INFORME DEL ENSAYO INTERLABORATORIOS PARA FANGOS...

INFORME DEL ENSAYO INTERLABORATORIOS PARA

FANGOS ACTIVOS (Febrero 2006)

Asociación Científica Grupo Bioindación Sevilla

Con el patrocinio de: Izasa, Emasesa y Surcis.

ÍNDICE

1. Introducción

2. Participantes

3. Resultados

4. Análisis de datos

Caracterización macroscópica y microscópica del fango activado (IF)

Identificación y cuantificación de bacterias filamentosas

Caracterización de la microfauna

Otros parámetros de interés

5. Conclusiones

• Generales

• Valoración de la muestra

6. Consideraciones para los próximos ejercicios interlaboratorios

7. Agradecimientos

8. Bibliografía

Anexo I: Procedimiento operativo para las hojas de trabajo

Anexo II: Reportaje fotográfico (se adjunta en un documento aparte debido a su gran tamaño)

Anexo III: Estudio respirométrico de la muestra (se adjunta en un documento aparte)

INFORME "EJERCICIO INTERLABORATORIOS DE 22 DE Febrero de 2006" 1

1. INTRODUCCIÓN

Con el objetivo de unificar criterios en los análisis de tipo microbiológico de fangos activos ("evaluación del fango: características macro- y microscópicas" y "evaluación de la microfauna: filamentos y protozoos"), GBS organiza ejercicios interlaboratorios con muestras de distintas características. Estos ensayos ofrecen la oportunidad al laboratorio participante de comparar sus resultados con aquellos aportados por el resto de participantes, posibilitándole conocer su desempeño técnico y detectar posibles errores sistemáticos.

El ejercicio del día 22 de febrero de 2006 se realizó sobre una muestra puntual de Fango Activo, distribuida desde la sede de GBS (EDAR Ranilla), junto con los formatos de remisión de resultados. En esta ocasión, la toma de muestras se efectuó el día 21 de febrero a las 7.30h a.m., siendo los participantes convocados a realizar el análisis el día 22, a fin de evitar diferencias entre los que reciben la muestra antes respecto a los que lo hacen después.

Conjuntamente, se adjuntaron frotis de una muestra puntual de fango activo de procedencia urbana pero con un fuerte componente industrial en su influente. En este caso, el formato de datos a cumplimentar se simplificó, pues se trataba de realizar un ejercicio de identificación de bacterias filamentosas sobre frotis fijo, careciendo de la información procedente de la observación en vivo de la muestra.

En este ejercicio interlaboratorios se han adjuntado las nuevas hojas de trabajo, que incorporan parámetros tales como la cuantificación de bacterias filamentosas en disolución, con la asignación de una categoría numérica. También quedan recogidas algunas observaciones relacionadas con el estudio de la microfauna: densidad de amebas desnudas, telotrocos, etc.

Aunque los participantes están lo suficientemente cualificados para cumplimentar las hojas de trabajo, GBS ha decidido adjuntar documentación al inicio del circuito para detallar la metodología de análisis. Además, para insistir en ciertos aspectos metodológicos que por los resultados aportados por los analistas entendemos que no permanecen claros, se adjuntan las ideas básicas a conocer acerca de las "hojas de trabajo" en el Anexo I, sobre las que se han añadido algunos ejemplos prácticos que esperamos aporten claridad. Adicionalmente, en el apartado 6, "Consideraciones para los próximos ejercicios interlaboratorios", se recogen observaciones que los analistas deberán tener en cuenta en próximos ejercicios.

Por último, hacer saber a los participantes que la presente muestra ha sido estudiada de forma respirométrica por la empresa Surcis, S.L., cuyo informe


adjuntamos en anexo aparte (Anexo III) y esperamos sea de su agrado. Por nuestra parte, entendemos que muchos de los aspectos aquí recogidos son complementados y en ocasiones confirmados por los resultados extraídos con este método indirecto de evaluación de la biomasa, la respirometría. Sin embargo, nos gustaría hacer saber a los participantes que el presente informe ha sido realizado sin conocimiento de los datos técnicos de dicho estudio.

2. PARTICIPANTES

Durante este ejercicio, el total de participantes ha sido de 24, de los cuales el 50%, aproximadamente, trabajaba por primera vez con esta metodología de análisis. El otro 50% había trabajado con anterioridad con las hojas de trabajo y tan sólo un 25% puede considerarse "experto" respecto al uso de esta metodología. Es nuestra intención que la experiencia de este primer ejercicio sirva a los participantes para adquirir la autonomía necesaria para cumplimentar de forma independiente las hojas de trabajo con la información requerida en cada apartado. Desde el presente informe se tratará de aclarar aquellos aspectos metodológicos que han presentado mayor índice de error al ser cumplimentados.

En la Tabla 1 se recogen los plazos de tiempo transcurridos entre la toma de muestras y el análisis en el caso de cada participante. Con la excepción de los participantes 10 y 15 todos los laboratorios efectuaron el análisis en el plazo previsto.

Tabla 1. Días transcurridos en el análisis de la muestra desde su toma.

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 P13 P14 P15 P16 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 2 1

P17 P18 P19 P20 P21 P24 P25 P261 1 1 1 3 1 1 1

Pi= Participante 1-26

3. RESULTADOS

Los resultados más relevantes del análisis microscópico de la muestra, para cada uno de los participantes, se recogen en la Tabla 2.

Se advierte a los participantes que los cuadros-resumen aquí recogidos presentan modificaciones respecto a los adelantados por correo electrónico. En algunos casos, los participantes ratificaron o aportaron la información ausente

solicitada, en otros casos los datos han debido de quedar como ausentes por falta de respuesta.

Sería conveniente llamar la atención de los participantes sobre la Clase Madoni, que en la mayoría de los casos ha debido de ser modificada por nuestra parte, al haber sido establecida de forma errónea por algunos participantes. Sobre esta cuestión se ahondará en próximos apartados. También, se ha modificado el grupo funcional dominante de los participantes 19, 20 y 26.

Con relación al valor del índice de Shannon-Weaver ha debido de ser calculado en muchos casos por GBS, cuando ha sido posible, para evitar perder esta información y dejar de incluirla en el presente informe.

De la misma forma, las densidades de población parciales y por especies han sido calculadas para poder ser analizadas en el presente informe.

En cualquier caso, se informa a los participantes que, una vez conocida la sistemática de trabajo, esta información habrá de ser aportada de forma personal en próximos ejercicios; de lo contrario, se entenderá que se trata de información omitida por el participante.

Tabla 2 (I). Resultados aportados por los participantes 1-5.

* Los datos que presentan color rojo, se destacan del resto por no haber sido ratificados por los participantes.


Tabla 2 (II). Resultados aportados por los participantes 6-15.


Tabla 2 (III). Resultados aportados por los participantes 21, 24-26.



4. ANÁLISIS DE DATOS

En este apartado se realizará un análisis estadístico de los valores obtenidos en cada uno de los puntos en los que está dividido el análisis de fangos activos. Los parámetros estadísticos seleccionados son:

El cálculo de la media nos informa sobre el valor más probable de la variable a estudiar. Es afectada fuertemente por los valores extremos de la población.

La desviación estándar muestra como de agrupados o dispersos se encuentran los valores. Si la varianza tiende a cero, quiere decir que la dispersión de los datos es muy baja y se encuentran concentrados en torno a la media.

Dada la dispersión natural de los datos biológicos, y más aún de este tipo de análisis que no presentan capacidad de contraste con un patrón, hemos preferido realizar una invalidación de medidas que se ha determinado mediante el test de la Q de Dixon. Dicho test tiene en cuenta la diferencia de los valores máximos y mínimos respecto a la media, inhabilitando aquéllos que superen el valor preestablecido para este estimador.

CARACTERIZACIÓN MACRO- Y MICROSCÓPICA DEL FANGO ACTIVO

En los resultados que se muestran a continuación se resaltan en color amarillo aquellos datos que, sin ser excluídos por el Test de la Q de Dixon, se alejaron de la tendencia extraída del total de datos. Se resaltan en color verde claro los datos rechazados por el test de invalidación.

- MACROSCOPÍA

CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS

0102030

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 25

participante

MACROSCOPÍA MEDIA

1 212 7,53 16,54 175 306 217 16,58 189 16,510 2111 2112 2113 16,514 1215 7,516 817 2118 16,519 2120 16,521 2124 2125 2126 25,5

MEDIA 18,1VARIANZA 5,36

INTERV CONF

PARTICIP DESCARTADO 5,00MEDIA CORREG 17,60VAR CORREG 4,83

MACROSCOPÍA

Figura 1. Características macroscópicas de la muestra ("totales" ∑[turbidez, flóculos en suspensión,sedimentabilidad y olor]) para cada uno de los participantes, así como la media y varianzacalculadas. Descartado el dato del participante 5 según el test de la Q de Dixon.


Tabla 3. Características macroscópicas de la muestra para cada uno de los participantes. Se resaltan enamarillo las categorías menos frecuentes.

REPARTO PORCENTUAL DE LAS CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS DE LA MUESTRA.

PARTICIPANTE TURBIDEZ FLÓCULOS EN SUSP. SEDIMENTABILIDAD OLOR1 Media Media Alta Correcto2 Alta Alta Media Correcto3 Media Alta Alta Correcto4 Media Media Media Correcto5 Baja Baja Alta Correcto6 Media Media Alta Correcto7 Media Media Media Correcto8 Media Media Alta Correcto9 Media Media Media Correcto

10 Baja Media Media Correcto11 Baja Media Media Correcto12 Media Media Alta Correcto13 Media Alta Alta Correcto14 Media Alta Media Correcto15 Alta Alta Media Correcto16 Alta Alta Media Correcto17 Media Media Alta Correcto18 Media Media Media Correcto19 Media Media Alta Correcto20 Media Media Media Correcto21 Media Media Alta Correcto24 Media Media Alta Correcto25 Baja Media Media Correcto26 Baja Media Alta Correcto

Turbidez

13%

66%

21%

AltaMediaBaja

Flóculos en suspensión

71%

25%4%

AltaMediaBaja

Sedimentabilidad

50%50%

0%

AltaMediaBaja

Olor

100%

0%

CorrectoIncorrecto


- MICROSCOPÍA

CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS

0

10

20

30

40

50

60

70

80

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 24 25 26

participantes

MICROSCOPÍA MEDIA

1 572 503 534 575 706 447 538 409 60

10 4111 5412 5113 7014 6415 4816 4617 5618 4119 4020 16,521 4324 5325 6126 37


INTERV CONF

PARTICIP DESCARTAD 20MEDIA CORREG 49,5VAR CORREG 9,45

MICROSCOPÍA

Figura 2. Características microscópicas de la muestra (totales) para cada uno de losparticipantes, así como la media y varianza calculadas. Descartado el participante 20.

PARTICIPANTE FORMA TAMAÑO ESTRUCTURA TEXTURA COBERTURA FIL EN FLÓC. FIL EN DIS. DIV PROTOZ1 Irregular Medio Media Fuerte 10-50% < 5fil./flóculo Baja > 7 sp.2 Irregular Medio Media Fuerte 10-50% 5-20 fil./flóculo Baja > 7 sp.3 Irregular Medio Compacta Fuerte 10-50% 5-20 fil./flóculo Baja 4-7 sp.4 Regular Medio Compacta Fuerte 10-50% 5-20 fil./flóculo Baja 4-7 sp.5 Regular Medio Compacta Fuerte 10-50% < 5 fil./flóculo Baja > 7 sp.6 Irregular Medio Media Fuerte 10-50% 5-20 fil./flóculo Baja 4-7 sp.7 Irregular Medio Compacta Fuerte < 10% < 5 fil./flóculo Baja 4-7 sp.8 Irregular Medio Media Débil 10-50% 5-20 fil./flóculo Baja 4-7 sp.9 Irregular Medio Compacta Fuerte 10-50% < 5fil./flóculo Baja 4-7 sp.10 Regular Medio Media Fuerte 10-50% 5-20 fil./flóculo Baja > 7 sp.11 Regular Medio Media Fuerte 10-50% 5-20 fil./flóculo Baja > 7 sp.12 Irregular Medio Media Fuerte 10-50% < 5fil./flóculo Baja 4-7 sp.13 Regular Medio Compacta Fuerte 10-50% < 5 fil./flóculo Baja > 7 sp.14 Irregular Grande Compacta Fuerte 10-50% 5-20 fil./flóculo Baja 4-7 sp.15 Regular Medio Media Fuerte 10-50% 5-20 fil./flóculo Baja 4-7 sp.16 Irregular Grande Compacta Fuerte 10-50% < 5 fil./flóculo Baja < 4sp.17 Regular Medio Compacta Fuerte 10-50% < 5fil./flóculo Baja 4-7 sp.18 Irregular Medio Media Fuerte 10-50% 5-20 fil./flóculo Alta 4-7 sp.19 Irregular Grande Media Débil 10-50% 5-20 fil./flóculo Alta > 7 sp.20 Irregular Medio Media Fuerte 10-50% 5-20 fil./flóculo Alta > 7 sp.21 Irregular Medio Media Fuerte 10-50% 5-20 fil./flóculo Baja > 7 sp.24 Irregular Medio Media Débil 10-50% < 5 fil./flóculo Baja > 7 sp.25 Regular Medio Compacta Fuerte 10-50% < 5 fil./flóculo Baja > 7 sp.26 Irregular Grande Media Débil 10-50% 5-20 fil./flóculo Baja 4-7 sp.

Tabla 4. Características microscópicas de la muestra (forma, tamaño, estructura, textura y cobertura flocular,filamentos en flóculos y en disolución, diversidad de especies) para cada uno de los participantes. Se resaltanen amarillo las categorías menos frecuentes.


REPARTO PORCENTUAL DE LAS CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS DE LA MUESTRA.

Forma

33%

67%

RegularIrregular

Tamaño

0%

83%

17%

PequeñoMedioGrande

Estructura

42%

58%

0%

CompactaMediaAbierta

Textura

83%

17%

Fuerte

Débil

Cobertura

4%

96%

0%

< 10%

10-50 %

> 50%

Filamentos en flóculo

0%

58%

42% > 20 fil./flóc.5-20 fil./flóc.< 5 fil./flóc.

Filamentos en disolución

13%

87%

AltaBaja

Diversidad protozoos

46%

50%

4%

> 7 sp.

4-7 sp.

< 4 sp.


- ÍNDICE DE FANGO

ÍNDICE DE FANGO (IF)

0

20

40

60

80

100

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 24 25 26participante

ÍNDICE DE FANGO ( IF) MEDIA

CATEGORÍA1 78 Bueno2 57,5 Regular3 69,5 Bueno4 74 Bueno5 1006 65 Bueno7 69,5 Bueno8 58 Regular9 76,5 Bueno10 62 Bueno11 75 Bueno12 72 Bueno13 86,5 Óptimo14 64 Bueno15 57,5 Regular16 54 Regular17 77 Bueno18 57,5 Regular19 61 Bueno20 63,5 Bueno21 64 Bueno24 74 Bueno25 82 Óptimo26 62,5 Bueno

MEDIA 69,2VARIANZ

Óptimo

A 10,89INTERV CONF

PARTICIP DESCARTADO 5MEDIA CORREG 65,0VAR CORREG 8,9

ÍNDICE DE FANGO ( IF)

CATEGORÍA IF

69%

22%

9%

BuenoRegularÓptimo

I

Figura 3. IF (sumatorio de las características macro- y microscópicas) para cada uno de losparticipantes, así como la media y varianza calculadas. Descartado el participante 5.

NFORME "EJERCICIO INTERLABORATORIOS DE 22 DE Febrero de 2006" 11

IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE BACTERIAS FILAMENTOSAS

- ABUNDANCIA DE BACTERIAS FILAMENTOSAS IDENTIFICADAS: CATEGORÍA NUMÉRICA Y OTROS MÉTODOS PROPUESTOS.

Figura 4. Abundancia de bacterias filamentosas (categoría numérica) para cada uno de losparticipantes, así como la media y varianza calculadas. Ningún participante descartado.

En la tabla anterior se recoge la presencia de bacterias filamentosas en función a una técnica "cualitativa" que permite establecer un criterio subjetivo de abundancia para la densidad total de microorganismos filamentosos presentes.

En el caso de aquellos participantes que adoptaron la categoría intermedia "entre 3 y 4", se ha adoptado la categoría numérica "3,5" por simplificación a la hora de calcular la media y varianza.

Dado que el valor medio calculado para la categoría numérica de bacterias filamentosas es de 3,1, la categoría media finalmente adoptada es de 3, aunque realmente este valor indica una situación intermedia entre las categorías 3 y 4.

A continuación, en las Tablas 5 y 6, se recogen los resultados referentes a "otros procedimientos de cuantificación de organismos filamentosos". La mayoría de participantes que aportó este dato, empleó la técnica basada en el

ABUNDANCIA FILAMENTOS (CATEGORÍA)

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 24 25 26

participante

CATEGORÍA BACTERIANA MEDIA

1 2,02 4,03 4,04 3,05 1,06 2,07 3,08 3,59 2,0

10 4,011 4,012 3,013 4,014 4,015 2,016 4,017 3,018 4,019 3,020 4,021 3,024 3,025 2,026 4,0


CATEGORÍA BACTERIANA


cálculo de los "m/mL filamentos" (13 participantes) y 10 participantes emplearon la técnica de "cortes con la diagonal".

Con relación a esta primera técnica de cuantificación de filamentos, aunque los datos indican que la dispersión es importante, no se ha aplicado estudio estadístico por la escasez de resultados. Se sugiere a los participantes, sin embargo, la revisión de sus datos.

Tabla 5. Cuantificación de los filamentos de la muestra como "m/mL filamentos".

1 148,482 -3 222,74 491,75 27,86 37,127 -8 352,649 -10 -11 -12 -13 92,814 148,515 111,3616 -17 -18 334,0619 510,420 47021 44024 -25 -26 -


RECUENTO FILAMENTOS (m/mL filamentos)

RECUENTO FILAMENTOS (m/mL filamentos)

0100200300400500600

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 25

RECUENTO FILAMENTOS (m/mL filamentos) Media


En cuanto a la segunda técnica, los participantes que aportaron datos más dispersos fueron el 7, el 9 y el 10 (Tabla 6). Sin embargo, por la escasez de resultados, no pueden extraerse conclusiones sobre la validez de este método. Tan sólo podemos convocar a los participantes 7, 9 y 10 a revisar sus resultados y a ponerse en contacto con nosotros si necesitan alguna aclaración. Algunos de los aspectos que pueden revisarse con relación a esta técnica son: valorar si es necesario diluir la muestra, cuestión ésta que habrá de ser tenida en cuenta en valor final determinado; tener en cuenta que un mismo filamento puede interceptar varias veces con la diagonal y por último, no utilizar este sistema para el caso de Nocardia sp.

Tabla 6. Cuantificación de los filamentos de la muestra como "cortes con la diagonal".

1 -2 0,613 1,434 -5 0,816 -7 28,98 -9 8,07

10 6,511 -12 0,8413 -14 -15 -16 217 -18 -19 -20 -21 -24 0,4725 0,5226 -


RECUENTO FILAMENTOS (CORTES DIAGONAL)


IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS FILAMENTOSAS

PAR

Tabla 7. Filamentos dominante, secundario y "otros filamentos". Especies totales identificadas porcada participante.

TICIPANTE FILAMENTO DOMINANTE F. SECUNDARIO OTROS FILAMENTOS1 Tipo 021N N. limicola III, M. parvicella y Nocardia T 1863, Thiothrix II y T 09612 Tipo 021N y Tipo 1701 Nostocoida, H. hydrossis Nocardia3 Microthrix parvicella y Nocardia Tipo 021N Tipo 1863, Nostocoida limicola, H. hydrossis4 Tipo 021N H. hydrossis -5 Tipo 021N Microthrix parvicella Cianobacterias6 Microthrix parvicella Nocardia spp. Thiothrix I y Nostocoida limicola I7 Microthrix parvicella Tipo 0961 Nocardia sp.8 Tipo 021N Microthrix parvicella Tipo 1701, Thiothrix, H. hydrossis, Nocardia9 Thiothrix I T 1851, Microthrix, Nocardia T 0675, T 1701, H. hydrossis, T 021N10 Microthrix parvicella Thiothrix I Nocardia, Haliscomenobacter hydrossis, T 004111 Microthrix parvicella Nostocoida limicola Nocardia , Tipo 096112 Microthrix parvicella Tipo 021N Nocardia13 Microthrix parvicella - Nostocoida limicola II y III, T 1863, Nocardia, T 170114 Tipo 021N - Beggiatoa sp.15 Beggiatoa Nocardia spp. Flexibacter, Microthrix p., Cyanophyceae16 Tipo 021N - T 0675, T0211, N.limicola, T 0411, T 186317 Microthrix parvicella Tipo 021N Nocardia s, Tipo 0411, Tipo 1863, Tipo 185118 Tipo 021N y Microthrix parvicella Nocardia y Thiothrix Nostocoida, Tipo 0041 y Tipo 009219 Microthrix y Nocardia T 1702, T 021N, T 0211, T 0411 N. limicola, T 0411, T 0675, Thiothrix I y II, T 170120 Tipo 021N Microthrix parvicella Nocardia sp., Tipo 1702, Thiothrix21 Microthrix parvicella y Nocardia Tipo 1702 y Tipo 021N H.hydrossis, N. limicola II, Thiothrix I y II, T 0411, T 067524 Microthrix parvicella Nocardia spp. Thiothrix I25 Thiothrix II Tipo 021N Nocardia sp., N. limicola II, Tipo 0675, H. hydrossis26 Nocardia sp. Microthrix parvicella T 021N, T 1702, T 1851, N. limicola III, T 1863, T1701, T0411

NÚMERO TOTAL SP BACTERIANAS

0

2

4

6

8

10

12

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 24 25 26

participantes

nº total sp. media

1 72 53 64 25 36 47 38 59 8

10 511 412 313 414 415 216 717 518 719 1120 521 1024 325 626 9

MEDIA 5 VARIANZA 2,43

Nº TOTAL DE SP BACT. DETERMINADAS



De la información recogida en la Tabla 7 se extrae que la mayoría de los participantes identificó a la bacteria Microthrix parvicella como organismo dominante, en algunas ocasiones en conjunción con otro filamento como Nocardia o el Tipo 021N. Otro filamento identificado por la mayoría de los participantes fue el Tipo 021N, en algunas ocasiones cuantificado como filamento dominante y en otros casos como filamento secundario.

Entendemos que al tratarse de una muestra de importante densidad y diversidad bacteriana, el establecimiento de la especie dominante y del filamento secundario ha podido verse dificultado por esta circunstancia y por esto mismo que los resultados no hayan sido uniformes.

Otros filamentos identificados, bien entre los filamentos secundarios o entre los de observación incidental, han sido: Nocardia sp., Thiothrix sp., Haliscomenobacter hydrossis, Tipo 1701, Nostocoida limicola y Tipo 1702.

En el Anexo III, láminas 18-28, están ilustrados algunos de los microorganismos recogidos en los partes de resultado de los distintos laboratorios.

Respecto al principal efecto del crecimiento filamentoso sobre la estructura flocular, las observaciones han sido muy variadas y no pueden resumirse en el presente informe. Con relación a este apartado, sería conveniente recordar a los participantes que las consecuencias del crecimiento filamentoso han de ser resumidas como "disgregación flocular" y/o "formación de puentes interfloculares".

En líneas generales, han sido más abundantes los participantes que han recogido en su informe la disgregación flocular y la formación de puentes interfloculares (en algunos casos expresados como "esponjamiento del fango"), que aquellos participantes que no detectaron efectos del crecimiento filamentoso. Sin embargo, también han habido laboratorios que han recogido en su informe la ausencia de efectos del crecimiento filamentoso sobre la estructura del flóculo.

En relación con lo anterior, la categoría media de filamentos, extraída del total de participantes, ha sido moderada, de valor "3,1" por lo que se considera que la situación final sería la intermedia entre las categorías 3 y 4. Es decir, "filamentos en todos los flóculos, de 1-5 filamentos/flóculo"-"filamentos en todos los flóculos, de 5-20 filamentos/flóculo". Este resultado se encuentra en concordancia con un valor medio del IVF de 167 mL/g.

Por nuestra parte, nos gustaría llamar la atención a los participantes sobre la categoría seleccionada en el IF en su apartado de microscopía "filamentos en

flóculo", la cual siempre deberá mostrarse acorde con la seleccionada en el apartado destinado a filamentos, en la segunda hoja de trabajo.

La valoración de los filamentos en disolución se encuentra representada en la Tabla 8. Aunque algunos participantes no han especificado morfotipo o especie, la dispersión entre los datos aportados es alta y no puede extraerse ningún filamento en común.

Entre aquellos participantes que identificaron los filamentos en disolución, no siempre ha existido relación entre el filamento dominante identificado en el flóculo y el filamento hallado en disolución. La categoría asociada a los filamentos en disolución ha sido principalmente "0: pocos", aunque también han sido seleccionadas las categorías 1 y, en menor proporción la 2.

En cualquier caso, la cuantificación de filamentos en disolución no debe ser confundida con las definidas para filamentos en el flóculo, cuyos valores numéricos oscilan entre 0 y 6.

Tabla 8. Densidad de filamentos en disolución.

1 T 1863 y T 021N 02 - -3 - -4 - -5 - -6 Thiothrix I y Nocardia 07 - -8 No especifica 09 - -10 No especifica 011 No especifica 012 - -13 No especifica 014 No especifica 015 - -16 T 0675/ T1863 117 Nocardia, Tipo 0411, Tipo 1863 018 No especifica 119 Microthrix 120 - -21 Microthrix 124 No especifica 025 No especifica 226 Microthrix 1

FILAMENTOS EN DISOLUCIÓN


CARACTERIZACIÓN DE LA MICROFAUNA

- DENSIDAD PROTOZOARIA

El test de la Q de Dixon sugiere la invalidación de los resultados del participante 14, aunque también sería necesario destacar los datos de densidad aportados por los participantes 4 y 24, anormalmente altos. Nos pusimos en contacto con los participantes que presentaron los valores de densidad más desviados respecto a la media y, en la mayoría de los casos, encontramos errores en los cálculos realizados sobre los valores de recuento. En otras ocasiones, se debieron a recuentos realizados sobre cámaras de recuento y a aproximaciones de volumen y de densidad de individuos que llevaron finalmente a error.

Con relación a estos resultados, en próximos apartados, recordaremos cuestiones básicas relacionadas con las técnicas de recuento de microfauna.

Figura 5. Densidad de microorganismos (protozoos y metazoos) para cada uno de los participantes, asícomo la media y varianza calculadas. Descartado el participante 14 según el Test de la Q de Dixon.

DENSIDAD DE PROTOZOOS

0

2

4

6

8

10

12

14

16

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 24 25 26

participante

DENSIDAD PROTOZOARIA (10 exp 6) MEDIA

1 3,922 3,823 3,164 14,625 7,706 2,547 7,448 2,609 3,35

10 7,5611 9,4812 2,6613 4,6514 25,0015 2,8616 2,0017 2,0818 3,6419 3,7420 3,5221 3,3824 9,9225 1,5826 3,14


INTERV CONF


DENSIDAD PROTOZOARIA (10 exp 6)


- ÍNDICE DE SHANNON (H)

Para esta población de datos se ha aplicado el test de invalidación, el cual sugiere la eliminación del participante 14. La interpretación de la diversidad de la muestra según Shannon atiende a una interpretación compleja de dicho concepto, por el que especies de escasa densidad que sean recogidas en el cómputo total de individuos no son tenidas en cuenta en el valor global de este índice. La representatividad de los datos, en estrecha relación con el número de recuentos realizados y con el modo de proceder del analista, desempeña un papel decisivo.

El cálculo de Shannon y su interpretación serán tratados con mayor detalle en próximos apartados.

ÍNDICE DE SHANNON

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

3,50

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 25participante

ÍNDICE DE SHANNON MEDIA

1 1,2 2,3 1,4 1,5 0,6 2,7 1,8 1,9 1,

10 1,1711 1,4512 0,8613 2,5014 0,2115 2,9516 1,2517 1,9118 2,1619 0,9920 0,7721 1,2024 -25 2,5626 -



ÍNDICE DE SHANNON395138875859898950

Figura 6. Índice de Shannon para uno de los participantes, así como la media y varianza calculadas.Ningún participante descartado.


- ÍNDICE DE MADONI

En la figura anterior se recogen las categorías numéricas definidas por el total de participantes así como la clase asociada a cada una de ellas. Como se observa en la Figura 8, la coincidencia en cuanto a clase es muy reducida, encontrándose valores del SBI distribuidos entre las cuatro clases definidas. El análisis de esta situación se hará posteriormente, en el apartado de microfauna.

ÍNDICE DE MADONI

0

2

4

6

8

10

12

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 24 25 26

participante

ÍNDICE DE MADONI MEDIA

1 8 Clase I2 73 64 75 56 77 68 59 6

10 6 Clase II11 5 Clase III12 5 Clase III13 10 Clase I14 5 Clase III15 4 Clase III16 - -17 7 Clase II18 7 Clase II19 4 Clase III20 2 Clase IV21 7 Clase II24 7 Clase II25 8 Clase I26 2 Clase IV

MEDIA 6VARIANZ

Clase IIClase IIClase IIClase IIIClase IIClase IIClase IIIClase II

A 1,86

ÍNDICE DE MADONI

Figura 7. Índice de Madoni (1-10) para cada uno de los participantes, así como la media y varianzacalculadas. Ningún participante descartado.

CLASE MADONI

13%

48%

30%

9%

Clase IClase IIClase IIIClase IV

Figura 8. Clase Madoni (I-IV) definida por el total de participantes.


- N º ESPECIES DE PROTOZOOS

ae

aca

1 102 83 54 95 76 77 58 59 8

10 711 712 813 1114 615 1216 717 518 919 1020 621 1024 1225 1126 5


Nº DE ESPECIES (MICROFAUNA)

Nº ESPECIES (MICROFAUNA)

0

2

4

6

8

10

12

14

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 24 25 26participante

Nº DE ESPECIES (MICROFAUNA) MEDIA

Figura 9. Número de especies protozoarias identificadas por cada uno de los participantes.

De los resultados aquí recogidos se resalta el valor máximo, de 12 especies, portado por los participantes 15 y 24. En cualquier caso, la diversidad de species de situó siempre por encima de las 4 especies.

Para una mejor interpretación del valor del Índice de Shannon, se recomienda los participantes comparar los resultados recogidos en las figuras 6 y 9. Esta omparación permite entender que la diversidad medida con este índice responde un concepto más complejo que el número de especies.


- GRUPO FUNCIONAL DOMINANTE (PROTOZOOS)

1 Bacterívoros sésiles2 Bacterívoros sésiles3 Bacterívoros sésiles4 Bacterívoros sésiles5 Bacterívoros sésiles6 Bacterívoros sésiles7 Bacterívoros sésiles8 Bacterívoros sésiles9 Bacterívoros sésiles10 Bacterívoros sésiles11 Bacterívoros sésiles12 Bacterívoros sésiles13 Bacterívoros sésiles14 Bacterívoros sésiles15 Bacterívoros sésiles16 Bacterívoros sésiles17 Bacterívoros sésiles18 Bacterívoros sésiles19 Pequeños flagelados20 Pequeños flagelados21 Bacterívoros sésiles24 Bacterívoros sésiles25 Bacterívoros sésiles26 Pequeños flagelados

GRUPO DOMINANTE

Tabla 9. Grupo funcional dominante para cada uno de los participantes.

Como se puede observar en los datos aportados, la mayoría de participantes obtuvo densidades máximas para el grupo de los bacterívoros sésiles. De forma minoritaria, un sector de los participantes definió como grupo mayoritario al de los pequeños flagelados. Esta situación se analizará en apartados posteriores.

- LISTADO DE ESPECIES DE PROTOZOOS

En la Tabla 10 se recogen, por grupos funcionales, las especies de protozoos y los grupos de metazoos observados por la totalidad de participantes.

Como se deduce de la Tabla 10, se trata de una muestra de diversidad moderada (Figura 6), con un mínimo de cinco especies observadas y un máximo de doce para los participantes más expertos (Figura 9). En este sentido, consideramos que han debido de tener influencia factores como la experiencia del analista, el retraso con el que se realizó el análisis y el protocolo de conservación seguido. Respecto a este primer punto, la experiencia del analista, se recomienda que en el caso de que éste no disponga de los conocimientos


suficientes para identificar a nivel de especie, al menos, debe tratar de hacerlo a nivel de género o grupo funcional. En el caso de especies distintas con pertenencia a un mismo género, sería necesario recoger en el informe el número de especies observadas, aunque no se disponga de la información necesaria para identificarlo. Esta situación es muy frecuente en el género Vorticella, en el que se recomienda la identificación de las especies o complejos y especificar aquellas otras especies que se hayan observado pero no se hayan podido identificar como Vorticella sp.1, Vorticella sp.2, por ejemplo.

Tabla 10. Protozoos y grupos de metazoos observados por el total de participantes.

*Como Trachelophyllum sp. entendemos Acineria uncinata

En la Tabla 11 se recoge el total de especies observado por cada uno de los participantes.

Opercularia sp., Epistylis sp., Complejo Vorticella convallaria, Complejo Vorticella aquadulcis, Vorticella campanula, Vorticella sp., Complejo V. infusionum, Complejo V. microstoma, Vorticella striata, Campanella sp., V. banatica, Campanella umbelaria

Uronema sp., Glaucoma sp., Colpidium sp., Paramecium sp.

Bodonianos

Euglena sp., Peranema sp., Entosiphon sp., Grandes flagelados (sin identificar)

Amebas desnudas, Amoeba sp.

Difflugia sp. (restos)

Acineria sp., Acineria uncinata, Trachelophyllum sp.*, Aspidisca sp., Aspidisca cicada, Oxytricha sp., Bacterívoro reptante sin identificar

NematodosMetazoos

Amebas testáceas

Bacterívoros reptantes

Litonotus sp., Litonotus lamella, Spathidium sp., Hemiophrys sp.

Tokophrya sp., Podophrya sp.

Bacterívoros sésiles

Especies de protozoos y Grupos de metazoosPequeños flagelados

Grandes flagelados

Amebas desnudas

Carnívoros nadadores

Carnívoros suctores

Bacterívoros nadadores

En las láminas 9-17 del Anexo II, se incluyen ilustraciones de algunos de los organismos constituyentes de la microfauna, presentes en la muestra.


Tabla 11. Especies observadas por cada uno de los participantes.

PARTICIPANTE

Litonotus sp., Carnívoro nadador sin identificar, Aspidisca sp., Oxitricha sp., Complejo Vorticella convallaria, Complejo Vorticella aquadulcis14

Grandes flagelados, Amebas testáceas, Tokophrya sp., Uronema sp., Aspidisca sp., Acineria sp., Euplotes sp., Opercularia sp., Epistylis sp., Vorticella campanula, Vorticella sp., Rotíferos

15Entosiphon sp., Amebas desnudas, Vorticella striata, Campanella sp., Vorticella microstoma, Vorticella banatica, Rotíferos

16Litonotus sp., Aspidisca sp., Complejo Vorticella convallaria, Complejo V. aquadulcis, Complejo V.microstoma

17Amebas testáceas, Litonotus sp., Aspidisca sp., Acineria sp., Complejo Vorticella convallaria, V. sp1, V. sp2, Rotíferos, Nematodos

18Grandes flagelados, Amebas con testa, Litonotus sp., Aspidisca sp., Acineria sp., Oxitrichia sp., Complejo Vorticella convallaria, Complejo V. microstoma,

19 Complejo V. infusionumPequeños flagelados, Aspidisca sp., Acineria sp., Vorticella sp., Complejo Vorticella convallaria, Complejo Vorticella microstoma, Complejo V. infusionum

20Pequeños flagelados, Difflugia sp., Amoeba sp., Litonotus lamella, Aspidisca cicada, Acineria uncinata, Bacterívoro reptante sin identificar,

21 Complejo Vorticella convallaria, Complejo V. infusionum, Complejo V. microstoma, Vorticella sp., Nematodos

9

11

12 Podophrya sp., Aspidisca sp., Acineria sp., Opercularia sp., Complejo Vorticella convallaria, Complejo V. aquadulcis,Complejo V. infusionum, Nematodos

Grandes flagelados, Litonotus sp., Acineta sp., Aspidisca sp., Complejo Vorticella convallaria, Opercularia sp., Nematodos

Pequeños flagelados, Amebas desnudas, Aspidisca sp., Acineria sp., Complejo Vorticella convallaria, Vorticella sp., Complejo V. microstoma

Euglena sp., Amebas desnudas, Litonotus sp., Spathidium sp., Hemiophrys sp., Paramecium sp., Aspidisca sp., Euplotes sp., Epistylis sp., Carchesium sp.,Complejo V. convallaria, Campanela umbelariaAmebas testáceas, Litonotus sp., Aspidisca sp., Acineria sp., Bacterívoro reptante sin identificar, Epistylis sp., Complejo Vorticella convallaria, Vorticella sp., Complejo Vorticella microstoma, Complejo V. infusionum

Peranema sp., Amebas desnudas, Litonotus sp., Aspidisca sp., Acineria sp., Complejo Vorticella convallaria, Complejo Vorticella infusionum, Rotíferos

Vorticella sp., Complejo V. microstoma, RotíferosAmebas con testa, Litonotus sp., Colpidium sp., Aspidisca sp., Acineria sp., Bacterívoro reptante sin identif., Epistylis sp., Complejo V . convallaria

Litonotus sp., Trachelophyllum sp., Aspidisca sp., Opercularia sp., Complejo Vorticella convallaria, Complejo Vorticella microstoma, Nematodos

Amebas desnudas, Aspidisca sp., Acineria sp., Complejo Vorticella convallaria, Complejo Vorticella microstoma

Pequeños flagelados, Amebas desnudas, Litonotus sp., Aspidisca sp., Acineria sp., Complejo Vorticella convallaria, Complejo Vorticella microstoma

Acineria sp., Litonotus sp., Aspidisca sp., Complejo Vorticella convallaria, Complejo Vorticella infusionum, Complejo Vorticella microstoma, Amebas desnudas

Litonotus sp., Glaucoma sp., Aspidisca sp., Acineria sp., Opercularia sp., Epistylis sp., Complejo Vorticella convallaria, Complejo Vorticella aquadulcis,Complejo Vorticella microstoma

5Grandes flagelados, Litonotus sp., Aspidisca sp., Acineria sp., Bacterívoro reptante sin identificar, Complejo Vorticella convallaria, Vorticella sp.

3

10

24

26

6

7

4

8

13

25

1

2

ESPECIES OBSERVADASLitonotus sp., Tokophrya sp., Uronema sp., Paramecium sp., Aspidisca sp., Acineria sp., Opercularia sp., Complejo Vorticella convallaria, Complejo V. aquadulcis,Nematodos

Grandes flagelados, Litonotus sp., Aspidisca sp., Acineria sp., Complejo Vorticella convallaria, Vorticella campanula, Vorticella sp., Nematodos

Litonotus sp., Aspidisca cicada, Acineria sp., Complejo Vorticella convallaria, Complejo Vorticella infusionum


RELACIÓN DE PORCENTAJES DE PROTOZOOS

En la Tabla 12 se recoge la abundancia relativa de cada grupo funcional.

En cuanto a la densidad de amebas desnudas, se recuerda a los participantes que, si bien ha de ser tenida en cuenta en la valoración global de la muestra, para el cálculo del SBI (Método Madoni) es necesario que su densidad de población no esté incluida en la global de la muestra.

Tabla 12. Porcentajes de abundancia de los distintos grupos funcionales obtenidos por cada uno de losparticipantes. G. FLAG: grandes flagelados; AMEBAS: amebas desnudas; C. NADAD: carnívorosnadadores; C. SUCTOR: carnívoros suctores; B. NADAD: bacterívoros nadadores; B.REP: bacterívorosreptantes; B. SÉSIL: bacterívoros sésiles; METAZOOS: metazoos.

PARTICIPANTE G. FLAG (%) AMEBAS (%) A. TESTÁCEAS (%) C. NADAD (%) C. SUCTOR (%) B. NADAD (%) B. REPT (%) B. SÉSIL (%) METAZOOS (%)1 0 0 0 1 1 3 9 86 12 17 0 0 4 0 0 20 58 13 0 0 0 3,8 0 0 21,5 70,9 3,84 0 0 0 0,4 0 0,4 13,3 85,9 05 0 0 0 1 0 0 5 94 06 23 22 0 3 0 0 19 33 17 0 13 0 3 0 0 19 65 08 0 25 0 0 0 0 17 57 09 0 20 0 2 0 14 0 63 0

10 0 0 0 3,6 0 0 2,4 93,5 0,511 0 0 0 20 5 0 4 70 112 0 0 0 0 0 0 7 93 013 0 0 2,6 3,4 0 1,7 14,5 75,8 1,714 0 0 0 20 0 0 0 80 015 1,4 11,88 0 0 2,8 8,39 12,58 61,53 1,416 0 10 0 0 0 0 0 88 217 0 0 0 6,7 0 0 3,8 89,4 018 0 3,3 0 4,4 0 0 18,7 71,4 2,219 1 0 1 1 0 0 8 90 120 0 0 0 0 0 0 7 93 021 1 0 1 2 0 0 5 91 124 0 4,6 0 21,7 0 0 7,5 66,2 025 0 0 15 1 0 0 14 69 126 0 0 0 0 0 0 16,5 83,5 0


OTROS PARÁMETROS DE INTERÉS

En la Figura 10 se recogen los resultados referentes al ensayo de decantabilidad en probeta (V30), la concentración de sólidos en suspensión del licor mixto (SSLM), porcentaje de sólidos en suspensión volátiles (SSVLM) e índice volumétrico de fangos (IVF).

PARTICIPANTE V30 (mL/L) SSLM (mg/L) % SSVLM IVF (mL/g)1 338 1723 79,6 1962 290 1553 68 186,73 311 1668 73,6 186,64 250 2012 78,13 124,25 250 1872 76 1346 280 1136 - 246,57 270 1790 82 1518 250 1904 79 1319 300 1850 77 16210 340 1240 82 27411 270 1800 77 15012 290 1884 99 153,913 300 1790 79,8 16814 300 1902 78,1 157,715 290 1300 86,15 22316 325 - - -17 300 1922 83 15618 270 2200 77 12319 270 1809 78 14920 260 1820 79 14221 280 - - -24 263 1800 93,3 14625 280 - - -26 270 1877 77 144

MEDIA 285 1.898 80,1 167VARIANZA 25,6 256 6,66 40

PARTICIP DESCARTADO - 6 2 Y 12 10MEDIA CORREG - 1695,8 79,7 161,53

VAR CORREG - 218,4 4,45 32,0

Figura 10 (I). V30, SSLM y SSVLM, así como IVF para cada uno de los participantes, incluidaslas medias y varianzas. Participantes descartados: 6 (SSLM); 2 y 12 (%SSVLM) y 10 (IVF).

Ensayo de sedimentabilidad en probeta

050

100150200250300350400

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 25

participante

mL/

L

V30 (mL/L) Media


Índice volumétrico de fangos (IVF)

0

50

100

150

200

250

300

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 25

participante

mL/

g

IVF (mL/g) Media

Sólidos en suspensión del licor mixto (SSLM) y %

sólidos en suspensión volátiles (SSVLM)

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 25

participante

mg/

L

0

20

40

60

80

100

% v

olát

iles

% SSVLM SSLM (mg/L)

Media (SSLM) Media (%SSVLM)

6 hnosana

IN

Figura 10 (II) (continuación). V30, SSLM y SSVLM, así como IVF para cada uno de losparticipantes, incluidas las medias y varianzas. Participantes descartados: 6 (SSLM); 2 y 12(%SSVLM) y 10 (IVF).

Respecto a los datos de SSLM, tan sólo el correspondiente al participante ubo de ser descartado, quien expresamente se puso en comunicación con otros para explicarnos que se habían producido incidencias durante la lítica.

FORME "EJERCICIO INTERLABORATORIOS DE 22 DE Febrero de 2006" 27

5. CONCLUSIONES

■ VALORES MEDIOS ESTIMADOS DE LA MUESTRA ANALIZADA

En la Tabla 13 se recogen los valores "medios" de los principales parámetros que definen la calidad de la muestra estudiada, extraídos entre el total de datos aportados por los participantes.

Tabla 13. Valores medios estimados de la muestra analizada a partir de los resultadosobtenidos por el total de participantes.

ÍNDICE DE FANGO 65 (Bueno)3 a 4 (de "filam.en todos los flóculos, de 1-5 fil/flóc."a "filam. en todos los flóculos, de 5-20 fil/flóc.")

IDENTIFICACIÓN DE FILAMENTOS Microthrix parvicella, seguido de Tipo 021NDENSIDAD PROTOZOARIA APROXIMADA 4,6 x 106 ind/LÍNDICE DE SHANNON 1,5ÍNDICE DE MADONI 6CLASE MADONI Clase IINº DE ESPECIES ENCONTRADAS 8GRUPO DOMINANTE Bacterívoros sésilesRENDIMIENTO SEGÚN MADONI Fango estable y bien colonizado, actividad biológica

en descenso. Buen funcionamiento.V30 estimada 285 mL/LSSLM 1696 mg/LIVF 161 mL/g

CATEGORÍA BACTERIANA

RESULTADOS MEDIOS ESTIMADOS DE LA MUESTRA

■ CONCLUSIONES GENERALES

Las presentes conclusiones se han obtenido como compendio de las observaciones realizadas por los distintos participantes.

- Calidad previsible del agua tratada: regular-buena.

Nos encontramos ante una muestra en la que la turbidez y la presencia de microflóculos en suspensión han sido características valoradas por la totalidad de los participantes como "medias", sin que dicha turbidez fuese atribuida a la presencia de organismos filamentosos en disolución, característica microscópica que fue valorada mayoritariamente como "baja".

La sedimentabilidad quedó definida a partes iguales como "media" y "alta" entre el total de participantes.

El olor ha sido evaluado comúnmente como "correcto", aunque con apreciaciones como las siguientes: "olor de fango joven (inicio proceso), leve



falta de estabilización", "olor correcto, también con oxigenación correcta, pero de un repunte a mohoso o viejo, como si hubieran procesos degradativos".

En cuanto a las características microestructurales del fango, una apreciación comúnmente recogida por los participantes ha sido la presencia en el sistema de flóculos de buena mineralización y núcleo compacto, que contrastaban con otra población de flóculos más pequeños y más laxos en cuanto a su estructura.

La presencia de estos flóculos más pequeños o microflóculos, que probablemente aparecerán en el clarificado final, es atribuible a cambios en la operación del reactor y se considera causa suficiente para un empeoramiento de la calidad del clarificado, pese a una sedimentabilidad aceptable. No obstante, el origen principal de la calidad del clarificado, determinada como "regular", se considera que ha sido la turbidez.

Entre las causas de este desajuste del sistema, los participantes han barajado como posibilidades un brusco descenso de los sólidos en suspensión en el reactor por elevadas purgas de fango o por efecto de lavado por lluvias y, por otra parte, se ha contemplado la posibilidad de una sobrecarga orgánica.

En conclusión, nos encontramos ante un sistema en el que habitualmente los rendimientos depuradores deben ser buenos, pero que sin embargo ha sufrido algún tipo de desequilibrio en su operación, por el que tanto la turbidez como la presencia de microflóculos en el clarificado han experimentado un empeoramiento.

- Valoración de la calidad del fango y de la estabilidad del sistema: regular.

La densidad de microfauna media, extraída del total de participantes, indica que el fango activo estudiado se encuentra dentro de los límites de "normalidad" establecidos por el Método Madoni, superando el millón de individuos por litro. El grupo funcional establecido como dominante por la mayoría de participantes es el de "ciliados reptantes + ciliados sésiles y/o amebas testáceas", si bien ha habido analistas que han señalado al grupo de los pequeños flagelados como dominante.

En cualquier caso, la estabilidad del sistema ha sido valorada como "regular" por buena parte de los participantes, quienes han tenido en cuenta la presencia de pequeños flagelados, el valor medio del Índice de Shannon, de aproximadamente 1,5 y las Clases II-III según Madoni, determinadas por buena parte de los analistas.


Efectivamente, la convivencia en el mismo sistema de una población de ciliados sésiles y reptantes, que en el caso de los sésiles se encuentra dominada por Vorticella convallaria, son indicios suficientes para considerar que el sistema ha sido sometido a algún cambio o desajuste que justifique la presencia de una abundante población de pequeños flagelados. Más aún, la prácticamente inexistente población de ciliados bacterívoros nadadores de la muestra confirma el carácter de "estabilidad" que anteriormente debió presentar la microfauna de este reactor, en la que el crecimiento disperso debió ser muy reducido.

Sin embargo, una cuestión que ha pasado desapercibida por los participantes y que viene a confirmar lo expuesto anteriormente ha sido la población de amebas desnudas presente en esta muestra. Si bien esta población no tiene papel alguno en la determinación del SBI, ha de ser incluida en la valoración global de la muestra, como así queda especificado en el formato de recogida de datos. Concretamente, nos encontramos ante una población de amebas desnudas de aproximadamente el 20% del total, lo cual no es información despreciable para la valoración del sistema.

De hecho, las amebas desnudas, al igual que los flagelados, son poco frecuentes en el tratamiento biológico por fangos activos bajo condiciones estables de funcionamiento. Sin embargo, ambas poblaciones pueden aparecer de forma dominante en los estadios iniciales de colonización del reactor y durante fases de inestabilidad por sobrecarga. En concreto, la presencia de una sobrecarga orgánica en este sistema es un factor a barajar del que existen evidencias tanto estructurales (turbidez) como biológicas.

En el reparto de grupos funcionales también cabría destacar la presencia del ciliado bacterívoro Acineria uncinata, de ubicación incierta en el grupo de los reptantes o al menos muy discutida entre los especialistas, pese a las indicaciones del Profesor Madoni (Madoni, 1996). En este caso nos encontramos con una población de aproximadamente un 7-10% de ciliados reptantes, de la que más del 60% está formada por A. uncinata. Sin embargo, durante el mismo día de la toma de muestras, la población de este organismo era bastante más reducida que el día de estudio, consecuencia, probablemente, del aumento del crecimiento disperso en la misma. A. uncinata puede considerarse como un indicador de deficiente sedimentabilidad del fango (Serrano et al., 2004), cuya presencia puede estar asociada en este caso al deterioro de la muestra y a la liberación de bacterias y material soluble de los flóculos.

Por último, cabría señalar la reducida población de ciliados reptantes respecto a la de ciliados sésiles en la muestra, con predominio casi absoluto del grupo de las vorticelas. Un rápido aumento de la carga másica debido a pérdidas


o extracciones de fangos, carga orgánica introducida de modo discontinuo, etc. (Madoni, 1994), son causas que justifican la dominancia de este género dentro de la población de los ciliados sésiles. Por otra parte, la escasez de ciliados reptantes en la muestra confirma el carácter de ecosistema joven, circunstancia que será contrastada a continuación con el resto de la información.

- Tiempos de retención celular moderados y carga entrante moderada pero probablemente "alterada" en los días próximos al estudio.

La proporción de sólidos en suspensión volátiles del licor mixto (en torno al 80%) es indicativa de un fango activo de mineralización moderada y por tanto de una edad de fangos moderada-baja. Por su parte, la proporción de ciliados reptantes y sésiles (sésiles>>reptantes), al margen de la importante población de pequeños flagelados, sugiere igualmente un tiempo de retención celular moderado, en un sistema en el que la carga orgánica entrante no debe ser elevada de forma habitual pero en el que ha podido producirse una situación de desajuste de forma puntual. Esta situación de desajuste, podría ser debida a una sobrecarga puntual que explicase la presencia de pequeños flagelados, pese a la presencia de Vorticella convallaria.

Otra observación a recoger en torno al tiempo de retención celular de la presente muestra se refiere a la convivencia en el sistema, como se señaló anteriormente, de flóculos de fango activo de distinto grado de mineralización y, por tanto, edades del fango distintas. Esta valoración se ve reforzada por la coexistencia de bacterias filamentosas en el sistema, cuyos requerimientos de desarrollo en cuanto a edad de fangos son también distintos.

Por nuestra experiencia, recomendamos siempre que en la valoración global de una muestra sean atendidas las siguientes fuentes de información: estructuración del fango y crecimiento filamentoso, diversidad y estado de la microfauna. En este caso, siguiendo la metodología de trabajo propuesta, en la que todos estos aspectos son contemplados, nos encontramos comúnmente ante una muestra en la que los valores de los tres índices empleados, Índice de Fangos, Índice de Shannon y Método Madoni, presentan valores medios y concordantes entre sí.

Por nuestra parte, invitamos a los participantes a contrastar algunas de las teorías aquí presentadas con los datos recogidos en el estudio respirométrico (Anexo III).

■ CONCLUSIONES DE CADA APARTADO

ÍNDICE DE FANGO

Los resultados obtenidos en cuanto a características macroscópicas que han presentado mayor dispersión han sido los relacionados con la turbidez y los flóculos en suspensión.

Sedimentabilidad y olor han sido parámetros más coincidentes, aunque en el caso de la sedimentabilidad el reparto ha sido al 50% entre las categorías "alta" y "media". Como se verá a continuación, la sedimentabilidad es un parámetro fácilmente entendible pues, a diferencia con la turbidez y los flóculos en suspensión, puede ser caracterizado atendiendo a criterios menos subjetivos. En el Anexo I se recoge la forma de valorar este parámetro.

La sedimentabilidad fue definida como "media" y "alta", con un 50% para ambas categorías. Sin embargo, para definir este parámetro correctamente, es necesario anotar el valor del volumen de fango decantado a los 10, 20 y 30 minutos (V10, V20 y V30) y, en función a la secuencia de sedimentación, realizar una valoración general sobre dicho parámetro.

A continuación se adjuntan las secuencias de sedimentación aportadas por dos participantes, con las que se podrá revisar este concepto:


Participante Vn Volumen (mL) Expresión para estimación

V10 508 = 0,74

V20 368 = 0,95P 1

V30 338

V10 450 = 0,75

V20 320 = 0,93P 19

V30 270

min 30 t 0t

min 10 t 0 t

aVolumen -aVolumen aVolumen - aVolumen

==

==

min 30 t 0t

min 02 t 0 t


==

==

1 aVolumen -aVolumen aVolumen - aVolumen

min 30 t 0t

min 03 t 0 t=

==

==

min 30 t 0t

min 10 t 0 t


==

==

min 30 t 0t

min 02 t 0 t


==

==

1 aVolumen -aVolumen aVolumen - aVolumen

min 30 t 0t

min 03 t 0 t=

==

==

Como se recoge en el Anexo I, las secuencias de sedimentación, en ambos casos, se corresponden con la categoría "alta" pues, transcurridos 10 minutos, el volumen de fango decantado con relación al volumen compactado a los 30 min es superior a 0,5. Tal y como se observa en el "Gráfico de sedimentabilidad", en el que se representa gráficamente la evolución temporal de la V30, el mayor volumen de fango depositado en la probeta se corresponde con los 10 minutos iniciales.

Dados los valores expuestos anteriormente, concluimos que el participante 1 definió mal el parámetro sedimentabilidad.

Gráfico de sedimentabilidad

0100200300400500600700

5 10 15 20 30

Tiempo (min)

Volu

men

(mL)

V30

Por nuestra parte, añadir que la turbidez fue uno de los parámetros que sufrió una evolución más negativa desde la toma de muestras. Por tratarse de un fango joven, y del que es esperable una evolución importante de las características macro- y microscópicas del mismo, realizamos un estudio de los parámetros macroscópicos durante el día de la toma de muestras. Así los resultados podrían ser comparados con los del día siguiente, en el que todos los participantes estábamos convocados a realizar el estudio (22/II). De dicho análisis hemos obtenido que la turbidez ha sido el parámetro que ha evolucionado más rápidamente, pasando de presentar turbidez "baja" durante el día de la toma de muestras, a presentar turbidez "media" en el día de estudio. El resto de parámetros, en especial la sedimentabilidad, no experimentaron cambios de consideración.

La turbidez ha quedado definida principalmente por la categoría "media", con un 66,5%, mientras que el resto de participantes se repartió entre las categorías "baja" y "alta", con porcentajes del 21% y 12,5%, respectivamente. Como se recoge en el "Procedimiento operativo para las hojas de trabajo", es necesario colocar un objeto en la parte posterior de la probeta, en la fracción


correspondiente al clarificado, para catalogar la turbidez de la muestra en función del grado de definición de dicho objeto.

Los flóculos en suspensión fueron definidos con la categoría "media" por el 71% de los participantes, siendo las categorías "alta" y "baja" el 25 y 4%, respectivamente.

La definición del olor para el total de participantes fue "correcto".

Atendiendo a las características "medias" extraídas de los datos aportados por los participantes, la muestra quedaría definida en cuanto a sus características macroscópicas de la siguiente manera:

Parámetro Categoría más frecuente

Turbidez Media

Flóculos en suspensión Medio

Sedimentabilidad Alta

Olor Correcto

En cuanto a las características microscópicas, a modo de resumen, se recogen las categorías seleccionadas con mayor frecuencia por los participantes:

Parámetro Categoría más comunes y frecuencia asociada (%)

Forma Irregular (67%)

Tamaño Medio (83%)

Estructura Media (58%) / Compacta (42%)

Textura Fuerte (83%)

Cobertura 10-50% (96%)

Filamentos en flóculo 5-20 filamento/flóculo (58%)

Filamentos en disolución Baja (87,5%)

Diversidad protozoos 4-7 sp. (50%) / > 7 sp. (46%)



Con relación a las características microscópicas, aquellas que presentaron mayor dispersión fueron la estructura, que se distribuyó entre las categorías "media"(58%) y "compacta"(42%), filamentos en flóculo repartida entre las categorías "<5 filamentos/flóculo"(42%) y "5-20 filamentos/flóculo"(58%) y diversidad de protozoos, distribuida entre las categorías ">7 sp."(46%) y "4-7 sp."(50%).

Sobre la característica estructura, sería conveniente señalar que el importante reparto entre las categorías "media" y "compacta", probablemente, tenga su explicación en la presencia de flóculos en el sistema con distinto estado de mineralización, situación sobre la que ya se ha comentado en apartados anteriores y que queda ilustrada en el Reportaje fotográfico (Anexo II).

En cuanto a la presencia de filamentos en flóculo, la categoría más frecuentemente seleccionada ha sido "5-20 filamentos/flóculo", es decir, el equivalente a una categoría numérica 4. En este caso, sería conveniente recordar a los participantes que es necesario que exista concordancia entre la categoría de filamentos en el flóculo seleccionada en la "hoja de trabajo" relativa al IF y la posteriormente seleccionada en la destinada al estudio de microorganismos filamentosos. Se sugiere a los participantes la revisión de este apartado.

La diversidad de protozoos, sin embargo, es un parámetro que depende de la experiencia del analista. En el caso que nos ocupa, la densidad de población de ciertas especies fue tan reducida que probablemente se trata de la causa de que ciertas especies no hayan sido recogidas en el parte de resultados de algunos participantes, con el consecuente descenso en diversidad de la muestra. De nuevo, se recuerda a los participantes la necesidad de que este parámetro se muestre en concordancia con el número de especies observadas en la "hoja de trabajo" destinada al estudio de microfauna.

Contrariamente, las características con menor dispersión fueron: forma, con predominio de la categoría "irregular", tamaño con predominio de la categoría "medio", la categoría "fuerte" para la textura, cobertura del "10-50%" y presencia de filamentos en disolución "baja".

El IF ha resultado con un reparto en categorías como sigue: 69,5% "Bueno", 21,7% "Regular" y 8,7% "Óptimo" (Figura 3). Estos resultados permiten definir el IF de esta muestra como "Bueno", con una puntuación comprendida en el intervalo 60-79.

Finalmente, en el apartado "observaciones" incluido en la primera "hoja de trabajo", han sido escasas las anotaciones realizadas, que han apuntado comúnmente hacia:


- Presencia de "bacterias helicoidales" (Espirilos y Espiroquetas)

- Ausencia/presencia moderada de "fibras orgánicas"

- Presencia moderada de "Zoogloea sp."

- Ausencia/presencia moderada de "partículas inorgánicas"

- Ausencia de "burbujas"

- "Color" marrón claro

- Ligero "hinchazón"

- Ligera presencia/ausencia de "espumas"

DENSIDAD Y DIVERSIDAD DE PROTOZOOS

En líneas generales podría calificarse a ésta muestra como moderadamente diversa y con una densidad de población alta (4,6 x 106 ind/L), atendiendo al histórico de datos de los ejercicios interlaboratorios organizados por GBS, en los que rara vez se superó el valor de densidad de 2,5 millones de individuos por litro.

La densidad de protozoos ha sido especialmente dispersa, siendo necesario eliminar los valores aportados por algunos participantes (participante 14), y señalando como anormalmente elevados los de los participantes 4 y 14.

Algunas sugerencias para evitar errores en el cálculo de densidad de microfauna son las siguientes:

- Realizar, al menos, tres réplicas del recuento de microfauna y calcular medias. El volumen de suspensión recomendado para cada recuento es de 25 µL.

- En el recuento deben incluirse los organismos que hayan quedado aislados en los reboses del cubreobjetos.

- Si se utilizan micropipetas automáticas para la medida de volumen, es recomendable cambiar las puntas en cada toma de muestra para el recuento. Se aconseja también secar el exterior de la punta antes de depositar el contenido en el portaobjetos.

- Las colonias muy numerosas de peritricos falsean los resultados finales de los recuentos (Anexo II). En este caso, el procedimiento a seguir es el siguiente: realizar los recuentos de organismos y si aparece una colonia grande, obviarla en el resultado final. Una vez concluido el recuento, se efectúan dos nuevos recuentos y esta vez sólo se contabilizan individuos de la especie


colonial. Una vez terminado, se sustituyen los valores del colonial en los dos recuentos iniciales.

- Es necesario no incluir el valor de amebas desnudas en el total de población. En el caso de que existan amebas testáceas, tan sólo se contabilizarán aquellas que se encuentren activas. En ambos casos, estas circunstancias están incluidas en el Anexo I.

El número de especies identificadas se ha repartido al 50% entre las categorías 4-7 especies y >7 especies, siendo el valor medio de especies identificadas de 8.

La determinación del grupo funcional dominante para el cálculo del SBI ha sido el de "ciliados sésiles + ciliados reptantes y/o amebas testáceas", aunque un 12,5% de los participantes determinó que el grupo funcional dominante era el de los pequeños flagelados. Respecto a esta situación, entendemos que la causa principal se sitúa en el valor del número de pequeños flagelados contabilizados en la cámara Fuchs-Rosenthal que, atendiendo a los valores aportados por algunos participantes, en algunos casos superó el valor de 100 y en otros se situó muy próximo a éste.

Principales grupos de organismos observados y notas sobre su morfología

Las notas sobre las características morfológicas de los organismos aquí expuestas y otras consideraciones sobre el SBI, han sido tomadas de la siguiente bibliografía:

Foissner, W. y Berger, H. (1996). A user-friendly guide to the cilates (Protozoa, Ciliophora) commonly used by hidrobiologists as bioindicators in rivers, lakes, and waste waters, with notes on their ecology. Freshwater Biology 35, 375-482.

Foissner, W., Berger, H. y Kohmann, F. (1992). Taxonomische und ökologische revision der ciliaten des saprobiensystems. Band II: Peritrichia, Heterotrichida, Odontostomatida. Informationsberichte des Bayerischen Landesamtes für Wasserwirtschaft. München.

Foissner, W., Berger, H. y Kohmann, F. (1994). Taxonomische und ökologische revision der ciliaten des saprobiensystems. Band III: Hymenostomata, Prostomatida, Nassulida. Informationsberichte des Bayerischen Landesamtes für Wasserwirtschaft. München.

Foissner, W., Berger, H., Blatterer, H. y Kohmann, F. (1991). Taxonomische und ökologische revision der ciliaten des saprobiensystems. Band I: Cyrtophorida, Oligotrichida, Hypotrichia, Colpodea. Informationsberichte des Bayerischen Landesamtes für Wasserwirtschaft. München.

Foissner, W., Berger, H., Blatterer, H. y Kohmann, F. (1995). Taxonomische und ökologische revision der ciliaten des saprobiensystems. Band IV: Gymnostomatea, Loxodes, Suctoria. Informationsberichte des Bayerischen Landesamtes für Wasserwirtschaft. München.

Madoni, P. (1994). A sludge biotic index (SBI) for the evaluation of the biological performance of activated sludge plants based on the microfauna analysis. Wat. Res. 28, 1, 67-75.

Serrano, S., Pérez-Uz, B., Arregui, L. y Calvo, P. (2004). Claves de identificación de protistas en estaciones depuradoras de fangos activos. Curso: Protozoos en el fango activo. Fundación Emasesa, Sevilla.

Streble, H. y Krauter, D. (1987). Atlas de los microorganismos de agua dulce. La vida en una gota de agua. Ed. Omega, Barcelona.

Warren, A. (1986). A revision of the genus Vorticella (Ciliophora: Peritrichida). Bull. Br. Mus. Nat. Hist. (Zool). 50, 1, 1-57.

Amebas desnudas

La presencia de amebas desnudas ha sido recogida por la casi totalidad de los participantes, tal y como se resume a continuación:

Nivel amebas desnudas Frecuencia Categoría 0 5 Categoría 1 5 Categoría 2 9

No responden 5

Es decir, la mayoría de los participantes estimó una densidad media "valor numérico 2".

Es importante recordar a los participantes que la población de amebas desnudas, a efectos del cálculo del SBI, no debe ser incluida entre la población total. En el caso que nos ocupa, en el que las amebas desnudas estaban presentes en la muestra, el valor final de densidad puede quedar alterado así como el reparto de grupos funcionales, si dicha población es incluida entre la de protozoos. Como ejemplo, se ha incorporado la población de amebas desnudas contabilizadas por uno de los participantes al resto de individuos tenidos en cuenta para el cálculo del SBI.


El papel de las amebas desnudas en fangos activos ha pasado, en general, desapercibido salvo en algunos estudios de patogenicidad y de sus simbiontes (p.ej. Legionella). Estos organismos presentan una distribución cosmopolita, con importancia en distintos ecosistemas, aunque desgraciadamente no está estudiado adecuadamente y en muchas ocasiones se menosprecia su diversidad, abundancia, etc. Su forma de sobrevivir en condiciones adversas puede ser mediante la formación de quistes y en otras ocasiones manteniendo un mínimo poblacional en el ecosistema, para desarrollar un bloom poblacional cuando se produce un acumulamiento temporal del alimento. Los sistemas de transporte y permeabilidad de sus membranas les permiten sobrevivir en ambientes con fuentes reducidas de C y N.



Parte del importante papel que juegan es el de consumidores de bacterias, aunque también se alimentan de algunos protozoos y otras amebas. Este puede ser el caso de esta muestra, en la que se ha podido liberar parte del material del flóculo o bien se ha producido una sobrecarga, circunstancias en ambos casos que han podido producir este nivel de amebas desnudas, en torno al 20% de la población total de protozoos.

En este ejemplo, la densidad original de 3,74 x 106 ind./L queda alterada y aumentada a 4,5 x 106 ind./L.

Las descripciones de algunos de los géneros recogidos por los participantes en el grupo de las amebas han sido:

Amoeba sp.: célula ameboide, polipoidal con pseudópodos tipo lobópodo. Núcleo vesicular, con muchos gránulos periféricos o endosoma (nucleolo) patente. Normalmente con una vacuola contráctil.

Aunque esta población no es tenida en cuenta para el cálculo del SBI, es relevante recoger su presencia, pues este grupo de organismos es poco frecuente en tratamientos biológicos por fangos activos en condiciones estables de funcionamiento, pero su presencia de forma dominante está asociada a estadios de colonización de la planta junto con los flagelados, así como a fases de inestabilidad por sobrecarga en el reactor.

Bacterívoros reptantes:

Algunos de los ciliados reptantes identificados dentro de este grupo funcional han sido:

Aspidisca cicada (sinónimo de Aspidisca costata): ciliado de cuerpo redondeado con crestas dorsales patentes y cirros en el lado ventral. Cirros frontales y transversos muy desarrollados. Son característicos los cirros transversos que emplea para desplazarse como si fueran “patas”. Tamaño: 25-40 µm.

Acineria uncinata: forma corporal lanceolada con una pequeña torsión del extremo anterior hacia el lado izquierdo. Dos macronúcleos en la parte media y una vacuola contráctil en el polo anterior. Tamaño de 30-60 µm de longitud. Puede confundirse in vivo con la especie Trachelophyllum pusillum, por lo que es necesario recurrir a técnicas de impregnación argéntica para efectuar su correcta identificación. Sin embargo, T. pusillum no es frecuente en fangos activos y hasta muy recientemente su identificación se ha venido realizando de forma errónea.


En el caso de aquellos participantes que incluyeron en su parte de resultados a Trachelophyllum sp., hemos entendido que se referían a Acineria uncinata. Pese a la controversia existente entre los especialistas en cuanto a su ubicación en el grupo funcional de los bacterívoros nadadores o bacterívoros reptantes, para la determinación del SBI debe ser incluido en el grupo de los bacterívoros reptantes.

Oxytricha sp.: Cuerpo elipsoidal con extremo posterior redondeado. Cirros marginales derechos e izquierdos en dos filas que se juntan en el extremo posterior. Núcleo dispuesto en dos porciones. ZAM bien desarrollada en la zona anterior. Tamaño: Dependiente de la especie, así p.ej. O. setigera (60-80 µm) y O. fallax (130-180 µm).

Ciliados sésiles bacterívoros:

A continuación se muestran algunas características morfológicas con relación a los microorganismos sésiles detectados por los distintos participantes:

Complejo Vorticella convallaria: zooide de 22-55 µm de ancho y 40-120 µm de largo con forma de campana esbelta; pedúnculo de 100-500 µm de longitud. Vacuola contráctil situada en el tercio anterior del zooide y abundantes vacuolas alimenticias. Macronúcleo en forma de "J". Labio peristomial de diámetro igual o ligeramente superior al cuerpo.

V. campanula: zooide de 50-157 µm de largo (media 68 µm) y 35-99 µm de ancho (media 58 µm) con forma de campana invertida; constricción bajo el labio peristomial; vacuola contráctil situada en el primer tercio superior de la célula; macronúcleo en forma de "J", situado longitudinalmente al cuerpo; citoplasma con numerosos gránulos refringentes; pedúnculo estriado y largo (incluso >500 µm).

Complejo Vorticella microstoma: zooide de 22-50 µm de ancho y 35-85 µm de largo, con forma de campana invertida; pedúnculo fino de aproximadamente 6 veces la longitud del cuerpo. Gránulos en el endoplasma, estriación en el borde del peristoma y macronúcleo en "C" fácilmente diferenciable. Es muy característica la constricción en la zona anterior del peristoma, de menor anchura que el cuerpo celular.

Complejo Vorticella infusionum: zooide de 35-60 µm de largo y 50 µm de ancho con forma de campana invertida con un labio peristomial bien desarrollado de 55 µm de ancho. Vacuola contráctil situada justo debajo del centro del zooide; macronúcleo en forma de "J". Pedúnculo delgado de más de 80 µm de largo.


[Según indicaciones del Profesor Madoni, Vorticella microstoma y Vorticella infusionum están incluidas en el mismo grupo a efectos del SBI. No así para el cálculo del Índice de Shannon, para el que han de ser tenidas en cuenta como especies distintas].

En cualquier caso, nos gustaría resaltar la conveniencia de descartar las grandes colonias de ciliados sésiles (más de 50 individuos, aproximadamente), que aparezcan durante la observación. En ese caso, ese dato habría de ser eliminado y debería realizarse un recuento específico para la especie observada.

Género Opercularia: individuos de la colonia no contráctiles; estrechamiento en la parte superior del zooide sin forma de embudo. Presencia de opérculo y ausencia de labio peristomial. A nivel especie, el pedúnculo es una característica diferenciadora.

Género Epistylis: ciliado colonial de pedúnculo ramificado sin capacidad contráctil (sin espasmonema). Los zooides presentan labio peristomial. Tamaño: 70-90 µm (zooide); colonias hasta 2-3 mm. Presentes frecuentemente en sistema de fangos activos que trabajan a medias cargas.

Campanella umbellaria: Peritrico colonial de grandísimas dimensiones. Disco peristomial con ciliación oral dispuesta en tres espirales. Tamaño: 150-250 µm (zooide). Asociado a medias cargas en el reactor.

Bacterívoros nadadores:

Las características más importantes para la determinación de estos organismos son las siguientes:

Género Uronema: cuerpo ovoide con polo anterior aplanado y carente de ciliación somática. Cilios somáticos largos, de los que destaca el cilio caudal, de mayor longitud que el resto. Vacuola contráctil posterior. Tamaño 30-50 µm.

Género Paramecium: cuerpo celular similar al de una "suela de zapato". Vacuolas pulsátiles estrelladas. Cilios caudales más largos que el resto de cilios somáticos. Macronúcleo ovoide y un único micronúcleo. Depresión que se extiende desde el extremo anterior hasta el vestíbulo oral.

Género Colpidium: Tamaño y formas variables: redondeada, ovalada, alargada, cilíndrica, arriñonada. Citostoma pequeño, triangular, situado a 1/4 del polo anterior. Macronúcleo esférico, micronúcleo; vacuola contráctil. Tamaño: 50-155 µm (depende de la sp.).Frecuente en aguas muy contaminadas. Presente en las primeras fases de colonización del fango. Ineficiencia biológica de la depuración.


Carnívoros nadadores:

La densidad de población de este grupo funcional ha sido escasa, recayendo sobre los siguientes géneros:

Género Litonotus: cuerpo fusiforme, aplanado lateralmente. Citostoma ventral alargado. Ciliación somática diferente a ambos lados del cuerpo. 2 macronúcleos y un micronúcleo. Tamaño del cuerpo celular: 80-100 µm. Dentro de este género, por haber sido recogido en el parte de resultados de un participante, se destaca a Litonotus lamella, con las siguientes características: Forma lanceolada con la parte anterior inclinada ligeramente hacia el lado dorsal. Tamaño: 200 µm de largo. Relacionado positivamente con el índice volumétrico de fango y con la concentración de amoníaco en el influente.

Género Spathidium: Citoplasma con granulaciones y a veces zooclorelas; macronúcleo ovoide o acintado (depende de la sp.); vacuola contráctil; citostoma en el extremo anterior del cuerpo, que presenta distinto aspecto según la especie: truncado oblicuamente, más aplanado, etc. Tamaño: 40-300 µm (depende de la sp.). Poco frecuente en fangos activos.

Carnívoros sésiles:

En este grupo se han recogido especies como Tokophrya sp. y Podophrya sp. Algunas de las características morfológicas de estos dos organismos son las siguientes:

Tokophrya sp.: cuerpo celular piriforme o cónico, con dos o cuatro fascículos de tentáculos dispuestos en la región anterior del cuerpo. Macronúcleo más o menos esférico.

Podophrya sp.: Forma esférica u ovoide. No existe lóriga. Tentáculos distribuidos por toda la superficie del cuerpo. Macronúcleo esférico.

Grandes flagelados:

La presencia de grandes flagelados fue recogida por gran parte de los participantes, quienes identificaron, principalmente, al género Peranema.

Género Peranema: célula alargada, muy elástica, con extremo posterior amplio y redondeado o truncado cuando la célula está en movimiento. La apertura del reservorio donde se anclan los flagelos está en el extremo anterior. Presenta dos flagelos: uno libre y largo, que en movimiento deslizante tiene aspecto rígido con el extremo libre y apunta en la dirección del movimiento; otro


flagelo es corto y recurrente, adherido a la película. Núcleo central. Vacuola contráctil posterior.

Género Entosiphon: células de forma redondeada y rígidas, con un tamaño comprendido entre 20-25 µm. Se caracteriza por presentar costillas longitudinales visibles. Dos flagelos, uno dirigido hacia delante y el otro hacia detrás.

Pequeños flagelados:

Los pequeños flagelados han sido recogidos en el parte de resultados de varios participantes, quienes han reconocido al género Bodo.

Género Bodo: células pequeñas, ovoides, arriñonadas o piriformes con núcleo central o anterior. Dos flagelos diferentes en posición subapical.

Metazoos:

Dentro de este grupo han sido observados Rotíferos y Nematodos, pero a baja densidad de población.

ÍNDICE DE MADONI E ÍNDICE DE SHANNON

Las clases Madoni mayoritariamente definidas han sido la II y III, con porcentajes de reparto entre estas dos categorías del 48 y 30%, respectivamente. En ambos casos, el grupo funcional dominante ha sido el de los bacterívoros sésiles, con una presencia de pequeños flagelados comprendida entre los 10-100 pequeños flagelados en la diagonal de la cámara de Fuchs-Rosenthal, lo que determina el ingreso en la tabla de doble entrada a través del grupo "ciliados reptantes+sésiles+y/o amebas testáceas". La inclusión en una u otra clase ha estado determinada por el número de especies observadas.

En el caso de la Clase I, los analistas contabilizaron <10 pequeños flagelados y el grupo funcional dominante fue nuevamente el de los bacterívoros sésiles, acompañado de una diversidad de especies superior a 8.

Por último, aquellos participantes que determinaron la Clase IV, determinaron como grupo dominante el de los pequeños flagelados, al contabilizar más de 100 pequeños flagelados en la diagonal de la cámara Fuchs-Rosenthal y una diversidad inferior a 8 especies. Sin embargo, también ha habido un participante que determinó la clase III, para el que el grupo dominante fue el de los pequeños flagelados, en este caso con mayor diversidad de especies.

Por nuestra parte, esta dispersión de los datos tan sólo puede tratarse explicando a los participantes la forma de realizar el recuento de pequeños flagelados en la cámara de Fuchs-Rosenthal, pues han sido varias las consultas que se han realizado a este respecto y creemos se trata del principal motivo de dispersión.

En el siguiente esquema, a la izquierda, se presenta un esquema de la cuadrícula completa con los 16 cuadrados grandes, mientras que a la derecha se presenta un esquema de lo que sería una vista ampliada de uno de los cuadros grandes. Tal y como se señala en el esquema con la flecha azul, es necesario realizar el cómputo de pequeños flagelados en los cuadritos que forman la diagonal central completa, en la que estarían incluidos 16 cuadrados pequeños.

1 mm

1 mm

0,25 mm 0,25 mm

Esquema de la cámara Fuchs-Rosenthal.

Otro error común ha sido la asignación de la clase Madoni al valor de SBI determinado. Por esa razón adjuntamos la tabla con las correspondientes correspondencias entre SBI, clase y diagnosis:

SBI Clase Diagnosis

8-10 I Fango estable y muy bien colonizado, excelente actividad biológica y muy buen funcionamiento

6-7 II Fangos estable y bien colonizado, actividad biológica en descenso; buen funcionamiento

4-5 III Depuración biológica insuficiente en la balsa de aireación; funcionamiento medio

0-3 IV Depuración biológica escasa en la balsa de aireación; bajo rendimiento


En cuanto al Índice de Shannon, los resultados obtenidos por los distintos participantes han resultado bastante dispersos (Figura 6), descartándose al participante 14 según el test de la Q de Dixon y destacándose el resultado del participante 15, aunque sin ser descartado.

Se recuerda a los participantes que para el cálculo de este índice se han de tener en cuenta todas las especies de microorganismos observadas (protozoos y metazoos), independientemente del tratamiento que se siga con éstas para el Método Madoni. De igual forma, atendiendo a las consultas realizadas por los participantes, se recomienda el cálculo de este índice empleando la expresión que utiliza el logaritmo en base 2.

Como se comprueba en el siguiente ejemplo, en el que la población de microorganismos es la misma, la aplicación de logaritmo neperiano o logaritmo en base 2 puede alterar el valor final de este índice.

ÍNDICE DE SHANNON Y WEAVER (1949)

Nº ind de la sp A Pi log2 Pi Pi ( log2 Pi )80 0,200 -2,322 -0,46480 0,200 -2,322 -0,46480 0,200 -2,322 -0,46480 0,200 -2,322 -0,46480 0,200 -2,322 -0,464

Total de indiv = 400 H = 2,322 bit

ÍNDICE DE SHANNON Y WEAVER (1949)

Nº ind de la sp A Pi ln Pi Pi ( ln Pi )80 0,200 -1,609 -0,32280 0,200 -1,609 -0,32280 0,200 -1,609 -0,32280 0,200 -1,609 -0,32280 0,200 -1,609 -0,322

Total de indiv = 400 H = 1,609



Si existe alguna duda respecto a su aplicación, se ruega a los participantes se pongan en contacto con nosotros. En el Anexo I se recoge información sobre este índice.

IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES BACTERIANAS

En la Tabla 16 se recogen conjuntamente las características que describen a los organismos filamentosos más frecuentes en la muestra según la evaluación de los distintos participantes (Jenkins et al., 1993 y Seviour y Blackall, 1999). La mayoría de estos organismos están recogidos en el Anexo fotográfico.

De los datos observados en esta tabla se deduce que el microorganismo identificado más comúnmente, incluido entre las categorías "dominante" (de forma compartida o no con otro filamento) y "secundaria" ha sido Microthrix parvicella. El Tipo 021N también ha sido identificado e incluido en estas mismas categorías con bastante frecuencia. Al tratarse de filamentos con claras diferencias en cuanto a morfología y reactiva a tinciones, entendemos que este reparto se debe a la diversidad de la muestra y a la distinta valoración que los analistas realizaron sobre estos filamentos.

Secundariamente, varios analistas han recogido a Thiothrix sp. entre el grupo de los filamentos dominante y secundario, los cuales sí entendemos pueden deberse a un error en cuanto a identificación, quizás con el filamento Tipo 021N. Si bien este filamento, Thiothrix sp., fue observado en la muestra e incluido entre el grupo de los filamentos de observación menos frecuente u observación incidental, no consideramos que deba ser incluido entre los más abundantes. En la Tabla 16 se pueden comprobar las semejanzas a nivel óptico entre estas dos bacterias filamentosas. Como puede observarse, las diferencias son sutiles cuando la morfología celular del Tipo 021N es "cuadrada" o "rectangular" y coincide con la de Thiothrix sp. En algunas ocasiones, incluso, la gruesa pared celular del morfotipo 021N puede confundirse con una vaina. Frecuentemente, la presencia de gránulos de azufre en ambos filamentos dan lugar a que ciertas partes del filamento aparezcan como Gram positivas, ofreciendo un aspecto bastante parecido bajo la tinción Gram. Sin embargo, la presencia de gránulos de azufre in situ, suele ser más habitual en el caso de Thiothrix sp. que en el del Tipo 021N, pero no por ello se trata de una característica distintiva que excluya a este último.

Tabla 16. C

aracterísticas morfológicas y reacción a tinciones de los filam

entos más abundantes en la m

uestra según criterio de los distintos participantes.



Organismos de observación secundaria:

Entre los organismos identificados como secundarios se encuentran: Nocardia sp., Thiothrix I, Haliscomenobacter hydrossis, Tipo 1701 y Tipo 1702.

Entendemos que Nocardia y el grupo de los Nocardioformes no presentan dificultad en cuanto a su identificación, por lo que no han sido incluidos en la Tabla 16. En el caso de H. hydrossis nos gustaría señalar la presencia de crecimiento epifítico en esta muestra, de la misma manera que en el caso de los filamentos 1701 y del poco frecuente morfotipo 1702. En este último caso, mencionar que, en la última edición del manual de Jenkins, el Tipo 1702 ni siquiera es descrito por su reducida frecuencia de aparición. En el caso del manual de Seviour y Blackall, la descripción de este filamento incluye un aspecto que consideramos novedoso con relación a la documentación disponible en castellano (Tabla 16): la presencia, aunque de forma moderada, de crecimiento epifítico en el Tipo 1702. Ya que algunos participantes han recogido la presencia de este filamento entre sus resultados, nos ha parecido interesante recoger esta información que, probablemente, justifique la inclusión de este filamento entre las bacterias filamentosas observadas en la muestra. Por nuestra parte, tan sólo podemos afirmar que dada la gran similitud entre H. hydrossis y el morfotipo 1702, tan sólo un estudio a nivel molecular podría confirmar la presencia de esta bacteria en la muestra.

Otros filamentos presentes en la muestra y recogidos en los partes de resultados de algunos participantes han sido: Tipo 0041, Tipo 0675, Tipo 0211 y Tipo 0411.

En cuanto a la ecología de los filamentos mayoritariamente observados en la muestra, a continuación se extraen algunas notas de la bibliografía (Seviour y Blackall, 1999; Jenkins et al., 2004):

- Microthrix parvicella: para este filamento son cuatro las causas principalmente asociadas a su desarrollo: tiempos de retención celular altos (TRC), concentraciones de oxígeno disuelto (OD) bajas, temperaturas bajas y presencia de zonas anóxicas, anaerobias y zonas de aireación intermitente, tales como aquellas presentes en sistemas de eliminación biológica de nutrientes, también en sistemas biológicos de aireación mecánica. Además de M. parvicella, el Tipo 0092, Tipo 0041 y Tipo 0675 son favorecidos en su desarrollo por elevados TRC (bajos valores de la carga másica) y con zonas iniciales en las que no existe aireación (condiciones anaerobias o anóxicas).

Algunas estrategias de control recogidas en la bibliografía para la reducción de este filamento son: reducción de TRC tanto como sea posible,

eliminación de la aeración intermitente o zonas en las que la concentración de OD sea inferior a 1-2 mg/L en zonas aerobias, especialmente en el punto de mezcla del licor mixto con los fangos procedentes de la zona previa anaerobia o anóxica. También, eliminando las espumas atrapadas en el sistema y mediante adición de floculantes como aquellos basados en el cloruro de polialuminio.

- Tipo 021N: el crecimiento del Tipo 021N, Thiothrix spp., S. natans, N. limicola II, Tipo 1701, Haliscomenobacter hydrossis, Tipo 1851 y nocardioformes, en general, es favorecido por sistemas en los que la aireación es uniforme y existe mezcla completa. El crecimiento de estos filamentos es suprimido cuando el tanque de aireación incluye en cabecera una zona en la que la carga másica es elevada y especialmente cuando el selector está compartimentalizado y sobre todo cuando éste es anóxico o anaerobio.

En la siguiente figura, extraída de Jenkins et al. (2004), se recoge la relación entre TRC y la carga másica en los organismos de observación más frecuente en el fango activo.


Como se deduce de la información expuesta anteriormente, nos encontramos con filamentos que, conviviendo en un mismo sistema, presentan requerimientos de desarrollo, en algunos casos, contrapuestos. De la misma forma, la disposición en el flóculo de los filamentos identificados como dominantes ha sido distinta, como así han valorado varios analistas: M.


parvicella y nocardioformes dispuestos de forma intraflocular, y el resto de tipos filamentosos como Tipo 021N, Thiothrix sp., H. hydrossis y Tipo 1701, de forma externa. En cierta forma, esta disposición en la estructura del flóculo podría justificar los requerimientos ambientales de uno y otro tipo de microorganismo, aunque esta situación podría deberse también a la convivencia en el sistema de flóculos de fango activo que pudieron desarrollarse bajo condiciones ambientales distintas a las presentes, en las que el crecimiento filamentoso también pudo ser distinto.

Esta cuestión está en relación con observaciones recogidas en el apartado de estructura flocular, según la cual, en este sistema coexisten flóculos muy jóvenes y flóculos en los que los núcleos se presentan fuertemente cohesionados aunque de contornos menos consistentes y en los que existe una altísima diversidad bacteriana (Anexo II). En el interior de algunos de estos flóculos se identificó, precisamente, a M. parvicella.

Otros organismos observados en la muestra:

Una observación que ha sido reflejada en el parte de resultados de algunos participantes ha sido la presencia abundante de cúmulos de células Neisser-positivas, localizados dentro de los flóculos de fango activo (Anexo II). Como es sabido, las bacterias almacenan en su interior ciertos compuestos en forma de gránulos de reserva, entre los que se encuentran los polifosfatos. La tinción de Neisser pone de manifiesto la presencia de estas sustancias de reserva, consistentes en gránulos de polifosfato (volutina) las cuales no son visibles sin una tinción que los haga reaccionar químicamente. La presencia de agrupaciones bacterianas Neisser-positivas es frecuente en sistemas en los que existen zonas anóxicas o anaerobias al inicio del tratamiento biológico, pues los microorganismos acumulan gránulos intracelulares cuando se desarrollan en ambientes en los que se alternan condiciones aerobias/anaerobias. Con frecuencia, estos células Neisser negativas son halladas en número significativo en sistemas con eliminación de fósforo (Jenkins et al., 2004).

Además de este tipo de reacción Neisser positiva, también se ha recogido en la bibliografía la presencia de grupos de bacterias Neisser positivas en los que el contorno y pared celular son más claros que el interior celular (azul oscuro). En este caso, la bibliografía ha considerado que se tratan de "G-bacterias", asociadas con sistemas de fangos activos en los que existe una compartimentación inicial del reactor bajo condiciones anaerobias/anóxicas y en los que no existe eliminación de fósforo. Estos organismos pueden tomar y acumular sustratos bajo condiciones anaerobias/anóxicas sin estar


necesariamente acompañados de la acumulación de polifosfatos inorgánicos en el ciclo del fósforo (Jenkins et al., 2004). Sobre las G-bacterias, según Seviour y Blackall (1999), poco es sabido excepto que no sintetizan poli-P o PHB, aunque acumulan polisacáridos. Con una morfología similar y agrupadas en forma de tetradas, probablemente se corresponden con grupos taxonómicamente diversos y de fisiología diferente. Se piensa que las G-bacterias pueden encontrarse en relación de competencia con las bacterias acumuladoras de polifosfato.

Por nuestra parte, hemos llevado a cabo tinciones específicas para la detección de bacterias acumuladoras de polifosfato1 (PAO, Polyphosphate Accumulating Organisms), según el protocolo con azul de metileno de Loeffler (Serafin et al., 2002, En: Borrás Falomir et al., 2004). Este reactivo puede adquirirse ya preparado, pero su elaboración es sencilla y la detallamos a continuación (Borrás Falomir et al., 2004): Disolver 0,3 g de azul de metileno en 100 mL de etanol 60% (solución de Loeffler), y disolver 10 mg de hidróxido potásico en 100 mL de agua destilada (solución II). Mezclar las soluciones I y II a partes iguales.

Para realizar la tinción, se dispone un pequeño volumen de muestra sobre un portaobjetos y se deja secar la muestra al aire durante unos minutos. Una vez que la muestra se encuentre seca, se cubre con la solución de azul de metileno de Loeffler durante 20 segundos. Lavar a continuación con cuidado la muestra con agua destilada, dejar secar y observar al microscopio óptico con 1000x y aceite de inmersión. Las inclusiones de poli-P se observan como puntos de color rosa-violeta brillantes, mientras que el resto del flóculo adquiere tono azulado.

Los resultados de este tinción se encuentran ilustrados en el reportaje fotográfico (Anexo II).

Otros participantes han señalado la presencia abundante de bacterias acumuladoras de PHB en el interior de los flóculos (Anexo II), así como entre bacterias filamentosas. Cabría destacar que muchas bacterias sobreviven periodos inevitables de estrés nutricional mediante la acumulación de sustratos en forma de polifosfatos, poli-ß- hidroxibutirato (PHB) y gránulos de glucógeno. Estas sustancias almacenadas son utilizadas para generar energía (ATP), cuando otras

1 Las bacterias denominadas como "PAO" (Polyphosphate Accumulating Organisms) han sido descritas como las

responsables de la eliminación biológica de fósforo. Estos microorganismos, cuando son sometidos a condiciones de alternancia

entre anaerobiosis y aerobiosis, son capaces de eliminar el fósforo soluble de las aguas (fosfatos, PO43-), de modo que en la etapa

anaerobia toman ácidos grasos de cadena corta presentes en el medio como acetato y propionato, y transforman el polifosfato (poly-

P) almacenado interiormente en PO43-, produciendo un incremento de PO4

3- en el medio. Bajo condiciones aerobias, las PAO toman el PO4

3- del medio y lo almacenan en forma de poly-P, resultando en la

eliminación neta de fósforo en el sistema.


sustancias no están disponibles en el medio. Frente a lo que durante un tiempo se pensó, muchos filamentos, observados bajo microscopía óptica, permiten visualizar este tipo de polímeros en su interior. Sin embargo, las condiciones que pueden influenciar la síntesis de PHB o gránulos de polifosfato en estos filamentos no queda claro (Seviour y Blackall, 1999).

Algunos participantes registraron la presencia de Hyphomicrobium sp., organismo característico por su actividad desnitrificante y fácilmente reconocible por su morfología (Anexo II). Hyphomicrobium sp. se desarrolla en sistemas de fangos activos cuyas aguas residuales contienen metanol y otros compuestos orgánicos (Jenkins et al., 2004). La observación de este microorganismo es útil para valorar si la dosificación de amonio como nutriente, en sistemas de aguas residuales industriales, se está realizando adecuadamente o en exceso, en el intento de prevenir los problemas que acompañan la nitrificación-desnitrificación (fangos flotantes, por ejemplo).

Han sido muy frecuentes las observaciones relacionadas con la presencia de las típicas asociaciones bacterianas en forma circular de bacterias nitrificantes (Anexo II). Según Jenkins et al. (2004), la localización de este tipo de microorganismos suele encontrarse en los contornos del flóculo, presentándose en forma de agregados esféricos, con diámetros en el rango de los 6-9 µm. Sin embargo, la confirmación de este hecho debería realizarse mediante técnicas moleculares como la hibridación in situ (FISH).

Han sido varios los participantes que han registrado la presencia de Zoogloea sp. formando parte, de los flóculos y en algunas ocasiones en forma de agregados amorfos. La presencia de Zoogloea según Jenkins et al. (2004) frecuentemente se asocia a sistemas en los que la relación F/M es elevada, especialmente si el agua residual contiene sustratos fácilmente degradables, compuestos orgánicos solubles y el pH es bajo. Por esta razón, con frecuencia suele asociarse con sistemas de fangos activos en los que existe un selector. También son frecuentes en fangos activos que tratan aguas residuales con elevadas concentraciones de ácidos grasos.

Con relación a la presencia de actividad nitrificante en la muestra, los participantes disponen de información más detallada en el correspondiente estudio respirométrico (Anexo III).

En líneas generales y en función a los datos aportados por los participantes, podría concluirse que la muestra analizada es diversa en su población de bacterias filamentosas y con una presencia de éstas moderada (Figura 4 y Tabla 7). El valor medio de densidad de organismos filamentosos,


extraído del total de los datos, es de 3, es decir, "filamentos en todos los flóculos 1-5 fil./flóculo". El número medio de especies identificadas ha sido de 5.

No se ha podido determinar un efecto en común del crecimiento filamentoso sobre la estructura flocular, pues han sido varios los efectos del crecimiento filamentoso recogidos por los analistas en sus partes de resultados y en algunos casos contradictorios, abarcando desde la "disgregación flocular y los puentes interfloculares" hasta la "ausencia de efectos sobre la estructura del flóculo".

6. CONSIDERACIONES PARA LOS PRÓXIMOS EJERCICIOS INTERLABORATORIOS

Agradecemos el esfuerzo realizado a los distintos laboratorios durante este ejercicio y especialmente a aquellos que se incorporan por primera vez a este tipo de práctica. Entendemos que en cuanto que la familiaridad con las hojas de trabajo mejore, la realización de los ejercicios también se facilitará. Sin embargo, rogamos a los participantes que cumplimenten de forma rigurosa los distintos apartados que se proponen para cada una de las hojas de trabajo. Si bien durante este primer ejercicio hemos tratado de cumplimentar todos los apartados posibles que los participantes habían dejado desiertos, en próximos ejercicios esta posibilidad no se contemplará. En el caso de que exista dificultad en la determinación de alguno de los parámetros solicitados, los analistas deberán ponerse en contacto con nosotros antes de la realización de la próxima intercomparativa. Por último, se ruega a los participantes una mayor diligencia en la entrega de los resultados y rectificaciones de los datos cuando éstas sean solicitadas, a fin de no retrasar el envío de resultados al resto de participantes y el transcurso, en general, del ejercicio.

Con relación al material fotográfico, nos gustaría invitar a los laboratorios participantes a aportarlo para ser añadido al anexo fotográfico, tanto en el apartado de microfauna y bacterias filamentosas como en el de características macro- y microscópicas del fango activo. En ese caso, es imprescindible que el nombre del autor aparezca inserto en el mismo archivo fotográfico (jpg o tiff) y, especialmente, que la identificación del organismo aparezca claramente recogida en la documentación adjunta. Igualmente, todos los comentarios que los participantes consideren oportunos serán incluidos en el informe final.

Como en ejercicios anteriores, nos gustaría manifestar nuestro interés hacia todas las objeciones, desacuerdos u observaciones, que pudieran surgir en


torno al presente informe. Todas ellas serán tenidas en cuenta y discutidas en la jornada final de interlaboratorios.

Con relación a cada una de las hojas de trabajo, a modo de resumen, exponemos las siguientes aclaraciones:

Hoja 1 "Evaluación del fango". Las puntuaciones otorgadas a las categorías de los distintos parámetros definidos, tanto a nivel macroscópico como microscópico, son invariables. Ejemplo: la puntuación otorgada al parámetro turbidez deberá ser 0, 4,5 ó 9, para las características "alta", "media" y "baja", respectivamente. Nunca podrá otorgarse una puntuación intermedia entre los "bloques de puntuación" anteriormente definidos.

Se recomienda realizar observaciones con relación a los siguientes aspectos: bacterias helicoidales, fibras orgánicas, Zoogloea sp., partículas inorgánicas, burbujas, color, hinchazón y espumas. Son observaciones que en ciertas ocasiones pueden arrojar información complementaria de valor sobre el estado estructural del fango.

Es necesario comprobar si se producen fenómenos de levantamiento de la manta de fango en el ensayo de sedimentabilidad en probeta. En ese caso, dicha situación ha de ser recogida en la "evaluación del fango" como valor macroscópico 0.

Hoja 2 "Bacterias filamentosas". En este apartado son dos las categorías de filamentos que hay que valorar: 1) filamentos en el flóculo y 2) filamentos en disolución. En la siguiente figura se recogen las tablas que ilustran las posibles categorías numéricas para uno y otro caso, así como el lugar en el que hay que incluir dicha categoría. Además, es necesario especificar el nombre del filamento en disolución y de los filamentos en el flóculo. En este segundo caso, es necesario distinguir "filamento dominante", "filamento secundario" y "otros filamentos de interés". A continuación, se adjunta un ejemplo de como habría que rellenar esta sección:

EJEMPLO:

Hoja 3 "Microfauna".

En este apartado, los espacios reservados para los dos recuentos realizados sobre 25 µL, han de ser cumplimentados. Si bien tan sólo se ha reservado espacio para dos recuentos, se recomienda realizar siempre, al menos, tres recuentos y realizar media. Las densidades deberán calcularse para cada especie recogida en el parte de resultados así como para los distintos grupos funcionales definidos según el método Madoni. Es necesario hacer constar el dato de densidad de individuos (individuos por litro) y no simplificar esta información indicando solamente ">106 ó < 106 ind./L".

Siempre que sea posible realizar una identificación a nivel de especie, se ruega adjuntar el nombre de la especie identificada. Es decir, si los nombres recogidos en el cuadro-resumen se refieren sólo a géneros e incluye aquellos más comunes en fangos activos, no por ello se tratan de los únicos posibles en fangos activos y no por ello no pueden ser descritos a nivel de especie.


Se recomienda cumplimentar todos los "recuadros" de información referidos a: "recuento de pequeños flagelados", "nivel de amebas desnudas", "nivel de telotrocos" y "organismos no incluidos en el SBI". Consideramos que

es información complementaria, muy útil, con la que valorar el estado global de la microfauna y el sistema.

EVALUACIÓN DE LA MICROFAUNA fecha: 18/02/2005 Código de muestra: Interlaboratorios

GRUPO SPP OBS. 1ºcont 2ºcont ind/mL ind/L % ind/L % GRUPO FUNC.Aspidisca 5 4 1 100 100.000 10%Acineria 2 1 1 40 40.000 4%

Bacter reptante Euplotes affinis 14%OxitrichiaStentor

otros

Datos recogidos en la "hoja 3 de trabajo" de un supuesto "participante 1": Observaciones realizadas por el "participante 1" sobre la microfauna de la muestra: (...) dentro de la población de reptantes se ha podido observar a Aspidisca cicada y Acineria uncinata. Tabla que finalmente se recogería en el informe: PARTICIPANTE

... Aspidisca cicada , Acineria uncinata ....1

3... Aspidisca turrita, Acineria uncinata ....

ESPECIES OBSERVADAS

2... Aspidisca lynceus, Acineria uncinata ....

Comentario que podría realizarse sobre los organismos recogidos en la tabla: Aspidisca lynceus puede desarrollar una espina en la zona dorsal cuando se siente amenazado por depredadores.Por esta razón se la había considerado como una especie distinta: A. turrita. Es decir, los participantes 2 y 3,probablemente, hayan observado el mismo organismo.

EJEMPLO

Por último, se informa los participantes que el segundo ejercicio interlaboratorios del presente circuito está previsto para el día 24 de mayo. Es decir, la distribución de la muestra se realizará durante el día 23 de mayo y el análisis se realizará al día siguiente. Por favor, confirmen su conformidad con la fecha en la dirección de correo electrónico [email protected]. La organización entenderá que la fecha propuesta es válida si no existe respuesta por parte de los participantes.

Saludos cordiales,

Grupo Bioindicación Sevilla



7. AGRADECIMIENTOS

A D. Juan Antonio Díaz, de la empresa IZASA, por su imprescindible asesoramiento técnico en microscopía óptica y su disponibilidad en todo momento.

A D. Emilio Serrano y D. Josep Xavier Sensada, de la empresa Surcis S.L., por el estudio respirométrico realizado y por el interés mostrado durante todo momento en el desarrollo del mismo.

Nuestro agradecimiento a D. Andrés Zornoza (EDAR Quart de Benager), por el material fotográfico aportado y su participación.

A D. Carlos Ferrer (FACSA), por el material fotográfico aportado.

A todos los participantes, especialmente aquellos que se incorporan al circuito, por el esfuerzo realizado y por los comentarios y observaciones añadidos en el parte de resultados.


8 .BIBLIOGRAFÍA

◙ Borrás Falomir, L., Alonso Medina, J.L., Pernilla Eggoy y Ferrer Polo, J. (2004). Técnica de detección de polifosfatos intracelulares y cuantificación mediante análisis de imagen. Tecnología del Agua 253, 56-60.

◙ Foissner, W. y Berger, H. (1996). A user-friendly guide to the cilates (Protozoa, Ciliophora) commonly used by hidrobiologists as bioindicators in rivers, lakes, and waste waters, with notes on their ecology. Freshwater Biology 35, 375-482.

◙ Grupo Biondicación Sevilla y A. Zornoza (2004-2005). Coleccionable de fichas sobre Microbiología del Fango Activo. Tecnología del Agua Octubre 2004-Enero 2005.

◙ Jenkins, D., Richard, M. G. y Daigger, G. T. (1993). Manual on the Causes and Control of Activated Sludge Bulking and Foaming. WRC, Pretoria y USEPA, Cincinnati.

◙ Jenkins, D., Richard, M. G. y Daigger, G. T. (2004). Manual on the Causes and Control of Activated Sludge Bulking and Foaming. Lewis Publishers.

◙ Jiménez, C., Fernández, N., de la Horra, J. M., Rodríguez, E., Isac, L., Salas, D. y Gómez, E. (2001). Sistema rápido de estimación de los rendimientos en depuración de una E.D.A.R. en función de las características macroscópicas y microscópicas del fango activado. Tecnología del Agua 216, 40-44.

◙ Madoni, P. (1994). A sludge biotic index (SBI) for the evaluation of the biological performance of activated sludge plants based on the microfauna analysis. Wat. Res. 28, 1, 67-75.

◙ Madoni, P. (1996). The Sludge Biotic Index for the Evaluation of the activated-sludge plant performance: the allocation of the ciliate Acineria uncinata to its correct functional group. Acta Protozoologica 35, 209-214.

◙ Rodríguez-Zaragoza, S. (1994). Ecology of Free-Living Amoebae. Critical Reviews in Microbiology 20, 225-241.

◙ Streble, H. y Krauter, D. (1987). Atlas de los microorganismos de agua dulce. La vida en una gota de agua. Ed. Omega, Barcelona.

◙ Warren, A. (1986). A revision of the genus Vorticella (Ciliophora: Peritrichida). Bull. Br. Mus. Nat. Hist. (Zool). 50, 1, 1-57.

◙ Web recomendada sobre índices de diversidad:

http://www.mdsg.umd.edu/Education/biofilm/diverse.htm

ANEXO I: PROCEDIMIENTO OPERATIVO PARA LAS HOJAS DE TRABAJO

1.- Evaluación de la calidad de un fango biológico

En esta hoja se han definido una serie de parámetros considerados de interés para establecer las características y calidad flocular de un fango activado.

• A nivel macroscópico sobre la V30

- Turbidez del clarificado.

- Flóculos en suspensión en el clarificado

- Sedimentabilidad del fango

- Olor

CARACTERISTICAS MACROSCOPICAS

TURBIDEZ ALTA: Visibilidad clara a traves de la probeta 0MEDIA 4,5BAJA: Visibilidad muy baja a traves de la probeta 9

FLOC EN SUSPENSIONALTA 0MEDIA 4,5BAJA 9

SEDIMENTABILIDAD ALTA: V30 dec 10 primeros min 9MEDIA : V30 dec de 10-20 primeros min 4,5BAJA: V30 decanta despues 20 primeros min 0

OLOR CORRECTO 3INCORRECTO 0

El máximo valor obtenido por las características macroscópicas es de 30.

Si se produce un levantamiento total o mayoritario de la manta de fangos, se indica como valor macroscópico cero.

A nivel orientativo y con relación a la turbidez, por su complejidad en la evaluación, se muestran algunas fotografías que permiten ajustar los tres rangos de este parámetro. La turbidez se desglosa en esta valoración de los microflóculos en suspensión del clarificado, valorándose ambos de forma independiente. Por lo tanto la medición directa sobre el clarificado con un turbidímetro nos proporcionará un valor erróneo.


Este parámetro se encuentra actualmente en revisión, de forma que se ajusten las medidas directas de turbidimetría a la calificación previamente definida.

Como referencia, tomaremos un objeto que se colocará en la parte trasera de la probeta. Si la forma del objeto se observa claramente, definiremos la muestra como poco turbia (turbidez baja). En este caso se pueden incluso apreciar los dibujos existentes sobre el objeto. Si los contornos se aprecian, pero no es posible observar el dibujo de la superficie, en ese caso hablaremos de turbidez media. Por último, si no es imposible observar ningún dibujo y los contornos del objeto quedan difuminados e incluso no se ven, estaremos hablando de turbidez alta.

TURBIDEZMEDIA

ALTA

BAJA

Para la definición de la sedimentabilidad es necesario hacer lecturas de la V30 a los 10, 20 y 30 minutos. Sólo de esta forma tendremos criterio suficiente para saber si la manta de fangos ha decantado mayoritariamente a los 10, 20 o 30 minutos.


En la siguiente tabla se recogen tres ejemplos para ilustrar este concepto:

Ejemplo 1: Sedimentabilidad "media"

Vol. decantado a los 10 min (mL/L) 700 1(300/700=0,42)

Vol. decantado a los 20 min (mL/L) 400 2(600/700=0,85)

V30 (mL/L) 300 3(700/700=1)

Ejemplo 2: Sedimentabilidad "alta"

Vol. decantado a los 10 min (mL/L) 450 (550/760=0,72)


V30 (mL/L) 240 (760/760=1)

Ejemplo 3: Sedimentabilidad "baja"



V30 (mL/L) 550 (450/450=1)

1 2


3

Los valores representados entre paréntesis, bajo el volumen de fango decantado, se han calculado para aclarar el concepto sedimentabilidad y tener un dato medianamente representativo que nos ayude a discriminar la "categoría". Pero dichos cálculos no responden a ninguna expresión de interés o en particular del concepto "sedimentabilidad". Simplemente ha tratado de buscarse una relación entre el volumen de fango compactado a un tiempo determinado (10 o 20 min), con respecto al volumen compactado a los 30 min. Como es lógico, a los 30 min de espera, el valor de esta relación es 1. El criterio adoptado es que la sedimentabilidad será alta si a los 10 min este valor es mayor o igual a 0,5. Si han de transcurrir 20 min para que el valor de esta relación se aproxime o sea superior a 0,5, la sedimentabilidad será media. Si ni siquiera a los 20 min el valor de esta relación alcanza el valor 0,5, la sedimentabilidad de la muestra será baja.

min 30 t 0t

min 10 t 0 t

aVolumen -aVolumen aVolumen - aVolumen =

min 30 t 0t

min 02 t 0 t


==

=

==

==

1aVolumen - aVolumen aVolumen - aVolumen

min 30 t 0t

min 03 t 0 t=

==

==

Como se observa en el ejemplo 1, han de transcurrir 20 min para que el volumen de fango decantado se aproxime al valor de la V30. En este caso, el cociente calculado es mayor a 0,5 y próximo a 1. La sedimentabilidad es media.

En el ejemplo 2, a los 10 min de comenzado el ensayo de sedimentabilidad en probeta, el volumen decantado se aproxima al valor final de la V30. En este caso, el cociente es mayor a 0,5 y próximo a 1 a los 10 min. La sedimentabilidad es alta.

En el ejemplo 3, el valor de la relación calculada no alcanza el valor de 0,5 ni siquiera a los 20 min de espera. La sedimentabilidad es baja.

• A nivel microscópico

- Tamaño del flóculo

- Forma del flóculo

- Estructura y textura del flóculo

- Cobertura de la masa de fango sobre la circunferencia de un objetivo de 10X;

- Presencia de filamentos en flóculo, en disolución y diversidad de protozoos

CARACTERISTICAS MICROSCOPICAS

FORMA REGULAR 4IRREGULAR 0

TAMAÑO GRANDE: > 500 micras 4MEDIO: 150-500 micras (**) 7PEQUEÑO: < 150 micras 0

ESTRUCTURA COMPACTA 18MEDIA 9ABIERTA 0

TEXTURA (por puncion) FUERTE 4DEBIL 0

COBERTURA <10 % 010-50 % (**) 7>50 % 3,5

FIL EN FLOCULO >20 fil/floc 05<*<20 fil/floc (**) 7<5 fil/floc 14

FIL EN DISOLUCION ALTA> categoría bacteriana 2 0BAJA< categoría bacteriana 2 3

DIV PROTOZOOS >7 SP 134-7 SP (**) 7<4 SP 0


El máximo valor obtenido por las características microscópicas es de 70.

Todas estas observaciones se han de realizar con un objetivo de 10X sobre al menos 2 muestras previamente homogeneizadas suavemente con ayuda de una pipeta Pasteur. El volumen de muestra se deposita sobre un porta-objetos y se coloca encima un cubre-objetos, obteniéndose como valor final una evaluación del fango comprendida entre 0-100 que permite definir una categoría de IF entre pésimo y óptimo.

(**): Pertenecen los extremos de los intervalos a las categorías intermedias. Es necesario revisar los apartados de filamentos y protozoos tras los recuentos, para reajustarlos a los valores obtenidos.

Es recomendable realizar una medida del tamaño flocular entre 15 flóculos elegidos al azar, para decidir en que categoría se engloban.

Es conveniente realizar otras observaciones de presencia/ausencia, de: Bacterias helicoidales, fibras orgánicas, Zoogloea sp., partículas inorgánicas, burbujas, color, hinchazón y espumas o natas en superficie.

También es conveniente realizar el ensayo de los SSLM, SSVLM, V30 e IVF.

A nivel orientativo y con relación al tamaño, estructura y textura, se muestran algunas fotografías que permiten ajustar los rangos de estos parámetros.

TAMAÑOS

FLOCULARES

>500micras

150-500micras

< 150micras

TAMAÑO MEDIO

TAMAÑO GRANDE

TAMAÑO PEQUEÑO


ESTRUCTURAS FLOCULARES

FLOCULOCOMPACTO;TEXTURA FUERTE

FLOCULO ABIERTO;TEXTURA DEBIL

Índice de Fango: IF

ÍNDICE DE FANGO: 0-19 pésimo, 20-39 malo, 40-79 regular, 80-89 bueno y 90-100 óptimo.

2.- Evaluación del desarrollo de bacterias filamentosas en un fango activo.

La identificación bacteriana se realizará fundamentalmente sobre el filamento dominante y el secundario según la clasificación que se establece en el libro de EMASESA: “Microorganismos filamentosos en el fango activo”, valorándose la proliferación total de filamentos en función de la abundancia relativa según la tabla especificada en la hoja de trabajo.

Se entiende por filamentos dominante y secundario aquellos que predominan sobre los demás con independencia de la categoría numérica en la que se encuentren.

Paralelamente se pueden realizar dos aproximaciones más exactas de la cantidad de filamentos:

- Una valoración semicuantitativa en la que se contabiliza el número de filamentos observados que interceptan la circunferencia del objetivo de 40X. Para ello, la muestra debe estar teñida con Azul de Metileno (se añaden dos gotas de una solución de Azul de metileno al 0,5 % a 25 mL de muestra, tras lo cual se



dejan unos dos minutos de reacción y posteriormente se coloca una gota sobre el porta, el cubre y se observa).

- Una valoración cuantitativa de los m/mL de filamentos según el recuento de los cortes en la diagonal de la cámara Neubauer improved x 37,12 bajo el objetivo de 20X. En este caso la muestra debe estar in vivo (Arnáiz et al., 1999).

Ambos sistemas no son comparativos, pero pueden servir de referencia si se realizan de forma metódica en una EDAR para detectar la proliferación de bacterias filamentosas. Es más exacto el recuento sobre Neubauer.

Abundancia relativa para filamentos en el flóculo

VALORACIÓN DE FILAMENTOS EN EL FLÓCULO (ABUNDANCIA RELATIVA)

VALOR NUMÉRICO

ABUNDANC. SIGNIFICADO

0 Ninguno 1 Pocos Hay filamentos pero se observan solo en algunos flóculos 2 Alguno Se ven filamentos en los flóculos, pero no en todos ellos

3 Comunes Se observan filamentos en todos los flóculos pero en pequeña cantidad (de 1-5 filamentos por flóculo)

4 Muy comunes Se observan filamentos en todos los flóculos, pero con una densidad media (de 5 a 20 por flóculo)

5 Abundantes Hay filamentos en todos los flóculos y con densidad alta

6 Excesivos Filamentos presentes en todos los flóculos; hay más filamentos que flóculos, dándose un enorme crecimiento

Debido a que determinadas bacterias originan problemas de turbidez (Bacilllus sp., Tipo 1863....) se realizará una determinación cualitativa independiente y una cuantificación para este tipo de organismos, según la tabla siguiente:

Abundancia relativa para filamentos libres

VALOR NUMÉRICO ABUNDANCIA0 Pocos 1 Medio 2 Muchos

Esta valoración se realizará sobre los filamentos que se encuentren situados en el espacio interflocular.


3.- Evaluación de la microfauna presente en fangos activos

En esta hoja de trabajo se pretende valorar la diversidad de la microfauna presente (Índice Biótico de fango (SBI) e Índice de Diversidad de Shannon (H)) e identificar y cuantificar los organismos presentes (protozoos y metazoos) en la muestra.

De estos organismos se han clasificado en la hoja de trabajo correspondiente los más comunes en aparición, a fin de simplificar el trabajo. La observación se hará a 10X/40X aumentos con volúmenes de 25 µL y en dos réplicas.

La metodología a seguir es la establecida por Madoni (1994) para el cálculo del SBI complementado con el reparto porcentual de los organismos y el Índice de Shannon (H=- ∑ (Pi(log2Pi) (bit)); Siendo Pi = nº organismos SPA/ nº total organismos.

El Índice de Shannon de biodiversidad permite completar este estudio contribuyendo con otro parámetro más en el estudio biótico, el cual aporta las unidades de información que circulan por el sistema en bit. Al valorar un ecosistema necesitamos, en muchas ocasiones, conocer la relación de organismos presentes y su representación numérica. Una manera de realizar este cálculo es el Índice de Biodiversidad de Shanon (Margalef, 1992), que estima el grado de entropía o información circulante en el sistema; queda definido en la Teoría de los sistemas Ecológicos de Margalef (1992).

Dado que este Índice se basa en el número de especies, debemos asegurarnos en las identificaciones y ser cuidadosos con nuestras muestras (manipulación, recuentos, etc.). De esta forma, este Índice nos permite conocer las interrelaciones del sistema y comparar muestras de sistemas biológicos distintos.

CONSIDERACIONES A TENER EN CUENTA PARA EL SBI Y H:

Microorganismos a considerar Microorganismos no considerados

Pequeños flagelados Amebas desnudas

Grandes flagelados

Ciliados

Microorganismos de arrastre (algas, crustáceos, insectos, etc.)

Amebas testáceas

Rotíferos y Nematodos (Metazoos) Actinópodos


- Rotíferos y nematodos, debido a la complejidad que supone identificarlos a nivel de especie, contribuyen cada uno a una sola unidad sistemática; sin embargo, si somos capaces de distinguir géneros es importante reflejarlos para el cálculo de H.

- La determinación de amebas testáceas se realiza sólo a nivel de género para el SBI. Sin embargo, si es posible llegar a diferenciar especies hay que señalarlo para determinar H.

- En cuanto a los "grupos-clave" sólo los ciliados bacteriófagos se engloban dentro de los 3 grupos funcionales (nadadores de vida libre, reptantes o móviles de fondo y sésiles o pedunculados).

- Los ciliados carnívoros tan sólo contribuyen a la densidad y diversidad total de la microfauna. Así pues, ciliados nadadores predadores, tales como Litonotus sp., Amphileptus sp., Coleps hirtus, Acineria incurvata y Sphathidium sp. deben ser excluídos del grupo de los ciliados nadadores de vida libre. De la misma forma, los ciliados predadores sésiles o pedunculados, como los suctores Podophrya sp., Tokophrya sp. y Acineta sp. deben ser igualmente excluidos del grupo de los ciliados sésiles o pedunculados, considerándose tan sólo a la hora de computar densidad y diversidad total de la microfauna.

- No se tienen en cuenta las larvas telotrocas, pero se reseña en observaciones su abundancia.

- Es necesario realizar los recuentos de organismos contando también los contenidos en el rebose que se pueda producir en el cubreobjetos.

- Vorticella microstoma y Vorticella infusionum están incluidas en el mismo grupo para el SBI, no así para H.

- Colonias muy numerosas de peritricos falsean los resultados finales de los recuentos. Por ello, el procedimiento a seguir cuando aparecen es: realizar los dos recuentos normales de organismos y si aparece una colonia grande se obvia en el resultado final. Una vez terminado, se realizan de nuevo dos conteos y esta vez sólo se contabiliza el organismo colonial. Una vez terminado se sustituyen los valores del colonial en los dos recuentos iniciales y se realiza el resultado final.

- La lista de especies observadas se realiza con al menos dos organismos vistos de cada especie.

- El SBI es adecuado para tratamientos convencionales de fangos activos, contacto-estabilización y aireación prolongada. La medida de diversidad, H, es adecuada para cualquier ecosistema.


- Las amebas testáceas deben contabilizarse solo cuando están vivas, por ello se prestará especial atención a su transparencia y si es necesario aplicaremos Rosa de Bengala. Como idea general: se tomarán las testáceas oscuras como inertes. Sin embargo, ésto plantea un problema para aquellas testáceas que utilizan material extracelular (piedras, diatomeas...) para generar su teca (testas aglutinadas), pues casi siempre son oscuras. En el caso de un fango activo con abundancia de testáceas se procederá a realizar la prueba de actividad con el Rosa de Bengala (C2OH2O5T4Cl2Na2). Este reactivo se absorbe por la superficie protoplasmática, coloreándose de rosa. Se añade un poco de reactivo a 50 mL de fango activo y se deja reposar unos 15 minutos, tras lo que se realiza el recuento.

SITUACIONES ANÓMALAS EN EL SBI:

La presencia masiva de grandes flagelados por un lado o de nematodos y rotíferos por otro, plantea dificultades a la hora de aplicar el SBI. En estos casos se pueden plantear dos situaciones:

1.- Sólo existen estos organismos anteriormente citados, en cuyo caso no se puede aplicar el SBI. Se indicarían las densidades de tales organismos.

2.- Existen otros organismos que sí están recogidos en el SBI. En este caso se aplicaría el SBI a estos grupos de organismos, puntualizando que existen determinadas densidades de organismos no recogidos en dicha clasificación.

Otra situación dificultosa es la aparición de Vorticella microstoma más V. infusionum o de Opercularia no dominante, pero sí abundantes. En este caso se aplica el SBI normalmente y se puntualiza que aparecen estos grupos de organismos a tales densidades.

4.- Evaluación total del fango activo: Conclusiones.

En esta última hoja de trabajo se recogen las conclusiones parciales de cada una de las hojas anteriores de forma que nos aporten una visión clara de la calidad del fango y de la calidad previsible del agua de salida, así como de los parámetros de los cuales son bioindicadores los organismos presentes.

En este apartado se recogerán todas las anomalías de aplicación de los índices antes citadas, así como todas las consideraciones que el operador crea que es necesario tener en cuenta.

INFORME DEL ENSAYO INTERLABORATORIOS PARA FANGOS...

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