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Profesor Patrocinante
Dra. Marcia Costa L.
Instituto de Ciencia y Tecnología de los
Alimentos
Facultad de Ciencias Agrarias.
Extracción, caracterización parcial y determinación de propiedades
fisiológicas in vitro de fucoidina y laminarina a partir de Macrocystis
pyrifera y Durvillaea antarctica.
Tesis de Grado presentada como parte de
los requisitos para optar al grado de
Licenciado en Bioquímica y Título
Profesional de Bioquímico.
OSCAR OLIVER DÍAZ ROLDÁN
VALDIVIA – CHILE
2014
“Solo en las condiciones de mi vida diaria,
puedo estudiar donde yacen mi fuerza y mi debilidad.” Gurdjieff
AGRADECIMIENTOS
A mis padres y abuelos, que con su esfuerzo, crianza, valores, paciencia, amor y cariño, han
concebido en mi, parte de sus anhelos, pero por sobre todo, me han regalado unas grandes alas e
imaginación, para llegar lo más lejos que Dios y el destino me permitan en esta vida (humanamente
hablando).
A mis hermosos cachorros, Johny, Tomás y Gaspar, que más que simples animales, son
unos incondicionales y fieles amigos, que fecundan mi casa con alegría y son considerados como
miembros de mi familia.
A mis machos alfa (algunos no tanto) por los vacilones vividos, historias indignas e
irreproducibles, pero por sobre todo, hermandad incondicional; Pablosky, Jano, Gonzalo Iván,
“MatuSaint”, Adolfo, “abuelin” y Andrés.
No puedo dejar de mencionar además a, Lisette Yañez, Paulina Figueroa, Daniela Ampuero,
Leo Castro, Seba González, Javito Aguinaga, Pamela Burdiles, Polin Lobos, Andrea Foitzich,
Silvia Sánchez, Claudia Fuentealba, Eduardo Maureira, Claudia Roa y los “cabros del baby”.
Gracias a todos ustedes, por los agradables momentos vividos y las buenas vibras de siempre.
A mis compañeros de laboratorio, Alexandra González, Toña Sepúlveda, Yoli García y
Francisco Palma. A tesistas como, Vicky López, Karin Milling, Marta Muñoz, Gabriela, Fernando
Quezada y Olga García. A personal del Instituto, como Don Otto, Don Tito, Paula Pozo, Susana
Agüero y Erwin Ojeda. Gracias a todos, por su disposición, risas, sugerencias o facilitando material
de trabajo (…) gracias de corazón.
A mis compañeros de la carrera de Bioquímica, Jorge Torres, Cristián Marchant, Rodrigo
Sandoval, Agustín Barría, Rodrigo Carrasco, Paulina Ferrada, Magdalena Esparza, Javiera
Campos, Consuelo Geoffroy, y Vanesa Muñoz. Gracias por todo el transcurso y por esas horas de
estudio en los primeros años. Donde quiera que estén, mucha suerte a todos en sus futuros
proyectos.
A Andrea, por su apoyo y consejos incondicionales, sin duda, un pilar fundamental en los
últimos años de mi vida. Con cariño y agradecido eternamente por todo lo vivido junto a ti.
Al Profesor Dr. Patricio Godoy e Instituto de Microbiología Clínica, por su ayuda en el
desarrollo de la sección antifúngica de esta tesis, la paciencia y disposición a enseñar; muchas
gracias. No puedo dejar de lado a mis compañeras en este pasaje, Vanesa y Yoli.
A la Sra. Gloria Muñoz, QF del Hospital Base Valdivia, por su ayuda en la sección
antimicrobiana de esta tesis.
A la Profesora QF Claudia Oróstegui, por su apoyo y disposición a formar parte de este
trabajo de tesis, muchas gracias.
A mis profesoras de internado hospitalario, QF Ximena Lagos, QF Ingrid Navarrete, y QF
Eliana Sánchez, por facilitarme tiempo para dedicar al proceso terminal de titulación. A su vez, a
mis compañeros de internado perteneciente a la carrera de Química y Farmacia, Mackarena A,
Francisco A y Andy A, muchas gracias.
A los profesores, Dra. Marcia Costa, Dr. Ociel Muñoz y Prof. Mariela Horzella, por su
disposición a ayudar y corregir mis errores. Atentamente muchas gracias.
Finalmente a Francisca, por toda la ayuda brindada en la última parte de este trabajo de
tesis, por ser la mujer que eres, y por ser sinónimo de una nueva etapa en mi vida. Miles de gracias.
Este trabajo fue realizado en la Universidad Austral de Chile y fue financiado por el
proyecto FONDEF DOi 1095.
i
INDICE GENERAL
1. RESUMEN 1
1.1SUMMARY 2
2. INTRODUCCIÓN. 3
2.1 Algas marinas. 3
2.2 Algas pardas. (Reino Protista, Filum Heterokontophyta, Clase Phaeophyceae) 8
2.3 Estructura celular en algas pardas. 13
2.4 Algas Kelp 17
2.5 Macrocystis pyrifera. 17
2.6 Durvillaea antarctica. 30
2.7 Polisacáridos de reserva en algas pardas: Laminarina. 32
2.8 Polisacáridos extracelulares y de la pared celular en algas marinas. 34
2.9 Polisacárido extracelular en algas pardas: Fucoidina. 36
2.10 Importancia médica y Propiedades fisiológicas en algas marinas. 36
2.10.1 Protothecosis. 36
2.10.2 Silicosis. 43
2.10.3 Bocio. 43
2.10.4 Arseniosis. 43
2.10.5 Alergias. 43
2.10.6 Actividad Anticancerígena. 43
ii
2.10.7 Actividad Antihelmíntica. 44
2.10.8 Actividad anticoagulante. 44
2.10.9 Actividad Laxante. 44
2.10.10 Actividad antifúngica. 44
2.10.11 Actividad antiviral. 45
2.10.12 Actividad inmunológica e inflamación. 46
2.10.13 Actividad Hipolipemiante e Hipotensora. 47
2.10.14 Actividad antibacteriana. 48
2.10.15 Actividad Antioxidante 52
2.11 Digestión enzimática y método de detección de productos de hidrólisis. 57
2.11.1 Enzimas. 57
2.11.2 β – glucanos y distribución en levaduras, hongos y algas según el tipo de
enlace glucosídico que presentan. 58
2.11.3 Técnicas de detección, Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). 58
2.12 Hipótesis 61
2.13 Objetivo General 61
2.14 Objetivos Específicos 61
3. MATERIALES Y MÉTODOS. 62
3.1 Extracción de polisacáridos. 62
3.2 Detección de polisacáridos. 65
iii
3.3 Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). 65
3.4 Recolección de fracciones de polisacáridos (pick cromatográficos) desde HPLC. 66
3.5 Hidrólisis enzimática de polisacáridos. 66
3.6 Test de glucosa. 67
3.7 Ensayo del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS). 67
3.8 Determinación cualitativa de Sulfatos. 68
3.9 Determinación de la Actividad Antioxidante. 69
3.9.1 Estándares y Reactivos. 69
3.9.2 Método DPPH. 69
3.9.3 Método de Fenoles Totales. 71
3.10 Determinación de la Actividad Antibacteriana. 72
3.10.1 Cepas bacterianas. 72
3.10.1.1 Bacillus subtilis ATCC 33608. 72
3.10.1.2 Escherichia coli ATCC 25922. 72
3.10.1.3 Klebsiella pneumoniae ATCC 23357. 73
3.10.1.4 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. 73
3.10.1.5 Shigella sonnei OSP 2047 – 01. 73
3.10.1.6 Staphylococcus aureus ATCC 25923. 74
3.10.1.7 Staphylocccus epidermidis ATCC 12228. 74
3.10.1.8 Streptococcus pyogenes OSP 344 – 10. 74
iv
3.10.2 Conservación de cepas de referencia. 74
3.10.3 Activación de las cepas. 75
3.10.4 Recuento de colonias bacterianas. 75
3.10.5 Estándar de medicamentos Unasyn®, Inem® y Sulperazon®. 76
3.10.5.1 Unasyn® 76
3.10.5.2 Inem® 76
3.10.5.3 Sulperazon® 76
3.10.6 Ensayo de Sensibilidad de las cepas de referencia frente a los extractos de
Macrocystis pyrifera y Durvillaea antarctica. 77
3.10.7 Diseño experimental para la inhibición bacteriana por medio de pocillos o
discos filtro. 81
3.10.8 Análisis estadísticos. 82
3.11 Determinación de la actividad antifúngica. 82
3.11.1 Cepas fúngicas. 82
3.11.2 Cultivo de cepas fúngicas. 83
3.11.3 Ensayo de Sensibilidad de las cepas fúngicas frente a los extractos de
Macrocystis pyrifera y Durvillaea antarctica. 83
3.11.4 Diseño experimental para la inhibición bacteriana por medio de pocillos
o discos filtro. 85
4. RESULTADOS. 85
v
4.1 Extracción y detección mediante HPLC, de los polisacáridos Laminarina y
Fucoidina desde las algas Macrocystis pyrifera y Durvillaea antarctica. 85
4.2 Detección mediante HPLC, de los polisacáridos Laminarina y Fucoidina,
obtenidos por la metodología de extracción según Nakamura – Black. 90
4.3 Contenido de Laminarina y Fucoidina en los extractos algales. 92
4.4. Hidrólisis enzimática de polisacáridos. 95
4.4.1 Estandarización del método DNS (ANEXO 3.1). 95
4.5 Detección de los productos de hidrólisis de Laminarina y Fucoidina
mediante HPLC 101
4.6 Determinación cualitativa de sulfatos. 105
4.7 Determinación de la actividad antioxidante. 105
4.7.1 Estudio de Estabilidad del método DPPH Brand – Williams. 105
4.7.2 Estabilidad del ensayo DPPH en condiciones de Luz – Oscuridad. 107
4.7.3 Estabilidad del ensayo DPPH a distintas temperaturas. 107
4.7.4 Estado estacionario del ensayo DPPH a 517 nm. 111
4.7.5 Determinación de la concentración óptima a utilizar para extractos
liofilizados de Macrocystis pyrifera y Durvillaea antarctica. 111
4.7.6 % de Inhibición del radical libre DPPH (%IRL). 114
4.7.7 % DPPH remanente, EC50, TEC50 y AE. 114
4.7.8 Actividad antioxidante equivalente al Ácido ascórbico (VCEAC) y Actividad
antioxidante equivalente a TROLOX (TEAC). 119
vi
4.7.9 Método de Fenoles Totales (FT) o Método de Folin – Ciocalteu. 121
4.8 Determinación de la Actividad Antibacteriana. 123
4.9 Determinación de la actividad antifúngica. 132
5. DISCUSIÓN. 135
6. CONCLUSIONES. 142
7. BIBLIOGRAFÍA. 144
ANEXOS. 160
ANEXO 1 161
ANEXO 1.1. PROTOCOLO BLACK DE EXTRACCIÓN DE LAMINARINA
Y FUCOIDINA. 161
ANEXO 1.2. PROTOCOLO BLACK VARIANTE DE EXTRACCIÓN DE
LAMINARINA Y FUCOIDINA. 162
ANEXO 1.3. PROTOCOLO IVIN DE EXTRACCIÓN DE LAMINARINA Y
FUCOIDINA. 163
ANEXO 1.4. PROTOCOLO NUEVO DE EXTRACCIÓN DE LAMINARINA
Y FUCOIDINA. 164
ANEXO 1.5. PROTOCOLO NAKAMURA DE EXTRACCIÓN DE
LAMINARINA Y FUCOIDINA. 165
ANEXO 1.6 PROTOCOLO NAKAMURA –BLACK DE EXTRACCIÓN DE
LAMINARINA Y FUCOIDINA. 166
ANEXO 2 167
ANEXO 2.1 ESQUEMA DE RECUENTO DE COLONIAS BACTERIANAS. 167
vii
ANEXO 2.2 ENSAYO DE SENSIBILDIAD DE LAS CEPAS DE REFERENCIA
FRENTE A LOS EXTRACTOS DE MACROCYSTIS PYRIFERA Y
DURVILLAEA ANTARCTICA. 168
ANEXO 2.3 PREPARACIÓN DE DILUCIONES DE MUESTRAS DE
ESTÁNDARES DE FUCOIDINA - LAMINARINA Y MUESTRAS DE
ENSAYO DE ACTIVIDAD ANTIBIÓTICA. 169
ANEXO 3 170
ANEXO 3.1 PROTOCOLO SELECCIONADO DE LA ESTANDARIZACIÓN
DEL MÉTODO DE DNS. 170
ANEXO 4 171
ANEXO 4.1. CURVA DE CALIBRACIÓN DE FUCOIDINA. 171
ANEXO 4.2. CURVA DE CALIBRACIÓN DE LAMINARINA. 172
ANEXO 5 173
ANEXO 5.1 EC50 PARA EXTRACTO DE MACROCYSTIS PYRIFERA 173
ANEXO 5.2 TEC50 PARA EXTRACTO DE MACROCYSTIS PYRIFERA. 174
ANEXO 6 175
ANEXO 6.1 CURVA DE CALIBRACIÓN TROLOX (TEAC) 175
ANEXO 6.2 CURVA DE CALIBRACIÓN ÁCIDO ASCÓRBICO (VCEAC) 176
ANEXO 7 178
ANEXO 7.1 CURVA DE CALIBRACIÓN DE ÁCIDO GÁLICO A 765 nm
(MÉTODO DE FENOLES TOTALES). 177
viii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Esquema de clasificación del filum Phaeophyta y sus órdenes Laminariales y
Fucales. 9
Figura 2. Estructura de la pared celular en Algas pardas. 14
Figura 3. Diagrama esquemático de una célula de alga parda.. 15
Figura 4. Ciclo de vida de Macrocystis pyrifera. 21
Figura 5. Conformación anatómica general de Macrocystis pyrifera 22
Figura 6. Conformación anatómica general de Durvillaea antarctica. 31
Figura 7. Estructura del polisacárido de reserva Laminarina. 33
Figura 8. Moléculas fibrilares de la pared celular algal. 34
Figura 9. Estructura de fucoidina . 39
Figura 10: Espectro de absorción del DPPH. 70
Figura 11. Esquema representativo de las placas de antibiograma . 80
Figura 12. Cromatograma de moléculas estándar de Maltosa, Fucosa, Glucosa y
Ácido algínico. 87
Figura 13. Cromatograma de estándares. 88
Figura 14. Cromatograma de extractos algales de Macrocystis pyrifera, obtenidos
por las distintas metodologías de extracción según Deville et al. 89
Figura 15. Cromatograma de extractos algales de Durvillaea antarctica, obtenidos
por las distintas metodologías de extracción según Deville et al. 91
ix
Figura 16. Cromatograma de extractos algales de Durvillaea antarctica, obtenidos
por la metodología de extracción según Nakamura – Black. 93
Figura 17. Cromatograma extractos de protocolos Nakamura – Black del alga
Durvillaea antarctica. 94
Figura 18. Hidrólisis enzimática de estándares. 96
Figura 19. Hidrólisis enzimática de extractos algales. 97
Figura 20. Test de DNS de muestras estándar de laminarina y fucoidina. 98
Figura 21. Test de DNS de extractos algales. 99
Figura 22. Cromatograma de estándares de polisacáridos y estándares de productos
de hidrólisis. 102
Figura 23. Cromatograma de productos de hidrólisis de ensayo enzimático con la
enzima β-glucanasa. 103
Figura 24. Cromatograma de productos de hidrólisis de ensayo enzimático con la
enzima laminarinasa. 104
Figura 25. Determinación cualitativa de sulfatos. 106
Figura 26. Estabilidad ante la exposición de luz – oscuridad en el ensayo DPPH. 108
Figura 27. Estabilidad del ensayo DPPH, frente a la variación de temperatura. 109
Figura 28. Estabilidad del ensayo DPPH, frente a la variación de temperatura. 110
Figura 29. Estado estacionario del ensayo DPPH a 37°C y 517 nm. 112
Figura 30. Concentración óptima a utilizar para extractos liofilizados de
Macrocystis pyrifera y Durvillaea antarctica. 113
x
Figura 31. Antibiogramas de Extractos de protocolo nuevo de Macrocystis
pyrifera. 126
Figura 32. Antibiogramas de estándares antibióticos Inem®, Unasyn®, Sulperazon®. 127
Figura 33. Inhibción de Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus y
Staphylococcus epidermidis por efecto de las distintas diluciones de extracto de
Macrocystis pyrifera. 130
Figura 34. Actividad antifúngica de Estándar comercial de Laminarina 25 mg/ml y
Fucoidina 25 mg/ml 133
Figura 35. Actividad antifúngica para el género Aspergillus. 134
xi
INDICE DE TABLAS
Tabla I. Tres filum algales y sus características principales. 11-12
Tabla II. Principales especies de algas pardas, distribución geográfica y
principales usos. 14
Tabla III. Composición proximal en algas Phaeophyta, porcentaje expresado en
base seca. 24
Tabla IV. Composición aminoacídica en algas Phaeophyta. 25
Tabla V. Contenido de Ácidos grasos en algas Phaeophyta. (%). 26
Tabla VI. Contenido de tocoferoles (mg/kg de lípido). 27
Tabla VII. Contenido de compuestos carotenoides en algas Phaeophyta
expresado en µg/g en peso seco. 28
Tabla VIII. Concentración de polifenoles totales presentes en las algas Phaeophyta. 29
Tabla IX. Composición química de algunos fucoidanos según la especie algal. 37
Tabla X. Variación del Peso Molecular de la Fucoidina según la especie algal. 38
Tabla XI. Propiedades fisiológicas de polisacáridos de algas o de extractos algales,
reportados en humanos y otros organismos. 40
Tabla XII. Moléculas con actividad biológica en algas marinas. 41 - 42
Tabla XIII. Lista de algunas algas marinas reportadas con actividad
antibacteriana. 51- 52
Tabla XIV. Categorización de grupos antioxidantes, ejemplos de ellos y fuente
algal de la cual proceden. 54
Tabla XV. Compuesto antioxidante algal con actividad fisiológica o efecto
beneficioso para la salud. 56
Tabla XVI. Distribución de β – 1,3 glucanos en levaduras, hongos y algas. 59
xii
Tabla XVII. Modificaciones realizadas a protocolos Nakamura – Black (NB) 64
Tabla XVIII. Muestras estudiadas en ensayo de antibiograma. 79
Tabla XIX. % Inhibición del radical libre DPPH 115
Tabla XX. % DPPH remanente según concentración de extracto algal utilizada. 117
Tabla XXI. % DPPH remanente según tiempo de ensayo DPPH. 118
Tabla XXII. EC50, TEC50 y AE de extractos de alga Macrocytis pyrifera. 120
Tabla XXIII. VCEAC y TEAC para extractos de Macrocystis pyrifera y
Durvillaea antarctica. 122
Tabla XXIV. Fenoles Totales en extractos de Macrocytis pyrifera y Durvillaea
antarctica. 124
xiii
LISTADO DE ABREVIATURAS.
AE Eficiencia antiradical
CST Caldo Soya Tripticasa
D Dictiosoma
DA Durvillaea antarctica
DNS Ácido 3,5 – Dinitrosalícilico.
DPPH 2,2 – Difenil – 1 – picrilhidrazilo
EPOC Enfermedad pulmonar obstructiva crónica
EROS/ROS Especies reactivas de oxígeno
F Plasmodesmo
Fib Microfibrillas de DNA
GLUT4 Transportador de glucosa tipo 4
GSH Glutatión reducido
HDL Lipoproteína de alta densidad
IR Índice de refracción
% IRL % Inhibición del radical libre
ITU Infección tracto urinaria
LCAT Lecitina colesterol acil transferasa
LDL Lipoproteína de baja densidad
LH Lipasa Hepática
LPL Lipoproteína lipasa
xiv
M Mitocondrias
MP Macrocystis pyrifera
N Núcleo
Nu Nucléolo
P Prenoide
Ps Saco prenoideal
PVDF Membrana de transferencia fluoruro de polivinilideno
TCA Ácido tricloroacético
TEAC Actividad equivalente al TROLOX
TROLOX Ácido 6 – hidroxi – 2, 5, 7, 8 – tetrametilcromano – 2 – carboxílico
V Vacuolas
VCEAC Actividad equivalente al ácido ascórbico
VIH Virus de la inmunodeficiencia adquirida
VMT Virus del mosaico del tabaco
1
1. RESUMEN
Los polisacáridos son moléculas biológicas que cumplen diversas funciones en los organismos
vivos. Algunas de estas moléculas poseen actividad antiglicémica, antioxidante, anticoagulante,
antibacteriana y antifúngica, entre otras.
El objetivo de este trabajo de tesis fue extraer y detectar polisacáridos con capacidad
antibacteriana, antifúngica y antioxidante desde las algas pardas Macrocystis pyrifera y Durvillaea
antarctica. La extracción de los polisacáridos laminarina y fucoidina, fue realizada a base de los
protocolos propuestos por Deville et al., la detección de estos fue llevada a cabo por la técnica de
HPLC – IR.
Para determinar la capacidad antibacteriana de ambos polisacáridos, se aplicó la técnica de
antibiograma en ciertas cepas bacterianas, tales como Bacillus subtilis ATCC 33608, Escherichia
coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 23357, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853,
Shigella sonnei OSP 2047-01, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus epidermidis
ATCC 12228 y Streptococcus pyogenes OSP 344-10, siendo ésta positiva utilizando extractos de
Macrocystis pyrifera, en cuanto a la aparición de halos de inhibición, para Escherichia coli,
Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis y Bacillus subtilis.
Para la determinación de la capacidad antifúngica, se trabajó con cepas clínicas del género
Candida y Aspergillus, resultando esta prueba negativa en cuanto a la aparición de halos de
inhibición, en todos sus casos.
La determinación de la capacidad antioxidante fue positiva para los extractos de laminarina
y fucoidina, efectuándose ésta por medio de la técnica de DPPH (Método de Brand-Williams) y
Fenoles totales (Método Folin-Ciocalteu).
2
1.1 SUMMARY
Polysaccharides are biological molecules that fulfill different functions in living
organisms. Some of these molecules have antiglycemic, antioxidant, anticoagulant, antibacterial
and antifungical activities.
The objective of this thesis, was to extract and detect polysaccharides with antimicrobial
and antioxidant capacity from brown algae Macrocystis pyrifera and Durvillaea antarctica. The
extraction of this polysaccharides was done from the basis of the extraction method proposed by
Deville et al., the detection of this molecules was realized by HPLC – IR technique and the
application of molecular exclusion columns.
To determine the antibacterial capacity from both polysaccharides, it was applied the
antibiogram technique on certain bacterial strains, such as Bacillus subtilis ATCC 33608,
Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 23357, Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853, Shigella sonnei OSP 2047-01, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus
epidermidis ATCC 12228 and Streptococcus pyogenes OSP 344-10, being positive (in matters of
inhibition halos) to Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Saphylococcus epidermidis and
Bacillus subtilis.
For the determination of antifungic activity, clinical strains of the gender Candida and
Aspergillus were used, being this negative (in matters of inhibition halos) in all the cases.
The determination of the antioxidante capacity, was positive for the laminarin and fucoidan
extracts, being this realized by the DPPH technique (Brand-Williams method) and Total phenols
(Folin-Ciocalteu method).
3
2. INTRODUCCIÓN.
2.1 Algas marinas.
Las algas marinas son un grupo grande y heterogéneo de organismos vegetales, unas 50000
especies, entre los que se cuentan desde especies unicelulares hasta plantas enormes que pueden
medir sobre 50 metros (Ortiz, 2011). Además, estos organismos se clasifican como protistas
fotótrofos, donde se incluyen todos los eucariontes sin verdaderos tejidos ni órganos. 1
Desde el punto de vista morfológico, las algas marinas son organismos estructuralmente
simples, sin embargo, para compensar tal limitación han desarrollado eficientes mecanismos
fisiológicos de respuesta, cuyas modificaciones a menudo presentan valor adaptativo. En este
sentido, los valores calóricos y constituyentes energéticos presentan variaciones ligadas con las
estrategias de desarrollo y consiguiente adecuación biológica de las especies (Lewin, 1981).
Adicionalmente, se considera a las algas marinas, como vegetales acuáticos y productores
primarios, responsables de alrededor del 80% de la producción del oxígeno atmosférico. Su
organización biológica es sencilla, pudiendo ser protofitos o talófitos; pueden presentar una
diversidad pigmentaria que ha sido aprovechada como parámetro para su clasificación. De acuerdo
a su hábitat, se las puede encontrar tanto en el plancton, neuston, como en el bentos (Wratten y
Faulkner, 1977).
Las algas marinas viven en dos tipos de condiciones muy distintas: unas lo hacen flotando en
las capas más superficiales del agua, son unicelulares y se las conoce con el nombre de algas
plantónicas; las otras viven adheridas a rocas u otros sustratos, y se las conoce con el nombre de
1 Brown Algae 3G. Coastal and Marine Life.
4
Algas bentónicas (Santelices, 1991). La distribución, el asentamiento, el crecimiento y la
propagación de las algas dependen directamente de las corrientes oceanográficas, al igual que su
estructura fisiológica.
Las algas bentónicas por su parte, crecen fijas a un sustrato. Hoy día, ese sustrato puede ser
artificial, permitiendo el desarrollo de una tecnología con vistas al máximo aprovechamiento de
los recursos algológicos. En la naturaleza, en tanto, el sustrato se localiza preferentemente en la
región litoral (Neushul y Luning, 1978).
Las algas del bentos (bentónicas) son macroscópicas y presentan una gran variedad de formas
y colores. En consideración a la mayoritaria síntesis de un determinado pigmento, se pueden
distinguir a grandes rasgos en tres grandes filum, a saber: algas verdes (Chlorophyta), algas pardas
(Phaeophyta) y algas rojas (Rhodophyta) (Hay et al., 1986).
Es relevante mencionar que, no todas las especies de algas presentan el color típico del grupo
al cual pertenecen, así por ejemplo, Gymnogongrus furcellatus es un alga roja de color pardo.
Hay diversos factores que pueden enmascarar o alterar el color de una misma especie, como
por ejemplo, la presencia simultánea de otros pigmentos, la intensidad de la radiación solar, el
momento del ciclo de vida del alga, la presencia de órganos reproductores, etc. (Wheeler, 1980).
En el litoral, las algas marinas bentónicas pueden ubicarse en diferentes zonas, tales como:
supramareal, inframareal e intermareal, que es la zona más afectada por los cambios de
temperatura, humedad y salinidad, debido al efecto de las mareas.
En Chile central, se han descrito para la zona intermareal tres cinturones permanentes de algas
y varios cinturones estacionales (Santelices, 1981). Los tres cinturones permanentes incluyen una
franja de algas calcáreas crustosas (Lithophyllum lithothamnion), un cinturón de algas pardas
5
formado por poblaciones de Lessonia nigrescens y Durvillaea antarctica y un cinturón de algas
crustosas (Codium dimorphum, Gelidium spp), con talos rastreros y coalescentes que forman una
cubierta vegetal continua.
El análisis de los factores causales de la organización de estos cinturones, indica que su límite
superior está regulado por factores abióticos, su límite inferior por presión de pastoreo, mientras
que su estructura interna (importancia relativa de las especies con morfología semejante), está
regulada por la competencia inter e intraespecífica (Wylie y Paul, 1988).
Las algas marinas bentónicas, sólo usan el sustrato como lugar de fijación. Tanto los nutrientes,
como el oxígeno se encuentran disueltos o en suspensión en el agua, la cual con su constante
agitación, ayudada por el flujo y reflujo, los pone a disposición de la planta. Este intercambio entre
el alga y el agua que la circunda, se ve facilitado si la planta está adherida a un sustrato y si su talo
opone resistencia, en caso contrario, este proceso se interrumpe y el alga muere.
En lo que respecta a su actividad fotosintética, las algas bentónicas producen una variada gama
de compuestos orgánicos, los cuales se acumulan principalmente en sus paredes celulares. Se ha
demostrado que la composición química de las algas sufre variaciones, las que pueden estar
relacionadas con los cambios estacionales, estado de desarrollo, ubicación geográfica, etc. (Ramus,
1990, Reed et al., 1985, Steinberg, 1989).
Por otra parte y respecto a la importancia industrial de las algas, podemos mencionar que; la
industria mundial se abastece de cantidades considerables de algas de distintos tipos, con miras a
la confección de una variedad de productos que ayudan al hombre a vivir mejor. Entre las algas de
mayor utilización se debe nombrar a especies de los géneros Gracilaria y Gelidium, ocupadas en
la obtención de agar – agar; Iridae, para la obtención de carragenanos y Macrocystis, Lessonia y
6
Gymnogongrum para la producción de alginatos (Abbott, 1979). En el caso específico de
Macrocystis pyrifera, el producto extraído más importante, tanto por su volumen como por su uso
es el ácido algínico, un polímero coloidal de ácido manurónico y gulurónico. Las aplicaciones del
ácido algínico son múltiples, como por ejemplo, como espesante, emulsionante, estabilizante de
alimentos, fármacos, bebidas, textiles y muchos otros productos (Iturriaga y Hope, 1977, Kajiwara
et al., 1990).
En el plano ecológico, las poblaciones de algas bentónicas en general y de Macrocytis pyrifera
en particular, forman un ambiente de gran analogía con el bosque y con ello proveen de alimento,
protección y sustrato de asentamiento a numerosas otras plantas y animales marinos; a su vez,
muchos de los peces y moluscos asociados a este “bosque”, son comestibles por los humanos. Aún
más, la producción orgánica de Macrocystis, fuera de la consumida por erizos y peces herbívoros,
eventualmente se transforma en material arrastrado, que a su vez sirve de alimento a los otros
organismos que viven fuera de la pradera de Macrocystis. Después que un alga adulta de este tipo
desaparece como consecuencia del pastoreo, desgarro u otro accidente, la iluminación del fondo
generalmente aumenta, lo que facilita el poblamiento de la zona del disco con otros ejemplares
juveniles de la misma especie preferentemente, antes que por otras especies (Parker, 1966. Gerard
et al., 1976. Kobayashi, 1989).
En Chile existen aproximadamente 550 especies de algas bentónicas, aunque las conocidas
ampliamente por la población representan menos del 1 % de ellas. Las especies más comunes son
exportadas como materia prima , usadas internamente en las industrias de alginatos y agar, y en
menor grado consumidas como alimentos (Chapman y Chapman, 1980); pero durante los últimos
años ha aumentado significativamente la importancia económica y social de este recurso natural
renovable.
7
Las algas en general constituyen un alimento sano y completo, perfecto para nuestra época;
en la cual, el pésimo hábito alimenticio, el consumo de alimentos altamente procesados, y el exceso
en la utilización de sustancias químicas en la agricultura, se desvirtúan el sentido de la nutrición,
además de debilitar el organismo.
Investigaciones realizadas en el extranjero señalan que la ingesta de algas de manera habitual,
provocan efectos favorables en la salud, relacionando los componentes químicos derivados de la
biosíntesis de las células vegetales marinas con dichos efectos; por lo tanto, moléculas como
polifenoles, ácidos grasos esenciales, pigmentos, fitoestrógenos, proteínas, vitaminas y minerales;
son objeto de acuciosos estudios y son buscados incesantemente para ser utilizados como base de
alimentos funcionales y saludables (Chan , 1997). Es decir, la gran variedad de componentes
nutricionales que conforman las algas propician la formulación y desarrollo de nuevos alimentos,
los cuales por sus propiedades físicas, químicas y biológicas pueden ayudar a una nutrición
adaptada a cada caso o situación fisiológica individual, contribuyendo a mejorar la salud y
bienestar, junto con prevenir o hacer más tolerable muchas enfermedades como cáncer de colon,
arteriosclerosis, obesidad y problemas cardiovasculares entre otras (Sanz, 2000).
No obstante, la explotación de las algas a nivel nacional ha sido mínima perdiendo con esto la
optimización de procesos, productos industriales y agrícolas (Chapman y Chapman, 1980). En
menor grado se les ha considerado como una importante fuente de nutrientes esenciales para una
alimentación sana; atendiendo a su aporte energético, fibra dietaría (Lahaye, 1991) y los bajos
contenidos de lípidos, principalmente ricos en ácidos grasos poliinsaturados ω3 (Khotimchenko,
2002), lo que permite incluirlas en dietas especiales. Son muy pocos los productos en nuestro
mercado que cumplen con las características de ser beneficiosos para los consumidores con
carencias fisiológicas y nutricionales especiales, y los existentes lo son gracias a que se le ha
8
añadido una sustancia específica, cuyos efectos favorables han sido científicamente probados. Pero
en el caso particular de las algas, éstas podrían llegar a constituir un alimento funcional por sí
mismo; es decir, no sería necesario enriquecerlas.
2.2 Algas pardas. (Reino Protista, Filum Heterokontophyta, Clase Phaeophyceae)
Las algas pardas son un importante grupo de plantas que están clasificadas en
aproximadamente 265 géneros, con más de 1500 especies (Bold et al., 1985). Ellas derivan su
coloración característica de una gran cantidad de carotenoides de fucoxantina (que otorga la
coloración parda), contenidos en cloroplastos y de la presencia de varios taninos propios de la
especie. Las algas pardas se desarrollan en regiones temperadas a subpolares, donde exhiben la
mayor diversidad en especies y expresión morfológica (Lee, 1989).
La clase Phaeophyceae está dividida en ordenes, que subsecuentemente está dividida en
familias y luego éstas en géneros (13 en esta división) y especies (Bold et al., 1985). Desde el punto
de vista de la bioabsorción, sólo los órdenes Laminariales y Fucales son de importancia (Figura 1)
(Davis et al., 2003).
Ambos órdenes son abundantes en la naturaleza e incluyen las algas estructuralmente más
complejas. Laminariales son colectivamente y comúnmente denominadas como “kelp” y son
cultivadas a gran escala para fines comerciales (propiedades gelificantes, emulsificantes para
polvos, propiedades estabilizantes en cerámica, entre otros.) (Chapman, 1980). El orden Fucales,
es un amplio y diverso orden, con una gran variación morfológica. Por ejemplo, la familia
Sargassaceae contenida en él, es bien conocida por el género algal Sargassum, que se encuentra
en aguas tropicales del Mar de Sargasso.
9
Figura 1. Esquema de clasificación del filum Phaeophyta y sus órdenes Laminariales y
Fucales. De estos últimos se desprenden las familias respectivas que lo componen. Extraído de
Bold et al., 1985.
10
La Figura 1 contiene alguno de los géneros y especies objeto de mayor estudio científico y por su
especial capacidad de absorber metales pesados. (Davis et al., 2003).
Es importante señalar que las algas, son distintas del filum Cyanophyta, clase
Cyanophyceae, o algas verde – azuladas, que también son organismos oxígenicos fotótrofos, pero
corresponden a eubacterias y evolutivamente se diferencian de las algas (Davis et al., 2003).
Si comparamos las algas pardas, con otras clases de algas, nos encontramos con que muchas
de ellas son microscópicas en tamaño y son por lo tanto, consideradas como microorganismos,
muchas formas de algas son macroscópicas en términos de morfología. Estas formas coloniales de
algas funcionan como “agregados celulares”, donde ellas comparten funciones y propiedades
comunes, incluyendo los productos de almacenamiento que ellas utilizan, así como las propiedades
estructurales de sus paredes celulares. (Stumm et al., 1996).
Existen variadas características para clasificar un alga, incluyendo la naturaleza de la
clorofila, la composición química de la pared celular y flagelación. Una característica común es
que todos los tipos de alga contienen clorofila; sin embargo, la presencia de fitopigmentos distintos
a la clorofila, es particular de cada filum/división algal. La naturaleza del polímero de reserva
sintetizado por fotosíntesis, es también clave a la hora de clasificar un alga. Según lo anterior, es
factible clasificar a los organismos algales, en los filum; Cyanophyta, Prochlorophyta,
Phaeophyta, Chlorophyta, Charophyta, Euglenophyta, Chrysophyta, Pyrrhophyta, Cryptophyta y
Rhodophyta, los cuales se contienen en la Tabla I, según presenten o no pared celular, resaltando
sus características más particulares. (Bouck, 1965).
11
Tabla I. Tres filum algales y sus características principales.
Filum Nombre
común
Pigmentos Producto de
almacenamiento
Pared
Celular
Flagelos
Chlorophyta Algas
verdes
Clorofila
a,b,α, β y γ –
carotenos y
xantofilas.
Almidón Celulosa,
Glucosidos de
hidroxiprolina,
xilanos y
manosa; o
pared celular
ausente,
calcificada en
algunos casos.
Presente
Phaeophyta Algas
pardas
Clorofila a,
c, β –
caroteno y
fucoxatina,
más otras
xantofilas.
Laminarina,
manitol.
Celulosa,
ácido algínico
y muco –
polisacáridos
sulfatados
(fucoidina)
Presente
Extraído y adaptado de Bold et al., 1985.
12
Tabla I. (Cont.) Tres filum algales y sus características principales.
Rhodophyta
Algas rojas
Clorofila a;
R y C –
ficocianinas;
R y B –
ficoeritrina,
xantofilas y
α β
carotenos.
Almidón
floridiano.
Celulosa,
xilanos,
polisacáridos
sulfatados
(galactanos).
Ausente.
Extraído y adaptado de Bold et al, 1985.
13
En el filum Phaeophyta (algas pardas), el polisacárido laminarina es el principal producto
biosintético de almacenamiento, mientras que en Rhodophyta (algas rojas) el almidón floridiano es
el principal producto. Los flagelos están ausentes en Rhodophyta, pero si se encuentran presentes
en Chlorophyta y Phaeophyta. (Kylin, 1915).
Una pared celular algal típica de Phaeophyta, Rhodophyta y muchas Chlorophyta, está
compuesta de un esqueleto fibrilar y una matriz amorfa. El esqueleto fibrilar de mayor
preponderancia dentro de estos filum, es el de celulosa. Ésta puede ser reemplazada por xilano en
Chlorophyta y Rhodophyta, en adición de manosa en Chlorophyta.
El filum Phaeophyta se caracteriza por una matriz predominante en ácido algínico o alginato,
con una menor proporción de polisacáridos sulfatados (fucoidina) (Figura 2), mientras que
Rhodophyta contiene una cierta cantidad de galactanos sulfatados (carrageninas). Ambas
Phaeophyta y Rhodophyta contienen las matrices de polisacáridos amorfas más grandes dentro de
los filum mencionados (Haug et al., 1967).
2.3 Estructura celular en algas pardas.
Una célula de alga parda típica, corresponde a lo comprendido en la Figura 3. La envoltura
del cloroplasto (Ce) contiene los cloroplastos que poseen tres tilacoides por banda. Esta estructura
(conocida como plastidio) almacena material de reserva y contiene clorofila a, c1, y c2.
Adicionalmente a la envoltura del cloroplasto, los cloroplastos se encuentran rodeados por las dos
membranas de retículo endoplasmático (Cer). La membrana externa, que contiene a su vez una
membrana interna, es descontinuada o interrumpida por la envoltura nuclear (Ne) en los órdenes
Fucales y Laminaria; sin embargo ésta es continua (Figura 3) en el caso de las algas pardas, orden
Ectocarples (Brook y Madigan, 1991).
14
Figura 2. Estructura de la pared celular en Algas pardas. Extraído de Shiewer et al., 2000.
15
Figura 3. Diagrama esquemático de una célula de alga parda. Envoltura del cloroplasto (Ce),
retículo endoplasmático cloroplástico (Cer), retículo endoplasmático (Er), envoltura nuclear (Ne),
DNA fibrilar (Fib), Nucléolo (Un), Núcleo (N), prenoide (P), saco del prenoide (Ps), dictiosoma
(D) (también conocido como aparato de Golgi o dictiosoma de golgi), mitocondria (M), vacuola
(V), plasmodesmo (F), pared celular (Cw), centriolos (Cen). Extraído de Bouck, 1965.
16
Aunque gran parte de las funciones celulares algales, son codificadas por el DNA, algunas
proteínas organelares son codificadas dentro del cloroplasto. Dentro del cloroplasto, encontramos
microfibrillas de DNA (Fib) relacionadas directamente con los plastidios. La organización del
DNA en este caso, puede ser lineal o circular y se encuentra unido a las membranas del tilacoide.
Como en todos los eucariontes, el DNA es almacenado en el nucléolo, (Nu) y éste a su vez en el
núcleo (N) celular. El prenoide (P) es responsable de la fijación de O2 y de la formación de
productos de almacenamiento. Éste es contenido por el saco prenoideal (Ps) y se extiende hacia
afuera del retículo endoplasmático del cloroplasto (Dodge, 1973).
La producción y secreción de polisacáridos acontece en el dictiosoma (D), también llamado
aparato de Golgi o dictiosoma de Golgi. Las mitocondrias (M) es el lugar donde ocurre la
respiración celular, con subsecuente síntesis de ATP. (Dodge, 1973)
La principal función de las vacuolas (V) es el almacenamiento y transporte de variadas
macromoléculas dentro o hacia el espacio extracelular.
Una proporción significativa de estos organelos, contienen ácido algínico, que adicionalmente
posee una función protectora (de la luz solar), al resituarse en la pared celular, mientras se
reabastece la síntesis de este ácido. (Figueira et al., 2000).
Finalmente, las células se encuentran interconectadas por plasmodesmo (F), los cuales se
encuentran presentes en gran cantidad de células (Figueira et al., 2000).
17
2.4 Algas Kelp
El kelp es un nombre genérico utilizado para denominar a las algas pardas de los órdenes
Fucales (e.i Ascophyllum nodosum, Sargassum spp. y Pelvetia spp.) y Laminariales (e.i. Laminaria
hyperborea, Macrocytis pyrifera y Nereocystis luetkaena) (Vásquez, 1999), aunque existen
algunos autores que solamente consideran dentro de este término, específicamente a las
Laminariales (Vozzhinskaya y Kuzin, 1994, Kloareg et al., 1999). Estas algas generalmente se
localizan en zonas de sustratos rocosos cercanas a las costas a profundidades no mayores de 40
metros, en aguas templadas o frías, claras y ricas en nutrientes. Las principales áreas en donde se
localiza Macrocystis pyrifera es en las costas de América del Norte y del Sur, sur de África, Nueva
Zelanda, Noruega, Escocia, Japón y Corea (Tabla II).
2.5 Macrocystis pyrifera.
Ubicación taxonómica según Silva et al., 1996.
División: Phaeophyta
Clase: Phaeophyceae
Orden: Laminariales
Familia: Lessoniaceae
Género: Macrocystis
Especie: pyrifera
18
Tabla II. Principales especies de algas pardas, distribución geográfica y principales usos
Especie Distribución Principal uso
Macrocystis Costa oeste de Norteamérica, de
la península de Monterrey a la
mitad de la Baja California, costa
oeste. Perú, Chile y Argentina.
En california: Industria del
alginato, poca producción en
forma de harina o alga
deshidratada para consumo
animal o humano farmacéutico.
Laminaria Escocia, Irlanda, Noruega,
Francia, China y Japón.
En Asia: Consumo humano.
Laminaria
hyperborea
Francia, Irlanda y Escocia. Noruega produce alginatos.
Laminaria digitata Francia, Noruega y Escocia. Alginatos
Ascophyllum
nodosum
Escocia e Irlanda, Noruega, Sur
de Nueva Escocia y Cánada.
Producción de alginatos y de
harina de kelp como forraje o
aditivo alimenticio.
Durvillaea
antarctica
Chile Exportada para alginatos a
Inglaterra y Estados Unidos
Lessonia Chile Exportada a Japón, Estados
Unidos y Cánada
Undaria Corea Consumo humano, desechos
para alginato.
Extraído de Hernández - Carmona, 1996
19
Macrocystis pyrifera es una alga de gran tamaño, comúnmente conocida como huiro, que en
ocasiones alcanza una longitud de 50 m o más, en su base se encuentra sujeta a una sustrato rocoso
por medio de un rizoide, del cual se originan el estirpe primario de la planta, que tiene apariencia
de tallo y de éste a su vez, emanan los cauloides que tienen apariencia de ramas, y a lo largo de
estos, se encuentran las estructuras flotadoras llamadas neumatocistos o aerocistos de donde se
despliegan las láminas, constituyendo cada cauloide, sus aerocistos y láminas, una fronda (Guzmán
del Próo et al., 1986). Los aerocistos sostienen las frondas y permiten que crezcan hacia la
superficie, una vez que la fronda alcanza la superficie continua creciendo y expandiéndose,
formando un denso dosel flotante. Cada planta consta de un gran número de frondas, contando
siempre con una mezcla de frondas juveniles, adultas y senescentes.
El ciclo de vida de Macrocystis pyrifera, consiste de una alternancia de generaciones
heteromórfico y difásico entre un esporofito diploide y un gametofito microscópico haploide. Las
zoosporas biflageladas se liberan de láminas reproductivas especializadas o esporofilos, situados
cerca del sujetador del esporofito maduro. La producción de esporas inicia cuando el esporofito
tiene de seis a doce meses de edad; las zoosporas germinan produciendo gametofitos dioicos. Los
gametofitos masculinos y femeninos se pueden diferenciar después de aproximadamente una
semana (en cultivos de laboratorio); los masculinos producen células biflageladas móviles
(anterozoides), mientras que los femeninos producen el óvulo, el cual se desarrolla en un embrión
después de fertilización (Guzmán del Próo et al., 1986; North, 1987). En unas cuatro semanas, el
crecimiento produce láminas diminutas apenas visibles a simple vista (1 – 2 mm de largo), 30 días
después el esporofito mide 5 a 10 cm. Las divisiones posteriores y la aparición de frondas iniciales
conducen al desarrollo de la morfología de una planta joven, con más de ocho frondas y 20 cm de
20
longitud a los 12 meses y a los 18 meses aproximadamente la planta puede cosecharse (Figura 4)
(Neushul y Haxo, 1963).
Aunque la producción de esporas es grande, sólo una pequeña fracción se fija en un sustrato
adecuado y un número aún menor sobrevive de la fase microscópica del ciclo de vida para producir
esporofitos (Dodge, 1973).
El período máximo de vida de las frondas es de aproximadamente seis meses, pero en muchas
ocasiones puede ser menor por el deterioro ocasionado por tormentas, ramoneo o condiciones
anómalas de temperatura. Una planta completa puede tener un período de vida de dos meses a
varios años, dependiendo de los factores antes mencionados, que son las principales causas de la
mortalidad de las algas (North, 1987).
Macrocystis pyrifera, es una especie característica de fondos rocosos, que forma mantos
densos en grandes extensiones (bosques), cuyo dosel (Figura 5), facilita el no tener competencia
con otras algas por la luz, pero incrementa su susceptibilidad al daño por tormentas, ya que al
entrelazarse las frondas en la superficie oponen una gran resistencia a las marejadas y entonces son
desprendidas las plantas completas. Se puede encontrar desde profundidades someras como es la
zona de mareas hasta profundidades de 40 m, cuando existe la suficiente penetración de luz. Su
distribución horizontal local frecuentemente está controlada por la disponibilidad de sustrato
rocoso (Guzmán del Bróo et al., 1986).
21
Figura 4. Ciclo de vida de Macrocystis pyrifera. Extraído de North, 1971.
22
Figura 5. Conformación anatómica general de Macrocystis pyrifera. A. Aspecto general de un
talo de Macrocystis pyrifera y partes principales que lo integran; B. Aspecto de una lámina.
Extraído de Guzmán del Bróo et al., 1986.
23
Desde el punto de vista nutricional, las algas Macrocytis pyrifera son productos bajos en
calorías, con un alta concentración de minerales (Mg, Ca, P, K y I), vitaminas, proteínas,
carbohidratos poco digestibles, fibra y bajo contenido en lípidos (Mayer, et al, 1987). La calidad
de la proteína y de los lípidos es aceptable en comparación con otras fuentes vegetales
principalmente debido al alto contenido de aminoácidos esenciales y altos valores relativos de
ácidos grasos insaturados. El perfil de aminoácidos destaca por contener elementos esenciales para
diversas especies, como alanina, leucina y lisina y no esenciales como ácido glutámico, ácido
aspártico, considerándose como una fuente de proteínas complementaria, interesante por este
aspecto. Los carbohidratos se encuentran en esta alga en forma de carbohidratos complejos o
ficocoloides (40%), estos se presentan en forma de gomas, alginatos (18 – 26%), fucoidinas (0.5 –
2%), manitol (6 – 22%). Estos tienen la capacidad de retener agua (con sus minerales) en el alga
para evitar la deshidratación (Ortiz, 2011).
En general la composición proximal (Tabla III), aminoacídica (Tabla IV), lipídica (Tabla V),
de tocoferoles (Tabla VI), de compuestos carotenoides (Tabla VII) y concentración de polifenoles
totales (Tabla VIII) en las algas M. pyrifera y D. antarctica, varía considerablemente de especie a
especie y en función de su localización geográfica, estaciones del año, exposición al oleaje y a las
corrientes, concentración de nutrientes presentes en el medio, profundidad a la que se localizan, la
temperatura, y estado de desarrollo de las algas.
24
Tabla III. Composición proximal en algas Phaeophyta, porcentaje expresado en base seca.
Algas pardas Proteínas
(% ± D.E)
Lípidos
(% ± D.E)
Cenizas
(% ± D.E)
Calorías
(kcal/100g)
Macrocystis
pyrifera
13,2 ± 0.0 0,7 ± 0,1 10,8 ± 0,2 360,3
Durvillaea
antarctica
(cochayuyo)
10,4 ± 0,6 0,8 ± 0,0 17,9 ± 0,1 332,4
Durvillaea
antarctica
(Hulte)
11,6 ± 0,1 4,3 ± 0,1 25,7 ± 0,1 318,7
Extraído de Ortiz, 2011.
25
Tabla IV. Composición aminoacídica en algas Phaeophyta.
Aminoácidos
(mg/100g base seca)
Macrocystis pyrifera Durvillaea antarctica
(cochayuyo)
Durvillaea antarctica
(Hulte)
Ácido aspártico 1338,8 ± 22,8 936,4 ± 10,2 2953,6 ± 14,1
Ácido glutámico 1827,3 ± 15,4 1642,7 ± 29,9 1485,9 ± 8,3
Serina 830,9 ± 9,6 552,7 ± 12,4 385,6 ± 4,8
Histidina 161,9 ± 6,1 867,1 ± 9,9 1743,0 ± 10,7
Glicina 664,9 ± 8,7 715,3 ± 14,1 441,7 ± 6,3
Treonina 735,4 ± 6,9 626,9 ± 15,6 421,4 ± 9,4
Arginina 944,7 ± 10,1 225,6 ± 8,1 229,8 ± 7,5
Alanina 643,8 ± 13,7 780,0 ± 10,3 1252,9 ± 9,0
Prolina 0,8 ± 0,1 0,5 ± 0,1 0,3 ± 0,0
Tirosina 425,9 ± 9,4 264,0 ± 5,8 123,1 ± 3,6
Valina 1140,2 ± 12,5 274,4 ± 11,2 281,4 ± 5,1
Metionina 1111,6 ± 10,8 170,4 ± 9,7 631,7 ± 7,7
Cistina 228,1 ± 8,3 13,9 ± 4,8 148,7 ± 4,3
Extraído de Ortiz, 2011.
26
Tabla V. Contenido de Ácidos grasos en algas Phaeophyta. (%).
Ácidos grasos Macrocytis pyrifera Durvillaea antarctica
(cochayuyo)
Durvillaea antarctica
(Hulte)
Porcentaje Materia
grasa
0,7 0,8 4,3
Total saturados 22,8 ± 0,6 26,6 ± 1,5 39,8 ± 1,4
Total
Monoinsaturados
25,2 ± 0,2 38,9 ± 2,2 33,9 ± 2,8
Total
poliinsaturados
51,4 ± 0,6 35,5 ± 3,4 28,3 ± 1,3
Total
poliinsaturados ω6
43,9 ± 0,4 22,5 ± 1,9 15,7 ± 1,1
Total
poliinsaturados ω3
5,9 ± 0,01 11,0 ± 1,4 3,8 ± 0,05
Razón ω6/ ω3 7,42 2,05 4,13
Índice de
poliinsaturación
2.3 1,3 0,7
Extraído de Ortiz, 2011.
27
Tabla VI. Contenido de tocoferoles (mg/kg de lípido)
Algas pardas α –
tocoferol
β -
tocoferol
γ -
tocoferol
γ -
tocotrienol
δ - tocoferol Tocoferoles
totales
M. pyrifera 1327 ± 4,4 91,3 ± 4,7 88,9 ± 4,0 25,2 ± 1,4 7,7 ± 1,1 1457,2 ± 11,4
D. antarctica
(cochayuyo)
179,4 ± 7,3 7,7 ± 0,5 19,4 ± 1,0 615,7 ± 8,1 245,9 ± 3,7 1112,4 ± 22,1
D. antarctica
(Hulte)
24,0 ± 1,8 16,0 ± 2,0 35,6 ± 0,7 15,3 ± 2,1 10,6 ± 1,4 167,3 ± 8,3
Extraído de Ortiz, 2011.
28
Tabla VII. Contenido de compuestos carotenoides en algas Phaeophyta expresado en µg/g
en peso seco.
Algas pardas Luteína β-Caroteno trans β-Caroteno cis
Macrocystis pyrifera 0,3 ± 0,0 10,8 ± 0,3 6,6 ± 0,1
Durvillaea antarctica
cochayuyo
1,0 ± 0,0 35,0 ± 1,6 -----
Durvillaea antarctica
Hulte
4,2 ± 0,4 58,0 ± 3,4 43,0 ± 1,0
Extraído de Ortiz, 2011.
29
Tabla VIII. Concentración de polifenoles totales presentes en las algas Phaeophyta.
(Representado en equivaletes a ppm de Acido Gálico)
Algas pardas Obtenido desde
extracto etanólico
Obtenido desde alga
fresca
Obtenido desde alga
seca.
M. pyrifera 125 83,5 96,5
D.antarctica
cochayuyo
130 55,0 198,6
D. antárctica
Hulte
127 48.7 273,7
Extraído de Ortiz, 2011.
30
2.6 Durvillaea antarctica.
Ubicación taxonómica según Silva et al., 1996.
División: Phaeophyta
Clase: Phaeophyceae
Orden: Durvillaeales
Familia: Durvillaeaceae
Género: Durvillaea
Especie: antarctica
D. antarctica, más conocida como cochayuyo, corresponde al alga de mayor consumo en
nuestro país, encontrándose en toda la costa chilena.
Las plantas pueden medir hasta 15 m de largo, son de color pardo verdoso oscuro o pardo
amarillento. Esta alga se divide en cochayuyo, que corresponde a las frondas de la planta, que
suelen medir entre 3 y 12 cm de ancho y Hulte, que representa al tallo; el cuál, generalmente se
consume sin previa hidratación. (Figura 6).
Crece adherida a rocas, mediante el rizoide, que es como una raíz que se aferra al terreno;
especialmente, en lugares de oleaje intenso y cierta profundidad. Para que toda la planta pueda
recibir la energía del sol, las frondas están formadas por cavidades llenas de aire, separadas por
tabiques, envueltas en una elástica y firme membrana; lo que les permite flotar (Buschmann et al.,
1984).
El cochayuyo como tal, destaca nutricionalmente por su equilibrada cantidad de yodo,
aproximadamente, 150 µg/100g.
31
Figura 6. Conformación anatómica general de Durvillaea antarctica, considerando frondas
laminares, estipe, disco adhesivo y frondas cilíndricas. En el extremo superior derecho se
esquematiza un corta transversal de fronda y en el extremo inferior derecho, la apariencia de un
ejemplar juvenil de la especie. Extraído de Guzmán del Bróo et al., 1986.
32
Es rico en minerales, fibra y proteínas, además, posee todos los aminoácidos esenciales. Todo esto
convierte al cochayuyo en una fuente valiosa de nutrientes; por lo cual, es ideal que se le incorpore
en la dieta habitual.
Esta alga kelp, la cual produce esporas de corta vida (1 – 2 h) (Buschmann et al., 1984), habita
expuesta a las rocas intermareales y submareales superficiales subantárticas y en el hemisferio sur
en zonas temperadas de costas rocosas (Hay, 1977). En Chile, las especies se encuentran presente
desde la región de Magallanes, extendiéndose hasta el sur. Las estipes y frondas secas de
Durvillaea antarctica han sido explotadas para el consumo humano en Chile, inicialmente por los
mapuches, anterior al establecimiento español (Masuda, 1986).
2.7 Polisacáridos de reserva en algas pardas: Laminarina.
En algas marinas (como en algas Kelp), el carbono es almacenado en unidades monoméricas
(como manitol) o en unidades poliméricas. Almacenamientos en formas poliméricas son mucho
más ventajosas que formas monoméricas, puesto que éstas últimas producen una mayor alteración
osmótica en relación a las poliméricas. (Lobban, 1985). Generalmente el manitol no se encuentra
en algas pardas, aun cuando se puede llegar a presentar hasta en un 30% en relación al peso seco
de ésta.
La laminarina, el segundo mayor polisacárido de reserva en algas pardas (Figura 7), fue
inicialmente caracterizado por Schmiedeberg (1885), desde una mezcla de polisacáridos. La
glucosa en esta moléculas se encuentra en la forma β (que significa que el grupo hidroxilo presente
en el C1, el carbono quiral, se encuentra presente por sobre el plano en una proyección de Haworth).
Los enlaces presentes en este polisacárido, corresponden a uniones β (1 – 3) y β (1 – 6) en menor
proporción.
33
Figura 7. Estructura del polisacárido de reserva Laminarina (principalmente con uniones β (1
– 3)), consistente en dos tipos de cadenas. En (a), el manitol se encuentra unido al extremo terminal
(cadenas – M), mientras que en (b), la glucosa está unida al extremo terminal (cadenas – G).
Extraído de Percival y McDowell, 1967.
34
Dos clases de cadenas de Laminarina puede existir, la cadena – M, con manitol en el extremo
terminal y la cadena – G, con presencia de glucosa en su extremo terminal (Percival y Mc dowell,
1967). La cantidad que puede llegar a almacenarse de este polisacárido depende de múltiples
factores en el alga, entre los cuales se consideran la etapa de crecimiento, tejido algal, condiciones
de reproducción, condición de luminosidad, período del año y condiciones medioambientales en
general.
2.8 Polisacáridos extracelulares y de la pared celular en algas marinas.
La pared celular algal está formada por al menos dos membranas diferentes. La más interna
consiste de un esqueleto microfibrilar que otorga rigidez a la pared (Figura 2). La membrana
externa es una matriz amorfa (Kreger y Levin, 1962). Existe cierta evidencia que la matriz no
penetra las microfibrillas, pero sí se encuentra unida a la membrana más interna por uniones de
hidrogeno (Mackie y Preston, 1974). La membrana interna microfibrilar, se encuentra comprimida
con un polímero de celulosa (homopolímero de glucosa, con uniones β (1 – 4)) (Figura 8a). Dos
otras moléculas fibrilares, xilano (polisacárido constituido por uniones β (1 – 3) de D – xilosa y
diversas ramificaciones y sustituciones y manano (oligosacárido de D – manosa con uniones β (1
– 4)) son constituyentes principales en algas rojas y verdes (Figura 8b y 8c). Finalmente, el alginato
contribuye a la fuerza de la pared celular de algas pardas, en adición a otorgarle flexibilidad
(Smidsrod y Draget, 1996). Incluso si el alginato está presente dentro de la membrana más interna,
la celulosa se mantiene como el principal componente estructural. La fucoidina no sólo se
encuentra presente en la matriz, sino que también en la pared celular interna. (Chapman, 1980).
35
Figura 8. Moléculas fibrilares de la pared celular algal. (a) Celulosa, homopolisacárido de glucosa
con uniones β (1 – 4), (b) uniones estructurales β (1 – 3) y β (1 – 4) presentes en xilano de algas
rojas, y (c) manano, oligosacárido de manosa con uniones β (1 – 4) de algas verdes. Extraído de
Percival y McDowell et al., 1967.
36
2.9 Polisacárido extracelular en algas pardas: Fucoidina.
La molécula de laminarina fue inicialmente aislada por Kylin (1915), y de ahí en adelante ha
sido encontrada en numerosas especies de la familia Laminariaceae (Figura 1), con porcentajes de
masa seca de entre 5 – 20 % (Black, 1953).
La fucoidina es un heteropolisacárido ramificado, con una composición química (Tabla IX) y
peso molecular variable (Tabla X) según la especie algal que se trate y al cual se le atribuyen
múltiples actividades fisiológicas. Está constituido principalmente por L – fucosa (Figura 9); una
hidrólisis ácida de la fucoidina, puede liberar concentraciones considerables de D – xilosa, D –
galactosa y ácido úrico, entre otros (Mackie y Preston, 1974).
2.10 Importancia médica y Propiedades fisiológicas en algas marinas.
Las distintas especies de algas marinas poseen una serie de propiedades o cualidades,
atribuibles polisacáridos (Tabla XI) u otras moléculas con actividad biológica (Tabla XII), que
resultan fisiológicamente favorables para el hombre, sin embargo, no se debe olvidar que hay
algunas de ellas que le son patógenas. De las enfermedades y propiedades fisiológicas producidas
por la acción de algas marinas, se pueden mencionar las siguientes:
2.10.1 Protothecosis. Enfermedad causada por un alga unicelular del Género Prototheca
(Chlorophyceae: Chlorococcales), que carece de clorofila, parecida a una levadura pero que se
reproduce por la formación de endospora (Nosanchuk y Geenberg, 1973). Diferentes especies de
Prototheca han sido aisladas de lesiones humanas como bursitis, infecciones secundarias a
bacterias, infecciones de la piel, lesiones nodulares en la nariz y en inflamaciones del tracto
digestivo con diarrea crónica (Kaplan, 1978, Venezio et al., 1982).
37
Tabla IX. Composición química de algunos fucoidanos según la especie algal.
Alga parda Composición química (proporciones)
F. vesiculosus Fucosa, sulfato
F. evanescens C. Ag. Fucosa/sulfato/acetato (1/1.23/0.36)
F. distichus Fucosa/sulfato/acetato (1/1.21/0.08)
F. serratus L. Fucosa/sulfato/acetato (1/1/0.1)
Lessonia vadosa Fucosa/sulfato (1/1.12)
Macrocystis pyrifera Fucosa/galactosa (18/1), sulfato
Pelvetia wrightii Fucosa/galactosa (10/1), sulfato
Undara pinnatifida (Mekabu) Fucosa/galactosa (1/11), sulfato
Laminaria angustata Fucosa/galactosa/sulfato (9/1/9)
Adenocystis utricularis Fucosa/galactosa/manosa, sulfato
Spatoglossum schroederi Fucosa/xilosa/galactosa/sulfato (1/0.5/2/2)
Hizikia fusiforme Fucosa, galactosa, manosa, xilosa, sulfato
Sargassum stenophyllum Fucosa, galactosa, manosa, glucosa, xilosa,
sulfato.
Extraído de Kaplan, 1978.
38
Tabla X. Variación del Peso Molecular de la Fucoidina según la especie algal.
Peso Molecular Fucoidina Especie algal
13 KDa Ascophyllum nodosum
16 KDa Ascophyllum nodosum
25 KDa Hizikia fusiforme
100 – 180 KDa Fucus vesiculosus (Laboratorio Sigma)
160 KDa Fucus vesiculosus (nativa)
189 KDa Laminarina japonica
200 KDa Cladosiphon okamuranus
950 KDa Hizikia fusiforme.
Extraído de Kaplan, 1978.
39
Figura 9. Estructura de fucoidina, heteropolisacárido ramificado de L – fucosa, éste último como
el constituyente principal y con predominantes uniones α (1 – 2). Extraído de Percival y McDowell
et al., 1967.
40
Tabla XI. Propiedades fisiológicas de polisacáridos de algas o de extractos algales,
reportados en humanos y otros organismos.
Actividad Sustancia Activa
Anticoagulante, Antitrombótica Polisacáridos sulfatados, Fucoidanos de Ascophyllum y
otras algas pardas.
Anticoagulante Derivados de dextranos, y fracciones de fucoidanos de
algas pardas.
Antitumoral y antiproliferativa en casos
de cáncer.
Fucoidanos, polisacáridos sulfatados de Ascophyllum.
Antioxidante Pigmento fucoxantina de algas pardas asiáticas: Undaria
saragassum, Hijikia.
Antioxidante Función compartida con otros polisacáridos solubles en
agua, como diversas sales de alginato sulfatado y
manuronato.
Disminución de la absorción intestinal
de glucosa e insulina en cerdos.
Polisacáridos extraídos o alginatos de algas Euchema
cottonni, Laminaria digitata, Palmaria palmata.
Actividades inmunomodulatorias Polisacáridos extraídos con aguas calientes, de algas
pardas en Japón; Hijikia y Laminaria japonica.
Extraído de Cruz – Suárez et al., 2010.
41
Tabla XII. Moléculas con actividad biológica en algas marinas.
Moléculas con actividad biológica Actividad específica.
Proteínas Fuente de aminoácidos esenciales.
Elementos de comunicación intercelular.
Actividad antiviral
Actividad antimicrobiana
Actividad antiinflamatoria
Actividad antioxidante
Ácidos grasos poliinsaturados Actividad antibiótica
Actividad antifúngica
Pigmentos Actividad antiviral
Actividad Neuroprotectora
Actividad antiobesidad
Actividad antiangiogénica
Actividad anticáncer
Extraído desde Chojnacka et al., 2012.
42
Tabla XII (Cont.).
Polifenoles Potente antioxidantes.
Actividad antimicrobiana.
Actividad antiviral.
Actividad antialérgica
Minerales Promotor del crecimiento
Hormonas de crecimiento vegetal Control sobre la división celular
Extraído desde Chojnacka et al., 2012.
43
2.10.2 Silicosis. Cuando es producida por algas, consiste en una irritación pulmonar que causa la
descompensación de las fibras del tejido conectivo; frecuentemente se presenta cuando el personal
que trabaja con tierra de diatomeas lo hace sin usar mascarilla, con lo cual se produce la aspiración
de polvo de silicio (Beskow, 1978).
2.10.3 Bocio. Se han reportado algunos casos de bocio atribuibles a dieta por algas; en Japón se
produjeron casos de bocio por la ingestión de exceso de yodo contenido en tabletas de algas, casos
que fueron remediados simplemente disminuyendo la ingesta (Liewendahl y Torula, 1972).
2.10.4 Arseniosis. El alga Hizika (Phaeophyceae: Fucales), posee una alta concentración de
arsénico y se ha observado que en ratas causa envenenamiento cuando se las consume en gran
cantidad; sin embargo, no se han observado casos clínicos en humanos (Watanabe et al., 1980).
2.10.5 Alergias. El alga verde – azulada Lyngbya majuscula, causa una dermatitis en nadadores
cuando se produce un contacto severo, especialmente en climas templados. De esta especie se han
aislado dos toxinas que causan dermatitis; la debromoaplysiatoxina y la lyngbyatoxina A. Esta
causan inflamación de las membranas mucosas de los ojos y nariz y reacciones en la piel, con
producción de ampollas (Moore, 1977). La diatoma Fragilaria striatula (Fragilariales), también ha
sido implicada como productora de dermatitis alérgica (Hashimoto, 1979).
2.10.6 Actividad Anticancerígena. Hay informes que muestran evidencias de actividad antitumoral
en especies de los Géneros Sargassum y Laminaria (Phaeophyceae). Se logró aislar algunos
compuestos que al ser probados contra el sarcoma de rata 180 y contra tumores leucémicos,
demostraron una moderada inhibición del crecimiento (Yamamoto et al., 1982, Bhakuni et al.,
1976, Chenieux et al., 1980, Mayer y Panick, 1984, Chong y Parish 1985, Zea et al., 1986).
44
2.10.7 Actividad Antihelmíntica. El alga roja del Género Digenea (Ceramiales), es conocida como
un vermífugo eficaz en contra de Ascaris lumbricoides. El principio activo es el ácido Kainico que
a la dosis de 5 a 10 mg, fuerza al parásito a salir del huésped sin producir efectos colaterales. La
actividad se produce porque el principio activo causa parálisis neuromuscular y el gusano pierde
la habilidad de mantenerse en posición contra la acción del intestino delgado, siendo arrastrado
junto con las deposiciones del paciente (Hoope, 1979).
2.10.8 Actividad anticoagulante. Del alga marina Laminaria digitata, Macrocytis pyrifera y
Durvillaea antarctica, se aisló el polisacárido laminarina, que posee acción anticoagulante, tanto
in vivo como in vitro, y cuya potencia se estima equivalente a un tercio del de la heparina, que es
uno de los de mayor acción anticoagulante. (Nigrelli et al., 1967, Stein y Borden, 1984).
2.10.9 Actividad Laxante. Se sabe que los ficoloides tienen efectiva acción como laxantes y no
producen hábito (Gopal, 1979).
2.10.10 Actividad antifúngica. Las investigaciones acerca de la actividad antifúngica de extractos
de algas marinas, se inician con los trabajos de Pratt et al., (1951), quienes ensayaron sus
compuestos sobre Trichophyton metagrophytes y Trichophyton rubrum. En un acabado estudio,
Welch (1962) analizó las propiedades fugistáticas de 35 especies de algas marinas, contra seis
especies de hongos patógenos y encontró que once de estos extractos presentaban amplias zonas
de inhibición contra una o más de los organismos de prueba. En forma análoga y algo más tarde,
Pesando y Caramb (1984), muestrearon algas del Mar Mediterráneo y en los extractos obtenidos,
encontraron actividad contra dermatofitos, levaduras y mohos. Ma Jing – Wen y Tan Wei – Ci
(1984), por su parte, estudiaron la actividad antibiótica de 60 especies de algas de tres Divisiones
45
de macroalgas de la costa de China, contra Sccharomyces cerevisiae y sólo Laurencia spp y
Plocamium telefairiae presentaron baja acción contra esta levadura.
Reichelt y Borowitzka (1984), realizaron un intensivo estudio de la flora y fauna marina en
Australia y nueva Zelanda con el objetivo de encontrar nuevos compuestos de eventual uso en la
terapia humana y veterinaria; los extractos de algas fueron probados contra Candida albicans,
Cryptococcus neoformans, Trichophyton mentagrophytes y Microsporum audouini y obtuvieron
actividad significativa para los tres primeros con el extracto de Delisea elegans, en tanto
Microsporum audouni fue sensible a extractos de Gracilaria spp.
2.10.11 Actividad antiviral. En este ámbito, destaca el trabajo pionero Kathan (1965), quien ensayó
la protección de embriones de pollo contra el ataque del virus de la Influenza A, usando extractos
de Macrocytis pyrifera. También fue este autor, quién reportó la acción inhibitoria de los extractos
de esta misma alga sobre la neuraminidasa viral.
En Sudamérica, recién en 1986, Mayer et al., (1987), estudiaron la actividad antiviral de
extractos de Macrocytis pyrifera, observando la protección de una capa de células de amnios
humanos, del efecto citopático del virus de la estomatitis vesicular. Los mismos autores, también
estudiaron la actividad antiviral de la fucoidina, alginato de sodio y laminarina, contra el virus de
la estomatitis vesicular. Observaron que la fucoidina, presentaba una gran actividad antiviral.
Supusieron que la fucoidina se uniría a receptores específicos (lectinas), que se encuentran
presentes en diferentes tipos celulares (Mayer et al., 1984). Otras hipótesis, respecto del mecanismo
de acción antiviral de la fucoidina, indican que éstos podrían interferir la adsorción de los virus a
la célula susceptible o interactuar directamente con la partícula viral, formando un complejo
inhibidor – virus, que disminuía la tasa de partículas virales adheridas a la membrana celular y con
46
ello, la capacidad infecciosa del virión, o bien, gracias a la capacidad de las fucoidinas de unirse a
metales, podrían funcionar como bloqueadores antivirales (Allen y Dawson 1960, Paskins –
Hurjburt et al., 1978; Richard et al., 1978; Blunden et al., 1981; Bauer 1985; Hutchinson 1985;
Abrams et al., 1988).
El agar – agar y las carrageninas, ambos extraídos de Rhodophyta, han sido informados como
inhibidores de los virus de la Influenza A, Herpes simplex, polio y dengue, además de la actividad
contra virus de plantas, tales como el virus del mosaico del tabaco. En Chlorophyta se ha
encontrado actividad antiviral contra Togaviridae, Influenza A y VMT (Takemoto y Spicer, 1965).
Los extractos acuosos de muchas algas rojas son activos contra ciertos retrovirus, y se supone
que la acción pueda deberse a las carrageninas, que son polisacáridos comunes de las paredes
celulares de estas algas y son comunes de las paredes celulares de estas algas y son co –
internalizados al interior de la célula con el virus infectante inhibiéndolo (Baba et al., 1988).
Neushul (1990) informa que los carragenanos interfieren en la fusión de células infectadas con el
virus del VIH e inhiben específicamente la transcriptasa reversa. Estudios clínicos en pacientes con
SIDA, internados en el Hospital General de San Francisco, fueron tratados con sulfato de dextrano,
vía intravenosa y entérica, con resultados muy satisfactorios (Starr et al., 1962).
La literatura científica actual informa de actividad antiviral en las tres divisiones de macroalgas
y ésta se manifiesta contra virus de células animales y células vegetales. Sin embargo, no se informa
aún acerca de la actividad en contra de virus bacterianos o de cianófagos.
2.10.12 Actividad inmunológica e inflamación. La experiencias con estimulación de la
multiplicación de células T in vitro por extractos algales, procede de observaciones in vivo de otros
investigadores. (Cooper et al, 2002. Subramian et al, 2001).
47
Los desórdenes inflamatorios, como psoriasis y algunos tipos de colitis, son caracterizados
por una presencia excesiva de linfocitos que pueden ser aminorados por la ingestión de algas
marinas. Fucoidanos derivados de las algas, inhiben el pasaje de linfocitos hacia el tejido por el
bloqueo de receptores. Estos fucoidanos están siendo investigados clínicamente por su potencial
de prevenir la destrucción postisquémica de tejido cardíaco muscular, por una acción sobre
linfocitos. (Ritter, 1998).
2.10.13 Actividad Hipolipemiante e Hipotensora. Muchas comidas son conocidas por su
capacidad de reducir los niveles de colesterol y las algas pardas caen en esta categoría. La ingestión
de Undaria, produce una disminución del colesterol sanguíneo en ratas (Iritani y Nogi, 1972). Este
efecto sobre el procesamiento lipídico, parece ser el resultado de la estimulación de enzimas
hepáticas (Murata et al., 1999).
Un extracto de F. vesiculosus, de forma dosis – dependiente, redujo en forma efectiva la
elevación de triglicéridos sanguíneos y los niveles totales de colesterol. En ratas, con una dieta alta
en colesterol por 21 días, la aplicación de la suplementación en la dieta de U. pertusa, produce una
disminución en el colesterol y LDL, no así en los triglicéridos séricos. (Pengzhan et al., 2003). Los
efectos de U. pertusa, fueron modificados una vez que ésta fue sometida a degradación a pequeñas
fracciones moleculares. Estos derivados de bajo peso molecular y viscosidad intrínseca, no
redujeron el colesterol sérico, pero sí normalizaron la Hipertrigliceridemia de estos animales, así
como también el HDL. El mecanismo por el cual se consiguen estos efectos, es incierto, pero
aparentemente no involucra la acción sobre ácidos biliares, puesto que U.pertusa y sus derivados
de bajo peso molecular, incrementan la excreción biliar.
48
Recientemente, ha sido reportado que la fucoidina de L. japonica, reduce el contenido sérico
de LDL y triglicéridos y aumenta el HDL en modelos de ratas hiperlípidemicas (Huang et al.,
2010). El tratamiento también incremento la actividad de lipoproteína lipasa (LPL), lipasa hepática
(LH), y Lecitina colesterol acil transferasa (LCAT) en suero. Estos cambios en la actividad
enzimática, pueden ser el resultado directo del tratamiento fucoidano o un efecto indirecto asociado
con la mejora del perfil lipídico. (Chopin et al., 1999).
Los polisacáridos sulfatados algales, han demostrado efectos prometedores en el manejo de
la hiperlipidemia asociada con la toxicidad de ciertas drogas (efectos adversos). Fucanos, de S.
polycystum, demostraron tener un efecto preventivo en la elevación de colesterol y triglicéridos en
suero y tejido hepáticos, derivado de la toxicidad hepática por acetaminofeno. (Raghavendran et
al., 2005). De forma similar, un polisacárido sulfatado de S. wightii, redujo hiperlipidemia y
normalizo la LPL y LCAT en plasma un caso de Nefrotoxicidad inducida por el uso de Ciclosporina
A. (Josephine et al., 2007).
Undaria contiene cantidades suficientes de laminina y tetrapéptidos similares, que han
demostrado poseer una actividad inhibitoria sobre la enzima convertidora de angiotensina, en
ensayos in vivo e in vitro (Suetsana y Nakano, 2000). Una ingestión de 3.6 g/día de Undaria
(wakame) por cuatro semanas, resulta en una caída de 14 mmHg en la presión sistólica, en pacientes
asiáticos que tenían hipertensión (Krothiewski, 1991).
2.10.14 Actividad antibacteriana. Fue estudiada por primera vez por Pratt et al., (1951), al observar
que diversas especies de algas tropicales presentaban una importante actividad antibacteriana. Los
avances significativos que se han continuado hasta el día de hoy, han sido numerosos y se
49
incorporan sólo alguno de ellos en la Tabla XIII (Chester y Stott 1956, Fassina 1962, Olesse et al.,
1964; Blunden et al., 1981; Rossel y Srivastava 1987, Steinberg et al., 1991).
Rossel y Srivastava (1987), estudiaron la actividad antibacteriana de nueva algas pardas y las
probaron contra nueve especies bacterianas, encontrando que la actividad antimicrobiana está dada
principalmente por ácidos grasos insaturados, los cuales pueden estar en el alga como ácidos grasos
libres o formando parte de mono, di y triglicéridos. Reichelt y Borowitzka (1984), en cambio,
atribuyeron la actividad antimicrobiana de algas pardas australianas, a la acción de fenoles, como
resorcinol y floroglucinol.
Entre los principios activos aislados de alga marinas, que tienen actividad antibiótica, se
mencionan los siguientes; ácido acrílico, ácidos grasos insaturados, fenoles, sesquiterpenos
halogenados, carbonilos, hidroquinonas bromadas, etc. (Howard y Fenical 1978, Steinberg et al.,
1991)
Diversos autores, estiman que algunas de las sustancias con actividad antibiótica y antiviral
producidas por algas marinas, tendrían una función ecológica de protección del organismo que la
produce, provocando la eliminación de microorganismos epi o endofiticos y provocando respuestas
de repelencia en sus predadores (Krasilnikova 1961, Steinberg 1986, Santelices 1989).
Se ha observado que la actividad antibiótica de las algas marinas presenta marcadas
variaciones estacionales en términos cualitativos y cuantitativos, hasta el punto que Chester y Stott
(1956), señalan que cada especie de alga posee su propia periodicidad en la producción del
antibiótico. En cambio, otros autores encuentran cuatro patrones de producción del antibiótico, que
van desde uniforme todo el año, hasta máxima producción en Invierno, en Primavera o en Verano
(Hornsey y Hide 1985, Valdebenito 1981, Mora 1981).
50
Tabla XIII. Lista de algunas algas marinas reportadas con actividad antibacteriana.
Nombre del alga Microorganismo
Ceramium indica, Enteromorpha intestinalis,
Ulva lactuca, Gelidiella acerosa, Corallina
officinalis, Gracilaria coticata, Sargassum
sp., Galaxaura oblongata, Grateloupia sp.,
Ceramium indica, Laurentia pedicullata,
Sargassum sp., Padina gymnospora,
Stoechospermum marginatum, Cystoseira sp.,
Caulerpa racemosa, Caulerpa
scalpelliforrmis, Spathoglossum variabile,
Halimda tuna, Gelidiopsis gracilis, Iyengaria
stellata, Gelidium sp., Udotea indica,
B. cereus ATCC 11778, M. flavus ATCC
10249, K. pneumonia NCIM 2719, P.
testosterone NCIM 5098, C. freundii ATCC
10787.
Corallina officinalis, Cystoseria barbata,
Dictyota dichotoma, Halopteris filicina,
Cladostephus spongiosus, Ulva rigida.
S.aureus, M. luteus, E. faecalis, E. coli, E.
aerogenes, E. coli O157:H7
Gracilaria tikvahiae, Ulva lactuca, Ulva
fasciata, Sargassum fluitans.
E. coli, S. aureus, S. enteritidis, S.
epidermidis, P. aeruginosa, S. faecalis, C.
albicans.
Ulva lactuca, Padina gymnospora, Sargassum
wightii, Gracilaria edulis.
S. aureus, V. cholerae, S. dysentriae, S. bodi,
S. paratyphi, P. aeruginosa, K. pneumoniae.
Extraído de Chanda et al., 2010.
51
Tabla XIII. (cont.)
Caulerpa prolifera, Gracilaria domingensis,
Gracilaria sp., Amansia smultifida.
E. coli, E. aerogenes, K. pneumoniae, M.
morganii, P. aeruginosa, S. typhi, S.
typhimurium, S. enteritidis, S. cholerae.
S. marginatum, St. marginatum, P.
tetrastromatica, P. gymnospora, C. implexa,
D. australis, D. bartayresiana, S. aspermum,
Asparagopsis taxiformis, Amphiroa
fragilissima, Jania reubens, Caulerpa
racemosa, Caulerpa peltaa, Caulerpa
taxifolia, Codium fragile, Chlorodesmis
fastigiata.
B. subtilis, E.coli, Pseudomonas sp., S.
pyogenes, S. aureus, P. vulgaris, K.
pneumoniae, S. morgani, C. albicans.
Gacilaria corticata, Ulva fasciata,
Enteromorpha compressa.
V. alginolyticus, P. aeruginosa, A. hydrophilia
E, tarde, P. fluorescens, A. hydrophila.
Valonia aegrophila, Ulva pertusa, Halimeda
opuntia, Halimeda tuna, Caulerpa racemosa,
Caulerpa mexicana.
S. aureus, B, subtilis, E. coli, C. albicans.
Enteromorpha linza S. aureus, S. epidermidis, S. faecalis, B,
subtilis, S. typhimorium, P. aeruginosa, E.
cloacae, E. coli, C. albicans.
52
Por otra parte, Hornsey y Hide (1985) analizaron la distribución de la sustancia antibiótica
dentro del talo de seis especies de algas y observaron que sólo Ulva lactuca, presentaba un
contenido uniforme en toda su economía, en tanto que tres especies, Chondrus crispus, Dilsea
carnosa, Codium fragile, exhibían actividad antibiótica aumentada en las regiones más jóvenes de
la planta.
En Laminaria sacharina, la menor actividad se presentó alrededor de las zonas
meristemáticas, en tanto que en Laminaria digitata, la actividad antibiótica se distribuyó
irregularmente dentro del talo.
2.10.15 Actividad Antioxidante. Los procesos metabólicos normales de todos los organismos que
utilizan oxígeno pueden producir especies reactivas del oxígeno (EROS o ROS), se estima que
cerca del 2 – 5% del oxígeno total consumido se convierte en EROS (O2- , OH-, H2O2,
-O2, entre
otros). Probablemente, la fuente endógena más importante generadora de EROS es la cadena
respiratoria mitocondrial, aunque también pueden incluirse algunas reacciones del metabolismo de
los prostanoides, la autoxidación de las catecolaminas, la actividad de la Xantina oxidasa y la
activación de fagocitos y células endoteliales (Ríos de Molina 2003. Ferrari, 1994).
En situación patológica se incrementan sustancialmente estas especies químicas, provocando
una alteración orgánica conocida como estrés oxidativo caracterizado por el daño a biomolecular,
viéndose implicadas en la génesis o exacerbación de numerosos procesos en el aparato
cardiovascular (arteriosclerosis, cardiopatía alcohólica), sistema neurológico (enfermedad de
Parkinson, Alzhemier traumatismo craneales), aparato ocular (Cataratas, fibroplasia), aparato
respiratorio (cáncer de pulmón), riñón (Nefrotoxicidad por metales) y artritis reumatoidea, entre
otros (Rodríguez et al., 2001. Elejalde, 2001).
53
Entre los desórdenes metabólicos crónicos de mayor morbilidad y mortalidad esta la diabetes,
del 5 al 10% de la población mundial la padece, y se estima que para el año 2010 cerca de 239
millones de personas pueden ser afectadas (Hamdan y Afifi, 2004). La diabetes y el estrés oxidativo
parecen relacionarse (Sabu y Kuttan, 2002. Ugochukwu y Babady, 2002), existe evidencia que
demuestra que los niveles elevados de glucosa en la sangre conducen a la autooxidación de esta
misma, también la glicosilación no enzimática de proteínas y el aumento del metabolismo de la
glucosa por la ruta del poliol – sorbitol son contribuyentes del proceso; en cualquier caso la
producción de EROS se incrementa, y más aún en presencia de metales como el hierro (Failla y
kiser, 1981). Las EROS contribuyen a la resistencia a la insulina debido a que, interfieren con las
vías de señalización inducida por esta hormona, evitando así la traslocación del transportador de
glucosa GLUT 4 a la membrana plasmática, por otra parte una descarga de EROS es liberada por
los neutrófilos, exacerbando los procesos inflamatorios y elevando la concentración de las EROS
ajo condiciones patológicas persistentes (Micelii, 2005. Fernández et al., 2004).
Si bien los organismos vivos soportan multitudinarios factores endógenos y exógenos de estrés
oxidativo, también poseen numerosos sistemas de defensa antioxidantes regulables, enzimáticos
(superóxido dismutasa, catalasa, GSH – peroxidasa, quinonas reductasas y hemoxigenasa) y no
enzimáticos (Se, Zn, vitaminas Cy E y carotenoides) que conforman la defensa antioxidante frente
a las EROS (Kim et al., 2003), pero que no siempre resultan ser una barrera efectiva.
Muchos estudios in vitro han demostrado que la fucoidina presenta una actividad antioxidante
muy significativa, así como también existen otros antioxidantes algales (Tabla XIV) con distintas
actividades fisiológicas o efectos beneficiosos para la salud (Tabla XV). La fucoidina es un
excelente antioxidante natural, con gran potencial para prevenir la liberación o síntesis de ROS,
producto de múltiples patologías.
54
Tabla XIV. Categorización de grupos antioxidantes, ejemplos de ellos y fuente algal de la
cual proceden.
Categoría General Molécula Fuente algal
Carotenoides β – Caroteno Chondrus crispus,
Mastocarpus stellatus.
Fucoxantina Algas pardas
Anteraxantina, luteína,
Violaxantina, zeaxantina.
Algas rojas
Compuestos fenólicos. Estipodiol, Isoepitaondiol,
Taondiol.
Taonia atomaria
Terpenoides Cystoseria sp.
Pigmentos ficobilinas Ficoeritrina Algas pardas
Ficocianina
Polifenoles Catequinas, Epicatequina,
Galato
Halimeda sp.
Flavonoides Palmaria palmata
Florotaninos Sargassum pallidum
Fucus vesiculosus
Extraído desde Cornish et al., 2010.
55
Tabla. XIV (Cont.).
Polisacáridos Sulfatados Fucoidina, ácido algínico,
laminarina.
Turbinaria conoides
Laminarina, Fucoidina. Laminaria japonica,
Durvillaea antarctica,
Macrocystis pyrifera.
Galactanos sulfatados Algunas algas rojas
Vitaminas Ascorbato Chondrus crispus
Mastrocarpus stellatus
Sargassum sp.
Vitamina A Kappaphycus alvarezii
Extraído desde Cornish et al., 2010.
56
Tabla XV. Compuesto antioxidante algal con actividad fisiológica o efecto beneficioso para
la salud.
Compuesto antioxidante Actividad fisiológica/Efecto beneficioso.
β - Caroteno, Luteína Antimutagénico
Protector ante el cáncer de mama
Carragenanos, oligosacáridos del Carragenano Antitumoral, Anti – HIV
Fucoxantinas Antiangiogénico
Efecto protector ante la
deficiencia de retinol
Galactanos sulfatados Antiviral
Florotaninos Antiinflamatorio
Bactericida
Inhibición peróxido de hidrogeno
Hipertensión
Polifenoles Antimicrobiano
Protección vascular
Extraído desde Cornish et al., 2010.
57
La fucoidina de Laminaria japonica puede prevenir el incremento del peróxido lipídico (LPO,
implicado en la liperoxidación lipídica), en suero, hígado y bazo de ratones diabéticos. Este
fucoidano tiene un potente efecto contra el radical superóxido, pero uno menor en el radical
hidroxilo y en DPPH. (Micheline et al., 2007).
2.11 Digestión enzimática y método de detección de productos de hidrólisis.
2.11.1 Enzimas.
Las capacidades de los polisacáridos algales señaladas anteriormente (fucoidina y
laminarina), se ven mejoradas cuando se trata de sus oligómeros con ramificaciones β-1,6 que son
los que tendrían un mayor efecto inmunoestimulador (Elyakova et al., 2006).
Laminarina puede ser hidrolizada por β-glucanasas microbianas resultando fragmentos de
4 – 6 residuos de monosacáridos (β – glucanos, que según su extensión de monómeros pueden
recibir nombres como laminaribiosa, laminaritreosa o laminariteraosa, en la caso de la hidrólisis
de la laminarina) que preservan la actividad biológica del polisacárido, estas enzimas son
encontradas en las bacteria y hongos marinos que colonizan las algas y son capaces de degradar la
laminarina y otros carbohidratos presentes. Estas enzimas son clasificadas como exo-β-1,3-
glucanasa y endo-β-1,3-glucanasa.
Las glucanasas cumplen distintos roles fisiológicos: en plantas terrestres, están involucradas
en diferenciación celular y defensa contra hongos patógenos. En hongos tienen diferentes funciones
en procesos morfogenéticos, movilización de β-glucanos e interacción hongo-patógeno-planta. En
bacterias, cumplen funciones metabólicas (Gueguen et al., 1997).
La enzima específica que degrada laminarina es laminarinasa, una endo-β-1,3-glucanasa.
Se han identificado dos tipos de laminarinasas, endo-β-1,3(4)-glucanasa y endo-β-1,3-glucanasa;
58
endo-β-1,3(4)-glucanasa es capaz de hidrolizar ambos enlaces β-1,3 y β-1,4-glicosídicos, mientras
que endo-β-1,3-glucanasa hidroliza principalmente enlaces β-1,3-glicosídicos (Allardyce et al.,
2008).
2.11.2 β – glucanos y distribución en levaduras, hongos y algas según el tipo de enlace
glucosídico que presentan.
Los β – glucanos, corresponden a oligómeros cortos resultantes de la hidrólisis de ciertos
polisacáridos, pero también pueden ser encontrados de forma natural, en microorganismos y
plantas mayores, como estructuras conformantes de la pared celular, como material de reserva en
el espacio citoplasmático o vacuolar o como substancias extracelulares de significancia o
importancia incierta. (Allardyce et al, 2008). La distribución natural de algunos β – 1,3, β – 1,6
glucanos, se muestra en la Tabla XVI.
2.11.3 Técnicas de detección, Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
La cromatografía líquida de alta eficiencia es la técnica analítica de separación más usada
en la actualidad, por su alta sensibilidad, exactitud, una gran capacidad para la separación de
sustancias no volátiles y termolábiles y principalmente por la aplicabilidad a sustancias de interés
como lo son aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, polisacáridos, fármacos, hidrocarburos y
variadas sustancias inorgánicas. La diferencia de esta técnica cromatográfica con la cromatografía
liquida convencional, en la que la fase móvil es un líquido, es que en la cromatografía liquida de
alta eficiencia el diámetro de las partículas de relleno de la columna es del orden de 3 a 10 µm.
además de que se utilizan altas presiones para forzar a los componentes disueltos en la fase móvil
a pasar por la columna (Skoog et al., 2001).
59
Tabla XVI. Distribución de β – 1,3 glucanos en levaduras, hongos y algas.
Fuente Enlace glucosídico 1,3 (%) Otro enlace
glucosídico/componente
Levaduras
Saccharomyces cerevisiae 80 – 90 β – 1,6
Candida albicans 28 β – 1,6
Cryptococcus laurentii --- β – 1,6, β – 1,4, β – 1,2.
Hongos
Penicilium luteum --- β – 1,6, β – 1,4
Microsporum quinckeanum --- β – 1,6
Plectania occidentalis 60 – 70 β – 1,6, fructosa, manosa.
Algas
Laminaria digitata
(laminarina soluble)
90 β – 1,6, manitol 2,7%.
Laminaria cloustoni
(laminarina insoluble)
95 β – 1,6, manitol 1,7%.
Euglena gracilis 100 ----
Extraído de Allardyce et al, 2008.
60
Básicamente las partes de un equipo de HPLC son: depósito de solventes, bomba, inyector
y detector. El detector de Índice de Refracción (IR), el cual mide la diferencia de índice de
refracción entre el solvente puro y el solvente que contiene la muestra, es el recomendado para usar
en la detección de carbohidratos en general (Quattrocchi et al., 1975).
Entre los métodos clásicos de cromatografía liquida, la cromatografía de exclusión
molecular fue el último en ser desarrollado, esta cromatografía se utiliza para el análisis de
compuestos de elevado peso molecular, los rellenos están constituidos por pequeñas partículas
(aprox. 10 µm.) poliméricas o de sílice que contienen una red de poros uniforme en los que puede
difundir las moléculas del soluto y del disolvente. Las moléculas son atrapadas por los poros y
eliminadas del flujo de la fase móvil. Las moléculas de mayor tamaño que el tamaño medio de los
poros del relleno son excluidas, siendo las primeras en eluir, las moléculas que tienen un tamaño
inferior que el tamaño del poro penetran al interior del laberinto de poros resultando atrapadas por
más tiempo, siendo las ultimas en eluir. Las moléculas de un tamaño medio cuya penetración en
los poros depende de su diámetro eluyen de forma intermedia (Skoog et al., 2001).
El resultado del ensayo cromatográfico es, por un lado, la obtención de fracciones separadas
de los componentes de la muestra, y por el otro, la de un gráfico o cromatograma, de cuya
interpretación puede extraerse conclusiones cualitativas y cuantitativas (Quattrocchi et al., 1975).
61
2.12 Hipótesis
H1. Usando diversos protocolos es posible obtener extractos de fucoidina y laminarina con
propiedades fisiológicas (antioxidante, antibacteriana y antifúngica) a partir del alga
Macrocytis pyrifera y Durvillaea antarctica.
H2. La hidrólisis enzimática refuerza las propiedades fisiológicas de los extractos de laminarina y
fucoidina obtenidos del alga Macrocytis pyrifera y Durvillaea antarctica.
2.13 Objetivo General
Efectuar la extracción, detección y caracterización parcial de laminarina y fucoidina a partir
del alga parda Macrocytis pyrifera y obtener oligosacáridos (β – glucanos) con propiedades
fisiológicas.
2.14 Objetivos Específicos
1.- Extraer laminarina y fucoidina desde Macrocystis pyrifera usando diversos protocolos de
extracción (técnicas, instrumentación y reactivos).
2.- Determinar la actividad antioxidante, antibacteriana y antifúngica, de los dos mejores extractos
de laminarina y fucoidina obtenidos.
3.- Determinar de actividad antioxidante, antibacteriana y antifúngica de oligosacáridos de
fucoidina y laminarina obtenidos mediante hidrólisis enzimática con enzimas estándar (SIGMA).
62
3. MATERIALES Y MÉTODOS.
3.1 Extracción de polisacáridos.
Las algas utilizadas para la extracción de polisacáridos fueron colectadas en dos zonas y
fechas distintas del año (estaciones del año), a saber, M. pyrifera desde Calbuco en junio de 2009
y D. antarctica desde la localidad de Pucatrihue, costa de Osorno, en abril de 2010.
Para la extracción de los polisacáridos se procedió a aplicar las metodologías propuestas
por Deville y colaboradores (Deville et al., 2004), efectuando los ajustes necesarios que no estaban
especificados en el documento antes señalado1
Es así como se determinó que para el protocolo Black et al., (Anexo 1.1) se realizaría
posterior a la adición del HCl 0,09 M una filtración con muselina para separar la fracción de mayor
tamaño, además se estableció que la primera centrifugación se realizaría a 5000 rpm durante 30
min. , se estipulo también que la coagulación con etanol se efectuaría en una proporción 1:5 (v/v)
y que la segunda centrifugación se realizaría a 8000 rpm durante 30 min. Para el protocolo Black
et al., modificado (Anexo 1.2) se establecieron las mismas condiciones mencionadas en el
protocolo anterior.
En el protocolo Yvin’s (Anexo 1.3) la incubación del alga con H2SO4 se realiza durante 150
min. a 70 °C, para una posterior filtración con muselina; la primera centrifugación y la coagulación
1Los ajustes a la metodología fueron desarrollados en el Lab. de Biotecnología del ICYTAL por Oscar Díaz R. (el
suscrito), Andrea Díaz C., y Javier Aguinaga G, estudiantes tesistas de Bioquímica de la UACh, adscritos al proyecto
FONDEF D07I 1095
63
con etanol se realizan en las mismas condiciones que en los protocolos mencionados anteriormente,
mientras que la segunda filtración se realizó a 5000 rpm por 30 min.
Para el protocolo Nuevo (Anexo 1.4) al igual que en los protocolos anteriores se realiza una
filtración con muselina, una primera centrifugación a 5000 rpm durante 30 min. , subsecuentemente
una coagulación con etanol en una proporción 1:5 (v/v) y una última centrifugación a 5000 rpm
durante 30 min.
Los extractos obtenidos fueron secados por medio del uso de Centrivap refrigerated
concentrator Labconco (speed back), este instrumento utiliza la fuerza centrífuga y vacío para
condensar rápidamente solventes a partir de muestras biológicas y analíticas. Concentra el soluto
en la parte inferior del vial, permitiendo la recuperación de éstos en muestras de volúmenes
pequeños, de esta forma, se obtienen muestras secas sin remanentes de alcohol.
La línea central de protocolo de extracción, se realizó a base de los protocolos elaborado
por Deville et al., (2004), y aunque finalmente estos fueron la base sobre la cual se efectuó la
detección de polisacáridos por HPLC, se confeccionaron protocolos alternativos, combinando los
protocolos de Deville y Nakamura (1985) (Anexo 1.5), o protocolos NB (NB01 a NB09, según la
modificación realizada, Tabla XVII) (Anexo 1.6). Nakamura, confeccionó su protocolo de
extracción en orden de conseguir la extracción de manitol, ácidos orgánicos, aminoácidos libres y
ácido algínico entre otros, desde el alga marina japonesa Laminaria religias. El protocolo de
Nakamura se diferencia del de Deville, básicamente en las proporciones y concentraciones de ácido
que se utilizan para la extracción, así como también en los ajustes de pH y los volúmenes de etanol
85% que se utilizaban. A su vez, la extracción de Laminarina y Fucoidina por el protocolo de
Nakamura, implica que ambos polisacáridos sean extraídos de forma conjunta en el precipitado de
uno de los pasos finales del protocolo.
64
Tabla XVII. Modificaciones realizadas a protocolos Nakamura – Black (NB)
** Los puntos 1, 2, 3 y 4, corresponden a las modificaciones realizadas al protocolo NB, que en
definitiva resulta en la numeración correspondiente a cada protocolo. En Anexos 1,6 se específica
a que proceso del protocolo corresponde cada punto.
Proto-
colo
Modifi-
cacion
1 **
Modificicación 2** Modificación
3**
( recirculaciones)
Modificación
4**
(recirculaciones)
NB01 1:8 Shaker 24h + proceso
congelamiento y descongelamiento.
1
0
NB02 1:6 Shaker 24h + proceso
congelamiento y descongelamiento.
4
0
NB03 1:7 Shaker 24h + proceso de
congelamiento y descongelamiento.
2
2
NB04 1:9 Shaker 24h + proceso de
congelamiento y descongelamiento.
4
4
NB05 1:5 Ultrasonido por 1-2 h 4 0
NB06 1:8 Ultrasonido por 1-2 h 4 0
NB07 1:8 Ultrasonido por 1-2 h 2 1
NB08 1:8 Ultrasonido 1-2 h + shaker 4 0
NB09 1:8 Ultrasonido 1-2 h + shaker 4 2
65
Por lo tanto, y en vista de las variaciones que presenta Nakamura en sus protocolos, se
realizó la combinación antes mencionada, con el propósito de elaborar un nuevo protocolo que
resulte en un método de extracción alternativo de los polisacáridos en estudio.
3.2 Detección de polisacáridos.
Los extractos obtenidos de cada uno de los protocolos ensayados, se disuelven en agua
desionizada y se procesan por HPLC ConstaMetric 3200 solvent delivery system con columnas de
exclusión molecular Ultrahidrogel Waters 500 y 250 de 7,8*300 mm y detector IR Merck detector
diferential refractometer RI-71. La utilización de equipos de cromatografía, orienta a la utilización
de los mejores protocolos, en cuánto a contenido de laminarina y fucoidina, descartando aquellos
con baja concentración de polisacáridos o simplemente en ausencia de estos.
3.3 Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
Previo a este análisis y para una mayor purificación y facilitación en la detección de los
polisacáridos se realiza una filtración de la muestra con filtros Millex con membrana de PVDF,
con tamaño de poro de 0,22 µm. Una vez realizada la filtración de los extractos obtenidos por la
aplicación de los distintos protocolos, éstos se analizan por HPLC/IR, utilizando como fase móvil
agua desionizada y una columna cromatográfica de exclusión molecular a 1000 psi a un flujo de
1,0 mL/min. A temperatura ambiente y con un tiempo de corrida de 25 min. Los componentes de
la mezcla eluyen de la columna en función de sus pesos moleculares, lo que constituye el
cromatograma. Por medio de éste último, se puede realizar la identificación cualitativa y
cuantitativa de los polisacáridos.
66
La recolección de pick cromatográficos, se refiere a la captura y acumulación del eluído que
proviene del HPLC y que corresponde al inicio y fin de un pico en el cromatograma, perteneciente
a Fucoidina, o bien a Laminarina.
3.5 Hidrólisis enzimática de polisacáridos.
Una vez elegido el protocolo de mayor rendimiento y pureza basado en los resultados
mostrados en el HPLC, se procede a la degradación enzimática de los polisacáridos utilizando dos
enzimas comerciales, para luego utilizar estos productos enzimáticos en pruebas de actividad
fisiológica.
La primera enzima que se utiliza es la β-glucanasa GrainGain®, con esta enzima se realizan
ensayos enzimáticos de 6, 12, 24 y 48 h para conocer el tiempo que necesita esta β-glucanasa para
la degradación de los polisacáridos. Cada ensayo enzimático se realizó como se describe a
continuación: Se incuba a 60°C 500 µL del polisacárido con 500 µL de la enzima β-glucanasa
(cada muestra en triplicado), incubándose la mezcla a distintos tiempos (0, 30, 60 min, etc.),
cumplido el tiempo determinado las muestras se trasladan rápidamente al congelador (para
inactivar la acción hidrolítica de la enzima). Una vez terminado el ensayo las muestras son retiradas
del congelador y descongeladas en agua fría para análisis.
Por otra parte, se utilizó también la enzima comercial Laminarinasa Sigma®, la cual es
específica para el polisacárido de laminarina. Se realizaron ensayos enzimáticos de 6, 12, 24 y 48
h a 37 °C para conocer el tiempo que requería la enzima para la degradación completa de los
polisacáridos en estudio, estos ensayos se realizan de la misma forma que con la enzima GrainGain.
Los productos de hidrólisis obtenidos de la degradación enzimática con ambas enzimas
fueron detectados por medio del test de glucosa, DNS y HPLC.
3.4 Recolección de fracciones de polisacáridos (pick cromatográficos) desde HPLC.
67
3.6 Test de glucosa.
Para este ensayo se utilizó el GOD – PAP comercial (Spin React®). Este método se basa
en el principio que se específica; la enzima glucosa-oxidasa (GOD) cataliza la oxidación de glucosa
de acuerdo a la siguiente ecuación:
C6H12O6 + O2 + H2O GOD C6H12O7 + H2O2
El H2O2 formado en esta reacción, reacciona con 4-aminoantipireno y 4-ácido
hidroxibenzoico en presencia de peroxidasa para formar N-(4-antipiril)-p-benzoquinona imino. La
cantidad de color formado es proporcional a la concentración de glucosa.
El procedimiento consiste en mezclar 50 µL de muestra (digerida enzimáticamente) con 2
mL del reactivo que contiene las enzimas hidrolizantes de glucosa, luego se incuba a 37 °C durante
10 min, para así medir la absorbancia contra el blanco a 505 nm en un espectrofotómetro Spectronic
Genesys 5 ®.
3.7 Ensayo del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS).
Este método detecta la presencia de un grupo carbonilo (C=O) libre presente en azúcares
reductores, involucrando la oxidación de grupos aldehídos funcionales presentes en los azúcares,
reduciéndose simultáneamente el ácido 3,5-dinitrosalicílico a ácido 3-amino, 5-nitrosalicílico bajo
condiciones alcalinas (Miller, 1959). Según la siguiente ecuación:
Grupo aldehído oxidación Grupo carboxilo
3,5-dinitrosalicílico reducción Ácido 3-amino, 5-nitrosalicílico
Este método fue estandarizado 2, de manera tal de optimizar el ensayo según las variaciones
en la metodología que se encontraron en las bases bibliográficas.
68
Los primeros ensayos en estudio, coinciden en utilizar 1,5 mL de muestra con 2 mL de
Ácido tricloroacético (TCA) y 3,5 mL de DNS, luego la mezcla obtenida se lleva a hervor por baño
maría durante 5 min. , para posteriormente dejar enfriar a temperatura ambiente. La absorbancia
fue medida a 510 nm ó 540 nm. Por contraparte, otros protocolos coinciden en mezclar 3 mL de
muestra con 3 mL de DNS e incubar a 90°C durante 15 min. , para luego dejar enfriar a temperatura
ambiente y así agregar 1 mL de tartrato de sodio y potasio al 40%; finalmente se mide la
absorbancia contra el blanco a 575 nm ó 610 nm. La estandarización se realiza utilizando las 4
mezclas propuestas y midiendo cada una de estas a las cuatro longitudes de ondas expresadas, así,
la muestra utilizada corresponde a glucosa a distintas concentraciones y el blanco a reactivo DNS.
3.8 Determinación cualitativa de Sulfatos.
La presencia de sulfatación en los polisacáridos en estudio, es relevante por el hecho de que
en variadas investigaciones del campo algal, se atribuye a estos grupo sulfatos, gran parte de la
actividad fisiológica que se intenta demostrar en este trabajo de investigación, o en su defecto
explicaría parte de la actividad biológica que presentarían Fucoidina y Laminarina. Es por ello, que
ensayos tan sólo cualitativos, son de gran ayuda para dilucidar la presencia de estos grupos. Para
esto, la muestra que posiblemente contiene grupos sulfatos es levemente acidificada agregando
gotas de HCl 2 M, para así adicionar BaCl2 0,2 M, produciéndose un precipitado blanco
correspondiente a sulfato de bario.
2 La Estandarización de la Metodología, fue desarrollada en el Laboratorio de Biotecnología del ICYTAL por Andrea
Díaz C., estudiante tesista de Bioquímica UACh, adscrito al proyecto FONDEF D07I 1095.
Finalmente se agregan gotas de ácido clorhídrico 2 M, el cual disuelve los sulfatos que no
correspondan a sulfato bario 3. Este ensayo se resume en la siguiente ecuación:
69
SO42- + Ba2+ BaSO4
3.9 Determinación de la Actividad Antioxidante.
3.9.1 Estándares y Reactivos.
Los siguientes estándares fueron utilizados; ácido gálico, ácido ascórbico y TROLOX (ácido
6-hidroxi – 2, 5, 7,8 – tetrametilcromo – 2 – ácido carboxílico 97 %), todos ellos de Sigma -
Aldrich®. El primero de ellos para la determinación de Fenoles Totales y los dos últimos, para la
metodología por DPPH. Los reactivos utilizados fueron, reactivo de Folin – Ciocalteu de Sigma -
Aldrich® y la preparación de Na2CO3 20 % p/v, para el caso del método de Fenoles Totales.
3.9.2 Método DPPH.
Este método, desarrollado por Brand – Williams, (Brand – Williams et al., 1995), se basa en
la reducción de la absorbancia medida del radical DPPH* (2,2 – difenil – 1 – picrilhidrazilo), por
antioxidantes. Ya que una notoria banda de absorción, se encuentra aproximadamente a los 520
nm, el DPPH posee una fuerte coloración violeta (en su estado reducido, con un electrón
deslocalizado), éste al ser expuesto a una sustancia antioxidante, es llevado a su forma oxidada,
donde la característica coloración violeta, cambia a un amarillo pálido, signo del que el radical
DPPH ha sido estabilizado o ha perdido su capacidad oxidante (Figura 10).
3 La Determinación cualitativa de Sulfatos, fue desarrollada en el Laboratorio de Biotecnología del ICYTAL por
Andrea Díaz C., estudiante tesista de Bioquímica UACh, adscrito al proyecto FONDEF D07I 1095. En esta
oportunidad, será utilizado como fundamentación y soporte de la Actividad Antioxidante de las algas antes
mencionadas.
70
Figura 10. Espectro de absorción del DPPH. Línea morada indica el espectro, con pico de
absorción a 520 nm, del estado reducido del radical DPPH. Línea amarilla indica el espectro, del
estado oxidado del radical DPPH, así como también el descenso en la absorción a los 520 nm.
Además se incluye el cambio en la conformación molecular, del DPPH en su estado radical
reducido (molécula izquierda) a su estado estable oxidado (molécula a la derecha), con la respectiva
acción del agente antioxidante (R*). Figura extraída de Sánchez – Moreno et al., 1997.
71
Con modificaciones el método descrito por Kim (Kim et al., 2002), se basa en la medida de
la absorbancia del radical DPPH* 5,10 ×10 -5 M (1,5 mL), disuelto en Metanol 100 %, a la longitud
de onda de 517 nm. Se añade 0.75 mL de la muestra o patrón, ésta se homogeniza cuidadosamente,
y se mantiene en la oscuridad durante 1 hora y a una temperatura de 37°C (parámetros obtenidos
por estandarización del método Brand – Williams, a raíz del bajo consenso que existía en las fuentes
bibliográficas, en cuanto a parámetros utilizados). La inhibición del radical libre (DPPH) o % IRLa,
fue efectuada midiendo el descenso de la absorbancia a 517 nm, para ello se realizaron mediciones
antes de añadir la muestra con supuesta actividad antioxidante (A0) y pasada 1 h de haber agregado
ésta (Af). La concentración de DPPH* en el medio de reacción se calcula a partir de una curva de
calibración obtenida por regresión lineal. Los resultados son expresados en TEAC y VCEAC, o en
otras palabras, actividad antioxidante equivalente a Trolox y actividad antioxidante equivalente al
ácido ascórbico respectivamente. Los resultados de actividad antioxidante, también fueron
expresados como la cantidad de antioxidante que era necesaria para disminuir la concentración
inicial de DPPH* a la mitad (EC50). El tiempo necesario para alcanzar EC50 (TEC50, determinado
gráficamente), fue un parámetro necesario de determinar, ya que junto a EC50 (ambos afectan la
capacidad antiradical), se obtiene un nuevo parámetro para la medición antioxidante, AEb o
eficiencia antiradical, que se complementa al TEAC y VCEAC.
a %IRL = A (t = 0min) – A (t = tiempo en estado estacionario) / A (t = 0 min) × 100
b AE = 1/EC50 TEC50
3.9.3 Método de Fenoles Totales.
El método espectrofotométrico desarrollado por Folin y Ciocalteu (Folin y Ciocalteu, 1924),
para la determinación de fenoles totales, se fundamente en su carácter reductor y es el más
72
empleado. Se utiliza como reactivo una mezcla de ácido fosfowolfrámico y fosfomolibdíco en
medio básico, que se reducen al oxidar los compuestos fenólicos, originando óxidos azules de
wolframio (W8023) y molibdeno (Mo8023). La metodología empleada en el laboratorio, consistió en
mezclar 3,16 mL de H20 destilada, 400 µL de estándar (ácido gálico) o de extracto, 200 µL de
reactivo Folin – Ciocalteu, esperar 5 min. , agregar 600 µL de Na2CO3 al 20 % p/v, esperar 2 h y
finalmente medir la absorbancia a 765 nm. Los resultados se expresan en unidad de concentración
para ácido gálico.
3.10 Determinación de la Actividad Antibacteriana.
3.10.1 Cepas bacterianas.
La elección de las cepas utilizadas en este trabajo de investigación, fue en base a los
antecedentes bibliográficos encontrados y según su incidencia en salud pública, ya que todas las
bacterias en cuestión, causan alguna patología en el ser humano. A continuación, se detalla cada
cepa utilizada y las patologías o afecciones de salud que éstas pueden causar.
3.10.1.1 Bacillus subtilis ATCC 33608. No es considerado un patógeno humano; sin embargo
puede contaminar alimentos, pero raramente causa intoxicación alimenticia. Sus esporas pueden
sobrevivir las temperaturas extremas, que a menudo es usada en la preparación de alimentos.
(Madigan et al., 2005).
3.10.1.2 Escherichia coli ATCC 25922. Esta bacteria puede causar infecciones intestinales y extra
intestinales generalmente graves, tales como infecciones del aparato excretor, vías urinarias,
cistitis, meningitis, peritonitis, mastitis, septicemias y neumonía. La ITU por E coli son más
comunes en mujeres por la corta longitud de la uretra en comparación con el hombre, y por la
73
proximidad a la zona anal. Entre los ancianos, las infecciones urinarias tienden a ser de la misma
proporción entre hombres y mujeres. (Bae et al., 2006).
3.10.1.3 Klebsiella pneumoniae ATCC 23357. Dentro de este género están involucradas
principalmente infecciones nosocomiales. Es el agente causal de infecciones del tracto urinario,
neumonías, sepsis, infecciones de tejidos blandos, e infecciones de herida quirúrgica. Son
especialmente susceptibles los pacientes ingresados en unidades de cuidados intensivos, neonatos
y pacientes con EPOC, diabetes mellitus o alcohólicos. (Biering et al., 2001).
3.10.1.4 Pseudomnas aeruginosa ATCC 27853. Este patógeno oportunista de individuos
inmunocomprometidos, infecta el tracto pulmonar, el urinario, tejidos, heridas, y también causa
otras infecciones de sangre. La fibrosis quística está también predispuesta a la infección con P
aeruginosa de los pulmones, esta bacteria es la causante de dermatitis, causada por la disminución
del control de la calidad del agua de bebida. El más común causante de altas fiebres en infecciones
es P aeruginosa. (King et al., 1954).
3.10.1.5 Shigella sonnei OSP 2047 – 01. La mayoría de las personas infectadas con Shigella
contraen diarrea, fiebre y calambres estomacales a partir de un día o dos después de su exposición
a la bacteria. La diarrea es a menudo sanguinolenta. La Shigelosis se resuelve de ordinario en 5 a
7 días. En algunas personas, especialmente en los niños de corta edad y los ancianos, la diarrea
puede ser tan grave que el paciente necesite ser hospitalizado.
Además, Shigella alcanza la submucosa del colon y es capaz de ulcerar esos tejidos, pero
sólo produce bacterieremia en casos absolutamente excepcionales. Sin embargo, al causar
afectación colónica provoca una reacción inflamatoria intensa con moco y pus, pudiendo formarse
úlceras sangrantes, por lo que las deposiciones son de pequeño volumen y pueden ir acompañadas
74
de moco y sangre dando lugar, en conjunto, al cuadro denominado disentería bacilar. (Delpiano et
al., 2001).
3.10.1.6 Staphylococcus aureus ATCC 25923. Es el causante de diversos procesos infecciosos
que van desde infecciones cutáneas hasta enfermedades sistémicas mortales. Entre ellas podemos
mencionar, Síndrome de la piel escaldada, intoxicación alimentaria, Síndrome del shock tóxico,
abscesos cutáneos, impétigo, foliculitis, ántrax, celulitis de cara y cuello, Mastitis, Endocarditis,
Neumonía, Osteomielitis, Artritis séptica, peritonitis, pericarditis, entre otras. (Cheung et al.,
1994).
3.10.1.7 Staphylocccus epidermidis ATCC 12228. Este microorganismo es por lejos, el
recuperado con mayor frecuencia, ya que explica entre el 50% y más del 80 % de los aislamientos.
Se ha aislado en válvulas cardiacas protésicas, prótesis ortopédicas y catéteres intravenosos.
(Cheung et al., 1994).
3.10.1.8 Streptococcus pyogenes OSP 344 – 10. Esta bacteria se asocia a muchas enfermedades,
algunas muy importantes; faringitis estreptocócica, infecciones de la piel por estreptococo
(celulitis, erisipelas, impétigos, fascitis necrotizante). La faringitis se puede complicar con la
aparición de un exantema difuso (escarlatina), lo que ocurre con algunas cepas de estreptococo.
Otras enfermedades que puede causar son las bartolinitis, síndrome de shock tóxico, fiebre
reumática y glomerulonefritis postestreptocócica. (Bisno et al., 2003).
3.10.2 Conservación de cepas de referencia.
Para conservar las cepas de referencia se deben congelar usando criopreservantes como; leche
descremada al 20% o caldo glicerol al 20%, éste último fue el utilizado normalmente en los
75
procedimientos y desde el cual se realizaban los repiques. El proceso de conservación consistió
básicamente en los siguientes pasos;
Sembrar la cepa en el agar adecuado e incubar por 18 – 24 h a 35°C.
Cosechar con tórula y hacer una suspensión espesa en leche o caldo glicerol.
Agitar en vortex y congelar a -70°C (duración indefinida) o -20°C (dura alrededor de 1
año).
Mientras más baja sea la temperatura de congelación, mayor es la viabilidad de la cepa. Para
recuperar la cepa del congelado, se raspó la superficie del hielo con un asa y se siembra en el medio
adecuado. Luego incubar 24 – 48h a 35°C, siempre teniendo la precaución de que el criopreservante
no se descongele, pues la cepa puede perder viabilidad.
3.10.3 Activación de las cepas.
Cada una de las cepas de bacterias conservadas, fue sometida a un proceso de repique, que
consistió en tomar una alícuota de 100 µL desde el agar de conservación, para ser ésta inoculada
en 10 mL de Caldo Soya Tripticasa (Triptic Soy Agar, Merck AG) a 30 ± 1°C por 24 h, para
posteriormente obtener una concentración de trabajo de entre 105 – 106 ufc/mL.
3.10.4 Recuento de colonias bacterianas.
El recuento de bacterias fue realizado con el objeto de determinar una concentración en
unidades formadoras de colonias/mL, cercana a la concentración de la cual se debe disponer para
desencadenar un proceso infeccioso. Es por ello que, contar con concentraciones de entre 105 – 106
ufc/mL, fue preponderante para las posteriores pruebas antibióticas. Este proceso se detalla en
ANEXO 2.1.
76
3.10.5 Estándar de medicamentos Unasyn®, Inem® y Sulperazon®.
3.10.5.1 Unasyn®, antibiótico inyectable, consistente de ampicilina sódica y sulbactam sódico. El
primero consistente en un antibiótico semisintético de la familia de las penicilinas y el segundo, un
inhibidor de las β – lactamasas. Su espectro de acción, se detalla a continuación;
a. Bacterias Gram positivas: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis,
Stapyloccus saprophyticus, Streptococcus faecalis (Enterococcus), Streptococcus
pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus viridans.
b. Bacterias Gram negativas: Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis,
Escherichia coli, Klebsiella spp, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Providencia
rettgeri, Providencia stuartii, Morganella morganii y Neisseria gonorrhoeae.
c. Anaerobios: Clostridium spp, Peptococcus spp, Peptostreptococcus spp, Bacteroides
spp.
3.10.5.2 Inem®, antibiótico β – lactámico del grupo de los carbapenems. Amplio espectro que
incluye bacterias Gram positivas y Gram negativas aerobias y anaerobias. Todos los estafilococos
resistentes a meticilina son resistentes a imipenem. Los microorganismos intrínsecamente
resistentes a Imipenem incluyen Enterococcus faecium, Legionella spp, Stenotrophomonas
maltophilia, Corynebacterium y algunas cepas de Burkholderia cepacia, Clostridium difficile
puede ser moderadamente sensible. No es activo contra Chlamydia spp, Chlamydophila spp y
Mycoplasma spp.
3.10.5.3 Sulperazon®, consistente en Cefoperazona sódica, cefalosporina de tercera generación,
antibiótico semisintético de amplio espectro, más Sulbactam sódico.
77
3.10.6 Ensayo de Sensibilidad de las cepas de referencia frente a los extractos de Macrocystis
pyrifera y Durvillaea antarctica.
El proceso de activación de cepas referenciales y posterior recuento de ellas, son los
procedimientos que preceden al ensayo de sensibilidad o antibiograma de las bacterias en cuestión
(este proceso se específica de mejor manera en ANEXO 2.2).
Para la realización de las diluciones que fueron utilizadas para conseguir concentraciones
de entre 105 – 106 ufc/mL, y posterior inoculo en agar semisólido Soya Tripticasa (Contenedor de
menor cantidad de agar en relación al agar sólido Soya Tripticasa), se requirió de buffer fosfato
salino (PBS) 0.01 M pH 7.20, el cual se elaboró de la siguiente forma;
Preparar una solución sales en 500 mL de H2O destilada, ajustando a pH 7.20.
Las sales consisten de; NaCl 4 g, KCl 0.1 g, Na2HPO4 anhidro 0.72 g, KH2PO4 0.12 g.
La placa Petri de ensayo de antibiograma, fue elaborada con un inóculo de cada bacteria de
referencia, incluida en el agar semisólido Soya Tripticasa, de manera tal, de evitar la siembra en
césped sobre agar sólido y así conseguir un sembrado más homogéneo. Se tuvo especial cuidado
al momento de someter a temperatura al agar semisólido (para fundir el agar y aplicar inóculo),
dejando un tiempo pertinente para que ésta descienda y así agregar el inóculo bacteriano con
seguridad. Alícuotas (5 – 7 mL) de este agar semisólido con inóculo incluido a él, fueron vertidas
sobre una agar sólido Soya Tripticasa previamente preparado. (Mayor detalle en ANEXO 2.2).
Posteriormente las placas fueron incubadas en un tiempo pertinente y a T° óptima para el
crecimiento de cada bacteria, para luego determinar halos de inhibición formados alrededor de los
discos. El tamaño del halo de inhibición, se midió mediante un pie de metro digital, midiendo en
78
milímetros la distancia correspondiente entre el borde del disco y el inicio del cultivo. Todas las
mediciones se realizaron en triplicado.
La manera en que se confeccionó cada placa de ensayo de antibiograma y el contenido de
éstas en cuanto a muestras ensayadas fue la siguiente;
A. Las placas que contenían extractos crudos (concentrado de 25 mg/mL en H2O estéril, desde
el cual se realizaban las diluciones), extractos digeridos enzimáticamente, estándares
comerciales de los polisacáridos en estudio, estándar de antibióticos y pick cromatográficos
recolectados por HPLC de fracciones de fucoidina y laminarina (Tabla XVIII), consistieron
de 6 perforaciones o 6 discos filtros. Cada perforación o pocillo, previo a un proceso de
filtrado por filtros Millipore de 0,45 µm, almacenaba (25 µL) distintas diluciones de las
muestras mencionadas. Es así como, cada placa estaba constituida por: (Figura 11)
a. Pocillo 1, correspondiente a la muestra concentrada.
b. Pocillo 2, correspondiente a la muestra con una dilución 1:1
c. Pocillo 3, correspondiente a la muestra con una dilución 1:2
d. Pocillo 4, correspondiente a la muestra con una dilución 1:4
e. Pocillo 5, correspondiente a la muestra con una dilución 1:8
f. Pocillo 6, correspondiente a una muestra de H2O destilada estéril, como blanco.
B. En el caso del trabajo por discos filtros, los discos Whatman estériles de 9 mm de diámetro,
eran impregnados en la respectiva muestra. Los discos, posteriormente fueron depositados
sobre la superficie de la placa que contiene el césped de cultivo bacteriano, para así ser
incubadas por 24 h a 30°C indistintamente para cada bacteria de referencia.
79
Tabla XVIII. Muestras estudiadas en ensayo de antibiograma.
Estándar con
Actividad
Antibiótica
Estándar
comercial
polisacáridos en
estudio
Extracto crudo Extracto digerido
enzimáticamente
Pick
cromatográficos
recolectados
desde HPLC
Unasyn® Fucoidina 25
mg/mL
Macrocystis
pyrifera 25 mg/
mL
Durvillaea
antárctica +
laminarinasa
Laminarina
Inem® Laminarina 25
mg/ mL
Durvillaea
antarctica 25
mg/mL
Durvillaea
antárctica + β
glucanasa
Fucoidina
Sulperazon® Macrocystis
pyrifera + β
glucanasa
Laminarina +
laminarinasa
Fucoidina + β
glucanasa
Laminarina + β
glucanasa
Fucoidina + β
glucanasa
Fucoidina + β
glucanasa
Laminarina +
laminarinasa
80
Figura 11. Esquema representativo de las placas de antibiograma realizadas en este trabajo de
investigación. En azul el Agar sólido Soya Tripticasa, sobre el cual se dispersa una alícuota de 25
µL de agar semisólido Soya Tripticasa, contenedor de inóculos de las bacterias de referencia. De
mayor a menor, 1, indica un concentrado de la muestra estudiada, 2, dilución 1:1 de la muestra, 3,
dilución 1:2 de la muestra, 4, dilución 1:4 de la muestra, 5, dilución 1:8 de la muestra y 6, H2O
destilada estéril.
2
3
4
5
6
1
81
A. Las muestras estándar de los medicamentos Unasyn®, Inem® y Sulperazon®, de las cuales
sólo se trabajó un preparado sin diluciones, fueron preparadas de la siguiente forma:
a. Inem®: Solución de 100 mL, dónde Inem® era resuspendido en NaCl 0.9 % y 5 –
10 % de Dextrosa H2O. Si se mantiene refrigerado, la estabilidad se conserva por
24 h.
b. Unasyn®: Resuspensión en NaCl0.9 % y 5 – 10 % Dextrosa en H2O. Si se mantiene
refrigerado, la estabilidad se conserva por 24 h.
c. Sulperazon®: Resuspensión en solución de 20 mL, constituida por; 5 % dextrosa y
NaCl 0.9 %. Si se mantiene refrigerado, la estabilidad se conserva por 24 h.
B. Las muestras concentradas de estándares comerciales de Fucoidina y Laminarina, de las
cuales se realizaron diluciones en la misma placa (pocillo 2, 3, 4 y 5), fueron de 25 mg/mL.
En lo que compete a las muestras ensayadas para actividad antibiótica, también fueron
sometidas a las mismas diluciones que en el caso de los estándares. El modo por el cual se
realizaron las diluciones fue el esquematizado en ANEXO 2.3.
3.10.7 Diseño experimental para la inhibición bacteriana por medio de pocillos o discos filtro.
El diseño experimental utilizado consistió en un diseño multifactorial 8 × 5 × 3 de dos
factores representantes o responsables de cada bacteria, cuyos parámetros corresponden a los
ocho microorganismos afectados por la inhibición. El factor cinco corresponde a los
tratamientos efectuados con las concentraciones de extracto algal y el factor tres indica el
número de repeticiones.
82
3.10.8 Análisis estadísticos.
La inhibición bacteriana por efecto de los extractos crudos fue evaluada mediante
estadística descriptiva y análisis de varianza de una vía (ANDEVA) utilizando el software
estadístico Statgraphics 5.1. En caso de reportarse evidencia significativa (p ≤ 0.05) entre
resultados se realizó una prueba de rango múltiple con el fin de determinar la magnitud de
diferencia.
3.11 Determinación de la actividad antifúngica.
3.11.1 Cepas fúngicas.
La elección de las cepas utilizadas en este trabajo de investigación, fue en base a los
antecedentes bibliográficos que indican que los hongos testeados en esta oportunidad, son los
primeros que deben probarse para un ensayo de actividad antifúngica, puesto presentan un grado
de sensibilidad mayor a ser inhibidos en crecimiento, en comparación a otras especies de hongos.
Los hongos estudiados en esta oportunidad, fueron obtenidos y estudiados desde el
cepario fúngico de las dependencias del Instituto de Microbiología Clínica. Las especies de hongos
estudiadas fueron;
Candida albicans
Candida krusei
Candida glabrans
Candida Guillermondii
Aspergillus niger
83
Aspergillus terreus
Aspergillus flavus
Aspergillus fumigatus.
3.11.2 Cultivo de cepas fúngicas.
El cultivo fue realizado a base de un cepario o banco fúngico del Instituto de
Microbiología Clínica, desde él se realizó un repique por medio de asa de micrón a un Agar
Sabouraud inclinado, incubando las cepas por 48 h a 32°C. Desde éste último cultivo, y por medio
del asa de micrón se realizó un inoculo en H2O estéril, para finalmente y por medio de una tórula,
realizar un siembra en placa con Agar Sabouraud, para incubar por 48 h a 32°C.
3.11.3 Ensayo de Sensibilidad de las cepas fúngicas frente a los extractos de Macrocystis pyrifera
y Durvillaea antarctica.
Las muestras estudiadas en esta oportunidad fueron las siguientes:
A. Extracto de Macrocystis pyrifera concentrado 25 mg/mL en H2O estéril.
B. Extracto de Durvillaea antarctica concentrado 25 mg/mL en H2O estéril.
C. Preparado de Laminarina y Fucoidina estándar 25 mg/mL en H2O estéril, a raíz del cual se
realizaron las mismas diluciones descritas en la Figura 11.
D. Muestras de pick recolectados desde HPLC, correspondiente a las fracciones de Laminarina
y Fucoidina. Extractos digeridos enzimáticamente con β - glucanasa y laminarinasa.
La manera en que se confeccionó cada placa de ensayo de antibiograma y el contenido de
éstas en cuanto a muestras ensayadas fue la siguiente;
84
A. Los cultivos en placas consistieron de 6 perforaciones o 6 discos filtros. Cada perforación
o pocillo, previo a un proceso de filtrado por filtros Millipore de 0,45µm, almacenaba (25
µL) distintas diluciones de las muestras mencionadas. Es así como, cada placa estaba
constituida por: (Figura 11)
a. Pocillo 1, correspondiente a la muestra concentrada.
b. Pocillo 2, correspondiente a la muestra con una dilución 1:1
c. Pocillo 3, correspondiente a la muestra con una dilución 1:2
d. Pocillo 4, correspondiente a la muestra con una dilución 1:4
e. Pocillo 5, correspondiente a la muestra con una dilución 1:8
f. Pocillo 6, correspondiente a una muestra de H2O destilada estéril, como blanco.
B. En el caso del trabajo por discos filtros, los discos Whatman estériles de 9 mm de diámetro,
eran impregnados en una solución de 25 mg/mL por aproximadamente 30 segundos. Los
discos, posteriormente fueron depositados sobre la superficie de la placa que contiene el
césped de cultivo fúngico, para así ser incubadas por 48h a 32°C indistintamente para cada
cepa fúngica.
C. Las muestras concentradas de estándares comerciales de Fucoidina y Laminarina, de las
cuales se realizaron diluciones en la misma placa (pocillo 2, 3, 4 y 5), fueron de 25 mg/mL
para ambos casos. En lo que compete a las muestras ensayadas para actividad antibiótica,
también fueron sometidas a las mismas diluciones que en el caso de los estándares. El modo
por el cual se realizaron las diluciones fue el esquematizado en ANEXO 2.3.
85
3.11.4 Diseño experimental para la inhibición bacteriana por medio de pocillos o discos filtro.
El diseño experimental utilizado consistió en un diseño multifactorial 8 × 5 × 3 de dos
factores representantes o responsables de cada cepa fúngica, cuyos parámetros corresponden a los
ocho microorganismos afectados por la inhibición. El factor cinco corresponde a los tratamientos
efectuados con las concentraciones de extracto algal y el factor tres indica el número de
repeticiones.
4. RESULTADOS.
4.1 Extracción y detección mediante HPLC, de los polisacáridos Laminarina y Fucoidina desde
las algas Macrocystis pyrifera y Durvillaea antarctica.
El proceso de secado, de los extractos húmedos obtenidos por las distintas metodologías de
extracción, fue realizado por la metodología Speed back mencionada en la sección de Materiales y
Métodos. Los extractos secos derivados de este procedimiento, fueron disueltos y resuspendidos
en agua desionizada para su posterior detección por HPLC. Se obviaron los resultados por el
protocolo Black modificado del método elaborado por Deville et al., ya que la disolución de éste
en agua desionizada, resultó muy dificultosa, sin mencionar que la presencia de los polisacáridos
en estudio, fue mínima.
Es importante a la hora de la lectura o análisis de un cromatograma, considerar todos los
elementos que han sido detectados por el HPLC, tanto los conocidos o esperados, como los no
conocidos; sobre todo estos últimos, ya que pueden ser sinónimo de errores o interferentes a la hora
de detectar moléculas en estudio.
86
Para disminuir este factor de error, es trascendental conocer en parte, las posibles moléculas
o componentes químicos que pueden poseer la muestras (y que pueden ser detectados por el
detector acoplado al HPLC), por ello realizar inyecciones y posteriores cromatogramas de
estándares que se pueden encontrar en la muestra problema que se analizará a futuro, puede
convertirse en una buena opción, para optimizar el trabajo y disminuir errores. Para esto, se realizó
la detección de moléculas estándar (Figura 12) como; manitol, glucosa, fucosa y ácido algínico,
que en definitiva se convierten en picko típicos distintos a los de Laminarina y Fucoidina, que
pudiesen encontrarse en posteriores cromatogramas.
De la Figura 12 se desprende además que, de las moléculas que pudiesen significar un
problema para el análisis de extractos y posterior detección de laminarina y fucoidina, manitol,
fucosa y glucosa, no involucran un problema o posible fuente de error, puesto su tiempo de elución,
es mucho después que los polisacáridos en estudio, es decir, mayor que 17 min. (alrededor de los
20 min.). Es de cuidado, no caer en confusiones con el pico correspondiente a fucoidina y ácido
algínico, puesto ambos se encuentran muy cercanos a los 10 min, pero siempre, fucoidina eluye
más rápido (según las condiciones de flujo, detector y columna utilizados) y por ende es detectado
antes que ácido algínico.
El cromatograma contenido en la Figura 13, comprende a los polisacáridos en estudio, es
decir, los estándares de laminarina y fucoidina. La Figura 14 por tanto, corresponde al
cromatograma de los extractos logrados con los protocolos Black, Nuevo e Yvin’s a partir del alga
Macrocystis pyrifera.
Del análisis de los cromatogramas mencionados, se observa que laminarina y fucoidina
estándar, presentan un picocercano a los 15 y 10 min. respectivamente.
87
Figura 12. Cromatograma de moléculas estándar de Maltosa, Fucosa, Glucosa y Ácido
algínico. Se inyectaron 20 µL en todas las muestras analizadas en este cromatograma,
adicionalmente se realizó la inyección de; laminarina estándar, fucoidina estándar, laminaritriosa
y laminaritetraosa. El procedimiento cromatográfico se efectuó con un tiempo de retención de 25
min. , a un flujo de 1 mL/min a temperatura ambiente.
88
Figura 13. Cromatograma de estándares. Se inyectaron 20 µL de las siguientes muestras:
laminarina estándar y fucoidina estándar. El procedimiento cromatográfico, se efectuó con un
tiempo de retención de 25 min. a un flujo de 1 mL/min y temperatura ambiente.
89
Figura 14. Cromatograma de extractos algales de Macrocystis pyrifera, obtenidos por las
distintas metodologías de extracción según Deville et al. Se inyectaron 20 µL de las siguientes
muestras; extracto protocolo Black, extracto protocolo Nuevo y extracto protocolo Yvin’s. Con un
tiempo de retención de 25 min. a un flujo de 1 mL/min a temperatura ambiente.
90
En lo que respecta a la detección de Laminarina, no es menor considerar que ésta puede
variar su tiempo de elución de entre 15 a 17 min. (observando la Figura 12 y Figura 13). Referente
de los extractos por la metodología de Deville et al., los protocolos Black, Nuevo e Yvin’s
presentan un patrón común en cuanto a que, todos presentan los pico de los 10 y 15 min, en mayor
o menor proporción, pero que en definitiva apuntan a la presencia de los polisacáridos en cuestión.
La Figura 15 representa el cromatograma de los extractos de Durvillaea antarctica, de los
protocolos Black, Nuevo e Yvin’s. Se observan picos cercanos a los 15 min. , sugerentes de la
presencia de Laminarina.
4.2 Detección mediante HPLC, de los polisacáridos Laminarina y Fucoidina, obtenidos por la
metodología de extracción según Nakamura – Black.
La detección de fucoidina, fue relativamente simple y en cantidad aceptable en el caso del
protocolo Nuevo de Deville et al., a partir de Macrocytis pyrifera. No así para el caso del
polisacárido Laminarina, cuya detección fue compleja por múltiples factores, además de que
cuando ésta era detectada a partir del protocolo Black y del alga Durvillaea antarctica, se
encontraba en baja cantidad en el extracto o debido a factores ambientales, el alga analizada no
contenía el polisacárido de Laminarina, por lo que desarrollar métodos alternativos, más eficientes
o con mayor rendimiento, fue una alternativa en este trabajo de investigación. En vista de aquello,
se intentó elaborar protocolos viables, en base al método Black y el método desarrollado por
Nakamura (protocolos NB); siendo los resultados positivos en cuánto a presencia de Laminarina,
pero negativos en cantidad del polisacárido extraído.
91
Figura 15. Cromatograma de extractos algales de Durvillaea antarctica, obtenidos por las
distintas metodologías de extracción según Deville et al. Se inyectaron 100 µL de extracto del
protocolo Black, Nuevo e Yvin’s. El procedimiento cromatográfico se efectuó con un tiempo de
retención de 25 min. a un flujo de 1 mL/min y temperatura ambiente.
92
En vista de ello, se optó por mantener la metodología de Deville et al., (protocolo Black),
como método base para realizar la extracción de este polisacárido. Aun así, los resultados obtenidos
por medio del protocolo NB, figuran en la Figura 16 para NB 01 a NB05 y Figura 17, del protocolo
NB 06 a NB09.
Para la determinación de la concentración de fucoidina se seleccionó el extracto logrado por
medio del protocolo Nuevo según Deville et al., y a partir del alga Macrocytis pyrifera. Por otra
parte, para determinar la concentración de laminarina se seleccionó el protocolo Black según
Deville et al., a partir del alga Durvillaea antarctica.
4.3 Contenido de laminarina y fucoidina en los extractos algales.
Esta selección se basó en los cromatogramas que mostraban un peak cercano a los 10 min.
para fucoidina y otro a los 15 min. para laminarina, las áreas de estos peaks se utilizaron para la
determinación de la concentración de los polisacáridos, utilizando las curvas de calibración de los
estándares de fucoidina (ANEXO 4.1) (y = 12,477 x – 48,564) y laminarina (ANEXO 4.2) (y =
10,614 x – 11,939).
93
Figura 16. Cromatograma de extractos algales de Durvillaea antárctica, obtenidos por la
metodología de extracción según Nakamura – Black. Se inyectaron 100 µL de extracto del
protocolo NB01 a NB05, procedimiento cromatográfico realizado con un tiempo de retención de
25 min. a un flujo de 1 mL/min y a temperatura ambiente.
94
Figura 17. Cromatograma extractos de protocolos Nakamura – Black del alga Durvillaea
antarctica. Se inyectaron 100 µL de extracto del protocolo NB06 al NB09, procedimiento
cromatográfico realizado con un tiempo de retención de 25 min. a un flujo de 1 mL/min y a
temperatura ambiente.
95
4.4. Hidrólisis enzimática de polisacáridos. 4
4.4.1 Estandarización del método DNS (ANEXO 3.1). Los ensayos realizados por Díaz (2011),
apuntaron a la forma correcta y estandarizada en la que se debía realizar el método DNS, a raíz de
las diferencias que figuraban en las fuentes bibliográficas. La metodología, consistió en;
a. Mezclar 3 mL de muestra con 3 mL de reactivo de DNS.
b. Incubación a 90°C durante 15 min, y luego enfriar a temperatura ambiente.
c. Agregar 1 mL de Tartrato de Na y K al 40%.
d. Para finalizar, medición de la absorbancia a 540 nm, que corresponde a la longitud de onda,
donde se obtiene la mejor linealidad con un R2 = 0,9861.
En la Figura 18 y 19, 20 y 21 se exponen los resultados del test de glucosa y DNS
respectivamente. Estos ensayos fueron realizados a los productos de hidrólisis de los estándares de
laminarina, fucoidina y a los extractos obtenidos por la aplicación del protocolo Nuevo en el caso
del alga Macrocytis pyrifera y protocolo Black, para el alga Durvillaea. antarctica.
4 La Hidrolisis enzimática de polisácaridos, fue desarrollada en el Laboratorio de Biotecnología del ICYTAL por
Andrea Díaz C., estudiante tesista de Bioquímica UACh, adscrito al proyecto FONDEF D07I 1095. En esta
oportunidad, los resultados serán utilizados como fundamentación y soporte de las actividades fisiológicas estudiadas
en este trabajo de investigación.
96
Figura 18. Hidrólisis enzimática de estándares. Las gráficas muestran los resultados
obtenidos de los procesos de hidrólisis enzimática a las 48 h, con β-glucanasa y laminarinasa,
sobre: Laminarina (A), Fucoidina (B), siendo la respuesta la glucosa liberada detectada con test
de glucosa. La fucoidina no fue sometida a hidrolisis enzimática con laminarinasa, ya que esta
enzima no tiene actividad hidrolítica sobre este polisacárido. Figura extraída desde Díaz, 2011.
A
B
97
Figura 19. Hidrólisis enzimática de extractos algales. Las gráficas muestran los resultados
obtenidos de los procesos de hidrólisis enzimática a las 48 h, con β-glucanasa y laminarinasa,
sobre: extracto de D. antarctica (A) y extracto de M. pyrifera (B), siendo la respuesta la glucosa
liberada detectada con test de glucosa. Figura extraída desde Díaz, 2011.
A
B
98
Figura 20. Test de DNS de muestras estándar de laminarina y fucoidina. Se realizó una
hidrólisis enzimática de 48 h, para luego aplicar el test de DNS a las muestras obtenidas. Estas
se analizaron como extracto crudo, digeridas enzimáticamente con laminarinasa y β-glucanasa.
A. Laminarina; B. Fucoidina. La fucoidina no fue sometida a hidrolisis enzimática con
laminarinasa, ya que esta enzima no tiene actividad hidrolítica sobre este polisacárido. Figura
extraída desde Díaz, 2011.
A
B
99
Figura 21. Test de DNS de extractos algales. Se realizó una hidrólisis enzimática de 48 h,
luego se realizó un test de DNS a las muestras obtenidas. Estas se analizaron como extracto
crudo, degradadas con laminarinasa e hidrolizadas con β-glucanasa. A, D. antarctica; B. M.
pyrifera. Figura extraída desde Díaz, 2011.
A
B
100
Si se comparan las metodologías del test de glucosa y DNS aplicados a los extractos de
Macrocystis pyrifera y Durvillaea antarctica, tenemos que, por el método del test de glucosa
(Figura 19A) si existe actividad sobre M. pyrifera, pero sólo por parte de la enzima β - glucanasa,
ya que esta es no específica y actúa hidrolizando enlaces β – glucosídicos indistintamente, no así
Laminarinasa que sólo actúa sobre el polisacárido de Laminarina, claramente reflejado en la Figura
19A, ya que el extracto de M.pyifera sólo contiene Fucoidina o en su defecto, Laminarina en una
muy baja cantidad. Respecto a la Figura 19B, ésta es relacionable al hecho de que el extracto de D.
antarctica contiene laminarina y por ende la acción enzimática de laminarina, debiese arrojar
resultados positivos en cuanto a presencia de glucosa detectable por la metodología del test de
glucosa. La enzima β – glucanasa, también es efectiva en este caso, pues es no específica y genera
cortes hidrolíticos de igual forma en este polisacárido, así como también en otro que estén presentes
en el extracto, lo que explica la mayor cantidad de residuos de glucosa detectables en el caso de la
β - glucanasa comparada a laminarinasa. Referente a la Figura 21A y 21B, éstas también son
concluyentes a la hora de ratificar la acción de ambas enzimas y que efectivamente hay presencia
de fucoidina y laminarina en los extractos. Si se comparan ambas metodologías en relación a su
efectividad o utilidad en cuanto a detección de productos de hidrolisis tenemos que; el método
DNS detecta azúcares reductores, que normalmente son monosacáridos, por lo tanto se deduce que
en el caso de la Figura 21, el hecho de que se haya detectado más azúcar reductor que glucosa
(como en el caso de la Figura 19), obedece a que la digestión enzimática genera productos de
hidrólisis variados, y no exclusivamente glucosa, que es la que únicamente detecta el test de
glucosa. Por lo tanto, en términos de sensibilidad la técnica DNS es superior al test de glucosa,
pero inferior en especificidad por glucosa. Para efectos de corroborar la acción enzimática sobre
los extractos estudiados, ambas técnicas son igual de útiles y entregan información relevante.
101
4.5 Detección de los productos de hidrólisis de Laminarina y Fucoidina mediante HPLC
La Figura 22 comprende los estándares de los polisacáridos y productos de hidrolizis
(laminaritriosa y laminaritetraosa). En esta última se reitera la patrón de elución de acido algínico
y fucoidina, muy cercanos ambos a los 10 min. , pero aun más impotante, se asevera que los
productos de hidrolizis de estos polisacáridos, no eluyen o no son detectados por el detector IR
antes de los 17 min. (17-22 min.) . Los productos de hidrolizis específicos de laminarina en
conjunto con laminarinasa, eluyen entre los 17-19 min.
Por otra parte, la detecion de productos de hidrolizis de laminarina y fucoidina, por la
utilización de enzimas hidroliticas β- glucanasa y laminarinasa, es presentada en las Figuras 23 y
24, respectivamente.
En la Figura 23 se exponen los cromatogramas de los productos de hidrólisis del ensayo
enzimático realizado con la enzima β-glucanasa durante 48 h a 60°C a los estándares laminarina,
fucoidina y a los extractos obtenidos del protocolo Nuevo para el alga Macrocystis pyrifera y del
protocolo Black para Durvillaea antárctica. A raíz de esta Figura, se observa que existen pick que
se condicen o relacionan directamente con aquellos de la Figura 22, aseverándose por lo tanto la
presencia efectiva de productos de hidrolisis de los polisacáridos laminarina y fucoidina, así como
también productos de hidrólisis específicos de la acción de laminarinasa sobre laminarina (Figura
23, picks entre 17 y 20 min. ). Esto último, se correlaciona además con los resultados presentados
en las Figuras 19 y 21, que ratifican que la digestión enzimática sobre extractos algales,
efectivamente resulta en la generación de monosacáridos (como fucosa, glucosa o manitol) u
oligosacáridos como laminaritriosa y laminaritetraosa.
102
Figura 22. Cromatograma de estándares de polisacáridos y estándares de productos de
hidrólisis. Los polisacáridos analizados fueron laminarina, fucoidina y ácido algínico y los
productos de hidrólisis corresponden a laminaritriosa (Laminarina3), laminaritetraosa
(Laminarina4), glucosa, fucosa y manitol. Para este procedimiento cromatográfico, se
inyectaron 20 µL de estándares con un tiempo de retención de 25 min. a un flujo de 1 mL/min
y a temperatura ambiente.
103
Figura 23. Cromatograma de productos de hidrólisis de ensayo enzimático con la enzima β-
glucanasa. Los productos de hidrolisis de los estándares de laminarina (Lam + B), fucoidina (Fuc
+ B) y de los extractos algales Macrocystis pyrifera (Mp + B) y Durvillaea antarctica (Da + B)
muestran peaks a los 17 min al igual que los estándares de productos de hidrólisis laminaritriosa
(Lam3), laminaritetraosa (Lam4) y glucosa. Se inyectaron 20 µL de muestras con un tiempo de
retención de 25 min. a un flujo de 1 mL/min a temperatura ambiente. Estos resultados confirman
la eficacia de las enzimas al efectuar cortes del polisacárido y generar Lam 3 y Lam 4.
104
Figura 24. Cromatograma de productos de hidrólisis de ensayo enzimático con la enzima
laminarinasa. Los productos de hidrólisis de los estándares de laminarina, fucoidina y de los
extractos algales de M. pyrifera y D. antárctica muestran peaks a los 17 min al igual que los
estándares de productos de hidrólisis laminaritriosa (Lam3, verde)), laminaritetraosa (Lam4,
fucsia) y glucosa. Se inyectaron 20 µL de muestras con un tiempo de retención de 25 min. a un
flujo de 1 mL/min a temperatura ambiente.
105
En la Figura 24 se exponen los cromatogramas de los productos de hidrólisis del ensayo
enzimático realizado con la enzima laminarinasa durante 48 h a 37°C a los estándares laminarina,
fucoidina y a los extractos del protocolo Nuevo para el alga M. pyrifera y extracto Black para el
caso de D. antarctica. En esta figura también es posible apreciar peaks cercanos a los 15 - 17 min
que coinciden con los peaks de los estándares de los productos de hidrólisis, sin embargo estos son
de un área menor a la que presentan los estándares de productos de hidrólisis.
4.6 Determinación cualitativa de sulfatos.
En la Figura 25 se observan los resultados del análisis cualitativo de sulfatos los cuales se
presentan como un precipitado blanco que corresponde a BaSO4, el cual precipitó luego de agregar
gotas de BaCl2 a una muestra acidificada previamente con HCl 2M. En todas las muestras
analizadas es posible observar precipitado blanco, siendo menor en el estándar de laminarina que
en el de fucoidina. Con respecto a los extractos, aquel obtenido por el protocolo Black utilizando
el alga D. antarctica presentó mayor contenido sulfatado que el extracto obtenido por el uso del
protocolo Nuevo, para el alga M.pyrifera.
4.7 Determinación de la actividad antioxidante.
4.7.1 Estudio de Estabilidad del método DPPH Brand – Williams.
Ya que la metodología presentaba muchas variaciones tras su revisión bibliográfica, y ésta
además variada en relación al tipo de antioxidante a estudiar, se optó por realizar un ensayo de
estabilidad previo al estudio final de la actividad antioxidante. Este ensayo tuvo como objeto,
determinar las condiciones óptimas a las cuales se debería realizar la prueba, es decir, en
condiciones de oscuridad – luz, temperatura, por cuanto tiempo debería extenderse el ensayo
DPPH, concentración óptima a la que se deberían trabajar los extractos, entre otros.
106
Figura 25. Determinación cualitativa de sulfatos. Los sulfatos se precipitaron como BaSO4,
desde una muestra levemente acidificada. Control positivo MgSO4 1% (A); Estándar de laminarina
1% (B); Estándar de fucoidina 1% (C); Extracto protocolo Black D. antárctica 1% (D); Extracto
protocolo Nuevo M. pyrifera 1% (F). Figura extraída desde Díaz, 2011.
A. B. C.
D. F.
107
4.7.2 Estabilidad del ensayo DPPH en condiciones de Luz – Oscuridad.
Esta prueba se realizó, utilizando una concentración de DPPH (DPPH disuelto en metanol
100%) de 5.10 × 10-5 M, longitud de onda de 517 nm, temperatura ambiente y extendiendo el
ensayo por 24h en condiciones de luz u oscuridad. Se observó por lo tanto como estas
condicionantes, afectaron la estabilidad de la absorbancia propia del DPPH en el tiempo.
Observando la Figura 26, se determinó que la condición de oscuridad es más apropiada para realizar
este tipo de ensayo, que por lo demás se correlaciona con la información bibliográfica, que describe
claramente que el DPPH es altamente inestable si es expuesto a la luz.
4.7.3 Estabilidad del ensayo DPPH a distintas temperaturas.
Se realizó un ensayo de estabilidad del ensayo DPPH a distintas temperaturas (T° ambiente,
37°C, 27°C y 20°C), con el objeto de determinar la temperatura a la cual se consigue el mayor
descenso de la absorbancia para el tipo de extracto utilizado y para los efectos de este estudio
(Figura 27 – 28). Puesto que desde la hora de ensayo en adelante, se experimentó un aumento de
la absorbancia probablemente debido a la inestabilidad de la solución de DPPH (5.10 × 10-5 M),
en todas las temperaturas probadas, se tomó como máximo de absorbancia al cumplirse una hora
de ensayo. Considerado aquello, los mejores resultados se obtuvieron con la aplicación de 37°C,
con lo cual ésta se convirtió en la temperatura de trabajo. Para este ensayo y considerando que en
esta instancia, si se debe visualizar el efecto antioxidante, se utilizaron las siguientes preparaciones:
a) Extracto de protocolo Nuevo Macrocytis pyrifera 5 mg/mL (en metanol 100%).
b) TROLOX 8,00 × 10-5 M (en metanol 100%).
c) Ácido gálico 5,80 × 10-5 M (en metanol 100%).
d) Ácido ascórbico 5,00 × 10-5 M (en metanol 100%).
108
Figura 26. Estabilidad ante la exposición de luz – oscuridad en el ensayo DPPH. A,
representación gráfica de la variación de la absorbancia ante la exposición de luz y oscuridad, en
el tiempo (hasta 6 horas). B, representación gráfica de la variación de la absorbancia ante la
exposición de luz y oscuridad, hasta 1 hora (tiempo óptimo de realización del ensayo DPPH).
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Ab
sorb
anci
a
Tiempo (minutos)
Estabilidad del ensayo DPPH a la exposición de Luz -Oscuridad
Absorbancia Luz Absorbancia Oscuridad
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0 10 20 30 40 50 60 70
Ab
sorb
anci
a
Tiempo (minutos)
Estabilidad del ensayo DPPH a la exposición Luz - Oscuridad
Absorbancia Luz Absorbancia Oscuridad
B
A
109
Figura 27. Estabilidad del ensayo DPPH, frente a la variación de temperatura. Para las cuatro
soluciones probadas, se testeo el descenso de la absorbancia en el ensayo de DPPH como reflejo
de la actividad antioxidante, variando éste según el antioxidante y temperatura utilizada. A,
estabilidad del ensayo DPPH a T° ambiente, B, estabilidad del ensayo DPPH a 37°C.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Ab
sorb
anci
a
Tiempo (minutos)
Estabilidad ensayo DPPH a T° ambiente.
Extracto MP 5mg/mL TROLOX Ácido gálico Ácido ascórbico
A
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Ab
sorb
anci
a
Tiempo (minutos)
Estabilidad ensayo DPPH a 37°C
Extracto MP 5 mg/mL TROLOX Ácido gálico Ácido ascórbico
B
110
Figura 28. Estabilidad del ensayo DPPH, frente a la variación de temperatura. Para las cuatro
soluciones probadas, se testeo el descenso de la absorbancia en el ensayo de DPPH como reflejo
de la actividad antioxidante, variando éste según el antioxidante y temperatura utilizada. A,
estabilidad del ensayo DPPH a 27°C, B, estabilidad del ensayo DPPH a 20°C.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0 50 100 150 200
Ab
sorb
anci
a
Tiempo (minutos)
Estabilidad ensayo DPPH a 27°C
Extracto MP 5mg/mL TROLOX Ácido gálico Ácido ascórbico
A
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0 50 100 150 200
Ab
sorb
anci
a
Tiempo (minutos)
Estabilidad ensayo DPPH a 20°C
Extracto MP 5mg/mL TROLOX Ácido gálico Ácido ascórbico
B
111
4.7.4 Estado estacionario del ensayo DPPH a 517 nm.
La determinación del estado estacionario consistió en determinar a qué tiempo, la
disminución de la absorbancia fue máxima y si la medición era estable en cuanto a variación de la
absorbancia en torno al tiempo establecido (Figura 29). Para este caso, se utilizaron sólo extractos
de Macrocystis pyrifera (contenedores de fucoidina), ya que por referencia y los resultados de las
Figuras 27 y 28, se sabe que este extracto posee actividad antioxidante. Adicionalmente, se reiteran
los resultados obtenidos en la Figuras 27 y 28, puesto hasta una hora de ensayo, el descenso de la
absorbancia es máxima y estable para su medición. Además, este resultado fue previsualizado y
deducido de la Figura 26, puesto si se considera la condición de oscuridad, sólo hasta la hora de
ensayo, se observa estabilidad en los valores de absorbancia.
4.7.5 Determinación de la concentración óptima a utilizar para extractos liofilizados de
Macrocystis pyrifera y Durvillaea antarctica.
La determinación de la concentración óptima a la cual se debía trabajar los extractos
liofilizados, consistió en determinar la disminución de la absorbancia en el ensayo DPPH según la
concentración utilizada. El ensayo fue realizado a 517 nm, 37°C y a una hora de la reacción
antioxidante. Los extractos probados, consistieron en los mejores liofilizados (Según resultados
cromatográficos por HPLC) de extracto según protocolo Nuevo de Macrocystis pyrifera y
protocolo Black para Durvillaea antarctica, cada uno de ellos probados por triplicado. Según la
Figura 30, todos los extractos probados, resultaron ser buenos antioxidantes (por la disminución de
la absorbancia) a 5mg/mL, ya que aparentemente a concentraciones mayores, la solución se satura
y arroja resultados de absorbancia no concordantes, así como también, concentraciones menores a
5 mg/mL, no equivalen a un máximo de actividad antioxidante.
112
Figura 29. Estado estacionario del ensayo DPPH a 37°C y 517 nm. Los extractos MP
corresponden a extractos de Macrocystis pyrifera, pero de orígenes geográficos y estacionales
distintos. Cada extracto se conformó de un triplicado.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0 50 100 150 200 250 300
Ab
sorb
anci
a
Tiempo (minutos)
Estado estacionario ensayo DPPH a 37°C 517 nm.
Extracto MP 5 mg/mL (1) Extracto MP 5mg/mL (2)
113
Figura 30. Concentración óptima a utilizar para extractos liofilizados de Macrocystis pyrifera
y Durvillaea antarctica. Cada extracto utilizado (MP o Macrocystis pyrifera 1 – 10, DA o
Durvillaea antarctica 1 - 2) fue realizado en triplicado, utilizando concentraciones de 1 a 10
mg/mL, se midió la actividad antioxidante de los extractos sólo por la disminución de la
absorbancia del ensayo DPPH. La prueba se realizó midiendo la absorbancia a 517 nm, 1 h de
ensayo, 37 °C y en condiciones de oscuridad.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 2 4 6 8 10 12
Ab
sorb
anci
a
Concentración Extracto algal (mg/mL)
Concentración óptima a utilizar para extractos liofilizados de Macrocystis pyrifera y Durvillaea antarctica.
Extracto MP (1) Extracto MP (2) Extracto MP (3) Extracto MP (5)
Extracto MP (5) Extracto MP (6) Extracto MP (7) Extracto MP (8)
Extracto MP (9) Extracto MP (10) Extracto DA(1) Extracto DA2
114
4.7.6 % de Inhibición del radical libre DPPH (%IRL).
Según Von Gadow et al., (1997), Sánchez – Moreno et al., (1997) y KushoSki et al., (2005),
una de las formas de representar la actividad antioxidante de un agente antioxidante, es determinar
el %IRL, representando cuanto radical libre, o en otras palabras, cuanto potencial oxidante ha sido
inhibido por el antioxidante. La determinación del %IRL, se lleva a cabo por el cálculo a través de
la formula indicada en la sección de materiales y métodos.
Los extractos utilizados para probar la actividad antioxidante, consistieron en extracto por
protocolo Nuevo de Macrocytis pyrifera o MP (contenedor de fucoidina) y extracto de protocolo
Black de Durvillaea antarctica o DA (contenedor de laminarina). Se trabajó en base a los
resultados conseguidos en la Figura 30, dónde el extracto MP 3 y DA2, fueron los que consiguieron
un mayor descenso de la absorbancia en el ensayo DPPH a una concentración óptima de 5mg/mL.
Estos extractos fueron probados considerando los resultados de todo el ensayo de estabilidad, es
decir, 517 nm, 37 °C, 1 h de ensayo y condición de oscuridad, además de realizar triplicados para
ambos extractos MP y DA. Se midió el %IRL a distintas concentraciones de estándares
antioxidantes tales como; TROLOX, ácido ascórbico y ácido gálico, para establecer una referencia
en cuanto a la potencia antioxidante. La absorbancia a 517 nm al minuto cero del ensayo fue de
0,383 y la absorbancia a la hora de ensayo, corresponde a cada valor de absorbancia promedio, que
figura en la Tabla XIX.
4.7.7 % DPPH remanente, EC50, TEC50 y AE.
Este parámetro fue determinado como consecuencia directa del % IRL, puesto denota el
porcentaje restante de DPPH que queda en la solución sin reducir o en otras palabras, la cantidad
de DPPH que no ha sido sometida al efecto antioxidante.
115
Tabla XIX. % Inhibición del radical libre DPPH
Agente antioxidante Concentración %IRL Abs 517 nm ± DE
TROLOX 1,60 × 10-4 M 89,56% 0,04 ± 0,002
4,00 × 10-4 M 85,90% 0,054 ± 0,002
8,00 × 10-5 M 81,20% 0,072 ± 0,003
Ácido Ascórbico 1,10 mM 93,47% 0,025 ± 0,001
2,30 × 10-4 M 72,84% 0,104 ± 0,002
2,80 × 10-4 M 69,20% 0,118 ± 0,002
5,00 × 10-5 M 26,89% 0,280 ± 0,005
Ácido gálico 1,40 mM 94,26% 0,022 ± 0,002
5,80 × 10-4 M 95,82% 0,016 ± 0,005
6,00 × 10-4 M 93,73% 0,024 ± 0,003
5,80 × 10-5 M 85,12% 0,057 ± 0,001
Extracto Macrocytis pyrifera 5,0 mg/mL 81,72% 0,070 ± 0,002
Extracto Durvillaea antarctica 5,0 mg/mL 36,30% 0,244 ± 0,020
116
El % DPPH remanente se calcula por medio de la siguiente fórmula;
% DPPH remanente = Absorbancia 517 nm muestra / Absorbancia 517 nm control × 100
Donde la absorbancia a 517 nm de la muestra, corresponde a la absorbancia conseguida por
un extracto en particular que posee actividad antioxidante y la absorbancia control, corresponde a
la absorbancia del DPPH sin ser sometido a algún agente antioxidante. Ya que él % DPPH
remanente, es útil para determinar la cantidad de agente antioxidante necesario para disminuir en
un 50 % la absorbancia de DPPH (50 % de DPPH remanente) (EC50), se trabajó en esta oportunidad
con los extractos comprendidos en la tabla XIX, pero esta vez, abarcando un mayor espectro de
concentraciones (1 – 5 mg/mL). Así mismo, se utilizó el % DPPH remanente de las distintas
concentraciones de los extractos antes mencionados, pero comparándolos con el tiempo
transcurrido (0 – 60 min), es decir, para concentraciones de extracto MP y DA de 5 mg/mL, se
determinó como varía el % DPPH remanente en el tiempo (60 min). Con aquello, es posible
conseguir el tiempo necesario para alcanzar el valor de EC50 (TEC50).
En definitiva, la determinación de las ecuaciones de la recta para calcular, tanto EC50 como
TEC50, fueron logradas en un principio por el cálculo del % DPPH remanente según la concentración
utilizada de extracto (Tabla XX) y en segunda instancia o una vez que ya se conocía la
concentración con la cual se conseguía un mejor resultado de porcentaje de DPPH remanente, se
estableció ésta (5 mg/mL) para realizar el estudio de cómo variaba el % DPPH remanente en el
tiempo (Tabla XXI). Las gráficas desde donde se obtienen las ecuaciones de la recta necesarias
para determinar, EC50 y TEC50, se adjuntan en ANEXOS 5.0.
117
Tabla XX. % DPPH remanente según concentración de extracto algal utilizada.
% DPPH remanente + DE
Concentración
extracto algal
(mg/mL)
Extracto Macrocystis
pyrifera.
Extracto Durvillaea antarctica.
1.00 97,17 ± 0,002 87,21 ± 0,007
2.00 76,33 ± 0,008 78.07 ± 0,017
3.00 55,22 ± 0,010 73,89 ± 0,020
4.00 34,22 ± 0,007 69,71 ± 0,009
5.00 19,84 ± 0,003 66,31 ± 0,008
118
Tabla XXI. % DPPH remanente según tiempo de ensayo DPPH.
% DPPH remanente
Tiempo de ensayo (min) Extracto de Macrocytis
pyrifera
Extracto de Durvillaea
antarctica
0 94,78 ± 0,023 98,96 ± 0,006
5 91,55 ± 0,017 96,87 ± 0,024
10 85,11 ± 0,012 94,52 ± 0,015
15 81,22 ± 0,010 92,17 ± 0,016
20 75,02 ± 0,019 89,30 ± 0,022
25 66,84 ± 0,020 86,42 ± 0,006
30 59,53 ± 0,008 82,11 ± 0,005
35 53,00 ± 0,019 77,35 ± 0,013
40 48,30 ± 0,027 72,06 ± 0,029
45 42,04 ± 0,011 68,93 ± 0,032
50 38,38 ± 0,006 64,22 ± 0,041
55 31,44 ± 0,009 61,11 ± 0,008
60 26,23 ± 0,003 58,77 ± 0,007
119
Observando las Tablas XX y XXI, se concluye que los extractos del alga Durvillaea
antarctica, no poseen suficiente actividad antioxidante, para lograr disminuir a la mitad la
concentración de radical libre DPPH, esto considerando que en todos los ensayos realizados en este
trabajo, la concentración óptima de trabajo para los extractos, fue de 5 mg/mL, midiendo valores
de absorbancia a la hora de ensayo. Esto último, no resta el hecho de que extractos de Durvillaea
antarctica, si presentan un %IRL considerable, aunque menor que los extractos provenientes del
alga Macrocystis pyrifera.
Finalmente, se calculó el AE o eficiencia antiradical, inversamente proporcional a EC50 y
TEC50, como parámetro extraordinario para valorar la actividad antioxidante de los extractos de
Macrocystis pyrifera, ya que estos si lograban disminuir al menos en un 50% la actividad oxidante
del DPPH. Los valores de EC50 se obtuvieron por medio de la ecuación de la recta y = -19,677 x +
115,59 (ANEXO 5.1) y los de TEC50 por medio de la ecuación de la recta y = -1,1908 x + 96,757
(ANEXO 5.2). AE por tanto fue determinado como una relación inversamente proporcional entre
EC50 y TEC50. Estos valores son expuestos en la Tabla XXII adjunto a valores bibliográficos para
acido gálico y acido ascórbico, extraídos desde el trabajo de Sánchez – Moreno et al., (1998).
4.7.8 Actividad antioxidante equivalente al Ácido ascórbico (VCEAC) y Actividad antioxidante
equivalente a TROLOX (TEAC).
Al igual que % IRL, % DPPH remanente, EC50, TEC50 y AE, VCEAC y TEAC, son parámetros
muy utilizados para valorar la actividad antioxidante de una muestra sometida a estas pruebas. La
particularidad en este caso, es que la actividad antioxidante se correlaciona con aquella que
presenta el ácido ascórbico (VCEAC) y TROLOX (TEAC), estableciendo una relación de
equivalencia para con estas moléculas antioxidantes, comúnmente utilizadas como estándares.
120
Tabla XXII. EC50, TEC50 y AE de extractos de alga Macrocytis pyrifera.
Parámetro
antioxidante
Extracto de
Macrocystis
pyrifera
5mg/mL
Ácido ascórbico
177 g/kg DPPH
Ácido gálico
171 g/Kg DPPH
EC50 3,33 mg/mL 76 ± 7
g Antioxidante/kg DPPH
26 ± 1
g Antioxidante/Kg DPPH
TEC50 (min) 39,27 1,15 ± 0,08 14,69 ± 1,10
AE (× 10-3) 7,65 11,44 2,62
Clasificación
potencia
antioxidante según
Sánchez – Moreno
et al., (1998)
Alto? Muy alto Medio
121
Para el cálculo de estos parámetros, se hizo uso de las ecuaciones de la recta obtenidas por
medio de las curvas de calibración para el ácido ascórbico y TROLOX (ANEXO 6). Para el caso
del VCEAC, se utilizó la ecuación y = - 0,0021x + 0,2565 y para TEAC, la ecuación y = - 0,0008x
+ 0,0774. Los resultados fueron expresados en µM para TEAC y en mg/L o ppm para VCEAC
(Tabla XXIII). El TEAC no fue aplicable para el caso del extracto de Durvillaea antarctica, porque
el valor de absorbancia de éste, escapaba del rango de absorbancia de TROLOX por el ensayo
DPPH. En la Tabla XXIII además, se agrega información recopilada de Kushoski et al., (2005), en
relación al TEAC y VCEAC de agente antioxidantes naturales, como la acerola y el mango, para
así contar con valores comparativos para un mejor análisis de estos parámetros.
4.7.9 Método de Fenoles Totales (FT) o Método de Folin – Ciocalteu.
Ya que la metodología por ensayo DPPH, permite determinar la capacidad antioxidante de
una muestra en particular, aplicar metodologías como la de los Fenoles Totales, permite especificar
un tanto más, a que componente de la muestra analizada se atribuye dicha capacidad. Por lo tanto,
resultados positivos para el método de fenoles totales, es decir, un resultado de absorbancia
apreciable en la medición a 765 nm o el cambio de color de la solución, de amarillo a azul, equivale
a que la muestra analizada, posee en su constitución compuesto fenólicos con actividad
antioxidante.
Por lo tanto, en esta oportunidad y al igual como se ha llevado a cabo anteriormente, se trabajó
con el mejor extracto de Macrocystis pyrifera y Durvillaea antarctica (triplicados) y a base de la
ecuación de la recta, obtenida de la curva de calibración para el ácido gálico a 765 nm (ANEXO7),
potente antioxidante, comúnmente utilizado en esta metodología.
Las muestras analizadas en esta oportunidad (triplicados todas ellas) consistieron en;
a) Estándar de Laminarina y Fucoidina, a 5mg/mL y 1mg/mL cada uno de ellos.
122
Tabla XXIII. VCEAC y TEAC para extractos de Macrocystis pyrifera y Durvillaea
antarctica.
Parámetro de
actividad
antioxidante
Extracto de
Macrocystis
pyrifera
Extracto de
Durvillaea
antarctica
Acerola Mango
TEAC (µM) + DE 0,370 ± 0,021 ---- 68,0 ± 2,2 13,7 ± 0,4
VCEAC (ppm) +
DE
88,81 ± 0,018 5,95 ± 0,012 959,1 ± 19,0 174,0 ± 0,5
123
b) Extracto de protocolo nuevo de Macrocystis pyrifera y extracto de protocolo Black de
Durvillaea antarctica. Ambos a 5mg/mL.
El ácido gálico fue disuelto en metanol 100%, al igual que los extractos. Los estándares por su
parte, fueron disueltos en agua destilada. Además se realizó un blanco para el solvente metanol
100%, sin obtenerse absorbancia apreciable a 765 nm.
En la Tabla XXIV figuran los datos de la metodología por Fenoles Totales, calculados por
medio de la ecuación de la recta y = 0,0008x + 0,0239.
4.8 Determinación de la Actividad Antibacteriana.
Según la Tabla XVIII de la sección de Materiales y Métodos, se analizó una variedad de
muestras considerable para este estudio, contemplando estándares comerciales de Laminarina y
Fucoidina, Estándar antibióticos como Unasyn®, Sulperazon® e Inem® extractos algales a una
concentración de 5 mg/mL y extractos digeridos enzimáticamente y pick cromatográficos de
laminarina y fucoidina, recolectados desde el mismo HPLC. Para el caso, de los últimos tipos de
muestras, no se observó ninguna clase de inhibición en placa, siendo los resultados para pick
recolectados y extractos digeridos con laminarina y β - glucanasa, completamente negativos a todas
las concentraciones probadas.
Se realizaron placas control con el mismo inóculo y metodología que se realizaron los
antibiogramas, para todas las bacterias en cuestión y con el fin de corroborar el correcto crecimiento
bacteriano, libre cualquier contaminación que invalide las pruebas.
Las placas elaboradas para testear los estándares comerciales de Laminarina y Fucoidina, a
concentraciones de 25 mg/mL ambas, resultaron todas negativas en cuanto a inhibición bacteriana,
lo que se contrarresta para los extractos de Macrocytis pyrifera, que si presentaron actividad
antibacteriana para algunas bacterias.
124
Tabla XXIV. Fenoles Totales en extractos de Macrocytis pyrifera y Durvillaea antarctica.
Concentración Extracto algal o
Estándar polisacárido
Absorbancia 765 nm + DE Fenoles Totales
(representado en
concentración de fenoles
totales, equivalentes a
ppm de ácido gálico) +
DE
Laminarina 5 mg/mL 0,005 ± 0,001 -----
Fucoidina 5 mg/mL 0,037 ± 0,002 16,375 ± 0,012
Laminarina 1 mg/mL 0,019 ± 0,001 -----
Fucoidina 1 mg/mL 0,159 ± 0,003 168,88 ± 0,011
Extracto Macrocystis pyrifera
5 mg/mL
0,069 ± 0,004 56,38 ± 0,018
Extracto Durvillaea antarctica
5 mg/mL
0,041 ± 0,001 21,38 ± 0,022
M. pyrifera (referencial) ----- 125 ± 0,096
D.antarctica (referencial) ----- 130 ± 0,135
125
Las bacterias ATCC que presentaron inhibición frente al uso de extractos de Macrocystis
pyrifera, fueron Bacillus subtilis ATCC 33608, Staphylococcus aureus ATCC 25923,
Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 y Escherichia coli ATCC 25922. La actividad
antibacteriana fue evaluada en relación al halo de inhibición formado en torno al pocillo que
contenía cada preparado de extracto. Además, se estudió el halo de inhibición formado para estas
bacterias, pero contra antibióticos comerciales (preparados comerciales inyectables vía
endovenosa), tales como; Inem®, Sulperazon® y Unasyn®, con el fin de establecer una
comparación en la magnitud del halo de inhibición de estos estándar y el extracto de Macrocystis
pyrifera. El extracto de Durvillaea antarctica no presento inhibición alguna, para ninguna de las
bacterias estudiadas. Ya que este ensayo obedece a un diseño experimental, 8 × 5 × 3, se realizaron
las pruebas en triplicado, donde en cada placa se testeaban cinco diluciones distintas más un control
de H2O estéril, resultando efectiva la prueba solamente para cuatro bacterias y no las ocho
originales que fueron contempladas.
Por lo tanto, en la Figura 31, se incluyen cuatro fotografías que comprenden los cuatro
antibiogramas positivos para halos de inhibición por la aplicación de extractos de Macrocystis
pyrifera. En la Figura 32 por otra parte, se contemplan las fotografías para halos de inhibición por
la aplicación de estándares antibióticos; conjuntamente se realizaron placas control para cada
bacteria, resultando todas ellas correctas en crecimiento bacteriano y libre de contaminación.
(Información no entregada)
En la Tabla XXV se muestran los halos de inhibición en milímetros (promedio de tres
repeticiones más desviación estándar), que son el resultado de la aplicación de preparados en los
pocillos o impregnación de discos filtros.
126
Figura 31. Antibiogramas de Extractos de protocolo nuevo de Macrocystis pyrifera.
En el sentido contrario de las manecillas del reloj, comenzando desde la flecha roja, los pocillos
corresponden a; concentrado, dilución 1:1, dilución 1:2, dilución 1:4, dilución 1:8 y control de H2O
estéril. La concentración de extracto utilizado fue de 25 mg/mL. A, antibiograma para Bacillus
subtilis ATCC 33608, B, Escherichia coli ATCC 25922, C, Staphylococcus aureus ATCC 25923,
D, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228.
A B
C D
127
Figura 32. Antibiogramas de estándares antibióticos Inem®, Unasyn®, Sulperazon®.
En el sentido contrario de las manecillas del reloj y comenzando desde la flecha roja, para A
(Bacillus subtilis), Unasyn®, Sulperazon®, Inem®, para B (Escherichia coli), Unasyn®,
Sulperazon®, Inem®, para C (Staphylococcus epidermidis), Sulperazon®, Inem®, Unasyn®. Los
estándares antibióticos fueron preparados como se señala en la sección de materiales y métodos.
A B
C
128
Tabla XXV. Halos de inhibición bacteriana para Extracto de Macrocystis pyrifera y
estándares antibióticos.
Halos de inhibición (mm) + DE
Concentraciones Bacillus subtilis Escherichia coli Staphylococcus
aureus
Staphylococcus
epidermidis
Concentrado
25mg/mL
1,30 ± 0,064 A
a
2,26 ± 0,09 A
a
3,57 ± 0,06 A
a
5,39 ± 0,03 A
b
1:1 1,16 ± 0,04 A
a
2,11 ± 0,025 A
a
2,77 ± 0,02 B
ab
3,82 ± 0,05 B
b
1:2 0 ± 0 B
a
0 ± 0 B
a
0 ± 0 C
a
0 ± 0 C
a
1:4 0 ± 0 B
a
0 ± 0 B
a
0 ± 0 C
a
0 ± 0 C
a
1:8 0 ± 0 B
a
0 ± 0 B
a
0 ± 0 C
a
0 ± 0 C
a
H2O estéril
(control)
0 ± 0 B
a
0 ± 0 B
a
0 ± 0 C
a
0 ± 0 C
a
Halos de inhibición (nm) + DE para estándar antibiótico.
Inem® 11,74 ± 0,22 a 12,94 ± 0,39 ac 18,74 ± 0,38 b 13,16 ± 0,59 c
Unasyn® 14,29 ± 0,28 a 17,94 ± 0,10 b 22,90 ± 0,11 c 16,18 ± 0,33 b
Sulperazon® 16,59 ± 0,46 a 18,92 ± 0,78 b 20,67 ± 0,49 c 17,58 ± 0,64 ab
Letras mayúsculas diferentes en las columnas, indican diferencia significativa estadística entre
concentraciones de acuerdo a la prueba de rango múltiple de Tukey al 95%. Letras minúsculas diferentes
en las filas, indican diferencia significativa estadística entre bacterias de acuerdo a la prueba de rango
múltiple de Tukey al 95 %.
129
En la Figura 33, se contemplan los resultados comprendidos en la Tabla XXV, para el
concentrado y diluido 1:1 del extracto de Macrocystis pyrifera. Los resultados para los diluidos
1:2, 1:4, 1:8 y H2O estéril fueron todos negativos, sin ninguna formación de halo de inhibición,
siendo no incorporados en la Figura 33.
En cuanto a la Tabla XXV en particular, podemos inferir que; para extractos de protocolo nuevo
para el alga Macrocystis pyrifera, sólo resultaron efectivas para impedir el crecimiento
bacteriológico, los extractos concentrado y con una dilución 1:1, siendo inefectivas las diluciones
1:2, 1:4 y 1:8, además de no presentarse inhibición alguna en el pocillo control. De forma adicional,
la bacteria más fuertemente inhibida resultó ser S. epidermidis, con un halo de inhibición de 5,39
± 0,03 mm para el concentrado y de 3,82 ± 0,05 mm para la dilución 1:1 del extracto probado
(demostrable también por Figura 33). La segunda bacteria más fuertemente inhibida, fue S. aureus,
con un halo de inhibición de 3,57 ± 0,06 mm para el concentrado y otro de 2,77 ± 0,02 mm para la
dilución 1:1, le siguen a éste, E. coli, con un halo de inhibición para el extracto concentrado de
2,26 ± 0,09 mm y de 2,11 ± 0,025 mm para el extracto con dilución 1:1 y finalmente, con la menor
inhibición de crecimiento, la bacteria B. subtilis, con halos de inhibición de 1,30 ± 0,064 mm y
1,16 ± 0,04 mm, para el extracto concentrado y 1:1 respectivamente.
Al analizar estadísticamente la inhibición bacterial mediante análisis de varianza (ANDEVA),
fue posible comprobar para el caso del extracto concentrado sobre S. epidermidis, que éste presenta
diferencia significativa (p < 0,05) con respecto a las tres bacterias restantes, como se observa en
las letras minúsculas de la fila del concentrado. Para el caso de la dilución 1:1 sobre S. epidermidis,
no existe diferencia significativa si comparamos a ésta con S. aureus por análisis ANDEVA (p >
0,05) y por las letras minúsculas de la fila dilución 1:1 (letras minúsculas iguales entre ambas
bacterias). Además, para el caso de la fila
130
Figura 33. Inhibición de Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus y
Staphylococcus epidermidis por efecto de las distintas diluciones de extracto de Macrocystis
pyrifera. A, inhibición del crecimiento bacteriano correspondiente al extracto concentrado de
Macrocystis pyrifera (25 mg/mL), B, inhibición del crecimiento bacteriano correspondiente a una
dilución 1:1 del extracto de Macrocystis pyrifera.
1,3
2,26
3,57
5,39
0
1
2
3
4
5
6
Concentrado
Hal
o d
e in
hib
ició
n (
mm
)
Extracto concenrado de Macrocystis pyrifera
Bacillus subtilis Escherichia coli
Stahphylococcus aureus Staphylococcus epidermidisA
1,16
2,11
2,77
3,82
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
Dilucion 1
Hal
o d
e in
hib
ició
n (
mm
)
Extracto diluido 1:1 de Macrocystis pyrifera
Bacillus subtilis Escherichia coli
Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidisB
131
del extracto concentrado, podemos indicar que no existe diferencia significativa (p < 0,05) entre
Bacillus subtilis, Escherichia coli y Staphylococcus aureus; por otra parte, y observando la fila
dilución 1:1, tampoco existió diferencia significativa entre Bacillus subtilis, Escherichia coli y
Staphylococcus aureus.
Para el caso de los controles antibióticos, todos presentaron una inhibición del crecimiento
bacteriano mucho más fuerte y en todas las bacterias, que el extracto probado. Analizando la acción
de estos antibióticos sobre cada bacteria estudiada y no sobre distintas concentraciones (como el
caso del extracto), tenemos que; Inem® inhibe más fuertemente a Staphylococcus aureus, seguido
de S. epidermidis, luego E. coli y finalmente B. subtilis. Además, existe diferencia significativa (p
< 0,05) de magnitud de la inhibición entre B. subtilis, S. aureus y S. epidermidis, pero no existe
diferencia significativa (p > 0,05) entre E. coli y B. subtilis o S. epidermidis. Desde otra perspectiva,
Unasyn®, inhibe fuertemente y en primer lugar a S. aureus, luego a E. coli, S. epidermidis y
finalmente a B.subtilis. En términos de análisis ANDEVA, existe diferencia significativa (p > 0,05)
entre B. subtilis, E. coli y S. aureus, pero no entre E. coli y S. epidermidis (letras minúsculas iguales
en Tabla XXV). En última instancia, Sulperazon®, inhibe de mejor forma a S. aureus, luego a E.
coli, para seguir con S. epidermidis y finalmente B. subtilis. En cuanto a diferencia significativa, si
existe entre B. subtilis, E. coli y S. aureus, pero no entre S. epidermidis y E. coli. (p < 0,05 y letras
minúsculas iguales en la fila).
Comparando los resultados de la prueba del extracto de Macrocytus pyrifera y estándares
antibióticos, claramente observamos una superioridad notable de estos últimos y el extracto, aún
cuando se trate del concentrado o dilución 1:1 del extracto. Sólo para el caso del extracto probado,
se observó concordancia en cuanto a que, la inhibición bacteriana debe disminuir a medida que el
agente a probar, se somete a dilución. No se observa concordancia en relación a que, para el caso
132
de Staphylococcus epidermidis, se observó diferencia significativa entre esta bacteria y
Staphylococcus aureus para el extracto concentrado, pero no así cuando se trataba del extracto con
dilución 1:1, revelando que no existe diferencia en la inhibición del crecimiento bacteriano para
estas bacterias, cuando se trata de la aplicación de una dilución 1:1.
Finalmente, se concreta el hecho que, los extractos de Macrocystis pyrifera contenedores de
fucoidina, si presentaron actividad antibacteriana, lo que no ocurrió con las muestras estándar de
Fucoidina 25 mg/mL. Si corresponde que el extracto de Durvillaea antarctica no haya presentado
actividad alguna, puesto que el estándar de Laminarina 25 mg/mL tampoco fue efectivo en ningún
grado o magnitud para inhibir el crecimiento de algunas de las bacterias estudiadas.
4.9 Determinación de la actividad antifúngica.
La realización de la actividad antifúngica fue desarrollada en las dependencias del Instituto
de Microbiología Clínica de la Facultad de Medicina de la Universidad Austral de Chile. Según lo
descrito en la sección de Materiales y Métodos, de todos los tipos de muestras ensayadas sobre las
cepas fúngicas estudiadas, no se obtuvo ningún resultado positivo en cuanto a aparición de halo de
inhibición. Esto último se corroboró al aplicar estándar comercial de Laminarina y Fucoidina y no
conseguirse ninguna clase de inhibición del crecimiento fúngico. En las Figuras 34 y 35, se
exponen algunos de los resultados negativos para el género Candida y Aspergillus respectivamente,
pero sólo para algunas de las muestras ensayadas.
133
Figura 34. Actividad antifúngica de Estándar comercial de Laminarina 25 mg/mL y
Fucoidina 25 mg/mL. En el sentido contrario de las manecillas del reloj, desde la flecha roja,
concentrado, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8 y control (H2O estéril). A, Candida albicans, para estándar comercial
de Laminarina 25 mg/mL, B, Candida guillermondii, para estándar comercial de Fucoidina 25
mg/mL, C, Candida Krusei, para estándar comercial de Laminarina 25 mg/mL.
A B
C
134
Figura 35. Actividad antifúngica para el género Aspergillus. A, Extracto de Durvillaea
antarctica, arriba Aspergillus terreus, abajo Aspergillus fumigatus, B, Extracto de Durvillaea
antarctica, arriba A. flavus, abajo A. niger, C, Extracto de Macrocystis pyrifera, arriba A. terreus,
abajo A. fumigatus, D, Extracto de Macrocystis pyrifera, arriba A. flavus, abajo A. niger, E,
Fucoidina estándar, arriba A. terreus, abajo A. fumigatus, F, Laminarina estándar, arriba A. flavus,
abajo A. niger.
A B C
D E F
135
5. DISCUSIÓN
En lo que respecta el proceso de extracción de las materias primas algales, tenemos que;
observando la Figura 12 (página 89), los monosacáridos glucosa, fucosa y manitol no revierten un
posible interferente en cuanto a tiempo de elución, comparado con los picos principales y objeto
central de este trabajo de tesis, es decir, los picos referentes a fucoidina y laminarina, que eluyen a
los 10 min y 15 – 17 min respectivamente. De igual forma, los productos de hidrólisis enzimática
como laminaritriosa y laminaritetraosa y su tiempo de elución de aproximado de 18 y 19 min
respectivamente, tampoco son sinónimo de conflicto a la hora de identificar los picos principales a
detectar en los cromatogramas. Según el cromatograma de los estándares comerciales (Figura 13,
página 90), se obtiene una relación directa con la Figura 12, ya que el estándar de fucoidina siempre
eluye en torno a los 10 min y antes que el picos de ácido algínico. De igual forma, el pico de
laminarina comercial, eluye en esta oportunidad cercano a los 15 min, manteniéndose el rango
aproximado de elución, de 15 – 17 min. Según Ortiz (2011), los extractos de Macrocystis pyrifera
debiesen contener mayor proporción del polisacárido estructural fucoidina, que del polisacárido de
reserva, laminarina, lo cual es consistente con que en la Figura 14, todos los procesos extractivos
elaborados por Deville et al., entregan una proporción aceptable de fucoidina, pero en menor grado
de laminarina (a excepción de protocolo Yvin’s), siendo el protocolo Nuevo, el que resulta en una
mayor cantidad (Según área de pico) de fucoidina. Por otra parte, para el caso del proceso de
extracción desde Durvillaea antarctica, el protocolo Black se convirtió en el mejor proceso
extractivo para conseguir una mayor cantidad de laminarina, lo que también se condice con las
fuentes referenciales, que se refieran a que esta alga contiene un mayor grado de laminarina que
Macrocystis pyrifera, sólo cuando, los factores ambientales así lo promueven. Esto último, se
convierte en una limitante y factor determinante a la hora de intentar extraer en primera instancia
136
estos polisacáridos y por otra parte, en efectivamente detectarlos por la metodología HPLC – IR,
ya que se encuentra perfectamente descrito que, la variación del contenido, aminoacídico, de
tocoferoles, compuestos carotenoides y concentración de polifenoles, entre otros, varía de especie
a especie según la localización geográfica, estaciones del año, exposición a oleaje y a las corrientes,
concentración de nutrientes presentes en el medio, profundidad a la que se localizan, la temperatura
y estado de desarrollo del alga. Sintetizando lo predicho, las condiciones ambientales pueden
promover o restringir totalmente, la síntesis del polisacárido laminarina, ya que la presencia de
ésta, está directamente limitada a la mayor o menor irradiación de luz solar que se utiliza para el
proceso fotosintético, directamente dependiente de la profundidad a la cual se encuentra el alga, a
las condiciones climatológicas (menor luz solar en período de invierno, lo que fomenta la síntesis
de un polisacárido de almacenamiento como laminarina), y a la juventud del alga que ha sido
extraída (algas jóvenes, según condiciones ambientales, puede contener mayor cantidad de
laminarina y fucoidina). Así también, no es de menor importancia mencionar que, la anatomía del
alga pudiese influir en encontrar mayor o menor contenido de estos polisacáridos en las algas
estudiadas, siendo una alternativa para trabajos futuros, realizar un estudio más acucioso sobre
estipes y frondas, así como también correlacionar los resultados, con la fuente de la materia prima,
es decir, la ubicación geográfica y el período estacional a la que corresponde el alga trabajada.
Aun cuando las metodologías elaboradas por Deville et al., fueron el principal foco de trabajo,
la elaboración de protocolos alternativos como Nakamura – Black se convirtieron por momentos
en opciones no menores para experimentar en torno a, cuánta cantidad de laminarina se podía
conseguir, ya que ésta revestía el principal problema de detección de este trabajo, debido a que
siempre se encuentra en mucho menor proporción, independiente de la materia prima, que el
polisacárido de fucoidina. A raíz de la Figura 16 (página 95), se tiene que para estos protocolos
137
NB, se consigue una menor de laminarina en relación al protocolo Black elaborado de Deville y
aplicada al alga Durvillaea antarctica.
A pesar de que, el trabajo en torno a los productos de hidrólisis no fue productivo en ninguna
de las actividades ensayadas, se realizó el proceso de detección de estos según si se aplicaba la
enzima β - glucanasa o laminarinasa (Figura 23 y 24 respectivamente). En ambos casos, la
detección de laminaritriosa o laminaritetraosa fue positiva, siendo algo menor en el caso de la β-
glucanasa, por ser ésta una enzima de menor especificidad para la hidrólisis exclusiva de
laminarina.
Para determinar la concentración de fucoidina entonces, se seleccionó el extracto logrado con
el protocolo Nuevo a partir de M. pyrifera. Mientras que para determinar la concentración de
laminarina se optó por el extracto del protocolo Black de D. antarctica. Esta elección se basó en
que el protocolo Nuevo de M. pyrifera extrae mayoritariamente fucoidina, mientras que el
protocolo Black de D. antarctica es más específico para conseguir buenas cantidades de
laminarina. Las áreas de los respectivos picos se utilizaron para la determinación de concentración
de los polisacáridos, utilizando las curvas de calibración de los estándares fucoidina (y = 12,477 x
– 48,564) y laminarina (y = 10,614 x – 11,939) (Anexo 4.1 y 4.2 respectivamente). Esto resultados
indican que el extracto de M. pyrifera correspondía en un 100% a fucoidina mientras que el extracto
de D. antarctica presenta un 79% de laminarina.
En otra instancia y respecto a la actividad enzimática de las enzimas β – glucanasa y
laminarinasa sobre los extractos de Macrocystis pyrifera y Durvillaea antarctica, se realizaron
pruebas de detección de los productos de hidrólisis. Es este punto, el test de glucosa y el método
estandarizado del DNS, son relevantes para determinar si las enzimas efectivamente fueron activas
enzimáticamente frente a los extractos. Podemos decir por lo tanto, que aunque esta sección era
138
primordial para desarrollar parte de la hipótesis de este trabajo, era aún más relevantes para
determinar si existía o no presencia de los polisacáridos en estudio (sobre todo laminarina, por
especificidad hidrolítica de una de las enzimas por este polisacárido). Se obtuvo entonces que, para
ambos casos si existía una hidrólisis enzimática positiva, siendo ésta más sensible, pero más
inespecífica para el caso del test del DNS y más específica, pero menos sensible para el test de
glucosa. Esto último ya que, el test del DNS detecta azúcares reductores, que comprende
mayoritariamente monosacáridos como productos de hidrólisis probables, detectando por ende
mayor cantidad de posibles productos hidrolíticos en relación al test de glucosa, que sólo se refiere
a la detección exclusiva de glucosa.
Referente a la medición de la actividad antioxidante para extractos de Macrocystis pyrifera y
Durvillaea antarctica, podemos mencionar que, los mejores resultados se consiguieron en torno a
extractos de M. pyrifera, con un % IRL (Tabla XIX, página 117) en torno al 81,72 % siempre
cercano a los rangos de estándares antioxidantes, como TROLOX, ácido gálico y ácido ascórbico.
Extractos de D. antarctica, siempre presentaron menor actividad antioxidante (% IRL del 36,30
%). Si consideramos la concentración óptima de trabajo para extractos algales, 5 mg/mL, los
extractos de M. pyrifera vuelven a ser superiores que los de D. antarctica, esta vez en el % DPPH
remanente (Tabla XX, página 119), 19,84 % y 66,31 % respectivamente, denotando que el extracto de
M. pyrifera ejerce una actividad antioxidante más potente, al dejar menor cantidad de DPPH libre
o en estado reducido en el medio. En relación a la Tabla XXII (página 122), los parámetros EC50,
TEC50 y AE, comprenden otra herramienta para establecer la actividad antioxidante de un agente
antioxidante en particular, así tenemos que, el extracto de M. pyrifera, posee un EC50 aceptable en
comparación con el ácido ascórbico y ácido gálico, pero un TEC50 un tanto alto, lo que equivale a
que el extracto es un buen antioxidante, pero lento en su acción en relación a los estándares con los
139
que se compara en esta figura, y que según la clasificación de Sánchez – Moreno et al.,
correspondería aparentemente (por carecer de rangos de referencia) a un agente antioxidante de
alta potencia. La eficiencia antiradical para el extracto de M.pyrifera por tanto es excelente, pero
menor al ácido ascórbico, que es considerado un agente con una altísima potencia antioxidante. De
forma adicional, EC50 demuestra que, sólo se necesita de una concentración de 3,3 mg/mL para
conseguir la mitad de la inhibición del DPPH. Además, la Tabla XXIII (página 124) demuestra que
el extracto de D. antarctica sigue siendo menor en cuanto a actividad antioxidante y que la Acerola
y Mango son agentes antioxidantes muy potentes, pues consiguen valores de TEAC y VCEAC
importantes, considerando que el TROLOX y ácido ascórbico ya son fuertes antioxidantes. Ante
esto último, podemos inferir que, a pesar que según los parámetros EC50, TEC50 y AE son buenos
para el extracto de M. pyrifera, el TEAC y VCEAC son menores, ya que ésta corresponde a una
comparación directa de la capacidad antioxidante de dos conocidos antioxidantes y un agente
nuevo que se prueba. Por lo tanto, el extracto de M.pyrifera sólo equivale a 0,370 ± 0,021 µM de
Trolox y a 88,81 ± 0,018 ppm de ácido ascórbico. La Tabla XXIV por tanto (página 126), se refiere
a la medición de fenoles totales, por la metodología de Folin-Ciocalteu que mide el aumento de la
absorbancia a 765 nm y es útil para la determinación de antioxidante fenólicos y polifenólicos. La
Tabla XXIV demuestra además que, para el estándar de Laminarina si existe absorbancia a 765
nm, debido a una absorción a esa longitud de onda propia de laminarina o de algún producto de
reacción una vez sometida la muestra a los reactivos del método de fenoles totales. Para el caso de
fucoidina 5 mg/mL y 1 mg/mL, también se presentó lectura de absorbancia,pero mayor que en el
caso de laminarina, posiblemente a las mismas razones anteriores, ya que el estándar comercial de
fucoidina proviene de Fucus vesiculosus, donde se conoce que este tipo de fucoidina no contiene
compuestos fenólicos en su estructura, sino que contiene fucosa y sulfato. Adicionalmente, la
140
actividad antioxidante que reporta fucoidina, y algunos polisacáridos, se debe en gran parte a los
radicales hidroxilados de estos y no a la estructura resonante propia de los fenoles, o grupos fenil
en su defecto. A pesar de lo anterior, resulta más razonable que los extractos de M. pyrifera y D.
antarctica hayan sido positivos para el ensayo de fenoles totales, puesto que en su calidad de
extractos, además de fucoidina o laminarina, puedan contener otros compuestos, a los cuales se les
pueda atribuir la absorbancia resultante de este ensayo. Esto último, se condice con lo señalado en
la Tabla XXIV, puesto que Macrocystis pyrifera presenta una concengtracion de fenoles totales
quivalentes a 125 ppm de ácido gálico y Durvillaea antarctica, una de 130 ppm de ácido gálico,
resaltando el hecho entonces, de que ambas especies algales poseen efectivamente compuestos
fenólicos a los que se les puede atribuir parte de la actividad antioxidante ya demostrada en el
ensayo del DPPH. Dentro de los posibles compuestos fenólicos que pudiesen contener las algas en
cuestión, se encuentran los florotaninos, que según Koivikko (2008), son la única clase de taninos
que se encuentran en algas pardas, consistentes en polímeros de floroglicenoles, que pueden llegar
a constituir aproximadamente el 15 % del peso seco del alga (1 – 1,3 % del peso seco de
Macrocystis pyrifera, según Van Alystyne (1999)). Swanson y Druehl (2002), señalan además que
la síntesis y liberación al espacio marino de florotaninos, está estrechamente relacionada con el
stress UV – A y la protección a radiación UV – B. Cruces et al., (2013) por tanto señala que, la
actividad antioxidante y contenido soluble de florataninos, es positivamente correlacionada con la
exposición a radiación UV y rápidamente inducible a T° > 20 °C para el caso de D. antarctica, la
especie más sensible a la irradiación de temperatura. Esto reafirma aún más, que las condiciones
ambientales, influye fuertemente en la capacidad antioxidante de estas algas.
En relación a la determinación de la actividad antibacteriana, sólo se consiguieron positivos
para el extracto obtenido por protocolo nuevo de Macrocystis pyrifera, siendo éste efectivo en
141
cuanto a aparición de halo de inhibición para las bacterias, Escherichia coli, Staphylococcus
aureus, Staphylococcus epidermidis y Bacillus subtilis. Es altamente probable por antecedentes
bibliográficos, que la actividad antibiótica de este extracto se deba a fucoidina, aun cuando Reichelt
y Borowitzka (1984) señalan que, esta actividad podría deberse también a múltiples principios
activos presentes en este tipo de algas, entre los cuales tenemos, ácidos grasos insaturados, fenoles,
sesquiterpenos halogenados e hidroquinonas bromadas. Howard y Fenical (1978) agregan a la lista
anterior, ácidos grasos libres o formando parte de mono, di y triglicéridos. Una vez más, no se
puede menospreciar el hecho, y señalado por Valdebenito (1981), que cada especie algal posee su
propia periodicidad en la producción del antibiótico. En cambio, otros autores como Hornsey y
Hide (1985) encuentran cuatro patrones de producción de antibiótico, que van desde uniforme todo
el año, hasta máximo producción en invierno, primavera o verano.
Finalmente, en materia de medición de actividad antifúngica, ésta prueba resultó negativa
para todos los tipo de muestra ensayada, no obteniéndose ninguna clase de inhibición de las cepas
fúngicas utilizadas. Esto posiblemente debido a que escasos estudios indican que, el género
Undaria, u otras algas de costas tropicales u orientes, han presentado actividad sobre Trichophyton,
Candida y Saccharomyces, pero no sobre el género Aspergillus. La actividad antifúngica de
fucoidina o laminarina tampoco se encuentra bien especificada en antecedentes bibliográficos.
142
6. CONCLUSIONES.
Para finalizar y considerando los resultados de este trabajo de investigación, es posible concluir
lo que sigue;
a.- A partir del alga Durvillaea antarctica, es posible extraer en mayor cantidad el polisacárido de
reserva, laminarina, mientras que, desde MP se obtiene de mejor forma fucoidina.
b.- El polisacárido laminarina no se encuentra sulfatado en forma natural en cambio fucoidina
presenta un importante contenido de sulfatos.
c.- Respecto a la medición de actividad antioxidante para extractos de Durvillaea antarctica y
Macrocystis pyrifera, podemos mencionar que, los mejores resultados se consiguieron en torno a
extractos de Macrocystis pyrifera, cuyos resultados se asemejan a los obtenidos por medio de
estándares antioxidantes como, TROLOX, Acido Gálico y Acido Ascorbico.
d.- Las especies algales, Durvillaea antarctica y Macrocystis pyrifera, contienen compuestos
fenólicos a los que se les puede atribuir parte de la actividad antioxidante registrada. Entre estos,
los florotaninos serían los taninos que contemplan mayor importancia.
e.- Extractos del alga Macrocystis pyrifera, presentan actividad antibacteriana contra las cepas
bacterianas de, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylocuccus epidermidis y Bacillus
subtilis. Existe una gran probabilidad, que esta actividad pueda deberse al polisacárido fucoidina,
pero no se descarta atribuir esta actividad a otros principios activos presentes en el alga (descrito
por varios autores).
f.- Extractos de las algas Durvillaea antarctica y Macrocystis pyrifera, no presentan actividad
antifúngica alguna, ante las cepas fúngicas estudiadas.
g.- No es de menor importancia mencionar que, la anatomía del alga puede influir en encontrar
mayor o menor contenido de estos polisacáridos, siendo una alternativa para trabajos futuros.
143
Realizar un estudio acucioso sobre estipes y frondas, ubicación geográfica y período estacional,
son variantes importantes a considerar, en la variación en el contenido de polisacáridos que
contienen estas algas.
h.- Finalmente, puesto que tanto Durvillaea antarctica y Macrocystis pyrifera son recursos marinos
nacionales y aplicables a la dieta humana, sería importante considerar a éstas como terapias no
farmacológicas para aprovechar así, las actividades fisiológicas probadas en este trabajo de
investigación. Aun así, trabajos in vivo serían necesarios para avalar de mejor forma, los resultados
obtenidos en esta oportunidad.
144
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160
ANEXOS.
161
ANEXO 1
ANEXO 1.1. PROTOCOLO BLACK DE EXTRACCIÓN DE LAMINARINA Y
FUCOIDINA.
4x
La laminarina es extraída desde el alga seca de acuerdo a la técnica descrita por Black et
al., el alga fue mezclada con HCl 0,09 M (1:10 p/v) a 4°C durante 2 h. se realizan 4 sucesivas
extracciones y la laminarina contenida en el sobrenadante fue precipitada por adición de etanol.
Alga + HCl (1:10 p:v)
120 min 4°C
Centrifugación
Sobrenadante + Alga
Ajustar pH a 2,5
Centrifugación
Sobrenadante + Etanol
Centrifugación
Precipitado
162
ANEXO 1.2. PROTOCOLO BLACK VARIANTE DE EXTRACCIÓN DE LAMINARINA
Y FUCOIDINA.
4x
La laminarina es extraída desde el alga seca de acuerdo a la técnica descrita por Black et
al., hasta la precipitación con etanol. En este caso el sobrenadante no fue mezclado con etanol,
siendo que neutralizado con NaOH 1M, manteniéndose la laminarina en solución.
Alga + HCl (1:10 p:v)
120 min 4°C
Centrifugación
Sobrenadante + Alga
Ajustar pH a 2,5
Centrifugación
Sobrenadante
Neutralización con NaOH
Muestra liquida
163
ANEXO 1.3. PROTOCOLO IVIN DE EXTRACCIÓN DE LAMINARINA Y FUCOIDINA.
La laminarina es extraída desde el alga seca de acuerdo a la técnica descrita por Ivin et
al., el alga fue mezclada con H2SO4 0,09 M (1:10 p/v) a 70°C durante 2,5 h. la laminarina contenida
en el sobrenadante fue precipitada por adición de etanol.
Alga + H2SO4 (1:14 p: v)
150 min 70°C
Centrifugación
Sobrenadante + Etanol
Centrifugación
Precipitado
164
ANEXO 1.4. PROTOCOLO NUEVO DE EXTRACCIÓN DE LAMINARINA Y
FUCOIDINA.
La laminarina es extraída desde el alga seca de acuerdo a la técnica descrita por Ivin et
al., el alga fue mezclada con HCl 0,09 M (1:10 p/v) a 70°C durante 2,5 h. la laminarina contenida
en el sobrenadante fue precipitada por adición de etanol.
Alga + HCl (1:14 p:v)
150 min 70°C
Centrifugación
Sobrenadante + Etanol
Centrifugación
Precipitado
165
ANEXO 1.5. PROTOCOLO NAKAMURA DE EXTRACCIÓN DE LAMINARINA Y
FUCOIDINA.
4x
Alga marina + HCl 0.1 M (1:2 p/v)
Adición de 2L HCl 0.1 M
Homogeneizado
Agitación por shaker a T° ambiente, durante la noche.
Centrifugación 5000 rpm × 20 min.
Sobrenadante.
Ajuste a pH 7.00 con NaOH 5M
Centrifugación a 3000 rpm.
Sobrenadante.
Precipitado (Laminarina + Fucoidina)
Resuspender con EtOH 85%
Centrifugación a 3000 rpm.
166
ANEXO 1.6 PROTOCOLO NAKAMURA –BLACK DE EXTRACCIÓN DE
LAMINARINA Y FUCOIDINA.
Alga marina + HCl 0.1 N
MODIFICACIÓN 1
(Diluciones reaizadas)
MODIFICACIÓN 2
(Procesos realizados)
Filtración
Centrifugar a 5000 rpm por 20 – 30 min.
Sobrenadante
Ajustar pH 7.00 con NaOH 5N + Alga
5000 rpm por 20 min.
Sobrenadante
Coagulación con EtOH 85% (1:2)
Centrifugación 5000 rpm por 20 – 30 min.
Sobrenadante
MODIFICACIÓN 3
(Recirculaciones)
MODIFICACIÓN 4
(Recirculaciones)
Precipitado (Laminarina y Fucoidina)
167
ANEXO 2.
ANEXO 2.1 ESQUEMA DE RECUENTO DE COLONIAS BACTERIANAS.
Eppendorf + Bacteria ATCC
Caldo Soya Tripticasa (CST) (10ml)
Incubar por 24 h a 30°C
9 m
l P
BS
9 m
l P
BS
9 m
l P
BS
9 m
l P
BS
9 m
l P
BS
1 mL
de
CST
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
-2 -3 -4 -5 -6
Agar Soya Tripticasa
( 20 – 30 mL)
Incubación 24 h a 30°C
-7 -8 -9 -10 -1
9 m
l P
BS
9 m
l P
BS
9 m
l P
BS
9 m
l P
BS
9 m
l P
BS
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
100 µL de cada dilución con PBS a placa AST
Recuento de colonias en
Contador de colonias digital.
Ej:
Placa -6: 65 colonias = 6,5 ×10 -7
168
ANEXO 2.2 ENSAYO DE SENSIBILDIAD DE LAS CEPAS DE REFERENCIA FRENTE
A LOS EXTRACTOS DE MACROCYSTIS PYRIFERA Y DURVILLAEA ANTARCTICA.
Eppendorf + Bacteria ATCC
Caldo Soya Tripticasa (CST) (10ml)
Incubar por 24 h a 30°C
9 m
l P
BS
9 m
l P
BS
9 m
l P
BS
9 m
l P
BS
9 m
l P
BS
1 mL
de
CST
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
5 mL
45 mL
Agar Soya
Tripticasa
semisólido
106 ufc/mL
-1 -2 -3 -4 -5
Agar Soya Tripticasa (20 – 30mL)
-6
Alicuotas de 5 – 7
mL 106 ufc/mL
25 µL cada
muestra +
reposo 1 – 3 h.
Incubación 24 h
a 30°C
169
ANEXO 2.3 PREPARACIÓN DE DILUCIONES DE MUESTRAS DE ESTÁNDARES DE
FUCOIDINA - LAMINARINA Y MUESTRAS DE ENSAYO DE ACTIVIDAD
ANTIBIÓTICA.
1.5
ml
conce
ntr
ado
0.7
5 m
l H
2O
des
t est
éril
0.7
5 m
l H
2O
des
t est
éril
0.7
5 m
l H
2O
des
t est
éril
0.7
5 m
l H
2O
des
t est
éril
Conc
.. 1:1 1:2 1:4 1:8
0.75 mL 0.75 mL
0.75 mL 0.75 mL
170
ANEXO 3
ANEXO 3.1 PROTOCOLO SELECCIONADO DE LA ESTANDARIZACIÓN DEL
MÉTODO DE DNS.
Protocolo consistente en la mezcla de 3 mL del Reactivo DNS, más 3 mL de muestra en
estudio. Incubación a 90°C durante 15 min, enfriar a temperatura ambiente, para luego agregar 1
mL de Tartrato de sodio y potasio al 40%, finalmente medir la absorbancia a 540 nm. Como
muestra se utilizó glucosa a distintas concentraciones. Figura extraída de Díaz, AP (2011).
y = 0,863x - 0,0167R² = 0,9832
Ab
sorb
anci
a (n
m)
Concetración glucosa (mg/mL)
Estandarización DNS
171
ANEXO 4.
ANEXO 4.1. CURVA DE CALIBRACIÓN DE FUCOIDINA.
Se realizó una curva de Calibración con fucoidina estándar a las concentraciones: 0, 40, 80,
120, 160, 200 µg , obteniéndose la siguiente ecuación de la recta: y= 12,477x – 48,564 y un R2=
0,9975. Figura extraída de Díaz, AP (2011).
172
ANEXO 4.2. CURVA DE CALIBRACIÓN DE LAMINARINA.
Se realizó una curva de Calibración con laminarina estándar a las concentraciones: 0, 20, 40,
60, 80, 100 µg , obteniéndose la siguiente ecuación de la recta: y= 10,614x – 11,939 y un R2=
0,9943. Figura extraída de Díaz, AP (2011).
y = 10,614x - 11,939
R2 = 0,9943
0
200
400
600
800
1000
1200
0 20 40 60 80 100 120
Contenido de Laminarina (μg)
Are
a (
mV
s)
173
ANEXO 5
ANEXO 5.1 EC50 PARA EXTRACTO DE MACROCYSTIS PYRIFERA
y = -19,677x + 115,59R² = 0,9955
0
20
40
60
80
100
120
0 1 2 3 4 5 6
%D
PP
H r
eman
ente
Concentración extracto Macrocystis pyrifera (MP) mg/ml
EC50 Extracto Macrocystis pyrifera
174
ANEXO 5.2 TEC50 PARA EXTRACTO DE MACROCYSTIS PYRIFERA.
y = -1,1908x + 96,757R² = 0,9961
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50 60 70
%D
PP
H r
eman
ente
Tiempo (min)
TEC50 Extracto Macrocytis pyrifera
175
ANEXO 6
ANEXO 6.1 CURVA DE CALIBRACIÓN TROLOX (TEAC)
y = -0,0008x + 0,0774R² = 0,9902
-0,01
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0 20 40 60 80 100 120
Ab
sorb
anci
a
Concentración (ppm)
Curva de calibración TROLOX
176
ANEXO 6.2 CURVA DE CALIBRACIÓN ÁCIDO ASCÓRBICO (VCEAC)
y = -0,0021x + 0,2565R² = 0,9835
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0 20 40 60 80 100 120
Ab
sorb
anci
a
Concentración (ppm)
Curva de calibración Ácido ascórbico
177
ANEXO 7
ANEXO 7.1 CURVA DE CALIBRACIÓN DE ÁCIDO GÁLICO A 765 nm (MÉTODO DE
FENOLES TOTALES).
y = 0,0008x + 0,0239R² = 0,9866
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0 20 40 60 80 100 120
Ab
sorb
anci
a 7
65
nm
Concentración ácido gálico (ppm)
Curva de calibración ácido gálico 765 nm