INFLUENCIA DE COMPVIT-B® SOBRE LA NEUROGÉNESIS PRE Y...

INFLUENCIA DE COMPVIT-B® SOBRE LA NEUROGÉNESIS PRE Y POSTNATAL DE RATAS WISTAR

ERIKA LUCIA MAYORGA BELTRÁN

UNIVERSIDAD DEL TOLIMA FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS

PROGRAMA DE BIOLOGÍA IBAGUÉ

2013

INFLUENCIA DE COMPVIT-B® SOBRE LA NEUROGÉNESIS PRE Y POSTNATAL DE RATAS WISTAR

ERIKA LUCIA MAYORGA BELTRÁN

Trabajo de tesis presentado como requisito parcial para optar al título de Biólogo

LILIANA FRANCIS TURNER PhD. Fisiología Celular

Directora

TERESA GONZÁLEZ GAY Licenciada en Biología

Tecnóloga en Procesos de la Industria Farmacéutica Codirectora

UNIVERSIDAD DEL TOLIMA FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS

PROGRAMA DE BIOLOGÍA IBAGUE

2013

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"Bienvenido a mi casa. Venga libremente, váyase a salvo,

y deje algo de la alegría que trae consigo"

Abraham Stoker - Drácula

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NOTA DE ACEPTACIÓN El trabajo de grado titulado, ―INFLUENCIA DE COMPVIT-B® SOBRE LA NEUROGÉNESIS PRE Y POSTNATAL DE RATAS WISTAR‖ presentado por la estudiante ERIKA LUCIA MAYORGA BELTRÁN, para optar al título de Biólogo, fue revisado y calificado como:

_____________________________ Dra. Liliana Francis Turner

_____________________________ Dra. Teresa González Gay

_____________________________ Firma de jurado

_____________________________ Firma de jurado

Ibagué, de Agosto 2013

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DEDICATORIA

El esfuerzo, la dedicación y la paciencia dados en la ejecución de este proyecto no pueden ser para otro más que Dios. Gracias a Él, se cruzaron en mi camino las personas correctas en el momento correcto, y solamente gracias a Él pude llevar a término esta investigación que no solo deja conocimientos a mí y a la ciencia, sino personas, momentos y palabras que ahora definen la profesional en la que me convierto.

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AGRADECIMIENTOS

Mis agradecimientos se extienden a todos los que de alguna manera contribuyeron a culminar con éxito esta importante etapa. A Dios, quien define mi moral. A mi familia, por su apoyo incondicional, a mis primas Luisa Alejandra y Lorena, a mi madre, mis hermanas, y muy especialmente a mi Padre, Germán Mayorga quien no ha dudado jamás en darme su apoyo en mis decisiones. Mis amigas de toda la vida, Isliana, Diana, mi mejor amiga Jessica, porque tengo mucha suerte de tenerlas y porque a pesar de no tener ni idea de lo que hacía o por qué lo hacía, siempre me acompañaron. A mis amigas de la UT, Johana, Yudy, Jacquelin, Eliana y Jeniffer, por trasnocharse, llorar, reír, viajar, pelear y participar en muchas otras importantes actividades de la carrera conmigo. Gracias a la Universidad del Tolima, a la Facultad de Ciencias Básicas y al Programa de Biología. Muchas gracias al GRUPO DE MODELOS EXPERIMENTALES PARA LAS CIENCIAS ZOOHUMANAS, por acoger mi proyecto y ser la cuna de mi interés como investigador en neurociencias. A todos sus integrantes porque de alguna manera tuve su colaboración durante la ejecución del proyecto y porque sé que más que el apoyo académico, tengo su amistad. Angélica, muchas gracias por acompañarme. Liliana Francis Turner, gracias por ser una inspiración en mi vida académica y un ejemplo como persona y profesional.

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TABLA DE CONTENIDO

Pág INTRODUCCIÓN 19 1. OBJETIVOS 21 1.1 OBJETIVO GENERAL 21 1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 21 2. MARCO REFERENCIAL 22

2.1 NEUROGÉNESIS 22

2.1.1 Neurogénesis Embrionaria 22

2.1.2 Desarrollo Postnatal 26 2.1.3 Neurogénesis Adulta 27

2.2 FACTORES QUE INFLUYEN EN LA NEUROGÉNESIS 29

2.3 VITAMINAS 31

2.4 COMPLEJO B 31

2.5 COMPVIT -B® 35 2.6 LABERINTO ACUÁTICO DE MORRIS (LAM) 36

2.7 BrdU 37

3. METODOLOGÍA 39

3.1 SUJETOS EXPERIMENTALES 39

3.2 GRUPOS EXPERIMENTALES- TRATAMIENTO PRENATAL 41

8

3.2.1 Seguimiento al Ciclo Estral 41

3.2.2 Inyección Intraperitoneal 41 3.3 GRUPOS EXPERIMENTALES – TRATAMIENTO POSTNATAL 42 3.3.1 Test Neurológico 42 3.3.2 Laberinto Acuático de Morris (LAM) 43 3.3.3 Marcaje de células con BrdU 45 3.3.4 Perfusión 45 3.3.5 Inmunofluorescencia 45 3.4 ANÁLISIS ESTADÍSTICO 46 4. RESULTADOS 47 4.1 APAREAMIENTO CONTROLADO Y SEGUIMIENTO DE LA GESTACIÓN 47 4.2 LABERINTO ACUÁTICO DE MORRIS (LAM) 49 4.2.1 LAM del Tratamiento Prenatal 49 4.2.2 LAM del Tratamiento Postnatal 52 4.3 INMUNOFLUORESCENCIA 55 4.3.1 Inmunofluorescencia del tratamiento prenatal 56 4.3.2 Inmunofluorescencia del tratamiento post natal 58

5. DISCUSIÓN 62 6. CONCLUSIONES 68 REFERENCIAS 69 ANEXOS 100

9

LISTA DE FIGURAS

Pág.

Figura 1. Línea del tiempo de los principales eventos en el desarrollo del cerebro.

23

Figura 2. Comparación de los principales eventos del desarrollo en cerebros de ratas y humanos

25

Figura 3. Neurogénesis y células madre neuronales en el cerebro adulto.

28

Figura 4. Estructura de la Tiamina. 32

Figura 5. Estructura de la Piridoxina.

33

Figura 6. Estructura de la Cianocobalamina

34

Figura 7. BrdU (5-bromo- 2’-deoxyuridina) Bromodeoxiuridina. 37

Figura 8. Agrupación de los tratamientos experimentales

39

Figura 9. Metodología experimental. 40

Figura 10. Descripción de las características del aparato para realizar LAM

44

Figura 11. Comparación de la ganancia en peso durante la gestación.

47

Figura 12. Comparación del número de días de gestación respecto del tratamiento.

48

Figura 13. Número de animales nacidos y sobrevivientes por camada

49

Figura 14. Latencia de Escape en el LAM de adquisición para los animales tratados en etapa prenatal Figura 15. Latencia de escape en el tercer día del LAM de adquisición y la fase de retención para los animales tratados en la etapa prenatal

50

50

10

Figura 16. Latencia de Escape en el LAM de retención para los animales tratados en etapa prenatal.

51

Figura 17. Latencia de escape en el LAM de transferencia para los animales tratados en etapa prenatal.

52

Figura 18. Latencia de escape en el LAM de adquisición para los animales tratados en etapa neonatal. Figura 19. Latencia de escape del tercer día del LAM de adquisición y la fase de retención para los animales tratados en etapa postnatal

53

53

Figura 20. Latencia de Escape en el LAM de retención para los animales tratados etapa neonatal.

54

Figura 21. Latencia de escape en el LAM de transferencia para los animales tratados en etapa neonatal.

55

Figura 22. Controles de procedimiento para el doble marcaje

56

Figura 23. Inmunofluorescencia del grupo prenatal que recibió Compvit-B ®

56

Figura 24. Inmunofluorescencia del grupo prenatal tratado con el vehículo

57

Figura 25. Número de células marcadas con BrdU y NeuN en los animales tratados en la etapa embrionaria

57

Figura 26. Inmunofluorescencia de los animales tratados con Compvit-B® en la etapa postnatal

58

Figura 27. Inmunofluorescencia de animales tratados con vehículo durante la etapa postnatal

58

Figura 28. Número de células marcadas con BrdU y NeuN en los animales tratados en la etapa post natal

59

Figura 29. Inmunofluorescencia de todos los tratamientos en etapas pre y pos natal

60

Figura 30. Comparación del número de células marcadas con BrdU y NeuN en los animales tratados en las etapas prenatal y postnatal

61

11

Figura 31. Fases del Ciclo Estral

108

Figura 32. Espermatozoides de rata Wistar tomados de citología vaginal exfoliativa

108

Figura 33. Ejecución del Laberinto Acuático de Morris

116

Figura 34. Esquema de cráneo de rata

123

Figura 35. Esquema de la inserción de la aguja en el corazón de la rata 127

12

LISTA DE CUADROS

Pág.

Cuadro 1. Factores que influencian la neurogénesis. 30

Cuadro 2. Distribución y actividades en los grupos de la primera etapa experimental

41

Cuadro 3. Distribución y actividades en los grupos durante la segunda etapa experimental

42

Cuadro 4. Descripción de los procedimientos realizados en el Test Neurológico.

43

Cuadro 5. Descripción de las pruebas estadísticas realizadas

46

Cuadro 6. Proporción celular que se observa en el tejido vaginal durante cada fase del ciclo estral

107

Cuadro 7. Resultados de la prueba de normalidad en el LAM prenatal

134

Cuadro 8. Resultados de la prueba de normalidad en el LAM postnatal

134

Cuadro 9. Resultados de la prueba de normalidad para el conteo celular del doble marcaje BrdU y NeuN

135

Cuadro 10. Resultados de la estadística descriptiva de los animales tratados con Compvit-B® en etapa prenatal

135

Cuadro 11. Resultados de la estadística descriptiva de los animales tratados con vehículo en etapa prenatal

135

Cuadro 12. Resultados de la estadística descriptiva de los animales tratados con Compvit-B® en etapa post natal

136

Cuadro 13. Resultados de la estadística descriptiva de los animales tratados con vehículo en etapa post natal

136

Cuadro 14. Resultados de la estadística para el conteo celular del doble marcaje BrdU y NeuN

137

13

Cuadro 15. ANOVA en fase de adquisición del LAM para los animales tratados en etapa prenatal

137

Cuadro 16. Test de probabilidad Post-hoc para la ANOVA en fase de adquisición del LAM de los animales tratados en etapa prenatal con interacción 1x2

138

Cuadro 17. ANOVA en fase de retención del LAM para los animales tratados en etapa prenatal

138

Cuadro 18. ANOVA en fase de transferencia del LAM para los animales tratados en etapa prenatal

138

Cuadro 19. Test de probabilidad Post-hoc para la ANOVA en fase de transferencia del LAM de los animales tratados en etapa prenatal con interacción 1x2

139

Cuadro 20. ANOVA en fase de adquisición del LAM para los animales tratados en etapa post natal

139

Cuadro 21. Test de probabilidad Post-hoc para la ANOVA en fase de adquisición del LAM de los animales tratados en etapa postnatal con interacción 1x2

139

Cuadro 22. ANOVA en fase de retención del LAM para los animales tratados en etapa postnatal

140

Cuadro 23. ANOVA en fase de transferencia del LAM para los animales tratados en etapa post natal

140

Cuadro 24. Test de probabilidad Post-hoc para la ANOVA en fase de transferencia del LAM de los animales tratados en etapa postnatal con interacción 1x2

140

Cuadro 25. Kruskal-Wallis ANOVA para el conteo celular del doble marcaje BrdU y NeuN de los animales tratados en etapa prenatal

141

Cuadro 26. Kruskal-Wallis ANOVA para el conteo celular del doble marcaje BrdU y NeuN de los animales tratados en etapa post natal

141

Cuadro 27. Kruskal-Wallis ANOVA para el conteo celular del doble marcaje BrdU y NeuN de los animales tratados en las etapas pre y post natal

141

14

Cuadro 28. Test de probabilidad Post-hoc para el Kruskal-Wallis ANOVA para el conteo celular del doble marcaje BrdU y NeuN de los animales tratados en las etapas pre y post natal con interacción 1x2

142

Cuadro 29. Kruskal-Wallis ANOVA para la comparación de las estructuras.

142

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LISTA DE ANEXOS

Pág.

Anexo A. Mantenimiento de una colonia de ratas en el Bioterio de Experimentación Animal de la Universidad el Tolima – PNT

100

Anexo B. Citología Vaginal Exfoliativa - PNT

106

Anexo C. Tinción Hematoxilina-Eosina - PNT

109

Anexo D. Inyección Intraperitoneal (IP) - PNT

112

Anexo E. Laberinto Acuático de Morris (LAM) - PNT

115

Anexo F. Preparación de BrdU en líquido cefalorraquídeo - PNT

118

Anexo G. Inyección Intracerebro Ventricular bilateral de BrdU - PNT

121

Anexo H. Perfusión de tejidos cerebral - PNT

126

Anexo I. Inmunofluorescencia: Doble marcaje BrdU – NeuN. PNT

130

Anexo J. Análisis estadísticos

134

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LISTA DE ABREVIATURAS

AP: Antero Posterior BDNF: Factor neurotrófico derivado del cerebro BHE: Barrera Hemato Encefálica BrdU: Bromodeoxiuridina CA1: Área 1 del cornu ammonis CA3: Área 3 del cornu ammonis cc: corpus callosum CNTF: Factor neurotrófico ciliar CoA: Coenzima A DG: Giro Dentado DV: Dorso Ventral EGF: Factor de crecimiento epidermal f: fornix FAD: Flavín Adenin Dinucleótido FGF: Factor de crecimiento fibroblástico FMN: Flavín mononucleótido ICLAS: International Council for Laboratory Animal Science ICV: Intracerebroventricular ip: Intraperitoneal IV: Intravenosa LAM: Laberinto Acuático de Morris LCRa: Líquido Cefalorraquídeo artificial LV: Ventrículo Lateral ML: Medio Lateral NAD: Nicotinamida Adenín Dinucleótido NeuN: Anti-Neuron Specific Nuclear Protein Antibody OB: Bulbo Olfatorio RMS: Flujo Migratorio Rostral S: Subiculum SGZ: Zona Subgranular SNC: Sistema Nervioso Central SVZ: Zona Sub Ventricular TGF: Factor de crecimiento transformante VEGF: Factor de crecimiento endotelial

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RESUMEN

Los requerimientos vitamínicos son cruciales durante las etapas de gestación para el desarrollo correcto del gestante. El complejo vitamínico Compvit-B® compuesto por tiamina, pridoxina y cianocobalamina, ha sido utilizado en tratamientos de neuritis y polineuritis de origen múltiple, neuropatías periféricas, ciáticas, parálisis facial, padecimientos con aumento de la utilización de energía como el estrés y el cáncer. Más recientemente este complejo vitamínico ha sido evaluado en el desarrollo de los procesos de memoria y aprendizaje en animales neonatos concluyendo su contribución a la ejecución exitosa de paradigmas cognitivos. Con el objetivo de evaluar el efecto neurogénico del Compvit-B® durante el desarrollo pre y postnatal del sistema nervioso se establecieron dos grupos experimentales con sus respectivos controles: Grupo Exp. 1: 4 ratas hembras gestante que recibieron una inyección ip. de 0.1ml del complejo vitamínico una vez al día durante los últimos 15 días del embarazo; Grupo Exp. 2: Neonatos de 15 días de nacidos, recibieron una inyección ip. de 0.1ml de complejo vitamínico una vez al día durante 15 días. Los grupos controles para ambos tratamientos recibieron una inyección ip. del vehículo utilizado para diluir la vitamina (agua estéril), bajo las mismas características metodológicas que sus grupos experimentales. Se evaluó la influencia del Compvit-B® en la memoria y el aprendizaje espacial, utilizando la prueba del Laberinto Acuático de Morris (LAM), posteriormente, los animales recibieron una inyección intracerebroventricular (I.C.V) de BrdU, que permitió el marcaje de las células en división. Finalmente se reveló histológicamente el marcaje de las células reactivas a BrdU y NeuN, confirmando la neurogénesis asociada a la aplicación del Compvit-B®. Los animales que recibieron Compvit-B® en estado embrionario tuvieron un mejor desempeño que su grupo control en la prueba LAM en la fase de transferencia; mientras que los neonatos evidenciaron diferencias significativas en la adquisición y la transferencia respecto a su control. En los resultados histológicos, hubo diferencias significativas en la neurogénesis únicamente en los neonatos tratados con Compvit-B®, con un mayor número de neuronas producidas en la zona hipocampal. Estos resultados evidencian, que la neurogénesis en neonatos mejora significativamente con la aplicación del Compvit-B®, y aunque no fue significativa la mejora de estos procesos neurogénicos por la estimulación vitamínica durante la fase embrionaria, el Compvit-B® posiblemente puede afectar positivamente la gestación; y el estado y desarrollo fisiológico de los neonatos. Palabras clave: Compvit-B®, memoria y aprendizaje, BrdU, neurogénesis, ratas

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ABSTRACT

The vitamin requirements are vital during the stages of pregnancy for the proper development of the fetus. The Compvit-B vitamin complex composed by vitamins B1, B6 and B12 has been used in the treatment of neuritis and multiple source polyneuritis, peripheral neuropathy, sciatica, facial paralysis, diseases with increased energy use as stress and cancer. Additional, this vitamin complex has been evaluated in the development of learning and memory processes in neonatal animals concluding his contribution to the successful implementation of cognitive paradigms. With the objective to evaluate the neurogenic effect of Compvit-B ® during nervous system development, it’s established two experimental groups with their respective controls: Exp Group 1: 4 pregnant female rats received an ip. Injection of 0.1 ml of the vitamin complex one once a day for the last 15 days of pregnancy; Exp Group 2: Neonates with 15 days old received an ip. Injection of 0.1ml multivitamin once a day for 15 days. Controls for both groups received an ip. Injection treatment, the vehicle used to dilute the vitamin (sterile water), under the same methodological features that their experimental groups. The influence of Compvit-B ® in memory and spatial learning was evaluated using the Morris water maze test (MWM), subsequently, the animals received an intracerebroventricular (ICV) injection of BrdU, this allowed to do monitoring to cell in division. Finally, the histochemistry against BrdU and NeuN showed positive cells. It confirmed the presence of neurogenesis associated with the application of Compvit-B®. The animals that received Compvit-B® in an embryonic state had better performance than the control group at the MWM test in the transfer phase, while neonates showed significant differences in the acquisition and transfer regarding their control. On the other hand, on the histological results, there were significant differences only in neurogenesis in neonates, with a larger number of neurons produced in the hippocampal area. These results show, the neurogenesis in neonates significantly improves with the application of Compvit-B®, and although it was significantly improve these neurogenic processes by stimulation of vitamin during the embryonic stage, the Compvit-B® could positively affect pregnancy, state and physiological development of infants. Keywords: Compvit-B ®, memory and learning, BrdU, neurogenesis, rats

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INTRODUCCIÓN

El desarrollo del cerebro humano, es un largo proceso que comienza en la tercera semana de gestación, con la diferenciación de las células progenitoras neurales y se extiende al menos, hasta la adolescencia tardía, posiblemente durante toda la vida (Stiles & Jernigan, 2010). Cambios fundamentales se producen a lo largo de este proceso, especialmente en el estado embrionario tardío y neonatal temprano, donde determinados eventos definen las habilidades del cerebro adulto. Mediante la aplicación de Compvit-B®, se pretende establecer la influencia del complejo vitamínico en los eventos neurogénicos tempranos y en el desempeño en pruebas comportamentales que evalúan la memoria y el aprendizaje. El Compvit-B® es un complejo vitamínico liofilizado compuesto por las vitaminas Tiamina (B1), Piridoxina (B6) y Cianocobalamina (B12); La deficiencia en tiamina durante el embarazo puede producir en neonatos síntomas característicos de la polineuritis y se ha asociado con la conducción nerviosa (Smithline, et al. 2012; Talwar, et al., 2000), la piridoxina desempeña funciones en el desarrollo cerebral y del sistema nervioso, y durante la gestación puede prevenir la preclampsia (Thaver et. al. 2008) y su deficiencia puede causar isquemia, formación de edemas, producción de radicales libres, neurotoxicidad y alteraciones cognitivas a largo plazo (Kuypers & Hoane, 2010), mientras que la cianocobalamina, es un nutriente importante para el desarrollo y función normal del cerebro (Stabler, 2003; Healton et. al. 1991), y su hipovitaminosis puede provocar pérdida de la mielina, y en los casos más severos, atrofia cerebral (Black, 2008). Por lo tanto, la aplicación de estas vitaminas puede favorecer eventos en el desarrollo temprano del cerebro. El Compvit-B® se ha indicado para el tratamiento de neuropatías y enfermedades neurodegenerativas (González, et al. 2011) y previamente, González, et al. 2011a han comprobado la efectividad del complejo en la recuperación de una lesión de fimbria-fornix y Bonilla, et. al, 2008 reportaron un mejor desempeño en la ejecución de pruebas comportamentales en animales neonatos tratados con Compvit-B®. Teniendo como referencia estos antecedentes, se propuso evaluar la influencia neurogénica del Compvit-B® en dos etapas diferentes del desarrollo en ratas: embrionaria y neonatal, y comprobar tanto comportamental como histológicamente la posible presencia de eventos neurogénicos asociados al complejo vitamínico. Para llevar a cabo estos objetivos, evaluó del aprendizaje y la memoria espacial mediante la prueba del LAM, y se correlacionaron las células con inmunoreactividad positiva a BrdU y NeuN como marcadores de posibles procesos neurogénicos. Este proyecto, muestra nuevas aplicaciones del Compvit-B®, resalta la importancia de dos etapas en el desarrollo del sistema nervioso fundamentales y

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la participación determinante de las vitaminas en los eventos neurológicos iniciales.

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1. OBJETIVOS

1.1 OBJETIVO GENERAL Evaluar los efectos neurogénicos del complejo vitamínico COMPVIT-B® en dos etapas del desarrollo de ratas Wistar: embrionaria y neonatal. 1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Determinar el efecto de la administración intraperitoneal del complejo Compvit-B® sobre los procesos neurogénicos durante las etapas embrionaria y neonatal a través del inmunomarcaje de BrdU y NeuN.

Establecer la influencia de la aplicación del complejo Compvit-B® en la ejecución de tareas de aprendizaje y memoria espacial evaluadas con la prueba del Laberinto Acuático Morris (LAM).

Correlacionar la magnitud de los procesos neurogénicos con la ejecución de la prueba de memoria y aprendizaje espacial de los grupos tratados con Compvit-B® en las etapas embrionaria y neonatal.

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2. MARCO REFERENCIAL 2.1 NEUROGÉNESIS La neurogénesis es el proceso de producción de nuevas neuronas. Este, sucede tanto durante el desarrollo embrionario como en la edad adulta mediante procesos diferentes que proveen y renuevan al cerebro del material neuronal (Bath & Lee, 2010; Stiles & Jernigan, 2010). El proceso neurogénico tiene un rol importante en el aprendizaje y la memoria (Imayoshi I, et al. 2008), incluso, un incremento en la neurogénesis se asocia con una mejor cognición (Van Praag, 2009). Es por esto, que la búsqueda de elementos que favorezcan la producción neuronal, ocupan siempre un interés primario en la investigación. 2.1.1 Neurogénesis Embrionaria. El desarrollo del cerebro humano es un proceso que comienza en la tercera semana de gestación con sucesos que abarcan desde eventos moleculares de expresión génica a efectos ambientales (Stiles & Jernigan, 2010). Durante la gastrulación emergen líneas de células madres, entre ellas las células madre neuronales, que son capaces de producir las diferentes células que conforman el cerebro y el sistema nervioso central (Stiles & Jernigan, 2010). Posteriormente el proceso neuro-ontogénico del ser humano (como se generaliza en la Figura 1) comienza en las semanas 2 y 3 de gestación con el plegamiento y la fusión del ectodermo para formar el tubo neural (Ladher & Schoenwolf, 2005). En la semana 4 de gestación, la porción rostral del tubo neural forman tres vesículas que están destinadas a dar lugar al prosencéfalo, mesencéfalo y romboencéfalo (Rhinn, et al. 2006). Para iniciar la producción neural la población de progenitores neurales se incrementa mediante divisiones simétricas, desde el fin de la gastrulación hasta el día embrionario 42 en humanos. Pasado esto, la división se vuelve asimétrica, y en el caso de los progenitores neurales, la división asimétrica produce un progenitor neural y una neurona (Wodarz & Huttner 2003). El nuevo progenitor neural se queda en la zona proliferativa, mientras que la neurona postmitótica va a tomar su lugar en el neocórtex en desarrollo (Stiles & Jernigan, 2010). En humanos, la neurogénesis cortical se completa aproximadamente en el día embrionario 108 (Clancy, et al. 2001). Durante las semanas 5 y 6 de gestación, neuroblastos, o precursores neurales están proliferando rápidamente dentro de la zona ventricular (matriz germinal) (Bystron, et al. 2008). Por su parte, en la semana 8 de gestación, los neuroblastos comienzan a diferenciarse en cualquiera de los tipos específicos de células neuronales o

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selectiva de las neuronas y sus procesos (Cowan, et al. 1984). El número de neuronas en el cerebro humano, alcanza su pico en la semana 28 de gestación, sin embargo, al menos la mitad de las neuronas producidas en la neurogénesis mueren por el proceso de apoptosis al final de la adolescencia (Lossi & Merighi, 2003). Durante el desarrollo las neuronas compiten por factores tróficos para optimizar sus funciones, así, unas de las funciones más importantes de la muerte celular en el cerebro en desarrollo es el rol en la regulación del establecimiento de circuitos neuronales funcionales y efectivos (Buss & Oppenheim, 2006). La muerte celular puede también servir para corregir los errores en la producción ó migración neural (Buss & Oppenheim, 2004). Éste proceso apoptótico tiene su primer pico que involucra principalmente precursores celulares de proliferación y neuroblastos post mitóticos jóvenes en la zona ventricular (Blaschke, et al. 1996). Este pico comienza cerca de la semana 7 de gestación y continúa a través del primer trimestre (Tau, G. Z. & Peterson, B. S., 2010), está gobernada por procesos intracelulares relacionados a la regulación del ciclo celular (de la Rosa & de Pablo, 2000). El segundo pico de apoptosis se produce alrededor de las semanas 19 a 23 y elimina neuronas postmitóticas dentro de la placa cortical (Tau, & Peterson, 2010). En este pico la apoptosis es regulada por la actividad sináptica, varias formas de contacto célula-célula y una amplia gama de factores tróficos que son producidos por células gliales y otras neuronas (Lossi & Merighi, 2003). En este sentido, las células que envían procesos a regiones incorrectas son finalmente eliminadas por ser menos propensas a disparar sincrónicamente con la célula postsináptica, la cual, no puede liberar los factores tróficos necesarios para la supervivencia de las neuronas presinápticas (Goda & Davis, 2003). Así, la actividad neuronal coherente también es importante para la supervivencia y el mantenimiento de las neuronas, sinápsis y los circuitos neuronales (Tau, & Peterson, 2010). Por su parte, la microglía, los oligodendrocitos y los astrocitos, son los componentes gliales de la materia blanca en el sistema nervioso central. Éstos participan en una serie de funciones de apoyo importantes para las neuronas, incluyendo la orientación de la migración neuronal, la regulación de la composición del medio extracelular, la modulación de las conexiones sinápticas, y el aclaramiento de los neurotransmisores (Tau, & Peterson, 2010). Oligodendrocitos premielinizantes colonizan la corteza en desarrollo durante la gestación, y la subsecuente producción de mielina mejora la velocidad y fidelidad de la transmisión de información codificada en los potenciales de acción que se propagan a lo largo de las neuronas (Tau, & Peterson, 2010). Entre las semanas de gestación 20 y 28, la mielina madura es detectada por primera vez en regiones subcorticales y posteriormente en las regiones corticales, en la semana 35 de

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gestación estas células son detectadas en el giro pre-central, post-central y la radiación óptica, y en la semana 40 de gestación, se presentan en la radiación acústica (Tau, & Peterson, 2010). Al finalizar el periodo embrionario las estructuras rudimentarias del cerebro y el sistema nervioso central se han definido (Stiles & Jernigan, 2010); durante el desarrollo postnatal se produce la continuación y refinamiento de la mayoría de éstos procesos. De manera similar, pero con una distribución temporal diferente, se forma durante el desarrollo del cerebro de los mamíferos, incluyendo la rata (Figura 2), a lo largo de los ventrículos laterales, una capa germinativa que contiene las células progenitoras neurales que posteriormente se diferencian y dan lugar a los diferentes linajes, entre ellos las neuronas que migran hacia todas las estructuras cerebrales (Arias, et al. 2007; Morgane, et al. 1993); y es durante esta etapa también, cuando se inician la mielinización, sinaptogénesis, gliogénesis tardía, apoptosis entre otros procesos que llegan a tener los picos de mayor actividad durante el periodo postnatal (Morgane, et al. 1993). Figura 2. Comparación de los principales eventos del desarrollo en cerebros de ratas y humanos.

Se muestran eventos del desarrollo respecto al nacimiento, eventos de maduración que ocurren en las etapas: prenatal y postnatal. Fuente: Modificado de Morgane, et al., 1993

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2.1.2 Desarrollo Postnatal. El desarrollo cerebral continúa durante el período postnatal y los cambios estructurales en los principales compartimentos de materia gris y blanca continúan a través de la infancia y la adolescencia, estos cambios en estructura son paralelos a los cambios en organización funcional y se ven reflejados en el comportamiento (Stiles & Jernigan, 2010). Durante el período postnatal temprano, la neurogénesis y la migración neuronal continúan (Bhardwaj, et al. 2006), los niveles de conectividad a través del desarrollo cerebral exceden al de los adultos (Innocenti & Price, 2005). Esta conectividad va decayendo por procesos competitivos que son influenciados por la experiencia del organismo (Stiles & Jernigan, 2010). Además, es un periodo dramático de cambio en la estructura y función cerebral (Tau, & Peterson, 2010). El cerebro crece cerca del 70% del tamaño adulto el primer año de edad y alcanza alrededor del 80% del tamaño adulto para los 2 años de edad (Knickmeyer, et al. 2008). Este crecimiento dramático del cerebro observado en recién nacidos y niños pequeños probablemente es debido a la expansión de la glía y la mielinización durante este periodo (Dekaban, 1978). La mielinización, es característica del desarrollo postnatal y se produce rápidamente durante el primer año de vida, continuando posteriormente a un paso más lento pero estable (Gao, et al. 2009). Por su parte, la materia gris cortical continúa creciendo a través de los primeros años de vida, aunque su tasa es más robusta durante el primer año postnatal (Tau, & Peterson, 2010). La materia blanca, a pesar de tener una tasa de incremento de volumen mayor durante la infancia, su volumen continúa incrementándose a través de la adolescencia y la adultez (Bartzokis, et al. 2003; Sowell, et al. 2003) Los 2 primeros años de vida se ve la arborización de las células piramidales e interneuronas inhibidoras GABAérgicas (Mrzljak, et al. 1990), así como la expansión relativa de las capas corticales II y III, en comparación con otras capas (Landing, et al. 2002). Y para la materia blanca, a pesar de tener una tasa de incremento de volumen mayor durante la infancia, su volumen continúa incrementándose a través de la adolescencia y la adultez (Bartzokis, et al. 2003; Sowell, et al. 2003). Otros eventos en el desarrollo postnatal temprano son las células granulares que aunque comienzan a desarrollarse durante la gestación, tienen su punto máximo durante el periodo postnatal, en el tercer mes en humanos y en la segunda semana en la rata (Altman & Bayer, 1990; Fenoglio, et al. 2006), este proceso ocurre hasta la adultez, aunque en una proporción mucho menor (Gould, et al. 1999). Adicionalmente, durante la etapa postnatal, los factores externos son fundamentales para los procesos que se están desarrollando y determinan las condiciones en las que se manejará el cerebro adulto.

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Por otro lado, al comparar el desarrollo cerebral de la rata con el humano (Figura 2) se hallan grandes similitudes, muchos de los principales eventos suceden proporcionalmente en las mismas etapas, sin embargo, las interpretaciones al usar modelos animales deben ser comparadas específicamente en términos de maduración en el cerebro (Morgane, et al. 1993). Los principales picos de mielinización, apoptosis, sinaptogénesis, gliogénesis y producción de células granulares se dan en el periodo prenatal tardío y postnatal temprano en ratas, y a su vez, de manera similar que en los humanos, durante el periodo postnatal, se produce el mayor crecimiento cerebral en ratas y es esta etapa una de las más sensibles a los estímulos ambientales. Posteriormente, en el periodo postnatal tardío va disminuyendo la producción neuronal, hasta que en la adultez desaparece la zona ventricular germinativa y se mantienen únicamente nichos de proliferación en la Zona Sub Ventricular (Arias, et al. 2007) 2.1.3 Neurogénesis Adulta. Una región cerebral que produce neurogénesis es clasificada como neurogénica, e implica la presencia de células precursoras inmaduras y un micro ambiente que permita la producción de nuevas neuronas (Balu & Lucki, 2009). El descubrimiento de la neurogénesis en adultos se opuso al dogma del siglo pasado, en el que se menciona que en el cerebro mamífero, después del nacimiento, no hay posibilidad de formación de nuevas neuronas (Sierra, et al. 2011). La existencia de neurogénesis en humanos adultos fue firmemente establecida cuando en 1998, demostraron por primera vez que nuevas neuronas se producían en el hipocampo del cerebro adulto (Eriksson, et al. 1998). En roedores, está bien establecido que las nuevas neuronas están involucradas en el olfato así como en ciertas formas de aprendizaje y memoria (Sierra, et al. 2011) y en humanos las nuevas neuronas producidas pueden estar involucradas en el refinamiento del circuito hipocampal optimizándolo para el futuro almacenamiento de memoria (Kempermann, 2002). La neurogénesis adulta ocurre principalmente en dos áreas del prosencéfalo del cerebro adulto en el mamífero, el Giro dentado (GD) y la Zona Sub Ventricular (ZSV) (Taupin & Gage, 2002) (Fig. 3). En el GD del hipocampo, la nuevas neuronas generadas en la Zona Sub Granular (ZSG), una capa bajo la capa granular, migran a la capa granular donde se diferencia a células neuronales de la capa granular y extienden sus proyecciones neuronales al área CA3 del Cuerno de Ammon (Markakis & Gage, 1999); Por esto, la producción de neuronas granulares es importante en el período postnatal temprano, cuando la mayor parte de la porción rostral del hipocampo, particularmente la hoja medial, de la capa de células granulares se está formando (Bayer, 1980).

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aprovechamiento autólogo (Sohur, et al. 2006) como para terapias de trasplante celular (Goldman & Windrem, 2006). 2.2 FACTORES QUE INFLUYEN EN LA NEUROGÉNESIS La neurogénesis involucra diferentes procesos: proliferación, falla celular, migración, diferenciación, supervivencia e integración, todos ellos están altamente regulados por factores intrínsecos y extrínsecos (Cuadro 1) (Gheusi, et al. 2009). La neurogénesis adulta es regulada por el ambiente y los estímulos fisiológicos; factores como el estrés crónico, el envejecimiento y la exposición repetida a drogas opiáceas de abuso decrecen la neurogénesis adulta hipocampal (Eisch, et. al. 2000), mientras que el ejercicio, los tratamientos antidepresivos, y el aprendizaje dependiente del hipocampo la incrementan (Eisch & Nestler, 2002), estos factores ambientales pueden afectar también la neurogénesis embrionaria, siendo la madre la que se somete a los estímulos adversos o beneficiosos para el proceso neurogénico (Kolb & Gibb, 2011) El nicho de las células madre es vital en el proceso neurogénico, este nicho consiste en los precursores celulares y las células alrededor que forman un microambiente permisivo. En esta área ocurre comunicación célula – células y es donde las células precursoras reciben las señales reguladoras locales. (Balu & Lucki, 2009). Los factores liberados por otros componentes celulares del nicho neurogénico como GABA y glutamato, regulan el proceso neurogénico (Hsieh & Eish, 2010) y otros neurotransmisores como la serotonina estimulan factores neurotróficos como el BDNF (factor neurotrófico derivado del cerebro) que incrementan la neurogénesis (Hagg, 2009). En general, los factores endocrinos regulan la proliferación de precursores de células granulares en el giro dentado adulto (Gould, et al. 1999). Gould, et al. En el 1998 encontraron que en roedores y primates, la acción supresora de los glucocorticoides en la neurogénesis es biológicamente relevante porque las condiciones que están asociadas con elevadas hormonas adrenales, como el estrés o el envejecimiento, también están acompañados por la disminución de la producción de células granulares. Otros moduladores de la neurogénesis son los factores de crecimiento: El factor de crecimiento fibroblástico (FGF-2), factor de crecimiento epidermal (EGF), factor de crecimiento transformante (TGF), Factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), y el factor neurotrófico ciliar (CNTF) influencian la proliferación celular en la Zona Subventricular (Bath & Lee, 2010). Factores como las experiencias sensorimotoras, estimulan la neurogénesis en etapa prenatal y postnatal y pueden influenciar poderosamente la organización

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cerebral durante el desarrollo y la adultez (Kolb & Gibb, 2011). La exposición a drogas prescritas o por abuso tienen profundos efectos en el desarrollo prefrontal y los comportamientos asociados a esta zona, estos efectos pueden ser duraderos, permanentes y pueden influenciar la plasticidad en el adulto (Kolb & Gibb, 2011). En este sentido, estudios realizados en rata mostraron que la privación del sueño puede reducir la proliferación celular y suprimir la neurogénesis en el hipocampo, el sueño, está relacionado con la consolidación de la memoria cuando el hipocampo envía la información de la memoria al neocortex para almacenaje permanente (Taki & Kawashima, 2012). Así mismo la alimentación durante las etapa prenatal y postnatal son importantes en el desarrollo del Sistema Nervioso Central, la deficiencia de macro y micronutrientes puede influenciar profundamente el proceso neurogénico (Taki & Kawashima, 2012). Cuadro 1. Factores que influencian la neurogénesis.

Factores Neurogénesis

Estrés Enriquecimiento Ambiental Ejercicio Pruebas de Memoria y aprendizaje Envejecimiento Experiencias sensorimotoras Opiáceos Epilepsia Lesión cerebral traumática Isquemia Enfermedad de Huntington Enfermedad de Alzheimer Corticoesterona Factores de Crecimiento Medicamentos Antidepresivos Glutamato Serotonina Estrógeno BDNF

Fuente: Adaptado de Taupin 2006, Eisch & Nestler 2002, Gould, et al., 2001, y Bath & Lee, 2010. Las flechas indican el aumento o disminución de la neurogénesis de acuerdo con cada factor.

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2.3 VITAMINAS Las vitaminas son nutrientes esenciales (Spitzer, 2007), y a diferencia de otros nutrientes no cumplen funciones estructurales ni aportan energía, en cambio, son altamente específicos, por lo que son requeridas en pequeñas cantidades en el organismo y muchas veces requieren una activación metabólica para ser funcionales (Combs, 2008). Muchas vitaminas funcionan como cofactores: A, K y C, tiamina, niacina, riboflavina, piridoxina, biotina, ácido pantoténico, folato y cianocobalamina; Otras vitaminas funcionan como antioxidantes: Vitaminas E y C, y muchas vitaminas funcionan como cofactores metabólicos en reacciones oxido-reductoras: E, K y C, niacina, riboflavina, y ácido pantoténico; Dos vitaminas, A y D, funcionan como hormonas y una de ellas, la vitamina A también funciona como cofactor fotoreceptivo en la visión (Combs, 2008). 2.4 COMPLEJO B Las vitaminas del complejo B son hidrosolubles, esenciales para el funcionamiento normal del metabolismo (Kaneda, et.al. 1997), y están implicadas en muchos desórdenes neuropsiquíatricos y neurodegenerativos (Lalonde, 2008). La vitamina B1 (Figura 4), es requerida para el metabolismo de carbohidratos y las funciones neurológicas (Herrmann & Geisel, 2002), es utilizada como cofactor para la oxidación del ácido pirúvico y el ácido α cetoglutárico en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos y en la conjunción con transcetolasa en la ruta de las pentosas fosfato para la glicólisis no oxidativa (Frank, et. al. 2000; Higdon, 2000). Esta vitamina es conocida por sus beneficios al sistema nervioso y la actitud mental (Mindell, 1998). La tiamina no es sintetizada por los humanos y no es almacenada en grandes cantidades en el organismo (Smithline, et al. 2012), por lo tanto, se requiere el consumo diario de 1.2 a 1.5mg, aunque se requieren niveles ligeramente más altos durante el embarazo, la lactancia, la enfermedad o el estrés y en procesos quirúrgicos (Dis Mon, 2003). Está presente en una amplia variedad de alimentos de origen animal y vegetal (Laforenza, et. al. 1997), las mejores fuentes naturales de vitamina B1 incluye levadura seca, cáscara de arroz, trigo integral, avena, cacahuetes, carne de cerdo, la mayoría de las verduras, salvado y leche (Manore, 2000).

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Figura 4. Estructura de la Tiamina..

Fuente: Suasti, 2012

La deficiencia de tiamina puede causar beriberi y el síndrome de Wernicke-Korsakoff y su consumo oral puede usarse para el tratamiento de condiciones fisiopatológicas asociadas con diabetes, fallas cardíacas, y estados hipermetabólicos (Smithline, et al. 2012). También es importante resaltar que la deficiencia de la B1 puede afectar el cerebro en desarrollo, ya que existen enzimas dependientes de tiamina que juegan un papel importante en el metabolismo de energía celular para la síntesis de lípidos y nucleótidos del cerebro en desarrollo (Butterworth, 1990) La riboflavina o vitamina B2 es esencial para la producción de energía en la cadena respiratoria mitocondrial, participa en reacciones metabólicas de carbohidratos, ácidos grasos y proteínas, está presente en las coenzimas flavinmononucleótido (FMN) y flavin adenin dinonucleótido (FAD) (Delgadillo & Ayala, 2009); la vitamina B2 también promueve el crecimiento normal, y asiste la producción de esteroides, glóbulos rojos, y glicógeno (Spitzer, 2007), ayuda a mantener la integridad de las membranas mucosas, piel, ojos, y el sistema nervioso y está involucrada en la producción de adrenalina por las glándulas adrenales (Spitzer, 2007). La vitamina B2 se puede hallar en la levadura, el hígado, leche y sus derivados, huevos, vegetales de hojas verdes y cereales; la deficiencia de riboflavina puede producir alteraciones del crecimiento, alopecia, alteraciones de la visión, mucosa, malformación y sangrados que pueden llevar a la muerte (Delgadillo & Ayala, 2009) La niacina o vitamina B3, hace parte de la coenzima Nicotinamida adenín dinucleótido (NAD) que está involucrada en muchas de las reacciones oxido-reductoras principalmente en la generación de energía a partir de la degradación química de carbohidratos, grasas y proteínas (Spitzer, 2007). Se puede encontrar en la levadura, hígado, pollo, carnes, frutos secos y las legumbres contribuyen con la mayor parte de la niacina obtenido a partir alimentos, la leche y verduras de hojas verdes contribuyen cantidades menores (Spitzer, 2007). La deficiencia de niacina pueden incluir: insomnio, pérdida del apetito, pérdida de masa y peso muscular, indigestión, dolor abdominal, vértigo y/o dolores de

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cabeza; el requerimiento diario de vitamina es de 2mg en los infantes, 14mg para adultos y 18mg para madres gestantes (Spitzer, 2007). El ácido pantoténico ó vitamina B5 es un precursor importante del cofactor enzimático Coenzima A (CoA), la vitamina es ampliamente utilizada en la industria cosmética (Saliba, et al. 2005). Igualmente la Biotina (B8) actúa como cofactor de cuatro carboxilasas: CoA, piruvato carboxilasa, propionil CoA carboxilasa y β-metilcrotonil-CoA carboxilasa, además, cumple un papel importante en la proliferación y diferenciación celular, así como en la regulación de la síntesis de ciertas proteínas (Rodríguez, 2000). Aunque la deficiencia de biotina es muy rara, ocasiona alopecia, dermatitis, resequedad e infecciones, además, algunas alteraciones neurológicas como depresión, somnolencia, dolor muscular y ataxia (Rodríguez, 2000) La vitamina B6 o piridoxina (Figura 5) cumple un papel crucial en el funcionamiento normal del sistema nervioso central (Merrill & Burnham, 1990). Se han observado anormalidades comportamentales y funcionales en animales con deficiencia de vitamina B6 (Wei, et. al. 1999), sugiriendo que la deficiencia de esta vitamina cambia la actividad funcional de estructuras cerebrales o regiones que modulan el movimiento, la cognición, y el aprendizaje (Wei, et. al. 1999), y se han reportado alteraciones bioquímicas y morfológicas en ciertas regiones del cerebro en la progenie de ratas alimentadas con dietas bajas de vitamina B6 durante el embarazo y la lactancia (Wei, et. al. 1999). Figura 5. Estructura de la Piridoxina.

Fuente: Zamora, 2013

La piridoxina juega un rol esencial como cofactor de un amplio rango de reacciones bioquímicas, predominantemente en el metabolismo amino ácido (Havaux, et al. 2009). Junto con la vitamina B2, la vitamina B6 está asociada con la disminución en el riesgo de padecer cáncer colon-rectal (Eussen, et al. 2010). Los mamíferos, adquieren la vitamina B6 en su dieta, el requerimiento diario de la vitamina para adultos es de 2.0 mg y para niños 0.3 mg (Hansen, et.al. 1996). La deficiencia dietaria de piridoxina ha sido implicada en enfermedades cerebrovasculares, cáncer (Mackraj, et. al. 2009), producción de radicales libres, neurotoxicidad (Kuypers & Hoane, 2010), y formas activas de la vitamina B6 han demostrado ser neuroprotectoras luego de un daño de isquemia inducido (Kuypers

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& Hoane, 2010), además, la función cognitiva puede beneficiarse de la suplementación con ácido fólico, vitamina B6 y B12 (Uffelen, et al. 2005). En conjunto, las deficiencias en ácido fólico, vitamina B6 y B12 resultan en elevados niveles del amino ácido homocisteína, por estar vinculados al metabolismo de ella (Selhub, et al. 2003), en este caso, la homocisteína es rápidamente metabolizada a S-adenosylhomocysteina, un potente inhibidor de las reacciones que requieren metilación, adicionalmente la homocisteína puede ser directamente tóxica para las células endoteliales vasculares (Ariogul, et al. 2005), y se han encontrado asociaciones negativas entre el incremento de los niveles de homocisteína y el desempeño cognitivo global, memoria, velocidad psicomotora, habilidades espaciales (Riggs, et al. 1996), la enfermedad de Alzheimer (Ramesh, et al. 2010) y el 1% de los casos de demencia (Ariogul, et al. 2005) El folato, ácido fólico o vitamina B9 es un nutriente esencial para la replicación del ADN y es un substrato para ciertas reacciones enzimáticas que involucran síntesis de aminoácidos, es muy requerida durante el embarazo por ser necesaria para el crecimiento y desarrollo del feto (Greenberg, et al. 2011). La deficiencia de ácido fólico puede causar anemia, neuropatía periférica y anormalidades congénitas (Greenberg, et al. 2011). Se halla fácilmente en alimentos como: carne, hígado, huevo, vegetales, cereales, frutas y se recomienda la ingesta diaria de entre 30 y 40µg dependiendo de la edad o condición (Rodríguez, 1998) La vitamina B12 o cianocobalamina, es un nutriente esencial para el desarrollo de todas las células y el crecimiento humano (Kumar, et al. 2009). Está compuesta por un átomo central de cobalto unido a un grupo dimetilbencimidazol, cuatro átomos de nitrógeno cada uno pertenecientes a cuatro anillos pirrólicos, y un grupo R (-CN, -OH, -CH3, o grupo adenosil) que denota el tipo específico de cobalamina (Werder, 2010) (Figura 6). Esta vitamina soporta el proceso de eritropoyesis durante el embarazo (Carretti, et al. 1998), actúa como coenzima en la síntesis del ADN y juega un rol integral en el desarrollo de la vaina de la mielina (Herbert, 1996). Figura 6. Estructura de la Cianocobalamina.

Fuente: Forrelat, et al., 1999

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La cianocobalamina es una forma no fisiológica de la cobalamina, en el organismo se transforma de forma espontánea en metil y 5-desoxiadenosil que son las formas fisiológicamente activas de la vitamina B12 (Forrelat, et al. 1999). El requerimiento diario es de 2.0µg o entre 0,3 y 1,5 para niños y lactantes y se puede obtener únicamente de fuentes animales (Carmel, 1997). La deficiencia de la vitamina B12 puede resultar en daños irreversibles para el sistema nervioso central (Fujii, et al. 1996), puede llevar a la degeneración del nervio, anemia perniciosa, enfermedad cardiovascular, debilidad, y/o fatiga (Bernard, et al. 1998), además los infantes con deficiencias en vitamina B12 han sido asociados con desmielinización y atrofia cerebral (Black, 2008) Al igual que el folato, la deficiencia de vitamina B12 disminuye los niveles del metabolito 5-hydroxytryptamina importante en el líquido cefalorraquídeo (Botez, et al. 1982). Otros efectos de la deficiencia de la cianocobalamina incluyen la deficiencias de espermidina que está involucrada en la señalización del glutamato (Adachi, et al. 2003), la modulación de citoquinas / factores de crecimiento (Scalabrino & Peracchi, 2006), y altera las uniones GABA transportador/receptor (Brennan, et al. 1981). Un rol de esta vitamina en las transmisiones sinápticas se ha indicado para hallazgos en methil-cobalamina (un análogo de la vitamina B12) mejorando los potenciales exitatorios post-sinápticos en zonas hipocampales (Ikeuchi & Nishizaki, 1995). 2.5 COMPVIT-B® El COMPVIT-B® es un complejo vitamínico liofilizado compuesto por 100 mg de clorhidrato de tiamina (B1), 100 mg de clorhidrato de piridoxina (B6) y 5 mg de cianocobalamina (B12) producido por la Empresa de Productos Biológicos Carlos J. Finlay de La Habana, Cuba. El COMPVIT-B® ha sido utilizado en tratamientos de neuritis y polineuritis de origen múltiple, neuropatías periféricas, ciáticas, parálisis facial, padecimientos con aumento de la utilización de energía como el estrés y el cáncer (Bonilla, et al. 2008). El complejo vitamínico ha demostrado tener una influencia, experimentalmente demostrada en ratas Wistar, en la recuperación de una lesión en nervio periférico, acelerando la recuperación funcional de la extremidad afectada, con lo cual se atribuye la regeneración del nervio dañado (González, et al. 2011) y en la recuperación de lesiones de fimbria – fornix, que causan deprivación colinérgica al hipocampo y en consecuencia un impacto negativo a la hora de desempeñarse en pruebas de aprendizaje espacial como el laberinto acuático de Morris, los animales tratados con Compvit-B® mostraron mejores latencias de escape (González, et al. 2011a)

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Del COMPVIT-B® se ha probado también, que mejora la habilidad de animales en la respuesta de pruebas comportamentales, luego de ser aplicado en etapa neonatal. Los animales que recibieron COMPVIT-B® probaron tener latencias de escape menores comparadas con el grupo control, con un rápido progreso en el proceso de aprendizaje (Bonilla, et al. 2008). Estos resultados pueden suponer, que el complejo vitamínico está influyendo en la neurógenesis de los animales tratados; Esta conclusión podría ser verificada y comparada realizando inmuno marcaje de células en división, dilucidando nuevas aplicaciones del COMPVIT-B® en el aporte y mejoramiento de la calidad de vida. 2.6 LABERINTO ACUÁTICO DE MORRIS (LAM) Las pruebas comportamentales aportan información acerca de los mecanismos neurobiológicos y los sustratos neuroanatómicos de la memoria y el aprendizaje en roedores (Sharma, et al. 2010). El Laberinto Acuático de Morris, es una de las pruebas comportamentales mas utilizadas que permite el estudio de la memoria de referencia, la memoria de trabajo espacial y el aprendizaje (Dudchenko, 2004) El aparato consiste de una piscina circular con una pequeña plataforma oculta a dos centímetro bajo el nivel del agua (D’Hooge & De Deyn, 2001). El animal debe aprender a localizar la plataforma de escape partiendo desde distintos puntos seleccionados al azar (Sharma, et al. 2010); El animal puede usar tres estrategias para hallar la plataforma: Praxis, cuando el animal aprende la secuencia de movimientos que los llevan a la plataforma, Taxis, cuando el animal usa pistas cercanas al objetivo para hallar la plataforma, y la estrategia espacial, en la que el animal llega usando la información acerca de la ubicación espacial de la plataforma de acuerdo con la configuración espacial de las pistas distantes (Sharma, et al. 2010). Con el tiempo, el animal aprende dónde está la plataforma y el tiempo que le toma en llegar va disminuyendo (Simpson & Kelly, 2011). Para la ejecución de la prueba deben controlarse muchas características que pueden influir en los resultados: el sexo, la edad, la cepa de los animales, la alimentación y el estrés son determinantes a la hora de planificar el LAM (D’Hooge & De Deyn, 2001). Esta prueba, ha demostrado ser muy sensible a los daños producidos en el hipocampo, es de rápido aprendizaje probablemente debido al estímulo de aversión, no requiere de una preparación previa y elimina la posibilidad de que el animal use pistas aromáticas para orientarse hacia la plataforma de escape (Sharma, et al. 2010).

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2.7 BrdU La Bromodeoxiuridina es un marcador universalmente usado para detectar células en proliferación en estudios de neurogénesis (Kee, et. al. 2007), que cuando es administrada, se incorpora al ADN durante la fase S del ciclo celular y es transmitida a sus células hijas, tanto, como no se diluya a través de muchos ciclos de proliferación (Karpowicz, et al. 2005). Para el marcaje de nuevas células vía inmnohistoquímica, el BrdU permitió ir más allá en estudios de co-marcaje con marcadores neuronales específicos (Miller & Nowakowski, 1988) y es ampliamente usado en modelos animales para cuantificar el número de células en división en un tejido y para el seguimiento a su progenie (Sierra, et al., 2011). La mayor ventaja del marcaje con BrdU es la sensibilidad para detectar células en proliferación en comparación con otros métodos (Sierra, et al. 2011). BrdU no es un marcador de proliferación celular; es un marcador de síntesis de ADN. Esto tienen profundas consecuencias en el estudio y análisis de la neurogénesis en adultos, así como puede permitir falsos resultados y malinterpretación si los controles apropiados no son implementados (Taupin, 2007). El BrdU (5-bromo-2′-deoxyuridina) es una halopirimidina (Fig. 4) usada terapéuticamente como agente antiviral y antineoplástico (Begg, et al. 2000; Freese, et al., 1994). Puede ser detectada por inmunohistoquímica, usando directamente anticuerpos monoclonales contra la cadena sencilla de ADN que contiene el BrdU. Este marcaje fue desarrollado como una alternativa para la determinación del índice proliferativo de tumores (Struikmans, et al. 1997), y fue introducida para el estudio de la proliferación celular en el desarrollo del sistema nervioso por Nowakowski, et al. (1989). Figura 7. BrdU (5-bromo- 2’-deoxyuridina) Bromodeoxiuridina.

Fuente: Taupin, 2007

El BrdU cruza la barrera hemato encefálica, y puede ser aplicada vía intracerebroventricular (I.C.V), intraperitoneal (ip.), inyección intravenosa (I.V.), u oralmente para el estudio de neurogénesis adulta (Taupin, 2007). La Bromodeoxiuridina es metabolizada a través de deshalogenación cuando es

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integrada en el ADN, una vez deshalogenada, los residuos de uracilo se expulsan del ADN por el sistema de reparación uracil glucosilasa (Hume & Saffhill, 1986). Cuando es administrado vía ip., la concentración del análogo de timidina que alcanza el cerebro es una fracción de la dosis administrada, la inyección I.C.V permite grandes concentraciones en el cerebro a diferencia de la entrega periférica, y es empleada cuando una gran concentración local en el cerebro es requerida (Zhao, et al. 2003). Sin embargo, inyecciones ip. o I.V son los métodos de administración más comunes en roedores y primates para el estudio de neurogénesis, porque obvian la necesidad de cirugía (Gould, et al. 2001; Kornack & Rakic, 2001). El BrdU es una sustancia tóxica y la administración puede tener menos toxicidad para el Sistema Nervioso Central (SNC) adulto que para el SNC embrionario y neonatal, porque la Barrera Hemato Encefálica (BHE) está más desarrollada en el adulto (Taupin, 2007). Sin embargo, y a pesar de sus limitaciones es una de las metodologías más utilizadas para el marcaje de células en división, por minimizar los riesgos y falencias que presenta el marcaje por 3H Timidina.

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3.2 GRUPOS EXPERIMENTALES – TRATAMIENTO PRENATAL En la primera etapa del proyecto, se realizó la aplicación prenatal del Compvit-B® en ratas durante los últimos 15 días de gestación, los animales se agruparon como se muestra en el cuadro 2. Cuadro 2. Distribución y actividades en los grupos de la primera etapa experimental

Grupo Compvit Pre Grupo Vhl Pre

2 Ratas Wistar hembras

Pareja

Citología Vaginal Exfoliativa

Día 0 de embarazo

Seguimiento de peso e Inyección ip. de 0.1ml de Compvit-B® durante los

últimos 15 días de gestación

2 Ratas Wistar hembras

Pareja

Citología Vaginal Exfoliativa

Día 0 de embarazo

Seguimiento de peso e Inyección ip. de 0.1ml de agua estéril durante los

últimos 15 días de gestación

3.2.1 Seguimiento al Ciclo Estral. Las hembras de rata Wistar fueron sometidas a Citología Vaginal Exfoliativa con el procedimiento descrito en el Protocolo de normalización de Trabajo (PNT) 2 (Anexo B), y el frotis obtenido, fue teñido con Hematoxilina – Eosina, una tinción que permite el marcaje diferencial de núcleos y citoplasma con el procedimiento descrito en el PNT 3 (Anexo C). A partir de estos resultados, se estableció el día 0 de gestación, como el día en que se encontraba por primera vez espermatozoides en la cavidad vaginal, posteriormente se continuó con un seguimiento de peso en las hembras para controlar cualquier eventualidad dentro de la gestación. 3.2.2 Inyección Intraperitoneal (ip.). Una vez establecido el día 0 de gestación, se comenzó un registro diario de peso en las ratas. A partir del día 7 las hembras de del tratamiento prenatal fueron inyectadas Intraperitonealmente mediante el protocolo descrito en el PNT 4 (Anexo D) con 0.1ml de Compvit-B® y agua estéril, respectivamente durante los 15 días siguientes o hasta el nacimiento de las crías. Las hembras del Grupo postnatal no se inyectaron, sólo sirvieron de control para el seguimiento de peso hasta el nacimiento de sus crías.

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3.3 GRUPOS EXPERIMENTALES – TRATAMIENTO POSTNATAL El nacimiento de los animales determinó el tamaño de los grupos experimentales en la segunda etapa. Los grupos experimentales se distribuyeron y se trabajaron como se muestra en el cuadro 3. Cuadro 3. Distribución y actividades en los grupos durante la segunda etapa experimental

Grupo Compvit Post

Neonatos de 15 días

Seguimiento de peso e Inyección ip. de 0.1ml de Compvit-B® durante 15 días

Grupo Vhl Post

Neonatos de 15 días

Seguimiento de peso e Inyección ip. de 0.1ml de agua estéril durante 15 días

Una vez nacidas todas las crías de los grupos, se realizaron controles de peso en los animales y 15 días después de su nacimiento los animales del grupo experimental postnatal, recibieron una inyección ip. de 0.1ml de Compvit-B® ó 0.1ml de agua estéril (vehículo) según correspondiera. Al finalizar la aplicación del tratamiento postnatal, estos animales, junto con las crías de las hembras tratadas durante el periodo prenatal, fueron sometidos a procedimientos comunes, que se describen en los siguiente acápites, en el siguiendo orden:

1. Test neurológico 2. Laberinto Acuático de Morris (LAM) 3. Inyección ICV de BrdU 4. Perfusión 5. Inmunofluorescencia 3.3.1 Test Neurológico. El Test neurológico consiste en una serie de pruebas que permiten determinar el estado del sistema nervioso central (Bures & Buresova, 1983), se realizan con el fin de determinar que los animales estén en condiciones normales para la ejecución del experimento. Las pruebas que se realizaron se encuentran consignadas en el cuadro 4.

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Cuadro 4. Descripción de los procedimientos realizados en el Test Neurológico.

Prueba Procedimiento

Reflejo de Flexión Se levanta al animal y se estira suavemente una de sus extremidades y se evalúa la flexión de su pata

Reflejo de corrección de posición

Se ubica al animal sobre una superficie plana y su cuerpo se gira hasta dejarlo con las extremidades hacia arriba. Se evalúa la corrección de la posición del animal

Reacción de Ubicación Se suspende el animal de la cola y se acerca al borde de una mesa. Se evalúa la ubicación de las patas delanteras sobre la mesa

Test de Equilibrio

Se ubica el animal sobre una vara de madera durante un minuto. Se evalúa el equilibrio, permanencia y posición del cuerpo en el animal

Reflejo de Córnea Se toca gentilmente el animal con una fibra suave sobre su córnea y se evalúa el pestañeo de la rata

Impresión Auditiva Se realiza un fuerte aplauso y se evalúa la retracción repentina de las patas y orejas

Agitación de la cabeza Se sopla el oído del animal, se evalúa la agitación de la cabeza posterior al soplo

Fuente: Modificado de Ávila, 2008 3.3.2 Laberinto Acuático de Morris (LAM). Después del Test Neurológico, los animales fueron entrenados en el Laberinto acuático de Morris, para evaluar la memoria y el aprendizaje espacial. El aparato del LAM consiste en una piscina entre 150 – 180 cm de diámetro (Morris, 1984), 70 cm de altura y llena de agua hasta 50cms, en dicha piscina se esconde a 2cms por debajo del agua una plataforma de escape de aproximadamente 7cms de diámetro (Figura 9b), la plataforma se ubicó en el centro de uno de los cuatro cuadrantes imaginarios (Figura 9a). En la habitación donde se realizó el procedimiento se mantuvo con baja iluminación, utilizando para esto un bombillo incandescente de 50W y se establecieron una serie de pistas extra – laberínticas que le permitieron al animal su orientación espacial, por lo que

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nado, entre otros parámetros, siendo la latencia de escape en este experimento la variable fundamental para evaluar el aprendizaje y la memoria (PNT 5- Anexo E). 3.3.3 Marcaje de células con BrdU. Para verificar el efecto neurogénico del COMPVIT–B® mediante inmunofluorescencia, se realizó el marcaje de células en división con BrdU aplicado mediante cirugía Intracerebro ventricular (I.C.V.) en todos los animales. El BrdU fue diluido en líquido cefalorraquídeo artificial en un proceso de dilución descrito en el PNT 6 (Anexo F), y posteriormente fueron inyectados bilateralmente 2µl de BrdU a una concentración de 20mg/ml llevando a cabo el procedimiento descrito en el PNT 7 (Anexo G). El objetivo del marcaje con BrdU es evidenciar el proceso de diferenciación celular a neuronas, por lo tanto la evaluación de la diferenciación se realizó un mes después de la administración de BrdU, teniendo en cuenta que después de este tiempo, se estima que el 70% de las células positivas a BrdU expresan marcadores de neuronas maduras (Taupin, 2007). 3.3.4 Perfusión. Para el análisis histológico los animales fueron anestesiados con sobredosis Pentobarbirtal y se perfundieron por el método de gravedad utilizando 250ml de solución salina 0.9% y 20ml de paraformaldehído al 4% por cada animal; los cerebros fueron extraídos y post fijados en paraformaldehído al 4% por un intervalo de 24 a 48 horas a 4°C, posteriormente criopreservados sometiendose a un gradiente ascendente de sacarosa (7%, 25% y 30%) a 4°C y finalmente almacenados a -20°C hasta la realización de los cortes histológicos. El procedimiento de perfusión se detalla en el PNT 8 (Anexo H), los cerebros se mantuvieron criopreservados hasta la estandarización de los protocolos de inmunofluorescencia. 3.3.5 Inmunofluorescencia. El marcaje con BrdU, permitió observar las células que proliferaban en el hipocampo y la corteza cerebral, mediante la visualización de los núcleos que conservaban el análogo de timidina en su ADN; En contraste, se realizó marcaje con NeuN (un marcador específico del tipo celular neuronal, que marca los núcleos de las células neuronales) para determinar cuáles proliferantes presentaban fenotipo neuronal. Los anticuerpos primarios fueron usados en un protocolo de doble marcaje a diluciones de 1:100 para 5-Bromo-2'-Deoxyuridibe (Sigma – Aldrich ®) y 1:2 para Anti-Neuron-Specific Nuclear Protein Antibody (Merck Millipore ®), con anticuerpos secundarios Alexa Fluor 488 y 594 (Life technologies ®) diluidos a 1:500; El protocolo de doble marcaje se describe en detalle en el PNT 10 (Anexo J), resultado de la adaptación de los protocolos de Kee, et.al., 2007 y Kee, et. al. 2002.

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Los resultados obtenidos se observaron en el Sistema de análisis de imágenes FLoidTM Cell Imaging Station y el conteo celular se realizó con el programa Fiji. 3.4 ANÁLISIS ESTADÍSTICO Los datos recolectados fueron analizados con el programa Statistica 5.1. Se realizó estadística descriptiva y la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk para establecer el método estadístico que correspondiera a la distribución de los datos. Las variables evaluadas estadísticamente fueron: la latencia de escape en el LAM y el número de células marcadas con BrdU y NeuN en la histología. Las variables de peso de las gestantes, días de embarazo y número de animales por camada, no recibieron un análisis estadístico por no contar con un número suficiente de datos, sin embargo, se realizó una comparación de datos que describe el comportamiento de las variables. Las variables independientes, la normalidad, así como el tipo de análisis que se realizó se señalan en el Cuadro 5. Cuadro 5. Descripción de las pruebas estadística realizadas

Variables dependientes Latencia de Escape en LAM Número de células Marcadas con BrdU + NeuN

Variables Independientes

Variable Inter grupal -Tratamiento: Compvit-B®

Vehículo

Variable Intra grupal - Días de la prueba:

Adquisición: 3 días

Retención: 1 día Transferencia: 3 días

Tratamiento: Compvit-B®

Vehículo

Estructura: Corteza

Hipocampo

Tipo de Estadística Paramétrica No Paramétrica

Prueba Anova con medidas Repetidas Comparación Post-Hoc

Prueba de Wilcoxon para la

comparación de los tratamientos por etapas

Kruskal – Wallis para la

comparación general de los tratamientos en las etapas pre

y postnatal

Comparación Post-Hoc

Los resultados de las pruebas de normalidad y demás análisis estadísticos se encuentran en el anexo 11.

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4. RESULTADOS 4.1 APAREAMIENTO CONTROLADO Y SEGUIMIENTO DE LA GESTACIÓN A partir de la formación de parejas transcurrieron entre 2 y 3 días para observar la presencia de espermatozoides a través de la citología vaginal exfoliativa en la cavidad vaginal de las hembras, considerándose como día 0 para el registro de los parámetros de la gestación y aplicación de tratamientos. No se observó diferencias de la ganancia en peso de las hembras gestantes en los diferentes grupos de tratamiento. Sin embargo, hay una correlación positiva entre los parámetros relacionados en todos los grupos de experimentación (Figura 11). Figura 11. Comparación de la ganancia en peso durante la gestación.

*Los resultados se representan de la siguiente manera: Peso en gramos de las gestantes (ordenadas), día de gestación (abcisas).

La duración de la gestación fue notablemente mayor en los animales tratados con Compvit-B® prenatal, de 30,5 días en promedio, en comparación con su control y los animales no tratados durante esta etapa, quienes tuvieron una gestación regular de 21 días (Figura 12). Las diferencias en el tiempo de gestación, aunque

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no tienen significancia estadística, puede ser causada por una estimación errónea del día 0 (día de fertilización) y/o un posiblemente un efecto de la vitamina aplicada en esta etapa. Figura 12. Comparación del número de días de gestación respecto del tratamiento.

*En el gráfico se representan las variables así: Número de días de gestación (ordenadas) ± el error estándar; y Grupos de tratamiento en la etapa prenatal (abcisas). El número de crías por camada fue mayor en los animales que recibieron Compvit-B® durante la etapa prenatal, en comparación con su control y los animales destinados para el tratamiento post natal, sin embargo, hubo una mortalidad por camada similar en los todos tratamientos (Figura 13).

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Figura 13. Número de animales nacidos y sobrevivientes por camada.

*La comparación entre nacimiento y supervivencia de las crías por camada de respresenta: Número de animales (ordenadas) ± Error estándar; y grupo de nacidos y sobrevivientes (abcisas). 4.2 LABERINTO ACUÁTICO DE MORRIS (LAM) Después de concluir con las inyecciones del tratamiento post natal y el test neurológico, los animales ejecutaron el Laberinto acuático de Morris en las fases de adquisición, retención y transferencia. 4.2.1 LAM del tratamiento prenatal. La prueba de ANOVA demostró que no existió diferencia entre grupos de tratamiento F(1.102; 230.3773)= 0.004; p=0.945767, hubo una diferencia entre los días de tratamiento F(1750.809;65.7030)=26.64732; p=0.000: En el grupo ―Compvit pre‖ hubo una diferencia del primer día de LAM respecto del segundo (p=0.0006) y tercer día (p=0.0001) y en el grupo ―Vhl pre‖ hubo una diferencia del primer día de LAM respecto del segundo (p=0.0006) y tercer día (p=0.000005) (Figura 14). Demostrando que los grupos ―Compvit pre‖ y ―Vhl pre‖, no presentaron diferencias significativas en la fase de adquisición del LAM, con una evolución asintótica para ambos grupos, que se traduce en un proceso de aprendizaje.

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Figura 14. Latencia de Escape en el LAM de adquisición para los animales tratados en etapa prenatal.

*Los resultados de la fase de adquisición del LAM prenatal se representan así: Latencias de escape en segundos (ordenadas) ± el error estándar; y días de prueba en el LAM (abcisas). Las barras claras y la oscura señalan latencias de escape menores y mayor en función del grupo Compvit Pre respectivamente. Comparando el tercer día de adquisición con la fase de retención, la ANOVA no mostró diferencias significativas entre los grupos de estudio F(517,45; 266, 58)= 0,675; p=0,64715 (Figura 15) Figura 15. Latencia de Escape en el tercer día del LAM de adquisición y la fase de retención para los animales tratados en etapa prenatal.

*Se representa la latencia de escape en segundo ± el error estándar en las ordenadas y en las abscisas, los grupos de tratamiento prenatal y la fase del LAM.

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En la fase de retención, La ANOVA con medida repetida mostró que no existen diferencias significativas entre los grupos de estudio F(10370.99; 112.85)=1.019; p=0.9926 (Figura 16). Figura 16. Latencia de escape en el LAM de retención para los animales tratados en etapa prenatal.

*Se representa la latencia de escape en segundos ± el error estándar en las ordenadas y los grupos de tratamiento prenatal en las abscisas. Sin embargo, en el LAM de transferencia, la ANOVA evidenció que los animales sometidos al tratamiento prenatal: tuvieron diferencias significativas entre los grupos de tratamiento F(109.9007; 26.43265)=4.15; p=0.059, y entre los días de tratamiento F(278.5030; 15.79034)=17.637; p=0.00: En el grupo ―Compvit Pre‖ hubo una diferencia del primer día de LAM respecto del segundo (p=0.002) y tercer día (p=0.000) y en el grupo ―Vhl Pre‖ hubo una diferencia del primer día de LAM respecto del segundo (p=0.022) y tercer día (p=0.0107) (Figura 17). Muestra una evolución asintótica para ambos grupos, con una mayor eficiencia del grupo tratado con Compvit-B® para resolver el paradigma en la fase de transferencia.

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Figura 18. Latencia de escape en el LAM de adquisición para los animales tratados en etapa neonatal

*Los resultados de la fase de adquisición del LAM post natal se representan así: Latencias de escape en segundos ± el Error estándar (ordenadas), días de prueba en el LAM (abcisas). Las barras claras señalan latencias de escape menores en función del grupo Compvit Pre. Comparando el tercer día de adquisición con la fase de retención, la ANOVA no mostró diferencias significativas entre los grupos de estudio F(1621,18; 714,89)= 2,65; p=0,1549 (Figura 19) Figura 19. Latencia de Escape en el tercer día del LAM de adquisición y la fase de retención para los animales tratados en etapa post natal.

*Se representa la latencia de escape en segundo ± el error estándar en las ordenadas y en las abscisas, los grupos de tratamiento postnatal y la fase del LAM. Al evaluar la memoria en la fase de retención del LAM, los animales tratados con Compvit-B® en la etapa postantal no tuvieron diferencias significativas respecto

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del grupo control F(712.5313; 269.7591)=2.641361; p=0.155240 (Figura 20), sin embargo, el grupo que recibió el complejo vitamínico tuvo una latencia mucho menor. Figura 20. Latencia de escape en el LAM de retención para los animales tratados en etapa neonatal.

*Se representa la latencia de escape en segundos ± el error estándar en las ordenadas y los grupos de tratamiento prenatal en las abscisas.

Finalmente, en la fase de transferencia del LAM, los animales tratados en la etapa postnatal, no tuvieron diferencias significativas entre los grupos de tratamiento F(385.0006; 975.2958)=0.39475; p=0.552960, a pesar de tener una notable reducción de tiempo; sin embargo hubo diferencias significativas entre los días de tratamiento únicamente para el grupo ―Compvit Post‖ del primer día de LAM respecto del segundo (p=0.004129) y tercer día (p=0.000393), mientras que el grupo ―Vhl Post‖ no tuvo una evolución asintótica, lo que resalta que el proceso de aprendizaje fue efectivo solo en los animales que recibieron el tratamiento con multivitamínico en la etapa postnatal (Figura 21)

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Figura 21. Latencia de escape en el LAM de transferencia para los animales tratados en etapa neonatal

*La fase de transferencia del LAM prenatal se representan de la siguiente manera: Latencias de escape en segundos (ordenadas), días de prueba en el LAM (abcisas). Las barras claras señalan latencias de escape menores en función del grupo Compvit Pre. 4.3 INMUNOFLUORESCENCIA Se realizaron estudios histológicos, para evidenciar la posible influencia de los tratamientos sobre los procesos neurológicos tempranos. El marcaje de las células reactivas a BrdU permitió ver las células que se encontraban en división y el contraste con NeuN, permitió observar cuántas de estas células proliferantes se diferenciaron al linaje neural. En cada montaje de inmunofluorescencia, se realizaron controles para confirmar que el protocolo estandarizado y los reactivos utilizados no dieran lugar autofluorescencia (Figura 22 a y b), fluorescencia sin anticuerpos primarios (Figura 20 c y d) y para tener en cuenta un control positivo de marcaje por cada anticuerpo por separado (Figura 22 e, f, g y h)

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Figura 29. Inmunofluorescencia de todos los tratamientos en etapas pre y postnatal

*Comparación histológica de los tratamientos vehículo (a) y Compvit-B® (b) en los tratamientos pre y postnatal. Las fotografías muestran un número mayor de células con doble marcaje BrdU + NeuN en el tratamiento postnatal que recibió Compvit-B®. Bregma entre: -3.6 y -4.16 y un n= 6 cortes

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5. DISCUSIÓN Evaluando la influencia del complejo vitamínico Compvit-B®, se observaron eventos que si bien, no eran objeto central de evaluación en este proyecto y no tienen una significancia estadística por el número reducido de animales, llamaron la atención; La prolongación del periodo gestacional y la supervivencia del número de crías observado en los animales tratados en la etapa prenatal (Figuras 11 y 12), muestran que puede existir una influencia por la aplicación del Compvit-B®, sin embargo, estudios de Thaver, et al. 2008 y Haider, et al., 2011 muestran que no hay una relación entre la aplicación de vitaminas, entre ellas la vitamina B y eventos como, la producción de leche materna, peso o mortalidad de las crías. Por lo que podría realizarse un estudio que evalúe la influencia de la suplementación con vitamina B en el desarrollo prenatal, teniendo en cuenta que además de ser esta una etapa sensible para el embrión y la gestante, es usual que se suministre suplementos vitamínicos en las mujeres gestantes. El buen desempeño en el LAM de los animales que recibieron Compvit-B® durante las etapa pre y postnatal, demuestra que al igual que otros suplementos dietarios evaluados en modelos experimentales, el multivitamínico tiene efectos benéficos en el desempeño en el laberinto acuático de Morris (D’Hooge, R. & De Deyn, P., 2001); y teniendo en cuenta que las neuronas granulares producidas en la adultez son necesarias para la función hipocampal de ciertos tipos de aprendizaje y memoria, entonces los factores reguladores que disminuyen la producción de nuevas neuronas deberían estar asociados con problemas en el aprendizaje, mientras los que mejoran la producción de neuronas deben mejorar el aprendizaje (Gould, et al. 1999), deduciendo que, siendo el Compvit-B® un suplemento vitamínico que contiene elementos que están involucrados en procesos básicos que soporta entre otros la neurogénesis, puede estar mejorando la producción neuronal y de igual forma estimular también un mejor desempeño en el LAM. Los resultados aquí evaluados, confirman una reducción en la latencia de escape en todas las etapas del LAM para los animales que recibieron Compvit-B®, con diferencias significativas intragrupales para las fases de adquisición y transferencia en las etapas pre y postnatal y una diferencia intergrupal en la fase adquisición para los animales tratados con el multivitamínico en la etapa embrionaria; Éstos resultados son similares a los obtenidos por Bonilla, et al., 2008 en un estudio que evaluó la influencia del Compvit-B® en neonatos de 15 días de nacidos; en la ejecución del LAM, obtuvieron menores latencias de escape en la fase de adquisición, retención y transferencia; Confirmando el efecto estimulante del Compvit-B® sobre la memoria y el aprendizaje. La fase de adquisición del LAM tuvo una influencia mayor sobre el aprendizaje y la memoria espacial por el Compvit-B® cuando el multivitamínico fue aplicado en la

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etapa prenatal, con diferencias significativas que indican un proceso de aprendizaje mucho más eficiente que su grupo control; esto vincula la vitamina con los procesos de aprendizaje en etapas tempranas del desarrollo del Sistema Nervioso Central, como lo expuso Maurer & Tsai en un antiguo estudio en 1930, donde probó en un modelo de ratas, que la deficiencia del complejo B de las madres durante el embarazo y la lactancia afectó el aprendizaje en sus crías. La retención y la transferencia son etapas del LAM que ponen a prueba la memoria de los sujetos experimentales, y los animales que recibieron tratamiento con Compvit-B® en las etapas pre y postnatal tuvieron latencias menores que su respectivos controles, esto puede asociarse con la vitamina B12, que además de estar implicada en el mantenimiento de la función neuronal, su deficiencia puede resultar en daños neurológicos caracterizados por la pérdida de la memoria y la confusión (Morris, et al. 2005). De igual forma, la asociación de la deficiencia de la B1 con el síndrome de Korsakoff (caracterizada por la inhabilidad de generar nuevos recuerdos, una mala recuperación de los recuerdos remotos y apatía e insipidez emocional (Benton, et al., 1997), nos permite considerar que así como los procesos de memoria se ven afectados por la deficiencia de las vitaminas, podrían estimularse en el caso opuesto. Latencias de escape menores en el LAM de transferencia, indican una mejor memoria de reconocimiento, por el hallazgo de la nueva posición de la plataforma de escape (Simpson & Kelly, 2011), hecho evidenciado en los animales que recibieron Compvit-B® en las etapas pre y post natal (Figuras 15 y 18) Troen, et al. 2008, reportan en un modelo experimental de ratones, que la deficiencia del complejo B, afecta significativamente la habilidad de los animales para aprender la nueva ubicación de la plataforma en la fase de transferencia del LAM, además mostraron una dificultad en el uso de las estrategias espaciales para encontrar la plataforma en comparación con el grupo control; evidenciando que el complejo vitamínico puede estar soportando los mecanismos mediante los cuales el animal recuerda y aprende de nuevo a encontrar la plataforma en el LAM de transferencia. Aunque el complejo vitamínico no influenció un desarrollo cognitivo significativamente superior a su grupo control en la mayoría de los casos, es evidente cómo mejora la habilidad de los animales para resolver el paradigma cognitivo del LAM, además, la aplicación ip. del Compvit-B® no va directamente a soportar los procesos involucrados en el aprendizaje y la memoria, por lo que dosis superiores no afectarían únicamente el desarrollo cognitivo de los animales, sino que podría ser benéfico o perjudicial en otros procesos del desarrollo integral. De igual forma, con los resultados también se podría asociar que las áreas vinculadas con el aprendizaje y la memoria como el hipocampo, que es necesario para la adquisición y retención de la información espacial, así como para su

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consolidación (D’Hooge & De Deyn, 2001), tendrían una mayor actividad o producción neuronal, presumiblemente estimulada por el Compvit-B®. Sin embargo, a pesar de los resultados comportamentales, las células marcadas con BrdU y NeuN en la zona hipocampal de los animales tratados en la etapa prenatal, no fueron muy diferentes de los animales control; Este hecho, nos puede indicar que la influencia del Compvit-B® no está en la producción de neuronas durante esta etapa, sino en mejorar la eficiencia de las neuronas existentes. Porque, aunque durante el desarrollo, el feto puede obtener la mayoría de las vitaminas de su madre, y en particular las vitaminas solubles, que son activamente transportadas a través de la placenta durante el embarazo (Leaf, 2007); Durante el periodo prenatal, es común que se produzca deficiencia en las vitaminas A, D, tiamina, riboflavina, piridoxina, Cobalamina y ácido fólico (Bruinse & Van den Berg, 1995), por lo que es posible, que el destino de la aplicación de Compvit-B® fuera a suplementar las deficiencias de la madre en su etapa gestante. Y aunque durante la etapa prenatal tardía y postnatal temprana es donde se producen los principales picos neurogénicos, solo una pequeña parte de las neuronas pueden sobrevivir mas allá de las 4 semanas (Kee, et. al. 2007), siendo el periodo postnatal temprano, un periodo importante para la apoptosis neural, por lo que, de producirse neurogénesis influenciada por Compvit-B® en la etapa prenatal, puede que éstas se estén perdiendo al pasar por los picos apoptóticos postnatales. Vale la pena resaltar también, que a la hora de aplicar medicamentos a las gestantes, se deben tener en cuenta factores farmacocinéticos que determinan que tanta, en este caso vitamina llega al embrión o feto. Para ello se debe contar con la administración, distribución, metabolismo y excreción de la madre; el paso y metabolismo a través del saco vitelino y la placenta; la distribución, metabolismo y excreción del embrión o feto; y la reabsorción e ingestión de sustancias del fluido amniótico (Peters & Schaefe, 2001), por lo que es muy posible que la cantidad de vitamina recibida por los animales tratados en etapa prenatal, fuera mucho menor que la que recibieron los animales en etapa postnatal. Como lo evidenciado por Berman y colegas quienes encontraron que al suplementar con vitamina B6 embarazadas durante las últimas 3 a 5 semanas se incrementan los niveles de serotonina en sangre materna, mas no se incrementa en la sangre del cordón umbilical, lo que sugiere que la placenta puede proteger el feto de la sobre exposición a la vitamina (Berman, et al. 1965) entregando únicamente lo necesario para el desarrollo correcto del feto. Aún cuando, de acuerdo con Ortega, et al. En el 2004, la administración de tiamina durante el último trimestre de embarazo en humanos, influencia las concentraciones de tiamina en la leche materna. Considerando, que si bien la asimilación de la vitamina pudo verse reducida durante la fase prenatal, pudo haber una pequeña recuperación en la etapa de amamantamiento.

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En contraste, los animales tratados con Compvit-B® en la etapa postnatal, mostraron diferencias significativas en la producción neuronal en comparación con todos los tratamientos, incluyendo la etapa prenatal, esto debido a que, en los animales adultos-jóvenes, muchas neuronas nuevas son producidas diariamente (Kee, et. al. 2007), además, entre las principales diferencias en el desarrollo cerebral entre el ser humano y la rata son que, la velocidad máxima de crecimiento del cerebro humano ocurre en el nacimiento, mientras que en ratas y ratones ocurre postnatalmente (Zhang, et al. 2010), indicando que un mejor efecto del complejo vitamínico durante la etapa postnatal en ratas sea debido a que en ellas el desarrollo cerebral es progresivamente mayor durante este periodo. El complejo B, está involucrado en diversos procesos que permiten el buen funcionamiento cerebral además de estar asociadas con diferentes aspectos del metabolismo que asocia estas vitaminas en un papel neuroprotector o estimulador de la neurogénesis Entre los mecanismos mediante los cuales las vitaminas B1, B6 y B12 pudieron actuar en el cerebro en desarrollo podemos encontrar que en su mayoría, estas vitamina están involucradas en reacciones esenciales que permiten el desarrollo de procesos básicos, es así como según Depeint, et al. 2006 han enfatizado la importancia del Complejo B en el mantenimiento del metabolismo energético mitocondrial y cómo la mitocondria, como organelo responsable del metabolismo energético, se ve comprometido ante la deficiencia de cualquier vitamina del complejo B. Y además de ser las neuronas, uno de los tipos celulares que más requiere energía, las etapas pre y postnatal también implican un alto requerimiento energético por la gran cantidad de procesos que se llevan a cabo en estos periodos, que de verse afectados, alteraría el desarrollo del sistema nervioso. De acuerdo con Kaneda, et al., 1997, la tiamina en su forma fisiológicamente activa, Pirofosfato de Tiamina (TPP) es catalizador de importantes enzimas involucradas en la producción energética (metabolismo de los carbohidratos y pentosas), y el deterioro energético afecta los mecanismos que mantienen el potencial de membrana, llegando a causar citotoxicidad y degeneración neural. Es un cofactor importante de tres formas diferentes de cetoácido deshidrogenasas involucradas en descarboxilación oxidativa del piruvato, el α cetoglutarato y aminoácidos de cadena ramificada (Mayr, et al. 2011). Se relaciona con la sinaptogénesis y las enzimas dependientes de tiamina, son importantes en el establecimiento de patrones adultos del metabolismo energético cerebral y para la síntesis de mielina (Ramakrishna, 1999). La piridoxina por su parte, en la forma fisiológicamente activa, fosfato piridoxal (PLP), es una coenzima importante en la transformación metabólica de muchos aminoácidos (Kaneda, et al. 1997), y su déficit puede afectar la producción de muchos neurotransmisores. La B6 es también, precursora del pyridoxal 5’-fosfato,

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que regula la afinidad del eritrocito por el O2 (Shen, et al. 2010), y está involucrada en la asimilación de glucosa por parte del cerebro (Wei, et al., 1999), lo que permite la oxigenación y nutrición cerebral, aspectos vitales del desarrollo temprano. Además, se ha probado en un modelo experimental de rata, que la neurogénesis y la longevidad neuronal se ven altamente afectados cuando existe restricción de la B6 durante la gestación (Groziak & Kirksey, 1987), mostrando una fuerte vinculación a los procesos de mielinización durante las etapas pre y postnatal (Ramakrishna, 1999). La piridoxina es también cofactor de en la síntesis de GABA, un regulador de múltiples fases de la neurogénesis, incluyendo los mecanismos de diferenciación e integración sináptica, dependientes de piridoxina y promotor de la supervivencia neuronal y la mejora en funciones cognitivas como la memoria (Yoo, et al. 2011). La deficiencia de B6 puede ocasionar isquemia, formación de edemas, producción de radicales libres, neurotoxicidad y deficiencias cognitivas a largo plazo (Kuypers & Hoane), por lo que la falta de esta vitamina afectaría seriamente la integridad de gestantes, además, se ha demostrado que la deficiencia de la vitamina B6 en los últimos días de gestación y los primeros días postnatales, decrecen el número de neuronas presentes en el neocórtex junto con la densidad sináptica (Ramakrishna, 1999). En conjunto, la B6 y B12 están vinculadas directamente a la función cerebral a través del ciclo de metilaciones, en reacciones dependientes de cobalamina y piridoxina que comprometen un gran número de metil-transferasas, reguladoras internas de moléculas como la DOPA y otros componentes como lípidos y proteínas (Weir & Scott, 1999). La B6 y B12 también están relacionadas con la enfermedad de Alzheimer; La B12 está involucrada en la biosíntesis de metionina a partir de su precursor homocisteína, y la B6 juega un rol en la conversión de homocisteína a cisteína, y se han relacionado los elevados niveles de homocisteína como un factor de riesgo para la oclusión arterial el tromboembolismo en la infancia (Rodríguez, 1998) y la enfermedad de Alzheimer (Ramesh, et al. 2010), por lo que el consumo de estas vitaminas es recomendado en la etapa senil donde es más común el Alzheimer, y ya que el Compvit-B® contiene estas vitaminas, podría evaluarse como un elemento protector en un modelo de la enfermedad de Alzheimer. La Cianocobalamina (B12), implicada en el proceso de mielinización (Black, 2008) pudo ser más efectiva en el periodo postnatal, por ser en este dónde ocurren los principales procesos mielinizantes del desarrollo (Gao, et al. 2009), su deficiencia se asocia con la desmielinización y la atrofia cerebral en infantes (Black, 2008). Esta desmielinización puede afectar los sistemas auditivo y visual, llegando a interferir con el aprendizaje (Black, 2008), esta evidencia se puede relacionar con

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lo obtenido en el LAM donde los animales que recibieron Compvit-B® tuvieron mejores latencia de escape. Finalmente, es de considerar que previamente se ha evaluado usando marcadores mediante expresión inmediata que las nuevas células se activan preferiblemente durante pruebas de aprendizaje, (Van Praag, 2009) y aunque no hubo un control para las pruebas comportamentales, puede que en conjunto, con la aplicación del Compvit-B® se optimizara el proceso neurogénico durante ambas etapas; por lo que un estudio que separara el aspecto comportamental de la aplicación del complejo vitamínico podría dilucidar que tanto afecta la ejecución de paradigmas cognitivos en la efectividad del Compvit-B®.

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6. CONCLUSIONES El presente estudio, permitió establecer la influencia positiva del Compvit-B® en la neurogénesis cuando es aplicado durante los últimos 15 días de gestación y en el periodo postnatal temprano, teniendo un mejor efecto en este último. Los animales sometidos al tratamiento con Compvit-B®, en ambas etapas tuvieron un mejor desempeño en la prueba comportamental del LAM, particularmente en la fase de transferencia, donde se pudo evidenciar la influencia del complejo vitamínico en el aprendizaje y la memoria. Mientras que el análisis histológico, permitió observar cómo se incrementó la población neuronal de los animales tratados en el periodo postnatal mediante el doble marcaje BrdU y NeuN. Este proyecto logró establecer que durante el desarrollo postnatal temprano, es posible estimular el proceso neurogénico mediante la aplicación del Compvit-B®, así como mejorar la memoria y el aprendizaje desde la etapa prenatal final. Concluyendo que el complejo vitamínico podría suministrarse a las poblaciones en las que existe típicamente falencia de estas vitaminas (madres con vegetarianismo estricto, alcoholismo, entre otras condiciones), con prescripción médica en poblaciones normales o en pacientes con patologías asociadas a la deficiencia de éstas vitaminas. Sumando así nuevos aportes de la aplicación del Compvit-B como suplemento vitamínico.

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REFERENCIAS

Adachi, K., Izumi, M., Osano, Y., Miura, N., Takatsu, S., Terao, S., & Mitsuma, T.

(2003). Polyamine concentrations in the brain of vitamin B12-deficient rats.

Experimental Biology and Medicine. 228, 1069–1071.

Altman, J. & Bayer, S.A. (1990). Migration and distribution of two populations of

hippocampal granule cell precursors during the perinatal and postnatal periods.

Journal of Comparative Neurology. 301, 365–381

Ares, R & Abud, M. (2009). Procedimiento: Tinción Hematoxilina – Eosina de

anatomía parológica. Hospital Padre Hurtado. Recuperado de:

http://www.hurtadohosp.cl/archivos/CalidadySeguridad/NormasdeCalidad/Nor

mas_Anatomia_Patologica/PTHEAP.pdf

Arias, O., Olivares, T., Drucker, R. (2007). Neurogénesis en el cerebro adulto.

Revisión en Neurociencia. 44(9), 541-550.

Ariogul, S., Cankurtaran, M., Dagli, N., Khalil, M., & Yavuz, B. (2005). Vitamin B12,

folate, homocysteine and dementia: are they really related?. Archives of

Gerontology and Geriatrics. 40, 139–146. doi:10.1016/j.archger.2004.07.005

70

Ávila, M. (2008). Estudio de la incidencia de la cocaína sobre la neurogénesis de

poblaciones hipocampales de ratas jóvenes adultas y su relación con los

procesos de memoria y aprendizaje. (Tesis de Maestría no publicada).

Universidad del Tolima. Ibagué.

Balu, D. T. & Lucki, I. (2009). Adult hippocampal neurogenesis: regulation,

functional implications, and contribution to disease pathology. Neuroscience &

Biobehavioral Reviews. 33(3), 232–252.

Bartzokis, G., Cummings, J. L., Sultzer, D., Henderson, V. W., Nuechterlein, K. H.,

& Mintz, J. (2003). White matter structural integrity in healthy aging adults and

patients with Alzheimer disease: a magnetic resonance imaging study.

Archives of Neurology. 60, 393–398.

Bath, K. G. & Lee, F. S. (2010). Neurotrophic factor control of adult SVZ

neurogenesis. Developmental Neurobiology. 70(5), 339–349.

Bayer, S. A. (1980). Development of the hippocampal region in the rat:

Neurogenesis examined with 3H-thymidine autoradiography. Journal of

Comparative Neurology. 190, 87-114.

71

Begg, A. C., Hofland, I., Van Der Pavert, I., Van Der Schueren, B., & Haustermans,

K. (2000). Use of thymidine analogues to indicate vascular perfusion in

tumours. British Journal of Cancer. 83, 899 – 905.

Belluzzi, O., Benedusi, M., Ackman, J., & Loturco, J. J. (2003). Electrophysiological

differentiation of new neurons in the olfactory bulb. The Journal of

Neuroscience. 23, 10411 – 10418.

Benton, D., Griffiths, R. & Haller, J. (1997). Thiamine supplementation mood and

cognitive functioning. Psychopharmacology 129, 66-7.

Berman, J.L., Justice, P., y Hsia, D. (1965). The metabolism of 5-

hydroxytryptamine (serotonin) in the newborn. The Journal of Pediatrics. 67

(4), 603–608

Bernard, M. A., Nakonezny, P. A., & Kashner, T. M. (1998). The effect of vitamin

B12 deficiency on older veterans and its relationship to health. Journal of the

American Geriatrics Society. 46, 1199–1203.

Bhardwaj, R. D., Curtis, M. A., Spalding, K. L., Buchholz, B. A., Fink, D., & Bjork, T.

(2006). Neocortical neurogenesis in humans is restricted to

72

development. Procedings of the National Academy of Science. 103, 12564 –

12568.

Black, M. (2008) Effects of vitamin B12 and folate deficiency on brain development

in children. Food and Nutrition Bulletin. 29, 126 – 131.

Blaschke, A. J., Staley, K., & Chun, J. (1996). Widespread programmed cell death

in proliferative and postmitotic regions of the fetal cerebral cortex.

Development. 122, 1165 – 1174.

Bonilla, A., Bonilla, L., Francis, L., & González, T. (2008). Efectos del COMPVIT-

B® sobre la memoria y el aprendizaje espacial y la actividad motora en ratas

Wistar neonatas. Revista Tumbaga. 3, 81 - 91.

Bonilla, A., Bonilla L. (2006). Ciencia del animal de laboratorio: El primer peldaño

hacia la neurociencia y la experimentación animal. (Proyecto de pasantía no

publicado). Universidad del Tolima. Ibagué.

Botez, M. I., Young, S. N., Bachevalier, J., & Gauthier, S. (1982). Effect of folic acid

and vitamin B12 deficiencies on 5-hydroxyindoleacetic acid in human

cerebrospinal fluid. Annals of Neurology. 12, 479 – 484.

73

Brennan, M. J., Cantrill, R. C., Warner, S. J., Van Der Westhuyzen, J., Fernandes,

F., Kramer, S., & Metz, J. (1981). Amino acid transmitter receptor binding in

synaptic membranes from normal and vitamin B12 deficient fruit bats. Brain

Research. 219, 186–189.

Bruinse, H. W., & Van Den Berg, H. (1995). Changes of some vitamin levels during

and after normal pregnancy. European Journal of Obstetrics & Gynecology and

Reproductive Biology. 61, 31 - 37.

Bures, J., & Buresova, O. (1983). Techniques and basic experiments for the study

of brain and behavior. 2nd ed. Amsterdam: Elsevier Science Publishers B. V.

Butterworth, R. F. (1990). Vitamin deficiencies and brain development. En:

Nutrition and the Infant Brain. (207-224). N.M.Van Gelder, R.F.Butterworth &

B. Drujan, Eds:. Wiley-Liss Inc. New York.

Buss, R. R., & Oppenheim, R. W. (2004). Role of programmed cell death in normal

neuronal development and function. Anatomical Science International. 79(4),

191 – 197.

Buss, R. R., Sun, W., & Oppenheim, R. W. (2006). Adaptive roles of programmed

cell death during nervous system development. Annual Review of

Neuroscience. 29, 1–35.

74

Bystron, I., Blakemore, C., & Rakic, P. (2008). Development of the human cerebral

cortex: Boulder Committee revisited. Nature Reviews Neuroscience. 9, 110 –

122.

Carlen, M., Cassidy, R. M., Brismar, H., Smith, G. A., Enquist, L. W., & Frisen, J.

(2002). Functional integration of adult-born neurons. Current Biology. 12, 606 –

608.

Carmel, R. (1997). Cobalamin, the stomach, and aging. The American Journal of

Clinical Nutrition. 66, 750-759.

Carretti, N., Ditto, A., & Guidoni, C. (1998). Vitamin B levels in pregnancy influence

erythropoietin response to 12 anemias. European Journal of Obstetrics &

Gynecology and Reproductive Biology. 80, 63–66.

Centro de Investigación, Hospital General Universitario de Valencia. (1990).

Anestesia en el animal de laboratorio. Roedores. Research in surgery.

Recuperado de:

http://www.oc.lm.ehu.es/Fundamentos/Doctorado/cursos/CirExp/015.pdf

Clancy, B., Darlington, R. B., & Finlay, B. L. (2001). Translating developmental

time across mammalian species. Neuroscience. 105(1), 7–17.

75

Combs, G. (2008). The Vitamins: Fundamental Aspects in Nutrition and Health.

Third Edition. San Diego, California - Estados Unidos. Elsevier Academic

Press.

Cowan, W. M., Fawcett, J. W., O'leary, D. D., & Stanfield, B. B. (1984). Regressive

events in neurogenesis. Science. 225, 1258–1265.

Dekaban, A. S. (1978). Changes in brain weights during the span of human life:

relation of brain weights to body heights and body weights. Annals of

Neurology. 4, 345–356.

Delgadillo, J., & Ayala, G. (2009). Efectos de la deficiencia de riboflavina sobre el

desarrollo del tejido dentoalveolar, en ratas. Anales de la Facultad de

Medicina. 70 (1), 19-27.

De Graaf, V. B., & Hadders, M. (2006). Ontogeny of the human central nervous

system: What is happening when?. Early Human Development. 82, 257–266.

De La Rosa, E. J., & De Pablo, F. (2000). Cell death in early neural development:

beyond the neurotrophic theory. Trends in Neuroscience. 23, 454–458.

76

Del Rio, J. A., & Soriano, E. (1989). Immunocytochemical detection of 5′-

bromodeoxyuridine incorporation in the central nervous system of the mouse.

Developmental Brain Research. 49, 311–317.

Depeint, F., Bruce, W. & Shangari, N. (2006). Mitochondrial function and toxicity:

Role of the B-Vitamin family on mitochondrial energy metabolism. Chemico-

Biological Interactions Journal. 16, 94-112.

Desai, A. R., & Mc Connell, S. K. (2000). Progressive restriction in fate potential by

neural progenitors during cerebral cortical development. Development.

127(13), 2863 – 2872.

D’hooge, R., & De Deyn, P. P. (2001). Applications of the Morris water maze in the

study of learning and memory. Brain Research Reviews. 36, 60 – 90.

Dis Mon. (2003). Vitamin B1. Dis Mon. 49, 646 - 52

Dudchenko, P. A. (2004). An overview of the tasks used to test working memory in

rodents. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 28 (7), 699 – 709.

Eisch, A. J, Barrot, M., Schad, C. A., Self, D. W., & Nestler, E. J. (2000). Opiates

inhibit neurogenesis in the adult rat hippocampus. Proceedings of the

Nationational Academy of Sciences USA. 97, 7579 – 7584.

77

Eisch, A. J., & Nestler, E. J. (2002). To be or not to be: adult neurogenesis and

psychiatry. Clinical Neuroscience Research. 2, 93 – 108

Eriksson, P. S., Perfilieva, E., Bjork- Eriksson, T., Alborn, A. M., Nordborg, C.,

Peterson, D. A., & Gage, F. H. (1998). Neurogenesis in the adult human

hippocampus. Nature Medicine. 4, 1313 – 1317.

Eussen, S., Vollset, S., Hustad, S. Midttun, Ø., Meyer, K., Fredriksen, Å., … &

Riboli, E. (2010). Plasma vitamins B2, B6, B12, and related genetic variants as

predictors of colorectal cancer risk. Cancer Epidemiology, Biomarkers &

Prevention. 19(10), 2549 – 2561.

Fenoglio, K. A., Brunson, K. L., & Baram, T. Z. (2006). Hippocampal neuroplasticity

induced by early-life stress: functional and molecular aspects. Frontiers in

Neuroendocrinology. 27, 180 – 192.

Forrelat, M., Gómis, I., & Gautier, H. (1999). Vitamina B12: Metabolismo y aspectos

clínicos de su deficiencia. Revista Cubana de Hematología, Inmunología y

Hemoterapia. 15(3), 159 – 74.

78

Frank, T., Czeche K., Bitsch, R., & Stein, G. (2000). Assessment of thiamine status

in chronic renal failure patients, transplant recipients and hemodialysis patients

receiving a multivitamin supplementation. International Journal for Vitamin and

Nutrition Resesrch. 70, 159-66.

Freese, A., O'rourke, D., Judy, K., & O'connor, M. J. (1994). The application of 5-

bromodeoxyuridine in the management of CNS tumors. Journal of Neuro-

Oncology. 20, 81–95.

Fujii, A., Matsumoto, H., & Yamamoto, H. (1996). Effect of Vitamin B Complex on

Neurotransmission and Neurite Outgrowth. General Pharmaceutical. 278(6)

995 - 1000.

Gao, W., Lin, W., Chen, Y., Gerig, G., Smith, J. K., Jewells, V., & Gilmore, J. H.

(2009). Temporal and spatial development of axonal maturation and

myelination of white matter in the developing brain. American Journal of

Neuroradiology. 30, 290 – 296.

Gheusi, G., Ortega, I., Murray, K., & Lledo, P. (2009). A niche for adult

neurogenesis in social behavior. Behavioural Brain Research. 200, 315–322.

doi:10.1016/j.bbr.2009.02.006.

79

Giedd, J. (1999). Brain development, IX: human brain growth. American Journal of

Psychiatry. 156, 4.

Goda, Y., & Davis, G. W. (2003). Mechanisms of synapse assembly and

disassembly. Neuron. 40, 243–264.

Goldman, S. A., & Windrem, M. S. (2006). Cell replacement therapy in neurological

disease. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological

Sciences. 361, 1463–1475.

González, O., Almaguer, W., Gómez, L., Báez, M., & Bergado, J. (2011). Un

método experimental para lesionar un nervio periférico y evaluar

conductualmente la recuperación y el efecto de tratamientos restaurativos.

Revista Cubana de Investigaciones Biomédicas. 30(2), 260-270

González, O. T., Almaguer, W., Ramírez, M., Vallejo, A., & Bergado, J. (2011 A).

Efectos del tratamiento con Compvit B, ácido orótico o la combinación de

ambos sobre la recuperación de la memoria espacial en ratas con lesión de

fimbria-fornix. Revista Cubana de Investigaciones Biomédicas. 30, 194-207.

Gould, E., Tanapat, P., Mc Ewen, B. S., Flügge, G., & Fuchs, E. (1998).

Proliferation of granule cell precursors in the dentate gyrus of adult monkeys is

80

diminished by stress. Proceedings of the National Academy of Sciences USA.

95, 3168 – 3171

Gould, E., Tanapat, P., Hastings, N., & Shors, T. (1999). Neurogenesis in

adulthood: a possible role in learning. Trends in Cognitive Sciences. 3 (5).

Gould, E., Vail, N., Wagers, M., & Gross, C. G. (2001). Adult-generated

hippocampal and neocortical neurons in macaques have a transient existence.

Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 98, 10910 – 10917.

Groziak, S. & Kirksey, A. (1987). Effects of maternal dietary restriction in vitamin B6

on neocortex development in rats. The journal of nutrition. 117(6), 1045-52

Greenberg, J., Bell, S., Guan, Y., & Yu, Y. (2011). Folic Acid Supplementation and

Pregnancy: More Than Just Neural Tube Defect Prevention. Reviews In

Obstetrics & Gynecology. 4(2), 52

Guevara, R., González, M. & Virgilii, I. (2010). Tratamiento quirúrgico de la

menopausia, un modelo experimental. Rev Obstet Ginecol Venez. 70 (3), 178 -

189.

Hagg, T. (2009). From Neurotransmitters to Neurotrophic Factors to Neurogenesis.

Neuroscientist. 15(1), 20 – 27.

81

Haider, B., Yakoob, M., & Bhutta, Z. (2011). Effect of multiple micronutrient

supplementationduring pregnancy on maternal and birth outcomes. BMC

Public Health 11(3).

Hansen, C. M., Leklem, J. E., & Miller, L. T. (1996). Vitamin B-6 status of women

with a constant intake of vitamin B-6 changes with three levels of dietary

protein. Journal of Nutrition. 126, 1891 - 1901.

Havaux, M., Ksas, B., Szewczyk, A., Rumeau, D., Franck, F., Caffarri, S., &

Triantaphylidès, C. (2009). Vitamin B6 deficient plants display increased

sensitivity to high light and photo-oxidative stress. BMC Plant Biology. 9, 130

Healton, E. B., Savage, D. G., Brust, J. C., Garrett, T. J., & Lindenbaum, J. (1991).

Neurological aspects of cobalamin deficiency. Medicine (Baltimore). 70, 229 –

45.

Herbert, V. (1996). Vitamin B12, En: EPresent Knowledge in Nutrition, seventh ed.

(191 – 205). E. Ziegler, L.J. Filer (Eds.). Washington, DC: ILSI Press,

Herrmann, W., & Geisel, J. (2002). Vegetarian lifestyle and monitoring of vitamin B-

12 status. Clinica Chimica Acta. 326, 47 – 59.

82

Higdon, J. (2000). Thiamin. Linus Pauling Institute Micronutrient Information

Center; Recuperado de: http://osu.orst.edu/dept/lpi/infocenter.

Hsieh, J. & Eisch, A. (2010). Epigenetics, hippocampal neurogenesis, and

neuropsychiatric disorders: unraveling the genome to understand the mind.

Neurobiology of Disease. 39, 73 – 84.

Hume, W. J., & Saffhill, R., (1986). Iodo- and bromodeoxyuridine are excised at

different rates from DNA of mouse tongue keratinocytes in vitro. Chemico-

Biological Interactions. 60, 227 – 232.

Hüppi, P. S., Warfield, S., Kikinis, R., Barnes, P. D., Zientara, G. P., Jolesz, F.A., ...

& Volpe, J.J. (1998). Quantitative magnetic resonance imaging of brain

development in premature and mature newborns. Annals of Neurology. 43,

224 – 235.

International Council for Laboratory Animal Science & Council for international

Organization of Medical Sciences. (2012). International Guiding Principles for

Biomedical Research Involving Animals. Recuperado de http://iclas.org/wp-

content/uploads/2013/03/CIOMS-ICLAS-Principles-Final.pdf

83

Ikeuchi, Y., & Nishizaki, T. (1995). Methylcobalamin induces a long-lasting

enhancement of the postsynaptic field potential in hippocampal slices of the

guinea pig. Neuroscience Letters. 192, 113–116.

Imayoshi, I., Sakamoto, M., Ohtsuka, T., Takao, K., Miyakawa, T., Yamaguchi,

M.,…& Kageyama, R. (2008). Roles of continuous neurogenesis in the

structural and functional integrity of the adult forebrain. Nature Neuroscience.

11, 1153–1161.

Innocenti, G. M., & Price, D. J. (2005). Exuberance in the development of cortical

networks. Nature Reviews, 6(12), 955–965.

Kaneda, K., Kikuchi, M., Kashii, S., Honda, Y., Maeda, T., Kaneko, S. & Akaike, A.

(1997). Effects of B vitamins on glutamate-induced neurotoxicity in retinal

cultures. European Journal of Pharmacology. 322, 259–264

Karpowicz, P., Morshead, C., Kam, A., Jervis, E., Ramunas, J., Cheng, V., & Van

Der Kooy, D. (2005). Support for the immortal strand hypothesis: neural stem

cells partition DNA asym- metrically in vitro. The Journal of Cell Biology. 170,

721 – 732.

84

Kee, N., Sivalingam, S., Boonstra, R., & Wojtowicz, J.M. (2002). The utility of Ki-67

and BrdU as proliferative markers of adult neurogenesis. Journal of

Neuroscience Methods. 115, 97-105.

Kee, N., Teixeira, C., Wang, A., & Frankland, P. (2007). Imaging activation of adult-

generated granule cells in spatial memory. Nature Protocols. 2, 12.

Kempermann, G. (2002). Why new neurons? Possible functions for adult

hippocampal neurogenesis. Journal of Neuroscience. 22, 635 – 638.

Kerever, A., Schnack, J., Vellinga, D., Ichikawa, N., Moon, C., Arikawa, E., … &

Mercier, F. (2007). Novel Extracellular Matrix Structures in the Neural Stem

Cell Niche Capture the Neurogenic Factor Fibroblast Growth Factor 2 from the

Extracellular Milieu. Stem Cells. 25, 2146 – 2157.

Knickmeyer, R. C., Gouttard, S., Kang, C., Evans, D., Wilber, K., Smith, J. K.., … &

Gilmore, J. (2008). A structural MRI study of human brain development from

birth to 2 years. Journal Neuroscience. 28, 12176 – 12182.

Kolb, B., & Gibb, R. (2011). Brain Plasticity and Behaviour in the Developing Brain.

Journal of the Canadian Academy of Child and Adolescent Psychiatry. 20(4),

265 – 276.

85

Kornack, D. R., & Rakic, P., (2001). The generation, migration, and differentiation

of olfactory neurons in the adult primate brain. Proceedings of the National

Academy of Sciences USA. 98, 4752 – 4757.

Kumar, S. S., Chouhan, R. S., & Thakur, M. S. (2009). Enhancement of

chemiluminescence for vitamin B12 analysis. Analytical Biochemistry. 388, 312

– 316

Kuypers, N., & Hoane, M. (2010). Pyridoxine Administration Improves Behavioral

and Anatomical Outcome after Unilateral Contusion Injury in the Rat. Journal of

Neurotrauma. 27, 1275 – 1282.

Ladher, R. & Schoenwolf, G. (2005). Making a neural tube: neural tube induction

and neurulation. En: Developmental Neurobiology 4th edn. (1-20). Mahendra

SR, Jacobson M (eds). New York: Kluwer Academic/Plenum Publishing.

Laforenza, U., Patrini, C., Alvisi, C., Faelli, A., Licandro, A., & Rindi, G. (1997).

Thiamine uptake in human intestinal biopsy specimens, including observations

from a patient with acute thiamine deficiency. The American Journal of Clinical

Nutrition. 66, 320 - 326.

Lalonde, R., Barraud, H., Ravey, J., Guéant, J., Bronowicki, J., & Strazielle, C.

(2008). Effects of a B-vitamin-deficient diet on exploratory activity, motor

86

coordination, and spatial learning in young adult Balb/c mice. Brain Research.

1188, 122 – 131

Landing, B. H., Shankle, W. R., Hara, J., Brannock, J., & Fallon, J. H. (2002). The

development of structure and function in the postnatal human cerebral cortex

from birth to 72 months: changes in thickness of layers II and III co-relate to the

onset of new age-specific behaviors. Pediatric Pathology & Molecular

Medicine. 21, 321 – 342.

Leaf, A. (2007). Vitamins for babies and young children. Archives of Disease in

Childhood.92, 160 – 164.

Leuner, B., Glasper, E., & Gould, E. (2009).Thymidine analog methods for studies

of adult neurogenesis are not equally sensitive. Journal of Comparative

Neurology. 517(2), 123 – 133.

Lois, C., & Alvarez, A. (1994). Long-distance neuronal migration in the adult

mammalian brain. Science. 264, 1145 – 1148.

Long, J. A., & Evans, H. M. (1922). The estrous cycle in the rat and its associated

phenomena. Memories of University of California. 6, 1 - 148.

87

Lossi, L, & Merighi, A. (2003). In vivo cellular and molecular mechanisms of

neuronal apoptosis in the mammalian CNS. Progress in Neurobiology. 69, 287

– 312.

Mackraj, I., Thirumalab, G., & Gathiram, P. (2009). Vitamin B6 deficiency alters

tissue iron concentrations in the Wistar rat. Journal of Trace Elements in

Medicine and Biology. 23, 43 – 49.

Manore, M. M. (2000). Effect of physical activity on thiamine, riboflavin, and vitamin

B-6 requirements. The American Journal of Clinical Nutrition. 72, 598 - 606.

Markakis, E. A., & Gage, F.H. (1999). Adult-generated neurons in the dentate

gyrus send axonal projections to field CA3 and are surrounded by synaptic

vesicles. Journal of Comparative Neurology. 406, 449 – 460.

Maurer, S. & Tsi, L. (1930). Vitamin B deficiency and learning ability. Juornal of

comparative psychology, 11(1), 51-62.

Mayr, J. Fresinger, P., Schlachter, K., Rolinsdky, B., Zimmermann, F., Scheffer, T.,

Hoack, T., Kock, J., Ahting, U., Prokisch, H. & Sperl, W. (2011), Thiamine

psychokinse deficiency un encephalopathic children with defects in the

pyruvate oxidation pathway. The American journal of human genetics. 89, 806-

812.

88

Merrill, A. H., & Burnham, F. S. (1990). Vitamin B-6. En: Present Knowledge in

Nutrition (M.L. Brown, ed.). (155 – 162). Washington, DC, USA: International

Life Science Institute, Nutrition Foundation,

Miller, M., & Nowakowski, R. S. (1988). Use of bromodeoxyuridine-

immunohistochemistry to examine the proliferation, migration and time of origin

of cells in the central nervous system. Brain Research. 457, 44 – 52.

Mindell, E. (1998). The vitamin bible: how the right vitamins and nutrients

supplements can revolutionise your life. 2nd edition. (36 - 38) London,

England: Arlington Books.

Ministerio de Ciencia e Innovación. (2012). Técnicas de obtención e inoculación de

muestras. Consejo superior de investigaciones científicas. Centro Nacional de

Biotecnología. Universidad Autónoma de Madrid. Recuperado de:

www.cnb.csic.es/.../CEEA/CEEA_Tecnicas61_2.doc

Montalvo, C. (2010). Técnica Histológica. Recuperado de:

http://www.facmed.unam.mx/deptos/biocetis/PDF/Portal%20de%20Recursos%

20en%20Linea/Apuntes/3_tecnica_histologica.pdf

89

Morgane, P., Austin, R., Bronzino, J., Tonkiss, J., Diaz, S., Cintra, L., Kemper, T.,

Galler, J. (1993). Prenatal malnutrition and development of the brain.

Neuroscience and Behavioral Reviews. 17, 91-128.

Morris, R. (1984). Developments of a water maze procedure for studying spatial

learning in the rat. Journal of Neuroscience Methods.11, 47 – 60.

Morris. M., Evans, D., Bienias, J., Tangney, C., Hebert, L., Scherr, P. & Schneider,

J. (2005). Dietary folate and vitamin B12 intake and cognitive decline among

community –dwelling older persons. Archives of neurology, 62(4), 641-645.

Mrzljak, L., Uylings, H., Van Eden, C. G., & Judas, M. (1990). Neuronal

development in human prefrontal cortex in prenatal and postnatal stages. En:

The Prefrontal Cortex: Its Structure, Function and Pathology. (185 - 222).

Uylings HBM, van Eden CG, de Bruin JPC, Corne MA, Feenstra MGP (eds).

Amsterdam: Elsevier.

Muñoz, J., Saldivar, S., Maldonado, C., Muñoz, C., & Moreno, M. (2010). La

habilidad para sujetar y manejar animales de laboratorio no se adquiere

fácilmente. Revista electrónica de Veterinaria. 12 (5B), 1695 - 7504.

Recuperado de:

http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n050511B/051116.pdf

90

Murcia, E. (2010).Cirugía estereotáxica: canulación en rata. Recuperado de:

http://dameunsilbidito.wordpress.com/2010/12/17/cirugia-estereotaxica-

canulacion-en-rata/

Nowakowski, R. S., Lewin, S. B., & Miller, M. W. (1989). Bromodeoxyuridine

immunohistochemical determination of the lengths of the cell cycle and the

DNA-synthetic phase for an anatomically defined population. Journal of

Neurocytology. 18, 311 – 318.

Ortega, R., Martínez, R., Andrés, P., Marín, L. & López, A. (2004). Thiamin status

during the third trimester of pregnancy and its influence on thiamin

concentrations in transition and mature breast milk. British Journal of Nutrition.

92, 129-135.

Peters, P., & Schaefe, C. (2001). General commentary to drug therapy and drug

risks in pregnancy. En: Pregnancy and Lactation. Ed. Schaefer, C. Elsevier

sciencies B.V.

Ramakrishna, T. (1999). Vitamins and brain development. Physiological Research.

48, 175 -187

91

Ramesh, B., Sathyanarayana, T., Prakasam, A., Sambamurti, K., & Jagannatha, K.

(2010). Neuronutrition and Alzheimer's Disease. Journal of Alzheimer’s

Disease, 19(4), 1123 – 1139.

Rhinn, M., Picker, A., & Brand, M. (2006). Global and local mechanisms of

forebrain and midbrain patterning. Current Opinion in Neurobiology. 16, 5 – 12.

Riascos, D., Guzmán, F., Buriticá, E., Palacios, M., Escobar, M., & Pimienta, H.

(2008). Caracterización de un modelo organotípico de cultivos de neuronas

corticales de humano derivadas de trauma craneoencefálico. Colombia

Médica. 39(3), 29 - 37. Recuperado de:

<http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1657-

95342008000700005&lng=es&nrm=iso>. ISSN 1657-9534.

Riascos, D., Guzmán, F., Buriticá, E., Palacios, M., Escobar, M., Pimienta, H.

(2013). Caracterización de un modelo organotípico de cultivos de neuronas

corticales de humano derivadas de trauma craneoencefálico. Colombia

Médica. Recuperado de:

http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1657-

95342008000700005&lng=es.

Riggs, K. M., Spiro, A., Tucker, K., & Rush, D. (1996). Relations of vitamin B-12,

vitamin B-6, folate, and homocysteine to cognitive performance in the

92

Normative Aging Study. The American Journal of Clinical Nutrition. 63, 306 -

314.

Rodríguez, G. (1998). Ácido fólico y vitamina B12 en la nutrición humana. Revista

Cubana de Alimentación y Nutrición. 12(2), 107 – 19

Rodríguez, M. (2000). Importancia del metabolismo de la biotina. La Revista de

Investigación Clínica. 52(2), 194 – 199.

Sahay, A., & Hen, R. (2007). Adult hippocampal neurogenesis in depression.

Nature Neuroscience. 10, 1110 – 1115.

Saliba, K., Ferru, I., & Kirk, K. (2005). Provitamin B5 (Pantothenol) Inhibits Growth

of the Intraerythrocytic Malaria Parasite. Antimicrobial Agents And

Chemotherapy. 49 (2), 632 – 637.

Scalabrino, G., Peracchi, M., (2006). New insights into the pathophysiology of

cobalamin deficiency. Trends in Molecular Medicine. 12, 247 – 254.

S.E.A. Animalario OMG. (2005). Anestesia en Roedores. Recuperado de:

http://www.ucm.es/info/secivema/docs%20anestesia%20pdf/GUIAS-

ANESTESIA-PDF/26-guias-anestesia-anim-experimentacion-NR.pdf

93

Selhub, J., Jacques, P. F., Wilson, P. W., Rush, D., & Rosenberg, I. H. (2003).

Vitamin status and intake as primary determinants of homocysteinemia in an

elderly population. Journal of the American Medical Association. 270, 2693 -

2698.

Sharma S., Rakoczy, S., & Brown, H. (2010). Assesment of spatial memory in

mice. Life Sciences. 87, 521 – 536.

Shen, J., Lai, C.Q., Mattei, J., Ordovas, J.M., and Tucker, K.L. (2010). Association

of vitamin B-6 status with inflammation, oxidative stress, and chronic

inflammatory conditions: the Boston Puerto Rican Health Study. The American

Journal of Clinical Nutrition. 91, 337–342.

Sierra, A., Encinas, J. M., & Maletic, M. S. (2011). Adult human neurogenesis: from

microscopy to magnetic resonance imaging. Frontiers in Neuroscience. 5 (47),

1 - 18.

Simpson, J., & Kelly J.P. (2011). The impact of environmental enrichment in

laboratory rats—Behavioural and neurochemical aspects. Behavioural Brain

Research. 222(1), 246 - 64.

94

Smithline, H., Donnino, M., & Greenblatt, D. (2012). Pharmacokinetics of high-dose

oral thiamine hydrochloride in healthy subjects. BMC Clinical Pharmacology.

12, 4.

Sohur, U. S., Emsley, J. G., Mitchell, B. D., & Macklis, J. D. (2006). Adult

neurogenesis and cellular brain repair with neural progenitors, precursors and

stem cells. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B:

Biological Sciences. 361, 1477 – 1497.

Sowell, E. R., Peterson, B. S., Thompson, P. M., Welcome, S. E., Henkenius, A. L.,

& Toga, A. W. (2003). Mapping cortical change across the human life span.

Nature Neuroscience. 6, 309 – 315.

Spitzer, V. (2007). Vitamin basics: The facts about vitamins in nutrition. 3rd edition.

DSM Nutritional Products AG.

Stabler, S. P. (2003). Vitamins, homocysteine and cognition. American Journal of

Clinical Nutrition. 78, 359 – 60.

Stiles, J. & Jernigan, T. L. (2010). The Basics of Brain Development.

Neuropsychology Review. 20(4), 327 - 348

95

Struikmans, H., Rutgers, D. H., Jansen, G. H., Tulleken, C. A., Van Der Tweel, I., &

Batterman, J. J. (1997). S-phase fraction, 5-bromo-2′-deoxy-uridine labeling

index, duration of S-phase, potential doubling time, and DNA index in benign

and malignant brain tumors. Radiation Oncology Investigations. 5, 170 – 179.

Suasti, M. (2012). Enfermedad de Wernicke. Recuperado de

http://enfermedaddewernicke.blogspot.com/2012/12/tiamina.html

Talwar, D., Davidson H, Cooney J, O’Reilly DS. (2000) Vitamin B1 status assessed

by direct measurement of thiamine pyrophosphate in erythrocytes or whole

blood by HPLC: comparison with erythrocyte transketolase activation assay.

Clinical Chemistry 46, 704-10

Taki, Y., & Kawashima, R. (2012). Brain Development in Childhood. The Open

Neuroimaging Journal. 6, 103 - 110.

Tau, G. Z., & Peterson, B. S. (2010). Normal Development of Brain Circuits.

Neuropsychopharmacology. 35(1), 147 – 168.

Taupin, P. (2006). Neurogenesis in the adult central nervous system. Comptes

Rendus Biologies. 329, 465 – 475.

96

Taupin, P. (2007). BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis:

Paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Research Reviews. 53,

198 – 214.

Taupin, P., & Gage, F.H. (2002). Adult neurogenesis and neural stem cells of the

central nervous system in mammals. Journal of Neuroscience Research. 1,

745 – 749.

Temple, S., & Alvarez, A. (1999). Stem cells in the adult mammalian central

nervous system. Current Opinion in Neurobiology. 9, 135 – 141.

Thaver, D., Saeed M. A., & Bhutta Z. A. (2008). Suplemento de piridoxina

(vitamina B6) en el embarazo (Revisión Cochrane traducida). En: La Biblioteca

Cochrane Plus, Oxford: Update Software Ltd. Recuperado de:

http://www.update-software.com.

Troen, A., Shea, M., Schukitt, B. Smith, D., Selhub, J. & Rosenberg, I. (2008). B-

Vitamin deficiency causes hyperhomocysteinemia and vascular cognitive

impairment in mice. Procedings of the national academy of sciences of the

United States of America. 103(34), 12474-12479.

Uffelen, J., Hopman, M. R., Chin, M., & Mechelen, W. V. (2005). Protocol for

Project FACT: a randomised controlled trial on the effect of a walking program

97

and vitamin B supplementation on the rate of cognitive decline and

psychosocial wellbeing in older adults with mild cognitive impairment. BMC

Geriatrics. 5, 18

Van Praag, H. (2009). Exercise and the brain: something to chew on. Trends in

Neuroscience. 32(5), 283 – 290.

Van Praag, H., Schinder, A.F., Christie, B.R., Toni, N., Palmer, T.D., & Gage, F.H.

(2002). Functional neurogenesis in the adult hippocampus. Nature. 415, 1030

– 1034.

Vicens, P., Redolat, R. & Carrasco, C. (2003). Aprendizaje espacial y laberinto de

agua: metodología y aplicaciones. Psicothema. 15 (4), 539-544.

Wei, I., Huang, Y., & Wang, G. (1999). Vitamin B6 deficiency decreases the

glucose utilization in cognitive brain structures of rats. The Journal of Nutritiona

Biochemistry. 10, 525 – 531.

Weir, D. & Scott, J. (1999). Brain function in the elderly: role of vitamin B12 and

folate. British Medical Bulletin. 55(3), 669-682.

Werder, S. (2010). Cobalamin deficiency, hyperhomocysteinemia, and dementia.

Neuropsychiatric Disease and Treatment. 6, 159 – 195.

98

Wodarz, A., & Huttner, W. B. (2003). Asymmetric cell division during neurogenesis

in Drosophila and vertebrates. Mechanisms of Development, 120(11), 1297 –

1309.

Wood, J. G., Martin S, & Price, D. J. (1992). Evidence that the earliest generated

cells of the murine cerebral cortex form a transient population in the subplate

and marginal zone. Developmental Brain Research. 66, 137 – 141.

Yoo, D., Kim, W., Kim, D., Yoo, K., Chung, J., Youn, H., Yoon, Y., Choi, S., Won,

M. & Hwang, I. (2011). Pyridoxine enhances cel proliferation and neuorblast

differentiation by upregulating the GABAergic system in the mouse dentate

gyrus. Neurochemistry Research. 36, 713-721.

Zamora, A. (2013). Estructura química de las vitaminas y minerales. Recuperado

de: http://www.scientificpsychic.com/health/vitaminas-y-minerales.html

Zhang, Y., Li, N., Yang, J., Zhang, T., & Yang, Z. (2010). Effects of maternal food

restriction on physical growth and neurobehavior in newborn Wistar rats. Brain

Research Bulletin. 83, 1 – 8.

Zhao, M., Momma, S., Delfani, K., Carlen, M., Cassidy, R.M., Johansson, C.B., …

& Janson, A.M., (2003). Evidence for neurogenesis in the adult mammalian

99

substantia nigra. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A.

100, 7925 – 7930.

100

ANEXOS

Anexo A. MANTENIMIENTO DE UNA COLONIA DE RATAS EN EL BIOTERIO DE EXPERIMENTACIÓN ANIMAL DE LA UNIVERSIDAD DEL TOLIMA - PNT

PROTOCOLO DE NORMALIZACIÓN DELTRABAJO

GRUPO DE MODELOS EXPERIMENTALES PARA LAS CIENCIAS ZOOHUMANAS

OBJETIVO Garantizar el bienestar de los animales mediante el desarrollo de las actividades de mantenimiento de la colonia de ratas en el BE-UT que aseguren el bienestar animal (cumplimiento de las 3Rs), la calidad genética e higiénico-sanitarias estatus convencional y el macroambiente de un bioterio convencional de producción, mantenimiento y experimentación de pequeños roedores de la Universidad del Tolima. CONDICIONES DE SEGURIDAD

Es necesario llevar ropa cómoda y portar los elementos básicos de seguridad como bata, gorro y polainas o zapatos de laboratorio. El uso de guantes de látex puede ser restringido a la manipulación de tipo experimental ya que este material causa malestar al animal al contacto con su pelaje.

No usar perfumes, lociones, cremas o cualquier sustancia que tenga olor fuerte, debido a que estos olores afectan el microambiente de las colonias.

El cambio de camas debe ser realizado por una sola persona con el fin de

garantizar un control zootécnico verídico y permitir un seguimiento constante de las colonias que se tienen en el bioterio, así como disminuir al máximo el estrés de los animales. Se recomienda que la manipulación sea mínima ya que esta causa estrés en el animal y puede llegar a alterar los resultados experimentales y la salud de las colonias

101

EQUIPAMIENTO, LOCALES, MATERIALES Y REACTIVOS

Cajas Cisco estéril Solución de hipoclorito Detergente Toallas Escoba Baldes Traperos

OPERACIONES PRELIMINARES Cerciorarse que el extractor este funcionando correctamente y que los accesos a diferentes áreas estén abiertos para que los recambios de aire sean completos, los únicos accesos que deben estar cerrados son el transfer hacia quirófano y la puerta de acceso al laboratorio de conducta La preparación del agua y la esterilización del cisco previamente garantizan que su tiempo en el bioterio va a ser solo el necesario y al realizar estas actividades simultáneamente ganara tiempo y eficiencia en el proceso PROCEDIMIENTO

1. Se hace un escaneo general de la sala de mantenimiento para detectar, por ejemplo animales fuera de sus jaulas o cualquier anomalía en dicho recinto.

2. Se sigue al área de lavado en donde se deben servir las cajas de cambio con el material de cama estéril (cisco de arroz) en medidas que se han especificado de acuerdo a las condiciones del bioterio, se deben servir en este lugar debido a que el cisco genera partículas pequeñas que pueden provocar enfermedades respiratorias y dérmicas en los animales.

3. Las cajas servidas con el cisco estéril se llevan a la sala de mantenimiento

y se comienza con el cambio de camas. Se ubican las cajas de cada entrepaño de los estantes de mantenimiento en la mesa de cambio.

4. Se limpia la superficie y esquinas del entrepaño con solución limpiadora

(aún los entrepaños donde no hay animales).

102

5. Se abre la caja que contiene los animales, con el cuidado mantenerlos dentro de la caja para evitar fugas, así mismo estar atentos para evitar accidentes que incluyan mordeduras o rasguños.

6. Suavemente sujetar al animal por el tronco y pasarlo a la caja donde se

encuentra el cisco limpio.

7. Se ajusta la tapa y se acomoda nuevamente en su estante. Es necesario en este paso verificar la información de las fichas de mantenimiento como número de individuos y sexo y en caso del banco genético número de crías, fecha de nacimiento y destete, así como observaciones adicionales como aspecto del individuo y si presenta alguna alteración de cualquier tipo.

8. Se limpia la tapa, la botella y se verifica el agua de bebida (si se llena o se

cambia).

9. El proceso se repite con cada caja e individuo de las colonias

10. Una vez terminado el cambio las cajas sucias se llevan a la zona de lavado.

11. Se barren TODAS las áreas del bioterio, se limpian TODAS las superficies, se eliminan telarañas se mueven los estantes del área de mantenimiento y del banco genético, se limpia las mesas de cambio y se trapea con solución limpiadora dos veces.

12. Se cierran los accesos y el trabajo se concentra en el área de lavado.

13. Con guantes domésticos se retira el cisco de todas las cajas y se deposita

en la caneca de riesgo biológico.

14. Se procede al lavado de cajas.

15. Terminado este proceso se debe barrer y trapear el área de lavado, así como limpiar las superficies de los mesones que se ubican en esta área.

16. En este momento se pueden llenar los teteros que se necesitan y ubicarlos

en las cajas.

17. El cisco que se ha estado esterilizando se almacena en el recipiente destinado para tal fin.

18. Las bolsas rojas con el cisco sucio que resultan del cambio se deben sacar

del Bioterio antes de las 10:30 am, deben ser debidamente marcadas con la procedencia y la fecha para que puedan ser llevadas hasta el cuarto frío por

103

el operario de la Universidad y posteriormente sean recogidas por la empresa encargada de su incineración.

19. Si los chupos de los teteros están en mal estado es necesario cambiarlos

y/o fabricarlos en caso de que no hayan. CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS El Jefe del Bioterio de Experimentación Animal de la Universidad del Tolima, evaluará la ejecución del protocolo, aprobando, corrigiendo y tomando las medidas correctivas necesarias de acuerdo con la condiciones del bioterio. CONTROL El aseo permanente del laboratorio, el bueno estado higiénico – sanitario y la calidad genética del estatus convencional de los animales son la garantía de buenas prácticas en el mantenimiento de la colonia. REQUISITOS DE DOCUMENTACIÓN Para la producción y mantenimiento de pequeños roedores en un bioterio, es necesario primero conocer la biología, genética y fisiología del animal, mantener un micro y macroambiente adecuado, que garanticen la calidad del reactivo biológico, que consiste en:

Un estatus genético acorde con los intereses de los estudios, para lo que es necesario utilizar sistemas de cruzamiento isogénicos o no isogénicos según correspondan con las líneas o colonias que se mantienen.

El estatus higiénico-sanitario esperado, que aseguren la no presencia de

gérmenes patógenos o zoonóticos que interfieran en los resultados de experimentos o proyectos de investigación o que afecten el bienestar de animales, cuidadores e investigadores.

Estatus de bienestar animal que asegure la calidad de los reactivos

biológicos, que debe ser inversamente proporcional con los niveles de estrés.

Control zootécnico de la colonia que nos permitirá entrelazar los diferentes

estatus y comprobar el estado real del Banco genético, banco de expansión y experimentación.

104

A continuación se describen cuales son las actividades que deben realizar para asegurar estos tres estatus. El bioterio de experimentación de la UT tiene un área de, divido en las siguientes áreas:

1. Almacén de alimento y encamado 2. Sala de mantenimiento del Banco genético y banco de expansión 3. Área de Lavado y esterilización. 4. Sala de mantenimiento de animales de Experimentación.

El tamaño de las jaulas elegidas debe ser apropiado para cada especie mantenida. Las jaulas no deben permitir solamente alojar los animales de una manera segura, sino también asegurar su comodidad y seguridad, permitiendo ajustes de postura y de comportamiento normales, y por contribuir al enriquecimiento ambiental. Las jaulas deben ser adecuadamente ventiladas, permitir un campo visual satisfactorio y un acceso fácil a los animales. Los sistemas de bebederos y de distribución de alimentos deben ser planificados y ubicados para permitir su acceso fácil, sin que se contaminen con excrementos. El diseño de las jaulas debe facilitar su limpieza y desinfección. Tipo de caja y cantidad de animales que se pueden alojar La cama de las jaulas de los animales deberá ser de un material no tóxico, absorbente, pero que no provoque la deshidratación de los neonatos, entre los materiales que se pueden usar como encamando para pequeños roedores tenemos: viruta de madera (pino), bagazo de azúcar (desmollado y presecado) cisco de arroz, todos los materiales para encamado deben ser seleccionados, que están libres de otras sustancias y contaminantes y deben ser esterilizados por calor húmedo (121º C o 1,5 at, durante 30 minutos o sistema de irradiación). La cama debe ser cambiada tan frecuentemente como sea necesario para mantener los animales limpios, secos, y relativamente sin mal olor, y para mantener el nivel de amoníaco en las jaulas en niveles aceptables. En ratas, este nivel es de 25 ppm y para los animales menores de laboratorio, se debe cambiar la cama de las jaulas de una a tres veces por semana según variables tales como el tamaño de los animales, la densidad de la población, el tipo de jaula y el grado de producción de excrementos. De la misma forma deberán ser tratadas y cambiada el agua de bebida y los materiales que tengan contacto con los animales.

105

REFERENCIAS/DOCUMENTOS APLICABLES Bonilla A., Bonilla L. 2006. Ciencia del animal de laboratorio: El primer peldaño hacia la neurociencia y la experimentación animal.

106

Anexo B. CITOLOGÍA VAGINAL EXFOLIATIVA - PNT



OBJETIVO Obtención de frotis vaginal para observar cambios cíclicos que corresponden con los cambios del ciclo del endometrio, diagnósticos patológicos o presencia de espermatozoides en la cavidad vaginal. CONDICIONES DE SEGURIDAD

En caso de ser necesario, uso de guantes para la manipulación del animal

Usar un hisopo por animal Uso de bata, polainas y gorro


Hisopos Solución salina Porta objetos Metanol

OPERACIONES PRELIMINARES

Esterilizar los hisopos Limpiar y marcar los porta objetos

PROCEDIMIENTO

1. Humedecer un hisopo con solución salina

107

2. Sacar la hembra cuidadosamente de su jaula

3. Sujetar el animal de la parte basal de la cola con los dedos índice y pulgar, e inmovilizar con el resto de la mano.

4. Insertar el hisopo en la cavidad vaginal

5. Girar cuidadosamente el hisopo dentro de la cavidad vaginal y retirarlo de la

hembra

6. Extender el frotis en la placa portaobjetos

7. Fijar el extendido con metanol

8. Deja secar y realizar tinción de la muestra CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS La lectura de los resultados requiere de la realización de un procedimiento adicional, teñir o sembrar el exudado vaginal. Para determinar la fase del ciclo estral en la que se encuentra la hembra, se debe tener en cuenta la proporción celular: Cuadro 6. Proporción celular que se observa en el tejido vaginal durante cada fase del ciclo estral Fase del Ciclo Características Proestro Gran cantidad de células epiteliales, baja proporción de

células queratinizadas y leucocitos (Figura 29A). Estro Abundancia de células queratinizadas, algunas células

epiteliales y pocos leucocitos (Figura 29B). Metaestro Proporción similar entre células queratinizadas y

epiteliales; leucocitos en mayor número (Figura 29C). Diestro Leucocitos muy abundantes; escaza presencia de células

epiteliales y queratinizadas (Figura 29D). Fuente: Adaptado de Long & Evans, 1922

108

Figura 31. Fases del ciclo estral.

A: proestro, B: estro, C: metaestro, D: diestro. Las flechas señalan los tipos de celulares que se observan. Amarilla: Epiteliales, Verde: Qqueratinizadas, Rojo: Leucocitos. Con un frotis vaginal se puede determinar también la presencia de espermatozoides: Figura 32. Espermatozoides de rata Wistar tomados de citología vaginal exfoliativa

CONTROL Respecto de lo requerido, la experiencia del investigador determinará si los resultados representan adecuadamente la intención del procedimiento REFERENCIAS/DOCUMENTOS APLICABLES Guevara, R., González, M. & Virgilii, I. (2010). Tratamiento quirúrgico de la menopausia, un modelo experimental. Rev Obstet Ginecol Venez. 70 (3), 178 - 189. Long, J. A. & Evans, H. M. (1922). The estrous cycle in the rat and its associated phenomena. Memories of University of California. 6, 1 - 148.

109

Anexo C. TINCIÓN HEMATOXILINA-EOSINA. PNT



OBJETIVO Teñir muestras mediante la tinción Hematoxilina – Eosina con el fin de facilitar la observación microscópica. CONDICIONES DE SEGURIDAD

Uso de bata, polainas, gorro y tapabocas Uso de guantes de nitrilo Realizar el procedimiento en una campana de extracción preferiblemente


Solución de Hematoxilina (1%) Solución de Eosina (1%) Etanol al 70% Etanol al 80% Etanol al 90% Etanol al 96% Xilol 2 recipientes con agua Placas a teñir Rejilla para inmersión de placas Cronómetro

OPERACIONES PRELIMINARES Antes de la tinción se debe realizar la toma y fijación de las muestras a teñir.

110

PROCEDIMIENTO

1. Sumergir la muestra en Hematoxilina (1%) por 15 minutos

2. Lavar la placa con agua sumergiéndola y retirándola 3 veces

3. Sumergir la placa en Eosina (1%) durante 5 minutos

4. Lavar la placa con agua sumergiéndola y retirándola 3 veces

5. Sumergir la placa en etanol al 70% por un minuto




9. Sumergir la placa en Xilol por 10 segundos

10. Dejar secar a temperatura ambiente CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS La Hematoxilina de carácter básico tiñe los núcleos de las células y la Eosina, que es un colorante ácido tiñe el citoplasma y las fibras de colágeno que son de carácter básico. La observación se realiza preferiblemente 24 horas después de la tinción o cuando la placa esté completamente seca en un microscopio. CONTROL Respecto de lo requerido, la experiencia del investigador determinará si los resultados representan adecuadamente la intención del procedimiento. REFERENCIAS / DOCUMENTOS APLICABLES Ares, R & Abud, M. (2009). Procedimiento: Tinción Hematoxilina – Eosina de anatomía parológica. Hospital Padre Hurtado. Recuperado de: http://www.hurtadohosp.cl/archivos/CalidadySeguridad/NormasdeCalidad/Normas_Anatomia_Patologica/PTHEAP.pdf Montalvo, C. (2010). Técnica Histológica. Recuperado de:

111

http://www.facmed.unam.mx/deptos/biocetis/PDF/Portal%20de%20Recursos%20en%20Linea/Apuntes/3_tecnica_histologica.pdf

112

Anexo D. INYECCIÓN INTRAPERITONEAL (IP) - PNT



OBJETIVO Descripción general del proceso de aplicación de sustancias vía intraperitoneal en ratas Wistar, con un manejo adecuado de los animales. CONDICIONES DE SEGURIDAD

Uso de bata, polainas y gorro De ser necesario, usar de guantes para la manipulación del animal Utilizar una aguja diferente por cada animal que se inyecta Eliminar los elementos corto punzantes en un guardián Evitar los pinchazos en la piel del investigador


Animal de experimentación Jeringa y Aguja Sustancia a Inocular


Limpiar el área de trabajo Preparar la solución a inocular y tenerla preferiblemente a temperatura

corporal o ambiente Tener al alcance de la mano todos los elementos a utilizar

113

PROCEDIMIENTO

1. La jaula debe ser abierta con cuidado evitando incomodar los animales

2. Permitir que el animal se habitúe a la presencia del investigador

3. Tomar el animal cuidadosamente de la base de la cola y sacarlo de la jaula

4. Sujetar con firmeza el animal desde detrás, rodeando debajo de las patas delanteras con los dedos índices y pulgar evitando apretar el cuerpo, los demás dedos se usan de sujeción. Asegura una de sus patas traseras con la cola para facilitar la inyección.

5. Se divide imaginariamente la cavidad abdominal en cuatro secciones,

aplicando la inyección en las regiones posteriores, inclinando el animal hacia el cráneo, introduciendo la aguja en ángulo de 35° aproximadamente para no tocar las vísceras.

6. Aplicar la solución y retirar cuidadosamente la aguja

7. Regresar el animal a su jaula

8. Desechar la aguja

CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS El animal debe quedar en perfectas condiciones inmediatamente después del procedimiento. Dependiendo de qué tipo de solución se aplica en el animal, su efecto se verá posteriormente. CONTROL Cuando se ve el efecto de la solución aplicada puede comprobarse la correcta aplicación de la inyección. Cualquier otra anomalía, paro cardíaco, peritonitis u otra reacción adversa, puede deberse a una mala aplicación. REQUISITOS DE DOCUMENTACIÓN En la manipulación, cuando el animal es pequeño se permitir que se agarre de la tapa de la jaula sujetando bien su cola con una mano para poder sujetar la piel suelta de la nuca con los dedos índice y pulgar de la otra mano, se debe procurar hacer esto en un solo movimiento rápido. Una vez sujetado firme pero sin apretar

114

demasiado, el animal puede sujetarse sobre la palma de la mano con los dedos restantes. REFERENCIAS/DOCUMENTOS APLICABLES Centro de Investigación, Hospital General Universitario de Valencia. (1990). Anestesia en el animal de laboratorio. Roedores. Research in surgery. Recuperado de: http://www.oc.lm.ehu.es/Fundamentos/Doctorado/cursos/CirExp/015.pdf Muñoz, J., Saldivar, S., Maldonado, C., Muñoz, C., & Moreno, M. (2010). La habilidad para sujetar y manejar animales de laboratorio no se adquiere fácilmente. Revista electrónica de Veterinaria. 12 (5B), 1695 - 7504. Recuperado de: http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n050511B/051116.pdf

115

ANEXO E. LABERINTO ACUÁTICO DE MORRIS (LAM) - PNT



OBJETIVO Descripción de una metodología que permite evaluar la memoria y el aprendizaje espacial en roedores. El laberinto acuático de Morris es una de las técnicas más utilizadas. CONDICIONES DE SEGURIDAD

Uso de bata, polainas y gorro Limpiar el tanque después del uso con cada animal Mantener el suelo seco Tener al alcance de la mano una toalla para secar los animales Alejar del agua los objetos eléctricos o electrónicos


Tanque de entre 120 y 150cm de diámetro y más de 50cm de profundidad Cámara o formato de registro de datos Plataforma de escape de al menos 5 cm de diámetro, sumergida a 2cm de

profundidad Señales extra laberínticas (cuadros, cortinas o cualquier otro objeto por

fuera del tanque) Animal de experimentación Toalla Cronómetro


Llenar de agua el tanque Mantener a temperatura corporal el agua del tanque

116

Fijar la posición de las claves extra laberínticas que NO deben ser modificadas durante la ejecución de la prueba

Determinar la ubicación de la plataforma de escape Preparar la cámara de vídeo o el formato de registro de los datos Mantener luz opaca durante la ejecución la prueba

PROCEDIMIENTO

1. El animal es sacado gentilmente de su caja

2. Ubicar el animal en uno de los puntos cardinales seleccionados al azar

3. Esperar que el animal encuentre la plataforma de escape

4. Luego de 60sg guiar el animal a la plataforma de escape si no la ha encontrado

5. Tomar el tiempo que le toma al animal en encontrar la plataforma de escape

6. Permitir que el animal conozca la ubicación de la plataforma de escape a

través de las pistas extra laberínticas durante 10 sg

7. Repetir los pasos 1, 2, 3, 4, 5 y 6 en los otros 3 puntos cardinales restantes

8. Repetir los pasos 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7. Figura 33. Ejecución del Laberinto Acuático de Morris

Fuente: Erika Mayorga

117

CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Durante el procedimiento se toma el tiempo que le necesita el animal para encontrar la plataforma de escape, y dependiendo de la digitalización del aparato se puede medir trayectoria y velocidad del animal. CONTROL Por ser una prueba de aprendizaje, una animal en condiciones normales, debe aprender a reconocer la ubicación de la plataforma, por lo que en cada repetición la latencia de escape debería ser menor. REQUISITOS DE DOCUMENTACIÓN Dependiendo de los requerimientos del experimentador, el Laberinto Acuático de Morris puede tener tres fases: Fase de Adquisición: Es el primer ensayo que se realiza con el animal, la fase de aprendizaje. Es una prueba en el que la capacidad del animal para localizar eficientemente la plataforma depende únicamente del uso de las señales extra laberínticas, y se realiza durante 3 días.

Fase de Retención: Se realiza 7 días después de la fase de adquisición y se puede evaluar la memoria del animal tomando el tiempo que le toma recordar en dónde se encontraba la plataforma. Se realiza durante un día. Fase de Transferencia: Se realiza 7 días después de la prueba de retención, en ella se evalúa de nuevo el aprendizaje y la memoria. El animal debe hallar de nuevo la plataforma de escape que esta vez, va a estar ubicada en un cuadrante diferente. Al igual que la prueba de adquisición se realiza durante 3 días. REFERENCIAS/DOCUMENTOS APLICABLES Vicens, P., Redolat, R. & Carrasco, C. (2003). Aprendizaje espacial y laberinto de agua: metodología y aplicaciones. Psicothema. 15 (4), 539-544. D’Hooge, R. & De Deyn, P. (2001). Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory. Brain Research Reviews. 36, 60–90.

Sharma, S., Rakoczy, S., & Brown-Borg, H. (2010). Assessment of spatial memory in mice. Life Sciences. 87, 521–536.

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Anexo F. PREPARACIÓN DE BrdU EN LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO ARTIFICIAL - PNT



OBJETIVO Preparar BrdU a 50 mg/ml diluido en líquido Cefalorraquídeo artificial para inyección intracerebroventricular CONDICIONES DE SEGURIDAD

Realizar el procedimiento en Cabina de flujo Usar bata, polainas, gorro, guantes y tapabocas


BrdU liofilizado NaCl KCl NH2PO4 MgSO4 NaHCO3 CaCl2 Glucosa Soluciones para equilibrar pH Vortex Baño maría


Preparación de los materiales Calentar el baño maría a 37°C

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PROCEDIMIENTO 1. Preparación de líquido Cefalorraquídeo artificial:

a. NaCl 124mM b. KCl 5mM c. NH2PO4 1,24mM d. MgSO4 1.3mM e. NaHCO3 26mM f. CaCl2 2mM g. Glucosa 10mM h. pH controlado de 7,4

2. El BrdU liofilizado se reconstituye en el líquido cefalorraquídeo artificial a una concentración de 50mg/ml

3. Agitar la mezcla en el vortex hasta que esté completamente mezclado, si es necesario, usar un poco de calor con el baño María para facilitar la mezcla 4. Almacenar en alícuotas y mantener a -20°C hasta su uso CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Cuando el BrdU se mezcle completamente con el Líquido cefalorraquídeo artificial, está listo para su uso, sin embargo, diluir el BrdU puede tomar tiempo. CONTROL Se puede observar que la solución está bien preparada cuando se obtienen resultados positivos en un control luego de su aplicación y revelado en tejido. REQUISITOS DE DOCUMENTACIÓN La preparación de BrdU puede variar dependiendo del requerimiento, de acuerdo del método de aplicación se puede diluir BSA/PBS, Agua u otro tipo de sustancias. REFERENCIAS/DOCUMENTOS APLICABLES Riascos, D., Guzmán, F., Buriticá, E., Palacios, M., Escobar, M., Pimienta, H. (2013). Caracterización de un modelo organotípico de cultivos de neuronas corticales de humano derivadas de trauma craneoencefálico. Colombia Médica.

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Recuperado de: http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1657-95342008000700005&lng=es. Kee, N., Teixeira, C., Wang, A. & Frankland, P. (2007). Imaging activation of adult-generated granule cells in spatial memory. Nature Protocols. 2(12), 3033 - 44. doi:10.1038/nprot.2007.415.

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Anexo G. INYECCIÓN INTRACEREBRO VENTRICULAR BILATERAL DE BrdU - PNT



OBJETIVO Realizar la aplicación Intracerebroventricular (ICV) bilateral de soluciones mediante cirugía estereotáxica, permitiendo acceder directamente al cerebro evitando la barrera hematoencefálica. CONDICIONES DE SEGURIDAD

Uso de bata, polainas y gorro Mantener el área de trabajo limpia Tener precaución con los elementos corto punzantes que se utilizan Dejar al alcance de la mano todos los elementos a utilizar Permitir una buena iluminación del área de trabajo


Estereotáxico Lámpara Fresa Material quirúrgico (Bisturí, pinzas, tijeras, etc) Jeringa Hamilton Jeringa de Insulina Solución a Inyectar Thimerosal Peróxido de Hidrógeno Anestésicos Gasa Aguja de sutura Hilo de sutura Marcador

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Solución salina


Definir las coordenadas de trabajo. Éstas medidas se establecen con un Atlas de coordenadas esterotáxicas para rata, por ser una inyección bilateral en ventrículo las medidas son: Antero-Posterior (AP): -1.30, Medio Lateral (ML): ±2.0 y Dorso Ventral (DV): 3.5. Se debe tener en cuenta las conversiones para que las unidades del Atlas y el Aparato Estereotáxico sean las mismas.

Preparar la solución a inyectar o diluirla en líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa).

Preparar la mesa de cirugía con el montaje del aparato estereotáxico con la

aguja Hamilton, la fresa, y una lámpara PROCEDIMIENTO

1. Anestesiar el animal mediante la aplicación intraperitoneal de Ketamina y Xilacina en las proporciones requeridas para el peso del animal

2. Esperar que el animal este completamente dormido, verificando la ausencia de respuesta a estímulos externos o ausencia de reflejos (pellizcar pata, la nariz, tirar de las vibrisas, ausencia de reflejo corneal y palpebral, etc), ritmo respiratorio regular y relajado, sin apnea respiratoria

3. Cortar al rape el pelo del animal sobre la zona en que se va a realizar la

cirugía

4. Posicionar el animal en el estreotáxico ajustando bien el cráneo en las estructuras del oído y los dientes en la parte anterior del aparato

5. Esterilizar la zona en la que se realiza la disección con Timerosal

6. Realizar la disección del animal desde la parte anterior de la cabeza,

cuidando de no acercarse mucho a los ojos hasta la parte posterior del cráneo, pretendiendo abarcar desde bregma hasta lambda

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Figura 34. Esquema del cráneo de rata

Fuente: Murcia, E. 2010

7. Limpiar el área de disección con Peróxido de Hidrógeno para facilitar la

visibilidad

8. Colocar la aguja Hamilton sobre el bregma y tomar las coordenadas Antero posterior y Medio Lateral que marca el aparato para este animal

9. Sumar las coordenadas de trabajo a las coordenadas del aparato y se

obtienen las coordenadas reales, son éstas últimas las que se deben ajustar en el estereotáxico para realizar la cirugía

10. Por ser bilateral la cirugía, se marcan los dos puntos en los que se realizará

la inyección

11. Realizar los trépanos al cráneo para acceder al cerebro del animal. Los trépanos deben realizarse cuidadosa y precisamente para no dañar el cerebro, pero acertando correctamente al lugar en que se realiza la inyección

12. Ubicar la punta de la aguja justo sobre el cerebro y tomar la coordenada

Dorso ventral del aparato

13. Sumar la coordenada de trabajo a la coordenada del aparato para obtener la coordenada dorso ventral real

14. Cargar la jeringa con 2µl de BrdU

15. Inyectar el animal hasta la coordenada real, se debe ser muy cuidadoso en

no pasar de esta medida

16. Aplicar lentamente el BrdU, la aplicación completa del BrdU debe durar alrededor de 15minutos, esto permite a la solución implantarse en el tejido

17. Dejar la aguja insertada unos minutos más para evitar que la solución de

BrdU ascienda al sacarla

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18. Sacar lentamente la aguja

19. Suturar la herida

20. Desinfectar con timerosal la sutura

21. Desmontar el animal del estereotáxico

22. Colocar el animal cuidadosamente de regreso a su caja y vigilar su

recuperación CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS El éxito del procedimiento se puede ver posteriormente con el revelado del marcaje. Posterior a la cirugía, el animal debe recuperarse del procedimiento. REQUISITOS DE DOCUMENTACIÓN Para una mejor preservación del BrdU, éste debe ser mantenido a -20°C, por lo que se recomienda sacarlo de congelación solo unos minutos antes de la aplicación en la rata, teniendo el tiempo suficiente para que se descongele y quede a temperatura corporal justo antes de su inyección. REFERENCIAS/DOCUMENTOS APLICABLES Riascos, D., Guzmán, F., Buriticá, E., Palacios, M., Escobar, M., & Pimienta, H. (2008). Caracterización de un modelo organotípico de cultivos de neuronas corticales de humano derivadas de trauma craneoencefálico. Colombia Médica. 39(3), 29 - 37. Recuperado de: <http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1657-95342008000700005&lng=es&nrm=iso>. ISSN 1657-9534. S.E.A. Animalario OMG. (2005). Anestesia en Roedores. Recuperado de: http://www.ucm.es/info/secivema/docs%20anestesia%20pdf/GUIAS-ANESTESIA-PDF/26-guias-anestesia-anim-experimentacion-NR.pdf Murcia, E. (2010).Cirugía estereotáxica: canulación en rata. Recuperado de: http://dameunsilbidito.wordpress.com/2010/12/17/cirugia-estereotaxica-canulacion-en-rata/

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Kerever, A., Schnack, J., Vellinga, D., Ichikawa, N., Moon, C., Arikawa, E., Efird, J., & Mercier, F. (2007). Novel Extracellular Matrix Structures in the Neural Stem Cell Niche Capture the Neurogenic Factor Fibroblast Growth Factor 2 from the Extracellular Milieu. Stem Cells 25, 2146 – 2157. doi: 10.1634/stemcells.2007-0082

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Anexo H. PERFUSIÓN DE TEJIDO CEREBRAL - PNT



OBJETIVO Fijación del tejido cerebral con Paraformaldehído a través de la perfusión. CONDICIONES DE SEGURIDAD

Uso de guantes quirúrgicos, gorro, tapabocas y gafas Realizar procedimiento en Campana de extracción


Anestésicos (Ketamina/Xilacina, Pentobarbital, etc) Solución Salina Solución de fijado (Paraformaldehído 4%) Agujas Jeringas Equipo de disección Guillotina Superficie de apoyo para el animal Sistema de Perfusión


Preparar la solución de fijado, Paraformaldehído al 4% que para un litro consta de: 750ml de agua desionizada 250ml de PB 0.4M 40gr de Paraformaldehído

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Para preparar el Paraformaldehído se debe calentar 400 de agua desionizada a 65°C, adicionar lentamente el paraformaldehído y agitar permanentemente hasta que se disuelva completamente. Posteriormente se adicionan 250ml de PB 0.4M al paraformaldehído y completa el volumen con el agua desionizada. PROCEDIMIENTO

1. Anestesiar de acuerdo a las proporciones requeridas para el peso del animal

2. Esperar que el animal este completamente dormido, verificando la ausencia

de respuesta a estímulos externos o ausencia de reflejos (pellizcar pata, la nariz, tirar de las vibrisas, ausencia de reflejo corneal y palpebral, etc), ritmo respiratorio regular y relajado, sin apnea respiratoria

3. Colocar el animal en posición decúbito supino sobre una superficie adecuada para la recolección de los tejidos de lavado y fijación, se debe sujetar el animal con cinta en sus patas para garantizar que este no se mueva durante el procedimiento

4. Realizar un corte en la parte superior del abdomen, en su esternón, separa la piel y cortar las costillas en paralelo hasta exponer el corazón y los pulmones

5. Insertar la aguja del sistema de perfusión por el ventrículo izquierdo y llegar hasta alcanzar la aorta ajustando la aguja a este nivel Figura 35. Inserción de la aguja en el corazón de la rata

Fuente: Ministerio de Ciencia e Innovación. 2012

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6. Hacer una incisión en la aurícula derecha que permita la salida de la circulación

7. Comenzar a circular la solución de lavado a una velocidad moderada, agregando 200ml de solución salina de a 50ml por vez

8. Circular la solución de fijado que debe estar a temperatura ambiente. Se agregan 150ml de solución (aunque esta cantidad puede variar dependiendo del tamaño del animal). Cuando el Paraformaldehído entra en el animal, usualmente sufre una serie de contracciones musculares que es un indicativo de una correcta fijación

9. Retirar la aguja del animal y extraer el cerebro separando inicialmente la cabeza con la guillotina y posteriormente separando el tejido cuidadosamente para no dañar el cerebro

10. Los cerebros se almacenan en recipientes con paraformaldehído, por separado y debidamente marcados.

11. Los cerebros permanecen hasta un día en paraformaldehído, después de esto son lavados 3 veces en PB al 0.1% por 5 minutos y posteriormente puede ser almacenados en PB para su uso.

CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Cuando el procedimiento se realizó adecuadamente el animal no expulsa líquidos por la nariz, el cuerpo del animal sufre de contracciones musculares y toma dureza durante la aplicación de la solución fijadora, finalmente al extraer el cerebro, este debe tener una consistencia dura y sin rastro de sangre, de otra forma se dificulta la preservación y manipulación del tejido. REQUISITOS DE DOCUMENTACIÓN Para una preservación prolongada de los cerebros deben almacenarse en criopreservante a -20°C. Para criopreservar los cerebros, deben someterse a gradientes de sacarosa al 7, 15 y 30% por un día cada uno o hasta que se precipite el cerebro, posteriormente se sumergen en un criopreservante que consta de:

200ml de PB 0.4M 300ml de Etilenglicol

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300ml de Glicerol 150ml de Agua destilada

REFERENCIAS/DOCUMENTOS APLICABLES Ministerio de Ciencia e Innovación. (2012). Técnicas de obtención e inoculación de muestras. Consejo superior de investigaciones científicas. Centro Nacional de Biotecnología. Universidad Autónoma de Madrid. Recuperado de: www.cnb.csic.es/.../CEEA/CEEA_Tecnicas61_2.doc

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Anexo I. INMUNOFLUORESCENCIA: DOBLE MARCAJE BrdU – NeuN. PNT



OBJETIVO Estandarización de la técnica de inmunofluorescente para el marcaje de doble de NeuN y BrdU, identificando células en división que se diferenciaron hasta neuronas CONDICIONES DE SEGURIDAD

Manipular con precaución los reactivos EQUIPAMIENTO, LOCALES, MATERIALES Y REACTIVOS

Placas con Poly L lisina Placas de pozos PB 0.1M N4HCl 50mM HCl 1.5N Solución de bloqueo 1 Solución de bloqueo 2 Anticuerpo primario BrdU Sigma – Aldrich ® (1:100 la concentración

depende del anticuerpo que se use) Anticuerpo primario NeuN Merck Millipore ® (1:2, la concentración depende

del anticuerpo que se use, este anticuerpo viene previamente diluido) Anticuerpo secundario Alexa 594 Life technologies ® 1:500 (Coloración roja

para el marcaje de BrdU) Anticuerpo secundario Alexa 488 Life technologies ® 1:500 (Coloración

verde para el marcaje en contraste del NeuN) Fluoromount®

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Preparar HCl 1.5N para la apertura del ADN, paso requerido en el marcaje de BrdU y N4HCl 50mM usado para evitar la autofluorescencia del tejido

Preparar Solución de bloqueo 1 adicionando 20ml de suero, 3ml de triton y llevando a volumen de 1000ml con PB 0.1M y solución de bloqueo 2 en las mismas proporciones pero excluyendo el suero

Preparar Anticuerpos primarios BrdU y NeuN diluyendo los anticuerpos en

solución de bloqueo 1 de acuerdo a lo requerido.

Preparar anticuerpos secundarios Alexa 488 y 594 diluyendo los anticuerpos en solución de bloqueo 2 de acuerdo a lo requerido

Preparar placas, sumergiéndolas en Poly-L lisina en dilución 1:10 durante 5

minutos 2 veces. Esto permitirá la adhesión del tejido cuando se vaya a realiza el montaje de los cortes en la placa. Las placas deben estar completamente secas antes de uso, se recomienda realizar esta preparación un día antes de la inmunofluorescencia

Un día antes del procedimiento se separan los cortes que se van a marcar,

separando 2 cortes por pozo en PB 0.1M, marcando los tratamientos, controles y los controles de procedimiento (Control de autofluorescencia: no se aplica ningún anticuerpo; Control de fluorescencia: No se aplican anticuerpos primarios; Control de fluorescencia cruzada: Aplicando anticuerpo NeuN y BrdU por separado)

PROCEDIMIENTO

1. Lavar los cortes 3 veces con PB 0.1M por 5 minutos (Cada pozo requiere entre 200 y 400µl dependiendo del tamaño del pozo)

2. Lavar los cortes con N4HCl 50mM durante 10 minutos, esto, para evitar la autofluorescencia del tejido

3. Lavar con PB 0.1M 3 veces por 5 minutos

4. El marcaje del BrdU requiere denaturar el ADN adicionando HCl

1.5Ndurante 40 minutos a temperatura ambiente

5. Neutralizar el ácido realizando lavados con PB 0.1M 3 veces por 5 minutos

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6. Lavar con solución de bloqueo 1 durante 20 minutos a 37°C

7. Incubar con Anticuerpo primario BrdU por 48 horas a 4°C


9. Incubar con Alexa 594 por 2 horas a temperatura ambiente


11. Lavar con solución de bloqueo 1 durante 20 minutos a 37°C

12. Incubar con Anticuerpo NeuN por 1 hora a temperatura ambiente


14. Incubar con Alexa 488 por 2 horas a temperatura ambiente


16. Se montan los cortes en las placas con Poly L debidamente marcadas

17. Dejar secar

18. Aplicar una gota de Fluoromount® en las placas y colocar cubreobjetos

19. Dejar secar y sellar la placa con esmalte transparente CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Los resultados del procedimiento debe ser visto en un microscopio de fluorescencia en el que preferiblemente se puedan observar los dos colores al tiempo (Confocal) y es criterio del investigador verificar el éxito o falla del marcaje REQUISITOS DE DOCUMENTACIÓN Esta metodología tiene diferentes variaciones: se pueden usar otro tipo de sustancias para evitar la autofluorescencia, para la apertura del ADN requerida para el marcaje con BrdU se puede usar además del HCl calor, las diluciones de los anticuerpos pueden variar dependiendo de los protocolos previos y la intención del marcaje. Además, se pueden realizar un cocktail de anticuerpos primarios y/o secundarios para reducir el tiempo del procedimiento, pero es preferible realizar por separado el marcaje para evitar la reacción cruzada

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REFERENCIAS/DOCUMENTOS APLICABLES Kee, N., Teixeira, C., Wang, A. & Frankland, P. (2007). Imaging activation of adult-generated granule cells in spatial memory. Nature Protocols. 2(12), 3033 - 44. doi:10.1038/nprot.2007.415. Leuner, B., Glasper, E., & Gould, E. (2009).Thymidine analog methods for studies of adult neurogenesis are not equally sensitive. Journal of Comparative Neurology. 517(2), 123 – 133. doi: 10.1002/cne.22107

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Anexo J. ANÁLISIS ESTADÍSTICOS

1. Prueba de Normalidad: Shapiro - Wilk 1.1 LAM prenatal: Los datos son normales Cuadro 7. Resultados de la prueba de normalidad en el LAM prenatal

Parámetro W p LA1 W=.91018 p<.3601 LA2 W=.93934 p<.6085 LA3 W=.96652 p<.8675 LM1 W=.93143 p<.5338 RET W=.90327 p<.3135 LT1 W=.87459 p<.1701 LT2 W=.80836 p<.0365 LT3 W=.69856 p<.0025 LM2 W=.79444 p<.0261

*Prueba de normalidad de Shapiro-Wilk. Se considera que los datos son normales cuando el valor ―p‖ es mayor a 0.05. LA: Latencia de Adquisición; LM: Latencia media; RET: Retención; LT: Latencia de Transferencia 1.2 LAM post natal: Los datos son normales Cuadro 8. Resultados de la prueba de normalidad en el LAM post natal

Parámetro W p LA1 W=.96876 p<.6897 LA2 W=.92811 p<.1227 LA3 W=.87249 p<.0090 LM1 W=.94716 p<.2958 RET W=.90327 p<.3135 LAT1 W=.87459 p<.1701 LT2 W=.80836 p<.0365 LT3 W=.69856 p<.0025 LM2 W=.79444 p<.0261

*Prueba de normalidad de Shapiro-Wilk. Se considera que los datos son normales cuando el valor ―p‖ es mayor a 0.005. LA: Latencia de Adquisición; LM: Latencia media; RET: Retención; LT: Latencia de Transferencia

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1.3 Inmunofluorescencia Cuadro 9. Resultados de la prueba de normalidad para el conteo celular del doble marcaje BrdU y NeuN

Parámetro W p NO_CEL W=.70050 p<.0000

*Prueba de normalidad de Shapiro-Wilk. Se considera que los datos son normales cuando el valor ―p‖ es mayor a 0.05. NO_CEL: Número de células 2. Estadística Descriptiva 2.1 LAM prenatal Cuadro 10. Resultados de la estadística descriptiva de los animales tratados con Compvit - B® en la etapa prenatal

N Media Mínimo Máximo Dev. Est. Error Estándar LA1 9 30.09444 17.50000 48.62000 12.12860 4.042868 LA2 9 15.57722 8.93000 24.18000 5.17335 1.724449 LA3 9 13.83222 8.75000 21.75000 5.47943 1.826476 LM 9 18.73111 14.02000 25.88000 4.26989 1.423296 RET 9 8.47111 4.75000 19.37000 4.31178 1.437259 LT1 9 19.24778 14.87000 25.37000 3.51875 1.172915 LT2 9 11.58000 6.87000 16.50000 3.53905 1.179682 LT3 9 9.43667 3.87000 14.52000 3.65530 1.218435 LM 9 13.42667 10.25000 18.83000 2.55688 .852294

*LA: Latencia de Adquisición; LM: Latencia media; RET: Retención; LT: Latencia de Transferencia. Dev.Est.: Desviación Estándar Cuadro 11. Resultados de la estadística descriptiva de los animales tratados con vehículo en la etapa prenatal

N Media Mínimo Máximo Dev. Est. Error Estándar LA1 8 32.76500 14.75000 60.00000 16.42862 5.808395 LA2 8 17.43625 8.25000 48.50000 15.11942 5.345523 LA3 8 10.18625 4.50000 26.00000 6.61329 2.338149 LM 8 20.13000 11.46000 44.83000 12.09681 4.276869 RET 8 7.29375 3.62000 14.50000 4.27007 1.509696 LT1 8 19.76375 12.12000 29.00000 6.51020 2.301704 LT2 8 14.96750 12.00000 18.25000 2.26402 .800450 LT3 8 14.35625 4.50000 20.87000 5.75077 2.033203 LM 8 16.37125 12.04000 21.91000 3.38942 1.198340

*LA: Latencia de Adquisición; LM: Latencia media; RET: Retención; LT: Latencia de Transferencia. Dev.Est.: Desviación Estándar

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2.2 LAM post natal Cuadro 12. Resultados de la estadística descriptiva de los animales tratados con Compvit - B® en la etapa postnatal

N Media Mínimo Máximo Dev. Est. Error Estándar LA1 11 33.31000 13.88000 54.12500 13.48729 4.066571 LA2 11 20.99045 7.00000 43.50000 12.89989 3.889464 LA3 11 17.37909 4.12000 41.12500 12.36506 3.728206 LM1 11 23.96473 9.04000 45.04200 12.09339 3.646293 RET 4 19.34375 8.87500 33.25000 10.89982 5.449908 LT1 4 24.06250 10.50000 35.87500 11.66034 5.830170 LT2 4 15.87500 4.75000 26.87500 12.21040 6.105198 LT3 4 12.40625 5.25000 19.75000 6.42697 3.213487 LM2 4 17.44775 6.83300 27.50000 9.98208 4.991040

*LA: Latencia de Adquisición; LM: Latencia media; RET: Retención; LT: Latencia de Transferencia. Dev.Est.: Desviación Estándar Cuadro 13. Resultados de la estadística descriptiva de los animales tratados con vehículo en la etapa postnatal

N Media Mínimo Máximo Dev. Est. Error Estándar LA1 10 40.23900 22.13000 58.50000 11.84890 3.74695 LA2 10 28.02450 9.62000 60.00000 14.74690 4.66338 LA3 10 22.80100 7.75000 60.00000 16.68526 5.27634 LM1 10 30.33740 15.20000 57.87500 13.10322 4.14360 RET 4 38.21875 17.75000 60.00000 20.51127 10.25564 LT1 4 28.31250 13.00000 60.00000 21.89951 10.94976 LT2 4 24.25000 9.12500 60.00000 24.04141 12.02071 LT3 4 23.81250 5.50000 60.00000 24.61992 12.30996 LM2 4 25.45833 9.20830 60.00000 23.46400 11.73200

*LA: Latencia de Adquisición; LM: Latencia media; RET: Retención; LT: Latencia de Transferencia. Dev.Est.: Desviación Estándar

137

2.3 Inmunofluorescencia Cuadro 14. Resultados de la estadística descriptiva para el conteo celular del doble marcaje BrdU y NeuN

N Media Mínimo Máximo Dev. Est. Error Estándar 1-1 8 7,38 5,00 12,00 2,26 0,80 1-2 8 6,00 4,00 13,00 2,88 1,02 2-1 4 10,25 7,00 14,00 2,99 1,49 2-2 4 9,75 6,00 15,00 3,86 1,93 3-1 8 8,25 5,00 11,00 2,12 0,75 3-2 8 6,25 5,00 8,00 1,04 0,37 4-1 4 23,00 18,00 28,00 5,23 2,61 4-2 4 26,25 15,00 45,00 14,03 7,02

*1-1: Control prenatal en corteza; 1-2: Control prenatal en Hipocampo; 2-1: Control postnatal en corteza; 2-2: Control postnatal en Hipocampo; 3-1: Tratamiento prenatal en corteza; 3-2: Tratamiento prenatal en Hipocampo; 4-1: Tratamiento postnatal en corteza; 4-2: Tratamiento postnatal en Hipocampo. Dev.Est.: Desviación Estándar 3. Análisis Estadístico 3.1 LAM Prenatal Cuadro 15. Anova en fase de Adquisición para los animales tratados en la etapa prenatal

df Effect MS Effect df Error MS Error F p-level 1 1 1.102 15 230.3773 .00478 .945767 2 2 1750.809 30 65.7030 26.64732 .000000 12 2 50.020 30 65.7030 .76131 .475866

*Se considera que hay diferencias significativas, cuando el nivel p es menor a 0.005. 1: Comparación Intergrupal; 2: Comparación Intragrupal; 1-2: Comparación Grupo-días

138

Cuadro 16. Test de probabilidad Post-hoc para la ANOVA en fase de adquisición del LAM de los animales tratados en etapa prenatal con interacción 1x2

{1} 30.09444

{2} 15.57722

{3} 13.83222

{4} 32.76500

{5} 17.43625

{6} 10.18625

1 1 {1} .000661 .000188 .502947 .003125 .000020 1 2 {2} .000661 .651193 .000139 .640347 .181248 1 3 {3} .000188 .651193 .000040 .367470 .361998 2 1 {4} .502947 .000139 .000040 .000692 .000005 2 2 {5} .003125 .640347 .367470 .000692 .083741 2 3 {6} .000020 .181248 .361998 .000005 .083741

*Se considera que hay diferencias significativas, cuando el nivel p es menor a 0.005. 1-1: Tratamiento con Compvit-B® el día 1; 1-2: Tratamiento con Compvit-B® el día 2; 1-3: Tratamiento con Compvit-B® el día 3; 2-1: Tratamiento con vehículo el día 1; 2-2: Tratamiento con vehículo el día 2; 2-3: Tratamiento con vehículo el día 3 Cuadro 17. Anova en fase de Retención del LAM para los animales tratados en la etapa prenatal df Effect MS Effect df Error MS Error F p-level 1 1 10370,99 9 112,85 1.019 .9926 *Se considera que hay diferencias significativas, cuando el nivel p es menor a 0.005. 1: Comparación Intragrupal Cuadro 18. Anova en fase de Transferencia del LAM para los animales tratados en la etapa prenatal

df Effect MS Effect df Error MS Error F p-level 1 1 109.9007 15 26.43265 4.15776 .059469 2 2 278.5030 30 15.79034 17.63755 .000009 12 2 21.1657 30 15.79034 1.34042 .276962

*Se considera que hay diferencias significativas, cuando el nivel p es menor a 0.005. 1: Comparación Intergrupal; 2: Comparación Intragrupal; 1-2: Comparación Grupo-días

139

Cuadro 19. Test de probabilidad Post-hoc para la ANOVA en fase de transferencia del LAM de los animales tratados en etapa prenatal con interacción 1x2

{1} 19.24778

{2} 11.58000

{3} 9.436666

{4} 19.76375

{5} 14.96750

{6} 14.35625

1 1 {1} .000295 .000012 .791127 .034364 .016761 1 2 {2} .000295 .261590 .000198 .089575 .160835 1 3 {3} .000012 .261590 .000009 .007557 .016200 2 1 {4} .791127 .000198 .000009 .022089 .010711 2 2 {5} .034364 .089575 .007557 .022089 .760477 2 3 {6} .016761 .160835 .016200 .010711 .760477

*Se considera que hay diferencias significativas, cuando el nivel p es menor a 0.005. 1-1: Tratamiento con Compvit-B® el día 1; 1-2: Tratamiento con Compvit-B® el día 2; 1-3: Tratamiento con Compvit-B® el día 3; 2-1: Tratamiento con vehículo el día 1; 2-2: Tratamiento con vehículo el día 2; 2-3: Tratamiento con vehículo el día 3 3.2 LAM Postnatal Cuadro 20. Anova en fase de Adquisición del LAM para los animales tratados en la etapa post natal

df Effect MS Effect df Error MS Error F p-level 1 1 656.118 19 474.0036 1.38420 .253917 2 2 1565.718 38 45.5897 34.34363 .000000 12 2 4.261 38 45.5897 .09347 .910970

*Se considera que hay diferencias significativas, cuando el nivel p es menor a 0.005. 1: Comparación Intergrupal; 2: Comparación Intragrupal; 1-2: Comparación Grupo-días Cuadro 21. Test de probabilidad Post-hoc para la ANOVA en fase de adquisición del LAM de los animales tratados en etapa postnatal con interacción 1x2

{1} 33.31000

{2} 20.99045

{3} 17.37909

{4} 40.23900

{5} 28.02450

{6} 22.80100

1 1 {1} .000349 .000041 .024257 .081284 .001467 1 2 {2} .000349 .228537 .000032 .028703 .543196 1 3 {3} .000041 .228537 .000028 .001607 .089626 2 1 {4} .024257 .000032 .000028 .000317 .000056 2 2 {5} .081284 .028703 .001607 .000317 .084771 2 3 {6} .001467 .543196 .089626 .000056 .084771 *Se considera que hay diferencias significativas, cuando el nivel p es menor a 0.005. 1-1: Tratamiento con Compvit-B® el día 1; 1-2: Tratamiento con Compvit-B® el día 2; 1-3: Tratamiento con Compvit-B® el día 3; 2-1: Tratamiento con vehículo el día 1; 2-2: Tratamiento con vehículo el día 2; 2-3: Tratamiento con vehículo el día 3

140

Cuadro 22. Anova en fase de Retención del LAM para los animales tratados en la etapa post natal

df Effect MS Effect df Error MS Error F p-level 1 1 712.5313 6 269.7591 2.641361 .155240

*Se considera que hay diferencias significativas, cuando el nivel p es menor a 0.005. 1: Comparación Intragrupal Cuadro 23. Anova en fase de Transferencia del LAM para los animales tratados en la etapa post natal

df Effect MS Effect df Error MS Error F p-level 1 1 385.0006 6 975.2958 .39475 .552960 2 2 142.1152 12 9.8726 14.39490 .000648 12 2 25.8053 12 9.8726 2.61383 .114217

*Se considera que hay diferencias significativas, cuando el nivel p es menor a 0.005. 1: Comparación Intergrupal; 2: Comparación Intragrupal; 1-2: Comparación Grupo-días Cuadro 24. Test de probabilidad Post-hoc para la ANOVA en fase de transferencia del LAM de los animales tratados en etapa postnatal con interacción 1x2

{1} 24.06250

{2} 15.87500

{3} 12.40625

{4} 28.31250

{5} 24.25000

{6} 23.81250

1 1 {1} .004129 .000393 .093076 .934244 .912397 1 2 {2} .004129 .144596 .000257 .004171 .003989 1 3 {3} .000393 .144596 .000053 .000373 .000409 2 1 {4} .093076 .000257 .000053 .092567 .084410 2 2 {5} .934244 .004171 .000373 .092567 .855007 2 3 {6} .912397 .003989 .000409 .084410 .855007 *Se considera que hay diferencias significativas, cuando el nivel p es menor a 0.005. 1-1: Tratamiento con Compvit-B® el día 1; 1-2: Tratamiento con Compvit-B® el día 2; 1-3: Tratamiento con Compvit-B® el día 3; 2-1: Tratamiento con vehículo el día 1; 2-2: Tratamiento con vehículo el día 2; 2-3: Tratamiento con vehículo el día 3

141

3.3 Inmunofluorescencia Cuadro 25. Prueba de Wilcoxon para el conteo celular del doble marcaje BrdU y NeuN de los animales tratados en etapa prenatal

Clasific Variable n(1) n(2) Media (1)

Media (2)

DE (1)

DE (2) W p (2 colas)

Tratamiento Número

de células

16 16 6.69 7.25 2.60 1.91 229.5 0.1827

*(1) Grupo Vhl-Pre, (2) Grupo Compvit-Pre. Se considera que existen diferencias significativas cuando el valor ―p‖ es menor a 0.005 Cuadro 26. Prueba de Wilcoxon para el conteo celular del doble marcaje BrdU y NeuN de los animales tratados en etapa post natal


Media (2)

DE (1)


Tratamiento Número

de células

8 8 10.00 24.63 3.21 9.96 36.50 0.0003

*(1) Grupo Vhl-Pre, (2) Grupo Compvit-Pre. Se considera que existen diferencias significativas cuando el valor ―p‖ es menor a 0.005 Cuadro 27. Kruskal-Wallis ANOVA para el conteo celular del doble marcaje BrdU y NeuN de los animales tratados en las etapas pre y post natal H ( 3, N= 48) = 25.56232 p =.0000

Code N Sum of Ranks H (3, =48) P Mediana

General Chi-

Cuadrado Group 1 1 16 251.5000 25.56232 0.0000 8.0000 22.13334 Group 2 2 8 241.0000 Group 3 3 16 328.0000 Group 4 4 8 355.5000 *Se considera que existen diferencias significativas cuando el valor ―H‖ es mayor que el Chi-cuadrado correspondiente al N de la muestra. 1: Control prenatal; 2: Tratamiento prenatal;. 3: Control prenatal; 4: Tratamiento prenatal

142

Cuadro 28. Test de Probabilidad Post Hoc para el Kruskal-Wallis ANOVA del conteo celular del doble marcaje BrdU y NeuN de los animales tratados en las etapas pre y post natal con interacción 1 x 2.

Grup x Estr. {1} 7.375000

{2} 6.000000

{3} 10.25000

{4} 9.750000

{5} 8.250000

{6} 6.250000

{7} 23.00000

{8} 26.25000

1 1 {1} .655648 .369075 .441412 .761970 .697038 .000036 .000028 1 2 {2} .655648 .202466 .252693 .482051 .931060 .000024 .000019 2 1 {3} .369075 .202466 .862567 .516707 .222449 .000178 .000063 2 2 {4} .441412 .252693 .862567 .603913 .274273 .000112 .000056 3 1 {5} .761970 .482051 .516707 .603913 .516707 .000066 .000031 3 2 {6} .697038 .931060 .222449 .274273 .516707 .000029 .000023 4 1 {7} .000036 .000024 .000178 .000112 .000066 .000029 .263936 4 2 {8} .000028 .000019 .000063 .000056 .000031 .000023 .263936

*Se considera que hay diferencias significativas, cuando el nivel p es menor a 0.005. 1-1: Control prenatal– Corteza; 1-2: Control prenatal – Hipocampo; 2-1: Control Postnatal – Corteza; 2-2: Control Postnatal – Hipocampo; 3-1: Tratamiento prenatal – Corteza; 3-2: Tratamiento prenatal – Hipocampo; 3-2: Tratamiento prenatal – Hipocampo; 4-1: Tratamiento postnatal – Corteza; 4-2: Tratamiento postnaltal – Hipocampo Cuadro 29. Prueba de Wilcoxon para la comparación de las estructuras.


Media (2)

DE (1)


Área Número

de células

25 24 10.88 10.08 6.22 9.32 509.5 0.0680

*(1): Corteza; (2): Hipocampo. Se considera que existen diferencias significativas cuando el valor ―p‖ es menor a 0.005.

INFLUENCIA DE COMPVIT-B® SOBRE LA NEUROGÉNESIS PRE Y...

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