plantas de A regalis fueron transferidas a bosque nativo donde se obtuvo una tasa de
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sobrevivencia de entre 70 y 95 despueacutes de 12 meses Estas plantas establecidas en bosque nativo estaacuten libres de cualquier defecto morfoloacutegico y de crecimiento (GANGAPRASAD et al 2000) 242 Orquiacutedeas epiacutefitas Estas orquiacutedeas viven en los aacuterboles pero no obtienen de eacuteste su alimento no son paraacutesitas 2421 Preservacioacuten de Cattleya walkeriana usando propagacioacuten in vitro El geacutenero Cattleya se encuentra en Meacutexico y Ameacuterica Central asiacute como tambieacuten en Venezuela Colombia y las laderas de los Andes Esta orquiacutedea tambieacuten se encuentra en varias regiones del Brasil creciendo en aacuterboles rocas cerca de riacuteos lagos y pantanos Las flores de esta orquiacutedea son conocidas debido a su hermosura y a causa de la destruccioacuten de su haacutebitat y a la excesiva coleccioacuten de eacutestas se encuentra en extincioacuten
La composicioacuten del medio de cultivo es esencial para la propagacioacuten in vitro ya que suple todos los nutrientes necesarios para el desarrollo y seraacute distinto dependiendo de cada especie en este caso se utilizoacute la mitad de los macronutrientes del medio Muchos autores sugieren el uso de carboacuten activado en el medio ya que por lo general en muchas especies aumenta el desarrollo de las raiacuteces En este estudio se probaron distintas dosis de carboacuten activado 1 2 4 y 6gL con un pH de 6 (TADEU DE FARIA et al 2002) Las semillas se obtuvieron de flores artificialmente polinizadas en invernadero Plaacutentulas de aproximadamente un centiacutemetro fueron seleccionadas y cultivadas nuevamente en el medio de cultivo Murashige y Skoog pero esta vez con las diferentes dosis de carboacuten activado Se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces el nuacutemero de brotes y el peso de la materia verde total Durante el autoclavado se produce normalmente una hidroacutelisis de sacarina la cual es de 10 aproximadamente este porcentaje aumenta considerablemente al agregar un 1 de carboacuten activado llegando a ser de 95
El desarrollo de las plaacutentulas de C walkeriana aumentan con una mayor concentracioacuten de carboacuten activado asiacute como tambieacuten un mayor tiempo de cultivo El resultado fue que la dosis ideal para el desarrollo de esta orquiacutedea es 2gL de carboacuten activado (TADEU DE FARIA et al 2002) 2422 Establecimiento de cultivos in vitro y micropropagacioacuten de Cattleya aurantiaca (Bateman ex Lindl) Por medio de siembra in vitro se logroacute el establecimiento de C aurantiaca con alto porcentaje de germinacioacuten y desarrollo de protocormos Para la oacuteptima formacioacuten de callo y para la proliferacioacuten de protocormos se determinaron los medios oacuteptimos (MS 10 mgL ANA 10 mgL BA) asiacute como tambieacuten de manera directa sobre explantes de hoja y pseudobulbos (MS 01 mgL ANA 01 mgL GA3)
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Con este uacuteltimo medio tambieacuten se logroacute una oacuteptima regeneracioacuten y desarrollo de plaacutentulas Los medios liacutequidos (sin agitacioacuten) son una buena opcioacuten para conseguir la produccioacuten masiva de protocormos ya que con ellos se optimizoacute la micropropagacioacuten de C aurantiaca Las plaacutentulas micropropagadas presentaron alto porcentaje de sobrevivencia y buen desarrollo despueacutes de su trasplante y aclimatacioacuten lo cual demuestra que es un buen sistema de propagacioacuten para C aurantiaca (GUTIERREZ y SALGADO 2007) En cuanto a transplante y aclimatacioacuten despueacutes de 45 diacuteas de desarrollo in vitro las plaacutentulas de un tamantildeo entre 3 y 5 cm con raiacuteces bien desarrolladas fueron llevadas a condiciones ex vitro eliminando los restos de medio de cultivo con agua potable y ocupando un sustrato de partes iguales de tezontle y corteza de encino cubierta con hojarasca de encino finamente molida Se mantuvieron cubiertas durante 15 diacuteas abriendo cada dos diacuteas hasta poder retirar la tapa en 30 diacuteas Despueacutes de dos meses de haber sido retiradas del cultivo in vitro las plaacutentulas presentaron 70 de sobrevivencia y alcanzaron una altura de hasta 7 cm presentando nuevas hojas y raiacuteces las plantas se muestran vigorosas y capaces de continuar su crecimiento en condiciones ambientales de invernadero (GUTIERREZ y SALGADO 2007)
2423 Establecimiento in vitro y regeneracioacuten de plantas de Laelia autumnalis (Llave y Lex) Lindl Para este estudio se obtuvieron las semillas de una caacutepsula desarrollada despueacutes de 6 meses de la floracioacuten las cuales se sembraron in vitro sin presentar contaminacioacuten ya que la siembra por este meacutetodo es muy eficiente en comparacioacuten al cultivo de semillas libres donde algunas veces se presenta la contaminacioacuten Las observaciones se realizaron cada 15 diacuteas la germinacioacuten se detectoacute en los primeros 15 diacuteas en la mayoriacutea de los medios de cultivos probados con la presencia de protocormos de 1mm de diaacutemetro (HUAPEO y SALGADO 2004) El porcentaje de germinacioacuten que se obtuvo de las semillas cultivadas in vitro de L autumnalis fue de 95 a 100 en todos los medios de cultivo la uacutenica diferencia fue el tiempo entre las germinaciones A excepcioacuten de las semillas cultivadas en el medio MS 100 la germinacioacuten del 100 se obtuvo hasta los 30 diacuteas de cultivo mientras que en el primero la germinacioacuten fue a los 15 diacuteas del cultivo Las plaacutentulas con raiacutez y un par de hojas se lograron a los 90 diacuteas de cultivo en el medio MS 100 alcanzando 07 mm de altura Estas plaacutentulas fueron subcultivadas en medio MS con 05 mgl de ANA y 01 mgl de GA3 para tener plaacutentulas fuente de explante (segmentos de hojas) un medio oacuteptimo de desarrollo de plaacutentulas de L speciosa No fue necesario probar otros medios de cultivos ya que se hicieron pruebas anteriores que demostraron que era el adecuado
Las plaacutentulas de 6 meses de cultivo in vitro despueacutes de su germinacioacuten presentaron una altura promedio de 5 cm con raiacuteces con velamen y hasta dos pares de hojas Segmentos de hoja de eacutestas fueron cultivadas en el medio MS conteniendo ANA BA y GA3 en diferentes concentraciones y se realizaron observaciones cada 30 diacuteas para determinar medios inductores de callo protocormos y raiacuteces La mejor respuesta en formacioacuten de callo fue observada en los segmentos de hoja de plaacutentulas de L autumnalis cultivados en MS con 1 mgl de ANA BA y GA3 iniciando la induccioacuten de
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eacuteste desde los 30 diacuteas de cultivo solamente en un 70 de los explantes cultivados El 100 se logroacute a los 90 diacuteas de cultivo observando callo abundante alrededor de todo el tejido de color blanco con puntos pigmentados de color verde La regeneracioacuten de protocormos de esta orquiacutedea se establecioacute con la siembra de segmentos de hoja de plaacutentulas de 6 meses de edad de manera directa o a partir de callos En callos la produccioacuten fue oacuteptima en el medio MS con 01 mgl de ANABAGA3 ya que a los 60 diacuteas se obtuvieron 50 protocormos por segmento de callo Solamente se produjeron 10 protocormos por explante al cultivarse los segmentos de hoja en MS con 01 mgl de ANABAGA3 a los 120 diacuteas de cultivo (HUAPEO y SALGADO 2004) 25 Aclimatacioacuten Aclimatacioacuten significa que el hombre intercede y guiacutea el proceso de acondicionamiento de las plantas hasta que eacutestas sean aptas para crecer en el campo yo invernadero
Un alto nuacutemero de plantas micropropagadas no sobreviven al cambio desde el cultivo in vitro hacia el ambiente exterior ya sea en campo o invernadero Eacutestos dos uacuteltimos tienen menor humedad relativa niveles maacutes altos de luminosidad y un ambiente seacuteptico los cuales son maacutes estresantes para las plantas micropropagadas La mayoriacutea de las especies que crecen in vitro necesitan un proceso de aclimatacioacuten pudiendo obtener asiacute un nuacutemero suficiente de plantas vivas y vigorosas para trasplantar al suelo (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991)
La aclimatacioacuten no es uacutenicamente para micropropagacioacuten siendo usada ademaacutes en propagacioacuten convencional durante antildeos Despueacutes de cortar las hojas y de haber formado raiacuteces por lo general son aclimatadas antes de ser llevadas al campo o invernadero Ejemplos de dos teacutecnicas comunes son bajar gradualmente la humedad y mantener el nivel de luz con un 50 de sombra antes de trasladarlos al campo Las raiacuteces que han sido cortadas y mal limpiadas muchas veces son focos de infeccioacuten En estos casos las plantas muestran signos de marchitez hojas necrosadas y tambieacuten se puede llegar a la muerte de eacutestas El cultivo in vitro reduce la necesidad de fotosiacutentesis ya que las condiciones de la caacutemara de incubacioacuten proveen a la planta de sacarosa u otro azuacutecar Tambieacuten en estas condiciones se reduce el stress por patoacutegenos al ser un ambiente aseacuteptico Todo esto se traduce en que las plantas micropropagadas no son aptas para el campo yo invernadero (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 251 Stress hiacutedrico El stress hiacutedrico puede ser el resultado de una excesiva transpiracioacuten de las diferentes partes aeacutereas de las plantas especialmente de las hojas o por una inadecuada absorcioacuten de agua por parte de las raiacuteces La cutiacutecula y los estomas son la ruta primaria de peacuterdida de agua desde de las hojas provenientes de esta teacutecnica reproductiva 2511 Cutiacutecula La cutiacutecula es una membrana compuesta por una matriz de cutina que a su vez se encuentra cubierta en su superficie por ceras cuya funcioacuten primaria consiste en limitar la peacuterdida de agua por transpiracioacuten La permeabilidad del agua a traveacutes de la cutiacutecula se ve influenciada principalmente por la estructura y la cantidad de
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ceras cuticulares y epicuticulares no vieacutendose afectada la peacuterdida de agua por el grosor de eacutesta o la naturaleza quiacutemica de la matriz de la cutina La estructura cristalina de la parte encerada de las hojas es distinta en las plantas micropropagadas con respecto a las plantas que crecen en el campo La cera epicuticular de las hojas de plantas in vitro tienen una proporcioacuten maacutes alta de esteres y de componentes polares por el contrario tienen unas cadenas de hidrocarbonos mucho maacutes cortas Esto hace que las plantas in vitro pierdan maacutes agua que las cultivadas en campo o invernadero
Las plantas que han crecido en el campo son naturalmente de color verde pero el color de las plantas cultivadas in vitro es diferente y se puede ver a simple vista Las plantas que son pasadas a invernadero y que tengan un color verde se aclimatan de mejor forma al ambiente exterior (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 2512 Estomas La estructura estomaacutetica y su funcionamiento han sido implicados recurrentemente en el desbalance de agua exhibido por plantas micropropagadas al momento de ser removidas del cultivo in vitro Estudios con microscopiacutea de scanner electroacutenico han indicado que la estructura estomaacutetica presente en algunas especies de plantas cultivadas in vitro difieren marcadamente de las cultivadas en invernadero o en el suelo Debido a que las primeras presentan estomas de mayor tamantildeo y maacutes redondos a diferencia de las plantas cultivadas de manera normal que presentan estomas maacutes pequentildeos y eliacutepticos lo que resulta en una deshidratacioacuten maacutes raacutepida en el caso de las provenientes de cultivo in vitro (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 252 Humedad Debido a la anatomiacutea y la condicioacuten fisioloacutegica de las plantas desarrolladas in vitro donde se ha mantenido una alta humedad relativa es necesario regar al momento del traslado para obtener una alta sobrevivencia Muchos laboratorios aseguran que hay que evitar tener un sistema de aspersioacuten ya que se produce el ambiente necesario (muy huacutemedo) para la aparicioacuten de hongos algas o bacterias Otros meacutetodos incluyen el uso de humidificadores o poner las macetas en un lugar cerrado donde se retenga vapor para esto se pueden usar por ejemplo tapas de polietileno Este meacutetodo es relativamente econoacutemico pero se debe tener control del calor y monitorear la falta de agua (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 253 Luz Durante la etapa in vitro las plantas estaacuten expuestas a altos niveles de luminosidad lo que se traduce en hojas delgadas Antes del traslado se recomienda mantener las plantas con un 50 de sombra para asiacute poder aclimatarlas de mejor manera esto debido a que las plantas micropropagadas tienen un bajo control sobre la transpiracioacuten y un inadecuado mecanismo de fotosiacutentesis La sombra reduce la transpiracioacuten evitando excesivas peacuterdidas de agua asiacute como tambieacuten el exceso de luz destruye las moleacuteculas de clorofila Luego del periacuteodo bajo sombra se deben mover las macetas gradualmente hacia el nivel de luz al cual seraacute llevado para su crecimiento final (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 254 Temperatura La temperatura del aire y del medio o sustrato de crecimiento estaacute generalmente controlado durante el periacuteodo de aclimatacioacuten El calor es necesario en los meses de invierno y el friacuteo (enfriar) es esencial en los meses de verano Ajustando la cantidad de sombra y humedad se obtiene un control sobre la temperatura El
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enfriamiento se puede obtener gracias a ventilacioacuten abanicos niebla o aire acondicionado El calor puede provenir del sistema existente en el edificio o invernadero donde esteacuten ubicadas las macetas o por las laacutemparas ocupadas para el control del fotoperiacuteodo El rango de temperatura que se mantiene por lo general es entre los 13 y 30ordmC y esta determinado principalmente por la especie en cuestioacuten La temperatura de la zona donde se encuentran las raiacuteces es muy importante para el crecimiento lo ideal es que dicho sector tenga una mayor temperatura que el aire fomentando el crecimiento de las raiacuteces e incrementando la humedad alrededor de la planta Durante el verano esto es difiacutecil de obtener ya que la temperatura del aire es muy alta debido a la alta radiacioacuten solar Terminado el proceso de aclimatacioacuten esto ya no es necesario (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 255 Fotosiacutentesis Las plantas sufren un cambio radical cuando son removidas desde cultivo in vitro ya que son forzadas a cambiar de heterotroacuteficas a autotroacuteficas y la fotosiacutentesis se vuelve fundamental para la sobrevivencia Las hojas de las plantas in vitro no estaacuten formadas para hacer fotosiacutentesis ya que en la caacutemara de incubacioacuten no se produce un fuerte intercambio gaseoso esto debido a que la sacarosa es entregada a traveacutes del medio de cultivo Las hojas de las plantas que son trasladadas al campo o invernadero sufren deterioro debido a que no estaacuten formadas para la fijacioacuten de carbono Esto se produce por un tiempo aproximado de cuatro semanas despueacutes de las cuales las hojas nuevas suplen a las viejas Otro punto es que las hojas de las plantas cultivadas in vitro contienen menor proporcioacuten de clorofila que las plantas que han crecido normalmente en el campo En un estudio de coliflor cultivado in vitro se midioacute el CO2 y se obtuvo un balance negativo el cual se mantuvo durante dos semanas despueacutes del transplante Algo similar ocurrioacute con frutilla despueacutes del transplante las hojas se deterioraron raacutepidamente lo que quiere decir que no hubo incremento en la fijacioacuten de carbono indicando falta de desarrollo en la competencia fotosinteacutetica
El bajo nivel de CO2 durante el cultivo in vitro limita el proceso de fotosiacutentesis lo cual se puede compensar usando sacarosa en el medio de cultivo Tambieacuten se puede incrementar el nivel de luz y CO2 obteniendo un fuerte aumento en el crecimiento de varias especies como orquiacutedeas clavel etc (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 256 Sustrato Un sustrato es todo material soacutelido distinto del suelo natural mineral u orgaacutenico que colocado en un contenedor en forma pura o en mezcla permite el anclaje del sistema radicular de la planta desempentildeando por lo tanto un papel de soporte para la planta El sustrato puede intervenir o no en el complejo proceso de la nutricioacuten mineral de la planta (INFOAGRO 2007) El sustrato y los contenedores dentro de los cuales se van a transplantar las plaacutentulas in vitro son importantes para una buena sobrevivencia
Los sustratos ejercen una influencia significativa en la arquitectura del sistema radical de las plantas y en las asociaciones bioloacutegicas de este con el suelo influenciando el
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estado nutricional y la translocacioacuten de agua en el sistema suelo-planta-atmoacutesfera Uno de los requisitos fundamentales que debe cumplir el sustrato para su utilizacioacuten es la sanidad Cuando estos no se elaboran almacenan o manejan correctamente pueden contaminarse y provocar serios dantildeos a las plantas durante la aclimatacioacuten por esta razoacuten son preferidos como componentes para su elaboracioacuten materiales inertes o aquellos en las cuales el proceso de obtencioacuten garantice la mayor desinfeccioacuten posible
Uno de los factores de mayor importancia a la hora de seleccionar los materiales que pueden constituir el sustrato es su disponibilidad tanto en teacuterminos de facilidad de obtencioacuten o suministro como de su costo (VILCHEZ et al 2007)
La presencia de inhibidores o tambieacuten cambios en el pH del sustrato pueden afectar el crecimiento de las raiacuteces y consecuentemente el eacutexito del transplante
Muchos laboratorios y viveros transplantan a un sustrato uniforme debiendo ser eacuteste adecuado en cuanto a soporte de las plantas pH porosidad aireacioacuten y drenaje (DEBERGH y ZIMMERMAN 1991)
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3 MATERIAL Y MEacuteTODO
Para la realizacioacuten de este trabajo se utilizoacute el siguiente material y meacutetodo
31 Material La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio e invernadero de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal pertenecientes a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de Chile
311 Material vegetal Se utilizaron plaacutentulas de C virescens cultivadas in vitro a partir de semillas las cuales fueron proporcionadas por el laboratorio estas plaacutentulas fueron separadas y repicadas para aumentar la poblacioacuten y obtener la cantidad necesaria para el ensayo
FIGURA 2 Plaacutentulas de C virescens en caacutemara de crecimiento in vitro
312 Materiales Los materiales que se utilizaron fueron los siguientes Equipos autoclave caacutemara de flujo laminar dispensador de medios medidor
de pH agitador magneacutetico horno microondas balanza mechero termoacutemetro Materiales vasos de precipitado matraces probetas pipetas papel de
aluminio frascos de vidrio placas Petri pinzas bisturiacute macetas regadera Soluciones soluciones madre (Medio MS) gelificante etanol 70 y 95
32 Meacutetodo A continuacioacuten se da a conocer la metodologiacutea con la cual se trabajoacute 321 Preparacioacuten del medio de cultivo Para la obtencioacuten de plantas a traveacutes de la micropropagacioacuten se ocupoacute el medio basal de MURASHIGE y SKOOG (1962) tambieacuten llamado medio MS Este medio tiene un pH de entre 56-57 Posteriormente se dosificoacute con el dispensador de medios para que cada frasco tenga una cantidad adecuada (25 mL) y se llevoacute a autoclave para esterilizar a 12 atm 120ordm C por 20 min
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322 Obtencioacuten del material vegetal Al tener el medio esterilizado se procedioacute a la separacioacuten y repicado de plaacutentulas existentes en el laboratorio Las siembras se realizaron en el mes de mayo del 2007 Estas siembras se realizaron en la caacutemara de flujo laminar de modo de asegurar que la siembra sea 100 aseacuteptica Estas plaacutentulas fueron mantenidas en la caacutemara de incubacioacuten hasta obtener los tamantildeos requeridos para el ensayo donde las condiciones fueron las siguientes
minus Temperatura ambiental de 23-25ordm C minus Fotoperiacuteodo de 16 horas minus Intensidad lumiacutenica controlada de 50-55 micromol m-2s-1
323 Sustratos Se utilizaron tres tipos de sustratos el primero corresponde a una mezcla de turba + perlita (11) el segundo corresponde a Sphagnum (100) y el tercero corresponde a una mezcla de turba + arena (11) Una vez realizadas las mezclas se procedioacute a una esterilizacioacuten en un autoclave a 121ordm C por 20 minutos a 12 atmoacutesfera De esta forma se trabajoacute con material limpio y sano evitando ataque de hongos o bacterias El anaacutelisis quiacutemico de los sustratos se muestra en el Anexo 2 324 Plantacioacuten Las plaacutentulas con un promedio de cuatro meses en condiciones de caacutemara de crecimiento in vitro obtuvieron el tamantildeo adecuado para ser utilizadas Se sacaron de los frascos y se plantaron en las macetas de plaacutestico transparente con los sustratos Posteriormente fueron dejadas en la sala del laboratorio donde se debioacute asperjar con solucioacuten nutritiva Hoagland y fungicida Captan CUADRO 1 Composicioacuten de solucioacuten nutritiva Hoagland
KNO3 102 gL Ca(NO3) 4 H2 O 0492 gL
NH4H2 (PO4) 023 gL MgSO4 7 H2O 049 gL
H3BO3 286 mgL MnCl2 2 H2O 181 mgL CuSO4 5 H2O 008 mgL ZnSO4 5 H2O 022 mgL Na2MoO4 H2O 009 mgL
FeSO4 7 H2O 05 06 mL FUENTE FINCK 1988 325 Disentildeo de los ensayos Este trabajo de investigacioacuten constoacute de un ensayo con dos etapas Antes que todo se realizoacute la separacioacuten y repicado in vitro de plaacutentulas de C virescens para la obtencioacuten del nuacutemero necesario de plantas En la etapa 1 se utilizaron tres tamantildeos de plaacutentulas obtenidas in vitro de 1-2cm de 2-3cm y de maacutes de 3cm de altura que se transplantaron a tres sustratos turba + perlita 11(vv) Sphagnum (100) y turba + arena 11 (vv) La turba provino de la Sociedad
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Minera Patagonia Peat SA en Hijuelas el Sphagnum de la empresa Lonquen Chile de Puerto Montt y la perlita se obtuvo a traveacutes del sitio web wwwjardisencl (representante legal Walter Rathgeb Penza Ingeniero Agroacutenomo Santiago) Las plaacutentulas se plantaron de acuerdo a su tamantildeo las de maacutes de 3cm se colocaron de 6 por maceta las de 2 a 3cm de a 8 por maceta y las maacutes chicas de a 10 por maceta Estas macetas fueron dejadas en una sala de aclimatacioacuten con una temperatura promedio de 20ordm C intensidad lumiacutenica de 50-55 micromol m-2s-1 y 14-16 hrs de fotoperiacuteodo Se fertilizoacute asperjando cada cinco diacuteas con solucioacuten nutritiva Hoagland Esta etapa se llevoacute a cabo durante dos meses desde el cinco de septiembre hasta el cinco de noviembre de 2007
En la etapa 2 se continuoacute el proceso de aclimatacioacuten en invernadero de las plaacutentulas obtenidas en la etapa 1 que despueacutes de dos meses teniacutean un mayor tamantildeo y se habiacutean acondicionado al ambiente exterior (fuera de la caacutemara de crecimiento) Las plantas se mantuvieron en las macetas durante tres semanas para aclimatarlas y luego las plantas sobrevivientes fueron transplantadas a macetas maacutes grandes individuales durante tres meses aproximadamente hasta el cinco de marzo 2008 Estas nuevas macetas tuvieron como sustrato turba y suelo (trumao) en igual proporcioacuten (Anexo 2) La temperatura promedio de invernadero fluctuoacute de 13 a 35 degC seguacuten el mes En enero el promedio fue de 25 (Anexo 3) Para bajar la temperatura alrededor de 5deg C se instaloacute una malla Rachel 326 Disentildeo experimental El disentildeo experimental utilizado fue completamente al azar ordenado como experimento factorial con dos factores tamantildeo (3) y sustrato (3) Cada tratamiento tuvo tres repeticiones con un miacutenimo de 6 plantas por recipiente 327 Variables a evaluar Durante los dos meses en que las macetas estuvieron en la sala de aclimatacioacuten se evaluoacute el desarrollo foliar contando el nuacutemero de hojas una vez al mes Posteriormente se trasladaron las mismas macetas a invernadero durante tres semanas para continuar con la aclimatacioacuten de las plaacutentulas Transcurrido este tiempo se transplantaron las plaacutentulas sobrevivientes a macetas individuales y continuoacute mensualmente la evaluacioacuten de eacutestas (nuacutemero de hojas) hasta la obtencioacuten de plantas establecidas Al momento del transplante y al final del ensayo se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces asiacute como tambieacuten al final del ensayo de evaluoacute el crecimiento en altura (cm) La sobrevivencia fue evaluada al final del ensayo por maceta
Tanto en la sala de aclimatacioacuten coacutemo en el invernadero se registroacute la temperatura con la ayuda de un termoacutemetro de maacutexima y miacutenima (Anexo 3) 328 Anaacutelisis estadiacutestico Una vez obtenidos los datos se procedioacute a comprobar si estos cumpliacutean con los supuestos de aleatoriedad normalidad y homogeneidad de varianzas que exige este tipo de anaacutelisis En el caso de no cumplirse estos supuestos los datos se transformaron utilizando log10(x+05) raiacutez(x+05) o 1x para normalizarlos
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y enseguida se sometioacute los datos a un anaacutelisis estadiacutestico (ANDEVA) Posteriormente en los casos en que se observoacute diferencias significativas en el ANDEVA se aplicoacute una prueba de rangos muacuteltiples (Tukey) al 5 de significancia Para las variables no parameacutetricas que no cumplieron con los supuestos para un anaacutelisis de varianza se realizoacute la prueba de KruskalndashWallis y las comparaciones muacuteltiples a traveacutes del test de Dunn con un nivel de 5 de significancia
Se utilizaron los programas estadiacutesticos STATGRAPHICS 20 y GRAPHPAD PRISM 5 para el anaacutelisis de datos
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4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
En los siguientes puntos se discuten los resultados obtenidos en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens
En la Figura 3 se observan plaacutentulas de C virescens micropropagadas en medio MS en caacutemara de crecimiento al inicio del ensayo (A) y en invernadero despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten (B)
BA
FIGURA 3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten
A continuacioacuten se presentan los resultados obtenidos para las variables analizadas (Cuadro 2 y 3) de esta manera se pueden visualizar en general los resultados obtenidos en el proceso de aclimatacioacuten durante seis meses
CUADRO 2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de raiacuteces
inicial y final Variables
Hojas finales (nuacutemero)
Raiacuteces iniciales (nuacutemero)
Raiacuteces finales (nuacutemero)
Tamantildeo de plaacutentulas 36 24 37 47 29 46
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 61 43 76
Sustratos 53 36 56 43 29 51
Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 46 27 49
Significa que hay diferencias significativas al 95 Test de Dunn
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Las variables no parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en hojas finales y raiacuteces iniciales en sus rangos de distribucioacuten Las raiacuteces finales no presentaron diferencias seguacuten el sustrato utilizado pero de acuerdo al tamantildeo hubo diferencias en su distribucioacuten
CUADRO 3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas
Variables Altura final de plaacutentulas
(cm) Sobrevivencia
Tamantildeo de plaacutentulas
36 c 567 b 47 b 821 a
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 59 a 908 a
Sustratos 52 a 933 a
41 ab 59 b Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 49 b 772 a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY Las variables parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en altura final de hojas y en sobrevivencia 41 Nuacutemero de hojas finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentulas y de sustratos para la variable nuacutemero final de hojas 411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula Seguacuten el Cuadro 2 y Figura 4 las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero final de hojas Las plaacutentulas pequentildeas de 1-2 cm obtuvieron el nuacutemero maacutes bajo de hojas finales con una media de 36 hojas por plaacutentula lo cual es la mitad de las hojas finales que se obtuvo con las plaacutentulas de mayor tamantildeo (61 hojas aproximado por plaacutentula) Para las plaacutentulas medianas de 2-3 cm se obtuvo una media de 47 hojas por plaacutentula (Figura 4)
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Hojas finales
1-2 cm 2-3cm maacutes de 3 cm0
5
10
15
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn)
BLANCO (2006) sentildeala que plaacutentulas cultivadas in vitro crecen bajo condiciones especiales como alta humedad relativa y baja luminosidad ademaacutes son suplidas con sacarosa Estas condiciones fueron proporcionadas en una caacutemara de crecimiento en el laboratorio donde las plantas micropropagadas no son dependientes por completo de su fotosiacutentesis son heteroacutetrofas Parece ser necesario un estiacutemulo para convertirse en organismos totalmente capaces de sustentar sus propios requisitos de carbono y nitroacutegeno reducido pasando de esta manera a ser autoacutetrofos
Al ser sacadas de un medio in vitro las hojas no estaacuten preparadas para producir su propio alimento y sobreviven gracias a que el medio de cultivo le proporciona los nutrientes necesarios para vivir En este punto muchas de las hojas mueren y nacen hojas nuevas capaces de generar su alimento supliendo asiacute las hojas viejas (SEELYE et al 2003) En este ensayo las plaacutentulas de Chloraea virescens presentaron en general una buena adaptacioacuten al ser sacadas de un medio in vitro
Se observoacute que plaacutentulas con menor tamantildeo al ser aclimatadas y tener menor tejido fue maacutes difiacutecil y maacutes lento que empezaran a generar nuevos tejidos y materia orgaacutenica a partir de dioacutexido de carbono POSPIacuteŠILOVAacute et al (1999) sentildeala que al tener los estomas con desarrollo incompleto maacutes grandes y de forma maacutes redonda pierden maacutes agua lo cual puede provocar una peacuterdida de hojas muriendo asiacute la plaacutentula Por esta razoacuten las plaacutentulas pequentildeas se demoran maacutes tiempo en generar hojas nuevas es por ello que al finalizar este estudio muestran el menor nuacutemero final de hojas 412 Efecto del tipo de sustrato Al analizar la influencia del tipo de sustrato se encontraron diferencias significativas entre los tres sustratos utilizados Seguacuten el Cuadro 2 y la Figura 5 el sustrato donde se obtuvo mejores resultados fue
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turba+perlita en el cual se observoacute un promedio de 53 hojas por plaacutentula siendo Sphagnum el maacutes bajo con 43 hojas por plaacutentula De acuerdo a los resultados del anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados el sustrato turba+perlita tiene mayor cantidad de nitroacutegeno foacutesforo calcio magnesio y azufre disponible comparativamente con los otros dos sustratos (Sphagnum y arena+turba) (Anexo 2)
Hojas finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
Sustratos
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) Para la brotacioacuten y el crecimiento de las plantas se necesita agua y Nitroacutegeno lo que favorece a una mayor tasa de aparicioacuten de hojas lo que se traduce en una mayor cantidad de hojas finales El Nitroacutegeno se encuentra en mayor cantidad en el sustrato turba+perlita debido a lo cual los mejores resultados se obtienen en dicho sustrato 413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Despueacutes de analizados los efectos individuales del tamantildeo y del sustrato al interactuar ambos factores existen diferencias significativas La mejor interaccioacuten se obtuvo con el sustrato turba+perlita y con el mayor tamantildeo de la plaacutentula (Figura 6) Debido a la buena estructura (porosa) de dicho sustrato se podriacutea decir que se favorecioacute la absorcioacuten radicular de nutrientes obteniendo por ello un mayor nuacutemero de hojas finales Para los menores tamantildeos no se observan diferencias significativas obteniendo como promedio 41 hojas por plaacutentula Para el mayor tamantildeo el promedio fue de 6 hojas por plaacutentula
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Hojas finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 42 Raiacuteces iniciales Este paraacutemetro se evaluoacute luego de la primera etapa de aclimatacioacuten la cual se realizoacute en una sala de aclimatacioacuten del laboratorio Se analizoacute la influencia de diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos sobre la variable nuacutemero raiacuteces iniciales (Anaacutelisis de Kruskal-Wallis en Anexo 7)
FIGURA 7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses de pre aclimatacioacuten
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En la Figura 7 se puede observar los resultados de pre aclimatacioacuten en sala de laboratorio En esta etapa ya es posible ver la presencia de raiacuteces desarrolladas 421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula En el Cuadro 2 se puede observar que las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero inicial de raiacuteces y en la Figura 8 se puede comprobar que para los dos tamantildeos de plaacutentula maacutes pequentildeos no se observa gran cantidad de raiacuteces esto no impidioacute el desarrollo posterior de las plaacutentulas las cuales lograron enraizar al final del estudio Esto se contrapone a lo observado en un estudio de Lapageria rosea donde la presencia de raiacutez y brote para lograr una multiplicacioacuten exitosa de plantas es de vital importancia Incluso algunas plaacutentulas de L rosea no brotan en condiciones in vitro en donde tienen las mejores condiciones nutricionales y hormonales para hacerlo Esto se debe a factores internos de la plaacutentula siendo muy difiacutecil que broten inmediatamente en caacutemara de aclimatacioacuten donde ya dejan de recibir los nutrientes necesarios de manera directa y requieren de balances de energiacutea para poder seguir elongando raiacuteces absorber nutrientes y brotar para poder obtener los carbohidratos necesarios para seguir su crecimiento (BLANCO 2006) El tamantildeo de plaacutentula tiene importancia para el desarrollo de raiacuteces se distingue notoriamente que en los tamantildeos maacutes grandes el nuacutemero de raiacuteces es mayor comparativamente con los tamantildeos pequentildeos donde el nuacutemero de raiacuteces fue escaso Debido a la presencia de maacutes hojas existe una mayor cantidad de aacuterea fotosinteacutetica esta situacioacuten estimula el crecimiento de las raiacuteces para la obtencioacuten de agua y nutrientes
Raices iniciales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
2
4
6
8
10
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o inicial de ra
iacuteces
FIGURA 8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn)
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422 Efecto del tipo de sustrato Para el sustrato turba+perlita se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas en el nuacutemero de raiacuteces con respecto a los dos otros sustratos esto se puede ver en el Figura 9 donde se observa que se obtuvieron los mayores resultados En cualquier medio de crecimiento el espacio no ocupado por un soacutelido se llama porosidad este espacio puede ser ocupado en parte para retener agua y en parte para proporcionarle aire a las raiacuteces La ausencia de uno de estos elementos es perjudicial para las plantas La turba es conocida por tener estas propiedades y la perlita tambieacuten por esta razoacuten se sabe que la mezcla turba-perlita provee propiedades fiacutesicas excelentes como medio de crecimiento y propagacioacuten (INFOAGRO 2007) Estos resultados con turba-perlita (298 de materia orgaacutenica) coinciden con los obtenidos por DIAZ et al (2004) quienes al utilizar un sustrato compuesto por 100 de humus de lombriz para aclimatar cantildea de azuacutecar obtuvieron el mayor nuacutemero de raiacuteces Esto puede atribuirse al importante aporte de materia orgaacutenica del humus (47) lo que le confiere una mejor estructura obtenieacutendose una excelente porosidad del sustrato La aireacioacuten del suelo es necesaria para favorecer la maacutexima absorcioacuten de nutrientes por las raiacuteces Esto tambieacuten sucede en el sustrato turba+perlita el cual posee la mayor cantidad de materia orgaacutenica de los tres sustratos utilizados
Raices iniciales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
2
4
6
8
10
Sustratos
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato En los anaacutelisis para la variable nuacutemero de raiacuteces se puede decir que la mejor interaccioacuten se presentoacute para el sustrato de turba+perlita junto con el mayor tamantildeo de plaacutentulas obteniendo los valores maacutes altos entre los nueve tratamientos La presencia de raiacuteces luego de la micropropagacioacuten aumenta la posibilidad de eacutexito en el transplante ya que se crea un favorable balance de agua Pero esto no quiere
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decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
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Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
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En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
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El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
34
Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
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Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
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Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
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Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
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- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
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- INDICES
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- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
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- RESUMEN
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- Reacutesumeacute
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- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
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- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
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- 3 MATERIAL Y METODO
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- 31 Material
- 32 Meacutetodo
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- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
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- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
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- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
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- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
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Seguacuten SHEEHAN (1980) las temperaturas ideales para las orquiacutedeas de origen tropical son 10ordmC en la noche y entre 21ordm - 24ordmC durante el diacutea 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas La micropropagacioacuten de orquiacutedeas estaacute en vanguardia hoy en diacutea El estudio de cultivo de tejido de orquiacutedeas se lleva a cabo en muchos laboratorios de todo el mundo (ARDITTI and ERNST 1992) 231 Biologiacutea de las semillas Las semillas de orquiacutedeas son conocidas usualmente como semillas polvo porque son minuacutesculas y contienen pocas reservas de alimento Estas semillas por lo general no germinan en el medio natural a menos que sean infectadas por un hongo micorriacutezico Este hongo abastece a las plantas joacutevenes con azuacutecares y nutrientes hasta que sean lo suficientemente grandes para fabricar su propio alimento Cuando la semilla germina produce una masa indiferenciada de ceacutelulas llamada protocormo Manteniendo las condiciones normales el protocormo continuaraacute su crecimiento por varias semanas meses o incluso antildeos dependiendo de la especie hasta que alcance la edad apropiada para producir raiacuteces y hojas En el caso de orquiacutedeas terrestres es de vital importancia que la relacioacuten orquiacutedea-hongo se conserve durante los estados tempranos del ciclo de vida de la planta ya que el protocormo enterrado no puede fabricar alimento por siacute mismo Por otro lado los protocormos de las orquiacutedeas epiacutefitas son comuacutenmente verdes lo que les posibilita producir parte de su alimento La relacioacuten orquiacutedea-hongo no ha sido en su totalidad investigada para el caso de las orquiacutedeas tropicales (McKENDRICK 2000) 232 Germinacioacuten simbioacutetica y no simbioacutetica de semillas Mediante la germinacioacuten in vitro las semillas germinan en frascos de vidrio o plaacutestico Estos frascos contienen en su interior un medio nutritivo solidificado con agar con todos los azuacutecares y minerales necesarios para la germinacioacuten y crecimiento de las semillas Hay dos tipos de germinacioacuten la simbioacutetica y la asimbioacutetica En la germinacioacuten simbioacutetica las semillas se siembran junto con una pequentildea cantidad del hongo micorriza adecuado Dicho hongo crece en el medio coloniza a las semillas que estaacuten en proceso de germinacioacuten y se produce una relacioacuten simbioacutetica la cual alimentaraacute al protocormo hasta que este sea capaz de producir sus hojas y se vuelva autotroacutefico Esta teacutecnica es usada principalmente en propagacioacuten de orquiacutedeas terrestres en zonas templadas La germinacioacuten asimbioacutetica se usa principalmente en propagacioacuten de orquiacutedeas tropicales que crecen maacutes raacutepido que sus parientes de zonas templadas Para este tipo de germinacioacuten se necesita un medio de cultivo maacutes complejo ya que todos los nutrientes orgaacutenicos e inorgaacutenicos asiacute como tambieacuten los azuacutecares deben estar en forma disponible pues no existe la intermediacioacuten del hongo (McKENDRICK 2000) 233 Condiciones de esterilidad Tanto para la germinacioacuten simbioacutetica como para la asimbioacutetica es de vital importancia que los frascos las semillas aparatos y el medio esteacuten esteacuteriles desde el principio del proceso Esto debido a que cualquier hongo o bacteria que se introduzca creceraacute maacutes raacutepido que las semillas ocupando su espacio hasta matarlas Esto se evita gracias al autoclave el cual regulado a 12 atm y 120ordmC por 20 minutos mata hongos o bacterias presentes en el medio (McKENDRICK 2000)
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2331 Siembra de las semillas Las semillas pueden ser recolectadas desde caacutepsulas verdes o maduras La caacutepsula verde que estaacute madurando estaacute llena de semillas y no se deforma cuando se aprieta con las pinzas Estas semillas pueden ser almacenadas por algunas semanas en un lugar refrigerado con bastante aireacioacuten Las semillas se pueden sembrar a partir de caacutepsulas verdes o semillas secas A continuacioacuten se muestran las ventajas y desventajas de ambos meacutetodos
- Siembra a partir de caacutepsulas verdes Si las caacutepsulas se mantienen intactas el interior (las semillas) se mantiene esteacuteril Por lo tanto si se esteriliza la parte exterior de las mismas donde hongos y bacterias pueden desarrollarse y se abren las caacutepsulas bajo condiciones esteacuteriles y las semillas podraacuten mantenerse desinfectadas
La ventaja de este meacutetodo es que no se requiere de esterilizacioacuten de las semillas lo que provoca su deterioro Otro punto a favor es que algunas semillas podriacutean germinar maacutes raacutepido que las provenientes de caacutepsulas maduras por los mecanismos de dormancia La desventaja es que en este caso todas las semillas deben ser utilizadas o eliminadas mientras que las semillas maduras se pueden almacenar Tambieacuten se debe considerar que las semillas sembradas a partir de caacutepsulas que no han madurado lo suficiente podriacutean germinar lentamente o simplemente no germinar - Siembra a partir de semillas secas En este caso una vez que la caacutepsula es abierta las semillas dejan de ser esteacuteriles y requieren de un proceso de esterilizacioacuten Comuacutenmente se utiliza una solucioacuten de hipoclorito de sodio hipoclorito de calcio o peroacutexido de hidroacutegeno Las semillas se agitan dentro de la solucioacuten que ademaacutes contiene una gota de detergente para ldquohumedecerlasrdquo luego se las enjuaga con agua destilada y se las siembra en el medio preparado La ventaja de este meacutetodo es que las semillas pueden ser colectadas secadas al aire almacenadas por varios meses en el refrigerador y utilizarlas cuando sea necesario Se debe considerar que la siembra ya sea de caacutepsulas verdes o de semillas secas estaacute determinado por la eacutepoca en que se colectan (McKENDRICK 2000) 234 Trasplante En la caacutemara de incubacioacuten las plaacutentulas se han desarrollado en condiciones limpias y en un ambiente cerrado por lo que deben acostumbrase gradualmente al ambiente exterior antes de ser trasplantadas a las macetas Tambieacuten la temperatura y la luz la cual es baja han sido constantes durante el cultivo in vitro En el medio natural la temperatura y la luz variacutean constantemente por lo que las nuevas plantas deben estar protegidas de la fuerte luz solar la cual puede quemar las hojas con soacutelo una pequentildea cantidad de eacutesta La humedad en los frascos es alta y las plantas estaacuten protegidas de ataques por hongos o bacterias Ademaacutes las plaacutentulas han crecido bajo condiciones de alta humedad y por lo tanto tendraacuten cutiacuteculas deacutebiles por lo que necesitan acostumbrase a medios menos huacutemedos antes de ser transplantadas
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Para el trasplante se deben colocar los frascos en un lugar protegido de la lluvia para que se aclimaticen a las nuevas condiciones de luz y temperatura Se deben dejar por 2 a 4 semanas en los frascos tapados Luego se debe ir aflojando las tapas para dejar entrar pequentildeas cantidades de aire hasta el punto de dejarlas descubiertas Se debe revisar si hay hojas marchitas y ver que el sustrato esteacute huacutemedo
Lo ideal es dejarlas sin tapa durante una semana antes de pasarlas a las macetas Para el trasplante se debe elegir un sustrato adecuado para el tipo de planta humedecerlo y transplantar las plantas con cuidado de no dantildear las raiacuteces y evitando la deshidratacioacuten En esta etapa tambieacuten se debe dejar las macetas selladas para evitar una raacutepida deshidratacioacuten e ir abrieacutendolas paulatinamente (McKENDRICK 2000)
24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas 241 Orquiacutedeas terrestres 2411 Cypripedium Esta es una orquiacutedea terrestre de zonas templadas se desarrolla en el Hemisferio Norte como por ejemplo en Guatemala y en Honduras pero donde se encuentra principalmente es en China Su forma maacutes comuacuten de propagacioacuten es in vitro a partir de semillas La forma maacutes eficiente es a partir de semillas inmaduras Existe un intervalo de tiempo entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten eacuteste dependeraacute de la especie y de la zona donde se desarrolle Se asume que existen aproximadamente cuatro semanas entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten El oacuteptimo para una buena germinacioacuten de Cypripedium es entre 42 y 60 diacuteas despueacutes de la polinizacioacuten y entre 14 y 32 diacuteas despueacutes de la fertilizacioacuten La germinacioacuten ocurre entre la segunda y cuarta semana despueacutes de ser sembradas y los protocormos deberiacutean ser cambiados de medio de cultivo cada dos a cuatro meses si no se corre el riesgo de sufrir agotamiento de nutrientes Los rizomas y las raiacuteces se empiezan a desarrollar a partir de los siete meses para luego dar lugar a las primeras hojas Para obtener un buen transplante se deben tener raiacuteces de miacutenimo un centiacutemetro de largo El desarrollo de raiacuteces se ve potenciado al tener un periacuteodo corto de bajas temperaturas (10degC) exposicioacuten a la luz reduccioacuten en la concentracioacuten de iones del medio de cultivo o transferirlas a un compost esteacuteril Al tener raiacuteces suficientes y el tamantildeo adecuado se podraacuten llevar las plantas al lugar donde creceraacuten definitivamente En el momento del transplante las plantas son muy susceptibles al desecamiento por lo cual lo ideal es que los brotes sean maacutes chicos que las raiacuteces El mejor sustrato seriacutea aquel donde crece naturalmente la orquiacutedea (RAumlNNBAumlCK 2007) 2412 Preservacioacuten in vitro de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes Este estudio fue hecho para establecer que parte de tejido es viable para la micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes del noreste de Europa pudiendo asiacute reestablecer dichas orquiacutedeas a sus aacutereas correspondientes La propagacioacuten in vitro de orquiacutedeas
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terrestres de clima templado es maacutes difiacutecil que las orquiacutedeas epiacutefitas de clima subtropical y tropical Las orquiacutedeas terrestres tienen requerimientos maacutes estrictos que las epiacutefitas y se conoce menos sobre sus necesidades especiacuteficas (VAASA y ROSENBERG 2004) En Estonia existen 36 especies de orquiacutedeas terrestres pero solo tres estaacuten bajo proteccioacuten Dactylorhiza baltica Dactylorhiza ruthei Dactylorhiza praetermissa Como explantes para este estudio en el caso de D baltica se ocuparon protocormos en los otros dos casos se utilizaron semillas semi maduras las cuales fueron colectadas siete y diez semanas despueacutes de ser polinizadas Para D baltica se ocupoacute el medio Murashige y Skoog suplementado con 05 mgL de aacutecido naftaleacuten aceacutetico (ANA) y 2 mgL de isonpentenyl adenina Para el caso de las semillas semi maduras se ocuparon los medios de Lindemann de Heller de Norstog y de Murashige y Skoog como control
La composicioacuten del medio y la madurez de las semillas influye mucho en el desarrollo de las orquiacutedeas in vitro Se ha demostrado que se necesita una alta concentracioacuten de microelementos para obtener una correcta germinacioacuten de las semillas Tambieacuten se puede decir que los primeros tres meses son los de mayor crecimiento luego de este tiempo el crecimiento se vuelve maacutes lento (VAASA y ROSENBERG 2004)
Luego de cuatro semanas de crecimiento de D baltica el 60 de los explantes de meristemas apicales empezaron a crecer en cambio los de meristemas laterales no expresaron ninguacuten tipo de crecimiento Las raiacuteces empezaron su desarrollo luego de dos meses despueacutes de la siembra
En el caso de D ruthei y D praetermissa la germinacioacuten se produjo despueacutes de dos meses desde la inoculacioacuten Luego de cuatro y seis meses el mayor crecimiento fue observado en el medio Norstog superando en 14 al medio testigo Murashige y Skoog (VAASA y ROSENBERG 2004)
2413 Longevidad de semillas de orquiacutedeas terrestres Por lo general las orquiacutedeas producen muchas pero pequentildeas semillas que contienen muy pocas reservas de alimento Dichas semillas estaacuten estructuralmente adaptadas para ser dispersadas por el viento pero poco se sabe del destino de eacutestas luego de ser dispersadas Algunos estudios de viabilidad de semillas indican una sobrevivencia de uno a dos antildeos en orquiacutedeas de clima templado Las semillas que son guardadas en laboratorio duran mucho maacutes tiempo Se estudioacute la viabilidad de siete especies de orquiacutedeas norteamericanas dentro de las cuales se encuentran Goodyera pubescens y Liparis liliifolia Las semillas de eacutestas se colocaron en bolsas con suelo y sustratos de bosques provenientes de sus haacutebitats naturales (WHIGHAM et al 2005) En Goodyera pubescens la mayoriacutea de las semillas germinaron en un antildeo Cuatro otras especies germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero algunas semillas no germinadas despueacutes de siete antildeos seguiacutean siendo viables En la especie Liparis liliifolia semillas que han estado cuatro antildeos bajo observacioacuten han tenido una tasa de
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germinacioacuten de un 68 al ser sembradas in vitro junto con el hongo micorriacutezico adecuado Las dos especies restantes no germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero las semillas fueron evaluadas como intactas y testeadas positivamente en cuanto a su viabilidad despueacutes de cuatro antildeos en el suelo Estas observaciones fueron interpretadas como diferentes estrategias para especies especiacuteficas de germinacioacuten in situ (WHIGHAM et al 2005) 2414 Sobrevivencia de orquiacutedeas terrestres transplantadas a sectores urbanos La conservacioacuten de poblaciones de orquiacutedeas silvestres depende del establecimiento de las orquiacutedeas propagadas a los campos Sin embargo se conoce muy poco de los factores bioacuteticos que influencian el establecimiento de orquiacutedeas terrestres a sus haacutebitats naturales Un experimento fue establecido para medir la sobrevivencia de seis especies durante su primer periacuteodo de crecimiento seguido del transplante a un sector urbano en Australia (SCADE et al 2006)
Las orquiacutedeas germinadas simbioacuteticamente crecieron en laboratorio durante cinco meses antes de establecer la plantacioacuten en sitios adyacentes con alta o baja cobertura de malezas Existioacute una muerte gradual de las plaacutentulas durante el primer periacuteodo de crecimiento primeramente por ataque de insectos no siendo evitado por la presencia de una malla cobertora Los iacutendices de sobrevivencia variacutean desde 49 para Microtis media una especie capaz de crecer en un ambiente atiacutepico hasta un 21 para Caladenia arenicola la orquiacutedea nativa maacutes comuacuten de esos sitios Sin embargo no todas las orquiacutedeas sobrevivientes producen tubeacuterculos por lo que la tasa de sobrevivencia despueacutes del primer periacuteodo seco disminuye
La sobrevivencia de las orquiacutedeas sembradas no puede ser comparada con orquiacutedeas de la misma especie que crecieron en los mismos lugares ya que no existioacute la presencia del hongo compatible para estas orquiacutedeas (SCADE et al 2006)
2415 Micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres En India dos orquiacutedeas muy importantes para la horticultura del geacutenero Anoectochilus fueron exitosamente propagadas Noacutedulos aislados de A sikkimensis colectadas en Himalaya y A regalis colectadas en India fueron cultivadas in vitro durante 12 semanas para obtener un maacuteximo de 48 a 56 protocormos y brotes obteniendo como resultado un 95 y 98 de eficiencia respectivamente Durante el repicado de los explantes in vitro de A regalis se observoacute que el nuacutemero total de brotes obtenidos a partir de noacutedulos fue 214 asiacute como tambieacuten 82 puntas de brotes En cambio para A sikkimensis fueron mucho maacutes bajos 123 y 43 respectivamente teniendo un crecimiento maacutes lento pero plantas maacutes fuertes Las raiacuteces de 4 a 6cm crecieron con la presencia de NAA (270 microM ) en el medio asiacute como tambieacuten con carbono activado (02) Durante la aclimatacioacuten la tasa de establecimiento fue entre 95 y 98 Luego de seis meses en invernadero las plantas de A regalis fueron transferidas a bosque nativo donde se obtuvo una tasa de
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sobrevivencia de entre 70 y 95 despueacutes de 12 meses Estas plantas establecidas en bosque nativo estaacuten libres de cualquier defecto morfoloacutegico y de crecimiento (GANGAPRASAD et al 2000) 242 Orquiacutedeas epiacutefitas Estas orquiacutedeas viven en los aacuterboles pero no obtienen de eacuteste su alimento no son paraacutesitas 2421 Preservacioacuten de Cattleya walkeriana usando propagacioacuten in vitro El geacutenero Cattleya se encuentra en Meacutexico y Ameacuterica Central asiacute como tambieacuten en Venezuela Colombia y las laderas de los Andes Esta orquiacutedea tambieacuten se encuentra en varias regiones del Brasil creciendo en aacuterboles rocas cerca de riacuteos lagos y pantanos Las flores de esta orquiacutedea son conocidas debido a su hermosura y a causa de la destruccioacuten de su haacutebitat y a la excesiva coleccioacuten de eacutestas se encuentra en extincioacuten
La composicioacuten del medio de cultivo es esencial para la propagacioacuten in vitro ya que suple todos los nutrientes necesarios para el desarrollo y seraacute distinto dependiendo de cada especie en este caso se utilizoacute la mitad de los macronutrientes del medio Muchos autores sugieren el uso de carboacuten activado en el medio ya que por lo general en muchas especies aumenta el desarrollo de las raiacuteces En este estudio se probaron distintas dosis de carboacuten activado 1 2 4 y 6gL con un pH de 6 (TADEU DE FARIA et al 2002) Las semillas se obtuvieron de flores artificialmente polinizadas en invernadero Plaacutentulas de aproximadamente un centiacutemetro fueron seleccionadas y cultivadas nuevamente en el medio de cultivo Murashige y Skoog pero esta vez con las diferentes dosis de carboacuten activado Se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces el nuacutemero de brotes y el peso de la materia verde total Durante el autoclavado se produce normalmente una hidroacutelisis de sacarina la cual es de 10 aproximadamente este porcentaje aumenta considerablemente al agregar un 1 de carboacuten activado llegando a ser de 95
El desarrollo de las plaacutentulas de C walkeriana aumentan con una mayor concentracioacuten de carboacuten activado asiacute como tambieacuten un mayor tiempo de cultivo El resultado fue que la dosis ideal para el desarrollo de esta orquiacutedea es 2gL de carboacuten activado (TADEU DE FARIA et al 2002) 2422 Establecimiento de cultivos in vitro y micropropagacioacuten de Cattleya aurantiaca (Bateman ex Lindl) Por medio de siembra in vitro se logroacute el establecimiento de C aurantiaca con alto porcentaje de germinacioacuten y desarrollo de protocormos Para la oacuteptima formacioacuten de callo y para la proliferacioacuten de protocormos se determinaron los medios oacuteptimos (MS 10 mgL ANA 10 mgL BA) asiacute como tambieacuten de manera directa sobre explantes de hoja y pseudobulbos (MS 01 mgL ANA 01 mgL GA3)
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Con este uacuteltimo medio tambieacuten se logroacute una oacuteptima regeneracioacuten y desarrollo de plaacutentulas Los medios liacutequidos (sin agitacioacuten) son una buena opcioacuten para conseguir la produccioacuten masiva de protocormos ya que con ellos se optimizoacute la micropropagacioacuten de C aurantiaca Las plaacutentulas micropropagadas presentaron alto porcentaje de sobrevivencia y buen desarrollo despueacutes de su trasplante y aclimatacioacuten lo cual demuestra que es un buen sistema de propagacioacuten para C aurantiaca (GUTIERREZ y SALGADO 2007) En cuanto a transplante y aclimatacioacuten despueacutes de 45 diacuteas de desarrollo in vitro las plaacutentulas de un tamantildeo entre 3 y 5 cm con raiacuteces bien desarrolladas fueron llevadas a condiciones ex vitro eliminando los restos de medio de cultivo con agua potable y ocupando un sustrato de partes iguales de tezontle y corteza de encino cubierta con hojarasca de encino finamente molida Se mantuvieron cubiertas durante 15 diacuteas abriendo cada dos diacuteas hasta poder retirar la tapa en 30 diacuteas Despueacutes de dos meses de haber sido retiradas del cultivo in vitro las plaacutentulas presentaron 70 de sobrevivencia y alcanzaron una altura de hasta 7 cm presentando nuevas hojas y raiacuteces las plantas se muestran vigorosas y capaces de continuar su crecimiento en condiciones ambientales de invernadero (GUTIERREZ y SALGADO 2007)
2423 Establecimiento in vitro y regeneracioacuten de plantas de Laelia autumnalis (Llave y Lex) Lindl Para este estudio se obtuvieron las semillas de una caacutepsula desarrollada despueacutes de 6 meses de la floracioacuten las cuales se sembraron in vitro sin presentar contaminacioacuten ya que la siembra por este meacutetodo es muy eficiente en comparacioacuten al cultivo de semillas libres donde algunas veces se presenta la contaminacioacuten Las observaciones se realizaron cada 15 diacuteas la germinacioacuten se detectoacute en los primeros 15 diacuteas en la mayoriacutea de los medios de cultivos probados con la presencia de protocormos de 1mm de diaacutemetro (HUAPEO y SALGADO 2004) El porcentaje de germinacioacuten que se obtuvo de las semillas cultivadas in vitro de L autumnalis fue de 95 a 100 en todos los medios de cultivo la uacutenica diferencia fue el tiempo entre las germinaciones A excepcioacuten de las semillas cultivadas en el medio MS 100 la germinacioacuten del 100 se obtuvo hasta los 30 diacuteas de cultivo mientras que en el primero la germinacioacuten fue a los 15 diacuteas del cultivo Las plaacutentulas con raiacutez y un par de hojas se lograron a los 90 diacuteas de cultivo en el medio MS 100 alcanzando 07 mm de altura Estas plaacutentulas fueron subcultivadas en medio MS con 05 mgl de ANA y 01 mgl de GA3 para tener plaacutentulas fuente de explante (segmentos de hojas) un medio oacuteptimo de desarrollo de plaacutentulas de L speciosa No fue necesario probar otros medios de cultivos ya que se hicieron pruebas anteriores que demostraron que era el adecuado
Las plaacutentulas de 6 meses de cultivo in vitro despueacutes de su germinacioacuten presentaron una altura promedio de 5 cm con raiacuteces con velamen y hasta dos pares de hojas Segmentos de hoja de eacutestas fueron cultivadas en el medio MS conteniendo ANA BA y GA3 en diferentes concentraciones y se realizaron observaciones cada 30 diacuteas para determinar medios inductores de callo protocormos y raiacuteces La mejor respuesta en formacioacuten de callo fue observada en los segmentos de hoja de plaacutentulas de L autumnalis cultivados en MS con 1 mgl de ANA BA y GA3 iniciando la induccioacuten de
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eacuteste desde los 30 diacuteas de cultivo solamente en un 70 de los explantes cultivados El 100 se logroacute a los 90 diacuteas de cultivo observando callo abundante alrededor de todo el tejido de color blanco con puntos pigmentados de color verde La regeneracioacuten de protocormos de esta orquiacutedea se establecioacute con la siembra de segmentos de hoja de plaacutentulas de 6 meses de edad de manera directa o a partir de callos En callos la produccioacuten fue oacuteptima en el medio MS con 01 mgl de ANABAGA3 ya que a los 60 diacuteas se obtuvieron 50 protocormos por segmento de callo Solamente se produjeron 10 protocormos por explante al cultivarse los segmentos de hoja en MS con 01 mgl de ANABAGA3 a los 120 diacuteas de cultivo (HUAPEO y SALGADO 2004) 25 Aclimatacioacuten Aclimatacioacuten significa que el hombre intercede y guiacutea el proceso de acondicionamiento de las plantas hasta que eacutestas sean aptas para crecer en el campo yo invernadero
Un alto nuacutemero de plantas micropropagadas no sobreviven al cambio desde el cultivo in vitro hacia el ambiente exterior ya sea en campo o invernadero Eacutestos dos uacuteltimos tienen menor humedad relativa niveles maacutes altos de luminosidad y un ambiente seacuteptico los cuales son maacutes estresantes para las plantas micropropagadas La mayoriacutea de las especies que crecen in vitro necesitan un proceso de aclimatacioacuten pudiendo obtener asiacute un nuacutemero suficiente de plantas vivas y vigorosas para trasplantar al suelo (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991)
La aclimatacioacuten no es uacutenicamente para micropropagacioacuten siendo usada ademaacutes en propagacioacuten convencional durante antildeos Despueacutes de cortar las hojas y de haber formado raiacuteces por lo general son aclimatadas antes de ser llevadas al campo o invernadero Ejemplos de dos teacutecnicas comunes son bajar gradualmente la humedad y mantener el nivel de luz con un 50 de sombra antes de trasladarlos al campo Las raiacuteces que han sido cortadas y mal limpiadas muchas veces son focos de infeccioacuten En estos casos las plantas muestran signos de marchitez hojas necrosadas y tambieacuten se puede llegar a la muerte de eacutestas El cultivo in vitro reduce la necesidad de fotosiacutentesis ya que las condiciones de la caacutemara de incubacioacuten proveen a la planta de sacarosa u otro azuacutecar Tambieacuten en estas condiciones se reduce el stress por patoacutegenos al ser un ambiente aseacuteptico Todo esto se traduce en que las plantas micropropagadas no son aptas para el campo yo invernadero (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 251 Stress hiacutedrico El stress hiacutedrico puede ser el resultado de una excesiva transpiracioacuten de las diferentes partes aeacutereas de las plantas especialmente de las hojas o por una inadecuada absorcioacuten de agua por parte de las raiacuteces La cutiacutecula y los estomas son la ruta primaria de peacuterdida de agua desde de las hojas provenientes de esta teacutecnica reproductiva 2511 Cutiacutecula La cutiacutecula es una membrana compuesta por una matriz de cutina que a su vez se encuentra cubierta en su superficie por ceras cuya funcioacuten primaria consiste en limitar la peacuterdida de agua por transpiracioacuten La permeabilidad del agua a traveacutes de la cutiacutecula se ve influenciada principalmente por la estructura y la cantidad de
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ceras cuticulares y epicuticulares no vieacutendose afectada la peacuterdida de agua por el grosor de eacutesta o la naturaleza quiacutemica de la matriz de la cutina La estructura cristalina de la parte encerada de las hojas es distinta en las plantas micropropagadas con respecto a las plantas que crecen en el campo La cera epicuticular de las hojas de plantas in vitro tienen una proporcioacuten maacutes alta de esteres y de componentes polares por el contrario tienen unas cadenas de hidrocarbonos mucho maacutes cortas Esto hace que las plantas in vitro pierdan maacutes agua que las cultivadas en campo o invernadero
Las plantas que han crecido en el campo son naturalmente de color verde pero el color de las plantas cultivadas in vitro es diferente y se puede ver a simple vista Las plantas que son pasadas a invernadero y que tengan un color verde se aclimatan de mejor forma al ambiente exterior (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 2512 Estomas La estructura estomaacutetica y su funcionamiento han sido implicados recurrentemente en el desbalance de agua exhibido por plantas micropropagadas al momento de ser removidas del cultivo in vitro Estudios con microscopiacutea de scanner electroacutenico han indicado que la estructura estomaacutetica presente en algunas especies de plantas cultivadas in vitro difieren marcadamente de las cultivadas en invernadero o en el suelo Debido a que las primeras presentan estomas de mayor tamantildeo y maacutes redondos a diferencia de las plantas cultivadas de manera normal que presentan estomas maacutes pequentildeos y eliacutepticos lo que resulta en una deshidratacioacuten maacutes raacutepida en el caso de las provenientes de cultivo in vitro (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 252 Humedad Debido a la anatomiacutea y la condicioacuten fisioloacutegica de las plantas desarrolladas in vitro donde se ha mantenido una alta humedad relativa es necesario regar al momento del traslado para obtener una alta sobrevivencia Muchos laboratorios aseguran que hay que evitar tener un sistema de aspersioacuten ya que se produce el ambiente necesario (muy huacutemedo) para la aparicioacuten de hongos algas o bacterias Otros meacutetodos incluyen el uso de humidificadores o poner las macetas en un lugar cerrado donde se retenga vapor para esto se pueden usar por ejemplo tapas de polietileno Este meacutetodo es relativamente econoacutemico pero se debe tener control del calor y monitorear la falta de agua (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 253 Luz Durante la etapa in vitro las plantas estaacuten expuestas a altos niveles de luminosidad lo que se traduce en hojas delgadas Antes del traslado se recomienda mantener las plantas con un 50 de sombra para asiacute poder aclimatarlas de mejor manera esto debido a que las plantas micropropagadas tienen un bajo control sobre la transpiracioacuten y un inadecuado mecanismo de fotosiacutentesis La sombra reduce la transpiracioacuten evitando excesivas peacuterdidas de agua asiacute como tambieacuten el exceso de luz destruye las moleacuteculas de clorofila Luego del periacuteodo bajo sombra se deben mover las macetas gradualmente hacia el nivel de luz al cual seraacute llevado para su crecimiento final (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 254 Temperatura La temperatura del aire y del medio o sustrato de crecimiento estaacute generalmente controlado durante el periacuteodo de aclimatacioacuten El calor es necesario en los meses de invierno y el friacuteo (enfriar) es esencial en los meses de verano Ajustando la cantidad de sombra y humedad se obtiene un control sobre la temperatura El
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enfriamiento se puede obtener gracias a ventilacioacuten abanicos niebla o aire acondicionado El calor puede provenir del sistema existente en el edificio o invernadero donde esteacuten ubicadas las macetas o por las laacutemparas ocupadas para el control del fotoperiacuteodo El rango de temperatura que se mantiene por lo general es entre los 13 y 30ordmC y esta determinado principalmente por la especie en cuestioacuten La temperatura de la zona donde se encuentran las raiacuteces es muy importante para el crecimiento lo ideal es que dicho sector tenga una mayor temperatura que el aire fomentando el crecimiento de las raiacuteces e incrementando la humedad alrededor de la planta Durante el verano esto es difiacutecil de obtener ya que la temperatura del aire es muy alta debido a la alta radiacioacuten solar Terminado el proceso de aclimatacioacuten esto ya no es necesario (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 255 Fotosiacutentesis Las plantas sufren un cambio radical cuando son removidas desde cultivo in vitro ya que son forzadas a cambiar de heterotroacuteficas a autotroacuteficas y la fotosiacutentesis se vuelve fundamental para la sobrevivencia Las hojas de las plantas in vitro no estaacuten formadas para hacer fotosiacutentesis ya que en la caacutemara de incubacioacuten no se produce un fuerte intercambio gaseoso esto debido a que la sacarosa es entregada a traveacutes del medio de cultivo Las hojas de las plantas que son trasladadas al campo o invernadero sufren deterioro debido a que no estaacuten formadas para la fijacioacuten de carbono Esto se produce por un tiempo aproximado de cuatro semanas despueacutes de las cuales las hojas nuevas suplen a las viejas Otro punto es que las hojas de las plantas cultivadas in vitro contienen menor proporcioacuten de clorofila que las plantas que han crecido normalmente en el campo En un estudio de coliflor cultivado in vitro se midioacute el CO2 y se obtuvo un balance negativo el cual se mantuvo durante dos semanas despueacutes del transplante Algo similar ocurrioacute con frutilla despueacutes del transplante las hojas se deterioraron raacutepidamente lo que quiere decir que no hubo incremento en la fijacioacuten de carbono indicando falta de desarrollo en la competencia fotosinteacutetica
El bajo nivel de CO2 durante el cultivo in vitro limita el proceso de fotosiacutentesis lo cual se puede compensar usando sacarosa en el medio de cultivo Tambieacuten se puede incrementar el nivel de luz y CO2 obteniendo un fuerte aumento en el crecimiento de varias especies como orquiacutedeas clavel etc (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 256 Sustrato Un sustrato es todo material soacutelido distinto del suelo natural mineral u orgaacutenico que colocado en un contenedor en forma pura o en mezcla permite el anclaje del sistema radicular de la planta desempentildeando por lo tanto un papel de soporte para la planta El sustrato puede intervenir o no en el complejo proceso de la nutricioacuten mineral de la planta (INFOAGRO 2007) El sustrato y los contenedores dentro de los cuales se van a transplantar las plaacutentulas in vitro son importantes para una buena sobrevivencia
Los sustratos ejercen una influencia significativa en la arquitectura del sistema radical de las plantas y en las asociaciones bioloacutegicas de este con el suelo influenciando el
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estado nutricional y la translocacioacuten de agua en el sistema suelo-planta-atmoacutesfera Uno de los requisitos fundamentales que debe cumplir el sustrato para su utilizacioacuten es la sanidad Cuando estos no se elaboran almacenan o manejan correctamente pueden contaminarse y provocar serios dantildeos a las plantas durante la aclimatacioacuten por esta razoacuten son preferidos como componentes para su elaboracioacuten materiales inertes o aquellos en las cuales el proceso de obtencioacuten garantice la mayor desinfeccioacuten posible
Uno de los factores de mayor importancia a la hora de seleccionar los materiales que pueden constituir el sustrato es su disponibilidad tanto en teacuterminos de facilidad de obtencioacuten o suministro como de su costo (VILCHEZ et al 2007)
La presencia de inhibidores o tambieacuten cambios en el pH del sustrato pueden afectar el crecimiento de las raiacuteces y consecuentemente el eacutexito del transplante
Muchos laboratorios y viveros transplantan a un sustrato uniforme debiendo ser eacuteste adecuado en cuanto a soporte de las plantas pH porosidad aireacioacuten y drenaje (DEBERGH y ZIMMERMAN 1991)
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3 MATERIAL Y MEacuteTODO
Para la realizacioacuten de este trabajo se utilizoacute el siguiente material y meacutetodo
31 Material La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio e invernadero de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal pertenecientes a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de Chile
311 Material vegetal Se utilizaron plaacutentulas de C virescens cultivadas in vitro a partir de semillas las cuales fueron proporcionadas por el laboratorio estas plaacutentulas fueron separadas y repicadas para aumentar la poblacioacuten y obtener la cantidad necesaria para el ensayo
FIGURA 2 Plaacutentulas de C virescens en caacutemara de crecimiento in vitro
312 Materiales Los materiales que se utilizaron fueron los siguientes Equipos autoclave caacutemara de flujo laminar dispensador de medios medidor
de pH agitador magneacutetico horno microondas balanza mechero termoacutemetro Materiales vasos de precipitado matraces probetas pipetas papel de
aluminio frascos de vidrio placas Petri pinzas bisturiacute macetas regadera Soluciones soluciones madre (Medio MS) gelificante etanol 70 y 95
32 Meacutetodo A continuacioacuten se da a conocer la metodologiacutea con la cual se trabajoacute 321 Preparacioacuten del medio de cultivo Para la obtencioacuten de plantas a traveacutes de la micropropagacioacuten se ocupoacute el medio basal de MURASHIGE y SKOOG (1962) tambieacuten llamado medio MS Este medio tiene un pH de entre 56-57 Posteriormente se dosificoacute con el dispensador de medios para que cada frasco tenga una cantidad adecuada (25 mL) y se llevoacute a autoclave para esterilizar a 12 atm 120ordm C por 20 min
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322 Obtencioacuten del material vegetal Al tener el medio esterilizado se procedioacute a la separacioacuten y repicado de plaacutentulas existentes en el laboratorio Las siembras se realizaron en el mes de mayo del 2007 Estas siembras se realizaron en la caacutemara de flujo laminar de modo de asegurar que la siembra sea 100 aseacuteptica Estas plaacutentulas fueron mantenidas en la caacutemara de incubacioacuten hasta obtener los tamantildeos requeridos para el ensayo donde las condiciones fueron las siguientes
minus Temperatura ambiental de 23-25ordm C minus Fotoperiacuteodo de 16 horas minus Intensidad lumiacutenica controlada de 50-55 micromol m-2s-1
323 Sustratos Se utilizaron tres tipos de sustratos el primero corresponde a una mezcla de turba + perlita (11) el segundo corresponde a Sphagnum (100) y el tercero corresponde a una mezcla de turba + arena (11) Una vez realizadas las mezclas se procedioacute a una esterilizacioacuten en un autoclave a 121ordm C por 20 minutos a 12 atmoacutesfera De esta forma se trabajoacute con material limpio y sano evitando ataque de hongos o bacterias El anaacutelisis quiacutemico de los sustratos se muestra en el Anexo 2 324 Plantacioacuten Las plaacutentulas con un promedio de cuatro meses en condiciones de caacutemara de crecimiento in vitro obtuvieron el tamantildeo adecuado para ser utilizadas Se sacaron de los frascos y se plantaron en las macetas de plaacutestico transparente con los sustratos Posteriormente fueron dejadas en la sala del laboratorio donde se debioacute asperjar con solucioacuten nutritiva Hoagland y fungicida Captan CUADRO 1 Composicioacuten de solucioacuten nutritiva Hoagland
KNO3 102 gL Ca(NO3) 4 H2 O 0492 gL
NH4H2 (PO4) 023 gL MgSO4 7 H2O 049 gL
H3BO3 286 mgL MnCl2 2 H2O 181 mgL CuSO4 5 H2O 008 mgL ZnSO4 5 H2O 022 mgL Na2MoO4 H2O 009 mgL
FeSO4 7 H2O 05 06 mL FUENTE FINCK 1988 325 Disentildeo de los ensayos Este trabajo de investigacioacuten constoacute de un ensayo con dos etapas Antes que todo se realizoacute la separacioacuten y repicado in vitro de plaacutentulas de C virescens para la obtencioacuten del nuacutemero necesario de plantas En la etapa 1 se utilizaron tres tamantildeos de plaacutentulas obtenidas in vitro de 1-2cm de 2-3cm y de maacutes de 3cm de altura que se transplantaron a tres sustratos turba + perlita 11(vv) Sphagnum (100) y turba + arena 11 (vv) La turba provino de la Sociedad
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Minera Patagonia Peat SA en Hijuelas el Sphagnum de la empresa Lonquen Chile de Puerto Montt y la perlita se obtuvo a traveacutes del sitio web wwwjardisencl (representante legal Walter Rathgeb Penza Ingeniero Agroacutenomo Santiago) Las plaacutentulas se plantaron de acuerdo a su tamantildeo las de maacutes de 3cm se colocaron de 6 por maceta las de 2 a 3cm de a 8 por maceta y las maacutes chicas de a 10 por maceta Estas macetas fueron dejadas en una sala de aclimatacioacuten con una temperatura promedio de 20ordm C intensidad lumiacutenica de 50-55 micromol m-2s-1 y 14-16 hrs de fotoperiacuteodo Se fertilizoacute asperjando cada cinco diacuteas con solucioacuten nutritiva Hoagland Esta etapa se llevoacute a cabo durante dos meses desde el cinco de septiembre hasta el cinco de noviembre de 2007
En la etapa 2 se continuoacute el proceso de aclimatacioacuten en invernadero de las plaacutentulas obtenidas en la etapa 1 que despueacutes de dos meses teniacutean un mayor tamantildeo y se habiacutean acondicionado al ambiente exterior (fuera de la caacutemara de crecimiento) Las plantas se mantuvieron en las macetas durante tres semanas para aclimatarlas y luego las plantas sobrevivientes fueron transplantadas a macetas maacutes grandes individuales durante tres meses aproximadamente hasta el cinco de marzo 2008 Estas nuevas macetas tuvieron como sustrato turba y suelo (trumao) en igual proporcioacuten (Anexo 2) La temperatura promedio de invernadero fluctuoacute de 13 a 35 degC seguacuten el mes En enero el promedio fue de 25 (Anexo 3) Para bajar la temperatura alrededor de 5deg C se instaloacute una malla Rachel 326 Disentildeo experimental El disentildeo experimental utilizado fue completamente al azar ordenado como experimento factorial con dos factores tamantildeo (3) y sustrato (3) Cada tratamiento tuvo tres repeticiones con un miacutenimo de 6 plantas por recipiente 327 Variables a evaluar Durante los dos meses en que las macetas estuvieron en la sala de aclimatacioacuten se evaluoacute el desarrollo foliar contando el nuacutemero de hojas una vez al mes Posteriormente se trasladaron las mismas macetas a invernadero durante tres semanas para continuar con la aclimatacioacuten de las plaacutentulas Transcurrido este tiempo se transplantaron las plaacutentulas sobrevivientes a macetas individuales y continuoacute mensualmente la evaluacioacuten de eacutestas (nuacutemero de hojas) hasta la obtencioacuten de plantas establecidas Al momento del transplante y al final del ensayo se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces asiacute como tambieacuten al final del ensayo de evaluoacute el crecimiento en altura (cm) La sobrevivencia fue evaluada al final del ensayo por maceta
Tanto en la sala de aclimatacioacuten coacutemo en el invernadero se registroacute la temperatura con la ayuda de un termoacutemetro de maacutexima y miacutenima (Anexo 3) 328 Anaacutelisis estadiacutestico Una vez obtenidos los datos se procedioacute a comprobar si estos cumpliacutean con los supuestos de aleatoriedad normalidad y homogeneidad de varianzas que exige este tipo de anaacutelisis En el caso de no cumplirse estos supuestos los datos se transformaron utilizando log10(x+05) raiacutez(x+05) o 1x para normalizarlos
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y enseguida se sometioacute los datos a un anaacutelisis estadiacutestico (ANDEVA) Posteriormente en los casos en que se observoacute diferencias significativas en el ANDEVA se aplicoacute una prueba de rangos muacuteltiples (Tukey) al 5 de significancia Para las variables no parameacutetricas que no cumplieron con los supuestos para un anaacutelisis de varianza se realizoacute la prueba de KruskalndashWallis y las comparaciones muacuteltiples a traveacutes del test de Dunn con un nivel de 5 de significancia
Se utilizaron los programas estadiacutesticos STATGRAPHICS 20 y GRAPHPAD PRISM 5 para el anaacutelisis de datos
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4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
En los siguientes puntos se discuten los resultados obtenidos en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens
En la Figura 3 se observan plaacutentulas de C virescens micropropagadas en medio MS en caacutemara de crecimiento al inicio del ensayo (A) y en invernadero despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten (B)
BA
FIGURA 3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten
A continuacioacuten se presentan los resultados obtenidos para las variables analizadas (Cuadro 2 y 3) de esta manera se pueden visualizar en general los resultados obtenidos en el proceso de aclimatacioacuten durante seis meses
CUADRO 2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de raiacuteces
inicial y final Variables
Hojas finales (nuacutemero)
Raiacuteces iniciales (nuacutemero)
Raiacuteces finales (nuacutemero)
Tamantildeo de plaacutentulas 36 24 37 47 29 46
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 61 43 76
Sustratos 53 36 56 43 29 51
Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 46 27 49
Significa que hay diferencias significativas al 95 Test de Dunn
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Las variables no parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en hojas finales y raiacuteces iniciales en sus rangos de distribucioacuten Las raiacuteces finales no presentaron diferencias seguacuten el sustrato utilizado pero de acuerdo al tamantildeo hubo diferencias en su distribucioacuten
CUADRO 3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas
Variables Altura final de plaacutentulas
(cm) Sobrevivencia
Tamantildeo de plaacutentulas
36 c 567 b 47 b 821 a
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 59 a 908 a
Sustratos 52 a 933 a
41 ab 59 b Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 49 b 772 a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY Las variables parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en altura final de hojas y en sobrevivencia 41 Nuacutemero de hojas finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentulas y de sustratos para la variable nuacutemero final de hojas 411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula Seguacuten el Cuadro 2 y Figura 4 las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero final de hojas Las plaacutentulas pequentildeas de 1-2 cm obtuvieron el nuacutemero maacutes bajo de hojas finales con una media de 36 hojas por plaacutentula lo cual es la mitad de las hojas finales que se obtuvo con las plaacutentulas de mayor tamantildeo (61 hojas aproximado por plaacutentula) Para las plaacutentulas medianas de 2-3 cm se obtuvo una media de 47 hojas por plaacutentula (Figura 4)
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Hojas finales
1-2 cm 2-3cm maacutes de 3 cm0
5
10
15
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn)
BLANCO (2006) sentildeala que plaacutentulas cultivadas in vitro crecen bajo condiciones especiales como alta humedad relativa y baja luminosidad ademaacutes son suplidas con sacarosa Estas condiciones fueron proporcionadas en una caacutemara de crecimiento en el laboratorio donde las plantas micropropagadas no son dependientes por completo de su fotosiacutentesis son heteroacutetrofas Parece ser necesario un estiacutemulo para convertirse en organismos totalmente capaces de sustentar sus propios requisitos de carbono y nitroacutegeno reducido pasando de esta manera a ser autoacutetrofos
Al ser sacadas de un medio in vitro las hojas no estaacuten preparadas para producir su propio alimento y sobreviven gracias a que el medio de cultivo le proporciona los nutrientes necesarios para vivir En este punto muchas de las hojas mueren y nacen hojas nuevas capaces de generar su alimento supliendo asiacute las hojas viejas (SEELYE et al 2003) En este ensayo las plaacutentulas de Chloraea virescens presentaron en general una buena adaptacioacuten al ser sacadas de un medio in vitro
Se observoacute que plaacutentulas con menor tamantildeo al ser aclimatadas y tener menor tejido fue maacutes difiacutecil y maacutes lento que empezaran a generar nuevos tejidos y materia orgaacutenica a partir de dioacutexido de carbono POSPIacuteŠILOVAacute et al (1999) sentildeala que al tener los estomas con desarrollo incompleto maacutes grandes y de forma maacutes redonda pierden maacutes agua lo cual puede provocar una peacuterdida de hojas muriendo asiacute la plaacutentula Por esta razoacuten las plaacutentulas pequentildeas se demoran maacutes tiempo en generar hojas nuevas es por ello que al finalizar este estudio muestran el menor nuacutemero final de hojas 412 Efecto del tipo de sustrato Al analizar la influencia del tipo de sustrato se encontraron diferencias significativas entre los tres sustratos utilizados Seguacuten el Cuadro 2 y la Figura 5 el sustrato donde se obtuvo mejores resultados fue
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turba+perlita en el cual se observoacute un promedio de 53 hojas por plaacutentula siendo Sphagnum el maacutes bajo con 43 hojas por plaacutentula De acuerdo a los resultados del anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados el sustrato turba+perlita tiene mayor cantidad de nitroacutegeno foacutesforo calcio magnesio y azufre disponible comparativamente con los otros dos sustratos (Sphagnum y arena+turba) (Anexo 2)
Hojas finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
Sustratos
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) Para la brotacioacuten y el crecimiento de las plantas se necesita agua y Nitroacutegeno lo que favorece a una mayor tasa de aparicioacuten de hojas lo que se traduce en una mayor cantidad de hojas finales El Nitroacutegeno se encuentra en mayor cantidad en el sustrato turba+perlita debido a lo cual los mejores resultados se obtienen en dicho sustrato 413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Despueacutes de analizados los efectos individuales del tamantildeo y del sustrato al interactuar ambos factores existen diferencias significativas La mejor interaccioacuten se obtuvo con el sustrato turba+perlita y con el mayor tamantildeo de la plaacutentula (Figura 6) Debido a la buena estructura (porosa) de dicho sustrato se podriacutea decir que se favorecioacute la absorcioacuten radicular de nutrientes obteniendo por ello un mayor nuacutemero de hojas finales Para los menores tamantildeos no se observan diferencias significativas obteniendo como promedio 41 hojas por plaacutentula Para el mayor tamantildeo el promedio fue de 6 hojas por plaacutentula
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Hojas finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 42 Raiacuteces iniciales Este paraacutemetro se evaluoacute luego de la primera etapa de aclimatacioacuten la cual se realizoacute en una sala de aclimatacioacuten del laboratorio Se analizoacute la influencia de diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos sobre la variable nuacutemero raiacuteces iniciales (Anaacutelisis de Kruskal-Wallis en Anexo 7)
FIGURA 7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses de pre aclimatacioacuten
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En la Figura 7 se puede observar los resultados de pre aclimatacioacuten en sala de laboratorio En esta etapa ya es posible ver la presencia de raiacuteces desarrolladas 421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula En el Cuadro 2 se puede observar que las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero inicial de raiacuteces y en la Figura 8 se puede comprobar que para los dos tamantildeos de plaacutentula maacutes pequentildeos no se observa gran cantidad de raiacuteces esto no impidioacute el desarrollo posterior de las plaacutentulas las cuales lograron enraizar al final del estudio Esto se contrapone a lo observado en un estudio de Lapageria rosea donde la presencia de raiacutez y brote para lograr una multiplicacioacuten exitosa de plantas es de vital importancia Incluso algunas plaacutentulas de L rosea no brotan en condiciones in vitro en donde tienen las mejores condiciones nutricionales y hormonales para hacerlo Esto se debe a factores internos de la plaacutentula siendo muy difiacutecil que broten inmediatamente en caacutemara de aclimatacioacuten donde ya dejan de recibir los nutrientes necesarios de manera directa y requieren de balances de energiacutea para poder seguir elongando raiacuteces absorber nutrientes y brotar para poder obtener los carbohidratos necesarios para seguir su crecimiento (BLANCO 2006) El tamantildeo de plaacutentula tiene importancia para el desarrollo de raiacuteces se distingue notoriamente que en los tamantildeos maacutes grandes el nuacutemero de raiacuteces es mayor comparativamente con los tamantildeos pequentildeos donde el nuacutemero de raiacuteces fue escaso Debido a la presencia de maacutes hojas existe una mayor cantidad de aacuterea fotosinteacutetica esta situacioacuten estimula el crecimiento de las raiacuteces para la obtencioacuten de agua y nutrientes
Raices iniciales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
2
4
6
8
10
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o inicial de ra
iacuteces
FIGURA 8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn)
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422 Efecto del tipo de sustrato Para el sustrato turba+perlita se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas en el nuacutemero de raiacuteces con respecto a los dos otros sustratos esto se puede ver en el Figura 9 donde se observa que se obtuvieron los mayores resultados En cualquier medio de crecimiento el espacio no ocupado por un soacutelido se llama porosidad este espacio puede ser ocupado en parte para retener agua y en parte para proporcionarle aire a las raiacuteces La ausencia de uno de estos elementos es perjudicial para las plantas La turba es conocida por tener estas propiedades y la perlita tambieacuten por esta razoacuten se sabe que la mezcla turba-perlita provee propiedades fiacutesicas excelentes como medio de crecimiento y propagacioacuten (INFOAGRO 2007) Estos resultados con turba-perlita (298 de materia orgaacutenica) coinciden con los obtenidos por DIAZ et al (2004) quienes al utilizar un sustrato compuesto por 100 de humus de lombriz para aclimatar cantildea de azuacutecar obtuvieron el mayor nuacutemero de raiacuteces Esto puede atribuirse al importante aporte de materia orgaacutenica del humus (47) lo que le confiere una mejor estructura obtenieacutendose una excelente porosidad del sustrato La aireacioacuten del suelo es necesaria para favorecer la maacutexima absorcioacuten de nutrientes por las raiacuteces Esto tambieacuten sucede en el sustrato turba+perlita el cual posee la mayor cantidad de materia orgaacutenica de los tres sustratos utilizados
Raices iniciales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
2
4
6
8
10
Sustratos
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato En los anaacutelisis para la variable nuacutemero de raiacuteces se puede decir que la mejor interaccioacuten se presentoacute para el sustrato de turba+perlita junto con el mayor tamantildeo de plaacutentulas obteniendo los valores maacutes altos entre los nueve tratamientos La presencia de raiacuteces luego de la micropropagacioacuten aumenta la posibilidad de eacutexito en el transplante ya que se crea un favorable balance de agua Pero esto no quiere
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decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
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Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
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En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
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El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
34
Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
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Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
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Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
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Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
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- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
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- INDICES
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- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
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- RESUMEN
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- Reacutesumeacute
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- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
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- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
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- 3 MATERIAL Y METODO
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- 31 Material
- 32 Meacutetodo
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- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
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- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
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- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
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- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
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2331 Siembra de las semillas Las semillas pueden ser recolectadas desde caacutepsulas verdes o maduras La caacutepsula verde que estaacute madurando estaacute llena de semillas y no se deforma cuando se aprieta con las pinzas Estas semillas pueden ser almacenadas por algunas semanas en un lugar refrigerado con bastante aireacioacuten Las semillas se pueden sembrar a partir de caacutepsulas verdes o semillas secas A continuacioacuten se muestran las ventajas y desventajas de ambos meacutetodos
- Siembra a partir de caacutepsulas verdes Si las caacutepsulas se mantienen intactas el interior (las semillas) se mantiene esteacuteril Por lo tanto si se esteriliza la parte exterior de las mismas donde hongos y bacterias pueden desarrollarse y se abren las caacutepsulas bajo condiciones esteacuteriles y las semillas podraacuten mantenerse desinfectadas
La ventaja de este meacutetodo es que no se requiere de esterilizacioacuten de las semillas lo que provoca su deterioro Otro punto a favor es que algunas semillas podriacutean germinar maacutes raacutepido que las provenientes de caacutepsulas maduras por los mecanismos de dormancia La desventaja es que en este caso todas las semillas deben ser utilizadas o eliminadas mientras que las semillas maduras se pueden almacenar Tambieacuten se debe considerar que las semillas sembradas a partir de caacutepsulas que no han madurado lo suficiente podriacutean germinar lentamente o simplemente no germinar - Siembra a partir de semillas secas En este caso una vez que la caacutepsula es abierta las semillas dejan de ser esteacuteriles y requieren de un proceso de esterilizacioacuten Comuacutenmente se utiliza una solucioacuten de hipoclorito de sodio hipoclorito de calcio o peroacutexido de hidroacutegeno Las semillas se agitan dentro de la solucioacuten que ademaacutes contiene una gota de detergente para ldquohumedecerlasrdquo luego se las enjuaga con agua destilada y se las siembra en el medio preparado La ventaja de este meacutetodo es que las semillas pueden ser colectadas secadas al aire almacenadas por varios meses en el refrigerador y utilizarlas cuando sea necesario Se debe considerar que la siembra ya sea de caacutepsulas verdes o de semillas secas estaacute determinado por la eacutepoca en que se colectan (McKENDRICK 2000) 234 Trasplante En la caacutemara de incubacioacuten las plaacutentulas se han desarrollado en condiciones limpias y en un ambiente cerrado por lo que deben acostumbrase gradualmente al ambiente exterior antes de ser trasplantadas a las macetas Tambieacuten la temperatura y la luz la cual es baja han sido constantes durante el cultivo in vitro En el medio natural la temperatura y la luz variacutean constantemente por lo que las nuevas plantas deben estar protegidas de la fuerte luz solar la cual puede quemar las hojas con soacutelo una pequentildea cantidad de eacutesta La humedad en los frascos es alta y las plantas estaacuten protegidas de ataques por hongos o bacterias Ademaacutes las plaacutentulas han crecido bajo condiciones de alta humedad y por lo tanto tendraacuten cutiacuteculas deacutebiles por lo que necesitan acostumbrase a medios menos huacutemedos antes de ser transplantadas
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Para el trasplante se deben colocar los frascos en un lugar protegido de la lluvia para que se aclimaticen a las nuevas condiciones de luz y temperatura Se deben dejar por 2 a 4 semanas en los frascos tapados Luego se debe ir aflojando las tapas para dejar entrar pequentildeas cantidades de aire hasta el punto de dejarlas descubiertas Se debe revisar si hay hojas marchitas y ver que el sustrato esteacute huacutemedo
Lo ideal es dejarlas sin tapa durante una semana antes de pasarlas a las macetas Para el trasplante se debe elegir un sustrato adecuado para el tipo de planta humedecerlo y transplantar las plantas con cuidado de no dantildear las raiacuteces y evitando la deshidratacioacuten En esta etapa tambieacuten se debe dejar las macetas selladas para evitar una raacutepida deshidratacioacuten e ir abrieacutendolas paulatinamente (McKENDRICK 2000)
24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas 241 Orquiacutedeas terrestres 2411 Cypripedium Esta es una orquiacutedea terrestre de zonas templadas se desarrolla en el Hemisferio Norte como por ejemplo en Guatemala y en Honduras pero donde se encuentra principalmente es en China Su forma maacutes comuacuten de propagacioacuten es in vitro a partir de semillas La forma maacutes eficiente es a partir de semillas inmaduras Existe un intervalo de tiempo entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten eacuteste dependeraacute de la especie y de la zona donde se desarrolle Se asume que existen aproximadamente cuatro semanas entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten El oacuteptimo para una buena germinacioacuten de Cypripedium es entre 42 y 60 diacuteas despueacutes de la polinizacioacuten y entre 14 y 32 diacuteas despueacutes de la fertilizacioacuten La germinacioacuten ocurre entre la segunda y cuarta semana despueacutes de ser sembradas y los protocormos deberiacutean ser cambiados de medio de cultivo cada dos a cuatro meses si no se corre el riesgo de sufrir agotamiento de nutrientes Los rizomas y las raiacuteces se empiezan a desarrollar a partir de los siete meses para luego dar lugar a las primeras hojas Para obtener un buen transplante se deben tener raiacuteces de miacutenimo un centiacutemetro de largo El desarrollo de raiacuteces se ve potenciado al tener un periacuteodo corto de bajas temperaturas (10degC) exposicioacuten a la luz reduccioacuten en la concentracioacuten de iones del medio de cultivo o transferirlas a un compost esteacuteril Al tener raiacuteces suficientes y el tamantildeo adecuado se podraacuten llevar las plantas al lugar donde creceraacuten definitivamente En el momento del transplante las plantas son muy susceptibles al desecamiento por lo cual lo ideal es que los brotes sean maacutes chicos que las raiacuteces El mejor sustrato seriacutea aquel donde crece naturalmente la orquiacutedea (RAumlNNBAumlCK 2007) 2412 Preservacioacuten in vitro de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes Este estudio fue hecho para establecer que parte de tejido es viable para la micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes del noreste de Europa pudiendo asiacute reestablecer dichas orquiacutedeas a sus aacutereas correspondientes La propagacioacuten in vitro de orquiacutedeas
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terrestres de clima templado es maacutes difiacutecil que las orquiacutedeas epiacutefitas de clima subtropical y tropical Las orquiacutedeas terrestres tienen requerimientos maacutes estrictos que las epiacutefitas y se conoce menos sobre sus necesidades especiacuteficas (VAASA y ROSENBERG 2004) En Estonia existen 36 especies de orquiacutedeas terrestres pero solo tres estaacuten bajo proteccioacuten Dactylorhiza baltica Dactylorhiza ruthei Dactylorhiza praetermissa Como explantes para este estudio en el caso de D baltica se ocuparon protocormos en los otros dos casos se utilizaron semillas semi maduras las cuales fueron colectadas siete y diez semanas despueacutes de ser polinizadas Para D baltica se ocupoacute el medio Murashige y Skoog suplementado con 05 mgL de aacutecido naftaleacuten aceacutetico (ANA) y 2 mgL de isonpentenyl adenina Para el caso de las semillas semi maduras se ocuparon los medios de Lindemann de Heller de Norstog y de Murashige y Skoog como control
La composicioacuten del medio y la madurez de las semillas influye mucho en el desarrollo de las orquiacutedeas in vitro Se ha demostrado que se necesita una alta concentracioacuten de microelementos para obtener una correcta germinacioacuten de las semillas Tambieacuten se puede decir que los primeros tres meses son los de mayor crecimiento luego de este tiempo el crecimiento se vuelve maacutes lento (VAASA y ROSENBERG 2004)
Luego de cuatro semanas de crecimiento de D baltica el 60 de los explantes de meristemas apicales empezaron a crecer en cambio los de meristemas laterales no expresaron ninguacuten tipo de crecimiento Las raiacuteces empezaron su desarrollo luego de dos meses despueacutes de la siembra
En el caso de D ruthei y D praetermissa la germinacioacuten se produjo despueacutes de dos meses desde la inoculacioacuten Luego de cuatro y seis meses el mayor crecimiento fue observado en el medio Norstog superando en 14 al medio testigo Murashige y Skoog (VAASA y ROSENBERG 2004)
2413 Longevidad de semillas de orquiacutedeas terrestres Por lo general las orquiacutedeas producen muchas pero pequentildeas semillas que contienen muy pocas reservas de alimento Dichas semillas estaacuten estructuralmente adaptadas para ser dispersadas por el viento pero poco se sabe del destino de eacutestas luego de ser dispersadas Algunos estudios de viabilidad de semillas indican una sobrevivencia de uno a dos antildeos en orquiacutedeas de clima templado Las semillas que son guardadas en laboratorio duran mucho maacutes tiempo Se estudioacute la viabilidad de siete especies de orquiacutedeas norteamericanas dentro de las cuales se encuentran Goodyera pubescens y Liparis liliifolia Las semillas de eacutestas se colocaron en bolsas con suelo y sustratos de bosques provenientes de sus haacutebitats naturales (WHIGHAM et al 2005) En Goodyera pubescens la mayoriacutea de las semillas germinaron en un antildeo Cuatro otras especies germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero algunas semillas no germinadas despueacutes de siete antildeos seguiacutean siendo viables En la especie Liparis liliifolia semillas que han estado cuatro antildeos bajo observacioacuten han tenido una tasa de
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germinacioacuten de un 68 al ser sembradas in vitro junto con el hongo micorriacutezico adecuado Las dos especies restantes no germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero las semillas fueron evaluadas como intactas y testeadas positivamente en cuanto a su viabilidad despueacutes de cuatro antildeos en el suelo Estas observaciones fueron interpretadas como diferentes estrategias para especies especiacuteficas de germinacioacuten in situ (WHIGHAM et al 2005) 2414 Sobrevivencia de orquiacutedeas terrestres transplantadas a sectores urbanos La conservacioacuten de poblaciones de orquiacutedeas silvestres depende del establecimiento de las orquiacutedeas propagadas a los campos Sin embargo se conoce muy poco de los factores bioacuteticos que influencian el establecimiento de orquiacutedeas terrestres a sus haacutebitats naturales Un experimento fue establecido para medir la sobrevivencia de seis especies durante su primer periacuteodo de crecimiento seguido del transplante a un sector urbano en Australia (SCADE et al 2006)
Las orquiacutedeas germinadas simbioacuteticamente crecieron en laboratorio durante cinco meses antes de establecer la plantacioacuten en sitios adyacentes con alta o baja cobertura de malezas Existioacute una muerte gradual de las plaacutentulas durante el primer periacuteodo de crecimiento primeramente por ataque de insectos no siendo evitado por la presencia de una malla cobertora Los iacutendices de sobrevivencia variacutean desde 49 para Microtis media una especie capaz de crecer en un ambiente atiacutepico hasta un 21 para Caladenia arenicola la orquiacutedea nativa maacutes comuacuten de esos sitios Sin embargo no todas las orquiacutedeas sobrevivientes producen tubeacuterculos por lo que la tasa de sobrevivencia despueacutes del primer periacuteodo seco disminuye
La sobrevivencia de las orquiacutedeas sembradas no puede ser comparada con orquiacutedeas de la misma especie que crecieron en los mismos lugares ya que no existioacute la presencia del hongo compatible para estas orquiacutedeas (SCADE et al 2006)
2415 Micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres En India dos orquiacutedeas muy importantes para la horticultura del geacutenero Anoectochilus fueron exitosamente propagadas Noacutedulos aislados de A sikkimensis colectadas en Himalaya y A regalis colectadas en India fueron cultivadas in vitro durante 12 semanas para obtener un maacuteximo de 48 a 56 protocormos y brotes obteniendo como resultado un 95 y 98 de eficiencia respectivamente Durante el repicado de los explantes in vitro de A regalis se observoacute que el nuacutemero total de brotes obtenidos a partir de noacutedulos fue 214 asiacute como tambieacuten 82 puntas de brotes En cambio para A sikkimensis fueron mucho maacutes bajos 123 y 43 respectivamente teniendo un crecimiento maacutes lento pero plantas maacutes fuertes Las raiacuteces de 4 a 6cm crecieron con la presencia de NAA (270 microM ) en el medio asiacute como tambieacuten con carbono activado (02) Durante la aclimatacioacuten la tasa de establecimiento fue entre 95 y 98 Luego de seis meses en invernadero las plantas de A regalis fueron transferidas a bosque nativo donde se obtuvo una tasa de
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sobrevivencia de entre 70 y 95 despueacutes de 12 meses Estas plantas establecidas en bosque nativo estaacuten libres de cualquier defecto morfoloacutegico y de crecimiento (GANGAPRASAD et al 2000) 242 Orquiacutedeas epiacutefitas Estas orquiacutedeas viven en los aacuterboles pero no obtienen de eacuteste su alimento no son paraacutesitas 2421 Preservacioacuten de Cattleya walkeriana usando propagacioacuten in vitro El geacutenero Cattleya se encuentra en Meacutexico y Ameacuterica Central asiacute como tambieacuten en Venezuela Colombia y las laderas de los Andes Esta orquiacutedea tambieacuten se encuentra en varias regiones del Brasil creciendo en aacuterboles rocas cerca de riacuteos lagos y pantanos Las flores de esta orquiacutedea son conocidas debido a su hermosura y a causa de la destruccioacuten de su haacutebitat y a la excesiva coleccioacuten de eacutestas se encuentra en extincioacuten
La composicioacuten del medio de cultivo es esencial para la propagacioacuten in vitro ya que suple todos los nutrientes necesarios para el desarrollo y seraacute distinto dependiendo de cada especie en este caso se utilizoacute la mitad de los macronutrientes del medio Muchos autores sugieren el uso de carboacuten activado en el medio ya que por lo general en muchas especies aumenta el desarrollo de las raiacuteces En este estudio se probaron distintas dosis de carboacuten activado 1 2 4 y 6gL con un pH de 6 (TADEU DE FARIA et al 2002) Las semillas se obtuvieron de flores artificialmente polinizadas en invernadero Plaacutentulas de aproximadamente un centiacutemetro fueron seleccionadas y cultivadas nuevamente en el medio de cultivo Murashige y Skoog pero esta vez con las diferentes dosis de carboacuten activado Se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces el nuacutemero de brotes y el peso de la materia verde total Durante el autoclavado se produce normalmente una hidroacutelisis de sacarina la cual es de 10 aproximadamente este porcentaje aumenta considerablemente al agregar un 1 de carboacuten activado llegando a ser de 95
El desarrollo de las plaacutentulas de C walkeriana aumentan con una mayor concentracioacuten de carboacuten activado asiacute como tambieacuten un mayor tiempo de cultivo El resultado fue que la dosis ideal para el desarrollo de esta orquiacutedea es 2gL de carboacuten activado (TADEU DE FARIA et al 2002) 2422 Establecimiento de cultivos in vitro y micropropagacioacuten de Cattleya aurantiaca (Bateman ex Lindl) Por medio de siembra in vitro se logroacute el establecimiento de C aurantiaca con alto porcentaje de germinacioacuten y desarrollo de protocormos Para la oacuteptima formacioacuten de callo y para la proliferacioacuten de protocormos se determinaron los medios oacuteptimos (MS 10 mgL ANA 10 mgL BA) asiacute como tambieacuten de manera directa sobre explantes de hoja y pseudobulbos (MS 01 mgL ANA 01 mgL GA3)
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Con este uacuteltimo medio tambieacuten se logroacute una oacuteptima regeneracioacuten y desarrollo de plaacutentulas Los medios liacutequidos (sin agitacioacuten) son una buena opcioacuten para conseguir la produccioacuten masiva de protocormos ya que con ellos se optimizoacute la micropropagacioacuten de C aurantiaca Las plaacutentulas micropropagadas presentaron alto porcentaje de sobrevivencia y buen desarrollo despueacutes de su trasplante y aclimatacioacuten lo cual demuestra que es un buen sistema de propagacioacuten para C aurantiaca (GUTIERREZ y SALGADO 2007) En cuanto a transplante y aclimatacioacuten despueacutes de 45 diacuteas de desarrollo in vitro las plaacutentulas de un tamantildeo entre 3 y 5 cm con raiacuteces bien desarrolladas fueron llevadas a condiciones ex vitro eliminando los restos de medio de cultivo con agua potable y ocupando un sustrato de partes iguales de tezontle y corteza de encino cubierta con hojarasca de encino finamente molida Se mantuvieron cubiertas durante 15 diacuteas abriendo cada dos diacuteas hasta poder retirar la tapa en 30 diacuteas Despueacutes de dos meses de haber sido retiradas del cultivo in vitro las plaacutentulas presentaron 70 de sobrevivencia y alcanzaron una altura de hasta 7 cm presentando nuevas hojas y raiacuteces las plantas se muestran vigorosas y capaces de continuar su crecimiento en condiciones ambientales de invernadero (GUTIERREZ y SALGADO 2007)
2423 Establecimiento in vitro y regeneracioacuten de plantas de Laelia autumnalis (Llave y Lex) Lindl Para este estudio se obtuvieron las semillas de una caacutepsula desarrollada despueacutes de 6 meses de la floracioacuten las cuales se sembraron in vitro sin presentar contaminacioacuten ya que la siembra por este meacutetodo es muy eficiente en comparacioacuten al cultivo de semillas libres donde algunas veces se presenta la contaminacioacuten Las observaciones se realizaron cada 15 diacuteas la germinacioacuten se detectoacute en los primeros 15 diacuteas en la mayoriacutea de los medios de cultivos probados con la presencia de protocormos de 1mm de diaacutemetro (HUAPEO y SALGADO 2004) El porcentaje de germinacioacuten que se obtuvo de las semillas cultivadas in vitro de L autumnalis fue de 95 a 100 en todos los medios de cultivo la uacutenica diferencia fue el tiempo entre las germinaciones A excepcioacuten de las semillas cultivadas en el medio MS 100 la germinacioacuten del 100 se obtuvo hasta los 30 diacuteas de cultivo mientras que en el primero la germinacioacuten fue a los 15 diacuteas del cultivo Las plaacutentulas con raiacutez y un par de hojas se lograron a los 90 diacuteas de cultivo en el medio MS 100 alcanzando 07 mm de altura Estas plaacutentulas fueron subcultivadas en medio MS con 05 mgl de ANA y 01 mgl de GA3 para tener plaacutentulas fuente de explante (segmentos de hojas) un medio oacuteptimo de desarrollo de plaacutentulas de L speciosa No fue necesario probar otros medios de cultivos ya que se hicieron pruebas anteriores que demostraron que era el adecuado
Las plaacutentulas de 6 meses de cultivo in vitro despueacutes de su germinacioacuten presentaron una altura promedio de 5 cm con raiacuteces con velamen y hasta dos pares de hojas Segmentos de hoja de eacutestas fueron cultivadas en el medio MS conteniendo ANA BA y GA3 en diferentes concentraciones y se realizaron observaciones cada 30 diacuteas para determinar medios inductores de callo protocormos y raiacuteces La mejor respuesta en formacioacuten de callo fue observada en los segmentos de hoja de plaacutentulas de L autumnalis cultivados en MS con 1 mgl de ANA BA y GA3 iniciando la induccioacuten de
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eacuteste desde los 30 diacuteas de cultivo solamente en un 70 de los explantes cultivados El 100 se logroacute a los 90 diacuteas de cultivo observando callo abundante alrededor de todo el tejido de color blanco con puntos pigmentados de color verde La regeneracioacuten de protocormos de esta orquiacutedea se establecioacute con la siembra de segmentos de hoja de plaacutentulas de 6 meses de edad de manera directa o a partir de callos En callos la produccioacuten fue oacuteptima en el medio MS con 01 mgl de ANABAGA3 ya que a los 60 diacuteas se obtuvieron 50 protocormos por segmento de callo Solamente se produjeron 10 protocormos por explante al cultivarse los segmentos de hoja en MS con 01 mgl de ANABAGA3 a los 120 diacuteas de cultivo (HUAPEO y SALGADO 2004) 25 Aclimatacioacuten Aclimatacioacuten significa que el hombre intercede y guiacutea el proceso de acondicionamiento de las plantas hasta que eacutestas sean aptas para crecer en el campo yo invernadero
Un alto nuacutemero de plantas micropropagadas no sobreviven al cambio desde el cultivo in vitro hacia el ambiente exterior ya sea en campo o invernadero Eacutestos dos uacuteltimos tienen menor humedad relativa niveles maacutes altos de luminosidad y un ambiente seacuteptico los cuales son maacutes estresantes para las plantas micropropagadas La mayoriacutea de las especies que crecen in vitro necesitan un proceso de aclimatacioacuten pudiendo obtener asiacute un nuacutemero suficiente de plantas vivas y vigorosas para trasplantar al suelo (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991)
La aclimatacioacuten no es uacutenicamente para micropropagacioacuten siendo usada ademaacutes en propagacioacuten convencional durante antildeos Despueacutes de cortar las hojas y de haber formado raiacuteces por lo general son aclimatadas antes de ser llevadas al campo o invernadero Ejemplos de dos teacutecnicas comunes son bajar gradualmente la humedad y mantener el nivel de luz con un 50 de sombra antes de trasladarlos al campo Las raiacuteces que han sido cortadas y mal limpiadas muchas veces son focos de infeccioacuten En estos casos las plantas muestran signos de marchitez hojas necrosadas y tambieacuten se puede llegar a la muerte de eacutestas El cultivo in vitro reduce la necesidad de fotosiacutentesis ya que las condiciones de la caacutemara de incubacioacuten proveen a la planta de sacarosa u otro azuacutecar Tambieacuten en estas condiciones se reduce el stress por patoacutegenos al ser un ambiente aseacuteptico Todo esto se traduce en que las plantas micropropagadas no son aptas para el campo yo invernadero (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 251 Stress hiacutedrico El stress hiacutedrico puede ser el resultado de una excesiva transpiracioacuten de las diferentes partes aeacutereas de las plantas especialmente de las hojas o por una inadecuada absorcioacuten de agua por parte de las raiacuteces La cutiacutecula y los estomas son la ruta primaria de peacuterdida de agua desde de las hojas provenientes de esta teacutecnica reproductiva 2511 Cutiacutecula La cutiacutecula es una membrana compuesta por una matriz de cutina que a su vez se encuentra cubierta en su superficie por ceras cuya funcioacuten primaria consiste en limitar la peacuterdida de agua por transpiracioacuten La permeabilidad del agua a traveacutes de la cutiacutecula se ve influenciada principalmente por la estructura y la cantidad de
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ceras cuticulares y epicuticulares no vieacutendose afectada la peacuterdida de agua por el grosor de eacutesta o la naturaleza quiacutemica de la matriz de la cutina La estructura cristalina de la parte encerada de las hojas es distinta en las plantas micropropagadas con respecto a las plantas que crecen en el campo La cera epicuticular de las hojas de plantas in vitro tienen una proporcioacuten maacutes alta de esteres y de componentes polares por el contrario tienen unas cadenas de hidrocarbonos mucho maacutes cortas Esto hace que las plantas in vitro pierdan maacutes agua que las cultivadas en campo o invernadero
Las plantas que han crecido en el campo son naturalmente de color verde pero el color de las plantas cultivadas in vitro es diferente y se puede ver a simple vista Las plantas que son pasadas a invernadero y que tengan un color verde se aclimatan de mejor forma al ambiente exterior (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 2512 Estomas La estructura estomaacutetica y su funcionamiento han sido implicados recurrentemente en el desbalance de agua exhibido por plantas micropropagadas al momento de ser removidas del cultivo in vitro Estudios con microscopiacutea de scanner electroacutenico han indicado que la estructura estomaacutetica presente en algunas especies de plantas cultivadas in vitro difieren marcadamente de las cultivadas en invernadero o en el suelo Debido a que las primeras presentan estomas de mayor tamantildeo y maacutes redondos a diferencia de las plantas cultivadas de manera normal que presentan estomas maacutes pequentildeos y eliacutepticos lo que resulta en una deshidratacioacuten maacutes raacutepida en el caso de las provenientes de cultivo in vitro (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 252 Humedad Debido a la anatomiacutea y la condicioacuten fisioloacutegica de las plantas desarrolladas in vitro donde se ha mantenido una alta humedad relativa es necesario regar al momento del traslado para obtener una alta sobrevivencia Muchos laboratorios aseguran que hay que evitar tener un sistema de aspersioacuten ya que se produce el ambiente necesario (muy huacutemedo) para la aparicioacuten de hongos algas o bacterias Otros meacutetodos incluyen el uso de humidificadores o poner las macetas en un lugar cerrado donde se retenga vapor para esto se pueden usar por ejemplo tapas de polietileno Este meacutetodo es relativamente econoacutemico pero se debe tener control del calor y monitorear la falta de agua (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 253 Luz Durante la etapa in vitro las plantas estaacuten expuestas a altos niveles de luminosidad lo que se traduce en hojas delgadas Antes del traslado se recomienda mantener las plantas con un 50 de sombra para asiacute poder aclimatarlas de mejor manera esto debido a que las plantas micropropagadas tienen un bajo control sobre la transpiracioacuten y un inadecuado mecanismo de fotosiacutentesis La sombra reduce la transpiracioacuten evitando excesivas peacuterdidas de agua asiacute como tambieacuten el exceso de luz destruye las moleacuteculas de clorofila Luego del periacuteodo bajo sombra se deben mover las macetas gradualmente hacia el nivel de luz al cual seraacute llevado para su crecimiento final (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 254 Temperatura La temperatura del aire y del medio o sustrato de crecimiento estaacute generalmente controlado durante el periacuteodo de aclimatacioacuten El calor es necesario en los meses de invierno y el friacuteo (enfriar) es esencial en los meses de verano Ajustando la cantidad de sombra y humedad se obtiene un control sobre la temperatura El
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enfriamiento se puede obtener gracias a ventilacioacuten abanicos niebla o aire acondicionado El calor puede provenir del sistema existente en el edificio o invernadero donde esteacuten ubicadas las macetas o por las laacutemparas ocupadas para el control del fotoperiacuteodo El rango de temperatura que se mantiene por lo general es entre los 13 y 30ordmC y esta determinado principalmente por la especie en cuestioacuten La temperatura de la zona donde se encuentran las raiacuteces es muy importante para el crecimiento lo ideal es que dicho sector tenga una mayor temperatura que el aire fomentando el crecimiento de las raiacuteces e incrementando la humedad alrededor de la planta Durante el verano esto es difiacutecil de obtener ya que la temperatura del aire es muy alta debido a la alta radiacioacuten solar Terminado el proceso de aclimatacioacuten esto ya no es necesario (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 255 Fotosiacutentesis Las plantas sufren un cambio radical cuando son removidas desde cultivo in vitro ya que son forzadas a cambiar de heterotroacuteficas a autotroacuteficas y la fotosiacutentesis se vuelve fundamental para la sobrevivencia Las hojas de las plantas in vitro no estaacuten formadas para hacer fotosiacutentesis ya que en la caacutemara de incubacioacuten no se produce un fuerte intercambio gaseoso esto debido a que la sacarosa es entregada a traveacutes del medio de cultivo Las hojas de las plantas que son trasladadas al campo o invernadero sufren deterioro debido a que no estaacuten formadas para la fijacioacuten de carbono Esto se produce por un tiempo aproximado de cuatro semanas despueacutes de las cuales las hojas nuevas suplen a las viejas Otro punto es que las hojas de las plantas cultivadas in vitro contienen menor proporcioacuten de clorofila que las plantas que han crecido normalmente en el campo En un estudio de coliflor cultivado in vitro se midioacute el CO2 y se obtuvo un balance negativo el cual se mantuvo durante dos semanas despueacutes del transplante Algo similar ocurrioacute con frutilla despueacutes del transplante las hojas se deterioraron raacutepidamente lo que quiere decir que no hubo incremento en la fijacioacuten de carbono indicando falta de desarrollo en la competencia fotosinteacutetica
El bajo nivel de CO2 durante el cultivo in vitro limita el proceso de fotosiacutentesis lo cual se puede compensar usando sacarosa en el medio de cultivo Tambieacuten se puede incrementar el nivel de luz y CO2 obteniendo un fuerte aumento en el crecimiento de varias especies como orquiacutedeas clavel etc (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 256 Sustrato Un sustrato es todo material soacutelido distinto del suelo natural mineral u orgaacutenico que colocado en un contenedor en forma pura o en mezcla permite el anclaje del sistema radicular de la planta desempentildeando por lo tanto un papel de soporte para la planta El sustrato puede intervenir o no en el complejo proceso de la nutricioacuten mineral de la planta (INFOAGRO 2007) El sustrato y los contenedores dentro de los cuales se van a transplantar las plaacutentulas in vitro son importantes para una buena sobrevivencia
Los sustratos ejercen una influencia significativa en la arquitectura del sistema radical de las plantas y en las asociaciones bioloacutegicas de este con el suelo influenciando el
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estado nutricional y la translocacioacuten de agua en el sistema suelo-planta-atmoacutesfera Uno de los requisitos fundamentales que debe cumplir el sustrato para su utilizacioacuten es la sanidad Cuando estos no se elaboran almacenan o manejan correctamente pueden contaminarse y provocar serios dantildeos a las plantas durante la aclimatacioacuten por esta razoacuten son preferidos como componentes para su elaboracioacuten materiales inertes o aquellos en las cuales el proceso de obtencioacuten garantice la mayor desinfeccioacuten posible
Uno de los factores de mayor importancia a la hora de seleccionar los materiales que pueden constituir el sustrato es su disponibilidad tanto en teacuterminos de facilidad de obtencioacuten o suministro como de su costo (VILCHEZ et al 2007)
La presencia de inhibidores o tambieacuten cambios en el pH del sustrato pueden afectar el crecimiento de las raiacuteces y consecuentemente el eacutexito del transplante
Muchos laboratorios y viveros transplantan a un sustrato uniforme debiendo ser eacuteste adecuado en cuanto a soporte de las plantas pH porosidad aireacioacuten y drenaje (DEBERGH y ZIMMERMAN 1991)
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3 MATERIAL Y MEacuteTODO
Para la realizacioacuten de este trabajo se utilizoacute el siguiente material y meacutetodo
31 Material La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio e invernadero de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal pertenecientes a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de Chile
311 Material vegetal Se utilizaron plaacutentulas de C virescens cultivadas in vitro a partir de semillas las cuales fueron proporcionadas por el laboratorio estas plaacutentulas fueron separadas y repicadas para aumentar la poblacioacuten y obtener la cantidad necesaria para el ensayo
FIGURA 2 Plaacutentulas de C virescens en caacutemara de crecimiento in vitro
312 Materiales Los materiales que se utilizaron fueron los siguientes Equipos autoclave caacutemara de flujo laminar dispensador de medios medidor
de pH agitador magneacutetico horno microondas balanza mechero termoacutemetro Materiales vasos de precipitado matraces probetas pipetas papel de
aluminio frascos de vidrio placas Petri pinzas bisturiacute macetas regadera Soluciones soluciones madre (Medio MS) gelificante etanol 70 y 95
32 Meacutetodo A continuacioacuten se da a conocer la metodologiacutea con la cual se trabajoacute 321 Preparacioacuten del medio de cultivo Para la obtencioacuten de plantas a traveacutes de la micropropagacioacuten se ocupoacute el medio basal de MURASHIGE y SKOOG (1962) tambieacuten llamado medio MS Este medio tiene un pH de entre 56-57 Posteriormente se dosificoacute con el dispensador de medios para que cada frasco tenga una cantidad adecuada (25 mL) y se llevoacute a autoclave para esterilizar a 12 atm 120ordm C por 20 min
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322 Obtencioacuten del material vegetal Al tener el medio esterilizado se procedioacute a la separacioacuten y repicado de plaacutentulas existentes en el laboratorio Las siembras se realizaron en el mes de mayo del 2007 Estas siembras se realizaron en la caacutemara de flujo laminar de modo de asegurar que la siembra sea 100 aseacuteptica Estas plaacutentulas fueron mantenidas en la caacutemara de incubacioacuten hasta obtener los tamantildeos requeridos para el ensayo donde las condiciones fueron las siguientes
minus Temperatura ambiental de 23-25ordm C minus Fotoperiacuteodo de 16 horas minus Intensidad lumiacutenica controlada de 50-55 micromol m-2s-1
323 Sustratos Se utilizaron tres tipos de sustratos el primero corresponde a una mezcla de turba + perlita (11) el segundo corresponde a Sphagnum (100) y el tercero corresponde a una mezcla de turba + arena (11) Una vez realizadas las mezclas se procedioacute a una esterilizacioacuten en un autoclave a 121ordm C por 20 minutos a 12 atmoacutesfera De esta forma se trabajoacute con material limpio y sano evitando ataque de hongos o bacterias El anaacutelisis quiacutemico de los sustratos se muestra en el Anexo 2 324 Plantacioacuten Las plaacutentulas con un promedio de cuatro meses en condiciones de caacutemara de crecimiento in vitro obtuvieron el tamantildeo adecuado para ser utilizadas Se sacaron de los frascos y se plantaron en las macetas de plaacutestico transparente con los sustratos Posteriormente fueron dejadas en la sala del laboratorio donde se debioacute asperjar con solucioacuten nutritiva Hoagland y fungicida Captan CUADRO 1 Composicioacuten de solucioacuten nutritiva Hoagland
KNO3 102 gL Ca(NO3) 4 H2 O 0492 gL
NH4H2 (PO4) 023 gL MgSO4 7 H2O 049 gL
H3BO3 286 mgL MnCl2 2 H2O 181 mgL CuSO4 5 H2O 008 mgL ZnSO4 5 H2O 022 mgL Na2MoO4 H2O 009 mgL
FeSO4 7 H2O 05 06 mL FUENTE FINCK 1988 325 Disentildeo de los ensayos Este trabajo de investigacioacuten constoacute de un ensayo con dos etapas Antes que todo se realizoacute la separacioacuten y repicado in vitro de plaacutentulas de C virescens para la obtencioacuten del nuacutemero necesario de plantas En la etapa 1 se utilizaron tres tamantildeos de plaacutentulas obtenidas in vitro de 1-2cm de 2-3cm y de maacutes de 3cm de altura que se transplantaron a tres sustratos turba + perlita 11(vv) Sphagnum (100) y turba + arena 11 (vv) La turba provino de la Sociedad
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Minera Patagonia Peat SA en Hijuelas el Sphagnum de la empresa Lonquen Chile de Puerto Montt y la perlita se obtuvo a traveacutes del sitio web wwwjardisencl (representante legal Walter Rathgeb Penza Ingeniero Agroacutenomo Santiago) Las plaacutentulas se plantaron de acuerdo a su tamantildeo las de maacutes de 3cm se colocaron de 6 por maceta las de 2 a 3cm de a 8 por maceta y las maacutes chicas de a 10 por maceta Estas macetas fueron dejadas en una sala de aclimatacioacuten con una temperatura promedio de 20ordm C intensidad lumiacutenica de 50-55 micromol m-2s-1 y 14-16 hrs de fotoperiacuteodo Se fertilizoacute asperjando cada cinco diacuteas con solucioacuten nutritiva Hoagland Esta etapa se llevoacute a cabo durante dos meses desde el cinco de septiembre hasta el cinco de noviembre de 2007
En la etapa 2 se continuoacute el proceso de aclimatacioacuten en invernadero de las plaacutentulas obtenidas en la etapa 1 que despueacutes de dos meses teniacutean un mayor tamantildeo y se habiacutean acondicionado al ambiente exterior (fuera de la caacutemara de crecimiento) Las plantas se mantuvieron en las macetas durante tres semanas para aclimatarlas y luego las plantas sobrevivientes fueron transplantadas a macetas maacutes grandes individuales durante tres meses aproximadamente hasta el cinco de marzo 2008 Estas nuevas macetas tuvieron como sustrato turba y suelo (trumao) en igual proporcioacuten (Anexo 2) La temperatura promedio de invernadero fluctuoacute de 13 a 35 degC seguacuten el mes En enero el promedio fue de 25 (Anexo 3) Para bajar la temperatura alrededor de 5deg C se instaloacute una malla Rachel 326 Disentildeo experimental El disentildeo experimental utilizado fue completamente al azar ordenado como experimento factorial con dos factores tamantildeo (3) y sustrato (3) Cada tratamiento tuvo tres repeticiones con un miacutenimo de 6 plantas por recipiente 327 Variables a evaluar Durante los dos meses en que las macetas estuvieron en la sala de aclimatacioacuten se evaluoacute el desarrollo foliar contando el nuacutemero de hojas una vez al mes Posteriormente se trasladaron las mismas macetas a invernadero durante tres semanas para continuar con la aclimatacioacuten de las plaacutentulas Transcurrido este tiempo se transplantaron las plaacutentulas sobrevivientes a macetas individuales y continuoacute mensualmente la evaluacioacuten de eacutestas (nuacutemero de hojas) hasta la obtencioacuten de plantas establecidas Al momento del transplante y al final del ensayo se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces asiacute como tambieacuten al final del ensayo de evaluoacute el crecimiento en altura (cm) La sobrevivencia fue evaluada al final del ensayo por maceta
Tanto en la sala de aclimatacioacuten coacutemo en el invernadero se registroacute la temperatura con la ayuda de un termoacutemetro de maacutexima y miacutenima (Anexo 3) 328 Anaacutelisis estadiacutestico Una vez obtenidos los datos se procedioacute a comprobar si estos cumpliacutean con los supuestos de aleatoriedad normalidad y homogeneidad de varianzas que exige este tipo de anaacutelisis En el caso de no cumplirse estos supuestos los datos se transformaron utilizando log10(x+05) raiacutez(x+05) o 1x para normalizarlos
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y enseguida se sometioacute los datos a un anaacutelisis estadiacutestico (ANDEVA) Posteriormente en los casos en que se observoacute diferencias significativas en el ANDEVA se aplicoacute una prueba de rangos muacuteltiples (Tukey) al 5 de significancia Para las variables no parameacutetricas que no cumplieron con los supuestos para un anaacutelisis de varianza se realizoacute la prueba de KruskalndashWallis y las comparaciones muacuteltiples a traveacutes del test de Dunn con un nivel de 5 de significancia
Se utilizaron los programas estadiacutesticos STATGRAPHICS 20 y GRAPHPAD PRISM 5 para el anaacutelisis de datos
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4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
En los siguientes puntos se discuten los resultados obtenidos en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens
En la Figura 3 se observan plaacutentulas de C virescens micropropagadas en medio MS en caacutemara de crecimiento al inicio del ensayo (A) y en invernadero despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten (B)
BA
FIGURA 3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten
A continuacioacuten se presentan los resultados obtenidos para las variables analizadas (Cuadro 2 y 3) de esta manera se pueden visualizar en general los resultados obtenidos en el proceso de aclimatacioacuten durante seis meses
CUADRO 2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de raiacuteces
inicial y final Variables
Hojas finales (nuacutemero)
Raiacuteces iniciales (nuacutemero)
Raiacuteces finales (nuacutemero)
Tamantildeo de plaacutentulas 36 24 37 47 29 46
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 61 43 76
Sustratos 53 36 56 43 29 51
Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 46 27 49
Significa que hay diferencias significativas al 95 Test de Dunn
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Las variables no parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en hojas finales y raiacuteces iniciales en sus rangos de distribucioacuten Las raiacuteces finales no presentaron diferencias seguacuten el sustrato utilizado pero de acuerdo al tamantildeo hubo diferencias en su distribucioacuten
CUADRO 3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas
Variables Altura final de plaacutentulas
(cm) Sobrevivencia
Tamantildeo de plaacutentulas
36 c 567 b 47 b 821 a
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 59 a 908 a
Sustratos 52 a 933 a
41 ab 59 b Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 49 b 772 a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY Las variables parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en altura final de hojas y en sobrevivencia 41 Nuacutemero de hojas finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentulas y de sustratos para la variable nuacutemero final de hojas 411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula Seguacuten el Cuadro 2 y Figura 4 las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero final de hojas Las plaacutentulas pequentildeas de 1-2 cm obtuvieron el nuacutemero maacutes bajo de hojas finales con una media de 36 hojas por plaacutentula lo cual es la mitad de las hojas finales que se obtuvo con las plaacutentulas de mayor tamantildeo (61 hojas aproximado por plaacutentula) Para las plaacutentulas medianas de 2-3 cm se obtuvo una media de 47 hojas por plaacutentula (Figura 4)
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Hojas finales
1-2 cm 2-3cm maacutes de 3 cm0
5
10
15
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn)
BLANCO (2006) sentildeala que plaacutentulas cultivadas in vitro crecen bajo condiciones especiales como alta humedad relativa y baja luminosidad ademaacutes son suplidas con sacarosa Estas condiciones fueron proporcionadas en una caacutemara de crecimiento en el laboratorio donde las plantas micropropagadas no son dependientes por completo de su fotosiacutentesis son heteroacutetrofas Parece ser necesario un estiacutemulo para convertirse en organismos totalmente capaces de sustentar sus propios requisitos de carbono y nitroacutegeno reducido pasando de esta manera a ser autoacutetrofos
Al ser sacadas de un medio in vitro las hojas no estaacuten preparadas para producir su propio alimento y sobreviven gracias a que el medio de cultivo le proporciona los nutrientes necesarios para vivir En este punto muchas de las hojas mueren y nacen hojas nuevas capaces de generar su alimento supliendo asiacute las hojas viejas (SEELYE et al 2003) En este ensayo las plaacutentulas de Chloraea virescens presentaron en general una buena adaptacioacuten al ser sacadas de un medio in vitro
Se observoacute que plaacutentulas con menor tamantildeo al ser aclimatadas y tener menor tejido fue maacutes difiacutecil y maacutes lento que empezaran a generar nuevos tejidos y materia orgaacutenica a partir de dioacutexido de carbono POSPIacuteŠILOVAacute et al (1999) sentildeala que al tener los estomas con desarrollo incompleto maacutes grandes y de forma maacutes redonda pierden maacutes agua lo cual puede provocar una peacuterdida de hojas muriendo asiacute la plaacutentula Por esta razoacuten las plaacutentulas pequentildeas se demoran maacutes tiempo en generar hojas nuevas es por ello que al finalizar este estudio muestran el menor nuacutemero final de hojas 412 Efecto del tipo de sustrato Al analizar la influencia del tipo de sustrato se encontraron diferencias significativas entre los tres sustratos utilizados Seguacuten el Cuadro 2 y la Figura 5 el sustrato donde se obtuvo mejores resultados fue
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turba+perlita en el cual se observoacute un promedio de 53 hojas por plaacutentula siendo Sphagnum el maacutes bajo con 43 hojas por plaacutentula De acuerdo a los resultados del anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados el sustrato turba+perlita tiene mayor cantidad de nitroacutegeno foacutesforo calcio magnesio y azufre disponible comparativamente con los otros dos sustratos (Sphagnum y arena+turba) (Anexo 2)
Hojas finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
Sustratos
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) Para la brotacioacuten y el crecimiento de las plantas se necesita agua y Nitroacutegeno lo que favorece a una mayor tasa de aparicioacuten de hojas lo que se traduce en una mayor cantidad de hojas finales El Nitroacutegeno se encuentra en mayor cantidad en el sustrato turba+perlita debido a lo cual los mejores resultados se obtienen en dicho sustrato 413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Despueacutes de analizados los efectos individuales del tamantildeo y del sustrato al interactuar ambos factores existen diferencias significativas La mejor interaccioacuten se obtuvo con el sustrato turba+perlita y con el mayor tamantildeo de la plaacutentula (Figura 6) Debido a la buena estructura (porosa) de dicho sustrato se podriacutea decir que se favorecioacute la absorcioacuten radicular de nutrientes obteniendo por ello un mayor nuacutemero de hojas finales Para los menores tamantildeos no se observan diferencias significativas obteniendo como promedio 41 hojas por plaacutentula Para el mayor tamantildeo el promedio fue de 6 hojas por plaacutentula
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Hojas finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 42 Raiacuteces iniciales Este paraacutemetro se evaluoacute luego de la primera etapa de aclimatacioacuten la cual se realizoacute en una sala de aclimatacioacuten del laboratorio Se analizoacute la influencia de diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos sobre la variable nuacutemero raiacuteces iniciales (Anaacutelisis de Kruskal-Wallis en Anexo 7)
FIGURA 7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses de pre aclimatacioacuten
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En la Figura 7 se puede observar los resultados de pre aclimatacioacuten en sala de laboratorio En esta etapa ya es posible ver la presencia de raiacuteces desarrolladas 421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula En el Cuadro 2 se puede observar que las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero inicial de raiacuteces y en la Figura 8 se puede comprobar que para los dos tamantildeos de plaacutentula maacutes pequentildeos no se observa gran cantidad de raiacuteces esto no impidioacute el desarrollo posterior de las plaacutentulas las cuales lograron enraizar al final del estudio Esto se contrapone a lo observado en un estudio de Lapageria rosea donde la presencia de raiacutez y brote para lograr una multiplicacioacuten exitosa de plantas es de vital importancia Incluso algunas plaacutentulas de L rosea no brotan en condiciones in vitro en donde tienen las mejores condiciones nutricionales y hormonales para hacerlo Esto se debe a factores internos de la plaacutentula siendo muy difiacutecil que broten inmediatamente en caacutemara de aclimatacioacuten donde ya dejan de recibir los nutrientes necesarios de manera directa y requieren de balances de energiacutea para poder seguir elongando raiacuteces absorber nutrientes y brotar para poder obtener los carbohidratos necesarios para seguir su crecimiento (BLANCO 2006) El tamantildeo de plaacutentula tiene importancia para el desarrollo de raiacuteces se distingue notoriamente que en los tamantildeos maacutes grandes el nuacutemero de raiacuteces es mayor comparativamente con los tamantildeos pequentildeos donde el nuacutemero de raiacuteces fue escaso Debido a la presencia de maacutes hojas existe una mayor cantidad de aacuterea fotosinteacutetica esta situacioacuten estimula el crecimiento de las raiacuteces para la obtencioacuten de agua y nutrientes
Raices iniciales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
2
4
6
8
10
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o inicial de ra
iacuteces
FIGURA 8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn)
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422 Efecto del tipo de sustrato Para el sustrato turba+perlita se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas en el nuacutemero de raiacuteces con respecto a los dos otros sustratos esto se puede ver en el Figura 9 donde se observa que se obtuvieron los mayores resultados En cualquier medio de crecimiento el espacio no ocupado por un soacutelido se llama porosidad este espacio puede ser ocupado en parte para retener agua y en parte para proporcionarle aire a las raiacuteces La ausencia de uno de estos elementos es perjudicial para las plantas La turba es conocida por tener estas propiedades y la perlita tambieacuten por esta razoacuten se sabe que la mezcla turba-perlita provee propiedades fiacutesicas excelentes como medio de crecimiento y propagacioacuten (INFOAGRO 2007) Estos resultados con turba-perlita (298 de materia orgaacutenica) coinciden con los obtenidos por DIAZ et al (2004) quienes al utilizar un sustrato compuesto por 100 de humus de lombriz para aclimatar cantildea de azuacutecar obtuvieron el mayor nuacutemero de raiacuteces Esto puede atribuirse al importante aporte de materia orgaacutenica del humus (47) lo que le confiere una mejor estructura obtenieacutendose una excelente porosidad del sustrato La aireacioacuten del suelo es necesaria para favorecer la maacutexima absorcioacuten de nutrientes por las raiacuteces Esto tambieacuten sucede en el sustrato turba+perlita el cual posee la mayor cantidad de materia orgaacutenica de los tres sustratos utilizados
Raices iniciales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
2
4
6
8
10
Sustratos
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato En los anaacutelisis para la variable nuacutemero de raiacuteces se puede decir que la mejor interaccioacuten se presentoacute para el sustrato de turba+perlita junto con el mayor tamantildeo de plaacutentulas obteniendo los valores maacutes altos entre los nueve tratamientos La presencia de raiacuteces luego de la micropropagacioacuten aumenta la posibilidad de eacutexito en el transplante ya que se crea un favorable balance de agua Pero esto no quiere
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decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
10
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
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En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
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El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
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Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
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Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
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- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
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- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
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- 3 MATERIAL Y METODO
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- 31 Material
- 32 Meacutetodo
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- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
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- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
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- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
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- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
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Para el trasplante se deben colocar los frascos en un lugar protegido de la lluvia para que se aclimaticen a las nuevas condiciones de luz y temperatura Se deben dejar por 2 a 4 semanas en los frascos tapados Luego se debe ir aflojando las tapas para dejar entrar pequentildeas cantidades de aire hasta el punto de dejarlas descubiertas Se debe revisar si hay hojas marchitas y ver que el sustrato esteacute huacutemedo
Lo ideal es dejarlas sin tapa durante una semana antes de pasarlas a las macetas Para el trasplante se debe elegir un sustrato adecuado para el tipo de planta humedecerlo y transplantar las plantas con cuidado de no dantildear las raiacuteces y evitando la deshidratacioacuten En esta etapa tambieacuten se debe dejar las macetas selladas para evitar una raacutepida deshidratacioacuten e ir abrieacutendolas paulatinamente (McKENDRICK 2000)
24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas 241 Orquiacutedeas terrestres 2411 Cypripedium Esta es una orquiacutedea terrestre de zonas templadas se desarrolla en el Hemisferio Norte como por ejemplo en Guatemala y en Honduras pero donde se encuentra principalmente es en China Su forma maacutes comuacuten de propagacioacuten es in vitro a partir de semillas La forma maacutes eficiente es a partir de semillas inmaduras Existe un intervalo de tiempo entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten eacuteste dependeraacute de la especie y de la zona donde se desarrolle Se asume que existen aproximadamente cuatro semanas entre la polinizacioacuten y la fertilizacioacuten El oacuteptimo para una buena germinacioacuten de Cypripedium es entre 42 y 60 diacuteas despueacutes de la polinizacioacuten y entre 14 y 32 diacuteas despueacutes de la fertilizacioacuten La germinacioacuten ocurre entre la segunda y cuarta semana despueacutes de ser sembradas y los protocormos deberiacutean ser cambiados de medio de cultivo cada dos a cuatro meses si no se corre el riesgo de sufrir agotamiento de nutrientes Los rizomas y las raiacuteces se empiezan a desarrollar a partir de los siete meses para luego dar lugar a las primeras hojas Para obtener un buen transplante se deben tener raiacuteces de miacutenimo un centiacutemetro de largo El desarrollo de raiacuteces se ve potenciado al tener un periacuteodo corto de bajas temperaturas (10degC) exposicioacuten a la luz reduccioacuten en la concentracioacuten de iones del medio de cultivo o transferirlas a un compost esteacuteril Al tener raiacuteces suficientes y el tamantildeo adecuado se podraacuten llevar las plantas al lugar donde creceraacuten definitivamente En el momento del transplante las plantas son muy susceptibles al desecamiento por lo cual lo ideal es que los brotes sean maacutes chicos que las raiacuteces El mejor sustrato seriacutea aquel donde crece naturalmente la orquiacutedea (RAumlNNBAumlCK 2007) 2412 Preservacioacuten in vitro de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes Este estudio fue hecho para establecer que parte de tejido es viable para la micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres poco frecuentes del noreste de Europa pudiendo asiacute reestablecer dichas orquiacutedeas a sus aacutereas correspondientes La propagacioacuten in vitro de orquiacutedeas
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terrestres de clima templado es maacutes difiacutecil que las orquiacutedeas epiacutefitas de clima subtropical y tropical Las orquiacutedeas terrestres tienen requerimientos maacutes estrictos que las epiacutefitas y se conoce menos sobre sus necesidades especiacuteficas (VAASA y ROSENBERG 2004) En Estonia existen 36 especies de orquiacutedeas terrestres pero solo tres estaacuten bajo proteccioacuten Dactylorhiza baltica Dactylorhiza ruthei Dactylorhiza praetermissa Como explantes para este estudio en el caso de D baltica se ocuparon protocormos en los otros dos casos se utilizaron semillas semi maduras las cuales fueron colectadas siete y diez semanas despueacutes de ser polinizadas Para D baltica se ocupoacute el medio Murashige y Skoog suplementado con 05 mgL de aacutecido naftaleacuten aceacutetico (ANA) y 2 mgL de isonpentenyl adenina Para el caso de las semillas semi maduras se ocuparon los medios de Lindemann de Heller de Norstog y de Murashige y Skoog como control
La composicioacuten del medio y la madurez de las semillas influye mucho en el desarrollo de las orquiacutedeas in vitro Se ha demostrado que se necesita una alta concentracioacuten de microelementos para obtener una correcta germinacioacuten de las semillas Tambieacuten se puede decir que los primeros tres meses son los de mayor crecimiento luego de este tiempo el crecimiento se vuelve maacutes lento (VAASA y ROSENBERG 2004)
Luego de cuatro semanas de crecimiento de D baltica el 60 de los explantes de meristemas apicales empezaron a crecer en cambio los de meristemas laterales no expresaron ninguacuten tipo de crecimiento Las raiacuteces empezaron su desarrollo luego de dos meses despueacutes de la siembra
En el caso de D ruthei y D praetermissa la germinacioacuten se produjo despueacutes de dos meses desde la inoculacioacuten Luego de cuatro y seis meses el mayor crecimiento fue observado en el medio Norstog superando en 14 al medio testigo Murashige y Skoog (VAASA y ROSENBERG 2004)
2413 Longevidad de semillas de orquiacutedeas terrestres Por lo general las orquiacutedeas producen muchas pero pequentildeas semillas que contienen muy pocas reservas de alimento Dichas semillas estaacuten estructuralmente adaptadas para ser dispersadas por el viento pero poco se sabe del destino de eacutestas luego de ser dispersadas Algunos estudios de viabilidad de semillas indican una sobrevivencia de uno a dos antildeos en orquiacutedeas de clima templado Las semillas que son guardadas en laboratorio duran mucho maacutes tiempo Se estudioacute la viabilidad de siete especies de orquiacutedeas norteamericanas dentro de las cuales se encuentran Goodyera pubescens y Liparis liliifolia Las semillas de eacutestas se colocaron en bolsas con suelo y sustratos de bosques provenientes de sus haacutebitats naturales (WHIGHAM et al 2005) En Goodyera pubescens la mayoriacutea de las semillas germinaron en un antildeo Cuatro otras especies germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero algunas semillas no germinadas despueacutes de siete antildeos seguiacutean siendo viables En la especie Liparis liliifolia semillas que han estado cuatro antildeos bajo observacioacuten han tenido una tasa de
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germinacioacuten de un 68 al ser sembradas in vitro junto con el hongo micorriacutezico adecuado Las dos especies restantes no germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero las semillas fueron evaluadas como intactas y testeadas positivamente en cuanto a su viabilidad despueacutes de cuatro antildeos en el suelo Estas observaciones fueron interpretadas como diferentes estrategias para especies especiacuteficas de germinacioacuten in situ (WHIGHAM et al 2005) 2414 Sobrevivencia de orquiacutedeas terrestres transplantadas a sectores urbanos La conservacioacuten de poblaciones de orquiacutedeas silvestres depende del establecimiento de las orquiacutedeas propagadas a los campos Sin embargo se conoce muy poco de los factores bioacuteticos que influencian el establecimiento de orquiacutedeas terrestres a sus haacutebitats naturales Un experimento fue establecido para medir la sobrevivencia de seis especies durante su primer periacuteodo de crecimiento seguido del transplante a un sector urbano en Australia (SCADE et al 2006)
Las orquiacutedeas germinadas simbioacuteticamente crecieron en laboratorio durante cinco meses antes de establecer la plantacioacuten en sitios adyacentes con alta o baja cobertura de malezas Existioacute una muerte gradual de las plaacutentulas durante el primer periacuteodo de crecimiento primeramente por ataque de insectos no siendo evitado por la presencia de una malla cobertora Los iacutendices de sobrevivencia variacutean desde 49 para Microtis media una especie capaz de crecer en un ambiente atiacutepico hasta un 21 para Caladenia arenicola la orquiacutedea nativa maacutes comuacuten de esos sitios Sin embargo no todas las orquiacutedeas sobrevivientes producen tubeacuterculos por lo que la tasa de sobrevivencia despueacutes del primer periacuteodo seco disminuye
La sobrevivencia de las orquiacutedeas sembradas no puede ser comparada con orquiacutedeas de la misma especie que crecieron en los mismos lugares ya que no existioacute la presencia del hongo compatible para estas orquiacutedeas (SCADE et al 2006)
2415 Micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres En India dos orquiacutedeas muy importantes para la horticultura del geacutenero Anoectochilus fueron exitosamente propagadas Noacutedulos aislados de A sikkimensis colectadas en Himalaya y A regalis colectadas en India fueron cultivadas in vitro durante 12 semanas para obtener un maacuteximo de 48 a 56 protocormos y brotes obteniendo como resultado un 95 y 98 de eficiencia respectivamente Durante el repicado de los explantes in vitro de A regalis se observoacute que el nuacutemero total de brotes obtenidos a partir de noacutedulos fue 214 asiacute como tambieacuten 82 puntas de brotes En cambio para A sikkimensis fueron mucho maacutes bajos 123 y 43 respectivamente teniendo un crecimiento maacutes lento pero plantas maacutes fuertes Las raiacuteces de 4 a 6cm crecieron con la presencia de NAA (270 microM ) en el medio asiacute como tambieacuten con carbono activado (02) Durante la aclimatacioacuten la tasa de establecimiento fue entre 95 y 98 Luego de seis meses en invernadero las plantas de A regalis fueron transferidas a bosque nativo donde se obtuvo una tasa de
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sobrevivencia de entre 70 y 95 despueacutes de 12 meses Estas plantas establecidas en bosque nativo estaacuten libres de cualquier defecto morfoloacutegico y de crecimiento (GANGAPRASAD et al 2000) 242 Orquiacutedeas epiacutefitas Estas orquiacutedeas viven en los aacuterboles pero no obtienen de eacuteste su alimento no son paraacutesitas 2421 Preservacioacuten de Cattleya walkeriana usando propagacioacuten in vitro El geacutenero Cattleya se encuentra en Meacutexico y Ameacuterica Central asiacute como tambieacuten en Venezuela Colombia y las laderas de los Andes Esta orquiacutedea tambieacuten se encuentra en varias regiones del Brasil creciendo en aacuterboles rocas cerca de riacuteos lagos y pantanos Las flores de esta orquiacutedea son conocidas debido a su hermosura y a causa de la destruccioacuten de su haacutebitat y a la excesiva coleccioacuten de eacutestas se encuentra en extincioacuten
La composicioacuten del medio de cultivo es esencial para la propagacioacuten in vitro ya que suple todos los nutrientes necesarios para el desarrollo y seraacute distinto dependiendo de cada especie en este caso se utilizoacute la mitad de los macronutrientes del medio Muchos autores sugieren el uso de carboacuten activado en el medio ya que por lo general en muchas especies aumenta el desarrollo de las raiacuteces En este estudio se probaron distintas dosis de carboacuten activado 1 2 4 y 6gL con un pH de 6 (TADEU DE FARIA et al 2002) Las semillas se obtuvieron de flores artificialmente polinizadas en invernadero Plaacutentulas de aproximadamente un centiacutemetro fueron seleccionadas y cultivadas nuevamente en el medio de cultivo Murashige y Skoog pero esta vez con las diferentes dosis de carboacuten activado Se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces el nuacutemero de brotes y el peso de la materia verde total Durante el autoclavado se produce normalmente una hidroacutelisis de sacarina la cual es de 10 aproximadamente este porcentaje aumenta considerablemente al agregar un 1 de carboacuten activado llegando a ser de 95
El desarrollo de las plaacutentulas de C walkeriana aumentan con una mayor concentracioacuten de carboacuten activado asiacute como tambieacuten un mayor tiempo de cultivo El resultado fue que la dosis ideal para el desarrollo de esta orquiacutedea es 2gL de carboacuten activado (TADEU DE FARIA et al 2002) 2422 Establecimiento de cultivos in vitro y micropropagacioacuten de Cattleya aurantiaca (Bateman ex Lindl) Por medio de siembra in vitro se logroacute el establecimiento de C aurantiaca con alto porcentaje de germinacioacuten y desarrollo de protocormos Para la oacuteptima formacioacuten de callo y para la proliferacioacuten de protocormos se determinaron los medios oacuteptimos (MS 10 mgL ANA 10 mgL BA) asiacute como tambieacuten de manera directa sobre explantes de hoja y pseudobulbos (MS 01 mgL ANA 01 mgL GA3)
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Con este uacuteltimo medio tambieacuten se logroacute una oacuteptima regeneracioacuten y desarrollo de plaacutentulas Los medios liacutequidos (sin agitacioacuten) son una buena opcioacuten para conseguir la produccioacuten masiva de protocormos ya que con ellos se optimizoacute la micropropagacioacuten de C aurantiaca Las plaacutentulas micropropagadas presentaron alto porcentaje de sobrevivencia y buen desarrollo despueacutes de su trasplante y aclimatacioacuten lo cual demuestra que es un buen sistema de propagacioacuten para C aurantiaca (GUTIERREZ y SALGADO 2007) En cuanto a transplante y aclimatacioacuten despueacutes de 45 diacuteas de desarrollo in vitro las plaacutentulas de un tamantildeo entre 3 y 5 cm con raiacuteces bien desarrolladas fueron llevadas a condiciones ex vitro eliminando los restos de medio de cultivo con agua potable y ocupando un sustrato de partes iguales de tezontle y corteza de encino cubierta con hojarasca de encino finamente molida Se mantuvieron cubiertas durante 15 diacuteas abriendo cada dos diacuteas hasta poder retirar la tapa en 30 diacuteas Despueacutes de dos meses de haber sido retiradas del cultivo in vitro las plaacutentulas presentaron 70 de sobrevivencia y alcanzaron una altura de hasta 7 cm presentando nuevas hojas y raiacuteces las plantas se muestran vigorosas y capaces de continuar su crecimiento en condiciones ambientales de invernadero (GUTIERREZ y SALGADO 2007)
2423 Establecimiento in vitro y regeneracioacuten de plantas de Laelia autumnalis (Llave y Lex) Lindl Para este estudio se obtuvieron las semillas de una caacutepsula desarrollada despueacutes de 6 meses de la floracioacuten las cuales se sembraron in vitro sin presentar contaminacioacuten ya que la siembra por este meacutetodo es muy eficiente en comparacioacuten al cultivo de semillas libres donde algunas veces se presenta la contaminacioacuten Las observaciones se realizaron cada 15 diacuteas la germinacioacuten se detectoacute en los primeros 15 diacuteas en la mayoriacutea de los medios de cultivos probados con la presencia de protocormos de 1mm de diaacutemetro (HUAPEO y SALGADO 2004) El porcentaje de germinacioacuten que se obtuvo de las semillas cultivadas in vitro de L autumnalis fue de 95 a 100 en todos los medios de cultivo la uacutenica diferencia fue el tiempo entre las germinaciones A excepcioacuten de las semillas cultivadas en el medio MS 100 la germinacioacuten del 100 se obtuvo hasta los 30 diacuteas de cultivo mientras que en el primero la germinacioacuten fue a los 15 diacuteas del cultivo Las plaacutentulas con raiacutez y un par de hojas se lograron a los 90 diacuteas de cultivo en el medio MS 100 alcanzando 07 mm de altura Estas plaacutentulas fueron subcultivadas en medio MS con 05 mgl de ANA y 01 mgl de GA3 para tener plaacutentulas fuente de explante (segmentos de hojas) un medio oacuteptimo de desarrollo de plaacutentulas de L speciosa No fue necesario probar otros medios de cultivos ya que se hicieron pruebas anteriores que demostraron que era el adecuado
Las plaacutentulas de 6 meses de cultivo in vitro despueacutes de su germinacioacuten presentaron una altura promedio de 5 cm con raiacuteces con velamen y hasta dos pares de hojas Segmentos de hoja de eacutestas fueron cultivadas en el medio MS conteniendo ANA BA y GA3 en diferentes concentraciones y se realizaron observaciones cada 30 diacuteas para determinar medios inductores de callo protocormos y raiacuteces La mejor respuesta en formacioacuten de callo fue observada en los segmentos de hoja de plaacutentulas de L autumnalis cultivados en MS con 1 mgl de ANA BA y GA3 iniciando la induccioacuten de
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eacuteste desde los 30 diacuteas de cultivo solamente en un 70 de los explantes cultivados El 100 se logroacute a los 90 diacuteas de cultivo observando callo abundante alrededor de todo el tejido de color blanco con puntos pigmentados de color verde La regeneracioacuten de protocormos de esta orquiacutedea se establecioacute con la siembra de segmentos de hoja de plaacutentulas de 6 meses de edad de manera directa o a partir de callos En callos la produccioacuten fue oacuteptima en el medio MS con 01 mgl de ANABAGA3 ya que a los 60 diacuteas se obtuvieron 50 protocormos por segmento de callo Solamente se produjeron 10 protocormos por explante al cultivarse los segmentos de hoja en MS con 01 mgl de ANABAGA3 a los 120 diacuteas de cultivo (HUAPEO y SALGADO 2004) 25 Aclimatacioacuten Aclimatacioacuten significa que el hombre intercede y guiacutea el proceso de acondicionamiento de las plantas hasta que eacutestas sean aptas para crecer en el campo yo invernadero
Un alto nuacutemero de plantas micropropagadas no sobreviven al cambio desde el cultivo in vitro hacia el ambiente exterior ya sea en campo o invernadero Eacutestos dos uacuteltimos tienen menor humedad relativa niveles maacutes altos de luminosidad y un ambiente seacuteptico los cuales son maacutes estresantes para las plantas micropropagadas La mayoriacutea de las especies que crecen in vitro necesitan un proceso de aclimatacioacuten pudiendo obtener asiacute un nuacutemero suficiente de plantas vivas y vigorosas para trasplantar al suelo (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991)
La aclimatacioacuten no es uacutenicamente para micropropagacioacuten siendo usada ademaacutes en propagacioacuten convencional durante antildeos Despueacutes de cortar las hojas y de haber formado raiacuteces por lo general son aclimatadas antes de ser llevadas al campo o invernadero Ejemplos de dos teacutecnicas comunes son bajar gradualmente la humedad y mantener el nivel de luz con un 50 de sombra antes de trasladarlos al campo Las raiacuteces que han sido cortadas y mal limpiadas muchas veces son focos de infeccioacuten En estos casos las plantas muestran signos de marchitez hojas necrosadas y tambieacuten se puede llegar a la muerte de eacutestas El cultivo in vitro reduce la necesidad de fotosiacutentesis ya que las condiciones de la caacutemara de incubacioacuten proveen a la planta de sacarosa u otro azuacutecar Tambieacuten en estas condiciones se reduce el stress por patoacutegenos al ser un ambiente aseacuteptico Todo esto se traduce en que las plantas micropropagadas no son aptas para el campo yo invernadero (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 251 Stress hiacutedrico El stress hiacutedrico puede ser el resultado de una excesiva transpiracioacuten de las diferentes partes aeacutereas de las plantas especialmente de las hojas o por una inadecuada absorcioacuten de agua por parte de las raiacuteces La cutiacutecula y los estomas son la ruta primaria de peacuterdida de agua desde de las hojas provenientes de esta teacutecnica reproductiva 2511 Cutiacutecula La cutiacutecula es una membrana compuesta por una matriz de cutina que a su vez se encuentra cubierta en su superficie por ceras cuya funcioacuten primaria consiste en limitar la peacuterdida de agua por transpiracioacuten La permeabilidad del agua a traveacutes de la cutiacutecula se ve influenciada principalmente por la estructura y la cantidad de
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ceras cuticulares y epicuticulares no vieacutendose afectada la peacuterdida de agua por el grosor de eacutesta o la naturaleza quiacutemica de la matriz de la cutina La estructura cristalina de la parte encerada de las hojas es distinta en las plantas micropropagadas con respecto a las plantas que crecen en el campo La cera epicuticular de las hojas de plantas in vitro tienen una proporcioacuten maacutes alta de esteres y de componentes polares por el contrario tienen unas cadenas de hidrocarbonos mucho maacutes cortas Esto hace que las plantas in vitro pierdan maacutes agua que las cultivadas en campo o invernadero
Las plantas que han crecido en el campo son naturalmente de color verde pero el color de las plantas cultivadas in vitro es diferente y se puede ver a simple vista Las plantas que son pasadas a invernadero y que tengan un color verde se aclimatan de mejor forma al ambiente exterior (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 2512 Estomas La estructura estomaacutetica y su funcionamiento han sido implicados recurrentemente en el desbalance de agua exhibido por plantas micropropagadas al momento de ser removidas del cultivo in vitro Estudios con microscopiacutea de scanner electroacutenico han indicado que la estructura estomaacutetica presente en algunas especies de plantas cultivadas in vitro difieren marcadamente de las cultivadas en invernadero o en el suelo Debido a que las primeras presentan estomas de mayor tamantildeo y maacutes redondos a diferencia de las plantas cultivadas de manera normal que presentan estomas maacutes pequentildeos y eliacutepticos lo que resulta en una deshidratacioacuten maacutes raacutepida en el caso de las provenientes de cultivo in vitro (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 252 Humedad Debido a la anatomiacutea y la condicioacuten fisioloacutegica de las plantas desarrolladas in vitro donde se ha mantenido una alta humedad relativa es necesario regar al momento del traslado para obtener una alta sobrevivencia Muchos laboratorios aseguran que hay que evitar tener un sistema de aspersioacuten ya que se produce el ambiente necesario (muy huacutemedo) para la aparicioacuten de hongos algas o bacterias Otros meacutetodos incluyen el uso de humidificadores o poner las macetas en un lugar cerrado donde se retenga vapor para esto se pueden usar por ejemplo tapas de polietileno Este meacutetodo es relativamente econoacutemico pero se debe tener control del calor y monitorear la falta de agua (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 253 Luz Durante la etapa in vitro las plantas estaacuten expuestas a altos niveles de luminosidad lo que se traduce en hojas delgadas Antes del traslado se recomienda mantener las plantas con un 50 de sombra para asiacute poder aclimatarlas de mejor manera esto debido a que las plantas micropropagadas tienen un bajo control sobre la transpiracioacuten y un inadecuado mecanismo de fotosiacutentesis La sombra reduce la transpiracioacuten evitando excesivas peacuterdidas de agua asiacute como tambieacuten el exceso de luz destruye las moleacuteculas de clorofila Luego del periacuteodo bajo sombra se deben mover las macetas gradualmente hacia el nivel de luz al cual seraacute llevado para su crecimiento final (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 254 Temperatura La temperatura del aire y del medio o sustrato de crecimiento estaacute generalmente controlado durante el periacuteodo de aclimatacioacuten El calor es necesario en los meses de invierno y el friacuteo (enfriar) es esencial en los meses de verano Ajustando la cantidad de sombra y humedad se obtiene un control sobre la temperatura El
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enfriamiento se puede obtener gracias a ventilacioacuten abanicos niebla o aire acondicionado El calor puede provenir del sistema existente en el edificio o invernadero donde esteacuten ubicadas las macetas o por las laacutemparas ocupadas para el control del fotoperiacuteodo El rango de temperatura que se mantiene por lo general es entre los 13 y 30ordmC y esta determinado principalmente por la especie en cuestioacuten La temperatura de la zona donde se encuentran las raiacuteces es muy importante para el crecimiento lo ideal es que dicho sector tenga una mayor temperatura que el aire fomentando el crecimiento de las raiacuteces e incrementando la humedad alrededor de la planta Durante el verano esto es difiacutecil de obtener ya que la temperatura del aire es muy alta debido a la alta radiacioacuten solar Terminado el proceso de aclimatacioacuten esto ya no es necesario (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 255 Fotosiacutentesis Las plantas sufren un cambio radical cuando son removidas desde cultivo in vitro ya que son forzadas a cambiar de heterotroacuteficas a autotroacuteficas y la fotosiacutentesis se vuelve fundamental para la sobrevivencia Las hojas de las plantas in vitro no estaacuten formadas para hacer fotosiacutentesis ya que en la caacutemara de incubacioacuten no se produce un fuerte intercambio gaseoso esto debido a que la sacarosa es entregada a traveacutes del medio de cultivo Las hojas de las plantas que son trasladadas al campo o invernadero sufren deterioro debido a que no estaacuten formadas para la fijacioacuten de carbono Esto se produce por un tiempo aproximado de cuatro semanas despueacutes de las cuales las hojas nuevas suplen a las viejas Otro punto es que las hojas de las plantas cultivadas in vitro contienen menor proporcioacuten de clorofila que las plantas que han crecido normalmente en el campo En un estudio de coliflor cultivado in vitro se midioacute el CO2 y se obtuvo un balance negativo el cual se mantuvo durante dos semanas despueacutes del transplante Algo similar ocurrioacute con frutilla despueacutes del transplante las hojas se deterioraron raacutepidamente lo que quiere decir que no hubo incremento en la fijacioacuten de carbono indicando falta de desarrollo en la competencia fotosinteacutetica
El bajo nivel de CO2 durante el cultivo in vitro limita el proceso de fotosiacutentesis lo cual se puede compensar usando sacarosa en el medio de cultivo Tambieacuten se puede incrementar el nivel de luz y CO2 obteniendo un fuerte aumento en el crecimiento de varias especies como orquiacutedeas clavel etc (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 256 Sustrato Un sustrato es todo material soacutelido distinto del suelo natural mineral u orgaacutenico que colocado en un contenedor en forma pura o en mezcla permite el anclaje del sistema radicular de la planta desempentildeando por lo tanto un papel de soporte para la planta El sustrato puede intervenir o no en el complejo proceso de la nutricioacuten mineral de la planta (INFOAGRO 2007) El sustrato y los contenedores dentro de los cuales se van a transplantar las plaacutentulas in vitro son importantes para una buena sobrevivencia
Los sustratos ejercen una influencia significativa en la arquitectura del sistema radical de las plantas y en las asociaciones bioloacutegicas de este con el suelo influenciando el
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estado nutricional y la translocacioacuten de agua en el sistema suelo-planta-atmoacutesfera Uno de los requisitos fundamentales que debe cumplir el sustrato para su utilizacioacuten es la sanidad Cuando estos no se elaboran almacenan o manejan correctamente pueden contaminarse y provocar serios dantildeos a las plantas durante la aclimatacioacuten por esta razoacuten son preferidos como componentes para su elaboracioacuten materiales inertes o aquellos en las cuales el proceso de obtencioacuten garantice la mayor desinfeccioacuten posible
Uno de los factores de mayor importancia a la hora de seleccionar los materiales que pueden constituir el sustrato es su disponibilidad tanto en teacuterminos de facilidad de obtencioacuten o suministro como de su costo (VILCHEZ et al 2007)
La presencia de inhibidores o tambieacuten cambios en el pH del sustrato pueden afectar el crecimiento de las raiacuteces y consecuentemente el eacutexito del transplante
Muchos laboratorios y viveros transplantan a un sustrato uniforme debiendo ser eacuteste adecuado en cuanto a soporte de las plantas pH porosidad aireacioacuten y drenaje (DEBERGH y ZIMMERMAN 1991)
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3 MATERIAL Y MEacuteTODO
Para la realizacioacuten de este trabajo se utilizoacute el siguiente material y meacutetodo
31 Material La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio e invernadero de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal pertenecientes a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de Chile
311 Material vegetal Se utilizaron plaacutentulas de C virescens cultivadas in vitro a partir de semillas las cuales fueron proporcionadas por el laboratorio estas plaacutentulas fueron separadas y repicadas para aumentar la poblacioacuten y obtener la cantidad necesaria para el ensayo
FIGURA 2 Plaacutentulas de C virescens en caacutemara de crecimiento in vitro
312 Materiales Los materiales que se utilizaron fueron los siguientes Equipos autoclave caacutemara de flujo laminar dispensador de medios medidor
de pH agitador magneacutetico horno microondas balanza mechero termoacutemetro Materiales vasos de precipitado matraces probetas pipetas papel de
aluminio frascos de vidrio placas Petri pinzas bisturiacute macetas regadera Soluciones soluciones madre (Medio MS) gelificante etanol 70 y 95
32 Meacutetodo A continuacioacuten se da a conocer la metodologiacutea con la cual se trabajoacute 321 Preparacioacuten del medio de cultivo Para la obtencioacuten de plantas a traveacutes de la micropropagacioacuten se ocupoacute el medio basal de MURASHIGE y SKOOG (1962) tambieacuten llamado medio MS Este medio tiene un pH de entre 56-57 Posteriormente se dosificoacute con el dispensador de medios para que cada frasco tenga una cantidad adecuada (25 mL) y se llevoacute a autoclave para esterilizar a 12 atm 120ordm C por 20 min
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322 Obtencioacuten del material vegetal Al tener el medio esterilizado se procedioacute a la separacioacuten y repicado de plaacutentulas existentes en el laboratorio Las siembras se realizaron en el mes de mayo del 2007 Estas siembras se realizaron en la caacutemara de flujo laminar de modo de asegurar que la siembra sea 100 aseacuteptica Estas plaacutentulas fueron mantenidas en la caacutemara de incubacioacuten hasta obtener los tamantildeos requeridos para el ensayo donde las condiciones fueron las siguientes
minus Temperatura ambiental de 23-25ordm C minus Fotoperiacuteodo de 16 horas minus Intensidad lumiacutenica controlada de 50-55 micromol m-2s-1
323 Sustratos Se utilizaron tres tipos de sustratos el primero corresponde a una mezcla de turba + perlita (11) el segundo corresponde a Sphagnum (100) y el tercero corresponde a una mezcla de turba + arena (11) Una vez realizadas las mezclas se procedioacute a una esterilizacioacuten en un autoclave a 121ordm C por 20 minutos a 12 atmoacutesfera De esta forma se trabajoacute con material limpio y sano evitando ataque de hongos o bacterias El anaacutelisis quiacutemico de los sustratos se muestra en el Anexo 2 324 Plantacioacuten Las plaacutentulas con un promedio de cuatro meses en condiciones de caacutemara de crecimiento in vitro obtuvieron el tamantildeo adecuado para ser utilizadas Se sacaron de los frascos y se plantaron en las macetas de plaacutestico transparente con los sustratos Posteriormente fueron dejadas en la sala del laboratorio donde se debioacute asperjar con solucioacuten nutritiva Hoagland y fungicida Captan CUADRO 1 Composicioacuten de solucioacuten nutritiva Hoagland
KNO3 102 gL Ca(NO3) 4 H2 O 0492 gL
NH4H2 (PO4) 023 gL MgSO4 7 H2O 049 gL
H3BO3 286 mgL MnCl2 2 H2O 181 mgL CuSO4 5 H2O 008 mgL ZnSO4 5 H2O 022 mgL Na2MoO4 H2O 009 mgL
FeSO4 7 H2O 05 06 mL FUENTE FINCK 1988 325 Disentildeo de los ensayos Este trabajo de investigacioacuten constoacute de un ensayo con dos etapas Antes que todo se realizoacute la separacioacuten y repicado in vitro de plaacutentulas de C virescens para la obtencioacuten del nuacutemero necesario de plantas En la etapa 1 se utilizaron tres tamantildeos de plaacutentulas obtenidas in vitro de 1-2cm de 2-3cm y de maacutes de 3cm de altura que se transplantaron a tres sustratos turba + perlita 11(vv) Sphagnum (100) y turba + arena 11 (vv) La turba provino de la Sociedad
22
Minera Patagonia Peat SA en Hijuelas el Sphagnum de la empresa Lonquen Chile de Puerto Montt y la perlita se obtuvo a traveacutes del sitio web wwwjardisencl (representante legal Walter Rathgeb Penza Ingeniero Agroacutenomo Santiago) Las plaacutentulas se plantaron de acuerdo a su tamantildeo las de maacutes de 3cm se colocaron de 6 por maceta las de 2 a 3cm de a 8 por maceta y las maacutes chicas de a 10 por maceta Estas macetas fueron dejadas en una sala de aclimatacioacuten con una temperatura promedio de 20ordm C intensidad lumiacutenica de 50-55 micromol m-2s-1 y 14-16 hrs de fotoperiacuteodo Se fertilizoacute asperjando cada cinco diacuteas con solucioacuten nutritiva Hoagland Esta etapa se llevoacute a cabo durante dos meses desde el cinco de septiembre hasta el cinco de noviembre de 2007
En la etapa 2 se continuoacute el proceso de aclimatacioacuten en invernadero de las plaacutentulas obtenidas en la etapa 1 que despueacutes de dos meses teniacutean un mayor tamantildeo y se habiacutean acondicionado al ambiente exterior (fuera de la caacutemara de crecimiento) Las plantas se mantuvieron en las macetas durante tres semanas para aclimatarlas y luego las plantas sobrevivientes fueron transplantadas a macetas maacutes grandes individuales durante tres meses aproximadamente hasta el cinco de marzo 2008 Estas nuevas macetas tuvieron como sustrato turba y suelo (trumao) en igual proporcioacuten (Anexo 2) La temperatura promedio de invernadero fluctuoacute de 13 a 35 degC seguacuten el mes En enero el promedio fue de 25 (Anexo 3) Para bajar la temperatura alrededor de 5deg C se instaloacute una malla Rachel 326 Disentildeo experimental El disentildeo experimental utilizado fue completamente al azar ordenado como experimento factorial con dos factores tamantildeo (3) y sustrato (3) Cada tratamiento tuvo tres repeticiones con un miacutenimo de 6 plantas por recipiente 327 Variables a evaluar Durante los dos meses en que las macetas estuvieron en la sala de aclimatacioacuten se evaluoacute el desarrollo foliar contando el nuacutemero de hojas una vez al mes Posteriormente se trasladaron las mismas macetas a invernadero durante tres semanas para continuar con la aclimatacioacuten de las plaacutentulas Transcurrido este tiempo se transplantaron las plaacutentulas sobrevivientes a macetas individuales y continuoacute mensualmente la evaluacioacuten de eacutestas (nuacutemero de hojas) hasta la obtencioacuten de plantas establecidas Al momento del transplante y al final del ensayo se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces asiacute como tambieacuten al final del ensayo de evaluoacute el crecimiento en altura (cm) La sobrevivencia fue evaluada al final del ensayo por maceta
Tanto en la sala de aclimatacioacuten coacutemo en el invernadero se registroacute la temperatura con la ayuda de un termoacutemetro de maacutexima y miacutenima (Anexo 3) 328 Anaacutelisis estadiacutestico Una vez obtenidos los datos se procedioacute a comprobar si estos cumpliacutean con los supuestos de aleatoriedad normalidad y homogeneidad de varianzas que exige este tipo de anaacutelisis En el caso de no cumplirse estos supuestos los datos se transformaron utilizando log10(x+05) raiacutez(x+05) o 1x para normalizarlos
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y enseguida se sometioacute los datos a un anaacutelisis estadiacutestico (ANDEVA) Posteriormente en los casos en que se observoacute diferencias significativas en el ANDEVA se aplicoacute una prueba de rangos muacuteltiples (Tukey) al 5 de significancia Para las variables no parameacutetricas que no cumplieron con los supuestos para un anaacutelisis de varianza se realizoacute la prueba de KruskalndashWallis y las comparaciones muacuteltiples a traveacutes del test de Dunn con un nivel de 5 de significancia
Se utilizaron los programas estadiacutesticos STATGRAPHICS 20 y GRAPHPAD PRISM 5 para el anaacutelisis de datos
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4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
En los siguientes puntos se discuten los resultados obtenidos en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens
En la Figura 3 se observan plaacutentulas de C virescens micropropagadas en medio MS en caacutemara de crecimiento al inicio del ensayo (A) y en invernadero despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten (B)
BA
FIGURA 3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten
A continuacioacuten se presentan los resultados obtenidos para las variables analizadas (Cuadro 2 y 3) de esta manera se pueden visualizar en general los resultados obtenidos en el proceso de aclimatacioacuten durante seis meses
CUADRO 2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de raiacuteces
inicial y final Variables
Hojas finales (nuacutemero)
Raiacuteces iniciales (nuacutemero)
Raiacuteces finales (nuacutemero)
Tamantildeo de plaacutentulas 36 24 37 47 29 46
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 61 43 76
Sustratos 53 36 56 43 29 51
Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 46 27 49
Significa que hay diferencias significativas al 95 Test de Dunn
25
Las variables no parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en hojas finales y raiacuteces iniciales en sus rangos de distribucioacuten Las raiacuteces finales no presentaron diferencias seguacuten el sustrato utilizado pero de acuerdo al tamantildeo hubo diferencias en su distribucioacuten
CUADRO 3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas
Variables Altura final de plaacutentulas
(cm) Sobrevivencia
Tamantildeo de plaacutentulas
36 c 567 b 47 b 821 a
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 59 a 908 a
Sustratos 52 a 933 a
41 ab 59 b Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 49 b 772 a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY Las variables parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en altura final de hojas y en sobrevivencia 41 Nuacutemero de hojas finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentulas y de sustratos para la variable nuacutemero final de hojas 411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula Seguacuten el Cuadro 2 y Figura 4 las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero final de hojas Las plaacutentulas pequentildeas de 1-2 cm obtuvieron el nuacutemero maacutes bajo de hojas finales con una media de 36 hojas por plaacutentula lo cual es la mitad de las hojas finales que se obtuvo con las plaacutentulas de mayor tamantildeo (61 hojas aproximado por plaacutentula) Para las plaacutentulas medianas de 2-3 cm se obtuvo una media de 47 hojas por plaacutentula (Figura 4)
26
Hojas finales
1-2 cm 2-3cm maacutes de 3 cm0
5
10
15
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn)
BLANCO (2006) sentildeala que plaacutentulas cultivadas in vitro crecen bajo condiciones especiales como alta humedad relativa y baja luminosidad ademaacutes son suplidas con sacarosa Estas condiciones fueron proporcionadas en una caacutemara de crecimiento en el laboratorio donde las plantas micropropagadas no son dependientes por completo de su fotosiacutentesis son heteroacutetrofas Parece ser necesario un estiacutemulo para convertirse en organismos totalmente capaces de sustentar sus propios requisitos de carbono y nitroacutegeno reducido pasando de esta manera a ser autoacutetrofos
Al ser sacadas de un medio in vitro las hojas no estaacuten preparadas para producir su propio alimento y sobreviven gracias a que el medio de cultivo le proporciona los nutrientes necesarios para vivir En este punto muchas de las hojas mueren y nacen hojas nuevas capaces de generar su alimento supliendo asiacute las hojas viejas (SEELYE et al 2003) En este ensayo las plaacutentulas de Chloraea virescens presentaron en general una buena adaptacioacuten al ser sacadas de un medio in vitro
Se observoacute que plaacutentulas con menor tamantildeo al ser aclimatadas y tener menor tejido fue maacutes difiacutecil y maacutes lento que empezaran a generar nuevos tejidos y materia orgaacutenica a partir de dioacutexido de carbono POSPIacuteŠILOVAacute et al (1999) sentildeala que al tener los estomas con desarrollo incompleto maacutes grandes y de forma maacutes redonda pierden maacutes agua lo cual puede provocar una peacuterdida de hojas muriendo asiacute la plaacutentula Por esta razoacuten las plaacutentulas pequentildeas se demoran maacutes tiempo en generar hojas nuevas es por ello que al finalizar este estudio muestran el menor nuacutemero final de hojas 412 Efecto del tipo de sustrato Al analizar la influencia del tipo de sustrato se encontraron diferencias significativas entre los tres sustratos utilizados Seguacuten el Cuadro 2 y la Figura 5 el sustrato donde se obtuvo mejores resultados fue
27
turba+perlita en el cual se observoacute un promedio de 53 hojas por plaacutentula siendo Sphagnum el maacutes bajo con 43 hojas por plaacutentula De acuerdo a los resultados del anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados el sustrato turba+perlita tiene mayor cantidad de nitroacutegeno foacutesforo calcio magnesio y azufre disponible comparativamente con los otros dos sustratos (Sphagnum y arena+turba) (Anexo 2)
Hojas finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
Sustratos
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) Para la brotacioacuten y el crecimiento de las plantas se necesita agua y Nitroacutegeno lo que favorece a una mayor tasa de aparicioacuten de hojas lo que se traduce en una mayor cantidad de hojas finales El Nitroacutegeno se encuentra en mayor cantidad en el sustrato turba+perlita debido a lo cual los mejores resultados se obtienen en dicho sustrato 413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Despueacutes de analizados los efectos individuales del tamantildeo y del sustrato al interactuar ambos factores existen diferencias significativas La mejor interaccioacuten se obtuvo con el sustrato turba+perlita y con el mayor tamantildeo de la plaacutentula (Figura 6) Debido a la buena estructura (porosa) de dicho sustrato se podriacutea decir que se favorecioacute la absorcioacuten radicular de nutrientes obteniendo por ello un mayor nuacutemero de hojas finales Para los menores tamantildeos no se observan diferencias significativas obteniendo como promedio 41 hojas por plaacutentula Para el mayor tamantildeo el promedio fue de 6 hojas por plaacutentula
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Hojas finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 42 Raiacuteces iniciales Este paraacutemetro se evaluoacute luego de la primera etapa de aclimatacioacuten la cual se realizoacute en una sala de aclimatacioacuten del laboratorio Se analizoacute la influencia de diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos sobre la variable nuacutemero raiacuteces iniciales (Anaacutelisis de Kruskal-Wallis en Anexo 7)
FIGURA 7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses de pre aclimatacioacuten
29
En la Figura 7 se puede observar los resultados de pre aclimatacioacuten en sala de laboratorio En esta etapa ya es posible ver la presencia de raiacuteces desarrolladas 421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula En el Cuadro 2 se puede observar que las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero inicial de raiacuteces y en la Figura 8 se puede comprobar que para los dos tamantildeos de plaacutentula maacutes pequentildeos no se observa gran cantidad de raiacuteces esto no impidioacute el desarrollo posterior de las plaacutentulas las cuales lograron enraizar al final del estudio Esto se contrapone a lo observado en un estudio de Lapageria rosea donde la presencia de raiacutez y brote para lograr una multiplicacioacuten exitosa de plantas es de vital importancia Incluso algunas plaacutentulas de L rosea no brotan en condiciones in vitro en donde tienen las mejores condiciones nutricionales y hormonales para hacerlo Esto se debe a factores internos de la plaacutentula siendo muy difiacutecil que broten inmediatamente en caacutemara de aclimatacioacuten donde ya dejan de recibir los nutrientes necesarios de manera directa y requieren de balances de energiacutea para poder seguir elongando raiacuteces absorber nutrientes y brotar para poder obtener los carbohidratos necesarios para seguir su crecimiento (BLANCO 2006) El tamantildeo de plaacutentula tiene importancia para el desarrollo de raiacuteces se distingue notoriamente que en los tamantildeos maacutes grandes el nuacutemero de raiacuteces es mayor comparativamente con los tamantildeos pequentildeos donde el nuacutemero de raiacuteces fue escaso Debido a la presencia de maacutes hojas existe una mayor cantidad de aacuterea fotosinteacutetica esta situacioacuten estimula el crecimiento de las raiacuteces para la obtencioacuten de agua y nutrientes
Raices iniciales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
2
4
6
8
10
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o inicial de ra
iacuteces
FIGURA 8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn)
30
422 Efecto del tipo de sustrato Para el sustrato turba+perlita se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas en el nuacutemero de raiacuteces con respecto a los dos otros sustratos esto se puede ver en el Figura 9 donde se observa que se obtuvieron los mayores resultados En cualquier medio de crecimiento el espacio no ocupado por un soacutelido se llama porosidad este espacio puede ser ocupado en parte para retener agua y en parte para proporcionarle aire a las raiacuteces La ausencia de uno de estos elementos es perjudicial para las plantas La turba es conocida por tener estas propiedades y la perlita tambieacuten por esta razoacuten se sabe que la mezcla turba-perlita provee propiedades fiacutesicas excelentes como medio de crecimiento y propagacioacuten (INFOAGRO 2007) Estos resultados con turba-perlita (298 de materia orgaacutenica) coinciden con los obtenidos por DIAZ et al (2004) quienes al utilizar un sustrato compuesto por 100 de humus de lombriz para aclimatar cantildea de azuacutecar obtuvieron el mayor nuacutemero de raiacuteces Esto puede atribuirse al importante aporte de materia orgaacutenica del humus (47) lo que le confiere una mejor estructura obtenieacutendose una excelente porosidad del sustrato La aireacioacuten del suelo es necesaria para favorecer la maacutexima absorcioacuten de nutrientes por las raiacuteces Esto tambieacuten sucede en el sustrato turba+perlita el cual posee la mayor cantidad de materia orgaacutenica de los tres sustratos utilizados
Raices iniciales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
2
4
6
8
10
Sustratos
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato En los anaacutelisis para la variable nuacutemero de raiacuteces se puede decir que la mejor interaccioacuten se presentoacute para el sustrato de turba+perlita junto con el mayor tamantildeo de plaacutentulas obteniendo los valores maacutes altos entre los nueve tratamientos La presencia de raiacuteces luego de la micropropagacioacuten aumenta la posibilidad de eacutexito en el transplante ya que se crea un favorable balance de agua Pero esto no quiere
31
decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
10
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
32
En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
33
El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
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Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
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Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
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5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
12
terrestres de clima templado es maacutes difiacutecil que las orquiacutedeas epiacutefitas de clima subtropical y tropical Las orquiacutedeas terrestres tienen requerimientos maacutes estrictos que las epiacutefitas y se conoce menos sobre sus necesidades especiacuteficas (VAASA y ROSENBERG 2004) En Estonia existen 36 especies de orquiacutedeas terrestres pero solo tres estaacuten bajo proteccioacuten Dactylorhiza baltica Dactylorhiza ruthei Dactylorhiza praetermissa Como explantes para este estudio en el caso de D baltica se ocuparon protocormos en los otros dos casos se utilizaron semillas semi maduras las cuales fueron colectadas siete y diez semanas despueacutes de ser polinizadas Para D baltica se ocupoacute el medio Murashige y Skoog suplementado con 05 mgL de aacutecido naftaleacuten aceacutetico (ANA) y 2 mgL de isonpentenyl adenina Para el caso de las semillas semi maduras se ocuparon los medios de Lindemann de Heller de Norstog y de Murashige y Skoog como control
La composicioacuten del medio y la madurez de las semillas influye mucho en el desarrollo de las orquiacutedeas in vitro Se ha demostrado que se necesita una alta concentracioacuten de microelementos para obtener una correcta germinacioacuten de las semillas Tambieacuten se puede decir que los primeros tres meses son los de mayor crecimiento luego de este tiempo el crecimiento se vuelve maacutes lento (VAASA y ROSENBERG 2004)
Luego de cuatro semanas de crecimiento de D baltica el 60 de los explantes de meristemas apicales empezaron a crecer en cambio los de meristemas laterales no expresaron ninguacuten tipo de crecimiento Las raiacuteces empezaron su desarrollo luego de dos meses despueacutes de la siembra
En el caso de D ruthei y D praetermissa la germinacioacuten se produjo despueacutes de dos meses desde la inoculacioacuten Luego de cuatro y seis meses el mayor crecimiento fue observado en el medio Norstog superando en 14 al medio testigo Murashige y Skoog (VAASA y ROSENBERG 2004)
2413 Longevidad de semillas de orquiacutedeas terrestres Por lo general las orquiacutedeas producen muchas pero pequentildeas semillas que contienen muy pocas reservas de alimento Dichas semillas estaacuten estructuralmente adaptadas para ser dispersadas por el viento pero poco se sabe del destino de eacutestas luego de ser dispersadas Algunos estudios de viabilidad de semillas indican una sobrevivencia de uno a dos antildeos en orquiacutedeas de clima templado Las semillas que son guardadas en laboratorio duran mucho maacutes tiempo Se estudioacute la viabilidad de siete especies de orquiacutedeas norteamericanas dentro de las cuales se encuentran Goodyera pubescens y Liparis liliifolia Las semillas de eacutestas se colocaron en bolsas con suelo y sustratos de bosques provenientes de sus haacutebitats naturales (WHIGHAM et al 2005) En Goodyera pubescens la mayoriacutea de las semillas germinaron en un antildeo Cuatro otras especies germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero algunas semillas no germinadas despueacutes de siete antildeos seguiacutean siendo viables En la especie Liparis liliifolia semillas que han estado cuatro antildeos bajo observacioacuten han tenido una tasa de
13
germinacioacuten de un 68 al ser sembradas in vitro junto con el hongo micorriacutezico adecuado Las dos especies restantes no germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero las semillas fueron evaluadas como intactas y testeadas positivamente en cuanto a su viabilidad despueacutes de cuatro antildeos en el suelo Estas observaciones fueron interpretadas como diferentes estrategias para especies especiacuteficas de germinacioacuten in situ (WHIGHAM et al 2005) 2414 Sobrevivencia de orquiacutedeas terrestres transplantadas a sectores urbanos La conservacioacuten de poblaciones de orquiacutedeas silvestres depende del establecimiento de las orquiacutedeas propagadas a los campos Sin embargo se conoce muy poco de los factores bioacuteticos que influencian el establecimiento de orquiacutedeas terrestres a sus haacutebitats naturales Un experimento fue establecido para medir la sobrevivencia de seis especies durante su primer periacuteodo de crecimiento seguido del transplante a un sector urbano en Australia (SCADE et al 2006)
Las orquiacutedeas germinadas simbioacuteticamente crecieron en laboratorio durante cinco meses antes de establecer la plantacioacuten en sitios adyacentes con alta o baja cobertura de malezas Existioacute una muerte gradual de las plaacutentulas durante el primer periacuteodo de crecimiento primeramente por ataque de insectos no siendo evitado por la presencia de una malla cobertora Los iacutendices de sobrevivencia variacutean desde 49 para Microtis media una especie capaz de crecer en un ambiente atiacutepico hasta un 21 para Caladenia arenicola la orquiacutedea nativa maacutes comuacuten de esos sitios Sin embargo no todas las orquiacutedeas sobrevivientes producen tubeacuterculos por lo que la tasa de sobrevivencia despueacutes del primer periacuteodo seco disminuye
La sobrevivencia de las orquiacutedeas sembradas no puede ser comparada con orquiacutedeas de la misma especie que crecieron en los mismos lugares ya que no existioacute la presencia del hongo compatible para estas orquiacutedeas (SCADE et al 2006)
2415 Micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres En India dos orquiacutedeas muy importantes para la horticultura del geacutenero Anoectochilus fueron exitosamente propagadas Noacutedulos aislados de A sikkimensis colectadas en Himalaya y A regalis colectadas en India fueron cultivadas in vitro durante 12 semanas para obtener un maacuteximo de 48 a 56 protocormos y brotes obteniendo como resultado un 95 y 98 de eficiencia respectivamente Durante el repicado de los explantes in vitro de A regalis se observoacute que el nuacutemero total de brotes obtenidos a partir de noacutedulos fue 214 asiacute como tambieacuten 82 puntas de brotes En cambio para A sikkimensis fueron mucho maacutes bajos 123 y 43 respectivamente teniendo un crecimiento maacutes lento pero plantas maacutes fuertes Las raiacuteces de 4 a 6cm crecieron con la presencia de NAA (270 microM ) en el medio asiacute como tambieacuten con carbono activado (02) Durante la aclimatacioacuten la tasa de establecimiento fue entre 95 y 98 Luego de seis meses en invernadero las plantas de A regalis fueron transferidas a bosque nativo donde se obtuvo una tasa de
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sobrevivencia de entre 70 y 95 despueacutes de 12 meses Estas plantas establecidas en bosque nativo estaacuten libres de cualquier defecto morfoloacutegico y de crecimiento (GANGAPRASAD et al 2000) 242 Orquiacutedeas epiacutefitas Estas orquiacutedeas viven en los aacuterboles pero no obtienen de eacuteste su alimento no son paraacutesitas 2421 Preservacioacuten de Cattleya walkeriana usando propagacioacuten in vitro El geacutenero Cattleya se encuentra en Meacutexico y Ameacuterica Central asiacute como tambieacuten en Venezuela Colombia y las laderas de los Andes Esta orquiacutedea tambieacuten se encuentra en varias regiones del Brasil creciendo en aacuterboles rocas cerca de riacuteos lagos y pantanos Las flores de esta orquiacutedea son conocidas debido a su hermosura y a causa de la destruccioacuten de su haacutebitat y a la excesiva coleccioacuten de eacutestas se encuentra en extincioacuten
La composicioacuten del medio de cultivo es esencial para la propagacioacuten in vitro ya que suple todos los nutrientes necesarios para el desarrollo y seraacute distinto dependiendo de cada especie en este caso se utilizoacute la mitad de los macronutrientes del medio Muchos autores sugieren el uso de carboacuten activado en el medio ya que por lo general en muchas especies aumenta el desarrollo de las raiacuteces En este estudio se probaron distintas dosis de carboacuten activado 1 2 4 y 6gL con un pH de 6 (TADEU DE FARIA et al 2002) Las semillas se obtuvieron de flores artificialmente polinizadas en invernadero Plaacutentulas de aproximadamente un centiacutemetro fueron seleccionadas y cultivadas nuevamente en el medio de cultivo Murashige y Skoog pero esta vez con las diferentes dosis de carboacuten activado Se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces el nuacutemero de brotes y el peso de la materia verde total Durante el autoclavado se produce normalmente una hidroacutelisis de sacarina la cual es de 10 aproximadamente este porcentaje aumenta considerablemente al agregar un 1 de carboacuten activado llegando a ser de 95
El desarrollo de las plaacutentulas de C walkeriana aumentan con una mayor concentracioacuten de carboacuten activado asiacute como tambieacuten un mayor tiempo de cultivo El resultado fue que la dosis ideal para el desarrollo de esta orquiacutedea es 2gL de carboacuten activado (TADEU DE FARIA et al 2002) 2422 Establecimiento de cultivos in vitro y micropropagacioacuten de Cattleya aurantiaca (Bateman ex Lindl) Por medio de siembra in vitro se logroacute el establecimiento de C aurantiaca con alto porcentaje de germinacioacuten y desarrollo de protocormos Para la oacuteptima formacioacuten de callo y para la proliferacioacuten de protocormos se determinaron los medios oacuteptimos (MS 10 mgL ANA 10 mgL BA) asiacute como tambieacuten de manera directa sobre explantes de hoja y pseudobulbos (MS 01 mgL ANA 01 mgL GA3)
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Con este uacuteltimo medio tambieacuten se logroacute una oacuteptima regeneracioacuten y desarrollo de plaacutentulas Los medios liacutequidos (sin agitacioacuten) son una buena opcioacuten para conseguir la produccioacuten masiva de protocormos ya que con ellos se optimizoacute la micropropagacioacuten de C aurantiaca Las plaacutentulas micropropagadas presentaron alto porcentaje de sobrevivencia y buen desarrollo despueacutes de su trasplante y aclimatacioacuten lo cual demuestra que es un buen sistema de propagacioacuten para C aurantiaca (GUTIERREZ y SALGADO 2007) En cuanto a transplante y aclimatacioacuten despueacutes de 45 diacuteas de desarrollo in vitro las plaacutentulas de un tamantildeo entre 3 y 5 cm con raiacuteces bien desarrolladas fueron llevadas a condiciones ex vitro eliminando los restos de medio de cultivo con agua potable y ocupando un sustrato de partes iguales de tezontle y corteza de encino cubierta con hojarasca de encino finamente molida Se mantuvieron cubiertas durante 15 diacuteas abriendo cada dos diacuteas hasta poder retirar la tapa en 30 diacuteas Despueacutes de dos meses de haber sido retiradas del cultivo in vitro las plaacutentulas presentaron 70 de sobrevivencia y alcanzaron una altura de hasta 7 cm presentando nuevas hojas y raiacuteces las plantas se muestran vigorosas y capaces de continuar su crecimiento en condiciones ambientales de invernadero (GUTIERREZ y SALGADO 2007)
2423 Establecimiento in vitro y regeneracioacuten de plantas de Laelia autumnalis (Llave y Lex) Lindl Para este estudio se obtuvieron las semillas de una caacutepsula desarrollada despueacutes de 6 meses de la floracioacuten las cuales se sembraron in vitro sin presentar contaminacioacuten ya que la siembra por este meacutetodo es muy eficiente en comparacioacuten al cultivo de semillas libres donde algunas veces se presenta la contaminacioacuten Las observaciones se realizaron cada 15 diacuteas la germinacioacuten se detectoacute en los primeros 15 diacuteas en la mayoriacutea de los medios de cultivos probados con la presencia de protocormos de 1mm de diaacutemetro (HUAPEO y SALGADO 2004) El porcentaje de germinacioacuten que se obtuvo de las semillas cultivadas in vitro de L autumnalis fue de 95 a 100 en todos los medios de cultivo la uacutenica diferencia fue el tiempo entre las germinaciones A excepcioacuten de las semillas cultivadas en el medio MS 100 la germinacioacuten del 100 se obtuvo hasta los 30 diacuteas de cultivo mientras que en el primero la germinacioacuten fue a los 15 diacuteas del cultivo Las plaacutentulas con raiacutez y un par de hojas se lograron a los 90 diacuteas de cultivo en el medio MS 100 alcanzando 07 mm de altura Estas plaacutentulas fueron subcultivadas en medio MS con 05 mgl de ANA y 01 mgl de GA3 para tener plaacutentulas fuente de explante (segmentos de hojas) un medio oacuteptimo de desarrollo de plaacutentulas de L speciosa No fue necesario probar otros medios de cultivos ya que se hicieron pruebas anteriores que demostraron que era el adecuado
Las plaacutentulas de 6 meses de cultivo in vitro despueacutes de su germinacioacuten presentaron una altura promedio de 5 cm con raiacuteces con velamen y hasta dos pares de hojas Segmentos de hoja de eacutestas fueron cultivadas en el medio MS conteniendo ANA BA y GA3 en diferentes concentraciones y se realizaron observaciones cada 30 diacuteas para determinar medios inductores de callo protocormos y raiacuteces La mejor respuesta en formacioacuten de callo fue observada en los segmentos de hoja de plaacutentulas de L autumnalis cultivados en MS con 1 mgl de ANA BA y GA3 iniciando la induccioacuten de
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eacuteste desde los 30 diacuteas de cultivo solamente en un 70 de los explantes cultivados El 100 se logroacute a los 90 diacuteas de cultivo observando callo abundante alrededor de todo el tejido de color blanco con puntos pigmentados de color verde La regeneracioacuten de protocormos de esta orquiacutedea se establecioacute con la siembra de segmentos de hoja de plaacutentulas de 6 meses de edad de manera directa o a partir de callos En callos la produccioacuten fue oacuteptima en el medio MS con 01 mgl de ANABAGA3 ya que a los 60 diacuteas se obtuvieron 50 protocormos por segmento de callo Solamente se produjeron 10 protocormos por explante al cultivarse los segmentos de hoja en MS con 01 mgl de ANABAGA3 a los 120 diacuteas de cultivo (HUAPEO y SALGADO 2004) 25 Aclimatacioacuten Aclimatacioacuten significa que el hombre intercede y guiacutea el proceso de acondicionamiento de las plantas hasta que eacutestas sean aptas para crecer en el campo yo invernadero
Un alto nuacutemero de plantas micropropagadas no sobreviven al cambio desde el cultivo in vitro hacia el ambiente exterior ya sea en campo o invernadero Eacutestos dos uacuteltimos tienen menor humedad relativa niveles maacutes altos de luminosidad y un ambiente seacuteptico los cuales son maacutes estresantes para las plantas micropropagadas La mayoriacutea de las especies que crecen in vitro necesitan un proceso de aclimatacioacuten pudiendo obtener asiacute un nuacutemero suficiente de plantas vivas y vigorosas para trasplantar al suelo (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991)
La aclimatacioacuten no es uacutenicamente para micropropagacioacuten siendo usada ademaacutes en propagacioacuten convencional durante antildeos Despueacutes de cortar las hojas y de haber formado raiacuteces por lo general son aclimatadas antes de ser llevadas al campo o invernadero Ejemplos de dos teacutecnicas comunes son bajar gradualmente la humedad y mantener el nivel de luz con un 50 de sombra antes de trasladarlos al campo Las raiacuteces que han sido cortadas y mal limpiadas muchas veces son focos de infeccioacuten En estos casos las plantas muestran signos de marchitez hojas necrosadas y tambieacuten se puede llegar a la muerte de eacutestas El cultivo in vitro reduce la necesidad de fotosiacutentesis ya que las condiciones de la caacutemara de incubacioacuten proveen a la planta de sacarosa u otro azuacutecar Tambieacuten en estas condiciones se reduce el stress por patoacutegenos al ser un ambiente aseacuteptico Todo esto se traduce en que las plantas micropropagadas no son aptas para el campo yo invernadero (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 251 Stress hiacutedrico El stress hiacutedrico puede ser el resultado de una excesiva transpiracioacuten de las diferentes partes aeacutereas de las plantas especialmente de las hojas o por una inadecuada absorcioacuten de agua por parte de las raiacuteces La cutiacutecula y los estomas son la ruta primaria de peacuterdida de agua desde de las hojas provenientes de esta teacutecnica reproductiva 2511 Cutiacutecula La cutiacutecula es una membrana compuesta por una matriz de cutina que a su vez se encuentra cubierta en su superficie por ceras cuya funcioacuten primaria consiste en limitar la peacuterdida de agua por transpiracioacuten La permeabilidad del agua a traveacutes de la cutiacutecula se ve influenciada principalmente por la estructura y la cantidad de
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ceras cuticulares y epicuticulares no vieacutendose afectada la peacuterdida de agua por el grosor de eacutesta o la naturaleza quiacutemica de la matriz de la cutina La estructura cristalina de la parte encerada de las hojas es distinta en las plantas micropropagadas con respecto a las plantas que crecen en el campo La cera epicuticular de las hojas de plantas in vitro tienen una proporcioacuten maacutes alta de esteres y de componentes polares por el contrario tienen unas cadenas de hidrocarbonos mucho maacutes cortas Esto hace que las plantas in vitro pierdan maacutes agua que las cultivadas en campo o invernadero
Las plantas que han crecido en el campo son naturalmente de color verde pero el color de las plantas cultivadas in vitro es diferente y se puede ver a simple vista Las plantas que son pasadas a invernadero y que tengan un color verde se aclimatan de mejor forma al ambiente exterior (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 2512 Estomas La estructura estomaacutetica y su funcionamiento han sido implicados recurrentemente en el desbalance de agua exhibido por plantas micropropagadas al momento de ser removidas del cultivo in vitro Estudios con microscopiacutea de scanner electroacutenico han indicado que la estructura estomaacutetica presente en algunas especies de plantas cultivadas in vitro difieren marcadamente de las cultivadas en invernadero o en el suelo Debido a que las primeras presentan estomas de mayor tamantildeo y maacutes redondos a diferencia de las plantas cultivadas de manera normal que presentan estomas maacutes pequentildeos y eliacutepticos lo que resulta en una deshidratacioacuten maacutes raacutepida en el caso de las provenientes de cultivo in vitro (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 252 Humedad Debido a la anatomiacutea y la condicioacuten fisioloacutegica de las plantas desarrolladas in vitro donde se ha mantenido una alta humedad relativa es necesario regar al momento del traslado para obtener una alta sobrevivencia Muchos laboratorios aseguran que hay que evitar tener un sistema de aspersioacuten ya que se produce el ambiente necesario (muy huacutemedo) para la aparicioacuten de hongos algas o bacterias Otros meacutetodos incluyen el uso de humidificadores o poner las macetas en un lugar cerrado donde se retenga vapor para esto se pueden usar por ejemplo tapas de polietileno Este meacutetodo es relativamente econoacutemico pero se debe tener control del calor y monitorear la falta de agua (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 253 Luz Durante la etapa in vitro las plantas estaacuten expuestas a altos niveles de luminosidad lo que se traduce en hojas delgadas Antes del traslado se recomienda mantener las plantas con un 50 de sombra para asiacute poder aclimatarlas de mejor manera esto debido a que las plantas micropropagadas tienen un bajo control sobre la transpiracioacuten y un inadecuado mecanismo de fotosiacutentesis La sombra reduce la transpiracioacuten evitando excesivas peacuterdidas de agua asiacute como tambieacuten el exceso de luz destruye las moleacuteculas de clorofila Luego del periacuteodo bajo sombra se deben mover las macetas gradualmente hacia el nivel de luz al cual seraacute llevado para su crecimiento final (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 254 Temperatura La temperatura del aire y del medio o sustrato de crecimiento estaacute generalmente controlado durante el periacuteodo de aclimatacioacuten El calor es necesario en los meses de invierno y el friacuteo (enfriar) es esencial en los meses de verano Ajustando la cantidad de sombra y humedad se obtiene un control sobre la temperatura El
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enfriamiento se puede obtener gracias a ventilacioacuten abanicos niebla o aire acondicionado El calor puede provenir del sistema existente en el edificio o invernadero donde esteacuten ubicadas las macetas o por las laacutemparas ocupadas para el control del fotoperiacuteodo El rango de temperatura que se mantiene por lo general es entre los 13 y 30ordmC y esta determinado principalmente por la especie en cuestioacuten La temperatura de la zona donde se encuentran las raiacuteces es muy importante para el crecimiento lo ideal es que dicho sector tenga una mayor temperatura que el aire fomentando el crecimiento de las raiacuteces e incrementando la humedad alrededor de la planta Durante el verano esto es difiacutecil de obtener ya que la temperatura del aire es muy alta debido a la alta radiacioacuten solar Terminado el proceso de aclimatacioacuten esto ya no es necesario (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 255 Fotosiacutentesis Las plantas sufren un cambio radical cuando son removidas desde cultivo in vitro ya que son forzadas a cambiar de heterotroacuteficas a autotroacuteficas y la fotosiacutentesis se vuelve fundamental para la sobrevivencia Las hojas de las plantas in vitro no estaacuten formadas para hacer fotosiacutentesis ya que en la caacutemara de incubacioacuten no se produce un fuerte intercambio gaseoso esto debido a que la sacarosa es entregada a traveacutes del medio de cultivo Las hojas de las plantas que son trasladadas al campo o invernadero sufren deterioro debido a que no estaacuten formadas para la fijacioacuten de carbono Esto se produce por un tiempo aproximado de cuatro semanas despueacutes de las cuales las hojas nuevas suplen a las viejas Otro punto es que las hojas de las plantas cultivadas in vitro contienen menor proporcioacuten de clorofila que las plantas que han crecido normalmente en el campo En un estudio de coliflor cultivado in vitro se midioacute el CO2 y se obtuvo un balance negativo el cual se mantuvo durante dos semanas despueacutes del transplante Algo similar ocurrioacute con frutilla despueacutes del transplante las hojas se deterioraron raacutepidamente lo que quiere decir que no hubo incremento en la fijacioacuten de carbono indicando falta de desarrollo en la competencia fotosinteacutetica
El bajo nivel de CO2 durante el cultivo in vitro limita el proceso de fotosiacutentesis lo cual se puede compensar usando sacarosa en el medio de cultivo Tambieacuten se puede incrementar el nivel de luz y CO2 obteniendo un fuerte aumento en el crecimiento de varias especies como orquiacutedeas clavel etc (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 256 Sustrato Un sustrato es todo material soacutelido distinto del suelo natural mineral u orgaacutenico que colocado en un contenedor en forma pura o en mezcla permite el anclaje del sistema radicular de la planta desempentildeando por lo tanto un papel de soporte para la planta El sustrato puede intervenir o no en el complejo proceso de la nutricioacuten mineral de la planta (INFOAGRO 2007) El sustrato y los contenedores dentro de los cuales se van a transplantar las plaacutentulas in vitro son importantes para una buena sobrevivencia
Los sustratos ejercen una influencia significativa en la arquitectura del sistema radical de las plantas y en las asociaciones bioloacutegicas de este con el suelo influenciando el
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estado nutricional y la translocacioacuten de agua en el sistema suelo-planta-atmoacutesfera Uno de los requisitos fundamentales que debe cumplir el sustrato para su utilizacioacuten es la sanidad Cuando estos no se elaboran almacenan o manejan correctamente pueden contaminarse y provocar serios dantildeos a las plantas durante la aclimatacioacuten por esta razoacuten son preferidos como componentes para su elaboracioacuten materiales inertes o aquellos en las cuales el proceso de obtencioacuten garantice la mayor desinfeccioacuten posible
Uno de los factores de mayor importancia a la hora de seleccionar los materiales que pueden constituir el sustrato es su disponibilidad tanto en teacuterminos de facilidad de obtencioacuten o suministro como de su costo (VILCHEZ et al 2007)
La presencia de inhibidores o tambieacuten cambios en el pH del sustrato pueden afectar el crecimiento de las raiacuteces y consecuentemente el eacutexito del transplante
Muchos laboratorios y viveros transplantan a un sustrato uniforme debiendo ser eacuteste adecuado en cuanto a soporte de las plantas pH porosidad aireacioacuten y drenaje (DEBERGH y ZIMMERMAN 1991)
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3 MATERIAL Y MEacuteTODO
Para la realizacioacuten de este trabajo se utilizoacute el siguiente material y meacutetodo
31 Material La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio e invernadero de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal pertenecientes a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de Chile
311 Material vegetal Se utilizaron plaacutentulas de C virescens cultivadas in vitro a partir de semillas las cuales fueron proporcionadas por el laboratorio estas plaacutentulas fueron separadas y repicadas para aumentar la poblacioacuten y obtener la cantidad necesaria para el ensayo
FIGURA 2 Plaacutentulas de C virescens en caacutemara de crecimiento in vitro
312 Materiales Los materiales que se utilizaron fueron los siguientes Equipos autoclave caacutemara de flujo laminar dispensador de medios medidor
de pH agitador magneacutetico horno microondas balanza mechero termoacutemetro Materiales vasos de precipitado matraces probetas pipetas papel de
aluminio frascos de vidrio placas Petri pinzas bisturiacute macetas regadera Soluciones soluciones madre (Medio MS) gelificante etanol 70 y 95
32 Meacutetodo A continuacioacuten se da a conocer la metodologiacutea con la cual se trabajoacute 321 Preparacioacuten del medio de cultivo Para la obtencioacuten de plantas a traveacutes de la micropropagacioacuten se ocupoacute el medio basal de MURASHIGE y SKOOG (1962) tambieacuten llamado medio MS Este medio tiene un pH de entre 56-57 Posteriormente se dosificoacute con el dispensador de medios para que cada frasco tenga una cantidad adecuada (25 mL) y se llevoacute a autoclave para esterilizar a 12 atm 120ordm C por 20 min
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322 Obtencioacuten del material vegetal Al tener el medio esterilizado se procedioacute a la separacioacuten y repicado de plaacutentulas existentes en el laboratorio Las siembras se realizaron en el mes de mayo del 2007 Estas siembras se realizaron en la caacutemara de flujo laminar de modo de asegurar que la siembra sea 100 aseacuteptica Estas plaacutentulas fueron mantenidas en la caacutemara de incubacioacuten hasta obtener los tamantildeos requeridos para el ensayo donde las condiciones fueron las siguientes
minus Temperatura ambiental de 23-25ordm C minus Fotoperiacuteodo de 16 horas minus Intensidad lumiacutenica controlada de 50-55 micromol m-2s-1
323 Sustratos Se utilizaron tres tipos de sustratos el primero corresponde a una mezcla de turba + perlita (11) el segundo corresponde a Sphagnum (100) y el tercero corresponde a una mezcla de turba + arena (11) Una vez realizadas las mezclas se procedioacute a una esterilizacioacuten en un autoclave a 121ordm C por 20 minutos a 12 atmoacutesfera De esta forma se trabajoacute con material limpio y sano evitando ataque de hongos o bacterias El anaacutelisis quiacutemico de los sustratos se muestra en el Anexo 2 324 Plantacioacuten Las plaacutentulas con un promedio de cuatro meses en condiciones de caacutemara de crecimiento in vitro obtuvieron el tamantildeo adecuado para ser utilizadas Se sacaron de los frascos y se plantaron en las macetas de plaacutestico transparente con los sustratos Posteriormente fueron dejadas en la sala del laboratorio donde se debioacute asperjar con solucioacuten nutritiva Hoagland y fungicida Captan CUADRO 1 Composicioacuten de solucioacuten nutritiva Hoagland
KNO3 102 gL Ca(NO3) 4 H2 O 0492 gL
NH4H2 (PO4) 023 gL MgSO4 7 H2O 049 gL
H3BO3 286 mgL MnCl2 2 H2O 181 mgL CuSO4 5 H2O 008 mgL ZnSO4 5 H2O 022 mgL Na2MoO4 H2O 009 mgL
FeSO4 7 H2O 05 06 mL FUENTE FINCK 1988 325 Disentildeo de los ensayos Este trabajo de investigacioacuten constoacute de un ensayo con dos etapas Antes que todo se realizoacute la separacioacuten y repicado in vitro de plaacutentulas de C virescens para la obtencioacuten del nuacutemero necesario de plantas En la etapa 1 se utilizaron tres tamantildeos de plaacutentulas obtenidas in vitro de 1-2cm de 2-3cm y de maacutes de 3cm de altura que se transplantaron a tres sustratos turba + perlita 11(vv) Sphagnum (100) y turba + arena 11 (vv) La turba provino de la Sociedad
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Minera Patagonia Peat SA en Hijuelas el Sphagnum de la empresa Lonquen Chile de Puerto Montt y la perlita se obtuvo a traveacutes del sitio web wwwjardisencl (representante legal Walter Rathgeb Penza Ingeniero Agroacutenomo Santiago) Las plaacutentulas se plantaron de acuerdo a su tamantildeo las de maacutes de 3cm se colocaron de 6 por maceta las de 2 a 3cm de a 8 por maceta y las maacutes chicas de a 10 por maceta Estas macetas fueron dejadas en una sala de aclimatacioacuten con una temperatura promedio de 20ordm C intensidad lumiacutenica de 50-55 micromol m-2s-1 y 14-16 hrs de fotoperiacuteodo Se fertilizoacute asperjando cada cinco diacuteas con solucioacuten nutritiva Hoagland Esta etapa se llevoacute a cabo durante dos meses desde el cinco de septiembre hasta el cinco de noviembre de 2007
En la etapa 2 se continuoacute el proceso de aclimatacioacuten en invernadero de las plaacutentulas obtenidas en la etapa 1 que despueacutes de dos meses teniacutean un mayor tamantildeo y se habiacutean acondicionado al ambiente exterior (fuera de la caacutemara de crecimiento) Las plantas se mantuvieron en las macetas durante tres semanas para aclimatarlas y luego las plantas sobrevivientes fueron transplantadas a macetas maacutes grandes individuales durante tres meses aproximadamente hasta el cinco de marzo 2008 Estas nuevas macetas tuvieron como sustrato turba y suelo (trumao) en igual proporcioacuten (Anexo 2) La temperatura promedio de invernadero fluctuoacute de 13 a 35 degC seguacuten el mes En enero el promedio fue de 25 (Anexo 3) Para bajar la temperatura alrededor de 5deg C se instaloacute una malla Rachel 326 Disentildeo experimental El disentildeo experimental utilizado fue completamente al azar ordenado como experimento factorial con dos factores tamantildeo (3) y sustrato (3) Cada tratamiento tuvo tres repeticiones con un miacutenimo de 6 plantas por recipiente 327 Variables a evaluar Durante los dos meses en que las macetas estuvieron en la sala de aclimatacioacuten se evaluoacute el desarrollo foliar contando el nuacutemero de hojas una vez al mes Posteriormente se trasladaron las mismas macetas a invernadero durante tres semanas para continuar con la aclimatacioacuten de las plaacutentulas Transcurrido este tiempo se transplantaron las plaacutentulas sobrevivientes a macetas individuales y continuoacute mensualmente la evaluacioacuten de eacutestas (nuacutemero de hojas) hasta la obtencioacuten de plantas establecidas Al momento del transplante y al final del ensayo se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces asiacute como tambieacuten al final del ensayo de evaluoacute el crecimiento en altura (cm) La sobrevivencia fue evaluada al final del ensayo por maceta
Tanto en la sala de aclimatacioacuten coacutemo en el invernadero se registroacute la temperatura con la ayuda de un termoacutemetro de maacutexima y miacutenima (Anexo 3) 328 Anaacutelisis estadiacutestico Una vez obtenidos los datos se procedioacute a comprobar si estos cumpliacutean con los supuestos de aleatoriedad normalidad y homogeneidad de varianzas que exige este tipo de anaacutelisis En el caso de no cumplirse estos supuestos los datos se transformaron utilizando log10(x+05) raiacutez(x+05) o 1x para normalizarlos
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y enseguida se sometioacute los datos a un anaacutelisis estadiacutestico (ANDEVA) Posteriormente en los casos en que se observoacute diferencias significativas en el ANDEVA se aplicoacute una prueba de rangos muacuteltiples (Tukey) al 5 de significancia Para las variables no parameacutetricas que no cumplieron con los supuestos para un anaacutelisis de varianza se realizoacute la prueba de KruskalndashWallis y las comparaciones muacuteltiples a traveacutes del test de Dunn con un nivel de 5 de significancia
Se utilizaron los programas estadiacutesticos STATGRAPHICS 20 y GRAPHPAD PRISM 5 para el anaacutelisis de datos
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4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
En los siguientes puntos se discuten los resultados obtenidos en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens
En la Figura 3 se observan plaacutentulas de C virescens micropropagadas en medio MS en caacutemara de crecimiento al inicio del ensayo (A) y en invernadero despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten (B)
BA
FIGURA 3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten
A continuacioacuten se presentan los resultados obtenidos para las variables analizadas (Cuadro 2 y 3) de esta manera se pueden visualizar en general los resultados obtenidos en el proceso de aclimatacioacuten durante seis meses
CUADRO 2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de raiacuteces
inicial y final Variables
Hojas finales (nuacutemero)
Raiacuteces iniciales (nuacutemero)
Raiacuteces finales (nuacutemero)
Tamantildeo de plaacutentulas 36 24 37 47 29 46
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 61 43 76
Sustratos 53 36 56 43 29 51
Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 46 27 49
Significa que hay diferencias significativas al 95 Test de Dunn
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Las variables no parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en hojas finales y raiacuteces iniciales en sus rangos de distribucioacuten Las raiacuteces finales no presentaron diferencias seguacuten el sustrato utilizado pero de acuerdo al tamantildeo hubo diferencias en su distribucioacuten
CUADRO 3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas
Variables Altura final de plaacutentulas
(cm) Sobrevivencia
Tamantildeo de plaacutentulas
36 c 567 b 47 b 821 a
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 59 a 908 a
Sustratos 52 a 933 a
41 ab 59 b Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 49 b 772 a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY Las variables parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en altura final de hojas y en sobrevivencia 41 Nuacutemero de hojas finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentulas y de sustratos para la variable nuacutemero final de hojas 411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula Seguacuten el Cuadro 2 y Figura 4 las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero final de hojas Las plaacutentulas pequentildeas de 1-2 cm obtuvieron el nuacutemero maacutes bajo de hojas finales con una media de 36 hojas por plaacutentula lo cual es la mitad de las hojas finales que se obtuvo con las plaacutentulas de mayor tamantildeo (61 hojas aproximado por plaacutentula) Para las plaacutentulas medianas de 2-3 cm se obtuvo una media de 47 hojas por plaacutentula (Figura 4)
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Hojas finales
1-2 cm 2-3cm maacutes de 3 cm0
5
10
15
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn)
BLANCO (2006) sentildeala que plaacutentulas cultivadas in vitro crecen bajo condiciones especiales como alta humedad relativa y baja luminosidad ademaacutes son suplidas con sacarosa Estas condiciones fueron proporcionadas en una caacutemara de crecimiento en el laboratorio donde las plantas micropropagadas no son dependientes por completo de su fotosiacutentesis son heteroacutetrofas Parece ser necesario un estiacutemulo para convertirse en organismos totalmente capaces de sustentar sus propios requisitos de carbono y nitroacutegeno reducido pasando de esta manera a ser autoacutetrofos
Al ser sacadas de un medio in vitro las hojas no estaacuten preparadas para producir su propio alimento y sobreviven gracias a que el medio de cultivo le proporciona los nutrientes necesarios para vivir En este punto muchas de las hojas mueren y nacen hojas nuevas capaces de generar su alimento supliendo asiacute las hojas viejas (SEELYE et al 2003) En este ensayo las plaacutentulas de Chloraea virescens presentaron en general una buena adaptacioacuten al ser sacadas de un medio in vitro
Se observoacute que plaacutentulas con menor tamantildeo al ser aclimatadas y tener menor tejido fue maacutes difiacutecil y maacutes lento que empezaran a generar nuevos tejidos y materia orgaacutenica a partir de dioacutexido de carbono POSPIacuteŠILOVAacute et al (1999) sentildeala que al tener los estomas con desarrollo incompleto maacutes grandes y de forma maacutes redonda pierden maacutes agua lo cual puede provocar una peacuterdida de hojas muriendo asiacute la plaacutentula Por esta razoacuten las plaacutentulas pequentildeas se demoran maacutes tiempo en generar hojas nuevas es por ello que al finalizar este estudio muestran el menor nuacutemero final de hojas 412 Efecto del tipo de sustrato Al analizar la influencia del tipo de sustrato se encontraron diferencias significativas entre los tres sustratos utilizados Seguacuten el Cuadro 2 y la Figura 5 el sustrato donde se obtuvo mejores resultados fue
27
turba+perlita en el cual se observoacute un promedio de 53 hojas por plaacutentula siendo Sphagnum el maacutes bajo con 43 hojas por plaacutentula De acuerdo a los resultados del anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados el sustrato turba+perlita tiene mayor cantidad de nitroacutegeno foacutesforo calcio magnesio y azufre disponible comparativamente con los otros dos sustratos (Sphagnum y arena+turba) (Anexo 2)
Hojas finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
Sustratos
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) Para la brotacioacuten y el crecimiento de las plantas se necesita agua y Nitroacutegeno lo que favorece a una mayor tasa de aparicioacuten de hojas lo que se traduce en una mayor cantidad de hojas finales El Nitroacutegeno se encuentra en mayor cantidad en el sustrato turba+perlita debido a lo cual los mejores resultados se obtienen en dicho sustrato 413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Despueacutes de analizados los efectos individuales del tamantildeo y del sustrato al interactuar ambos factores existen diferencias significativas La mejor interaccioacuten se obtuvo con el sustrato turba+perlita y con el mayor tamantildeo de la plaacutentula (Figura 6) Debido a la buena estructura (porosa) de dicho sustrato se podriacutea decir que se favorecioacute la absorcioacuten radicular de nutrientes obteniendo por ello un mayor nuacutemero de hojas finales Para los menores tamantildeos no se observan diferencias significativas obteniendo como promedio 41 hojas por plaacutentula Para el mayor tamantildeo el promedio fue de 6 hojas por plaacutentula
28
Hojas finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 42 Raiacuteces iniciales Este paraacutemetro se evaluoacute luego de la primera etapa de aclimatacioacuten la cual se realizoacute en una sala de aclimatacioacuten del laboratorio Se analizoacute la influencia de diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos sobre la variable nuacutemero raiacuteces iniciales (Anaacutelisis de Kruskal-Wallis en Anexo 7)
FIGURA 7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses de pre aclimatacioacuten
29
En la Figura 7 se puede observar los resultados de pre aclimatacioacuten en sala de laboratorio En esta etapa ya es posible ver la presencia de raiacuteces desarrolladas 421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula En el Cuadro 2 se puede observar que las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero inicial de raiacuteces y en la Figura 8 se puede comprobar que para los dos tamantildeos de plaacutentula maacutes pequentildeos no se observa gran cantidad de raiacuteces esto no impidioacute el desarrollo posterior de las plaacutentulas las cuales lograron enraizar al final del estudio Esto se contrapone a lo observado en un estudio de Lapageria rosea donde la presencia de raiacutez y brote para lograr una multiplicacioacuten exitosa de plantas es de vital importancia Incluso algunas plaacutentulas de L rosea no brotan en condiciones in vitro en donde tienen las mejores condiciones nutricionales y hormonales para hacerlo Esto se debe a factores internos de la plaacutentula siendo muy difiacutecil que broten inmediatamente en caacutemara de aclimatacioacuten donde ya dejan de recibir los nutrientes necesarios de manera directa y requieren de balances de energiacutea para poder seguir elongando raiacuteces absorber nutrientes y brotar para poder obtener los carbohidratos necesarios para seguir su crecimiento (BLANCO 2006) El tamantildeo de plaacutentula tiene importancia para el desarrollo de raiacuteces se distingue notoriamente que en los tamantildeos maacutes grandes el nuacutemero de raiacuteces es mayor comparativamente con los tamantildeos pequentildeos donde el nuacutemero de raiacuteces fue escaso Debido a la presencia de maacutes hojas existe una mayor cantidad de aacuterea fotosinteacutetica esta situacioacuten estimula el crecimiento de las raiacuteces para la obtencioacuten de agua y nutrientes
Raices iniciales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
2
4
6
8
10
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o inicial de ra
iacuteces
FIGURA 8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn)
30
422 Efecto del tipo de sustrato Para el sustrato turba+perlita se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas en el nuacutemero de raiacuteces con respecto a los dos otros sustratos esto se puede ver en el Figura 9 donde se observa que se obtuvieron los mayores resultados En cualquier medio de crecimiento el espacio no ocupado por un soacutelido se llama porosidad este espacio puede ser ocupado en parte para retener agua y en parte para proporcionarle aire a las raiacuteces La ausencia de uno de estos elementos es perjudicial para las plantas La turba es conocida por tener estas propiedades y la perlita tambieacuten por esta razoacuten se sabe que la mezcla turba-perlita provee propiedades fiacutesicas excelentes como medio de crecimiento y propagacioacuten (INFOAGRO 2007) Estos resultados con turba-perlita (298 de materia orgaacutenica) coinciden con los obtenidos por DIAZ et al (2004) quienes al utilizar un sustrato compuesto por 100 de humus de lombriz para aclimatar cantildea de azuacutecar obtuvieron el mayor nuacutemero de raiacuteces Esto puede atribuirse al importante aporte de materia orgaacutenica del humus (47) lo que le confiere una mejor estructura obtenieacutendose una excelente porosidad del sustrato La aireacioacuten del suelo es necesaria para favorecer la maacutexima absorcioacuten de nutrientes por las raiacuteces Esto tambieacuten sucede en el sustrato turba+perlita el cual posee la mayor cantidad de materia orgaacutenica de los tres sustratos utilizados
Raices iniciales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
2
4
6
8
10
Sustratos
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato En los anaacutelisis para la variable nuacutemero de raiacuteces se puede decir que la mejor interaccioacuten se presentoacute para el sustrato de turba+perlita junto con el mayor tamantildeo de plaacutentulas obteniendo los valores maacutes altos entre los nueve tratamientos La presencia de raiacuteces luego de la micropropagacioacuten aumenta la posibilidad de eacutexito en el transplante ya que se crea un favorable balance de agua Pero esto no quiere
31
decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
10
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
32
En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
33
El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
34
Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
13
germinacioacuten de un 68 al ser sembradas in vitro junto con el hongo micorriacutezico adecuado Las dos especies restantes no germinaron durante el periacuteodo de observacioacuten pero las semillas fueron evaluadas como intactas y testeadas positivamente en cuanto a su viabilidad despueacutes de cuatro antildeos en el suelo Estas observaciones fueron interpretadas como diferentes estrategias para especies especiacuteficas de germinacioacuten in situ (WHIGHAM et al 2005) 2414 Sobrevivencia de orquiacutedeas terrestres transplantadas a sectores urbanos La conservacioacuten de poblaciones de orquiacutedeas silvestres depende del establecimiento de las orquiacutedeas propagadas a los campos Sin embargo se conoce muy poco de los factores bioacuteticos que influencian el establecimiento de orquiacutedeas terrestres a sus haacutebitats naturales Un experimento fue establecido para medir la sobrevivencia de seis especies durante su primer periacuteodo de crecimiento seguido del transplante a un sector urbano en Australia (SCADE et al 2006)
Las orquiacutedeas germinadas simbioacuteticamente crecieron en laboratorio durante cinco meses antes de establecer la plantacioacuten en sitios adyacentes con alta o baja cobertura de malezas Existioacute una muerte gradual de las plaacutentulas durante el primer periacuteodo de crecimiento primeramente por ataque de insectos no siendo evitado por la presencia de una malla cobertora Los iacutendices de sobrevivencia variacutean desde 49 para Microtis media una especie capaz de crecer en un ambiente atiacutepico hasta un 21 para Caladenia arenicola la orquiacutedea nativa maacutes comuacuten de esos sitios Sin embargo no todas las orquiacutedeas sobrevivientes producen tubeacuterculos por lo que la tasa de sobrevivencia despueacutes del primer periacuteodo seco disminuye
La sobrevivencia de las orquiacutedeas sembradas no puede ser comparada con orquiacutedeas de la misma especie que crecieron en los mismos lugares ya que no existioacute la presencia del hongo compatible para estas orquiacutedeas (SCADE et al 2006)
2415 Micropropagacioacuten de orquiacutedeas terrestres En India dos orquiacutedeas muy importantes para la horticultura del geacutenero Anoectochilus fueron exitosamente propagadas Noacutedulos aislados de A sikkimensis colectadas en Himalaya y A regalis colectadas en India fueron cultivadas in vitro durante 12 semanas para obtener un maacuteximo de 48 a 56 protocormos y brotes obteniendo como resultado un 95 y 98 de eficiencia respectivamente Durante el repicado de los explantes in vitro de A regalis se observoacute que el nuacutemero total de brotes obtenidos a partir de noacutedulos fue 214 asiacute como tambieacuten 82 puntas de brotes En cambio para A sikkimensis fueron mucho maacutes bajos 123 y 43 respectivamente teniendo un crecimiento maacutes lento pero plantas maacutes fuertes Las raiacuteces de 4 a 6cm crecieron con la presencia de NAA (270 microM ) en el medio asiacute como tambieacuten con carbono activado (02) Durante la aclimatacioacuten la tasa de establecimiento fue entre 95 y 98 Luego de seis meses en invernadero las plantas de A regalis fueron transferidas a bosque nativo donde se obtuvo una tasa de
14
sobrevivencia de entre 70 y 95 despueacutes de 12 meses Estas plantas establecidas en bosque nativo estaacuten libres de cualquier defecto morfoloacutegico y de crecimiento (GANGAPRASAD et al 2000) 242 Orquiacutedeas epiacutefitas Estas orquiacutedeas viven en los aacuterboles pero no obtienen de eacuteste su alimento no son paraacutesitas 2421 Preservacioacuten de Cattleya walkeriana usando propagacioacuten in vitro El geacutenero Cattleya se encuentra en Meacutexico y Ameacuterica Central asiacute como tambieacuten en Venezuela Colombia y las laderas de los Andes Esta orquiacutedea tambieacuten se encuentra en varias regiones del Brasil creciendo en aacuterboles rocas cerca de riacuteos lagos y pantanos Las flores de esta orquiacutedea son conocidas debido a su hermosura y a causa de la destruccioacuten de su haacutebitat y a la excesiva coleccioacuten de eacutestas se encuentra en extincioacuten
La composicioacuten del medio de cultivo es esencial para la propagacioacuten in vitro ya que suple todos los nutrientes necesarios para el desarrollo y seraacute distinto dependiendo de cada especie en este caso se utilizoacute la mitad de los macronutrientes del medio Muchos autores sugieren el uso de carboacuten activado en el medio ya que por lo general en muchas especies aumenta el desarrollo de las raiacuteces En este estudio se probaron distintas dosis de carboacuten activado 1 2 4 y 6gL con un pH de 6 (TADEU DE FARIA et al 2002) Las semillas se obtuvieron de flores artificialmente polinizadas en invernadero Plaacutentulas de aproximadamente un centiacutemetro fueron seleccionadas y cultivadas nuevamente en el medio de cultivo Murashige y Skoog pero esta vez con las diferentes dosis de carboacuten activado Se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces el nuacutemero de brotes y el peso de la materia verde total Durante el autoclavado se produce normalmente una hidroacutelisis de sacarina la cual es de 10 aproximadamente este porcentaje aumenta considerablemente al agregar un 1 de carboacuten activado llegando a ser de 95
El desarrollo de las plaacutentulas de C walkeriana aumentan con una mayor concentracioacuten de carboacuten activado asiacute como tambieacuten un mayor tiempo de cultivo El resultado fue que la dosis ideal para el desarrollo de esta orquiacutedea es 2gL de carboacuten activado (TADEU DE FARIA et al 2002) 2422 Establecimiento de cultivos in vitro y micropropagacioacuten de Cattleya aurantiaca (Bateman ex Lindl) Por medio de siembra in vitro se logroacute el establecimiento de C aurantiaca con alto porcentaje de germinacioacuten y desarrollo de protocormos Para la oacuteptima formacioacuten de callo y para la proliferacioacuten de protocormos se determinaron los medios oacuteptimos (MS 10 mgL ANA 10 mgL BA) asiacute como tambieacuten de manera directa sobre explantes de hoja y pseudobulbos (MS 01 mgL ANA 01 mgL GA3)
15
Con este uacuteltimo medio tambieacuten se logroacute una oacuteptima regeneracioacuten y desarrollo de plaacutentulas Los medios liacutequidos (sin agitacioacuten) son una buena opcioacuten para conseguir la produccioacuten masiva de protocormos ya que con ellos se optimizoacute la micropropagacioacuten de C aurantiaca Las plaacutentulas micropropagadas presentaron alto porcentaje de sobrevivencia y buen desarrollo despueacutes de su trasplante y aclimatacioacuten lo cual demuestra que es un buen sistema de propagacioacuten para C aurantiaca (GUTIERREZ y SALGADO 2007) En cuanto a transplante y aclimatacioacuten despueacutes de 45 diacuteas de desarrollo in vitro las plaacutentulas de un tamantildeo entre 3 y 5 cm con raiacuteces bien desarrolladas fueron llevadas a condiciones ex vitro eliminando los restos de medio de cultivo con agua potable y ocupando un sustrato de partes iguales de tezontle y corteza de encino cubierta con hojarasca de encino finamente molida Se mantuvieron cubiertas durante 15 diacuteas abriendo cada dos diacuteas hasta poder retirar la tapa en 30 diacuteas Despueacutes de dos meses de haber sido retiradas del cultivo in vitro las plaacutentulas presentaron 70 de sobrevivencia y alcanzaron una altura de hasta 7 cm presentando nuevas hojas y raiacuteces las plantas se muestran vigorosas y capaces de continuar su crecimiento en condiciones ambientales de invernadero (GUTIERREZ y SALGADO 2007)
2423 Establecimiento in vitro y regeneracioacuten de plantas de Laelia autumnalis (Llave y Lex) Lindl Para este estudio se obtuvieron las semillas de una caacutepsula desarrollada despueacutes de 6 meses de la floracioacuten las cuales se sembraron in vitro sin presentar contaminacioacuten ya que la siembra por este meacutetodo es muy eficiente en comparacioacuten al cultivo de semillas libres donde algunas veces se presenta la contaminacioacuten Las observaciones se realizaron cada 15 diacuteas la germinacioacuten se detectoacute en los primeros 15 diacuteas en la mayoriacutea de los medios de cultivos probados con la presencia de protocormos de 1mm de diaacutemetro (HUAPEO y SALGADO 2004) El porcentaje de germinacioacuten que se obtuvo de las semillas cultivadas in vitro de L autumnalis fue de 95 a 100 en todos los medios de cultivo la uacutenica diferencia fue el tiempo entre las germinaciones A excepcioacuten de las semillas cultivadas en el medio MS 100 la germinacioacuten del 100 se obtuvo hasta los 30 diacuteas de cultivo mientras que en el primero la germinacioacuten fue a los 15 diacuteas del cultivo Las plaacutentulas con raiacutez y un par de hojas se lograron a los 90 diacuteas de cultivo en el medio MS 100 alcanzando 07 mm de altura Estas plaacutentulas fueron subcultivadas en medio MS con 05 mgl de ANA y 01 mgl de GA3 para tener plaacutentulas fuente de explante (segmentos de hojas) un medio oacuteptimo de desarrollo de plaacutentulas de L speciosa No fue necesario probar otros medios de cultivos ya que se hicieron pruebas anteriores que demostraron que era el adecuado
Las plaacutentulas de 6 meses de cultivo in vitro despueacutes de su germinacioacuten presentaron una altura promedio de 5 cm con raiacuteces con velamen y hasta dos pares de hojas Segmentos de hoja de eacutestas fueron cultivadas en el medio MS conteniendo ANA BA y GA3 en diferentes concentraciones y se realizaron observaciones cada 30 diacuteas para determinar medios inductores de callo protocormos y raiacuteces La mejor respuesta en formacioacuten de callo fue observada en los segmentos de hoja de plaacutentulas de L autumnalis cultivados en MS con 1 mgl de ANA BA y GA3 iniciando la induccioacuten de
16
eacuteste desde los 30 diacuteas de cultivo solamente en un 70 de los explantes cultivados El 100 se logroacute a los 90 diacuteas de cultivo observando callo abundante alrededor de todo el tejido de color blanco con puntos pigmentados de color verde La regeneracioacuten de protocormos de esta orquiacutedea se establecioacute con la siembra de segmentos de hoja de plaacutentulas de 6 meses de edad de manera directa o a partir de callos En callos la produccioacuten fue oacuteptima en el medio MS con 01 mgl de ANABAGA3 ya que a los 60 diacuteas se obtuvieron 50 protocormos por segmento de callo Solamente se produjeron 10 protocormos por explante al cultivarse los segmentos de hoja en MS con 01 mgl de ANABAGA3 a los 120 diacuteas de cultivo (HUAPEO y SALGADO 2004) 25 Aclimatacioacuten Aclimatacioacuten significa que el hombre intercede y guiacutea el proceso de acondicionamiento de las plantas hasta que eacutestas sean aptas para crecer en el campo yo invernadero
Un alto nuacutemero de plantas micropropagadas no sobreviven al cambio desde el cultivo in vitro hacia el ambiente exterior ya sea en campo o invernadero Eacutestos dos uacuteltimos tienen menor humedad relativa niveles maacutes altos de luminosidad y un ambiente seacuteptico los cuales son maacutes estresantes para las plantas micropropagadas La mayoriacutea de las especies que crecen in vitro necesitan un proceso de aclimatacioacuten pudiendo obtener asiacute un nuacutemero suficiente de plantas vivas y vigorosas para trasplantar al suelo (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991)
La aclimatacioacuten no es uacutenicamente para micropropagacioacuten siendo usada ademaacutes en propagacioacuten convencional durante antildeos Despueacutes de cortar las hojas y de haber formado raiacuteces por lo general son aclimatadas antes de ser llevadas al campo o invernadero Ejemplos de dos teacutecnicas comunes son bajar gradualmente la humedad y mantener el nivel de luz con un 50 de sombra antes de trasladarlos al campo Las raiacuteces que han sido cortadas y mal limpiadas muchas veces son focos de infeccioacuten En estos casos las plantas muestran signos de marchitez hojas necrosadas y tambieacuten se puede llegar a la muerte de eacutestas El cultivo in vitro reduce la necesidad de fotosiacutentesis ya que las condiciones de la caacutemara de incubacioacuten proveen a la planta de sacarosa u otro azuacutecar Tambieacuten en estas condiciones se reduce el stress por patoacutegenos al ser un ambiente aseacuteptico Todo esto se traduce en que las plantas micropropagadas no son aptas para el campo yo invernadero (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 251 Stress hiacutedrico El stress hiacutedrico puede ser el resultado de una excesiva transpiracioacuten de las diferentes partes aeacutereas de las plantas especialmente de las hojas o por una inadecuada absorcioacuten de agua por parte de las raiacuteces La cutiacutecula y los estomas son la ruta primaria de peacuterdida de agua desde de las hojas provenientes de esta teacutecnica reproductiva 2511 Cutiacutecula La cutiacutecula es una membrana compuesta por una matriz de cutina que a su vez se encuentra cubierta en su superficie por ceras cuya funcioacuten primaria consiste en limitar la peacuterdida de agua por transpiracioacuten La permeabilidad del agua a traveacutes de la cutiacutecula se ve influenciada principalmente por la estructura y la cantidad de
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ceras cuticulares y epicuticulares no vieacutendose afectada la peacuterdida de agua por el grosor de eacutesta o la naturaleza quiacutemica de la matriz de la cutina La estructura cristalina de la parte encerada de las hojas es distinta en las plantas micropropagadas con respecto a las plantas que crecen en el campo La cera epicuticular de las hojas de plantas in vitro tienen una proporcioacuten maacutes alta de esteres y de componentes polares por el contrario tienen unas cadenas de hidrocarbonos mucho maacutes cortas Esto hace que las plantas in vitro pierdan maacutes agua que las cultivadas en campo o invernadero
Las plantas que han crecido en el campo son naturalmente de color verde pero el color de las plantas cultivadas in vitro es diferente y se puede ver a simple vista Las plantas que son pasadas a invernadero y que tengan un color verde se aclimatan de mejor forma al ambiente exterior (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 2512 Estomas La estructura estomaacutetica y su funcionamiento han sido implicados recurrentemente en el desbalance de agua exhibido por plantas micropropagadas al momento de ser removidas del cultivo in vitro Estudios con microscopiacutea de scanner electroacutenico han indicado que la estructura estomaacutetica presente en algunas especies de plantas cultivadas in vitro difieren marcadamente de las cultivadas en invernadero o en el suelo Debido a que las primeras presentan estomas de mayor tamantildeo y maacutes redondos a diferencia de las plantas cultivadas de manera normal que presentan estomas maacutes pequentildeos y eliacutepticos lo que resulta en una deshidratacioacuten maacutes raacutepida en el caso de las provenientes de cultivo in vitro (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 252 Humedad Debido a la anatomiacutea y la condicioacuten fisioloacutegica de las plantas desarrolladas in vitro donde se ha mantenido una alta humedad relativa es necesario regar al momento del traslado para obtener una alta sobrevivencia Muchos laboratorios aseguran que hay que evitar tener un sistema de aspersioacuten ya que se produce el ambiente necesario (muy huacutemedo) para la aparicioacuten de hongos algas o bacterias Otros meacutetodos incluyen el uso de humidificadores o poner las macetas en un lugar cerrado donde se retenga vapor para esto se pueden usar por ejemplo tapas de polietileno Este meacutetodo es relativamente econoacutemico pero se debe tener control del calor y monitorear la falta de agua (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 253 Luz Durante la etapa in vitro las plantas estaacuten expuestas a altos niveles de luminosidad lo que se traduce en hojas delgadas Antes del traslado se recomienda mantener las plantas con un 50 de sombra para asiacute poder aclimatarlas de mejor manera esto debido a que las plantas micropropagadas tienen un bajo control sobre la transpiracioacuten y un inadecuado mecanismo de fotosiacutentesis La sombra reduce la transpiracioacuten evitando excesivas peacuterdidas de agua asiacute como tambieacuten el exceso de luz destruye las moleacuteculas de clorofila Luego del periacuteodo bajo sombra se deben mover las macetas gradualmente hacia el nivel de luz al cual seraacute llevado para su crecimiento final (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 254 Temperatura La temperatura del aire y del medio o sustrato de crecimiento estaacute generalmente controlado durante el periacuteodo de aclimatacioacuten El calor es necesario en los meses de invierno y el friacuteo (enfriar) es esencial en los meses de verano Ajustando la cantidad de sombra y humedad se obtiene un control sobre la temperatura El
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enfriamiento se puede obtener gracias a ventilacioacuten abanicos niebla o aire acondicionado El calor puede provenir del sistema existente en el edificio o invernadero donde esteacuten ubicadas las macetas o por las laacutemparas ocupadas para el control del fotoperiacuteodo El rango de temperatura que se mantiene por lo general es entre los 13 y 30ordmC y esta determinado principalmente por la especie en cuestioacuten La temperatura de la zona donde se encuentran las raiacuteces es muy importante para el crecimiento lo ideal es que dicho sector tenga una mayor temperatura que el aire fomentando el crecimiento de las raiacuteces e incrementando la humedad alrededor de la planta Durante el verano esto es difiacutecil de obtener ya que la temperatura del aire es muy alta debido a la alta radiacioacuten solar Terminado el proceso de aclimatacioacuten esto ya no es necesario (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 255 Fotosiacutentesis Las plantas sufren un cambio radical cuando son removidas desde cultivo in vitro ya que son forzadas a cambiar de heterotroacuteficas a autotroacuteficas y la fotosiacutentesis se vuelve fundamental para la sobrevivencia Las hojas de las plantas in vitro no estaacuten formadas para hacer fotosiacutentesis ya que en la caacutemara de incubacioacuten no se produce un fuerte intercambio gaseoso esto debido a que la sacarosa es entregada a traveacutes del medio de cultivo Las hojas de las plantas que son trasladadas al campo o invernadero sufren deterioro debido a que no estaacuten formadas para la fijacioacuten de carbono Esto se produce por un tiempo aproximado de cuatro semanas despueacutes de las cuales las hojas nuevas suplen a las viejas Otro punto es que las hojas de las plantas cultivadas in vitro contienen menor proporcioacuten de clorofila que las plantas que han crecido normalmente en el campo En un estudio de coliflor cultivado in vitro se midioacute el CO2 y se obtuvo un balance negativo el cual se mantuvo durante dos semanas despueacutes del transplante Algo similar ocurrioacute con frutilla despueacutes del transplante las hojas se deterioraron raacutepidamente lo que quiere decir que no hubo incremento en la fijacioacuten de carbono indicando falta de desarrollo en la competencia fotosinteacutetica
El bajo nivel de CO2 durante el cultivo in vitro limita el proceso de fotosiacutentesis lo cual se puede compensar usando sacarosa en el medio de cultivo Tambieacuten se puede incrementar el nivel de luz y CO2 obteniendo un fuerte aumento en el crecimiento de varias especies como orquiacutedeas clavel etc (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 256 Sustrato Un sustrato es todo material soacutelido distinto del suelo natural mineral u orgaacutenico que colocado en un contenedor en forma pura o en mezcla permite el anclaje del sistema radicular de la planta desempentildeando por lo tanto un papel de soporte para la planta El sustrato puede intervenir o no en el complejo proceso de la nutricioacuten mineral de la planta (INFOAGRO 2007) El sustrato y los contenedores dentro de los cuales se van a transplantar las plaacutentulas in vitro son importantes para una buena sobrevivencia
Los sustratos ejercen una influencia significativa en la arquitectura del sistema radical de las plantas y en las asociaciones bioloacutegicas de este con el suelo influenciando el
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estado nutricional y la translocacioacuten de agua en el sistema suelo-planta-atmoacutesfera Uno de los requisitos fundamentales que debe cumplir el sustrato para su utilizacioacuten es la sanidad Cuando estos no se elaboran almacenan o manejan correctamente pueden contaminarse y provocar serios dantildeos a las plantas durante la aclimatacioacuten por esta razoacuten son preferidos como componentes para su elaboracioacuten materiales inertes o aquellos en las cuales el proceso de obtencioacuten garantice la mayor desinfeccioacuten posible
Uno de los factores de mayor importancia a la hora de seleccionar los materiales que pueden constituir el sustrato es su disponibilidad tanto en teacuterminos de facilidad de obtencioacuten o suministro como de su costo (VILCHEZ et al 2007)
La presencia de inhibidores o tambieacuten cambios en el pH del sustrato pueden afectar el crecimiento de las raiacuteces y consecuentemente el eacutexito del transplante
Muchos laboratorios y viveros transplantan a un sustrato uniforme debiendo ser eacuteste adecuado en cuanto a soporte de las plantas pH porosidad aireacioacuten y drenaje (DEBERGH y ZIMMERMAN 1991)
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3 MATERIAL Y MEacuteTODO
Para la realizacioacuten de este trabajo se utilizoacute el siguiente material y meacutetodo
31 Material La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio e invernadero de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal pertenecientes a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de Chile
311 Material vegetal Se utilizaron plaacutentulas de C virescens cultivadas in vitro a partir de semillas las cuales fueron proporcionadas por el laboratorio estas plaacutentulas fueron separadas y repicadas para aumentar la poblacioacuten y obtener la cantidad necesaria para el ensayo
FIGURA 2 Plaacutentulas de C virescens en caacutemara de crecimiento in vitro
312 Materiales Los materiales que se utilizaron fueron los siguientes Equipos autoclave caacutemara de flujo laminar dispensador de medios medidor
de pH agitador magneacutetico horno microondas balanza mechero termoacutemetro Materiales vasos de precipitado matraces probetas pipetas papel de
aluminio frascos de vidrio placas Petri pinzas bisturiacute macetas regadera Soluciones soluciones madre (Medio MS) gelificante etanol 70 y 95
32 Meacutetodo A continuacioacuten se da a conocer la metodologiacutea con la cual se trabajoacute 321 Preparacioacuten del medio de cultivo Para la obtencioacuten de plantas a traveacutes de la micropropagacioacuten se ocupoacute el medio basal de MURASHIGE y SKOOG (1962) tambieacuten llamado medio MS Este medio tiene un pH de entre 56-57 Posteriormente se dosificoacute con el dispensador de medios para que cada frasco tenga una cantidad adecuada (25 mL) y se llevoacute a autoclave para esterilizar a 12 atm 120ordm C por 20 min
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322 Obtencioacuten del material vegetal Al tener el medio esterilizado se procedioacute a la separacioacuten y repicado de plaacutentulas existentes en el laboratorio Las siembras se realizaron en el mes de mayo del 2007 Estas siembras se realizaron en la caacutemara de flujo laminar de modo de asegurar que la siembra sea 100 aseacuteptica Estas plaacutentulas fueron mantenidas en la caacutemara de incubacioacuten hasta obtener los tamantildeos requeridos para el ensayo donde las condiciones fueron las siguientes
minus Temperatura ambiental de 23-25ordm C minus Fotoperiacuteodo de 16 horas minus Intensidad lumiacutenica controlada de 50-55 micromol m-2s-1
323 Sustratos Se utilizaron tres tipos de sustratos el primero corresponde a una mezcla de turba + perlita (11) el segundo corresponde a Sphagnum (100) y el tercero corresponde a una mezcla de turba + arena (11) Una vez realizadas las mezclas se procedioacute a una esterilizacioacuten en un autoclave a 121ordm C por 20 minutos a 12 atmoacutesfera De esta forma se trabajoacute con material limpio y sano evitando ataque de hongos o bacterias El anaacutelisis quiacutemico de los sustratos se muestra en el Anexo 2 324 Plantacioacuten Las plaacutentulas con un promedio de cuatro meses en condiciones de caacutemara de crecimiento in vitro obtuvieron el tamantildeo adecuado para ser utilizadas Se sacaron de los frascos y se plantaron en las macetas de plaacutestico transparente con los sustratos Posteriormente fueron dejadas en la sala del laboratorio donde se debioacute asperjar con solucioacuten nutritiva Hoagland y fungicida Captan CUADRO 1 Composicioacuten de solucioacuten nutritiva Hoagland
KNO3 102 gL Ca(NO3) 4 H2 O 0492 gL
NH4H2 (PO4) 023 gL MgSO4 7 H2O 049 gL
H3BO3 286 mgL MnCl2 2 H2O 181 mgL CuSO4 5 H2O 008 mgL ZnSO4 5 H2O 022 mgL Na2MoO4 H2O 009 mgL
FeSO4 7 H2O 05 06 mL FUENTE FINCK 1988 325 Disentildeo de los ensayos Este trabajo de investigacioacuten constoacute de un ensayo con dos etapas Antes que todo se realizoacute la separacioacuten y repicado in vitro de plaacutentulas de C virescens para la obtencioacuten del nuacutemero necesario de plantas En la etapa 1 se utilizaron tres tamantildeos de plaacutentulas obtenidas in vitro de 1-2cm de 2-3cm y de maacutes de 3cm de altura que se transplantaron a tres sustratos turba + perlita 11(vv) Sphagnum (100) y turba + arena 11 (vv) La turba provino de la Sociedad
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Minera Patagonia Peat SA en Hijuelas el Sphagnum de la empresa Lonquen Chile de Puerto Montt y la perlita se obtuvo a traveacutes del sitio web wwwjardisencl (representante legal Walter Rathgeb Penza Ingeniero Agroacutenomo Santiago) Las plaacutentulas se plantaron de acuerdo a su tamantildeo las de maacutes de 3cm se colocaron de 6 por maceta las de 2 a 3cm de a 8 por maceta y las maacutes chicas de a 10 por maceta Estas macetas fueron dejadas en una sala de aclimatacioacuten con una temperatura promedio de 20ordm C intensidad lumiacutenica de 50-55 micromol m-2s-1 y 14-16 hrs de fotoperiacuteodo Se fertilizoacute asperjando cada cinco diacuteas con solucioacuten nutritiva Hoagland Esta etapa se llevoacute a cabo durante dos meses desde el cinco de septiembre hasta el cinco de noviembre de 2007
En la etapa 2 se continuoacute el proceso de aclimatacioacuten en invernadero de las plaacutentulas obtenidas en la etapa 1 que despueacutes de dos meses teniacutean un mayor tamantildeo y se habiacutean acondicionado al ambiente exterior (fuera de la caacutemara de crecimiento) Las plantas se mantuvieron en las macetas durante tres semanas para aclimatarlas y luego las plantas sobrevivientes fueron transplantadas a macetas maacutes grandes individuales durante tres meses aproximadamente hasta el cinco de marzo 2008 Estas nuevas macetas tuvieron como sustrato turba y suelo (trumao) en igual proporcioacuten (Anexo 2) La temperatura promedio de invernadero fluctuoacute de 13 a 35 degC seguacuten el mes En enero el promedio fue de 25 (Anexo 3) Para bajar la temperatura alrededor de 5deg C se instaloacute una malla Rachel 326 Disentildeo experimental El disentildeo experimental utilizado fue completamente al azar ordenado como experimento factorial con dos factores tamantildeo (3) y sustrato (3) Cada tratamiento tuvo tres repeticiones con un miacutenimo de 6 plantas por recipiente 327 Variables a evaluar Durante los dos meses en que las macetas estuvieron en la sala de aclimatacioacuten se evaluoacute el desarrollo foliar contando el nuacutemero de hojas una vez al mes Posteriormente se trasladaron las mismas macetas a invernadero durante tres semanas para continuar con la aclimatacioacuten de las plaacutentulas Transcurrido este tiempo se transplantaron las plaacutentulas sobrevivientes a macetas individuales y continuoacute mensualmente la evaluacioacuten de eacutestas (nuacutemero de hojas) hasta la obtencioacuten de plantas establecidas Al momento del transplante y al final del ensayo se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces asiacute como tambieacuten al final del ensayo de evaluoacute el crecimiento en altura (cm) La sobrevivencia fue evaluada al final del ensayo por maceta
Tanto en la sala de aclimatacioacuten coacutemo en el invernadero se registroacute la temperatura con la ayuda de un termoacutemetro de maacutexima y miacutenima (Anexo 3) 328 Anaacutelisis estadiacutestico Una vez obtenidos los datos se procedioacute a comprobar si estos cumpliacutean con los supuestos de aleatoriedad normalidad y homogeneidad de varianzas que exige este tipo de anaacutelisis En el caso de no cumplirse estos supuestos los datos se transformaron utilizando log10(x+05) raiacutez(x+05) o 1x para normalizarlos
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y enseguida se sometioacute los datos a un anaacutelisis estadiacutestico (ANDEVA) Posteriormente en los casos en que se observoacute diferencias significativas en el ANDEVA se aplicoacute una prueba de rangos muacuteltiples (Tukey) al 5 de significancia Para las variables no parameacutetricas que no cumplieron con los supuestos para un anaacutelisis de varianza se realizoacute la prueba de KruskalndashWallis y las comparaciones muacuteltiples a traveacutes del test de Dunn con un nivel de 5 de significancia
Se utilizaron los programas estadiacutesticos STATGRAPHICS 20 y GRAPHPAD PRISM 5 para el anaacutelisis de datos
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4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
En los siguientes puntos se discuten los resultados obtenidos en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens
En la Figura 3 se observan plaacutentulas de C virescens micropropagadas en medio MS en caacutemara de crecimiento al inicio del ensayo (A) y en invernadero despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten (B)
BA
FIGURA 3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten
A continuacioacuten se presentan los resultados obtenidos para las variables analizadas (Cuadro 2 y 3) de esta manera se pueden visualizar en general los resultados obtenidos en el proceso de aclimatacioacuten durante seis meses
CUADRO 2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de raiacuteces
inicial y final Variables
Hojas finales (nuacutemero)
Raiacuteces iniciales (nuacutemero)
Raiacuteces finales (nuacutemero)
Tamantildeo de plaacutentulas 36 24 37 47 29 46
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 61 43 76
Sustratos 53 36 56 43 29 51
Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 46 27 49
Significa que hay diferencias significativas al 95 Test de Dunn
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Las variables no parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en hojas finales y raiacuteces iniciales en sus rangos de distribucioacuten Las raiacuteces finales no presentaron diferencias seguacuten el sustrato utilizado pero de acuerdo al tamantildeo hubo diferencias en su distribucioacuten
CUADRO 3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas
Variables Altura final de plaacutentulas
(cm) Sobrevivencia
Tamantildeo de plaacutentulas
36 c 567 b 47 b 821 a
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 59 a 908 a
Sustratos 52 a 933 a
41 ab 59 b Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 49 b 772 a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY Las variables parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en altura final de hojas y en sobrevivencia 41 Nuacutemero de hojas finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentulas y de sustratos para la variable nuacutemero final de hojas 411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula Seguacuten el Cuadro 2 y Figura 4 las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero final de hojas Las plaacutentulas pequentildeas de 1-2 cm obtuvieron el nuacutemero maacutes bajo de hojas finales con una media de 36 hojas por plaacutentula lo cual es la mitad de las hojas finales que se obtuvo con las plaacutentulas de mayor tamantildeo (61 hojas aproximado por plaacutentula) Para las plaacutentulas medianas de 2-3 cm se obtuvo una media de 47 hojas por plaacutentula (Figura 4)
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Hojas finales
1-2 cm 2-3cm maacutes de 3 cm0
5
10
15
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn)
BLANCO (2006) sentildeala que plaacutentulas cultivadas in vitro crecen bajo condiciones especiales como alta humedad relativa y baja luminosidad ademaacutes son suplidas con sacarosa Estas condiciones fueron proporcionadas en una caacutemara de crecimiento en el laboratorio donde las plantas micropropagadas no son dependientes por completo de su fotosiacutentesis son heteroacutetrofas Parece ser necesario un estiacutemulo para convertirse en organismos totalmente capaces de sustentar sus propios requisitos de carbono y nitroacutegeno reducido pasando de esta manera a ser autoacutetrofos
Al ser sacadas de un medio in vitro las hojas no estaacuten preparadas para producir su propio alimento y sobreviven gracias a que el medio de cultivo le proporciona los nutrientes necesarios para vivir En este punto muchas de las hojas mueren y nacen hojas nuevas capaces de generar su alimento supliendo asiacute las hojas viejas (SEELYE et al 2003) En este ensayo las plaacutentulas de Chloraea virescens presentaron en general una buena adaptacioacuten al ser sacadas de un medio in vitro
Se observoacute que plaacutentulas con menor tamantildeo al ser aclimatadas y tener menor tejido fue maacutes difiacutecil y maacutes lento que empezaran a generar nuevos tejidos y materia orgaacutenica a partir de dioacutexido de carbono POSPIacuteŠILOVAacute et al (1999) sentildeala que al tener los estomas con desarrollo incompleto maacutes grandes y de forma maacutes redonda pierden maacutes agua lo cual puede provocar una peacuterdida de hojas muriendo asiacute la plaacutentula Por esta razoacuten las plaacutentulas pequentildeas se demoran maacutes tiempo en generar hojas nuevas es por ello que al finalizar este estudio muestran el menor nuacutemero final de hojas 412 Efecto del tipo de sustrato Al analizar la influencia del tipo de sustrato se encontraron diferencias significativas entre los tres sustratos utilizados Seguacuten el Cuadro 2 y la Figura 5 el sustrato donde se obtuvo mejores resultados fue
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turba+perlita en el cual se observoacute un promedio de 53 hojas por plaacutentula siendo Sphagnum el maacutes bajo con 43 hojas por plaacutentula De acuerdo a los resultados del anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados el sustrato turba+perlita tiene mayor cantidad de nitroacutegeno foacutesforo calcio magnesio y azufre disponible comparativamente con los otros dos sustratos (Sphagnum y arena+turba) (Anexo 2)
Hojas finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
Sustratos
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) Para la brotacioacuten y el crecimiento de las plantas se necesita agua y Nitroacutegeno lo que favorece a una mayor tasa de aparicioacuten de hojas lo que se traduce en una mayor cantidad de hojas finales El Nitroacutegeno se encuentra en mayor cantidad en el sustrato turba+perlita debido a lo cual los mejores resultados se obtienen en dicho sustrato 413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Despueacutes de analizados los efectos individuales del tamantildeo y del sustrato al interactuar ambos factores existen diferencias significativas La mejor interaccioacuten se obtuvo con el sustrato turba+perlita y con el mayor tamantildeo de la plaacutentula (Figura 6) Debido a la buena estructura (porosa) de dicho sustrato se podriacutea decir que se favorecioacute la absorcioacuten radicular de nutrientes obteniendo por ello un mayor nuacutemero de hojas finales Para los menores tamantildeos no se observan diferencias significativas obteniendo como promedio 41 hojas por plaacutentula Para el mayor tamantildeo el promedio fue de 6 hojas por plaacutentula
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Hojas finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 42 Raiacuteces iniciales Este paraacutemetro se evaluoacute luego de la primera etapa de aclimatacioacuten la cual se realizoacute en una sala de aclimatacioacuten del laboratorio Se analizoacute la influencia de diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos sobre la variable nuacutemero raiacuteces iniciales (Anaacutelisis de Kruskal-Wallis en Anexo 7)
FIGURA 7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses de pre aclimatacioacuten
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En la Figura 7 se puede observar los resultados de pre aclimatacioacuten en sala de laboratorio En esta etapa ya es posible ver la presencia de raiacuteces desarrolladas 421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula En el Cuadro 2 se puede observar que las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero inicial de raiacuteces y en la Figura 8 se puede comprobar que para los dos tamantildeos de plaacutentula maacutes pequentildeos no se observa gran cantidad de raiacuteces esto no impidioacute el desarrollo posterior de las plaacutentulas las cuales lograron enraizar al final del estudio Esto se contrapone a lo observado en un estudio de Lapageria rosea donde la presencia de raiacutez y brote para lograr una multiplicacioacuten exitosa de plantas es de vital importancia Incluso algunas plaacutentulas de L rosea no brotan en condiciones in vitro en donde tienen las mejores condiciones nutricionales y hormonales para hacerlo Esto se debe a factores internos de la plaacutentula siendo muy difiacutecil que broten inmediatamente en caacutemara de aclimatacioacuten donde ya dejan de recibir los nutrientes necesarios de manera directa y requieren de balances de energiacutea para poder seguir elongando raiacuteces absorber nutrientes y brotar para poder obtener los carbohidratos necesarios para seguir su crecimiento (BLANCO 2006) El tamantildeo de plaacutentula tiene importancia para el desarrollo de raiacuteces se distingue notoriamente que en los tamantildeos maacutes grandes el nuacutemero de raiacuteces es mayor comparativamente con los tamantildeos pequentildeos donde el nuacutemero de raiacuteces fue escaso Debido a la presencia de maacutes hojas existe una mayor cantidad de aacuterea fotosinteacutetica esta situacioacuten estimula el crecimiento de las raiacuteces para la obtencioacuten de agua y nutrientes
Raices iniciales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
2
4
6
8
10
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o inicial de ra
iacuteces
FIGURA 8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn)
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422 Efecto del tipo de sustrato Para el sustrato turba+perlita se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas en el nuacutemero de raiacuteces con respecto a los dos otros sustratos esto se puede ver en el Figura 9 donde se observa que se obtuvieron los mayores resultados En cualquier medio de crecimiento el espacio no ocupado por un soacutelido se llama porosidad este espacio puede ser ocupado en parte para retener agua y en parte para proporcionarle aire a las raiacuteces La ausencia de uno de estos elementos es perjudicial para las plantas La turba es conocida por tener estas propiedades y la perlita tambieacuten por esta razoacuten se sabe que la mezcla turba-perlita provee propiedades fiacutesicas excelentes como medio de crecimiento y propagacioacuten (INFOAGRO 2007) Estos resultados con turba-perlita (298 de materia orgaacutenica) coinciden con los obtenidos por DIAZ et al (2004) quienes al utilizar un sustrato compuesto por 100 de humus de lombriz para aclimatar cantildea de azuacutecar obtuvieron el mayor nuacutemero de raiacuteces Esto puede atribuirse al importante aporte de materia orgaacutenica del humus (47) lo que le confiere una mejor estructura obtenieacutendose una excelente porosidad del sustrato La aireacioacuten del suelo es necesaria para favorecer la maacutexima absorcioacuten de nutrientes por las raiacuteces Esto tambieacuten sucede en el sustrato turba+perlita el cual posee la mayor cantidad de materia orgaacutenica de los tres sustratos utilizados
Raices iniciales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
2
4
6
8
10
Sustratos
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato En los anaacutelisis para la variable nuacutemero de raiacuteces se puede decir que la mejor interaccioacuten se presentoacute para el sustrato de turba+perlita junto con el mayor tamantildeo de plaacutentulas obteniendo los valores maacutes altos entre los nueve tratamientos La presencia de raiacuteces luego de la micropropagacioacuten aumenta la posibilidad de eacutexito en el transplante ya que se crea un favorable balance de agua Pero esto no quiere
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decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
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Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
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En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
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El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
34
Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
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Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
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Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
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Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
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- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
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- INDICES
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- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
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- RESUMEN
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- Reacutesumeacute
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- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
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- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
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- 3 MATERIAL Y METODO
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- 31 Material
- 32 Meacutetodo
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- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
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- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
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- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
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- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
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sobrevivencia de entre 70 y 95 despueacutes de 12 meses Estas plantas establecidas en bosque nativo estaacuten libres de cualquier defecto morfoloacutegico y de crecimiento (GANGAPRASAD et al 2000) 242 Orquiacutedeas epiacutefitas Estas orquiacutedeas viven en los aacuterboles pero no obtienen de eacuteste su alimento no son paraacutesitas 2421 Preservacioacuten de Cattleya walkeriana usando propagacioacuten in vitro El geacutenero Cattleya se encuentra en Meacutexico y Ameacuterica Central asiacute como tambieacuten en Venezuela Colombia y las laderas de los Andes Esta orquiacutedea tambieacuten se encuentra en varias regiones del Brasil creciendo en aacuterboles rocas cerca de riacuteos lagos y pantanos Las flores de esta orquiacutedea son conocidas debido a su hermosura y a causa de la destruccioacuten de su haacutebitat y a la excesiva coleccioacuten de eacutestas se encuentra en extincioacuten
La composicioacuten del medio de cultivo es esencial para la propagacioacuten in vitro ya que suple todos los nutrientes necesarios para el desarrollo y seraacute distinto dependiendo de cada especie en este caso se utilizoacute la mitad de los macronutrientes del medio Muchos autores sugieren el uso de carboacuten activado en el medio ya que por lo general en muchas especies aumenta el desarrollo de las raiacuteces En este estudio se probaron distintas dosis de carboacuten activado 1 2 4 y 6gL con un pH de 6 (TADEU DE FARIA et al 2002) Las semillas se obtuvieron de flores artificialmente polinizadas en invernadero Plaacutentulas de aproximadamente un centiacutemetro fueron seleccionadas y cultivadas nuevamente en el medio de cultivo Murashige y Skoog pero esta vez con las diferentes dosis de carboacuten activado Se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces el nuacutemero de brotes y el peso de la materia verde total Durante el autoclavado se produce normalmente una hidroacutelisis de sacarina la cual es de 10 aproximadamente este porcentaje aumenta considerablemente al agregar un 1 de carboacuten activado llegando a ser de 95
El desarrollo de las plaacutentulas de C walkeriana aumentan con una mayor concentracioacuten de carboacuten activado asiacute como tambieacuten un mayor tiempo de cultivo El resultado fue que la dosis ideal para el desarrollo de esta orquiacutedea es 2gL de carboacuten activado (TADEU DE FARIA et al 2002) 2422 Establecimiento de cultivos in vitro y micropropagacioacuten de Cattleya aurantiaca (Bateman ex Lindl) Por medio de siembra in vitro se logroacute el establecimiento de C aurantiaca con alto porcentaje de germinacioacuten y desarrollo de protocormos Para la oacuteptima formacioacuten de callo y para la proliferacioacuten de protocormos se determinaron los medios oacuteptimos (MS 10 mgL ANA 10 mgL BA) asiacute como tambieacuten de manera directa sobre explantes de hoja y pseudobulbos (MS 01 mgL ANA 01 mgL GA3)
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Con este uacuteltimo medio tambieacuten se logroacute una oacuteptima regeneracioacuten y desarrollo de plaacutentulas Los medios liacutequidos (sin agitacioacuten) son una buena opcioacuten para conseguir la produccioacuten masiva de protocormos ya que con ellos se optimizoacute la micropropagacioacuten de C aurantiaca Las plaacutentulas micropropagadas presentaron alto porcentaje de sobrevivencia y buen desarrollo despueacutes de su trasplante y aclimatacioacuten lo cual demuestra que es un buen sistema de propagacioacuten para C aurantiaca (GUTIERREZ y SALGADO 2007) En cuanto a transplante y aclimatacioacuten despueacutes de 45 diacuteas de desarrollo in vitro las plaacutentulas de un tamantildeo entre 3 y 5 cm con raiacuteces bien desarrolladas fueron llevadas a condiciones ex vitro eliminando los restos de medio de cultivo con agua potable y ocupando un sustrato de partes iguales de tezontle y corteza de encino cubierta con hojarasca de encino finamente molida Se mantuvieron cubiertas durante 15 diacuteas abriendo cada dos diacuteas hasta poder retirar la tapa en 30 diacuteas Despueacutes de dos meses de haber sido retiradas del cultivo in vitro las plaacutentulas presentaron 70 de sobrevivencia y alcanzaron una altura de hasta 7 cm presentando nuevas hojas y raiacuteces las plantas se muestran vigorosas y capaces de continuar su crecimiento en condiciones ambientales de invernadero (GUTIERREZ y SALGADO 2007)
2423 Establecimiento in vitro y regeneracioacuten de plantas de Laelia autumnalis (Llave y Lex) Lindl Para este estudio se obtuvieron las semillas de una caacutepsula desarrollada despueacutes de 6 meses de la floracioacuten las cuales se sembraron in vitro sin presentar contaminacioacuten ya que la siembra por este meacutetodo es muy eficiente en comparacioacuten al cultivo de semillas libres donde algunas veces se presenta la contaminacioacuten Las observaciones se realizaron cada 15 diacuteas la germinacioacuten se detectoacute en los primeros 15 diacuteas en la mayoriacutea de los medios de cultivos probados con la presencia de protocormos de 1mm de diaacutemetro (HUAPEO y SALGADO 2004) El porcentaje de germinacioacuten que se obtuvo de las semillas cultivadas in vitro de L autumnalis fue de 95 a 100 en todos los medios de cultivo la uacutenica diferencia fue el tiempo entre las germinaciones A excepcioacuten de las semillas cultivadas en el medio MS 100 la germinacioacuten del 100 se obtuvo hasta los 30 diacuteas de cultivo mientras que en el primero la germinacioacuten fue a los 15 diacuteas del cultivo Las plaacutentulas con raiacutez y un par de hojas se lograron a los 90 diacuteas de cultivo en el medio MS 100 alcanzando 07 mm de altura Estas plaacutentulas fueron subcultivadas en medio MS con 05 mgl de ANA y 01 mgl de GA3 para tener plaacutentulas fuente de explante (segmentos de hojas) un medio oacuteptimo de desarrollo de plaacutentulas de L speciosa No fue necesario probar otros medios de cultivos ya que se hicieron pruebas anteriores que demostraron que era el adecuado
Las plaacutentulas de 6 meses de cultivo in vitro despueacutes de su germinacioacuten presentaron una altura promedio de 5 cm con raiacuteces con velamen y hasta dos pares de hojas Segmentos de hoja de eacutestas fueron cultivadas en el medio MS conteniendo ANA BA y GA3 en diferentes concentraciones y se realizaron observaciones cada 30 diacuteas para determinar medios inductores de callo protocormos y raiacuteces La mejor respuesta en formacioacuten de callo fue observada en los segmentos de hoja de plaacutentulas de L autumnalis cultivados en MS con 1 mgl de ANA BA y GA3 iniciando la induccioacuten de
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eacuteste desde los 30 diacuteas de cultivo solamente en un 70 de los explantes cultivados El 100 se logroacute a los 90 diacuteas de cultivo observando callo abundante alrededor de todo el tejido de color blanco con puntos pigmentados de color verde La regeneracioacuten de protocormos de esta orquiacutedea se establecioacute con la siembra de segmentos de hoja de plaacutentulas de 6 meses de edad de manera directa o a partir de callos En callos la produccioacuten fue oacuteptima en el medio MS con 01 mgl de ANABAGA3 ya que a los 60 diacuteas se obtuvieron 50 protocormos por segmento de callo Solamente se produjeron 10 protocormos por explante al cultivarse los segmentos de hoja en MS con 01 mgl de ANABAGA3 a los 120 diacuteas de cultivo (HUAPEO y SALGADO 2004) 25 Aclimatacioacuten Aclimatacioacuten significa que el hombre intercede y guiacutea el proceso de acondicionamiento de las plantas hasta que eacutestas sean aptas para crecer en el campo yo invernadero
Un alto nuacutemero de plantas micropropagadas no sobreviven al cambio desde el cultivo in vitro hacia el ambiente exterior ya sea en campo o invernadero Eacutestos dos uacuteltimos tienen menor humedad relativa niveles maacutes altos de luminosidad y un ambiente seacuteptico los cuales son maacutes estresantes para las plantas micropropagadas La mayoriacutea de las especies que crecen in vitro necesitan un proceso de aclimatacioacuten pudiendo obtener asiacute un nuacutemero suficiente de plantas vivas y vigorosas para trasplantar al suelo (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991)
La aclimatacioacuten no es uacutenicamente para micropropagacioacuten siendo usada ademaacutes en propagacioacuten convencional durante antildeos Despueacutes de cortar las hojas y de haber formado raiacuteces por lo general son aclimatadas antes de ser llevadas al campo o invernadero Ejemplos de dos teacutecnicas comunes son bajar gradualmente la humedad y mantener el nivel de luz con un 50 de sombra antes de trasladarlos al campo Las raiacuteces que han sido cortadas y mal limpiadas muchas veces son focos de infeccioacuten En estos casos las plantas muestran signos de marchitez hojas necrosadas y tambieacuten se puede llegar a la muerte de eacutestas El cultivo in vitro reduce la necesidad de fotosiacutentesis ya que las condiciones de la caacutemara de incubacioacuten proveen a la planta de sacarosa u otro azuacutecar Tambieacuten en estas condiciones se reduce el stress por patoacutegenos al ser un ambiente aseacuteptico Todo esto se traduce en que las plantas micropropagadas no son aptas para el campo yo invernadero (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 251 Stress hiacutedrico El stress hiacutedrico puede ser el resultado de una excesiva transpiracioacuten de las diferentes partes aeacutereas de las plantas especialmente de las hojas o por una inadecuada absorcioacuten de agua por parte de las raiacuteces La cutiacutecula y los estomas son la ruta primaria de peacuterdida de agua desde de las hojas provenientes de esta teacutecnica reproductiva 2511 Cutiacutecula La cutiacutecula es una membrana compuesta por una matriz de cutina que a su vez se encuentra cubierta en su superficie por ceras cuya funcioacuten primaria consiste en limitar la peacuterdida de agua por transpiracioacuten La permeabilidad del agua a traveacutes de la cutiacutecula se ve influenciada principalmente por la estructura y la cantidad de
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ceras cuticulares y epicuticulares no vieacutendose afectada la peacuterdida de agua por el grosor de eacutesta o la naturaleza quiacutemica de la matriz de la cutina La estructura cristalina de la parte encerada de las hojas es distinta en las plantas micropropagadas con respecto a las plantas que crecen en el campo La cera epicuticular de las hojas de plantas in vitro tienen una proporcioacuten maacutes alta de esteres y de componentes polares por el contrario tienen unas cadenas de hidrocarbonos mucho maacutes cortas Esto hace que las plantas in vitro pierdan maacutes agua que las cultivadas en campo o invernadero
Las plantas que han crecido en el campo son naturalmente de color verde pero el color de las plantas cultivadas in vitro es diferente y se puede ver a simple vista Las plantas que son pasadas a invernadero y que tengan un color verde se aclimatan de mejor forma al ambiente exterior (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 2512 Estomas La estructura estomaacutetica y su funcionamiento han sido implicados recurrentemente en el desbalance de agua exhibido por plantas micropropagadas al momento de ser removidas del cultivo in vitro Estudios con microscopiacutea de scanner electroacutenico han indicado que la estructura estomaacutetica presente en algunas especies de plantas cultivadas in vitro difieren marcadamente de las cultivadas en invernadero o en el suelo Debido a que las primeras presentan estomas de mayor tamantildeo y maacutes redondos a diferencia de las plantas cultivadas de manera normal que presentan estomas maacutes pequentildeos y eliacutepticos lo que resulta en una deshidratacioacuten maacutes raacutepida en el caso de las provenientes de cultivo in vitro (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 252 Humedad Debido a la anatomiacutea y la condicioacuten fisioloacutegica de las plantas desarrolladas in vitro donde se ha mantenido una alta humedad relativa es necesario regar al momento del traslado para obtener una alta sobrevivencia Muchos laboratorios aseguran que hay que evitar tener un sistema de aspersioacuten ya que se produce el ambiente necesario (muy huacutemedo) para la aparicioacuten de hongos algas o bacterias Otros meacutetodos incluyen el uso de humidificadores o poner las macetas en un lugar cerrado donde se retenga vapor para esto se pueden usar por ejemplo tapas de polietileno Este meacutetodo es relativamente econoacutemico pero se debe tener control del calor y monitorear la falta de agua (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 253 Luz Durante la etapa in vitro las plantas estaacuten expuestas a altos niveles de luminosidad lo que se traduce en hojas delgadas Antes del traslado se recomienda mantener las plantas con un 50 de sombra para asiacute poder aclimatarlas de mejor manera esto debido a que las plantas micropropagadas tienen un bajo control sobre la transpiracioacuten y un inadecuado mecanismo de fotosiacutentesis La sombra reduce la transpiracioacuten evitando excesivas peacuterdidas de agua asiacute como tambieacuten el exceso de luz destruye las moleacuteculas de clorofila Luego del periacuteodo bajo sombra se deben mover las macetas gradualmente hacia el nivel de luz al cual seraacute llevado para su crecimiento final (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 254 Temperatura La temperatura del aire y del medio o sustrato de crecimiento estaacute generalmente controlado durante el periacuteodo de aclimatacioacuten El calor es necesario en los meses de invierno y el friacuteo (enfriar) es esencial en los meses de verano Ajustando la cantidad de sombra y humedad se obtiene un control sobre la temperatura El
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enfriamiento se puede obtener gracias a ventilacioacuten abanicos niebla o aire acondicionado El calor puede provenir del sistema existente en el edificio o invernadero donde esteacuten ubicadas las macetas o por las laacutemparas ocupadas para el control del fotoperiacuteodo El rango de temperatura que se mantiene por lo general es entre los 13 y 30ordmC y esta determinado principalmente por la especie en cuestioacuten La temperatura de la zona donde se encuentran las raiacuteces es muy importante para el crecimiento lo ideal es que dicho sector tenga una mayor temperatura que el aire fomentando el crecimiento de las raiacuteces e incrementando la humedad alrededor de la planta Durante el verano esto es difiacutecil de obtener ya que la temperatura del aire es muy alta debido a la alta radiacioacuten solar Terminado el proceso de aclimatacioacuten esto ya no es necesario (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 255 Fotosiacutentesis Las plantas sufren un cambio radical cuando son removidas desde cultivo in vitro ya que son forzadas a cambiar de heterotroacuteficas a autotroacuteficas y la fotosiacutentesis se vuelve fundamental para la sobrevivencia Las hojas de las plantas in vitro no estaacuten formadas para hacer fotosiacutentesis ya que en la caacutemara de incubacioacuten no se produce un fuerte intercambio gaseoso esto debido a que la sacarosa es entregada a traveacutes del medio de cultivo Las hojas de las plantas que son trasladadas al campo o invernadero sufren deterioro debido a que no estaacuten formadas para la fijacioacuten de carbono Esto se produce por un tiempo aproximado de cuatro semanas despueacutes de las cuales las hojas nuevas suplen a las viejas Otro punto es que las hojas de las plantas cultivadas in vitro contienen menor proporcioacuten de clorofila que las plantas que han crecido normalmente en el campo En un estudio de coliflor cultivado in vitro se midioacute el CO2 y se obtuvo un balance negativo el cual se mantuvo durante dos semanas despueacutes del transplante Algo similar ocurrioacute con frutilla despueacutes del transplante las hojas se deterioraron raacutepidamente lo que quiere decir que no hubo incremento en la fijacioacuten de carbono indicando falta de desarrollo en la competencia fotosinteacutetica
El bajo nivel de CO2 durante el cultivo in vitro limita el proceso de fotosiacutentesis lo cual se puede compensar usando sacarosa en el medio de cultivo Tambieacuten se puede incrementar el nivel de luz y CO2 obteniendo un fuerte aumento en el crecimiento de varias especies como orquiacutedeas clavel etc (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 256 Sustrato Un sustrato es todo material soacutelido distinto del suelo natural mineral u orgaacutenico que colocado en un contenedor en forma pura o en mezcla permite el anclaje del sistema radicular de la planta desempentildeando por lo tanto un papel de soporte para la planta El sustrato puede intervenir o no en el complejo proceso de la nutricioacuten mineral de la planta (INFOAGRO 2007) El sustrato y los contenedores dentro de los cuales se van a transplantar las plaacutentulas in vitro son importantes para una buena sobrevivencia
Los sustratos ejercen una influencia significativa en la arquitectura del sistema radical de las plantas y en las asociaciones bioloacutegicas de este con el suelo influenciando el
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estado nutricional y la translocacioacuten de agua en el sistema suelo-planta-atmoacutesfera Uno de los requisitos fundamentales que debe cumplir el sustrato para su utilizacioacuten es la sanidad Cuando estos no se elaboran almacenan o manejan correctamente pueden contaminarse y provocar serios dantildeos a las plantas durante la aclimatacioacuten por esta razoacuten son preferidos como componentes para su elaboracioacuten materiales inertes o aquellos en las cuales el proceso de obtencioacuten garantice la mayor desinfeccioacuten posible
Uno de los factores de mayor importancia a la hora de seleccionar los materiales que pueden constituir el sustrato es su disponibilidad tanto en teacuterminos de facilidad de obtencioacuten o suministro como de su costo (VILCHEZ et al 2007)
La presencia de inhibidores o tambieacuten cambios en el pH del sustrato pueden afectar el crecimiento de las raiacuteces y consecuentemente el eacutexito del transplante
Muchos laboratorios y viveros transplantan a un sustrato uniforme debiendo ser eacuteste adecuado en cuanto a soporte de las plantas pH porosidad aireacioacuten y drenaje (DEBERGH y ZIMMERMAN 1991)
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3 MATERIAL Y MEacuteTODO
Para la realizacioacuten de este trabajo se utilizoacute el siguiente material y meacutetodo
31 Material La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio e invernadero de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal pertenecientes a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de Chile
311 Material vegetal Se utilizaron plaacutentulas de C virescens cultivadas in vitro a partir de semillas las cuales fueron proporcionadas por el laboratorio estas plaacutentulas fueron separadas y repicadas para aumentar la poblacioacuten y obtener la cantidad necesaria para el ensayo
FIGURA 2 Plaacutentulas de C virescens en caacutemara de crecimiento in vitro
312 Materiales Los materiales que se utilizaron fueron los siguientes Equipos autoclave caacutemara de flujo laminar dispensador de medios medidor
de pH agitador magneacutetico horno microondas balanza mechero termoacutemetro Materiales vasos de precipitado matraces probetas pipetas papel de
aluminio frascos de vidrio placas Petri pinzas bisturiacute macetas regadera Soluciones soluciones madre (Medio MS) gelificante etanol 70 y 95
32 Meacutetodo A continuacioacuten se da a conocer la metodologiacutea con la cual se trabajoacute 321 Preparacioacuten del medio de cultivo Para la obtencioacuten de plantas a traveacutes de la micropropagacioacuten se ocupoacute el medio basal de MURASHIGE y SKOOG (1962) tambieacuten llamado medio MS Este medio tiene un pH de entre 56-57 Posteriormente se dosificoacute con el dispensador de medios para que cada frasco tenga una cantidad adecuada (25 mL) y se llevoacute a autoclave para esterilizar a 12 atm 120ordm C por 20 min
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322 Obtencioacuten del material vegetal Al tener el medio esterilizado se procedioacute a la separacioacuten y repicado de plaacutentulas existentes en el laboratorio Las siembras se realizaron en el mes de mayo del 2007 Estas siembras se realizaron en la caacutemara de flujo laminar de modo de asegurar que la siembra sea 100 aseacuteptica Estas plaacutentulas fueron mantenidas en la caacutemara de incubacioacuten hasta obtener los tamantildeos requeridos para el ensayo donde las condiciones fueron las siguientes
minus Temperatura ambiental de 23-25ordm C minus Fotoperiacuteodo de 16 horas minus Intensidad lumiacutenica controlada de 50-55 micromol m-2s-1
323 Sustratos Se utilizaron tres tipos de sustratos el primero corresponde a una mezcla de turba + perlita (11) el segundo corresponde a Sphagnum (100) y el tercero corresponde a una mezcla de turba + arena (11) Una vez realizadas las mezclas se procedioacute a una esterilizacioacuten en un autoclave a 121ordm C por 20 minutos a 12 atmoacutesfera De esta forma se trabajoacute con material limpio y sano evitando ataque de hongos o bacterias El anaacutelisis quiacutemico de los sustratos se muestra en el Anexo 2 324 Plantacioacuten Las plaacutentulas con un promedio de cuatro meses en condiciones de caacutemara de crecimiento in vitro obtuvieron el tamantildeo adecuado para ser utilizadas Se sacaron de los frascos y se plantaron en las macetas de plaacutestico transparente con los sustratos Posteriormente fueron dejadas en la sala del laboratorio donde se debioacute asperjar con solucioacuten nutritiva Hoagland y fungicida Captan CUADRO 1 Composicioacuten de solucioacuten nutritiva Hoagland
KNO3 102 gL Ca(NO3) 4 H2 O 0492 gL
NH4H2 (PO4) 023 gL MgSO4 7 H2O 049 gL
H3BO3 286 mgL MnCl2 2 H2O 181 mgL CuSO4 5 H2O 008 mgL ZnSO4 5 H2O 022 mgL Na2MoO4 H2O 009 mgL
FeSO4 7 H2O 05 06 mL FUENTE FINCK 1988 325 Disentildeo de los ensayos Este trabajo de investigacioacuten constoacute de un ensayo con dos etapas Antes que todo se realizoacute la separacioacuten y repicado in vitro de plaacutentulas de C virescens para la obtencioacuten del nuacutemero necesario de plantas En la etapa 1 se utilizaron tres tamantildeos de plaacutentulas obtenidas in vitro de 1-2cm de 2-3cm y de maacutes de 3cm de altura que se transplantaron a tres sustratos turba + perlita 11(vv) Sphagnum (100) y turba + arena 11 (vv) La turba provino de la Sociedad
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Minera Patagonia Peat SA en Hijuelas el Sphagnum de la empresa Lonquen Chile de Puerto Montt y la perlita se obtuvo a traveacutes del sitio web wwwjardisencl (representante legal Walter Rathgeb Penza Ingeniero Agroacutenomo Santiago) Las plaacutentulas se plantaron de acuerdo a su tamantildeo las de maacutes de 3cm se colocaron de 6 por maceta las de 2 a 3cm de a 8 por maceta y las maacutes chicas de a 10 por maceta Estas macetas fueron dejadas en una sala de aclimatacioacuten con una temperatura promedio de 20ordm C intensidad lumiacutenica de 50-55 micromol m-2s-1 y 14-16 hrs de fotoperiacuteodo Se fertilizoacute asperjando cada cinco diacuteas con solucioacuten nutritiva Hoagland Esta etapa se llevoacute a cabo durante dos meses desde el cinco de septiembre hasta el cinco de noviembre de 2007
En la etapa 2 se continuoacute el proceso de aclimatacioacuten en invernadero de las plaacutentulas obtenidas en la etapa 1 que despueacutes de dos meses teniacutean un mayor tamantildeo y se habiacutean acondicionado al ambiente exterior (fuera de la caacutemara de crecimiento) Las plantas se mantuvieron en las macetas durante tres semanas para aclimatarlas y luego las plantas sobrevivientes fueron transplantadas a macetas maacutes grandes individuales durante tres meses aproximadamente hasta el cinco de marzo 2008 Estas nuevas macetas tuvieron como sustrato turba y suelo (trumao) en igual proporcioacuten (Anexo 2) La temperatura promedio de invernadero fluctuoacute de 13 a 35 degC seguacuten el mes En enero el promedio fue de 25 (Anexo 3) Para bajar la temperatura alrededor de 5deg C se instaloacute una malla Rachel 326 Disentildeo experimental El disentildeo experimental utilizado fue completamente al azar ordenado como experimento factorial con dos factores tamantildeo (3) y sustrato (3) Cada tratamiento tuvo tres repeticiones con un miacutenimo de 6 plantas por recipiente 327 Variables a evaluar Durante los dos meses en que las macetas estuvieron en la sala de aclimatacioacuten se evaluoacute el desarrollo foliar contando el nuacutemero de hojas una vez al mes Posteriormente se trasladaron las mismas macetas a invernadero durante tres semanas para continuar con la aclimatacioacuten de las plaacutentulas Transcurrido este tiempo se transplantaron las plaacutentulas sobrevivientes a macetas individuales y continuoacute mensualmente la evaluacioacuten de eacutestas (nuacutemero de hojas) hasta la obtencioacuten de plantas establecidas Al momento del transplante y al final del ensayo se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces asiacute como tambieacuten al final del ensayo de evaluoacute el crecimiento en altura (cm) La sobrevivencia fue evaluada al final del ensayo por maceta
Tanto en la sala de aclimatacioacuten coacutemo en el invernadero se registroacute la temperatura con la ayuda de un termoacutemetro de maacutexima y miacutenima (Anexo 3) 328 Anaacutelisis estadiacutestico Una vez obtenidos los datos se procedioacute a comprobar si estos cumpliacutean con los supuestos de aleatoriedad normalidad y homogeneidad de varianzas que exige este tipo de anaacutelisis En el caso de no cumplirse estos supuestos los datos se transformaron utilizando log10(x+05) raiacutez(x+05) o 1x para normalizarlos
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y enseguida se sometioacute los datos a un anaacutelisis estadiacutestico (ANDEVA) Posteriormente en los casos en que se observoacute diferencias significativas en el ANDEVA se aplicoacute una prueba de rangos muacuteltiples (Tukey) al 5 de significancia Para las variables no parameacutetricas que no cumplieron con los supuestos para un anaacutelisis de varianza se realizoacute la prueba de KruskalndashWallis y las comparaciones muacuteltiples a traveacutes del test de Dunn con un nivel de 5 de significancia
Se utilizaron los programas estadiacutesticos STATGRAPHICS 20 y GRAPHPAD PRISM 5 para el anaacutelisis de datos
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4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
En los siguientes puntos se discuten los resultados obtenidos en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens
En la Figura 3 se observan plaacutentulas de C virescens micropropagadas en medio MS en caacutemara de crecimiento al inicio del ensayo (A) y en invernadero despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten (B)
BA
FIGURA 3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten
A continuacioacuten se presentan los resultados obtenidos para las variables analizadas (Cuadro 2 y 3) de esta manera se pueden visualizar en general los resultados obtenidos en el proceso de aclimatacioacuten durante seis meses
CUADRO 2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de raiacuteces
inicial y final Variables
Hojas finales (nuacutemero)
Raiacuteces iniciales (nuacutemero)
Raiacuteces finales (nuacutemero)
Tamantildeo de plaacutentulas 36 24 37 47 29 46
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 61 43 76
Sustratos 53 36 56 43 29 51
Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 46 27 49
Significa que hay diferencias significativas al 95 Test de Dunn
25
Las variables no parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en hojas finales y raiacuteces iniciales en sus rangos de distribucioacuten Las raiacuteces finales no presentaron diferencias seguacuten el sustrato utilizado pero de acuerdo al tamantildeo hubo diferencias en su distribucioacuten
CUADRO 3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas
Variables Altura final de plaacutentulas
(cm) Sobrevivencia
Tamantildeo de plaacutentulas
36 c 567 b 47 b 821 a
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 59 a 908 a
Sustratos 52 a 933 a
41 ab 59 b Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 49 b 772 a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY Las variables parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en altura final de hojas y en sobrevivencia 41 Nuacutemero de hojas finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentulas y de sustratos para la variable nuacutemero final de hojas 411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula Seguacuten el Cuadro 2 y Figura 4 las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero final de hojas Las plaacutentulas pequentildeas de 1-2 cm obtuvieron el nuacutemero maacutes bajo de hojas finales con una media de 36 hojas por plaacutentula lo cual es la mitad de las hojas finales que se obtuvo con las plaacutentulas de mayor tamantildeo (61 hojas aproximado por plaacutentula) Para las plaacutentulas medianas de 2-3 cm se obtuvo una media de 47 hojas por plaacutentula (Figura 4)
26
Hojas finales
1-2 cm 2-3cm maacutes de 3 cm0
5
10
15
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn)
BLANCO (2006) sentildeala que plaacutentulas cultivadas in vitro crecen bajo condiciones especiales como alta humedad relativa y baja luminosidad ademaacutes son suplidas con sacarosa Estas condiciones fueron proporcionadas en una caacutemara de crecimiento en el laboratorio donde las plantas micropropagadas no son dependientes por completo de su fotosiacutentesis son heteroacutetrofas Parece ser necesario un estiacutemulo para convertirse en organismos totalmente capaces de sustentar sus propios requisitos de carbono y nitroacutegeno reducido pasando de esta manera a ser autoacutetrofos
Al ser sacadas de un medio in vitro las hojas no estaacuten preparadas para producir su propio alimento y sobreviven gracias a que el medio de cultivo le proporciona los nutrientes necesarios para vivir En este punto muchas de las hojas mueren y nacen hojas nuevas capaces de generar su alimento supliendo asiacute las hojas viejas (SEELYE et al 2003) En este ensayo las plaacutentulas de Chloraea virescens presentaron en general una buena adaptacioacuten al ser sacadas de un medio in vitro
Se observoacute que plaacutentulas con menor tamantildeo al ser aclimatadas y tener menor tejido fue maacutes difiacutecil y maacutes lento que empezaran a generar nuevos tejidos y materia orgaacutenica a partir de dioacutexido de carbono POSPIacuteŠILOVAacute et al (1999) sentildeala que al tener los estomas con desarrollo incompleto maacutes grandes y de forma maacutes redonda pierden maacutes agua lo cual puede provocar una peacuterdida de hojas muriendo asiacute la plaacutentula Por esta razoacuten las plaacutentulas pequentildeas se demoran maacutes tiempo en generar hojas nuevas es por ello que al finalizar este estudio muestran el menor nuacutemero final de hojas 412 Efecto del tipo de sustrato Al analizar la influencia del tipo de sustrato se encontraron diferencias significativas entre los tres sustratos utilizados Seguacuten el Cuadro 2 y la Figura 5 el sustrato donde se obtuvo mejores resultados fue
27
turba+perlita en el cual se observoacute un promedio de 53 hojas por plaacutentula siendo Sphagnum el maacutes bajo con 43 hojas por plaacutentula De acuerdo a los resultados del anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados el sustrato turba+perlita tiene mayor cantidad de nitroacutegeno foacutesforo calcio magnesio y azufre disponible comparativamente con los otros dos sustratos (Sphagnum y arena+turba) (Anexo 2)
Hojas finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
Sustratos
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) Para la brotacioacuten y el crecimiento de las plantas se necesita agua y Nitroacutegeno lo que favorece a una mayor tasa de aparicioacuten de hojas lo que se traduce en una mayor cantidad de hojas finales El Nitroacutegeno se encuentra en mayor cantidad en el sustrato turba+perlita debido a lo cual los mejores resultados se obtienen en dicho sustrato 413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Despueacutes de analizados los efectos individuales del tamantildeo y del sustrato al interactuar ambos factores existen diferencias significativas La mejor interaccioacuten se obtuvo con el sustrato turba+perlita y con el mayor tamantildeo de la plaacutentula (Figura 6) Debido a la buena estructura (porosa) de dicho sustrato se podriacutea decir que se favorecioacute la absorcioacuten radicular de nutrientes obteniendo por ello un mayor nuacutemero de hojas finales Para los menores tamantildeos no se observan diferencias significativas obteniendo como promedio 41 hojas por plaacutentula Para el mayor tamantildeo el promedio fue de 6 hojas por plaacutentula
28
Hojas finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 42 Raiacuteces iniciales Este paraacutemetro se evaluoacute luego de la primera etapa de aclimatacioacuten la cual se realizoacute en una sala de aclimatacioacuten del laboratorio Se analizoacute la influencia de diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos sobre la variable nuacutemero raiacuteces iniciales (Anaacutelisis de Kruskal-Wallis en Anexo 7)
FIGURA 7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses de pre aclimatacioacuten
29
En la Figura 7 se puede observar los resultados de pre aclimatacioacuten en sala de laboratorio En esta etapa ya es posible ver la presencia de raiacuteces desarrolladas 421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula En el Cuadro 2 se puede observar que las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero inicial de raiacuteces y en la Figura 8 se puede comprobar que para los dos tamantildeos de plaacutentula maacutes pequentildeos no se observa gran cantidad de raiacuteces esto no impidioacute el desarrollo posterior de las plaacutentulas las cuales lograron enraizar al final del estudio Esto se contrapone a lo observado en un estudio de Lapageria rosea donde la presencia de raiacutez y brote para lograr una multiplicacioacuten exitosa de plantas es de vital importancia Incluso algunas plaacutentulas de L rosea no brotan en condiciones in vitro en donde tienen las mejores condiciones nutricionales y hormonales para hacerlo Esto se debe a factores internos de la plaacutentula siendo muy difiacutecil que broten inmediatamente en caacutemara de aclimatacioacuten donde ya dejan de recibir los nutrientes necesarios de manera directa y requieren de balances de energiacutea para poder seguir elongando raiacuteces absorber nutrientes y brotar para poder obtener los carbohidratos necesarios para seguir su crecimiento (BLANCO 2006) El tamantildeo de plaacutentula tiene importancia para el desarrollo de raiacuteces se distingue notoriamente que en los tamantildeos maacutes grandes el nuacutemero de raiacuteces es mayor comparativamente con los tamantildeos pequentildeos donde el nuacutemero de raiacuteces fue escaso Debido a la presencia de maacutes hojas existe una mayor cantidad de aacuterea fotosinteacutetica esta situacioacuten estimula el crecimiento de las raiacuteces para la obtencioacuten de agua y nutrientes
Raices iniciales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
2
4
6
8
10
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o inicial de ra
iacuteces
FIGURA 8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn)
30
422 Efecto del tipo de sustrato Para el sustrato turba+perlita se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas en el nuacutemero de raiacuteces con respecto a los dos otros sustratos esto se puede ver en el Figura 9 donde se observa que se obtuvieron los mayores resultados En cualquier medio de crecimiento el espacio no ocupado por un soacutelido se llama porosidad este espacio puede ser ocupado en parte para retener agua y en parte para proporcionarle aire a las raiacuteces La ausencia de uno de estos elementos es perjudicial para las plantas La turba es conocida por tener estas propiedades y la perlita tambieacuten por esta razoacuten se sabe que la mezcla turba-perlita provee propiedades fiacutesicas excelentes como medio de crecimiento y propagacioacuten (INFOAGRO 2007) Estos resultados con turba-perlita (298 de materia orgaacutenica) coinciden con los obtenidos por DIAZ et al (2004) quienes al utilizar un sustrato compuesto por 100 de humus de lombriz para aclimatar cantildea de azuacutecar obtuvieron el mayor nuacutemero de raiacuteces Esto puede atribuirse al importante aporte de materia orgaacutenica del humus (47) lo que le confiere una mejor estructura obtenieacutendose una excelente porosidad del sustrato La aireacioacuten del suelo es necesaria para favorecer la maacutexima absorcioacuten de nutrientes por las raiacuteces Esto tambieacuten sucede en el sustrato turba+perlita el cual posee la mayor cantidad de materia orgaacutenica de los tres sustratos utilizados
Raices iniciales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
2
4
6
8
10
Sustratos
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato En los anaacutelisis para la variable nuacutemero de raiacuteces se puede decir que la mejor interaccioacuten se presentoacute para el sustrato de turba+perlita junto con el mayor tamantildeo de plaacutentulas obteniendo los valores maacutes altos entre los nueve tratamientos La presencia de raiacuteces luego de la micropropagacioacuten aumenta la posibilidad de eacutexito en el transplante ya que se crea un favorable balance de agua Pero esto no quiere
31
decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
10
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
32
En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
33
El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
34
Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
15
Con este uacuteltimo medio tambieacuten se logroacute una oacuteptima regeneracioacuten y desarrollo de plaacutentulas Los medios liacutequidos (sin agitacioacuten) son una buena opcioacuten para conseguir la produccioacuten masiva de protocormos ya que con ellos se optimizoacute la micropropagacioacuten de C aurantiaca Las plaacutentulas micropropagadas presentaron alto porcentaje de sobrevivencia y buen desarrollo despueacutes de su trasplante y aclimatacioacuten lo cual demuestra que es un buen sistema de propagacioacuten para C aurantiaca (GUTIERREZ y SALGADO 2007) En cuanto a transplante y aclimatacioacuten despueacutes de 45 diacuteas de desarrollo in vitro las plaacutentulas de un tamantildeo entre 3 y 5 cm con raiacuteces bien desarrolladas fueron llevadas a condiciones ex vitro eliminando los restos de medio de cultivo con agua potable y ocupando un sustrato de partes iguales de tezontle y corteza de encino cubierta con hojarasca de encino finamente molida Se mantuvieron cubiertas durante 15 diacuteas abriendo cada dos diacuteas hasta poder retirar la tapa en 30 diacuteas Despueacutes de dos meses de haber sido retiradas del cultivo in vitro las plaacutentulas presentaron 70 de sobrevivencia y alcanzaron una altura de hasta 7 cm presentando nuevas hojas y raiacuteces las plantas se muestran vigorosas y capaces de continuar su crecimiento en condiciones ambientales de invernadero (GUTIERREZ y SALGADO 2007)
2423 Establecimiento in vitro y regeneracioacuten de plantas de Laelia autumnalis (Llave y Lex) Lindl Para este estudio se obtuvieron las semillas de una caacutepsula desarrollada despueacutes de 6 meses de la floracioacuten las cuales se sembraron in vitro sin presentar contaminacioacuten ya que la siembra por este meacutetodo es muy eficiente en comparacioacuten al cultivo de semillas libres donde algunas veces se presenta la contaminacioacuten Las observaciones se realizaron cada 15 diacuteas la germinacioacuten se detectoacute en los primeros 15 diacuteas en la mayoriacutea de los medios de cultivos probados con la presencia de protocormos de 1mm de diaacutemetro (HUAPEO y SALGADO 2004) El porcentaje de germinacioacuten que se obtuvo de las semillas cultivadas in vitro de L autumnalis fue de 95 a 100 en todos los medios de cultivo la uacutenica diferencia fue el tiempo entre las germinaciones A excepcioacuten de las semillas cultivadas en el medio MS 100 la germinacioacuten del 100 se obtuvo hasta los 30 diacuteas de cultivo mientras que en el primero la germinacioacuten fue a los 15 diacuteas del cultivo Las plaacutentulas con raiacutez y un par de hojas se lograron a los 90 diacuteas de cultivo en el medio MS 100 alcanzando 07 mm de altura Estas plaacutentulas fueron subcultivadas en medio MS con 05 mgl de ANA y 01 mgl de GA3 para tener plaacutentulas fuente de explante (segmentos de hojas) un medio oacuteptimo de desarrollo de plaacutentulas de L speciosa No fue necesario probar otros medios de cultivos ya que se hicieron pruebas anteriores que demostraron que era el adecuado
Las plaacutentulas de 6 meses de cultivo in vitro despueacutes de su germinacioacuten presentaron una altura promedio de 5 cm con raiacuteces con velamen y hasta dos pares de hojas Segmentos de hoja de eacutestas fueron cultivadas en el medio MS conteniendo ANA BA y GA3 en diferentes concentraciones y se realizaron observaciones cada 30 diacuteas para determinar medios inductores de callo protocormos y raiacuteces La mejor respuesta en formacioacuten de callo fue observada en los segmentos de hoja de plaacutentulas de L autumnalis cultivados en MS con 1 mgl de ANA BA y GA3 iniciando la induccioacuten de
16
eacuteste desde los 30 diacuteas de cultivo solamente en un 70 de los explantes cultivados El 100 se logroacute a los 90 diacuteas de cultivo observando callo abundante alrededor de todo el tejido de color blanco con puntos pigmentados de color verde La regeneracioacuten de protocormos de esta orquiacutedea se establecioacute con la siembra de segmentos de hoja de plaacutentulas de 6 meses de edad de manera directa o a partir de callos En callos la produccioacuten fue oacuteptima en el medio MS con 01 mgl de ANABAGA3 ya que a los 60 diacuteas se obtuvieron 50 protocormos por segmento de callo Solamente se produjeron 10 protocormos por explante al cultivarse los segmentos de hoja en MS con 01 mgl de ANABAGA3 a los 120 diacuteas de cultivo (HUAPEO y SALGADO 2004) 25 Aclimatacioacuten Aclimatacioacuten significa que el hombre intercede y guiacutea el proceso de acondicionamiento de las plantas hasta que eacutestas sean aptas para crecer en el campo yo invernadero
Un alto nuacutemero de plantas micropropagadas no sobreviven al cambio desde el cultivo in vitro hacia el ambiente exterior ya sea en campo o invernadero Eacutestos dos uacuteltimos tienen menor humedad relativa niveles maacutes altos de luminosidad y un ambiente seacuteptico los cuales son maacutes estresantes para las plantas micropropagadas La mayoriacutea de las especies que crecen in vitro necesitan un proceso de aclimatacioacuten pudiendo obtener asiacute un nuacutemero suficiente de plantas vivas y vigorosas para trasplantar al suelo (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991)
La aclimatacioacuten no es uacutenicamente para micropropagacioacuten siendo usada ademaacutes en propagacioacuten convencional durante antildeos Despueacutes de cortar las hojas y de haber formado raiacuteces por lo general son aclimatadas antes de ser llevadas al campo o invernadero Ejemplos de dos teacutecnicas comunes son bajar gradualmente la humedad y mantener el nivel de luz con un 50 de sombra antes de trasladarlos al campo Las raiacuteces que han sido cortadas y mal limpiadas muchas veces son focos de infeccioacuten En estos casos las plantas muestran signos de marchitez hojas necrosadas y tambieacuten se puede llegar a la muerte de eacutestas El cultivo in vitro reduce la necesidad de fotosiacutentesis ya que las condiciones de la caacutemara de incubacioacuten proveen a la planta de sacarosa u otro azuacutecar Tambieacuten en estas condiciones se reduce el stress por patoacutegenos al ser un ambiente aseacuteptico Todo esto se traduce en que las plantas micropropagadas no son aptas para el campo yo invernadero (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 251 Stress hiacutedrico El stress hiacutedrico puede ser el resultado de una excesiva transpiracioacuten de las diferentes partes aeacutereas de las plantas especialmente de las hojas o por una inadecuada absorcioacuten de agua por parte de las raiacuteces La cutiacutecula y los estomas son la ruta primaria de peacuterdida de agua desde de las hojas provenientes de esta teacutecnica reproductiva 2511 Cutiacutecula La cutiacutecula es una membrana compuesta por una matriz de cutina que a su vez se encuentra cubierta en su superficie por ceras cuya funcioacuten primaria consiste en limitar la peacuterdida de agua por transpiracioacuten La permeabilidad del agua a traveacutes de la cutiacutecula se ve influenciada principalmente por la estructura y la cantidad de
17
ceras cuticulares y epicuticulares no vieacutendose afectada la peacuterdida de agua por el grosor de eacutesta o la naturaleza quiacutemica de la matriz de la cutina La estructura cristalina de la parte encerada de las hojas es distinta en las plantas micropropagadas con respecto a las plantas que crecen en el campo La cera epicuticular de las hojas de plantas in vitro tienen una proporcioacuten maacutes alta de esteres y de componentes polares por el contrario tienen unas cadenas de hidrocarbonos mucho maacutes cortas Esto hace que las plantas in vitro pierdan maacutes agua que las cultivadas en campo o invernadero
Las plantas que han crecido en el campo son naturalmente de color verde pero el color de las plantas cultivadas in vitro es diferente y se puede ver a simple vista Las plantas que son pasadas a invernadero y que tengan un color verde se aclimatan de mejor forma al ambiente exterior (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 2512 Estomas La estructura estomaacutetica y su funcionamiento han sido implicados recurrentemente en el desbalance de agua exhibido por plantas micropropagadas al momento de ser removidas del cultivo in vitro Estudios con microscopiacutea de scanner electroacutenico han indicado que la estructura estomaacutetica presente en algunas especies de plantas cultivadas in vitro difieren marcadamente de las cultivadas en invernadero o en el suelo Debido a que las primeras presentan estomas de mayor tamantildeo y maacutes redondos a diferencia de las plantas cultivadas de manera normal que presentan estomas maacutes pequentildeos y eliacutepticos lo que resulta en una deshidratacioacuten maacutes raacutepida en el caso de las provenientes de cultivo in vitro (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 252 Humedad Debido a la anatomiacutea y la condicioacuten fisioloacutegica de las plantas desarrolladas in vitro donde se ha mantenido una alta humedad relativa es necesario regar al momento del traslado para obtener una alta sobrevivencia Muchos laboratorios aseguran que hay que evitar tener un sistema de aspersioacuten ya que se produce el ambiente necesario (muy huacutemedo) para la aparicioacuten de hongos algas o bacterias Otros meacutetodos incluyen el uso de humidificadores o poner las macetas en un lugar cerrado donde se retenga vapor para esto se pueden usar por ejemplo tapas de polietileno Este meacutetodo es relativamente econoacutemico pero se debe tener control del calor y monitorear la falta de agua (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 253 Luz Durante la etapa in vitro las plantas estaacuten expuestas a altos niveles de luminosidad lo que se traduce en hojas delgadas Antes del traslado se recomienda mantener las plantas con un 50 de sombra para asiacute poder aclimatarlas de mejor manera esto debido a que las plantas micropropagadas tienen un bajo control sobre la transpiracioacuten y un inadecuado mecanismo de fotosiacutentesis La sombra reduce la transpiracioacuten evitando excesivas peacuterdidas de agua asiacute como tambieacuten el exceso de luz destruye las moleacuteculas de clorofila Luego del periacuteodo bajo sombra se deben mover las macetas gradualmente hacia el nivel de luz al cual seraacute llevado para su crecimiento final (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 254 Temperatura La temperatura del aire y del medio o sustrato de crecimiento estaacute generalmente controlado durante el periacuteodo de aclimatacioacuten El calor es necesario en los meses de invierno y el friacuteo (enfriar) es esencial en los meses de verano Ajustando la cantidad de sombra y humedad se obtiene un control sobre la temperatura El
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enfriamiento se puede obtener gracias a ventilacioacuten abanicos niebla o aire acondicionado El calor puede provenir del sistema existente en el edificio o invernadero donde esteacuten ubicadas las macetas o por las laacutemparas ocupadas para el control del fotoperiacuteodo El rango de temperatura que se mantiene por lo general es entre los 13 y 30ordmC y esta determinado principalmente por la especie en cuestioacuten La temperatura de la zona donde se encuentran las raiacuteces es muy importante para el crecimiento lo ideal es que dicho sector tenga una mayor temperatura que el aire fomentando el crecimiento de las raiacuteces e incrementando la humedad alrededor de la planta Durante el verano esto es difiacutecil de obtener ya que la temperatura del aire es muy alta debido a la alta radiacioacuten solar Terminado el proceso de aclimatacioacuten esto ya no es necesario (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 255 Fotosiacutentesis Las plantas sufren un cambio radical cuando son removidas desde cultivo in vitro ya que son forzadas a cambiar de heterotroacuteficas a autotroacuteficas y la fotosiacutentesis se vuelve fundamental para la sobrevivencia Las hojas de las plantas in vitro no estaacuten formadas para hacer fotosiacutentesis ya que en la caacutemara de incubacioacuten no se produce un fuerte intercambio gaseoso esto debido a que la sacarosa es entregada a traveacutes del medio de cultivo Las hojas de las plantas que son trasladadas al campo o invernadero sufren deterioro debido a que no estaacuten formadas para la fijacioacuten de carbono Esto se produce por un tiempo aproximado de cuatro semanas despueacutes de las cuales las hojas nuevas suplen a las viejas Otro punto es que las hojas de las plantas cultivadas in vitro contienen menor proporcioacuten de clorofila que las plantas que han crecido normalmente en el campo En un estudio de coliflor cultivado in vitro se midioacute el CO2 y se obtuvo un balance negativo el cual se mantuvo durante dos semanas despueacutes del transplante Algo similar ocurrioacute con frutilla despueacutes del transplante las hojas se deterioraron raacutepidamente lo que quiere decir que no hubo incremento en la fijacioacuten de carbono indicando falta de desarrollo en la competencia fotosinteacutetica
El bajo nivel de CO2 durante el cultivo in vitro limita el proceso de fotosiacutentesis lo cual se puede compensar usando sacarosa en el medio de cultivo Tambieacuten se puede incrementar el nivel de luz y CO2 obteniendo un fuerte aumento en el crecimiento de varias especies como orquiacutedeas clavel etc (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 256 Sustrato Un sustrato es todo material soacutelido distinto del suelo natural mineral u orgaacutenico que colocado en un contenedor en forma pura o en mezcla permite el anclaje del sistema radicular de la planta desempentildeando por lo tanto un papel de soporte para la planta El sustrato puede intervenir o no en el complejo proceso de la nutricioacuten mineral de la planta (INFOAGRO 2007) El sustrato y los contenedores dentro de los cuales se van a transplantar las plaacutentulas in vitro son importantes para una buena sobrevivencia
Los sustratos ejercen una influencia significativa en la arquitectura del sistema radical de las plantas y en las asociaciones bioloacutegicas de este con el suelo influenciando el
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estado nutricional y la translocacioacuten de agua en el sistema suelo-planta-atmoacutesfera Uno de los requisitos fundamentales que debe cumplir el sustrato para su utilizacioacuten es la sanidad Cuando estos no se elaboran almacenan o manejan correctamente pueden contaminarse y provocar serios dantildeos a las plantas durante la aclimatacioacuten por esta razoacuten son preferidos como componentes para su elaboracioacuten materiales inertes o aquellos en las cuales el proceso de obtencioacuten garantice la mayor desinfeccioacuten posible
Uno de los factores de mayor importancia a la hora de seleccionar los materiales que pueden constituir el sustrato es su disponibilidad tanto en teacuterminos de facilidad de obtencioacuten o suministro como de su costo (VILCHEZ et al 2007)
La presencia de inhibidores o tambieacuten cambios en el pH del sustrato pueden afectar el crecimiento de las raiacuteces y consecuentemente el eacutexito del transplante
Muchos laboratorios y viveros transplantan a un sustrato uniforme debiendo ser eacuteste adecuado en cuanto a soporte de las plantas pH porosidad aireacioacuten y drenaje (DEBERGH y ZIMMERMAN 1991)
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3 MATERIAL Y MEacuteTODO
Para la realizacioacuten de este trabajo se utilizoacute el siguiente material y meacutetodo
31 Material La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio e invernadero de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal pertenecientes a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de Chile
311 Material vegetal Se utilizaron plaacutentulas de C virescens cultivadas in vitro a partir de semillas las cuales fueron proporcionadas por el laboratorio estas plaacutentulas fueron separadas y repicadas para aumentar la poblacioacuten y obtener la cantidad necesaria para el ensayo
FIGURA 2 Plaacutentulas de C virescens en caacutemara de crecimiento in vitro
312 Materiales Los materiales que se utilizaron fueron los siguientes Equipos autoclave caacutemara de flujo laminar dispensador de medios medidor
de pH agitador magneacutetico horno microondas balanza mechero termoacutemetro Materiales vasos de precipitado matraces probetas pipetas papel de
aluminio frascos de vidrio placas Petri pinzas bisturiacute macetas regadera Soluciones soluciones madre (Medio MS) gelificante etanol 70 y 95
32 Meacutetodo A continuacioacuten se da a conocer la metodologiacutea con la cual se trabajoacute 321 Preparacioacuten del medio de cultivo Para la obtencioacuten de plantas a traveacutes de la micropropagacioacuten se ocupoacute el medio basal de MURASHIGE y SKOOG (1962) tambieacuten llamado medio MS Este medio tiene un pH de entre 56-57 Posteriormente se dosificoacute con el dispensador de medios para que cada frasco tenga una cantidad adecuada (25 mL) y se llevoacute a autoclave para esterilizar a 12 atm 120ordm C por 20 min
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322 Obtencioacuten del material vegetal Al tener el medio esterilizado se procedioacute a la separacioacuten y repicado de plaacutentulas existentes en el laboratorio Las siembras se realizaron en el mes de mayo del 2007 Estas siembras se realizaron en la caacutemara de flujo laminar de modo de asegurar que la siembra sea 100 aseacuteptica Estas plaacutentulas fueron mantenidas en la caacutemara de incubacioacuten hasta obtener los tamantildeos requeridos para el ensayo donde las condiciones fueron las siguientes
minus Temperatura ambiental de 23-25ordm C minus Fotoperiacuteodo de 16 horas minus Intensidad lumiacutenica controlada de 50-55 micromol m-2s-1
323 Sustratos Se utilizaron tres tipos de sustratos el primero corresponde a una mezcla de turba + perlita (11) el segundo corresponde a Sphagnum (100) y el tercero corresponde a una mezcla de turba + arena (11) Una vez realizadas las mezclas se procedioacute a una esterilizacioacuten en un autoclave a 121ordm C por 20 minutos a 12 atmoacutesfera De esta forma se trabajoacute con material limpio y sano evitando ataque de hongos o bacterias El anaacutelisis quiacutemico de los sustratos se muestra en el Anexo 2 324 Plantacioacuten Las plaacutentulas con un promedio de cuatro meses en condiciones de caacutemara de crecimiento in vitro obtuvieron el tamantildeo adecuado para ser utilizadas Se sacaron de los frascos y se plantaron en las macetas de plaacutestico transparente con los sustratos Posteriormente fueron dejadas en la sala del laboratorio donde se debioacute asperjar con solucioacuten nutritiva Hoagland y fungicida Captan CUADRO 1 Composicioacuten de solucioacuten nutritiva Hoagland
KNO3 102 gL Ca(NO3) 4 H2 O 0492 gL
NH4H2 (PO4) 023 gL MgSO4 7 H2O 049 gL
H3BO3 286 mgL MnCl2 2 H2O 181 mgL CuSO4 5 H2O 008 mgL ZnSO4 5 H2O 022 mgL Na2MoO4 H2O 009 mgL
FeSO4 7 H2O 05 06 mL FUENTE FINCK 1988 325 Disentildeo de los ensayos Este trabajo de investigacioacuten constoacute de un ensayo con dos etapas Antes que todo se realizoacute la separacioacuten y repicado in vitro de plaacutentulas de C virescens para la obtencioacuten del nuacutemero necesario de plantas En la etapa 1 se utilizaron tres tamantildeos de plaacutentulas obtenidas in vitro de 1-2cm de 2-3cm y de maacutes de 3cm de altura que se transplantaron a tres sustratos turba + perlita 11(vv) Sphagnum (100) y turba + arena 11 (vv) La turba provino de la Sociedad
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Minera Patagonia Peat SA en Hijuelas el Sphagnum de la empresa Lonquen Chile de Puerto Montt y la perlita se obtuvo a traveacutes del sitio web wwwjardisencl (representante legal Walter Rathgeb Penza Ingeniero Agroacutenomo Santiago) Las plaacutentulas se plantaron de acuerdo a su tamantildeo las de maacutes de 3cm se colocaron de 6 por maceta las de 2 a 3cm de a 8 por maceta y las maacutes chicas de a 10 por maceta Estas macetas fueron dejadas en una sala de aclimatacioacuten con una temperatura promedio de 20ordm C intensidad lumiacutenica de 50-55 micromol m-2s-1 y 14-16 hrs de fotoperiacuteodo Se fertilizoacute asperjando cada cinco diacuteas con solucioacuten nutritiva Hoagland Esta etapa se llevoacute a cabo durante dos meses desde el cinco de septiembre hasta el cinco de noviembre de 2007
En la etapa 2 se continuoacute el proceso de aclimatacioacuten en invernadero de las plaacutentulas obtenidas en la etapa 1 que despueacutes de dos meses teniacutean un mayor tamantildeo y se habiacutean acondicionado al ambiente exterior (fuera de la caacutemara de crecimiento) Las plantas se mantuvieron en las macetas durante tres semanas para aclimatarlas y luego las plantas sobrevivientes fueron transplantadas a macetas maacutes grandes individuales durante tres meses aproximadamente hasta el cinco de marzo 2008 Estas nuevas macetas tuvieron como sustrato turba y suelo (trumao) en igual proporcioacuten (Anexo 2) La temperatura promedio de invernadero fluctuoacute de 13 a 35 degC seguacuten el mes En enero el promedio fue de 25 (Anexo 3) Para bajar la temperatura alrededor de 5deg C se instaloacute una malla Rachel 326 Disentildeo experimental El disentildeo experimental utilizado fue completamente al azar ordenado como experimento factorial con dos factores tamantildeo (3) y sustrato (3) Cada tratamiento tuvo tres repeticiones con un miacutenimo de 6 plantas por recipiente 327 Variables a evaluar Durante los dos meses en que las macetas estuvieron en la sala de aclimatacioacuten se evaluoacute el desarrollo foliar contando el nuacutemero de hojas una vez al mes Posteriormente se trasladaron las mismas macetas a invernadero durante tres semanas para continuar con la aclimatacioacuten de las plaacutentulas Transcurrido este tiempo se transplantaron las plaacutentulas sobrevivientes a macetas individuales y continuoacute mensualmente la evaluacioacuten de eacutestas (nuacutemero de hojas) hasta la obtencioacuten de plantas establecidas Al momento del transplante y al final del ensayo se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces asiacute como tambieacuten al final del ensayo de evaluoacute el crecimiento en altura (cm) La sobrevivencia fue evaluada al final del ensayo por maceta
Tanto en la sala de aclimatacioacuten coacutemo en el invernadero se registroacute la temperatura con la ayuda de un termoacutemetro de maacutexima y miacutenima (Anexo 3) 328 Anaacutelisis estadiacutestico Una vez obtenidos los datos se procedioacute a comprobar si estos cumpliacutean con los supuestos de aleatoriedad normalidad y homogeneidad de varianzas que exige este tipo de anaacutelisis En el caso de no cumplirse estos supuestos los datos se transformaron utilizando log10(x+05) raiacutez(x+05) o 1x para normalizarlos
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y enseguida se sometioacute los datos a un anaacutelisis estadiacutestico (ANDEVA) Posteriormente en los casos en que se observoacute diferencias significativas en el ANDEVA se aplicoacute una prueba de rangos muacuteltiples (Tukey) al 5 de significancia Para las variables no parameacutetricas que no cumplieron con los supuestos para un anaacutelisis de varianza se realizoacute la prueba de KruskalndashWallis y las comparaciones muacuteltiples a traveacutes del test de Dunn con un nivel de 5 de significancia
Se utilizaron los programas estadiacutesticos STATGRAPHICS 20 y GRAPHPAD PRISM 5 para el anaacutelisis de datos
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4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
En los siguientes puntos se discuten los resultados obtenidos en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens
En la Figura 3 se observan plaacutentulas de C virescens micropropagadas en medio MS en caacutemara de crecimiento al inicio del ensayo (A) y en invernadero despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten (B)
BA
FIGURA 3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten
A continuacioacuten se presentan los resultados obtenidos para las variables analizadas (Cuadro 2 y 3) de esta manera se pueden visualizar en general los resultados obtenidos en el proceso de aclimatacioacuten durante seis meses
CUADRO 2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de raiacuteces
inicial y final Variables
Hojas finales (nuacutemero)
Raiacuteces iniciales (nuacutemero)
Raiacuteces finales (nuacutemero)
Tamantildeo de plaacutentulas 36 24 37 47 29 46
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 61 43 76
Sustratos 53 36 56 43 29 51
Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 46 27 49
Significa que hay diferencias significativas al 95 Test de Dunn
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Las variables no parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en hojas finales y raiacuteces iniciales en sus rangos de distribucioacuten Las raiacuteces finales no presentaron diferencias seguacuten el sustrato utilizado pero de acuerdo al tamantildeo hubo diferencias en su distribucioacuten
CUADRO 3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas
Variables Altura final de plaacutentulas
(cm) Sobrevivencia
Tamantildeo de plaacutentulas
36 c 567 b 47 b 821 a
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 59 a 908 a
Sustratos 52 a 933 a
41 ab 59 b Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 49 b 772 a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY Las variables parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en altura final de hojas y en sobrevivencia 41 Nuacutemero de hojas finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentulas y de sustratos para la variable nuacutemero final de hojas 411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula Seguacuten el Cuadro 2 y Figura 4 las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero final de hojas Las plaacutentulas pequentildeas de 1-2 cm obtuvieron el nuacutemero maacutes bajo de hojas finales con una media de 36 hojas por plaacutentula lo cual es la mitad de las hojas finales que se obtuvo con las plaacutentulas de mayor tamantildeo (61 hojas aproximado por plaacutentula) Para las plaacutentulas medianas de 2-3 cm se obtuvo una media de 47 hojas por plaacutentula (Figura 4)
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Hojas finales
1-2 cm 2-3cm maacutes de 3 cm0
5
10
15
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn)
BLANCO (2006) sentildeala que plaacutentulas cultivadas in vitro crecen bajo condiciones especiales como alta humedad relativa y baja luminosidad ademaacutes son suplidas con sacarosa Estas condiciones fueron proporcionadas en una caacutemara de crecimiento en el laboratorio donde las plantas micropropagadas no son dependientes por completo de su fotosiacutentesis son heteroacutetrofas Parece ser necesario un estiacutemulo para convertirse en organismos totalmente capaces de sustentar sus propios requisitos de carbono y nitroacutegeno reducido pasando de esta manera a ser autoacutetrofos
Al ser sacadas de un medio in vitro las hojas no estaacuten preparadas para producir su propio alimento y sobreviven gracias a que el medio de cultivo le proporciona los nutrientes necesarios para vivir En este punto muchas de las hojas mueren y nacen hojas nuevas capaces de generar su alimento supliendo asiacute las hojas viejas (SEELYE et al 2003) En este ensayo las plaacutentulas de Chloraea virescens presentaron en general una buena adaptacioacuten al ser sacadas de un medio in vitro
Se observoacute que plaacutentulas con menor tamantildeo al ser aclimatadas y tener menor tejido fue maacutes difiacutecil y maacutes lento que empezaran a generar nuevos tejidos y materia orgaacutenica a partir de dioacutexido de carbono POSPIacuteŠILOVAacute et al (1999) sentildeala que al tener los estomas con desarrollo incompleto maacutes grandes y de forma maacutes redonda pierden maacutes agua lo cual puede provocar una peacuterdida de hojas muriendo asiacute la plaacutentula Por esta razoacuten las plaacutentulas pequentildeas se demoran maacutes tiempo en generar hojas nuevas es por ello que al finalizar este estudio muestran el menor nuacutemero final de hojas 412 Efecto del tipo de sustrato Al analizar la influencia del tipo de sustrato se encontraron diferencias significativas entre los tres sustratos utilizados Seguacuten el Cuadro 2 y la Figura 5 el sustrato donde se obtuvo mejores resultados fue
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turba+perlita en el cual se observoacute un promedio de 53 hojas por plaacutentula siendo Sphagnum el maacutes bajo con 43 hojas por plaacutentula De acuerdo a los resultados del anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados el sustrato turba+perlita tiene mayor cantidad de nitroacutegeno foacutesforo calcio magnesio y azufre disponible comparativamente con los otros dos sustratos (Sphagnum y arena+turba) (Anexo 2)
Hojas finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
Sustratos
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) Para la brotacioacuten y el crecimiento de las plantas se necesita agua y Nitroacutegeno lo que favorece a una mayor tasa de aparicioacuten de hojas lo que se traduce en una mayor cantidad de hojas finales El Nitroacutegeno se encuentra en mayor cantidad en el sustrato turba+perlita debido a lo cual los mejores resultados se obtienen en dicho sustrato 413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Despueacutes de analizados los efectos individuales del tamantildeo y del sustrato al interactuar ambos factores existen diferencias significativas La mejor interaccioacuten se obtuvo con el sustrato turba+perlita y con el mayor tamantildeo de la plaacutentula (Figura 6) Debido a la buena estructura (porosa) de dicho sustrato se podriacutea decir que se favorecioacute la absorcioacuten radicular de nutrientes obteniendo por ello un mayor nuacutemero de hojas finales Para los menores tamantildeos no se observan diferencias significativas obteniendo como promedio 41 hojas por plaacutentula Para el mayor tamantildeo el promedio fue de 6 hojas por plaacutentula
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Hojas finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 42 Raiacuteces iniciales Este paraacutemetro se evaluoacute luego de la primera etapa de aclimatacioacuten la cual se realizoacute en una sala de aclimatacioacuten del laboratorio Se analizoacute la influencia de diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos sobre la variable nuacutemero raiacuteces iniciales (Anaacutelisis de Kruskal-Wallis en Anexo 7)
FIGURA 7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses de pre aclimatacioacuten
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En la Figura 7 se puede observar los resultados de pre aclimatacioacuten en sala de laboratorio En esta etapa ya es posible ver la presencia de raiacuteces desarrolladas 421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula En el Cuadro 2 se puede observar que las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero inicial de raiacuteces y en la Figura 8 se puede comprobar que para los dos tamantildeos de plaacutentula maacutes pequentildeos no se observa gran cantidad de raiacuteces esto no impidioacute el desarrollo posterior de las plaacutentulas las cuales lograron enraizar al final del estudio Esto se contrapone a lo observado en un estudio de Lapageria rosea donde la presencia de raiacutez y brote para lograr una multiplicacioacuten exitosa de plantas es de vital importancia Incluso algunas plaacutentulas de L rosea no brotan en condiciones in vitro en donde tienen las mejores condiciones nutricionales y hormonales para hacerlo Esto se debe a factores internos de la plaacutentula siendo muy difiacutecil que broten inmediatamente en caacutemara de aclimatacioacuten donde ya dejan de recibir los nutrientes necesarios de manera directa y requieren de balances de energiacutea para poder seguir elongando raiacuteces absorber nutrientes y brotar para poder obtener los carbohidratos necesarios para seguir su crecimiento (BLANCO 2006) El tamantildeo de plaacutentula tiene importancia para el desarrollo de raiacuteces se distingue notoriamente que en los tamantildeos maacutes grandes el nuacutemero de raiacuteces es mayor comparativamente con los tamantildeos pequentildeos donde el nuacutemero de raiacuteces fue escaso Debido a la presencia de maacutes hojas existe una mayor cantidad de aacuterea fotosinteacutetica esta situacioacuten estimula el crecimiento de las raiacuteces para la obtencioacuten de agua y nutrientes
Raices iniciales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
2
4
6
8
10
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o inicial de ra
iacuteces
FIGURA 8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn)
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422 Efecto del tipo de sustrato Para el sustrato turba+perlita se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas en el nuacutemero de raiacuteces con respecto a los dos otros sustratos esto se puede ver en el Figura 9 donde se observa que se obtuvieron los mayores resultados En cualquier medio de crecimiento el espacio no ocupado por un soacutelido se llama porosidad este espacio puede ser ocupado en parte para retener agua y en parte para proporcionarle aire a las raiacuteces La ausencia de uno de estos elementos es perjudicial para las plantas La turba es conocida por tener estas propiedades y la perlita tambieacuten por esta razoacuten se sabe que la mezcla turba-perlita provee propiedades fiacutesicas excelentes como medio de crecimiento y propagacioacuten (INFOAGRO 2007) Estos resultados con turba-perlita (298 de materia orgaacutenica) coinciden con los obtenidos por DIAZ et al (2004) quienes al utilizar un sustrato compuesto por 100 de humus de lombriz para aclimatar cantildea de azuacutecar obtuvieron el mayor nuacutemero de raiacuteces Esto puede atribuirse al importante aporte de materia orgaacutenica del humus (47) lo que le confiere una mejor estructura obtenieacutendose una excelente porosidad del sustrato La aireacioacuten del suelo es necesaria para favorecer la maacutexima absorcioacuten de nutrientes por las raiacuteces Esto tambieacuten sucede en el sustrato turba+perlita el cual posee la mayor cantidad de materia orgaacutenica de los tres sustratos utilizados
Raices iniciales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
2
4
6
8
10
Sustratos
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato En los anaacutelisis para la variable nuacutemero de raiacuteces se puede decir que la mejor interaccioacuten se presentoacute para el sustrato de turba+perlita junto con el mayor tamantildeo de plaacutentulas obteniendo los valores maacutes altos entre los nueve tratamientos La presencia de raiacuteces luego de la micropropagacioacuten aumenta la posibilidad de eacutexito en el transplante ya que se crea un favorable balance de agua Pero esto no quiere
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decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
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Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
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En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
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El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
34
Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
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- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
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- INDICES
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- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
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- RESUMEN
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- Reacutesumeacute
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- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
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- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
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- 3 MATERIAL Y METODO
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- 31 Material
- 32 Meacutetodo
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- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
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- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
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- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
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- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
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eacuteste desde los 30 diacuteas de cultivo solamente en un 70 de los explantes cultivados El 100 se logroacute a los 90 diacuteas de cultivo observando callo abundante alrededor de todo el tejido de color blanco con puntos pigmentados de color verde La regeneracioacuten de protocormos de esta orquiacutedea se establecioacute con la siembra de segmentos de hoja de plaacutentulas de 6 meses de edad de manera directa o a partir de callos En callos la produccioacuten fue oacuteptima en el medio MS con 01 mgl de ANABAGA3 ya que a los 60 diacuteas se obtuvieron 50 protocormos por segmento de callo Solamente se produjeron 10 protocormos por explante al cultivarse los segmentos de hoja en MS con 01 mgl de ANABAGA3 a los 120 diacuteas de cultivo (HUAPEO y SALGADO 2004) 25 Aclimatacioacuten Aclimatacioacuten significa que el hombre intercede y guiacutea el proceso de acondicionamiento de las plantas hasta que eacutestas sean aptas para crecer en el campo yo invernadero
Un alto nuacutemero de plantas micropropagadas no sobreviven al cambio desde el cultivo in vitro hacia el ambiente exterior ya sea en campo o invernadero Eacutestos dos uacuteltimos tienen menor humedad relativa niveles maacutes altos de luminosidad y un ambiente seacuteptico los cuales son maacutes estresantes para las plantas micropropagadas La mayoriacutea de las especies que crecen in vitro necesitan un proceso de aclimatacioacuten pudiendo obtener asiacute un nuacutemero suficiente de plantas vivas y vigorosas para trasplantar al suelo (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991)
La aclimatacioacuten no es uacutenicamente para micropropagacioacuten siendo usada ademaacutes en propagacioacuten convencional durante antildeos Despueacutes de cortar las hojas y de haber formado raiacuteces por lo general son aclimatadas antes de ser llevadas al campo o invernadero Ejemplos de dos teacutecnicas comunes son bajar gradualmente la humedad y mantener el nivel de luz con un 50 de sombra antes de trasladarlos al campo Las raiacuteces que han sido cortadas y mal limpiadas muchas veces son focos de infeccioacuten En estos casos las plantas muestran signos de marchitez hojas necrosadas y tambieacuten se puede llegar a la muerte de eacutestas El cultivo in vitro reduce la necesidad de fotosiacutentesis ya que las condiciones de la caacutemara de incubacioacuten proveen a la planta de sacarosa u otro azuacutecar Tambieacuten en estas condiciones se reduce el stress por patoacutegenos al ser un ambiente aseacuteptico Todo esto se traduce en que las plantas micropropagadas no son aptas para el campo yo invernadero (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 251 Stress hiacutedrico El stress hiacutedrico puede ser el resultado de una excesiva transpiracioacuten de las diferentes partes aeacutereas de las plantas especialmente de las hojas o por una inadecuada absorcioacuten de agua por parte de las raiacuteces La cutiacutecula y los estomas son la ruta primaria de peacuterdida de agua desde de las hojas provenientes de esta teacutecnica reproductiva 2511 Cutiacutecula La cutiacutecula es una membrana compuesta por una matriz de cutina que a su vez se encuentra cubierta en su superficie por ceras cuya funcioacuten primaria consiste en limitar la peacuterdida de agua por transpiracioacuten La permeabilidad del agua a traveacutes de la cutiacutecula se ve influenciada principalmente por la estructura y la cantidad de
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ceras cuticulares y epicuticulares no vieacutendose afectada la peacuterdida de agua por el grosor de eacutesta o la naturaleza quiacutemica de la matriz de la cutina La estructura cristalina de la parte encerada de las hojas es distinta en las plantas micropropagadas con respecto a las plantas que crecen en el campo La cera epicuticular de las hojas de plantas in vitro tienen una proporcioacuten maacutes alta de esteres y de componentes polares por el contrario tienen unas cadenas de hidrocarbonos mucho maacutes cortas Esto hace que las plantas in vitro pierdan maacutes agua que las cultivadas en campo o invernadero
Las plantas que han crecido en el campo son naturalmente de color verde pero el color de las plantas cultivadas in vitro es diferente y se puede ver a simple vista Las plantas que son pasadas a invernadero y que tengan un color verde se aclimatan de mejor forma al ambiente exterior (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 2512 Estomas La estructura estomaacutetica y su funcionamiento han sido implicados recurrentemente en el desbalance de agua exhibido por plantas micropropagadas al momento de ser removidas del cultivo in vitro Estudios con microscopiacutea de scanner electroacutenico han indicado que la estructura estomaacutetica presente en algunas especies de plantas cultivadas in vitro difieren marcadamente de las cultivadas en invernadero o en el suelo Debido a que las primeras presentan estomas de mayor tamantildeo y maacutes redondos a diferencia de las plantas cultivadas de manera normal que presentan estomas maacutes pequentildeos y eliacutepticos lo que resulta en una deshidratacioacuten maacutes raacutepida en el caso de las provenientes de cultivo in vitro (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 252 Humedad Debido a la anatomiacutea y la condicioacuten fisioloacutegica de las plantas desarrolladas in vitro donde se ha mantenido una alta humedad relativa es necesario regar al momento del traslado para obtener una alta sobrevivencia Muchos laboratorios aseguran que hay que evitar tener un sistema de aspersioacuten ya que se produce el ambiente necesario (muy huacutemedo) para la aparicioacuten de hongos algas o bacterias Otros meacutetodos incluyen el uso de humidificadores o poner las macetas en un lugar cerrado donde se retenga vapor para esto se pueden usar por ejemplo tapas de polietileno Este meacutetodo es relativamente econoacutemico pero se debe tener control del calor y monitorear la falta de agua (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 253 Luz Durante la etapa in vitro las plantas estaacuten expuestas a altos niveles de luminosidad lo que se traduce en hojas delgadas Antes del traslado se recomienda mantener las plantas con un 50 de sombra para asiacute poder aclimatarlas de mejor manera esto debido a que las plantas micropropagadas tienen un bajo control sobre la transpiracioacuten y un inadecuado mecanismo de fotosiacutentesis La sombra reduce la transpiracioacuten evitando excesivas peacuterdidas de agua asiacute como tambieacuten el exceso de luz destruye las moleacuteculas de clorofila Luego del periacuteodo bajo sombra se deben mover las macetas gradualmente hacia el nivel de luz al cual seraacute llevado para su crecimiento final (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 254 Temperatura La temperatura del aire y del medio o sustrato de crecimiento estaacute generalmente controlado durante el periacuteodo de aclimatacioacuten El calor es necesario en los meses de invierno y el friacuteo (enfriar) es esencial en los meses de verano Ajustando la cantidad de sombra y humedad se obtiene un control sobre la temperatura El
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enfriamiento se puede obtener gracias a ventilacioacuten abanicos niebla o aire acondicionado El calor puede provenir del sistema existente en el edificio o invernadero donde esteacuten ubicadas las macetas o por las laacutemparas ocupadas para el control del fotoperiacuteodo El rango de temperatura que se mantiene por lo general es entre los 13 y 30ordmC y esta determinado principalmente por la especie en cuestioacuten La temperatura de la zona donde se encuentran las raiacuteces es muy importante para el crecimiento lo ideal es que dicho sector tenga una mayor temperatura que el aire fomentando el crecimiento de las raiacuteces e incrementando la humedad alrededor de la planta Durante el verano esto es difiacutecil de obtener ya que la temperatura del aire es muy alta debido a la alta radiacioacuten solar Terminado el proceso de aclimatacioacuten esto ya no es necesario (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 255 Fotosiacutentesis Las plantas sufren un cambio radical cuando son removidas desde cultivo in vitro ya que son forzadas a cambiar de heterotroacuteficas a autotroacuteficas y la fotosiacutentesis se vuelve fundamental para la sobrevivencia Las hojas de las plantas in vitro no estaacuten formadas para hacer fotosiacutentesis ya que en la caacutemara de incubacioacuten no se produce un fuerte intercambio gaseoso esto debido a que la sacarosa es entregada a traveacutes del medio de cultivo Las hojas de las plantas que son trasladadas al campo o invernadero sufren deterioro debido a que no estaacuten formadas para la fijacioacuten de carbono Esto se produce por un tiempo aproximado de cuatro semanas despueacutes de las cuales las hojas nuevas suplen a las viejas Otro punto es que las hojas de las plantas cultivadas in vitro contienen menor proporcioacuten de clorofila que las plantas que han crecido normalmente en el campo En un estudio de coliflor cultivado in vitro se midioacute el CO2 y se obtuvo un balance negativo el cual se mantuvo durante dos semanas despueacutes del transplante Algo similar ocurrioacute con frutilla despueacutes del transplante las hojas se deterioraron raacutepidamente lo que quiere decir que no hubo incremento en la fijacioacuten de carbono indicando falta de desarrollo en la competencia fotosinteacutetica
El bajo nivel de CO2 durante el cultivo in vitro limita el proceso de fotosiacutentesis lo cual se puede compensar usando sacarosa en el medio de cultivo Tambieacuten se puede incrementar el nivel de luz y CO2 obteniendo un fuerte aumento en el crecimiento de varias especies como orquiacutedeas clavel etc (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 256 Sustrato Un sustrato es todo material soacutelido distinto del suelo natural mineral u orgaacutenico que colocado en un contenedor en forma pura o en mezcla permite el anclaje del sistema radicular de la planta desempentildeando por lo tanto un papel de soporte para la planta El sustrato puede intervenir o no en el complejo proceso de la nutricioacuten mineral de la planta (INFOAGRO 2007) El sustrato y los contenedores dentro de los cuales se van a transplantar las plaacutentulas in vitro son importantes para una buena sobrevivencia
Los sustratos ejercen una influencia significativa en la arquitectura del sistema radical de las plantas y en las asociaciones bioloacutegicas de este con el suelo influenciando el
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estado nutricional y la translocacioacuten de agua en el sistema suelo-planta-atmoacutesfera Uno de los requisitos fundamentales que debe cumplir el sustrato para su utilizacioacuten es la sanidad Cuando estos no se elaboran almacenan o manejan correctamente pueden contaminarse y provocar serios dantildeos a las plantas durante la aclimatacioacuten por esta razoacuten son preferidos como componentes para su elaboracioacuten materiales inertes o aquellos en las cuales el proceso de obtencioacuten garantice la mayor desinfeccioacuten posible
Uno de los factores de mayor importancia a la hora de seleccionar los materiales que pueden constituir el sustrato es su disponibilidad tanto en teacuterminos de facilidad de obtencioacuten o suministro como de su costo (VILCHEZ et al 2007)
La presencia de inhibidores o tambieacuten cambios en el pH del sustrato pueden afectar el crecimiento de las raiacuteces y consecuentemente el eacutexito del transplante
Muchos laboratorios y viveros transplantan a un sustrato uniforme debiendo ser eacuteste adecuado en cuanto a soporte de las plantas pH porosidad aireacioacuten y drenaje (DEBERGH y ZIMMERMAN 1991)
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3 MATERIAL Y MEacuteTODO
Para la realizacioacuten de este trabajo se utilizoacute el siguiente material y meacutetodo
31 Material La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio e invernadero de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal pertenecientes a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de Chile
311 Material vegetal Se utilizaron plaacutentulas de C virescens cultivadas in vitro a partir de semillas las cuales fueron proporcionadas por el laboratorio estas plaacutentulas fueron separadas y repicadas para aumentar la poblacioacuten y obtener la cantidad necesaria para el ensayo
FIGURA 2 Plaacutentulas de C virescens en caacutemara de crecimiento in vitro
312 Materiales Los materiales que se utilizaron fueron los siguientes Equipos autoclave caacutemara de flujo laminar dispensador de medios medidor
de pH agitador magneacutetico horno microondas balanza mechero termoacutemetro Materiales vasos de precipitado matraces probetas pipetas papel de
aluminio frascos de vidrio placas Petri pinzas bisturiacute macetas regadera Soluciones soluciones madre (Medio MS) gelificante etanol 70 y 95
32 Meacutetodo A continuacioacuten se da a conocer la metodologiacutea con la cual se trabajoacute 321 Preparacioacuten del medio de cultivo Para la obtencioacuten de plantas a traveacutes de la micropropagacioacuten se ocupoacute el medio basal de MURASHIGE y SKOOG (1962) tambieacuten llamado medio MS Este medio tiene un pH de entre 56-57 Posteriormente se dosificoacute con el dispensador de medios para que cada frasco tenga una cantidad adecuada (25 mL) y se llevoacute a autoclave para esterilizar a 12 atm 120ordm C por 20 min
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322 Obtencioacuten del material vegetal Al tener el medio esterilizado se procedioacute a la separacioacuten y repicado de plaacutentulas existentes en el laboratorio Las siembras se realizaron en el mes de mayo del 2007 Estas siembras se realizaron en la caacutemara de flujo laminar de modo de asegurar que la siembra sea 100 aseacuteptica Estas plaacutentulas fueron mantenidas en la caacutemara de incubacioacuten hasta obtener los tamantildeos requeridos para el ensayo donde las condiciones fueron las siguientes
minus Temperatura ambiental de 23-25ordm C minus Fotoperiacuteodo de 16 horas minus Intensidad lumiacutenica controlada de 50-55 micromol m-2s-1
323 Sustratos Se utilizaron tres tipos de sustratos el primero corresponde a una mezcla de turba + perlita (11) el segundo corresponde a Sphagnum (100) y el tercero corresponde a una mezcla de turba + arena (11) Una vez realizadas las mezclas se procedioacute a una esterilizacioacuten en un autoclave a 121ordm C por 20 minutos a 12 atmoacutesfera De esta forma se trabajoacute con material limpio y sano evitando ataque de hongos o bacterias El anaacutelisis quiacutemico de los sustratos se muestra en el Anexo 2 324 Plantacioacuten Las plaacutentulas con un promedio de cuatro meses en condiciones de caacutemara de crecimiento in vitro obtuvieron el tamantildeo adecuado para ser utilizadas Se sacaron de los frascos y se plantaron en las macetas de plaacutestico transparente con los sustratos Posteriormente fueron dejadas en la sala del laboratorio donde se debioacute asperjar con solucioacuten nutritiva Hoagland y fungicida Captan CUADRO 1 Composicioacuten de solucioacuten nutritiva Hoagland
KNO3 102 gL Ca(NO3) 4 H2 O 0492 gL
NH4H2 (PO4) 023 gL MgSO4 7 H2O 049 gL
H3BO3 286 mgL MnCl2 2 H2O 181 mgL CuSO4 5 H2O 008 mgL ZnSO4 5 H2O 022 mgL Na2MoO4 H2O 009 mgL
FeSO4 7 H2O 05 06 mL FUENTE FINCK 1988 325 Disentildeo de los ensayos Este trabajo de investigacioacuten constoacute de un ensayo con dos etapas Antes que todo se realizoacute la separacioacuten y repicado in vitro de plaacutentulas de C virescens para la obtencioacuten del nuacutemero necesario de plantas En la etapa 1 se utilizaron tres tamantildeos de plaacutentulas obtenidas in vitro de 1-2cm de 2-3cm y de maacutes de 3cm de altura que se transplantaron a tres sustratos turba + perlita 11(vv) Sphagnum (100) y turba + arena 11 (vv) La turba provino de la Sociedad
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Minera Patagonia Peat SA en Hijuelas el Sphagnum de la empresa Lonquen Chile de Puerto Montt y la perlita se obtuvo a traveacutes del sitio web wwwjardisencl (representante legal Walter Rathgeb Penza Ingeniero Agroacutenomo Santiago) Las plaacutentulas se plantaron de acuerdo a su tamantildeo las de maacutes de 3cm se colocaron de 6 por maceta las de 2 a 3cm de a 8 por maceta y las maacutes chicas de a 10 por maceta Estas macetas fueron dejadas en una sala de aclimatacioacuten con una temperatura promedio de 20ordm C intensidad lumiacutenica de 50-55 micromol m-2s-1 y 14-16 hrs de fotoperiacuteodo Se fertilizoacute asperjando cada cinco diacuteas con solucioacuten nutritiva Hoagland Esta etapa se llevoacute a cabo durante dos meses desde el cinco de septiembre hasta el cinco de noviembre de 2007
En la etapa 2 se continuoacute el proceso de aclimatacioacuten en invernadero de las plaacutentulas obtenidas en la etapa 1 que despueacutes de dos meses teniacutean un mayor tamantildeo y se habiacutean acondicionado al ambiente exterior (fuera de la caacutemara de crecimiento) Las plantas se mantuvieron en las macetas durante tres semanas para aclimatarlas y luego las plantas sobrevivientes fueron transplantadas a macetas maacutes grandes individuales durante tres meses aproximadamente hasta el cinco de marzo 2008 Estas nuevas macetas tuvieron como sustrato turba y suelo (trumao) en igual proporcioacuten (Anexo 2) La temperatura promedio de invernadero fluctuoacute de 13 a 35 degC seguacuten el mes En enero el promedio fue de 25 (Anexo 3) Para bajar la temperatura alrededor de 5deg C se instaloacute una malla Rachel 326 Disentildeo experimental El disentildeo experimental utilizado fue completamente al azar ordenado como experimento factorial con dos factores tamantildeo (3) y sustrato (3) Cada tratamiento tuvo tres repeticiones con un miacutenimo de 6 plantas por recipiente 327 Variables a evaluar Durante los dos meses en que las macetas estuvieron en la sala de aclimatacioacuten se evaluoacute el desarrollo foliar contando el nuacutemero de hojas una vez al mes Posteriormente se trasladaron las mismas macetas a invernadero durante tres semanas para continuar con la aclimatacioacuten de las plaacutentulas Transcurrido este tiempo se transplantaron las plaacutentulas sobrevivientes a macetas individuales y continuoacute mensualmente la evaluacioacuten de eacutestas (nuacutemero de hojas) hasta la obtencioacuten de plantas establecidas Al momento del transplante y al final del ensayo se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces asiacute como tambieacuten al final del ensayo de evaluoacute el crecimiento en altura (cm) La sobrevivencia fue evaluada al final del ensayo por maceta
Tanto en la sala de aclimatacioacuten coacutemo en el invernadero se registroacute la temperatura con la ayuda de un termoacutemetro de maacutexima y miacutenima (Anexo 3) 328 Anaacutelisis estadiacutestico Una vez obtenidos los datos se procedioacute a comprobar si estos cumpliacutean con los supuestos de aleatoriedad normalidad y homogeneidad de varianzas que exige este tipo de anaacutelisis En el caso de no cumplirse estos supuestos los datos se transformaron utilizando log10(x+05) raiacutez(x+05) o 1x para normalizarlos
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y enseguida se sometioacute los datos a un anaacutelisis estadiacutestico (ANDEVA) Posteriormente en los casos en que se observoacute diferencias significativas en el ANDEVA se aplicoacute una prueba de rangos muacuteltiples (Tukey) al 5 de significancia Para las variables no parameacutetricas que no cumplieron con los supuestos para un anaacutelisis de varianza se realizoacute la prueba de KruskalndashWallis y las comparaciones muacuteltiples a traveacutes del test de Dunn con un nivel de 5 de significancia
Se utilizaron los programas estadiacutesticos STATGRAPHICS 20 y GRAPHPAD PRISM 5 para el anaacutelisis de datos
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4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
En los siguientes puntos se discuten los resultados obtenidos en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens
En la Figura 3 se observan plaacutentulas de C virescens micropropagadas en medio MS en caacutemara de crecimiento al inicio del ensayo (A) y en invernadero despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten (B)
BA
FIGURA 3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten
A continuacioacuten se presentan los resultados obtenidos para las variables analizadas (Cuadro 2 y 3) de esta manera se pueden visualizar en general los resultados obtenidos en el proceso de aclimatacioacuten durante seis meses
CUADRO 2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de raiacuteces
inicial y final Variables
Hojas finales (nuacutemero)
Raiacuteces iniciales (nuacutemero)
Raiacuteces finales (nuacutemero)
Tamantildeo de plaacutentulas 36 24 37 47 29 46
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 61 43 76
Sustratos 53 36 56 43 29 51
Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 46 27 49
Significa que hay diferencias significativas al 95 Test de Dunn
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Las variables no parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en hojas finales y raiacuteces iniciales en sus rangos de distribucioacuten Las raiacuteces finales no presentaron diferencias seguacuten el sustrato utilizado pero de acuerdo al tamantildeo hubo diferencias en su distribucioacuten
CUADRO 3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas
Variables Altura final de plaacutentulas
(cm) Sobrevivencia
Tamantildeo de plaacutentulas
36 c 567 b 47 b 821 a
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 59 a 908 a
Sustratos 52 a 933 a
41 ab 59 b Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 49 b 772 a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY Las variables parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en altura final de hojas y en sobrevivencia 41 Nuacutemero de hojas finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentulas y de sustratos para la variable nuacutemero final de hojas 411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula Seguacuten el Cuadro 2 y Figura 4 las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero final de hojas Las plaacutentulas pequentildeas de 1-2 cm obtuvieron el nuacutemero maacutes bajo de hojas finales con una media de 36 hojas por plaacutentula lo cual es la mitad de las hojas finales que se obtuvo con las plaacutentulas de mayor tamantildeo (61 hojas aproximado por plaacutentula) Para las plaacutentulas medianas de 2-3 cm se obtuvo una media de 47 hojas por plaacutentula (Figura 4)
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Hojas finales
1-2 cm 2-3cm maacutes de 3 cm0
5
10
15
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn)
BLANCO (2006) sentildeala que plaacutentulas cultivadas in vitro crecen bajo condiciones especiales como alta humedad relativa y baja luminosidad ademaacutes son suplidas con sacarosa Estas condiciones fueron proporcionadas en una caacutemara de crecimiento en el laboratorio donde las plantas micropropagadas no son dependientes por completo de su fotosiacutentesis son heteroacutetrofas Parece ser necesario un estiacutemulo para convertirse en organismos totalmente capaces de sustentar sus propios requisitos de carbono y nitroacutegeno reducido pasando de esta manera a ser autoacutetrofos
Al ser sacadas de un medio in vitro las hojas no estaacuten preparadas para producir su propio alimento y sobreviven gracias a que el medio de cultivo le proporciona los nutrientes necesarios para vivir En este punto muchas de las hojas mueren y nacen hojas nuevas capaces de generar su alimento supliendo asiacute las hojas viejas (SEELYE et al 2003) En este ensayo las plaacutentulas de Chloraea virescens presentaron en general una buena adaptacioacuten al ser sacadas de un medio in vitro
Se observoacute que plaacutentulas con menor tamantildeo al ser aclimatadas y tener menor tejido fue maacutes difiacutecil y maacutes lento que empezaran a generar nuevos tejidos y materia orgaacutenica a partir de dioacutexido de carbono POSPIacuteŠILOVAacute et al (1999) sentildeala que al tener los estomas con desarrollo incompleto maacutes grandes y de forma maacutes redonda pierden maacutes agua lo cual puede provocar una peacuterdida de hojas muriendo asiacute la plaacutentula Por esta razoacuten las plaacutentulas pequentildeas se demoran maacutes tiempo en generar hojas nuevas es por ello que al finalizar este estudio muestran el menor nuacutemero final de hojas 412 Efecto del tipo de sustrato Al analizar la influencia del tipo de sustrato se encontraron diferencias significativas entre los tres sustratos utilizados Seguacuten el Cuadro 2 y la Figura 5 el sustrato donde se obtuvo mejores resultados fue
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turba+perlita en el cual se observoacute un promedio de 53 hojas por plaacutentula siendo Sphagnum el maacutes bajo con 43 hojas por plaacutentula De acuerdo a los resultados del anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados el sustrato turba+perlita tiene mayor cantidad de nitroacutegeno foacutesforo calcio magnesio y azufre disponible comparativamente con los otros dos sustratos (Sphagnum y arena+turba) (Anexo 2)
Hojas finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
Sustratos
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) Para la brotacioacuten y el crecimiento de las plantas se necesita agua y Nitroacutegeno lo que favorece a una mayor tasa de aparicioacuten de hojas lo que se traduce en una mayor cantidad de hojas finales El Nitroacutegeno se encuentra en mayor cantidad en el sustrato turba+perlita debido a lo cual los mejores resultados se obtienen en dicho sustrato 413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Despueacutes de analizados los efectos individuales del tamantildeo y del sustrato al interactuar ambos factores existen diferencias significativas La mejor interaccioacuten se obtuvo con el sustrato turba+perlita y con el mayor tamantildeo de la plaacutentula (Figura 6) Debido a la buena estructura (porosa) de dicho sustrato se podriacutea decir que se favorecioacute la absorcioacuten radicular de nutrientes obteniendo por ello un mayor nuacutemero de hojas finales Para los menores tamantildeos no se observan diferencias significativas obteniendo como promedio 41 hojas por plaacutentula Para el mayor tamantildeo el promedio fue de 6 hojas por plaacutentula
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Hojas finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
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Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 42 Raiacuteces iniciales Este paraacutemetro se evaluoacute luego de la primera etapa de aclimatacioacuten la cual se realizoacute en una sala de aclimatacioacuten del laboratorio Se analizoacute la influencia de diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos sobre la variable nuacutemero raiacuteces iniciales (Anaacutelisis de Kruskal-Wallis en Anexo 7)
FIGURA 7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses de pre aclimatacioacuten
29
En la Figura 7 se puede observar los resultados de pre aclimatacioacuten en sala de laboratorio En esta etapa ya es posible ver la presencia de raiacuteces desarrolladas 421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula En el Cuadro 2 se puede observar que las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero inicial de raiacuteces y en la Figura 8 se puede comprobar que para los dos tamantildeos de plaacutentula maacutes pequentildeos no se observa gran cantidad de raiacuteces esto no impidioacute el desarrollo posterior de las plaacutentulas las cuales lograron enraizar al final del estudio Esto se contrapone a lo observado en un estudio de Lapageria rosea donde la presencia de raiacutez y brote para lograr una multiplicacioacuten exitosa de plantas es de vital importancia Incluso algunas plaacutentulas de L rosea no brotan en condiciones in vitro en donde tienen las mejores condiciones nutricionales y hormonales para hacerlo Esto se debe a factores internos de la plaacutentula siendo muy difiacutecil que broten inmediatamente en caacutemara de aclimatacioacuten donde ya dejan de recibir los nutrientes necesarios de manera directa y requieren de balances de energiacutea para poder seguir elongando raiacuteces absorber nutrientes y brotar para poder obtener los carbohidratos necesarios para seguir su crecimiento (BLANCO 2006) El tamantildeo de plaacutentula tiene importancia para el desarrollo de raiacuteces se distingue notoriamente que en los tamantildeos maacutes grandes el nuacutemero de raiacuteces es mayor comparativamente con los tamantildeos pequentildeos donde el nuacutemero de raiacuteces fue escaso Debido a la presencia de maacutes hojas existe una mayor cantidad de aacuterea fotosinteacutetica esta situacioacuten estimula el crecimiento de las raiacuteces para la obtencioacuten de agua y nutrientes
Raices iniciales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
2
4
6
8
10
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o inicial de ra
iacuteces
FIGURA 8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn)
30
422 Efecto del tipo de sustrato Para el sustrato turba+perlita se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas en el nuacutemero de raiacuteces con respecto a los dos otros sustratos esto se puede ver en el Figura 9 donde se observa que se obtuvieron los mayores resultados En cualquier medio de crecimiento el espacio no ocupado por un soacutelido se llama porosidad este espacio puede ser ocupado en parte para retener agua y en parte para proporcionarle aire a las raiacuteces La ausencia de uno de estos elementos es perjudicial para las plantas La turba es conocida por tener estas propiedades y la perlita tambieacuten por esta razoacuten se sabe que la mezcla turba-perlita provee propiedades fiacutesicas excelentes como medio de crecimiento y propagacioacuten (INFOAGRO 2007) Estos resultados con turba-perlita (298 de materia orgaacutenica) coinciden con los obtenidos por DIAZ et al (2004) quienes al utilizar un sustrato compuesto por 100 de humus de lombriz para aclimatar cantildea de azuacutecar obtuvieron el mayor nuacutemero de raiacuteces Esto puede atribuirse al importante aporte de materia orgaacutenica del humus (47) lo que le confiere una mejor estructura obtenieacutendose una excelente porosidad del sustrato La aireacioacuten del suelo es necesaria para favorecer la maacutexima absorcioacuten de nutrientes por las raiacuteces Esto tambieacuten sucede en el sustrato turba+perlita el cual posee la mayor cantidad de materia orgaacutenica de los tres sustratos utilizados
Raices iniciales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
2
4
6
8
10
Sustratos
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato En los anaacutelisis para la variable nuacutemero de raiacuteces se puede decir que la mejor interaccioacuten se presentoacute para el sustrato de turba+perlita junto con el mayor tamantildeo de plaacutentulas obteniendo los valores maacutes altos entre los nueve tratamientos La presencia de raiacuteces luego de la micropropagacioacuten aumenta la posibilidad de eacutexito en el transplante ya que se crea un favorable balance de agua Pero esto no quiere
31
decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
10
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
32
En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
33
El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
34
Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
17
ceras cuticulares y epicuticulares no vieacutendose afectada la peacuterdida de agua por el grosor de eacutesta o la naturaleza quiacutemica de la matriz de la cutina La estructura cristalina de la parte encerada de las hojas es distinta en las plantas micropropagadas con respecto a las plantas que crecen en el campo La cera epicuticular de las hojas de plantas in vitro tienen una proporcioacuten maacutes alta de esteres y de componentes polares por el contrario tienen unas cadenas de hidrocarbonos mucho maacutes cortas Esto hace que las plantas in vitro pierdan maacutes agua que las cultivadas en campo o invernadero
Las plantas que han crecido en el campo son naturalmente de color verde pero el color de las plantas cultivadas in vitro es diferente y se puede ver a simple vista Las plantas que son pasadas a invernadero y que tengan un color verde se aclimatan de mejor forma al ambiente exterior (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 2512 Estomas La estructura estomaacutetica y su funcionamiento han sido implicados recurrentemente en el desbalance de agua exhibido por plantas micropropagadas al momento de ser removidas del cultivo in vitro Estudios con microscopiacutea de scanner electroacutenico han indicado que la estructura estomaacutetica presente en algunas especies de plantas cultivadas in vitro difieren marcadamente de las cultivadas en invernadero o en el suelo Debido a que las primeras presentan estomas de mayor tamantildeo y maacutes redondos a diferencia de las plantas cultivadas de manera normal que presentan estomas maacutes pequentildeos y eliacutepticos lo que resulta en una deshidratacioacuten maacutes raacutepida en el caso de las provenientes de cultivo in vitro (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 252 Humedad Debido a la anatomiacutea y la condicioacuten fisioloacutegica de las plantas desarrolladas in vitro donde se ha mantenido una alta humedad relativa es necesario regar al momento del traslado para obtener una alta sobrevivencia Muchos laboratorios aseguran que hay que evitar tener un sistema de aspersioacuten ya que se produce el ambiente necesario (muy huacutemedo) para la aparicioacuten de hongos algas o bacterias Otros meacutetodos incluyen el uso de humidificadores o poner las macetas en un lugar cerrado donde se retenga vapor para esto se pueden usar por ejemplo tapas de polietileno Este meacutetodo es relativamente econoacutemico pero se debe tener control del calor y monitorear la falta de agua (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 253 Luz Durante la etapa in vitro las plantas estaacuten expuestas a altos niveles de luminosidad lo que se traduce en hojas delgadas Antes del traslado se recomienda mantener las plantas con un 50 de sombra para asiacute poder aclimatarlas de mejor manera esto debido a que las plantas micropropagadas tienen un bajo control sobre la transpiracioacuten y un inadecuado mecanismo de fotosiacutentesis La sombra reduce la transpiracioacuten evitando excesivas peacuterdidas de agua asiacute como tambieacuten el exceso de luz destruye las moleacuteculas de clorofila Luego del periacuteodo bajo sombra se deben mover las macetas gradualmente hacia el nivel de luz al cual seraacute llevado para su crecimiento final (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 254 Temperatura La temperatura del aire y del medio o sustrato de crecimiento estaacute generalmente controlado durante el periacuteodo de aclimatacioacuten El calor es necesario en los meses de invierno y el friacuteo (enfriar) es esencial en los meses de verano Ajustando la cantidad de sombra y humedad se obtiene un control sobre la temperatura El
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enfriamiento se puede obtener gracias a ventilacioacuten abanicos niebla o aire acondicionado El calor puede provenir del sistema existente en el edificio o invernadero donde esteacuten ubicadas las macetas o por las laacutemparas ocupadas para el control del fotoperiacuteodo El rango de temperatura que se mantiene por lo general es entre los 13 y 30ordmC y esta determinado principalmente por la especie en cuestioacuten La temperatura de la zona donde se encuentran las raiacuteces es muy importante para el crecimiento lo ideal es que dicho sector tenga una mayor temperatura que el aire fomentando el crecimiento de las raiacuteces e incrementando la humedad alrededor de la planta Durante el verano esto es difiacutecil de obtener ya que la temperatura del aire es muy alta debido a la alta radiacioacuten solar Terminado el proceso de aclimatacioacuten esto ya no es necesario (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 255 Fotosiacutentesis Las plantas sufren un cambio radical cuando son removidas desde cultivo in vitro ya que son forzadas a cambiar de heterotroacuteficas a autotroacuteficas y la fotosiacutentesis se vuelve fundamental para la sobrevivencia Las hojas de las plantas in vitro no estaacuten formadas para hacer fotosiacutentesis ya que en la caacutemara de incubacioacuten no se produce un fuerte intercambio gaseoso esto debido a que la sacarosa es entregada a traveacutes del medio de cultivo Las hojas de las plantas que son trasladadas al campo o invernadero sufren deterioro debido a que no estaacuten formadas para la fijacioacuten de carbono Esto se produce por un tiempo aproximado de cuatro semanas despueacutes de las cuales las hojas nuevas suplen a las viejas Otro punto es que las hojas de las plantas cultivadas in vitro contienen menor proporcioacuten de clorofila que las plantas que han crecido normalmente en el campo En un estudio de coliflor cultivado in vitro se midioacute el CO2 y se obtuvo un balance negativo el cual se mantuvo durante dos semanas despueacutes del transplante Algo similar ocurrioacute con frutilla despueacutes del transplante las hojas se deterioraron raacutepidamente lo que quiere decir que no hubo incremento en la fijacioacuten de carbono indicando falta de desarrollo en la competencia fotosinteacutetica
El bajo nivel de CO2 durante el cultivo in vitro limita el proceso de fotosiacutentesis lo cual se puede compensar usando sacarosa en el medio de cultivo Tambieacuten se puede incrementar el nivel de luz y CO2 obteniendo un fuerte aumento en el crecimiento de varias especies como orquiacutedeas clavel etc (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 256 Sustrato Un sustrato es todo material soacutelido distinto del suelo natural mineral u orgaacutenico que colocado en un contenedor en forma pura o en mezcla permite el anclaje del sistema radicular de la planta desempentildeando por lo tanto un papel de soporte para la planta El sustrato puede intervenir o no en el complejo proceso de la nutricioacuten mineral de la planta (INFOAGRO 2007) El sustrato y los contenedores dentro de los cuales se van a transplantar las plaacutentulas in vitro son importantes para una buena sobrevivencia
Los sustratos ejercen una influencia significativa en la arquitectura del sistema radical de las plantas y en las asociaciones bioloacutegicas de este con el suelo influenciando el
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estado nutricional y la translocacioacuten de agua en el sistema suelo-planta-atmoacutesfera Uno de los requisitos fundamentales que debe cumplir el sustrato para su utilizacioacuten es la sanidad Cuando estos no se elaboran almacenan o manejan correctamente pueden contaminarse y provocar serios dantildeos a las plantas durante la aclimatacioacuten por esta razoacuten son preferidos como componentes para su elaboracioacuten materiales inertes o aquellos en las cuales el proceso de obtencioacuten garantice la mayor desinfeccioacuten posible
Uno de los factores de mayor importancia a la hora de seleccionar los materiales que pueden constituir el sustrato es su disponibilidad tanto en teacuterminos de facilidad de obtencioacuten o suministro como de su costo (VILCHEZ et al 2007)
La presencia de inhibidores o tambieacuten cambios en el pH del sustrato pueden afectar el crecimiento de las raiacuteces y consecuentemente el eacutexito del transplante
Muchos laboratorios y viveros transplantan a un sustrato uniforme debiendo ser eacuteste adecuado en cuanto a soporte de las plantas pH porosidad aireacioacuten y drenaje (DEBERGH y ZIMMERMAN 1991)
20
3 MATERIAL Y MEacuteTODO
Para la realizacioacuten de este trabajo se utilizoacute el siguiente material y meacutetodo
31 Material La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio e invernadero de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal pertenecientes a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de Chile
311 Material vegetal Se utilizaron plaacutentulas de C virescens cultivadas in vitro a partir de semillas las cuales fueron proporcionadas por el laboratorio estas plaacutentulas fueron separadas y repicadas para aumentar la poblacioacuten y obtener la cantidad necesaria para el ensayo
FIGURA 2 Plaacutentulas de C virescens en caacutemara de crecimiento in vitro
312 Materiales Los materiales que se utilizaron fueron los siguientes Equipos autoclave caacutemara de flujo laminar dispensador de medios medidor
de pH agitador magneacutetico horno microondas balanza mechero termoacutemetro Materiales vasos de precipitado matraces probetas pipetas papel de
aluminio frascos de vidrio placas Petri pinzas bisturiacute macetas regadera Soluciones soluciones madre (Medio MS) gelificante etanol 70 y 95
32 Meacutetodo A continuacioacuten se da a conocer la metodologiacutea con la cual se trabajoacute 321 Preparacioacuten del medio de cultivo Para la obtencioacuten de plantas a traveacutes de la micropropagacioacuten se ocupoacute el medio basal de MURASHIGE y SKOOG (1962) tambieacuten llamado medio MS Este medio tiene un pH de entre 56-57 Posteriormente se dosificoacute con el dispensador de medios para que cada frasco tenga una cantidad adecuada (25 mL) y se llevoacute a autoclave para esterilizar a 12 atm 120ordm C por 20 min
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322 Obtencioacuten del material vegetal Al tener el medio esterilizado se procedioacute a la separacioacuten y repicado de plaacutentulas existentes en el laboratorio Las siembras se realizaron en el mes de mayo del 2007 Estas siembras se realizaron en la caacutemara de flujo laminar de modo de asegurar que la siembra sea 100 aseacuteptica Estas plaacutentulas fueron mantenidas en la caacutemara de incubacioacuten hasta obtener los tamantildeos requeridos para el ensayo donde las condiciones fueron las siguientes
minus Temperatura ambiental de 23-25ordm C minus Fotoperiacuteodo de 16 horas minus Intensidad lumiacutenica controlada de 50-55 micromol m-2s-1
323 Sustratos Se utilizaron tres tipos de sustratos el primero corresponde a una mezcla de turba + perlita (11) el segundo corresponde a Sphagnum (100) y el tercero corresponde a una mezcla de turba + arena (11) Una vez realizadas las mezclas se procedioacute a una esterilizacioacuten en un autoclave a 121ordm C por 20 minutos a 12 atmoacutesfera De esta forma se trabajoacute con material limpio y sano evitando ataque de hongos o bacterias El anaacutelisis quiacutemico de los sustratos se muestra en el Anexo 2 324 Plantacioacuten Las plaacutentulas con un promedio de cuatro meses en condiciones de caacutemara de crecimiento in vitro obtuvieron el tamantildeo adecuado para ser utilizadas Se sacaron de los frascos y se plantaron en las macetas de plaacutestico transparente con los sustratos Posteriormente fueron dejadas en la sala del laboratorio donde se debioacute asperjar con solucioacuten nutritiva Hoagland y fungicida Captan CUADRO 1 Composicioacuten de solucioacuten nutritiva Hoagland
KNO3 102 gL Ca(NO3) 4 H2 O 0492 gL
NH4H2 (PO4) 023 gL MgSO4 7 H2O 049 gL
H3BO3 286 mgL MnCl2 2 H2O 181 mgL CuSO4 5 H2O 008 mgL ZnSO4 5 H2O 022 mgL Na2MoO4 H2O 009 mgL
FeSO4 7 H2O 05 06 mL FUENTE FINCK 1988 325 Disentildeo de los ensayos Este trabajo de investigacioacuten constoacute de un ensayo con dos etapas Antes que todo se realizoacute la separacioacuten y repicado in vitro de plaacutentulas de C virescens para la obtencioacuten del nuacutemero necesario de plantas En la etapa 1 se utilizaron tres tamantildeos de plaacutentulas obtenidas in vitro de 1-2cm de 2-3cm y de maacutes de 3cm de altura que se transplantaron a tres sustratos turba + perlita 11(vv) Sphagnum (100) y turba + arena 11 (vv) La turba provino de la Sociedad
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Minera Patagonia Peat SA en Hijuelas el Sphagnum de la empresa Lonquen Chile de Puerto Montt y la perlita se obtuvo a traveacutes del sitio web wwwjardisencl (representante legal Walter Rathgeb Penza Ingeniero Agroacutenomo Santiago) Las plaacutentulas se plantaron de acuerdo a su tamantildeo las de maacutes de 3cm se colocaron de 6 por maceta las de 2 a 3cm de a 8 por maceta y las maacutes chicas de a 10 por maceta Estas macetas fueron dejadas en una sala de aclimatacioacuten con una temperatura promedio de 20ordm C intensidad lumiacutenica de 50-55 micromol m-2s-1 y 14-16 hrs de fotoperiacuteodo Se fertilizoacute asperjando cada cinco diacuteas con solucioacuten nutritiva Hoagland Esta etapa se llevoacute a cabo durante dos meses desde el cinco de septiembre hasta el cinco de noviembre de 2007
En la etapa 2 se continuoacute el proceso de aclimatacioacuten en invernadero de las plaacutentulas obtenidas en la etapa 1 que despueacutes de dos meses teniacutean un mayor tamantildeo y se habiacutean acondicionado al ambiente exterior (fuera de la caacutemara de crecimiento) Las plantas se mantuvieron en las macetas durante tres semanas para aclimatarlas y luego las plantas sobrevivientes fueron transplantadas a macetas maacutes grandes individuales durante tres meses aproximadamente hasta el cinco de marzo 2008 Estas nuevas macetas tuvieron como sustrato turba y suelo (trumao) en igual proporcioacuten (Anexo 2) La temperatura promedio de invernadero fluctuoacute de 13 a 35 degC seguacuten el mes En enero el promedio fue de 25 (Anexo 3) Para bajar la temperatura alrededor de 5deg C se instaloacute una malla Rachel 326 Disentildeo experimental El disentildeo experimental utilizado fue completamente al azar ordenado como experimento factorial con dos factores tamantildeo (3) y sustrato (3) Cada tratamiento tuvo tres repeticiones con un miacutenimo de 6 plantas por recipiente 327 Variables a evaluar Durante los dos meses en que las macetas estuvieron en la sala de aclimatacioacuten se evaluoacute el desarrollo foliar contando el nuacutemero de hojas una vez al mes Posteriormente se trasladaron las mismas macetas a invernadero durante tres semanas para continuar con la aclimatacioacuten de las plaacutentulas Transcurrido este tiempo se transplantaron las plaacutentulas sobrevivientes a macetas individuales y continuoacute mensualmente la evaluacioacuten de eacutestas (nuacutemero de hojas) hasta la obtencioacuten de plantas establecidas Al momento del transplante y al final del ensayo se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces asiacute como tambieacuten al final del ensayo de evaluoacute el crecimiento en altura (cm) La sobrevivencia fue evaluada al final del ensayo por maceta
Tanto en la sala de aclimatacioacuten coacutemo en el invernadero se registroacute la temperatura con la ayuda de un termoacutemetro de maacutexima y miacutenima (Anexo 3) 328 Anaacutelisis estadiacutestico Una vez obtenidos los datos se procedioacute a comprobar si estos cumpliacutean con los supuestos de aleatoriedad normalidad y homogeneidad de varianzas que exige este tipo de anaacutelisis En el caso de no cumplirse estos supuestos los datos se transformaron utilizando log10(x+05) raiacutez(x+05) o 1x para normalizarlos
23
y enseguida se sometioacute los datos a un anaacutelisis estadiacutestico (ANDEVA) Posteriormente en los casos en que se observoacute diferencias significativas en el ANDEVA se aplicoacute una prueba de rangos muacuteltiples (Tukey) al 5 de significancia Para las variables no parameacutetricas que no cumplieron con los supuestos para un anaacutelisis de varianza se realizoacute la prueba de KruskalndashWallis y las comparaciones muacuteltiples a traveacutes del test de Dunn con un nivel de 5 de significancia
Se utilizaron los programas estadiacutesticos STATGRAPHICS 20 y GRAPHPAD PRISM 5 para el anaacutelisis de datos
24
4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
En los siguientes puntos se discuten los resultados obtenidos en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens
En la Figura 3 se observan plaacutentulas de C virescens micropropagadas en medio MS en caacutemara de crecimiento al inicio del ensayo (A) y en invernadero despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten (B)
BA
FIGURA 3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten
A continuacioacuten se presentan los resultados obtenidos para las variables analizadas (Cuadro 2 y 3) de esta manera se pueden visualizar en general los resultados obtenidos en el proceso de aclimatacioacuten durante seis meses
CUADRO 2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de raiacuteces
inicial y final Variables
Hojas finales (nuacutemero)
Raiacuteces iniciales (nuacutemero)
Raiacuteces finales (nuacutemero)
Tamantildeo de plaacutentulas 36 24 37 47 29 46
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 61 43 76
Sustratos 53 36 56 43 29 51
Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 46 27 49
Significa que hay diferencias significativas al 95 Test de Dunn
25
Las variables no parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en hojas finales y raiacuteces iniciales en sus rangos de distribucioacuten Las raiacuteces finales no presentaron diferencias seguacuten el sustrato utilizado pero de acuerdo al tamantildeo hubo diferencias en su distribucioacuten
CUADRO 3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas
Variables Altura final de plaacutentulas
(cm) Sobrevivencia
Tamantildeo de plaacutentulas
36 c 567 b 47 b 821 a
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 59 a 908 a
Sustratos 52 a 933 a
41 ab 59 b Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 49 b 772 a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY Las variables parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en altura final de hojas y en sobrevivencia 41 Nuacutemero de hojas finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentulas y de sustratos para la variable nuacutemero final de hojas 411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula Seguacuten el Cuadro 2 y Figura 4 las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero final de hojas Las plaacutentulas pequentildeas de 1-2 cm obtuvieron el nuacutemero maacutes bajo de hojas finales con una media de 36 hojas por plaacutentula lo cual es la mitad de las hojas finales que se obtuvo con las plaacutentulas de mayor tamantildeo (61 hojas aproximado por plaacutentula) Para las plaacutentulas medianas de 2-3 cm se obtuvo una media de 47 hojas por plaacutentula (Figura 4)
26
Hojas finales
1-2 cm 2-3cm maacutes de 3 cm0
5
10
15
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn)
BLANCO (2006) sentildeala que plaacutentulas cultivadas in vitro crecen bajo condiciones especiales como alta humedad relativa y baja luminosidad ademaacutes son suplidas con sacarosa Estas condiciones fueron proporcionadas en una caacutemara de crecimiento en el laboratorio donde las plantas micropropagadas no son dependientes por completo de su fotosiacutentesis son heteroacutetrofas Parece ser necesario un estiacutemulo para convertirse en organismos totalmente capaces de sustentar sus propios requisitos de carbono y nitroacutegeno reducido pasando de esta manera a ser autoacutetrofos
Al ser sacadas de un medio in vitro las hojas no estaacuten preparadas para producir su propio alimento y sobreviven gracias a que el medio de cultivo le proporciona los nutrientes necesarios para vivir En este punto muchas de las hojas mueren y nacen hojas nuevas capaces de generar su alimento supliendo asiacute las hojas viejas (SEELYE et al 2003) En este ensayo las plaacutentulas de Chloraea virescens presentaron en general una buena adaptacioacuten al ser sacadas de un medio in vitro
Se observoacute que plaacutentulas con menor tamantildeo al ser aclimatadas y tener menor tejido fue maacutes difiacutecil y maacutes lento que empezaran a generar nuevos tejidos y materia orgaacutenica a partir de dioacutexido de carbono POSPIacuteŠILOVAacute et al (1999) sentildeala que al tener los estomas con desarrollo incompleto maacutes grandes y de forma maacutes redonda pierden maacutes agua lo cual puede provocar una peacuterdida de hojas muriendo asiacute la plaacutentula Por esta razoacuten las plaacutentulas pequentildeas se demoran maacutes tiempo en generar hojas nuevas es por ello que al finalizar este estudio muestran el menor nuacutemero final de hojas 412 Efecto del tipo de sustrato Al analizar la influencia del tipo de sustrato se encontraron diferencias significativas entre los tres sustratos utilizados Seguacuten el Cuadro 2 y la Figura 5 el sustrato donde se obtuvo mejores resultados fue
27
turba+perlita en el cual se observoacute un promedio de 53 hojas por plaacutentula siendo Sphagnum el maacutes bajo con 43 hojas por plaacutentula De acuerdo a los resultados del anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados el sustrato turba+perlita tiene mayor cantidad de nitroacutegeno foacutesforo calcio magnesio y azufre disponible comparativamente con los otros dos sustratos (Sphagnum y arena+turba) (Anexo 2)
Hojas finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
Sustratos
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) Para la brotacioacuten y el crecimiento de las plantas se necesita agua y Nitroacutegeno lo que favorece a una mayor tasa de aparicioacuten de hojas lo que se traduce en una mayor cantidad de hojas finales El Nitroacutegeno se encuentra en mayor cantidad en el sustrato turba+perlita debido a lo cual los mejores resultados se obtienen en dicho sustrato 413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Despueacutes de analizados los efectos individuales del tamantildeo y del sustrato al interactuar ambos factores existen diferencias significativas La mejor interaccioacuten se obtuvo con el sustrato turba+perlita y con el mayor tamantildeo de la plaacutentula (Figura 6) Debido a la buena estructura (porosa) de dicho sustrato se podriacutea decir que se favorecioacute la absorcioacuten radicular de nutrientes obteniendo por ello un mayor nuacutemero de hojas finales Para los menores tamantildeos no se observan diferencias significativas obteniendo como promedio 41 hojas por plaacutentula Para el mayor tamantildeo el promedio fue de 6 hojas por plaacutentula
28
Hojas finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 42 Raiacuteces iniciales Este paraacutemetro se evaluoacute luego de la primera etapa de aclimatacioacuten la cual se realizoacute en una sala de aclimatacioacuten del laboratorio Se analizoacute la influencia de diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos sobre la variable nuacutemero raiacuteces iniciales (Anaacutelisis de Kruskal-Wallis en Anexo 7)
FIGURA 7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses de pre aclimatacioacuten
29
En la Figura 7 se puede observar los resultados de pre aclimatacioacuten en sala de laboratorio En esta etapa ya es posible ver la presencia de raiacuteces desarrolladas 421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula En el Cuadro 2 se puede observar que las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero inicial de raiacuteces y en la Figura 8 se puede comprobar que para los dos tamantildeos de plaacutentula maacutes pequentildeos no se observa gran cantidad de raiacuteces esto no impidioacute el desarrollo posterior de las plaacutentulas las cuales lograron enraizar al final del estudio Esto se contrapone a lo observado en un estudio de Lapageria rosea donde la presencia de raiacutez y brote para lograr una multiplicacioacuten exitosa de plantas es de vital importancia Incluso algunas plaacutentulas de L rosea no brotan en condiciones in vitro en donde tienen las mejores condiciones nutricionales y hormonales para hacerlo Esto se debe a factores internos de la plaacutentula siendo muy difiacutecil que broten inmediatamente en caacutemara de aclimatacioacuten donde ya dejan de recibir los nutrientes necesarios de manera directa y requieren de balances de energiacutea para poder seguir elongando raiacuteces absorber nutrientes y brotar para poder obtener los carbohidratos necesarios para seguir su crecimiento (BLANCO 2006) El tamantildeo de plaacutentula tiene importancia para el desarrollo de raiacuteces se distingue notoriamente que en los tamantildeos maacutes grandes el nuacutemero de raiacuteces es mayor comparativamente con los tamantildeos pequentildeos donde el nuacutemero de raiacuteces fue escaso Debido a la presencia de maacutes hojas existe una mayor cantidad de aacuterea fotosinteacutetica esta situacioacuten estimula el crecimiento de las raiacuteces para la obtencioacuten de agua y nutrientes
Raices iniciales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
2
4
6
8
10
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o inicial de ra
iacuteces
FIGURA 8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn)
30
422 Efecto del tipo de sustrato Para el sustrato turba+perlita se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas en el nuacutemero de raiacuteces con respecto a los dos otros sustratos esto se puede ver en el Figura 9 donde se observa que se obtuvieron los mayores resultados En cualquier medio de crecimiento el espacio no ocupado por un soacutelido se llama porosidad este espacio puede ser ocupado en parte para retener agua y en parte para proporcionarle aire a las raiacuteces La ausencia de uno de estos elementos es perjudicial para las plantas La turba es conocida por tener estas propiedades y la perlita tambieacuten por esta razoacuten se sabe que la mezcla turba-perlita provee propiedades fiacutesicas excelentes como medio de crecimiento y propagacioacuten (INFOAGRO 2007) Estos resultados con turba-perlita (298 de materia orgaacutenica) coinciden con los obtenidos por DIAZ et al (2004) quienes al utilizar un sustrato compuesto por 100 de humus de lombriz para aclimatar cantildea de azuacutecar obtuvieron el mayor nuacutemero de raiacuteces Esto puede atribuirse al importante aporte de materia orgaacutenica del humus (47) lo que le confiere una mejor estructura obtenieacutendose una excelente porosidad del sustrato La aireacioacuten del suelo es necesaria para favorecer la maacutexima absorcioacuten de nutrientes por las raiacuteces Esto tambieacuten sucede en el sustrato turba+perlita el cual posee la mayor cantidad de materia orgaacutenica de los tres sustratos utilizados
Raices iniciales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
2
4
6
8
10
Sustratos
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato En los anaacutelisis para la variable nuacutemero de raiacuteces se puede decir que la mejor interaccioacuten se presentoacute para el sustrato de turba+perlita junto con el mayor tamantildeo de plaacutentulas obteniendo los valores maacutes altos entre los nueve tratamientos La presencia de raiacuteces luego de la micropropagacioacuten aumenta la posibilidad de eacutexito en el transplante ya que se crea un favorable balance de agua Pero esto no quiere
31
decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
10
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
32
En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
33
El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
34
Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
18
enfriamiento se puede obtener gracias a ventilacioacuten abanicos niebla o aire acondicionado El calor puede provenir del sistema existente en el edificio o invernadero donde esteacuten ubicadas las macetas o por las laacutemparas ocupadas para el control del fotoperiacuteodo El rango de temperatura que se mantiene por lo general es entre los 13 y 30ordmC y esta determinado principalmente por la especie en cuestioacuten La temperatura de la zona donde se encuentran las raiacuteces es muy importante para el crecimiento lo ideal es que dicho sector tenga una mayor temperatura que el aire fomentando el crecimiento de las raiacuteces e incrementando la humedad alrededor de la planta Durante el verano esto es difiacutecil de obtener ya que la temperatura del aire es muy alta debido a la alta radiacioacuten solar Terminado el proceso de aclimatacioacuten esto ya no es necesario (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 255 Fotosiacutentesis Las plantas sufren un cambio radical cuando son removidas desde cultivo in vitro ya que son forzadas a cambiar de heterotroacuteficas a autotroacuteficas y la fotosiacutentesis se vuelve fundamental para la sobrevivencia Las hojas de las plantas in vitro no estaacuten formadas para hacer fotosiacutentesis ya que en la caacutemara de incubacioacuten no se produce un fuerte intercambio gaseoso esto debido a que la sacarosa es entregada a traveacutes del medio de cultivo Las hojas de las plantas que son trasladadas al campo o invernadero sufren deterioro debido a que no estaacuten formadas para la fijacioacuten de carbono Esto se produce por un tiempo aproximado de cuatro semanas despueacutes de las cuales las hojas nuevas suplen a las viejas Otro punto es que las hojas de las plantas cultivadas in vitro contienen menor proporcioacuten de clorofila que las plantas que han crecido normalmente en el campo En un estudio de coliflor cultivado in vitro se midioacute el CO2 y se obtuvo un balance negativo el cual se mantuvo durante dos semanas despueacutes del transplante Algo similar ocurrioacute con frutilla despueacutes del transplante las hojas se deterioraron raacutepidamente lo que quiere decir que no hubo incremento en la fijacioacuten de carbono indicando falta de desarrollo en la competencia fotosinteacutetica
El bajo nivel de CO2 durante el cultivo in vitro limita el proceso de fotosiacutentesis lo cual se puede compensar usando sacarosa en el medio de cultivo Tambieacuten se puede incrementar el nivel de luz y CO2 obteniendo un fuerte aumento en el crecimiento de varias especies como orquiacutedeas clavel etc (DEBERGH and ZIMMERMAN 1991) 256 Sustrato Un sustrato es todo material soacutelido distinto del suelo natural mineral u orgaacutenico que colocado en un contenedor en forma pura o en mezcla permite el anclaje del sistema radicular de la planta desempentildeando por lo tanto un papel de soporte para la planta El sustrato puede intervenir o no en el complejo proceso de la nutricioacuten mineral de la planta (INFOAGRO 2007) El sustrato y los contenedores dentro de los cuales se van a transplantar las plaacutentulas in vitro son importantes para una buena sobrevivencia
Los sustratos ejercen una influencia significativa en la arquitectura del sistema radical de las plantas y en las asociaciones bioloacutegicas de este con el suelo influenciando el
19
estado nutricional y la translocacioacuten de agua en el sistema suelo-planta-atmoacutesfera Uno de los requisitos fundamentales que debe cumplir el sustrato para su utilizacioacuten es la sanidad Cuando estos no se elaboran almacenan o manejan correctamente pueden contaminarse y provocar serios dantildeos a las plantas durante la aclimatacioacuten por esta razoacuten son preferidos como componentes para su elaboracioacuten materiales inertes o aquellos en las cuales el proceso de obtencioacuten garantice la mayor desinfeccioacuten posible
Uno de los factores de mayor importancia a la hora de seleccionar los materiales que pueden constituir el sustrato es su disponibilidad tanto en teacuterminos de facilidad de obtencioacuten o suministro como de su costo (VILCHEZ et al 2007)
La presencia de inhibidores o tambieacuten cambios en el pH del sustrato pueden afectar el crecimiento de las raiacuteces y consecuentemente el eacutexito del transplante
Muchos laboratorios y viveros transplantan a un sustrato uniforme debiendo ser eacuteste adecuado en cuanto a soporte de las plantas pH porosidad aireacioacuten y drenaje (DEBERGH y ZIMMERMAN 1991)
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3 MATERIAL Y MEacuteTODO
Para la realizacioacuten de este trabajo se utilizoacute el siguiente material y meacutetodo
31 Material La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio e invernadero de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal pertenecientes a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de Chile
311 Material vegetal Se utilizaron plaacutentulas de C virescens cultivadas in vitro a partir de semillas las cuales fueron proporcionadas por el laboratorio estas plaacutentulas fueron separadas y repicadas para aumentar la poblacioacuten y obtener la cantidad necesaria para el ensayo
FIGURA 2 Plaacutentulas de C virescens en caacutemara de crecimiento in vitro
312 Materiales Los materiales que se utilizaron fueron los siguientes Equipos autoclave caacutemara de flujo laminar dispensador de medios medidor
de pH agitador magneacutetico horno microondas balanza mechero termoacutemetro Materiales vasos de precipitado matraces probetas pipetas papel de
aluminio frascos de vidrio placas Petri pinzas bisturiacute macetas regadera Soluciones soluciones madre (Medio MS) gelificante etanol 70 y 95
32 Meacutetodo A continuacioacuten se da a conocer la metodologiacutea con la cual se trabajoacute 321 Preparacioacuten del medio de cultivo Para la obtencioacuten de plantas a traveacutes de la micropropagacioacuten se ocupoacute el medio basal de MURASHIGE y SKOOG (1962) tambieacuten llamado medio MS Este medio tiene un pH de entre 56-57 Posteriormente se dosificoacute con el dispensador de medios para que cada frasco tenga una cantidad adecuada (25 mL) y se llevoacute a autoclave para esterilizar a 12 atm 120ordm C por 20 min
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322 Obtencioacuten del material vegetal Al tener el medio esterilizado se procedioacute a la separacioacuten y repicado de plaacutentulas existentes en el laboratorio Las siembras se realizaron en el mes de mayo del 2007 Estas siembras se realizaron en la caacutemara de flujo laminar de modo de asegurar que la siembra sea 100 aseacuteptica Estas plaacutentulas fueron mantenidas en la caacutemara de incubacioacuten hasta obtener los tamantildeos requeridos para el ensayo donde las condiciones fueron las siguientes
minus Temperatura ambiental de 23-25ordm C minus Fotoperiacuteodo de 16 horas minus Intensidad lumiacutenica controlada de 50-55 micromol m-2s-1
323 Sustratos Se utilizaron tres tipos de sustratos el primero corresponde a una mezcla de turba + perlita (11) el segundo corresponde a Sphagnum (100) y el tercero corresponde a una mezcla de turba + arena (11) Una vez realizadas las mezclas se procedioacute a una esterilizacioacuten en un autoclave a 121ordm C por 20 minutos a 12 atmoacutesfera De esta forma se trabajoacute con material limpio y sano evitando ataque de hongos o bacterias El anaacutelisis quiacutemico de los sustratos se muestra en el Anexo 2 324 Plantacioacuten Las plaacutentulas con un promedio de cuatro meses en condiciones de caacutemara de crecimiento in vitro obtuvieron el tamantildeo adecuado para ser utilizadas Se sacaron de los frascos y se plantaron en las macetas de plaacutestico transparente con los sustratos Posteriormente fueron dejadas en la sala del laboratorio donde se debioacute asperjar con solucioacuten nutritiva Hoagland y fungicida Captan CUADRO 1 Composicioacuten de solucioacuten nutritiva Hoagland
KNO3 102 gL Ca(NO3) 4 H2 O 0492 gL
NH4H2 (PO4) 023 gL MgSO4 7 H2O 049 gL
H3BO3 286 mgL MnCl2 2 H2O 181 mgL CuSO4 5 H2O 008 mgL ZnSO4 5 H2O 022 mgL Na2MoO4 H2O 009 mgL
FeSO4 7 H2O 05 06 mL FUENTE FINCK 1988 325 Disentildeo de los ensayos Este trabajo de investigacioacuten constoacute de un ensayo con dos etapas Antes que todo se realizoacute la separacioacuten y repicado in vitro de plaacutentulas de C virescens para la obtencioacuten del nuacutemero necesario de plantas En la etapa 1 se utilizaron tres tamantildeos de plaacutentulas obtenidas in vitro de 1-2cm de 2-3cm y de maacutes de 3cm de altura que se transplantaron a tres sustratos turba + perlita 11(vv) Sphagnum (100) y turba + arena 11 (vv) La turba provino de la Sociedad
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Minera Patagonia Peat SA en Hijuelas el Sphagnum de la empresa Lonquen Chile de Puerto Montt y la perlita se obtuvo a traveacutes del sitio web wwwjardisencl (representante legal Walter Rathgeb Penza Ingeniero Agroacutenomo Santiago) Las plaacutentulas se plantaron de acuerdo a su tamantildeo las de maacutes de 3cm se colocaron de 6 por maceta las de 2 a 3cm de a 8 por maceta y las maacutes chicas de a 10 por maceta Estas macetas fueron dejadas en una sala de aclimatacioacuten con una temperatura promedio de 20ordm C intensidad lumiacutenica de 50-55 micromol m-2s-1 y 14-16 hrs de fotoperiacuteodo Se fertilizoacute asperjando cada cinco diacuteas con solucioacuten nutritiva Hoagland Esta etapa se llevoacute a cabo durante dos meses desde el cinco de septiembre hasta el cinco de noviembre de 2007
En la etapa 2 se continuoacute el proceso de aclimatacioacuten en invernadero de las plaacutentulas obtenidas en la etapa 1 que despueacutes de dos meses teniacutean un mayor tamantildeo y se habiacutean acondicionado al ambiente exterior (fuera de la caacutemara de crecimiento) Las plantas se mantuvieron en las macetas durante tres semanas para aclimatarlas y luego las plantas sobrevivientes fueron transplantadas a macetas maacutes grandes individuales durante tres meses aproximadamente hasta el cinco de marzo 2008 Estas nuevas macetas tuvieron como sustrato turba y suelo (trumao) en igual proporcioacuten (Anexo 2) La temperatura promedio de invernadero fluctuoacute de 13 a 35 degC seguacuten el mes En enero el promedio fue de 25 (Anexo 3) Para bajar la temperatura alrededor de 5deg C se instaloacute una malla Rachel 326 Disentildeo experimental El disentildeo experimental utilizado fue completamente al azar ordenado como experimento factorial con dos factores tamantildeo (3) y sustrato (3) Cada tratamiento tuvo tres repeticiones con un miacutenimo de 6 plantas por recipiente 327 Variables a evaluar Durante los dos meses en que las macetas estuvieron en la sala de aclimatacioacuten se evaluoacute el desarrollo foliar contando el nuacutemero de hojas una vez al mes Posteriormente se trasladaron las mismas macetas a invernadero durante tres semanas para continuar con la aclimatacioacuten de las plaacutentulas Transcurrido este tiempo se transplantaron las plaacutentulas sobrevivientes a macetas individuales y continuoacute mensualmente la evaluacioacuten de eacutestas (nuacutemero de hojas) hasta la obtencioacuten de plantas establecidas Al momento del transplante y al final del ensayo se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces asiacute como tambieacuten al final del ensayo de evaluoacute el crecimiento en altura (cm) La sobrevivencia fue evaluada al final del ensayo por maceta
Tanto en la sala de aclimatacioacuten coacutemo en el invernadero se registroacute la temperatura con la ayuda de un termoacutemetro de maacutexima y miacutenima (Anexo 3) 328 Anaacutelisis estadiacutestico Una vez obtenidos los datos se procedioacute a comprobar si estos cumpliacutean con los supuestos de aleatoriedad normalidad y homogeneidad de varianzas que exige este tipo de anaacutelisis En el caso de no cumplirse estos supuestos los datos se transformaron utilizando log10(x+05) raiacutez(x+05) o 1x para normalizarlos
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y enseguida se sometioacute los datos a un anaacutelisis estadiacutestico (ANDEVA) Posteriormente en los casos en que se observoacute diferencias significativas en el ANDEVA se aplicoacute una prueba de rangos muacuteltiples (Tukey) al 5 de significancia Para las variables no parameacutetricas que no cumplieron con los supuestos para un anaacutelisis de varianza se realizoacute la prueba de KruskalndashWallis y las comparaciones muacuteltiples a traveacutes del test de Dunn con un nivel de 5 de significancia
Se utilizaron los programas estadiacutesticos STATGRAPHICS 20 y GRAPHPAD PRISM 5 para el anaacutelisis de datos
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4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
En los siguientes puntos se discuten los resultados obtenidos en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens
En la Figura 3 se observan plaacutentulas de C virescens micropropagadas en medio MS en caacutemara de crecimiento al inicio del ensayo (A) y en invernadero despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten (B)
BA
FIGURA 3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten
A continuacioacuten se presentan los resultados obtenidos para las variables analizadas (Cuadro 2 y 3) de esta manera se pueden visualizar en general los resultados obtenidos en el proceso de aclimatacioacuten durante seis meses
CUADRO 2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de raiacuteces
inicial y final Variables
Hojas finales (nuacutemero)
Raiacuteces iniciales (nuacutemero)
Raiacuteces finales (nuacutemero)
Tamantildeo de plaacutentulas 36 24 37 47 29 46
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 61 43 76
Sustratos 53 36 56 43 29 51
Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 46 27 49
Significa que hay diferencias significativas al 95 Test de Dunn
25
Las variables no parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en hojas finales y raiacuteces iniciales en sus rangos de distribucioacuten Las raiacuteces finales no presentaron diferencias seguacuten el sustrato utilizado pero de acuerdo al tamantildeo hubo diferencias en su distribucioacuten
CUADRO 3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas
Variables Altura final de plaacutentulas
(cm) Sobrevivencia
Tamantildeo de plaacutentulas
36 c 567 b 47 b 821 a
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 59 a 908 a
Sustratos 52 a 933 a
41 ab 59 b Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 49 b 772 a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY Las variables parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en altura final de hojas y en sobrevivencia 41 Nuacutemero de hojas finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentulas y de sustratos para la variable nuacutemero final de hojas 411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula Seguacuten el Cuadro 2 y Figura 4 las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero final de hojas Las plaacutentulas pequentildeas de 1-2 cm obtuvieron el nuacutemero maacutes bajo de hojas finales con una media de 36 hojas por plaacutentula lo cual es la mitad de las hojas finales que se obtuvo con las plaacutentulas de mayor tamantildeo (61 hojas aproximado por plaacutentula) Para las plaacutentulas medianas de 2-3 cm se obtuvo una media de 47 hojas por plaacutentula (Figura 4)
26
Hojas finales
1-2 cm 2-3cm maacutes de 3 cm0
5
10
15
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn)
BLANCO (2006) sentildeala que plaacutentulas cultivadas in vitro crecen bajo condiciones especiales como alta humedad relativa y baja luminosidad ademaacutes son suplidas con sacarosa Estas condiciones fueron proporcionadas en una caacutemara de crecimiento en el laboratorio donde las plantas micropropagadas no son dependientes por completo de su fotosiacutentesis son heteroacutetrofas Parece ser necesario un estiacutemulo para convertirse en organismos totalmente capaces de sustentar sus propios requisitos de carbono y nitroacutegeno reducido pasando de esta manera a ser autoacutetrofos
Al ser sacadas de un medio in vitro las hojas no estaacuten preparadas para producir su propio alimento y sobreviven gracias a que el medio de cultivo le proporciona los nutrientes necesarios para vivir En este punto muchas de las hojas mueren y nacen hojas nuevas capaces de generar su alimento supliendo asiacute las hojas viejas (SEELYE et al 2003) En este ensayo las plaacutentulas de Chloraea virescens presentaron en general una buena adaptacioacuten al ser sacadas de un medio in vitro
Se observoacute que plaacutentulas con menor tamantildeo al ser aclimatadas y tener menor tejido fue maacutes difiacutecil y maacutes lento que empezaran a generar nuevos tejidos y materia orgaacutenica a partir de dioacutexido de carbono POSPIacuteŠILOVAacute et al (1999) sentildeala que al tener los estomas con desarrollo incompleto maacutes grandes y de forma maacutes redonda pierden maacutes agua lo cual puede provocar una peacuterdida de hojas muriendo asiacute la plaacutentula Por esta razoacuten las plaacutentulas pequentildeas se demoran maacutes tiempo en generar hojas nuevas es por ello que al finalizar este estudio muestran el menor nuacutemero final de hojas 412 Efecto del tipo de sustrato Al analizar la influencia del tipo de sustrato se encontraron diferencias significativas entre los tres sustratos utilizados Seguacuten el Cuadro 2 y la Figura 5 el sustrato donde se obtuvo mejores resultados fue
27
turba+perlita en el cual se observoacute un promedio de 53 hojas por plaacutentula siendo Sphagnum el maacutes bajo con 43 hojas por plaacutentula De acuerdo a los resultados del anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados el sustrato turba+perlita tiene mayor cantidad de nitroacutegeno foacutesforo calcio magnesio y azufre disponible comparativamente con los otros dos sustratos (Sphagnum y arena+turba) (Anexo 2)
Hojas finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
Sustratos
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) Para la brotacioacuten y el crecimiento de las plantas se necesita agua y Nitroacutegeno lo que favorece a una mayor tasa de aparicioacuten de hojas lo que se traduce en una mayor cantidad de hojas finales El Nitroacutegeno se encuentra en mayor cantidad en el sustrato turba+perlita debido a lo cual los mejores resultados se obtienen en dicho sustrato 413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Despueacutes de analizados los efectos individuales del tamantildeo y del sustrato al interactuar ambos factores existen diferencias significativas La mejor interaccioacuten se obtuvo con el sustrato turba+perlita y con el mayor tamantildeo de la plaacutentula (Figura 6) Debido a la buena estructura (porosa) de dicho sustrato se podriacutea decir que se favorecioacute la absorcioacuten radicular de nutrientes obteniendo por ello un mayor nuacutemero de hojas finales Para los menores tamantildeos no se observan diferencias significativas obteniendo como promedio 41 hojas por plaacutentula Para el mayor tamantildeo el promedio fue de 6 hojas por plaacutentula
28
Hojas finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 42 Raiacuteces iniciales Este paraacutemetro se evaluoacute luego de la primera etapa de aclimatacioacuten la cual se realizoacute en una sala de aclimatacioacuten del laboratorio Se analizoacute la influencia de diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos sobre la variable nuacutemero raiacuteces iniciales (Anaacutelisis de Kruskal-Wallis en Anexo 7)
FIGURA 7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses de pre aclimatacioacuten
29
En la Figura 7 se puede observar los resultados de pre aclimatacioacuten en sala de laboratorio En esta etapa ya es posible ver la presencia de raiacuteces desarrolladas 421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula En el Cuadro 2 se puede observar que las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero inicial de raiacuteces y en la Figura 8 se puede comprobar que para los dos tamantildeos de plaacutentula maacutes pequentildeos no se observa gran cantidad de raiacuteces esto no impidioacute el desarrollo posterior de las plaacutentulas las cuales lograron enraizar al final del estudio Esto se contrapone a lo observado en un estudio de Lapageria rosea donde la presencia de raiacutez y brote para lograr una multiplicacioacuten exitosa de plantas es de vital importancia Incluso algunas plaacutentulas de L rosea no brotan en condiciones in vitro en donde tienen las mejores condiciones nutricionales y hormonales para hacerlo Esto se debe a factores internos de la plaacutentula siendo muy difiacutecil que broten inmediatamente en caacutemara de aclimatacioacuten donde ya dejan de recibir los nutrientes necesarios de manera directa y requieren de balances de energiacutea para poder seguir elongando raiacuteces absorber nutrientes y brotar para poder obtener los carbohidratos necesarios para seguir su crecimiento (BLANCO 2006) El tamantildeo de plaacutentula tiene importancia para el desarrollo de raiacuteces se distingue notoriamente que en los tamantildeos maacutes grandes el nuacutemero de raiacuteces es mayor comparativamente con los tamantildeos pequentildeos donde el nuacutemero de raiacuteces fue escaso Debido a la presencia de maacutes hojas existe una mayor cantidad de aacuterea fotosinteacutetica esta situacioacuten estimula el crecimiento de las raiacuteces para la obtencioacuten de agua y nutrientes
Raices iniciales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
2
4
6
8
10
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o inicial de ra
iacuteces
FIGURA 8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn)
30
422 Efecto del tipo de sustrato Para el sustrato turba+perlita se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas en el nuacutemero de raiacuteces con respecto a los dos otros sustratos esto se puede ver en el Figura 9 donde se observa que se obtuvieron los mayores resultados En cualquier medio de crecimiento el espacio no ocupado por un soacutelido se llama porosidad este espacio puede ser ocupado en parte para retener agua y en parte para proporcionarle aire a las raiacuteces La ausencia de uno de estos elementos es perjudicial para las plantas La turba es conocida por tener estas propiedades y la perlita tambieacuten por esta razoacuten se sabe que la mezcla turba-perlita provee propiedades fiacutesicas excelentes como medio de crecimiento y propagacioacuten (INFOAGRO 2007) Estos resultados con turba-perlita (298 de materia orgaacutenica) coinciden con los obtenidos por DIAZ et al (2004) quienes al utilizar un sustrato compuesto por 100 de humus de lombriz para aclimatar cantildea de azuacutecar obtuvieron el mayor nuacutemero de raiacuteces Esto puede atribuirse al importante aporte de materia orgaacutenica del humus (47) lo que le confiere una mejor estructura obtenieacutendose una excelente porosidad del sustrato La aireacioacuten del suelo es necesaria para favorecer la maacutexima absorcioacuten de nutrientes por las raiacuteces Esto tambieacuten sucede en el sustrato turba+perlita el cual posee la mayor cantidad de materia orgaacutenica de los tres sustratos utilizados
Raices iniciales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
2
4
6
8
10
Sustratos
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato En los anaacutelisis para la variable nuacutemero de raiacuteces se puede decir que la mejor interaccioacuten se presentoacute para el sustrato de turba+perlita junto con el mayor tamantildeo de plaacutentulas obteniendo los valores maacutes altos entre los nueve tratamientos La presencia de raiacuteces luego de la micropropagacioacuten aumenta la posibilidad de eacutexito en el transplante ya que se crea un favorable balance de agua Pero esto no quiere
31
decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
10
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
32
En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
33
El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
34
Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
19
estado nutricional y la translocacioacuten de agua en el sistema suelo-planta-atmoacutesfera Uno de los requisitos fundamentales que debe cumplir el sustrato para su utilizacioacuten es la sanidad Cuando estos no se elaboran almacenan o manejan correctamente pueden contaminarse y provocar serios dantildeos a las plantas durante la aclimatacioacuten por esta razoacuten son preferidos como componentes para su elaboracioacuten materiales inertes o aquellos en las cuales el proceso de obtencioacuten garantice la mayor desinfeccioacuten posible
Uno de los factores de mayor importancia a la hora de seleccionar los materiales que pueden constituir el sustrato es su disponibilidad tanto en teacuterminos de facilidad de obtencioacuten o suministro como de su costo (VILCHEZ et al 2007)
La presencia de inhibidores o tambieacuten cambios en el pH del sustrato pueden afectar el crecimiento de las raiacuteces y consecuentemente el eacutexito del transplante
Muchos laboratorios y viveros transplantan a un sustrato uniforme debiendo ser eacuteste adecuado en cuanto a soporte de las plantas pH porosidad aireacioacuten y drenaje (DEBERGH y ZIMMERMAN 1991)
20
3 MATERIAL Y MEacuteTODO
Para la realizacioacuten de este trabajo se utilizoacute el siguiente material y meacutetodo
31 Material La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio e invernadero de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal pertenecientes a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de Chile
311 Material vegetal Se utilizaron plaacutentulas de C virescens cultivadas in vitro a partir de semillas las cuales fueron proporcionadas por el laboratorio estas plaacutentulas fueron separadas y repicadas para aumentar la poblacioacuten y obtener la cantidad necesaria para el ensayo
FIGURA 2 Plaacutentulas de C virescens en caacutemara de crecimiento in vitro
312 Materiales Los materiales que se utilizaron fueron los siguientes Equipos autoclave caacutemara de flujo laminar dispensador de medios medidor
de pH agitador magneacutetico horno microondas balanza mechero termoacutemetro Materiales vasos de precipitado matraces probetas pipetas papel de
aluminio frascos de vidrio placas Petri pinzas bisturiacute macetas regadera Soluciones soluciones madre (Medio MS) gelificante etanol 70 y 95
32 Meacutetodo A continuacioacuten se da a conocer la metodologiacutea con la cual se trabajoacute 321 Preparacioacuten del medio de cultivo Para la obtencioacuten de plantas a traveacutes de la micropropagacioacuten se ocupoacute el medio basal de MURASHIGE y SKOOG (1962) tambieacuten llamado medio MS Este medio tiene un pH de entre 56-57 Posteriormente se dosificoacute con el dispensador de medios para que cada frasco tenga una cantidad adecuada (25 mL) y se llevoacute a autoclave para esterilizar a 12 atm 120ordm C por 20 min
21
322 Obtencioacuten del material vegetal Al tener el medio esterilizado se procedioacute a la separacioacuten y repicado de plaacutentulas existentes en el laboratorio Las siembras se realizaron en el mes de mayo del 2007 Estas siembras se realizaron en la caacutemara de flujo laminar de modo de asegurar que la siembra sea 100 aseacuteptica Estas plaacutentulas fueron mantenidas en la caacutemara de incubacioacuten hasta obtener los tamantildeos requeridos para el ensayo donde las condiciones fueron las siguientes
minus Temperatura ambiental de 23-25ordm C minus Fotoperiacuteodo de 16 horas minus Intensidad lumiacutenica controlada de 50-55 micromol m-2s-1
323 Sustratos Se utilizaron tres tipos de sustratos el primero corresponde a una mezcla de turba + perlita (11) el segundo corresponde a Sphagnum (100) y el tercero corresponde a una mezcla de turba + arena (11) Una vez realizadas las mezclas se procedioacute a una esterilizacioacuten en un autoclave a 121ordm C por 20 minutos a 12 atmoacutesfera De esta forma se trabajoacute con material limpio y sano evitando ataque de hongos o bacterias El anaacutelisis quiacutemico de los sustratos se muestra en el Anexo 2 324 Plantacioacuten Las plaacutentulas con un promedio de cuatro meses en condiciones de caacutemara de crecimiento in vitro obtuvieron el tamantildeo adecuado para ser utilizadas Se sacaron de los frascos y se plantaron en las macetas de plaacutestico transparente con los sustratos Posteriormente fueron dejadas en la sala del laboratorio donde se debioacute asperjar con solucioacuten nutritiva Hoagland y fungicida Captan CUADRO 1 Composicioacuten de solucioacuten nutritiva Hoagland
KNO3 102 gL Ca(NO3) 4 H2 O 0492 gL
NH4H2 (PO4) 023 gL MgSO4 7 H2O 049 gL
H3BO3 286 mgL MnCl2 2 H2O 181 mgL CuSO4 5 H2O 008 mgL ZnSO4 5 H2O 022 mgL Na2MoO4 H2O 009 mgL
FeSO4 7 H2O 05 06 mL FUENTE FINCK 1988 325 Disentildeo de los ensayos Este trabajo de investigacioacuten constoacute de un ensayo con dos etapas Antes que todo se realizoacute la separacioacuten y repicado in vitro de plaacutentulas de C virescens para la obtencioacuten del nuacutemero necesario de plantas En la etapa 1 se utilizaron tres tamantildeos de plaacutentulas obtenidas in vitro de 1-2cm de 2-3cm y de maacutes de 3cm de altura que se transplantaron a tres sustratos turba + perlita 11(vv) Sphagnum (100) y turba + arena 11 (vv) La turba provino de la Sociedad
22
Minera Patagonia Peat SA en Hijuelas el Sphagnum de la empresa Lonquen Chile de Puerto Montt y la perlita se obtuvo a traveacutes del sitio web wwwjardisencl (representante legal Walter Rathgeb Penza Ingeniero Agroacutenomo Santiago) Las plaacutentulas se plantaron de acuerdo a su tamantildeo las de maacutes de 3cm se colocaron de 6 por maceta las de 2 a 3cm de a 8 por maceta y las maacutes chicas de a 10 por maceta Estas macetas fueron dejadas en una sala de aclimatacioacuten con una temperatura promedio de 20ordm C intensidad lumiacutenica de 50-55 micromol m-2s-1 y 14-16 hrs de fotoperiacuteodo Se fertilizoacute asperjando cada cinco diacuteas con solucioacuten nutritiva Hoagland Esta etapa se llevoacute a cabo durante dos meses desde el cinco de septiembre hasta el cinco de noviembre de 2007
En la etapa 2 se continuoacute el proceso de aclimatacioacuten en invernadero de las plaacutentulas obtenidas en la etapa 1 que despueacutes de dos meses teniacutean un mayor tamantildeo y se habiacutean acondicionado al ambiente exterior (fuera de la caacutemara de crecimiento) Las plantas se mantuvieron en las macetas durante tres semanas para aclimatarlas y luego las plantas sobrevivientes fueron transplantadas a macetas maacutes grandes individuales durante tres meses aproximadamente hasta el cinco de marzo 2008 Estas nuevas macetas tuvieron como sustrato turba y suelo (trumao) en igual proporcioacuten (Anexo 2) La temperatura promedio de invernadero fluctuoacute de 13 a 35 degC seguacuten el mes En enero el promedio fue de 25 (Anexo 3) Para bajar la temperatura alrededor de 5deg C se instaloacute una malla Rachel 326 Disentildeo experimental El disentildeo experimental utilizado fue completamente al azar ordenado como experimento factorial con dos factores tamantildeo (3) y sustrato (3) Cada tratamiento tuvo tres repeticiones con un miacutenimo de 6 plantas por recipiente 327 Variables a evaluar Durante los dos meses en que las macetas estuvieron en la sala de aclimatacioacuten se evaluoacute el desarrollo foliar contando el nuacutemero de hojas una vez al mes Posteriormente se trasladaron las mismas macetas a invernadero durante tres semanas para continuar con la aclimatacioacuten de las plaacutentulas Transcurrido este tiempo se transplantaron las plaacutentulas sobrevivientes a macetas individuales y continuoacute mensualmente la evaluacioacuten de eacutestas (nuacutemero de hojas) hasta la obtencioacuten de plantas establecidas Al momento del transplante y al final del ensayo se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces asiacute como tambieacuten al final del ensayo de evaluoacute el crecimiento en altura (cm) La sobrevivencia fue evaluada al final del ensayo por maceta
Tanto en la sala de aclimatacioacuten coacutemo en el invernadero se registroacute la temperatura con la ayuda de un termoacutemetro de maacutexima y miacutenima (Anexo 3) 328 Anaacutelisis estadiacutestico Una vez obtenidos los datos se procedioacute a comprobar si estos cumpliacutean con los supuestos de aleatoriedad normalidad y homogeneidad de varianzas que exige este tipo de anaacutelisis En el caso de no cumplirse estos supuestos los datos se transformaron utilizando log10(x+05) raiacutez(x+05) o 1x para normalizarlos
23
y enseguida se sometioacute los datos a un anaacutelisis estadiacutestico (ANDEVA) Posteriormente en los casos en que se observoacute diferencias significativas en el ANDEVA se aplicoacute una prueba de rangos muacuteltiples (Tukey) al 5 de significancia Para las variables no parameacutetricas que no cumplieron con los supuestos para un anaacutelisis de varianza se realizoacute la prueba de KruskalndashWallis y las comparaciones muacuteltiples a traveacutes del test de Dunn con un nivel de 5 de significancia
Se utilizaron los programas estadiacutesticos STATGRAPHICS 20 y GRAPHPAD PRISM 5 para el anaacutelisis de datos
24
4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
En los siguientes puntos se discuten los resultados obtenidos en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens
En la Figura 3 se observan plaacutentulas de C virescens micropropagadas en medio MS en caacutemara de crecimiento al inicio del ensayo (A) y en invernadero despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten (B)
BA
FIGURA 3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten
A continuacioacuten se presentan los resultados obtenidos para las variables analizadas (Cuadro 2 y 3) de esta manera se pueden visualizar en general los resultados obtenidos en el proceso de aclimatacioacuten durante seis meses
CUADRO 2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de raiacuteces
inicial y final Variables
Hojas finales (nuacutemero)
Raiacuteces iniciales (nuacutemero)
Raiacuteces finales (nuacutemero)
Tamantildeo de plaacutentulas 36 24 37 47 29 46
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 61 43 76
Sustratos 53 36 56 43 29 51
Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 46 27 49
Significa que hay diferencias significativas al 95 Test de Dunn
25
Las variables no parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en hojas finales y raiacuteces iniciales en sus rangos de distribucioacuten Las raiacuteces finales no presentaron diferencias seguacuten el sustrato utilizado pero de acuerdo al tamantildeo hubo diferencias en su distribucioacuten
CUADRO 3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas
Variables Altura final de plaacutentulas
(cm) Sobrevivencia
Tamantildeo de plaacutentulas
36 c 567 b 47 b 821 a
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 59 a 908 a
Sustratos 52 a 933 a
41 ab 59 b Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 49 b 772 a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY Las variables parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en altura final de hojas y en sobrevivencia 41 Nuacutemero de hojas finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentulas y de sustratos para la variable nuacutemero final de hojas 411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula Seguacuten el Cuadro 2 y Figura 4 las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero final de hojas Las plaacutentulas pequentildeas de 1-2 cm obtuvieron el nuacutemero maacutes bajo de hojas finales con una media de 36 hojas por plaacutentula lo cual es la mitad de las hojas finales que se obtuvo con las plaacutentulas de mayor tamantildeo (61 hojas aproximado por plaacutentula) Para las plaacutentulas medianas de 2-3 cm se obtuvo una media de 47 hojas por plaacutentula (Figura 4)
26
Hojas finales
1-2 cm 2-3cm maacutes de 3 cm0
5
10
15
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn)
BLANCO (2006) sentildeala que plaacutentulas cultivadas in vitro crecen bajo condiciones especiales como alta humedad relativa y baja luminosidad ademaacutes son suplidas con sacarosa Estas condiciones fueron proporcionadas en una caacutemara de crecimiento en el laboratorio donde las plantas micropropagadas no son dependientes por completo de su fotosiacutentesis son heteroacutetrofas Parece ser necesario un estiacutemulo para convertirse en organismos totalmente capaces de sustentar sus propios requisitos de carbono y nitroacutegeno reducido pasando de esta manera a ser autoacutetrofos
Al ser sacadas de un medio in vitro las hojas no estaacuten preparadas para producir su propio alimento y sobreviven gracias a que el medio de cultivo le proporciona los nutrientes necesarios para vivir En este punto muchas de las hojas mueren y nacen hojas nuevas capaces de generar su alimento supliendo asiacute las hojas viejas (SEELYE et al 2003) En este ensayo las plaacutentulas de Chloraea virescens presentaron en general una buena adaptacioacuten al ser sacadas de un medio in vitro
Se observoacute que plaacutentulas con menor tamantildeo al ser aclimatadas y tener menor tejido fue maacutes difiacutecil y maacutes lento que empezaran a generar nuevos tejidos y materia orgaacutenica a partir de dioacutexido de carbono POSPIacuteŠILOVAacute et al (1999) sentildeala que al tener los estomas con desarrollo incompleto maacutes grandes y de forma maacutes redonda pierden maacutes agua lo cual puede provocar una peacuterdida de hojas muriendo asiacute la plaacutentula Por esta razoacuten las plaacutentulas pequentildeas se demoran maacutes tiempo en generar hojas nuevas es por ello que al finalizar este estudio muestran el menor nuacutemero final de hojas 412 Efecto del tipo de sustrato Al analizar la influencia del tipo de sustrato se encontraron diferencias significativas entre los tres sustratos utilizados Seguacuten el Cuadro 2 y la Figura 5 el sustrato donde se obtuvo mejores resultados fue
27
turba+perlita en el cual se observoacute un promedio de 53 hojas por plaacutentula siendo Sphagnum el maacutes bajo con 43 hojas por plaacutentula De acuerdo a los resultados del anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados el sustrato turba+perlita tiene mayor cantidad de nitroacutegeno foacutesforo calcio magnesio y azufre disponible comparativamente con los otros dos sustratos (Sphagnum y arena+turba) (Anexo 2)
Hojas finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
Sustratos
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) Para la brotacioacuten y el crecimiento de las plantas se necesita agua y Nitroacutegeno lo que favorece a una mayor tasa de aparicioacuten de hojas lo que se traduce en una mayor cantidad de hojas finales El Nitroacutegeno se encuentra en mayor cantidad en el sustrato turba+perlita debido a lo cual los mejores resultados se obtienen en dicho sustrato 413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Despueacutes de analizados los efectos individuales del tamantildeo y del sustrato al interactuar ambos factores existen diferencias significativas La mejor interaccioacuten se obtuvo con el sustrato turba+perlita y con el mayor tamantildeo de la plaacutentula (Figura 6) Debido a la buena estructura (porosa) de dicho sustrato se podriacutea decir que se favorecioacute la absorcioacuten radicular de nutrientes obteniendo por ello un mayor nuacutemero de hojas finales Para los menores tamantildeos no se observan diferencias significativas obteniendo como promedio 41 hojas por plaacutentula Para el mayor tamantildeo el promedio fue de 6 hojas por plaacutentula
28
Hojas finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 42 Raiacuteces iniciales Este paraacutemetro se evaluoacute luego de la primera etapa de aclimatacioacuten la cual se realizoacute en una sala de aclimatacioacuten del laboratorio Se analizoacute la influencia de diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos sobre la variable nuacutemero raiacuteces iniciales (Anaacutelisis de Kruskal-Wallis en Anexo 7)
FIGURA 7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses de pre aclimatacioacuten
29
En la Figura 7 se puede observar los resultados de pre aclimatacioacuten en sala de laboratorio En esta etapa ya es posible ver la presencia de raiacuteces desarrolladas 421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula En el Cuadro 2 se puede observar que las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero inicial de raiacuteces y en la Figura 8 se puede comprobar que para los dos tamantildeos de plaacutentula maacutes pequentildeos no se observa gran cantidad de raiacuteces esto no impidioacute el desarrollo posterior de las plaacutentulas las cuales lograron enraizar al final del estudio Esto se contrapone a lo observado en un estudio de Lapageria rosea donde la presencia de raiacutez y brote para lograr una multiplicacioacuten exitosa de plantas es de vital importancia Incluso algunas plaacutentulas de L rosea no brotan en condiciones in vitro en donde tienen las mejores condiciones nutricionales y hormonales para hacerlo Esto se debe a factores internos de la plaacutentula siendo muy difiacutecil que broten inmediatamente en caacutemara de aclimatacioacuten donde ya dejan de recibir los nutrientes necesarios de manera directa y requieren de balances de energiacutea para poder seguir elongando raiacuteces absorber nutrientes y brotar para poder obtener los carbohidratos necesarios para seguir su crecimiento (BLANCO 2006) El tamantildeo de plaacutentula tiene importancia para el desarrollo de raiacuteces se distingue notoriamente que en los tamantildeos maacutes grandes el nuacutemero de raiacuteces es mayor comparativamente con los tamantildeos pequentildeos donde el nuacutemero de raiacuteces fue escaso Debido a la presencia de maacutes hojas existe una mayor cantidad de aacuterea fotosinteacutetica esta situacioacuten estimula el crecimiento de las raiacuteces para la obtencioacuten de agua y nutrientes
Raices iniciales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
2
4
6
8
10
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o inicial de ra
iacuteces
FIGURA 8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn)
30
422 Efecto del tipo de sustrato Para el sustrato turba+perlita se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas en el nuacutemero de raiacuteces con respecto a los dos otros sustratos esto se puede ver en el Figura 9 donde se observa que se obtuvieron los mayores resultados En cualquier medio de crecimiento el espacio no ocupado por un soacutelido se llama porosidad este espacio puede ser ocupado en parte para retener agua y en parte para proporcionarle aire a las raiacuteces La ausencia de uno de estos elementos es perjudicial para las plantas La turba es conocida por tener estas propiedades y la perlita tambieacuten por esta razoacuten se sabe que la mezcla turba-perlita provee propiedades fiacutesicas excelentes como medio de crecimiento y propagacioacuten (INFOAGRO 2007) Estos resultados con turba-perlita (298 de materia orgaacutenica) coinciden con los obtenidos por DIAZ et al (2004) quienes al utilizar un sustrato compuesto por 100 de humus de lombriz para aclimatar cantildea de azuacutecar obtuvieron el mayor nuacutemero de raiacuteces Esto puede atribuirse al importante aporte de materia orgaacutenica del humus (47) lo que le confiere una mejor estructura obtenieacutendose una excelente porosidad del sustrato La aireacioacuten del suelo es necesaria para favorecer la maacutexima absorcioacuten de nutrientes por las raiacuteces Esto tambieacuten sucede en el sustrato turba+perlita el cual posee la mayor cantidad de materia orgaacutenica de los tres sustratos utilizados
Raices iniciales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
2
4
6
8
10
Sustratos
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato En los anaacutelisis para la variable nuacutemero de raiacuteces se puede decir que la mejor interaccioacuten se presentoacute para el sustrato de turba+perlita junto con el mayor tamantildeo de plaacutentulas obteniendo los valores maacutes altos entre los nueve tratamientos La presencia de raiacuteces luego de la micropropagacioacuten aumenta la posibilidad de eacutexito en el transplante ya que se crea un favorable balance de agua Pero esto no quiere
31
decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
10
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
32
En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
33
El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
34
Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
20
3 MATERIAL Y MEacuteTODO
Para la realizacioacuten de este trabajo se utilizoacute el siguiente material y meacutetodo
31 Material La investigacioacuten se realizoacute en el laboratorio e invernadero de Cultivos de Tejidos Vegetales del Instituto de Produccioacuten y Sanidad Vegetal pertenecientes a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de Chile
311 Material vegetal Se utilizaron plaacutentulas de C virescens cultivadas in vitro a partir de semillas las cuales fueron proporcionadas por el laboratorio estas plaacutentulas fueron separadas y repicadas para aumentar la poblacioacuten y obtener la cantidad necesaria para el ensayo
FIGURA 2 Plaacutentulas de C virescens en caacutemara de crecimiento in vitro
312 Materiales Los materiales que se utilizaron fueron los siguientes Equipos autoclave caacutemara de flujo laminar dispensador de medios medidor
de pH agitador magneacutetico horno microondas balanza mechero termoacutemetro Materiales vasos de precipitado matraces probetas pipetas papel de
aluminio frascos de vidrio placas Petri pinzas bisturiacute macetas regadera Soluciones soluciones madre (Medio MS) gelificante etanol 70 y 95
32 Meacutetodo A continuacioacuten se da a conocer la metodologiacutea con la cual se trabajoacute 321 Preparacioacuten del medio de cultivo Para la obtencioacuten de plantas a traveacutes de la micropropagacioacuten se ocupoacute el medio basal de MURASHIGE y SKOOG (1962) tambieacuten llamado medio MS Este medio tiene un pH de entre 56-57 Posteriormente se dosificoacute con el dispensador de medios para que cada frasco tenga una cantidad adecuada (25 mL) y se llevoacute a autoclave para esterilizar a 12 atm 120ordm C por 20 min
21
322 Obtencioacuten del material vegetal Al tener el medio esterilizado se procedioacute a la separacioacuten y repicado de plaacutentulas existentes en el laboratorio Las siembras se realizaron en el mes de mayo del 2007 Estas siembras se realizaron en la caacutemara de flujo laminar de modo de asegurar que la siembra sea 100 aseacuteptica Estas plaacutentulas fueron mantenidas en la caacutemara de incubacioacuten hasta obtener los tamantildeos requeridos para el ensayo donde las condiciones fueron las siguientes
minus Temperatura ambiental de 23-25ordm C minus Fotoperiacuteodo de 16 horas minus Intensidad lumiacutenica controlada de 50-55 micromol m-2s-1
323 Sustratos Se utilizaron tres tipos de sustratos el primero corresponde a una mezcla de turba + perlita (11) el segundo corresponde a Sphagnum (100) y el tercero corresponde a una mezcla de turba + arena (11) Una vez realizadas las mezclas se procedioacute a una esterilizacioacuten en un autoclave a 121ordm C por 20 minutos a 12 atmoacutesfera De esta forma se trabajoacute con material limpio y sano evitando ataque de hongos o bacterias El anaacutelisis quiacutemico de los sustratos se muestra en el Anexo 2 324 Plantacioacuten Las plaacutentulas con un promedio de cuatro meses en condiciones de caacutemara de crecimiento in vitro obtuvieron el tamantildeo adecuado para ser utilizadas Se sacaron de los frascos y se plantaron en las macetas de plaacutestico transparente con los sustratos Posteriormente fueron dejadas en la sala del laboratorio donde se debioacute asperjar con solucioacuten nutritiva Hoagland y fungicida Captan CUADRO 1 Composicioacuten de solucioacuten nutritiva Hoagland
KNO3 102 gL Ca(NO3) 4 H2 O 0492 gL
NH4H2 (PO4) 023 gL MgSO4 7 H2O 049 gL
H3BO3 286 mgL MnCl2 2 H2O 181 mgL CuSO4 5 H2O 008 mgL ZnSO4 5 H2O 022 mgL Na2MoO4 H2O 009 mgL
FeSO4 7 H2O 05 06 mL FUENTE FINCK 1988 325 Disentildeo de los ensayos Este trabajo de investigacioacuten constoacute de un ensayo con dos etapas Antes que todo se realizoacute la separacioacuten y repicado in vitro de plaacutentulas de C virescens para la obtencioacuten del nuacutemero necesario de plantas En la etapa 1 se utilizaron tres tamantildeos de plaacutentulas obtenidas in vitro de 1-2cm de 2-3cm y de maacutes de 3cm de altura que se transplantaron a tres sustratos turba + perlita 11(vv) Sphagnum (100) y turba + arena 11 (vv) La turba provino de la Sociedad
22
Minera Patagonia Peat SA en Hijuelas el Sphagnum de la empresa Lonquen Chile de Puerto Montt y la perlita se obtuvo a traveacutes del sitio web wwwjardisencl (representante legal Walter Rathgeb Penza Ingeniero Agroacutenomo Santiago) Las plaacutentulas se plantaron de acuerdo a su tamantildeo las de maacutes de 3cm se colocaron de 6 por maceta las de 2 a 3cm de a 8 por maceta y las maacutes chicas de a 10 por maceta Estas macetas fueron dejadas en una sala de aclimatacioacuten con una temperatura promedio de 20ordm C intensidad lumiacutenica de 50-55 micromol m-2s-1 y 14-16 hrs de fotoperiacuteodo Se fertilizoacute asperjando cada cinco diacuteas con solucioacuten nutritiva Hoagland Esta etapa se llevoacute a cabo durante dos meses desde el cinco de septiembre hasta el cinco de noviembre de 2007
En la etapa 2 se continuoacute el proceso de aclimatacioacuten en invernadero de las plaacutentulas obtenidas en la etapa 1 que despueacutes de dos meses teniacutean un mayor tamantildeo y se habiacutean acondicionado al ambiente exterior (fuera de la caacutemara de crecimiento) Las plantas se mantuvieron en las macetas durante tres semanas para aclimatarlas y luego las plantas sobrevivientes fueron transplantadas a macetas maacutes grandes individuales durante tres meses aproximadamente hasta el cinco de marzo 2008 Estas nuevas macetas tuvieron como sustrato turba y suelo (trumao) en igual proporcioacuten (Anexo 2) La temperatura promedio de invernadero fluctuoacute de 13 a 35 degC seguacuten el mes En enero el promedio fue de 25 (Anexo 3) Para bajar la temperatura alrededor de 5deg C se instaloacute una malla Rachel 326 Disentildeo experimental El disentildeo experimental utilizado fue completamente al azar ordenado como experimento factorial con dos factores tamantildeo (3) y sustrato (3) Cada tratamiento tuvo tres repeticiones con un miacutenimo de 6 plantas por recipiente 327 Variables a evaluar Durante los dos meses en que las macetas estuvieron en la sala de aclimatacioacuten se evaluoacute el desarrollo foliar contando el nuacutemero de hojas una vez al mes Posteriormente se trasladaron las mismas macetas a invernadero durante tres semanas para continuar con la aclimatacioacuten de las plaacutentulas Transcurrido este tiempo se transplantaron las plaacutentulas sobrevivientes a macetas individuales y continuoacute mensualmente la evaluacioacuten de eacutestas (nuacutemero de hojas) hasta la obtencioacuten de plantas establecidas Al momento del transplante y al final del ensayo se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces asiacute como tambieacuten al final del ensayo de evaluoacute el crecimiento en altura (cm) La sobrevivencia fue evaluada al final del ensayo por maceta
Tanto en la sala de aclimatacioacuten coacutemo en el invernadero se registroacute la temperatura con la ayuda de un termoacutemetro de maacutexima y miacutenima (Anexo 3) 328 Anaacutelisis estadiacutestico Una vez obtenidos los datos se procedioacute a comprobar si estos cumpliacutean con los supuestos de aleatoriedad normalidad y homogeneidad de varianzas que exige este tipo de anaacutelisis En el caso de no cumplirse estos supuestos los datos se transformaron utilizando log10(x+05) raiacutez(x+05) o 1x para normalizarlos
23
y enseguida se sometioacute los datos a un anaacutelisis estadiacutestico (ANDEVA) Posteriormente en los casos en que se observoacute diferencias significativas en el ANDEVA se aplicoacute una prueba de rangos muacuteltiples (Tukey) al 5 de significancia Para las variables no parameacutetricas que no cumplieron con los supuestos para un anaacutelisis de varianza se realizoacute la prueba de KruskalndashWallis y las comparaciones muacuteltiples a traveacutes del test de Dunn con un nivel de 5 de significancia
Se utilizaron los programas estadiacutesticos STATGRAPHICS 20 y GRAPHPAD PRISM 5 para el anaacutelisis de datos
24
4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
En los siguientes puntos se discuten los resultados obtenidos en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens
En la Figura 3 se observan plaacutentulas de C virescens micropropagadas en medio MS en caacutemara de crecimiento al inicio del ensayo (A) y en invernadero despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten (B)
BA
FIGURA 3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten
A continuacioacuten se presentan los resultados obtenidos para las variables analizadas (Cuadro 2 y 3) de esta manera se pueden visualizar en general los resultados obtenidos en el proceso de aclimatacioacuten durante seis meses
CUADRO 2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de raiacuteces
inicial y final Variables
Hojas finales (nuacutemero)
Raiacuteces iniciales (nuacutemero)
Raiacuteces finales (nuacutemero)
Tamantildeo de plaacutentulas 36 24 37 47 29 46
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 61 43 76
Sustratos 53 36 56 43 29 51
Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 46 27 49
Significa que hay diferencias significativas al 95 Test de Dunn
25
Las variables no parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en hojas finales y raiacuteces iniciales en sus rangos de distribucioacuten Las raiacuteces finales no presentaron diferencias seguacuten el sustrato utilizado pero de acuerdo al tamantildeo hubo diferencias en su distribucioacuten
CUADRO 3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas
Variables Altura final de plaacutentulas
(cm) Sobrevivencia
Tamantildeo de plaacutentulas
36 c 567 b 47 b 821 a
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 59 a 908 a
Sustratos 52 a 933 a
41 ab 59 b Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 49 b 772 a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY Las variables parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en altura final de hojas y en sobrevivencia 41 Nuacutemero de hojas finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentulas y de sustratos para la variable nuacutemero final de hojas 411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula Seguacuten el Cuadro 2 y Figura 4 las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero final de hojas Las plaacutentulas pequentildeas de 1-2 cm obtuvieron el nuacutemero maacutes bajo de hojas finales con una media de 36 hojas por plaacutentula lo cual es la mitad de las hojas finales que se obtuvo con las plaacutentulas de mayor tamantildeo (61 hojas aproximado por plaacutentula) Para las plaacutentulas medianas de 2-3 cm se obtuvo una media de 47 hojas por plaacutentula (Figura 4)
26
Hojas finales
1-2 cm 2-3cm maacutes de 3 cm0
5
10
15
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn)
BLANCO (2006) sentildeala que plaacutentulas cultivadas in vitro crecen bajo condiciones especiales como alta humedad relativa y baja luminosidad ademaacutes son suplidas con sacarosa Estas condiciones fueron proporcionadas en una caacutemara de crecimiento en el laboratorio donde las plantas micropropagadas no son dependientes por completo de su fotosiacutentesis son heteroacutetrofas Parece ser necesario un estiacutemulo para convertirse en organismos totalmente capaces de sustentar sus propios requisitos de carbono y nitroacutegeno reducido pasando de esta manera a ser autoacutetrofos
Al ser sacadas de un medio in vitro las hojas no estaacuten preparadas para producir su propio alimento y sobreviven gracias a que el medio de cultivo le proporciona los nutrientes necesarios para vivir En este punto muchas de las hojas mueren y nacen hojas nuevas capaces de generar su alimento supliendo asiacute las hojas viejas (SEELYE et al 2003) En este ensayo las plaacutentulas de Chloraea virescens presentaron en general una buena adaptacioacuten al ser sacadas de un medio in vitro
Se observoacute que plaacutentulas con menor tamantildeo al ser aclimatadas y tener menor tejido fue maacutes difiacutecil y maacutes lento que empezaran a generar nuevos tejidos y materia orgaacutenica a partir de dioacutexido de carbono POSPIacuteŠILOVAacute et al (1999) sentildeala que al tener los estomas con desarrollo incompleto maacutes grandes y de forma maacutes redonda pierden maacutes agua lo cual puede provocar una peacuterdida de hojas muriendo asiacute la plaacutentula Por esta razoacuten las plaacutentulas pequentildeas se demoran maacutes tiempo en generar hojas nuevas es por ello que al finalizar este estudio muestran el menor nuacutemero final de hojas 412 Efecto del tipo de sustrato Al analizar la influencia del tipo de sustrato se encontraron diferencias significativas entre los tres sustratos utilizados Seguacuten el Cuadro 2 y la Figura 5 el sustrato donde se obtuvo mejores resultados fue
27
turba+perlita en el cual se observoacute un promedio de 53 hojas por plaacutentula siendo Sphagnum el maacutes bajo con 43 hojas por plaacutentula De acuerdo a los resultados del anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados el sustrato turba+perlita tiene mayor cantidad de nitroacutegeno foacutesforo calcio magnesio y azufre disponible comparativamente con los otros dos sustratos (Sphagnum y arena+turba) (Anexo 2)
Hojas finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
Sustratos
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) Para la brotacioacuten y el crecimiento de las plantas se necesita agua y Nitroacutegeno lo que favorece a una mayor tasa de aparicioacuten de hojas lo que se traduce en una mayor cantidad de hojas finales El Nitroacutegeno se encuentra en mayor cantidad en el sustrato turba+perlita debido a lo cual los mejores resultados se obtienen en dicho sustrato 413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Despueacutes de analizados los efectos individuales del tamantildeo y del sustrato al interactuar ambos factores existen diferencias significativas La mejor interaccioacuten se obtuvo con el sustrato turba+perlita y con el mayor tamantildeo de la plaacutentula (Figura 6) Debido a la buena estructura (porosa) de dicho sustrato se podriacutea decir que se favorecioacute la absorcioacuten radicular de nutrientes obteniendo por ello un mayor nuacutemero de hojas finales Para los menores tamantildeos no se observan diferencias significativas obteniendo como promedio 41 hojas por plaacutentula Para el mayor tamantildeo el promedio fue de 6 hojas por plaacutentula
28
Hojas finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 42 Raiacuteces iniciales Este paraacutemetro se evaluoacute luego de la primera etapa de aclimatacioacuten la cual se realizoacute en una sala de aclimatacioacuten del laboratorio Se analizoacute la influencia de diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos sobre la variable nuacutemero raiacuteces iniciales (Anaacutelisis de Kruskal-Wallis en Anexo 7)
FIGURA 7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses de pre aclimatacioacuten
29
En la Figura 7 se puede observar los resultados de pre aclimatacioacuten en sala de laboratorio En esta etapa ya es posible ver la presencia de raiacuteces desarrolladas 421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula En el Cuadro 2 se puede observar que las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero inicial de raiacuteces y en la Figura 8 se puede comprobar que para los dos tamantildeos de plaacutentula maacutes pequentildeos no se observa gran cantidad de raiacuteces esto no impidioacute el desarrollo posterior de las plaacutentulas las cuales lograron enraizar al final del estudio Esto se contrapone a lo observado en un estudio de Lapageria rosea donde la presencia de raiacutez y brote para lograr una multiplicacioacuten exitosa de plantas es de vital importancia Incluso algunas plaacutentulas de L rosea no brotan en condiciones in vitro en donde tienen las mejores condiciones nutricionales y hormonales para hacerlo Esto se debe a factores internos de la plaacutentula siendo muy difiacutecil que broten inmediatamente en caacutemara de aclimatacioacuten donde ya dejan de recibir los nutrientes necesarios de manera directa y requieren de balances de energiacutea para poder seguir elongando raiacuteces absorber nutrientes y brotar para poder obtener los carbohidratos necesarios para seguir su crecimiento (BLANCO 2006) El tamantildeo de plaacutentula tiene importancia para el desarrollo de raiacuteces se distingue notoriamente que en los tamantildeos maacutes grandes el nuacutemero de raiacuteces es mayor comparativamente con los tamantildeos pequentildeos donde el nuacutemero de raiacuteces fue escaso Debido a la presencia de maacutes hojas existe una mayor cantidad de aacuterea fotosinteacutetica esta situacioacuten estimula el crecimiento de las raiacuteces para la obtencioacuten de agua y nutrientes
Raices iniciales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
2
4
6
8
10
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o inicial de ra
iacuteces
FIGURA 8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn)
30
422 Efecto del tipo de sustrato Para el sustrato turba+perlita se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas en el nuacutemero de raiacuteces con respecto a los dos otros sustratos esto se puede ver en el Figura 9 donde se observa que se obtuvieron los mayores resultados En cualquier medio de crecimiento el espacio no ocupado por un soacutelido se llama porosidad este espacio puede ser ocupado en parte para retener agua y en parte para proporcionarle aire a las raiacuteces La ausencia de uno de estos elementos es perjudicial para las plantas La turba es conocida por tener estas propiedades y la perlita tambieacuten por esta razoacuten se sabe que la mezcla turba-perlita provee propiedades fiacutesicas excelentes como medio de crecimiento y propagacioacuten (INFOAGRO 2007) Estos resultados con turba-perlita (298 de materia orgaacutenica) coinciden con los obtenidos por DIAZ et al (2004) quienes al utilizar un sustrato compuesto por 100 de humus de lombriz para aclimatar cantildea de azuacutecar obtuvieron el mayor nuacutemero de raiacuteces Esto puede atribuirse al importante aporte de materia orgaacutenica del humus (47) lo que le confiere una mejor estructura obtenieacutendose una excelente porosidad del sustrato La aireacioacuten del suelo es necesaria para favorecer la maacutexima absorcioacuten de nutrientes por las raiacuteces Esto tambieacuten sucede en el sustrato turba+perlita el cual posee la mayor cantidad de materia orgaacutenica de los tres sustratos utilizados
Raices iniciales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
2
4
6
8
10
Sustratos
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato En los anaacutelisis para la variable nuacutemero de raiacuteces se puede decir que la mejor interaccioacuten se presentoacute para el sustrato de turba+perlita junto con el mayor tamantildeo de plaacutentulas obteniendo los valores maacutes altos entre los nueve tratamientos La presencia de raiacuteces luego de la micropropagacioacuten aumenta la posibilidad de eacutexito en el transplante ya que se crea un favorable balance de agua Pero esto no quiere
31
decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
10
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
32
En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
33
El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
34
Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
21
322 Obtencioacuten del material vegetal Al tener el medio esterilizado se procedioacute a la separacioacuten y repicado de plaacutentulas existentes en el laboratorio Las siembras se realizaron en el mes de mayo del 2007 Estas siembras se realizaron en la caacutemara de flujo laminar de modo de asegurar que la siembra sea 100 aseacuteptica Estas plaacutentulas fueron mantenidas en la caacutemara de incubacioacuten hasta obtener los tamantildeos requeridos para el ensayo donde las condiciones fueron las siguientes
minus Temperatura ambiental de 23-25ordm C minus Fotoperiacuteodo de 16 horas minus Intensidad lumiacutenica controlada de 50-55 micromol m-2s-1
323 Sustratos Se utilizaron tres tipos de sustratos el primero corresponde a una mezcla de turba + perlita (11) el segundo corresponde a Sphagnum (100) y el tercero corresponde a una mezcla de turba + arena (11) Una vez realizadas las mezclas se procedioacute a una esterilizacioacuten en un autoclave a 121ordm C por 20 minutos a 12 atmoacutesfera De esta forma se trabajoacute con material limpio y sano evitando ataque de hongos o bacterias El anaacutelisis quiacutemico de los sustratos se muestra en el Anexo 2 324 Plantacioacuten Las plaacutentulas con un promedio de cuatro meses en condiciones de caacutemara de crecimiento in vitro obtuvieron el tamantildeo adecuado para ser utilizadas Se sacaron de los frascos y se plantaron en las macetas de plaacutestico transparente con los sustratos Posteriormente fueron dejadas en la sala del laboratorio donde se debioacute asperjar con solucioacuten nutritiva Hoagland y fungicida Captan CUADRO 1 Composicioacuten de solucioacuten nutritiva Hoagland
KNO3 102 gL Ca(NO3) 4 H2 O 0492 gL
NH4H2 (PO4) 023 gL MgSO4 7 H2O 049 gL
H3BO3 286 mgL MnCl2 2 H2O 181 mgL CuSO4 5 H2O 008 mgL ZnSO4 5 H2O 022 mgL Na2MoO4 H2O 009 mgL
FeSO4 7 H2O 05 06 mL FUENTE FINCK 1988 325 Disentildeo de los ensayos Este trabajo de investigacioacuten constoacute de un ensayo con dos etapas Antes que todo se realizoacute la separacioacuten y repicado in vitro de plaacutentulas de C virescens para la obtencioacuten del nuacutemero necesario de plantas En la etapa 1 se utilizaron tres tamantildeos de plaacutentulas obtenidas in vitro de 1-2cm de 2-3cm y de maacutes de 3cm de altura que se transplantaron a tres sustratos turba + perlita 11(vv) Sphagnum (100) y turba + arena 11 (vv) La turba provino de la Sociedad
22
Minera Patagonia Peat SA en Hijuelas el Sphagnum de la empresa Lonquen Chile de Puerto Montt y la perlita se obtuvo a traveacutes del sitio web wwwjardisencl (representante legal Walter Rathgeb Penza Ingeniero Agroacutenomo Santiago) Las plaacutentulas se plantaron de acuerdo a su tamantildeo las de maacutes de 3cm se colocaron de 6 por maceta las de 2 a 3cm de a 8 por maceta y las maacutes chicas de a 10 por maceta Estas macetas fueron dejadas en una sala de aclimatacioacuten con una temperatura promedio de 20ordm C intensidad lumiacutenica de 50-55 micromol m-2s-1 y 14-16 hrs de fotoperiacuteodo Se fertilizoacute asperjando cada cinco diacuteas con solucioacuten nutritiva Hoagland Esta etapa se llevoacute a cabo durante dos meses desde el cinco de septiembre hasta el cinco de noviembre de 2007
En la etapa 2 se continuoacute el proceso de aclimatacioacuten en invernadero de las plaacutentulas obtenidas en la etapa 1 que despueacutes de dos meses teniacutean un mayor tamantildeo y se habiacutean acondicionado al ambiente exterior (fuera de la caacutemara de crecimiento) Las plantas se mantuvieron en las macetas durante tres semanas para aclimatarlas y luego las plantas sobrevivientes fueron transplantadas a macetas maacutes grandes individuales durante tres meses aproximadamente hasta el cinco de marzo 2008 Estas nuevas macetas tuvieron como sustrato turba y suelo (trumao) en igual proporcioacuten (Anexo 2) La temperatura promedio de invernadero fluctuoacute de 13 a 35 degC seguacuten el mes En enero el promedio fue de 25 (Anexo 3) Para bajar la temperatura alrededor de 5deg C se instaloacute una malla Rachel 326 Disentildeo experimental El disentildeo experimental utilizado fue completamente al azar ordenado como experimento factorial con dos factores tamantildeo (3) y sustrato (3) Cada tratamiento tuvo tres repeticiones con un miacutenimo de 6 plantas por recipiente 327 Variables a evaluar Durante los dos meses en que las macetas estuvieron en la sala de aclimatacioacuten se evaluoacute el desarrollo foliar contando el nuacutemero de hojas una vez al mes Posteriormente se trasladaron las mismas macetas a invernadero durante tres semanas para continuar con la aclimatacioacuten de las plaacutentulas Transcurrido este tiempo se transplantaron las plaacutentulas sobrevivientes a macetas individuales y continuoacute mensualmente la evaluacioacuten de eacutestas (nuacutemero de hojas) hasta la obtencioacuten de plantas establecidas Al momento del transplante y al final del ensayo se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces asiacute como tambieacuten al final del ensayo de evaluoacute el crecimiento en altura (cm) La sobrevivencia fue evaluada al final del ensayo por maceta
Tanto en la sala de aclimatacioacuten coacutemo en el invernadero se registroacute la temperatura con la ayuda de un termoacutemetro de maacutexima y miacutenima (Anexo 3) 328 Anaacutelisis estadiacutestico Una vez obtenidos los datos se procedioacute a comprobar si estos cumpliacutean con los supuestos de aleatoriedad normalidad y homogeneidad de varianzas que exige este tipo de anaacutelisis En el caso de no cumplirse estos supuestos los datos se transformaron utilizando log10(x+05) raiacutez(x+05) o 1x para normalizarlos
23
y enseguida se sometioacute los datos a un anaacutelisis estadiacutestico (ANDEVA) Posteriormente en los casos en que se observoacute diferencias significativas en el ANDEVA se aplicoacute una prueba de rangos muacuteltiples (Tukey) al 5 de significancia Para las variables no parameacutetricas que no cumplieron con los supuestos para un anaacutelisis de varianza se realizoacute la prueba de KruskalndashWallis y las comparaciones muacuteltiples a traveacutes del test de Dunn con un nivel de 5 de significancia
Se utilizaron los programas estadiacutesticos STATGRAPHICS 20 y GRAPHPAD PRISM 5 para el anaacutelisis de datos
24
4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
En los siguientes puntos se discuten los resultados obtenidos en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens
En la Figura 3 se observan plaacutentulas de C virescens micropropagadas en medio MS en caacutemara de crecimiento al inicio del ensayo (A) y en invernadero despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten (B)
BA
FIGURA 3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten
A continuacioacuten se presentan los resultados obtenidos para las variables analizadas (Cuadro 2 y 3) de esta manera se pueden visualizar en general los resultados obtenidos en el proceso de aclimatacioacuten durante seis meses
CUADRO 2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de raiacuteces
inicial y final Variables
Hojas finales (nuacutemero)
Raiacuteces iniciales (nuacutemero)
Raiacuteces finales (nuacutemero)
Tamantildeo de plaacutentulas 36 24 37 47 29 46
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 61 43 76
Sustratos 53 36 56 43 29 51
Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 46 27 49
Significa que hay diferencias significativas al 95 Test de Dunn
25
Las variables no parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en hojas finales y raiacuteces iniciales en sus rangos de distribucioacuten Las raiacuteces finales no presentaron diferencias seguacuten el sustrato utilizado pero de acuerdo al tamantildeo hubo diferencias en su distribucioacuten
CUADRO 3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas
Variables Altura final de plaacutentulas
(cm) Sobrevivencia
Tamantildeo de plaacutentulas
36 c 567 b 47 b 821 a
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 59 a 908 a
Sustratos 52 a 933 a
41 ab 59 b Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 49 b 772 a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY Las variables parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en altura final de hojas y en sobrevivencia 41 Nuacutemero de hojas finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentulas y de sustratos para la variable nuacutemero final de hojas 411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula Seguacuten el Cuadro 2 y Figura 4 las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero final de hojas Las plaacutentulas pequentildeas de 1-2 cm obtuvieron el nuacutemero maacutes bajo de hojas finales con una media de 36 hojas por plaacutentula lo cual es la mitad de las hojas finales que se obtuvo con las plaacutentulas de mayor tamantildeo (61 hojas aproximado por plaacutentula) Para las plaacutentulas medianas de 2-3 cm se obtuvo una media de 47 hojas por plaacutentula (Figura 4)
26
Hojas finales
1-2 cm 2-3cm maacutes de 3 cm0
5
10
15
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn)
BLANCO (2006) sentildeala que plaacutentulas cultivadas in vitro crecen bajo condiciones especiales como alta humedad relativa y baja luminosidad ademaacutes son suplidas con sacarosa Estas condiciones fueron proporcionadas en una caacutemara de crecimiento en el laboratorio donde las plantas micropropagadas no son dependientes por completo de su fotosiacutentesis son heteroacutetrofas Parece ser necesario un estiacutemulo para convertirse en organismos totalmente capaces de sustentar sus propios requisitos de carbono y nitroacutegeno reducido pasando de esta manera a ser autoacutetrofos
Al ser sacadas de un medio in vitro las hojas no estaacuten preparadas para producir su propio alimento y sobreviven gracias a que el medio de cultivo le proporciona los nutrientes necesarios para vivir En este punto muchas de las hojas mueren y nacen hojas nuevas capaces de generar su alimento supliendo asiacute las hojas viejas (SEELYE et al 2003) En este ensayo las plaacutentulas de Chloraea virescens presentaron en general una buena adaptacioacuten al ser sacadas de un medio in vitro
Se observoacute que plaacutentulas con menor tamantildeo al ser aclimatadas y tener menor tejido fue maacutes difiacutecil y maacutes lento que empezaran a generar nuevos tejidos y materia orgaacutenica a partir de dioacutexido de carbono POSPIacuteŠILOVAacute et al (1999) sentildeala que al tener los estomas con desarrollo incompleto maacutes grandes y de forma maacutes redonda pierden maacutes agua lo cual puede provocar una peacuterdida de hojas muriendo asiacute la plaacutentula Por esta razoacuten las plaacutentulas pequentildeas se demoran maacutes tiempo en generar hojas nuevas es por ello que al finalizar este estudio muestran el menor nuacutemero final de hojas 412 Efecto del tipo de sustrato Al analizar la influencia del tipo de sustrato se encontraron diferencias significativas entre los tres sustratos utilizados Seguacuten el Cuadro 2 y la Figura 5 el sustrato donde se obtuvo mejores resultados fue
27
turba+perlita en el cual se observoacute un promedio de 53 hojas por plaacutentula siendo Sphagnum el maacutes bajo con 43 hojas por plaacutentula De acuerdo a los resultados del anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados el sustrato turba+perlita tiene mayor cantidad de nitroacutegeno foacutesforo calcio magnesio y azufre disponible comparativamente con los otros dos sustratos (Sphagnum y arena+turba) (Anexo 2)
Hojas finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
Sustratos
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) Para la brotacioacuten y el crecimiento de las plantas se necesita agua y Nitroacutegeno lo que favorece a una mayor tasa de aparicioacuten de hojas lo que se traduce en una mayor cantidad de hojas finales El Nitroacutegeno se encuentra en mayor cantidad en el sustrato turba+perlita debido a lo cual los mejores resultados se obtienen en dicho sustrato 413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Despueacutes de analizados los efectos individuales del tamantildeo y del sustrato al interactuar ambos factores existen diferencias significativas La mejor interaccioacuten se obtuvo con el sustrato turba+perlita y con el mayor tamantildeo de la plaacutentula (Figura 6) Debido a la buena estructura (porosa) de dicho sustrato se podriacutea decir que se favorecioacute la absorcioacuten radicular de nutrientes obteniendo por ello un mayor nuacutemero de hojas finales Para los menores tamantildeos no se observan diferencias significativas obteniendo como promedio 41 hojas por plaacutentula Para el mayor tamantildeo el promedio fue de 6 hojas por plaacutentula
28
Hojas finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 42 Raiacuteces iniciales Este paraacutemetro se evaluoacute luego de la primera etapa de aclimatacioacuten la cual se realizoacute en una sala de aclimatacioacuten del laboratorio Se analizoacute la influencia de diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos sobre la variable nuacutemero raiacuteces iniciales (Anaacutelisis de Kruskal-Wallis en Anexo 7)
FIGURA 7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses de pre aclimatacioacuten
29
En la Figura 7 se puede observar los resultados de pre aclimatacioacuten en sala de laboratorio En esta etapa ya es posible ver la presencia de raiacuteces desarrolladas 421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula En el Cuadro 2 se puede observar que las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero inicial de raiacuteces y en la Figura 8 se puede comprobar que para los dos tamantildeos de plaacutentula maacutes pequentildeos no se observa gran cantidad de raiacuteces esto no impidioacute el desarrollo posterior de las plaacutentulas las cuales lograron enraizar al final del estudio Esto se contrapone a lo observado en un estudio de Lapageria rosea donde la presencia de raiacutez y brote para lograr una multiplicacioacuten exitosa de plantas es de vital importancia Incluso algunas plaacutentulas de L rosea no brotan en condiciones in vitro en donde tienen las mejores condiciones nutricionales y hormonales para hacerlo Esto se debe a factores internos de la plaacutentula siendo muy difiacutecil que broten inmediatamente en caacutemara de aclimatacioacuten donde ya dejan de recibir los nutrientes necesarios de manera directa y requieren de balances de energiacutea para poder seguir elongando raiacuteces absorber nutrientes y brotar para poder obtener los carbohidratos necesarios para seguir su crecimiento (BLANCO 2006) El tamantildeo de plaacutentula tiene importancia para el desarrollo de raiacuteces se distingue notoriamente que en los tamantildeos maacutes grandes el nuacutemero de raiacuteces es mayor comparativamente con los tamantildeos pequentildeos donde el nuacutemero de raiacuteces fue escaso Debido a la presencia de maacutes hojas existe una mayor cantidad de aacuterea fotosinteacutetica esta situacioacuten estimula el crecimiento de las raiacuteces para la obtencioacuten de agua y nutrientes
Raices iniciales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
2
4
6
8
10
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o inicial de ra
iacuteces
FIGURA 8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn)
30
422 Efecto del tipo de sustrato Para el sustrato turba+perlita se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas en el nuacutemero de raiacuteces con respecto a los dos otros sustratos esto se puede ver en el Figura 9 donde se observa que se obtuvieron los mayores resultados En cualquier medio de crecimiento el espacio no ocupado por un soacutelido se llama porosidad este espacio puede ser ocupado en parte para retener agua y en parte para proporcionarle aire a las raiacuteces La ausencia de uno de estos elementos es perjudicial para las plantas La turba es conocida por tener estas propiedades y la perlita tambieacuten por esta razoacuten se sabe que la mezcla turba-perlita provee propiedades fiacutesicas excelentes como medio de crecimiento y propagacioacuten (INFOAGRO 2007) Estos resultados con turba-perlita (298 de materia orgaacutenica) coinciden con los obtenidos por DIAZ et al (2004) quienes al utilizar un sustrato compuesto por 100 de humus de lombriz para aclimatar cantildea de azuacutecar obtuvieron el mayor nuacutemero de raiacuteces Esto puede atribuirse al importante aporte de materia orgaacutenica del humus (47) lo que le confiere una mejor estructura obtenieacutendose una excelente porosidad del sustrato La aireacioacuten del suelo es necesaria para favorecer la maacutexima absorcioacuten de nutrientes por las raiacuteces Esto tambieacuten sucede en el sustrato turba+perlita el cual posee la mayor cantidad de materia orgaacutenica de los tres sustratos utilizados
Raices iniciales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
2
4
6
8
10
Sustratos
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato En los anaacutelisis para la variable nuacutemero de raiacuteces se puede decir que la mejor interaccioacuten se presentoacute para el sustrato de turba+perlita junto con el mayor tamantildeo de plaacutentulas obteniendo los valores maacutes altos entre los nueve tratamientos La presencia de raiacuteces luego de la micropropagacioacuten aumenta la posibilidad de eacutexito en el transplante ya que se crea un favorable balance de agua Pero esto no quiere
31
decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
10
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
32
En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
33
El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
34
Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
22
Minera Patagonia Peat SA en Hijuelas el Sphagnum de la empresa Lonquen Chile de Puerto Montt y la perlita se obtuvo a traveacutes del sitio web wwwjardisencl (representante legal Walter Rathgeb Penza Ingeniero Agroacutenomo Santiago) Las plaacutentulas se plantaron de acuerdo a su tamantildeo las de maacutes de 3cm se colocaron de 6 por maceta las de 2 a 3cm de a 8 por maceta y las maacutes chicas de a 10 por maceta Estas macetas fueron dejadas en una sala de aclimatacioacuten con una temperatura promedio de 20ordm C intensidad lumiacutenica de 50-55 micromol m-2s-1 y 14-16 hrs de fotoperiacuteodo Se fertilizoacute asperjando cada cinco diacuteas con solucioacuten nutritiva Hoagland Esta etapa se llevoacute a cabo durante dos meses desde el cinco de septiembre hasta el cinco de noviembre de 2007
En la etapa 2 se continuoacute el proceso de aclimatacioacuten en invernadero de las plaacutentulas obtenidas en la etapa 1 que despueacutes de dos meses teniacutean un mayor tamantildeo y se habiacutean acondicionado al ambiente exterior (fuera de la caacutemara de crecimiento) Las plantas se mantuvieron en las macetas durante tres semanas para aclimatarlas y luego las plantas sobrevivientes fueron transplantadas a macetas maacutes grandes individuales durante tres meses aproximadamente hasta el cinco de marzo 2008 Estas nuevas macetas tuvieron como sustrato turba y suelo (trumao) en igual proporcioacuten (Anexo 2) La temperatura promedio de invernadero fluctuoacute de 13 a 35 degC seguacuten el mes En enero el promedio fue de 25 (Anexo 3) Para bajar la temperatura alrededor de 5deg C se instaloacute una malla Rachel 326 Disentildeo experimental El disentildeo experimental utilizado fue completamente al azar ordenado como experimento factorial con dos factores tamantildeo (3) y sustrato (3) Cada tratamiento tuvo tres repeticiones con un miacutenimo de 6 plantas por recipiente 327 Variables a evaluar Durante los dos meses en que las macetas estuvieron en la sala de aclimatacioacuten se evaluoacute el desarrollo foliar contando el nuacutemero de hojas una vez al mes Posteriormente se trasladaron las mismas macetas a invernadero durante tres semanas para continuar con la aclimatacioacuten de las plaacutentulas Transcurrido este tiempo se transplantaron las plaacutentulas sobrevivientes a macetas individuales y continuoacute mensualmente la evaluacioacuten de eacutestas (nuacutemero de hojas) hasta la obtencioacuten de plantas establecidas Al momento del transplante y al final del ensayo se evaluoacute el nuacutemero de raiacuteces asiacute como tambieacuten al final del ensayo de evaluoacute el crecimiento en altura (cm) La sobrevivencia fue evaluada al final del ensayo por maceta
Tanto en la sala de aclimatacioacuten coacutemo en el invernadero se registroacute la temperatura con la ayuda de un termoacutemetro de maacutexima y miacutenima (Anexo 3) 328 Anaacutelisis estadiacutestico Una vez obtenidos los datos se procedioacute a comprobar si estos cumpliacutean con los supuestos de aleatoriedad normalidad y homogeneidad de varianzas que exige este tipo de anaacutelisis En el caso de no cumplirse estos supuestos los datos se transformaron utilizando log10(x+05) raiacutez(x+05) o 1x para normalizarlos
23
y enseguida se sometioacute los datos a un anaacutelisis estadiacutestico (ANDEVA) Posteriormente en los casos en que se observoacute diferencias significativas en el ANDEVA se aplicoacute una prueba de rangos muacuteltiples (Tukey) al 5 de significancia Para las variables no parameacutetricas que no cumplieron con los supuestos para un anaacutelisis de varianza se realizoacute la prueba de KruskalndashWallis y las comparaciones muacuteltiples a traveacutes del test de Dunn con un nivel de 5 de significancia
Se utilizaron los programas estadiacutesticos STATGRAPHICS 20 y GRAPHPAD PRISM 5 para el anaacutelisis de datos
24
4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
En los siguientes puntos se discuten los resultados obtenidos en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens
En la Figura 3 se observan plaacutentulas de C virescens micropropagadas en medio MS en caacutemara de crecimiento al inicio del ensayo (A) y en invernadero despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten (B)
BA
FIGURA 3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten
A continuacioacuten se presentan los resultados obtenidos para las variables analizadas (Cuadro 2 y 3) de esta manera se pueden visualizar en general los resultados obtenidos en el proceso de aclimatacioacuten durante seis meses
CUADRO 2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de raiacuteces
inicial y final Variables
Hojas finales (nuacutemero)
Raiacuteces iniciales (nuacutemero)
Raiacuteces finales (nuacutemero)
Tamantildeo de plaacutentulas 36 24 37 47 29 46
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 61 43 76
Sustratos 53 36 56 43 29 51
Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 46 27 49
Significa que hay diferencias significativas al 95 Test de Dunn
25
Las variables no parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en hojas finales y raiacuteces iniciales en sus rangos de distribucioacuten Las raiacuteces finales no presentaron diferencias seguacuten el sustrato utilizado pero de acuerdo al tamantildeo hubo diferencias en su distribucioacuten
CUADRO 3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas
Variables Altura final de plaacutentulas
(cm) Sobrevivencia
Tamantildeo de plaacutentulas
36 c 567 b 47 b 821 a
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 59 a 908 a
Sustratos 52 a 933 a
41 ab 59 b Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 49 b 772 a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY Las variables parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en altura final de hojas y en sobrevivencia 41 Nuacutemero de hojas finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentulas y de sustratos para la variable nuacutemero final de hojas 411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula Seguacuten el Cuadro 2 y Figura 4 las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero final de hojas Las plaacutentulas pequentildeas de 1-2 cm obtuvieron el nuacutemero maacutes bajo de hojas finales con una media de 36 hojas por plaacutentula lo cual es la mitad de las hojas finales que se obtuvo con las plaacutentulas de mayor tamantildeo (61 hojas aproximado por plaacutentula) Para las plaacutentulas medianas de 2-3 cm se obtuvo una media de 47 hojas por plaacutentula (Figura 4)
26
Hojas finales
1-2 cm 2-3cm maacutes de 3 cm0
5
10
15
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn)
BLANCO (2006) sentildeala que plaacutentulas cultivadas in vitro crecen bajo condiciones especiales como alta humedad relativa y baja luminosidad ademaacutes son suplidas con sacarosa Estas condiciones fueron proporcionadas en una caacutemara de crecimiento en el laboratorio donde las plantas micropropagadas no son dependientes por completo de su fotosiacutentesis son heteroacutetrofas Parece ser necesario un estiacutemulo para convertirse en organismos totalmente capaces de sustentar sus propios requisitos de carbono y nitroacutegeno reducido pasando de esta manera a ser autoacutetrofos
Al ser sacadas de un medio in vitro las hojas no estaacuten preparadas para producir su propio alimento y sobreviven gracias a que el medio de cultivo le proporciona los nutrientes necesarios para vivir En este punto muchas de las hojas mueren y nacen hojas nuevas capaces de generar su alimento supliendo asiacute las hojas viejas (SEELYE et al 2003) En este ensayo las plaacutentulas de Chloraea virescens presentaron en general una buena adaptacioacuten al ser sacadas de un medio in vitro
Se observoacute que plaacutentulas con menor tamantildeo al ser aclimatadas y tener menor tejido fue maacutes difiacutecil y maacutes lento que empezaran a generar nuevos tejidos y materia orgaacutenica a partir de dioacutexido de carbono POSPIacuteŠILOVAacute et al (1999) sentildeala que al tener los estomas con desarrollo incompleto maacutes grandes y de forma maacutes redonda pierden maacutes agua lo cual puede provocar una peacuterdida de hojas muriendo asiacute la plaacutentula Por esta razoacuten las plaacutentulas pequentildeas se demoran maacutes tiempo en generar hojas nuevas es por ello que al finalizar este estudio muestran el menor nuacutemero final de hojas 412 Efecto del tipo de sustrato Al analizar la influencia del tipo de sustrato se encontraron diferencias significativas entre los tres sustratos utilizados Seguacuten el Cuadro 2 y la Figura 5 el sustrato donde se obtuvo mejores resultados fue
27
turba+perlita en el cual se observoacute un promedio de 53 hojas por plaacutentula siendo Sphagnum el maacutes bajo con 43 hojas por plaacutentula De acuerdo a los resultados del anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados el sustrato turba+perlita tiene mayor cantidad de nitroacutegeno foacutesforo calcio magnesio y azufre disponible comparativamente con los otros dos sustratos (Sphagnum y arena+turba) (Anexo 2)
Hojas finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
Sustratos
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) Para la brotacioacuten y el crecimiento de las plantas se necesita agua y Nitroacutegeno lo que favorece a una mayor tasa de aparicioacuten de hojas lo que se traduce en una mayor cantidad de hojas finales El Nitroacutegeno se encuentra en mayor cantidad en el sustrato turba+perlita debido a lo cual los mejores resultados se obtienen en dicho sustrato 413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Despueacutes de analizados los efectos individuales del tamantildeo y del sustrato al interactuar ambos factores existen diferencias significativas La mejor interaccioacuten se obtuvo con el sustrato turba+perlita y con el mayor tamantildeo de la plaacutentula (Figura 6) Debido a la buena estructura (porosa) de dicho sustrato se podriacutea decir que se favorecioacute la absorcioacuten radicular de nutrientes obteniendo por ello un mayor nuacutemero de hojas finales Para los menores tamantildeos no se observan diferencias significativas obteniendo como promedio 41 hojas por plaacutentula Para el mayor tamantildeo el promedio fue de 6 hojas por plaacutentula
28
Hojas finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 42 Raiacuteces iniciales Este paraacutemetro se evaluoacute luego de la primera etapa de aclimatacioacuten la cual se realizoacute en una sala de aclimatacioacuten del laboratorio Se analizoacute la influencia de diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos sobre la variable nuacutemero raiacuteces iniciales (Anaacutelisis de Kruskal-Wallis en Anexo 7)
FIGURA 7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses de pre aclimatacioacuten
29
En la Figura 7 se puede observar los resultados de pre aclimatacioacuten en sala de laboratorio En esta etapa ya es posible ver la presencia de raiacuteces desarrolladas 421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula En el Cuadro 2 se puede observar que las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero inicial de raiacuteces y en la Figura 8 se puede comprobar que para los dos tamantildeos de plaacutentula maacutes pequentildeos no se observa gran cantidad de raiacuteces esto no impidioacute el desarrollo posterior de las plaacutentulas las cuales lograron enraizar al final del estudio Esto se contrapone a lo observado en un estudio de Lapageria rosea donde la presencia de raiacutez y brote para lograr una multiplicacioacuten exitosa de plantas es de vital importancia Incluso algunas plaacutentulas de L rosea no brotan en condiciones in vitro en donde tienen las mejores condiciones nutricionales y hormonales para hacerlo Esto se debe a factores internos de la plaacutentula siendo muy difiacutecil que broten inmediatamente en caacutemara de aclimatacioacuten donde ya dejan de recibir los nutrientes necesarios de manera directa y requieren de balances de energiacutea para poder seguir elongando raiacuteces absorber nutrientes y brotar para poder obtener los carbohidratos necesarios para seguir su crecimiento (BLANCO 2006) El tamantildeo de plaacutentula tiene importancia para el desarrollo de raiacuteces se distingue notoriamente que en los tamantildeos maacutes grandes el nuacutemero de raiacuteces es mayor comparativamente con los tamantildeos pequentildeos donde el nuacutemero de raiacuteces fue escaso Debido a la presencia de maacutes hojas existe una mayor cantidad de aacuterea fotosinteacutetica esta situacioacuten estimula el crecimiento de las raiacuteces para la obtencioacuten de agua y nutrientes
Raices iniciales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
2
4
6
8
10
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o inicial de ra
iacuteces
FIGURA 8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn)
30
422 Efecto del tipo de sustrato Para el sustrato turba+perlita se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas en el nuacutemero de raiacuteces con respecto a los dos otros sustratos esto se puede ver en el Figura 9 donde se observa que se obtuvieron los mayores resultados En cualquier medio de crecimiento el espacio no ocupado por un soacutelido se llama porosidad este espacio puede ser ocupado en parte para retener agua y en parte para proporcionarle aire a las raiacuteces La ausencia de uno de estos elementos es perjudicial para las plantas La turba es conocida por tener estas propiedades y la perlita tambieacuten por esta razoacuten se sabe que la mezcla turba-perlita provee propiedades fiacutesicas excelentes como medio de crecimiento y propagacioacuten (INFOAGRO 2007) Estos resultados con turba-perlita (298 de materia orgaacutenica) coinciden con los obtenidos por DIAZ et al (2004) quienes al utilizar un sustrato compuesto por 100 de humus de lombriz para aclimatar cantildea de azuacutecar obtuvieron el mayor nuacutemero de raiacuteces Esto puede atribuirse al importante aporte de materia orgaacutenica del humus (47) lo que le confiere una mejor estructura obtenieacutendose una excelente porosidad del sustrato La aireacioacuten del suelo es necesaria para favorecer la maacutexima absorcioacuten de nutrientes por las raiacuteces Esto tambieacuten sucede en el sustrato turba+perlita el cual posee la mayor cantidad de materia orgaacutenica de los tres sustratos utilizados
Raices iniciales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
2
4
6
8
10
Sustratos
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato En los anaacutelisis para la variable nuacutemero de raiacuteces se puede decir que la mejor interaccioacuten se presentoacute para el sustrato de turba+perlita junto con el mayor tamantildeo de plaacutentulas obteniendo los valores maacutes altos entre los nueve tratamientos La presencia de raiacuteces luego de la micropropagacioacuten aumenta la posibilidad de eacutexito en el transplante ya que se crea un favorable balance de agua Pero esto no quiere
31
decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
10
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
32
En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
33
El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
34
Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
23
y enseguida se sometioacute los datos a un anaacutelisis estadiacutestico (ANDEVA) Posteriormente en los casos en que se observoacute diferencias significativas en el ANDEVA se aplicoacute una prueba de rangos muacuteltiples (Tukey) al 5 de significancia Para las variables no parameacutetricas que no cumplieron con los supuestos para un anaacutelisis de varianza se realizoacute la prueba de KruskalndashWallis y las comparaciones muacuteltiples a traveacutes del test de Dunn con un nivel de 5 de significancia
Se utilizaron los programas estadiacutesticos STATGRAPHICS 20 y GRAPHPAD PRISM 5 para el anaacutelisis de datos
24
4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
En los siguientes puntos se discuten los resultados obtenidos en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens
En la Figura 3 se observan plaacutentulas de C virescens micropropagadas en medio MS en caacutemara de crecimiento al inicio del ensayo (A) y en invernadero despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten (B)
BA
FIGURA 3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten
A continuacioacuten se presentan los resultados obtenidos para las variables analizadas (Cuadro 2 y 3) de esta manera se pueden visualizar en general los resultados obtenidos en el proceso de aclimatacioacuten durante seis meses
CUADRO 2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de raiacuteces
inicial y final Variables
Hojas finales (nuacutemero)
Raiacuteces iniciales (nuacutemero)
Raiacuteces finales (nuacutemero)
Tamantildeo de plaacutentulas 36 24 37 47 29 46
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 61 43 76
Sustratos 53 36 56 43 29 51
Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 46 27 49
Significa que hay diferencias significativas al 95 Test de Dunn
25
Las variables no parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en hojas finales y raiacuteces iniciales en sus rangos de distribucioacuten Las raiacuteces finales no presentaron diferencias seguacuten el sustrato utilizado pero de acuerdo al tamantildeo hubo diferencias en su distribucioacuten
CUADRO 3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas
Variables Altura final de plaacutentulas
(cm) Sobrevivencia
Tamantildeo de plaacutentulas
36 c 567 b 47 b 821 a
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 59 a 908 a
Sustratos 52 a 933 a
41 ab 59 b Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 49 b 772 a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY Las variables parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en altura final de hojas y en sobrevivencia 41 Nuacutemero de hojas finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentulas y de sustratos para la variable nuacutemero final de hojas 411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula Seguacuten el Cuadro 2 y Figura 4 las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero final de hojas Las plaacutentulas pequentildeas de 1-2 cm obtuvieron el nuacutemero maacutes bajo de hojas finales con una media de 36 hojas por plaacutentula lo cual es la mitad de las hojas finales que se obtuvo con las plaacutentulas de mayor tamantildeo (61 hojas aproximado por plaacutentula) Para las plaacutentulas medianas de 2-3 cm se obtuvo una media de 47 hojas por plaacutentula (Figura 4)
26
Hojas finales
1-2 cm 2-3cm maacutes de 3 cm0
5
10
15
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn)
BLANCO (2006) sentildeala que plaacutentulas cultivadas in vitro crecen bajo condiciones especiales como alta humedad relativa y baja luminosidad ademaacutes son suplidas con sacarosa Estas condiciones fueron proporcionadas en una caacutemara de crecimiento en el laboratorio donde las plantas micropropagadas no son dependientes por completo de su fotosiacutentesis son heteroacutetrofas Parece ser necesario un estiacutemulo para convertirse en organismos totalmente capaces de sustentar sus propios requisitos de carbono y nitroacutegeno reducido pasando de esta manera a ser autoacutetrofos
Al ser sacadas de un medio in vitro las hojas no estaacuten preparadas para producir su propio alimento y sobreviven gracias a que el medio de cultivo le proporciona los nutrientes necesarios para vivir En este punto muchas de las hojas mueren y nacen hojas nuevas capaces de generar su alimento supliendo asiacute las hojas viejas (SEELYE et al 2003) En este ensayo las plaacutentulas de Chloraea virescens presentaron en general una buena adaptacioacuten al ser sacadas de un medio in vitro
Se observoacute que plaacutentulas con menor tamantildeo al ser aclimatadas y tener menor tejido fue maacutes difiacutecil y maacutes lento que empezaran a generar nuevos tejidos y materia orgaacutenica a partir de dioacutexido de carbono POSPIacuteŠILOVAacute et al (1999) sentildeala que al tener los estomas con desarrollo incompleto maacutes grandes y de forma maacutes redonda pierden maacutes agua lo cual puede provocar una peacuterdida de hojas muriendo asiacute la plaacutentula Por esta razoacuten las plaacutentulas pequentildeas se demoran maacutes tiempo en generar hojas nuevas es por ello que al finalizar este estudio muestran el menor nuacutemero final de hojas 412 Efecto del tipo de sustrato Al analizar la influencia del tipo de sustrato se encontraron diferencias significativas entre los tres sustratos utilizados Seguacuten el Cuadro 2 y la Figura 5 el sustrato donde se obtuvo mejores resultados fue
27
turba+perlita en el cual se observoacute un promedio de 53 hojas por plaacutentula siendo Sphagnum el maacutes bajo con 43 hojas por plaacutentula De acuerdo a los resultados del anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados el sustrato turba+perlita tiene mayor cantidad de nitroacutegeno foacutesforo calcio magnesio y azufre disponible comparativamente con los otros dos sustratos (Sphagnum y arena+turba) (Anexo 2)
Hojas finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
Sustratos
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) Para la brotacioacuten y el crecimiento de las plantas se necesita agua y Nitroacutegeno lo que favorece a una mayor tasa de aparicioacuten de hojas lo que se traduce en una mayor cantidad de hojas finales El Nitroacutegeno se encuentra en mayor cantidad en el sustrato turba+perlita debido a lo cual los mejores resultados se obtienen en dicho sustrato 413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Despueacutes de analizados los efectos individuales del tamantildeo y del sustrato al interactuar ambos factores existen diferencias significativas La mejor interaccioacuten se obtuvo con el sustrato turba+perlita y con el mayor tamantildeo de la plaacutentula (Figura 6) Debido a la buena estructura (porosa) de dicho sustrato se podriacutea decir que se favorecioacute la absorcioacuten radicular de nutrientes obteniendo por ello un mayor nuacutemero de hojas finales Para los menores tamantildeos no se observan diferencias significativas obteniendo como promedio 41 hojas por plaacutentula Para el mayor tamantildeo el promedio fue de 6 hojas por plaacutentula
28
Hojas finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 42 Raiacuteces iniciales Este paraacutemetro se evaluoacute luego de la primera etapa de aclimatacioacuten la cual se realizoacute en una sala de aclimatacioacuten del laboratorio Se analizoacute la influencia de diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos sobre la variable nuacutemero raiacuteces iniciales (Anaacutelisis de Kruskal-Wallis en Anexo 7)
FIGURA 7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses de pre aclimatacioacuten
29
En la Figura 7 se puede observar los resultados de pre aclimatacioacuten en sala de laboratorio En esta etapa ya es posible ver la presencia de raiacuteces desarrolladas 421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula En el Cuadro 2 se puede observar que las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero inicial de raiacuteces y en la Figura 8 se puede comprobar que para los dos tamantildeos de plaacutentula maacutes pequentildeos no se observa gran cantidad de raiacuteces esto no impidioacute el desarrollo posterior de las plaacutentulas las cuales lograron enraizar al final del estudio Esto se contrapone a lo observado en un estudio de Lapageria rosea donde la presencia de raiacutez y brote para lograr una multiplicacioacuten exitosa de plantas es de vital importancia Incluso algunas plaacutentulas de L rosea no brotan en condiciones in vitro en donde tienen las mejores condiciones nutricionales y hormonales para hacerlo Esto se debe a factores internos de la plaacutentula siendo muy difiacutecil que broten inmediatamente en caacutemara de aclimatacioacuten donde ya dejan de recibir los nutrientes necesarios de manera directa y requieren de balances de energiacutea para poder seguir elongando raiacuteces absorber nutrientes y brotar para poder obtener los carbohidratos necesarios para seguir su crecimiento (BLANCO 2006) El tamantildeo de plaacutentula tiene importancia para el desarrollo de raiacuteces se distingue notoriamente que en los tamantildeos maacutes grandes el nuacutemero de raiacuteces es mayor comparativamente con los tamantildeos pequentildeos donde el nuacutemero de raiacuteces fue escaso Debido a la presencia de maacutes hojas existe una mayor cantidad de aacuterea fotosinteacutetica esta situacioacuten estimula el crecimiento de las raiacuteces para la obtencioacuten de agua y nutrientes
Raices iniciales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
2
4
6
8
10
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o inicial de ra
iacuteces
FIGURA 8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn)
30
422 Efecto del tipo de sustrato Para el sustrato turba+perlita se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas en el nuacutemero de raiacuteces con respecto a los dos otros sustratos esto se puede ver en el Figura 9 donde se observa que se obtuvieron los mayores resultados En cualquier medio de crecimiento el espacio no ocupado por un soacutelido se llama porosidad este espacio puede ser ocupado en parte para retener agua y en parte para proporcionarle aire a las raiacuteces La ausencia de uno de estos elementos es perjudicial para las plantas La turba es conocida por tener estas propiedades y la perlita tambieacuten por esta razoacuten se sabe que la mezcla turba-perlita provee propiedades fiacutesicas excelentes como medio de crecimiento y propagacioacuten (INFOAGRO 2007) Estos resultados con turba-perlita (298 de materia orgaacutenica) coinciden con los obtenidos por DIAZ et al (2004) quienes al utilizar un sustrato compuesto por 100 de humus de lombriz para aclimatar cantildea de azuacutecar obtuvieron el mayor nuacutemero de raiacuteces Esto puede atribuirse al importante aporte de materia orgaacutenica del humus (47) lo que le confiere una mejor estructura obtenieacutendose una excelente porosidad del sustrato La aireacioacuten del suelo es necesaria para favorecer la maacutexima absorcioacuten de nutrientes por las raiacuteces Esto tambieacuten sucede en el sustrato turba+perlita el cual posee la mayor cantidad de materia orgaacutenica de los tres sustratos utilizados
Raices iniciales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
2
4
6
8
10
Sustratos
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato En los anaacutelisis para la variable nuacutemero de raiacuteces se puede decir que la mejor interaccioacuten se presentoacute para el sustrato de turba+perlita junto con el mayor tamantildeo de plaacutentulas obteniendo los valores maacutes altos entre los nueve tratamientos La presencia de raiacuteces luego de la micropropagacioacuten aumenta la posibilidad de eacutexito en el transplante ya que se crea un favorable balance de agua Pero esto no quiere
31
decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
10
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
32
En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
33
El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
34
Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
24
4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
En los siguientes puntos se discuten los resultados obtenidos en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens
En la Figura 3 se observan plaacutentulas de C virescens micropropagadas en medio MS en caacutemara de crecimiento al inicio del ensayo (A) y en invernadero despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten (B)
BA
FIGURA 3 A Plaacutentulas micropropagadas de Chloraea virescens en medio MS B Plaacutentulas despueacutes de 180 diacuteas de aclimatacioacuten
A continuacioacuten se presentan los resultados obtenidos para las variables analizadas (Cuadro 2 y 3) de esta manera se pueden visualizar en general los resultados obtenidos en el proceso de aclimatacioacuten durante seis meses
CUADRO 2 Variables no parameacutetricas nuacutemero final de hojas nuacutemero de raiacuteces
inicial y final Variables
Hojas finales (nuacutemero)
Raiacuteces iniciales (nuacutemero)
Raiacuteces finales (nuacutemero)
Tamantildeo de plaacutentulas 36 24 37 47 29 46
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 61 43 76
Sustratos 53 36 56 43 29 51
Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 46 27 49
Significa que hay diferencias significativas al 95 Test de Dunn
25
Las variables no parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en hojas finales y raiacuteces iniciales en sus rangos de distribucioacuten Las raiacuteces finales no presentaron diferencias seguacuten el sustrato utilizado pero de acuerdo al tamantildeo hubo diferencias en su distribucioacuten
CUADRO 3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas
Variables Altura final de plaacutentulas
(cm) Sobrevivencia
Tamantildeo de plaacutentulas
36 c 567 b 47 b 821 a
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 59 a 908 a
Sustratos 52 a 933 a
41 ab 59 b Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 49 b 772 a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY Las variables parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en altura final de hojas y en sobrevivencia 41 Nuacutemero de hojas finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentulas y de sustratos para la variable nuacutemero final de hojas 411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula Seguacuten el Cuadro 2 y Figura 4 las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero final de hojas Las plaacutentulas pequentildeas de 1-2 cm obtuvieron el nuacutemero maacutes bajo de hojas finales con una media de 36 hojas por plaacutentula lo cual es la mitad de las hojas finales que se obtuvo con las plaacutentulas de mayor tamantildeo (61 hojas aproximado por plaacutentula) Para las plaacutentulas medianas de 2-3 cm se obtuvo una media de 47 hojas por plaacutentula (Figura 4)
26
Hojas finales
1-2 cm 2-3cm maacutes de 3 cm0
5
10
15
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn)
BLANCO (2006) sentildeala que plaacutentulas cultivadas in vitro crecen bajo condiciones especiales como alta humedad relativa y baja luminosidad ademaacutes son suplidas con sacarosa Estas condiciones fueron proporcionadas en una caacutemara de crecimiento en el laboratorio donde las plantas micropropagadas no son dependientes por completo de su fotosiacutentesis son heteroacutetrofas Parece ser necesario un estiacutemulo para convertirse en organismos totalmente capaces de sustentar sus propios requisitos de carbono y nitroacutegeno reducido pasando de esta manera a ser autoacutetrofos
Al ser sacadas de un medio in vitro las hojas no estaacuten preparadas para producir su propio alimento y sobreviven gracias a que el medio de cultivo le proporciona los nutrientes necesarios para vivir En este punto muchas de las hojas mueren y nacen hojas nuevas capaces de generar su alimento supliendo asiacute las hojas viejas (SEELYE et al 2003) En este ensayo las plaacutentulas de Chloraea virescens presentaron en general una buena adaptacioacuten al ser sacadas de un medio in vitro
Se observoacute que plaacutentulas con menor tamantildeo al ser aclimatadas y tener menor tejido fue maacutes difiacutecil y maacutes lento que empezaran a generar nuevos tejidos y materia orgaacutenica a partir de dioacutexido de carbono POSPIacuteŠILOVAacute et al (1999) sentildeala que al tener los estomas con desarrollo incompleto maacutes grandes y de forma maacutes redonda pierden maacutes agua lo cual puede provocar una peacuterdida de hojas muriendo asiacute la plaacutentula Por esta razoacuten las plaacutentulas pequentildeas se demoran maacutes tiempo en generar hojas nuevas es por ello que al finalizar este estudio muestran el menor nuacutemero final de hojas 412 Efecto del tipo de sustrato Al analizar la influencia del tipo de sustrato se encontraron diferencias significativas entre los tres sustratos utilizados Seguacuten el Cuadro 2 y la Figura 5 el sustrato donde se obtuvo mejores resultados fue
27
turba+perlita en el cual se observoacute un promedio de 53 hojas por plaacutentula siendo Sphagnum el maacutes bajo con 43 hojas por plaacutentula De acuerdo a los resultados del anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados el sustrato turba+perlita tiene mayor cantidad de nitroacutegeno foacutesforo calcio magnesio y azufre disponible comparativamente con los otros dos sustratos (Sphagnum y arena+turba) (Anexo 2)
Hojas finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
Sustratos
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) Para la brotacioacuten y el crecimiento de las plantas se necesita agua y Nitroacutegeno lo que favorece a una mayor tasa de aparicioacuten de hojas lo que se traduce en una mayor cantidad de hojas finales El Nitroacutegeno se encuentra en mayor cantidad en el sustrato turba+perlita debido a lo cual los mejores resultados se obtienen en dicho sustrato 413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Despueacutes de analizados los efectos individuales del tamantildeo y del sustrato al interactuar ambos factores existen diferencias significativas La mejor interaccioacuten se obtuvo con el sustrato turba+perlita y con el mayor tamantildeo de la plaacutentula (Figura 6) Debido a la buena estructura (porosa) de dicho sustrato se podriacutea decir que se favorecioacute la absorcioacuten radicular de nutrientes obteniendo por ello un mayor nuacutemero de hojas finales Para los menores tamantildeos no se observan diferencias significativas obteniendo como promedio 41 hojas por plaacutentula Para el mayor tamantildeo el promedio fue de 6 hojas por plaacutentula
28
Hojas finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 42 Raiacuteces iniciales Este paraacutemetro se evaluoacute luego de la primera etapa de aclimatacioacuten la cual se realizoacute en una sala de aclimatacioacuten del laboratorio Se analizoacute la influencia de diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos sobre la variable nuacutemero raiacuteces iniciales (Anaacutelisis de Kruskal-Wallis en Anexo 7)
FIGURA 7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses de pre aclimatacioacuten
29
En la Figura 7 se puede observar los resultados de pre aclimatacioacuten en sala de laboratorio En esta etapa ya es posible ver la presencia de raiacuteces desarrolladas 421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula En el Cuadro 2 se puede observar que las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero inicial de raiacuteces y en la Figura 8 se puede comprobar que para los dos tamantildeos de plaacutentula maacutes pequentildeos no se observa gran cantidad de raiacuteces esto no impidioacute el desarrollo posterior de las plaacutentulas las cuales lograron enraizar al final del estudio Esto se contrapone a lo observado en un estudio de Lapageria rosea donde la presencia de raiacutez y brote para lograr una multiplicacioacuten exitosa de plantas es de vital importancia Incluso algunas plaacutentulas de L rosea no brotan en condiciones in vitro en donde tienen las mejores condiciones nutricionales y hormonales para hacerlo Esto se debe a factores internos de la plaacutentula siendo muy difiacutecil que broten inmediatamente en caacutemara de aclimatacioacuten donde ya dejan de recibir los nutrientes necesarios de manera directa y requieren de balances de energiacutea para poder seguir elongando raiacuteces absorber nutrientes y brotar para poder obtener los carbohidratos necesarios para seguir su crecimiento (BLANCO 2006) El tamantildeo de plaacutentula tiene importancia para el desarrollo de raiacuteces se distingue notoriamente que en los tamantildeos maacutes grandes el nuacutemero de raiacuteces es mayor comparativamente con los tamantildeos pequentildeos donde el nuacutemero de raiacuteces fue escaso Debido a la presencia de maacutes hojas existe una mayor cantidad de aacuterea fotosinteacutetica esta situacioacuten estimula el crecimiento de las raiacuteces para la obtencioacuten de agua y nutrientes
Raices iniciales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
2
4
6
8
10
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o inicial de ra
iacuteces
FIGURA 8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn)
30
422 Efecto del tipo de sustrato Para el sustrato turba+perlita se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas en el nuacutemero de raiacuteces con respecto a los dos otros sustratos esto se puede ver en el Figura 9 donde se observa que se obtuvieron los mayores resultados En cualquier medio de crecimiento el espacio no ocupado por un soacutelido se llama porosidad este espacio puede ser ocupado en parte para retener agua y en parte para proporcionarle aire a las raiacuteces La ausencia de uno de estos elementos es perjudicial para las plantas La turba es conocida por tener estas propiedades y la perlita tambieacuten por esta razoacuten se sabe que la mezcla turba-perlita provee propiedades fiacutesicas excelentes como medio de crecimiento y propagacioacuten (INFOAGRO 2007) Estos resultados con turba-perlita (298 de materia orgaacutenica) coinciden con los obtenidos por DIAZ et al (2004) quienes al utilizar un sustrato compuesto por 100 de humus de lombriz para aclimatar cantildea de azuacutecar obtuvieron el mayor nuacutemero de raiacuteces Esto puede atribuirse al importante aporte de materia orgaacutenica del humus (47) lo que le confiere una mejor estructura obtenieacutendose una excelente porosidad del sustrato La aireacioacuten del suelo es necesaria para favorecer la maacutexima absorcioacuten de nutrientes por las raiacuteces Esto tambieacuten sucede en el sustrato turba+perlita el cual posee la mayor cantidad de materia orgaacutenica de los tres sustratos utilizados
Raices iniciales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
2
4
6
8
10
Sustratos
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato En los anaacutelisis para la variable nuacutemero de raiacuteces se puede decir que la mejor interaccioacuten se presentoacute para el sustrato de turba+perlita junto con el mayor tamantildeo de plaacutentulas obteniendo los valores maacutes altos entre los nueve tratamientos La presencia de raiacuteces luego de la micropropagacioacuten aumenta la posibilidad de eacutexito en el transplante ya que se crea un favorable balance de agua Pero esto no quiere
31
decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
10
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
32
En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
33
El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
34
Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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Survival of transplanted terrestrial orchid seedlings in urban bushland habitats with high or low weed cover Australian Journal of Botany 54(4)383ndash389
SEELYE J BURGE G y MORGAN E 2003 Acclimatizing Tissue Culture Plants
Reducing the Shock Combined Proceedings International Plant Propagatorsrsquo Society 53 85-90
SHEEHAN T 1980 Orchids In Larson R (Ed) Introduction to Floriculture Academic
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41
VAASA A y ROSENBERG V 2004 Preservation of the rare terrestrial orchids in vitro
Acta Universitatis Latviensis Biology 676 243ndash246 VILCHEZ J RAMIREZ E VILLASMIL M ALBANY N LEON de SIERRALTA S y
MOLINA M 2007 Aclimatacioacuten de vitroplantas de zaacutebila (Aloe vera (L) Burm f) efectos del sustrato Facultad de Agronomiacutea Universidad del Zulia Maracaibo estado Zulia Repuacuteblica Bolivariana de Venezuela 5p
WHIGHAM D OacuteNEILL J RASMUSSEN H CALDWELL B y McCORMICK M
2005 Seed longevity in terrestrial orchids ndash Potential for persistent in situ seed banks Biological conservation 129 (1) 24-30 ISSN 0006-3207 Original no consultado CAB abstracts
42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
25
Las variables no parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en hojas finales y raiacuteces iniciales en sus rangos de distribucioacuten Las raiacuteces finales no presentaron diferencias seguacuten el sustrato utilizado pero de acuerdo al tamantildeo hubo diferencias en su distribucioacuten
CUADRO 3 Variables parameacutetricas altura final de plaacutentulas y sobrevivencia de
plaacutentulas
Variables Altura final de plaacutentulas
(cm) Sobrevivencia
Tamantildeo de plaacutentulas
36 c 567 b 47 b 821 a
Pequentildeas (1-2cm) Medianas (2-3 cm) Grandes (gt 3 cm) 59 a 908 a
Sustratos 52 a 933 a
41 ab 59 b Turba+perlita (A) Sphagnum (B) Arena+turba (C) 49 b 772 a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY Las variables parameacutetricas evaluadas seguacuten tamantildeo de plaacutentulas y sustrato presentaron diferencias significativas en altura final de hojas y en sobrevivencia 41 Nuacutemero de hojas finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentulas y de sustratos para la variable nuacutemero final de hojas 411 Efecto del tamantildeo de plaacutentula Seguacuten el Cuadro 2 y Figura 4 las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero final de hojas Las plaacutentulas pequentildeas de 1-2 cm obtuvieron el nuacutemero maacutes bajo de hojas finales con una media de 36 hojas por plaacutentula lo cual es la mitad de las hojas finales que se obtuvo con las plaacutentulas de mayor tamantildeo (61 hojas aproximado por plaacutentula) Para las plaacutentulas medianas de 2-3 cm se obtuvo una media de 47 hojas por plaacutentula (Figura 4)
26
Hojas finales
1-2 cm 2-3cm maacutes de 3 cm0
5
10
15
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn)
BLANCO (2006) sentildeala que plaacutentulas cultivadas in vitro crecen bajo condiciones especiales como alta humedad relativa y baja luminosidad ademaacutes son suplidas con sacarosa Estas condiciones fueron proporcionadas en una caacutemara de crecimiento en el laboratorio donde las plantas micropropagadas no son dependientes por completo de su fotosiacutentesis son heteroacutetrofas Parece ser necesario un estiacutemulo para convertirse en organismos totalmente capaces de sustentar sus propios requisitos de carbono y nitroacutegeno reducido pasando de esta manera a ser autoacutetrofos
Al ser sacadas de un medio in vitro las hojas no estaacuten preparadas para producir su propio alimento y sobreviven gracias a que el medio de cultivo le proporciona los nutrientes necesarios para vivir En este punto muchas de las hojas mueren y nacen hojas nuevas capaces de generar su alimento supliendo asiacute las hojas viejas (SEELYE et al 2003) En este ensayo las plaacutentulas de Chloraea virescens presentaron en general una buena adaptacioacuten al ser sacadas de un medio in vitro
Se observoacute que plaacutentulas con menor tamantildeo al ser aclimatadas y tener menor tejido fue maacutes difiacutecil y maacutes lento que empezaran a generar nuevos tejidos y materia orgaacutenica a partir de dioacutexido de carbono POSPIacuteŠILOVAacute et al (1999) sentildeala que al tener los estomas con desarrollo incompleto maacutes grandes y de forma maacutes redonda pierden maacutes agua lo cual puede provocar una peacuterdida de hojas muriendo asiacute la plaacutentula Por esta razoacuten las plaacutentulas pequentildeas se demoran maacutes tiempo en generar hojas nuevas es por ello que al finalizar este estudio muestran el menor nuacutemero final de hojas 412 Efecto del tipo de sustrato Al analizar la influencia del tipo de sustrato se encontraron diferencias significativas entre los tres sustratos utilizados Seguacuten el Cuadro 2 y la Figura 5 el sustrato donde se obtuvo mejores resultados fue
27
turba+perlita en el cual se observoacute un promedio de 53 hojas por plaacutentula siendo Sphagnum el maacutes bajo con 43 hojas por plaacutentula De acuerdo a los resultados del anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados el sustrato turba+perlita tiene mayor cantidad de nitroacutegeno foacutesforo calcio magnesio y azufre disponible comparativamente con los otros dos sustratos (Sphagnum y arena+turba) (Anexo 2)
Hojas finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
Sustratos
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) Para la brotacioacuten y el crecimiento de las plantas se necesita agua y Nitroacutegeno lo que favorece a una mayor tasa de aparicioacuten de hojas lo que se traduce en una mayor cantidad de hojas finales El Nitroacutegeno se encuentra en mayor cantidad en el sustrato turba+perlita debido a lo cual los mejores resultados se obtienen en dicho sustrato 413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Despueacutes de analizados los efectos individuales del tamantildeo y del sustrato al interactuar ambos factores existen diferencias significativas La mejor interaccioacuten se obtuvo con el sustrato turba+perlita y con el mayor tamantildeo de la plaacutentula (Figura 6) Debido a la buena estructura (porosa) de dicho sustrato se podriacutea decir que se favorecioacute la absorcioacuten radicular de nutrientes obteniendo por ello un mayor nuacutemero de hojas finales Para los menores tamantildeos no se observan diferencias significativas obteniendo como promedio 41 hojas por plaacutentula Para el mayor tamantildeo el promedio fue de 6 hojas por plaacutentula
28
Hojas finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 42 Raiacuteces iniciales Este paraacutemetro se evaluoacute luego de la primera etapa de aclimatacioacuten la cual se realizoacute en una sala de aclimatacioacuten del laboratorio Se analizoacute la influencia de diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos sobre la variable nuacutemero raiacuteces iniciales (Anaacutelisis de Kruskal-Wallis en Anexo 7)
FIGURA 7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses de pre aclimatacioacuten
29
En la Figura 7 se puede observar los resultados de pre aclimatacioacuten en sala de laboratorio En esta etapa ya es posible ver la presencia de raiacuteces desarrolladas 421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula En el Cuadro 2 se puede observar que las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero inicial de raiacuteces y en la Figura 8 se puede comprobar que para los dos tamantildeos de plaacutentula maacutes pequentildeos no se observa gran cantidad de raiacuteces esto no impidioacute el desarrollo posterior de las plaacutentulas las cuales lograron enraizar al final del estudio Esto se contrapone a lo observado en un estudio de Lapageria rosea donde la presencia de raiacutez y brote para lograr una multiplicacioacuten exitosa de plantas es de vital importancia Incluso algunas plaacutentulas de L rosea no brotan en condiciones in vitro en donde tienen las mejores condiciones nutricionales y hormonales para hacerlo Esto se debe a factores internos de la plaacutentula siendo muy difiacutecil que broten inmediatamente en caacutemara de aclimatacioacuten donde ya dejan de recibir los nutrientes necesarios de manera directa y requieren de balances de energiacutea para poder seguir elongando raiacuteces absorber nutrientes y brotar para poder obtener los carbohidratos necesarios para seguir su crecimiento (BLANCO 2006) El tamantildeo de plaacutentula tiene importancia para el desarrollo de raiacuteces se distingue notoriamente que en los tamantildeos maacutes grandes el nuacutemero de raiacuteces es mayor comparativamente con los tamantildeos pequentildeos donde el nuacutemero de raiacuteces fue escaso Debido a la presencia de maacutes hojas existe una mayor cantidad de aacuterea fotosinteacutetica esta situacioacuten estimula el crecimiento de las raiacuteces para la obtencioacuten de agua y nutrientes
Raices iniciales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
2
4
6
8
10
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o inicial de ra
iacuteces
FIGURA 8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn)
30
422 Efecto del tipo de sustrato Para el sustrato turba+perlita se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas en el nuacutemero de raiacuteces con respecto a los dos otros sustratos esto se puede ver en el Figura 9 donde se observa que se obtuvieron los mayores resultados En cualquier medio de crecimiento el espacio no ocupado por un soacutelido se llama porosidad este espacio puede ser ocupado en parte para retener agua y en parte para proporcionarle aire a las raiacuteces La ausencia de uno de estos elementos es perjudicial para las plantas La turba es conocida por tener estas propiedades y la perlita tambieacuten por esta razoacuten se sabe que la mezcla turba-perlita provee propiedades fiacutesicas excelentes como medio de crecimiento y propagacioacuten (INFOAGRO 2007) Estos resultados con turba-perlita (298 de materia orgaacutenica) coinciden con los obtenidos por DIAZ et al (2004) quienes al utilizar un sustrato compuesto por 100 de humus de lombriz para aclimatar cantildea de azuacutecar obtuvieron el mayor nuacutemero de raiacuteces Esto puede atribuirse al importante aporte de materia orgaacutenica del humus (47) lo que le confiere una mejor estructura obtenieacutendose una excelente porosidad del sustrato La aireacioacuten del suelo es necesaria para favorecer la maacutexima absorcioacuten de nutrientes por las raiacuteces Esto tambieacuten sucede en el sustrato turba+perlita el cual posee la mayor cantidad de materia orgaacutenica de los tres sustratos utilizados
Raices iniciales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
2
4
6
8
10
Sustratos
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato En los anaacutelisis para la variable nuacutemero de raiacuteces se puede decir que la mejor interaccioacuten se presentoacute para el sustrato de turba+perlita junto con el mayor tamantildeo de plaacutentulas obteniendo los valores maacutes altos entre los nueve tratamientos La presencia de raiacuteces luego de la micropropagacioacuten aumenta la posibilidad de eacutexito en el transplante ya que se crea un favorable balance de agua Pero esto no quiere
31
decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
10
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
32
En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
33
El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
34
Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
26
Hojas finales
1-2 cm 2-3cm maacutes de 3 cm0
5
10
15
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 4 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero final de hojas (Test de Dunn)
BLANCO (2006) sentildeala que plaacutentulas cultivadas in vitro crecen bajo condiciones especiales como alta humedad relativa y baja luminosidad ademaacutes son suplidas con sacarosa Estas condiciones fueron proporcionadas en una caacutemara de crecimiento en el laboratorio donde las plantas micropropagadas no son dependientes por completo de su fotosiacutentesis son heteroacutetrofas Parece ser necesario un estiacutemulo para convertirse en organismos totalmente capaces de sustentar sus propios requisitos de carbono y nitroacutegeno reducido pasando de esta manera a ser autoacutetrofos
Al ser sacadas de un medio in vitro las hojas no estaacuten preparadas para producir su propio alimento y sobreviven gracias a que el medio de cultivo le proporciona los nutrientes necesarios para vivir En este punto muchas de las hojas mueren y nacen hojas nuevas capaces de generar su alimento supliendo asiacute las hojas viejas (SEELYE et al 2003) En este ensayo las plaacutentulas de Chloraea virescens presentaron en general una buena adaptacioacuten al ser sacadas de un medio in vitro
Se observoacute que plaacutentulas con menor tamantildeo al ser aclimatadas y tener menor tejido fue maacutes difiacutecil y maacutes lento que empezaran a generar nuevos tejidos y materia orgaacutenica a partir de dioacutexido de carbono POSPIacuteŠILOVAacute et al (1999) sentildeala que al tener los estomas con desarrollo incompleto maacutes grandes y de forma maacutes redonda pierden maacutes agua lo cual puede provocar una peacuterdida de hojas muriendo asiacute la plaacutentula Por esta razoacuten las plaacutentulas pequentildeas se demoran maacutes tiempo en generar hojas nuevas es por ello que al finalizar este estudio muestran el menor nuacutemero final de hojas 412 Efecto del tipo de sustrato Al analizar la influencia del tipo de sustrato se encontraron diferencias significativas entre los tres sustratos utilizados Seguacuten el Cuadro 2 y la Figura 5 el sustrato donde se obtuvo mejores resultados fue
27
turba+perlita en el cual se observoacute un promedio de 53 hojas por plaacutentula siendo Sphagnum el maacutes bajo con 43 hojas por plaacutentula De acuerdo a los resultados del anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados el sustrato turba+perlita tiene mayor cantidad de nitroacutegeno foacutesforo calcio magnesio y azufre disponible comparativamente con los otros dos sustratos (Sphagnum y arena+turba) (Anexo 2)
Hojas finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
Sustratos
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) Para la brotacioacuten y el crecimiento de las plantas se necesita agua y Nitroacutegeno lo que favorece a una mayor tasa de aparicioacuten de hojas lo que se traduce en una mayor cantidad de hojas finales El Nitroacutegeno se encuentra en mayor cantidad en el sustrato turba+perlita debido a lo cual los mejores resultados se obtienen en dicho sustrato 413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Despueacutes de analizados los efectos individuales del tamantildeo y del sustrato al interactuar ambos factores existen diferencias significativas La mejor interaccioacuten se obtuvo con el sustrato turba+perlita y con el mayor tamantildeo de la plaacutentula (Figura 6) Debido a la buena estructura (porosa) de dicho sustrato se podriacutea decir que se favorecioacute la absorcioacuten radicular de nutrientes obteniendo por ello un mayor nuacutemero de hojas finales Para los menores tamantildeos no se observan diferencias significativas obteniendo como promedio 41 hojas por plaacutentula Para el mayor tamantildeo el promedio fue de 6 hojas por plaacutentula
28
Hojas finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 42 Raiacuteces iniciales Este paraacutemetro se evaluoacute luego de la primera etapa de aclimatacioacuten la cual se realizoacute en una sala de aclimatacioacuten del laboratorio Se analizoacute la influencia de diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos sobre la variable nuacutemero raiacuteces iniciales (Anaacutelisis de Kruskal-Wallis en Anexo 7)
FIGURA 7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses de pre aclimatacioacuten
29
En la Figura 7 se puede observar los resultados de pre aclimatacioacuten en sala de laboratorio En esta etapa ya es posible ver la presencia de raiacuteces desarrolladas 421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula En el Cuadro 2 se puede observar que las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero inicial de raiacuteces y en la Figura 8 se puede comprobar que para los dos tamantildeos de plaacutentula maacutes pequentildeos no se observa gran cantidad de raiacuteces esto no impidioacute el desarrollo posterior de las plaacutentulas las cuales lograron enraizar al final del estudio Esto se contrapone a lo observado en un estudio de Lapageria rosea donde la presencia de raiacutez y brote para lograr una multiplicacioacuten exitosa de plantas es de vital importancia Incluso algunas plaacutentulas de L rosea no brotan en condiciones in vitro en donde tienen las mejores condiciones nutricionales y hormonales para hacerlo Esto se debe a factores internos de la plaacutentula siendo muy difiacutecil que broten inmediatamente en caacutemara de aclimatacioacuten donde ya dejan de recibir los nutrientes necesarios de manera directa y requieren de balances de energiacutea para poder seguir elongando raiacuteces absorber nutrientes y brotar para poder obtener los carbohidratos necesarios para seguir su crecimiento (BLANCO 2006) El tamantildeo de plaacutentula tiene importancia para el desarrollo de raiacuteces se distingue notoriamente que en los tamantildeos maacutes grandes el nuacutemero de raiacuteces es mayor comparativamente con los tamantildeos pequentildeos donde el nuacutemero de raiacuteces fue escaso Debido a la presencia de maacutes hojas existe una mayor cantidad de aacuterea fotosinteacutetica esta situacioacuten estimula el crecimiento de las raiacuteces para la obtencioacuten de agua y nutrientes
Raices iniciales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
2
4
6
8
10
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o inicial de ra
iacuteces
FIGURA 8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn)
30
422 Efecto del tipo de sustrato Para el sustrato turba+perlita se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas en el nuacutemero de raiacuteces con respecto a los dos otros sustratos esto se puede ver en el Figura 9 donde se observa que se obtuvieron los mayores resultados En cualquier medio de crecimiento el espacio no ocupado por un soacutelido se llama porosidad este espacio puede ser ocupado en parte para retener agua y en parte para proporcionarle aire a las raiacuteces La ausencia de uno de estos elementos es perjudicial para las plantas La turba es conocida por tener estas propiedades y la perlita tambieacuten por esta razoacuten se sabe que la mezcla turba-perlita provee propiedades fiacutesicas excelentes como medio de crecimiento y propagacioacuten (INFOAGRO 2007) Estos resultados con turba-perlita (298 de materia orgaacutenica) coinciden con los obtenidos por DIAZ et al (2004) quienes al utilizar un sustrato compuesto por 100 de humus de lombriz para aclimatar cantildea de azuacutecar obtuvieron el mayor nuacutemero de raiacuteces Esto puede atribuirse al importante aporte de materia orgaacutenica del humus (47) lo que le confiere una mejor estructura obtenieacutendose una excelente porosidad del sustrato La aireacioacuten del suelo es necesaria para favorecer la maacutexima absorcioacuten de nutrientes por las raiacuteces Esto tambieacuten sucede en el sustrato turba+perlita el cual posee la mayor cantidad de materia orgaacutenica de los tres sustratos utilizados
Raices iniciales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
2
4
6
8
10
Sustratos
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato En los anaacutelisis para la variable nuacutemero de raiacuteces se puede decir que la mejor interaccioacuten se presentoacute para el sustrato de turba+perlita junto con el mayor tamantildeo de plaacutentulas obteniendo los valores maacutes altos entre los nueve tratamientos La presencia de raiacuteces luego de la micropropagacioacuten aumenta la posibilidad de eacutexito en el transplante ya que se crea un favorable balance de agua Pero esto no quiere
31
decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
10
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
32
En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
33
El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
34
Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
27
turba+perlita en el cual se observoacute un promedio de 53 hojas por plaacutentula siendo Sphagnum el maacutes bajo con 43 hojas por plaacutentula De acuerdo a los resultados del anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados el sustrato turba+perlita tiene mayor cantidad de nitroacutegeno foacutesforo calcio magnesio y azufre disponible comparativamente con los otros dos sustratos (Sphagnum y arena+turba) (Anexo 2)
Hojas finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
Sustratos
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 5 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de hojas (Test de Dunn) Para la brotacioacuten y el crecimiento de las plantas se necesita agua y Nitroacutegeno lo que favorece a una mayor tasa de aparicioacuten de hojas lo que se traduce en una mayor cantidad de hojas finales El Nitroacutegeno se encuentra en mayor cantidad en el sustrato turba+perlita debido a lo cual los mejores resultados se obtienen en dicho sustrato 413 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Despueacutes de analizados los efectos individuales del tamantildeo y del sustrato al interactuar ambos factores existen diferencias significativas La mejor interaccioacuten se obtuvo con el sustrato turba+perlita y con el mayor tamantildeo de la plaacutentula (Figura 6) Debido a la buena estructura (porosa) de dicho sustrato se podriacutea decir que se favorecioacute la absorcioacuten radicular de nutrientes obteniendo por ello un mayor nuacutemero de hojas finales Para los menores tamantildeos no se observan diferencias significativas obteniendo como promedio 41 hojas por plaacutentula Para el mayor tamantildeo el promedio fue de 6 hojas por plaacutentula
28
Hojas finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 42 Raiacuteces iniciales Este paraacutemetro se evaluoacute luego de la primera etapa de aclimatacioacuten la cual se realizoacute en una sala de aclimatacioacuten del laboratorio Se analizoacute la influencia de diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos sobre la variable nuacutemero raiacuteces iniciales (Anaacutelisis de Kruskal-Wallis en Anexo 7)
FIGURA 7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses de pre aclimatacioacuten
29
En la Figura 7 se puede observar los resultados de pre aclimatacioacuten en sala de laboratorio En esta etapa ya es posible ver la presencia de raiacuteces desarrolladas 421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula En el Cuadro 2 se puede observar que las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero inicial de raiacuteces y en la Figura 8 se puede comprobar que para los dos tamantildeos de plaacutentula maacutes pequentildeos no se observa gran cantidad de raiacuteces esto no impidioacute el desarrollo posterior de las plaacutentulas las cuales lograron enraizar al final del estudio Esto se contrapone a lo observado en un estudio de Lapageria rosea donde la presencia de raiacutez y brote para lograr una multiplicacioacuten exitosa de plantas es de vital importancia Incluso algunas plaacutentulas de L rosea no brotan en condiciones in vitro en donde tienen las mejores condiciones nutricionales y hormonales para hacerlo Esto se debe a factores internos de la plaacutentula siendo muy difiacutecil que broten inmediatamente en caacutemara de aclimatacioacuten donde ya dejan de recibir los nutrientes necesarios de manera directa y requieren de balances de energiacutea para poder seguir elongando raiacuteces absorber nutrientes y brotar para poder obtener los carbohidratos necesarios para seguir su crecimiento (BLANCO 2006) El tamantildeo de plaacutentula tiene importancia para el desarrollo de raiacuteces se distingue notoriamente que en los tamantildeos maacutes grandes el nuacutemero de raiacuteces es mayor comparativamente con los tamantildeos pequentildeos donde el nuacutemero de raiacuteces fue escaso Debido a la presencia de maacutes hojas existe una mayor cantidad de aacuterea fotosinteacutetica esta situacioacuten estimula el crecimiento de las raiacuteces para la obtencioacuten de agua y nutrientes
Raices iniciales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
2
4
6
8
10
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o inicial de ra
iacuteces
FIGURA 8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn)
30
422 Efecto del tipo de sustrato Para el sustrato turba+perlita se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas en el nuacutemero de raiacuteces con respecto a los dos otros sustratos esto se puede ver en el Figura 9 donde se observa que se obtuvieron los mayores resultados En cualquier medio de crecimiento el espacio no ocupado por un soacutelido se llama porosidad este espacio puede ser ocupado en parte para retener agua y en parte para proporcionarle aire a las raiacuteces La ausencia de uno de estos elementos es perjudicial para las plantas La turba es conocida por tener estas propiedades y la perlita tambieacuten por esta razoacuten se sabe que la mezcla turba-perlita provee propiedades fiacutesicas excelentes como medio de crecimiento y propagacioacuten (INFOAGRO 2007) Estos resultados con turba-perlita (298 de materia orgaacutenica) coinciden con los obtenidos por DIAZ et al (2004) quienes al utilizar un sustrato compuesto por 100 de humus de lombriz para aclimatar cantildea de azuacutecar obtuvieron el mayor nuacutemero de raiacuteces Esto puede atribuirse al importante aporte de materia orgaacutenica del humus (47) lo que le confiere una mejor estructura obtenieacutendose una excelente porosidad del sustrato La aireacioacuten del suelo es necesaria para favorecer la maacutexima absorcioacuten de nutrientes por las raiacuteces Esto tambieacuten sucede en el sustrato turba+perlita el cual posee la mayor cantidad de materia orgaacutenica de los tres sustratos utilizados
Raices iniciales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
2
4
6
8
10
Sustratos
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato En los anaacutelisis para la variable nuacutemero de raiacuteces se puede decir que la mejor interaccioacuten se presentoacute para el sustrato de turba+perlita junto con el mayor tamantildeo de plaacutentulas obteniendo los valores maacutes altos entre los nueve tratamientos La presencia de raiacuteces luego de la micropropagacioacuten aumenta la posibilidad de eacutexito en el transplante ya que se crea un favorable balance de agua Pero esto no quiere
31
decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
10
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
32
En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
33
El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
34
Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
28
Hojas finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero final
de hoj
as
FIGURA 6 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica
nuacutemero de hojas finales (Test de Dunn) 42 Raiacuteces iniciales Este paraacutemetro se evaluoacute luego de la primera etapa de aclimatacioacuten la cual se realizoacute en una sala de aclimatacioacuten del laboratorio Se analizoacute la influencia de diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos sobre la variable nuacutemero raiacuteces iniciales (Anaacutelisis de Kruskal-Wallis en Anexo 7)
FIGURA 7 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de dos meses de pre aclimatacioacuten
29
En la Figura 7 se puede observar los resultados de pre aclimatacioacuten en sala de laboratorio En esta etapa ya es posible ver la presencia de raiacuteces desarrolladas 421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula En el Cuadro 2 se puede observar que las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero inicial de raiacuteces y en la Figura 8 se puede comprobar que para los dos tamantildeos de plaacutentula maacutes pequentildeos no se observa gran cantidad de raiacuteces esto no impidioacute el desarrollo posterior de las plaacutentulas las cuales lograron enraizar al final del estudio Esto se contrapone a lo observado en un estudio de Lapageria rosea donde la presencia de raiacutez y brote para lograr una multiplicacioacuten exitosa de plantas es de vital importancia Incluso algunas plaacutentulas de L rosea no brotan en condiciones in vitro en donde tienen las mejores condiciones nutricionales y hormonales para hacerlo Esto se debe a factores internos de la plaacutentula siendo muy difiacutecil que broten inmediatamente en caacutemara de aclimatacioacuten donde ya dejan de recibir los nutrientes necesarios de manera directa y requieren de balances de energiacutea para poder seguir elongando raiacuteces absorber nutrientes y brotar para poder obtener los carbohidratos necesarios para seguir su crecimiento (BLANCO 2006) El tamantildeo de plaacutentula tiene importancia para el desarrollo de raiacuteces se distingue notoriamente que en los tamantildeos maacutes grandes el nuacutemero de raiacuteces es mayor comparativamente con los tamantildeos pequentildeos donde el nuacutemero de raiacuteces fue escaso Debido a la presencia de maacutes hojas existe una mayor cantidad de aacuterea fotosinteacutetica esta situacioacuten estimula el crecimiento de las raiacuteces para la obtencioacuten de agua y nutrientes
Raices iniciales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
2
4
6
8
10
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o inicial de ra
iacuteces
FIGURA 8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn)
30
422 Efecto del tipo de sustrato Para el sustrato turba+perlita se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas en el nuacutemero de raiacuteces con respecto a los dos otros sustratos esto se puede ver en el Figura 9 donde se observa que se obtuvieron los mayores resultados En cualquier medio de crecimiento el espacio no ocupado por un soacutelido se llama porosidad este espacio puede ser ocupado en parte para retener agua y en parte para proporcionarle aire a las raiacuteces La ausencia de uno de estos elementos es perjudicial para las plantas La turba es conocida por tener estas propiedades y la perlita tambieacuten por esta razoacuten se sabe que la mezcla turba-perlita provee propiedades fiacutesicas excelentes como medio de crecimiento y propagacioacuten (INFOAGRO 2007) Estos resultados con turba-perlita (298 de materia orgaacutenica) coinciden con los obtenidos por DIAZ et al (2004) quienes al utilizar un sustrato compuesto por 100 de humus de lombriz para aclimatar cantildea de azuacutecar obtuvieron el mayor nuacutemero de raiacuteces Esto puede atribuirse al importante aporte de materia orgaacutenica del humus (47) lo que le confiere una mejor estructura obtenieacutendose una excelente porosidad del sustrato La aireacioacuten del suelo es necesaria para favorecer la maacutexima absorcioacuten de nutrientes por las raiacuteces Esto tambieacuten sucede en el sustrato turba+perlita el cual posee la mayor cantidad de materia orgaacutenica de los tres sustratos utilizados
Raices iniciales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
2
4
6
8
10
Sustratos
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato En los anaacutelisis para la variable nuacutemero de raiacuteces se puede decir que la mejor interaccioacuten se presentoacute para el sustrato de turba+perlita junto con el mayor tamantildeo de plaacutentulas obteniendo los valores maacutes altos entre los nueve tratamientos La presencia de raiacuteces luego de la micropropagacioacuten aumenta la posibilidad de eacutexito en el transplante ya que se crea un favorable balance de agua Pero esto no quiere
31
decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
10
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
32
En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
33
El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
34
Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
6 BIBLIOGRAFIA
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
29
En la Figura 7 se puede observar los resultados de pre aclimatacioacuten en sala de laboratorio En esta etapa ya es posible ver la presencia de raiacuteces desarrolladas 421 Efecto del tamantildeo de plaacutentula En el Cuadro 2 se puede observar que las plaacutentulas presentaron diferencias estadiacutesticas significativas sobre el nuacutemero inicial de raiacuteces y en la Figura 8 se puede comprobar que para los dos tamantildeos de plaacutentula maacutes pequentildeos no se observa gran cantidad de raiacuteces esto no impidioacute el desarrollo posterior de las plaacutentulas las cuales lograron enraizar al final del estudio Esto se contrapone a lo observado en un estudio de Lapageria rosea donde la presencia de raiacutez y brote para lograr una multiplicacioacuten exitosa de plantas es de vital importancia Incluso algunas plaacutentulas de L rosea no brotan en condiciones in vitro en donde tienen las mejores condiciones nutricionales y hormonales para hacerlo Esto se debe a factores internos de la plaacutentula siendo muy difiacutecil que broten inmediatamente en caacutemara de aclimatacioacuten donde ya dejan de recibir los nutrientes necesarios de manera directa y requieren de balances de energiacutea para poder seguir elongando raiacuteces absorber nutrientes y brotar para poder obtener los carbohidratos necesarios para seguir su crecimiento (BLANCO 2006) El tamantildeo de plaacutentula tiene importancia para el desarrollo de raiacuteces se distingue notoriamente que en los tamantildeos maacutes grandes el nuacutemero de raiacuteces es mayor comparativamente con los tamantildeos pequentildeos donde el nuacutemero de raiacuteces fue escaso Debido a la presencia de maacutes hojas existe una mayor cantidad de aacuterea fotosinteacutetica esta situacioacuten estimula el crecimiento de las raiacuteces para la obtencioacuten de agua y nutrientes
Raices iniciales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
2
4
6
8
10
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o inicial de ra
iacuteces
FIGURA 8 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn)
30
422 Efecto del tipo de sustrato Para el sustrato turba+perlita se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas en el nuacutemero de raiacuteces con respecto a los dos otros sustratos esto se puede ver en el Figura 9 donde se observa que se obtuvieron los mayores resultados En cualquier medio de crecimiento el espacio no ocupado por un soacutelido se llama porosidad este espacio puede ser ocupado en parte para retener agua y en parte para proporcionarle aire a las raiacuteces La ausencia de uno de estos elementos es perjudicial para las plantas La turba es conocida por tener estas propiedades y la perlita tambieacuten por esta razoacuten se sabe que la mezcla turba-perlita provee propiedades fiacutesicas excelentes como medio de crecimiento y propagacioacuten (INFOAGRO 2007) Estos resultados con turba-perlita (298 de materia orgaacutenica) coinciden con los obtenidos por DIAZ et al (2004) quienes al utilizar un sustrato compuesto por 100 de humus de lombriz para aclimatar cantildea de azuacutecar obtuvieron el mayor nuacutemero de raiacuteces Esto puede atribuirse al importante aporte de materia orgaacutenica del humus (47) lo que le confiere una mejor estructura obtenieacutendose una excelente porosidad del sustrato La aireacioacuten del suelo es necesaria para favorecer la maacutexima absorcioacuten de nutrientes por las raiacuteces Esto tambieacuten sucede en el sustrato turba+perlita el cual posee la mayor cantidad de materia orgaacutenica de los tres sustratos utilizados
Raices iniciales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
2
4
6
8
10
Sustratos
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato En los anaacutelisis para la variable nuacutemero de raiacuteces se puede decir que la mejor interaccioacuten se presentoacute para el sustrato de turba+perlita junto con el mayor tamantildeo de plaacutentulas obteniendo los valores maacutes altos entre los nueve tratamientos La presencia de raiacuteces luego de la micropropagacioacuten aumenta la posibilidad de eacutexito en el transplante ya que se crea un favorable balance de agua Pero esto no quiere
31
decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
10
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
32
En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
33
El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
34
Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
30
422 Efecto del tipo de sustrato Para el sustrato turba+perlita se encontraron diferencias estadiacutesticamente significativas en el nuacutemero de raiacuteces con respecto a los dos otros sustratos esto se puede ver en el Figura 9 donde se observa que se obtuvieron los mayores resultados En cualquier medio de crecimiento el espacio no ocupado por un soacutelido se llama porosidad este espacio puede ser ocupado en parte para retener agua y en parte para proporcionarle aire a las raiacuteces La ausencia de uno de estos elementos es perjudicial para las plantas La turba es conocida por tener estas propiedades y la perlita tambieacuten por esta razoacuten se sabe que la mezcla turba-perlita provee propiedades fiacutesicas excelentes como medio de crecimiento y propagacioacuten (INFOAGRO 2007) Estos resultados con turba-perlita (298 de materia orgaacutenica) coinciden con los obtenidos por DIAZ et al (2004) quienes al utilizar un sustrato compuesto por 100 de humus de lombriz para aclimatar cantildea de azuacutecar obtuvieron el mayor nuacutemero de raiacuteces Esto puede atribuirse al importante aporte de materia orgaacutenica del humus (47) lo que le confiere una mejor estructura obtenieacutendose una excelente porosidad del sustrato La aireacioacuten del suelo es necesaria para favorecer la maacutexima absorcioacuten de nutrientes por las raiacuteces Esto tambieacuten sucede en el sustrato turba+perlita el cual posee la mayor cantidad de materia orgaacutenica de los tres sustratos utilizados
Raices iniciales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
2
4
6
8
10
Sustratos
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 9 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero inicial de raiacuteces (Test de Dunn) 423 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato En los anaacutelisis para la variable nuacutemero de raiacuteces se puede decir que la mejor interaccioacuten se presentoacute para el sustrato de turba+perlita junto con el mayor tamantildeo de plaacutentulas obteniendo los valores maacutes altos entre los nueve tratamientos La presencia de raiacuteces luego de la micropropagacioacuten aumenta la posibilidad de eacutexito en el transplante ya que se crea un favorable balance de agua Pero esto no quiere
31
decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
10
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
32
En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
33
El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
34
Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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40
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167p McKENDRICK S 2000 Manual para la germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas Ceiba Foundation for Tropical Conservation Scotland United Kingdom 17p NOVOA P ESPEJO J CISTERNAS M RUBIO M y DOMINGUEZ E 2006 Guiacutea
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ORQUIDEAS 2007 Orquiacutedeascl Informacioacuten sobre orquiacutedeas (on line)
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41
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
31
decir que sin dicha presencia no se produzca un transplante exitoso (POSPIacuteŠILOVAacute et al 1999)
Esto se puede observar en la Figura 10 donde se ve que en los menores tamantildeos sin importar el tipo de sustrato hay escaso crecimiento radical no significando esto una muerte de las plaacutentulas
Raices iniciales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
2
4
6
8
10
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutemero inicial de raiacuteces
FIGURA 10 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces iniciales (Test de Dunn) 43 Raiacuteces finales A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable raiacuteces finales
FIGURA 11 Desarrollo de raiacuteces y nuacutemero de hojas despueacutes de tres meses de aclimatacioacuten
32
En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
33
El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
34
Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
32
En la Figura 11 se puede observar el desarrollo radical y foliar que presentaron las plaacutentulas al final del estudio 431 Efecto del tamantildeo de plaacutentula La influencia del tamantildeo de plaacutentula en el nuacutemero de raiacuteces finales muestra diferencias estadiacutesticas significativas Al utilizar el mayor tamantildeo de plaacutentulas (maacutes de 3 cm) se obtuvieron los mejores resultados donde se desarrollaron 76 raiacuteces promedio por plaacutentula Para las plaacutentulas pequentildeas fue inferior se desarrollaron 37 raiacuteces promedio por plaacutentula (Cuadro 2) Las plaacutentulas de mayor tamantildeo presentaron mayor cantidad de raiacuteces iniciales esta tendencia se mantuvo y las plaacutentulas se desarrollan de mejor manera obtenieacutendose asiacute el mayor nuacutemero de raiacuteces finales con el mismo tamantildeo
Raices finales
1-2cm 2-3cm maacutes de 3cm0
5
10
15
20
Tamantildeo de plaacutentula
Nuacutemer
o final de ra
iacuteces
FIGURA 12 Efecto del tamantildeo de plaacutentula sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn)
432 Efecto del tipo de sustrato Se analizoacute el nuacutemero de raiacuteces finales con respecto a los tres sustratos aplicados Mediante la Prueba de Kruskal-Wallis (Anexo 8) se determinoacute que no existen diferencias significativas Esto difiere de los resultados obtenidos por DIAZ et al 2004 que encontraron diferencias al utilizar como sustrato humus de lombriz con 47 de materia orgaacutenica en la aclimatacioacuten de cantildea de azuacutecar Comparativamente al usar en este estudio sustrato turba+perlita que posee un 298 no existieron diferencias entre los demaacutes sustratos utilizados que contienen menor cantidad de materia orgaacutenica
33
El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
34
Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
33
El rango de raiacuteces fue bastante homogeacuteneo aproximadamente cinco raiacuteces por plaacutentula solo se observa un leve aumento no significativo en el nuacutemero de raiacuteces para el sustrato turba+perlita Una serie de factores del medio ambiente favorecen la rizogeacutenesis entre ellos la oxigenacioacuten del medio La eleccioacuten del sustrato responde a la doble necesidad de asegurar a la vez humedad y drenaje
Raices finales
Turba+perlita Sphagnum Turba+arena0
5
10
15
20
Sustratos
Nuacutem
ero final
de ra
iacuteces
FIGURA 13 Efecto del sustrato sobre la variable no parameacutetrica nuacutemero final de raiacuteces (Test de Dunn) 433 Interaccioacuten entre tamantildeo de plaacutentula y sustrato Para la interaccioacuten entre los dos factores se observa que la mejor es para el sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo y no tiene diferencia significativa con el sustrato arena+turba para el mismo tamantildeo En la Figura 14 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita y arena+turba con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en el nuacutemero final de raiacuteces con un promedio de 96 y 78 respectivamente En el sustrato Sphagnum se puede apreciar que el tamantildeo de plaacutentulas no influye en el nuacutemero final de raiacuteces
Para el menor tamantildeo se observa que el sustrato arena+turba fue donde se obtuvo el menor desarrollo radical
34
Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
34
Raices finales
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C30
5
10
15
20
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Nuacutem
ero
final
de ra
iacuteces
FIGURA 14 Efecto del tamantildeo y del sustrato sobre la variable no parameacutetrica raiacuteces finales (Test de Dunn) 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten A continuacioacuten se presenta la influencia de los diferentes tamantildeos de plaacutentula y de sustratos para la variable altura de plaacutentulas (Figura 15 a y b)
Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la altura de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo la mayor altura 52cm pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo 49 cm El sustrato compuesto de Sphagnun presentoacute diferencias significativas con respecto a los dos otros sustratos obteniendo solo 41 cm (Fig 15 a)
Al evaluar la altura seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula (Fig 15 b) se obtuvieron las mayores alturas con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm
En la Figura 16 se observa que las plaacutentulas del sustrato turba+perlita con el mayor tamantildeo mantienen la predominancia en altura final (76 cm) lograda por la plaacutentula despueacutes de seis meses de crecimiento Esto no sucede de igual forma con las plaacutentulas del sustrato Sphagnum con el menor tamantildeo que logran alcanzar la miacutenima altura final entre los tres sustratos evaluados (27 cm) ver Anexo 11
Es decir que se puede aseverar que existioacute una influencia de los sustratos y los tamantildeos en el desarrollo promedio de las plaacutentulas en la fase de aclimatacioacuten
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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40
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
35
Con un nivel de confianza del 95 podemos afirmar que la altura promedio poblacional obtenida al final de la aclimatacioacuten en el sustrato turba+perlita se encuentra entre 41 cm y 76 cm siendo superior a las obtenidas en los otros dos sustratos (Anexo 11)
Altura de plaacutentula
abb
a
0
2
4
6
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Alt
ura
(cm
)
Altura de plaacutentula
a
b
c
0
1
2
3
4
5
6
7
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(a) (b)
FIGURA 15 Altura final de plaacutentula seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b)
Altura de plaacutentula
bcbc
d
bb
cd
a
cc
0
2
4
6
8
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
Alt
ura
(cm
)
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 16 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica altura final de plaacutentulas
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
6 BIBLIOGRAFIA
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40
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41
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
36
45 Sobrevivencia A continuacioacuten se presenta en la Figura 17 la influencia de los factores tamantildeos de plaacutentula y sustratos para la variable sobrevivencia de plaacutentulas y en la Figura 18 la interaccioacuten de ambas variables Se determinoacute la influencia del sustrato y tamantildeo en la sobrevivencia de las plaacutentulas En el sustrato turba + perlita se obtuvo el mayor porcentaje de sobrevivencia (93) pero no presentoacute diferencias significativas con el sustrato arena + turba que obtuvo un 77 de plaacutentulas vivas El sustrato compuesto de Sphagnum presentoacute diferencias significativas en la sobrevivencia con respecto a los dos otros sustratos Al evaluar la sobrevivencia seguacuten el tamantildeo inicial de la plaacutentula se obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia con los tamantildeos 2 y 3 que corresponden a plaacutentulas de un tamantildeo mayor de 2cm Las plantas producidas en estas condiciones y con estos tamantildeos pueden resultar de faacutecil aclimatacioacuten tomando en cuenta todos los factores que influyen en su desarrollo Esto permite indicar que el tamantildeo de plaacutentula inicial 1 (1-2 cm) no es adecuado para aclimatar esta especie ya que presentoacute diferencias significativas y el menor porcentaje de sobrevivencia La mortandad de plaacutentulas en esta etapa es un factor de alto riesgo si no se tiene establecido los tamantildeos y condiciones adecuadas para este proceso de adaptacioacuten y el estreacutes de cambio puede afectar en pocas horas la sobrevivencia de la planta En cuanto a la sobrevivencia porcentual en la interaccioacuten de ambos factores se repite la misma tendencia anterior donde los sustratos arena + turba y turba + perlita en los tamantildeos mediano y grande obtuvieron los mayores porcentajes de sobrevivencia
Sotolongo citado por DOMIacuteNGUEZ y DONAYRE (2006) explica que el eacutexito de la propagacioacuten in vitro radica en lograr la aclimatacioacuten de las plaacutentulas a las condiciones ambientales Durante esta etapa se produce un retorno gradual al funcionamiento autotroacutefico de las plaacutentulas asiacute como la recuperacioacuten de las caracteriacutesticas morfoloacutegicas y fisioloacutegicas normales asimismo en esta etapa las plaacutentulas sufren un estreacutes provocado por el cambio en las condiciones de humedad y temperatura por lo que la transferencia debe realizarse de forma gradual En el caso de las plaacutentulas de Uncaria tomentosa perteneciente a la familia Rubiaceae (Untildea de gato) eacutestas son incapaces de sobrevivir al trasplante directo al invernadero o campo (DOMINGUEZ y DONAYRE 2006)
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
37
Sobrevivencia de plaacutentulas
a
b
ab
0
20
40
60
80
100
A (turba+perlita) B (Sphagnum) C (arena+turba)
Sustrato
Po
rcen
taje
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
0
20
40
60
80
100
1 (1-2 cm) 2 (2-3 cm) 3 (+ 3cm)
Tamantildeo
Po
cen
taje
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY
(b) (a)
FIGURA 17 Sobrevivencia de plaacutentulas seguacuten sustrato (a) y tamantildeo (b) En la Figura 18 se observa la interaccioacuten entre ambos factores
Sobrevivencia de plaacutentulas
aa
b
ab
bb
aa
ab
0102030405060708090
100
A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3
Tratamientos (Sustrato x Tamantildeo)
So
bre
vive
nci
a
Letras distintas en las columnas indican diferencias estadiacutesticamente significativas al 5 TUKEY FIGURA 18 Anaacutelisis de Varianza con un 95 de confianza para la variable parameacutetrica de sobrevivencia
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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40
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
38
5 CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que
Se confirma la hipoacutetesis de trabajo ya que en la aclimatacioacuten de plaacutentulas de Chloraea virescens (Willd) Lindl obtenidas in vitro si influyen los tamantildeos de plaacutentula y los sustratos utilizados
El mejor de los tamantildeos utilizados para aclimatar plaacutentulas de C virescens es
de maacutes de tres centiacutemetros y el sustrato maacutes adecuado fue turba+perlita obteniendo en todos los paraacutemetros los mejores resultados bajo las condiciones del presente ensayo
Existen diferentes respuestas de sobrevivencia de plaacutentulas de acuerdo al
material vegetal empleado especialmente durante la etapa de establecimiento ex vitro donde los porcentajes de sobrevivencia oscilaron entre 27 y 90
Se logroacute un incremento en el tamantildeo de las plaacutentulas el crecimiento promedio
alcanzado en los tres sustratos al final de la aclimatacioacuten fue de 47cm y el nuacutemero promedio de hojas (4-7) han sido adecuadas para el desarrollo posterior
39
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
39
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
40
INFOAGRO 2007 Tipos de sustratos de cultivo Infoagro Systems SL Madrid Espantildea (on line) wwwinfoagrocom ( 15 octubre 2007)
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167p McKENDRICK S 2000 Manual para la germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas Ceiba Foundation for Tropical Conservation Scotland United Kingdom 17p NOVOA P ESPEJO J CISTERNAS M RUBIO M y DOMINGUEZ E 2006 Guiacutea
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41
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42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
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- Indice de Anexos
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- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
41
VAASA A y ROSENBERG V 2004 Preservation of the rare terrestrial orchids in vitro
Acta Universitatis Latviensis Biology 676 243ndash246 VILCHEZ J RAMIREZ E VILLASMIL M ALBANY N LEON de SIERRALTA S y
MOLINA M 2007 Aclimatacioacuten de vitroplantas de zaacutebila (Aloe vera (L) Burm f) efectos del sustrato Facultad de Agronomiacutea Universidad del Zulia Maracaibo estado Zulia Repuacuteblica Bolivariana de Venezuela 5p
WHIGHAM D OacuteNEILL J RASMUSSEN H CALDWELL B y McCORMICK M
2005 Seed longevity in terrestrial orchids ndash Potential for persistent in situ seed banks Biological conservation 129 (1) 24-30 ISSN 0006-3207 Original no consultado CAB abstracts
42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
42
7 ANEXOS
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
43
ANEXO 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
Nutrientes (mgL) Macronutrientes NH4NO3
KNO3
CaCL2 2H2O MgSO4 7H2O KH2PO4
1650 1900 440 370 170
Micronutrientes Na2 EDTA 2H2O FeSO4 7H2O MnSO4 H2O ZnSO4 7H2O H3BO3
KI Na2MoO4 2H2O CuSO4 5H2O CoCl2 6 H2O
3725 2785 223 86 62
083 025
0025 0025
Vitaminas Tiamina Ac Nicotiacutenico Piridoxina HCL Glicina Myo-inositol Sacarosa Gelrite
04 05 05 2
100 20000 3500
FUENTE JARA G y SEEMANN P 2007
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
44
ANEXO 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
Turba+perlita Arena+Turba Sphagnum Turba+suelo trumao
pH en agua (125) 59 59 42 54 pH CaCl2 001M 54 54 - 5
Materia orgaacutenica () 298 136 - 217 N- mineral (N-
NO3+NH4) (mgkg) 308 196 - 126
Foacutesforo Olsen (mgkg) 194 446 538 17 Potasio intercambiable
(mgkg) 673 266 661 391
Sodio intercambiable (cmol+kg)
055 010 445 042
Calcio intercambiable (cmol+kg)
1635 847 902 615
Magnesio intercambiable
(cmol+kg)
898 325 796 457
Suma de bases (cmol+kg)
2760 125 2312 1214
Aluminio intercambiable (cmol+kg)
003 008 025 009
CICE (cmol+kg)
2763 1258 2338 1223
Saturacioacuten de Al ()
01 065 11 07
Azufre disponible (mgkg)
2592 552 573 519
Zinc disponible (mgkg) 456 175 835 109 Fierro disponible
(mgkg) 1832 - - -
Cobre disponible (mgkg)
117 - - -
Manganeso disponible (mgkg)
151 - - -
Boro disponible (mgkg) - 114 507 086 FUENTE INSTITUTO DE INGENIERIA AGRARIA Y SUELOS UNIVERSIDAD
AUSTRAL DE CHILE (11 DE DICIEMBRE 2007)
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
45
ANEXO 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
Promedio mensual en sala de aclimatacioacuten Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Septiembre 20 24 22 Octubre 21 23 22
Noviembre 21 24 23
Promedio mensual en invernadero Tdeg miacutenima Tdeg maacutexima Tdeg promedio
Diciembre 11 29 20 Enero 14 37 26
Febrero 14 39 27 Marzo 12 35 24
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
46
ANEXO 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 655 0004 Tamantildeo 3011 0000 Sustrato x Tamantildeo 5811 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 53 02 50 56 C (arena+turba) 40 46 02 42 50
B (Sphagnum) 53 43 02 39 46 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 33 40 2 (2-3 cm) 59 47 02 44 50 3 (+ 3cm) 49 61 02 58 65 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 03 39 47 A2 24 46 03 41 50 A3 18 76 03 71 81 B1 13 33 04 27 38 B2 12 51 04 45 57 B3 15 54 03 48 59 C1 14 29 04 23 34 C2 23 45 03 41 50 C3 16 52 03 47 57
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
47
ANEXO 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 993 0007 Tamantildeo 4338 0000 Sustrato x Tamantildeo 6076 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 36 01 33 39 C (arena+turba) 40 27 02 24 30
B (Sphagnum) 53 29 02 26 32 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 24 01 21 26 2 (2-3 cm) 59 29 01 26 31 3 (+ 3cm) 49 43 01 41 46 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 30 02 26 33 A2 24 32 02 28 35 A3 18 51 02 47 55 B1 13 17 03 12 22 B2 12 26 03 21 31 B3 15 36 03 32 41 C1 14 20 03 15 24 C2 23 27 25 23 30 C3 16 41 03 37 46
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ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
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ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
48
ANEXO 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales Factor Test Kruskall Wallis Valor P Sustrato 078 068 Tamantildeo 4310 0000 Sustrato x Tamantildeo 7133 0000 significa que hay diferencias significativas al 95 ANEXO 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Sustrato A (turba+perlita) 66 56 03 51 60 C (arena+turba) 40 49 04 42 55
B (Sphagnum) 53 51 03 46 56 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 37 03 32 42 2 (2-3 cm) 59 46 03 42 50 3 (+ 3cm) 49 76 03 71 81 Sustrato seguacuten tamantildeo
A1 24 43 04 37 49 A2 24 39 04 33 45 A3 18 95 04 88 102 B1 13 42 05 34 50 B2 12 53 05 45 61 B3 15 51 05 43 58 C1 14 22 05 15 30 C2 23 50 04 44 56 C3 16 78 05 70 85
49
ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
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ANEXO 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten Fuente Suma de
cuadrados GL Cuadrado
medio Coeficiente
F Valor P
A=Sustrato 4143 2 2071 796 00005
B=Tamantildeo 13980 2 6990 2686 0000 Interacciones AB
6779 4 1695 651 00001
Residuos 39037 150 260 Total 63534 158 indican diferencias significativas al 95 de confianza ANEXO 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 159 47 Sustrato A (turba+perlita) 66 52 02 47 58 C (arena+turba) 40 49 03 41 55 B (Sphagnum) 53 41 02 34 47 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 51 36 02 29 42 2 (2-3 cm) 59 47 02 41 52 3 (+ 3cm) 49 59 02 53 66 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 24 41 03 32 49 A2 24 41 03 32 50 A3 18 76 03 66 86 B1 13 39 04 27 51 B2 12 53 05 41 65 B3 15 53 04 42 64 C1 14 27 04 15 38 C2 23 45 03 36 54 C3 16 50 04 39 61
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
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ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
50
ANEXO 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
indican diferencias significativas al 95 de confianza
Fuente Suma de cuadrados
GL Cuadrado medio
Coeficiente F
Valor P
A=Sustrato 3879 2 1939 1175 00005
B=Tamantildeo 4567 2 2284 1384 00002 Interacciones AB
1233 4 308 187 016
Residuos 2971 16 165 Total 12650 26
ANEXO 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia Nivel Frecuencia Media Error
estaacutendar Limite inferior
Limite superior
Media total 27 671 Sustrato A (turba+perlita) 9 933 42 723 903 C (arena+turba) 9 772 42 43 609 B (Sphagnum) 9 59 42 591 771 Tamantildeo 1 (1-2 cm) 9 567 42 401 581 2 (2-3 cm) 9 821 42 637 817 3 (+ 3cm) 9 908 42 705 885 Sustrato seguacuten tamantildeo A1 3 639 74 483 795 A2 3 90 74 744 1055 A3 3 90 74 744 1055 B1 3 407 74 252 563 B2 3 45 74 294 606 B3 3 702 74 546 857 C1 3 427 74 272 583 C2 3 832 74 676 988 C3 3 783 74 627 938
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
51
ANEXO 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea Chloraea alpina Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la Regioacuten Metropolitana hasta la XI Regioacuten Su floracioacuten es desde octubre a diciembre
Chloraea barbata Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en las provincias centrales de Chile desde Valparaiacuteso hasta Nahuelbuta Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre
Chloraea bidentata (Poepp et Endl) Correa
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es en la precordillera entre Chillaacuten y Malleco Florece en verano
Chloraea bletioides Lindl
Planta perenne Su ubicacioacuten geograacutefica es desde Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde septiembre a diciembre
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
52
Chloraea cuneata Lindl
Su distribucioacuten geograacutefica es en algunos sectores de la Cordillera de Nahuelbuta Su floracioacuten es desde noviembre a diciembre
Chloraea chica Speg et Kraenzlin
Planta perenne Vive en Chile desde la IV hasta la XII Regioacuten Florece entre noviembre y enero
Chloraea chrysantha Poepp
Vive entre Valparaiacuteso y Talca Su floracioacuten es entre septiembre y noviembre
Chloraea crispa Lindl
Planta perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia preferentemente en la VIII Regioacuten en sitios arenosos tanto en valle como en la costa Su floracioacuten es desde octubre hasta enero
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
53
Chloraea cristata Lindl
Existe desde el sur de Los Vilos hasta Concepcioacuten Su floracioacuten es desde octubre a noviembre
Chloraea cylindrostachya Poepp
Planta perenne Se encuentra entre la V y X regioacuten Su floracioacuten es desde diciembre a enero
Chloraea disoides Lindl
Planta perenne Se encuentra solamente en algunos cerros del litoral chileno Su floracioacuten es desde agosto hasta septiembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea galeata Lindl
Planta perenne Crece desde Ovalle hasta Concepcioacuten y su floracioacuten es desde agosto a septiembre
Chloraea gaudichaudii Brongn
Planta perenne Vive desde las VIII hasta la XII Regioacuten y su floracioacuten es desde diciembre a enero
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
54
Chloraea gavilu Lindl
Su ubicacioacuten geograacutefica es desde la V hasta la X Regioacuten Florece en primavera
Chloraea grandiflora Poepp
Planta perenne Crece desde la V hasta la IX Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea heteroglossa Rchb
Planta pequentildea perenne Especie al parecer endeacutemica de la zona de Valparaiacuteso sin embargo uacuteltimos estudios indican que podriacutea encontrarse en Nancagua (VI Regioacuten) Florece entre noviembre y diciembre Su estado de conservacioacuten es vulnerable
Chloraea incisa Poepp
Planta perenne Su ubicacioacuten va desde Valparaiacuteso hasta Valdivia Florece desde diciembre a enero
Chloraea lamellata Lindl
Existe desde San Fernando hasta Valdivia Florece desde septiembre a noviembre
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
-
- Comiteacute Evaluador
- Dedicatoria
-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
55
Chloraea lechleri Lindl
Ubicacioacuten geograacutefica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es desde noviembre a enero Su origen es nativo
Chloraea leptopetala Reiche
Planta perenne Crece en los faldeos del Volcaacuten Antuco y en la Cordillera de la Araucaniacutea Aparentemente se encontraria en los alrededores del Parque Nacional Torres del Paine Florece de diciembre a enero
Chloraea longipetala Lindl
Planta perenne Desde la VIII hasta la X Regioacuten (Llanquihue) Florece en verano
Chloraea magellanica Hook
Planta perenne Crece desde la VII hasta la XII Regioacuten Florece desde diciembre hasta febrero
Chloraea multiflora Lindl
Su ubicacioacuten es desde Valparaiacuteso hasta Cautin Su floracioacuten es desde agosto hasta octubre
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
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-
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-
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- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
56
Chloraea nudilabia Poepp
Planta perenne Crece desde la VII hasta la X (Lanco) Regioacuten Florece entre diciembre y enero
Chloraea philippii Reichb
Hierba perenne Se ubica desde Concepcioacuten a Valdivia Su floracioacuten es de noviembre a diciembre Es una orquiacutedea nativa
Chloraea disioides var picta (Kranzl) Correa
Se encuentra en la Precordillera y Cordillera de los Andes Florece en noviembre Su origen es nativo
Chloraea prodigiosa Reichb
Planta perenne Crece desde La Rufina-San Fernando hasta Chiloeacute- isla Chonos Su floracioacuten es desde septiembre a noviembre y es endeacutemica
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
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- Comiteacute Evaluador
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- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
- Indice de Figuras
- Indice de Anexos
-
- RESUMEN
-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
- 4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
-
57
Chloraea speciosa Poepp
Se encuentra en la Cordillera de Antuco y Lonquimay Florece de septiembre a noviembre Es endeacutemica
Chloraea virescens Lindl
La distribucioacuten geograacutefica de esta especie es desde la V (Vintildea del Mar) hasta la XI Regioacuten (Ayseacuten) Es comuacuten en terrenos arenosos pedregosos terraplenes y en los bosques Vive en las provincias centrales de Chile
Chloraea viridiflora Poepp
Planta perenne Se ubica en la Cordillera de la VIII Regioacuten Florece desde diciembre a febrero
Chloraea volkmanni Phil ex Kranzl
Planta perenne Su distribucioacuten es restringida desde la VII hasta la IX Regioacuten Florece desde diciembre a enero Es endeacutemica y su estado de conservacioacuten es muy poco conocido (NOVOA et al 2006)
- PORTADA
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- Comiteacute Evaluador
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-
- INDICES
-
- Indice de Materias
- Indice de Cuadros
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-
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-
- Reacutesumeacute
-
- 1 INTRODUCCION
- 2 REVISION BIBLIOGRAFICA
-
- 21 Descripcioacuten general
- 22 Requerimientos de las orquiacutedeas
- 23 Germinacioacuten in vitro de semillas de orquiacutedeas
- 24 Propagacioacuten de orquiacutedeas selectas
- 25 Aclimatacioacuten
-
- 3 MATERIAL Y METODO
-
- 31 Material
- 32 Meacutetodo
-
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-
- 41 Nuacutemero de hojas finales
- 42 Raiacuteces iniciales
- 43 Raiacuteces finales
- 44 Altura de la planta al teacutermino de la aclimatacioacuten
- 45 Sobrevivencia
-
- 5 CONCLUSIONES
- 6 BIBLIOGRAFIA
- 7 ANEXOS
-
- Anexo 1 Composicioacuten del medio basal MURASHIGE y SKOOG (1962) y suplementos orgaacutenicos
- Anexo 2 Anaacutelisis quiacutemico de los sustratos ocupados en el estudio
- Anexo 3 Registro de temperaturas miacutenimas maacuteximas y promedios durante el estudio en sala de aclimatacioacuten y en invernadero
- Anexo 4 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable hojas finales
- Anexo 5 Tabla de medias para la variable no parameacutetrica hojas finales
- Anexo 6 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces iniciales
- Anexo 7 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces iniciales
- Anexo 8 Test no-parameacutetrico de Kruskall Wallis para la variable raiacuteces finales
- Anexo 9 Tabla de medias para la variable no-parameacutetrica raiacuteces finales
- Anexo 10 Anaacutelisis de varianza del paraacutemetro altura de plaacutentula en aclimatacioacuten
- Anexo 11 Tabla de medias para la variable parameacutetrica altura
- Anexo 12 Anaacutelisis de varianza para el paraacutemetro sobrevivencia de plaacutentulas en el periacuteodo de aclimatacioacuten
- Anexo 13 Tabla de medias para la variable parameacutetrica sobrevivencia
- Anexo 14 Cuadro descriptivo del geacutenero Chloraea
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