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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

TESIS

PRESENTADA AL HONORABLE CONSEJO DIRECTIVO

COMO REQUISITO PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO

DE MÉDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA

TEMA

ESTUDIO DE TOXICIDAD EN LOTES DE VENENOS DE

SERPIENTES Bothrops DE MÁS DE UN AÑO DE

ALMACENAMIENTO

AUTOR

LUIS ALFREDO VERA ARTEAGA

DIRECTOR

DR. SANTIAGO RANGEL BAJAÑA MSc.

GUAYAQUIL-ECUADOR

2011 – 2012

ii

TEMA:

ESTUDIO DE TOXICIDAD EN LOTES DE VENENOS DE SERPIENTES

Bothrops DE MÁS DE UN ANO DE ALMACENAMIENTO

AUTOR


TESIS

PRESENTADA AL H. CONSEJO DIRECTIVO COMO

TULO DE:

DICO VETERINARIO ZOOTECNISTA

N DESIGNADO POR EL

H. CONSEJO DIRECTIVO DE LA FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA

Y ZOOTECNIA, DAMOS

N DE_______ ( ) EQUIVALENTE A ________ ( )

__________________________

Dr. Santiago Rangel Bajaña MSc.

DIRECTOR DE TESIS

_______________________ ___________________

Biolg. Antonio Freire Lascano Dr. Mauro Loor Macías

EXAMINADOR PRINCIPAL EXAMINADOR PRINCIPAL

iii

Los datos escritos en esta investigación son de

Conocimiento y responsabilidad del autor.


iv

DEDICATORIA

A Dios y a Jesús por haberme dado

las fuerzas necesarias para continuar siempre

hacia adelante, por alejarme de todo lo malo

e impulsar mi vida para el bien ofreciéndome

cada día una nueva oportunidad.

A mis padres Tulio Vera Arteaga y

Carlota Arteaga Zambrano por darme el

apoyo, los consejos para mejorar como

persona y procurar mi bienestar en todo

momento, necesarios para llevar a cabo mis

metas. A mi esposa Leovy Viteri Andrade e

Hijos Luis Vera Viteri y Luciana Vera Viteri

por la alegría que siempre transmiten a mi

corazón, y a toda mi familia.

v

AGRADECIMIENTO

Mi más sincero agradecimiento a:

Al Dr. Santiago Rangel Bajaña MSc. Director de tesis, por su

ayuda durante el manejo experimental.

Al Biólg. Antonio Freire y al Dr. Mauro Loor, por su guía y

ayuda constante en el desarrollo te mi tesis.

Al Dr. Raúl Martínez, quien o or en el Instituto Nacional de

Higiene y edi in ropi “ eopo do zquiet érez”

A todos los Docentes de la Facultad de Medicina Veterinaria y

Zootecnia de la Universidad de Guayaquil, por impartir de forma

responsable y paciente sus conocimientos.

A mis amigos y compañeros, muchas gracias.

A todas las personas que de una forma u otra, han colaborado en

la culminación de este trabajo, para ellos mis más sinceros

agradecimientos.

vi

ÍNDICE GENERAL

CAPÍTULOS Pág.

I. OBJETIVOS………………………………………..…………..

3

II. REVISION DE LITERATURA……………………………..……..

4

III. HIP TISIS DE LA INVESTIGA I N………………………… 21

IV. ETODOLOG A……………..…………………………………...

V. RESULTADOS……………..……………………………………....

VI. DIS USI N………………………………………………………

VII. ON LUSIONES………………………………………………

VIII. RE O ENDA IONES………………………………………

IX. RESU EN……………………………………………………….

X. SU ARY…………………………………………………………

XI. I LIOGRAF A…………………………………………………

XII. ANEXOS…………………………………………………………

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43

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CONTENIDO

Portada…………………………………………………………………….. I

Aceptación del Tribunal de Sustentación……………………………….. Ii

DEDI ATORIA…………………………………………………………... Iii

AGRADE I IENTO……………………………………………………. Iv

INTRODU I N………………………………………..……………… 1

I. OBJETIVOS……………………………………………………………

1.1. OBJETIVO GENERAL…………………………………………..

3

3

. . O JETIVOS ESPE FI OS……………………………………..

II. REVISI N DE LITERATURA……………………………..……….

3

4

2.1. OFIDIOS OTHROPS……..……………………………………

2.1.1. GENERALIDADES…………………………………….

2.2. DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFI A…………..…………………

2.2.1. Hábitat en Ecuador……….……………………………

2.3. VENENO…………………………………………………..…….

2.3.1. Accidente Bothrópico…………………….…………….

2.3.2. Descripción del veneno…………..…………………….

2.3.3. Suero antiofídico y su producción……………..……..

2.3.4. Fraccionamiento del veneno……………………….….

.3.5. Determinación del peso molecular aparente………...

.3.6. Isoelectroenfoque………………………………………

.3.7. Actividad Hemolítica…………………………………..

.3.8. Actividad de fosfolipasa A ……………………………

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.3.9. itoxicidad………………………………………………

2.4. IN UNIZA I N EN ONEJOS…………..…………………

2.5. APLI A I N DE TRATA IENTO…………………………

2.5.1. Seguimiento del tratamiento…………………………….

2.5.2. Recolección de datos……………………………………

2.5.3. Evaluación de ensayos y de criterios de evaluación...

III. HIP TESIS DE LA INVESTIGA I N…………………………..

IV. ATERIALES Y TODOS……………………………………...

4.1. LOCALIZACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN……………

4.2. CONDICIONES METEOROLÓGI AS…………………..

4.3. ATERIALES…………...…………………………….……

4.3. . ateriales biológicos………………………………...

4.3.2. ateriales químicos………………………………….

4.3.3. Instrumental y equipos……………………………….

4.3.4. ateriales de vidrio………………………………….

4.3.5. aterial de oficina……………………………………

4.4. TODOS…..….................................................................

4.4.1. Recolección del veneno………………………………

4.4. . Pesaje del veneno…………………………………….

4.4.3. Pesaje de los ratones…………………………………

4.4.4. Obtención de la DL 50……………………………...

4.5. ANÁLISIS ESTAD STI O…………………………………

V. RESULTADOS……………..……………………………………........

4.1. VARIACIONES DE LA DOSIS LETAL MEDIA (DL 50)

DE ACUERDO AL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO

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5.1.1. Desviación estándar de la dosis letal (DL 50)……...

5.2. DOSIS LETAL MEDIA (DL 50) EN LOTES DE

VENENO DE SERPIENTES OTHROPS………………

5.2.1. Incremento porcentual de la dosis letal media (DL

50) prestablecida en lotes de veneno Bothrops por

especie……………………………………………….

VI. DIS USI N…………………………………………………………

VII. CON LUSIONES…………………………………………………

VIII. RE O ENDA IONES…………………………………………

IX. RESU EN…………………………………………………………

X. SU ARY……………………………………………………………

XI. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………

XII. ANEXOS………………………………………………………… 43

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1

INTRODUCCIÓN

Existen una gran familia de serpientes que su veneno tiene un alto grado de

toxicidad y poder de envenenamiento de gran magnitud, éste es el género Bothrops,

de las cuales se derivan muchas especies, la obtención de este es utilizado para la

preparación de los sueros antiofídicos.

Las serpientes venenosas del género Bothrops, son responsables de la

mayoría de los accidentes ofídicos registrados anualmente en toda Latinoamérica y

en Ecuador, los que se caracterizan por presentar hemorragia y necrosis local,

sangrado por coagulopatía de consumo, hipotensión, shock y muerte. Anualmente en

el mundo se presentan alrededor de 5.400.000 envenenamientos ofídicos, donde en

Latinoamérica se estiman 150.000 envenenamientos ofídicos anuales y 5.000

muertes por esta causa.

El accidente ocurre principalmente en áreas rurales donde la cobertura de

salud es deficitaria. Dado que una de las problemáticas más concurridas en los

cuadros clínicos producidos por mordeduras de serpientes es la diversa

sintomatología producida por los venenos, se hace evidente que puedan sufrir

grandes variaciones - aun en individuos de la misma especie - debido a factores

ambientales externos tales como: clima, altitud, humedad, tipo de presas disponibles,

entre otros; así como también otros factores internos: sexo, edad, ciclo hormonal,

nutrición, estado de salud y condiciones de bienestar - animales en cautiverio -

(Charry-Restrepo, 2007), lo cual reafirma que las variantes en la composición

química de estas sustancias son consecuencia del proceso de síntesis proteica a nivel

glandular y los mecanismos que controlan dicho proceso molecular (Russell, 1983;

Yarlequé, 2000).

Por consiguiente, se ha demostrado que existen variaciones en la composición

química de los venenos, las cuales están sujetas a factores biogeográficos y

climáticos, además de los específicos, razón por la cual, por ejemplo, los sueros

antiofídicos norteamericanos son ineficaces frente al veneno de serpientes

suramericanas y viceversa (Charry-Restrepo, 2007). Silva-Haad (1981) y

2

recientemente Otero, et al 2007 y (Charry-Restrepo 2007) reportan a las serpientes

del género Bothrops, como el agente agresor de mayor importancia médica, causante

del 95% de los accidentes ofídicos en la región amazónica.

Varios estudios sobre caracterización tóxica de venenos de serpientes se han

realizado en el mundo (Bush 1999, Health Organization, World 1981; Theakston &

Reid, 1983), sin embargo, solo se dispone de pocos estudios sobre actividades

enzimáticas y tóxicas del veneno de Bothrops atrox en Colombia (Núñez, 2005).

En la actualidad, los estudios de caracterización químico, molecular y de

actividades toxicas y electroforéticos en los venenos de serpientes, son necesarios

para el mejor entendimiento de los procesos bioquímico y fisiopatológicos que se

producen posterior a su mordedura, además de ayudar a evaluar el potencial

neutralizante de los sueros antiofídicos (Roodt, et al 2005).

Por lo antes mencionado se justifica la presente tesis, porque en la actualidad no

existen estudios relevantes que determinen la toxicidad de lotes de venenos ofídicos

en estado de caducidad, como es el caso de las serpientes del género Bothrops que

tengan más de un año de caducidad para la producción de sueros antiofídicos, y así

aportar de esta manera a dilucidar las interrogantes que se generan sobre la

efectividad de éste componente , ya que muchas veces el producto escasea y los

recursos para su fabricación no se encuentran disponibles con rapidez ante un tipo de

emergencia de ésta índole.

3

I. OBJETIVOS

1.1. OBJETIVO GENERAL:

Establecer toxicidad de los lotes de venenos de serpientes Bothrops de más

de un año de almacenamiento.

1.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

Determinar las variaciones de la dosis letal media (DL 50) en lotes de

venenos de serpientes Bothrops de acuerdo al tiempo de almacenamiento.

Establecer la dosis letal media (DL 50) en lotes de venenos de serpientes

Bothrops de acuerdo a la especie.

4

N DE LITERATURA

2.1. OFIDIOS DEL GÉNERO Bothrops

2.1.1. GENERALIDADES

Este género agrupa numerosas especies, distribuidas desde América del Sur,

toda América Central y el sur de América del Norte. Son todas serpientes

extremadamente agresivas y de un veneno muy potente. La mayoría de las especies

poseen veneno mixto (coagulante y proteolítico), cuya acción es muy rápida y el

accidentado siente los primeros síntomas a los pocos minutos.

Poseen una cola corta, generalmente roma. No poseen cascabel en la punta.

Subcaudales en una o dos hileras. Cabeza de forma triangular, hexagonal o

romboidal, bien diferenciada del cuello. Es achatada y ancha, con escamas carenadas.

Colmillos largos y huecos, que con la boca cerrada están paralelos al paladar.

El cuello es delgado al que le sigue un cuerpo grueso en su mitad, pesado y

rechoncho. A falta de cascabel, cuando están irritados, golpean la cola repetidamente,

de forma tan rápida que producen un ruido similar al de una varilla golpeando. Todas

las especies del género se caracterizan por tener todo su cuerpo revestido por

escamas lanceoladas y carenadas o aquilladas con o sin marca apical.

Se reproducen ovovivíparamente y suelen tener hasta 60 crías que apenas nacidas ya

tienen la agresividad y el potente veneno de los adultos.

Habitan zonas calurosas y húmedas, entre la leña, las hojas secas y los

matorrales. Son afectos a introducirse en las casas de los poblados que están situadas

en las zonas de ofidismo.

Se los considera como las verdaderas Víboras americanas. Reciben en

América varios nombres según el lugar donde habiten, Yararás, Víboras de fosa,

Cuatro narices, Yoperojobos, etc.

5

También a cada especie se la denomina de diferentes maneras. Como ser a la

Bothrops alternatus se la llama de las siguientes formas: Yarará guazú, Yarará

grande, Víbora de la cruz, Crucera, Yarará real, Mboí cuatiá, Quiririog, Viririog

acacurussú, etc. Esto hace que a veces sea muy confuso distinguir de que serpiente se

trata o se está hablando.

Se encuentra validado por ITIS "Integrated Taxonomic Information System".

Presenta treinta y seis especies:

Bothrops alcatraz

Bothrops alternatus

Bothrops ammodytoides

Bothrops andianus

Bothrops asper

Bothrops atrox

Bothrops barnetti

Bothrops brazili

Bothrops caribbaeus

Bothrops colombianus

Bothrops colombiensis

Bothrops cotiara

Bothrops doporus

Bothrops erythromelas

Bothrops fonsecai

Bothrops iglesiasi

Bothrops insularis

Bothrops itapetiningae

Bothrops jararaca

Bothrops jararacussu

Bothrops jonathani

Bothrops lanceolatus

Bothrops leucurus

Bothrops lojanus

Bothrops lutzi

http://www.serpientes-snakes.com.ar/superfamilias/bothrops_andianus.htm

http://www.serpientes-snakes.com.ar/superfamilias/bothrops_asper.htm

http://www.serpientes-snakes.com.ar/superfamilias/bothrops_atrox.htm

http://www.serpientes-snakes.com.ar/superfamilias/bothrops_barnetti.htm

http://www.serpientes-snakes.com.ar/superfamilias/bothrops_brazili.htm

http://www.serpientes-snakes.com.ar/superfamilias/bothrops_caribbaeus.htm

http://www.serpientes-snakes.com.ar/superfamilias/bothrops_colombianus.htm

http://www.serpientes-snakes.com.ar/superfamilias/bothrops_colombiensis.htm

http://www.serpientes-snakes.com.ar/superfamilias/bothrops_cotiara.htm

http://www.serpientes-snakes.com.ar/superfamilias/bothrops_diporus.htm

http://www.serpientes-snakes.com.ar/superfamilias/bothrops_erythromelas.htm

http://www.serpientes-snakes.com.ar/superfamilias/bothrops_fonsecai.htm

http://www.serpientes-snakes.com.ar/superfamilias/bothrops_iglesiasi.htm

http://www.serpientes-snakes.com.ar/superfamilias/bothrops_insularis.htm

http://www.serpientes-snakes.com.ar/superfamilias/bothrops_itapetiningae.htm

http://www.serpientes-snakes.com.ar/superfamilias/bothrops_jararaca.htm

http://www.serpientes-snakes.com.ar/superfamilias/bothrops_jararacussu.htm

http://www.serpientes-snakes.com.ar/superfamilias/bothrops_jonathani.htm

http://www.serpientes-snakes.com.ar/superfamilias/bothrops_lanceolatus.htm

http://www.serpientes-snakes.com.ar/superfamilias/bothrops_leucurus.htm

http://www.serpientes-snakes.com.ar/superfamilias/bothrops_lojanus.htm

http://www.serpientes-snakes.com.ar/superfamilias/bothrops_lutzi.htm

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Bothrops marajoensis

Bothrops mattogrossensis

Bothrops moojeni

Bothrops muriciensis

Bothrops neuwiedi

Bothrops pauloensis

Bothrops pictus

Bothrops pirajai

Bothrops pubescens

Bothrops sanctaecrucis

Bothrops venezuelensis

2.2. Bothrops asper

2.2.1. GENERALIDADES

Es una de las especies de serpientes con mayor dimorfismo sexual. Las

serpientes de ambos sexos nacen con el mismo tamaño, pero entre los 7 a 12 meses

de edad las hembras comienzan a crecer más rápidamente que los machos. En

general, los adultos miden entre 140-180 cm.

Los machos nunca alcanzan más de 195 cm de longitud, mientras que las

hembras tienen un tamaño promedio de 185 cm, con una longitud máxima

confirmada de 250 cm. Las hembras tienen cuerpos gruesos y las más grandes

pueden pesar hasta 6 kg, aunque se han reportado ejemplares de mayor peso. La

cabeza de las hembras es dos o tres veces más grandes que la de los machos en

proporción a su tamaño, y sus colmillos también son proporcionalmente más grandes

(típicamente 2,5 cm).

El patrón de color se asemeja al de B. atrox: rayas diagonales y diamantes de

varios tonos de marrón. La parte inferior de la cabeza es amarillo pálido. Las

serpientes recién nacidas son de color más brillante y los machos juveniles tienen la

punta de la cola amarilla.

http://www.serpientes-snakes.com.ar/superfamilias/bothrops_marajoensis.htm

http://www.serpientes-snakes.com.ar/superfamilias/bothrops_mattogrossensis.htm

http://www.serpientes-snakes.com.ar/superfamilias/bothrops_moojeni.htm

http://www.serpientes-snakes.com.ar/superfamilias/bothrops_muriciensis.htm

http://www.serpientes-snakes.com.ar/superfamilias/bothrops_neuwiedi.htm

http://www.serpientes-snakes.com.ar/superfamilias/bothrops_pauloensis.htm

http://www.serpientes-snakes.com.ar/superfamilias/bothrops_pictus.htm

http://www.serpientes-snakes.com.ar/superfamilias/bothrops_pirajai.htm

http://www.serpientes-snakes.com.ar/superfamilias/bothrops_pubescens.htm

http://www.serpientes-snakes.com.ar/superfamilias/bothrops_sanctaecrucis.htm

http://www.serpientes-snakes.com.ar/superfamilias/bothrops_venezuelensis.htm

7

A cada lado de la cabeza tiene una foseta loreal ubicada entre el ojo y el

hocico, que sirve para detectar presas que emiten radiación infrarroja. La foseta

loreal es una característica compartida con las demás víboras de foseta.

2.2.2. DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA

Se encuentra en las tierras bajas del Atlántico del este de México y América

Central, incluyendo Guatemala, Bélice, Honduras, Nicaragua, Costa Rica y Panamá.

Existe una población aislada en el sureste de Chiapas (México) y el suroeste de

Guatemala. En el norte de Sudamérica se encuentra en Colombia, Ecuador y

Venezuela. La localidad tipo dado es "Obispo", en el Istmo de Darién (Panamá).

Bothrops asper es una especie que vive principalmente en tierras bajas. En

México y América Central se encuentra desde el nivel del mar hasta una altitud de

1.200-1.300 m. En América del Sur, al parecer, su ocurrencia altitudional varía

considerablemente e incluye zonas más elevadas: hasta 2.500 m en Venezuela, y por

lo menos 2.640 m en Colombia. (Lancini, 1979).

2.2.3. HÁBITAT EN ECUADOR

De acuerdo con Campbell y Lamar (2004), su área de distribución en Ecuador

se extiende hasta la costa del Pacífico en provincia de El Oro, la zona de Vilcabamba

y el valle del río Catamayo (Lascano Freire y Kuch, 1994 Schätti, y Kramer, 1993).

Hay también algunos registros en la costa norte de Perú en la región de Tumbes.

También es conocida en la isla Gorgona en Colombia.

B. asper ocurre a lo largo de los valles interandinos de Colombia, la llanura

costera del Caribe por el centro norte de Venezuela del Orinoco, hacia el este hasta el

Delta Amacuro. Es la única especie de Bothrops que existe en la isla de Trinidad,

aunque la situación es complicada debido a la proximidad de Trinidad y la Delta del

Orinoco, que puede resultar en especiación simpátrica de B. atrox.

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2.2.4. VENENO

Esta especie es responsable de una parte importante de las mordeduras de

serpientes dentro de su área de distribución. Junto a la víbora de cascabel (Crotalus

durissus) es la principal causa de mordeduras de serpiente en Yucatán, México. En

Costa Rica es considerada la serpiente más peligrosa del país, responsable del 46%

de todas las mordeduras y el 30% de todos los casos hospitalizados; Antes de 1947 la

tasa de mortalidad fue del 7%, pero desde entonces se ha reducido a casi 0%

(Bolaños, 1984). En los departamentos Colombianos de Antioquia y Chocó causa un

50-70% de todas las mordeduras de serpientes con una tasa de secuelas de 6% y una

tasa de mortalidad de 5% (Otero et al., 1992).

En el estado de Lara, Venezuela, es responsable de 78% de todos los

envenenamientos y de todas las muertes por mordedura de serpiente. Una de las

razones porque tantas personas son mordidas por ésta especie es su asociación con

las habitaciones humanas donde viven sus presas comunes (ratas, ratones, lagartos).

Por lo tanto, muchas de las mordeduras ocurren en el interior de las casas.

Los accidentes ofídicos en el país registran una tendencia estable y que en

promedio es de 13.21 por 100.000 habitantes. Se reportan entre 1500 a 1600 casos

siendo las provincias del litoral como Los Ríos, Guayas, El Oro, Manabí y

Esmeraldas las que registran mayor número de casos y en la amazonía las provincias

con mayor problema epidemiológico son Morona Santiago, Orellana, Zamora

Chinchipe y Napo, cuyas tasa de incidencia son superiores a las observadas a nivel

nacional.

Esta especie es fácilmente irritable y tiene la reputación de ser agresiva. Es

considerada como más excitable e imprevisible que B. atrox. Su gran tamaño y su

hábito de levantar la parte superior de su cuerpo pueden dar lugar a mordeduras

arriba de las rodillas. También se ha observado que puede expulsar el veneno en

chorros finos desde las puntas de sus colmillos sobre una distancia de al menos 6 pies

(1,8 m).

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Los síntomas de mordedura incluyen dolor, supuración de las heridas

punzantes, inflamación local que puede aumentar durante 36 horas, moretones que se

extiende desde el lugar de la picadura, ampollas, entumecimiento, fiebre leve, dolor

de cabeza, sangrado de la nariz y las encías, hemoptisis, hemorragia gastrointestinal,

hematuria, hipotensión, náuseas, vómitos, alteración de la conciencia y sensibilidad

del bazo. En los casos no tratados, con frecuencia se produce necrosis local que

puede requerir la amputación. En 12 casos mortales la causa de la muerte fue

septicemia, hemorragia intracraneal, Insuficiencia renal aguda con hiperpotasemia y

acidosis metabólica y choque hemorrágico. (Nuñez, 2005)

2.3.1. ACCIDENTE BOTHRÓPICO:

Es causado por serpientes del género Bothrops, actualmente clasificado en

varios géneros. El veneno de estas serpientes por su alta concentración de factores

anti-coagulantes y mio-necrotizantes, tiene acción proteolítica, coagulante, citotóxica

y mio-necrotizante.

El cuadro clínico luego de 1 a 3 horas de la mordedura, dependiendo de la

cantidad de veneno inoculado, se caracteriza por presentar dolor intenso localizado,

edema firme progresivo, lesiones eritematosas con manchas rosáceas o cianóticas,

lesiones equimóticas y formación de flictenas en el sitio de la mordedura. Luego de

algunos días aparecen signos de necrosis superficial o profunda en la zona afectada y

en algunas ocasiones se puede apreciar necrosis total. Las manifestaciones

hemorrágicas son de diversa índole como: epistaxis, gingivorragias, hematemesis,

melenas, hemoptisis, hematuria y sangrado en otros órganos (hemorragia cerebral e

intraperitoneal), debido a la coagulación del fibrinógeno circulante lo cual depende

de la cantidad de veneno inoculado. (Charry-Restrepo, 2007).

2.3.2. DESCRIPCIÓN DEL VENENO

Durante los últimos años varios autores han hecho un aporte en cuanto a la

definición del veneno como es el caso de (Vidal 1976. Mebs 1989). Los venenos de

serpientes son las secreciones más ricas en enzimas y toxinas en la naturaleza y están

compuestos por múltiples moléculas tóxicas; los venenos de las serpientes que

10

pertenecen a la familia Viperidae tienen una composición química muy compleja,

con presencia de diversas toxinas y enzimas que afectan múltiples procesos

fisiológicos (Rojas et al. 2001).

Los envenenamientos provocados por estas serpientes se caracterizan por sus

efectos locales y manifestaciones sistémicas. Los primeros se caracterizan por la

aparición de edema, el cual constituye el efecto más común en envenenamientos por

serpientes de la familia Viperidae. (Lomonte 1994, Lomonte et al. 1993, Rojas et al.

2001).

Las investigaciones acerca de la composición química de los venenos de las

serpientes han demostrado que dichos fluidos biológicos son complejos

fundamentalmente proteicos cuya acción le permite al ofidio, inmovilizar a su presa,

causarle la muerte y producir la degradación de sus tejidos ( Yarlequé, 2000).

Los componentes de la ponzoña varían principalmente de acuerdo con la

especie pero existen otros factores que participan en la modificación del contenido

total, dando lugar a la producción masiva de uno o más tipos de proteína, a la

desaparición de alguno de ellos o a la aparición de un nuevo factor proteico (Russell,

1983), esto en base al estado fisiológico del animal, el nicho ecológico en el que

habita y el tipo de alimentación que tiene.

Un procedimiento idóneo para la caracterización de tales componentes, y por

lo tanto para el estudio de su acción biológica, es el uso de la técnica cromatográfica

en columna de filtración molecular y de intercambio iónico, lo cual permite separar

en base a la masa molecular o a la carga respectivamente, las proteínas contenidas en

el veneno. Así por ejemplo, la enzima similar a trombina del veneno de la serpiente

peruana Lachesis muta, “ husupe”, fue purificada mediante dos pasos sucesivos en

columna de filtración molecular Sephadex G-100 y una cromatografía de

intercambio aniónico en DEAE- celulosa (Yarlequé, 1989); en tanto que la

proteinasa 1 del mismo veneno fue aislada usando una cromatografía en Sephadex

G-100 y dos columnas sucesivas de intercambio iónico en DEAE-celulosa a pH 7.5

Y 8.2 respectivamente (Rodríguez, 1991).

11

En el mismo sentido, la fosfatasa alcalina y la fosfolipasa A detectadas en el

veneno de la serpiente coral Micrurus spixii fueron separadas utilizando Sephadex

G-100 y DEAE- Sephadex A-50 (Tu, 1977).

De acuerdo con ello el empleo de la filtración molecular permite fraccionar el

veneno y agrupar a las proteínas del mismo por sus pesos moleculares, de manera

que se puedan evaluar en cada grupo los componentes más representativos, que en

muchos venenos son las enzimas. La concentración y potencia de ellas puede ser

entonces examinada.

En el presente trabajo se ha utilizado la técnica cromatográfica de filtración

para purificar parcialmente cinco proteínas enzimáticas detectadas previamente en

los venenos crudos de tres especies venenosas, una de ellas B. oligolepis, B. pictus y

B. rogengheri.

2.3.3. SUERO ANTIOFÍDICO Y SU PRODUCCIÓN

El suero antiofídico es el antídoto o antiveneno que se aplica para

contrarrestar el efecto de los venenos por mordeduras de serpientes.

La producción de antivenenos por ejemplo involucra las siguientes etapas:

1) Obtención de veneno

La producción del suero polivalente inicia con la extracción del veneno de los

ejemplares pertenecientes a las especies Bothrops asper (terciopelo), Crotalus

durissus (Cascabel) y Lachesis muta (cascabel muda). Por su parte, la producción de

suero anti-coral inicia con la extracción de veneno de ejemplares pertenecientes a la

especie Micrurus nigrocinctus (coral).

Para conservar la estructura y la actividad de los diferentes componentes del

veneno, este es estabilizado mediante un proceso llamado liofilización, en el cual el

agua es sublimada y el veneno es recuperado como un polvo seco que puede ser

12

almacenado durante años sin descomponerse y que al ser disuelto en agua recupera

las propiedades que tenía el día de su extracción.

2) Obtención de plasma hiperínmune

Una vez que el veneno es liofilizado se emplea para preparar una serie de

inyecciones que son administradas a caballos por vía subcutánea. El sistema

inmunológico de los caballos reconoce a las proteínas del veneno como extrañas y

responde de una forma compleja que se caracteriza entre otras cosas por la

producción de gran cantidad de anticuerpos dirigidos contra los elementos del

veneno.

Posteriormente los caballos son sometidos a un proceso en el cual se les

extrae sangre en una cantidad que no compromete su salud. Luego de que la sangre

es colectada asépticamente en bolsas estériles que contienen un anticoagulante, se

deja reposar en refrigeración hasta que las células sanguíneas sedimentan y es

posible separar de ellas el plasma donde se encuentran los anticuerpos que

constituyen el principio activo de los antivenenos.

Para evitar que este proceso de sangría produzca cuadros de anemia en los

animales empleados, cada paquete de glóbulos rojos es resuspendido en solución

salina y retransfundido al caballo respectivo. Finalmente los caballos son enviados al

campo, donde descansan y se recuperan antes de ser empleados nuevamente.

3) Purificación de los anticuerpos

Los anticuerpos son purificados adicionando ácido caprílico al plasma,

mediante una técnica que fue adaptado a la aplicación industrial por investigadores

de en 1994. En esta, la mayoría de las proteínas presentes en el plasma que no tienen

actividad neutralizante sobre la toxicidad del veneno, como son la albúmina y el

fibrinógeno, son precipitadas y posteriormente removidas por una serie de

filtraciones. El producto resultante es una solución estéril de anticuerpos equinos que

es formulada a pH fisiológico con preservantes y otros excipientes.

13

Dependiendo de las necesidades de los usuarios, los diferentes lotes de suero

pueden ser envasados para ser distribuidos en su forma líquida, o bien pueden ser

liofilizados para ser distribuidos en su forma seca, la cual es más estable en

condiciones de almacenamiento menos exigentes, pero requiere ser disuelto antes de

su uso, lo que retrasa algunos minutos su administración. Al Ecuador llegan una serie

de sueros antiofídicos entre los que se encuentran el polivalente, antibotrópico el p.

anticoral, el p. antibotrópico crotálico, el polivante antiobotrópico laquético,

producidos en Costa Rica; el antibotropico crotálico de México. El antibotrópico

laquético crotálico producido en Brasil y antibotrópico producido en Ecuador.

2.3.4. FRACCIONAMIENTO DEL VENENO:

Para los ensayos, el veneno cristalizado (disecado), fue reconstituido con una

solución de acetato de sodio 50mM pH 3, centrifugándolo por 10 minutos a 3000

r.p.m. antes de su uso. 100 mg de veneno cristalizado de B. hyoprorus fueron

diluidos en 1mL de solución de acetato de sodio 50mM pH 3, centrifugado por 10

minutos a 3000 r.p.m. y aplicado a una columna de 90 x 1.8 cm de gel Sephadex G-

100 Superfino (Pharmacia, Suecia), calibrada y eluída a temperatura ambiente con

buffer acetato de amonio 0.2M pH 8.4 a flujo constante de 6.3 mL/ hora. Las

fracciones diluidas (2.1mL/tubo) se colectaron en un colector de fracciones y la

absorbancia a 280nm fue registrada espectrofotométricamente.

La filtración en Sephadex G-50 Fino se realizó en una columna de 100 x 1.0

cm de gel Sephadex G-50 Fino (Pharmacia, Suecia), calibrada y eluida a temperatura

ambiente con buffer bicarbonato de amonio 200 mM pH 8.4 a flujo constante de 6.0

mL/ hora. Las fracciones eluidas (2.0 mL/tubo) se recogieron en un colector de

fracciones, registrándose su absorbancia a 280 nm.

2.3.5. DETERMINACIÓN DEL PESO MOLECULAR APARENTE:

El peso molecular aparente de las fracciones fue estimado mediante filtración

en gel Sephadex y electroforesis en gel de poliacrilamida:

14

a) Luego de la filtración en columna de gel Sephadex G-100 s.f. se grafica el

logaritmo del peso molecular de las fracciones eluídas versus la constante de

distribución (Kav=Vi/Vo) de las fracciones y estándares proteicos de peso

molecular conocido: Azul de dextrano (2000 Kd, Pharmacia), Albúmina Sérica

Bovina (66 Kd, Sigma), Anhidrasa Carbónica (29 Kd, Sigma), Citocromo C

(12.4Kd, Sigma) y Aprotinina (6.5 Kd, Sigma).

b) Electroforesis en gel de Poliacrilamida en condiciones desnaturalizante S26

(SDS-PAGE). Se empleó geles verticales de SDS-PAGE al 14% en buffer Tris-

Glicina (0.25M-1.92M, SDS 1%) bajo corriente constante de 13 mA durante 5

horas. Se utilizó estándares similares a los descritos para la técnica de filtración

en gel.

2.3.6. ISOELECTRO ENFOQUE:

Para la determinación del punto isoeléctrico de las fracciones se utilizó la

metodología empleada por Berheimer, Weinstein y Linder. Para detectar la presencia

de la actividad de Fosfolipasa y su punto isoeléctrico se vertió sobre el gel una

suspensión de agarosa-yema de huevo la cual se gelifica y luego se incuba la placa a

50°C. El aclaramiento de la suspensión de yema de huevo, confirma la presencia de

Fosfolipasa.

2.3.7. ACTIVIDAD HEMOLÍTICA:

La actividad hemolítica del veneno fue ensayada en eritrocitos humanos

lavados obtenidos de donadores O Rh positivos y mantenidos en suspensión con

tampón glicina -NaCl (glicina 0.1 M en cloruro de sodio al 0.6%) a pH 5.8. La

actividad hemolítica directa e indirecta fue evaluada en tubo y en placa

respectivamente, por los métodos siguientes:

a) Hemólisis en tubo

En forma similar al utilizado por Martínez, Bonilla & Zavaleta (1989) para

veneno de B. barnetti, determinando la cantidad de hemoglobina liberada mediante

15

la técnica de la cianometahemoglobina que emplea el reactivo de Drabkin. La

actividad hemolítica se expresó como Unidad Específica de Hemólisis Directa

(U.E.H.D,) o Indirecta (U.E.H.I.) según sea el caso:

UEHD = % de Hemólisis directa

mg Proteína

UEHI = % de Hemólisis indirecta

mg Proteína

% Hemólisis = __ HL___

HT x 100

Donde : HL = Hb liberada por tratamiento

HT = Hb Total (con Tritón X-100)

i. Hemólisis directa en tubos conteniendo 0.2 mL de eritrocitos lavados y 1.6 ml

de buffer glicina-NaCl a los que se adicionó en un ensayo típico, 0.2 ml de

solución de veneno (9.4-564 µg/ml), y se incubó por 20 minutos a 37°C, luego de

los cuales se procedió a centrifugar la suspensión a 1000 r.p.m. durante 20

minutos, cuantificándose la hemoglobina liberada en el sobrenadante. El efecto

del tiempo de incubación sobre la hemólisis directa fue estudiado para tiempos de

incubación de hasta 2 horas.

ii. Hemólisis indirecta (método de Grassmann y Hanning . Una mezcla de veneno

(0.5 mL, 18.8-94 µg/mL) y 0.5 mL de suspensión de yema de huevo al 6.4% en

buffer Tris-HCl 50 mM pH 7.5 se preincuban a 37°C durante 30 minutos, 0.2 mL

del hidrolizado obtenido es ensayado en el sistema de hemólisis indirecta

incubando la mezcla a 37°C por 1 hora, al cabo de los cuales se centrifuga la

mezcla y se mide la hemoglobina liberada en el sobrenadante. El efecto del

tiempo de incubación sobre la hemólisis indirecta fue estudiado para, tiempos de

incubación de 30 minutos a 2 horas.

16

b) Hemólisis en placa de agar

i. Hemólisis directa en placa: Las placas se preparan mezclando partes iguales de

agar SIGMA tipo I de baja electroendósmosis al 1% y agar DIFCO de alta

electroendósmosis al 1% preparados en buffer acetato de sodio 0.05 M a pH 7.5 y

adicionando 2 ml de eritrocitos lavados a 40°C.

Luego de homogenizar la mezcla, se reparte en placas de vidrio de 10 x 10 cm, y

luego de la gelificación se practican agujeros de 3 mm de diámetro en el gel para

adicionar el veneno (9.4-94 µg/ml). Las placas conteniendo veneno y control

salino, se incubaron a 37°C, por períodos variables de tiempo (0-120 minutos),

midiéndose a continuación el diámetro (mm) del halo producido con un Vernier.

ii. Hemólisis indirecta en placa: Se empleó el método de agar yema de huevo-

eritocitos modificado por Da Silva, preparada agregando 1ml de suspensión de

yema de huevo al 85% en acetato de amonio 100 mM pH 7.4 al agar base a 50°C,

y luego de llevar a temperatura de 45°C y se agregó 1 ml de eritrocitos lavados.

Procediéndose a homogenizar la mezcla, y repartirla en placas de vidrio de 10 x

10 cm. Se deja gelificar y se practicaron agujeros de 3 mm de diámetro en el gel,

para adicionar el veneno (9.4-94 µg/ml). Las placas conteniendo veneno y control

salino, se incubaron a 37°C, por períodos variables de tiempo (15-120 minutos),

midiéndose a continuación con un Vernier, el diámetro (mm) del halo.

La actividad hemolítica directa e indirecta en placa se expresa como Unidad

Hemolítica Directa (UHD) ó Indirecta (UHI) según sea el caso:

UHD = Diámetro de Hemólisis directa (mm)

hora x mg .de Proteína

UHI = Diámetro de Hemolisis indirecta (mm)

hora x mg .de Proteína

17

2.3.8. ACTIVIDAD DE FOSFOLIPASA A2:

La actividad es determinada por la disminución de la turbidez de una

suspensión de yema de huevo por acción de la Fosfolipasa sobre la lecitina de la

yema, cuantificada a 925 nm.

La actividad fosfolipásica se evaluó en dos sistemas: en tubo y en placa.

a) En tubo (método turbidimétrico de Marinetti) . Se incubó 100µL de veneno

(18.8-94 µg/mL) con 200 µl, de una suspensión de yema de huevo al 5% (60 a

70% de lecitina correspondientes a 0.6 unidades de absorbancia a 925 nm) en

buffer Tris-HCI 50 mM a pH 7.5 y 800 µL de NaCl 0.85%. Se estudió el efecto

del tiempo de incubación (0 a 2 horas), sobre la actividad fosfolipásica del

veneno. Una Unidad de actividad específica de Fosfolipasa (UEF), se expresa

como la cantidad de enzima capaz de producir la disminución de la turbidez de la

mezcla en una miliunidad de absorbancia a 925 nm, por minuto.

UEF = ___ UF ___

mg de Proteína

Siendo:

UR = (Abs. 0'-Abs. 10') x 1000

tiempo (10 minutos)

UF corresponde a unidades de Fosfolipasa

b) En placa, se empleó el método de Habermann y Hardt [30] que mide la

formación de un halo claro producto de la hidrólisis de la lecitina por la

Fosfolipasa. La placa de agar yema de huevo es preparada agregando 1mL de

suspensión de yema de huevo al 85% en acetato de amonio 100 mM pH 7.4, al

agar base a 50°C. Luego se homogeniza la mezcla y se reparte en las placas.

Después de la gelificación se practican agujeros de 3 mm de diámetro para

adicionar el veneno (9.4-94 µg/ml) o salino como control.

18

Las placas conteniendo veneno y control salino, se incubaron a 37°C, por

períodos variables de tiempo (15-120 minutos), midiéndose a continuación con un

Vernier, el diámetro (mm) del halo. La enzima Fosfolipasa A de Páncreas Porcino

(SIGMA P-6534) con actividad de 14500 unidades/mL (Una unidad hidroliza

1uM de L-a-fosfatidilcolina de soya hasta L-a-lisofosfatidilcolina y ácido graso

por minuto a pH 8.0 y 37°C fue empleada como estándar.

Para la evaluación de los resultados en placa se aplicó análisis de regresión

lineal, considerándose como válidas aquellas concentraciones en donde el

coeficiente de regresión r fue igual o superior a 0.99. Una unidad de actividad

fosfolipásica (UF) en placa se expresa como la cantidad de proteína capaz de lisar

1 mm. de gel en 1 hora de incubación y se determino mediante la fórmula:

UF = Diámetro de Hidrólisis (mm) x hora

mg de Proteína

2.3.9. CITOTOXICIDAD

La acción citotóxica del veneno de B. hyoprorus se estudió en macrófagos

peritoneales de ratón de la cepa BALB/c extraídos inoculando 3 ml de MEM (Medio

Esencial Mínimo) en la cavidad peritoneal. El líquido peritoneal es extraído y los

macrófagos se adhieren en laminillas cubreobjetos las que son posteriormente

mantenidas en MEM con Suero Fetal Bovino al 13% e incubadas en atmósfera

húmeda a 37°C y 5% de CO2 hasta su uso.

El efecto citotóxico, se determinó observando al microscopio de fluorescencia

las laminillas previamente tratadas con 3 ml de NaCl 0.85% conteniendo 10 ug/ml de

diacetato de Fluoresceina, 120 µg/ml de Bromuro de etidio y 20ug/ml de Naranja de

acridina, a 24°C. Las células vivas se colorean de verde y las muertas lo hacen de

color rojo, tomándose como parámetro cualitativo de observación: Leve (redondeo

celular, +), Moderado (desprendimiento celular, ++) y Severo, (muerte celular, +++).

Para la evaluación de la citotoxicidad directa, se incubaron durante 15 minutos

los macrófagos con MEM conteniendo veneno o fracción (50-100µg/mL), y para la

19

citotoxicidad mediada por sustrato, se incubaron por 15 minutos en MEM los

macrófagos, el veneno o fracción (50-100mg/mL) y 0.5mL de suspensión de yema

de huevo al 6% en NaCl 0.85%. Para la evaluación de la citotoxicidad indirecta, se

preincubó MEM conteniendo veneno o fracción (50-100 mg/mL) y 0.5 mL de

suspensión de yema de huevo al 6% en NaCl 0.85% por 30minutos a 50°C; Luego la

mezcla fue agregada a los macrófagos e incubados por 15 minutos.

2.4. INMUNIZACIÓN EN CONEJOS:

Se inmunizaron dos conejos Nueva Zelanda (machos de 1.5 Kg), empleando

dosis de 0.1 ml de veneno (10mg/ml), según el esquema mostrado en la Tabla 1.

TABLA N° 1 Esquema de inmunización para veneno de B. hyoprorus y sus

fracciones en conejos.

Dosis Día de

inmunización

Veneno o fracción

(ml)

NaCl 0.85%

(ml)

Adyuvante de

Freund (ml)

1

2

3

4

Sangría

1

5

9

13

22

0.1

0.1

0.1

0.1

tt

-----

-----

-----

0.5

tt

0.5 (completo)

0.5 (incompleto)

0.5 (completo)

----

tt

La presencia o ausencia de anticuerpos en el suero de conejo inoculado con

veneno fue evaluada empleando la técnica de inmunodifusión radial en gel de

Ouchterlony. Para la inmunodifusión se empleó Agarosa Tipo II-Low (Sigma) al 1%

en buffer barbital (Sigma) a pH 8.6 con un diseño de un pozo central y 6 periféricos

equidistantes. En el pozo central se colocó el suero obtenido experimentalmente ó el

suero comercial antibotrópico polivalente nacional (INS/MINSA, Perú) y en los

restantes, el veneno control y las fracciones obtenidas de la purificación dejándose

difundir las muestras durante 48 horas a 4°C. A continuación las placas se tiñeron

con 0.1% Coomassie Blue 250-R (Sigma), y se decoloró en una solución 5:5:2 (v/v)

de metanol, agua destilada y ácido acético glacial.

20

2.5. APLICACIÓN DE TRATAMIENTO

Una vez inoculado el veneno se dejará pasar de 2 a 3 horas, puesto que es el

tiempo aproximado mínimo en que el paciente recibe atención, ya que si se aplica

tratamiento inmediato, influenciará en los resultados, se necesita dejar tiempo para

que actúe el veneno.

2.5.1. SEGUIMIENTO DEL TRATAMIENTO

Se hace un seguimiento intensivo por 36 horas posteriores a la inoculación del

veneno, observando signos y síntomas.

2.5.2. RECOLECCIÓN DE DATOS

Se recogen en cartillas de apuntes y en las tablas respectivas y básicamente re

refiere a síntomas y signos clínicos.

2.5.3. EVALUACIÓN DE ENSAYOS Y DE CRITERIOS DE EVALUACIÓN

Se determinarán los parámetros y frecuencia de los criterios de evaluación, las

cuales no se presentan en el presente informe, se las reserva para una vez sustentada

la tesis y se obtengan todos los datos pertinentes para su comprobación. Los métodos

se refieren básicamente al estadístico en la representación de gráficos, tablas y

curvas.

21

III. HIPÓTESIS DE LA INVESTIGACIÓN

Hi.- los lotes de venenos de más de un año de almacenamiento no son aptos

para la elaboración de sueros antiofídicos.

Ho.- los lotes de venenos de más de un año de almacenamiento son aptos

para la elaboración de sueros antiofídicos.

22

IV TODOS

4.1. LOCALIZACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN

Los ensayos se realizaron en el serpentario de los laboratorios de salud animal del

Instituto Nacional de Higiene y Medicina Tropical ´´Leopoldo Izquieta Pérez´´

Dirección: Av. De las Américas y Juan Tanca Marengo

Parroquia: Tarqui

Cantón: Guayaquil

Provincia: Guayas

Republica: Ecuador -Sur-América.

4.1.1. COORDENADAS:

Latitud Sur 02 ongitud este

4.2. CONDICIONES METEOROLÓGICAS

- Altura promedio: 4 m.s.n.m.

- Precipitación pluvial: 900 – 1000 mm / ano

- Características meteorológicas:

- Humedad atmosférica: 75%

- Temperatura máxima absoluta: 36 ºC

- Temperatura media anual: 25 ºC

- Temperatura mínima absoluta: 18 ºC

- Evaporación: 120 – 150 mm / mes.

Fuente: INOCAR

23

4.3. MATERIALES

4.3.1. MATERIALES BIOLÓGICOS

- Lotes de veneno Bothrópico desecado y cristalizado.

- Ratones blancos de 16 – 18 g.

4.3.2. MATERIALES QUÍMICOS

- Alcohol

- Solución salina fisiológica.

4.3.3. INTRUMENTAL Y EQUIPOS

- Balanza gramera

- Balanza de precisión de tres dígitos

- Cajas plásticas para ratones

- bebederos

- Aserrín o Viruta

- Alimento balanceado

- Algodón

- Espátula

- Mandil

- Guantes

- Mascarillas

- Gorros

- Jeringuillas descartables de 1 ml

4.3.4. MATERIALES DE VIDRIO

- Pipetas de 10 – 5 – 1 ml

- frasco de vidrio de 50 ml

- Campana al vacío

24

4.3.5. MATERIAL DE OFICINA.

- Computadora

- Cuaderno de Apunte

- Esferográficos

- Calculadora

- Regla transparente de 30 cm

- Hojas semi logarítmicas

4.4. TODOS

En esta investigación se utilizaron 15 lotes de venenos Bothrópicos de las

especies B. asper, B. atrox y B. xanthogramma con más de un ano de

almacenamiento y ratones albinos de 3 – 4 semanas de edad de un peso de 16 – 18 g,

para poder establecer la dosis letal media (DL 50), de acuerdo a la siguiente

metodología de trabajo, denominada prueba de titulación en ratones.

4.4.1. RECOLECCIÓN DEL VENENO

Se obtiene de lotes de veneno de más de un año de almacenamiento, los cuales

se encuentran desecados al vacío y almacenados al medio ambiente en el serpentario

de nstituto ion de Higiene y edi in ropi “ eopo do zquiet érez”

4.4.2. PESAJE DEL VENENO

El veneno se lo pesó en una balanza de precisión de tres dígitos y se lo

procedió a colocar en frasco de vidrio x 50 ml previamente identificado.

4.4.3. PESAJE DE LOS RATONES

Los ratones se los pesan en una balanza gramera, deben de tener un peso de 16-

18 g y se los coloca en una caja plástica con sus respectivos bebederos y balanceados

25

4.4.4. OBTENCIÓN DE LA DL 50

Para la determinación de la DL 50 se procede de la siguiente manera:

1. Al veneno seco se lo disuelve en una solución salina fisiológica al 0,89% que

contenga 1000 µg de veneno por cada ml.

2. Se prepara 5 ml de la solución que contiene la cantidad de veneno en µg

necesaria para inocular a 10 ratones.

3. Una vez que hemos realizado las diluciones con las diferentes concentraciones de

veneno, procederemos a la inoculación por vía intraperitoneal 0,5 ml.

4. Los ratones se los deja con suficiente agua y comida en sus cajas debidamente

identificadas y se observaron hasta 48 horas, anotando los muertos durante este

periodo.

5. Finalmente calculamos la DL 50 por método gráfico directo, en base a porcentaje

de mortalidad y próbito.

En los ensayos previos a la dosificación de la DL 50 de una toxina o veneno, debe

calcularse el porcentaje de mortalidad que corresponde a cada una de las dosis

empleadas en el experimento. Se empleó la tabla para obtener los próbitos con el fin

de transformar una curva sigmoide en una línea recta para cada porcentaje de

mortalidad, debiendo buscar el próbito correspondiente de acuerdo a la cantidad de

animales usados por dosis inoculadas.

Con estos datos trazamos un gráfico en una hoja semilogarítmica, colocando en la

escala logarítmica la dosis inoculada y en la escala milimétrica el próbito

correspondiente. Trazando la línea recta que se adapte lo mejor posible a los puntos

encontrados, debe calcularse la DL 50, proyectando la dosis que corresponde al

próbito 5 (50%) de mortalidad, que indica donde esta la DL 50 correspondiente.

4.5. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Para el análisis estadístico de los resultados obtenidos, se determinó la desviación

estándar de los lotes de venenos analizados, bajo la siguiente formula:

26

V. RESULTADOS

De los 15 lotes de venenos Bothrópicos analizados, se determinó las variaciones de

la dosis letal media (DL 50) de acuerdo al tiempo de almacenamiento; y se estableció

la dosis letal media (DL 50) de acuerdo al género de las serpientes bajo estudio.

5.1 VARIACIONES DE LA DOSIS LETAL MEDIA (DL 50) DE

ACUERDO AL TIEMPO DE ALMACENAMIENTO

Las variaciones de la dosis letal de acuerdo al tiempo de almacenamiento, están

representadas por la desviación estándar global, por género y por año

almacenamiento. De igual manera se específica el porcentaje de incremento anual de

cada uno de los lotes de venenos analizados.

5.1.1 DESVIACION ESTÁNDAR DE LA DOSIS LETAL (DL50)

Según el periodo de 7 años de almacenamiento de los lotes de venenos analizados, se

encontró una desviación estándar global de ±15,26 µg (Gráfico 1), para la dosis letal

(DL 50). De acuerdo a la especie la desviación estándar para el B. asper es de ±9,79

µg, para el B. atrox ±4,07 µg y para el B. xanthogramma ±21,42 µg. (Gráfico 1).

Las fluctuaciones de acuerdo a la especie de serpientes bajo estudio varían,

mostrándose así para el género Bothrops asper una desviación de ±9,79 µg (Gráfico

2), en el género Bothrops atrox ±4,07 µg (Gráfico 3), y para el género Bothrops

xanthogramma ±21,42 µg. Los resultados muestran claramente que el mayor

porcentaje de desviación se encuentra en la especie B. xanthogramma y el menor

corresponde a B. atrox (Gráfico 4).

Los valores más altos de desviación de acuerdo a los años de almacenamiento se

registran en el género B. xanthogramma con ±16,22 µg, ±16,78 µg y ±19,47 µg a

los 5, 4 y 3 años de almacenamiento respectivamente (Gráfico 2).

27

Consecuentemente la tendencia mínima de desviación para la dosis letal (DL 50) se

presenta el género B. atrox, con ±6,27 µg a los 5 años, ±7,83 µg a los 4 años y ±5,66

µg a los 3 años de almacenamiento. (Grafico 2). El cuadro 1 y 2 muestran la

desviación estándar en la dosis letal de los lotes de veneno por género y por años de

almacenamiento.

CUADRO 1. DESVIACIÓN ESTÁNDAR DE LA DOSIS LETAL EN LOTES

DE VENENOS DEL GÉNERO Bothrops

Especies N° de lotes Media Desviación Estándar

B. asper 5 98,00 µg ±9,79 µg

B. atrox 4 109,50 µg ±4,07 µg

B. xanthogramma 6 98,67 µg ±21,42 µg

Global 101,30 µg ±15,26 µg

GRÁFICO 1. DESVIACIÓN ESTÁNDAR DE LA DOSIS LETAL EN LOTES

DE VENENOS DEL GÉNERO Bothrops

28

CUADRO 2. DESVIA I N ESTÁNDAR DE LA DOSIS LETAL EN LOTES

DE VENENO DEL GÉNERO Bothrops POR AÑOS DE

ALMACENAMIENTO

Años de

almacenamiento

Desviación Estándar

B. asper B. atrox B. xanthogramma

5 años 10,91 µg 6,27 µg 16,22 µg

4 años 11,63 µg 7,83 µg 16,78 µg

3 años 14,09 µg 5,66 µg 19,47 µg

GRÁFI O . DESVIA I N ESTÁNDAR DE LA DOSIS LETAL EN LOTES

DE VENENO DEL GENERO Bothrops POR AÑOS DE

ALMACENAMIENTO

5.1.2 PORCENTAJE DE INCREMENTO DE LA DOSIS LETAL (DL 50)

POR AÑOS DE ALMACENAMIENTO

En el porcentaje de incremento de la dosis letal por año de almacenamiento, se puede

observar que los índices más altos a los 2 y 4 años, se presentan en B. asper con

82,5%, y 62,5% respectivamente. A los 3 y 7 años de almacenamiento los mayores

incrementos corresponden a B. xanthogramma con 53,7% y 144,3% en su orden. Y

29

a los 5 y 6 años los porcentajes más elevados se encuentran en B. atrox con 39,1% y

91,5% (Gráfico3). El cuadro 3 muestra los valores correspondientes al incremento de

dosis letal por año almacenamiento.

CUADRO 3. INCREMENTO DE LA DOSIS LETAL EN LOTES DE VENENO

DEL GÉNERO Bothrops POR AÑOS DE ALMACENAMIENTO

Género Años de almacenamiento

2 años 3 años 4 años 5 años 6 años 7 años

B. asper 82,5% 42,2% 62,5% 16,7%

112,2%

B. atrox

31,6% 49,3% 39,1% 91,5%

B. xanthogramma 4,4% 53,7% 41,7% 11,0% 58,3% 144,3%

30

GRÁFICO 3. INCREMENTO DE LA DOSIS LETAL EN LOTES DE VENENO DEL GÉNERO Bothrops POR AÑOS DE

ALMACENAMIENTO

31

5.2 DOSIS LETAL MEDIA (DL 50) EN LOTES DE VENENO DE

SERPIENTES Bothrops

Se determinó la dosis letal media en 15 lotes de veneno Bothrops, y a la vez se

calculó el incremento porcentual para B. asper, atrox y xanthogramma, de cada

dosis prestablecida para los resultados obtenidos en las dos pruebas bajo estudio. Las

tendencias de incremento varían de acuerdo a la especie y a la cantidad de veneno.

5.2.1 INCREMENTO PORCENTUAL DE LA DOSIS LETAL MEDIA (DL

50) PREESTABLECIDA EN LOTES DE VENENO Bothrops POR

ESPECIE

El incremento porcentual de la dosis letal media en los 5 lotes analizados de B.

asper, determinó que la DL 78 µg presenta el menor índice porcentual, con valores

de 17,95% y 15,38% en las 2 pruebas realizadas. Por otra parte el mayor aumento de

porcentajes se encontró en la DL 45 con el 117,78% y 106,67% en las pruebas

correspondientes, lo que demuestra una tendencia de duplicación de la frecuencia de

la dosis establecida. (Gráfico 4). El cuadro 4 muestra el incremento porcentual de las

dosis letales establecidas en los 5 lotes de veneno B. asper bajo estudio.

Para B. atrox se determinó que el mayor incremento porcentual en los 4 lotes

analizados se encuentra en la dosis letal (50) 59 µg con el 89,8% y 93,2%, donde la

dosis calculada supera la establecida por encima de la mitad de la misma. El menor

ascenso en cambio, se presentó en la DL (50) 76 µg con el 36,8% y 26,3% (Gráfico

5). El cuadro 5 presenta el incremento porcentual de las dosis letales establecidas en

los 4 lotes de veneno B. atrox.

En B. xanthogramma se encontró que en los 6 lotes de venenos analizados la dosis

letal (50) 53 µg mostró los mayores índices porcentuales con el 145,3% y 143,4%,

duplicando la frecuencia de la dosis establecida y bordeando una mitad adicional de

la misma. Los menores incrementos se presentaron en la DL (50) 68 µg con

porcentajes de 2,9% y 5,9%. (Gráfico 6). El cuadro 6 presenta el incremento

porcentual de las dosis letales establecidas en los 6 lotes de veneno B.

xanthogramma.

32

CUADRO 4. INCREMENTO PORCENTUAL DE LAS DOSIS LETALES ESTABLECIDAS EN LOTES DE VENENO B.

asper

CUADRO 5. INCREMENTO PORCENTUAL DE LAS DOSIS LETALES ESTABLECIDAS EN LOTES DE VENENO B. atrox

CUADRO 6. INCREMENTO PORCENTUAL DE LAS DOSIS LETALES ESTABLECIDAS EN LOTES DE VENENO B.

xanthogramma

# Prueba DL (50) - 63 µg DL (50) - 64 µg DL (50) - 60µg DL (50) - 78µg DL (50) - 45µg

DL (50) Incremt. % DL (50) Incremt. % DL (50) Incremt. % DL (50) Incremt. % DL (50) Incremt. %

Prueba 1 114 µg 80,95% 88 µg 37,50% 102 µg 70,00% 92 µg 17,95% 98 µg 117,78%

Prueba 2 116 µg 84,13% 94 µg 46,88% 93 µg 55,00% 90 µg 15,38% 93 µg 106,67%

Media 115 µg 82,54% 91 µg 42,19% 97,5 µg 62,50% 91 µg 16,67% 95,5 µg 112,22%

# Prueba DL (50) - 76µg DL (50) - 75µg DL (50) - 78µg DL (50) - 59µg

DL (50) Incremt. % DL (50) Incremt. % DL (50) Incremt. % DL (50) Incremt. %

Prueba 1 104 µg 36,84% 114 µg 52,00% 110 µg 41,03% 92 µg 89,83%

Prueba 2 96 µg 26,32% 110 µg 46,67% 107 µg 37,18% 90 µg 93,22%

Media 100 µg 31,58% 112 µg 49,33% 108,5 µg 39,10% 91 µg 91,53%

#

Prueba

DL (50) - 68µg DL (50) - 68µg DL (50) - 72µg DL (50) - 68µg DL (50) - 72µg DL (50) - 53µg

DL (50) Incremt. % DL (50) Incremt. % DL (50) Incremt. % DL (50) Incremt. % DL (50) Incremt. % DL (50) Incremt. %

Prueba 1 70 µg 2,94% 102 µg 50,00% 102 µg 41,67% 76 µg 11,76% 116 µg 61,11% 130 µg 145,28%

Prueba 2 72 µg 5,88% 107 µg 57,35% 102 µg 41,67% 75 µg 10,29% 112 µg 55,56% 129 µg 143,40%

Media 71 µg 4,41% 104,5 53,68% 102 µg 41,67% 75,5 µg 11,03% 114 µg 58,33% 129,5 µg 144,34%

33

GRÁFICO 4. INCREMENTO PORCENTUAL DE LAS DOSIS LETALES

ESTABLECIDAS EN LOTES DE VENENO B. asper


ESTABLECIDAS EN LOTES DE VENENO B. atrox


ESTABLECIDAS EN LOTES DE VENENO B. xanthogramma

34

En la determinación de la dosis letal media mediante el estudio de la toxicidad, se

encontró que los 15 lotes de veneno Bothrops en las 2 pruebas realizadas, ninguno

presentó efectividad bajo la dosis prestablecida para la elaboración de sueros

antiofídicos. El cuadro 7 muestra los valores correspondientes a la dosis letal (DL50)

CUADRO 7. DOSIS LETAL MEDIA EN LOTES DE VENENO Bothrops

Lote Género

DL (50)

Registrada

Año de

Almacen.

N°

Prueba DL (50)

1 - LSas160104 B. asper 45 2004 1 98 µg

2 93 µg

2 - LSxt200104 B. xanthogramma 53 2004 1 130 µg

2 129 µg

3 - LSat240505 B. atrox 59 2005 1 112 µg

2 114 µg


2 112 µg

5 - LSas170106 B. asper 78 2006 1 92 µg

2 90 µg

6 - LSas170106 B. atrox 78 2006 1 110 µg

2 107 µg


2 75 µg

8 - LSas280807 B. asper 60 2007 1 102 µg

2 93 µg

9 - LSat300807 B. atrox 75 2007 1 114 µg

2 110 µg


2 102 µg

11 - LSas020908 B. asper 64 2008 1 88 µg

2 94 µg

12 - LSat210808 B. atrox 76 2008 1 104 µg

2 96 µg


2 107 µg

14 - LSas080909 B. asper 63 2009 1 114 µg

2 116 µg


2 72 µg

Media 101,3 µg

Desviación estándar 15,26 µg

35

VI. DISCUSIÓN

Actualmente no existen estudios relacionados con la Toxicidad en lotes de venenos

Bothrops con más de un año de almacenamiento. Sin embargo existen reportes en

Colombia donde se realizó un estudio químico y de toxicidad del veneno de serpientes

de la familia VIPERIDAE: Bothrops atrox mantenidas en cautiverio en el serpentario

de la Universidad de la Amazonía con lotes de veneno seco y fresco expulsado, donde

se registraron valores de 66,2 µg para B. asper y de 70,34 µg para B. atrox, cifras que

coinciden y se asemejan con las prestablecidas en los lotes de veneno analizados.

Similares reportes descritos en la misma investigación detallan desviaciones estándar en

B. asper ± 0.4, notablemente inferior a la encontrada en 3 años almacenamiento en los

lotes analizados de B. atrox con 5,66 µg.

En investigaciones realizadas en Perú reportan una dosis letal con una desviación ± 1,7

para B. atrox, igualmente inferior al reportado en la presente tesis. En México reportan

una desviación del ± 0,2 para B. asper la cual está muy por debajo a la establecida a 2

años de almacenamiento-

Por periodos de almacenamiento fue notorio que el menor alcance de desviación

correspondió a B. atrox, siendo la cifras reportadas un 30% de lo que presentaron B.

asper y B. xanthogramma.

Los porcentajes de incremento de la dosis letal por años de almacenamiento se

presentaron de forma irregular, probablemente debido al método de conservación y a la

cantidad de veneno utilizado en cada muestra, ya que las dosis preestablecidas fueron

diferentes para cada caso. La tendencia irregular de incremento porcentual fue similar

para las dosis establecidas para B. asper, atrox y xanthogramma. Los elevados desfases

en las muestras analizados, determinaron la ineficacia de los lotes de veneno

almacenados para la elaboración de sueros antiofídicos, y a pesar de ello, la especia de

B. xanthogramma presento el menor índice porcentual de incremento a partir de los 2

años de almacenamiento con una dosis letal prestablecida de 68 µg.

36

VII. CONCLUSIONES

En base a los resultados se plantean las siguientes conclusiones:

1. En 7 años de almacenamiento de lotes de venenos bothrops se encuentra una

desviación estándar global de ±15,26 µg

2. B. asper presenta una desviación estándar de ±9,79 µg, B. atrox una desviación de

±4,07 µg y B. xanthogramma de ±21,42 µg

3. Los valores más altos de desviación de acuerdo a los años de almacenamiento se

registran en el género B. xanthogramma con ±16,22 µg, ±16,78 µg y ±19,47 µg a

los 5, 4 y 3 años de almacenamiento respectivamente.

4. El porcentaje de incremento de la dosis letal por año de almacenamientose encuentra

a los 2 y 4 años, B. asper con 82,5%, y 62,5% respectivamente. A los 3 y 7 años de

almacenamiento en B. xanthogramma con 53,7% y 144,3%. Y a los 5 y 6 años en

B. atrox con 39,1% y 91,5%

5. El mayor incremento porcentual de la dosis letal prestablecida se encontró en DL

(50) 45 con el 117,78% y 106,67% en B. asper, en DL (50) 59 µg con el 89,8% y

93,2% en B. atrox, y en DL (50) 68 µg con porcentajes de 2,9% y 5,9% en B.

xanthogramma.

6. Los lotes de venenos de serpientes Bothrops no son efectivos para elaborar los

sueros antiofídicos con el mismo efecto potencial bajo la dosis letal prestablecida.

37

VIII. RECOMENDACIONES

Luego de la investigación efectuada se puede indicar las siguientes recomendaciones:

- Realizar un estudio comparativo de esquemas de inmunización con venenos

frescos y venenos con más de un año almacenamiento.

- Realizar investigaciones que profundicen en la determinación de dosis letal

media (DL 50) con la aplicación de diferentes métodos y pruebas que respalden

la información obtenida.

- Realizar análisis cada 6 meses para comprobar el estado de los lotes de veneno

y la efectividad de los mismos.

- Proponer protocolos de estandarización para métodos, pruebas, almacenamiento

y utilización de los lotes de venenos, para evitar el manejo incorrecto de los

productos ofídicos.

- Recomendamos el uso de los venenos con mas de una año de almacenamiento

para el iniciar el esquema de inmunización de los equinos a fin de evitar los

efectos tóxicos colaterales que producen los venenos frescos, posteriormente se

completaría la inmunización con venenos frescos.

38

IX. RESUMEN

n e serpent rio de os or torios de s ud nim de “ nstituto ion de Higiene

y edi in ropi “ eopo do zquierd érez” de iud d u y qui se re iz ron

os ens yos p r re iz r e “ studio de oxi id d en otes de enenos de erpientes

Bothrops de más de un ño de m en miento” proponiendo omo o jetivos:

determinar las variaciones de la dosis letal media (DL 50) en lotes de veneno de

serpientes Bothrops de acuerdo al tiempo de almacenamiento y, establecer la dosis letal

letal media (DL 50) en lotes de venenos serpientes Bothrops de acuerdo al género.

Tomando como variable independiente: las tres serpientes Bothrops bajo estudio (B.

asper, B. atrox y B. xanthogramma) , y como variable independiente: El estudio de la

dosis letal media (DL 50).

Al efectuar los análisis de toxicidad de los 15 lotes de venenos de serpientes Bothrops

se pudo determinar que en los 7 años de almacenamiento registrados de los lotes, se

encuentra un desviación estándar global de ±15,26 µg. B. asper presentó una desviación

estándar de ±9,79 µg, B. atrox una desviación de ±4,07 µg y B. xanthogramma de

±21,42 µg. Los valores más altos de desviación de acuerdo a los años de

almacenamiento se registran en el género B. xanthogramma con ±16,22 µg, ±16,78 µg

y ±19,47 µg a los 5, 4 y 3 años de almacenamiento respectivamente.

El porcentaje de incremento de la dosis letal por año de almacenamiento se encontró a

los 2 y 4 años, B. asper con 82,5%, y 62,5% respectivamente. A los 3 y 7 años de

almacenamiento en B. xanthogramma con 53,7% y 144,3%. Y a los 5 y 6 años en B.

atrox con 39,1% y 91,5%. El mayor incremento porcentual de la dosis letal

prestablecida se encontró en DL (50) 45 con el 117,78% y 106,67% en B. asper, en DL

(50) 59 µg con el 89,8% y 93,2% en B. atrox, y en DL (50) 68 µg con porcentajes de

2,9% y 5,9% en B. xanthogramma.

De los resultados obtenidos se pudo confirmar la hip tesis “los lotes de venenos de más

de un año de almacenamiento no son aptos para la elaboración de sueros antiofídicos”

Palabras clave: Bothrops, B. asper, b. atrox, b. xanthogramma, DL50.

X. SUMMARY

39

The snake of animal health laboratories "National Institute of Hygiene and Tropical

Medicine" Leopoldo Perez Left "city Guayaquil, trials were conducted for the" Lots

Toxicity Study in Bothrops snake venoms from more than one storage year ', proposing

objectives: determine variations of the median lethal dose (LD 50) in batches of

Bothrops snake venom according to storage time and establish the median lethal lethal

dose (LD 50) in lots of poisons Bothrops snakes by gender. Taking as an independent

variable: the three Bothrops snakes under study (B. asper, B. atrox and B.

xanthogramma), and as independent variables: The study of the median lethal dose (LD

50).

Upon analysis of cytotoxicity of the 15 batches of Bothrops snake venoms it was

determined that in the 7 years registered storage of lots, there is a global standard

deviation ± 15.26 mg. B. asper showed a standard deviation of ± 9.79 mg, B. atrox

deviation of ± 4.07 mg and B. xanthogramma of ± 21.42 g. Higher values of deviation

according to years of storage are recorded in the genus with ± 16.22 mg B.

xanthogramma, ± 16.78 ± 19.47 g and g at 5, 4 and 3 years of storage respectively.

The percentage increase of the dose lethal by year of storage was found at 2 and 4 years,

B. asper with 82.5% and 62.5% respectively. At 3 and 7 years of storage in B.

xanthogramma with 53.7% and 144.3%. And at 5 and 6 years in B. atrox with 39.1%

and 91.5%. The greatest percentage increase of the preset lethal dose was found in DL

(50) 45 to 106.67% 117.78% and in B. asper, in DL (50) 59 mg with 89.8% and 93.2%

in B. atrox, and DL (50) 68 mg with rates of 2.9% and 5.9% in B. xanthogramma.

The results obtained confirm the hypothesis could be "lots of poisons over a year of

storage are not suitable for the development of antivenom"

Keywords: Bothrops, B. asper, B. atrox, B. xanthogramma, DL50.

XI. BIBLIOGRAFÍA

40

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57

43

XII. ANEXOS

44

CUADRO # 1/1

PROTOCOLO DE DL50

Fecha: 23 de agosto del 2011

Nombre científico: Bothrops asper

Nombre común: Equis, equis rabo de hueso.

Lote de veneno: LSas170106 Cantidad de veneno usado: 25 mg.

DL50 INHMT: 78 µg.

Método: Directo

DL50: no se obtuvo por que no hubo 100% mortalidad

Observaciones: Se realizó la inoculación de las diferentes dosis de

venenos a ratones machos con un peso que oscilaba entre 16 – 18 g.

Veneno

inoculado I.P

# de

ratones

Mortalidad

24 H 48 H

V M V M

% de

Mortalidad

48 H

Próbito

50 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

70 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

80 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

90 µg 6 4 2 4 2 33,33% 4,57

100 µg 6 4 2 4 2 33,33% 4,57

Control 6 6 0 6 0 ----- -----

45

GRÁFICO # 1/1

GRÁFICO PARA TRANSFORMAR UNA CURVA SIGMOIDE DE

MORTALIDAD EN LINEA RECTA.

NOMBRE CIENTÍFICO: Bothrops asper

NOMBRE COMÚN: Equis, equis rabo de hueso.

LOTE DE VENENO: LSas170106

FECHA DE INOCULACIÓN: 23 de agosto del 2011

CANTIDAD TOTAL: 25 mg.

DL50: no se obtuvo por que no hubo 100% de

mortalidad

46

CUADRO # 1/2

PROTOCOLO DE DL50

Fecha: 12 de septiembre del 2011




DL50 INHMT: 78 µg.

Método: Directo

DL50: 92 µg.


venenos a ratones machos con un peso que oscilaba entre 16 – 18 g. En este

cuadro se repitió la prueba del cuadro # 1 aumentando la dosis para obtener

la DL50.

Veneno

inoculado I.P

# de

ratones

Mortalidad

24 H 48 H

V M V M

% de

Mortalidad

48 H

Próbito

60 µg 6 5 1 5 1 16,66% 4,06

80 µg 6 3 3 3 3 50% 5,01

100 µg 6 5 1 5 1 16,66% 4,57

120 µg 6 2 4 2 4 66,66% 5,45

140 µg 6 0 6 0 0 100% 8,5

160 µg 6 0 6 0 0 100% 8,5

Control 6 6 0 6 0 ----- -----

47

GRÁFICO # 1/2






FECHA DE INOCULACION: 12de septiembre del 2011


DL50: 92 µg.

48

CUADRO # 1/3

PROTOCOLO DE DL50

Fecha: 2 de abril del 2012




DL50 INHMT: 78 µg.

Método: Directo

DL50: 90 µg.




la DL50.

Veneno

inoculado I.P

# de

ratones

Mortalidad

24 H 48 H

V M V M

% de

Mortalidad

48 H

Próbito

60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

80 µg 6 3 3 3 3 50% 5,01

100 µg 6 3 3 3 3 50% 5,01

120 µg 6 2 4 2 4 66,66% 5,45

140 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

Control 6 6 0 6 0 ----- -----

49

GRÁFICO # 1/3






FECHA DE INOCULACION: 2 de mayo del 2012


\

DL50: 90 µg.

50

CUADRO # 2/1

PROTOCOLO DE DL50

Fecha: 30 de agosto del 2011

Nombre científico: Bothrops atrox

Nombre común: Pitalala, macanche.

Lote de veneno: LSat170106 Cantidad de veneno usado: 30 mg.

DL50 INHMT: 78 µg.

Método: Directo

DL50: no se obtuvo por que no hubo 100% mortalidad



Veneno

inoculado I.P

# de

ratones

Mortalidad

24 H 48 H

V M V M

% de

Mortalidad

48 H

Próbito

50 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

70 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

80 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

90 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

100 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

Control 6 6 0 6 0 ----- -----

51

GRÁFICO # 2/1



NOMBRE CIENTÍFICO: Bothrops atrox

NOMBRE COMÚN: Pitalala, macanche.

LOTE DE VENENO: LSat170106

FECHA DE INOCULACION: 30 de agosto del 2011


DL50: no se obtuvo por que no hubo 100% de

mortalidad

52

CUADRO # 2/2

PROTOCOLO DE DL50





DL50 INHMT: 78 µg.

Método: Directo

DL50: 110 µg.




la DL50.

Veneno

inoculado I.P

# de

ratones

Mortalidad

24 H 48 H

V M V M

% de

Mortalidad

48 H

Próbito

60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

80 µg 6 6 0 5 1 16,66% 4,06

100 µg 6 4 2 4 2 33,33% 4,57

120 µg 6 1 5 1 5 83,33% 5,97

140 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

160 µg 6 3 3 3 3 50% 5,01

Control 6 6 0 6 0 ----- -----

53

GRÁFICO # 2/2






FECHA DE INOCULACION: 19 de septiembre del 2011


DL50: 110 µg.

54

CUADRO # 2/3

PROTOCOLO DE DL50





DL50 INHMT: 78 µg.

Método: Directo

DL50: 107 µg.




la DL50.

Veneno

inoculado I.P

# de

ratones

Mortalidad

24 H 48 H

V M V M

% de

Mortalidad

48 H

Próbito

60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

80 µg 6 5 1 5 1 16,66% 4,06

100 µg 6 3 3 3 3 50% 5,01

120 µg 6 4 2 4 2 33,33% 4,57

140 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

Control 6 6 0 6 0 ----- -----

55

GRÁFICO # 2/3








DL50: 107 µg.

56

CUADRO # 3/1

PROTOCOLO DE DL50


Nombre científico: Bothrops xanthogramma

Nombre común: Equis pachona.

Lote de veneno: LSxt170106 Cantidad de veneno usado: 26 mg.

DL50 INHMT: 68 µg.

Método: Directo

DL50: 76 µg.



Veneno

inoculado I.P

# de

ratones

Mortalidad

24 H 48 H

V M V M

% de

Mortalidad

48 H

Próbito

50 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

70 µg 6 4 2 4 2 33,33% 4,57

80 µg 6 2 4 2 4 66,66% 5,45

90 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

100 µg 6 3 3 3 3 50% 5,01

Control 6 6 0 6 0 ----- -----

57

GRÁFICO # 3/1



NOMBRE CIENTÍFICO: Bothrops xanthogramma

NOMBRE COMÚN: Equis pachona.

LOTE DE VENENO: LSxt170106

FECHA DE INOCULACION: 06 de septiembre 2011


DL50: 76 µg.

58

CUADRO # 3/2

PROTOCOLO DE DL50





DL50 INHMT: 68 µg.

Método: Directo

DL50: 75 µg.



Veneno

inoculado I.P

# de

ratones

Mortalidad

24 H 48 H

V M V M

% de

Mortalidad

48 H

Próbito

50 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

70 µg 6 4 2 4 2 33,33% 4,57

80 µg 6 2 4 2 4 66,66% 5,45

90 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

100 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

Control 6 6 0 6 0 ----- -----

59

GRÁFICO # 3/2






FECHA DE INOCULACION: 26 de marzo del 2012


DL50: 75 µg.

60

CUADRO # 4/1

PROTOCOLO DE DL50





DL50 INHMT: 60 µg.

Método: Directo

DL50: 102 µg.



Veneno

inoculado I.P

# de

ratones

Mortalidad

24 H 48 H

V M V M

% de

Mortalidad

48 H

Próbito

60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

80 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

100 µg 6 1 5 1 5 83,33% 5,97

120 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

140 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

Control 6 6 0 6 0 ----- -----

61

GRÁFICO # 4/1






FECHA DE INOCULACIÓN: 26 de septiembre del 2011


DL50: 102 µg.

62

CUADRO # 4/2

PROTOCOLO DE DL50





DL50 INHMT: 60 µg.

Método: Directo

DL50: 93 µg.



Veneno

inoculado I.P

# de

ratones

Mortalidad

24 H 48 H

V M V M

% de

Mortalidad

48 H

Próbito

60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

80 µg 6 6 0 5 1 16,66% 4,06

100 µg 6 1 5 1 5 83,33% 5,97

120 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

140 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

Control 6 6 0 6 0 ----- -----

63

GRÁFICO # 4/2








DL50: 93 µg.

64

CUADRO # 5/1

PROTOCOLO DE DL50

Fecha: 11 de octubre del 2011




DL50 INHMT: 75 µg.

Método: Directo

DL50: 114 µg.



Veneno

inoculado I.P

# de

ratones

Mortalidad

24 H 48 H

V M V M

% de

Mortalidad

48 H

Próbito

60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

80 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

100 µg 6 2 4 2 4 66,66% 5,45

120 µg 6 5 1 4 2 33,33% 4,57

140 µg 6 2 4 2 4 66,66% 5,45

160 µg 6 2 4 0 6 100% 8,5

Control 6 6 0 6 0 ----- -----

65

GRÁFICO # 5/1






FECHA DE INOCULACION: 11 de octubre del 2011


DL50: 114 µg.

66

CUADRO # 5/2

PROTOCOLO DE DL50





DL50 INHMT: 75 µg.

Método: Directo

DL50: 110 µg.



Veneno

inoculado I.P

# de

ratones

Mortalidad

24 H 48 H

V M V M

% de

Mortalidad

48 H

Próbito

60 µg 6 5 1 5 1 16,66% 4,06

80 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

100 µg 6 3 3 3 3 50% 5,01

120 µg 6 5 1 4 2 33,33% 4,57

140 µg 6 2 4 2 4 66,66% 5,45

160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

Control 6 6 0 6 0 ----- -----

67

GRÁFICO # 5/2






FECHA DE INOCULACIÓN: 23 de abril del 2012


DL50: 110 µg.

68

CUADRO # 6/1

PROTOCOLO DE DL50





DL50 INHMT: 72 µg.

Método: Directo

DL50: 102 µg.



Veneno

inoculado I.P

# de

ratones

Mortalidad

24 H 48 H

V M V M

% de

Mortalidad

48 H

Próbito

60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

80 µg 6 5 1 5 1 16,,66% 4,06

100 µg 6 3 3 3 3 50% 5,01

120 µg 6 2 4 2 4 66,66% 5,45

140 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

Control 6 6 0 6 0 ----- -----

69

GRÁFICO # 6/1






FECHA DE INOCULACIÓN: 17 de octubre 2011


DL50: 102 µg.

70

CUADRO # 6/2

PROTOCOLO DE DL50





DL50 INHMT: 72 µg.

Método: Directo

DL50: 102 µg.



Veneno

inoculado I.P

# de

ratones

Mortalidad

24 H 48 H

V M V M

% de

Mortalidad

48 H

Próbito

60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

80 µg 6 5 1 5 1 16,,66% 4,06

100 µg 6 3 3 3 3 50% 5,01

120 µg 6 2 4 2 4 66,66% 5,45

140 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

Control 6 6 0 6 0 ----- -----

71

GRÁFICO # 6/2






FECHA DE INOCULACIÓN: 30 de abril del 2012


DL50: 102 µg.

72

CUADRO # 7/1

PROTOCOLO DE DL50





DL50 INHMT: 59 µg.

Método: Directo

DL50: 112 µg.



Veneno

inoculado I.P

# de

ratones

Mortalidad

24 H 48 H

V M V M

% de

Mortalidad

48 H

Próbito

60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

80 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

100 µg 6 5 1 5 1 16,66% 4,06

120 µg 6 5 1 5 1 16,66% 4,57

140 µg 6 2 4 2 4 66,66% 5,45

160 µg 6 2 4 0 6 100% 8,5

Control 6 6 0 6 0 ----- -----

73

GRÁFICO # 7/1






FECHA DE INOCULACIÓN: 24 de octubre del 2011


DL50: 112 µg.

74

CUADRO # 7/2

PROTOCOLO DE DL50

Fecha: 7 de mayo del 2012




DL50 INHMT: 59 µg.

Método: Directo

DL50: 114 µg.



Veneno

inoculado I.P

# de

ratones

Mortalidad

24 H 48 H

V M V M

% de

Mortalidad

48 H

Próbito

60 µg 6 6 0 5 1 16,66% 4,06

80 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

100 µg 6 4 2 4 2 33,33% 4,57

120 µg 6 5 1 5 1 16,66% 4,06

140 µg 6 2 4 2 4 66,66% 5,45

160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

Control 6 6 0 6 0 ----- -----

75

GRÁFICO # 7/2








DL50: 114 µg.

76

CUADRO # 8/1

PROTOCOLO DE DL50

Fecha: 7 de noviembre del 2011




DL50 INHMT: 72 µg.

Método: Directo

DL50: 116 µg.



Veneno

inoculado I.P

# de

ratones

Mortalidad

24 H 48 H

V M V M

% de

Mortalidad

48 H

Próbito

60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

80 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

100 µg 6 5 1 5 1 16,66% 4,06

120 µg 6 4 2 4 2 33,33% 4,57

140 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

160 µg 6 3 3 2 4 66,66% 5,45

Control 6 6 0 6 0 ----- -----

77

GRÁFICO # 8/1






FECHA DE INOCULACIÓN: 7 de noviembre del 2011


DL50: 116 µg.

78

CUADRO # 8/2

PROTOCOLO DE DL50

Fecha: 14 de mayo del 2012




DL50 INHMT: 72 µg.

Método: Directo

DL50: 112 µg.



Veneno

inoculado I.P

# de

ratones

Mortalidad

24 H 48 H

V M V M

% de

Mortalidad

48 H

Próbito

60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

80 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

100 µg 6 4 2 4 2 33,33% 4,57

120 µg 6 4 2 4 2 33,33% 4,57

140 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

160 µg 6 1 5 1 5 83,33% 5,97

Control 6 6 0 6 0 ----- -----

79

GRÁFICO # 8/2






FECHA DE INOCULACIÓN: 14 de mayo del 2012


DL50: 112 µg.

80

CUADRO # 9/1

PROTOCOLO DE DL50





DL50 INHMT: 45 µg.

Método: Directo

DL50: 98 µg.



Veneno

inoculado I.P

# de

ratones

Mortalidad

24 H 48 H

V M V M

% de

Mortalidad

48 H

Próbito

60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

80 µg 6 5 1 5 1 16,66% 4,06

100 µg 6 4 2 4 2 33,33% 4,57

120 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

140 µg 6 1 5 1 5 83,33% 5,97

160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

Control 6 6 0 6 0 ----- -----

81

GRÁFICO # 9/1








DL50: 98 µg.

82

CUADRO # 9/2

PROTOCOLO DE DL50





DL50 INHMT: 45 µg.

Método: Directo

DL50: 93 µg.



Veneno

inoculado I.P

# de

ratones

Mortalidad

24 H 48 H

V M V M

% de

Mortalidad

48 H

Próbito

60 µg 6 5 1 5 1 16,66% 4,06

80 µg 6 5 1 5 1 16,66% 4,06

100 µg 6 4 2 4 2 33,33% 4,57

120 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

140 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

Control 6 6 0 6 0 ----- -----

83

GRÁFICO # 9/2








DL50: 93 µg.

84

CUADRO # 10/1

PROTOCOLO DE DL50





DL50 INHMT: 53 µg.

Método: Directo

DL50: 130 µg.



Veneno

inoculado I.P

# de

ratones

Mortalidad

24 H 48 H

V M V M

% de

Mortalidad

48 H

Próbito

60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

80 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

100 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

120 µg 6 4 2 4 2 33,33% 4,57

140 µg 6 2 4 2 4 66,66% 5,45

160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

Control 6 6 0 6 0 ----- -----

85

GRÁFICO # 10/1








DL50: 130 µg.

86

CUADRO # 10/2

PROTOCOLO DE DL50





DL50 INHMT: 53 µg.

Método: Directo

DL50: 129 µg.



Veneno

inoculado I.P

# de

ratones

Mortalidad

24 H 48 H

V M V M

% de

Mortalidad

48 H

Próbito

60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

80 µg 6 5 1 5 1 16,66% 4,06

100 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

120 µg 6 4 2 4 2 33,33% 4,57

140 µg 6 1 5 1 5 83,33% 5,97

160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

Control 6 6 0 6 0 ----- -----

87

GRÁFICO # 10/2








DL50: 129 µg.

88

CUADRO # 11/1

PROTOCOLO DE DL50





DL50 INHMT: 64 µg.

Método: Directo

DL50: 88 µg.



Veneno

inoculado I.P

# de

ratones

Mortalidad

24 H 48 H

V M V M

% de

Mortalidad

48 H

Próbito

60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

80 µg 6 4 2 4 2 33,33% 4,57

100 µg 6 3 3 3 3 50% 5,01

120 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

140 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

Control 6 6 0 6 0 ----- -----

89

GRÁFICO # 11/1






FECHA DE INOCULACION: 29 de noviembre del 2011


DL50: 88 µg.

90

CUADRO # 11/2

PROTOCOLO DE DL50

Fecha: 4 de junio del 2012




DL50 INHMT: 64 µg.

Método: Directo

DL50: 94 µg.



Veneno

inoculado I.P

# de

ratones

Mortalidad

24 H 48 H

V M V M

% de

Mortalidad

48 H

Próbito

60 µg 6 6 0 6 0 16,66% 4,06

80 µg 6 4 2 4 2 50% 5,01

100 µg 6 3 3 3 3 33,33% 4,57

120 µg 6 0 6 0 6 83,33% 5,97

140 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

Control 6 6 0 6 0 ----- -----

91

GRÁFICO # 11/2






FECHA DE INOCULACION: 4 de junio del 2012


DL50: 94 µg.

92

CUADRO # 12/1

PROTOCOLO DE DL50

Fecha: 6 de diciembre del 2011




DL50 INHMT: 76 µg.

Método: Directo

DL50: 104 µg.



Veneno

inoculado I.P

# de

ratones

Mortalidad

24 H 48 H

V M V M

% de

Mortalidad

48 H

Próbito

60 µg 6 5 1 5 1 16,66% 4,06

80 µg 6 5 1 5 1 16,66% 4,06

100 µg 6 5 1 5 1 16,66% 4,06

120 µg 6 3 3 3 3 50% 5,01

140 µg 6 1 5 1 5 83,33% 5,97

160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

Control 6 6 0 6 0 ----- -----

93

GRÁFICO # 12/1






FECHA DE INOCULACION: 06 de diciembre del 2011


DL50: 104 µg.

94

CUADRO # 12/2

PROTOCOLO DE DL50





DL50 INHMT: 76 µg.

Método: Directo

DL50: 96 µg.



Veneno

inoculado I.P

# de

ratones

Mortalidad

24 H 48 H

V M V M

% de

Mortalidad

48 H

Próbito

60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

80 µg 6 5 1 5 1 16,66% 4,06

100 µg 6 5 1 5 1 16,66% 4,06

120 µg 6 2 4 2 4 66,66% 5,45

140 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

Control 6 6 0 6 0 ----- -----

95

GRÁFICO # 12/2






FECHA DE INOCULACION: 11 de junio del 2012


DL50: 96 µg.

96

CUADRO # 13/1

PROTOCOLO DE DL50





DL50 INHMT: 68 µg.

Método: Directo

DL50: 102 µg.



Veneno

inoculado I.P

# de

ratones

Mortalidad

24 H 48 H

V M V M

% de

Mortalidad

48 H

Próbito

60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

80 µg 6 4 2 4 2 33,33% 4,57

100 µg 6 2 4 2 4 66,66% 5,45

120 µg 6 2 4 2 4 66,66% 5,45

140 µg 6 1 5 1 5 83,33% 5,97

160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

Control 6 6 0 6 0 ----- -----

97

GRÁFICO # 13/1






FECHA DE INOCULACIÓN: 12 de diciembre del 2011


DL50: 102 µg.

98

CUADRO # 13/2

PROTOCOLO DE DL50





DL50 INHMT: 68 µg.

Método: Directo

DL50: 107 µg.



Veneno

inoculado I.P

# de

ratones

Mortalidad

24 H 48 H

V M V M

% de

Mortalidad

48 H

Próbito

60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

80 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

100 µg 6 2 4 2 4 66,66% 5,45

120 µg 6 2 4 2 4 66,66% 5,45

140 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

Control 6 6 0 6 0 ----- -----

99

GRÁFICO # 13/2






FECHA DE INOCULACIÓN: 18 de junio del 2012


DL50: 107 µg.

100

CUADRO # 14/1

PROTOCOLO DE DL50





DL50 INHMT: 63 µg.

Método: Directo

DL50: 114 µg.



Veneno

inoculado I.P

# de

ratones

Mortalidad

24 H 48 H

V M V M

% de

Mortalidad

48 H

Próbito

60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

80 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

100 µg 6 5 1 5 1 16,66% 4,06

120 µg 6 3 3 3 3 50% 5,01

140 µg 6 1 5 1 5 83,33% 5,97

160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

Control 6 6 0 6 0 ----- -----

101

GRÁFICO # 14/1






FECHA DE INOCULACIÓN: 19 de diciembre del 2011


DL50: 114 µg.

102

CUADRO # 14/2

PROTOCOLO DE DL50





DL50 INHMT: 63 µg.

Método: Directo

DL50: 116 µg.



Veneno

inoculado I.P

# de

ratones

Mortalidad

24 H 48 H

V M V M

% de

Mortalidad

48 H

Próbito

60 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

80 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

100 µg 6 6 0 6 0 0% 2,48

120 µg 6 3 3 3 3 50% 5,01

140 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

Control 6 6 0 6 0 ----- -----

103

GRÁFICO # 14/2






FECHA DE INOCULACIÓN: 25 de junio del 2012


DL50: 116 µg.

104

CUADRO # 15/1

PROTOCOLO DE DL50





DL50 INHMT: 68 µg.

Método: Directo

DL50: 70 µg.



Veneno

inoculado I.P

# de

ratones

Mortalidad

24 H 48 H

V M V M

% de

Mortalidad

48 H

Próbito

60 µg 6 4 2 4 2 33,33% 4,57

80 µg 6 2 4 2 4 66,66% 5,45

100 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

120 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

140 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

Control 6 6 0 6 0 ----- -----

105

GRÁFICO # 15/1






FECHA DE INOCULACION: 27 de diciembre del 2011


DL50: 70 µg.

106

CUADRO # 15/2

PROTOCOLO DE DL50





DL50 INHMT: 68 µg.

Método: Directo

DL50: 72 µg.



Veneno

inoculado I.P

# de

ratones

Mortalidad

24 H 48 H

V M V M

% de

Mortalidad

48 H

Próbito

60 µg 6 3 3 3 3 50% 5,01

80 µg 6 2 4 2 4 66,66% 5,45

100 µg 6 1 5 1 5 83,33% 5,97

120 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

140 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

160 µg 6 0 6 0 6 100% 8,5

Control 6 6 0 6 0 ----- -----

107

GRÁFICO # 15/2






FECHA DE INOCULACIÓN: 2 de julio del 2012


DL50: 72 µg.

108

LUIS VERA ARTEAGA - TESIS DE GRADO 2012

FIGURA #2 PESANDO EL VENENO Bothrops asper.

LUIS VERA ARTEAGA – TESIS DE GRADO 2012

109


FIGURA #4 CAJAS PARA COLOCAR RATONES INOCULADOS


110

B. asper.


B. atrox.


111

B. xanthogramma.


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