Universidad de Santiago de ChileFacultad de Química y Biología Licenciatura en Bioquímica.

ELISA

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Introducción

Todos los métodos inmunoquímicos de cuantificación modernos se basanen un método simple y preciso de medida de la cantidad de moléculas indicadoras. En el caso de que dicha molécula se marque con un radioisótopo, puede cuantificarse midiendo la radiactividad en un contador, análisis denominado RIA(radioinmunoanálisis). Dentro modo, si la molécula indicadora se une a una enzima de manera covalente, se puede cuantificar en un espectrofotómetro la velocidad inicial a la cual la enzima convierte un sustrato incoloro en un producto con color, análisis denominado ELISA.

El análisis inmunoabsorbente ligado a enzima (enzima linked Immunosorbent assay, ELISA) es un método usado para detectar la presencia de antígenos (ag) o anticuerpos (ab) ya sean estos péptidos o proteínas de interés en muestras biológicas. El método se basa en la detección de la formación de un complejo inmune antígeno-anticuerpo que directa o indirectamente producen una reacción debido a que uno de los reactantes está marcado con una enzima la cual transforma un sustrato cromogénico, en donde la intensidad del color es directamente proporcional a la concentración del antígeno o anticuerpo a detectar. Para la fijación del anticuerpo o el antígeno a determinar se utilizan placas de poliestireno, la cual tiene la propiedad de unir espontáneamente péptidos o proteínas. Para la eliminación de aquellos antígenos o anticuerpo que no se hayan unido a la placa se realizan lavados con buffer.1

Este método ha tenido una enorme aplicación en todos aquellos campos en los que se precisa la cuantificación de productos mediante anticuerpos: diagnostico clínico, detección viral, clasificación de anticuerpos en isotipos, búsqueda de anticuerpos monoclonales, etc.2

Dentro de la técnica de ELISA se pueden distinguir tres grupos principales: ELISA directo.Este método es el más básico de las configuraciones de ELISA. Se utiliza para detectar

un ag(triángulo rojo; virus/bacteria/hongo, péptido/proteína recombinante, u otro ag)después de que se haya unido a la fase sólida(por ejemplo una membrana o una placa de poliestireno). Un ab(verde), conjugado con un marcador(estrella amarilla; por ejemplo HRPO, el AP, FITC) se incuba con el antígeno capturado. Después de lavar el exceso conjugado y de incubar con un sustrato y un cromogénico, la presencia de un color determinado indica una interacción específica ab-ag. El conjugado podría ser una preparación comercial específica para el ag de interés, o un ab monoclonal o policlonal(ver Anexo, 1). 3

ELISA indirecto.Un ag es de nuevo adsorbido sobre una fase sólida. El ab primario(verde) se incuba con

el ag, después de lo cual el exceso es lavado. Un ab secundario(azul), conjugado, se incuba con las muestras. El exceso es quitado otra vez lavándose.Para que el color se convierta, un ab primario que es específico para el ag, debe haber estado presente en la muestra (por ejemplo suero humano, CSF o saliva). Esto indica una reacción positiva. Es importante, para la optimización del análisis, asegurarse de que el ab secundario no una no específicamente la preparación del ag o las impurezas dentro de él, ni a la fase sólida(ver Anexo, 2).3

ELISA de captura.1. Captura del antígeno.En un acercamiento más específico, un ab que captura (anaranjado) está retenido sobre

la fase sólida. El anticuerpo de la captura puede ser el reactivo que se probará. Sin embargo, el ab puede ser un reactivo estándar y el antígeno desconocido(como cuando un suero de los pacientes se está investigando para la presencia de una infección microbiana). La misma optimización rigurosa se requiere en cuanto a ELISA indirecto. Esto se asegurará de que el ab no tenga reacción cruzada en ausencia del ag, o un enlace no específico a la fase sólida. Es también importante, al detectar el ag, utilizar el ab de diversa especie animal para prevenir el atascamiento del ab de la misma especie(ver Anexo, 3).3

2. Captura del anticuerpo.En este acercamiento, un Ag que captura (anaranjado) está retenido en la fase sólida. El

ab se diseña para capturar una clase de ab humano(verde; por ejemplo. IgG, IgA o IgM). La muestra se aplica después, conteniendo el Ab bajo investigación. Después de lavarse, un ag específico (rojo) para el Ab se agrega y finalmente una conjugación contra-AG (azul) proporciona la señal(ver Anexo, 4).3

3. ELISA competitvo.En un ELISA competitivo , un suero paciente y una conjugación AG-especi'fica (color

de rosa) se co-incuban con un AG capturado. La cantidad de color desarrollada es inversamente proporcional a la cantidad de AG-específico de Ig presente en el paciente. Se requiere una estandarización cuidadosa para interpretar los resultados (ver Anexo, 5).3

4. ELISA de bloqueo.En un ELISA de bloqueo, el suero paciente se agrega primero, incubando y luego el

exceso lavado. Una conjugación AG-especi'fica se agrega y los resultados se interpretan después como en el caso anterior.3

Dentro de los Marcadores enzimáticos más comúnmente utilizados se encuentranEnzima Sustratos

HRP (peróxidasa de rábano) OPD, TMB, ABTS, DAB, CNP, AEC, ASA.AP (fosfatasa alcalina) PNPP, NAPFB, NAPR, BCIP.

Beta-G ONPGUreasa BP

PG ISEstos marcadores permiten la detección en la que se utiliza un sustrato cromogénico

de la enzima. La enzima transforma el sustrato en un producto coloreado soluble donde la intensidad de color resultante se relaciona con la concentración del anticuerpo primario y el antígeno respectivo.2

Los anticuerpos que se utilizan en ELISA pueden ser monoclonales o policlonales, presentando cada uno ventajas y desventajas que se presentan en la siguiente tabla:4

Anticuerpos monoclonales Anticuerpos policlonalesGrandes cantidades Alta afinidadEspecificidad Amplia reactividadHomogenidad Estabilidad con pH y concentraciones de

salesSe pueden obtener en antígenos con baja frecuencia y afinidad

De simple producción

El antígeno no tiene que estar puro No hay riesgo de pérdida de clonesBajo costo de producción o compra

Materiales y Métodos.

Se siguió el protocolo establecido en (4), realizándose algunas modificaciones que se señalan a continuación:2) Las placas se lavan tres veces por 5 minutos con 50 L de PBS.(todos los pocillos)4) las diluciones a trabajar son las siguientes:

Pocillo Dilución1 1:1002 1:1503 1:2504 1:5005 1:10006 1:12507 1:15008 1:20009 1:250010 1:300011 1:400012 1:5000

Una vez que se bloquean los sitios específicos con BSA 1 % en PBS, se utilizan sólo los pocillos que se presentan activos porque se agregó una suspensión de extractos proteicos provenientes de Neisseria gonorrhoeae P9-17 y Escherichia coli DH-3. los sitios activos se presentan a continuación:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A X X X X X X X X X X X XB X X X X X X X X X X X XCD X X X X X X X X X X X XE X X X X X X X X X X X XFG X XH X X

Donde la fila A, B y F están activadas con Neisseria gonorrhoeae P9-17 y las filas D, E y H están activadas con Escherichia coli DH-3.

Resultados

Los resultados de la absorbancia medida a cada muestra a 405 nm, se presenta a continuación en las siguientes tablas:

N. gonorhoeae.

Columna Dilución(1:X)Fila

A(Absorbancia)Fila

B(Absorbancia) X1 100 3,410 3,429 3,4202 150 3,329 3,315 3,3223 250 3,003 2,940 2,9724 500 2,554 2,529 2,5425 1000 1,557 2,101 1,8296 1250 1,625 1,685 1,6557 1500 1,394 1,451 1,4238 2000 0,225 0,199 0,2129 2500 0,909 0,998 0,95410 3000 0,168 0,155 0,16211 4000 0,120 0,145 0,13312 5000 0,493 0,527 0,510

E. coli

Hilera Dilución(1:X)Fila

D(Absorbancia)Fila

E(Absorbancia) X1 100 0,440 0,462 0,4512 150 0,344 0,354 0,3493 250 0,223 0,209 0,2164 500 0,161 0,139 0,1505 1000 0,124 0,126 0,1256 1250 0,106 0,100 0,1037 1500 0,102 0,095 0,0998 2000 0,070 0,068 0,0699 2500 0,091 0,090 0,09110 3000 0,079 0,072 0,07611 4000 0,077 0,074 0,07612 5000 0,097 0,091 0,094

El background es el siguiente:

Fila/ColumnaFila G

(Absorbancia)Fila H

(Absorbancia)X

G1 0,101 0,080 0,090H2 0,086 0,077 0,081

Donde la fila/columna G1 corresponde a N. gonorhoeae sin anticuerpo primario pero si con anticuerpo secundario y la la fila/columna G1 corresponde E. coli sin anticuerpo primario pero si con anticuerpo secundario.

De esta manera la curva de calibración, con la absorbancia corregida dada por al background se presenta en la siguiente tabla:

N. gonorhoeae.

Columna X BackgroundAbsrorbancia

corregida1 3,420 0,090 3,332 3,322 0,090 3,2323 2,972 0,090 2,8824 2,542 0,090 2,4525 1,829 0,090 1,7396 1,655 0,090 1,5657 1,423 0,090 1,3338 0,212 0,090 0,1229 0,954 0,090 0,86410 0,162 0,090 0,07211 0,133 0,090 0,04312 0,510 0,090 0,42

E. coli

Columna X BackgroundAbsrorbancia

corregida1 0,451 0,081 0,372 0,349 0,081 0,2683 0,216 0,081 0,1354 0,150 0,081 0,0695 0,125 0,081 0,0446 0,103 0,081 0,0227 0,099 0,081 0,0188 0,069 0,081 -0,0129 0,091 0,081 0,0110 0,076 0,081 -0,00511 0,076 0,081 -0,00512 0,094 0,081 0,013

La representación gráfica es la siguiente:

Discusiones

Se puede apreciar en el gráfico prsentado de las diluciones utlizadas de anticue`rpoas paa N. gonorhoeae y para E. coli

Anexo

1. ELISA directo

2. ELISA indirecto.

3. Captura del antígeno.

4. Captura del anticuerpo.

5. ELISA competitivo y ELISA de bloqueo.

Bibliogradfía

1. Abbas, A., Lichtman, A., Pober; J., Inmunología celular y molecular, Editorial McGraw-Hill; 3ª edición 2000; p 63-65.

2. http://www.ub.es/biocel/pbc/images/inmunocitoquimica-s3/elisa3. http://www.uq.edu.au/vdu/ELISA.htm ELISA-virology down under.4. aqui va la pag de inmuno

http://www.uq.edu.au/vdu/ELISA.htm