AISLAMIENTO, IDENTIFICACION Y PRUEBAS DE PATOGENICIDAD DE BACTERIAS FITOPATOGENAS PRESENTES EN HOJAS DE MANGO (Mangifera indi

AISLAMIENTO, IDENTIFICACION Y PRUEBAS DE PATOGENICIDAD DE BACTERIAS FITOPATOGENAS PRESENTES EN HOJAS DE MANGO (Mangifera indica) CON SIGNOS DE INFECCION BACTERIANA

juan daniel gil, manuel jose castilla

Resumen

Se observaron varios arboles de mango (Mangifera indica) en las zonas verdes de la Universidad de Antioquia, de los que presentaron sintomatologa caracteristicas de ataques de bacterias fitopatogenas se muestrearon sus hojas se aislo la bacteria se identifico y se realizaron pruebas de patogenicidad con la misma en muestras de hojas de arboles d ela misma especie de la que originalmente fueron aisladas, estas pruebas arrojaron sntomas similares a los descritos inicialmente y se seala como presunto patogeno a las bacterias del genero Erwinia spp.

Abstract

There were several trees of mango (Mangifera indica) in the green areas of the University of Antioquia, of which displayed symptoms characteristic of plant pathogenic bacteria attacks the leaves were sampled bacterium was isolated and identified pathogenicity tests were performed with the same in leaf samples from trees d ela same species from which they were originally isolated, these tests yielded similar symptoms to those described initially and is designated as a suspected pathogen bacteria Erwinia spp.

Introduccin

Desde el punto de vista prctico, sin una identificacin apropiada, no es posible desarrollar mtodos de deteccin sensibles y precisos que permitan controlar subsecuentemente una enfermedad fitopatolgica. Solo la identificacin del agente causal de la enfermedad permitir desarrollar y validar estrategias de manejo que eviten su diseminacin y control para evitar grandes prdidas econmicas.

Cuando una planta, supuestamente infectada por una bacteria, es trada al laboratorio, se procede al aislamiento en medio artificial de cultivo segn la tcnica usual. No obstante, los resultados del aislamiento precisan ser interpretados con cautela, pues: a) Las colonias desarrolladas en la caja de Petri pueden ser bacterias saprofitas, por lo que la enfermedad puede no ser provocada por estas bacterias. b) Aparecen en la caja, colonias de bacterias patognicas y saprofitas las cuales no se diferencian por su aspecto. c) Las colonias obtenidas, aunque sean de bacteria patognica, se presentan avirulentas o perdieron por alguna razn, la patogenicidad.La demostracin de la patogenicidad de una cepa bacteriana es un procedimiento complicado que requiere mucho tiempo para que aparezcan los sntomas tpicos de la enfermedad en la planta. En la mayora de las ocasiones no siempre se dispone de este material, siendo ms difcil, an, cuando se tratan de rboles o plantas que no se encuentran en la regin.

La determinacin de los agentes causales, es el primer paso para establecer estrategias adecuadas de manejo en el caso de las enfermedades de cultivos. Para conseguir este objetivo, existen diferentes herramientas las cuales van desde la simple observacin de signos sobre los tejidos afectados hasta complejos procedimientos de biologa molecular, pasando por aislamientos tradicionales en medios de cultivo generales o especficos adems del uso de las pruebas de patogenicidad en las cuales se intentan aplicar los postulados de Koch.

La bacteriosis en mango fue encontrada por primera vez en el Continente Americano en Venezuela y el agente fue identificado como Erwinia mangifera, bajo el nombre de mancha negra del fruto. Despus de este primer informe, diferentes investigaciones han dado resultados variados en cuanto a la identificacin del agente causal, tenindose en ultima instancia al genero Erwinia con dos especies E. mangifera y E .carotovora. Posteriormente, esta primera especie E. mangiera es sealada como E. herbicola. En Costa Rica, los sntomas de la enfermedad se comenzaron a observar en forma generalizada a mediados de 1987, aislndose en forma consistente a esta misma bacteria.Los sntomas que se observan en el mango son: en !as hojas, manchas oscuras que se pueden tomar blancas y secas cuando viejas. Estas manchas pueden fusionarse y formar grandes parches, que producen exudados en las reas verdes. La infeccin puede pasar a la inflorescencia y pecolo, produciendo rajaduras longitudinales con bordes levantados.Se ha sugerido que dpteros que se alimentan de las secreciones gomosas del rbol de mango estn involucrados en la transmisin mecnica de Erwinia.

Materiales y Mtodos

OBSERVACIN DE MATERIAL VEGETAL INFECTADOSe realiza un corte y preparacin de las muestras vegetales seguido de un montaje directo al microscopio donde se espera ver flujo bacteriano.Se har desinfeccin al material vegetal con NaOCl al 1% durante 1 minuto y proceder a realizar lavados sucesivos con agua Destilada.Macerar el material vegetal, hacer montajes en fresco.Con este mismo material, realizar extendidos, para colorear con el mtodo Gram.

SIEMBRA DE SUSPENSIN EN SUPERFICIECon el macerado obtenido realizar dilucin (10-1, 10-2) y sembrarla en superficie (100 ul) y extenderla con la ayuda de un asa de vidrio en el medio Agar nutritivo. Dejar incubar a temperatura ambiente durante dos-tres das para realizar el conteo de la Unidades formadoras de colonias.Para el clculo de las unidades utilizar la frmula:No. De UFC= No. De colonias X dilucin sembrada (Inverso).

AILSAMIENTO DE BACTERIAS DIRECTAMENTE A PARTIR DEL MATERIAL VEGETAL.Se realizaran cortes en trozos de material vegetal, que incluya tejido sano y enfermo.Procederemos a desinfestarlo sumergindolo en NaOCl 0,5% o 1% durante 1 minuto luego se colocara dentro de Agua destilada estril, con el fin de eliminar el NaOCl.Se eliminaran residuos de agua, el procedimiento a seguir es la siembra en agar nutritivo el cual dejaremos incubar 48-72 Horas. Hacer observaciones del crecimiento, posterior a incubacin, reportar gram.

SIEMBRA EN MEDIOS DE CULTIVOS PARA REALIZACIN DE PRUEBAS BIOQUIMICASLas pruebas bioqumicas realizadas fueron las siguientes: Coloracin de gramm Sembrar en medio YPGA para observacin de coloracin de colonias Siembra en Maconkey Siembra en King B para observacin de flourescencia Prueba del KOH3% Prueba de la Catalasa SIM AGAR AGAR 1.5% UREA NITRATOS GLUCOSA GALACTOSA CITRATO SIMMONS KLIGER O TSI ESCULINA GELATINA ARGININA HIDROLASA HUGH Y LEIFSON VOGER PROSKAUER

Las observaciones se haran pasadas de 24 a 48 horas.

Pruebas de patogenicidadPreparacin de material vegetal:Se recolectaron hojas de mango sanas en la universidad de Antioquia, las cuales se lavaron con agua corriente y luego desinfectadas con hipoclorito de sodio al 1% por un tiempo de 1 minuto, luego enjuagadas con agua destilada estril.Preparacin del cultivo bacteriano:Las colonias bacterianas fueron previamente aisladas de hojas de mango con sntomas de infeccin bacteriana y luego identificadas morfolgicamente y con la ayuda de pruebas bioqumicas, estas bacterias fueron replicadas y mantenidas en agar nutritivo.Preparacin de la solucin madre de bacterias y determinacin de la concentracin de bacterias:Se procedi a realizar un raspado de las colonias contenidas en las cajas de Petri, utilizando 10 ml de ADE, la solucin obtenida se deposit en tubo falcon de 10 ml, se realizaron diluciones seriadas hasta 10-5 , de las cuales se tomaron 100l de las diluciones 10-4 y 10-5 y se sembraron en cajas de Petri con agar nutritivo y posteriormente realizar el conteo de UFC (unidades formadoras de colonias) a las 48h. la concentracin se determina de la siguiente forma: UFC (Unidades Formadoras de Colonias)= N de colonias contadas X Factor de dilucin (inverso) / ml de muestra sembrada.Montaje de las Pruebas de patogenicidad:Para el montaje de las pruebas de patogenicidad se utilizaron dos metodologas para la inoculacin de la solucin bacteriana, la primera fue por contacto en la cual se deposita en la base de la hoja 0.5 ml de solucin de bacterias con una jeringa estril, la otra metodologa fue la inoculacin por puncin de la base de la hoja utilizando una jeringa y 0.5ml de solucin de bacterias. Para ambos tratamientos se utilizaron 8 unidades muestrales y un control para cada tratamiento, los cuales se montaron en cmara hmeda y se les hizo un seguimiento por 15 das donde se registr el nmero de plantas infectadas y el tipo de lesin producida.

Resultados:Tabla1. Pruebas bioqumicas para la identificacin de Erwinia sp.Morfotipo 5 bacilos gram negativosSIMAGAR-AGAR 0.5%GLUCOSASACAROSACITRATO DE SIMMONSKLIGLERHIDROLISIS DE GELATINAARGININA HIDROLASA

negativo para indol, no hubo expansin Muy poca movilidadpositivoPositivo con cambio leve de colorPositivoPositivo todo el tubo cambio a amarillopositivonegativo

Licuefaccin de la papaHUGH Y LEIFSONYPGASNAHIDROLISIS ALMIDONKING BMACCONKEYKOH CATALASA

Se observa muy poca reaccin Negativo para medio aerobio y anaerobioColonias color amarilloColonias blancas,Lisas,brillantes

negativoNo fluorescenciaCrecimiento de colonias(positiva)formacin de un hilopositivo

Prueba de patogenicidad:

Concentracin del inoculo:UFC (Unidades Formadoras de Colonias)= N de colonias contadas X Factor de dilucin (inverso) / ml de muestra sembrada.UFC= 212 X 100000 / 0.1mlUFC= 213000000 Colonias/ml

Total de plantas evaluadas:

Infeccin por contacto: 8 plantas + 1 controlInfeccin por puncin: 8 plantas + 1 control

Tabla 2. Nmero de plantas infectadasDa 4 Dia 6Dia 10Dia 15total

Contacto

44444

Puncin 46777

Tipo de lesin:Contacto: las hojas presentan pudricin en el lugar donde se inoculo la bacteria, estas toman color marrn oscuro en el peciolo y el lugar de inoculo, el nmero de plantas infectadas por este mtodo fue menor comparndolas con el otro mtodo, los sntomas de las hojas infectadas fueron ms fuertes a medida que avanza el tiempo, el control no presento ningn tipo de lesin.Puncin: las hojas presentan pudricin y manchas color marrn que se distribuan a lo largo del peciolo y en el lugar donde se inoculo la bacteria por puncin, los sntomas fueron ms severos por esta metodologa y empeoran al pasar los das, el control no presento lesiones caractersticas de la infeccin de bacterias.

DiscusinDe acuerdo a las pruebas bioqumicas hechas y basados en la clave para la identificacin de bacterias fitopatogenas suministrados por la profesora, se logr identificar el gnero de la bacteria fitopatogena aislada de las hojas de mango, esta bacteria es posiblemente del genero Erwinia causante de la bacteriosis en mango, los sntomas hallados en la literatura concuerdan con los hallado en las muestras que se recolectaron, manchas amarillentas y marrones en las hojas que pueden abarcar el peciolo, apariencia de flacidez en las hojas.Los resultados que hallamos luego de realizar las pruebas de patogenicidad nos mostraron los mismos sntomas que los reportados previamente en las muestras de las que se aisl la bacteria, los cuales se hacan ms severos a lo largo del tiempo, algo a tener en cuenta es que los sntomas se presentaron de manera gradual y solo el da 4 pudimos observar la aparicin de las primeras lesiones en algunas muestras, este efecto tardo de la infeccin puede deberse a varios factores que no pudimos controlar a lo largo de los ensayos, factores como la temperatura y alta humedad relativa teniendo en cuenta que los valores ptimos para el crecimiento de Erwinia son 80% de humedad y una temperatura de entre 24-32 C la variacin en estos factores produjo la aparicin de los sntomas no se diera en todas las muestras de manera simultnea ya que solo al pasar 15 das pudimos observar las lesiones en la mayor parte de las muestras.En los dos mtodos de inoculacin utilizados pudimos obtener muestras que presentaron los sntomas esperados auqnue hay que tener en cuenta que el mtodo de puncion fue ms efectivo que el de contacto ya que en este ltimo mtodo solo obtuvimos 4 muestras con las lesiones descritas previamente a su vez en el mtodo de puncion obtuvimos un total de 7 muestras infectadas exitosamente. Estos resultados se deben principalmente a que la bacteria necesita de una lesin en la planta para poder iniciar el proceso de infeccin, debido a que no tiene mecanismos que le permitan traspasar la cuticula de las plantas, se cree que en campo esta bacteria infecta a la planta por la lesiones ocasionadas por hongos e insectos.Para observar como la bacteria ataca diversas partes de la planta hubiera sido interesante realizar las pruebas tanto en flores como en frutos de mango lo que nos permitira observar como los sintomas se presentan en estas estructuras, posterior a estos resultados sera importante reaisla la bacteria de las muestras que presentaron los sntomas y realizar de nuevo las pruebas bioqumicas para ratificar la identificacin y presencia de Erwinia en ellas, conllevando esto a sealar al gnero bacteriano Erwinia como agente patgeno que produce estos sntomas.

Bibliografa.

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