Hematología automatizada 2013
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HEMOGRAMA AUTOMATIZADO
Lic. TM Boris Valdivia Vizarraga
UNMSM
Hospital Nacional “ Guillermo Almenara Irigoyen “
ESSALUD
Introducción • El desarrollo de los Autoanalizadores hematológicos
comenzó en la década de los 50 con los hermanos Wallace y Joseph Coulter, quienes inventaron en 1956 el primer contador automático de células sanguíneas
• Hasta 1973 los hermanos coulter mantuvieron sus diseños en forma exclusiva, desarrollándolos y mejorándolos
• Posteriormente otros fabricantes introducen nuevos modelos basados en el mismo principio
• En 1980 se introduce el diferencial 3 Diff además del estudio de la serie roja con los cómputos de eritocitos, la determinación de la hemoglobina y el cálculo de los índices eritrocitarios
Hermanos Wallace y Joseph
Coulter
Parámetros del Hemograma Automatizado 5 Diff
Parametro Abreviarura Unidades
Recuento total de glóbulos blancos WBC x 103 / ul
Porcentaje de neutrófilos NEUT % %
Porcentaje de linfocitos LYNPH % %
Porcentaje de monocitos MONO % %
Porcentaje de eosinófilos EO % %
Porcentaje de basofilos BASO % %
Valor absoluto de neutrófilos NEUT # x 103 / ul
Valor absoluto de linfocitos LYNPH # x 103 / ul
Valor absoluto de monocitos MONO # x 103 / ul
Valor absoluto de eosinófilos EO # x 103 / ul
Parámetros del Hemograma Automatizado 5 Diff
Parametro Abreviarura Unidades
Valor absoluto de basófilos BASO # x 103 / ul
Recuento total de glóbulos rojos RBC x 106 / ul
Hemoglobina HGB G / dl
Hematocrito HCT %
Volumen Corpuscular Medio MCV fL
Hemoglobina Corpuscular Media HCM pg
Concentración de HGB Corpuscular Media MCHM g / dl
Ancho de Distribución Eritrocitaria RDW - SD fL
Ancho de Distribución Eritrocitaria – CV RDW – CV %
Parámetros del Hemograma Automatizado 5 Diff
Parametro Abreviarura Unidades
Recuento total de Plaquetas PLT x 106 / ul
Volumen Plaquetario Medio MPV fL
Ancho de Distribución Plaquetario PDW %
Principio de Medición
por el Método
de la
Impedancia Eléctrica
El número de pulsos
eléctricos indica la
cantidad de partículas
que pasan a través de la
apertura y el tamaño de
los pulsos es
proporcional al volumen
de las partículas
Un pequeño voltaje aparece
A travez de los electródos
Señal celular
Apertura
Cuando una célula suspendida en una solución electrolítica pasa a través
De la apertura, el cambio de la impedancia eléctrica es detectado como un
Pulso. El número total de pulsos corresponde al conteo total de células y
La altura de cada pulso es proporcional al correspondiente volumen celular
Apertura
Apertura
Célula 1
Célula 2
Cuando 2 o mas células son detectadas en
La apertura, la célula 1 y célula 2 son
Detectadas como un gran pulso, por lo tanto
Una de las células no es contada ( perdida
De coincidencia ). El grado de perdida de
Coincidencia depende de la concentración
Celular .
• Los sistemas
COULTER poseen 2
baños, uno de
eritrocitos y otro de
leucocitos, en el baño
de eritrocitos se
encuentra una
apertura de 50 µm y
en el de los leucocitos
otra de 100 µm.
Ley de Ohm : V=IR
El voltaje generado es directamente proporcional
al tamano de la particula. Por lo tanto para cada
celula se le puede determinar su recuento y
tamaño
Permite la medicion de
parametros objetivos en
estas dos poblaciones
MCV: Tamano eritrocitos
MCH y MCHC: Hb en GR
RDW: Anisocitosis
MPV: Volumen plaquetario
IMPEDANCIA
BUENO PARA PLAQUETAS Y ERITROCITOS
Eritrocitos Dimórficos
Falla renal crónica con
transfusión reciente
Microcitosis
Betatalasemia
VOLUMETRIA
No se puede obtener el recuento celular absoluto a
menos que se conozca el volumen preciso de sangre
total diluida que atraviesa la abertura durante el ciclo
de recuento
Método de Conteo Celular por
Dispersión de la Luz
• Medida a 0º
sirve para medir el tamaño
celular
• Medida a 10º
mide la complejidad celular
• Medida a 90º
mide la superficie celular y la
estructura interna
( granularidad )
• Medida a 90ºD
mide determinados tipos de
granularidad celular
FOCALIZACIÓN HIDRODINÁMICA
• A medida que las células
penetran en el área de
visualización específica,
se produce la interacción
con el rayo láser con
ángulos diferentes, que
suministran información
sobre el tamaño de la
célula, la estructura
interna, la granularidad y
la morfología de la
superficie.
• CITOMETRIA DE FLUJO
“ Una subdisciplina de
la citología analítica,
con orientación
metodológica, que mide
las células en
suspensión, dentro de
un vehículo líquido, a
su paso por una
estación de medida ”
NCCLS
RADIOFRECUENCIA ( Conductividad )
La conductividad de las
ondas de radio
A través de las células, nos
revelan su composición
interna
Una frecuencia alta, generada por
un oscilador de cristal,
sobreimpuesta a la corriente
directa, que incide sobre
las células para medir su
densidad.
TECNOLOGÍA
VCS
• IMPEDANCIA
• SCATTER LIGHT
• RADIOFRECUENCIA
Estudio de la Serie Roja
• Los años y evaluaciones han dado total aprobación a la impedancia eléctrica para el estudio de las serie roja, en la obtención del computo de eritrocitos
• Hematocrito electrónico
• Hemoglobina
• VCM, HCM, CHCM
• Nuevos índices como RDW
• Gráficos de distribución de la población eritroide, histogramas que se obtienen de los parámetros de volumen celular Vs distribución de frecuencia
Recuento de Glóbulos Rojos
Cuando una célula
pasa a través de una
apertura por la cual
fluye una corriente
eléctrica continua y
constante, en un
medio electrolítico que
puede ser isotónico o
no isotónico, generara
una variación en la
velocidad de flujo de
esta corriente eléctrica
( impedancia ) que será
directamente
proporcional al
volumen de la célula e
inversamente
proporcional al
diámetro de la
apertura.
• En el hemograma automatizado por la metodología usada el valor de Hto es menor al método del capilar. Disminuye 5% ( 1 – 2 unidades del Hto )
• La CHCM deja el significado del método manual debido a la menor variabilidad debido a que el Hto se obtiene electrónicamente
• Solo es significativa si presenta variaciones muy importantes ( < 29% ) o elevaciones extremas ( > de 37% ) como se observa en la esferocitosis
• Entonces en un caso de anemia la clasificación inicial se realiza con las cifras de HB, Hto, constantes corpusculares , RDW y el histograma
• Toda esta información muy valiosa para el clínico debe ser corroborada por el examen microscópico de la serie roja, atendiendo a las alarmas que estos equipos mostrarán en sus pantallas .
Para tener en cuenta :
• A pesar del avance tecnológico alcanzado, los autoanalizadores hematológicos presentan limitaciones :
1. No detectan poiquilocitosis
2. No detectan inclusiones eritrocitarias
3. Lo que nos presentan los fabricantes son distintos tipos de alarmas con diversa sensibilidad, que tienen que ver con el tamaño celular, línea celular, error intra-método y/o de proceso.
4. Finalmente, no se debe por ningún motivo, dejar de realizar el examen microscópico de las células
Estudio de la Serie Roja
• Por lo tanto, la observación microscópica nos permite confirmar lo señalado por los índices hemáticos, asi como, establecer la presencia de anormalidades
• Deben considerarse además una serie de interferencias que alteran el hemograma automatizado :
• 1. lipemia
• 2. ictericia severa
• 3. hemólisis
• 4. auto-aglutinación por anticuerpos fríos
• 5. plaquetas gigantes
• 6. leucemias
• 7. otras anormalidades
ANEMIA MCV RDW CV RDW SD
Deficiencia de B12/folato, hemólisis elevado elevado elevado
Causa inmune, aglutinación de GR
Por anticuerpos fríos, anemia aplásica
Insuficiencia severa de fierro bajo elevado elevado
Hemoglobinopatías heterocigóticas normal normal bajo
Hemoglobinopatías homocigótas normal elevado elevado
Mielofibrosis / anemia sideroblástica normal elevado elevado
Anemia hemolítica normal normal elevado
Anemia secundaria normal normal normal
Talasemia y Hemoglobina S combinada bajo elevado elevado
Talasemia bajo normal bajo
Talasemia
Estudio de las Plaquetas
• El computo se hace habitualmente por
impedancia
• La condición de una muestra en
circunstancias de tiempo, temperatura,
homogenización, relación sangre total /
anticoagulante, y la no formación de
hemólisis y espuma. Son indispensables
para un resultado confiable
Recuento de Plaquetas
En los instrumentos
tipo impedancia las
partículas analizadas
son suspendidas en
una solución
electrolítica y la
dilución es pasada a
través de una apertura
que liga dos cámaras,
una que tiene un
electrodo positivo y
otra un electrodo
negativo.
Al pasar por el orificio
las células causan un
incremento
momentáneo en la
resistencia eléctrica,
que es registrado
como un pulso.
La alarma LRI aparece acompañando a la cifra de plaquetas para indicar interferencias en la región baja ( LRI ); se debe a la acumulación de datos en la región de 2 – 3 fl. Se activa por una o varias de las siguientes causas : microplaquetas hemólisis fragmentos celulares residuos en el orificio del transductor crioglobulinas inclusiones intraeritrocitarias
Cell Dyn Series ( ABBOTT )
La alarma URI aparece acompañando a la cifra de plaquetas para indicar interferencias en la región alta ( URI ); se debe a la acumulación de plaquetas y eritrocitos entre los 20 y 40 fl. Esta alarma se activa por las siguientes causas :
Macroplaquetas Eritrocitos Microcíticos Agregados plaquetarios Eritrocitos Fragmentados Satelitósis Plaquetaria
Cell Dyn Series ( ABBOTT )
Histogramas de Plaquetopenias
•COULTER utiliza su tecnología patentada de SWEET FLOW
que consiste en hacer circular una corriente de diluyente en
la parte inmediatamente posterior de la apertura de
eritrocitos, a fin de que las plaquetas como son tan pequeñas
no permanezcan en el área de recuento y por lo tanto no se
cuenten más de una vez
• Ante un recuento plaquetario disminuido, se debe de hacer un examen microscópico de toda la lámina y/o recuento en cámara.
• Las plaquetas se comportan de manera particular, ya que cambian de forma desde el momento de su extracción, para luego estabilizarse, despues de varias horas pierde confiabilidad.
• Los cambios reales dependen de la alteración en la generación medular de plaquetas
• Presenta alteraciones en pacientes con plaquetas gigantes
• El PDW o ancho de distribución plaquetaria, corresponde a la amplitud de distribución o anisocitosis plaquetaria y se encuentra alterado en PTI, Mielodisplasia, Mieloproliferación
• Debe tenerse presente que algunas condiciones con producción defectuosa medular liberan plaquetas muy pequeñas y entonces el PDW, VPM y P-LCR presentan valores muy bajos
• En trombocitopenias es muy útil el histograma, ya que el equipo no realiza los cálculos
• Es definitivo que toda alteración plaquetaria debe realizarse al examen microscópico
• Alteraciones en el recuento automatizado :
• 1. pseudotrombicitopenia
• 2. microcitos
• 3. fragmetos eritrocitarios
• 4. inclusiones eritrocitarias
• 5. microcoagulos
• 6. heparina
Estudio de la Serie Blanca
• Es en el estudio diferencial de leucocitos donde se han desarrollado mas y nuevas tecnologías, con el fin de detectar con mayor precisión : tamaño, forma, morfología nuclear, granularidad y estructuras complejas.
• La cuenta total de leucocitos se da con la impedancia en la mayoría de aparatos
• Algunos aparatos usan la impedancia para medir el volumen nuclear y realizar un diferencial 3 Diff, que muestra linfocitos, granulocitos y células mixtas
• Estos diferenciales se acompañan de histogramas y deben ser tomados en cuenta, pero nunca ser los definitivos. Mas usados en pacientes saludables
Estudio de la Serie Blanca
• Los datos mas confiables para el leucograma
electrónico los ofrecen los diferenciales 5 Diff
• Estos ofrecen análisis por medi de :
• 1. rayo láser ( scatter light )
• 2. radiofrecuencia
• 3. impedancia
• 4. citoquímica
• 5. canales de lobularidad
• La utilización de citoquímica para detectar los granulocitos se encuentra en algunos instrumentos, con el uso de la peroxidasa, en conjunto con un canal de lobularidad, para basófilos
• Análoga a la especificidad de los antígenos, la composición y cantidad relativa de diferentes clases de lípidos en la membrana de los leucocitos, muestra patrones característicos, que son diferentes para cada tipo de célula
• Una reacción cito-química, basada en estas características de la membrana es la mejor forma de estos instrumentos para diferenciar granulocitos maduros de los inmaduros
• Causas de interferencia en serie blanca :
• 1. crioglobulinas
• 2. criofibrinógeno
• 3. proteínas monoclonales
• 4. eritroblastos
• 5. agregados plaquetarios
• 6. eritrocitos no lisados
• 7. microcoagulos
• 8. heparina circulante
Limitaciones del recuento manual de
leucocitos
• Rumke C.L. The statistical expected variability in differential
leucocyte counting en Kopke JA Differential Leucocyte Counting
CAP 1978
• Bacus JW. The observer error in peripheral blood leucocyte
classification Am J Clin Path 1973, 59, 223-230
• Talstad I, Problems in microscopic and automatic differentiation of
blood and cell suspensions Scand J Haematol, 1981, 26, 398-406
• Bentley S.A. Quality control and the differential leucocyte count. Clin
Lab Haemat, 1990, 12 Suppl 1, 101-109
• Kopke JA, Dotson MA, Shifman MA, A critical evaluation of the
manual/visual differential leucocyte counting method Blood Cells,
1985, 11, 173- 186
• Goossens W, Van Hove L, Verwilghen RL, Monocyte counting,
discrepancies in results obtained with differential automated
instruments , J Clin Pathol, 1991, 44, 224-227
HISTOGRAMAS
Histogramas
• De Glóbulos Rojos.
VCM
Histograma Normal
de Distribución de
Globulos rojos.
RDW
Histogramas
• De Glóbulos Rojos.
VCM
Desplazamiento a la Izquierda:
Microcitosis
Histogramas
• De Glóbulos Rojos.
VCM
Desplazamiento a la Derecha:
Macrocitosis
Histogramas
• De Glóbulos Rojos.
RDW
RDW Mayor de 15%:
Anisocitosis
Histogramas
• De Plaquetas.
Zona de Macroplaquetas,
Agregados plaquetarios, microcitos
Todo conteo celular comparte tres pasos básicos :
1. Dilución de la sangre
2. Toma de muestra de una cantidad medida
3. Enumeración de partículas
Ventajas de los métodos electrónicos :
1. Velocidad
2. Precisión
3. Cálculo automatizado del Hematocrito y constantes
4. Impresión de resultados
•
• El MCV es calculado sobre las bases de la sumatoria de la altura de los pulsos de las células rojas y dividido por el conteo de G.R.
• El volumen del paquete celular es calculado del MCV multiplicado por el conteo de células rojas
• El MCH es calculado del valor de la Hemoglobina y el conteo de G.R.
• El MCHC es calculado del valor de Hemoglobina y el Hematocrito
1. La turbidez producida por conteos elevados de células blancas, pueden alterar el valor de la Hemoglobina, MVC, y Hematocrito.
2. En LLC y otras leucemias las células son fácilmente dañadas por la apertura, pudiendo aparecer falsos conteos bajos de leucocitos ( WIC / WOC )
3. Títulos altos de aglutininas frías, que agregan los GR a temperaturaambiente, son responsables de macrocitosis y valores altos de MCHM
Hematocrito :
Se mide en % y representa la proporción total de GR en la sangre.
• No se mide directamente con los citómetros de flujo y se calcula a partir del VCM y en número de GR. Tiene menor presición
• El hematocrito es medido electrónicamente :
“ el pulso que es generado cuando los GR pasan a través de la abertura es proporcional a su volumen “. Se determina comparando el volumen total o acumulado de GR al volumen total de sangre en los 11.7ul de la dilución 1:500
El conteo diferencial manual está
sujeto a varios errores
• Errores en la preparación del frotis
• Errores en la tinción del frotis
• Distribución celular
• Interpretación celular
• Número de células contadas
Un buen diferencial automatizado debe ser capaz de :
1. Identificar células normales y anormales
2. Resultados reproducibles en conteos repetitivos
3. El conteo debe exceder largamente ( 8,000 – 32,000 cel. )
al tradicional conteo manual ( 100 – 200 células )
1. El conteo debe llevarse a cabo en un mínimo lapso
de tiempo
1. Se debe tener capacidad de almacenamiento de datos
ALARMA LRI EN EL HISTOGRAMA DE PLAQUETAS
Interferencias en la región baja “low region
interference”(LRI)
PLT: 94K ul LRI
• Esta alarma se activa por una o varias causas
– Microplaquetas
– Fragmentos celulares
– Crioglobulinas
– Inclusiones eritrocitarias
– Hemólisis
– Residuos en el orificio del transductor
ALARMA URI EN EL HISTOGRAMA DE PLAQUETAS
PLT: 296 K/uL URI
• Esta alarma se activa por una o varias causas
– Acumulación de plaquetas
– Eritrocitos microciticos
– Macroplaquetas
– Eritrocitos fragmentados
– Eritrocitos microcíticos
– Satelitosis plaquetaria
– Agregados plaquetarios
Alarma Interferencias en la región alta
URI “upper region interference”
LOCALIZACIÓN DE LAS ALARMAS REGIONALES EN EL HISTOGRAMA DE LEUCOCITOS
• Los grupos celulares que se encuentran fuera de las regiones consideradas como normales, disparan una alarma. Según la categoría de las células anormales, CELL-DYN utiliza seis alarmas diferentes
– R0,R1,R2,R3,R4 y RM
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS DEL HISTOGRAMA DE BLANCOS
• Existen diferentes regiones o puntos de control dentro de las tres poblaciones de células blancas
• Cuando no se cumplen los criterios de normalidad se muestran las alarmas R (R0,R1,R2,R3,R4 y RM)
• Las muestra cuyos resultados numéricos estén dentro del rango normal, con histograma normal y que no presenten alarmas ¨R¨, pueden ser informadas directamente sin supervisión posterior
• Las muestras que presentan un resultado o histograma anormal con alarma ¨R¨, requieren posterior supervisión
Histograma Influencia del EDTA y la temperatura
HEMATOLOGÍA NORMAL
Diferencial manual
Linfocitos: 39%
Neutrófilos: 56%
Monocitos: 3%
Bandas:1%
Eosinofilos: 1%
LEUCOCITOSIS CON LINFOPENIA Y NEUTROFILIA, LIGERA TROMBOCITOSIS
Diferencial manual
Linfocitos: 4.5% Neutrófilos:81.5%
Monocitos: 5%
Bandas: 9%
(CD) Diferencial automatizado
Linfocitos: 8.4%
Granulocitos:87.7%
MID: 3.9%
ERITROCITOSIS MICROCÍTICA
Diferencial manual
Linfocitos: 55%
Neutrófilos: 36%
Monocitos: 5
Bandas: 1%
Basófilos: 3%
Anisocitosis: +
Poiquilocitosis: +
Policromasia: +
GR nucleados: 1/1000GR
(CD) Diferencial automatizado Linfocitos: 45.9%
Granulocitos: 49.5%
MID: 4.6 %
Valores serie roja alterados
Alarma URI
LIGERA MONOCITOSIS Y EOSINOFILIA CON NEUTROPENIA
Diferencial manual
Linfocitos: 34%
Basófilos: 2%
Monocitos: 16%
Neutrófilos: 26%
Eosinófilos: 13%
Bandas:7%
Mielocitos: 1%
Metamielocitos: 1%
Poiquilositosis:+
Policromasia: +
Células en diana: +
GRnucleados:1/100G
Reticulocitos:23/1000GR
(CD) Diferencial automatizado Linfocitos: 32.6%
Granulocitos: R3 51.6%
MID: R3 15.8 %
Valores serie roja alterados
DISPLASIA MEDULAR CON FIBRINA. CÉLULAS AFECTADAS POR QUIMIOTERAPIA CITÓXICA
Diferencial manual
Linfocitos: 28%
Bandas: 11%
Monocitos: 24%
Eosinofilos: 3%
Neutrófilos: 34%
Reticulocitos: 13/1000GR
Anisocitosis: ++
Poiquilocitosis: ++
(CD) Diferencial automatizado Linfocitos: RM 54.3 %
Granulocitos: RM 33.1 %
MID: R3 12.6 %
Valores serie roja alterados
Alarma URI
MUCHAS GRACIAS !
SISTEMA MODULAR TOTALMENTE AUTOMATIZADO