Fundamentos y Tipos de ELISA

Autor: Cultek, S.L.U

El ELISA es una técnica que se basa en el uso de un antígeno o un anticuerpo

marcado con una enzima; al estar uno estos componentes marcado y fijado a un soporte,

se interrumpe la reacción antígeno-anticuerpo, posteriormente se le agrega un sustrato

especifico sobre la enzima que producirá un color determinado observable a simple

vista o cuantificable por un espectrofotómetro o analizar la reacción antígeno

anticuerpo. Existen diversos tipos de ELISA los que se marca el anticuerpo: directo,

indirecto, sándwich: Doble, Heterólogo.

En cuanto a los pasos generales de un ELISA primero se tapizada el antígeno o

anticuerpo, luego se agrega la muestra problema con la mezcla de antígenos o

anticuerpos, se une el antígeno o anticuerpo específico al anticuerpo o antígeno ya

tapizado, lavado para eliminar el exceso no unido. Adición del anticuerpo secundario

marcado con la enzima , unión del anticuerpo secundario al antígeno o

anticuerpo ,lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no adherida , adición

del substrato, unión del substrato a la enzima, para luego obtener la coloración color

ELISA directo: En este se fija el antígeno al soporte, se lava para eliminar los

no fijados, luego se adicionan los anticuerpos marcados con la enzima para que reacción

con el antígeno y que solubilizado el complejo, se lava para eliminar anticuerpos que no

reaccionaron y se agrega un sustrato específico para la enzima, al final se observa la

coloración. ELISA indirecto: En este la diferencia viene dad que a nivel que el elemento

marcado por la enzima es un anti-anticuerpo que va a reaccionar con el anticuerpo, que

reacciono junto al antígeno previamente fijado; finalmente agrega un sustrato

específico para la enzima, se lava y se observa la coloración.

ELISA sándwich doble: Se fija al soporte el anticuerpo específicos del antígeno

en el suero problema, posteriormente se añade el suero problema y los antígenos de

fijan a los anticuerpo, luego se lava para eliminar elementos no fijados, posteriormente

se añaden anticuerpos conjugados con una enzima(de diferente epítopo a los

previamente fijados) estos reaccionan con los antígenos de la muestra problema que se

encuentran fijados a los otros anticuerpos, se lava la muestra y se añade un sustrato a la

enzima marcadora y se observa el color visual o por colorimetría, en cuanto al ELISA

sándwich triple la diferencia viene dada por que los segundos anticuerpos que se

colocan no son marcados con la enzima, si no que luego se coloca anti-anticuerpos

conjugados con la enzima que reaccionaran con los anticuerpo que se colocaron luego,

posteriormente se lava y se coloca el sustrato especifico para la enzima.

ELISA Competitivo: Fijación de anticuerpos específicos al soporte anticuerpos,

adición en concentración conocida de una mezcla de antígenos del anticuerpo utilizado

en el paso anterior, marcados con una enzima y antígenos desconocidos (objeto de

estudio).Al mismo tiempo, añadir únicamente antígenos del anticuerpo usado en el paso

anterior, marcados con una enzima, lavar. Agregar un substrato sobre el que sea capaz

de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea. Lectura visual o

colorimétrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados.

Si las lecturas de ambas pruebas son iguales, el antígeno a estudio no tiene nada que ver

con los anticuerpos empleados en el soporte. Si hay diferencia en las lecturas de ambos

pocillos, el antígeno objeto de estudio, está relacionado con el anticuerpo empleado para

tapizar el soporte y la diferencia de absorbancia o densidad óptica, es proporcional a la

concentración del antígeno problema.

Métodos específicos

Para lograr el tapizado de antígenos y anticuerpos de diluye el antígeno o

anticuerpo en tampón carbonato (pH 9,6) y se incuba luego durante 3h a 37°C o 16h a

4°C, también de puede incubar a 40-50°C en tampón fosfato (PBS) o en agua fisiológica

tamponada pH 7,2-7,4. En cuanto a la solución de lavado se elaborara una solución

salina con Tween 20 como agente tensioactivo8, 5gr. De igual forma se debe conjugar

la enzima, esta debe de poder unirse fácilmente a antígenos y anticuerpos, un substrato

cromogénico o fluorogénico conveniente. Las enzimas más utilizadas son las fosfatas

alcalina, peroxidasa de rábano y ß-galactosidasa.

Métodos de lectura de resultados

Colorimetría: En estos ensayos se obtiene un producto de reacción coloreado que

absorbe luz, siendo la densidad óptica (DO) del mismo proporcional a la cantidad de

producto medido. Para todos los ensayos enzimáticos, la etapa final es la adición del

substrato enzimático, este es escogido por su rendimiento en la reacción enzimática.

Para ensayos colorimétricos, la tasa de desarrollo de color es proporcional, dentro de un

cierto rango, a la cantidad de conjugado enzimático presente.

Fluorescencia: La fluorescencia es una variación de la colorimetría en este un

producto de reacción emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada

longitud de onda, siendo las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz

emitidos) proporcionales a la cantidad de producto analizado. En comparación con los

métodos colorimétricos, los ensayos de fluorescencia son ligeramente más sensibles y,

sufren a cambios de pH, temperatura, restos de detergente en el lavado y concentración

iónica. Lo que lo hace mas funcional es que amplia el rango de medida en cuanto al

obtenido en los ensayos colorimétricos.

Luminiscencia: En este proceso la enzima actúa sobre un sustrato generando un

producto capaz de emitir fotones en lugar de generar un color visible, este proceso se

define como la capacidad de emitir luz por parte una sustancia esta puede ser mediante

una reacción química (quimioluminiscencia), mediante una longitud de onda

(fotoluminiscencia= florescencia) o mediante un producto al ser degradado

(bioluminiscencia).

Para poder interpretar los resultados, se puede observar el color a simple vista,

pero el ojo humano no es capaz de notar la variación de 0,1 de densidad óptica, por eso

se usa el espectrofotómetro para poder así cuantificar los resultados. Es importante

resaltar que las soluciones ELISA es un método de inmunodetección que se utiliza para

detectar diversas patologías animales y vegetales.