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TECNOLOGÍA Y CALIDAD DE LECHE

Y PRODUCTOS LÁCTEOS

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Licenciatura en Tecnología de los Alimentos FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS - U.N.C.P.B.A.

GUÍA DE TRABAJOS

PRÁCTICOS

Docente: Dra. Julieta Bruschi

Invitado externo: Lic. Soledad Vera

2016



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INDICE

CONTENIDO PAGINA

TRABAJO PRÁCTICO Nº 1 3




BIBLIOGRAFIA 14

ANEXO I 15

ANEXO II 16



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TRABAJO PRÁCTICO N 1

PREPARACIÓN Y ACONDICIONAMIENTO DE MATERIALES

Se recomienda la revisión de contenidos previos relativos a:

Preparación de medios de cultivo y esterilización Preparación de soluciones Funcionamiento del autoclave

En este primer trabajo práctico, se prepararán la mayoría de los medios de cultivo, soluciones y otros insumos necesarios para la realización del trabajo práctico N° 2. Se recomienda, realizar un listado de tareas entre todos los grupos para iniciar las actividades, organizar y distribuir adecuadamente las mismas.

Análisis de leche y productos lácteos La leche, como cualquier otro alimento puede actuar como vehículo de

contagio de varias enfermedades. La contaminación puede provenir de la misma ubre del animal, o puede contaminarse fácilmente luego de ordeñada (en el tambo, por higiene deficiente, por el agua de lavado, etc.).

Debemos considerar además que la leche es un excelente medio de cultivo y la multiplicación en ella de los microorganismos es sumamente importante. Para analizar diferentes tipos de muestras que pueden contener bacterias, deben sembrarse en medios que artificialmente permiten a los microorganismos crecer y desarrollarse en condiciones similares a las naturales.

La mayoría de los medios de cultivo empleados actualmente, para el análisis microbiológico, se encuentran disponibles comercialmente como productos deshidratados, en forma de polvo y se reconstituyen mediante la adición de agua destilada y luego se esterilizan de manera convencional.

No todos los medios de cultivo tienen como objetivo lograr el desarrollo de todas las bacterias. Algunos se formulan para favorecer el desarrollo de ciertos microorganismos, mientras que otros lo hacen para inhibir deliberadamente el crecimiento de grupos específicos de microorganismos. Clasificación de los medios de cultivo Los medios de cultivo pueden clasificarse siguiendo principalmente criterios como su origen, consistencia o composición, del siguiente modo: Por su origen Naturales: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal como extractos de tejidos o infusiones y cuya composición química no se conoce exactamente.

Sintéticos: son los medios que contienen una composición química definida cuali y cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados reproducibles.



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Semisintéticos: son los sintéticos a los que se les añaden factores de crecimiento bajo una forma de un extracto orgánico complejo, como por ejemplo extracto de levadura. Por su consistencia Líquidos: se denominan caldos y contienen los nutrientes en solución acuosa.

Sólidos: se preparan añadiendo agar a un medio líquido. El agar es una sustancia inerte polisacárida (hidrato de carbono) que se extrae de las algas, y que no es consumida por los microorganismos. Este tipo de medio puede ser vertido en placas de Petri o en tubos de ensayo y presentan la posibilidad de aislar y diferenciar bacterias.

Semisólidos: contienen una pequeña proporción de agar (menor que los sólidos). Se utilizan por ejemplo, para determinar la motilidad de las especies en estudio. Por su composición Generales o universales: su finalidad es el crecimiento de la mayor parte de los microorganismos existentes. Es el medio más frecuentemente utilizado para mantener colonias microbianas.

Enriquecidos: están compuestos de un medio base como apoyo del crecimiento al cual se le puede agregar una gran cantidad de nutrientes como suplementos nutritivos, por ejemplo: sangre, suero, líquido ascítico, etc. Se utiliza para microorganismos que tienen grandes exigencias nutricionales.

Diferenciales: son medios de cultivo que nos permiten distinguir entre varios géneros y especies de microorganismos. Por ejemplo si al medio se le ha añadido un carbohidrato y un indicador y la bacteria que se cultiva es capaz de fermentar dicho carbohidrato, se produce una acidificación del medio con el consiguiente viraje de color del indicador por el cambio de pH. Suelen ser a la vez selectivos, por lo tanto solo crecerán determinadas bacterias (pueden ser dos o más tipos) que al actuar sobre alguno de los componentes específicos del medio, demuestran algunas de sus propiedades o características y nos permite diferenciar entre ambos tipos.

Selectivos: son medios sólidos en los que la selectividad se consigue alterando las condiciones físicas del medio o añadiendo o suprimiendo componentes químicos específicos con el fin de inhibir el crecimiento de ciertas especies cuyo crecimiento no interesa analíticamente. Este tipo de medio sólo permite el crecimiento de un grupo de microorganismos e inhibe el de otros. Se utiliza para seleccionar y aislar microorganismos a partir de poblaciones mixtas.

De enriquecimiento: Estos medios contienen un agente que inhibe las especies no deseadas pero favorece el crecimiento del agente infeccioso.

Un gran número de medios de cultivo empleados en el laboratorio de

microbiología son mixtos, es decir que tienen más de una finalidad de las antes mencionadas, por ejemplo, el agar S-S es selectivo (pues tiene un inhibidor: el verde brillante) y es a la vez un medio diferencial (lactosa) y un indicador que permite diferenciar las bacterias fermentadoras o no de dicho polisacárido.



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ACTIVIDADES 1- Preparación de los medios de cultivo

Antes de preparar cualquier medio se debe leer cuidadosamente el rótulo del envase y controlar la fecha de vencimiento. Prepare el volumen necesario de los medios de cultivo siguiendo las indicaciones que se detallan a continuación y prestando especial atención a las condiciones de esterilización (tiempo y presión). Seleccione el material de vidrio a emplear, según el volumen de medio que se desee preparar. Calcule y pese la cantidad de polvo adecuada siguiendo las instrucciones del rótulo del envase. Vuelque el contenido pesado en el recipiente de vidrio y agregue el agua destilada. Mezcle y coloque sobre el mechero, hasta que comienza su ebullición y se observa un líquido homogéneo y transparente. Fraccione en tubos, y acondiciónelos para su esterilización. Retire los medios del autoclave, espere que se enfríen y conserve en la heladera hasta su utilización.

Cuidado!! Estar atentos al momento justo de sacar los medios del fuego, para prevenir accidentes.

2- Acondicionamiento de material para su posterior esterilización Preparar tips y tubos de vidrio vacíos. El material esterilizado debe conservarse en lugares adecuados, protegidos del polvo y la humedad para evitar su deterioro.

3- Preparación del diluyente Agua peptonada 0,1% pH 7 en tubos de 9 ml 4- Preparación de soluciones Solución Dornic Biftalato de Potasio Soluciones para llevar a pH el agua peptonada Contratitulación de la Solución Dornic La solución Dornic es una solución de Na(OH) 0.111 N que se emplea para determinar la acidez en diferentes productos lácteos. Luego de ser preparada debe ser contratitulada con una solución de Biftalato de Potasio 0.1 N. El material que se requiere es: erlenmeyer de 500 ml, pipetas de 10 ml, solución Dornic 0.111N, biftalato de potasio 0.1N, fenolftaleína al 2%, agitador magnético, buzo. Procedimiento Colocar en un erlenmeyer 5 o 10 ml de biftalato de K 0.1N, agregar 1 o 2 gotas de fenolftaleína, titular con la solución Dornic que quiero contratitular hasta obtener un color rosado, luego realizar los siguientes cálculos: N(NaOH) =

N(biftalato) Volumen utilizado de biftalato X

ml gastados de NaOH



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Ejemplo: Entonces calculo, si a esta normalidad la tengo en 1000 ml, en que volumen tendré la normalidad que necesito (0.111) según la fórmula que se indica a continuación. Luego llevar a volumen final.

V1 . C1= V2 . C2

TRABAJO PRÁCTICO N 2 DETERMINACIONES ANALÍTICAS EN LECHE FLUIDA

Se recomienda la revisión de contenidos previos relativos a:

Toma de muestra de leche y productos lácteos Características y valores normales del pago de leche por calidad

SISTEMA DE PAGO DE LECHE CRUDA SEGÚN SU CALIDAD

Pago de la leche cruda por Atributos de Calidad Composicional e Higiénico-Sanitaria

Este sistema fue establecido por el Ministerio de Agricultura, Ganadería y Pesca (MAGYP) y consiste en el pago de la leche cruda a los productores sobre la base de atributos de calidad composicional e higiénico-sanitaria, en formato de Liquidación Única. Las determinaciones que se incluyen en este sistema (que fueron detalladas en clase teórica) deben llevarse a cabo según metodologías internacionalmente reconocidas.

Tabla 1 – Parámetros y valores esperados para determinar la calidad de leche cruda.

PARÁMETRO VALORES ESPERADOS

Calidad higiénica

Rto. total de microorganismos aerobios mesófilos (UFC/ml)

10.000

Determinación de inhibidores Ausencia

Crioscopía (°C) - 0,520

Calidad sanitaria

Rto. de células somáticas (RCS/ml) 200.000

Sanidad Animal (Certificación) Brucelosis y Tuberculosis Libre

Calidad composicional

Materia Grasa (%) 3,5

Proteína (%) 3,3

Temperatura (°C) 4-5

Volumen entregado

N(NaOH) =

N(bif)= 0.1 Vol. Biftalato = 5 ml

X

ml gast NaOH= 3.4

N(NaOH) = 0.1470

N(NaOH) =

N(bif)= 0.1 Vol. Biftalato = 5 ml X

ml gast NaOH= 3.4



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En la base del pago se contemplan además, el volumen de leche entregado y la temperatura de entrega de leche. Recordar que todos los tambos deben poseer la certificación como tambos libres de brucelosis y tuberculosis. Estudio de diferentes grupos microbianos

Cada microorganismo tiene una temperatura de crecimiento adecuada. La temperatura de cultivo en la cual se alcanza la velocidad máxima de crecimiento es la que se denomina temperatura óptima.

En el tambo la leche se enfría a 4ºC y se almacena a esta temperatura en tanques refrigerantes, se recoge en camiones con cisternas refrigeradas o isotermas y se transporta a la planta en donde se almacena en silos isotermos hasta su uso. La leche así recogida puede tener cuando comienza la fabricación de 24-72 h y su tasa bacteriana puede ser superior a 106 UFC/ml, principalmente psicrótrofos. Por lo tanto, la leche cruda al llegar a planta puede contener de 103-107 UFC/ml, dependiendo de la higiene de los tambos. De todos ellos los únicos que se multiplican durante el transporte y almacenamiento de la leche, son los psicrótrofos. Bacterias Mesófilas El recuento de mesófilos viables, es un método macroscópico que se utiliza para determinar en forma aproximada la carga bacteriana. Consiste en determinar el número de colonias que desarrollan cuando se siembra en placas de agar una determinada cantidad de muestra, mediante métodos estandarizados. Los resultados obtenidos por este método permiten establecer la calidad higiénica de la leche. Una comparación de los resultados obtenidos en la leche antes y después de ser pasteurizadas, permite deducir la resistencia de los microorganismos presentes en el producto a la acción del calor. Un conteo superior en el producto pasteurizado indica recontaminación post-pasteurización o bien presencia de microorganismos termófílos. Este método puede aplicarse tanto a la leche y derivados fluidos como a los productos lácteos semisólidos o sólidos, variando fundamentalmente el procedimiento de preparación de las diferentes muestras y de la primera dilución. Bacterias termodúricas Son principalmente corinebacterias, micrococos, enterococos y esporos de los géneros Bacillus y Clostridium. Se consideran microorganismos termodúricos a aquellos que sobreviven a las temperaturas de pasteurización (aunque no crecen a dicha temperatura). El grado de supervivencia puede variar desde una fracción del 1% de la población original hasta incluso ocasionar incremento del recuento de mesófilos viables. La fuente de contaminación de bacterias termodúricas la constituyen ubres, utensilios y equipos (ordeñadoras, tanques), con insuficiente higiene.

En las plantas pasteurizadoras las bacterias termorresistentes suelen proceder de equipos inadecuadamente limpios, pero esto no es frecuente en plantas que operan correctamente. La repasteurización de leche devuelta, que se ha calentado lo suficiente como para permitir el crecimiento de microorganismos que sobrevivieron a la primera pasteurización, puede causar grandes recuentos de gérmenes termodúricos, pero el problema habitualmente se debe a que dichos recuentos eran ya



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elevados en la leche cruda. Se ha propuesto un recuento de 10.000 UFC/ml tras una pasteurización en el laboratorio como límite superior permisible para el recuento de termodúricos. Las bacterias termodúricas se consideran normalmente un índice de la higienización del equipo en el tambo. Sobreviven tras una limpieza y tratamiento microbicida inadecuados y crecen en la humedad residual.

Las bacterias termodúricas causan aromas y sabores no deseables y, en ocasiones, ciertos cambios físicos. En la leche cruda, los tipos termodúricos serán superados casi invariablemente por otros microorganismos que causaran los defectos característicos de sus actividades metabólicas. La importancia de estas bacterias radica en su capacidad de producir esporos, que sobreviven los tratamientos térmicos, siendo importantes en leches pasteurizadas porque dichos esporos producen el daño del producto luego de su elaboración. Un defecto conocido que se produce en la leche por la presencia de Bacillus cereus es el sabor a “crema amarga”.

Dentro de las bacterias termodúricas que se encuentran en las leches pasteurizadas tenemos bacilos G (+) y cocos, de los géneros: Artrobacter, Clostridium, Bacillus, Lactobacillus, Corynebacterium, Microbacterium, Micrococcus y Streptococcus. Algunos son patógenos para el hombre: Yersinia enterocolítica, Listeria monocytogenes y Clostridium botulinum tipo E, pero los de mayor importancia son Bacillus cereus y Yersinia enterocolítica.

Bacterias psicrotrofas Los microorganismos psicrótrofos son mesófilos que pueden crecer a

temperaturas bajas. Por tanto, se les puede considerar como psicrófilos facultativos. Esto es importante desde el punto de vista aplicado porque cuando se encuentran contaminando alimentos, son capaces de crecer en condiciones de refrigeración (4 - 8ºC) y de producir infecciones en los consumidores del alimento (30 - 35 ºC), además tanto los microorganismos mesófilos como psicrófilos, psicrótrofos y termófilos pueden producir toxinas causantes de intoxicaciones alimentarias. Entre los psicrótrofos predominan los bacilos G (-), no esporulados, catalasa (+) principalmente Pseudomonas, y dentro de éste género la más frecuentemente aislada es la Ps. fluorescens. Dentro de los microorganismos psicrótrofos se encuentran bacterias, hongos y levaduras, siendo las causantes de mayor deterioro, las primeras.

Son microorganismos que toleran bajas temperaturas para su crecimiento (entre 4° y 20°C). Su temperatura óptima de crecimiento se estima entre 10° y 20°C aunque sin embargo pueden multiplicarse aún a temperaturas propias de refrigeración (0° y 6°C). Se diferencian de los psicrófilos en que éstos tienen su óptimo crecimiento a 0°C o sus proximidades.

El origen de estos gérmenes es bien conocido, se encuentran en el suelo (20 % de la población) en algunos tipos de agua, en los forrajes y en la hierba (50 % de la población). Los psicrótrofos son sensibles a la acción del cloro, en especial las Pseudomonas. Son capaces de desarrollarse a partir de cualquier substrato (incluso el asfalto y el ladrillo) y poseen enzimas lipolíticas y proteolíticas termoestables, susceptibles de inducir defectos característicos en los productos fabricados, de los cuales el 90 % son de tipo lipolítico, y el 60 % a la vez lipolítico y proteolítico.



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Tabla 2- Recuento de bacterias psicrótrofas e interpretación

RECUENTO INTERPRETACION

< a 100.000 Leche apta para cualquier proceso industrial

100.000 a 1.000.000 Necesidad de higiene

> a 1.000.000 Defectos de proteólisis y lipólisis en productos ya elaborados

La incidencia depende del número y tipo de microorganismos psicrótrofos presentes, condiciones de producción y temperatura. La leche producida en adecuadas condiciones de higiene, usualmente contiene hasta 10 % de su flora microbiana compuesto por bacterias psicrótrofas; en cambio en condiciones inadecuadas de higiene puede contener hasta 75 % bacterias psicrótrofas. Si bien las bacterias psicrótrofas se destruyen durante la pasteurización, las enzimas resisten el tratamiento térmico y permanecen activas. Bacterias coliformes

Los organismos coliformes, los “coliformes fecales” y Escherichia coli se utilizan en primer lugar como indicadores de contaminación en principio potencialmente peligrosa, basándose en el hecho de que el hábitat natural de la familia de bacterias a que pertenecen (Enterobacteriaceas) son las heces humanas y de otros mamíferos. E coli se acepta de modo general como el indicador más positivo de contaminación fecal; una población de coliformes fecales es posible que contenga una alta proporción de E. coli o sus variantes probablemente de origen fecal reciente. Los coliformes comprenden además de E. coli las diversas especies de Enterobacter y Klebsiella, algunas de las cuales pueden multiplicarse o persistir en hábitats no fecales durante largos períodos de tiempo. Estos microorganismos proporcionan una indicación más exacta de las contaminaciones posteriores a los tratamientos industriales y de la eficacia de los sistemas de limpieza y desinfección en las industrias, en los alimentos que han sido sometidos a tratamientos térmicos o procesos suficientes para inactivarlos. La calificación de “fecales” que se aplica a estos organismos tiene un significado importante. La contaminación de un alimento por E. coli lleva implícito el riesgo de que también hayan podido llegar al alimento microorganismos entéricos patógenos, haciendo su consumo peligroso. Esta contaminación se produce de modo general por deficiencias en la limpieza y desinfección de las industrias y por falta de higiene de los operarios.

Otros microorganismos: Pueden existir micrococos, ocasionalmente estafilococos coagulasa positivos, coliformes, bacterias ácido lácticas (Lactobacillus, Pediococcus y a veces Leuconostoc) y Enterococos. Estos microorganismos proceden de tubería, tinas (en el caso de quesos) u otros elementos utilizados en la elaboración, del aire, del agua de lavado y del personal.

DETERMINACIONES Y TÉCNICAS Aclaración: Una vez realizada la dilución de la muestra se realiza la siembra simultánea de los distintos grupos de microorganismos.



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1. Determinación de acidez titulable La acidez titulable es la acidez de un producto, expresada convencionalmente

como contenido de ácido láctico y determinada mediante procedimientos normalizados.

Un volumen conocido de la muestra se titula con una solución alcalina de concentración determinada, con ayuda de un indicador y un color estándar, el que indica el punto final de la titulación.

Los materiales necesarios son erlenmeyer o vaso de precipitado de 125 ml, pipeta volumétrica de 10 ml, bureta de 10 ml, solución 0.111 Dornic contratitulada (1 ml de esta solución equivale a 0.01g de ácido láctico), solución indicadora de fenolftaleína al 2% en alcohol etílico.

Mida 10ml de leche con pipeta volumétrica y colóquela en el erlenmeyer. Añada 3 gotas de la solución de Fenolftaleína al 2%. Valore con solución 0.111N de NaOH hasta la aparición de una débil coloración rosada que persista como mínimo durante 30 segundos. Lea en la bureta el volumen de solución empleada. Calcule la acidez obtenida. Si la expresa como % de ácido láctico, al volumen gastado se lo divide por 10, pero si la expresa por grados Dornic, al volumen gastado se lo multiplica por 10.

2. Determinación de pH

Se medirá el pH con pHmetro o con cintas indicadoras. Para la utilización del pHmetro, previamente debe ser calibrado con los buffers adecuados (pH 4.00 y pH 7.00). Este equipo debe ser manipulado con sumo cuidado (bajo supervisión del docente).

3. Recuento de Aerobios Mesófilos Los materiales necesarios son tubos con 9 ml de agua peptonada estéril, gradilla,

agitador vortex, pipetas estériles de 1 ml, frasco descarte de pipetas, agar para recuento en placa fundido (5 placas).

Antes de realizar la siembra se deben rotular claramente las diluciones y las placas (Grupo, tipo de muestra, dilución, fecha). Luego se debe homogeneizar la muestra con movimientos de vaivén suaves 25 veces. Realice las diluciones de la muestra utilizando como diluyente agua peptonada 0.1% pH 7. Luego, con pipetas esterilizadas de 1 ml, se transfiere 1 ml de cada dilución a placas de Petri estériles. No deben transcurrir más de 20 minutos. Agregue el agar fundido a temperatura aproximada de 45ºC, y se mezcla. Una vez solidificado el agar, las placas se incuban invertidas a 37ºC por 72 horas. Al finalizar el período de incubación, se contarán aquellas placas que presentan entre 25 y 250 colonias. Se multiplica el número de colonias de una placa, por la dilución correspondiente y se obtiene el resultado que se expresará como UFC/ml.

4. Recuento de bacterias termodúricas Los materiales necesarios son tubos estériles, placas de Petri estériles, pipetas

estériles de 5 y 1 ml, baño termostático 63ºC, agar PCA fundido (3 placas). Se fraccionarán en forma estéril 5 ml de la muestra y se colocarán en un tubo

de ensayo estéril. Incube en baño termostático a temperatura de pasteurización 63 ºC durante 30 minutos. Siembre 1 ml de la leche pasteurizada en laboratorio en profundidad, agregue 15 ml de Agar Plate Count (PCA) fundido a una temperatura de



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40ºC aproximadamente e incube 48 horas a 35ºC. Realice el recuento total de las colonias desarrolladas.

5. Recuento de bacterias psicrótrofas Los materiales necesarios son pipetas estériles de 1 ml, placas de Petri estériles,

agar PCA fundido (4 placas). Siguiendo las mismas indicaciones que para el recuento de mesófilos viables y

luego de realizar las diluciones pertinentes, se siembra en profundidad 1 ml de leche o de la dilución que corresponda. Agregue 15 ml de Agar Plate Count (PCA) fundido a una temperatura de 40ºC aproximadamente e incube durante 10 días a 7°C.

6. Recuento de bacterias coliformes Los materiales necesarios son diluciones de la muestra, pipetas estériles de 1 ml,

agar VRB fundido (4 placas). Se realizará la siembra en profundidad de la muestra y sus diluciones. Luego

adicione el agar fundido sobre la misma y mezcle adecuadamente, cuando la placa ha solidificado, vierta sobre la misma una fina capa de agar. Deje solidificar y lleve a estufa de 30ºC. Finalizado el período de incubación, se cuentan aquellas placas que presentan entre 25 a 250 colonias de bacterias coliformes.

TRABAJO PRÁCTICO N 3 DETERMINACIONES ANALÍTICAS EN LECHES FERMENTADAS

En los últimos años se han producido importantes avances en el campo de la

nutrición debidos, en gran parte a su expansión hacia otras áreas científicas como la inmunología, la ecología microbiana y la genómica. Los esfuerzos interdisciplinarios han permitido profundizar en las bases que explican la estrecha relación entre la dieta y el estado de salud de modo que, actualmente, se considera no sólo el valor nutritivo de aquélla, sino también los efectos beneficiosos derivados de sus complejas interacciones con el huésped y la microflora intestinal.

En este contexto, han surgido las denominaciones de alimentos funcionales, probióticos, prebióticos y simbióticos entre otros que se definen a continuación:

Alimentos funcionales: Son aquellos alimentos que, además de aportar los nutrientes necesarios para el metabolismo, ejercen efectos beneficiosos sobre una o más funciones del organismo, fomentando la salud y reduciendo el riesgo de padecer enfermedad.

Probióticos: Son productos que contienen microorganismos definidos y viables en grado suficiente para modificar la microflora de un compartimento del huésped, ejerciendo así un efecto beneficioso sobre la salud de éste.

Prebióticos: Son ingredientes alimentarios no digeribles que, selectivamente, favorecen el desarrollo de un determinado grupo de microorganismos, existente ya en el tracto gastrointestinal del individuo.



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Simbióticos: Son productos que contienen probióticos y prebióticos.

En la actualidad, hay una gran diversidad de productos probióticos en el

mercado, aunque los de mayor aceptación son los derivados lácteos, especialmente el yogur y las leches fermentadas, ya que son vehículos óptimos para aportar un elevado número de bacterias viables y de nutrientes altamente biodisponibles (aunque algunos autores postulan que el queso es un hábitat más favorable para mantener la viabilidad de las bacterias lácticas).

El uso de fermentos con propiedades benéficas ha impulsado el desarrollo de productos que contienen microorganismos que ejercen un efecto positivo en la salud humana debido a que se instalan o permanecen durante tiempo prolongado en el intestino. Entre los efectos beneficiosos se pueden mencionar el desplazamiento o inhibición de microorganismos patógenos, el aumento de la respuesta inmune, la degradación de lactosa y la disminución de compuestos mutagénicos y cancerígenos en el colon. El término genérico de leche fermentada incluye una gran variedad de productos obtenidos por coagulación y disminución del pH de la leche por fermentación láctica, mediante la acción de cultivos de microorganismos específicos. Dentro de éstas, la normativa actual diferencia dos tipos: a) el yogur, considerado como aquel cuya fermentación se lleva a cabo mediante la incorporación de los cultivos iniciadores tradicionales, Lactobacillus debrueckii subsp. bulgaricus (L. bulgaricus) y Streptococcus thermophilus b) las leches fermentadas, que incluyen al resto de productos en cuya elaboración intervienen otros cultivos iniciadores (Bifidobacterium spp., L. acidophilus, L. casei, etc.), como por ejemplo el kefir. Medios de cultivo empleados para el desarrollo de bacterias lácticas

Las bacterias lácticas se consideran “organismos fastidiosos” para desarrollar, lo cual indica en otras palabras que sus exigencias nutricias son complejas. Esto deriva del hecho de que tienen una capacidad de biosíntesis muy limitada, consecuencia de un sistema enzimático pobremente desarrollado.

De acuerdo a estas exigencias nutricias de las bacterias lácticas, los medios de cultivo para desarrollarlas solo podrán ser de naturaleza compleja. Entre los más utilizados, se encuentra el agar leche, que se obtiene por el enriquecimiento del agar para recuento en placas con el agregado de 10% de leche descremada estéril. Dicho agregado mejora la visualización de las colonias (que de otro modo serían muy pequeñas). También se encuentran el medio– M17 (para Lactococcus y Streptococcus) y el medio MRS (para Lactobacillus y Leuconostoc), entre otros. DETERMINACIONES Y TÉCNICAS Para el desarrollo de las actividades prácticas, los alumnos se organizarán en grupos de trabajo formados por 3 o 4 personas, al igual que en el TP Nº2. Luego se asignará a cada grupo el listado de determinaciones analíticas que deberá realizar sobre las



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leches fermentadas. Una vez obtenidos los resultados, deberán registrarlos en la planilla que figura en el Anexo II, para luego poder comparar resultados y concluir sobre ellos. Las técnicas empleadas anteriormente, ya fueron descriptas. Una vez realizadas las diluciones de las muestras, a partir de ellas se realizará la siembra en los diferentes medios de cultivo.

1. Recuento de gérmenes totales en agar leche

Los materiales necesarios son estufa a 37ºC, estufa a 30ºC, estufa a 45ºC , erlenmeyer o frasco autoclavable, tubos con 9 ml de agua peptonada, 180 ml de PCA en erlenmeyer o frasco autoclavable. Se autoclava 15 minutos a 1 Atm, 20 ml de leche estéril. Se autoclavan tubos de 10ml 30 min a 0.5 atm (diluir bien la leche antes de fraccionar), frascos de vidrio con 90 ml de agua peptonada, placas estériles, pipetas de 0.1, 1 ml y 10 ml estériles, ansas de siembra estériles.

Para preparar el agar leche se adiciona a los 180 ml del agar para Recuento en Placa ya fundido, los 20 ml de leche descremada estéril, previamente entibiados. Se mezcla bien y se plaquea. Una vez solidificadas las placas secarlas en estufa. En caso de no ser utilizadas en el momento, almacenar en la heladera en bolsas de plástico apiladas y bien cerradas para que no se sigan secando y conserven la humedad. Se vuelven a secar antes de realizar la siembra en superficie.

2. Recuento de levaduras Los materiales necesarios son estufa 30ºC, placas estériles, pipetas de 1 ml, agar YGC fundido. Realice la siembra en profundidad e incube de 3-5 días a 30ºC.

3. Recuento de lactobacilos en MRS Los materiales necesarios son estufa a 45ºC, placas estériles, pipetas de 1 ml, agar MRS fundido. El método de siembra es en profundidad y se incuba de 48- 72hs 45ºC

TRABAJO PRÁCTICO N 4 INTERPRETACION DE RESULTADOS OBTENIDOS Y RESOLUCION DE

SITUACIONES PROBLEMATICAS

Se realizará la puesta en común y discusión de los resultados obtenidos en los trabajos prácticos anteriores para luego discutir la importancia de los mismos y evaluar el trabajo realizado por cada grupo, identificando las dificultades observadas. Posteriormente, se asignarán por grupo diferentes situaciones problemáticas que ocurren en una planta procesadora de alimentos, para lo cual los alumnos deberán indicar los análisis que solicitarían para identificar el problema y dictaminar una vez realizada la interpretación adecuada, las medidas preventivas y/o correctivas.



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BIBLIOGRAFÍA

Casado Cimiano, P; García Álvarez, J.A. 1985. La Calidad de la leche y factores que la influencian.

Código Alimentario Argentino, 1993. Actualización acumulada. Texto actualizado de la Ley Nº 2.126/71. Tomo 1. Marsochi Ediciones Art. 554, 555 y 556

Cowan S. T, Steel, K. J; 1.999.Cowan and Steel’s Manual for the Identification of Medical Bacterial Third Edition. Edited by G. I. Barrow and R. K. Feltham.

Demeter, K. J; 1969 Lactobacteriología. Editorial Acribia. Feltham, R.K.A., Barrow G.I. Cowan and Steels Manual for the Identification of

Medical Bacteria 3ª edición Cambridge University Press, 2004. Jay J. M; 1973. Microbiología moderna de los alimentos. Editorial Acribia. Kefir. Danone World Newsletter (1996) Nº 11. Luquet , F.M.; Lbonjean-Linczowski, Y. 1991. Leche y productos lácteos. La

Leche. De la mama a la lechería. Editorial ACRIBIA, S.A. España. Mac Faddin J..F; 1.980. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias

de importancia clínica. Editorial Médica Panamericama S.A. Madigan, M. T., Martinko, J. M., Parker, J. Brock Biología de los

Microorganismos. 10ª edición. Prentice-Hall. Madrid, 2003. Ministerio de Agricultura, Ganadería y Pesca. Disponible en:

http://www.minagri.gob.ar/site/_subsecretaria_de_lecheria/lecheria/04=Pago_por_Calidad/index.php (25/02/2016)

Reinheimer J. A; 1998. Bacterias psicrótrofas. Su incidencia en la calidad de la leche y productos lácteos. Jornadas ALMAST 98 . Calidad de leche y mastitis. Soc.

Robinson R. K. 1987. Microbiología, lactología. Volumen I. Microbiología de la leche. Editorial ACRIBIA, S.A. España.

Sanz Y., Collado M.C., Dalmau J. Probióticos: criterios de calidad y orientaciones para el consumo. Acta Pediátrica Española, Vol. 61, Nº 9, 2003

Tamime AY. (2002) Fermented milks: a historical food with modern applications, a review. Eur J Clin Nutr. 56 Suppl 4:S2-S15.

Varnam AH, Shuterland JP. 1995. Quesos, pp. 295-299. En Leche y productos lácteos. Tecnología, Química y Microbiología. Ed. Acribia, S.A. Zaragoza. España

Veisseyre, R. Lactología Técnica. Composición, recogida, tratamiento y transformación de la leche. Segunda Edición Española. Editorial Acribia, S.A. España.

http://www.libreriasaulamedica.com/resulbus.asp?adv=1&fam=1&idautor=15864

http://www.libreriasaulamedica.com/resulbus.asp?adv=1&fam=1&idautor=15863

http://www.libreriasaulamedica.com/resulbus.asp?adv=1&fam=1&editorial=60

http://cwx.prenhall.com/bookbind/pubbooks/brock2/

http://www.minagri.gob.ar/site/_subsecretaria_de_lecheria/lecheria/04=Pago_por_Calidad/index.php

http://www.minagri.gob.ar/site/_subsecretaria_de_lecheria/lecheria/04=Pago_por_Calidad/index.php



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ANEXO I

Resultados obtenidos en el trabajo práctico Nº 2

Fecha: Producto:

Determinaciones

Grupo:

pH

Acidez (g % de acido láctico)

Determinación de Materia Grasa (g/100 ml)

Rto. de mesófilos viables (UFC/ml)

Rto. de coliformes a 30ºC (UFC/ml)

Rto. de bacterias termodúricas (UFC/ml)

Rto. de bacterias psicrotrofas (UFC/ml)



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ANEXO II

CÓDIGO ALIMENTARIO ARGENTINO

Capítulo VIII Alimentos Lácteos

Art 576 - 1) Definiciones:

Se entiende por Leches Fermentadas los productos, adicionados o no de otras sustancias alimenticias, obtenidos por coagulación y disminución del pH de la leche o leche reconstituida, adicionada o no de otros productos lácteos, por fermentación láctica mediante la acción de cultivos de microorganismos específicos. Estos microorganismos específicos deben ser viables, activos y abundantes en el producto final durante su período de validez.

1.1) Se entiende por Yogur o Yoghurt o Iogurte, en adelante Yogur, el producto incluido en la definición 1) cuya fermentación se realiza con cultivos protosimbióticos de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus y Streptococcus salivarius subsp. thermophilus a los que en forma complementaria pueden acompañar otras bacterias acidolácticas que, por su actividad, contribuyen a la determinación de las características del producto terminado.

1.3) Se entiende por Kefir el producto incluido en la definición 1) cuya fermentación se realiza con cultivos acidolácticos elaborados con granos de kefir, Lactobacillus kefir, especies de los géneros Leuconostoc, Lactococcus y Acetobacter, con producción de ácido láctico, etanol y dióxido de carbono. Los granos de kefir están constituidos por levaduras fermentadoras de la lactosa (Kluyveromyces marxianus) y levaduras no fermentadoras de la lactosa (Saccharomyces omnisporus, Saccharomyces cerevicie y Saccharomyces exiguus), Lactobacillus casei, Bifidobacterium spp y Streptococcus salivarius subsp. termophilus).

LAS LECHES FERMENTADAS DEBERÁN RESPONDER A LOS SIGUIENTES REQUISITOS

Tabla 1.- Requisitos físico-químicos de las leches fermentadas

Materia Grasa Láctea (g/100 g)

Norma FIL 116A:1987

Acidez (g ác. láctico/100

g)

Norma FIL150:1991

Proteínas lácteas (g/100 g) (*)

Con Crema Enteras o Integrales

Parcialmente Descremadas

Descremadas

Mín. 6.0 3,0 a 5,9 0,6 a 2,9 Máx. 0,5 0,6 a 2,0 Mín. 2,9

Tabla 2.- Requisitos físico-químicos de las leches fermentadas

Producto Acidez g de ác. Láctico/100g Norma FIL

150:1991 Etanol (%V/m)

Yogur 0,6 a 1,5 -

Leche Fermentada o Cultivada 0,6 a 2,0 -

Leche Acidófila o Acidofilada 0,6 a 2,0 -

Kefir 1,0 0,5 a 1,5

Kumys 0,7 Mín. 0,5

Cuajada o Coalhada 0,6 a 2,0 -



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Las leches fermentadas deberán cumplir con los requisitos consignados en la tabla 4 durante su período de validez.

Tabla 3.- Requisitos microbiológicos de las leches fermentadas

Producto Rto. de bacterias lácticas totales

(UFC/g) Norma FIL 117 A:1988

Rto. de levaduras específicas (UFC/g) Norma FIL 94B:1990

Yogur Mín. 107

(*) -

Leche Fermentada o Cultivada Mín. 10

6

(*) -

Leche Acidófila o Acidofilada Mín. 10

7

-

Kefir Mín. 107

Mín. 104

Kumys Mín. 107

Mín. 104

Cuajada o Coalhada Mín. 106

–

(*) En el caso que se mencione el uso de bifidobacterias el recuento será de un mínimo de 106 UFC de bifidobacterias/g.

Tabla 4.- Criterios microbiológicos de las leches fermentadas

Microorganismos Criterios de Aceptación

Categoría ICMSF

Métodos de Ensayo

Coliformes/g (30°C) n = 5 c = 2 m =10 M = 100 4 FIL 73A: 1985

Coliformes/g (45°C) n = 5 c = 2 m <3 M = 10 4 APHA 1992, Cap. 24 (1)

Hongos y levaduras/g n = 5 c = 2 m = 50 M = 200 2 FIL 94B: 1990

Fuente: ICMSF- Métodos de muestreo para análisis microbiológicos ( 1) Compendium of methods for the microbiological examinations of foods. 3° Edición. Editado por Carl Vanderzant y Don F. Splittstoesser.

n: número de unidades de muestra analizada. c: número máximo de unidades de muestra cuyos resultados pueden estar comprendidos entre m (calidad aceptable) y M (calidad aceptable provisionalmente). m: nivel máximo del microorganismo en el alimento, para una calidad aceptable. M: nivel máximo del microorganismo en el alimento, para una calidad aceptable provisionalmente.

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