INFORME N°7: Técnicas de cultivo de microorganismos: Características de crecimiento en medio de cultivo Aislamiento y recuento en placas

PROFESOR: Ramos Chaupín, Roberto Raúl

MESA: 5

INTEGRANTES: - Aldon Pizarro, Belén

- Olortegui Pajuelo, Thalía

- Salas Chambi, Yuli Mónica

- Cabrera Montes, Pedro Luis

2014

I. INTRODUCCIÓN:

Sembrar un microorganismo es colocarlo en un ambiente artificial apropiado para que lleve a cabo su metabolismo, su desarrollo y su reproducción. Las técnicas de siembra varían según el estado físico del medio o las necesidades del microorganismo. Una condición básica de la siembra es que se realice bajo condiciones rigurosas de asepsia, ya que es indispensable evitar el crecimiento de gérmenes del ambiente en el cultivo.

Muchas especies bacterianas son tan parecidas morfológicamente que es imposible diferenciarlas sólo con el uso del microscopio; en este caso, para identificar cada tipo de bacteria, se estudian sus características bioquímicas sembrándolas en medios de cultivo especiales. Así, algunos medios contienen un producto que inhibe el crecimiento de la mayoría de las especies bacterianas, pero no la de un tipo que deseamos averiguar si está presente. Otras veces el medio de cultivo contiene determinados azúcares especiales que sólo pueden utilizar algunas bacterias. En algunos medios se añaden indicadores de pH que cambian de color cuando uno de los nutrientes del medio es fermentado y se generan catabolitos ácidos. Si las bacterias son capaces de producir fermentación, generan gases que pueden ser apreciados cuando el cultivo se realiza en un tubo cerrado

Si el cultivo tiene un solo tipo de microorganismo se le denomina cultivo puro. Cuando encontramos más de un tipo de microorganismo se llama entonces cultivo mixto. El proceso mediante el cual se separan los microorganismos se denomina aislamiento y la forma de sembrar puede realizarse de varias formas, dependiendo de la prueba y del medio de cultivo empleado.

II. OBJETIVOS:

Observar las características de crecimiento de los microorganismos al trasplante en medios de cultivo líquido y sólido.

Separar colonias individuales a partir de una mezcla de microorganismos utilizando técnicas de aislamiento.

III. MARCO TEÓRICO

El proceso de colocar las bacterias u otros microorganismos cultivables en medios de cultivo, recibe el nombre de “siembra”, esta operación la podemos realizar a partir de muestras biológicas (orina, pus, secreciones, etc.), de análisis de control de calidad (alimentos, aguas, cosméticos, medicamentos, etc.), procedentes de muestras ambientales (agua, suelo, aire, etc.) o de un cultivo microbiano a otro. Por otro lado, si la realizamos de un cultivo a otro se denomina “subcultivo” o “repique”.

Una vez que ha sido preparado un medio de cultivo (Agar Gelatina, Agar Mc Conkey, etc.), puede ser inoculado e inmediatamente incubado en condiciones que favorezcan el crecimiento microbiano. En la toma de muestras de un medio (solido, liquido o aire), mayormente se tiene una población mixta, entonces si se quiere cultivar una especie de la muestra se debe realizar “técnicas de aislamientos” que permitan obtener cultivo axénicos o puros. Un cultivo puro o axénico es aquel que contiene un solo tipo de microorganismo y que procede de una sola célula, el crecimiento de esta origina, en medio sólido, una masa de células fácilmente reconocibles o visibles que recibe el nombre de “colonia”.

Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo de éste en medios de cultivo y condiciones de laboratorio controladas. La población de microorganismos desarrollada en un medio se denomina cultivo. Cuando éste contiene una sola especie de microorganismo, se denomina cultivo puro o axénico, cuando contiene más de una especie de microorganismos se denomina cultivo mixto. Un cultivo tipo contiene una especie conocida de microorganismos y es conservada en el laboratorio para realizar diversos ensayos y estudios.

Técnicas de siembra de medios de cultivo en tubos

Se tiene siembra en medios de cultivo contenido en tubos, ya sea caldo, caldo nutritivo, agar inclinado, otros. Así se observaran en las colonias su intensidad de enturbiamiento, aparición de película o sedimento en el tubo, también poder determinar un crecimiento móvil o no.

a) Siembra en tubos por estrías simples: Se toma con asa de siembra previamente esterilizado por flameado una cantidad de muestra adecuada. Se añade al tubo desde el fondo de la superficie de este, realizando movimientos ascendentes en zig-zag hasta completar toda la superficie del medio. Este método es utilizado para conservar cepas durante largos periodos, así como para la realización de ciertas bioquímicas, como, por ejemplo, la prueba de la ureasa.

b) Siembra en tubos por picadura: Consiste en introducir la aguja de Kölle en el medio de cultivo semisólidos como por ejemplo, el medio de oxidación fermentación de Hugh-Leiffson.

Técnicas de aislamiento

Un modo de estudiar un ecosistema microbiano consiste en aislar de él los microorganismos y estudiar sus propiedades en cultivos de laboratorio. El aislamiento es importante porque se obtienen cultivos para estudios experimentales en el laboratorio y para las aplicaciones en los campos de la biotecnología y la microbiología industrial y ambiental (Madigan, 2009). Hernández (2003) nos dice que se ha desarrollado una serie de técnicas microbiológicas para aislar microorganismo y obtener cultivos puros. A continuación se mencionan tres de ellas:

Aislamiento por agotamiento de superficie o estrías: Se tomará con el asa de siembra (previamente esterilizado por flameado) una cantidad adecuada de muestra problema depositando el inoculo en uno de los extremos superiores de la placa; a partir de aquí se realizaran movimientos en zig-zag de un extremo a otro de la placa no tomándose en ningún momento nuevo inoculo y no levantándose el asa hasta concluir la siembra de toda la placa.

Aislamiento por diluciones: Se dispondrá de una serie de tubos con medio de cultivo específico o agua estéril según los casos. Se adicionara una cantidad de muestra solida o liquida en los tubos sabiendo la cantidad de muestra o inoculo que se añade en el tubo inicial. Se agitara hasta homogenización. Con pipeta estéril se tomara una cantidad específica o exacta y se adicionara al segundo tubo, que se homogeniza. Repetimos la operación anterior con el tercer tubo y así sucesivamente hasta obtener la dilución deseada. Con la dilución esperada, por ejemplo, 10-3 y 10-4, inocular en placas de cultivo una cantidad de inoculo exacta y extender con un asa ce Digrasky previamente estéril. Incubar a temperatura precisa durante unas 24 horas y posteriormente recontar. Existen muchas variaciones de este método. Una de ellas es hacerlo en medio de cultivo con agar, donde se mezcla en los tubos la muestra y se diluyen hasta obtener la dilución deseada; posteriormente son vertidos en placa y se deja solidificar.

IV. PARTE EXPERIMENTAL:

Ejercicio 1: Técnicas de cultivo de Microorganismos: Características de crecimiento en medio de cultivo.

MATERIALES:

Cultivo de microorganismos de 18 horas. Asa y aguja de Kölle Mechero Tubos con agar nutritivo inclinado Tubos con agar nutritivo vertical Tubos con caldo nutritivo

PROCEDIMIENTO:

1. Se esterilizó el asa de Kölle por flameo a la llama.

2. Se tomó el tubo con el cultivo de 18 horas, se retiró el tapón, flameando la boca del tubo al mechero y se obtuvo una pequeña porción del cultivo con ayuda del asa de Kölle. Flamee la boca del tubo antes de volver a taparlo.

3. Se tomó el tubo con caldo nutritivo, y con los mismos cuidados anteriores introduzca el asa en el líquido para dejar el inóculo. Homogenizando la mezcla girando el tubo entre las palmas de la mano.

4. Se repitió el procedimiento 1 para obtener más inóculo, pero usando esta vez aguja de Kölle.

5. Se tomó el tubo con agar inclinado y realizamos la siembra depositando el inóculo a lo largo de una sola línea descrita desde la base de la inclinación hasta el extremo.

6. Se repitió el procedimiento 1 para obtener inóculo, usando nuevamente aguja de Kölle.

7. Se tomó el tubo con agar vertical y realizamos la siembra por picadura profunda del medio.

8. Se rotuló los tubos sembrados y se mandó a incubar a 37°C por 24 horas.

9. Cuando se cumplió el tiempo de incubación, se evaluó el crecimiento y anotamos sus resultados.

Ejercicio 2: técnicas de cultivo de microorganismos: Aislamiento y recuento en placas

MATERIALES:

Tubos de caldo conteniendo una mezcla de microorganismos Tubos con 12 ml de agar nutritivo licuado y mantenido a 50 °C Placas Petri estériles Placas con agar Manitol Placas con agar Mac Conkey Asa , aguja de Kölle

PROCEDIMIENTO:

A) Aislamiento por estrías

1. Se tomó el tubo de caldo que contiene la mezcla de microorganismos y con ayuda de la aguja de Kölle previamente esterilizada a la llama, se retiró el inóculo.

2. Se tomó la placa con agar Manitol con la mano izquierda y con ayuda de los dedos pulgar e índice levante hacia un lado la tapa, procurando que la parte expuesta se encuentre bajo la influencia del mechero. No descubrimos por completo la placa, así se procuró evitar mayor contaminación. Con la aguja cargada de inóculo, se hizo estrías sobre toda la superficie del medio, procurando trazar una última estría sobre toda la superficie del medio, procurando trazar una última estría en un espacio libre. Cierre la placa.

3. Se esterilizó el asa a la llama nuevamente.4. Se repitieron los pasos 2 y 3 para la placa con agar Mac Conkey.5. Se mandaron las placas en incubación a 37°C por 24 horas.6. Se observaron el desarrollo de colonias individuales y describimos sus

características de forma, elevación, consistencia, bordes, etc. Diferenciamos las características de las colonias desarrolladas en el medio selectivo-diferencial.

B) Aislamiento por diluciones

1. Se tomó el tubo de caldo conteniendo la mezcla de microorganismos y con ayuda del asa de Kölle retirando inóculo.

2. Tomamos un primer tubo de agar licuado y mantenido a 50 °C y transfiriendo asépticamente el inóculo. Esterilizamos el asa a la llama del mechero. Con el tubo cerrado mezcle el inóculo con el medio, haciéndolo girar entre las palmas de las manos.

3. La idea era transferir una asada del agar mezclado con el inóculo hacia un segundo tubo de agar licuado. Repetir la operación anterior para obtener una mezcla homogénea.

4. Verter el contenido de cada tubo por separado en dos placas Petri estériles y rótelas lentamente para distribuir el medio de manera uniforme. Identificar cada dilución.

5. Incubar las placas a 37 °C por 24 horas.6. Examinar el crecimiento de las colonias en las placas; sin embargo,

solo tuvimos resultados de la primera incubación porque se solidificó el agar licuado, de la segunda disolución, antes de ser transferido a la placa que le correspondía. Haga un recuento de colonias, si el estimado no es inferior a 30 ni superior a 300. Describa las características diferenciales de las colonias observadas.

V. RESULTADOS:

Muestra: Staphylococcus sp.

a) Crecimiento en estrías sobre agar inclinado:

b) Crecimiento en agar vertical por picadura profunda:

Cantidad: Ninguna

Distribución de la superficie: Ninguna

Forma de crecimiento: Ninguna

Consistencia del crecimiento: Ninguna

Pigmentación: Ninguna

Crecimiento: Limitada a la línea de inoculación o picadura y en la superficie.

c) Crecimiento en caldo nutritivo:

Cantidad: Ninguna

Apariencia o tipo: Ninguna

Técnicas de Aislamiento y recuento:

a) Aislamiento por estrías:

Se observó crecimiento de colonias

Borde: entera

Forma: puntiforme

b) Aislamiento por dilución:

VI. DISCUSION:

A) Caldo nutritivo

El crecimiento de las bacterias en medios líquidos se hace con el objetivo de observar la respuesta que tienen las bacterias con respecto al oxígeno; se manifiesta por la aparición de turbidez o sedimento, velo en la superficie del medio y olor característico. Sin embargo no se encontró ningún crecimiento bacteriano de Staphylococcus sp.

B) Agar inclinado

Según la guía de laboratorio Microbiología (2000) las formas que se presentan son las siguientes arborescente, granulado, equinulado, rizoide y filiforme. Sin embargo no se encontró ningún crecimiento bacteriano de Staphylococcus sp.

C) Agar vertical

En los resultados de en agar vertical el crecimiento fue limitado a la línea de inoculación o picadura y en la superficie.

Se observaron pequeñas colonias (de menor diámetro) y muy unidas entre sí, debido por la gran cantidad de bacterias depositadas en el agar licuado.

Después de haber sembrado los microorganismos en agar vertical se confirmó que los géneros que formaban parte de la mezcla de bacterias son anaerobios facultativos, ya que estos se desarrollaron muy bien tanto en la superficie del medio de cultivo como en la profundidad.

De acuerdo a ECOLOGIA.UNALM, a menos que tengas un cultivo fresco de 24 horas directo de la incubadora, no verás muchos tubos con turbidez, debido a las bacterias tienden a depositarse cuando se refrigeran por varios días. Después de esto se formará un anillo o una película en la superficie del tubo. Al pasar el tiempo observara si se forma en los tubos el fenómeno de precipitación. Una vez completo este paso, mezcla las bacterias agitando, dando golpes, rodando el tubo en la palma de tu mano. Una vez mezclado, podrá observar turbidez, floculación, o una apariencia de hilo dentro del caldo.

Este fue uno de los posibles causantes de la variación en los resultados con las discusiones pues, al ser un cultivo viejo como se explicó no se podría apreciar muy bien las características propias de la bacteria.

Aislamiento y recuento de placas

A) Por estrías o agotamiento en superficie:

Para esta técnica se usa una mezcla de bacterias (E.coli, Staphylococcus sp. y Bacillus sp.); según Gamazo (2005) los microorganismos se encuentran en comunidades complejas en la naturaleza; por ello la técnica más utilizada en los laboratorios de microbiología que permite que cada bacteria viable (viva) sea aislada en la superficie del medio sólido es esta.De esta manera se desarrollará hasta formar un cúmulo de bacteria, que se hace visible como una colonia aislada, contabilizándose como unidades formadoras de colonias, para su posterior investigación.

En nuestros resultados se observa que en las placas Petri, hay un mayor crecimiento microbiano en el agar Manitol, también se observa en las colonias eran pequeñas y de color amarillo, Rodríguez (2007) menciona que el agar manitol es un medio de cultivo altamente selectivo pues al contener cloruro de sodio NaCl (7.5%), aumenta la presión osmótica ,originando la proliferación de bacterias osmoresistentes, y la presencia de manitol evidencia la fermentación que hubo, es por ello la coloración amarilla que presento, como

consecuencia solo creció las cepas de género Staphylococcus sp, pues son las únicas que cumplen estas dos condiciones. García (1994).

Se utilizó el agar Mac Conkey para el aislamiento de Gram negativas de fácil desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos, ya que en el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano y la lactosa es el hidrato de carbono fermentable (Food and Drug Administration, 1995)

Se observa que en las placas Petri, hay crecimiento microbiano en el agar Mac Conkey. Este agar es de tipo selectivo debido a la mezcla de sales biliares y cristal violeta que inhiben el desarrollo de gran parte de flora Gram positivas. (Food and Drug Administration, 1995)

En el agar Mac Conkey las poblaciones eran grandes y de color violeta debido a que eran Gram negativas, se podía contar eran 12 colonias. En cambio en el agar Manitol eran varias colonias muy pequeñas y de color amarillo y con mal olor debido a que había fermentado el manitol.

B) Por diluciones:

En este caso, se quiere hacer el recuento de bacterias para determinar el número de bacterias existentes en una muestra o cultivo, puede ser en un determinado volumen o determinando el número de bacterias vivas existente, ya que cada bacteria da lugar a una colonia diferente, y luego se cuenta el número de colonias que se han desarrollado (recuento viable), según De la Rosa (2003).

En la primera dilución las colonias eran pequeñas y estaban muy juntas lo cual se hacía difícil de contar, en la secunda dilución eran pocas colonias y de aspecto brilloso. Esta técnica sirve para diferenciar que tipo de microrganismos estamos trabajando y mantenerlo fresco.

VII. CONCLUSIONES:

Es importante tener bien claro el procedimiento, para llevar a cabo la preparación de los medios de cultivo, porque de estos dependen el crecimiento de los distintos microorganismos.

Es necesario trabajar con las suficientes medidas de asepsia y esterilidad, para que el aislamiento sea exitoso y para evitar posibles contaminaciones externas en nuestro medio de cultivo.

El cultivo en caldo nutritivo permite observar el crecimiento de la cepa en presencia o ausencia de oxígeno.

El medio de cultivo sólido permite una selección y diferenciación entre el crecimiento de las bacterias presentes en la mezcla.

Mediante las técnicas de aislamiento se pueden separar colonias individuales partiendo de una mezcla de microorganismos como se realizó en la práctica, de este modo nos permite visualizar de manera objetiva las colonias.

El agar Manitol es un medio de cultivo selectivo y diferenciado para las cepas de genero Staphylococcus y agar Mc Conkey para los E. coli.

Con la práctica se demuestra que uno de los métodos de cultivos de organismo puros más sencillos de usar y aun así muy efectivo, es mediante el aislamiento por estrías, mediante la estriación que poco a poco dará lugar a colonias formadas por organismos únicos que se van desarrollando en el Agar, tal como se puede observar en la placa con agar Mc Conkey.

VIII. CUESTIONARIO:

Ejercicio n° 1

1. ¿Por qué algunos microorganismos desarrollan en caldo un característico crecimiento tipo célula? ¿Qué factores sustanciales podrían alterar la formación de una película superficial?

Presentan este tipo de crecimiento porque es un medio de cultivo líquido, las bacterias según su forma de crecimiento invadirán todo el caldo si es posible. El factor que podría alterar la formación de la película es el oxígeno, ya que si son bacterias aerobias tendrán la película en la superficie, si son aerobias facultativas en el medio y si son anaerobias se sedimentarán en el fondo.

2. Cuando utiliza tubos de agar inclinado para el estudio de las características de crecimiento es preferible inocular con aguja de Kölle y no con asa ¿Por qué?

Es preferible que el instrumento de inoculación sea retirado a lo largo del mismo camino que se usó para atravesar inicialmente el medio. Solo se pica el agar con un movimiento uniforme y recto, por eso se usa la aguja de Kölle y no el asa.

3. ¿Qué factores influenciarán en la abundancia de crecimiento en caldo, agar inclinado y agar vertical?

En cualquier medio de cultivo es de primordial importancia ajustar el pH, ya que aún cuando la mayoría de los microorganismos crecen mejor en pH neutro, algunos requieren de pH alcalino o ácido, por lo que al proporcionar un pH adecuado se favorecerá el crecimiento del microorganismo de interés y la obtención del cultivo. Con este mismo propósito durante la incubación se deben proporcionar las condiciones adecuadas para el microorganismo en estudio. El crecimiento óptimo de los microorganismos se presenta a temperaturas que la mayoría de las veces están relacionadas con la de su hábitat natural.

Ejercicio n° 2:

1. ¿Qué procedimiento seguiría a continuación del desarrollo en estos ejercicios para obtener el cultivo puro de cada cepa contenida en la muestra? ¿Cómo podríamos comprobar que estas cepas obtenidas finalmente corresponden a las colonias aisladas?

Sería tomar muestras de las colonias aisladas que deben formarse al final de las estrías y ponerlas en medios de cultivo para su desarrollo y posterior identificación.En el caso de aislamiento por diluciones, debe tomarse la muestra de la placa que luego de varias diluciones, presenta un menor número de colonias aisladas, lo que facilita recogerla y sembrarla en un medio adecuado para su desarrollo y posterior identificación.La comprobación de que las cepas obtenidas pertenecen a las colonias aisladas, podría hacerse, sembrando la muestra en un medio que contenga determinado nutriente, al que sólo responde este tipo de microorganismo, o

regulando los niveles de oxígeno, dependiendo del tipo de respiración que presenta el microorganismo de la muestra.

2. ¿Qué factores limitan el tamaño de las colonias en una placa de cultivo?

Existen diversos factores que limitan el tamaño de las colonias en un placa de cultivo; una de ellas es el pH, dependiendo del rango de pH del medio; el contenido de agua, influenciar en la forma y tamaño de la colonia; el potencial de óxido reducción; el contenido nutricional presente en el medio cultivo; los constituyentes antimicrobiales y las estructuras biológicas.

3. Suponga que recibe una muestra de leche en polvo y se le pide determinar el número total de colonias por gramo. Plantee una metodología cuantitativa basada en diluciones sucesivas para resolver el problema.

Tomamos una muestra de un gramo de leche en polvo y la diluimos en aproximadamente 10 mL de medio de cultivo. De la mezcla, se transfiere 1 mL a otro tubo, el cual contenga 9 mL de una solución salina. A continuación, se procede a homogenizar y se toma finalmente, 1 mL de esta solución y se le transfiere a otro tubo con 9 mL de solución salina. Posteriormente, se vierte 1 mL de cada tubo en tres placas Petri y se procede a incubarlas a 30 °C por 24 horas. Transcurrido el tiempo, se realiza el conteo de las colonias en la placa que haya menor número de éstas y el resultado se multiplica por 10, pues fue la tercera dilución.

4. ¿En qué consiste la técnica del número más probable y qué usos tiene?

El método del número más probable (NMP), nos proporciona un recuento de viables. Se basa en el principio de que una única célula viva puede desarrollarse y producir un cultivo turbio. El NMP requiere la realización de una serie de diluciones seriadas al décimo de la muestra de cultivo, en un medio líquido adecuado para el crecimiento de dicho organismo. Posteriormente, se incuban las muestras de dichos tubos problema. Una vez que ha pasado suficiente tiempo como para que crezca el microorganismo, se examinan los tubos. Aquellos tubos que fueron inoculados con una o más células microbianas a partir de la muestra, se pondrán turbios, mientras que los tubos que no recibieron ninguna célula permanecerán transparentes. A medida que se aumenta el factor de dilución, se alcanzará un punto en el cual algunos tubos contendrán tan sólo un organismo y otros, ninguno. Al determinar la probabilidad de que los tubos no recibieran ninguna célula, se

puede determinar el número más probable de microorganismos presentes en la muestra original, utilizando para ello una tabla estadística.

La precisión del número más probable aumenta con el número de tubos que se usan, aunque cinco tubos por dilución se consideran como una relación apropiada entre la precisión y la economía. El método del NMP se utiliza para contar microorganismos que son difíciles de cultivar en medio sólido. También se usa para determinar el número de células de un cultivo mixto que pueden crecer en un medio líquido determinado. Por ejemplo, puede emplearse para determinar la contaminación del agua potable, determinando el número de bacterias que pueden crecer en un medio que contiene lactosa. Estas bacterias probablemente sean Escherichia coli provenientes de aguas residuales contaminadas, y la presencia de E. coli en el agua potable es una prueba presuntiva de contaminación.

5. ¿De qué manera se pueden preservar cepas puras por largos períodos?

A) Métodos de elección o de conservación a largo plazo .

Son los mejores porque en ellos se paraliza el crecimiento de las células microbianas, pero éstas no han muerto. Así se garantiza al máximo la estabilidad genética, por evitarse la aparición de generaciones sucesivas.

a) Conservación por congelación:

Se congelan las células en suspensión en un líquido con un agente crioprotector y se guardan a temperaturas inferiores a cero grados centígrados, con lo que el agua se congela. De esta forma, al no disponer las células de agua en forma líquida, no hay crecimiento. Cuando se quiere trabajar con las células así conservadas, se recuperan subiendo la temperatura. Este es el mejor método de conservación desde todos los puntos de vista, pero tiene el inconveniente de requerir aparatos especiales.

b) Conservación por liofilización:

Tampoco se da crecimiento en las células conservadas por este método, puesto que se les ha quitado el agua mediante la liofilización, que es un proceso suave. Con ello la estabilidad genética es alta, pero a veces no tanto como en la congelación, porque la liofilización se consigue por sublimación del hielo de las células.

B) Métodos alternativos :

Son los que se utilizan cuando no se pueden emplear los métodos de elección, bien por carecer de los equipos necesarios, o bien porque la cepa microbiana no resiste los tratamientos de la conservación por estos métodos. Conviene tener en cuenta que nunca se debe usar un único método alternativo, sino que se recomienda conservar el microorganismo empleando varios de estos métodos.

a) Conservación por transferencia periódica:

La cepa microbiana se guarda en forma de cultivo activo en el medio de cultivo en el que ha crecido. Sin embargo, estas células no pueden permanecer indefinidamente en el mismo tubo, porque al seguir activas excretan productos tóxicos del metabolismo que se acumulan, provocando el envejecimiento y muerte celulares, por lo que es necesario transferirlas a otro tubo con medio de cultivo fresco.

b) Conservación por suspensión en agua destilada o en agua de mar estéril:

Es un método alternativo muy utilizado y que da altos porcentajes de viabilidad en diversos tipos de microorganismos, tanto hongos filamentosos como levaduras y algunas bacterias. Consiste en suspender en agua estéril unas cuantas células del cultivo que se quiere conservar. Se pueden preparar en criotubos de los anteriormente mencionados. En este caso la concentración celular no debe ser superior a 104-105 células/ml en el caso de bacterias y levaduras. Para los hongos filamentosos que no esporulan, se pueden poner en suspensión trocitos de agar con el crecimiento del hongo. En el caso de microorganismos marinos, la suspensión se hace en agua de mar diluida.

C) Métodos restringidos :

En este grupo se engloban métodos no empleados habitualmente, pero a los que es necesario recurrir a la hora de conservar grupos de microorganismos muy determinados que no resisten bien la liofilización o la congelación, como por ejemplo los géneros bacterianos Spirillum, Rhodospirillum, etc. Los cuatro métodos que vamos a citar se basan en la paralización del crecimiento por eliminación del agua disponible para las células.

a) Desecación en papel de filtro.

Se utiliza un papel bastante absorbente (Whatmann nº 3) que se impregna con una solución muy densa de células y se deja secar al aire (en condiciones estériles). También es posible desecarlos por el procedimiento que se llama desecación líquida (L-Dry) porque se utiliza para ello el liofilizador, pero sin que haya habido congelación previa de las células.

b) Desecación en suelo, arena, silicagel, etc.

Se añaden las células a estos sustratos que las protegerán al desecar. Los microorganismos productores de esporas se pueden conservar durante bastante tiempo por este método.

c) Desecación en bolitas de alginato.

Éste es un procedimiento bastante eficaz. Las células se encuentran en una matriz de alginato y la eliminación del agua se hace por tratamiento con soluciones hipertónicas sucesivas y posterior desecación al aire hasta que se pierde un 70% de su contenido en agua.

d) Desecación en sal gorda para halobacterias.

Para su conservación por este método se mezclan las células con sal y se dejan desecar espontáneamente. Debido a la higroscopicidad de la sal, la desecación no es total, pero las células dejan de multiplicarse por ser insuficiente el nivel de agua disponible.

6. ¿Qué técnicas de cultivo se emplean para aislar microorganismos anaeróbicos?

Para el cultivo de microorganismos anaerobios estrictos: En medio líquido, añadimos al medio de cultivo agentes reductores que toman el O2 disuelto en el agua y forman H2o. Estos agentes son cisteína o tioglicolato, por ejemplo. Otra manera es bombeando CO2 o N2 libre de 02 al medio, mediante burbujeo.

En medio sólido, se emplean jarras de anaerobiosis o jarras de Gas-Pak. Su tamaño es similar al de un termo. En su interior se colocan las placas Petri invertidas. El recipiente se cierra con una tapa hermética. En la parte inferior hay un catalizador de paladio. Para conseguir la anaerobiosis, introducimos sobres de anaerobiosis, que contienen NaCO3 y borohidruro de sodio. Al añadir agua al sobre, se libera H2 y CO2. El oxígeno presente se reduce a agua. Para verificar la anaerobiosis hay un indicador, que consiste en una

tira de papel impregnada con azul de metileno. En condiciones aeróbicas, la tira es azul, pero sino, es transparente. En la tapa hay un manómetro con el que medimos la presión interna, ya que se están desprendiendo CO2 y H2.

IX. BIBLIOGRAFÍA:

HERNANDEZ, A. 2003. Microbiología industrial. Primera edición. Editorial EUNED. San José, Costa Rica.

MADIGANM.et al. 2009. Biología de los microorganismos. Brock. Pearson-Prentice Hall Editorial. 12ª edición. Madrid

GAMAZO, C. 2005. Manual Práctico de Microbiología. Tercera Edición. Editorial Masson. España.

RODRIGUEZ, G.2007. Compendio de Microbiología Médica. Editorial Harcourt. Madrid, España.

DE LA ROSA, M. 2003. Microbiología en ciencia de la Salud. Segunda Edición. Editorial Elsevier. España.

GARCIA MARTOS, P. 1994. Microbiología Clínica Práctica. Segunda edición. Servicio Publicaciones UCA.