IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE UN CONSORCIO DE ...
53
CIUDAD DE MÉXICO, 30 DE NOVIEMBRE DE 2016 TRABAJO ESCRITO CORRESPONDIENTE A LA OPCIÓN DE TITULACIÓN: EN LA MODALIDAD DE: PROYECTO DE INVESTIGACIÓN INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE UN CONSORCIO DE MICROALGAS DE UN CENOTE DE QUINTANA ROO QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE Ingeniero Biotecnólogo PRESENTA: VICTOR MANUEL CALVA ZALDIVAR DIRIGIDA POR: DRA. PAOLA BERENICE ZÁRATE SEGURA DR. SERGIO GARCIAS SALAS Evaluadores DRA. ESTELA FLORES GOMEZ ING. JOSELINE BERENICE SÁNCHEZ ARELLANO
Transcript of IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE UN CONSORCIO DE ...
CIUDAD DE MÉXICO, 30 DE NOVIEMBRE DE 2016
TRABAJO ESCRITO CORRESPONDIENTE A LA OPCIÓN DE TITULACIÓN: EN LA MODALIDAD DE:
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE UN CONSORCIO DE MICROALGAS DE
UN CENOTE DE QUINTANA ROO
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE
Ingeniero Biotecnólogo
PRESENTA: VICTOR MANUEL CALVA ZALDIVAR
DIRIGIDA POR: DRA. PAOLA BERENICE ZÁRATE SEGURA DR. SERGIO GARCIAS SALAS Evaluadores DRA. ESTELA FLORES GOMEZ ING. JOSELINE BERENICE SÁNCHEZ ARELLANO
2
3
4
Índice
Resumen............................................................................................................................................. 7
Agradecimientos ................................................................................................................................ 8
1. Introducción................................................................................................................................. 9
1.1 Antecedentes .............................................................................................................................. 9
1.2 Características generales de la microalgas ......................................................................... 10
1.2.1 Organización celular ............................................................................................................. 10
1.2.2 Estructuras de locomoción .................................................................................................. 11
1.2.3 Pared celular .......................................................................................................................... 11
1.2.4 Cloroplastos ........................................................................................................................... 12
1.2.5 Pigmentos fotosintéticos ...................................................................................................... 13
1.2.6 Sustancias de reserva .......................................................................................................... 14
1.2.7 Nutrición .................................................................................................................................. 14
1.3 Cultivo de microalgas .............................................................................................................. 14
1.3.1 Sistemas de cultivo ............................................................................................................... 15
1.3.2 Formas de cultivo .................................................................................................................. 16
1.3.3 Parametros fisicoquimicos ................................................................................................... 17
1.4 Interés de las microalgas ........................................................................................................ 18
1.5 Producción de lípidos y pigmentos fotosintéticos en Microalgas ..................................... 20
1.5.1 Lípidos ..................................................................................................................................... 20
1.5.2 Pigmentos carotenoides ....................................................................................................... 20
1.6 Aplicaciones de las microalgas .............................................................................................. 21
1.7 Microalga Chlorella ................................................................................................................... 24
1.8 Técnicas empleadas para la identificación del consorcio de microalgas ........................ 26
1.8.1 Extracción de ADN ................................................................................................................ 26
1.8.2 Técnica de PCR..................................................................................................................... 28
1.8.3 Electroforesis ......................................................................................................................... 30
1.8.3.1Electroforesis en geles de agarosa. ................................................................................. 31
1.8.4 Secuenciación ........................................................................................................................ 32
1.9 Técnicas empleadas para la caracterización del consorcio de microalgas .................... 32
1.9.1 Determinación de biomasa ............................................................................................. 32
2 Justificación............................................................................................................................... 34
3 Objetivos .................................................................................................................................... 36
3.1 General ...................................................................................................................................... 36
5
3.2 Específicos ................................................................................................................................ 36
4 Metodología .............................................................................................................................. 36
4.1 Material y equipo ...................................................................................................................... 36
4.2 Cepas de microalgas y condiciones de cultivo ................................................................... 38
4.3 Métodos ..................................................................................................................................... 38
4.3.1 Extracción de ADN ................................................................................................................ 38
4.3.2 Electroforesis ......................................................................................................................... 39
4.2.2 Amplificación con PCR ......................................................................................................... 39
4.2.3 Determinación de Biomasa .................................................................................................. 40
• 4.2.4 Determinación y cuantificación de Clorofila (Song et al., 2008) ............................. 40
• 4.2.5 Determinación y cuantificación de Lípidos (Folch et. al.1957) ............................... 40
5 Resultados ................................................................................................................................ 41
6 Discusión ................................................................................................................................... 49
7 Conclusiones ............................................................................................................................ 50
8 Recomendaciones ................................................................................................................... 51
Referencias ...................................................................................................................................... 52
Índice de Figuras
Figura 1. a) Célula eucariota, b) Célula Procariota (Modificadas de Ghershman, 2006)................ 11
Figura 2. Tipos de flagelos en las células algales (Modificada de Lee, 1980) ............................... 11
Figura 3. Tipos de cloroplastos en las algas (Modificada de Lee, 1980) ....................................... 13
Figura 4. Diferentes elementos o sustancias que se pueden obtener de las microalgas y utilización
de la biomasa (González, 2015) ................................................................................................... 19
Figura 5. Árbol Filogenético de Chlorella. ..................................................................................... 26
Figura 6. Amplificación de ADN mediante PCR. ........................................................................... 29
Figura 7. Esquema de los distintos métodos de determinación de la biomasa. (Arnaíz, Isac, &
Lebrato, 2000) .............................................................................................................................. 33
Figura 8. Gel de agarosa: PM (Marcador de peso molecular), M1-M9 se encuentran las muestras
de ADN de la amplificación por PCR del consorcio de microalgas. ............................................... 41
Figura 9. Secuenciación de la muestra obtenidas en la amplificación con PCR ............................ 42
Figura 10. Gráfico de producción de biomasa del consorcio de microalgas en sistema cerrado ... 43
Figura 11. Gráfico de producción de biomasa en sistema abierto en configuración columna de
agitación y airlift ............................................................................................................................ 44
Figura 12. Gráfico de producción de Clorofila en sistema cerrado ................................................ 45
6
Figura 13. Gráfico de producción de clorofila en sistema abierto en reactores configuración columna
de agitación y airlift ....................................................................................................................... 46
Figura 14. Gráfico de Producción de lípidos en sistema cerrado ................................................... 47
Figura 15. Gráfico de producción de lípido en sistema abierto en reactores de configuración columna
de agitación y airlift ....................................................................................................................... 48
Índice de Tablas
Tabla 1 Posibles aplicaciones de algunas especies de microalgas (Santos, González-
Arechavala, & Martín-Sastre, 2014) ............................................................................................. 23
Tabla 2 Copias de ADN generadas por la PCR en cada ciclo ................................................ 30
Tabla 3. Concentracion de agarosa para la separación de fragmentos de DNA ................. 31
Tabla 4. Medio BG11 ...................................................................................................................... 37
Tabla 5. Organismos identificados en base de datos, su similitud y el número de pb. ....... 42
Tabla 6. Concentración de biomasa en sistema abierto y cerrado ......................................... 44
Tabla 7. Concentración de la producción de clorofila del consorcio en un sistema cerrado y
un sistema abierto ........................................................................................................................... 46
Tabla 8. Concentración de la producción de lípidos del consorcio para un sistema cerrado
y un sistema abierto ........................................................................................................................ 48
7
Resumen
Las microalgas existen desde hace miles de años en cualquier latitud y ecosistema acuático del
planeta, son uno de los organismos vivos más antiguos e importantes en la Tierra, siendo los
productores primarios de los océanos, hecho que no ha cambiado a lo largo del tiempo. Su gran
capacidad de adaptación, la diversidad de especies que existen y su estructura simple les han
permitido sobrevivir durante muchos años en diversos ecosistemas, logrando encontrar dichos
organismos normalmente en ambientes extremos, tales como cavernas, suelos desérticos, lagos
hipersalinos, entre otros. Su rol en el ambiente es clave ya que como se mencionó anteriormente,
son los precursores al flujo de energía y son indispensables en el balance de oxígeno. (Viveros,
2014).
Con el propósito de encontrar una posible alternativa para la producción de un suplemento o un
biocombustible se establece una comparación entre dos sistemas para la producción de clorofila
que tiene un uso para suplemento alimenticio, así como la producción de lípidos que tiene dos
formas de utilización tanto en suplemento como un biocombustible. Por lo que se realizan cinéticas
de crecimiento para la determinación de los parámetros necesarios para tener un sistema que
proporcione una alta cantidad de lípidos como de clorofila y así tener una posible alternativa para
dichas producciones.
La identificación es importante en este proyecto ya que se tiene una muestra de un cenote de
Quintana Roo es por eso que se emplean técnicas de biología molecular para poder identificar la
microalgas que se tiene en el consorcio, que posterior servirá para la caracterización de dicha
muestra y poder establecer cuál sería una posible alternativa para la producción de algún
suplemento o biocombustible.
Se establecen una comparación de crecimiento en un sistema cerrado y un sistema abierto en
cantidades similares y condiciones de cultivo, para ello se emplea un medio para microalgas (BG11)
el cual favorece por su alta concentración de nitratos la producción de lípidos y clorofila, así mismo
también los volúmenes que se tiene para dichas comparaciones son los mismos (500mL). Esto hace
que el proyecto tenga futuro para posteriores investigaciones para obtener mejores cantidades de
los elementos estudiados en este proyecto.
8
Agradecimientos
A mis padres agradezco por haberme apoyado en lo que se pudo durante el transcurso de mi vida
estudiantil. A mis hermanos por darme ánimos a seguir adelante y no dejarme vencer por los
obstáculos que se presentaron durante mi trayecto.
A el Maestro. Marco Antonio Aquino por haberme brindado su apoyo y su comprensión, así como
su compañía en todo este tiempo.
A Dra. Paola Zárate por darme la oportunidad de trabajar con ella y poder realizar el proyecto,
además de que creyó en mi para la realización de este proyecto.
A mis amigas Circe, Norma Nezi, Aline, Cielo, Fany, Alejandra, Vania, Claudia y Elida, por haber
estado en el trascurso de la carrera y poder compartir con ellas los buenos y malos momentos que
pase a lo largo de mi trayectoria estudiantil.
Pero sobre todo agradezco a mi abuelita Hilaria por ser al principal impulso a terminar la carrera y
este proyecto, aunque ya no se encuentra conmigo fue y siempre será mi mejor impulso para realizar
este logo.
9
1. Introducción
1.1 Antecedentes
Las microalgas son uno de los organismos vivos más antiguos e importantes en la Tierra, siendo
los productores primarios de los océanos, hecho que no ha cambiado a lo largo del tiempo. Su gran
capacidad de adaptación, la diversidad de especies que existen y su estructura simple les han
permitido sobrevivir durante muchos años en diversos ecosistemas, logrando encontrar dichos
organismos normalmente en ambientes extremos, tales como cavernas, suelos desérticos, lagos
hipersalinos, entre otros. Su rol en el ambiente es clave ya que como se mencionó anteriormente,
son los precursores al flujo de energía y son indispensables en el balance de oxígeno. (Viveros,
2014)
Aunque las microalgas han estado presentes en el planeta muy probablemente desde antes del ser
humano, su primer uso por el hombre se remonta hace 2000 años atrás, cuando a raíz de la
hambruna, los chinos recurrieron a la cepa Nostoc como alimento. A pesar de esto, es solo unas
décadas atrás cuando se empezó el cultivo de microalgas. (Priyarshani & Rath, 2012)
Fue Hensen en 1887, quien usó por vez primera el término plancton (del griego plangktós: errante),
para llamar a todas las partículas organogénicas, muertas o vivas que se mueven a merced de las
aguas. Desde hace muchos años el plancton ha sido objeto de estudio. La comunidad planctónica
se clasifica, según sus componentes, en fitoplancton y zooplancton. El fitoplancton comprende un
amplio grupo de organismos autótrofos mayoritariamente microscópicos, que representan el primer
eslabón en la cadena alimenticia.
El término microalga aparece posteriormente, muy ligado al desarrollo biotecnológico; éste se refiere
a aquellos microorganismos que contiene clorofila a y otros pigmentos fotosintéticos, capaces de
realizar fotosíntesis oxigénica. En este contexto, las cianobacterias o algas verde-azules, con
estructura celular procariota, se han considerado tradicionalmente dentro del grupo.
Entre las microalgas se incluyen organismos con dos tipos celulares: cianobacterias, que tienen
estructuras celular procariota, y las restantes microalgas con estructura celular eucariota; sin
embargo, el término no tiene valor taxonómico alguno. (Gomez, 2007)
La gran cantidad de compuestos de valor obtenidos a partir del cultivo de microalgas impulsó
rápidamente su implementación en la industria, fue entonces en los años 60´s en Japón, cuando
apareció por primera vez el primer cultivo a gran escala, siendo la especie Chlorella la empleada en
dicho cultivo. Posteriormente en los años 70´s se estableció la instalación de cosecha y cultivo de
10
la cepa Arthrospira en México, para los años 80’s ya existían 46 fábricas dedicadas a la producción
de biomasa (Chlorella principalmente) en Asia. Fue de esta forma como el cultivo e investigación
de microalgas se replicó rápidamente en las diferentes regiones del mundo.
Hoy en día existe un amplio mercado de microalgas en diferentes sectores económicos, como
principales cabe mencionar su uso como alimento y suplemento alimenticio para el hombre y
animales, en la industria de cosméticos, como biofertilizantes, en la industria farmacéutica y en el
tratamiento de aguas residuales.
1.2 Características generales de la microalgas
El término microalga, es un término normalmente usado para referirse a un amplio grupo de
microorganismos fotosintéticos. Por lo general eucariotas, sin embargo, cabe resaltar que las
cianobacterias que son procariotas, también son incluidas generalmente en este grupo. Las
microalgas también son nombradas como talofitas, que hace alusión a plantas sin tallos, hojas,
sistema vascular y embriones. Estas pueden ser autotróficas, lo cual implica que utilizan el CO2, la
luz solar y sales para su crecimiento, o pueden ser heterotróficas, donde su crecimiento se da a
través del consumo de compuestos orgánicos y nutrientes. Los principales criterios para catalogar
a un microorganismo como microalga son la pigmentación, el ciclo de vida y su estructura celular
básica. Las microalgas albergan 2 divisiones de las células procariotas y nueve de las eucariotas.
(Mutanda,2011)
Las microalgas son organismos unicelulares eucariotas fotosintéticos (2-200 μm), que pueden
crecer de modo autotrófico o heterotrófico. En general son altamente eficientes en la fijación del
CO2 y utilización de la energía solar para producir biomasa, con una eficiencia hasta cuatro veces
superior a la de las plantas. La importancia de las microalgas radica en su papel como productoras
primarias de la cadena trófica, que las convierte en las primeras productoras de materia orgánica.
1.2.1 Organización celular
La organización celular que presentan las algas, con excepción de los representantes de las algas
verde azules, es de tipo eucariota, es decir, presentan núcleo delimitado por una doble membrana,
mitocondrias, cloroplastos, retículo endoplásmico, complejo de Golgi y lisosomas (Figura 1a). En
contraste, las algas verde-azules, presentan una organización celular de tipo procariota; no tienen
organelos celulares y su ADN se encuentra en una sola molécula circular en el citoplasma (Figura
1b) (Ghershman, 2006).
11
Figura 1. a) Célula eucariota, b) Célula Procariota (Modificadas de Ghershman, 2006).
1.2.2 Estructuras de locomoción
Las algas, con excepción de las algas verde azules y las algas rojas, presentan en algún momento
de su ciclo de vida estructuras de locomoción denominadas flagelos. En los diferentes grupos de
algas, estos órganos varían tanto en número como en forma, sin embargo, típicamente presentan
dos flagelos o múltiplos de dos, que pueden ser isocontos (Figura 2e, 2f), anisocontos (Figura 2c,
2d) o heterocontos (Figura 2a, 2b).
Es importante destacar que algunas especies en ciertos grupos de algas, presentan solamente un
flagelo por célula (Figura 2h), y otras, presentan múltiples flagelos organizados a manera de corona
en el ápice de las células, arreglo que se denomina estefenaconto (Figura 2g) (Lee, 1980).
Figura 2. Tipos de flagelos en las células algales (Modificada de Lee, 1980)
1.2.3 Pared celular
12
La mayoría de las algas presentan una pared celular conformada principalmente de celulosa y
glicoproteínas. Las diatomeas presentan una pared celular de sílice y las algas verde azules
presentan una pared celular de mureína. Otros grupos presentan además incrustraciones de
carbonato de calcio. Las euglenoideos carecen de pared celular, sin embargo, presentan un
periplasto o película semirígida alrededor de la célula, este hecho les da la apariencia como de
células desnudas.
En las macroalgas, es posible encontrar otros compuestos polisacáridos tales como alginatos,
agares y carragenanos, propiedad que les confiere importancia en la industria (Lee, 1980).
1.2.4 Cloroplastos
Los caracteres ultra-estructurales de los cloroplastos de las algas (como el número de membranas
que lo rodean, así como el número y arreglo de los tilacoides) han sido de los más importantes a
considerar para la separación de las divisiones que conforman al grupo (Figura 3). Por su origen
evolutivo, observamos que algunos grupos presentan la típica doble membrana, mientras que otros
presentan tres o cuatro membranas, siendo generalmente la última membrana continua con el
retículo endoplásmico. De estos cloroplastos algunos presentan tilacoides aislados o en bandas
apiladas de 2, 4 ó 6, denominado este arreglo como grana. En algunos casos, como en las algas
rojas, uno o dos tilacoides se agrupan paralelos a la membrana interna del cloroplasto semejando
una membrana más (Lee, 1980).
13
Figura 3. Tipos de cloroplastos en las algas (Modificada de Lee, 1980)
1.2.5 Pigmentos fotosintéticos
La clorofila a es el pigmento fotosintético (por excelencia) común en todas las algas y plantas
embriófitas, alcanza un espectro de absorción de luz de 663–430 nm. Sin embargo, las algas
presentan también otro tipo de clorofilas y pigmentos accesorios que les permiten un espectro de
absorción mayor de la luz, de esta manera pueden abarcar una distribución más profunda en la
columna de agua y realizar de manera óptima la fotosíntesis. Encontramos entonces, además de la
clorofila a, a la clorofila b, la clorofila c (en sus formas c1 y c2) y la clorofila d, esta última, de origen
bacteriano, presenta el rango de absorción más amplio.
Los pigmentos accesorios son los principales responsables de la coloración externa que presentan
las algas. Al igual que las clorofilas, se encuentran en la membrana de los tilacoides en los
cloroplastos, desde ahí captan los fotones de luz y los transportan al sitio activo (fotosistemas) para
iniciar la fotosíntesis. Los pigmentos accesorios más comunes en las algas son: las ficobilinas
(ficocianinas y ficoeritrinas, solubles en agua), presentes sólo en algas verde azules y algas rojas,
las fucoxantinas, las xantofilas y el más común y abundante, los carotenos(Dreckmann, Sentíes, &
Nuñez, 2013).
14
1.2.6 Sustancias de reserva
En las células algales podemos encontrar diferentes sustancias de reserva producto del
metabolismo. Las sustancias de reserva que podemos encontrar son principalmente el almidón,
aunque también encontramos crisolaminarina, laminarina, manitol y paramilion en los diferentes
grupos. Estas sustancias forman gránulos que se encuentran dispersos en el citoplasma celular, en
los cloroplastos o en los pirenoides.
1.2.7 Nutrición
Las algas son organismos principalmente autótrofos (fotoautótrofos o quimioautótrofos). La
fotosíntesis es su principal vía de nutrición, sin embargo, existen grupos que presentan también una
forma de nutrición heterótrofa (osmotrófica, fagotrófica o saprobiótica). Algunos organismos
presentan un tipo de nutrición mezclada de autotrofía y heterotrofía, la cual se denomina mixotrofía,
y a los organismos que la presentan se les denomina mixótrofos. (Dreckmann, Sentíes, & Nuñez,
2013)
1.3 Cultivo de microalgas
Es importante conocer las condiciones óptimas y los límites de tolerancia de una microalga para
todos o el mayor número de parámetros, tanto individualmente como para el conjunto de todos ellos.
En el cultivo masivo de microalgas el rendimiento alcanzado depende tanto de la concentración de
células en el cultivo como del grado en que las células pueden desarrollar su potencial de
crecimiento. Por tanto, para conseguir un cultivo de microalgas en crecimiento activo es necesario
un inóculo viable, un suministro mínimo de nutrientes y microelementos y adecuadas condiciones
químicas y físicas: luz, aireación, temperatura, salinidad y energía (Cañizares et al., 1994).
Son varios los factores que afectan a la producción de microalgas. Para su desarrollo requieren de
CO2, nitrógeno, fósforo, potasio, magnesio y otros nutrientes menores como metales, los cuales
son esenciales porque actúan como cofactor de enzimas esenciales del metabolismo de las
microalgas.
Otros factores importantes para la producción son la temperatura, intensidad luminosa, salinidad,
nutrientes y pH óptimos, que varían ampliamente de una especie a otra.
Estos parámetros fisicoquímicos se deben determinar previamente en condiciones de laboratorio,
para que nos ayuden a comprender las condiciones óptimas para el desarrollo de las diferentes
especies en cultivo (Gonzales, 2015).
15
1.3.1 Sistemas de cultivo
A lo largo de la historia se han desarrollado múltiples diseños de fotobioreactores y estanques a
cielo abierto, existiendo incluso híbridos entre ambos, buscando siempre las mejores condiciones
de cultivo y la forma más eficiente de utilizar la luz solar, la cual es una de los principales factores
limitantes en el cultivo a gran escala debido al fenómeno llamado auto sombreado. Los diseños
varían desde una capacidad de unos cuantos litros a grandes reactores capaces de albergar varios
metros cúbicos, existiendo de esta forma un gran número de posibles sistemas de cultivo.
En este orden de ideas, el cultivo de microalgas esencialmente se puede dividir en dos tipos;
sistemas cerrados (Fotobioreactores) y sistemas abiertos (tanques a cielo abierto). La palabra
fotobioreactor hace referencia a un cultivo en el cual la mayor parte de la luz o incide directamente
sobre el cultivo, en vez de esto, debe pasar a través de la pared transparente del reactor para llegar
al cultivo. Es por este motivo que los fotobioreactores son considerados sistemas cerrados. Estos a
su vez pueden clasificarse en diferentes tipos teniendo como criterio su operación o su diseño, es
de esta forma como de acuerdo con su operación se pueden clasificar en:(1) mezclados por
burbujeo, (2) de fase única y (3) de doble fase. De acuerdo a su diseño se pueden clasificar en: (4)
plana o tubular, (5) horizontal, vertical, inclinado o espiral, (6) colector o serpentina54.La principal
ventaja de los sistemas cerrados es su control sobre la contaminación del cultivo, variable que es
importante si se requiere de un monocultivo, adicionalmente por lo general permiten un mejor control
sobre algunos parámetros importantes en el crecimiento de las microalgas tales como: pH,
iluminación, temperatura, entre otros, permitiendo de esta forma alcanzar altas productividades de
biomasa. Por otra parte, los fotobioreactores acarrean unos mayores costos de construcción y
mayor complejidad de operación. (Kumar, et al, 2010)
Los estanques a cielo abierto por su parte son los de mayor implementación en el cultivo de
microalgas debido a su fácil y bajo costo de construcción, su diseño y materiales de construcción,
varían en gran medida en función de los recursos disponibles y los requerimientos específicos del
cultivo, estos de forma general se pueden clasificar en 3 tipos: (1) sistemas inclinados donde la
agitación se logra a través de burbujeo o gravedad, (2) estanques circulares donde la agitación se
realiza a través de brazo mecánico rotatorio y (3)estanques de pista rotatoria sin fin. Estos dos
últimos junto a los estanques a cielo abierto son utilizados en el cultivo comercial de microalgas.
(Razzak, et al., 2013)
16
1.3.2 Formas de cultivo
Las formas de cultivo hacen referencia a si existe o no flujo de medio de cultivo hacia o desde el
reactor, permitiendo de esta forma clasificar las formas de cultivo en 4: (1) En lote, (2) Continuo, (3)
Semi-continuo, adicionalmente se considera como forma de cultivo (4) Inmovilizado.
El cultivo en lote es el principalmente usado en estudios científicos debido a su fácil manejo y
garantía de condiciones asépticas, este consiste en cultivar la microalga inoculando una cantidad
determinada en un volumen limitado de medio de cultivo, incubando de esta forma bajo condiciones
de temperatura e iluminación adecuadas para el crecimiento. El suministro de CO2 normalmente se
realiza inyectando aire enriquecido con este. La iluminación se puede realizar de forma sintética
(con lámparas) o de forma natural (luz solar). En esta forma de cultivo es posible observar las
diferentes fases de crecimiento que presenta la microalga, las cuales están ligadas principalmente
a los cambios en el medio de cultivo (Gonzales, 2015).
Las fases del crecimiento de las microalgas se pueden dividir en 4: (1) fase de latencia, la cual se
observa cuando el crecimiento de la microalgas es mínimo o nulo, esta se presenta normalmente
cuando la microalga es cambiada bruscamente de condiciones de cultivo, lo cual genera una fase
de adaptación previa a la división celular o (2) fase exponencial, en esta el crecimiento celular se
presenta de forma exponencial (o logarítmica) a medida que se consume el sustrato, posteriormente
se presenta la (3) fase lineal donde el crecimiento se detiene y la concentración de células se
mantiene constante, esta fase se presenta principalmente debido a la escasez de nutrientes o luz.
Finalmente, una vez agotados los nutrientes y agotadas las reservas de energía se presenta la (4)
fase de decaimiento en el cual la muerte celular predomina, disminuyendo de esta forma la
concentración de biomasa.
Los cultivos continuos son aquellos que son alimentados constantemente con medio de cultivo
fresco y es expulsada simultáneamente una cantidad determinada de medio de cultivo, ya sea de
forma constante o intermitente. Este sistema se implementó debido a la necesidad de suministrar
nutrientes los cuales se encuentran en constante agotamiento y la necesidad de eliminar productos
inhibitorios expulsados al medio por parte de las microalgas. Los cultivos semi-continuos o
alimentados en lote por lo tanto, son aquellos que son alimentados con un volumen determinado de
medio de cultivo cada cierto periodo de tiempo, expulsando parte del cultivo de la misma forma.
(Richmond, 2004)
Finalmente, los cultivos inmovilizados consisten en generar un medio de soporte sobre el cual la
microalga no esté suspendida sino sujetada o adherida. En este sentido existen dos tipos de medios
de soporte, un medio de soporte químico con agar, el cual consiste en preparar un medio sólido
17
sobre el cual la microalga quede atrapada, el segundo consiste en generar un medio poroso que
absorba la microalga y de esta forma quede inmovilizada en dicho material de soporte. (Shi, Podola,
& Melkonian, 2013)
1.3.3 Parametros fisicoquimicos
La iluminación se divide en dos componentes: la irradiancia, la cual se refiere al flujo de luz por
unidad de área a la cual están expuestas las microalgas, y el fotoperiodo, el cual es el número de
horas durante el día en las que las microalgas son sometidas a dicha irradiación. Las microalgas
utilizan sólo la luz en el intervalo comprendido entre 300nm a 700nm, región del espectro conocida
como la radiación fotosintéticamente activa (PAR, por sus siglas en inglés).
En cuanto a la temperatura, la mayoría de las especies crecen entre 10 a 35 °C, con una
temperatura óptima de 16-24 °C. En el cultivo de microalgas, y en general en el de cualquier
microorganismo, hay tres temperaturas a considerar: una temperatura mínima, por debajo de la cual
no es posible el crecimiento (aunque depende de cada especie y condiciones de cultivo,
aproximadamente 16 °C), una temperatura óptima, entre 16 y 27 °C dependiendo de la microalga,
a la que se produce el crecimiento más rápido, y una temperatura máxima, alrededor de 35 °C, por
encima de la cual no es posible el crecimiento. Los cultivos de microalgas que crecen por debajo
de la temperatura óptima generalmente son más sensibles a la fotoinhibición que aquellos que se
mantienen en el valor ideal. La temperatura de crecimiento también afecta a la composición
bioquímica de las células (Gonzales, 2015).
La aireación es un factor importante para la homogeneización de los nutrientes y evitar la
sedimentación de las microalgas. Un adecuado mezclado favorece una distribución homogénea de
las células, de los metabolitos, el calor y la transferencia de gases a través de la interfase gas-
líquido. Sin embargo, una agitación excesiva puede causar un estrés hidrodinámico llevando a una
disminución en la tasa de crecimiento.
La tolerancia a la salinidad depende de la especie considerada (de agua dulce o salada).
Dentro de los requerimientos químicos necesarios para un buen crecimiento de las microalgas en
cultivo se encuentran, entre otras cosas, el balance entre los macronutrientes específicos y los
micronutrientes. Los nutrientes fundamentales son el carbono, los nitratos y los fosfatos. La
disminución de la fuente de nutrientes es un factor limitante en el cultivo, por lo que resulta necesario
el control de la calidad nutricional en los cultivos masivos.
18
Hay algunas microalgas que, además de macro y micronutrientes, requieren otras sustancias para
su desarrollo, como las vitaminas, ya que no son capaces de sintetizar todas las que necesitan y
las tienen que asimilar a través del medio. Además requieren otros elementos en pequeñas
cantidades que son esenciales para su crecimiento: manganeso, zinc, cobalto, cadmio, cobre,
molibdeno y níquel, los cuales forman parte de enzimas necesarias para el transporte de electrones,
la fijación y transporte del CO2, la transcripción del ADN, la fijación y transporte del nitrógeno, entre
otras (Gonzales, 2015).
La tasa de O2 y CO2 suministrado al cultivo puede convertirse en un factor limitante. Mejorando la
circulación o mediante la adición adecuada de CO2 o bicarbonato de sodio puede provocarse la
prolongación del crecimiento exponencial de las microalgas. El CO2 y el bicarbonato de sodio
afectan al pH del cultivo, el cual debe ser controlado y mantenido en condiciones óptimas. Cada
microorganismo crece en un intervalo de pH particular y normalmente existe un pH óptimo bien
definido; en el caso de las microalgas el pH óptimo se encuentra apenas por encima de la
neutralidad, por lo que son clasificados como microorganismos neutrófilos.
Además de los factores fisicoquímicos mencionados anteriormente, otro aspecto a considerar es la
relación entre las microalgas con determinadas bacterias. Es difícil producir un cultivo de microalgas
libre de bacterias y parece ser que muchas especies de microalgas crecen mejor en asociación con
bacterias, siendo este concepto muy importante para utilizar las microalgas como depuradores de
determinadas aguas, como aguas residuales, de minería, etc.
Todos estos factores son los que dirigen el comportamiento de las microalgas tanto en el medio
natural como en los sistemas de cultivo.
1.4 Interés de las microalgas
En los últimos años se han logrado avances importantes en la utilización de las microalgas para
diversos fines como la salud humana, cosmética, purificación de aguas residuales, prevención de
la contaminación acuática, industria farmacéutica, acuicultura, producción de pigmentos y
antibióticos, entre otros. Hay constancia de aproximadamente 493 especies que podrían ser
utilizadas como alternativas de alimentación para el hombre y otros animales. El uso de microalgas
está proporcionando a los científicos numerosas líneas de investigación y a los empresarios
posibilidades de negocio, debido a la cantidad de aplicaciones que tienen, como por ejemplo, la
producción de energía, ya sea en forma de hidrógeno o biocombustibles; o para limpiar el medio
ambiente absorbiendo dióxido de carbono y purificando aguas residuales; para alimentación y
producción de sustancias como vitaminas, ácidos grasos, o pigmentos; para la industria agraria con
19
la producción de fertilizantes; para acuicultura; para biomedicina e incluso para la industria
cosmética. Las microalgas son la base de la alimentación de la mayoría de especies que se crían
en acuicultura, tanto peces (primeros estadios larvarios); crustáceos (estadios larvarios de algunas
especies) y especialmente en bivalvos (todos los estadios de crecimiento).
En relación al medio ambiente las microalgas pueden utilizarse en biorremediación ambiental, como
es el caso del tratamiento de las aguas residuales urbanas. Además, estos organismos contribuyen
a fijar el CO2 por lo que podrían reducir las emisiones de dicho gas, gran responsable del efecto
invernadero. Cultivadas bajo condiciones adecuadas de iluminación, temperatura, salinidad y
concentración de nutrientes, las microalgas representan una excelente fuente de pigmentos
carotenoides. En el Esquema 2 se pueden ver las diferentes sustancias que se pueden obtener de
las microalgas.
El consumo de microalgas en alimentación está restringido a unas pocas especies debido a la
estricta regulación en materia de alimentos. El mercado está dominado por Chlorella, Dunaliella y
Spirulina en forma de comprimidos o en polvo. Las microalgas son una fuente importante de ácidos
grasos poliinsaturados, esenciales para el ser humano, entre otras cosas, reducir el riesgo de
enfermedades cardiovasculares. Estos ácidos grasos suelen obtenerse a partir de aceites del
pescado. Actualmente el único disponible comercialmente a partir de microalgas es el ácido
docosahexaenoico (DHA) ya que la obtención de otros (eicosapentaenoico EPA, gamma linoleico
GLA y araquidónico AA) no es competitiva frente a la producción a partir de otras fuentes. En países
como Alemania, Perú, India, Japón y México, han registrado que algunas especies de microalgas
son un excelente complemento alimenticio para el hombre. Por ejemplo, las harinas de Spirulina y
Scenedesmus se caracterizan por su alto valor proteico, careciendo de efectos tóxicos. (González,
2015)
Figura 4. Diferentes elementos o sustancias que se pueden obtener de las microalgas y
utilización de la biomasa (González, 2015)
20
1.5 Producción de lípidos y pigmentos fotosintéticos en Microalgas
1.5.1 Lípidos
Bajo el término lípido se incluyen, generalmente, moléculas de origen biológico insolubles en agua
y solubles en disolventes orgánicos, como acetona, metanol, éter dietílico, hexano y cloroformo,
entre otros. Las principales funciones biológicas de los lípidos incluyen su papel central en el
almacenamiento de energía, como componentes estructurales de las membranas celulares, y como
importantes moléculas de señalización.
Los lípidos denominados neutros incluyen los TAG (triacilglicéridos). Estos compuestos sirven
principalmente como almacenamiento de energía y carbono orgánico. Aparecen en forma de
cuerpos oleosos en las células de muchas especies de microalgas. En la mayoría de los casos, los
TAG se acumulan en las microalgas cuando sus cultivos se someten a condiciones limitantes para
el crecimiento, que suelen denominarse condiciones de estrés e incluyen variaciones en la
temperatura, alta irradiancia, carencias nutricionales o altas concentraciones de sal en el medio,
entre otras. Por tanto, los TAG son una reserva relevante de carbono y energía para el crecimiento
de los microorganismos después de estar sometidos a alguna condición de estrés. Por otra parte,
los lípidos polares desempeñan un papel estructural en la membrana celular y en otros orgánulos,
y junto a esta función estructural también pueden operar como moléculas señales o precursores de
la biosíntesis de otras. Entre los lípidos polares se encuentran moléculas de naturaleza terpenoide
que realizan funciones colectoras de luz y antioxidante en plantas y microalgas, conocidas como
pigmentos fotosintéticos. (Ruiz, 2013)
1.5.2 Pigmentos carotenoides
Los carotenoides son un grupo de pigmentos que le proporciona sus colores característicos a los
vegetales, desempeñan su función principal en la fotosíntesis, dado que poseen capacidad para
extinguir moléculas en estado tripe y regresarlas a su estado basal. Para extinguir la energía de
excitación del oxígeno en estado simple (altamente destructivo) y regresarlas a su estado triple
normal (el oxígeno es una molécula inusual dado que es más estable en estado triple que en estrado
simple), también presentan extinción de los centros de reacción de los fotosistemas cuando son
sobreexcitados por la luz muy intensa. Con su capacidad antioxidante neutralizan o bloquean la
recepción de radicales libres del oxígeno que puedan causar daño a las estructuras y funciones de
la membrana celular y al ADN de las proteínas.
21
Los carotenos son componentes del metabolismo secundario de las plantas, tanto los carotenoides
como la astaxantina son un producto de la vía mevalónica a través del acetato proveniente de la
fotosíntesis y de la respiración, conocida también como vía de los terpenos. El ácido mevalónico da
origen a un polímero isopentil difosfato de 5 carbonos (C5) formando: Geranildifostato (C10)
monoterpenos, esteroles y triterpenos (C30), el farnesildifosfato (C15), da origen a sesquiterpenos
(C15) y escualeno; al Geranilgeranildifosfato (C20), diterpenos , fitoles y la clorofilas, así como al
fitoeno, este por desaturación produce el Licopeno principal (pigmento del tomate y compuesto
acíclico) que por una doble ciclización da origen al β-caroteno (que da la coloración amarillo naranja
a la zanahoria) y dos núcleos de β–ionona. La oxigenación de β-caroteno, confiere la coloración
naranja de la cantaxantina, posteriormente la hidroxilación produce las xantofilas y diversos
compuestos carotenoides: luteína, zeaxantina, equinenona, cantaxantina (originada de la
oxigenación del β-caroteno) y finalmente astaxantina.
La producción de carotenoides a niveles masivos a partir del cultivo de microalgas se postuló en los
años 50`s, como una alternativa para obtener alimento para el hombre. En los años 60’s y 70’s se
buscó desarrollar el rendimiento de biomasa en los cultivos de estos organismos. Con el transcurso
de los años se diversificaron las áreas para las microalgas eucariotas y cianobacterias. El β-
caroteno fue el primer carotenoide purificado en 1831 por Wackenroder quien lo aisló en forma
cristalina partir de la zanahoria, dándole el nombre que lleva, derivado de la denominación latina de
este vegetal (Daucus carota). También fue el primer carotenoide natural producido a nivel industrial
a partir de microalgas. Otros de igual importancia son el licopeno, el cual confiere su color
característico a los tomates, así como la luteína que se encuentra presente en todos los vegetales
de hojas verdes. (Richmond, 2004)
1.6 Aplicaciones de las microalgas
Actualmente, la producción mundial de microalgas se destina principalmente a aplicaciones de
elevado valor añadido (Milledge, 2011), ya que la biomasa de algas, además de contener proteínas,
lípidos esenciales, pigmentos, carbohidratos, minerales y vitaminas, posee excelentes cualidades
para la obtención de productos naturales. La mayor parte de esta biomasa se comercializa como
alimentos medicinales en forma de tabletas o polvo como aditivos. También se pueden extraer
compuestos con valiosas aplicaciones como pigmentos, aditivos alimentarios, antioxidantes,
cosméticos y biofertilizantes. Además, hay que tener en cuenta que las microalgas representan un
recurso en gran parte sin explotar ya que sólo se ha estudiado una pequeña parte de ellas. El
consumo humano de microalgas está restringido a unas pocas especies debido a las estrictas
22
regulaciones de seguridad alimentaria, factores comerciales y demanda del mercado. Las especies
que mayoritariamente se cultivan para consumo humano son Chlorella, Spirulina y Dunaliella y
tienen como denominador común, crecer en estanques en medioambientes altamente selectivos
siendo inmunes a la contaminación de otras algas y protozoos. Entre los beneficios citados del
consumo de Chlorella, se encuentran el tratamiento de úlceras gástricas, acción preventiva frente
al arterioesclerosis e hipercolesterol y actividad antitumoral. La Spirulina (Arthrospira) se utiliza
debido a su elevado contenido proteico y su excelente valor nutricional; también es una fuente
esencial de ácidos grasos y ácido linoleico que no pueden sintetizar los humanos. Mientras que la
Dunaliella salina, como se verá a continuación, se utiliza fundamentalmente por su elevado
contenido en Betacaroteno. (Santos, González-Arechavala, & Martín-Sastre, 2014)
Las algas contienen carotenoides. Aunque se conocen unos 400 tipos de carotenoides, solo unos
pocos se utilizan comercialmente, principalmente el β-caroteno y la Astaxantina, y se usan
fundamentalmente como colorantes y suplementos de alimentación humana y animal (Milledge,
2011). La concentración promedio máxima de carotenoides en las algas es de entre 0,1% y 2%; sin
embargo, la Dunaliella, cuando crece en condiciones de alta salinidad e intensidad de luz, puede
llegar a acumular hasta un 14% de β-caroteno. Existen plantas de producción activas en Australia,
Israel, Usa y China y representan una industria en crecimiento y económicamente viable. Las
principales aplicaciones de la Astaxantina son en las granjas acuícolas y como suplemento a la
dieta o antioxidante.
Las microalgas son también una fuente de ácidos grasos poliinsaturados (Polyunsaturated fatty
acids, PUFA) y suministran estos componentes vitales a plantas más altas y animales que carecen
de las enzimas necesarias para sintetizarlos, siendo los PUFA esenciales para el desarrollo humano
y fisiológico. Actualmente, el pescado y sus aceites son las principales fuentes de PUFAs, aunque
su aplicación como aditivos para comidas está limitada por la posible acumulación de toxinas, el
olor a pescado y su sabor desagradable. Estas limitaciones se han superado empleando los PUFA
de las microalgas como aditivos a leches infantiles y a pollos para producir huevos enriquecidos con
Omega-3. Los dos PUFA más importantes son el ácido Docohexanoico (DHA) y el ácido
Eicosapentanoico (EPA). El DHA se obtiene de la Crypthecodinium cohnni y se utiliza como
suplemento en fórmulas infantiles y dietas, siendo esencial para el funcionamiento apropiado del
cerebro adulto, y para el desarrollo del sistema nervioso y habilidades visuales durante los primeros
seis meses de vida. El EPA se obtiene de Phaedactylum tricornutum por un proceso desarrollado
por la universidad de Almería (España). Se estima que se producen 430 kg del 96% de pureza al
año, con un coste de 3,54 €/kg. El precio se tiene que reducir en un 80% para que el proceso sea
económicamente viable. Aproximadamente un 30% de la producción actual de algas se vende para
alimentación animal, siendo esenciales en acuicultura, y forman parte de la cadena alimentaria en
cualquier criadero convencional. Numerosos estudios han mostrado que las algas pueden
23
reemplazar a proteínas convencionales como las de la soja o pescados. Sin embargo, la
alimentación en el resto de animales con algas no está tan extendida ya que, excepto la Spirulina,
se digieren mal por su alto contenido de celulosa. Sólo los rumiantes se podrían alimentar
directamente de ellas por ser capaces de digerir bien este material celulósico, pero a día de hoy,
apenas se usa este tipo de alimentación en rumiantes. Un problema en la alimentación animal
mediante microalgas es que un consumo elevado puede cambiar el color de la piel (en el caso de
los pollos, incluso el color de los huevos). Como beneficios adicionales, cabe destacar una mejor
respuesta inmune, mayor fertilidad, mejor control del peso y mejoras en la piel. Algunas tecnologías
de conversión de la biomasa de las algas, especialmente la pirólisis, originan un residuo carbonoso
que tiene aplicaciones potenciales en agricultura como biofertilizante, aprovechando la capacidad
de las cianobacterias para fijar el nitrógeno atmosférico y para controlar la erosión. Algunos de sus
extractos se han revelado como buenos promotores de la germinación y la floración. Las futuras
tendencias en el uso agrícola de las microalgas parecen apostar por su actividad preventiva frente
al desarrollo de enfermedades que ciertos virus y bacterias generan en plantas. Algunas especies
de microalgas producen extractos que se utilizan en productos cosméticos (cremas antiarrugas,
regeneradoras, protección del sol, etc.), siendo las principales especies Arthosphira y Chlorella y
Spirulina. Estas especies son utilizadas por reputadas marcas internacionales de cosmética que
han investigado sus propios sistemas de producción de algas e incluyen ya en sus fórmulas
extractos de estos microorganismos unicelulares, con las exigentes propiedades requeridas para
estas aplicaciones: una alta calidad y la ausencia total de contaminaciones. En la Tabla 1 se
resumen posibles aplicaciones de algunas especies de microalgas(Santos, González-Arechavala,
& Martín-Sastre, 2014).
Tabla 1 Posibles aplicaciones de algunas especies de microalgas (Santos, González-
Arechavala, & Martín-Sastre, 2014)
Especie de microalga Posible aplicación
Chorella Salud
Aditivo de alimentación
Nutrición animal
Cosméticos
Biocombustibles
Dunaliella salina Betacaroteno
Suplemento alimentario
Cosmético
Botryococcus braunii Biodiesel
Spirulina platensis Farmacéuticos
24
Nutrición humana
Haematococcus pluvialis Astaxantina
Aditivo alimentario
Farmacéuticos
Artrospira Carotenos
Cosméticos
Nannocloropsis Ácido ecosapentanoico
Biodiesel
1.7 Microalga Chlorella
La Chlorella es una microalga esférica, unicelular de agua dulce y de color verde. Aunque no fue
descubierta hasta el 1890 por el microbiólogo holandés M.W. Beijernick su origen se remonta a
hace más de 600 millones de años lo que la convierte en una de las formas de vida más primitivas
del planeta. Si alguna propiedad se le reconoce especialmente es la de depurar y desintoxicar el
cuerpo de metales pesados como el cadmio, el uranio, el mercurio o el plomo, pesticidas, herbicidas,
radiaciones, toxinas etc.
Se sabe que la Chlorella contiene casi un 60% de proteínas de alta calidad biológica siendo su
contenido proteico mucho mayor que el de la soja o la carne de vaca. Es más, contiene todos los
aminoácidos, incluidos los llamados esenciales que son necesarios obtener a través de la dieta en
proporciones equilibradas.
El alga Chlorella es el organismo vegetal con mayor concentración de clorofila, además, la clorofila
es el único sistema natural existente que a través de la alimentación puede transmitir al ser humano
la energía procedente del sol. Una vez en el organismo la clorofila activa las enzimas
imprescindibles para una adecuada asimilación de los nutrientes y para su combustión proceso que
permite convertirlos en energía. Además, se da la circunstancia de que las células de clorofila y las
de los glóbulos rojos presentan una estructura muy similar (únicamente se diferencian por el átomo
central, en hemoglobina es Fe y en la clorofila es Mg). Similitud que la convierte en un excelente
tónico para la sangre en caso de anemias. El alga Chlorella también contiene cantidades muy
significativas de vitamina C, betacaroteno (provitamina A), vitamina B1 (tiamina), B2 (riboflavina),
B3 (niacina), B5 (ácido pantoténico), B6 (ácido fólico) y B12, vitaminas E, H (biotina) y K, colina,
inositol y ácido paraaminobenzoico.
Chlorella sorokiniana
25
Se caracteriza por tener células esféricas (5µm de diámetro), con un cloroplasto en forma de copa
y un pirenoide. El género Chlorella es cosmopolita y por tanto se adapta a diversas condiciones
ambientales y nutricionales (Wehr y Sheath, 2003), pudiendo ser encontrada en el fitoplancton de
estanques y lagos, colonizando el suelo o como simbionte en protozoos ciliados. C. sorokiniana ha
sido ampliamente estudiada con respecto a su fisiología, genética y por su producción de biomasa
con alto contenido de lípidos, específicamente ácidos grasos insaturados omega 3, 6 y 9, empleados
en la obtención de suplementos nutricionales, cosméticos, farmaceúticos y biocombustibles. (Ugwu,
Ogbonna, & Takana, 2005)
Chlorella thermophila
Esta es una microalga solitaria verde y terrestre en hábitat. Las células son esféricas u ovales en
forma de 1,5-2,5 lm de diámetro. Las paredes celulares son lisas y de doble capa. Poseen
cloroplastos parietales y en forma de copa. En cada cloroplasto, que es atravesado por un tilacoide
de doble capa y envuelto por una sola vaina de almidón, se encuentra un solo pirenoide de 0,4-0,6
lm de diámetro. Se reproduce por autosporulación. Los esporangios contenen en su mayor parte 2-
4 esferas elipsoidales autosporaseas(Shui M. et al.,2015).
26
Figura 5. Árbol Filogenético de Chlorella.
1.8 Técnicas empleadas para la identificación del consorcio de microalgas
1.8.1 Extracción de ADN
La extracción consiste en el aislamiento y purificación de moléculas de ADN y se basa en las
características fisicoquímicas de la molécula. El ADN está constituido por dos cadenas de
27
nucleótidos unidas entre sí formando una doble hélice. Los nucleótidos están integrados por un
azúcar (desoxirribosa), un grupo fosfato y una base nitrogenada (adenina, guanina, timina o
citosina). La unión de los nucleótidos ocurre entre el grupo fosfato y el azúcar, mediante enlaces
fosfodiéster, dando lugar al esqueleto de la molécula. Las bases de cadenas opuestas se unen
mediante puentes de hidrógeno y mantienen estable la estructura helicoidal.
Los grupos fosfato están cargados negativamente y son polares, lo que le confiere al ADN una carga
neta negativa y lo hace altamente polar, características que son aprovechadas para su extracción.
Los métodos utilizados para romper la células deben ser tan leve como sea posible con el fin de
causar el menor daño posible al ADN. La lisis celular se puede hacer por acción mecánica,
pulverizando el tejido con hielo seco o nitrógeno líquido, también se puede utilizar la degradación
enzimática de la pared celular (si está presente) y lisis con detergentes de las membranas celulares.
Seguido al rompimiento celular la mayoría de métodos involucran una desproteinización, lo cual se
lleva a cabo con un solvente orgánico, seguido de una precipitación con isopropanol o etanol y
posterior solubilización con agua o tampón. Existen diferentes técnicas para la extracción del ADN,
aunque todas conservan el uso de los mismos principios y fundamentos.
Para obtener ADN a partir de leucocitos totales (obtenidos de sangre periférica), células en cultivo,
tejidos animales, vegetales, levaduras y bacterias; se usa generalmente una técnica de cuatro pasos
secuenciales:
El primer paso consiste en la lisis de las células y los núcleos.
Luego, la separación del ADN
Las proteínas celulares son entonces removidas por un paso de precipitación salina, y
Finalmente, el ADN genómico es concentrado por precipitación.
El ADN purificado por medio de este proceso, está listo para ser utilizado en diferentes aplicaciones,
las cuales involucran: amplificaciones (PCR), digestión con endonucleasas de restricción, Southern
blot y Dot blot.
Existen métodos tradicionales y comerciales en los comerciales son kits que utilizan matrices
inorgánicas compactas cargadas positivamente capaces de retener varios microgramos de ADN y
separarlos del resto de las biomoléculas, permitiendo obtener un extracto libre de inhibidores. Los
kits se venden en presentación de membranas de sílice o perlas magnéticas, las primeras están
formadas por una resina y las segundas consisten de un centro de hierro recubierto por resina
(Dundass, et al. 2008). Durante la extracción, el ADN cargado negativamente se adsorbe o une a
la matriz selectiva de manera reversible y se mantiene unido a ésta durante la remoción de lípidos,
proteínas y metabolitos secundarios, posteriormente la molécula se libera de la matriz. Los combos
también incluyen soluciones de lisis, unión y lavado que no contienen fenol ni cloroformo para
28
extraer proteínas, tampoco requieren etanol para precipitar al ADN. Los kits comerciales disminuyen
la extracción a unas cuantas horas porque reducen el número de pasos del procedimiento y,
utilizados bajo las recomendaciones de cada proveedor, garantizan una extracción de alta pureza
ya que tanto la recuperación del ADN como la eliminación de contaminantes son muy eficientes.
(Qiagen, 2005)
1.8.2 Técnica de PCR
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés Polymerase Chain Reaction)
es, sin lugar a dudas, la técnica más importante y revolucionaria en biología molecular, debido a
que permite obtener in vitro millones de copias de un fragmento de ácido desoxirribonucleico (ADN)
a partir de una sola molécula. La PCR se basa en la replicación celular en la que actúan varias
proteínas para sintetizar dos nuevas hebras de ADN a partir de otra que funciona como molde. En
procariontes se han encontrado al menos 12 proteínas involucradas en la replicación. Estas
proteínas actúan en diferentes actividades, como:
1) La identificación del sitio de origen de la replicación
2) El desenrollamiento de la doble hélice
3) La estabilización de la estructura desenrollada
4) La generación de cadenas iniciadoras complementarias con un extremo 3’ libre que sirve
de iniciador para que la ADN polimerasa comience su actividad catalizadora
5) El avance de la bifurcación replicadora por desenrollamiento
6) os pasos finales del ensamblaje de dos cadenas complementarias
7) La identificación de los sitios de terminación
8) El superenrollamiento de las dos nuevas moléculas de ADN
Sin embargo, la enzima más importante en la replicación es la polimerasa del ADN dependiente de
ADN, comúnmente conocida como ADN polimerasa, porque es la encargada de incorporar
nucleótidos durante la síntesis de las nuevas cadenas de ADN. (Bohinski, 1991)
Generalmente, la PCR inicia con la desnaturalización o separación de la doble hélice de ADN
mediante el calentamiento de la muestra a una temperatura entre 94 y 96 °C para romper los
puentes de hidrógeno que las unían, de esta manera cada cadena queda como molde para la
síntesis de una nueva cadena complementaria de ADN. Una vez separadas las cadenas del ADN,
se alinean los iniciadores a sitios específicos complementarios de las cadenas sencillas de la región
que se va a amplificar, para que esto suceda se baja la temperatura entre 40 y 60 °C lo que permite
la unión (alineamiento) de los iniciadores. Finalmente, se sintetiza una nueva cadena en sentido 5’
a 3’ para lo cual se incrementa la temperatura, por lo general a 72 °C, porque es la temperatura
29
óptima a la cual la ADN polimerasa se une a los iniciadores y comienza la replicación. Estas tres
etapas:
1) Desnaturalización,
2) Alineamiento y
3) Extensión del ADN
Se repiten sucesivamente, en cada nuevo ciclo se amplifica simultáneamente la región de interés
de las dos cadenas complementarias. Los productos generados aumentan su concentración de
manera exponencial porque cada nueva copia sirve de molde en los ciclos subsecuentes (Figura
5), dando origen a millones de copias del fragmento seleccionado (Tabla 2). (Espinosa, 2007)
Figura 6. Amplificación de ADN mediante PCR.
30
Tabla 2 Copias de ADN generadas por la PCR en cada ciclo
1.8.3 Electroforesis
La electroforesis de ácidos nucleicos es el método habitual para separar, identificar y purificar
moléculas o fragmentos de DNA y RNA. En los tampones habitualmente utilizados, los ácidos
nucleicos están cargados negativamente y migran hacia el ánodo. Cada molécula aporta una carga
negativa (procedente del grupo fosfato), por lo que la relación carga/tamaño es prácticamente
constante e idéntica para todas las moléculas, independientemente de su tamaño (un nucleótido
tendrá la misma movilidad que un fragmento de doble cadena de 800pb o uno de 5kb).
31
La electroforesis de DNA se lleva a cabo en geles de agarosa o poliacrilamida. Ambos soportes son
restrictivos para los ácidos nucleicos, de modo que los diferentes fragmentos (al tener la misma
relación carga/tamaño), migran en función de su tamaño y/o conformación (tabla ).
Los geles de poliacrilamida (en cubetas verticales) se emplean para fragmentos pequeños
de DNA (5-500pb), así como para la mayoría de los RNA.
• Los geles de agarosa (en cubetas horizontales) se utilizan para fragmentos grandes de
DNA (500pb-10Mb); utilizando agarosas de distintas concentraciones (distinto grado de
reticulación) pueden separarse fragmentos de hasta 50kb aplicando un campo eléctrico
constante; para separar fragmentos de tamaño superiores a 50kb se utiliza la electroforesis
de campo pulsante en la que la dirección del campo eléctrico cambia periódicamente
(Cultek, 2006)
.
1.8.3.1Electroforesis en geles de agarosa.
Se trata del método más común para el análisis, purificación y obtención de DNA. Las agarosas
disponibles comercialmente presentan una amplia gama de grados de pureza y especificaciones.
La presencia de polisacáridos sulfatados, contaminantes en algunas agarosas, puede ser
perjudicial, ya que son inhibidores de las enzimas con las que va a tratarse el DNA purificado en la
electroforesis (polimerasas, ligasas, endonucleasas de restricción, etc.).
Un aspecto importante de las agarosas es su estado físico. La agarosa estándar gelifica a 35°C y
funde a 80-90°C, aunque las hay modificadas por adición de grupos hidroxietilo, que gelifican a
menos de 30°C y funden a 65°C. Estos datos son importantes, ya que finalizada la electroforesis,
el gel se puede licuar a temperatura superior a la de fusión y así separar el DNA en disolución.
(Cultek, 2006)
Tabla 3. Concentracion de agarosa para la separación de fragmentos de DNA
Agarosa (%) Intervalo de tamaños separables (kb)
0.3 5 – 60
0.6 1 – 20
0.7 0.8 - 10.0
0.9 0.5 - 7.0
1.2 0.4 - 6.0
1.5 0.2 - 3.0
32
2.0 0.1 - 2.0
1.8.4 Secuenciación
Esta técnica permite la lectura de la secuencia de bases nitrogenadas (A, C, T, G) de los nucleótidos
que componen una molécula de ADN. Los nucleótidos son piezas que combinadas en un orden
determinado constituyen la información genética de un organismo. Cada nucleótido tiene una sola de
estas bases nitrogenadas. Aunque el ADN forma una doble cadena, para la lectura de la secuencia de
las bases nitrogenadas de los nucleótidos se parte de una sola de las cadenas. Se requiere, además,
la presencia de un fragmento de ADN sintético, llamado cebador o primer, complementario a la cadena
de interés. La ADN polimerasa reconoce el cebador y, a partir de él, añade nucleótidos completando
de este modo una cadena complementaria a la original. En la técnica de secuenciación se llevan a
cabo 4 reacciones de síntesis independientes. Lo común en cada una de estas reacciones es la
presencia del ADN de interés, del cebador, de la ADN polimerasa y de los cuatro tipos de nucleótidos
(según la base nitrogenada que tengan) necesarios para la síntesis de la cadena complementaria. Lo
que diferencia entre sí a estas 4 reacciones es que en cada una de ellas se añade además uno de los
nucleótidos con una modificación (carece de un grupo OH necesario para la elongación de la cadena
de ADN). Cada vez que uno de estos nucleótidos modificados se incorpore al azar en el proceso de
síntesis que dirige la ADN polimerasa, la elongación se interrumpirá. Cada reacción proporciona por
tanto la información de las posiciones en las que se localiza uno de los nucleótidos. La combinación
de la información obtenida de forma independiente para cada nucleótido permite una lectura completa
de la secuencia complementaria al ADN original. La secuencia original se deduce fácilmente a partir
de la obtenida. Para poder visualizar la secuencia es necesario utilizar métodos comunes de marcaje
(radiactividad o fluorescencia). (FIBAO, 2007)
1.9 Técnicas empleadas para la caracterización del consorcio de microalgas
1.9.1 Determinación de biomasa
La determinación de la biomasa es una de las variables más importantes de un bioproceso, ya que
su determinación nos lleva a la comprensión de la eficiencia del mismo. Se trata de una variable
clave para establecer las tasas de producción, de consumo de nutrientes y el cálculo de los balances
de masa de cualquier proceso biológico. Los métodos clásicos de determinación de biomasa son
métodos directos que se basan en el número de células o en el peso celular. Los métodos de
enumeración celular son métodos de observación, basados en propiedades físicas o en la actividad
biológica. Actualmente hay un gran interés en métodos alternativos de determinación de la biomasa.
Estos métodos son indirectos y estiman algún componente celular o alguna actividad metabólica
33
específica. No requieren el examen visual de los organismos ni su incubación. En la Figura 5 se
muestra un resumen esquemático de los distintos métodos de determinación de 1a biomasa.
(Arnaíz, Isac, & Lebrato, 2000)
Figura 7. Esquema de los distintos métodos de determinación de la biomasa. (Arnaíz, Isac,
& Lebrato, 2000)
34
2 Justificación
Actualmente en México existe la problemática de alto índice de contaminación generado
principalmente por la generación de gases provenientes de la combustión de hidrocarburos o sus
derivados como la gasolina, además debido a las condiciones de estrés, economía, falta de tiempo
e información, se han detectado distintas patologías relacionadas por un pobre alimentación y el
consumo de alimentos de alto contenido calórico, esto aumentado las necesidades por tener una
mejor alimentación así como una movilidad más rápido en cualquier lugar. La investigación para la
disminución del riesgo a la salud y la reducción de los altos niveles de contaminantes, han llevado
a realizar investigaciones con consorcios de microalgas que tienen mejores rendimientos y
productividad que sea un posible alternativa a la problemática que se está viviendo.
En Quintana Roo la gran microbiota que cuenta este estado por su clima y altitud favorece el
crecimiento de una gran variedad de microrganismos, esto hace que las disponibilidades de este
tipo de muestra estén al alcance y de fácil obtención, por ello se realizó este proyecto para encontrar
una posible alternativa para los requerimientos de la sociedad en nuestros días. El cultivo de
microalgas se ha planteado como una solución transversal e integral a una gran cantidad de
problemas ambientales, farmacéuticos y alimenticios. Los impactos ambientales en los últimos años
han empezado a afectar la calidad de vida de las personas de manera drástica.
En contraste, la producción de diferentes componentes de microalgas tiene grandes ventajas sobre
los cultivos convencionales, como las siguientes:
Las microalgas al tener una estructura simple, tienen una mejor eficiencia fotosintética
teniendo de esta forma producciones mucho más altas que la de los cultivos convencionales.
Puede cultivarse en aéreas no aptas para la producción de alimentos.
La gran diversidad de especies de microalgas junto con sus diversos hábitats en los cuales
crecen, ofrecen menos restricciones en cuanto a condiciones geográficas y climáticas para
su cultivo.
Al tener mejores eficiencias fotosintéticas, el secuestro de CO2 por parte de estas es mucho
mayor.
Su capacidad de utilizar el CO2 de plantas térmicas, las hace además una forma de mitigar
el cambio climático.
La utilización de biodiesel a partir de microalgas, contribuye en gran medida a mantener las
emisiones de CO2 y sulfuro cercanas a cero.
Es posible obtener una gran variedad de valiosos productos a partir de las microalgas tales
como proteínas, polisacáridos, pigmentos, fertilizantes, entre otros.
35
Permiten diversificar la canasta energética de un país, disminuyendo de esta forma el riesgo
de un colapso por una oferta limitada.
Sin embargo, diversos estudios realizados con consorcios de microalgas nativas han
demostrado que su producción de lípidos de forma natural permita la producción de
biocombustibles como biodiesel y bioetanol, la clorofila producida sirve como desintoxicante
y finalmente la producción de biomasa permite utilizarla como suplemento alimenticio. Por
estas razones surge este proyecto tomando un consorcio de microalgas provenientes de
un cenote de Quintana Roo, además, de la alta producción de lípidos y clorofila es de fácil
obtención y disponibilidad.
Por último, el campo de las microalgas es un área amplia por explorar, su utilización en diversas
actividades económicas ofrece todo un mercado que impactar, a pesar de sus diferentes usos,
todavía es poco lo que se sabe en relación al cultivo de microalgas a gran escala con propósitos de
generación de biocombustibles u otros productos de valor
36
3 Objetivos
3.1 General
- Identificar y caracterizar el consorcio de microalgas provenientes de un cenote de Quintana
Roo en un sistema abierto y cerrado para la alternativa de producción de algún suplemento
alimenticio o para biocombustible.
3.2 Específicos
- Identificar por medio de técnicas de biología molecular las especies que se tienen en el
consorcio.
- Determinar la cantidad de clorofila que produce en condiciones controladas en un sistema
cerrado y un sistema abierto.
- Determinar la cantidad de lípidos que producen en condiciones controladas en un sistema
cerrado y un sistema abierto.
4 Metodología
En el presente proyecto se llevó a cabo una serie de técnicas para la identificación y caracterización
del consorcio de microalgas, para ello se necesitó de una lista de materiales, equipo y reactivos que
se presenta descritos en el presente proyecto.
4.1 Material y equipo
En el presente proyecto se requirió del siguiente material y equipo de laboratorio para llevar acabo
la metodología correspondiente:
Microtubos
Juego de micropipetas (10 µL, 50 µL, 100 µL, 1000 µL)
Una campana de flujo laminar
Una balanza analítica
Una centrifuga
Una parrilla de calentamiento
37
Pipetas graduadas
Charolas
Termociclador
Cámara de electroforesis
Frascos para cultivo
Sistemas de aeración
Bomba de aireación
Lámpara de iluminación
También se requirieron de los siguientes reactivos para las metodologías:
Solución 1N de NaOH
Metanol 90%
Cloroformo
Metanol
Agua destilada
Agarosa
TAE 5x
Marcador de peso molecular
Colorante para ADN
Para la elaboración del medio de cultivo se requirieron también de los siguientes reactivos con su
respectiva cantidad por litro:
Tabla 4. Medio BG11
Componente g por cada L
NaNO3 1.5
K2HPO4 0.04
MgSO4- 7 H2O 0.075
CaCl – 2 H2O 0.036
NaCO3 0.02
Solución Stock 1 mL
Trace metal mix A5 1 mL
Solución Stock 10x (Diluir en 10 mL)
Ácido Cítrico 0.06 g
Citrato de Amonio Ferrico 0.06 g
38
EDTA (sal disodica) 0.01 g
Mezcla de A5 de trazas de metales
Componentes 10x (Diluir en 100 mL)
H3BO3 0.286 g
MnCl2 - 4 H2O 0.0181 g
ZnSO4 - 7 H2O 0.0222 g
NaMoO4 – 2 H2O 0.039 g
CuSO4 – 5 H2O 0.0074 g
También se utilizó para la técnica de PCR unos cebadores para la amplificación de ADN
Primers Cella
4.2 Cepas de microalgas y condiciones de cultivo
Se estudió una muestra proveniente de un cenote de Quintana Roo, se hizo crecer en medio de
cultivo BG11 en una cantidad de 500mL anteriormente descrito, posteriormente se realizó un
crecimiento de esta muestra en un frasco con una cantidad de inoculo de 50 mL de la muestra en
450mL de medio. Las condiciones a las que se trabajó fueron: luminosidad constante, aireación de
1 vvm, pH 7, a una temperatura ambiente aproximadamente de 28°C, en sistema cerrado y también
se realizó en un sistema abierto con las mismas características de sistema anterior.
4.3 Métodos
4.3.1 Extracción de ADN
Se realizó la extracción de RNA de las muestras con el protocolo de TriPure Reagent
(Roche, Alemania).
Por cada 100mg de sedimento del reactor se agregó 1mL de TriPure, para luego
homogenizar. Se incubó la mezcla 5 min a temperatura ambiente, luego se agregó
cloroformo (0.2 mL por cada 1mL de TriPure) y se agitó 15 segundos. Se dejó incubando a
temperatura ambiente durante 15 min, para la separación de las fases se centrifugó a
12,000 x g durante 15 min a 4℃. Despues de la centrifugaión se visualizaron tres fases,
para la extracción de RNA se recuperó la fase acuosa, incolora superior y se pasó a un tubo
de propileno limpio. Posteriormente se agregó isopropanol (0.5 mL por cada 1 mL), se
mezcló por inversión, la muestra se incubó por 10 min y después se centrifugó a 12,000 x
g durante 10 min a 4℃, se descartó el sobrenadante. Se agregó etanol al 75% 1:1 al tubo
39
y se centrifugó nuevamente a 7,500 x g durante 5 min a 4℃, por último se descartó el
sobrenadante y se dejó secar la pastilla, la cual se resuspendió en H2O libre de RNAsas.
4.3.2 Electroforesis
Se adiciono 1g de agarosa a 50 mL de buffer (TAE 1x) en un matraz, esta solución se llevó a
calentamiento para fundir totalmente la agarosa, dejar enfriar la solución. Mientras la solución de
agarosa se enfría, preparar el molde en el que se va a hacer el gel sellando los bordes con
cinta masking y colocarle el peine en la posición deseada. Posteriormente verter
cuidadosamente la solución de agarosa en el molde y dejar solidificar.
Después mezclar la muestra de ADN con el buffer de carga y el colorante. Una vez
solidificado el gel quitarle los sellos de masking y colocarla en la cámara de electroforesis,
retirar el peine e inundar la cámara con buffer de electroforesis (TAE 1x) hasta que cubra
el gel, cargar los pocillos con las muestras que se prepararon, después se conecta los
cables a la fuente de energía que aplicara un voltaje de 90 volts por 40 min o hasta que el
colorante este a 75% de la corrida, después sacar el molde con el gel y llevarlo al
transiluminador para visualizar el bandeo de la muestra y tomar una fotografía al gel.
4.2.2 Amplificación con PCR
Se realizó RT-PCR con 50ng de DNA total y con los iniciadores fueron Cella de proveedor
invitroyen. La síntesis de cDNA se realizó con un ciclo de 30 min a 55°C y al final una
desnaturalización a 94°C por 2 min. La amplificación de los fragmentos se realizó en un
termociclador por 35 ciclos a las siguientes temperaturas:
Desnaturalización a 95°C por 30 s.
Temperatura de hibridación, 56°C por 30 s.
Elongación 72°C por 30 s.
Al final 5 min a 72°C.
Todas las reacciones se realizaron en un volumen de 50μL: el mix de reacción (1X),
5μL de RNA, iniciadores a una concentración de 10 μM, 1μL de RT Super Script III One-
40
Step RT-PCR System with Platinum Taq de invitrogen y se completó el volumen con agua
grado PCR.
El corrimiento de electroforesis se realizó en geles de agarosa al 1%, en TAE 1X, durante 40 min a 90 Volts
4.2.3 Determinación de Biomasa
Se pesaron charolas y se dejaron en la estufa a peso constante por 24 h a una temperatura de 80°
C, después se tomaron 5 mL de y se adicionaron a las charolas que se dejaron enfriar, luego se
dejó la muestra secar en la estufa a 80°C por 12 h, pasado el tiempo de secado se pesó la charola
y por diferencia de pesos se determinó la cantidad de biomasa que contenía la muestra.
• 4.2.4 Determinación y cuantificación de Clorofila (Song et al., 2008)
Se tomaron 5 mL de la muestra del consorcio y se llevó a centrifugar 15 min a 3700 rpm, se desechó
el sobrenadante y se recuperó la pastilla de celular a la cual se le adicionó una solución de metanol
al 90% y se agito vigorosamente, posteriormente se calentó a baño maría por 5 min a una
temperatura de 70°C y después se llevó a refrigeración destapados por 24 h. Trascurrido el tiempo
se volvió a centrifugar a 3700 rpm durante 15 min y se leyó la muestra a 665 nm y 750 nm. Con las
lecturas se determinó la concentración de clorofila con la ecuación que se muestra a continuación.
𝐶ℎ𝑙𝑎 =13.9 ∗ (𝐴665 − 𝐴750) ∗ 𝑀𝑒𝑡.
𝑉 ∗ 𝐷𝑤
Met. = Volumen empleado de Metanol
V = Volumen de muestra
Dw = Peso seco (mg/L)
• 4.2.5 Determinación y cuantificación de Lípidos (Folch et. al.1957)
Se tomaron 50 mL de la muestra del consorcio y se le adiciono una solución de NaOH 1N hasta
alcanzar un pH de 10, después se dejó sedimentar por algunos minutos (2- 3 min), se separó por
decantación y se llevó a congelación por 24 h, después del tiempo transcurrido se descongelo la
muestra y se agito vigorosamente por 10 min. Al finalizar el tiempo se le adiciono 5 ml de Cloroformo:
metanol (2:1), después se centrifugo dos veces una a 5000 rpm por 10 min y otra a 3700 rpm por
15 min, luego de las centrifugaciones se le retiro la capa superior y la capa inferior quedándose con
la fase intermedia. Después se secó en la estufa a 80°C por 12 h. Ya seca la muestra se determinó
la cantidad de lípidos totales por diferencia de pesos y se utilizó la siguiente ecuación.
41
𝐿í𝑝𝑖𝑑𝑜𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠 =𝑀
𝑉 ∗ 𝐷𝑤
M = masa de lípidos totales (g)
Dw = peso seco (g/mL)
V= volumen de la muestra (mL)
5 Resultados
Para la identificación se realizó una extracción de ADN, posteriormente se amplifico por la técnica
de PCR al finalizar esa técnica se cargaron las muestras en un gel de agarosa, el cual se muestra
en figura 8.
Figura 8. Gel de agarosa: PM (Marcador de peso molecular), M1-M9 se encuentran las
muestras de ADN de la amplificación por PCR del consorcio de microalgas.
Se mandaron a secuenciar y obtuvieron secuencias como se muestra en la figura 9, se realizó una
alineación entre ellas para obtener una secuencia consenso y así alinearlas con las similitudes que
tenía en la base de datos de NCBI.
PM M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9
1450 pb
42
Figura 9. Secuenciación de la muestra obtenidas en la amplificación con PCR
Las secuencias consenso obtenidas del alineamiento se identificaron en la base de datos mostrando
una similitud entre las bases muy alta como se muestra en la tabla 6.
Tabla 5. Organismos identificados en base de datos, su similitud y el número de pb.
Organismo Similitud en porcentaje (%) Peso molecular
Chlorella sorokiniana 99 1450 pb
Chlorella thermophila 99 1435 pb
Posteriormente se llevó a cabo la caracterización del consorcio a partir de la realización de cinéticas
de crecimiento obteniéndose unos gráficos que muestran su comportamiento en los distintos
sistemas..
En la figura 10 se observa el comportamiento del crecimiento del consorcio en el sistema cerrado
se muestra la concentración máxima que alcanza el consorcio a un tiempo determinado.
43
Figura 10. Gráfico de producción de biomasa del consorcio de microalgas en sistema
cerrado
De igual manera en la figura 11 se observa el comportamiento del consorcio en los sistemas abiertos
que tienen un areerglo diferente al sistema cerrado.
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
0 50 100 150 200 250 300
Bio
mas
a (m
g/L)
tiempo (h)
Cineticas
Cinetica 1 (15°C)
Cinetica 2 (25°C)
Cinetica 3 (35°C)
44
Figura 11. Gráfico de producción de biomasa en sistema abierto en configuración columna
de agitación y airlift
En la tabla 7 se encentran la concentración máxima en que el consorcio alcanza en las cinéticas
que se llevaron a cabo para este proyecto.
Tabla 6. Concentración de biomasa en sistema abierto y cerrado
Sistema Cerrado (Cinéticas) Concentración de biomasa
(mg/l)
Tiempo (h)
Cinética 1 (15°C) 3360 168
Cinética 2 (25°C) 3420 168
Cinética 3 (35°C) 3340 168
Sistema Abierto (Cinéticas) Concentración de biomasa
(mg/l)
Tiempo (h)
Columna de agitación (25° C) 3200 96
Airlift (15°C) 3100 96
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Bio
mas
a (m
g/L)
Tiempo (h)
Biomasa
Airlift
Agitacion
45
En cuanto a la cuantificación de clorofila también se obtuvieron unos gráficos que se aprecian en la
figura 12 y figura 13 respectivamente de cada sistema que se trató.
Figura 12. Gráfico de producción de Clorofila en sistema cerrado
0
0.0005
0.001
0.0015
0.002
0.0025
0.003
0 50 100 150 200 250 300
Co
nce
ntr
acio
n (
mg
Cla
/mgB
iom
asa)
Tiempo (h)
Clorofila
Clorofila 15°
Clorofila 25°
Clorofila 35°
46
Figura 13. Gráfico de producción de clorofila en sistema abierto en reactores configuración
columna de agitación y airlift
En la tabla 8 se reportan las concentraciones de clorofilas totales de los diferentes reactores así
como el tiempo en que se alcanzó dicha concentración.
Tabla 7. Concentración de la producción de clorofila del consorcio en un sistema cerrado y
un sistema abierto
Sistema cerrado Concentración de clorofila (mg
cla/mg biomasa)
Tiempo (h)
Cinética 1 (15°C) 0.002626298 96
Cinética 2 (25°C) 0.001952893 216
Cinética 3 (35°C) 0.00243601 96
Sistema Abierto Concentración de clorofila (mg
cla/mg biomasa)
Tiempo(h)
Columna de agitación (25° C) 0.00240138 168
Airlift (25°C) 0.00229752 168
0
0.0005
0.001
0.0015
0.002
0.0025
0.003
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Co
mce
ntr
acio
n (
mg
cla/
mg
bio
mas
a)
Tiempo (h)
Clororila
Agitacion
Airlift
47
Por último, se muestran los gráficos de producción de lípidos totales que se observan en la figura
14 y figura 15 de cada sistema empleado.
Figura 14. Gráfico de Producción de lípidos en sistema cerrado
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0 50 100 150 200 250 300
Líp
ido
s to
tale
s (g
/g)
Tiempo (h)
Lipidos
Lipidos 15°
Lipidos 25°
Lipidos 35
48
Figura 15. Gráfico de producción de lípido en sistema abierto en reactores de configuración
columna de agitación y airlift
En la tabla 9 se encuentra la concentración de lípidos en el consorcio en los dos sistemas
propuestos para comparar en que sistema existe la mejor producción de lípidos totales.
Tabla 8. Concentración de la producción de lípidos del consorcio para un sistema cerrado y un sistema abierto Sistema cerrado Concentración de lípidos
(g/g)
Tiempo (h) Lípidos (% peso
seco)
Cinética 1 (15°C) 0.227375566 96 22.73
Cinética 2 (25°C) 0.239572193 96 23.93
Cinética 3 (35°C) 0.243612597 96 24.36
Sistema abierto Concentración de lípidos
(g/g)
Tiempo (h)
Columna de agitación
(25° C)
2.48x10-6 48 0.0002
Airlift (25°C) 1.51x10-6 48 0.0001
0
0.0000005
0.000001
0.0000015
0.000002
0.0000025
0.000003
0 20 40 60 80 100 120
Líp
ido
s to
tale
s (g
/g)
tiempo (h)
Lipidos
Agitacion
Airlift
49
6 Discusión
Después del tratamiento de las muestras para la identificación se requirió de la utilización de unos
softwares llamados MEGA7 (Molecular Evolutionary Genetics Analisys versión 7.0) y BioEdit
Secuence Alignment Editor, los cuales ayudaron para la obtención de las secuencias consenso
(tabla 5) que se introdujeron a la base de datos de National Center for Biotechnologyc Information
(NCBI), en esa base de datos se identificó dos especies del genero Chlorella, una de ellas es
Chlorella sorokiniana y la otra es Chlorella thermophila con una alta similitud respectivamente (tabla
6), estas son algas verdes de agua dulce la primer fue descubierta en 1890 por el microbiólogo
holandés Martinus W. Beijerinck mientras que la segunda fue encontrada recientemente el año
pasado por Shuai Ma y colaboradores.
En cuanto a las características del consorcio se llevó a cabo cinéticas de crecimiento para
caracterizar la muestra tanto en un sistema cerrado como un abierto, para el caso de la
concentración celular, el inoculo de consorcio de microalgas para los dos sistemas hubo una
variación significativa por lo que se reflejado en la producción de lípidos y clorofila respectivamente.
En las figuras 10 y 11 se muestra el crecimiento del consorcio en donde tienen un comportamiento
como la ecuación de Monod. Sin embargo, en el sistema abierto los tiempos en los que se presentan
cada una de las fases son a distintos a los del sistema cerrado, eso nos da la pauta que el
comportamiento es diferente, aunque con la misma característica de crecimiento, se observó que
la temperatura influye mucho en el crecimiento de este consorcio, puesto que en el sistema abierto
la trasferencia de calor es mayor que en un sistema cerrado esto hace que la concentración celular
de microalgas sea menor que en un sistema abierto, además de que la configuración de dichos
sistemas son diferente el sistema cerrado se mantiene en agitación por burbujeo siendo un área
menor de contacto de la burbuja y la configuración del sistema abierto son dos columnas una
configuración airlift y la otra como columna de agitación, esto hace que en el sistema abierto tenga
una mayor área de contacto en cuanto a la trasferencia de calor y la aeración. Por lo tanto la
concentración a la máxima que alcanzan es similar para ambos sistemas como se muestra en la
tabla 7 sin embargo se reporta por Fernández (2013) que la concentración en un sistema abierto
con las condiciones similares que se llevó a cabo para este proyecto es una cantidad de mayor
aunque a un intervalo mayor de tiempo, por lo que el consorcio alcanza una concentración menor,
siendo los requerimientos de las dos microalgas encontradas diferentes, esto nos da la pauta para
considerar que algún desecho de cualquiera de las dos podriaser un inhibidor del crecimiento. Sin
embargo, tanto la configuración de columna de agitación como airlift hay puntos ciegos que pueden
favorecer la sedimentación del consorcio esto no favorece al crecimiento y se ve reflejado también
en la escases de la producción de clorofilas y lípidos.
Para la producción de clorofila se tienen que los comportamientos en cada sistema si varían (figura
12 y figura 13) demasiado, se vio afectada la producción de este pigmento por la agitación como se
50
menciona anteriormente los puntos ciegos de las configuraciones de los reactores afecta en la
concentración de dicho pigmento, por otra parte, también se reporta que la agitación excesiva afecta
directamente a las microalgas lo cual se ve reflejada en la producción de clorofila. Para que una
microalga produzca este tipo de pigmentos debe de contener en el medio nitratos, el medio usado
favorece la producción de ese pigmento por el alto contenido de nitratos en el medio, pero lo que
produce Chlorella sorokiniana por si sola es una cantidad en 1.1 a 2.05 pg/g de células (Moronta,
Mora, & Morales, 2006) se observó que la cantidad producida por el consorcio es una cantidad
superior de este parámetro como se muestra en la tabla 8, lo cual puede deberse a que la cantidad
este repartida entre la dos microalgas que se tiene en el consorcio.
En cuanto a los lípidos la especie Chlorella sorokiniana produce un aproximado de 13 a 23% peso
seco de lípidos (Illman, et al. ,2000; Zheng et al.,2012) por lo que se consideró que la producción a
las condiciones que se trabajó fueron suficientes para que en un tiempo relativamente corto como
se muestra en la tabla 9, la producción de lípidos se ve reflejado por la cantidad de biomasa sin
embargo para que haya una mejor producción de lípidos se debe de tener en estrés la microalgas,
ya que pueden cambiar si metabolismo para generar una mayor producción de lípidos, aunque en
el caso del proyecto las condiciones no eran de estrés favorece al crecimiento lo cual hace que las
microalgas tengan una baja producción, en cuanto a los dos sistemas se ve mejor una producción
en el sistema cerrado esto se debe a que la temperatura del medio se mantiene constante y también
influye la aireación ya que la agitación no es la misma en cuanto al burbujeo que se genera en los
dos sistemas. Para el sistema abierto como fue un sistema nuevo para el consorcio se estaba
adaptando, pero si afecta más la agitación en esos sistemas porque tiene mayor burbujeo, aunque
sea la misma velocidad de flujo de aire el área de contacto es mayor esto favorece más en la
producción de pigmento y no para la producción de lípidos (Cobos, et al., 2015).
7 Conclusiones
• Se identificaron las especies de microalgas contenidas en el consorcio del cenote de
Quintana Roo.
• Un sistema cerrado tiene un mejor desempeño para la producción de lípidos totales y
clorofila totales.
• Se alcanzan altas concentraciones de clorofila total 1.9 a 2.6 pg/g biomasa, en tiempos
reducidos que rebaza lo reportado por Moronta et. al. (2006)
• En cuanto a la producción de lípidos se alcanzaron 22% a 24% , sin embargo, la cantidad
que produce rebaza lo reportado por Arias (2013) de la especie Chlorella sorokiniana
51
8 Recomendaciones
Para las próximas investigaciones recomiendo lo siguiente:
Realizar el aislamiento de las especies del consorcio y realizar las mismas metodologías
para comparar las producciones individuales de las microalgas con el consorcio.
Realizar la identificación de los tipos de lípidos que produce el consorcio, así como
también de las clorofilas.
Considerar diferentes condiciones de operación (modificar el fotoperiodo, pH,
Temperatura, agitación, volumen, la luminosidad, entre otros).
Realizar pruebas para determinar la cantidad de proteína y carbohidratos que genera el
consorcio.
52
Referencias
Arnaíz, C., Isac, L., & Lebrato, J. (2000). Determinación de biomasa en procesos biológicos. Sevilla,
España: Universidad de Sevilla.
Bohinski, R. (1991). Bioquímica. Mexico: Pearson Education.
Cañizares, R., Rivas, L., Montes, C., Domínguez, A., Travieso, L., & Benítez, F. (1994). Arted swine
wasterwater treatment with k.carrageenan immobilized Sirulina maxima. Bioresource
Technol 47, 89-91.
Cobos, R. M., Paredes Rodríguez, J., & Castro Gómez, J. (2016). C. Inducción de la producción de
lípidos totales en microalgas sometidas a estrés nutritivo. Acta biológica Colombiana, 17-26.
Cultek. (Febrero de 2006). Soluciones electroforiticas. Obtenido de Potocolos y Tecnicas:
www.cultek.com
Dreckmann, K. M., Sentíes, A., & Nuñez, M. L. (2013). Manual de Practicas de Biología de Algas.
México: Universidad Autonoma metropolitana Unidad Iztapalapa , División de Ciencias
Biológicas y de la Salud .
Espinosa, L. (2007). Guía práctica sobre la técnica de PCR. Mexico: Eguiarte L., V. Souza y X.
Aguirre (comps.). Ecología molecular. Secretaría de Medio Ambiente y Recursos Naturales,
Instituto Nacional de Ecología, Comisión Nacional para el Conocimiento y Uso de la
Biodiversidad e Instituto de Ecología.
Fernandez, M. (Octubre de 2013). Diseño, montaje y caracterización de fotobiorreactores airlift para
el cultivo de la microalga Chlorella sorokiniana. Medillin, Colombia.
FIBAO. (5 de Octubre de 2007). Secuenciación. Obtenido de Medicina Molecular:
http://medmol.es/tecnicas/27/
Folch, J., Lees, M., & GH., S. S. (1957). A simple method for the isolation and purification of total
lipides from animal tissues. J Biol Chem, 497-509.
Ghershman, E. (2006). Células procariotas. Obtenido de
http://www.galileog.com/ciencia/biologia/celulas.
Gonzales, A. C. (2015). ¿Qué son la microlagas? Barcelona: Cajamar ADN Agro.
Gomez, L. (2007). Microalgas: aspectos ecologicos y biotecnologicos. Revista cubana de química,
3-4.
Illman, A., Scragg, A., & Shales, S. (2000). Increase in Chlorella strains calorific values when grown
in low nitrogen medioum. Enzyme Mricrob. Technol., 631-635.
Kumar, A., Ergas, S., Yuang, X., Sahu, A., Zhang, Q., Dewulf, J., . . . al., e. (2010). Enhanced CO2
fixation and biofuel production via microalgae: recent developments and future. Trends in
biotecnology No. 28, 378.
Lee, R. E. (1980). Phycology. Cambridge: Cambridge University Pres.
Milledge, J. (2011). Commercial application of microlagae other than as biofuels: a brief review.
Review in Environmental Science and Biotechnology, 10 (1) 31-41.
53
Moronta, R., Mora, R., & Morales, E. (2006). Respuesta de la microalga Chlorella sorokiniana al pH,
salinidad y temperatura en condiciones axénicas y no axénicas. Maracaibo: Departamento
de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad del Zulia.
Mutanda, T. e. (2011). Mutanda, T., et al.(2011). Bioprospecting for hyper-lipid producing microalgal
strains for sustainable biofuel production. . Bioresource technology, No 102, pp. 57.
Priyarshani, I., & Rath, B. (2012). Commercial and industrial applications of micro algae – A review.
J. Algal Biomass Utln, 89-100.
Razzak, S., & al., e. (2013). Integrated CO2 capture, wastewater treatmente and biofuel production
by microalgae culturing- A review. Renewable and Sustainable Energy Reviews No. 27,
623.624.
Richmond, A. (2004). Handbook of Microalgal culture. Carlton, Australia: Blackwell Science.
Santos, A. m., González, Y. A., & Martín, C. S. (2014). Uso y aplicaciones potenciales de las
microlagia. Canales de mecánica y electricidad, 20-28.
Song, D., Fu, J., & Shi, D. (2008). Exploitation of oil-bearing microalgae for biodisel. Chin. J. Biotech,
341-348.
Shi, J., Podola, B., & Melkonian, M. (2013). Application of a prototype-scale Twin-Layer
photobioreactor for effective N and P removal from different process stanges of municipal
wastewater by immobilized microalgae. Bioresource tecnology No. 154, 260-261.
Viveros, J. S. (2014). Evaluación de las aguas domesticas de la universidad de occidente como
medio de cultivo natural para la microalga nativa Chlorela sp. y simultaneamente su
capacidad pra remover nitrato y DQO de dichas aguas. Santiago Cali: Universidad de
Occidente, Facltad de ingeniería, Departamento de Energetica y mecanica.
Ugwu, C., Ogbonna, J., & Takana, H. (2005). Characterization of light utilization and biomass yields
of Chlorella sorokiniana in inclined outdoor tubular photobioreactors equipped with static
mixers. Proceeds on Biochemistry, 3406-3411.
Zheng, Y., Chi, Z., Lucker, B., & Chen, B. (2012). Two-stage heterotrophic and phototrophic culture
strategy for algal biomasss and lipid production. Bioresour Technol., 484-488.
