Fibrosis Quistica

Enfermedad Fibroquistica del PáncreasMucovisidosis

Bioq. Raúl Horacio Lucero

Presentación Clínica

Insuficiencia pancreática exócrina, con sus consecuencias nutricionales.

Enfermedad pulmonar crónica (infecciónes recurrentes) Principal causa de morbilidad y mortalidad.

Alteración de los valores de cloruro y sodio en el sudor.

El 95% de los varones son estériles por ausencia bilateral congénita de vasos deferentes.

Complicaciones más frecuentes

íleo meconial (15%).

Cirrosis hepática.Pólipos nasales.Síndrome de obstrucción intestinal distalProlapso rectal.Edemas y hematomas (generalmente en neonatos)

Defecto Básico

Mutaciones en el gen CFTR

(Regulador de la Conductancia Transmembrana de la Fibrosis

Quística)

Codifica una proteína involucrada en el transporte de iones a

través de la membrana celular.Genética

Enfermedad monogénica.

Es la enfermedad autosómica recesiva más frecuente en la población blanca.

Probabilidad de tener un hijo afectado en una pareja de portadores es del 25%

Incidencia de 1 en 2500 nacidos vivos.

Frecuencia de portadores de 1 en 25.

Heterogeneidad alelica asociada a heterogeneidad clínica

Gen CFTR

Regulador de la Conductancia Transmembrana de la Fibrosis Quística.

Localización en el cromosoma 7. Mapea en 7q 31.

Región codificante: 250 Kb.

Constituido por 27 exones.

Características Moleculares

Proteína CFTR

Glicoproteína integral de membrana (1480 aa).

Canal de Cloro regulado por AMPcíclico.

Dos motivos repetidos: con un dominio transmembrana (TM1 y 2), un dominio de unión a nucleótidos

(NBF1 y 2) y un dominio citoplasmático con función

reguladora (R).

CFTR

∆F508: Deleción de tres pares de bases en el exón 10, que implica una pérdida de una fenilalanina en la posición 508 del péptido.

Esta presente en el 67% de los cromosomas provenientes de afectados, a nivel mundial.

Hay grandes variaciones geográficas y étnicas.

Es la mutación más frecuente en todas las poblaciones a excepción de los Judios Ashkenazis (W1282X).

Presenta alta frecuencia en el Norte de Europa (70%-80%), y más baja en el Sur de Europa (50%-55%).

No se encontraron grandes deleciones.

Más de 1500 mutaciones asociadas a la enfermedad

Alrededor de 200 polimorfismos.

Algunas mutaciones tienen una alta frecuencia en grupos étnicos específicos.

Mutaciones del gen CFTR

Espectro de mutaciones En la actualidad, se han identificado más de 1.500 cambios (mutaciones y polimorfismos) en el gen CFTR. La mutación más común a nivel mundial es una deleción de fenilalanina en posición 508 (p.F508del, sigla anterior ∆F508). Sin embargo, las mutaciones comunes (p.F508del, p.G542X, p.G551D, p.N1303K, p.W1282X) han mostrado diferentes frecuencias entre distintos grupos étnicos y localizaciones geográficas. La mayoría de las restantes mutaciones son menos frecuentes y generalmente se limitan a una región geográfica o a la aparición familiar exclusiva.Las mutaciones que provocan el cambio de un aminoácido por otro (en inglés "missense") representan un 41% de las mutaciones asociadas a enfermedad; las que provocan un codón de terminación prematuro (en inglés "nonsense"), un 10%; las inserciones o deleciones que causan un cambio en el marco de lectura (en inglés "frameshift"), un 18% y aquellas que alteran nucleótidos conservados en sitios de unión intrón-exón y afectan el procesamiento del pre-ARNm (en inglés "splicing"), un 13%.Existen 3% de rearreglos genómicos (grandes deleciones o inserciones) y otro 1% que afecta la zona promotora. Se han publicado datos sobre alrededor de un 14% de cambios neutros que no ocasionan enfermedad denominados polimorfismos.

Características Clínicas de pacientes Fibroquísticos

Fenotipo Severo Fenotipo Moderado

Edad de diagnóstico Temprana (1 a 2 años)

Tardía

(> de 10 años)

Función Pancreática IP SP

Estado Nutricional Pobre Bueno

Ileo Meconial Alta Incidencia (15%) No

Cl en sudor (> 80 mEq./l) 40-80 mEq./l

Fertilidad en hombres CBAVD CBAVD

Función pulmonar Variable Variable

Mutaciones asociadas 2 alelos severos 1 alelo moderado

Mutaciones Severas Mutaciones Moderadas

∆F508 R117H

G542X A455E

G551D 3849 + 10 Kb C → T

R553X R334W

621 + 1 G → A R347P

W1282X R347H

N1303K R3529

1717 − 1 G → A 2789 + 5 G → A

Tipos de Mutaciones de acuerdo al Fenotipo

Clases de Mutaciones del gen CFTR

G542XW1282XR1162XR553X621+1G→T

∆F508N1303kS549R∆I507

G551DG551SS1225

R117HR334WR347PA455E

3849+10KbC→TALELOS 5T

CBAVD Test del Sudor patológico o límiteEnfermedad pulmonar leve a moderadaSuficiencia pancreática exócrina

Polimorfismos

Pueden influenciar en el fenotipoMás estudiado en el CFTR Alelos T (intrón 8)El ejemplo más estudiado, con la mutación R117H:

R117H/∆F508 → 7T / 7T → CBAVD

R117H/∆F508 → 5T / 7TR117H/∆F508 → 5T / 5T

R117H/∆F508 → 7T / 7T Mujeres No sintomáticas

Fenotipo pancreático fuertemente correlacionado con el genotipo.

Mutaciones usualmente asociadas a IP y otras a SP.

Insuficiencia Pancreática (IP) → severo Suficiencia Pancreática (SP) → moderado

El diagnóstico temprano y las diferencias en los tratamientos serían los

responsables de la variabilidad en la severidad de la enfermedad

pulmonar, y de la ocurrencia de las complicaciones más comunes de la

Fibrosis Quística.

Existen otros factores genéticos, dentro y fuera del gen CFTR, así como

también factores ambientales.

Resumen

Asesoramiento Genético.

Familias con historia previa de FQ.

Cosanguineidad.

Diagnóstico de la enfermedad.

Individuos con síntomas clínicos sugestivos de FQ en los que

los métodos clásicos no son concluyentes.

Diagnóstico prenatal cuando por ultrasonido se detecta íleo

meconial, bolo ecogénico o bolo obstructivo.

Screening positivo.

Infertilidad masculina por ausencia bilateral de vasos deferentes. (se estudia también a la pareja para los cálculos de riesgo).

Ovo donación y espermodonación.

Estudios de Correlación Genotipo/ Fenotipo

Terapéutica ?

APLICACIONES DEL DIAGNOSTICOMOLECULAR

Gran espectro de mutaciones asociadas a la enfermedad.

Las diferentes mutaciones presentan grandes variaciones en sus frecuencias

en las diferentes poblaciones.

Grandes variaciones en el número de mutaciones para un análisis genotípico

completo.

Recomendación: Realizar estudios poblacionales para tener idea de la

frecuencia de mutaciones y poder establecer el rango de confianza.

Si existe historia de FQ en la familia, y no se determinó la mutación, realizar

estudios de ligamiento genético.

Quedan casos sin resolver.

Métodos costosos y laboriosos.

DIFICULTADES PARA EL DIAGNOSTICO MOLECULAR DE LA FIBROSIS QUISTICA

Métodos Indirectos

Marcadores extra o intra génicos.

No especifican la mutación.

Son más complejos y laboriosos.

Búsqueda de nuevas mutaciones

DGGE.

SSCP.

TGGE.

Secuenciacion.

Metodos de Diagnostico Molecular

Metodos Directos

Uso de diferentes técnicas para detectar alteraciones en el ADN.

Uso de Kits comerciales

Ausencia Bilateral Congénita de Vasos Deferentes (CBAVD)

Representa del 1 al 2% de la esterilidad masculina, y hasta el 25% de la azoospermia obstructiva global.

Cuando está aislada es considerada como una entidad clínica particular, pero debido a que está presente en el 95% de los varones con Fibrosis Quística (FQ), Holsclaw propuso que los varones con CBAVD presentarían una forma leve de FQ.

La hipótesis de Holsclaw fue corroborada años más tarde cuando fue posible identificar y clonar el gen causante del defecto básico de FQ detectándose mutaciones del CFTR en pacientes CBAVD.

Es causada por el mal desarrollo de los conductos mesonéfricos generando agenesia o atresia del epidídimo, los vasos deferentes, y las vesículas seminales.

Presenta un patrón de herencia autosómica recesiva.

.

La severidad de las manifestaciones clínicas de la FQ, está relacionada con las diferentes clases de mutaciones del gen CFTR.

La CBAVD por su desarrollo, sería una forma de presentación FQ ubicada en el extremo leve de un gradiente de expresión.

Los pacientes CBAVD presentan las mismas mutaciones que los FQ pero con otra frecuencia y algunas variantes propias (IVS 8-5T).

Se comprobó una asociación entre la presencia de mutaciones y sintomatología compatible con FQ en pacientes con CBAVD.

Si bien los pacientes CBAVD tendrían una forma preponderantemente genital de FQ, en algunos ciertos síntomas referidos exigen profundizar los estudios pulmonares y digestivos propios de la patología FQ.

Diagnóstico de CBAVD

Ausencia de vasos deferentes, epidídimo y/o vesículas seminales en la palpación y/o ultrasonografía.

Análisis bioquímico del semen : Azoospermia.

Bajo volumen (< 0.5 cc) pH< 7

Alta concentración de ácido cítrico

Ausencia de células redondas

Peroxidasa negativo.

Baja concentración de fructosa.

Asesoramiento

Los pacientes con CBAVD tienen espermatogénesis normal.

Actualmente es posible el tratamiento de su infertilidad.

Si la CBAVD está asociada con mutaciones en el CFTR, estos pacientes tienen riesgo aumentado de tener hijos FQ o CBAVD, ya que tienen el 100% de probabilidad detransmitir una copia alterada del gen.

La mujer debe ser estudiadas para las mutaciones FQ.

250.000 pb (27 Exones)

Zona regulatoria

F508

Pérdida de Fenilalanina en posición 508

Deleción de 3 Nt (CTT) entre los Nt 1652-1655

Sangre periférica

Extracción de ADN

PCR(ΔF508)

Alelo específica

ElectroforesisNORMAL

MUTADO

HOMOCIGOTA

HETEROCIGOTA

FREQUENT CYSTIC FIBROSIS MUTATIONS

Name Relative frequency Mutation Consequence

F508 67.2 Deletion de 3pb, Ex 10 Del Phe

G542X 3.4 G T, Ex 11 Gly Stop

W128X 2.1 G A, Ex 20 Trp Stop

F1 (4 a) 02-05-03 HOMO. M P/P F

F2 (2 a) 19-05-03 HOMO. N E C TS +-

F3 (1 a) 04-06-03 HETE. M P/P TS +- F

F4 (7 a) 26-06-03 HETE. M CONTROL

F5 (21 a) 20-08-03 HETE M mamá

F6 (31 a) 20-08-03 HETE. M papá

F7 (7 a) 26-08-03 HETE. M P/P

F8 (1 a) 22-09-03 HETE. M PUL.

F9 (8 m) 29-09-03 HOMO. M PUL. TS +

F10 (3m) 26-04-04 HOMO. M PUL.

F11 (6 m) 30-04-04 HOMO. N F

F12 (3 m) 18-04-04 HOMO. N TS +

F13 (11 a) 01-07-04 HOMO. N TS +

Pacientes Hosp. Pediátrico (Rcia.)

31%

23%

46%

FR1 (21 a) HETE. M IP. Hna. F.

FR2 (34 a) HETE. M IP

FR3 HETE. M

FR4 HETE. M

FR5 (19 a) HETE. M TS + P/P

FR6 HOMO. M

FR7 (17 a) HOMO. M CONTROL P/P

FR8 (12 a) HOMO. N IP TS + P/P

FR9 (8 a) HETE. M IP Control

FR10 (15 a) HETE. M IP TS+ Control

FR11 (14 a) HOMO. M P/P TS+

FR12 (33 a)HF2 HETE. M P/P

FR13 HETE. M

FR14 HOMO. N

FR15 HETE. M

PACIENTES ROSARIO

13%

20%

67%

Foto de corrida electroforética en gel de agarosa al 2%. De izquierda a derecha: w16d16,w17d17,w20d20,w20´d20´ ,mpm ,w21d21,w21´d21´,w-d- . Paciente w16d16: Homocigota mutadoPaciente w17d17: Heterocigota mutadoPaciente w20d20: Heterocigota mutadoDuplicado paciente anterior w20´d20´: Heterocigota mutado Mpm: Marcador de Peso molecularPaciente w21d21: Homocigota normalDuplicado paciente anterior w21´d21´ : Homocigota normal w-d-: Control negativo