Guia_de_Bioquimica_y_Nutricion_2011-II

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Gua de Prcticas

Bioqumica y Nutricin

Lima - Per 2011-II

UNIVERSIDAD RICARDO PALMAFACULTAD DE MEDICINA HUMANA

FACULTAD DE MEDICINA

GUIA DE BIOQUIMICA Y NUTRICION

Dr. Elio Ivn Rodrguez ChvezRector

Dr. Manuel Huamn GuerreroDecano de la Facultad de Medicina Humana

Autores:Dra. Nancy Jo Vargas (Coordinadora de Curso) Q.F. Cecilia Rojas Guerrero (Coordinadora de Laboratorio)

A.- CONTENIDOS DE BIOQUIMICA:Actividad Interconversin de unidades y manejo de concentraciones de disoluciones. Buffer: Capacidad buffer en trminos de pKa. Actividad enzimtica: Efecto de factores en la transformacin del sustrato. Espectrofotometra Uso de la luz visible y UV en Medicina. Pgina 08

10 13 19

Accin de la amilasa en la digestin del almidn. Metabolismo de los C.H y prueba de sobrecarga de glucosa (TTG).

22 25

Universidad Ricardo Palma

Pgina 2



Determinacin e interpretacin del HCO3- en la cidosis diabtica. Aislamiento e identificacin de lipoprotenas plasmticas y su asociacin con el riesgo coronario. Ictericia: Metabolismo de la bilirrubina y pigmentos biliares. Transaminacin. Uso de la cromatografa.

27 31

3538

B.- CONTENIDOS DE NUTRICIN HUMANAActividad Valoracin Nutricional: Balance Nitrogenado Evaluacin de la Masa Proteica Visceral y Esqueltica: Marasmo- Kwashiorkor. Medidas Antropomtricas y signos clnicos que evidencian desnutricin. Manejo de la Tabla de composicin de alimentos. Pgina 44 48 52

Reglamento Interno del Laboratorio 1. La asistencia a las prcticas de laboratrio son de caracter obligatorio e injustificada 2. Las justificaciones por enfermedad se realizarn dentro de las 48 horas y con la presentacin del certificado mdico del servicio mdico de la URP 3. Se aplicar una tolerancia mxima de 5 minutos para el ingreso del alumno y lo realizar portando un mandil como vestimenta de proteccin y la guia de prcticas respectiva. 4. Los alumnos rendirn una prueba cognoscitiva de entrada conforme a la tabla de evaluacin diseada, debiendo para ello haber ledo la prctica correspondiente 5. Em cada practica, los alumnos presentarn en forma individual, un informe absolviendo El cuestionario de la practica realizada en la semana anterior. Este informe no debe exceder 10 pginas. Los informes presentados fuera de fecha no tienen validez por extemporaneos. 6. A cada alumno se le asignar una mesa de trabajo, los cambios de grupos o subgrupos no son permitidos. 7. El alumno tomar conocimiento del profesor en cuanto al buen manejo del material y equipo de laboratrio y ser responsable de su integridad y funcionamiento. 8. Si algn alumno rompe material de vidrio, deber reponerlo, de lo contrario no podr rendir el prximo examen. Universidad Ricardo Palma Pgina 3



9. En caso de deterioro de algn equipo de laboratorio toda la mesa ser responsable del dao causado. 10. Si porta celulares y equipos de sonido (MP3, Ipod, Ipad, etc.) sern apagados, permaneciendo as durante el transcurso de la prctica. 11. No se permite ingresar con alimentos y/o bebidas al laboratorio y an menos ingerirlas 12. La duracin de desarrollo de la prctica es de 2 horas y todo permiso para salir del laboratorio deber ser solicitado a su profesor de prcticas, otorgndosele permiso slo si fuera absolutamente urgente.

El trabajo en el Laboratorio requiere la observacin de una serie de normas de seguridad que eviten posibles accidentes debido a desconocimiento de lo que se est haciendo o a una posible negligencia de los alumnos.

1. Cada grupo de prcticas se responsabilizar de su zona de trabajo y de su material. 2. Es conveniente la utilizacin de mandil, ya que evita posibles proyecciones de sustancias qumicas o biolgicas lleguen a la piel. Por supuesto adems, evitars posibles deterioros en tus prendas de vestir. 3. Si tienes el pelo largo, es conveniente que lo lleves recogido.

4. Y no hara falta decir esto; pero por supuesto en el laboratorio est terminantementeprohibido fumar, ingerir bebidas y/o alimentos

1. Antes de utilizar un compuesto, verifique el nombre con el que figura en el rotulo delcompuesto

2. No devolver a los envases de origen, los remanentes de los reactivos (no utilizados) 3. El descarte de los reactivos o productos qumicos utilizados se viertan en la pila deldesage para ser arrastrados con abundante agua. 4. No utilizar la boca para el aspirado de volmenes de reactivos. Utilice pipeteadores automticos o bombillas de aspiracin 5. Cuando se haga diluciones de cidos, tener la precaucin de agregar cido al agua y no agua al cido


Pgina 4



6. Para evitar contaminacin de reactivos, utilice una pipeta seca y limpia para cada sustancia qumica 7. Utilizar guantes descartables, para manipular material biolgico

8. Los productos inflamables (gases, alcohol, ter, etc) no deben estar cerca de fuentes decalor. Si hay que calentar tubos con estos productos, se har al bao Mara, nunca directamente a la llama. 9. Si se vierte sobre ti cualquier cido o producto corrosivo, lvate inmediatamente con mucha agua y avisa al profesor. 10. Al preparar cualquier disolucin se colocar en un frasco limpio y rotulado convenientemente.

1. Cuidado con los bordes y puntas cortantes de los tubos u objetos de vidrio. 2. El vidrio caliente no se diferencia a simple vista del vidrio fro. Para evitar quemaduras, dejarlo enfriar antes de tocarlo. 3. Las manos se protegern con guantes o trapos cuando se introduzca un tapn en un tubo de vidrio. 4. Si tienes que calentar a la llama el contenido de un tubo de ensayo, observa cuidadosamente estas dos normas: Ten sumo cuidado y ten en cuenta que la boca del tubo de ensayo no apunte a ningn compaero. Puede hervir el lquido y salir disparado, por lo que podras ocasionar un accidente. Calienta por el lateral del tubo de ensayo, nunca por el fondo; agita suavemente.

5. Utilizar material limpio y seco


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Por muchos aos los cientficos expresaron las mediciones en unidades mtricas, relacionadas entre s decimalmente, es decir, mediante potencias de 10. Sin embargo, en 1960, la Conferencia General de Pesas y Medidas, la autoridad internacional en unidades, propuso un sistema mtrico revisado y actualizado al cual se denomin Sistema Internacional de Unidades (Abreviado SI, del francs Systme Internationale d Unites). En la tabla N 1 se muestran las siete unidades SI fundamentales; las dems unidades de medicin se pueden derivar a partir de estas unidades. Como las unidades mtricas, las unidades SI cambian en forma decimal por medio de una serie de prefijos, como se muestra en la tabla N 2. En Bioqumica se suele usar ste sistema el cual significa un amplio dominio en su manejo toda vez que las concentraciones de los fluidos intra y extracelulares son generalmente en el orden de los submltiplos. Tabla 1 .- Unidades SI bsicasCANTIDAD FUNDAMENTAL Longitud Masa Tiempo Corriente elctrica Temperatura Cantidad de sustancia Intensidad luminosa NOMBRE DE LA UNIDAD Metro Kilogramo Segundo Ampere Kelvin Mol Candela SMBOLO m kg s A K mol cd

Tabla 2.- Prefijos utilizados con unidades SIMULTIPLOS Prefijo tera giga mega Kilo hecto deca deci centi mili micro nano pico femto atto Smbolo T G M K H Da d c m u n p f a Factor 1012 10 9 106 103 102 10 10-1 10-2 10-3 10-6 10-9 10-12 10-15 10-18 Equivalente 1 000 000 000 000 1 000 000 000 1 000 000 1 000 100 10 0,1 0,01 0,001 0,000 001 0,000 000 001 0,000 000 000 001 0,000 000 000 000 001 0,000 000 000 000 000 001

SUBMULTIPLOS

INFORME DE LA PRACTICA N 1Nombre del Alumno:-----------------------------------------------------------------------------------------------------------Grupo: ---------------------------------1.- Realice los siguientes conversiones: X X X X cg pg ul dm = = = = X ug X dg X pl X mm Xpl XnMol Xug = XHg = Xml = XuMol X Hg = X dg Fecha:---------------------------

2.- Describa la estructura qumica y calcule el Peso molecular de los siguientes compuestos: a) Glucosa b) Cloruro de sodio


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c) d) e) f) g) h)

Cloruro de potasio Cloruro de calcio Lactato de sodio Gluconato de calcio Urea Manitol

3.- Describa las siguientes expresiones: a) b) c) e) Molaridad Normalidad Equivalente m-Eq Osmolaridad

d)

4.- Calcule la Molaridad de 1 Litro de Solucin de : a) Cloruro de sodio al 0.9% b) Suero glucosado al 5% c) Una ampolla de NaCl al 20% d) Una ampolla de 20cc de NaHCO3 al 8.4% 5.- Calculo los mEq: a) Cuantos mEq de Na y de Cl hay en una ampolla de 20cc de NaCl al 20% b) Cuantos mEq de K hay en una ampolla de 20 ml de KCl al 10%

c) Cuantos mEq

de HCO3 y cuantos mEq de Na hay en una ampolla de 20cc de HCO3Na al 10%.

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Firma del Alumno

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Firma del Profesor

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Nota

La curva de titulacin de un cido dbil como actico representa las variaciones de pH con respecto a diferentes proporciones relativas entre la sal y el cido de una solucin tampn. Antes de adicionar la base, el pH se debe solamente al cido. Tan pronto como se agregue algo de base sta reacciona con una cantidad equivalente de sal y agua. Pero el cido dbil , mas su sal disuelta constituye una solucin tampn, cuyo pH puede calcularse mediante el uso de la ecuacin de Henderson - Hasselbach.

pH = pKa + log

[ ACIDO]OBJETIVO a) b) Obtener la curva de valoracin de un cido dbil, HA, CH3COOH O.1N y una base fuerte NaOH 0.1N Calcular el pH haciendo uso de un potencimetro y la ecuacin de Henderson Hasselbach

[ SAL]

POTENCIOMETRIA El mtodo ms confiable para medir el pH es mediante el uso de un medidor de pH comnmente denominado potencimetro, que mide la fuerza electromotriz (f.e.m.) de una celda formada por un electrodo de referencia, la solucin problema y un electrodo de vidrio sensible a hidrogeniones. El electrodo de referencia puede ser de calomel (mercurio, cloruro mercurioso) sumergido en una solucin concentrada de cloruro de potasio. El electrodo de medida o de vidrio, esta constituido por un tubo de vidrio grueso con un extremo en forma de bombilla, el cual es selectivo y sensible al paso de iones hidrgeno. Est conectado a un alambre de platino conectado al electrodo de Ag, Cl 2Ag, sumergido en HCl 0.1M. La fuerza electromotriz generada es leda en un galvanmetro es unidades de pH.


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EXPERIMENTO 1 Medir y mezclar los volmenes de CH3-COOH 0.1N, de NaOH 0.1N y agua indicados en el siguiente cuadro:

Tubo N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 a) b)

CH3-COOH 0.1N 10 ml 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

NaOH 0.1N 0.0 ml 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0

H2O DEST. 10 ml 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

pH

Medir los valores de pH de cada mezcla, utilizando el potencimetro Calcular los valores de pH de cada mezcla, aplicando la ecuacin de Henderson Hasselbach. pKa=4.76

INFORME DE LA PRACTICA N 2 Nombre del Alumno:-----------------------------------------------------------------------------------------------------------Grupo: ---------------------------------Fecha:---------------------------


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VALORACION DE UN ACIDO DEBIL MONOPROTICOpH

100% ACIDO ml de NaOH 0.1N

100% SAL

1. Un cido dbil, AH, est ionizado al 1% en una solucin 0,2M a) Calcule la constante de equilibrio (Keq) para la disociacin del acido2. b) Calcule el pH de la solucin En papel milimetrado, grafique los valores del pH vs ml de NaOH 0.1N utilizados en la titulacin y: a. Halle el valor del pKa b. Seale la regin de la grfica donde exista la capacidad buffer Si la concentracin del H2CO3 en el plasma sanguneo es aproximadamente 0.00125M

3.

a. b.

Calcule la concentracin de HCO3 en el plasma, cuando el pH es 7.4 Halle la razn HCO3 / H2CO3 del buffer

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Firma del Alumno

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Firma del Profesor

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Nota

Las enzimas son protenas que intervienen en las reacciones bioqumicas, acelerando la velocidad de la reaccin hasta su punto de equilibrio. ACTIVIDAD ENZIMATICA Es la capacidad de una enzima de acelerar una reaccin qumica. Se puede expresar de diversas maneras: (a) Desaparicin de un sustrato (S)

(b) (c)

Formacin de producto Modificacin de cofactores

(P) (C)

K1E+S ES

K3E+P c'

K2Diversos factores modifican la actividad enzimtica: 1. pH 2. Concentracin de la enzima 3. Concentracin del sustrato 4. Tiempo de incubacin

K4

e''


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5. 6.

Temperatura Inhibidores y activadores.

Para la prctica buscamos el efecto de la pepsina, enzima proteica, sobre la albmina. La mayor actividad enzimtica se demostrar por desaparicin del sustrato (menor turbidez de la albmina por su transformacin en aminocidos). EXPERIENCIA NRO. 1 EFECTO DEL pH Cada enzima tiene un pH ptimo de trabajo. Para demostrar el pH ptimo de la pepsina, trabajaremos con 6 tubos de acuerdo al siguiente esquema: TUBO Nro. 1 2 3 4 5 6 B PH 1.0 1.5 6.0 9.5 11.5 Albmina : ml 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 HCl 1N : ml 2.0 0.5 CO3Na2 10% : ml 0.5 2.0 Agua dest. : ml 1.5 2.0 1.5 5.0 Pepsina 1% : ml 20 Incubar los Tubos del 1 al 6 a 37C x 5 Aadir rpidamente del tubo N6; 3ml de pepsina a los tubos N 1,2,3,4 y 5. Mezclar, incubar 37 x 5' Leer D.O en el espectrofotmetro a 420nm de los tubos N1,2,3,4 y 5 y el tubo Blanco(B). Llevando a cero el instrumento con un blanco de agua destilada. Restar la lectura del tubo Blanco(B) menos la lectura de cada uno de los 5 tubos. La diferencia ser asumida como actividad enzimtica. EXPERIENCIA NRO. 2 EFECTO DE LA CONCENTRACION DE LA ENZIMA Demostrar que la velocidad de la reaccin es directamente proporcional a [E]cuando la concentracin del S es constante. Preparar el experimento de acuerdo al siguiente esquema: TUBO Nro. Albmina : ml HCl 1N : ml Agua dest. : ml Pepsina 1% : ml B 5.0 0.5 4.5 1 5.0 0.5 4.0 2 5.0 0.5 3.5 3 5.0 0.5 2.5 4 5.0 0.5 1.5 5

10.0

Incubar los Tubos a 37C x 5'. Aadir la pepsina del tubo 5 a los tubos 1 al 4 segn el sgte. esquema: TUBO Nro.1 B 1 2 3 4 Pepsina incubada 0.0 0.5 1.0 2.0 3.0 Mezclar, incubar a 37C x 5'.Detener la reaccin colocando los tubos en bao de hielo. Leer las D.O en el espectrofotmetro a 420nm. Llevando a cero el instrumento con un blanco de agua destilada. La diferencia de las absorbancias entre el tubo Blanco y la lecturas de los otros tubos nos indicar la actividad enzimticca para cada tubo.| EXPERIENCIA NRO. 3 EFECTO DE LA T El incremento de la temperatura acelera la velocidad de las reacciones qumicas por un aumento en nmero de colisiones efectivas entre los elementos reaccionantes, sin embargo todo incremento de temperatura por encima de la velocidad mxima de reaccin, produce una desnaturalizacin progresiva de la enzima. Para la experiencia, prepararemos 2 series de 5 tubos cada una. Serie N1 TUBO Nro.(1 serie) Albmina : ml HCl 1N : ml Agua dest. : ml Serie N2 TUBO Nro.(2 serie) Pepsina 1% : ml 1b 1.0 2b 1.0 3b 1.0 4b 1.0 5b 1.0 1a 5.0 0.5 3.5 2a 5.0 0.5 3.5 3a 5.0 0.5 3.5 4a 5.0 0.5 3.5 5a 5.0 0.5 3.5 Blanco 5.0 4.0

Incubar por 5los tubos de acuerdo al siguiente esquema de temperaturas: TUBO Nro. 1a-1b 2a-2b 3a-3b 4a-4b 5a 5b T.C 0C Tamb 37 70 37 100 Agregar el contenido de los tubos 1b,2b,3b,4b y 5b a sus respectivos tubos 1a,2a,3a,4a y 5a . Luego incubar a las T correspondientes 0C, Tamb, 37C, 70C y 100C a cada tubo por 5 minutos. Colocar los tubos en bao de agua helada para detener la reaccin. Leer D.O. en el espectrofotmetro a 420nm. Llevando a cero el instrumento con un blanco de agua destilada.


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La actividad enzimtica se encontrar restando la lectura del tubo blanco (B) menos la lectura de los otros 5 tubos. EXPERIENCIA NRO. 4 EFECTOS DE LA CONCENTRACION DEL SUSTRATO Si aumentamos progresivamente la concentracin del sustrato, aumentaremos la velocidad enzimtica (velocidad inicial) hasta un punto en que la velocidad llega a una meseta y no se modificar aunque sigamos aumentando el sustrato (saturacin). Preparar 8 tubos de acuerdo al siguiente esquema: TUBO Nro. Albmina : ml HCl 1N : ml Agua dest. : ml Pepsina 1% : ml 1 1.0 0.5 8.0 2 2.0 0.5 7.0 3 3.0 0.5 6.0 4 4.0 0.5 5.0 5 5.0 0.5 4.0 6 6.0 0.5 3.0 7 7.0 0.5 2.0 8 5.0

Mezclar. Leer los tubos 1,2,3,4,5,6,7. Considerar las absorbancias como lectura inicial. Luego incubar los 8 tubos a 37 x 5'. Aadir 0.5ml de pepsina a cada tubo (del tubo 8 a los tubos 1,2,3,4,5,6 y7)Mezclar. Incubar 5' a 37C. Detener la reaccin en un bao de hielo. Leer D.O en el espectrofotmetro a 420 nm. Considerar las absorbancias como lectura final. Hacer la diferencia: Actividad Enzimtica = Lectura Inicial Lectura Final El resultado de sta diferencia se considerar como actividad Enzimtica.

INFORME DE LA PRACTICA N 3 Nombre del Alumno:--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Grupo: --------------------------------Fecha:------------------------------------

1. Usando los valores de la actividad enzimtica obtenidos, Grafique:EFECTO DEL pH Act. Enz. ________________________________________________ _ EFECTO DE LA T Act. Enz.

pH Comentario:____________________________________ ________________________________________________ T


Pgina 12



Comentario:____________________________________ ________________________________________________ ________________________________________________ _


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GUIA DE BIOQUIMICA Y NUTRICIN

EFECTO DE LA CONCENTRACION DE LA ENZIMA Act. Enz.

EFECTO DE LA CONCENTRACION DEL SUSTRATO Act. Enz.

[E] Comentario:_______________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________________________________________ ____

[S] Comentario:_______________________________________________ ___________________________________________________________ ___________________________



2.

Los

valores

experimentales

de2

la

carbobenzoxiglicil-

L-Triptfano,

utilizada

por

la

enzima

carboxipeptidasa : Carbobenzoxiglicil-L-Triptfano + H O on los siguientes, donde la E es la misma en todo el ensayo: S (mM) 2,5 5,0 10,0 15,0 20,0 Velocidad (mMs ) 0,024 0,036 0,053 0,060 0,064 Km y Vmax de la Carbobenzoxiglicil-L-Triptfano-1

Carbobenzoxiglicina + L-Triptfano

3.

Para el comportamiento de una enzima que mostr los siguientes datos experimentales: S (mM) V , inhibidor (mmol.min ) 3,0 5,0 7,0 9,0 11,0 4,58 6,4 7,72 8,72 9,5 3,66 5,12 6,18 6,98 7,60-1 1

sin

V , con inhibidor (mmol.min )-1

2



Grafique la curva de

a)b)

Determine los valores de Km y Vmax Comente si el inhibidor es competitivo o no competitivo

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Firma del Alumno

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Firma del Profesor

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Nota

OBJETIVO: a) Preparar soluciones de concentracin creciente de una solucin estndar de Azul de Metileno y leer %T y calcular sus A D.O. Ley de Lambert: Cuando un rayo de luz monocromtica incide sobre un medio absorvente, su intensidad decrece en forma exponencial al espesor del medio. Ley de Beer: Cuando un rayo de luz monocromtica incide sobre un medio absorvente su intensidad decrece en forma exponencial a la concentracin. Ambas leyes se fusionan as: Ley Lambert Beer I = I0 . 10-abc a = absortividad molecular b = espesor medio c = concentracin I = luz emergente I0= luz incidente



I/I0 = 10-abc log(I/I0) = -abc log I0/I = abc log 100%/%T = 2-log%T 2-log%T = a.b.c Abs Abs = a.b.c si b = k a.k = K = K.c

La Abs es directamente proporcional a la concentracin . Luego establecemos la siguiente proporcionalidad :

Abs St CSt = Abs x CxCx = Cx =

Abs Abs Cx CSt

x St

= = = =

Abs desconocido Abs standard Concentr. Desconocido Concentr. Standard

Abs x xCst Abs St C St xAbs _ desconocido Abs StConcentracin = Desconocido

FACTOR CALIBRACION:

Concetraci n st. Abs st

x Abs desconocido

Cuando previamente se ha determinado la linaridad de Absst=k.c:

Concetraci n st. Abs st

= Factor

Factor x Abs desconocido = Concentracin desconocido Definiciones:

1. Absorbancia:A = log10T = -log

2. Absortividad Coef. Extin.: a=

1 T

= 2-log10 % T

Absorbancia/Unidad de concentracin y espesor absorbancia especfica Concentracin

a=A/bc espesor

3. Energa Radiante:I0 = Luz incidente

4. Transmitancia:T=

5. % Transmitancia:

I. I0

(emergente) (incidente)

%T = 100T



UV IR Luz Visible

Regin espectral de 200-380 nm Regin espectral de 0.7 - 300um Regin espectral de 380 780nm

M Absortividad molar cm Coeficiente de extincin molar o molecular Absortividad de una solucin11 Mol/L, en 1 cm espesor cm M La relacin matemtica entre A y concentracin: 1 A = a.b.c = log 100

A

A

por 100 de T

A= 2 log % T

Los espectrofotmetros reportan sus resultados en absorbancia (luz absorbida por las partculas de la solucin) y transmitancia ( luz absorbida) A 2 1.0 0.5 0.25 0.125 0.06 0

%T 0 10 31 56 75 87 100 La absorbancia o Densidad aplicada se expresa en valores semilogartmicos y la trasmitancia en valores alfanumricos. EXPERIMENTO N 2 La prctica consiste en preparar soluciones de concentracin creciente de una solucin standart y leer sus D.O. y %T. N tubo ml. de sol standart ml. Agua destilada ml. muestra problema % Transmitancia Calcular Absorbancia Calcular mg % de Azul de Metileno Mezclar. Leer el % de Transmitancia a 540, colocando a 0 con agua destilada. INFORME DE LA PRACTICA N 4 Nombre del Alumno:--------------------------------------------------------------------------------------------------------------Grupo: ---------------------------------Fecha:------------------------------

St 1 2 8 -

St 2 4 6 -

St 3 6 4 -

St 4 8 2 -

St 5 10 -

St 6 8.5 1.5

CURVA DE CALIBRACION 1.- Grafique en papel milimetrado A Vs Concentracin y en papel semilogartmico %T Vs Concentracin



A

%T

Papel semilogaritmico

Concentracin

Concentracin

2.- Calcular el Factor de Calibracin, con las A del azul de metileno en diferentes concentraciones 3.- Calcular la concentracin de una muestra problema haciendo uso del F.C. y curva de calibracin. 4.- Qu cantidad de alcohol al 20% se requiere para preparar 1 Litro de alcohol al 10%

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Firma del Alumno

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Firma del Profesor

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Nota

INTRODUCCION El almidn es un polmero de glucosa y se caracteriza por dar un color azul con una solucin de yodo. Est constituido por amilosa (15-20%) y amilopeptina (80-85%) ambos constituyentes son hidrolizadas por la alfa-amilasa salival y pancretica produciendo maltotriosa, maltosa y dextrinas. La presencia de azcares reductores se identifican por la formacin de Cu2O en presencia del reactivo de Benedict. OBJETIVO a) Determinar la accin de la amilasa sobre el almidn. b) Determinar sustratos y productos producidos por accin de la amilasa salival. c) Efecto del pH sobre la amilasa salival. HIDRLISIS DEL ALMIDON (DIGESTION) Haciendo uso de cuatro tubos, seguir el siguiente esquema:TUBO N ALMIDON 1%; ml BUFFER FOSFATO pH 6.8:ml HCL O,3N : ml 1 2.0 1.0 2 2.0 1.0 3 2.0 1.0 4 2.0 3.4



CL Na 0,9%: ml Agua dest.:ml Amilasa Salival: ml

3.0 Bao Mara 37 x 5 -

2.4 0.6

2.4 0.6

0.6

Mezclar, Incubar en Bao Mara 37C x 20 A. DETERMINACION EL SUSTRATOTUBOS N DIGERIDO DEL TUBO 1: DIGERIDO DEL TUBO 2: DIGERIDO DEL TUBO 3: DIGERIDO DEL TUBO 4: H CL 0.05N : ml Sol. de Lugol: ml ml ml ml ml 5 0.5 5 0.5 6 0.5 5 0.5 7 0.5 5 0.5 8 0.5 5 0.5

Dejar en reposo por 15 minutos. Leer al fotocolormetro con filtro rojo (660nm) B. DETERMINACION DEL PRODUCTOTUBOS DIGERIDO DEL TUBO 1: ml DIGERIDO DEL TUBO 2: ml DIGERIDO DEL TUBO 3: ml DIGERIDO DEL TUBO 4: ml SOLUCION DE GLUCOSA 1%: ml SOLUCION BENEDICT : ml 9 0.5 2 10 0.5 2 11 0.5 2 12 0.5 2 13 0.5 2

Mezclar, Incubar en Bao Mara a 100C x 5 Enfriar en agua helada e interpretar.



INFORME DE LA PRACTICA N 5 Nombre del Alumno:-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Grupo: -------------------------1.- Determinacin del sustrato: Fecha:----------------------------

Tubo N 1 ...........................................................................Interprete el resultado........... Tubo N 2 .......................................................................... Interprete el resultado........... Tubo N 3 .......................................................................... Interprete el resultado........... Tubo N 4......................................................................... Interprete el resultado............. 2.- Grafique Actividad enzimtica Vs Tubo de ensayo: Actividad

0.500 0.400 0. 300 0.200 0. 100 5 6 7 8 Tubo

COMENTARIO:---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------3.- Determinacin del producto: Tubo N 1 ........................................................................ Interprete el resultado........... Tubo N 2 ......................................................................... Interprete el resultado........... Tubo N 3 .......................................................................... Interprete el resultado........... Tubo N 4 .......................................................................... Interprete el resultado........... 4.- Explique, cuales son las condiciones ptimas para una hidrlisis enzimtica del almidn soluble. 5.- Interprete la reaccin de Benedict.

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Firma del Alumno

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Firma del Profesor

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Nota

La prueba de tolerancia a la glucosa (TTG) es empleada para evaluar pacientes en quienes se sospechan anormalidades del metabolismo de los carbohidratos. Esto es particularmente til para la diabetes mellitus. La prueba de tolerancia a la glucosa por va oral es ms funcional , ms confiable y ms fcil de llevar a cabo que la prueba de tolerancia a la glucosa por va intravenosa. La secrecin de insulina como respuesta a la administracin de glucosa es mayor debido a la estimulacin de la secrecin de hormonas entricas, las cuales a su vez estimulan la secrecin de insulina. OBJETIVO: 1 Determinar la concentracin de glucosa srica basal ( 0' ) y a los 30', 60', 90' y 120' despus de una sobrecarga oral de glucosa ( 75 g ). 2 Determinar el umbral renal de reabsorcin de glucosa 3 Presencia de Cuerpos Cetnicos DETERMINACION DE GLUCOSA SERICA:



La glucosa oxidasa cataliza la oxidacin de la glucosa de acuerdo con la siguiente ecuacin:

El perxido de hidrgeno formado reacciona con 4 amino-antipirina y fenol en presencia de peroxidasa, formando una quinonaimina coloreada, la cual es directamente proporcional a la concentracin de glucosa en sangre. EXPERIMENTO 1 Determinar la concentracin de glucosa srica siguiendo el siguiente esquema:N Tubo ST. Glucosa: 150 mg | dl: (ul) Suero : 0' (ul) 30' (ul) 60' (ul) 90' (ul) 120' (ul) Reactivo de glucosa: ml 1 2.5 2 25 2.5 3 25 2.5 4 25 2.5 5 25 2.5 6 25 2.5 7 25 2.5

1. 2.

Mezclar. Incubar 37 C x 10' o 20 minutos a T ambiente

Leer D.O. en el espectrofotmetro a 505 nm, frente al Bl CALCULO.Haciendo uso del factor de calibracin expresar la glucosa en mg/dl VN EXPERIMENTO 2 Para determinar la presencia de glucosa en orina, seguir el siguiente esquema: Tubo N Orina React. Benedict. 1 0.5 2.0 = 70 - 110 mg/dl

1.2.

Mezclar. Colocar a 100 C x 5'. Enfriar ( hielo). Observar la formacin de precipitado.



INFORME PRACTICA N 6 Nombre del Alumno:-----------------------------------------------------------------------------------------------------------Grupo: -----------------------------------------------------------------Fecha:---------------

CURVA DEL T.T.G.

Glucosa mg | dl

Tiempo : minutos 1. Graficar e interpretar la curva de un sujeto normal y un diabtico.2. Fundamento de la reaccin de Benedict frente a los carbohidratos la presencia de Cu2O en la orina del sujeto diabtico.

3. Interprete la curva y

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Firma del Alumno

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Firma del Profesor

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Nota



El sujeto diabtico se caracteriza por presentar alteracin del metabolismo de los carbohidratos, protenas y de los lpidos. La liplisis produce una elevacin de los cidos grasos libres y consecuentemente el incremento de cuerpos cetnicos. La cetonemia ocasiona una disminucin del pH sanguneo lo cual ocasiona una disminucin de la concentracin del HCO3sanguneo. ( acidosis diabtica) DETERMINACIN DEL BICARBONATO FUNDAMENTO: El CO3H srico o plasmtico es neutralizado con HCl desprende CO2. El cido que no reacciona se determina a travs de una titulacin con NaOH, obtenindose por diferencia la concentracin de HCO3PROCEDIMIENTO Se usa suero o plasma obtenido en anaerobiosis , empleando aceite mineral en el momento de su obtencin. 1. NEUTRALIZACION DEL BICARBONATO Colocar en un beacker o matraz los siguientes componentes: a) 5 ml de HCl 0.01N b) 1 ml de suero plasma c) 1 gota de alcohol caprlico. d) Agitar suavemente por rotacin por 2 e) Incubar 15 a 37C f) Aadir 20 ml agua destilada hervida y fra. g) Aadir 3 gotas del colorante fenosulfonthaleina(PSP). 2. TITULACION Usando una bureta, agregar solucin de NaOH 0.01 N hasta que el color del colorante cambie de color amarillo (ph 6.8) al rosado (ph 8.2) 3. EXPRESION Calcular los m Eq/L del sujeto normal y compararla con un sujeto diabtico descompensado VN= 26-32 m Eq/L 4. CETONURIA FUNDAMENTO La presencia de cuerpos cetnicos se determina por el test de Rothera, frente al reactivo de nitroprusiato de Na forma un anillo prpura rojizo. PROCEDIMIENTO En un tubo de prueba colocar a) 1 ml orina b) 1 gr de SO4(NH4)2 c) 3 gotas de nitroprusiato de Na al 10% d) Mezclar e) 1 ml de NH4 (OH) en zona Observar: Aparicin de un anillo prpura o morado = (+)



INFORME DE PRACTICA N. 7 Nombre del alumno ...................................................................................... Grupo .............................................. DETERMINACIN DE BICARBONATO 1. Calcule los mEq/L de HCO-3 del sujeto normal



2. 3.

Calcule los mEq/L de HCO-3 del sujeto D.M. Compare e interprete los resultados.

DETERMINACION DE CETONURIA COMENTARIO 1. 2. Explique la disminucin del bicarbonato en el sujeto diabtico Describa las sustancias que dan el anillo rojo-violaceo.

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Firma del Alumno

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Firma del Profesor

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Nota

La enfermedad cardiaca coronaria ( E.C.C.) sigue siendo la principal causa de morbilidad prematura. Un factor de riesgo importante es el incremento del colesterol plasmtico. Sin embrago el colesterol por si mismo no es un elemento de prediccin en el paciente individual. Otros parmetros lipdicos como el HDL y triglicrido tambin son necesarios para cuantificar el riesgo de ECC con mayor precisin. Aplicando la formula de Friedewald podemos calcular las otras lipoprotenas sricas VLDL y LDL que completan la informacin de prediccin de alteracin vascular. OBJETIVO a) Determinar la concentracin de colesterol total, triglicrido, HDL, LDL y VLDL. b) Determinar el RC a travs del perfil lipdico ( segn Castelli ) DETERMINACION DE COLESTEROL TOTAL Fundamento El colesterol se determina por accin de la enzima colesterol ster hidrolasa y colesterol oxidasa. La primera libera el colesterol de los esteres de colesterol, y la segunda oxida el colesterol libre producindose perxido de hidrogeno, el cual en presencia de la enzima peroxidasa reacciona con el sistema cromognico dando origen a un compuesto coloreado que absorbe 505nm. Colesterol ester Colesterol 2H2O2 + O2 PAP CEH CHOD Colesterol + cidos grasos

Colest-4-en-3-ona + H2O2 Comp. Coloreado + 4H2O

+ 4-AAP + p-HBA



Tubo N St-Colesterol: 200 mg/dl Suero Pb Reactivo Color

Blanco 3.0 ml

Standar d 30 ul 3.0 ml

Muestra 1 30 ul 3.0 ml

Muestra 2 30 ul 3.0 ml

Mezclar. Incubar 10 minutos a 37C o 20 minutos a Tambiente Leer en espectrofotmetro el St y Pb frente al BL a 505 nm. Expresin Haciendo uso del factor de Calibracin, expresar el colesterol en mg/dl : DETERMINACION DE TRIGLICERIDOS

VN = 160 - 200 mg / dl

Fundamento Los triglicridos presentes en la muestra, segn las reacciones acopladas descritas a continuacin, son un complejo coloreado que se cuantifica por espectrofotometra. Triglicridos + H20 Glicerol + ATP Glicerol 3 fosfato + O2 2H2O2 + 4-aminoantipirina + 4-clorofenol lipasa Glicerol-Kinasa GPO Peroxidasa Glicerol + cidos grasos Glicerol-3-P + ADP Dihidroxiacetona fosfato + H2O2 Quinonaimina

Esquema Tubo N St-Triglicrido: 200 mg| dl Suero -Pb Reactivo Color Blanco 3.0 ml Standar d 30 ul 3.0 ml Muestra 1 30 ul 3.0 ml Muestra 2 30 ul 3.0 ml

Agitar. Incubar 10 minutos a 37C o 20 minutos a T ambiente Leer en espectrofotmetro el St y Pb frente al BL a 520 nm. Expresin Haciendo uso del factor de Calibracin, expresar los triglicridos en mg/dl :

VN = 60 - 200 mg / dlDETERMINACION DE COLESTEROL - HDL Fundamento del Mtodo El HDL - Colesterol es obtenido precipitando selectivamente las lipopotrenas LDL y VLDL, quedando el primero en solucin. El HDL - Colesterol en solucin se determina por accin de las enzimas Colesterol ester hidrolasa y Colesterol oxidasa. La primera libera el colesterol de los steres de colesterol, y la segunda oxida el colesterol libre, producindose perxido de hidrgeno, el cual en presencia de la enzima peroxidasa reacciona con el sistema cromognico dando origen a un compuesto coloreado que absorbe a 505 nm.



Colesterol ester Colesterol +O2 2H2O2 + 4-AAP + p-HBA CHOD PAP

CEH

Colesterol + cidos grasos Colest-4-en-3-ona + H202 Comp. Coloreado + 4H2O

Tcnica Precipitacin: Agregar en un tubo de centrfuga 0.5 ml de reactivo precipitante y 0.2 ml de muestra, mezclar y esperar 15 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar 15 minutos a 3000 r.p.m. o 3 minutos a 10.000 r.p.m Colorimetra.LLevar el reactivo colesterol CHOD- PAP a la temperatura que se realizara el ensayo. Tubo N Sobrenadante (ml) Standard (ml) Reactivo (ml) Blanco 3.00 Standard 0.03 3.00 Muestra 1 0.30 3.00 Muestra 2 0.30 3.00

Mezclar e incubar 10 minutos a 37 o 20 minutos a temperatura ambiente (20 a 25 C). Leer las absorbancias a 505 nm. llevando a cero el espectrofotmetro con el blanco del reactivo. El color resultante es estable por lo menos 30 minutos. Clculos.HDL-Colesterol : (mg%)=F.D. x D.O. Pb FD =76.5/D.O standard Ecuacin de Friedewald:

LDL-C (mg/dl)=C.Tot.(mg/dl)-HDL(mg/dl)-VLDL. (mg/dl) VLDL (mg/dl) = TG 5 Esta frmula es vlida cuando los Tg son menores de 400 mg/dl.

Observaciones -

Despus de centrifugar, el sobrenadante debe ser claro. Sueros con concentraciones de triglicridos superior a 1000 (mg/dl) deben diluirse con suero fisiolgico antes de precipitar. El resultado obtenido se multiplica por el factor de dilucin.

-

Interpretacin del Perfil Lipdico Mnimo LIPIDO (mg/dl) CT LDL HDL : Hom : Muj TG : DESEABLE < 200 < 130 > 35 > 45 < 200 RIESGO POTENCIAL 200-239 130-159 25-35 40-45 > 200 ALTO RIESGO >= 240 >= 160 < 25 < 40 > 200 (*)

(*) Si se acompaa de HDL < 35 mg/dl o relacin CT/HDL >5 INFORME PRACTICA N 8 Nombre del Alumno:-------------------------------------------------------------------------------------------------------------Grupo: ----------------------------------------------------------------------1. Fecha:---------------

Calcular , en el sujeto normal y patolgico , la concentracin en mg/ dl del :



CT TG HDL LDL VLDL 2.

: : : : :

Calcular el R. C.: CT/HDL LDL/HDL : :

3.

Explique el comportamiento electrofortico de las lipoprotenas plasmticas

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Firma del Alumno

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Firma del Profesor

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Nota

Las alteraciones del Metabolismo de la bilirrubina pueden evaluarse haciendo su dosaje en suero o plasma sanguneo en forma fraccionada. Dichas alteraciones se deben a: 1. - Aumento de la produccin del pigmento (hemlisis: incremento de la destruccin de los hemates circulantes) 2. - Disminucin de la captacin heptica de la bilirrubina (medicamentosa, sndrome de Gilbert, dficit de glucoronil transferasa). 3. -Alteracin de la conjugacin heptica, disminucin de la actividad de la glucoronil transferasa ictericia neonatal (ictericia fisiolgica del recin nacido). 4. - Excrecin deficiente (obstruccin intraheptica o extraheptica clculos). Por ltimo permite el estudio de las enfermedades hepatocelulares: hepatitis o cirrosis, enfermedades en las cuales suelen estar interferidas todos los pasos del metabolismo de la bilirrubina (captacin conjugada y excrecin). OBJETIVO: a) b) Determinar la concentracin de Bilirrubina Total, Directa e Indirecta Determinar Urobilingeno y Urobilinas

Mtodo de Malloy y Evelyn Fundamento: La bilirrubina reacciona especficamente con el cido sulfanlico diazotado produciendo un pigmento color rojo violceo (azobilirrubina) que se mide fotocolorimtricamente a 530 nm. Si bien la bilirrubina conjugada (directa) reacciona directamente con el diazorreactivo, la bilirrubina no conjugada (indirecta) requiere la presencia de un desarrollador acuoso que posibilite su reaccin. De forma tal que, para que reaccione la bilirrubina total (conjugada y no conjugada) presente en la muestra, debe agregarse benzoato de cafena al medio de reaccin. VALORES NORMALES: BT = 0.3 1.1 mg/dl BD (Conjugada) = 0.1 0.4 mg/dl BI = 0.2 0.7 mg/dl PROCEDIMIENTO: Preparar St. 2mg% .D.O. st =0.09



Blanco Muestra Agua Destilada Desarrollador Reactivo sulfanlico Diazorreactivo 200 ul 2.4 ml 200 ul -

Directa 200 ul 2.4 ml 200 ul

Total 200 ul 2.4 ml 200 ul

Mezclar por inversin suave e Incubar por 5 minutos a T ambiente. Leer las absorbancias a 530nm, llevando a cero el instrumento con un blanco de agua destilada. La bilirrubina directa debe leerse exactamente a los 2 minutos.. CALCULOS: FC = Conc. St Abs St. BT = FC x (Abs Total Abs Blanco) = mg/dl BD = FC x (Abs Directa Abs Blanco) = mg/dl Determinacin de Urobilingeno y Urobilinas:

BI = BT BD = mg/dl

REACCION DE EHRLICH En un Si hay tubo de prueba urobilingeno en se colocan 5 ml cantidad anormales, de orina. a los 3 Se aade 0.5 ml de reactivo de Ehrlich. minutos se presenta un color rojo cereza.

REACCION DE GMELIN En un tubo de llegar al fondo dos capas. prueba 2 ml se de coloca 2 ml acido ntrico de orina nitroso, y con procurando una pipeta que se se hace forme

En la lneas de unin aparecen una serie de colores, comenzando con verde que luego puede cambiar a azul, violeta, anaranjado, si existe bilirrubina en la orina. En la orina normal solo aparecen bandas de color anaranjado o bruno, debido a la oxidacin del urocromo.



INFORME PRACTICA N 9 Nombre del Alumno:

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Grupo: -----------------------------------------------------------------------

Fecha:

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1.

Calcule los mg/dl de Bilirrubina Total, Bilirrubina Directa y Bilirrubina Indirecta en cada sujeto estudiado

2.

Explique bioqumicamente, la reaccin de conjugacin de la bilirrubina directa

3.

Indique cuales son los pigmentos biliares

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Firma del Alumno

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Firma del Profesor

Nota

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La reaccin de transaminacin consiste en la transferencia de un grupo amino de un aminocido a un cetocido con la consiguiente formacin de nuevos aminocidos y cetocidos. El objetivo es entender como el organismo a travs de este proceso los carbohidratos se transforman en aminocidos o como los aminocidos se interconvierten. Las enzimas que catalizan estas reacciones se llaman transaminasas, que tienen como coenzima al fosfato de piridoxal (B6). La glutmico pirvico y oxalactico son de importancia en el diagnstico de enfermedades hepticas y cardiacas toda vez que se produce aumento en el torrente circulatorio tras la muerte celular del rgano. COOH COOH | | CH2 CH2 | | CH2 CH2 | | CHC=O NH2 | | COOH GLUTAMIC COOH

Ac.

Ac.



Glutmico

O PO4B6 COOH | CH2 | C=O |OXALACETICA

Cetoglutarato

Ac. COOH Oxalactico

COOH | CH2 | C=NH2 | COOH Ac. Asprtico

1)

REACCION DE TRANSAMINACION

Para demostrar la reaccin de la transaminacin, se extraer la enzima de homogenizado de hgado de pollo y se aplicar a el siguiente esquema :Tubo N 1 CETOGLUTARATO ALANINA PIRUVATO GLUTAMATO ARSENITO ENZIMA ACTIVA ENZIMA INACTIVA 0.2 M (ml) 0.2 M (ml) 0.2 M (ml) 0.2 M (ml) 0.2 M (ml) 1 ----0.3 0.3 0.4 0 1 2 ----0.3 0.3 0.4 1 0

0.2 M (ml) 0.2 M (ml)

Incubar a 37 x 45min . Agregar 6 ml. alcohol etlico en cada tubo centrifugar y usar los sobrenadantes para la cromatografa. Demostrar si hubo transaminacin, utilizando el proceso de cromatografa ascendente. 2) EVIDENCIA DE LA TRANSAMINACION POR CROMATOGRAFIA: Cromatografa ascendente en placas con Silicagel: Por cromatografa en capa fina se entiende la tcnica capaz de separar los componentes de una muestra entre dos fases, una mvil, que suele ser lquida y otra estacionaria, que puede ser lquida o slida, y que est dispuesta como una capa de material poroso de un espesor determinado, colocada sobre un soporte plano inerte, de vidrio o de aluminio. Dos principios fisico-qumicos participan en esta separacin: particin por solvente y adsorcin. Los aminocidos Alanina, Ac. Asprtico, y Ac. Glutmico, se van a separar en funcin de sus diferentes solubilidades entre la fase mvil lquida, constituida por propanol:agua (80/20), y la fase estacionaria, tambin lquida al estar constituida por el agua adsorbida por el material slido de la capa fina, en este caso celulosa.

Por tanto, el fundamento de la separacin implica que los aminocidos cuya cadena lateral (R) tenga un carcter ms apolar, tendrn tendencia a desplazarse con la fase mvil, mientras que los aminocidos que sean polares, ya sean con carga o sin carga, sern retenidos por la fase estacionaria. Ello es as, porque la fase mvil est formada por solventes que son ms apolares que el agua, que es el solvente de la fase estacionaria. 2. Cmo realizar una cromatografa en capa fina? Primera etapa: Aplicacin de las muestras a analizar.



La primera precaucin que hay que tener en el manejo de la placa es la de procurar no tocar con los dedos la capa de celulosa. La placa fina se coge siempre por los bordes de la misma.

Se coloca la placa encima de la mesa, y con un lpiz se traza una lnea muy dbil a unos 1,5 cm del borde inferior de la placa, procurando daar lo mnimo posible la capa de celulosa.

En la lnea se sealan dbilmente cuatro puntos, distribuidos equitativamente a lo ancho de la placa. En cada punto de ellos se aplica cada uno de los muestras: patrn o standares y las muestras problemas con probable transaminacin. La aplicacin se realiza mediante capilares. La segunda precaucin a considerar es la de no contaminar las disoluciones de los aminocidos patrn y la muestra problema. Para ello, se utiliza un capilar para cada uno de las soluciones a aplicar. El capilar se introduce en el tubo de muestra y por capilaridad va a ascender la muestra a aplicar. Se aplica en la placa una gota de la muestra, procurando que se extienda lo menos posible y no dae la capa. Se seca a continuacin con el secador de aire. Se aplica una segunda gota y se vuelve a secar. Esta operacin se repite para cada unas de las tres muestras restantes. Segunda etapa: Elucin de las muestras. La cromatografa se realiza en la cubeta o cmara de desarrollo. La cubeta contiene un volumen de fase mvil, cuya altura de lquido debe de estar siempre por debajo de la lnea de aplicacin de las muestras.

La tcnica de elucin que se va a utilizar para la realizacin de la cromatografa es la ascendente, puesto que la fase mvil asciende por capilaridad por los poros e intersticios de la celulosa. La placa que contiene las muestras se introduce en la cubeta. Se coloca la tapa de la cubeta y se espera que la fase mvil ascienda por la capa hasta que alcance una altura de hasta unos 2-3 cm del extremo opuesto a la parte sumergida. Una vez realizada la elucin, se abre la tapa de la cubeta y se saca la placa.



Tercera etapa: Secado y visualizacin de los aminocidos.

Inmediatamente que se ha sacado la placa, con el lpiz se marca en un borde el nivel alcanzado por el solvente y que constituye el frente de solvente (FS). Se introduce en la estufa durante unos 5 min para que se seque. A continuacin, con ayuda de un pulverizador y una solucin de ninhidrina al 0.1% en butanol visualizar los aminocidos estandart y de la muestra problema.

Calculo de los valores del Rf. Rf = distancia (cm) recorridos por la sustancia distancia (cm) recorridos por el solvente (FS)



INFORME PRACTICA N 10

Nombre del Alumno:

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Grupo: -----------------------------------------------------------------------

Fecha:

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PROCESO DE TRANSAMINACIN: 1.- Indique, la reaccin de transaminacin producida en la prctica realizada

2.- Medidas de los Rf, identificacin de aminocidos en las cromatolminas obtenidas e interpretacin de los resultados

Discusin y/o comentarios

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Firma del Alumno

Firma del Profesor

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Nota

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El objeto de la presente prctica es evaluar el metabolismo proteico empleando el Balance Nitrogenado. Explicaremos los parmetros mas representativos de la excreta nitrogenada en general. Se evala los egresos de N mediante el nitrgeno ureico urinario en 24 horas y la excrecin de nitrgeno protenico urinario en 24 horas empleando la formula de nitrgeno total estimado (NTE).



FORMULA:

BN

=

N INGERIDO ( NTE + 2 )

NTE = g. N. UREICO + Urinario 24 hs. 2 = N. Ingerido = Excrecin fecal (g / 24 hrs.) g. de protenas 6.25

g. N.CREATININICO Urinario 24 hs.

Nota

:

Si el paciente presenta Albuminuria, aadir a la excreta : Protena urinaria 6.25

PROCEDIMIENTO: DETERMINACIN DE CREATININA URINARIA.FUNDAMENTO: La creatinina en presencia del cido pcrico en medio alcalino forma un complejo de color amarillo anaranjado cuya intensidad de color es proporcional a la concentracin de creatinina. (R. JAFFE). N TUBO ORINA 1/10 ml AGUA ml 0.8 1.6 0.4 0.2 0.2 0.8 0.2 1.6 0.4 1.6 0.4 St. 1.5 mg/dl ml R. Pcrico ml Buffer Alcalino ml BL ST Muestra 1 0.04 0.8 Muestra 2 0.04 0.8

Incubar a T ambiente por 20 min.y leer las Absorbancias a 505 nm.

Calculo: Cr.Orina (mg/dl)=Abs. Muestra Abs. standard x 150

Cr.Urinaria 24 hs = Cr.Orina (mg/dl) x Vol 24h(L) x 10 mg/CrU/24hs.x 0.37= mg N Creatinnico en 24 hs. VN = 0.8 a 1.5 g. en 24hsDETERMINACION DE UREA URINARIA.-



FUNDAMENTO: La urea presente en la muestra, es desdoblada a amonio por accin de la enzima ureasa, segn la proposicin de Faucett y Scott. (NH2)2CO + 2H2O UREASA 2NH3 + CO2 + H2O

El amonio producido reacciona con salicilato e hipoclorito en medio alcalino, formndose un complejo de color verde; la intensidad del color producido es directamente proporcional a la cantidad de urea presente en la muestra y su absorvancia se lee a 600nm (580 - 620). TCNICA: Preparacin Reactivo de trabajo.Mezclar 1 ml. de Reactivo Salicilato + 1 gota (50uL) de Suspensin Ureasa. Preparar el volumn de reactivo necesario manteniendo la proporcin (p.e. 30 ml. Reactivo Salicitato + 30 gotas (1.5 ml.) de Suspencin Ureasa). Mantener protegido de la luz. El Reactivo de trabajo es estable por 30 das entre 2 y 8 C y protegido de la luz. Mantener en frasco color ambar. Tcnica: Nitrgeno Ureico en orina. N TUBO Orina:1/100 St:66mg/dl Reactivo de trabajo Mezclar incubar Reactivo de Hipoclorito Mezclar incubar Leer las Absorvancia a 600 n.m. Expresin: mg urea/24 hs. (ml) 2.0 (ml) (ml) (ml) 2.0 0.02 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 3' a 37C o 5 a T ambiente 5' a 37C o 10 a T ambiente Blanco Standard Muestra 1 0.02 Muestra 2 0.02

Clculo: a) Factor = 66 D.O. St

b) Factor x D.O. Pb x 100x Vol.24 hs(ml) =mg. Urea Ur/24h. 100 c) mg. Urea Ur. /24hs x 0.455 = mg. Nitrgeno Urico, /24hs.



RANGO DE REFERENCIA UREA N. URICO : 15 a 30g /24hs. : 7 a 14g /24hs.

BN = IngestaNitrogenada - [N urico + N creatinnico + 2] BN = g N / 24hs

VARIACIONES EN ALGUNOS CONSTITUYENTES NITROGENADOS URINARIOS CON DIFERENTE INGESTA PROTICA Dieta Proteica normal (mixta) g. %N 13.2 100 82.5 11.36 86.1 0.4 3.0 0.61 4.6 0.21 1.6 0.62 4.7 Dieta rica en Protenas g 23.28 145.5 20.45 0.82 0.64 0.3 1.07 %N 100 87.9 3.5 2.7 1.3 4.6 Dieta pobre en Protenas g %N 4.2 100 26.25 2.9 69.1 0.17 4.0 0.6 14.3 0.11 2.6 0.42 10.0

N. Urinario Total N. Proteico Urea (N) Amoniaco (N) Creatininico (N) Urico (N) N indeterminado

INFORME PRACTICA N 11

Nombre del Alumno:-----------------------------------------------------------------------------------------------------------Grupo: ---------------------------------------------------------------------Fecha: ---------------

Determine el Balance Nitrogenado del sujeto Normal y del paciente empleando la siguiente frmula: BN = Ingesta Nitrogenada [gN urico + gN creatinnico + 2] -

INTERPRETACIN Y DIAGNOSTICO NUTRICIONAL:

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Firma del Alumno

Firma del Profesor

Nota

INTRODUCCION.Utilizamos el metabolismo proteico (sntesis y degradacin) para evaluar el estado nutricional de una persona. Sealamos didcticamente dos compartimientos de distribucin de las protenas en el organismo: a) Compartimiento Proteico Visceral. b) Compartimiento Proteico Somtico o esqueltico.

Las protenas del compartimiento visceral se evalan mediante los niveles de Transferrina, Pre - Albmina, Protena Total y Albmina en suero, que por su relativamente corto tiempo de vida (Albmina 20 das) rinde una estimacin razonable del compartimiento proteico visceral. En esta prctica utilizaremos la Protena total y Albmina srica. Las protenas del compartimiento somtico esqueltico la evaluaremos mediante la excrecin de la creatinina urinaria 24 hrs./Talla, relacin que es fiel ndice de masa muscular esqueltica. Asi mismo mediremos el Peso y la Talla para evaluar la masa corporal total. 1) DETERMINACION DE LA PROTEINA TOTAL.Fundamento: Las protenas en presencia del reactivo de Biuret forman un complejo Biuret cuprosdico color azul violeta, que indica la presencia de enlaces peptdicos, cuya intensidad de color es proporcional a la concentracin de protena en la muestra. BL Agua destil. Suero St. Prot. Tot 5.7 g/dl R. Color 2.0 ml 2.0 ml 2.0 ml 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 2.0 ml Muestra 1 Muestra 2 St

Mezclar. Incubar 10 min a 37 C o 20 min a T ambiente. Leer 540 n.m. Clculos : Factor de Calibracin y Concentracin del Problema.

Valores Normales :

6-8 g/dl

2) DETERMINACION DE ALBUMINA SERICA.BL Agua destil. Suero St. Albmina 3.3 g/dl R. Color 2.0 ml 2.0 ml 2.0 ml 20 ul 20 ul 20 ul 20 ul 2.0 ml Problema Problema St

Mezclar. Incubar 3 min a Temperatura ambiente. Leer 620 nm. Clculos : Factor de Calibracin y Concentracin del Problema.

Valores Normales :

3.5 a4.7 g/dl

3) DOSAJE DE CREATININA URINARIA..Empleremos el mismo mtodo usado para la creatinina urinaria de la prctica anterior. Dividir la excrecin urinaria 24 hs. entre la Talla. N TUBO ORINA 1/10 ml AGUA ml 0.8 0.2 0.2 1.6 0.4 0.8 0.2 1.6 0.4 1.6 0.4 BL ST Muestra 1 0.04 0.8 Muestra 2 0.04 0.8

St. 1.5 mg/dl ml R. Picrico ml Buffer Alcalino ml

Incubar a T ambiente por 20 min.y leer las Absorvancias a 505 nm. Calculo: Cr.Orina (mg/dl)=Abs. Muestra Abs. standard x 150

Cr.Urinaria 24 hs = Cr.Orina (mg/dl) x Vol 24h(L) x 10

Muestra 1: Peso : Peso

Muestra 2: :

Talla

:

Talla

:

Relacin

:

Relacin

:

Vol. Orina/24 h =

Vol. Orina/24 h =

Nomograma de Valoracin del Estado NutricionalImprimir archivo adjunto

INFORME PRACTICA N 12 Nombre del Alumno:-----------------------------------------------------------------------------------------------------------Grupo: ---------------------------------------------------------------------Fecha: --------------En el nomograma de valoracin del estado nutricional, marque : El Indice Cr. Ur. / 24hs / Talla encontrado o interprete el diagnstico del paciente. El Indice Peso / Talla encontrado e interprete el resultado. El Indice Prot. Tot. Srica y albmina Srica encontrado e interprete. DIAGNOSTICO FINAL.

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Firma del Alumno

Firma del Profesor

Nota

Debido a que el estado nutricional del paciente juega un papel importante para determinar su capacidad de tolerancia a la ciruga y a otros procedimientos teraputicos, la adecuada evaluacin del estado nutricional es de gran importancia. Las siguientes mediciones son valiosas en la determinacin del estado del paciente: A. DIAGNOSTICO CLINICO. Los mejores elementos para un correcto diagnostico nutricional son una buena historia clnica nutricional y un buen examen fsico. Ayuda de manera especial, el consignar en la anamnesis el estado socio-econmico del enfermo y de los antecedentes patolgicos, especialmente la presencia de enfermedades debilitantes crnicas como la tuberculosis pulmonar, diabetes mellitus, infecciones o parsitos intestinales. Es importante consignar la historia diettica con una apreciacin semicuantitativa de la ingesta calrico y proteica; el peso habitual en el estado de salud y el peso actual en estado de enfermedad, la fecha de inicio de la enfermedad, as como la fecha de inicio de sntomas que se asocian a la desnutricin, a saber; anorexia, nauseas, vmitos o diarreas. Se debe anotar tambin la presencia de depresin como factor anorexigeno y la actitud familiar frente a la enfermedad, desde que la rehabilitacin debe ser psicolgica y orgnica. Completa el diagnostico de desnutricin el examen fsico. La flacidez es caractersticas, con perdida de grasa y de la masa muscular de la cara, ojos hundidos que aparecen de mayor tamao El trax adelgazado, con atrofia mamaria y desaparicin del tejido graso y muscular, se observan las costillas y dificultad en los movimientos respiratorios. El abdomen mostrara hepatomegalia, edema, ascitis. B. DIAGNOSTICO DE LABORATORIO.

B.1 Mtodos Antropomtricos. B.1.1 Peso Corporal.- Los individuos cuyos estados nutricionales sean cuestionables deben ser pesados (peso actual), debiendo adems buscarse en las tablas pertinentes el peso ideal que corresponde a su talla. El peso ideal varia para una misma tala de acuerdo al sexo. Mediante la confrontacin del peso actual del paciente con su peso ideal se puede obtener el porcentaje del peso corporal ideal, utilizando la siguiente frmula: Peso actual % Peso Ideal = Peso ideal Se comparara este valor con la tabla 1. Esto nos dar el estado nutricional del paciente. Debe recordarse, sin embargo, que el edema es uno de los efectos de la malnutricin proteica y puede falsear una apreciacin cuantitativa. X 100

La integridad orgnica y funcional del organismo no se compromete durante perdidas medianas de peso y el equilibrio del organismo se restituye espontneamente. Las perdidas extremas de peso, que suceden en enfermedades graves medicas o quirrgicas se acompaan de una mortalidad elevada, as por ejemplo: la mortalidad de un paciente que sufre una perdida de peso de 20% o mas es el 37%, es contraste con el 3.5% en pacientes con perdidas de peso al 20%. Evaluacin de Peso Corporal Valor Standard > 120 % 110-120 % 90-110 % 80-90 % 70-80 % < 69 % Estado Nutricional Obesidad Sobrepeso Normal Desnutricin leve Desnutricin moderada Desnutricin grave

PESO IDEAL SEGN TALLA HOMBRES Talla (cm) 1.45 1.46 1.47 1.48 1.49 1.50 1.51 1.52 1.53 1.54 1.55 1.56 1.57 1.58 Peso (Kg) 51.9 52.4 52.9 53.5 54.0 54.5 55.0 56.6 56.7 56.8 57.2 57.9 58.6 59.3 Talla (cm) 1.59 1.60 1.61 1.62 1.63 1.64 1.65 1.66 1.67 1.68 1.69 1.70 1.71 1.72 Peso (Kg) 59.9 60.5 61.1 61.7 62.3 62.5 62.9 64.0 64.6 65.2 65.9 66.5 67.3 68.0 Talla (cm) 1.73 1.74 1.75 1.76 1.77 1.78 1.79 1.80 1.81 1.82 1.83 1.84 1.85 1.86 Peso (Kg) 68.7 69.4 70.1 70.8 71.6 72.4 73.3 74.2 75.0 75.8 76.5 77.3 78.1 78.5

PESO IDEAL SEGN TALLA MUJERES Talla (cm) 1.40 1.41 1.42 1.43 1.44 1.45 1.46 1.47 1.48 1.49 Peso (Kg) 44.9 45.4 45.9 46.4 47.0 47.5 48.0 48.6 49.2 49.8 Talla (cm) 1.50 1.51 1.52 1.53 1.54 1.55 1.56 1.57 1.58 1.59 Peso (Kg) 50.4 51.0 51.5 52.0 52.5 53.1 53.7 54.3 54.9 55.5 Talla (cm) 1.60 1.61 1.62 1.63 1.64 1.65 1.66 1.67 1.68 1.69 Peso (Kg) 56.2 56.9 57.6 58.3 58.9 59.5 60.1 60.7 61.4 62.1

B.1.2.Indice de Masa Corporal (IMC).- Esta medida es la que predice mejor el porcentaje de grasa corporal. Anteriormente para el diagnstico de obesidad se consideraban la edad, estatura, sexo y peso corporal; ahora se acepta el IMC que se obtiene dividiendo el peso (Kg) entre la altura al cuadrado (m2): IMC= P/A2 Un IMC entre 25 y 30 se considera como sobrepeso, y por arriba de 30 como obesidad. El sobrepeso indica simple aumento de la masa corporal; en cambio de la obesidad representa un exceso de grasa corporal por depsito de triglicridos en los adipocitos. IMC Kg/m2 > 40 35 39.9 30 34.9 >25 30 > 19 25 17 19 16 _ 16,9 < 16 Estado Nutricional Obesidad mrbida Obesidad severa Obesidad moderada Sobrepeso Normal Desnutricin leve Desnutricin moderada Desnutricin grave

B.1.3. Almacenamiento de Lpidos.- La medicin del pliegue cutneo del trceps arroja un estimado del almacenamiento corporal de lpidos. La medicin se realiza con calibraciones. Deben tomarse tres medidas y promediarse los resultados.

acromion

olecranon

PLIEGUE SUBCUTANEO DEL TRICEPS Adulto (mm) Espesor del pliegue del Triceps (EPT)

Hombre Mujer

Standard 12.5 16.5

90% Standard 11.3 14.9

80% Standard 10.0 13.2

70% Standard 8.8 11.6

60% Standard 7.5 9.9

B.1.4. Masa Magra Corporal.- Representa a la masa corporal total exenta de grasa. En otras palabras la masa msculo-esqueltica, la que puede ser determinada mediante dos mtodos: - circunferencia muscular del brazo (CMB) - ndice de creatinina urinaria (mtodo bioqumico). Circunferencia Muscular del Brazo.- Se mide toda la circunferencia de la parte superior del brazo no dominante, tomando el punto medio del mismo. Por la presencia de la capa de tejido adiposo subyacente se modifica esta medida de acuerdo a la siguiente formula:

CMB = CB (3.14 x PCT) CMB: circunferencia muscular del brazo, en cm. CB: circunferencia del brazo, en cm. PCT: pliegue cutneo del trceps, en cm. Luego se usa la tabla para calcular el grado de deplecin. CIRCUNFERENCIA DEL BRAZO (cm)

Hombre Mujer

Standard 29.3 28.5

90% Standard 26.3 25.7

80% Standard 23.4 22.8

70% Standard 20.5 20.0

60% Standard 17.6 17.0

Hombre Mujer

CIRCUNFERENCIA MUSCULAR DEL BRAZO (cm) Adulto (cm) 90% 80% 70% Standard Standard Standard Standard 25.3 22.3 20.2 17.7 23.2 20.9 19.0 16.2

60% Standard 15.2 13.9

MANEJO DE TABLA DE COMPOSICION DE ALIMENTOS 1) Sujeto de anlisis Edad: 2) Gasto calrico diaria: Actividad Durmiendo Muy Ligera Ligera Moderada Pesada 3) Ingesta Calrica y Proteica: Encuesta Diettica de 24 Hrs: Desayuno Alimento Porcin(g) Protena Lpido Carbohidrato Peso: Horas Talla: Kcaloras

Total:

Almuerzo Alimento

Porcin(g) Protena

Lpido

Carbohidrato

Cena Alimento

Porcin(g) Protena

Lpido

Carbohidrato

Otros Alimento

Porcin(g) Protena

Lpido

Carbohidrato

Total Protenas X 4 Kcal/g = Kcal obtenidas de protenas Total Carbohidratos X 4 Kcal/g = Kcal obtenidas de carbohidratos Total Lpidos X 9 Kcal/g = Kcal obtenidas de lpidos Kcal obtenidas de protenas + Kcal obtenidas de carbohidratos + Kcal obtenidas de lpidos

Descripcin de algunas preparaciones culinarias autctonas

Aceitunas preparadas: Las aceitunas se lavan y se cuecen en poco agua con sal, se aderezancon cebolla, aj, vinagre y aceite. Aj panca: El aj fresco se pone a secar al sol varios das. Cancha: Es el maz uniformemente tostado en una olla de barro con la abertura al costado. Ccaya (oca helada): La oca fresca es expuesta a la intemperie, a bajas temperaturas, (heladas) por espacio de varios das. Carne seca de venado: La carne de venado se corta en porciones pequeas y delgadas agregndole sal, y luego se pone a secar colgndola de cordeles. Chancaca: Es el jugo de caa de azcar, hervido, y concentrado hasta que tome la consistencia requerida y luego vaciado en moldes Chaquepa: Es la cebada tostada y molida, pero no siempre cernida. Chicharrn: Carne de chancho cortada en trozos, con sal y sancochada hasta que se consume el agua, luego empiezan a freirse los trozos en su propia grasa hasta que se doren por todos lados. Chochoca: Es el maz en grano, semi-cocido en pequea cantidad de agua y por poco tiempo, y luego secado al aire. Chuo: Es una forma indgena de preparacin y preservacin de la papa, para lo cual se la coloca en depresiones del terreno por las que corre agua lentamente, all permanece dos o tres semanas y luego es secada al aire. Esta operacin se efecta en la poca de fro, con lo cual se consigue una deshidratacin por congelamiento. Chuo negro: Humedecidas las papas, se extiende en campo abierto uno o dos das. Una vez que se han congelado, se pisan para extraerle toda el agua y parte de la cscara. Luego se secan al sol. Jamn del pas: La carne de cerdo se enrolla, se le agrega condimentos y sal, y se amarra; luego es hervida por espacio de dos horas. Jora: El maz colorado se hace germinar hasta conseguir el rote de los granos; a los diez das hasta quemar los brotes debido al calor intenso que se desarrolla. Luego es enfriado, al aire primero, y secado al sol despus. Es la materia prima para elaborar la Chicha de Jora. Llunka: Con este nombre se conoce el producto lavado, remojado durante dos horas y luego sobado suavemente en el batn hasta eliminar la cscara; enseguida se deja secar al aire. Se prepara de cebada o trigo. Machka: Es el producto tostado, slido y cernido, que se prepara de cebada o trigo. Man sancochado: Es el man en su vaina cocido en agua con sal.

Mote: Es el producto al que se le ha eliminado la cscara de un modo ms completo que en el caso de la Llunka; para esto se le cuece en una solucin de cenizas (generalmente usan madera de Molle, Schinus molle), y luego es sobado fuertemente con la palma de las manos, enjuagado y secado al aire. El mote de maz es preparado con una solucin de cenizas ms dbil y con menor tiempo de coccin que el trigo. Para el mote de cebada la solucin de cenizas es ms fuerte y el tiempo de coccin ms largo. Con frecuencia se adiciona cal. Pltano seco (orejn): Es el pltano maduro, pelado, y cortado en rebanadas, deshidratado parcialmente. Papa helada: La papa fresca es expuesta a la intemperie a bajas temperaturas (heladas) por espacio de varios das. Papa seca: Es la papa sancochada, pelada y secada al aire. Posteriormente puede ser molida o partida en trozos pequeos. Tocash: Es una forma de preservar el maz fresco, usada por los indgenas. Consiste en enterrrar el maz fresco en el lecho de un arroyuelo a unos 30 o 40 cm. De profundidad, durante varias semanas. La muestra analizada se extrajo de uno de estos sitios. Yuca fermentada (masato): Las yucas se pelan y se ponen a cocer, luego se muelen, o se mastican hasta formar una pasta, diluyndola en el agua de coccin; si no es masticada se le agrega azcar. Esta preparacin se deposita en tinajas, varios das, para que fermente.

TABLA DE COMPOSICIN DE LOS ALIMENTOS PERUANOS INSTITUTO NACIONAL DE SALUD 2009

Hacer click en el siguiente link: http://www.ins.gob.pe/insvirtual/images/otrpubs/pdf/Tabla%20de %20Alimentos.pdf

Guia_de_Bioquimica_y_Nutricion_2011-II

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