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Presenta:

Vázquez Gómez Estrella Trinidad

Asesoras:

Dra. Laura J. Pérez Flores

Profesor Titular “C” T. C.

M. en B. E. Beatriz Buentello Volante

Profesor Asociado “A” M. T.

Mèxico, D. F. Abril, 2006.

2

Abreviaturas

ABA Ácido abscísico

AIA Ácido indol –3- acético

AIB Ácido indol –3- butírico

DAG 1,2 diacilglicerol

DAGK Diacilglicerol cinasa

DAGPP Diacilglicerol pirofosfato

IP3 Inositol 1,4,5 trifosfato

LPA Ácido liso-fosfatídico

MAPK Proteín-cinasa activada por mitógenos

PA Ácido fosfatídico

PAK Ácido fosfatídico cinasa

PAP Ácido fosfatídico fosfatasa

PC Fosfatidilcolina

PE Fosfatidiletanolamina

PG Fosfatidilglicerol

PI Fosfatidilinositol

PIP Fosfatidilinositol monofosfato

PIP2 Fosfatidil inositol 4,5 bifosfato

PKC Proteín cinasa C

PLA Fosfolipasa A

PLC Fosfolipasa C

PLD Fosfolipasa D

PS Fosfatidilserina

3

Agradecimientos

A la Dra. Laura J. Pérez Flores, por permitir que me uniera a su

equipo de trabajo, por su asesoramiento y por las facilidades que me

brindo para el desarrollo de el proyecto.

A la M. en B. E. Beatriz Buentello Volante por su apoyo

incondicional, sus asesorías, su tiempo dedicado y sobre todo su

paciencia durante todo el desarrollo de este proyecto.

A los integrantes de laboratorio: M. en C. Fernando Díaz de León y

Dr. Fernando Rivera, Xochil, Julio, Juan, Maribel, Lucía, Saraí, Esther y

sobre todo Lluvia por haberme brindado su amistad y darme animos, pero

sobre todo por haber hecho agradable mi estancia durante este año donde

lleve a cabo este proyecto.

Con especial agradecimiento a mi Madre por todo el esfuerzo que

hizo para ayudarme en todos los aspectos, a mi Padre, hermanas y

hermano por la colaboración y ayuda para la terminación de mis estudios.

A mi pareja Luis Fernando y a mis hijas Itzel Carolina y Quetzalli Mariana

por la comprensión y sacrificio de el tiempo que pudieran haber

compartido conmigo.

No podían faltar mis suegros y demás amigos que pusieron un

granito de arena debes en cuando para que yo pudiera cumplir esta meta.

4

Resumen

Las auxinas constituyen un grupo de hormonas vegetales que tienen

diversos efectos en el crecimiento y desarrollo vegetal, regulando múltiples

respuestas bioquímicas y fisiológicas.

El mecanismo de acción a nivel molecular de las auxinas no se conoce

con precisión. En la literatura se tiene conocimiento de algunos

intermediarios de las cascadas de transducción de señales de auxinas

desde su percepción hasta la alteración de la expresión génica u otras

respuestas que podrían ser la clave para entender el (los) mecanismo (s)

de acción primario(s) de las auxinas por lo que es importante ver si

algunos fosfoínositidos participan como segundos mensajeros.

En este proyecto se analizó la participación de la fosfolipasa D en la

vía de transducción de auxinas. Para esto se determinaron los niveles de

fosfoinosítidos (PI, PIP2, PA). Los resultados indican que no hubo

diferencias significativas en los niveles de los fosfoinosítidos estudiados

tanto en la parte aérea como en la radícula de ejes embrionarios de maíz

en los tratamientos con auxinas (natural y sintética) con respecto al testigo

en los diferentes periodos de incubación.

Con los resultados obtenidos podemos decir que aparentemente el PA

no participa como segundo mensajero en la vía de transducción de

auxinas.

5

Marco Teórico

Hormonas vegetales

Se conocen como hormonas vegetales a los compuestos o sustancias

químicas que se sintetizan en la planta, donde actúan a muy bajas

concentraciones, regulando el crecimiento, desarrollo o metabolismo

vegetal. Las hormonas y reguladores del crecimiento vegetal se agrupan en

familias. Las más importantes y representativas son: las auxinas, las

giberelinas, las citoquininas, el etileno y el ácido abscísico (Granell y

Carbonell, 1995).

Auxinas

Son hormonas vegetales que tienen un papel central en el

crecimiento y desarrollo vegetal, regulando diversas respuestas

bioquímicas y fisiológicas (Granell y Carbonell, 1995).

Existen dos tipos de auxinas las naturales y las sintéticas. El ácido

indol -3- acético (AIA), se considera la auxinas natural más importante

(Napier y Venis, 1991; Sitbon y Perrot, 1997). Otras auxinas naturales

identificadas son: 4-Cl-AIA y el ácido indol-3-butírico (AIB). Entre las

auxinas sintéticas que inducen efectos similares a las naturales y además

se utilizan como herbicidas, están el ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D),

el ácido 4-naftalenacético (4-ANA) y el ácido 3,6 dicloro o-anísico

(DICAMBA) (Sitbon y Perrot, 1997).

Efectos de las auxinas

Las auxinas participan en diversos procesos a diferentes niveles:

��En la planta completa: regulan la dominancia apical, las respuestas

trópicas, la formación de raíces laterales, el desarrollo de tejidos

vasculares y la senescencia (Guilfoyle y col., 1998; Walter y Estelle,

1998).

6

��En las células regulan el alargamiento, la división y la

diferenciación celular (Guilfoyle y col., 1998; Walter y Estelle, 1998;).

��A nivel molecular inducen la actividad de la ATPasa de protones de

la membrana plasmática (Macdonald, 1997) y la expresión de genes

específicos de respuesta a auxinas, tales como los de la familia

Aux/AIA, la familia SAUR, la familia GH3 y genes que codifican para

proteínas ribosomales (Gantt y Key, 1985; Abel y Theologis, 1996).

Por otra parte, las auxinas se han asociado con cambios en el patrón de

proteínas sintetizadas y con la inducción de la fosforilación de proteínas

ribosomales (Pérez y col., 1987; Pérez y col., 1990).

Aunque no se conoce con precisión el (los) mecanismo (s) de acción a

nivel molecular de las auxinas, se tiene conocimiento de algunos

intermediarios de la(s) cascada(s) de transducción de señales de estas

hormonas desde su percepción hasta la alteración de la expresión genética

u otras respuestas. (Abel y Theologis, 1996).

Fosfolípidos

En 1953 Hokin detecto por primera vez en animales el sistema de

señalización celular de lípidos de inositol, en donde observó la

incorporación de un isótopo dentro de lípidos. En 1975 Michell sugirió que

el recambio de fosfolípidos de inositol es una manifestación de un sistema

de señalización intracelular diferente al que se conocía hasta entonces

(Irvine, 1990; Liscovitch y Cantley, 1994).

7

Los fosfolípidos de inositol son mediadores importantes entre la

célula y el ambiente, ya que son fuente de segundos mensajeros y también

pueden funcionar como efectores directos en la regulación de la actividad

de enzimas membranales (Cho y Boss, 1995; Munnik y col. 1998b).

La membrana plasmática en su porción lipídica está formada

básicamente por fosfolípidos. Estos son lípidos que contienen glicerol, dos

ácidos grasos, fosfato y un grupo cabeza (por ejemplo, inositol). Uno de

estos fosfolípidos es el fosfatidilinositol (PI) el cual puede ser fosforilado a

fosfatidilinositol monofosfato (PIP) y a fosfatidilinositol bifosfato (PIP2) (Cho

y Boss, 1995; Munnik y col. 1998b).

La diversidad de funciones biológicas de los fosfoinosítidos está dada

por su capacidad única de ser fosforilados reversiblemente en tres

posiciones distintas del anillo de inositol como grupo cabeza (fosforilación

simple o combinada en las posiciones 3, 4 y 5) (Cho y Boss, 1995; Munnik

y col. 1998b).

Muchos componentes del sistema de fosfoinosítidos que se han

encontrado en animales tienen equivalentes funcionales y/o estructurales

en células vegetales. Los principales fosfolípidos en las células vegetales

son los fosfoinosítidos y pueden constituir del 15 al 20 por ciento del total

de los fosfolípidos de la membrana plasmática y de la membrana

mitocondrial externa (Drobak, 1992; Munnik y col., 1998b; Stevenson y

col., 2000).

8

La degradación de fosfoinosítidos requiere de la hidrólisis enzimática

de los diversos enlaces éster para liberar los contituyentes. La enzimas

encargadas de dicho proceso se llaman “fosfolipasas” dentro de las cuales

se encuentran: la fosfolipasa A (PLA), la fosfolipasa C (PLC) y la fosfolipasa

D (PLD) (Fig. 1)(Bohinski, 1991).

Fosfolipasa A (PLA)

Se conocen 2 isoformas de esta enzima: PLA1 y PLA2 en función de la

cadena de ácidos grasos que se va a hidrolizar.. Esta es una acilhidrolasa

que da como resultado lisofosfolípidos y un ácido graso libre.

Su actividad se ha relacionado con respuestas de heridas y de

crecimiento. En Ricinus communis ha sido implicada en la remoción

selectiva de ácidos grasos inusuales de fosfolípidos del retículo

endoplásmico. La actividad de la PLA es un mecanismo para canalizar los

ácidos grasos inusuales a triacilgliceroles en semillas de oleaginosas,

previniendo un daño por acumulación de estos ácidos grasos. Además, es

activada por auxinas en respuestas de crecimiento (Chapman, 1998).

Fig. 1 Acción de las fosfolipasas sobre un fosfolípido

Grupo Cabeza

9

Fosfolipasa C (PLC)

Esta fosfolipasa es una fosfodiesterasa que remueve el grupo cabeza

unido a un fosfato de los fosfolípidos. Su activación es a través de

receptores acoplados a proteínas G o bien por receptores acoplados a

tirosin-cinasas (Drobak, 1993; Munnik y col. 1998b).

La PLC rompe la unión fosfodiester del fosfatidil inositol 4,5 difosfato

(PIP2) produciendo dos segundos mensajeros; el inositol 1,4,5 trifosfato

(IP3) y el 1,2 diacilglicerol (DAG). El IP3 es soluble en agua y difunde hacia

los almacenes intracelulares de Ca2+, donde se une a receptores específicos

unidos a canales de Ca2+ promoviendo la liberación de este ión. El DAG es

altamente lipofílico permanece en la matriz de la membrana plasmática

donde activa a la proteín cinasa C (PKC). Así dos cascadas de señalización

son inciadas por la PLC involucrando la elevación de Ca2+ citosólico, lo

que resulta en la modulación de elementos de respuesta sensibles a Ca2+

y por otra parte la fosforilación de proteínas por la PKC (Drobak, 1992,

1993).

Fosfolipasa D (PLD)

Esta enzima se ha encontrado en varias especies de plantas,

animales y microorganismos. La PLD rompe la unión fosfodiester terminal

y forma ácido fosfatídico (PA) y un grupo cabeza libre, además cataliza una

reacción de transesterificación cuando un alcohol esta presente como

donador nucleofílico y así se pueden sintetizar fosfolípidos de membrana

como la fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilserina (PS) y fosfatidilglicerol

(PG) a partir de fosfatidilcolina (PC) (Munnik y col., 1998a; Leiros y col.,

2000).

Se ha asociado también a la PLD con la germinación de semillas, la

senescencia, la maduración de frutos o flores, la respuesta a estrés por

temperatura o por heridas, la acción de las hormonas como el ácido

absíscico (ABA) y el etileno, y la respuesta a patógenos. Su activación al

parecer esta mediada por proteínas G (Chapman, 1998; Munnik y col.,

1998a; Laxalt y col., 2001).

10

Ácido fosfatídico (PA)

Este ácido es un lípido intermediario importante en la síntesis de

fosfolípidos y glicolípidos en el retículo endoplásmico, además se ha

propuesto como una señal intracelular en sistemas de animales y

recientemente también en vegetales (Munnik y col., 1996; Munnik y col.,

1998b; Van der Luit y col., 2000 y Munnik, 2001).

Este fosfolípido puede ser producido por dos rutas. Una ruta

involucra la hidrólisis de fosfoinosítidos por la PLC, que genera DAG, el

cual es fosforilado por la DAGK para formar PA. La otra ruta produce

directamente PA por la acción de la PLD, sobre los fosfolípidos

estructurales. Este fosfoinosítido puede ser desfosforilado por la PA

fosfatasa para formar DAG o fosforilado por la PAK para formar DAGPP,

además puede ser hidrolizado por la PLA para generar LPA (ácido liso-

fosfatídico) (Fig. 2).(Munnik, 2001)

Fig. 2 Metabolismo del ácido fosfatídico

11

Justificación

Existen investigaciones que han demostrado que la aplicación de

auxinas exógenas a las células y órganos vegetales influye de manera

importante sobre el crecimiento y desarrollo vegetal. El mecanismo de

acción de estas hormonas ha sido estudiado y se ha propuesto que

podrían tener distintas vías de señalización no necesariamente

independientes: la vía de ubiquitina-proteosoma (Walter y Estelle, 1998) y

otra vía mediada por fosfoinosítidos (Hobbie y col., 1994; Scherer y Arnold,

1997).

Se ha reportado que entre las respuestas rápidas de las células

vegetales a auxinas se encuentra la activación de fosfolipasas,

específicamente la PLA2. En segmentos de hipocótilos de girasol el

incremento del crecimiento en respuesta a auxinas estuvo asociado a una

rápida activación (entre 15 y 30 min.) de la actividad de la PLA2 (Chapman,

1998).

Estudios previos en nuestro grupo de trabajo, demostraron que el

patrón de fosfoinosítidos varía dependiendo de la etapa de germinación del

eje embrionario y del tejido analizado. En particular en la parte aérea de

granos imbibidos por 24 hr., no se logró detectar PI, mientras que a las 48

hr. sí se detectó este fosfoinosítido. Asimismo, se observó que en ejes

embrionarios completos imbibidos por 23 hr y estimulados 1hr con α-ANA

los niveles de PA disminuyen, así como, en ejes embrionarios completos

imbibidos por 47 hr y estimulados 1 hr con AIA. Por otra parte, al analizar

el recambio de fosfosinosítidos con [32P]-ATP en la parte aérea de ejes

embrionarios imbibidos por 24 hrs se observó que la aplicación de auxinas

por 3 y 5 minutos promueven el recambio de PA. (Buentello, 2002).

12

Objetivos

General

¾�Analizar la participación de la fosfolipasa D en la vía de

transducción de auxinas.

Particulares

• Cuantificar la actividad de la PLD en la parte aérea y radícula de ejes

embrionarios de maíz tratados y sin tratar con auxinas.

• Analizar si la auxina natural y las sintéticas activan de igual manera

a la fosfolipasas.

Hipótesis

Si en la vía de transducción de las auxinas participan diferentes

fosfolípidos como segundos mensajeros, se esperaría que estas hormonas

afectaran la actividad de las enzimas encargadas de generar estos

compuestos.

Metodología

I. Material biológico

Se usaron granos de maíz (Zea mays L. var. Chalqueño). Los granos

de maíz se desinfestarón con una solución de hipoclorito de sodio (NaOCl)

al 10% v/v por 10 minutos. Se enjuagaron tres veces con agua estéril. Los

granos se sembraron en camas de algodón humedecido y se mantuvieron

por 22 hrs. a 25º C. Se disectaron los ejes embrionarios y se trataron con

200µM de las auxinas: ácido indol-3-acético (AIA) y ácido α-naftalenacético

(α-ANA) y por diferentes períodos (3, 5, 10 y 15 minutos). Después de la

incubación, los ejes se lavaron tres veces con agua estéril. El eje se separó

en parte aérea y radícula, y cada parte se congelo en N2 líquido y se

almaceno a –70º C hasta su uso.

13

II. Obtención de membranas microsomales

Cada tejido se homogeneizó con 3 volúmenes de amortiguador de

extracción (250 mM sacarosa, 3 mM EDTA, 2 mM EGTA, 14 mM 2-

mercaptoetanol, 2 mM DTT, 30 mM TRIS-HCl pH=7.4) adicionando 0.05g

de polivinil polipirrolidona insoluble. Se filtró el homogenizado a través de

cuatro capas de gasa. Se centrífugo a 5000 g por 10 min., a 4º C. El

sobrenadante se centrífugo nuevamente a 100 000 g por 1hr a 4º C para

obtención de la pastilla de microsomas. Está pastilla se resuspendió en

500 µl de HEPES 50 mM. Se determinó la concentración de proteínas

microsomales por medio de un ensayo comercial (Bio-Rad, Catalogo 500-

0006) basado en el método de Bradford (Cho y Boss, 1995).

III. Obtención y separación de fosfolípidos

La separación de los fosfoinosítidos se llevó a cabo utilizando una

alícuota de 200 µg de proteínas contenidas en las membranas

microsomales. Se agregó 1.5 mL de una mezcla de cloroformo/metanol (1:2

v/v), 500µL de HCl 2.4 N y 500µL de cloroformo. Se agitó en vortex por 30

segundos, la fase inferior se extrajo y a la fase superior se le añadió

1000µL de cloroformo. Se agitó nuevamente en vortex por 30 seg. y se

extrajo la fase inferior combinándola con la anterior. A la fase inferior se le

agregó 2000µL de una mezcla de metanol/HCl 1N (1:1 v/v). Se separó la

fase inferior, la cual se dejó secar a temperatura ambiente por una noche.

V. Medición de la actividad Fosfolipasa D (PLD)

Los ejes embrionarios se incubaron con las auxinas como ya se

mencionó y se adicionó butanol al 0.75 %. Se separó la parte aérea y la

radícula, congelándose en N2 líquido y se almacenó a -70º C. Se obtuvieron

las membranas microsomales como anteriormente se mencionó y a partir

de éstas se obtuvieron los fosfolípidos con la metodología previamente

descrita.

14

VI. Separación y análisis de los fosfolípidos

Los lípidos obtenidos se resuspendieron en una mezcla de

cloroformo/metanol (9:1 v/v) y se separaron en placas de silica gel (Merck,

0B033695) utilizando dos mezclas de eluyente. Para visualizar el PA

proveniente de la PLD y el PA proveniente de la PLC-DAGK, se utilizo una

mezcla compuesta de acetato de etilo/ácido acético/iso-octano/agua

(13:3:2:10 v/v/v/v). Una la segunda mezcla compuesta de

cloroformo/metanol/acetona/ácido acético/agua (40:14:15:17:7

v/v/v/v/v) se utilizo para obtener el patrón general de fosoinosítidos. Los

fosfoinosítidos se revelaron por tinción con una solución de 14ml ácido

sulfúrico, 1.25g sulfato cérico de amonio y 20g ácido fosfomolíbdico en

500ml de agua. Los fosfolípidos se cuantificaron por densitometría

utilizando el programa Image J (http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html).

Resultados

En los ejes embrionarios de maíz imbibidos por 24 hrs, tratados y

sin tratar con auxinas (AIA y α-ANA) a los diferentes periodos (3,5,10 y 15

min) se detectaron los siguientes fosfoinosítidos: PI, PIP2, PA.

Niveles de PI

La aplicación exógena de auxinas (natural y sintética) en parte área

y en la radícula no cambia los niveles de PI con respecto al control (Gráfica

1 y gráfica 2).

15

PI (PARTE AÉREA)

0

20

40

60

80

100

120

140

3 5 10 15

Minutos

% c

on

res

pec

to a

l co

ntr

ol

Control AIA α−ΑΝΑ

PI (RADICULA)

0

20

40

60

80

100

120

140

3 5 10 15

Minutos

% c

on

res

pec

to a

l co

ntr

ol

Control AIA α−ΑΝΑ

Niveles de PIP2

En los niveles de PIP2 en parte área como en radícula no se observaron

diferencias significativas entre los diferentes tratamientos a los diversos periodos

de incubación con las auxinas (natural y sintética) (Gráfica 3 y gráfica 4).

Gráfica No. 1. Niveles de PI en parte aérea en ejes embrionarios

imbibidos por 24 hrs, tratados y sin tratar con auxinas.

Gráfica No. 2. Niveles de PI en radícula en ejes embrionarios

imbibidos por 24 hrs, tratados y sin tratar con auxinas.

16

PIP2 (PARTE AÉREA)

0

20

40

60

80

100

120

140

3 5 10 15

Minutos

% r

esp

ecto

al C

on

tro

l

Control AIA α−ΑΝΑ

PIP2 (RADICULA)

0

20

40

60

80

100

120

140

3 5 10 15

Minutos

% r

esp

ecto

al C

on

tro

l

Control AIA α−ΑΝΑ

Niveles de PA

En los niveles de PA no se observaron diferencias significativas entre la

auxina sintética y la natural con respecto al control tanto en parte área como en

radícula a los diferentes periodos.

Gráfica 3. Niveles de PIP2 en la parte áerea de ejes embrionarios

imbibidos por 24 hrs, tratados y sin tratar con auxinas.

Gráfica 4. Niveles de PIP2 en radícula de ejes embrionarios imbibidos por

24 hrs, tratados y sin tratar con auxinas.

17

PA (PARTE AÉREA)

0

20

40

60

80

100

120

140

3 5 10 15

Minutos

% r

esp

ecto

al C

on

tro

l

Control AIA α−ΑΝΑ

PA (RADICULA)

0

20

40

60

80

100

120

140

3 5 10 15

Minutos

% r

esp

ecto

al C

on

tro

l

Control AIA α−ΑΝΑ

Actividad de la PLD (PA-But)

En la gráfica no. 7 y gráfica no. 8 se presentan los niveles de PA-

butilado (PA-But), que determina la actividad de la PLD. En la parte aérea

de ejes embrionarios tratados por 10 minutos con AIA y α-ANA se observó

un incremento significativo en los niveles de PA-But, sin embargo este

aumento no se reflejo en los niveles totales de PA. Entre los diferentes

tipos de tratamiento con las auxinas (natural y sintética) no se observaron

diferencias significativas (Gráfica 7 y gráfica 8).

Gráfica No.5 Niveles de PA en parte aérea en ejes embrionarios

imbibidos por 24 hrs, tratados y sin tratar con auxinas.

Gráfica No.6 Niveles de PA en radícula en ejes embrionarios

imbibidos por 24 hrs, tratados y sin tratar con auxinas.

18

Actividad de PA/PLD (PARTE AÉREA)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

3 5 10 15

Minutos

% r

esp

ecto

al c

on

tro

l

Control AIA α−ΑΝΑ

Actividad de PA/PLD (RADICULA)

020406080

100120140160180

3 5 10 15

Minutos

% r

esp

ecto

al c

on

tro

l

Control AIA a-ANA

Gráfica No.7 Actividad de la PLD (PA-But) en parte aérea en ejes

embrionarios imbibidos por 24 hrs, tratados y sin tratar con auxinas.

Gráfica No.8 Actividad de la PLD (PA-But) en radícula en ejes

embrionarios imbibidos por 24 hrs, tratados y sin tratar con auxinas.

19

Discusión

Se ha reconocido a los fosfolípidos como precursores de moléculas

bioactivas, que se generan después de la estimulación de receptores de

superficie celular y funcionan como segundos mensajeros o como efectores

directos en la regulación de la actividad de enzimas membranales

(Liscovitch y Cantley, 1994; Cho y Boss, 1995; Munnik y col., 1998b).

En el presente trabajo se midieron los niveles de fosfoinosítidos en

parte área y radícula de ejes embrionarios, tratados y sin tratar con las

hormonas vegetales AIA (auxina natural), α-ANA (sintética), con y sin

butanol, durante las primeras etapas de germinación. Los fosfolípidos

detectados fueron: PI, PIP2, PA y el PA-But este último para medir la

actividad de la PLD.

Se ha reportado que la actividad de la fosfolipasa D se mide

indirectamente por la formación de un derivado butilado del ácido

fosfatídico el cual es el producto de la hidrólisis de esta enzima, solamente

que en vez de agua se realiza en presencia de un alcohol (butanol)(Munnik

y col., 1998b).

En los niveles de PI, PIP2 y PA no se observaron cambios

significativos en estos fosfoinosítidos, en presencia de las auxinas cuando

fueron detectados.

En este trabajo se observo que el PA-But en parte aérea a los 10

minutos con AIA y α-ANA incremento un poco su nivel, pero no se ve

reflejada en los niveles totales de PA, esto puede deberse a que este lípido

no se acumula, debido a que tenga un rápido recambio.

20

Conclusiones

No se encontraron diferencias significativas en los niveles de PI, PIP2

(sustrato de PLD) y PA (posible segundo mensajero) en los tejidos tratados

con la auxina natural (AIA) o la sintética (α-ANA) durante todos los tiempos

de exposición a estas hormonas analizados.

Se observó un ligero incremento en la actividad de PLD en la parte

aérea, a los 10 minutos de exposición a las auxinas pero no se ve reflejada

en los niveles totales de PA.

Aparentemente, el PA no participa como segundo mensajero en la vía

de transducción de auxinas.

21

Bibliografía

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24

ÍNDICE GENERAL

Página

ABREVIATURAS .............................................................................................2

AGRADECIMIENTOS....................................................................................3

RESUMEN ..........................................................................................................4

MARCO TEÓRICO...........................................................................................5

Hormonas vegetales..............................................................................5

Auxinas ...................................................................................................5

Efectos de las auxinas ............................................................................5

Fosfolípidos.............................................................................................6

Fosfolipasa A (PLA) ..............................................................................8

Fosfolipasa C (PLC) ..............................................................................9

Fosfolipasa D (PLD) ..............................................................................9

Ácido fosfatídico (PA) .........................................................................10

JUSTIFICACIÓN.............................................................................................11

OBJETIVOS .....................................................................................................12

General..................................................................................................12 Particulares ..........................................................................................12

HIPÓTESIS.......................................................................................................12

METODOLOGÍA.............................................................................................12

I. Material biológico ............................................................................12 II. Obtención de membranas microsomales......................................13 III. Obtención y separación de fosfolípidos.......................................13 V. Medición de la actividad fosfolipasa D (PLD) .............................13 VI. Separación y análisis de los fosfolípidos......................................14

RESULTADOS .................................................................................................14

Niveles de PI .........................................................................................14 Niveles de PIP2.....................................................................................15 Niveles de PA........................................................................................16 Actividad de la PLD (PA-But)............................................................17

DISCUSIÓN......................................¡ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO.

CONCLUSIONES ............................................................................................20

BIBLIOGRAFÍA ..............................................................................................21