hematologia 4

5/11/2018 hematologia 4 - slidepdf.com

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PRACTICA Nº 4

DIAGNÓSTICO DE ANEMIA HEMOLÍTICA POR ANTICUERPOSIRREGULARES

MARCO TEÓRICO

Los eritrocitos son células encargadas del transporte y oxigenación de lascélulas, poseen un tiempo de vida entre 100 a 120 días, luego de cumplireste ciclo se dirigen al bazo donde se realiza la hemocatéresis, la cual estamediada por el sistema reticuloendotelial.

Debido a la destrucción de los hematíes se produce bilirrubina indirecta ono conjugada, la cual es transportada por la albumina al hígado paraconjugarse o convertirse en bilirrubina directa, parte de esta bilirrubina

directa es excretada por el riñón y en forma de urobilinogeno, también esexcretada por el hígado a los conductos biliares y de ahí pasa al intestinodelgado. En forma de estercobilina.

Gracias a la eficiente excreción de la bilirrubina por parte del hígado, losniveles de este compuesto en sangre son bastante bajos. No obstante,cuando por algún motivo los niveles de esta sustancia aumentan en lasangre se puede producir una acumulación de bilirrubina en el cuerpo quese manifiesta como ictericia.

Cabe mencionar que los recién nacido poseen una ictericia. Hasta ciertopunto es normal que los bebés recién nacidos luzcan "amarillos" pues sushígados no están lo suficientemente maduros para procesar y excretar labilirrubina del modo más eficiente. Por ello, los valores normales debilirrubina en un recién nacido son mucho mayores a los de un adulto. Sinembargo, si la ictericia es excesiva y/o prolongada debe ser valorada por unmédico.

La anemia hemolítica es una afección en la cual hay un número insuficientede glóbulos rojos en la sangre, debido a su destrucción prematura. Existenmuchos tipos específicos de este tipo de anemia hemolítica.

Según su herencia:CongénitasAquiridas

Según su mecanismos de acción

CorpuscularesExtracorpusculares

Según el lugar donde se produce la hemolisis

IntravascularExtravascular



COMPETENCIAS Explica el fundamento, desarrolla la Prueba de Antiglobulina Indirecta o

test de Coombs indirecta para la detección de Anticuerpos Irregularesmétodos y procedimientos de laboratorio para

Interpreta los resultados obtenidos del test de Coombs Indirecto para ladeterminación de anticuerpos irregulares relacionados a AnemiaHemolítica Inmune.



MATERIALES Y EQUIPOS REQUERIDOS1. Sistema al vacío: Aguja (21x1), Holder,2. Tubos al vacío con EDTA3. Tubos al vacío sin anticoagulante

4. Papel filtro5. Micropipetas de 10 – 100 µl

6. Micropipetas de 100 – 1000 µl7. Tubos de 10 x 75 + gradillas

8. Parafilm9. Centrífuga10. Baño María11. Suero Fisiológico12. Goteros

13. REACTIVO ANTIGLOBULINA HUMANA14. ALBUMINA BOVINA15. ANTI -D16.



Procedimiento

Para el caso de transfusión sanguínea

1. Extraer hematíes del paquete globular.

2. Lavar los hematíes 3 veces con solución salina 0.9% obtenidos de paquetedel donante.

3. Prepare una suspensión al 5% en solución salina normal de los hematíesdel donante.

4. En un tubo agregar dos gotas de sangre suspendia y dos gotas de suerodel receptor

5. Centrifugar los por un lapso de 15 segundos.

6. Agregue dos gotas de albúmina bovina solución al 22% al tubo

7. Incube en un baño maría a 37°C por 15 minutos. (la incubación puedeProlongarse hasta 60 minutos si se desea).

8. Centrifugar por un lapso de 15 segundos.

9. Observar si hay presencia de aglutinación10. Lávese tres veces. Centrifugando por 15 segundo entre cada lavado.

11. Después del último lavado, decante lo más posible.

12. Agregue dos gotas de suero Anti-humano y mezcle bien.

13. Centrifugue por 1 minuto a 1500 r.p.m. durante 15 segundos.

14.Agite el botón hematico del tubo observando si hay presencia deaglutinación.



Las fases del test de coombs indirecto

Frio: formación del complejo antígeno - anticuerpo pero en inmunoglobulinas detipo M.

Proteica: disminución del potencial Z con el fin de que exista una mayorsensibilidad de los hematíes formando el complejo antígeno – anticuerpo.

Térmica: formación del complejo antígeno - anticuerpo pero en presencia deinmunoglobulinas de tipo G.

Coombs: formación del complejo antígeno – anticuerpo - antianticuerpo

Es importante el uso de la prueba de la inmunoglobulina humana, debido quepuede prevenir si el receptor pueda tener anticuerpo irregulares los cualespuedan ocasionar una reacción con los hematíes del plaquete globular de unreceptor. Y asi poder eviar una anemia hemolítica adquirida.

La distancia que han de salvar los anticuerpos para producir aglutinación es laque guardan entre sí los hematíes en suspensión en su propio suero o plasmao en un medio salino isotónico, distancia que viene impuesta por las fuerzas derepulsión existentes entre los hematíes. La teoría más ampliamente aceptadapara explicar este hecho es la del potencial Zeta.

La superficie de los hematíes tiene cargas eléctricas negativas debidas a loscarboxilos del ácido siálico (NANA) de la membrana. Si los hematíes están ensuspensión en un medio que contiene iones libres, los cationes forman unaenvoltura de cargas positivas alrededor de aquellos convirtiéndolos enpartículas cargadas de electricidad del mismo signo que experimentan unafuerza de repulsión entre ellas. Esta fuerza de repulsión se denomina potencialZeta.



La albúmina actúa disminuyendo el potencial zeta y aumentando la constantedieléctrica del medio, con lo cual la fuerza de repulsión entre hematíes sereduce facilitando su aglutinación.

Los anticuerpos del sistema Rh reaccionan muy bien en todos aquellos medios

que contienen Seroalbúmina bovina (SAB).



Sistema de complemento

El complemento es un conjunto de más de 20 proteínas plasmáticas solubles(β-globulinas) que forman un sistema enzimático en cascada. Está siemprepresentes de forma inactiva. Se activan secuencialmente ante la presencia de

complejos Ag-Ac o directamente por Ag.

Al activarse un componente se escinde en dos fragmentos: Uno grande (b) yotro pequeño (a). Estas proteínas reciben el nombre de complemento porqueayudan y complementan los mecanismos de respuesta inmune.

Las principales son los componentes C1 a C9, el factor B y el factor D.

Los componentes del complemento con acción enzimática se representancon una línea sobre los números y letras que los designan.

VÍA CLÁSICA: Se inicia:

– Por el complejo Ac-Ag, pues al formarse se

descubre un lugar reactivo en el fragmento Fc

del Ac que activa al componente C1qrs del

complemento

– Por la proteína C Reactiva (PCr) (formada enel hígado como respuesta a una infección o lesión

de los tejidos) que se une en presencia de Ca++

la membrana de microorganismos, formando un

complejo que activa el sistema del complemento.

VÍA ALTERNATIVA:

– Activada por polisacáridos de la membrana celular de microorganismos.

– Es un circuito cíclico de amplificación de la señal.

SECUENCIA FINAL: Es una vía común a partir de la activación del C3 a C3bpor las C3-convertasas obtenidas en las dos vías anteriores.

Se forma C5b a partir del C5. Al C5b se le unen los componentes C6 a C9,formando el complejo C5b-9 o Complejo de Ataque a la Membrana (MAC o

CAM).



El CAM es una estructura tubular que se une a la membrana de losmicroorganismos, atravesándola y permitiendo el paso de Na+ y agua queimplica la lisis del microorganismo.

PROTEINAS PLASMÁTICAS.

Albúmina (60%) Contribuyente mayoritario a la presión coloidal. Transporte delípidos y hormonas esteroideas.

Globulinas (35%) Transporte iones, hormonas, lípidos; función inmune

Fibrinógeno (4%) Componente esencial del mecanismo de coagulación(conversión a fibrina insoluble)

Proteínas reguladoras (< 1%)

Características de las proteínas plasmáticas.

La mayoría son sintetizadas en el hígado Casi todas son glicoproteína Muchas muestran polimorfismo Cada proteína posees una vida media Algunas se incrementan en estados inflamatorios



Región alfa-1

Alfa-1- Antitripsina

Alfa-1- Antitripsina (45 kDa)

Función: neutralización de proteasas de la familia de la tripsina y plasmina.

Producida por leucocitos de pulmón, páncreas y otros órganos

Aumentada: en reacciones inflamatorias.

Proteína de fase aguda

Disminuida: enfermedad pulmonar, enfisema.

Pacientes con deficiencia en alfa-1-antitripsina desarrollan enfisema

Alfa-1-Lipoproteína

Alfa-1-Lipoproteína (HDL, 200 kDa)

Función: Transporte de colesterol y de vitaminas liposolubles.

Producida por hígado e intestino

Aumentada: Hiperlipidemia

Disminuida: Enfermedad hepática, particularmente en la Enfermedad deTangier

Alfa-1-Glicoproteína

Alfa-1-Glicoproteína ( 44 kDa)

Función: Esta presente en secreciones mucosas y en diferentes tejidos.

Producida por muchos tejidos

Aumentada: Inflamación. Proteína de Fase aguda y algunos errores delmetabolismo



Protrombina

Protrombina ( 72 kDa)

Función: Factor II de la coagulación. Se transforma en trombina por acción del

factor V

Producida por hígado

Disminuida: Enfermedad hepática

TBG

TBG (Thyroid-binding globulin) Proteína de unión a hormonas tiroideas ( 36,5kDa)

Función: Unión y transporte de hormonas tiroideas en sangre


Aumentada: embarazo

Disminuida: Síndrome nefrótico.

Región alfa-1

Alfa-2 macroglobulina

Alfa-2 macroglobulina ( 820 kDa)

Función: inhibición de proteasas: tripsina, plasmina, kalikreina


Aumentada: Sindrome nefrótico, enfisema, diabetes mellitus, embarazo,síndrome de Down

Disminuida: Artritis y mieloma

Haptoglobina

Haptoglobina ( 85-1000 kDa)

Función: unión a hemoglobina. Los complejos Hb-haptoglobina preservan las

reservas de hierro




Aumentada: Inflamación aguda y crónica, neoplasias, infarto de miocardio, Enf.Hodgkin

Disminuida: Enfermedad hepática, anemia hemolitica y megalobástica.

Ceruloplasmina

Ceruloplasmina ( 132 kDa)

Proteína mayoritaria para el transporte de cobre, exportada desde el hígado alresto de tejidos Regula los procesos de oxidoreducción, transporte yutilizacióndel hierro

Aumentada en enfermedad hepática activa o en daños tisulares, embarazo

Disminuida en enfermedad de Wilson

Alfa-2-Lipoproteína

Función: Transporte de lípidos


Aumentada: Hiperlipidemias

Disminuida: Enfermedad hepática grave 44

Eritropoyetina

Eritropoyetina EPO (30 kDa)

Función: Hormona de la eritropoyesis

Producida por riñón

Aumentada: Anemia, (deportistas)

Disminuida: Enfermedades renales, Enfermedades autoinmunes



Región Beta

Transferrina

Transferrina (80-90 kDa)

Transporta hierro en plasma como férrico (Fe3+) – cada molecula de tranferrinaune dos Fe3+. Normalmente, transferrina está un 30% saturada con Fe3+.

Aumento de % de saturación sobrecarga de hierro

Diminiución de % de saturación deficiencia de hierro

Transferrina- Fe3+ se une a receptores de transferrina en las células y seinternaliza. En las células, Fe3+ se convierte en Fe2+ (ferroso) y se usa para la

síntesis de citocromos, etc.

La unión de Fe3+ a transferrina protege de los efectos tóxicos del hierro a lascélulas (stress oxidativo)

En estados inflamatorios la transferrina- Fe3+ se degrada por el sistemaretículoendotelial, al no aumentar la síntesis se produce una disminución de suconcentración en plasma

Beta-lipoproteína (LDL)

Beta-lipoproteínas (1000 kDa)

Función: Transporte de colesterol y fosfolípidos


Aumentada: Hiperlipidemias, Nefrosis

Disminuida: Ayuno

C3 y C4

C3 y C4 (185 a 417 kDa)

Función: Proteínas del complemento


Disminuida: enfermedades autoinmunes: lupus, anemia hemolítica



C1 inactivador de esterasas

C1 (104 kDa)

Función: Inhibe la acción del factor de complemento C1


Disminuida: Muy disminuida o ausente en el edema angioneurótico hereditario

Hemopexina

Hemopexina (80 kDa)

Función: transporte de grupo hemo


Aumentada: en las misma situaciones que haptoglobina

Disminuida: en las misma situaciones que haptoglobina

Región Gamma: IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE

Esta región contiene la mayor parte de las Inmunoglobulinas: IgG, IgM, IgA,IgD, e IgEProducidas: por linfocitos B-- plasmáticas.

Aumentada: Hipergammaglobulinemia, enfermedad hepática, infección crónica,lupus, mieloma, linfomas

Disminuida: Envejecimiento, drogas, leucemia linfocitica crónica,agammaglobulinemias, etc



INMUNOGLOBULINAS

Proteínas con función inmunológica y la mayoría son γ-globulinas, pero otraspertenecen a la fracción α o a la β

Se obtienen tres fragmentos:

uno denominado Fc, que determina la actividad biológica, contiene el alotipo ydetermina la clase y subclase de cadena pesada y dos denominados cada unode ellos Fab, que contienen el idiotipo y es por donde la molécula se une alantígeno.

4 cadenas polipeptídicas unidas entre sí por enlaces covalentes y puentesdisulfuro en forma de “Y”

Región bisagra : zona de unión de los tres brazos de la “Y”

Cadena ligera:

Tipo kappa (k) Cromosoma 2

Tipo lambda (λ) Cromosoma 22

En cada molécula de inmunoglobulina las dos cadenas ligeras sondel mismo tipo, k o bien λ, pero nunca existe una de cada tipo en la

misma inmunoglobulina.

Cadena pesada:



Estas dos cadenas están unidas entre si por puentes disulfurointercatenarios.

Hay una zona de unos 15 aminoácidos, de gran flexibilidad yconstituye lo que se denomina zona bisagra

Es por donde se deforma la molécula de inmunoglobulina cuando seproduce la unión con el antígeno, facilitándose así su acoplamiento conéste CLASES:

INMUNOGLOBULINA G

MonómeroDos zonas de unión al antígeno (dos fragmentosFab)Cuatro subclases (Ig1, Ig2, Ig3, Ig4)La Ig más abundante en el plasma (80%)Bajo PMDifunde bien a otros líquidos corporales yatraviesa la barrera placentariaNeutraliza toxinas bacterianas Activa elcomplementoSensibiliza y agrega microorganismos paraestimular su fagocitosis (opsonización)

Es la Ig más importante en la respuestainmunitaria secundaria

INMUNOGLOBULINA M

Elevado PMRepresenta del 5 al 10 % de las Igs séricas

totales y junto a la IgD es la más frecuentementeencontrada en la superficie de los linfocitos Bcomo inmunoglobulina de membrana ( BCR )

Pentámero de Ig. Los 5 monómeros están unidospor puentes disulfuro y la “proteína J” 10fragmentos Fab para unión al Ag No atraviesaactivamente lasmembranas biológicas

Eficaz en la aglutinación y citolisis demicroorganismosRespuesta inmunitaria primaria: Papel

predominante (aparición temprana) poseecapacidad neutralizante,precipitante, aglutinante y activa complemento



INMUNOGLOBULINA A

Dos subclases:

IgA1: Monomérica. En plasma (poco abundante)

IgA2: Dimérica. Predominante en secreciones(saliva, lagrimas, nasal, leche materna, etc.)

Los monómeros están unidos por puentesdisulfuro y proteína JTiene otra cadena polipeptídica denominada

COMPONENTE SECRETOR (sIgA), producida porlas células de las mucosas que la protege de laproteolisis enzimática y facilita su transporte

Inhibe la adherencia de los microorganismos a lasuperficie de las células de las mucosas, por loque es una primera línea de defensa frente alas infecciones

También es importante en el procesamiento delos antígenos alimentarios en el intestino

INMUNOGLOBULINA D

Monómero

Poco abundante en plasma Hasta fechas muyrecientes no se había demostrado que estainmunoglobulina poseía capacidad de unirse aantígenos, por lo que se dudaba de que actuasecon función de anticuerpo Se encuentra en lasuperficie de algunos linfocitos B ( BCR )

Se piensa que colabora de forma importante en laactivación de linfocitos B al actuar como receptoren la superficie de los mismos



INMUNOGLOBULINA E

Monómero

Baja concentración en plasma.

Se encuentra en la superficie de los mastocitos ylos basófilos

Es la mediadora de las reacciones dehipersensibilidad inmediata (alergias).

Confiere protección local frente a ciertospatógenos grandes, como helmintos:

sirve para reclutar células plasmáticas a travésde una reacción de inflamación aguda

Está aumentada en infecciones parasitarias



Reactivo de coombs

Los eritrocitos humanos en presencia de un anticuerpos dirigido contra un

antígeno que posean, pueden ser sensibilizadas para no lograr la aglutinación

por la naturaleza misma del anticuerpo o el antígeno en cuestión. El suero

antihumano, reaccionará contra la gamma globulina que han sensibilizado a

componentes del complemente humano y propiciará la aglutinación de los

eritrocitos.

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