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1 INFORME FINAL PROYECTO SIP 20070722 PERFIL EXOENZIMATICO DE LA MICROBIOTA AISLADA DE SUELOS ALTAMENTE CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS DIRECTORA DRA. LUZ IRENE ROJAS AVELIZAPA
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INFORME FINAL
PROYECTO SIP 20070722
PERFIL EXOENZIMATICO DE LA MICROBIOTA AISLADA DE SUELOS ALTAMENTE
CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS
DIRECTORA
DRA. LUZ IRENE ROJAS AVELIZAPA
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1.0 INTRODUCCIÓN.
1.1 Las Enzimas.
Las enzimas son proteínas que actúan como catalizadores en el
metabolismo de los seres vivos. Con su acción, regulan la velocidad de muchas
reacciones químicas implicadas en este proceso. El nombre de enzima fue
propuesto en 1867 por el fisiólogo alemán Wilhelm Kühne, y deriva del término
griego en zymé que significa “en el fermento”, o “en la levadura”.
Como propuso el químico sueco Jöns Jakob Berzelius en 1823, las enzimas
son catalizadores típicos capaces de acelerar la velocidad de una reacción, sin ser
consumidas o modificadas en el proceso. Por otra parte, las enzimas son
inherentes a la materia viva, y por lo mismo se han obtenido de plantas, animales
y fuentes microbianas. Estas ultimas pueden ser generadas en grandes
cantidades por las técnicas de fermentación establecidas para su producción
comercial. Además, resulta más sencillo perfeccionar un sistema enzimático
microbiano, que su equivalente en una planta o un animal. Otra ventaja deriva del
rápido crecimiento de los microorganismos, en el espacio relativamente pequeño
requerido para su cultivo. Adicionalmente, los microorganismos son más
accesibles a la manipulación genética para mejorar los niveles de producción
enzimática.
Los principales usos de las enzimas en la industria han sido resumidos en la
tabla 1.
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Tabla 1. Aplicaciones comerciales de las enzimas
INDUSTRIA APLICACIÓN ENZIMA Pan y molienda Reducción de la viscosidad de la masa, aceleración del
proceso de fermentación, incremento en el volumen del pan; mejoramiento de la suavidad y frescura de la migaja. Mejora de la textura de la masa, reducción del tiempo de mezcla e incremento en el volumen del pan.
Amilasa Proteasa
Cerveza Malteo. Mejoramiento de una fina filtración.
Amilasa ββββ-Glucanasa
Cereales Alimentos precocidos para bebé. Condimentos.
Amilasa Proteasa
Chocolate y cocoa Manufactura de jarabes. Amilasa Café Fermentación de la semilla de café.
Preparación de concentrados de café. Pectinasa Pectinasa y hemicelulasa
Confitera Manufactura de dulces con centro suave Pastas de azúcar para cobertura de dulces.
Invertasa y pectinasa Amilasa
Jarabe de maíz Manufactura de jarabe de maltosa. Producción de glucosa a partir de jarabe de maíz. Conversión del jarabe a fructosa.
Amilasa Amiloglucosidasa Glucosa isomerasa
Lechera Remoción de H2O2 de la leche (subsecuentemente al tratamiento con H2 O2) Manufactura de hidrolizados proteicos. Estabilización de leche evaporada. Producción de concentrados de leche entera, concentrados de suero, helados y postres congelados. Cuajado de la leche.
Catalasa Proteasa Proteasa Lactasa Proteasa
Huevo Eliminación de la glucosa. Glucosa oxidasa Alimento animal Preparados. Amilasa y proteasa Saborizantes Clarificación (remoción del almidón)
Eliminación de oxígeno. Amilasa Glucosa oxidasa
Lavandería Detergentes. Proteasa Piel Depilado. Proteasa Carne Ablandado.
Preparación de concentrados proteicos de carne de pescado.
Proteasa Proteasa
Farmacéutica y clínica
Refuerzo digestivo. Terapia para contusiones, inflamaciones, etc.
Amilasa y proteasa Estreptocinasa
Fotografía Recuperación de plata de películas desechadas. Proteasa Alimentos Preparación de hidrolizados proteicos. Proteasa Bebidas suaves Estabilización de terpenos cítricos de la oxidación catalizada
por la luz. Glucosa oxidasa y catalasa
Textiles Desgomado de las telas Amilasa Vegetales Preparación de hidrolizados.
Licuefacción de purés y sopas. Pectinasa celulasa Amilasa
Vino Clarificación Pectinasa
Tomado de : Montes Horcasitas y Magaña-Plaza 2002.
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1.2 Perfil enzimático extracelular de microorganismos aislados de diversos
hábitats.
Para la obtención de los microorganismos que secreten las enzimas
convenientes para una aplicación particular, se ha recurrido casi siempre a su
aislamiento a partir de muestras con un alto contenido del sustrato que se quiere
aprovechar. Por ejemplo, de sitios donde hay acúmulo de materiales quitino-
proteicos como los desechos de camarón, se aislan microorganismos proteo-
quitinolíticos; donde hay acúmulo de desechos como bagazo de caña y rastrojo,
se aislan productores de celulasas; de hábitats ricos en desechos avícolas como
plumas, se presupone debe haber esencialmente una flora productora de
queratinasas extracelulares, etc.
Existen pocos estudios donde se explore sin prejuicio alguno y de manera
más abierta, el perfil enzimático extracelular de la microbiota presente, con la
finalidad de explorar su potencial biotecnológico. A este respecto vale la pena
mencionar los trabajos que pudieron obtenerse después de una búsqueda
exhaustiva.
1) Strauss et al. 2001, aislaron 245 levaduras (no Saccharomyces ) de uvas
y jugo clarificado de uva, provenientes de cuatro regiones vitivinícolas de
Sudáfrica, correspondientes a los géneros: Kloeckera, Candida, Debaryomyces,
Rhodotorula, Pichia, Zygosaccharomyces, Hansenispora y Kluyveromyces. Los
aislados fueron estudiados en cuanto a la producción de enzimas extracelulares
como pectinasas, proteasas, liquenasas, β-glucanasas, β-glucosidasas, celulasas,
xilanasas, amilasas y sulfato reductasas. Todas produjeron las enzimas referidas,
excepto la β-glucosidasa. Este trabajo demostró el enorme potencial de esos
aislados silvestres de levaduras, para producir un amplio grupo de enzimas.
Además, estudios preliminares, constataron el impacto que pueden tener dichas
actividades enzimáticas sobre algunas propiedades sensoriales del vino. Por
ejemplo las celulasas y hemicelulasas podrían ayudar a la extracción del color y el
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sabor de la piel de las uvas. Adicionalmente demostraron que cuando se co-
cultivaban algunas de esas levaduras con S. cerevisae, se tenía también un mayor
efecto sobre el aroma del vino.
2) Buzzini y Martín en 2002, estudiaron el perfil enzimático extracelular de 348
levaduras aisladas de agua, suelo, insectos y plantas de ambientes tropicales de
los bosques de Brasil. Las enzimas evaluadas fueron amilasas, esterasas,
lipasas, proteasas, pectinasas y quitinasas, encontrando que los niveles de cada
una de esas enzimas variaba dependiendo de cada aislado. No se encontró
correlación entre el perfil enzimático extracelular de cada cepa y su fuente de
aislamiento, y sí se pudo concluir que las levaduras aisladas de fuentes tropicales
representan una fuente potencial de enzimas, que pudieran tener diversos usos
biotecnológicos.
3) Sánchez-Porro et al. 2003. Llevaron a cabo un estudio sobre la diversidad de
bacterias halofilas con actividades hidrolíticas, presentes en diferentes ambientes
hipersalinos del sur de España. Se aislaron 122 bacterias moderadamente
halofilas, capaces de crecer en medios con 5-25 % de sales, las cuales producían
DNasas, lipasas, proteasas y pullulanasas. Algunas fueron identificadas como
miembros del género Salinivibrio ( 55 ), Halomonas (25), Chromohalobacter (2),
Bacillus-Salibacillus (29), Salinicoccus (2 ) y Marinococcus ( 1 ). Ocho aislados no
fueron identificados. Cuando estos aislados se compararon con algunas cepas
pertenecientes a colecciones microbianas, se encontró que sus niveles
enzimáticos eran superiores a los mostrados por las cepas de referencia.
4) Gomes y Steiner en 2004, llevaron a cabo una revisión sobre la potencialidad
que tienen los microorganismos que crecen en ambientes extremos, con baja o
alta temperatura, alto o bajo pH, salinidad, alta concentración de metales, baja
actividad de agua, radiación y alta o baja tensión de oxígeno. Ellos encontraron
que tales organismos producían extremoenzimas con actividades de celulasas,
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amilasas, xilanasas, proteasas, pectinasas, queratinasas, lipasas, esterasas,
catalasas y peroxidasas.
1.3 Antecedentes directos del trabajo
Los estudios referidos dan la pauta del enorme y versátil potencial
biotecnológico que pudieran tener aquellos microorganismos aislados de
ambientes peculiares o extremos, donde se supone a priori; que sólo existe una
microbiota muy especializada, acorde con los nutrientes predominantes y las
condiciones ambientales existentes. Habitualmente no se piensa que en dichos
lugares pudiera existir una flora diversa, capaz de utilizar gran variedad de
sustratos.
Con respecto al perfil enzimático extracelular de la microbiota existente en
suelos altamente contaminados con hidrocarburos del petróleo, no se encontró
ninguna referencia que pudiera servir de antecedente al presente estudio. Por
otra parte una de las estrategias más usuales para biorrestaurar suelos con alto
contenido de hidrocarburos es el composteo con materiales de desecho, el cual se
practica empíricamente bajo un enfoque de “ensayo y error”, con resultados a
veces excelentes pero malos en otras ocasiones. Cuando hay buenos resultados
se argumenta que los materiales añadidos al suelo mejoran su textura,
composición y aireación. También se arguye que se propicia una mejor adsorción
de los contaminantes sobre las partículas presentes, lo que da lugar a la formación
de microhábitats donde los hidrocarburos son degradados más fácilmente por la
microbiota nativa.
Curiosamente, no existen estudios donde se haya realizado previamente un
estudio del perfil enzimático extracelular de la microbiota presente en los suelos
altamente contaminados con hidrocarburos a fin de seleccionar los materiales a
usar en el composteo, considerando su composición química, puesto que además
de mejorar las condiciones fisicoquímicas del suelo, tales desechos deben servir
como fuentes de carbono, energía y nitrógeno para la microflora presente.
Tampoco se ha considerado enriquecer la flora microbiana de los suelos
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contaminados, con microorganismos que tengan la capacidad de degradar
simultáneamente los hidrocarburos presentes, y los desechos a utilizar en el
composteo mediante la producción de las enzimas adecuadas.
En base a estas ideas se desarrolla en nuestro laboratorio un trabajo
paralelo que se inició con el aislamiento de 52 cepas bacterianas
hidrocarbonoclastas, a partir de 20 muestras de suelo del campo petrolero
“Paredón 31” en el Estado de Tabasco. Tales cepas podían producir proteasas
(caseinasas) y quitinasas cuando se cultivaban en medios con carapacho molido
de camarón, o queratinasas si eran cultivadas en presencia de plumas de pollo
molidas. Después se hicieron selecciones muy cuidadosas en cultivo sumergido,
que permitieron integrar 2 consorcios microbianos, uno capaz de degradar
hidrocarburos en presencia de desechos de camarón (consorcio
hidrocarbonoclasta-proteo-quitinolítico), y otro con la capacidad de degradar
hidrocarburos en presencia de materiales queratinosos como plumas molidas de
pollo (consorcio hidrocarbonoclasta-queratinolítico). Evaluaciones muy cuidadosas
mostraron que en presencia de los desechos mencionados, la degradación de los
hidrocarburos del petróleo era significativamente mayor, que cuando las bacterias
se cultivaban en presencia de petróleo como única fuente de carbono. Además,
se comprobó que en ambos procesos: la degradación de los hidrocarburos del
petróleo y la utilización de los desechos, ocurría simultáneamente. La utilización
de los desechos de camarón ocurría mediante la secreción de proteasas y
quitinasas, en tanto que la de las plumas molidas requería la secreción de
quitinasas extracelulares. También se demostró que el porcentaje de degradación
de los hidrocarburos del petróleo era significativamente mayor en presencia de los
desechos queratinosos (plumas de pollo molidas) que en presencia de los
desechos de camarón.
Los resultados anteriores sugieren fuertemente, que una remoción exitosa
de los hidrocarburos presentes en un suelo contaminado con petróleo, depende en
gran medida de que la composición química de los desechos a utilizar en el
composteo, sea acorde al perfil enzimático de la microbiota presente en ese suelo,
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o que es añadida para enriquecer la flora del suelo a restaurar. Incluso sugiere
que es posible obtener consorcios microbianos “a la medida”, para ser utilizados
según la composición química de los desechos a utilizar.
Con objeto de obtener información adicional que avale o no las ideas
anteriores, en el presente trabajo se investiga el perfil exoenzimático de las 52
cepas bacterianas, ya referidas, considerando esencialmente hidrolasas capaces
de actuar sobre distintos tipos de biopolímeros como proteínas, polisacáridos,
lípidos y ácidos nucleicos, a fin de establecer qué tipo de desechos serían
adecuados para biorrestaurar este tipo de suelos.
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2.0 OBJETIVO GENERAL Evaluar el perfil de enzimas hidrolíticas extracelulares de 52 aislados
bacterianos hidrocarbonoclastas, procedentes de 20 muestras de suelos del
campo petróleo “Paredón 31”, ubicado en el estado de Tabasco.
3.0 OBJETIVOS PARTICULARES
3.1 Investigar la capacidad proteolítica de 52 aislados bacterianos
hidrocarbonoclastas, evaluando las actividades de caseinasas,
queratinasas y elastasas.
3.2 Determinar la capacidad de tales aislados para degradar diversos
polisacáridos, considerando las actividades de amilasa, celulasa,
quitinasa, quitosanasa y pectinasa.
3.3 Evaluar la capacidad de las referidas bacterias para degradar
sustancias lipídicas, como grasas, fosfolípidos y ésteres (lipasas,
fosfolipasas y esterasas).
3.4 Evaluar su capacidad para producir nucleasas (DNasas).
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4.0 HIPOTESIS
Una porción significativa de la microbiota hidrocarbonoclasta existente
en los suelos altamente contaminados con hidrocarburos, posee la capacidad
de producir en forma inducida hidrolasas extracelulares, que degradan los
principales biopolímeros de la naturaleza, como proteínas, polisacáridos,
lípidos y ácidos nucleicos.
5.0 JUSTIFICACION
5.1 Desde el punto de vista biotecnológico, la presente investigación puede
contribuir a conocer la capacidad hidrolítica de la microflora presente en
suelos altamente contaminados con hidrocarburos del petróleo. Esta
información es relevante para seleccionar el tipo de desechos a utilizar
en un proceso de biorremediación por composteo. Además,
eventualmente podrían obtenerse aislados con una alta capacidad
para producir algún tipo de enzima de interés práctico.
5.2 El presente trabajo puede dar las bases para seleccionar consorcios
hidrocarbonoclastas, que además degraden eficazmente algunos tipos
particulares de desechos, por ejemplo, celulósicos, amiláceos,
quitinosos, queratinosos, etc. Estos consorcios y los desechos
respectivos podrían añadirse al inicio del composteo.
5.3 Desde el punto de vista básico, este estudio podría contribuir a
entender qué tipo de materiales pueden ser cometabolizados
preferentemente, para una biodegradación más eficaz de los
hidrocarburos del petróleo.
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6.0 MATERIALES Y METODOS 6.1 Microorganismos utilizados y su conservación. Se utilizaron 52 aislados bacterianos capaces de crecer en presencia de
hidrocarburos del petróleo como única fuente de carbono (hidrocarbonoclastas)
provenientes de 20 suelos contaminados del campo petrolero “Paredón 31”,
ubicado en el Estado de Tabasco. A los aislados se les asignó una clave para su
identificación, por ejemplo PE1A-a, en donde PE = pozo exploratorio; 1A =
número de muestra y a = es uno de los varios aislados encontrados en la misma
muestra.
Como microorganismos de referencia se utilizaron cepas caracterizadas
previamente como altas productoras de ciertas enzimas; por ejemplo Serratia
marcescens WF secreta cuando se cultiva en medios apropiados: caseinasa,
quitinasa, elastasa, esterasa, fosfolipasa, lipasa y nucleasa. Bacillus
thuringiensis Bt-132 produce quitosanasa, amilasa y queratinasa. Erwinia
carotovora secreta pectinasa, y como productor de celulasas se utilizó el hongo
Trichoderma reesei (antes T. viridae).
La conservación de las cepas de referencia se hizo mediante resiembras
trimestrales por estría cruzada en placas con agar nutritivo para confirmar pureza,
después de una incubación a 28°C durante 18-24 h. De una colonia típica se
resembró en tubos con agar nutritivo inclinado y se incubó en las condiciones
citadas. Las cepas crecidas se conservaron en refrigeración hasta la siguiente
resiembra. El hongo T. reesei se conservó bajo un esquema similar pero usando
papa-dextrosa-agar.
La conservación de los aislados hidrocarbonoclastas se realizó en medios
especiales, con hidrocarburos del petróleo como fuentes de carbono, según se
describe a continuación. Cada tres meses se hicieron resiembras en placas
conteniendo un medio mineral basal (MMB), cuya composición en g/L de agua
destilada es: 0.4 KH2 PO4, 1.6 K 2H PO4; 1.5 NH4Cl; 0.17 MgCl2 6H2O; 1.5
NaSO4 7H 20 y 0.45 CaCl2 . 2H2O. El pH se ajustó a 7.0 y enseguida se añadió
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agar al 1.5%. El medio se esterilizó a 15 lb/plg2 durante 15 minutos, y se dejó
enfriar hasta 45°C para evitar su solidificación. Enseguida se le adicionó 1 %
(v/v) de una solución de oligoelementos, previamente esterilizada por filtración, la
cual estaba compuesta en g/L de 5.1 MgCl2. 6HO; 0.66 MnCl. H 2O ; 1.0 NaCl ;
1.0 FeCl 3. 6 H 2O ; 0.1 CaCl2. 2H2O ; 0.01 CuCl2 ; 0.08 ZnCl2 ; 0.05 AlCl3 ; 0.01
H3BO3 ; 0.04 Na2 MoO4. 2H2O. El medio ya completo se vació en placas estériles
en porciones de 18-20 mL y se dejó solidificar en reposo. Luego las placas se
sometieron a prueba de esterilidad dejando incubar a 37°C durante 24 h.
Posteriormente los aislados se sembraron por estría cruzada y en la cara interna
de las tapas de las cajas de Petri se colocó un círculo de papel filtro impregnado
con petróleo estéril. Al cerrar y sellar las placas con parafilm, se propició la
formación en su interior de una atmósfera de hidrocarburos volátiles, los cuales
sirvieron como única fuente de carbono y energía. Al cabo de 48-96 h a 28°C se
observaron colonias aisladas de bacterias hidrocarbonoclastas. Las cajas se
conservaron luego en refrigeración a 5°C hasta por 3 meses, antes de repetir la
resiembra.
El petróleo utilizado se sometió previamente a tres esterilizaciones
consecutivas cada 24 h, en autoclave a 5 lb/plg2 durante 60 min.
6.2 Morfología colonial y microscópica
Para determinar la morfología colonial, los 52 aislados hidrocarbonoclastas
fueron sembrados por estría cruzada en placas de agar nutritivo, y se incubaron a
28°C durante 24-48 h. La morfología microscópica se realizó tiñendo frotis por la
técnica de Gram, y observando a inmersión.
6.3 Perfil exoenzimático de los 52 aislados bacterianos.
6.3.1 Evaluaciones en placa.
La mayor parte de los ensayos se realizaron sobre medios sólidos
formulados con el MMB ya descrito, adicionado de un inductor particular, acorde
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con la enzima a evaluar, más extracto de levadura y casaminoácidos, ambos al
0.1 %, y agar al 1.5%. Los medios se esterilizaron en autoclave a 15 lb/plg2
durante 15 min, y ya fuera de la autoclave se dejaron reposar hasta que
alcanzaron 45°C. Enseguida se les adicionó 1% (v/v) de la solución de
oligoelementos ya referida, y se mezcló suavemente para homogeneizar. El
medio se vació luego en porciones de 15-18 mL en placas estériles y se dejó
solidificar en reposo. Las placas se sometieron a prueba de esterilidad
incubándolas 24 h a 37ºC.
Los ensayos se realizaron inoculando por picadura con palillos estériles,
cada uno de los 52 aislados hidrocarbonoclastas, más los testigos pertinentes, de
acuerdo a la enzima en estudio, y se incubó a 28ºC durante el tiempo requerido
para observar los halos resultantes a la actividad a evaluar. Caso contrario para
cuantificar las diferentes enzimas, se consideró el cociente que resultaba de dividir
el diámetro del halo en mm, entre el tamaño de cada colonia también en mm.
Las enzimas que se evaluaron por este procedimiento fueron: como
proteasas, la caseinasa y la elastasa, como degradadoras de polisacáridos: la
amilasa, la pectinasa, la quitinasa y la quitosanasa. Como degradadoras de
lípidos y sustancias similares: la lipasa, la fosfolipasa y la esterasa; y como
degradadoras de ácidos nucléicos, la DNasa.
A continuación se describen los aspectos particulares del cada ensayo
enzimático en medio sólido.
6.3.1.1 Caseinasa.
En este caso la caseina se mezcló en mortero con el MMB, de modo que su
concentración fuera 1%. Esta solución se colocó en baño maría a ebullición
durante 30 min, para desnaturalizarla, y hacerla más susceptible al ataque
enzimático. Después se añadió el resto de los reactivos y se procedió como ya
fue descrito. Después de la inoculación, se incubó por 48 h a 28ºC y se
observaron y midieron los halos de proteolisis formados. Como la caseina es
hidrolizada en dos etapas, formándose primero un precipitado grumoso blanco de
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paracaseinato de calcio, el cual es luego solubilizado formándose péptidos
solubles y aminoácidos, fue posible juzgar por el aspecto de los halos si los
aislados eran o no buenos proteolíticos. Por ejemplo, halos pequeños y
totalmente opacos indicaban baja actividad, halos muy grandes y transparentes,
con un borde exterior muy delgado y opaco, donde apenas estaba iniciándose el
proceso, indicaban una alta proteolisis. Naturalmente, se encontraron halos con
características intermedias entre estos dos extremos. En otras palabras para la
evaluación de las caseinasas hubo que considerar no sólo la relación de
diámetros, sino también el aspecto de los halos (Rojas Avelizapa et al. 1999).
6.3.1.2 Elastasa
En este caso las placas contenían elastina al 0.4% adicionado al MMB,
casaminoácidos, solución de oligoelementos y agar, como ya fue referido.
Después de la inoculación con palillos, se incubó a 28°C durante 96 h. La
secreción de la enzima dio lugar a la formación de halos transparentes en un
fondo opaco y granuloso (Kaur et al. 1988).
6.3.1.3 Amilasa
El medio sólido contenía almidón al 1% (p/v), para propiciar la producción
de amilasas. Después de la inoculación, las placas se incubaron 96 h a 28°C, y
luego fueron inundadas con lugol para poner de manifiesto los halos de amilolisis,
de aspecto transparente o amarillento, según el tipo de amilasa secretada.
Algunas degradan el polisacárido hasta dí o monosacáridos como maltosa y
glucosa, respectivamente. Otras veces se forman oligosacáridos mayores, a los
que genéricamente se llaman dextrinas. En el primer caso los halos son claros y
en el segundo amarillentos, con un fondo azul producido por el almidón presente
en el medio, y que no fue digerido por la enzima (Dhawale et al. 1982).
El lugol se preparó mezclando en un mortero 3 g de yodo con 6 g de yoduro
de potasio. Después se colectó el contenido del mortero, con pequeñas porciones
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de agua destilada, agregando al final suficiente agua para un volumen de 300 mL.
El reactivo se envasó en frasco ambar con tapón de vidrio.
6.3.1.4 Pectinasa
Las placas contenían el medio sólido adicionado de pectina al 1%. Luego
de la inoculación, las placas se incubaron 102 h a 28°C. Como el medio es
transparente, se requirió adicionar el detergente catiónico bromuro de cetil trimetil
amonio al 5%, para neutralizar las cargas negativas de los grupos carboxilatos del
ácido metilgalacturónico, presente en la pectina no digerida por la enzima. De este
modo, los halos de pectinasa se manifiestan como halos transparentes en un
fondo opaco del sustrato sin hidrolizar y que fue precipitado (Hubbel et al. 1978).
6.3.1.5 Quitinasa
El medio sólido contiene quitina coloidal al 12% (peso húmedo), para inducir
la secreción de quitinasa. En este caso se requiere incubar a 28°C por al menos
144 h, para apreciar los halos transparentes de quitinasa en un fondo granuloso y
opaco debido a las partículas insolubles de quitina.
La quitina coloidal se preparó a partir de quitina comercial (Sigma),
previamente molida en un molino de cuchillas Willey, y tamizando con una malla
#40. Esto es necesario porque el material original viene en forma de escamas
gruesas. El procedimiento consiste en colocar 100 mL de ácido fosfórico
concentrado (85%), en el fondo de un vaso de precipitados de vidrio de al menos 3
L. Luego se espolvorean 10 g de quitina molida y se mueve la pasta formada con
una varilla gruesa de vidrio. Después se deja reposar en el refrigerador durante
toda la noche. El material toma un aspecto oscuro y viscoso. Este tratamiento
debilita los puentes de hidrógeno que unen las moléculas lineales de quitina
formando haces muy compactos. Después se añade agua corriente o destilada,
en exceso, observándose la aparición de un material gelatinoso y blanco, que
resulta del hinchamiento de los agregados moleculares de quitina, por la
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incorporación de una gran cantidad de agua entre las moléculas de quitina, cuya
cohesión fue debilitada por el tratamiento ácido. Después se filtra a través de
varias capas de gasa, o con papel filtro ordinario, hasta eliminar las aguas
madres. El sedimento gelatinoso retenido en el filtro es luego lavado haciéndole
pasar un flujo constante primero de agua corriente y después de agua destilada
hasta eliminar el ácido y obtener un material con un pH 6.5. La quitina coloidal de
consistencia pastosa se transfiere a pequeños vasos de precipitados, que se
cubren con papel aluminio y se esterilizan en autoclave en la forma acostumbrada.
Para que no se deseque se conserva en refrigeración hasta su uso (Cruz
Camarillo y Chávez Camarillo 1976; Rojas Avelizapa et al .1999).
6.3.1.6 Quitosanasa
En este caso las placas contenían el medio sólido adicionado de quitosana
coloidal al 3% (peso húmedo). Como la quitosana coloidal es un material blanco y
granuloso a pH 6.5-7, la producción de la enzima se aprecia como halos
transparentes debidos a la solubilización de las partículas del substrato, lo que
generalmente se aprecia después de incubar 168 h a 28°C.
Como la quitosana es un homopolímero de glucosamina, con un grupo
amino en la posición 2, el polisacárido se comporta como un policatión soluble a
pH ácido. Por lo tanto la obtención del material coloidal es más laborioso que el
de la quitina coloidal.
Primero se muelen las escamas de quitosana (Sigma, desacetilada en un
85%) en un molino Willey. Luego se mezclan en un vaso de precipitados de 2-3 L,
3 g de quitosana molida con 30 mL de ácido fosfórico al 85% y se deja en reposo
dentro de un refrigerador durante 24 h. Después se añade 1 L de agua destilada y
se agita suavemente con una varilla de vidrio. La quitosana como policatión a pH
ácido forma una solución transparente, y se requiere añadir 2 L de etanol frío
(-15°C) para precipitarla. El sedimento se colecta por centrifugación en frío a
6000 rpm/15 min, y se descarta el sobrenadante. El sedimento, blanco y
gelatinoso, se resuspende en etanol frío y se recupera por centrifugación. El
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procedimiento se repite las veces necesarias hasta que el pH de la suspensión es
cercano a la neutralidad. El material coloidal, de consistencia pastosa, se
transfiere a pequeños vasos de precipitados, se cubre con papel de aluminio y se
esteriliza en autoclave. Luego se conserva en refrigeración hasta su uso (Cruz
Camarillo et al. 2004).
6.3.1.7 Lipasa
El inductor agregado al medio sólido fue mantequilla al 5 %. También se
adicionó resarzurina al 0.01% como indicador, ya que tiene la peculiaridad de
mostrar distintos colores; así, a pH 6.6 muestra un color rosa, a 5.3 es rojo y a 4.8
amarillo. La mantequilla es una mezcla de triglicéridos, es decir de esteres del
glicerol, cuyos tres oxhidrilos están esterificados con diferentes ácidos grasos,
particularmente el ácido butírico. Cuando se secretan las lipasas al medio ocurre
la hidrólisis de los enlaces de éster, y los ácidos grasos libres se acumulan en
torno a la colonia del aislado en estudio. El grupo carboxilato de los ácidos grasos
tiene un pk cercano a 4.7, lo que indica que debajo de este valor está protonado y
se comporta como ácido, lo cual se apreciaría por un color amarillo de los halos.
Si los halos fueran rojos indicaría que se tiene un pH superior a 4.7.
Esta prueba fue instaurada por Nava en 1995, encontrando los mejores
resultados al usar la resarzurina al 0.1%. En estas condiciones las placas
muestran un fondo rojo y las colonias que secretan lipasa exhiben halos de color
amarillo. Posteriormente se redujo la concentración de resarzurina a 0.01%, lo
que aumentó la sensibilidad de la prueba, en este caso las placas muestran un
color azul-violeta, y el halo que muestran las colonias lipasa-positivas es de color
rojo (Tenorio Sánchez 2000). Resultados similares fueron observados en el
presente trabajo.
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6.3.1.8 Fosfolipasa
El medio sólido fue adicionado de yema de huevo obtenida al momento, al
3%. Este material es rico en lecitinas, uno de los fosfolípidos más abundantes,
compuesto por el glicerol, que tiene esterificados los oxhidrilos de sus posiciones 1
y 2 ( � y � ) con ácidos grasos. El oxhidrilo 3 del glicerol está esterificado con
fosforilcolina. En consecuencia, las lecitinas poseen moléculas anfipáticas porque
tienen una región polar en la parte correspondiente a la fosforilcolina, y una
porción hidrofóbica correspondiente a las cadenas de los ácidos grasos; además
son moléculas bipolares porque el residuo de fosforilcolina posee cargas negativas
en el grupo fosfato, y una carga positiva en el grupo trimetil amonio de la colina.
Estas peculiaridades explican porque las membranas biológicas contienen
siempre una capa de fosfolípidos, los cuales orientan su porción polar hacia la
región acuosa y la hidrofóbica hacia la región lipídica.
Los microorganismos secretan generalmente 2 tipos de lecitinasas, las A y
las C. Las primeras separan el ácido graso unido al carbono �, el cual
normalmente es insaturado, y producen un monoglicérido, esterificado con un
ácido graso (generalmente saturado) en el carbono � del glicerol, y esterificado
con fosforilcolina en el carbono �’. Este compuesto sigue siendo bipolar y
anfipático, y tiene afinidad por el agua a través de su porción polar. Cuando actúa
una lecitinasa A se forman halos claros. Las lecitinas C separa la fosforilcolina y
queda por tanto un diglicérido insoluble, y los halos son opacos (Crisope et al.
1976; Nava Fonseca 1995).
6.3.1.9 Esterasa
Las esterasas se consideran relacionadas con las enzimas lipolíticas,
porque los lípidos son ésteres del trialcohol glicerol con ácidos grasos, y los
ésteres típicos resultan de la unión de un monoalcohol lineal, con un ácido
carboxílico que puede o no ser un ácido graso. Consecuentemente, lipasas y
esterasas rompen el mismo enlace químico.
19
Para este ensayo se agregó al medio sólido Tween 80 al 4% como inductor,
y cloruro de calcio al 0.05% para visualizar los halos de hidrólisis. La prueba se
basa en que la enzima ataca un grupo ester de la molécula del detergente, y
separa ácido oleico, en forma de oleato, es decir posee un radical caboxilato con
una carga negativa, que rápidamente se une a los cationes divalentes de calcio,
para formar la sal insoluble de oleato de calcio. La acción de esta enzima se hace
visible por la formación de halos granulosos y blanquecinos de oleato de calcio en
torno a las colonias esterasa-positivas(Lovell, J. D. & Bibel, D. 1977. )
6.3.1.10 Nucleasa
A la formulación del medio sólido se añade en este caso DNA (de esperma
de salmón, Sigma) al 0.03%, además de azul de ortotoluidina al 0.0025%. La
prueba se fundamente en que el colorante y el DNA íntegro forman un complejo
de color azul. Cuando el DNA es hidrolizado, el complejo muestra un color rosa,
por tanto la presencia de una DNasa se visualiza por la formación de halos rosas
(Lachica et al 1971).
Cabe agregar que las nucleasas extracelulares de origen microbiano tienen
un carácter digestivo y son inespecíficas, es decir degradan moléculas de DNA o
RNA hasta oligonucleótidos de bajo peso molecular, que pueden ingresar a las
células, para ser usadas como fuente de carbono y nitrógeno o bien para la
construcción de moléculas más complejas a través de ciertas rutas biosintéticas.
6.3.2 Evaluación en medio líquido de las actividades extracelulares de
queratinasa y celulasa, de los 52 aislados bacterianos.
La evaluación de ambas enzimas se basa en el cultivo de los
microorganismos a estudiar, en un medio mineral adicionado de un sustrato
queratinoso o celulósico (lana o papel), ambos teñidos con azul brillante de
remazol (Cedillo Robles 2000; Poincelot & Day 1972). Dichos materiales actúan
como inductores, fuentes de carbono y sustratos enzimáticos. De modo que
20
primero se inducen las enzimas y luego se secretan al medio. Al secretarse la
queratinasa o la celulasa los sustratos teñidos correspondientes son
despolimerizados y solubilizados, quedando libre el colorante, el cual puede
evaluarse espectrofotométricamente a 595 nm. Explicándolo en forma más
simple, al inicio de la prueba ambos sustratos teñidos están suspendidos en el
medio como partículas o materiales insolubles; al ocurrir la producción y secreción
de la queratinasa y/o celulasa, los sobrenadantes van paulatinamente tornándose
de un azul cada vez más intenso, conforme la concentración enzimática aumenta
y más partículas de sustratos son solubilizadas.
En estos ensayos se utilizó el MMB ya referido para los ensayos en placa,
pero suprimiendo el agar. Alícuotas de 5 mL de este medio se colocaron en
frascos para antibióticos, y después de manera individual se añadieron 50 mg del
sustrato teñido inductor, de manera que su concentración final en el medio fuera
1% (p/v). Los métodos de tinción utilizados se describirán posteriormente.
Después de colocarles su respectivo tapón de algodón y gasa, así como su
capuchón protector individual, los matraces se esterilizaron en autoclave a 15
lb/plg2.
Por otra parte, los inóculos frescos de cada uno de los 52 aislados, fueron
obtenidos haciendo tres resiembras consecutivas cada 18 h, en matraces
Erlenmeyer de 50 mL, conteniendo 10 mL de caldo nutritivo. La incubación fue
siempre en agitación (180 rpm) a 28°C. De este modo se consiguieron inóculos
frescos, metabólicamente activos y relativamente sincronizados. De la tercera
resiembra se tomaron 0.1 mL de cada aislado y se inocularon los matraces
conteniendo los sustratos teñidos, para evaluar queratinasa y celulasa. Como
testigos negativos se dejaron matraces sin inocular, y como testigos positivos se
inocularon B. thuringiensis para queratinasa, y T. reesei para celulasa. Todos los
matraces se incubaron luego a 180 rpm a 28°C durante 7 días (168 h). Luego el
contenido de cada matraz se centrifugó a 8000 rpm/15 min, y los sobrenadantes
se leyeron a 595 nm.
21
La actividad se expresó como unidades de queratinasa o celulasa. En
ambos casos una unidad fue la cantidad de enzima que produjo un incremento de
0.010 en la absorbancia a 595 nm, en las condiciones utilizadas en el ensayo.
6.3.2.1 Preparación de la lana teñida.
Se utilizó lana blanca de borrego, la cual primero se limpió de basura y
después se lavó con detergente y agua corriente. Luego se enjuagó con exceso
de agua corriente y se dejó reposar 24 h en una palangana con agua destilada.
Se exprimió y se dejó secar al sol. El material seco se introdujo en una solución
de sulfito de sodio 0.5 M, y se dispersó y homogeneizó lo mejor posible. El
recipiente se introdujo luego en una olla Express para darle un tratamiento térmico
a presión (15 lb/plg2), no tanto para esterilizar sino para propiciar un efecto
reductor que rompa los puentes de disulfuro de la queratina. El material obtenido
se dejó reposar en un baño de agua tibia, adicionado de vinagre durante 1 h, y
luego se lavó exhaustivamente con agua corriente hasta la total eliminación de
olores sulfurosos. La lana tratada se dejó secar nuevamente y se procedió a su
tinción. Para ello se utilizó 1 g de azul brillante de remazol, por cada 30 g de lana,
adicionando agua suficiente para cubrir perfectamente el material. Luego se
calentó hasta ebullición y se mantuvo así por 1 h. El material teñido y exprimido
se introdujo en una cuba conteniendo una solución de dicromato de sodio y
tartrato de sodio, ambos al 1.5%, con el propósito de mordentar; es decir, fijar el
color. El tratamiento se realizó a temperatura de ebullición durante 10 min. La
lana teñida se exprimió y después se enjuagó con agua tibia cuanto fue necesario
hasta que ya no hubo desprendimiento del colorante. Enseguida se dejó secar al
sol. La lana ya teñida fue finalmente molida en un molino de cuchillas Willey, y se
tamizó en una malla #40. El polvo azul fue guardado en un frasco hermético a
temperatura ambiente hasta su uso (Cedillo Robles 2000).
22
6.3.2.2 Preparación del papel teñido
Se utilizó la técnica de Poincelot & Day (1972), consistente en colocar una
hoja de papel filtro Whatman #1 de 30 x 45 cm, en una charola metálica de
tamaño apropiado. El papel se cubrió con 250 mL de agua a temperatura de
ebullición, y mediante el deslizamiento de un rodillo se eliminaron las burbujas de
aire que estaban bajo el papel. Enseguida se añadieron 250 mL de una solución
de azul brillante de remazol al 0.6% previamente calentado a ebullición, y se
propició la acción del colorante mediante movimientos continuos de la charola. A
intervalos de 2 min y durante 10 min, se agregaron alícuotas de 20 mL de una
solución de sulfato de sodio al 30%, procurando agitar continuamente para
homogeneizar la solución. Después se agregaron gota a gota 15 mL de una
solución de fosfato trisódico al 10%, previamente calentada a ebullición. Después
de reposar 10 min se eliminó todo el líquido para lavar el papel teñido dentro de la
misma charola, haciendo circular agua corriente primero y dejando reposar
enseguida en agua destilada hasta obtener soluciones claras. Finalmente se
adicionó etanol hasta eliminar el exceso de colorante no fijado al papel.
Finalmente el material teñido se dejó secar al aire, y después se molió en un
molino Willey y se tamizó usando una malla # 40. El material se guardó en frasco
de boca ancha a temperatura ambiente, hasta su uso.
6.3.2.3 Preparación de celulosa coloidal teñida.
Con objeto de hacer más sensible el ensayo para evaluar las celulasas, se
utilizó también un material coloidal teñido, haciendo algunas modificaciones a la
técnica de Poincelot & Day (1972) ya descrita. En este caso se utilizaron como
materia prima hojas blancas de papel bond, las cuales fueron recortadas con
tijeras en pequeños cuadritos. Estos fueron disgregados en un molino Willey, y el
material obtenido se tamizó en una malla # 40. Por otra parte, en un vaso de
precipitados de vidrio de 2-3 L se colocaron 100 mL de ácido fosfórico al 85%,
sobre los cuales se espolvorearon 5 g del polvo de papel bond, y se mezcló
23
cuidadosamente con una varilla de vidrio; después se dejó reposar durante una
noche en el refrigerador. A continuación se agregó agua destilada en cantidad
suficiente, para propiciar la formación de un material blanco y gelatinoso que es la
celulosa coloidal. Luego se filtró sobre papel filtro para separar las aguas madres,
y el material retenido se lavó haciéndole pasar un flujo continuo de agua de la
llave, hasta lograr que el pH del agua de salida y el de entrada al filtro fuera el
mismo.
La tinción de la celulosa coloidal se consiguió colocando 35 g (peso
húmedo) del material coloidal, en 250 mL de una solución de azul brillante de
remazol al 0.6%, y se calentó a ebullición durante 30 min, teniendo cuidado de
mezclar con frecuencia usando una varilla de vidrio. Enseguida se hicieron 5
adiciones cada 2 min, de 20 mL de una solución de sulfato de sodio al 30%,
manteniendo la temperatura de ebullición y la agitación continuas. A continuación
se agregaron gota a gota, 15 mL de una solución de fosfato trisódico al 10%,
manteniendo las condiciones de reacción durante 10 min más. Después se dejó
enfriar en reposo y a temperatura ambiente, y se filtró sobre papel filtro ordinario.
Luego se lavó el material retenido haciéndole pasar agua caliente, hasta que el
agua de salida era casi clara. La eliminación final de colorante no unido al sustrato
se logró haciendo pasar etanol, y después enjuagues finales en agua calentada a
ebullición.
24
7.0 RESULTADOS Y DISCUSION
7.1 Morfología colonial y microscópica de los 52 aislados bacterianos
hidrocarbonoclastas.
Como fue mencionado, fueron 52 los aislados bacterianos obtenidos en el
presente trabajo, que fueron capaces de utilizar hidrocarburos volátiles del
petróleo como fuente de carbono y energía. Todos los aislados fueron de tipo
bacilar, no esporulados, casi siempre bacilos cortos (30/52; 58%). También hubo
predominancia de bacilos Gram negativos (35/52; 67%). Si se analizan como
grupos, los 35 aislados Gram-negativos mostraron a las 48 h colonias pequeñas,
de entre 2 y 3 mm de diámetro, predominantemente circulares ( 27/35) y bordes
enteros (18/35). Un buen número de los aislados eran de color amarillo (18/35),
aunque con diferente intensidad o transparencia. Algunos mostraron colonias
blancas (15/35), y hubo uno de color anaranjado. Las colonias mostraban
predominantemente una superficie convexa (32/35) y lisa (30/35),
mayoritariamente brillante (28/35) y húmeda (26/35), de consistencia suave
(29/35). En este grupo predominaron los bacilos cortos (28/35).
En cuanto a las colonias de los aislados Gram-positivos, éstas eran de 5
mm de diámetro (14/17), casi siempre blancas (14/17), aunque se encontraron dos
aislados de color salmón y otro amarillo intenso; sus bordes eran dentados (12/17)
o lisos (3/17), superficie convexa (14/17), lisa (16/17), casi siempre húmeda
(16/17) y opaca (13/17), de consistencia suave (14/17). Los bacilos eran
predominantemente largos (14/17). Aunque no fue un evento frecuente, algunos
aislados mostraron características morfológicas muy similares, por ejemplo el
PE1Ac y el PE2Ab, fueron bacilos largos Gram-positivos, cuyas colonias eran
blancas, de 5mm de diámetro, bordes dentados, convexas, lisas de aspecto
húmedo y opaco y consistencia suave. Otro ejemplo fueron los aislados PE2A-a y
PE4A-a, microscópicamente caracterizados como bacilos cortos Gram-negativos,
cuyas colonias de color amarillo claro tenían 2 mm de diámetro, forma circular,
bordes lisos, superficie convexa y lisa, de aspecto húmedo, brillante y translúcido,
y consistencia suave. No obstante su semejanza, los aislados referidos se
consideraron diferentes por provenir de diferentes muestras de suelo.
25
7.2 Perfil enzimático extracelular de los 52 aislados bacterianos
hidrocarbonoclastas.
7.2.1 Enzimas proteolíticas
En el presente trabajo se estudió la secreción de tres proteasas, capaces
de hidrolizar sustancias con características muy distintas, como son caseina,
elastina y queratina. La primera es una proteína nutricional, presente en la leche
de los mamíferos, de forma globular soluble y con una composición de
aminoácidos muy equilibrada, pues posee un buen balance entre aminoácidos
aromáticos, polares, alifáticos, azufrados, hidroxilados, etc. Su importancia radica
en su alto contenido en aminoácidos nutricionalmente esenciales. La elastina es
una proteína fibrosa, presente en el tejido conectivo de los animales,
particularmente en los ligamentos, por sus características de elasticidad. Su
composición es muy peculiar pues tiene una elevada proporción de valina, un
aminoácido alifático, de prolina, un aminoácido cíclico, y de glicina. Su proporción
de aminoácidos polares y aromáticos es muy baja. La queratina es también una
proteína fibrosa, insoluble, que forma parte de la piel y sus apéndices como pelo,
uñas, pezuñas y cuernos de los animales superiores. Esta proteína forma haces
moleculares insolubles fuertemente unidos a través de multiples puentes de
disulfuro, por su alto contenido de cistina (Leheninger 1971).
Considerando lo anterior, puede pensarse a priori que caseinasas, elastasas y
queratinas deberán ser enzimas con diferente especificidad, para poder reconocer
sustratos tan distintos.
26
7.2.1.1 Caseinasas
Fue interesante comprobar, que no obstante que las proteasas
extracelulares son enzimas microbianas muy comunes, sólo 32 (61%) de los
aislados bacterianos fueron caseinasa-positivos, y que sus niveles enzimáticos
fueron muy distintos.
Por otra parte, en la figura 1 se comparan los niveles de producción de caseinasa
en los 32 aislados positivos. Puede observarse que los valores varían de uno a
otro caso, lo cual es un fenómeno común; sin embargo, destacan como los más
activos los aislados PE1A-d, PE4A-i y PE6A-d. Todos ellos corresponden a
bacilos cortos Gram-negativos, de color amarillo, aunque PE4A-h y PE6A-d
forman colonias circulares de borde liso, superficie convexa, translúcida,
brillante y de consistencia suave. El aislado PE1A-d difiere en que sus colonias
tienen borde lobulado, son convexas, secas y duras. Cabe destacar que los
aislados referidos, aunque son buenos proteolíticos, producen menos caseinasa
que la cepa de referencia S. marcescens Wf.
Figura 1. Actividad caseinolítica de los 32 aislados bacterianos hidrocarbonoclastas, positivos para este ensayo.
0
1
2
3
4
5
6
PE
1A- a
PE
1 A-c
PE
1A- d
PE
2 A-a
PE
2A- b
PE
2 A-c
PE
2 A- d
PE
4 A-d
P
E4A
- e
PE
4 A-h
PE
4 A
- iP
E5 A
-aP
E5 A
-cP
E5 A
-eP
E5
A- f
PE
6A- a
PE
6 A-b
PE
6 A-d
PE
7 A- a
PE
7A- c
PE
7 A-e
P
E8 A
-aP
E8 A
-dP
E9A
- aP
E9 A
-bP
E9A
- cP
E9 A
-dP
E11
A- a
PE
1 1A
- dP
E12
A-a
PE
1 2A
- eP
E1 3
A-a
PE
1 3A
- cS
mW
f
Aislados
Act
ivid
ad c
asei
nolít
ica n
nnR
elac
ión
halo
/col
onia
27
7.2.1.2 Elastasas
La degradación de la elastina en el medio sólido fue observada primero por la
parte inferior de las placas, después de una incubación de 96 h a 28°C.
Posteriormente se hicieron más evidentes los halos transparentes en torno a las
colonias
elastasa
positivas, los cuales contrastaban con la opacidad del medio.
Del total de 52 aislados bacterianos en estudio, 19 secretaron elastasas (36%), lo
cual es inferior al 62% observado en el caso de las caseinasas, sugiriendo que
pudieran ser proteasas distintas. Probablemente por sus características
estructurales, la elastina es una proteína de más difícil digestión, y por eso son
menos los aislados capaces de degradarla, en relación a lo observado con la
caseina.
Con el propósito de mostrar cuales fueron los aislados elastasa-positivos, y
su actividad relativa, en la figura 2 se muestran los datos correspondientes en
función de una escala arbitraria, en donde los aislados PE4A-h, PE4A-k y PE6A-d
fueron los más elastolíticos con una relación de diámetros halo/colonia entre 1.8 y
2.2. A otros 3 se les asignó una actividad intermedia cercana a 1.5 (aislados
PE1A-d, PE8A-a y PE11A-a). El resto mostró valores inferiores. Cabe resaltar
que de acuerdo a este criterio, a la cepa eslastolítica de referencia B. thuringiensis
Bt-132 podría asignársele apenas un calificativo de “mediana”.
28
Cabe resaltar que de los 19 aislados que mostraron acción elastolítica, 16
están incluidos en el grupo de los 32 caseinolíticos, sugiriendo que pudieran
producir tanto caseinasas como elastasas, o bien proteasas inespecíficas capaces
de hidrolizar ambos sustratos. Los aislados que sólo produjeron elastasas fueron
PE4A-k, PE5A-b y PE9A-e. El primero fue uno de los más elastolíticos, no así los
2 últimos que tuvieron una actividad baja, sin embargo, es probable que estos tres
aislados sí produzcan proteasas específicas, capaces de degradar sólo elastina.
7.2.1.3 Queratinasas
La actividad en este caso fue evaluada en un medio líquido donde el substrato
era lana teñida con azul brillante de remazol, de manera que al ocurrir la secreción
de queratinasa, la lana es solubilizada, y el colorante liberado es evaluado
espectrofotométricamente a 595 nm.
Figura 2. Aislados que presentaron actividad de elastasa en placas con elastina al 0.4 % (96h/28ºC). A=actividad alta (factor 1.80-2.20) B = Actividad media (factor1.40 -1.79) y C = actividad baja (factor 1.00-1.39)
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
2.2
2.4
PE
1A-c
PE
1A-d
PE
2A-b
PE
4A-d
PE
4A-e
PE
4A-h
PE
4 A
-i
PE
4A-k
PE
5A-b
PE
5A-c
PE
6A-a
PE
6A-d
PE
7A-c
PE
8A-a
PE
9A-a
PE
9A-e
PE
11A
-a
PE
13A
-a
PE
13A
-c
Bt-
132
Aislados
Act
ivid
ad d
e el
asta
sa
u R
elac
ión
hal
o / c
olon
ia
A
B
C
29
De los 52 aislados bacterianos estudiados, 35 (67%) mostraron actividad de
queratinasa. Este dato es similar al encontrado con las caseinasas (62% de
positividad). Esta coincidencia se refuerza al considerar que de los 35 aislados
queratinolíticos, 29 mostraron también actividad de caseinasa, lo que sugiere otra
vez que estos microorganismos pudieran producir proteasas inespecíficas,
capaces de solubilizar caseina y queratina, y en algunos casos también elastina.
En la figura 3 se consignan los niveles de producción de queratinasa de los
35 aislados bacterianos positivos. En este caso la dispersión de los valores es
muy amplia, probablemente porque la evaluación espectrofotométrica es más
sensible. Como puede observarse el aislado más queratinolítico fue PE1A-d, y
con valores algo más bajos PE4A-h, PE5A-c y PE6A-d. Es interesante subrayar
que PE1A-d fue también el aislado más caseinolítico, aunque produjo niveles
medianos de elastasa. Los otros tres, también fueron capaces de producir las tres
proteasas en estudio.
Figura 3. Evaluación espectrofotométrica de la actividad de queratinasa, de los 35 aislados bacterianos que la produjeron. Los cultivos se realizaron en el MMB adicionado de lana teñida como fuente de carbono, incubando a 180 rpm, y 28 ° C durante 168 h. L os límites fueron: cuando A585nm era superior a 1, la actividad era alta (A) ; entre 0.5-0.99 mediana (B ), y debajo de 0.49 baja (C) .
.
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
PE
1A-a
PE
1A-c
PE
1A-d
PE
2A-a
PE
2A-b
PE
2A-c
PE
2A-d
PE
4A-b
PE
4A-d
PE
4A-e
PE
4A -f
PE
4A-h
PE
4 A
-iP
E5A
-aP
E5A
-cP
E5A
-dP
E5
A-f
PE
6A-a
PE
6A-b
PE
6A-d
PE
7A-a
PE
7A-c
PE
7A-e
PE
8A-a
PE
8A-d
PE
9A-a
PE
9A-b
PE
9A-c
PE
9A-g
PE
11A
-aP
E12
A-a
PE
12A
-bP
E12
A -f
PE
13A
-aP
E13
A-c
Bt-
132
Aislados
Abs
orba
ncia
595
nm
lll A
B
C
30
7.2.2 Enzimas Degradadoras de polisacáridos
En este caso se investigó la producción de amilasas, celulasas, quitinasas,
quitosanasas y pectinasas. Los substratos de estas enzimas difieren
grandemente en sus estructuras, propiedades y usos prácticos, según se resume
a continuación.
El almidón es el polisacárido de reserva vegetal, más ampliamente utilizado
en alimentación, y en diversas industrias como la panadera y cervecera. El
almidón no es una sustancia pura, sino una mezcla de 2 polisacáridos diferentes,
la amilosa y la amilopectina. La amilosa está constituída por largas cadenas de
glucosa eslabonadas por enlaces glicosídicos �-1,4, que cada 6 unidades dan una
vuelta , propiciando una conformación helicoidal, hidrofóbica en su interior e
hidrofílica en su superficie. Esta sustancia reacciona rápida y específicamente con
el lugol formando un complejo de color azul, donde átomos de yodo se acomodan
en el interior de la hélice. La amilopectina por su parte es una molécula
ramificada, pues sobre una cadena de glucosas unidas por enlaces glicosidicos �-
1,4, se desprenden cadenas laterales cada 10-12 unidades, mediante un enlace
glicosídico �-1,6. Las ramificaciones también consisten de glucosas unidas por
enlaces glicosídicos �-1,4.
Por su parte la celulosa es asímismo un homopolímero de glucosa, cuyas
unidades están eslabonadas por enlaces glicosídicos �-1,4. Las cadenas
lineales resultantes se agregan en grandes haces llamadas microfibrillas,
mediante infinidad de puentes de hidrógeno. De todo ello resultan estructuras
macromoleculares extraordinariamente resistentes y fuertes, acordes con la
función estructural de la celulosa en los vegetales, donde se encuentra firmemente
asociada a la lignina y a otras substancias. Los materiales celulósicos tiene usos
amplios en las industrias maderera y forrajera, y aunque desde mucho tiempo
atrás se ha buscado convertir la celulosa en glucosa, y de ahí obtener múltiples
compuestos, este proceso no ha sido económicamente viable, por que la
eliminación previa de la lignina es muy costosa.
31
La quitina es un homopolisacárido animal, muy abundante en insectos,
crustáceos y otros grupos, donde desempeña funciones estructurales y de
soporte. Su papel en los animales sería equivalente al de la celulosa en los
vegetales. La quitina tampoco se encuentra libre en la naturaleza, sino que está
asociada con proteínas formando complejos quitino-proteicos. La quitina es una
homoglucana formada por unidades de N-acetil-glucosamina, eslabonadas por
enlaces �-1,4. Las moléculas de quitina se asocian fuertemente en haces
estabilizados por puentes de hidrógeno. Tales haces están recubiertos por capas
unimoleculares de proteína. Es interesante recalcar que la celulosa y la quitina
son los 2 compuestos naturales más abundantes, considerados por tanto recursos
renovables por síntesis biológica. Por último la quitina tiene usos muy diversos,
principalmente en medicina, inmunología y farmacia.
La quitosana es un homopolímero de glucosamina, eslabonadas por
enlaces glicosídicos �-1,4, el cual se comporta como policatión a pH ácido. Se
encuentra en la pared celular de ciertos hongos, asociada con otras glucanas y
con proteínas. Como ocurre con la quitina, la quitosana tiene gran cantidad de
aplicaciones en medicina, farmacia y alimentos.
Por último, la pectina es un polisacárido vegetal, formado de ácido 6
galacturónico en un 65-70% y ácido 6 metil galacturónico en un 30-35%. Estos
compuestos están unidos por enlaces glicosídicos �-1,4. Los grupos carboxilato
pueden estar neutralizados con iones sodio, potasio o amonio. Se considera que
en promedio cada molécula de pectina tiene 1000 unidades de monosacárido. La
pectina se encuentra en forma abundante en la pulpa de ciertos frutos como la
pera o la manzana, y en la cáscara de los cítricos. Este polisacárido tiene muchas
aplicaciones como espesante y/o gelificante en la industria alimentaría.
En conclusión, los polisacáridos que sirvieron de sustrato a las
exoenzimas evaluadas en el presente trabajo fueron muy diferentes, y por lo
mismo se puede especular a priori que deben ser bastante específicas. A
continuación se describirán los datos obtenidos en cada caso.
32
7.2.2.1 Amilasas
Si se considera que del total de 52 aislados bacterianos
hidrocarbonoclastas, 39 tuvieron actividad amilolítica se tuvo un 75% de
positividad, lo cual no es sorprendente pues esta actividad está muy extendida en
el mundo microbiano. En la figura 4 se muestran los resultados obtenidos con los
39 aislados amilolíticos, comparados en una escala arbitraria basada en la
relación de los diámetros halo/colonia. En base a este criterio, dos cepas fueron
evidentemente superiores: P2A-c y P2A-d, los cuales superaron al testigo
positivo de referencia Bacillus. thuringiensis Bt-132. Esos 2 aislados secretaron
también caseinasas, queratinasas, quitinasas y quitosanasas. Al revisar sus
características (tabla 2), se observó que provinieron de la misma muestra y eran
bacilos cortos Gram-negativos, cuyas colonias traslúcidas eran pequeñas (3 mm
de diámetro), de color amarillo claro, lobuladas, de bordes lisos, superficie
convexa, opacas y duras. Por lo tanto podría tratarse del mismo microorganismo.
mostraron actividad alta; 13 (25%) una actividad mediana y 21 (40%) una baja
actividad.
Figura 4. Aislados que presentaron actividad amilolítica en placas de almidón al 1 % (96h/28ºC). Donde A =actividad amilolítica alta (factor 2.40-3.00) B = actividad amilolítica media (factor1.70 -2.39) y C = actividad amilolítica baja (factor 1.00-1.69).
1
1.5
2
2.5
3
PE
1A-a
PE
1A-c
PE
1A-d
PE
2A-b
PE
2A-c
PE
2A-d
PE
4A-a
PE
4A-b
PE
4A-d
PE
4A-e
PE
4A-h
PE
4 A
-iP
E5A
-aP
E5A
-cP
E5A
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E5
A-f
PE
6A-a
PE
6A-b
PE
6A-c
PE
6A-d
PE
7A-a
PE
7A-c
PE
7A-e
PE
8A-a
PE
8A-d
PE
9A-a
PE
9A-c
PE
9A-d
PE
11A
-aP
E11
A-b
PE
11A
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PE
12A
-bP
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A-c
PE
12A
-dP
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A-e
PE
12A
- fP
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A-a
PE
13A
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2
Aislados
Act
ivid
ad a
milo
lìtic
a
Rel
ació
n ha
lo/c
olon
ia
A
B
C
33
7.2.2.2 Celulasas
Para esta evaluación los 52 aislados bacterianos hidrocabonoclastas se
cultivaron en un medio líquido adicionado con 1 % de celulosa coloidal, teñida con
azul brillante de remazol. La secreción de la enzima en el medio dió lugar a la
solubilización del polímero y la consecuente liberación del colorante, el cual se
leyó a 595 nm.
Para confirmar lo anterior, en la figura 5 se consignan los valores de
solubilización del sustrato celulósico teñido, como absorbancia a 595 nm, tanto del
testigo positivo, como de la bacteria más celulolítica; puede verse que el hongo es
al menos 7 veces más efectivo.
Figura 5. Comparación de la actividad celulolítica del testigo positivo Trichoderma reesei, y del aislado bacteriano PE5A-a, encontrado como el más celulolítico.
0
2
4
6
8
10
12
14
60 80 100 120 140 160 180
Horas de incubación (h)
A
bsor
banc
ia 5
95 n
m
12
22
Trichoderma reesei
PE5A-a
168 h
144 h 120 h 96 h 72 h
34
Con respecto a la presencia de actividad celulolítica en los 52 aislados
bacterianos investigados, en la figura 6 se muestra que aparentemente fueron 28
los que mostraron alguna actividad, pero la mayor parte (24 aislados) dieron
valores muy bajos y pueden considerarse dudosos, por lo tanto sería más
apropiado considerar sólo 4, como claramente celulolíticos, lo que daría una
frecuencia de apenas 7%. Los aislados positivos en orden decreciente fueron
PE5A-a, PE6A-b, PE2A-d y PE5A-f. Al revisar las características de estos
aislados, se encontró que tres de ellos coinciden en ser bacilos cortos Gram-
negativos, que forman colonias pequeñas (3 mm), de color amarillo claro, bordes
irregulares, superficie convexa, opaca y dura; la otra es igual, pero con superficie
rugosa.
0
0.2
0.4
0.6
0.8
PE
1A-c
PE
1A-d
PE
2A-b
PE
2A-c
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2A-d
PE
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PE
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PE
4A-h
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4 A
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9A-b
PE
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PE
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PE
12A
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E13
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PE
13A
-c
Aislados
Abs
orba
ncia
a 5
95 n
m 1
2
Figura 6. Actividad celulolítica de los 52 aislados bacterianos hidrocarbonoclastas. Sólo cuatro mostraron una actividad significativa; el resto dio valores muy bajos y dudosos.
35
7.2.2.3 Quitinasas
En cuanto a quitinasas, sólo 18 (35%) de los 52 aislados investigados
mostraron producción de la enzima, aunque a un nivel inferior al de la cepa de
referencia S. marcescens Wf, la cual es excepcionalmente quitinolítica.
En la figura 7 se compara la actividad de los 18 aislados quitinasa-
positivos respecto a la cepa de referencia, en base a la relación de diámetros
halo/colonia, clasificándolos como bajos, medianos y buenos quitinolíticos, cuando
los factores de corte fueron respectivamente: hasta 1.29 (11 aislados, 21%); de
1.3-1.79 mm (6 aislados, 12 %) y arriba de 1.8 (1 aislado, 2%). Como
comparación, la cepa de referencia tendría un factor cercano a tres. Todo esto
permite concluir que dentro de los aislados hidrocarbonoclastas , sólo un 35%
produjeron quitinasas, aunque a un nivel modesto. El aislado más interesante
respecto a esta actividad fue PE1A-c, el cual corresponde a un bacilo Gram-
positivo, formador de colonias blancas, de aspecto húmedo y opaco, bordes
dentados, superficie convexa y lisa.
Figura 7. Comparación de la actividad quitinolítica de los 18 aislados bacterianos hidrocarbonoclastas, con relación a la cepa de referencia S. marcescens Wf. Donde A =actividad amilolítica alta (factor 1.80-2.75) B = actividad amilolítica media (factor1.30 –1.79) y C = actividad amilolítica baja (factor 0.80-1.29).
0.5
1
1.5
2
2.5
3
PE
1A-a
PE
1A-c
PE
1A-d
PE
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PE
4A-d
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PE
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6A-a
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7A-e
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13A
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S m
W f
Aislados
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ión
halo
/col
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B
C
A
36
7.2.2.4 Quitosanasas De los 52 aislados bacterianos estudiados, 13 de ellos (25%) produjeron la
quitosanasa a niveles similares. En todos los casos se trató de bacilos largos
Gram-positivos, cuyas colonias eran circulares, de bordes dentados, de 5 mm de
diámetro, superficie convexa y lisa, aspecto húmedo, opaco, y de consistencia
suave.
Figura 8. Producción de quitosanasa por aislados bacterianos hidrocarbonoclastas, en relación al testigo positivo Bacillus thuringiensis-132.
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
PE
1A-c
PE
2A-b
PE
4A-d
PE
4A-e
PE
4A -i
PE
5A-c
PE
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7A-c
PE
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PE
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11A
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13A
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132
Aislados
Act
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ad q
uito
sano
lític
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Rel
ació
n h
alo
/
colo
nia
37
Además de quitosanasa, esos aislados produjeron también quitinasas, lo
cual no es frecuente, ya que por ejemplo S. marcescens Wf produce altos niveles
de quitinasa pero no quitosanasa, y con Bacillus thuringiensis-132 ocurre
exactamente lo contrario. De modo que esos aislados resultan de interés para un
estudio monográfico posterior.
7.2.2.5 Pectinasas
La última polisacaridasa estudiada fue la pectinasa, la cual se encontró en 8
de los 52 aislados estudiados (15%). En este caso el medio sólido contenía el
polisacárido al 1%, aunque pudo observarse que variando su concentración en el
medio, la enzima podía hacerse más o menos evidente. Habrá que recalcar
también que los halos de hidrólisis no siempre eran visibles, y su existencia se
hacía evidente hasta que se inundaban las placas con una solución de bromuro de
cetiltrimetilamonio al 5%, el cual precipitaba el polisacárido remanente.
Un exámen de la figura 9 muestra que ninguno de los aislados alcanzó los
niveles de pectinasa del testigo positivo, aunque 3 de ellos PE8A-b, PE4A-h y
PE2A-d podrían considerarse sobresalientes. Las características morfológicas de
estas 3 cepas son: PE8A-b , bacilo largo Gram-negativo, con colonias pequeñas
(2 mm), de color amarillo ocre, bordes lisos, forma convexa, superficie lisa y
opaca, aspecto húmedo y consistencia suave. El aislado PE4A-h, bacilos cortos
Gram-negativos, colonia pequeña (2 mm), de color amarilla y translúcida, circular
con bordes lisos, y superficie convexa, lisa y brillante de aspecto húmedo. El
aislado PE2A-d, fueron también bacilos cortos Gram-negativos, que forman
colonias circulares (3mm) de color amarillo claro y translúcido, bordes lobulados,
superficie convexa y opaca, aspecto seco y consistencia dura. Como puede verse
se trata de bacterias diferentes cuya única característica común es que son
bacilos Gram-negativos. Desde el punto de vista biotecnológico, el aislado más
interesante es PE4A-h porque secreta también caseinasas, elastasas, amilasas,
quitinasas y esterasas; en tanto que PE8A-b produjo sólo fosfolipasas.
38
.
Figura 9. Comparación de la producción de pectinasa por los aislados bacterianos hidrocarbonoclastas, en un medio sólido con pectina al 1%, después de una incubación de 102 h a 28ºC. Como testigo positivo se usó una cepa de Erwinia carotovora.
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
PE
2A-c
PE
2A-d
PE
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5 A
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Aislados
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colo
nia
39
7.2.3 Enzimas degradadoras de lípidos y sustancias relacionadas
En este caso se estudió la degradación de lípidos, considerando un lípido
típico a los triglicéridos; es decir ésteres del glicerol con ácidos grasos, los cuales
pueden tener consistencia sólida (grasas), cuando los ácidos grasos son
saturados; o líquidos (aceites) si los ácidos grasos son insaturados uno o más
dobles enlaces en su cadena hidrocarbonada. También se estudió la degradación
de fosfolípidos, tomando como modelo a las lecitinas, que son compuestos en
donde 2 grupos OH del glicerol están esterificados con ácidos grasos, y al tercer
OH está esterificado con la fosforilcolina. El tercer tipo de enzimas fueron las
esterasas, considerando genéricamente a los ésteres como la combinación de
alcoholes con ácidos grasos. Los ésteres más típicos serían aquellos donde el
alcohol es un monoalcohol lineal, unido a cualquier tipo de ácido graso. Las
características de estos 3 tipos de sustratos fueron explicados previamente en el
capítulo de materiales y métodos.
7.2.3.1 Lipasas
Esta actividad se evaluó en un medio sólido adicionado de 5% de
mantequilla, una grasa. Al hidrolizarse por acción de las lipasas extracelulares se
liberan ácidos grasos, los cuales al acumularse en el entorno de la colonia crean
un microambiente ácido, que puede hacerse visible si se añade un indicador que
vire de color al disminuir el pH. En este caso se empleó rezasurina que vira de
azul a rosa intenso.
De los 52 aislados bacterianos hidrocarbonoclastas estudiados, 38 fueron
lipolíticos, lo que representa 73% de positividad. Esto significa que las lipasas,
junto con las amilasas fueron las enzimas más extendidas en el grupo microbiano
en estudio. Convendría recordar que la frecuencia de positividad para las enzimas
estudiadas hasta este punto, colocadas en orden descendente es: amilasas 75%,
queratinasas 67%, caseinasas 61%, elastasas 36%, quitinasas 35%,
quitosanasas 25% y pectinasas 15%. Las celulasas y las esterasasa son en
40
apariencia las menos frecuentes, al menos a un nivel significativo, pues solo 7% y
6 % de los aislados fueron positivos, respectivamente.
Es un hecho reportado, pero no aclarado, que las lipasas son enzimas muy
frecuentes en los microorganismos hidrocarbonoclastas. Incluso se ha propuesto
que las lipasas podrían estar involucradas de algún modo en la degradación de los
hidrocarburos del petróleo.
En la figura 10 se hace evidente, que los diferentes aislados positivos producen niveles variables de lipasas. Este es un comportamiento típico, pues es bien conocido que los niveles de producción de una enzima, es una característica propia de cada cepa o de cada aislado.
1
1.1
1.2
1.3
1.4
PE
1A-a
PE
1A-c
PE
1A-d
PE
2A-a
PE
2A-b
PE
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PE
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PE
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PE
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PE
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PE
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PE
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PE
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PE
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PE
8A-a
PE
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PE
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PE
9A-d
PE
11A
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A-b
PE
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A-a
PE
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A-c
PE
12A
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E12
A-e
PE
12A
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PE
13A
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S m
W F
Aislado
Act
ivid
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asa
Rel
ació
n ha
lo/c
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ia
B
A
C
Figura 10. Aislados bacterianos hidrocarbonoclastas que presentaron actividad lipolítica extracelular, en un medio sólido adicionado con 5% de mantequilla. Donde A = Actividad de lipasa alta (factor 1.31-1.45) B = Actividad de lipasa media (factor 1.16-1.30) y C = Actividad de lipasa baja (factor 1.0-1.15).
41
En la misma figura 10 se muestra que dentro de una escala arbitraria
basada en la relación de diámetros halo/colonia, tres (6%) aislados serían los más
lipolíticos con factores superiores a 1.31 Tales aislados son PE1A-c, PE4A-d y
PE6A-a, los cuales corresponden a bacilos largos Gram-positivos, formadores de
colonias blancas y circulares, de 5mm de diámetro, bordes dentados, superficie
convexa y lisa, de apariencia opaca y consistencia suave. Los aislados con
actividad intermedia (factor 1.16 a 1.30) fueron 21 (40%), y los correspondientes
a baja actividad (factor inferior a 1.15) fueron 14 (27 %).
7.2. 3.2 Fosfolipasa
Esta actividad se hizo evidente desde las 48 h de incubación a 28ºC. Su
ensayo se realizó en un medio sólido adicionado de yema de huevo al 5%. En el
caso de los aislados hidrocarbonoclastas se manifestó por la aparición de halos
opacos alrededor de las colonias positivas. Este comportamiento corresponde a
las fosfolipasas de tipo C, las cuales separan fosforilcolina, dejando un diglicerido
esterificado en las posiciones � y �, el cual es insoluble.
En este caso fueron 16 los aislados (31%) que mostraron actividad de
fosfolipasa, destacándose 2 como los más activos: PE 8A-c y PE 6A-b (ver figura
11). El primero corresponde a bacilos cortos Gram-negativos, formadora de
colonias (3 mm), de color naranja, translúcidas, de bordes lisos, superficie
convexa, lisa y opaca, de aspecto húmedo y consistencia suave. El aislado PE8A-
b corresponde a bacilos cortos, Gram-negativos, formadora de colonias pequeñas
( 2 mm), de color amarillo ocre, bordes lisos, superficie convexa y lisa, opaca de
consistencia húmeda y suave. Por lo tanto parecen no tener relación taxonómica.
42
7. 2 .3 .3 Esterasas
En este caso se adicionó al medio sólido el detergente tween 80 al 0.4%.
Dicho compuesto posee un grupo oxhidrilo esterificado con ácido oleico. En caso
de que se produzcan esterasas extracelulares, el oleato es separado y acumulado
en el entorno de las colonias positivas. La presencia de iones calcio en el medio
propicia la formación de oleato de calcio, lo cual se manifiesta como halos opacos
y granulosos.
La presencia de esterasas extracelulares en los aislados bacterianos
hidrocarbonoclastas fue escasa, pues sólo hubo 3 casos (6%) positivos (ver figura
12). Ellos fueron PE4A-k, el más activo, con valores semejantes al testigo
1
1.3
1.6
1.9
2.2
2.5
PE
1A-a
PE
1A-d
PE
2A-b
PE
2A-c
PE
4A-b
PE
4A- f
PE
5A-a
PE
5 A
-f
PE
6A-b
PE
6A-c
PE
6A-d
PE
8A-b
PE
9A-g
PE
11A
-b
PE
11A
-c
PE
12A
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/ co
loni
aA
B
C
Figura 11. Aislados bacterianos hidrocarbonoclastas que tuvieron actividad de fosfolipasa. Se consideraron bajos productores los 14 aislados cuyos factores estaban entre 1-1.59; medianos los que estaban entre 1.6-2.2 (un aislado) y altos si su factor estaba arriba de 2.2 (un aislado). En esta escala, el testigo positivo S. marcescens Wf tendría una mediana actividad.
43
positivo S. marcescens Wf, y los aislados PE4A-h y PE6A-d con valores un poco
inferiores.
Al revisar las características morfológicas de los aislados mencionados, se
encontró que aunque parecidos, sí tienen algunas diferencias; por ejemplo PE4A-k
corresponde a bacilos largos, Gram-negativos, formadores de colonias circulares
pequeñas (2 mm), amarillas, de bordes continuos, superficie convexa, lisa,
brillante y translúcida, de aspecto húmedo y consistencia suave. Por su parte,
tanto PE4A-h y PE6A-d son bacilos cortos Gram-negativos, pero el primero forma
colonias pequeñas (2 mm) y el segundo colonias mayores (5 mm), con
características similares; colonias redondas, bordes continuos, amarillas,
superficie convexa; lisa, brillante y translúcida, de consistencia suave. En
Figura 12. Aislados bacterianos hidrocarbonoclastas que mostraron actividad esterolítica. Los tres podrían considerarse buenos productores, en relación a lo obtenido con la cepa de referencia S. marcescens Wf
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
PE
4A-h
PE
4A-k
PE
6A-d
S m
W f
Aislados
Act
ivid
ad d
e e
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a
Rel
ació
n
halo
/ co
loni
a
44
consecuencia es probable que taxonómicamente los tres aislados esterolíticos no
tengan ninguna relación.
Otro aspecto importante es que los datos obtenidos para las actividades de
lipasa, fosfolipasa y esterasa fueron muy distintos, lo que sugiere que aunque las
tres enzimas rompen enlaces de éster, su especificidad es alta y distinguen muy
bien las diferencias estructurales de los substratos.
7.2.4 Enzimas degradadoras de ácidos nucleicos
Los ácidos nucleicos son biopolímeros formados por nucleótidos
encadenados por enlaces fosfodiester 3´, 5´. Los nucleótidos por su parte son
compuestos formados por una base nitrogenada, una pentosa y ácido fosfórico.
Los ácidos nucleicos pueden ser de 2 tipos; ácido desoxirribonucleico si los
nucleótidos contienen las siguientes bases nitrogenadas: adenina, guanina, timina
y citosina y si la pentosa es 2´desoxirribosa. El otro tipo de ácidos nucleicos se
denomina ácidos ribonucleicos, los cuales contienen adenina, guanina, uracilo y
citosina, y su pentosa es la ribosa.
Las nucleasas secretadas por los microorganismos son consideradas
enzimas digestivas e inespecíficas, que degradan lo mismo DNA que RNA, para
convertirlos en compuestos más simples, que puedan ingresar a la célula para ser
asimiladas como fuentes de carbono y nitrógeno.
Como en el presente estudio se utilizó solamente DNA como inductor,
adicionándolo al medio de cultivo, la enzima producida va a ser considerada una
desoxirribonucleasa, aunque probablemente sea una nucleasa inespecífica.
7.2.4.1 Desoxirribonucleasa (DNasa)
En este caso se adicionó al medio DNA al 0.03% y azul de ortotoluidina al
0.0025%. En estas condiciones el DNA nativo forma un complejo de color azul
con el colorante. Cuando el DNA es fragmentado en oligonucleótidos de diversos
tamaños por acción enzimática, las características espectrales del complejo
45
cambian y se desplaza a su λ max de absorción. Esto se visualiza por la
formación de halos de color rosa en el entorno de las colonias que secretan la
enzima.
En este caso fueron sólo 10 (19%), los aislados que dieron positiva esta
prueba, según puede apreciarse en la figura 13. Puede observarse que sólo el
aislado PE5A-b alcanzó niveles cercanos al de la cepa de referencia. Este aislado
corresponde a un bacilo corto Gram-negativo, productor de colonias circulares de
bordes lisos, superficie convexa, lisa, brillante y translúcida, de aspecto húmedo y
consistencia suave, es decir muy parecida a las que han sido descritas para otras
enzimas, pero en este caso son colonias no pigmentadas.
46
La poca frecuencia de productores de nucleasas en los suelos
contaminados con hidrocarburos, pudiera deberse a que los ácidos nucleicos no
abundan en estos suelos. El escaso contenido de ácidos nucleicos podría
provenir de la microflora muerta.
0
1
2
3
4
5
6
PE
4A-b
PE
5A-b
PE
6A-b
PE
7A-a
PE
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PE
12A
-e
S m
W f
Aislados
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Nas
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ión
halo
/ co
loni
a
Figura 13. Comparación de la actividad de DNasa de los 10 aislados bacterianos hidrocarbonoclastas, que dieron positivo este ensayo, con respecto a la cepa de referencia S. marcescens Wf.
47
7.2.5 Selección de los mejores aislados para la producción de exoenzimas
hidroliticas.
No debe perderse de vista que los mejores 52 aislados bacterianos
estudiados, son todos biodegradadores de hidrocarburos, procedentes de suelos
altamente contaminados con petróleo; por lo tanto su capacidad exoenzimatica es
un atributo adicional, de gran interés biotecnológico.
Para seleccionar los aislados con mayor capacidad exoenzimatica se
pueden utilizar diversos criterios, uno sería considerar como mejores, aquellos que
produzcan el mayor número de enzimas. En este contexto, los aislados mas
interesantes son PE6A-d que produjo 10 de las 12 enzimas evaluadas, de las que
destacan elastasa y queratinasa, tales fueron producidas en mayor cantidad en la
cepa de referencia SmWf . En segundo lugar podría considerarse el aislado PE2A-
b, que produjo 9 de las 12 enzimas ensayadas destacándose particularmente su
alta capacidad amilolítica que fue superior a la del testigo Bt-132. El tercer lugar
corresponde al aislado PE1A-d que produjo 8 enzimas distintas de las 15
ensayadas, presentando la mayor actividad de caseinasa y queratinasa entre los
52 aislados considerados. Además se mostró superior al testigo de referencia
(SmWf), en cuanto a la producción de elastasa y fosfolipasa.
Con este mismo criterio podrían destacarse el aislado PE4A-h productor de
8 enzimas, particularmente queratinasas y elastasas donde superó a la cepa
testigo. Sin embargo lo más relevante sería señalar que este aislado mostró alta
actividad de pectinasa, una enzima que se encontró con baja frecuencia en el
48
grupo estudiado. Otro Aislado destacable sería PE5A-a, por ser el que mostró
mayor capacidad celulolítica.
Otro criterio de selección puede ser considerar los niveles de producción de
cada enzima por los diferentes aislados, más que el número de enzimas que éstos
pueden producir. De este modo se destaca que en este ordenamiento quedaron
involucrados 22 aislados (42%) del total estudiado. Como un dato adicional, en la
tabla 4 se consigna también la frecuencia con que cada enzima fue producida por
los 52 aislados investigados.
En base a la frecuencia, expresada en porciento y en orden descendente,
con las distintas enzimas que fueron producidas es: amilasa 75; lipasa 73;
queratinasa 67; caseinasa 61; elastasa 36; quitinasa 34; fosfolipasa 30;
quitosanasa 25; DNasa 19; pectinasa 15; celulasa 7 y esterasa 6.
Como puede deducirse, sólo en el caso de las proteasas se encontraron
frecuencias parecidas (entre 61-67 %), aunque los mejores productores de cada
tipo de proteasa fueron distintos aislados, excepto en el caso de PE1A-d que fue
el mejor caseinolítico y queratinolítico. Esto sugiere que los perfiles
exoenzimáticos de cada aislado son diferentes y particulares. La misma idea
expresada de otra forma sería, que el perfil de producción para cada enzima es
diferente; es decir los mejores productores para cada enzima son aislados
diferentes.
Algo que cabe destacar es que los sustratos empleados como inductores,
fueron moléculas de alto peso molecular, frecuentemente biopolímeros como
proteínas, polisacáridos y ácidos nucleicos. En estos casos se conoce que los
49
microorganismos producen y secretan un conjunto de enzimas que por tener
diferente especificidad atacan al sustrato-inductor de distinta manera, de modo
que los biopolímeros son degradados en olígomeros de menor tamaño cada vez
hasta que el proceso concluye con la acumulación de compuestos relativamente
simples (péptidos pequeños y aminoácidos; oligosacaridos de bajo peso molecular
y monosacáridos, etc). Estos compuestos más simples pueden, generalmente, ser
utilizados ya como fuentes de carbono y energía, o como sustancias precursoras
para la síntesis de nuevos biopolímeros, ya en el interior de las células.
Para dar una idea de lo complejo que puede ser la producción de
exoenzimas hidrolíticas de biopolímeros , se puede considerar el trabajo de Pérez
García (2002), quien estudió si las proteasas secretadas por Bacillus thuringiensis
Bt-132 eran o no especificas. Él encontró que esta bacteria secretaba 6
proteasas diferentes cuando se cultivaba en medios con proteínas solubles como
caseína, gelatina y hemoglobina o con proteínas insolubles como elastina,
colágena o queratina. Sin embargo, la proporción relativa de cada una de esas 6
proteasas variaba según la proteasa adicionada al medio. En términos generales,
los niveles de 4 proteasas variaban según la proteína adicionada al medio. Así, los
niveles de proteasa eran más altos si se adicionaba proteínas insolubles como
queratina, que solubles como caseína. En cualquier caso, las proteasas formadas
eran siempre inespecíficas y podían solubulizar tanto queratina como caseína. Es
probable por lo tanto, que las proteasas producidas por los aislados señalados
sean inespecíficas, aunque distintas porque proceden de aislados o
microorganismos diferentes.
50
Los resultados obtenidos dan la pauta para imaginar que tipo de desechos
serían los más eficaces en procesos de biorrestauración, en base a las enzimas
que con mayor frecuencia son producidas por los 52 aislados hidrocarbonoclastas.
En este sentido los desechos amilolíticos serían una buena opción pues las
amilasas se produjeron con una frecuencia de 75 %. Como materiales amiláceos
podrían considerarse algunos de origen agrícola o industrial, provenientes de
plátano, papa, yuca. También los residuos ricos en grasas podrían ser
interesantes, ya que las lipasas se produjeron con un frecuencia de 73 %. Es
probable sin embargo que desechos ricos en grasas (y proteínas) que podrían
provenir de la industria pesquera o alimentaría no fueran muy aceptados por dar
lugar a malos olores durante la descomposición. Más posibilidades de uso para la
biorrestauración de suelos podrían tener los materiales de tipo queratinoso como
las plumas desechadas durante el sacrificio de aves. La frecuencia de producción
de las queratinasas resulto 67 %. Al respecto, Cervantes- Gonzáles (2006) ha
encontrado muy buenos resultados en la biodegradación cuando se añaden
plumas de pollo molidas a los medios de cultivo. Los materiales protein- quitinosos
como los desechos de camarón resultaron menos eficaces, lo cual coincide
aparentemente con el hecho de que las quitinasas son enzimas que se producen
con menor frecuencia (34 %). Dentro de esta lógica, los materiales de tipo
celulósico no serán una buena opción para biorrestaurar suelos contaminados con
hidrocarburos, ya que la frecuencia de producción de celulasas fue apenas del 7
%.
51
Finalmente, 22 aislados pueden ser considerados como los de mayor
interés, por ser los que producen los mayores niveles de las 12 enzimas
estudiadas. Es evidente que dentro de las cepas “campeonas “, los ganadores
absolutos son los aislados PE6A-d y PE4A-h por estar en cuatro ocasiones dentro
de los tres mejores productores de alguna de las enzimas estudiadas. En el caso
de PE6A-d es alta productora de caseína, elastasa, quitinasa y esterasa, en tanto
que PEA4-h produce altos niveles de elastasa, queratinasa, pectinasa y esterasa.
Es indudable que bajo cualquier criterio, los 2 aislados referidos deben
considerarse interesantes en cuanto a su perfil exoenzimático. De hecho el aislado
PE6A-d fue considerado el más versátil entre los 52 estudiados, por producir 10 de
las 12 enzimas estudiadas.
52
8.0 CONCLUSIONES 1.-Los 52 aislados bacterianos hidrocarbonoclastas utilizadas en la presente
investigación, eran todos bacilos no esporulados, principalmente cortos (58%),
Gram- negativos (67%).
2.-La capacidad proteolítica, medida por la producción de tres actividades
distintas, dio una frecuencia de 67 % para queratinasas; 36 % elastasas y 61 %
para caseinasa.
3.-Los tres mejores productores de las tres proteasas referidas, fueron aislados
diferentes, a excepción de PE1A-d que fue el mejor productor de queratinasa y
caseinasa.
4.-La producción de enzimas degradadotas de polisacáridos por los aislados
referidos dio las siguientes frecuencias: amilasas 75 %; quitinasas 34 %;
quitosanasas 25 %; pectinasas 15 % y celulasas 7 %.
5.-Los tres mejores productores de las distintas polisacáridasas fueron aislados
diferentes. Sólo PE2A-d produjo altos niveles de amilasa, pectinasa y celulasa.
6.-La producción de enzimas lipo-esterolíticas dio las siguientes frecuencias:
lipasas 73 %; fosfolipasa 30 % y esterasa 6 %.
7.-Los tres mejores productores de enzimas lipoesterolíticas fueron aislados
diferentes.
8.-La frecuencia de producción de DNasas fue 19 %.
53
9.-Comparando los 52 aislados bacterianos, el más versátil fue PE6A-d, el cual
produjo 10 de las 12 enzimas estudiadas. También destacaron PE2A-B y PE1A-d
que produjeron 9 y 8 enzimas respectivamente.
10.-Considerando sólo a los 22 aislados que incluyeron los tres mejores
productores de las 12 enzimas estudiadas, los más destacables fueron PG6A-d y
PE4A-h, por producir 4 de tales enzimas.
11.-Considerando la frecuencia de producción de las diferentes enzimas, pueden
proponerse desechos ricos en queratina como plumas, o en almidón y grasas
como algunos desechos agro-industriales, como los más efectivos en procesos de
restauración de suelos contaminados con petróleo mediante el composteo. Menos
eficaces podrían ser los desechos quitino-proteicos derivados del
aprovechamiento del camarón y otros crustáceos.
12.-El perfil exoenzimático obtenido para cada uno de los 52 aislados bacterianos
estudiados puede ser utilizado para seleccionar buenos productores de diversas
enzimas, y / o para integrar consorcios idóneos para biodegradar diferentes
materiales en base a su composición química.
54
9.0 BIBLIOGRAFÍA
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