RESUMEN

En microbiología es importante la preparación de un medio de cultivo que permita el crecimiento adecuado de determinado microorganismo, cuando se prepara un medio de cultivo, se debe tener cuidado con la elección del AGAR que se vaya a utilizar, ya que esto dependerá de la clase de microorganismo(s) que se vaya a cultivar. En el presente artículo, se podrán conocer algunas características de dos AGAR, que normalmente son usados en el ámbito universitario, tales como: el AGAR Nutritivo y el EMB. Así mismo, es vital tener en cuenta el método de siembra que se vaya a emplear, ya que este dependerá de los objetivos que se pretendan alcanzar con el cultivo, considerando que hay ocasiones en las que se requiere que el crecimiento microbiano se produzca de forma masiva o que este permita el aislamiento de colonias. A continuación, se explicaran los métodos de siembra por aislamiento (agotamiento), siembra en cuadrantes y siembra masiva. En dicha explicación, se dará a conocer la manera correcta en la que se debe proceder para emplear cada método.

Palabras Clave: metodos de siembra, medio de cultivo, siembra por agotamiento, siembra masiva, siembra en cuadrantes, AGAR.

ABSTRACT

In microbiology is important to prepare a culture medium which allows proper growth of microorganisms. When a culture medium is prepared, care must be taken with the choice of the AGAR that will be used, as this will depend on the kind of microorganism (s) that is going to be cultivated. In this article, it will be possible to learn some features of three particular AGARs, which are normally used in the university, such as: the Nutrient AGAR and the EMB. It is also vital to consider planting method that is going to be used, as this will depend on the objectives to be achieved through the cultivation, considering that there are occasions when it is necessary to get: massive microbial growth or colony isolation. In this paper, planting for isolation (depletion), planting into quadrants and massive planting are the methods that will be explained. In this explanation, we will point out the right way to proceed in order to use each method.

Introducción

El material nutritivo preparado para evidenciar el crecimiento de microorganismos en un laboratorio se denomina medio de cultivo; este último constituye un aporte de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes indispensables para el desarrollo de microorganismos.Los constituyentes habituales de los medios de cultivo son: peptonas, extractos, fluidos corporales, sistemas amortiguadores, indicadores de pH, agentes reductores y agentes selectivos, teniendo en cuenta que si el medio es sólido debe además contiene agar; la composición precisa de nutrientes dependerá de la especie que se quiera cultivar.

Los factores de crecimiento que se tienen en cuanta a la hora de generar un medio de cultivo adecuado son, la temperatura, la humedad, la disponibilidad o no de oxígeno y las concentraciones adecuadas de acidez o alcalinidad.

La esterilización de los medios de cultivo es un aspecto clave antes de usarlos, para eliminar de ellos todos los microorganismos presentes, y evitando que en las cajas no vuelva a entrar ningún microorganismo, y así de esta forma solo se cultivara los organismos deseados.

Para efectuar una adecuada identificación y un posterior estudio de microorganismos, se han diseñado diversos métodos, los cuales permiten cultivarlos bajo condiciones óptimas, para después analizarlos microscópicamente y macroscópicamente, uno se estos procedimientos es el denominado “método de siembra”, el cual se entiende como el proceso mediante el cual se lleva una porción de una población de microorganismos, denominada entonces inóculo, de un cultivo crecido a un medio nutritivo para su crecimiento. Todo este proceso hay que llevarlo a cabo con instrumentos y medios previamente esterilizados y siguiendo las instrucciones de los monitores de práctica; la principal advertencia consiste en trabajar siempre próximos a la llama del mechero que, debido a las corrientes de convección verticales que genera, es capaz de crear un ambiente estéril en la zona inmediatamente alrededor y debajo de la llama.

La aplicación de estos procedimientos ha permitido propagar el estudio de microorganismos en cultivos mixtos, así como su aislamiento y la obtención de cultivos puros, un cultivo puro consta de una población de células derivadas todas ellas de una única célula parental1.De este modo se facilita, el estudio, caracterización, aplicación y control de las colonias de microorganismos que se generan a partir de un medio de cultivo. La forma de sembrar y cultivar los microorganismos depende de su tipo y del propósito específico de estudio.

La mayor parte de los trabajos bacteriológicos requieren cultivos puros, o clones de bacterias. El método de aislamiento empleado con más frecuencia para obtener cultivos puros es el método de siembra por estría en placa conocido también como siembra por agotamiento. Se introduce un asa de inoculación estéril en un cultivo mixto, del que se presume haya más de un tipo de microbio, y se lo distribuye en forma de estría sobre la superficie de un medio nutritivo, las bacterias se desprenden del asa y pasan al medio. Las últimas células que se desprenden del asa están bastante separadas como para crecer en colonias aisladas.2 En el

1http://labmicrofarmaciaulat.blogspot.com/p/sembrado-en-placa-de-microorganismos.html2Tortora, G. Funke, B. Case, C. Introducción a la microbiología. Editorial Panamericana, 2007. 9°ed. Pp 168–183. [Disponible en línea] http://books.google.com.co/books?id=Nxb3iETuwpIC&dq=laboratorio+siembra+de+microorganismos&hl=es&source=gbs_navlinks_s

Presente artículo se hace uso además de la anterior técnica de la técnica de siembra en cuadrantes y siembra masiva.

Materiales:

Metodología:

Resultados

El agar comercial visiblemente es un polvo, al cual se le debe se prepara al llevarlo a ebullir hasta conseguir una textura adecuada, para ello se debe tener en cuenta las indicaciones del fabricante, las cuales son las siguientes:

Agar nutritivo: cálculos según las especificaciones del fabricante.

Agar EMB: cálculos según las especificaciones del fabricante.

Faltan los resultados de las cantidades de AGAR USADOS.

Para la preparación del medio de cultivo en el laboratorio, después de calentarlo, se obtuvo el medio completamente líquido, posteriormente el medio liquido fue servido en cajas de Petri completamente estériles, en la cámara de flujo laminar llenándolas aproximadamente hasta la mitad, esto se realizó con cada uno de los medios preparados en el laboratorio (Agar Nutritivo y EMB). A continuación se dejaron dentro de la cabina unos minutos después de pasado este tiempo el medio tomo una consistencia dura, de tal forma que al cerrar las cajas de Petri y voltearlas el medio permaneció inmóvil.

El medio Agar nutritivo, tomo una coloración casi transparente con un tono un poco amarillento.

El medio EMB tomo un color purpura

Por falta de tiempo no se realizó la siembra en estos medios, inmediatamente, por el contrario, se marcaron debidamente y se llevaron a refrigeración.

Por otra parte para la siembra de cultivo los medios se sacaron de refrigeración y se realizó la siembra, procurando un ambiente lo mas estéril posible, por esto se realizaron siembras alrededor de mechero y algunas se realizaron en la cabina de flujo laminar, allí se realizó la siembra por agotamiento, la siembra masiva y por cuadrantes, en los medios de cultivo se inoculo xxxxxxxx( lo que sembro),cada uno de los grupos sembró en cajas de Petri, que contenían agar nutritivo y EMB.

Posteriormente el Agar nutritivo, y el agar EMB se llevaron a la incubadora durante aproximadamente 24 horas y pasado ese tiempo se llevan a refrigeración.

Análisis

En la mayoría de los lugares del planeta tierra podemos encontrar gran diversidad de microorganismos, para poder estudiarlos es necesario cultivarlos en un medio de cultivo con unas condiciones de esterilidad, realizadas para asegurar el crecimiento de un microorganismo especifico y evitar la contaminación de un cultivo debida a la presencia de diversos microorganismos externos a los presentes en una muestra objeto, estos medios de cultivo proveen características nutricionales específicas para propiciar el crecimiento de los diferentes microorganismos a identificar. A veces se añaden otras clases de sustancias; por ejemplo, para impedir el crecimiento de otras bacterias que podrían contaminar el cultivo. Luego de realizar el procedimiento de preparación del medio de cultivo de acuerdo a unas especificaciones técnicas de la empresa fabricante, se lleva a autoclave y posteriormente se refrigera, para luego servir en condiciones de esterilidad. Cuando se sirve bien sea en tubos de ensayo o cajas de Petri (para el caso en cajas de Petri), se procede a refrigerarlo para de esta manera darle una consistencia más sólida al medio, posteriormente de la refrigeración se procede a realizar la siembra de una muestra objeto haciendo uso de diferentes técnicas de siembra. La técnica de siembra a emplear depende de los objetivos que se pretendan alcanzar con el cultivo, ya que en ocasiones se requiere que el desarrollo del microorganismo se produzca de forma masiva, mientras que en otras resulta indispensable que las colonias queden aisladas o que las manifestaciones del metabolismo tengan lugar con tensiones reducidas o privadas de oxígeno.

Sembrar es colocar una muestra de inóculo, en un medio de cultivo para obtener el crecimiento de los microorganismos. Para ello se extiende la muestra sobre caja

de Petri, que contiene un gel (Agar). Dentro de las técnicas usadas para sembrar se encuentra la siembra por aislamiento o agotamiento, la cual consiste en la realización de 4 estrías en un cuadrante, estas estrías se realizan en forma de zig-zag, luego de realizar la primera estría, la parte inicial de cada estría se toma de la parte final de la estría anterior, con el objetivo de ir reduciendo o agotando el inoculo, para de esta manera conseguir la separación de las células y obtener un cultivo puro o axènico (con un solo tipo de microorganismo), de muestras polimicrobianas. Esta técnica es útil para estudiar las características de los microorganismos y para poder identificarlos con seguridad. Otra técnica de siembra muy conocida es de siembra masiva, esta técnica consiste en la distribución y aprovechamiento de la superficie del medio de cultivo contenido en una caja Petri, esta técnica es muy útil para realizar el recuento de colonias (clon lo suficientemente grande como para ser visible sobre la superficie de un medio solido), para la siembra del inoculo se usan asas calibradas y es muy usado para realizar antibiogramas. Con esta técnica se determina el número de microorganismos en una muestra en relación a las colonias que forman, las UFC (Unidades Formadoras de Colonias). Se emplean soluciones diluidas o diluciones de una muestra concentrada para que cada colonia formada provenga de un solo microorganismo aunque algunas agrupaciones no pueden ser separadas por las diluciones. Se utilizan principalmente para la cuantificación de bacterias, levaduras y hongos filamentosos.

La técnica de siembra en cuadrantes Tiene por objetivo diluir el inóculo a medida que se realizan estrías en la superficie del agar. Para realizar la siembra, la caja se divide en cuatro cuadrantes (imaginariamente o con un marcador vidriográfico por la base de la caja); se procede a esterilizar el asa en el mechero, se toma el inóculo y se inicia el rayado de la superficie del agar, en cuatro cuadrantes consecutivos (sin esterilizar el asa posteriormente o tomar nuevamente inóculo). Las cajas así sembradas, se incuban a la temperatura adecuada de acuerdo a la bacteria. Con esta técnica de siembra, se espera que al menos en el cuarto cuadrante (última estría realizada), se encuentren colonias de la bacteria aisladas.

Luego de realizar la siembra se procede a la "incubación" del medio ya sembrado, esto para el caso del Agar EMB y Agar nutritivo, si se hubiese hecho uso de Agar OGY este se debe refrigerar (lo anterior debido a las condiciones necesarias para el crecimiento adecuado de los microorganismos que crecen en estos medios y a las especificaciones técnicas del mismo). En cada caso se hace en condiciones particulares de presión de oxígeno, temperatura, agitación, duración, etc. La temperatura adecuada debe ser cercana a los 37ºC.

Tras la incubación en condiciones adecuadas, cada  célula viable origina una colonia visible (macroscópica y microscópicamente) resultado de sucesivas divisiones celulares. Cada colonia microbiana tendrá unas características determinadas en cuanto a su forma, borde, elevación, tamaño, consistencia, etc. Las cueles deben describirse y caracterizar adecuadamente.

Falta hablar de las muestras que se sembraron, específicamente que se espera a obtener…

Conclusiones

El método de siembra por estría o por agotamiento permite establecer que hay en determinada muestra, ya que por medio de este se obtienen colonias aisladas, que posteriormente serán utilizadas para generar cultivos puros.

Durante el proceso de siembra por agotamiento, se debe muy cuidadoso y seguir la metodología al pie de la letra ya que, cualquier error como lo pudiera ser, trabajar alejado del mechero, no esterilizar el asa con el que se está trabajando, manipular de forma incorrecta el asa (hacer de forma incorrecta las estrías en el medio de cultivo); pueden llevar a obtener resultados erróneos o simplemente no cumplir con el objetivo de este tipo de siembra, que es el de obtener colonias aisladas.

Luego de realizar una siembra por agotamiento, frecuentemente se obtienen colonias aisladas, estas colonias provienen únicamente de una sola célula, es decir son clones de esta última, al resultado de la siembra de estos “clones”, se les denominan cultivos puros, es decir microorganismos de un mismo tipo.

El método de siembra masiva se utiliza para obtener una gran número de individuos de un mismo microorganismo, es decir se realiza un incremento del inoculo sobre la superficie del medio del cultivo, a partir de lo que se denomina cultivo puro.

El método de siembra en cuadrantes se usa para realizar una dilución del inóculo a medida que se realizan estrías en la superficie del agar, para así obtener colonias de la bacteria aisladas.

Bibliografía

AULA VIRTUAL. MEDIOS DE CULTIVO. [Disponible en línea] http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/curso/UNI_02/u2c2s1.htm#Anchor3

L, Alarcón. Manual de prácticas de Microbiología básica y Microbiología de alimentos. Programa de Nutrición. Universidad autónoma ciudad de Juárez [Disponible en línea] http://books.google.com.co/books?id=Oy-kG04ClBUC&dq=esterilidad+de+los+medios+de+cultivo&hl=es&source=gbs_navlinks_s

BRITANIA. PRODUCTOS. [Disponible en línea] http://www.britanialab.com/productos/598_hoja_tecnica_es.pdf