UNIVERSIDAD TCNICA DE MACHALA UNIDAD ACADMICA DE CIENCIAS QUMICAS DE LA SALUDCARRERA DE BIOQUMICA Y FARMACIA

CONTROL DE MEDICAMENTOS

TEMA: Cromatografa de lquidos de alta resolucin (HPLC).

DOCENTE: Dr. Carlos Garca. Mg.Sc

CURSO: Quinto Ao A

INTEGRANTES:

Vicente Orellana Hurtado Arelis Rogel Galarza

Introduccin

Los avances en el campo de la biotecnologa han requerido el uso de tcnicas ms eficaces para la separacin y purificacin de biomolculas. La cromatografa de lquidos ha resultado ser una herramienta muy poderosa y eficiente para la separacin de mezclas complejas tanto de compuestos de bajo peso molecular como de protenas y cidos nucleicos (Esquivel & Leal, 2004).

En la cromatografa lquida de alta resolucin, la fase mvil es un lquido que fluye a travs de una columna que contiene a la fase fija. La separacin cromatografa en HPLC es el resultado de las interacciones especficas entre las molculas de la muestra en ambas fases, mvil y estacionaria (Ozores, M. 2014).

A diferencia de la cromatografa de gases, la cromatografa de lquidos de alto rendimiento (HPLC, de high-performance liquid chromatography) no est limitada por la volatilidad o la estabilidad trmica de la muestra (Ozores, M. 2014).

La HPLC es capaz de separar macromolculas y especies inicas, productos naturales lbiles, materiales polimricos y una gran variedad de otros grupos polifuncionales de alto peso molecular. Con una fase mvil lquida interactiva, otro parmetro se encuentra disponible para la selectividad, en adicin a una fase estacionaria activa. Ofreciendo una mayor variedad de fases estacionarias, lo que permite una mayor gama de estas interacciones selectivas y ms posibilidades para la separacin (Ozores, M. 2014).

Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (HPLC)La cromatografa lquida (HPLC), es una tcnica utilizada para separar los componentes de una mezcla. Consiste en una fase estacionaria no polar (columna) y una fase mvil. La fase estacionaria es slica que se ha tratado con RMe2SiCl . La fase mvil acta de portador de la muestra. La muestra en solucin es inyectada en la fase mvil. Los componentes de la solucin emigran de acuerdo a las interacciones no-covalentes de los compuestos con la columna. Estas interacciones qumicas, determinan la separacin de los contenidos en la muestra. La utilizacin de los diferentes detectores depender de la naturaleza de los compuestos a determinar (Miranda, & Martn, 2013).AplicacionesCampos de Aplicacin de HPLC (Ozores, M. 2014): Frmacos: Antibiticos, sedantes esteroides, analgsicos

Bioqumica: Aminocidos, protenas, carbohidratos, lpidos

Productos de alimentacin: Edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos

Productos de la industria qumica: Aromticos condensados, tensoactivos, propulsores, colorantes

Contaminantes: fenoles, Pesticidas, herbicidas, PCB

Qumica forense: Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcticos

Medicina clnica: cidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina, estrgenos.Equipo de HPLCLa cromatografa de lquidos de alta resolucin utiliza presiones elevadas para hacer pasar un flujo de fase mvil a travs de una columna empacada con partculas micromtricas. Sin la aplicacin de presin sera prcticamente imposible que el diluyente pasara a travs de la columna. Un equipo de HPLC bsicamente debe contar con un sistema de bombeo que impulse el flujo de la fase mvil a travs de la columna, una columna que separe los componentes de la muestra, un detector que mida alguna caracterstica de dichos componentes conforme van saliendo de la columna y un procesador que convierta la seal electrnica del detector en un cromatograma (Esquivel & Leal, 2004).

Diagrama de flujo de proceso del HPLCPartes del Equipo de HPLCSistemas para el tratamiento de los disolventesLos recipientes que contienen los solventes a menudo se equipan con un sistema para eliminar los gases disueltos, como oxgeno y nitrgeno, que interfieren formando burbujas en los sistemas de deteccin. Un desgasificador puede consistir en un sistema de bombeo por vaco, dispositivos para calentar y agitar los disolventes o sistemas de difusin que permiten arrastrar los gases disueltos fuera de la solucin mediante finas burbujas de un gas inerte de baja solubilidad. Para poder hacer eluciones por gradiente, los equipos de HPLC modernos cuentan con recipientes conectados a una mezcladora, lo que permite variar la relacin de los disolventes en forma programada y modificar los valores de manera lineal o exponencial (Esquivel & Leal, 2004).

Sistemas de bombeoLa bombas recprocas son las ms usadas, el 90 % de los equipos de HPLC modernos cuentan con este sistema de bombeo. El disolvente es expulsado de una cmara por el movimiento de vaivn de un pistn accionado por un motor. Las bombas recprocas tienen la desventaja de que producen un flujo con pulsaciones que se manifiesta como ruido en la lnea base del cromatograma (Esquivel & Leal, 2004).

Sistemas de inyeccin de la muestraEl mtodo ms ampliamente utilizado para la introduccin de la muestra utiliza dispositivos en forma de bucle, que pueden introducir la muestra a presiones de hasta 7000psi con una precisin aceptable (Esquivel & Leal, 2004)..ColumnasPara aumentar la vida de la columna analtica se coloca delante una precolumna que elimina la materia en suspensin y los contaminantes de los disolventes. La composicin del relleno de la precolumna debe ser semejante al de la columna analtica; sin embargo, el tamao de la partcula es por lo comn mayor para minimizar la cada de presin (Esquivel & Leal, 2004)..Tipos de relleno de la columnaLos rellenos de partculas porosas para HPLC estn formados por micro partculas porosas con dimetros entre 3 y 10 m y con la menor dispersin posible para un tamao determinado. La slice es el material ms comnmente empleado para este tipo de columnas, debido a que se pueden producir partculas con dimetros muy uniformes (Esquivel & Leal, 2004).

Proceso de pulverizacin de la muestraAspersinPesar 1000 g de muestra (Hortalizas, frutas, etc.). Para seleccionar la muestra, se mide los parmetros de color, L, a* y b* con el colormetro (Arias y col., 2000).Se extrae el jugo de la muestra y se mide los parmetros de color al jugo extrado para tenerlos como referencia. Despus se determina los slidos solubles totales con el refractmetro. De acuerdo con el porcentaje de slidos determinado y al peso de jugo extrado, se calcula la cantidad en gramos. El jugo con el encapsulante se coloca en el secador por aspersin, donde se selecciona la temperatura del aire de entrada, cuyos valores son de 170 y 180 C. La velocidad de alimentacin se ajusta de manera que la temperatura mxima del aire, a la salida fuera de 80C. Una vez obtenido el polvo de la muestra en cada tratamiento, se coloca en bolsas de polietileno dentro de un frasco de vidrio y posteriormente se cubren con papel aluminio. Luego se almacenan en un lugar fresco y seco, debidamente etiquetado. (Candelas y col., 2005).NebulizacinUn secado por nebulizacin comprende bsicamente la cmara de secado, por lo general de fondo cnico, el atomizador y un sistema de separacin de polvos y gotas, adems de un apropiado sistema de bombeo, calentador de aire, etc (Vita Jato, 2008).

Secadero por nebulizacin: 1) tanque de alimentacin, 2) atomizador centrfugo, 3) cmara de desecacin, 4) filtro de aire, 5) ventilador, 6) calentador de aire, 7) conducto, 8) dispersador de aire ajustable, 9) ventilador de aire fro, 10) cmara del producto, 11) colector del producto, y 12) ventilador.

La muestra es liberada en el atomizador por flujo de gravedad o con una bomba apropiada. La velocidad de alimentacin se ajusta para que cada gota de lquido atomizado sea completamente desecada antes de que se ponga en contacto con la pared de la cmara de secado, para que as el polvo resultante no se sobrecaliente (Vita Jato, 2008).LiofilizacinEs un proceso de desecacin donde la muestra con el solvente, por lo general agua, es primero congelado y posteriormente eliminado por sublimacin en un entorno de vaco. La temperatura a la que es sometida la muestra est por debajo de aquella a la que muchas sustancias inestables sufren cambios qumicos. Debido a la baja temperatura a la cual se opera, la prdida de constituyentes voltiles es mnima (Vita Jato, 2008).Artculos Cientficos:Validacin de un Mtodo de Extraccin de Alicina en Ajo y su Cuantificacin por HPLCRESUMENEntre los constituyentes de mayor actividad biolgica del ajo destaca la alicina, compuesto sulfurado altamente inestable responsable de sus propiedades farmacolgicas adems de su olor caracterstico. Debido a la elevada degradabilidad de alicina, es importante el establecimiento de un mtodo eficiente de extraccin y de cuantificacin que pueda ser usado en procesos de control de calidad en la industria de suplementos alimenticios. En este trabajo se describe un mtodo de extraccin de alicina y su cuantificacin por HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Se realiza una validacin del mtodo evaluando parmetros de linealidad, exactitud, precisin, reproducibilidad, selectividad y robustez (Daz & Jimnez, 2008).Extraccin del analito El mtodo incluy la preparacin de una Disolucin de Estndar Interno de p-hidroxibenzoato de etilo diluyendo aproximadamente 0.53 g del compuesto en 1 000 mL de agua. Adicionalmente fue necesaria la preparacin de una solucin acuosa 1 mM de cido ctrico cuya funcin es detener la reaccin de formacin de alicina (Daz & Jimnez, 2008).Extraccin: Se pes con exactitud de 0.001 g, aproximadamente de 1 a 5 g de ajo y se transfiri a un matraz Erlenmeyer de 250 mL seguido de la adicin de aproximadamente 30 g de la disolucin del estndar interno. La mezcla de ajo y disolucin de etilparabeno se homogeniz durante aproximadamente 2.5 min, y al finalizar se mantuvo en reposo a temperatura ambiente por 30 min. Posteriormente se centrifug a 3 500 rpm durante 10 min. Del sobrenadante se tomaron 2 mL y se aforaron a 10 mL con la disolucin de cido ctrico. Finalmente la disolucin final se filtr a travs de una membrana Millipore para su anlisis por HPLC (Daz & Jimnez, 2008).Anlisis por HPLC: Las condiciones de anlisis fueron: fase mvil Metanol/Agua 45/55 a flujo de 0.8 mL/min; Temperatura de anlisis 25 C y deteccin UV a 230 nm.Cuantificacin: Para la determinacin de la concentracin de alicina, se realiz un anlisis cromatogrfico usando el Polvo de Ajo Estandarizado como patrn.

El cromatograma obtenido para la muestra de ajo fresco presenta un perfil cromatogrfico de una intensidad de la seal de alicina indica que la muestra presenta una alta concentracin del metabolito, de manera que la muestra no representara ninguna limitante para realizar la validacin del mtodo (Daz & Jimnez, 2008).

Extraccin y caracterizacin de principios activos con propiedades antioxidantes y antibacterianas, a partir de residuos del procesamiento de alcachofas.RESUMEN: En esta investigacin se determin la presencia y actividad de compuestos fenlicos como el cido cafeico (sin dato) y cido clorognico (40.06 - 82.86 mg/L) en brcteas de alcachofa mediante la aplicacin de tcnicas de extraccin slido-lquido, fenoles totales de Folin-Ciocalteu, actividad antioxidante con el reactivo DPPH, actividad antibacteriana, cromatografa en capa fina (TLC) y HPLC. Los resultados demostraron que el extracto con mayor concentracin de fenoles totales en equivalentes de quercetina fue el extracto hidroalcohlico (0.160 mg EQT/100g brcteas frescas), seguido del extracto alcohlico (0.153 mg EQT/100g brcteas frescas), del hidrolizado sin calor (0.142 mg EQT/100 g brcteas frescas) y, del hidrolizado con calor (0.001 mg EQT/100g brcteas frescas). Durante la prueba de actividad antioxidante se observ que los extractos, alcohlico e hidroalcohlico, fueron capaces de reducir al reactivo DPPH en 91.46% y 91.28% respectivamente. La prueba de actividad antibacteriana de estos dos extractos en cultivos de Staphylococcus aureus y Salmonella spp. demostr que tienen propiedades antibacterianas. Basado en los resultados, es posible afirmar que las brcteas de alcachofa son un valioso recurso para obtener principios activos tiles como antioxidantes y antibacterianos (Naranjo, 2009).OBTENCIN Y PREPARACIN DE LA MUESTRA. Las muestras de brcteas de alcachofa fueron obtenidas de la empresa INAEXPO, perteneciente a PRONACA, en Puembo, Pichincha-Ecuador. La preparacin de las muestras consisti en secarlas a una temperatura menor a 40C para evitar la alteracin de los principios activos y, finalmente fueron pulverizadas (Naranjo, 2009). EXTRACCIN DE PRINCIPIOS ACTIVOS. Los extractos de brcteas de alcachofa se obtuvieron aplicando tcnicas de extraccin slido-lquido recomendadas por. La primera tcnica aplicada fue la maceracin del pulverizado en etanol durante 30 das, utilizando 10 mL de etanol al 99.6% por cada 10g de brcteas pulverizadas. De este procedimiento se obtuvieron dos extractos, uno alcohlico y otro hidroalcohlico mediante la adicin de agua durante la maceracin.La segunda tcnica aplicada para la extraccin de principios activos fue la hidrlisis cida con cido clorhdrico (HCl) 6N, utilizando 200 mL de HCl por cada 15g de brcteas pulverizadas durante tres das, luego de la maceracin en cido clorhdrico (HCl) se dej el extracto en reflujo durante 12 horas. De este procedimiento se obtuvieron dos extractos, un hidrolizado con calor y otro a temperatura ambiente. Finalmente todos los extractos fueron concentrados en rotavapor con vaco y a una temperatura menor de 40C. (Naranjo, 2009).TAMIZAJE FITOQUMICO Y CROMATOGRAFA HPLCEl tamizaje fitoqumico del pulverizado y la cromatografa HPLC de los extractos alcohlico e hidroalcohlico se realizaron en el laboratorio de Productos Naturales de la Universidad Politcnica Salesiana por el profesor Wilson Tapia MSc. Para la cromatografa HPLC se utilizaron como estndares cido cafeico, cido clorognico y quercetina (Naranjo, 2009).RESULTADOSRf de los compuestos identificados en los cromatogramas.

ExtractosAlcohlicoHidroalcohlicoHidrolizadosincalor

Rf c. Cafeico0.960.950.95*

Rf c. Clorognico0.54*0.54*0.53

0.840.820.90*

Rf Muestra0.710.650.76

0.59*0.52*0.42

El resultado del anlisis realizado al extracto alcohlico e hidroalcohlico mediante HPLC revela que las concentraciones de cido clorognico son 82.8560 y 40 .0613 mg/L, respectivamente. Estos extract os no contienen cido cafeico y quercetina segn los cromatogramas.

Cromatograma HPLC del extracto alcohlico

Bibliografa:

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-Candelas M, Alans M & Olague F. (2005) Extraccin y cuantificacin por HPLC de aaaalicopeno en tomate y polvo de tomate. Facultad de Ciencias Qumicas de la aaaaUJED.(En lnea)(Disponible en): www.respyn.uanl.mx/especiales/2005/ee-13-aaaa2005/.../CNA37.pdf-Daz J. & Jimnez L. (2008). Validacin de un Mtodo de Extraccin de Alicina en Ajo aaaay su Cuantificacin por HPLC. Centro de Investigacin y de Estudios Avanzados aaaadel Instituto Politcnico Nacional. Mxico. (En lnea).(Disponible en): aaaahttps://www.cenam.mx/simposio2008/sm_2008/memorias/S2/SM2008-S2A2-aaaa1066.pdf

-Esquivel, E & Leal, L. (06/ 2004). Cromatografa De Fase Reversa. Mtodos aaaafisicoqumicos en Biotecnologa. Universidad Nacional Autnoma De Mxico aaaaInstituto De Biotecnologa. Cuernavaca, Morelos. Pg.6

-Miranda, A & Martn, O (12/2013). Cromatografa Lquida (HPLC).(En lnea)(Disponible aaaaen): http://www.ucm.es/data/cont/docs/650-2013-12-02-aaaagases%20l%C3%ADquidos.pdf-Naranjo B. (2009), Comunicacin personal, Escuela Politcnica del Ejrcito, Ecuador.-Ozores, M. (2014). Cromatografa de lquidos HPLC. Laboratorio de Tcnicas aaaInstrumentales. ). (En lnea).(Disponible en): http://laboratoriotecnicasinstrumentalesaaa.es/analisis-qumicos/cromatografa-de-lquidos-hplc

- Vita Jato. (2008). Aspectos fundamentales de los sistemas farmacuticos y aaaaoperaciones bsicas. Tecnologa Farmacutica. Facultad de Farmacia. aaaaUniversidad de Santiago de Cornpostela. Vol 1.Pg.482-498