Universidad Nacional Agraria la MolinaLaboratorio de EnzimologaPROCEDIMIENTOS:

0,1 ml de suero2,5 ml de NaOH 0,1 MIncubar por 3537C0,20 ml de buffer citrato0,05 ml de H2O

0,25 ml de p-nitrofenil fosfato+B

0,1 ml de suero2,5 ml de NaOH0,1 MIncubar por 537C0,05 ml de H2O0,20 ml de buffer citrato0,25 ml de p-nitrofenil fosfato+Incubar por 30T/D

0,05 ml de vanadato2,5 ml de NaOH 0,1 MIncubar por 300,1 ml de sueroIncubar por 537C0,25 ml de p-nitrofenil fosfato+0,20 ml de buffer citratoVanadato

Incubar por 537C

0,05 ml de fluoruroIncubar por 300,1 ml de suero2,5 ml de NaOH 0,1 M0,20 ml de buffer citrato+0,25 ml de p-nitrofenil fosfatoFluoruro

0,05 ml de tartratoIncubar por 300,1 ml de suero2,5 ml de NaOH 0,1 MIncubar por 537C0,20 ml de buffer citrato+0,25 ml de p-nitrofenil fosfatoTartrato

RESULTADOSTabla1: Absorbancia de actividad de fosfatasa en suero

M1M2M3M4

Bl0,170,1370,1480,139

t/c ( buffer citrato)0,2860,1290,1430,155

Vanadato0,2270,1220,1470,139

Tartrato0,2660,1360,1490,154

Fluoruro0,1880,1200,1380,137

Lectura a 402 nm

MuestraS2S1S3S4

Fuente: Elaboracin propia

Actividad fosfatasa cida (buffer citrato) en suero1M..18400 de absorbancia 2,7174x 10-7M0,143 (absorbancia de la muestra) -0,148 (absorbancia de reactivo en blanco)2,7174x 10-7M..0,005 de absorbancia del p-nitrofenxido de sodio

2,7174x 10-7 moles1000ml de solucin de muestrap-nitrofenxido de sodio8,424x 10-10 moles3,1ml de la solucin total de la muestra8,424x 10-10 moles30 minutos de reaccin2,808x 10-5umolesp-nitrofenxido de sodio1minuto de reaccin

0,1ml de suero 2,808 x10-5 umoles p-nitrofenxido de sodio1000ml de suero 0,2808 umoles. Min/L

Actividad fosfatasa cida (vanadato) en suero1M..18400 de absorbancia 5,4348x 10-8M0,147 (absorbancia de la muestra) -0,148 (absorbancia de reactivo en blanco)5,4348 x 10-8M..0,001 de absorbancia del p-nitrofenxido de sodio

5,4348x 10-8 moles1000ml de solucin de muestrap-nitrofenxido de sodio1,685x 10-10 moles3,1ml de la solucin total de la muestra1,685x 10-10 moles30 minutos de reaccin5,6167x 10-6umoles p-nitrofenxido de sodio1minuto de reaccin

0,1ml de suero 5,6167x10-6umoles p-nitrofenxido de sodio1000ml de suero 0,05617umoles. Min/L

Actividad fosfatasa cida (tartrato) en suero1M..18400 de absorbancia 5,4348x 10-8M0,149 (absorbancia de la muestra) -0,148 (absorbancia de reactivo en blanco)5,4348 x 10-8M..0,001 de absorbancia del p-nitrofenxido de sodio

5,4348x 10-8 moles1000ml de solucin de muestrap-nitrofenxido de sodio1,685x 10-10 moles3,1ml de la solucin total de la muestra1,685 x 10-10 moles30 minutos de reaccin5,6167x 10-6umoles p-nitrofenxido de sodio1minuto de reaccin

0,1ml de suero 5,6167x10-6 umoles p-nitrofenxido de sodio1000ml de suero 0,05617 umoles. Min/L

Actividad fosfatasa cida (fluoruro) en suero1M..18400 de absorbancia 5,4348x 10-8M0,138 (absorbancia de la muestra) -0,148 (absorbancia de reactivo en blanco)5,4348 x 10-7M..0,01 de absorbancia del p-nitrofenxido de sodio

5,4348x 10-7 moles1000ml de solucin de muestrap-nitrofenxido de sodio1,685x 10-9 moles3,1ml de la solucin total de la muestra1,685 x 10-9 moles30 minutos de reaccin5,6167x 10-5umoles p-nitrofenxido de sodio1minuto de reaccin

0,1ml de suero 5,6167x10-5umoles p-nitrofenxido de sodio1000ml de suero 0,5617 umoles. Min/L

Actividad fosfatasa cida en suero: 0,2808 + 0,05617+ 0,05617+0,5617 = 0,9548umoles.Min/L

DISCUSIONES: Los siguientes resultados de las distintas mesas, pero se realizarn el respectivo anlisis de la mesas dos y tres. Ya que los tubos a analizar fueron al azar y mediante los resultados tenamos que identificar si es de hombre o de mujer, pero resulto incongruencias que se explicarn ms adelante.La siguiente prctica se realizo para identificar fosfatasas cidas en la sangre coagulada de hombre, sin saber si es de varn o de mujer. Para poder observar las diferentes reacciones debemos ver como se manifiesta el inhibidor. Casi todas las clulas sanguneas contienen siete isoenzimas no eritroides de la fosfatasa cida 0, 1, 2, 3, 3b, 4 y 5. Las clulas pilosas liberan abundante isoenzimas 5. Esto provoca que la tincin de fosfatasa se transforme en un herramienta para diagnostico til para la confirmacin de clulas pilosas. La clula hematopoyticas presenta actividad de fosfatasa cida. Los granulocitos, linfocitos y monocitos son positivos en cierto punto, hasta el agregado del cido tartrico. La actividad se inhibe debido a la falta de isoenzimas 5 (Bernadette, 2005). Por otro lado en la prueba de nuestra prctica con el suero se muestran diferentes resultados porque los estudios bioqumicos de suero, en particular la fosfatasa alcalina y fosfatasa cida prosttica son tiles para detectar la diseminacin metastsica. La concentracin de fosfatasa cida en suero est elevada a un 70% de los pacientes con metastsis y en algunos con enfermedad avanzada (Kelley, 1995).En el plasma tambin existen enzimas, que provienen de la destruccin normal de las clulas sanguneas y de otros tejidos. La mayora de las enzimas del plasma no tienen funciones metablicas en el plasma, a excepcin de aquellas que participan en la coagulacin sangunea. As, la actividad de determinadas enzimas en plasma puede indicar alguna disfuncin, tal es el caso de la pancreatitis aguda que origina niveles elevados de amilasas srica, el cncer de prstata cursa con elevacin de fosfatasa cida (Garrido, 2006). Por lo tanto, es ventajoso saber con qu compuesto trabajar para poder realizar los diagnsticos y llegar a la especulacin de que si es cncer de prstata. As mismo, en la prctica que se llevo a cabo hemos recibido dos muestras de varn y de mujer, pero como se dijo se llego a una incongruencia al analizar las muestras S1 y S3 porque result ser evidente que el nivel de fosfatasa cida era semejante al blanco y se poda inferir que la muestra era del sexo femenino, pero al finalizar la prctica le perteneca las muestras a un varn.

Figura1: funciones de las cuatro adsorbancia para identificar la presencia de fosfatasas cida en la sangre.

Como podemos observar la actividad de la fosfatasa en la siguiente grafica. La actividad se puede definir mejor por los factores que inhiben su actividad enzimtica. Por ejemplo: la fosfatasa cida de los eritrocitos muestra particularidad sensibilidad a la inhibicin por formaldehido al 0.5% o iones cobre (0.2mM), mientras que la actividad de la fosfatasa cida prosttica es mucho ms sensible a la inhibicin por iones flor (1mM) o L-tartrato (1mM). CONCLUSIONES:La fosfatasa cida es una enzima lisosomal, encontrada en los lisosomas del epitelio de la prstata y es una glicoprotena y por lo tanto la mayor actividad por gramo de tejido de la PAP es encontrada en la glndula prosttica, pero en nuestra muestra los niveles estar parecidos al blanco; es decir, la fosfatasa cida en los hombres consiste de aproximadamente una parte prosttica y el resto del hgado y se desintegra en las plaquetas y eritrocitos. En cambio en mujeres, la actividad srica es presumiblemente a partir del hgado, eritrocitos y plaquetas. Adems, no debe a ver tanta variacin con la fosfatasa cida, ya que no pueden tener problemas prostticos. Por lo tanto la muestra del varn que estamos haciendo el anlisis no viene de las glndulas prosttico, sino del hgado o que estos niveles bajos significa que nuestro donante tiene cncer prosttico.

BIBLIOGRAFIA: PORTILLO, J, et al. 1997,ASPECTOS BASICOS DE LA BIOQUIMICA CLINICA. Ed.Diaz de Santos. Madrid Espaa paginas: 107- 109

DODELSON, R.,et al Giner 1997, Revista Medicina 57 (1): 679- 681. Disponible en: https://books.google.com.pe/books?id=9WnXip7NmMQC&pg=PA679&dq=actividad+fosfatasa+acida+en+suero&hl=es&sa=X&ei=hBc9Vau0LJLOgwTi3oCYBA&redir_esc=y#v=onepage&q=actividad%20fosfatasa%20acida%20en%20suero&f=fasse GUTIERREZ, J., 1998, El CANCER DE LA PROSTATA, Edit: San Jose de Costa Rica, Edic. 1 Espaa. Pginas 51-53 GARRIDO A. et al, 2006, FUNDAMENTOS DE LA BIOQUIMICA ESTRUCTURAL, Editorial: Espaa-Madrid, 2 da edicin. Pginas: 112-118 ZANCHETTA, J., 2001, OSTEOPOROSIS : FISIOPATOLOGIA, DIAGNOSTICO, PREVENCION Y TRATAMIENTO, Editorial: buenos aires, medica panamericana, Edicin: 3era Espaa. Paginas: 59-63

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