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1 INFORME TÉCNICO DE LA OPCIÓN CURRICULAR EN LA MODALIDAD DE: PROYECTO DE INVESTIGACIÓN INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA OPTIMIZACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO PARA Metarhizium anisopliae. QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE INGENIERO BIOTECNÓLOGO PRESENTA: SANDRA MEJÍA RAMÍREZ México, D. F., enero, 2016 DIRECTOR INTERNO: Dr. Sergio García Salas
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INFORME TÉCNICO DE LA OPCIÓN CURRICULAR EN LA MODALIDAD DE:
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
OPTIMIZACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO PARA
Metarhizium anisopliae.
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE
INGENIERO BIOTECNÓLOGO
PRESENTA:
SANDRA MEJÍA RAMÍREZ
México, D. F., enero, 2016
DIRECTOR INTERNO: Dr. Sergio García Salas
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CARTA DE SESIÓN DE DERECHOS
En la Ciudad de México el día 12 de Enero del 2016, el que suscribe Sandra
Mejía Ramírez, alumno del Programa Académico Ingeniería Biotecnológica con
número de boleta 2010620269, de la Unidad Profesional Interdisciplinaria de
Biotecnología, manifiesta que es autor intelectual del presente trabajo escrito bajo
la dirección del Dr. Sergio García Salas y cede los derechos del trabajo titulado
“Optimización del medio de Cultivo para Metarhizium anisopliae” al Instituto
Politécnico Nacional, para su difusión con los fines académicos que desarrolla.
Los usuarios de la información no deben reproducir el contenido textual, gráficas o
datos del trabajo sin el permiso expreso del autor y/o director del trabajo. Este
puede ser solicitado en la siguiente dirección de correo electrónico:
[email protected]. Si el permiso se otorga, el usuario deberá citar la
fuente y dar el agradecimiento correspondiente.
Sandra Mejía Ramírez
________________________________________
Nombre y firma
3
DEDICATORIAS
Con mucho amor a mi hijo Eduardo Said
Por ser mí motivo, mi fuerza, mi luz, por ser ese motor que uno necesita en
tiempos difíciles.
Por enseñarme tanto, esto es por y para ti.
Te amo
4
AGRADECIMIENTOS
Al Instituto Politécnico Nacional por ser mí segunda casa, por todas las
enseñanzas y aprendizaje adquiridos.
A mí querida UPIBI por darme la preparación durante todos estos años y
brindarme todas las facilidades para poder concluir este trabajo
Un especial agradecimiento a mi asesor y tutor el Dr. Sergio García Salas
por brindarme la oportunidad de trabajar con él, por la confianza,
paciencia y conocimiento durante todo el proceso y por su gran
disposición para dirigir el presente trabajo. Fue un placer trabajar con
usted.
5
AGRADECIMIENTOS
Deseo agradecer primeramente a dios, por permitirme llegar a este punto
de mi vida y poder disfrutar de este momento.
A mi madre María del Carmen por todo el apoyo y amor brindado desde
siempre, por esos sacrificios, esas desveladas , por ese trabajo duro que
tuviste que hacer para que yo pudiera seguir estudiando, es algo que
valoro mucho y quiere que sientas este logro como tuyo porque también lo
es ,nada de esto lo habría logrado sin ti. ¡Gracias!
A mi padre Victorino por enseñarme la disciplina y que la constancia es la
base de todo para que lograr lo que uno se propone, por el amor , el apoyo
y la comprensión brindada ya que fueron fundamentales para que yo esté
en este punto. ¡Gracias!
A mi esposo Eduardo por todo el amor, apoyo, respeto, comprensión y
consejos que me has brindado desde el día en que te conocí, por siempre
estar aquí en las buenas y en las malas. Por nunca dejarme sola. ¡Gracias!
A la familia de mi esposo pero principalmente a sus padres Carlos y
Alicia, por el cariño, el apoyo y la ayuda que siempre me dieron para que
pudiera seguir con mis estudios, por querer tanto a mi hijo ese es el mejor
regalo que me pueden dar. ¡Gracias!
A mis hermanos Teresa, Adriana, Mónica, Laura, Jorge, Guadalupe y
Ceci por hacer de mi niñez uno de los mejores recuerdos que tengo, por
esos días de risa, enojos y peleas. Por la motivación siempre brindada.
Nombrar a uno en especial sería injusto porque todos son mi ejemplo a
seguir, todos me han enseñado algo y solo puedo decir gracias. Gracias por
hacer mi vida más feliz.
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A todos mis amigos y compañeros que acompañaron desde el inicio de mi
educación, gracias por todos los momentos y experiencias compartidas,
pero especialmente a:
Sebastián Díaz por tu amistad incondicional, por todos los momentos de
alegría y de trabajo por ser más que mi amigo el hermano que un escoge,
gracias por todo el cariño y el apoyo! Gracias!
Ernesto López por ser mi psicólogo, mi cómplice, mi amigo, por todas esas
platicas de risa, por escucharme y confiar en mí. Gracias por tu amistad.
Daniel Bello por demostrarme que en la amistad no importa quien llega
primero, si no quien nunca se va, gracias por siempre motivarme, por tu
apoyo y tu disposición de siempre querer ayudar, gracias por esa nobleza,
por el cariño pero sobre todo por la amistad. ¡Gracias!
ÍNDICE
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1. Introducción ................................................................................................................................... 9
1.1 Metarhizium anisopliae ....................................................................................................... 10
1.2 Producción de Metarhizium anisopliae ............................................................................. 14
1.2.1. Cultivo en sustrato sólido ........................................................................................... 14
1.2.2 Cultivo en fase líquida .................................................................................................. 16
1.2.3 Cultivo bifásico .............................................................................................................. 17
1.2.4 Comparación de los tipos de cultivos ........................................................................ 17
1.3 Medios de cultivo ................................................................................................................. 19
1.4 Formulación de medios de cultivo ..................................................................................... 20
1.5 Selección de componentes del medio de cultivo ............................................................ 21
1.6 Optimización del medio de cultivo ..................................................................................... 22
2. Justificación ................................................................................................................................. 24
3. Objetivos ...................................................................................................................................... 26
4. Metodología ................................................................................................................................ 27
4.1 Microorganismo. ................................................................................................................... 27
4.2 Preparación de inoculo A. .................................................................................................. 28
4.3 Selección de componentes del medio de cultivo ............................................................ 28
4.4 Preparación de inoculo B.................................................................................................... 29
4.5 Optimización del medio de cultivo. .................................................................................... 29
5. Resultados y discusión ............................................................................................................. 31
5.1 Selección de componentes del medio .............................................................................. 31
5.2 Optimización del medio de cultivo ..................................................................................... 35
6. Conclusiones .............................................................................................................................. 39
7. Referencias ................................................................................................................................. 40
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ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Cultivos y sus principales plagas, que son sensibles al ataque de Metarhizium
anisopliae. ....................................................................................................................... 11
Tabla 2.Arreglo de Plackett Burman. ............................................................................... 29
Tabla 3. Valores codificados y concentraciones de los factores usados en el diseño
compuesto central. .......................................................................................................... 30
Tabla 4.Concentración de esporas obtenidas a los 7 días en los experimentos del arreglo
de Plackett Burman.......................................................................................................... 32
Tabla 5. Análisis de regresión múltiple de los resultados obtenidos en el Método de Plakett
Burman. ........................................................................................................................... 33
Tabla 6. Concentración de esporas obtenidas en los experimentos del diseño compuesto
central. ............................................................................................................................. 35
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Morfología macroscópica y microscópica de Metarhizium anisopliae (Pik-Kheng
y col., 2009). .................................................................................................................... 11
Figura 2.Proceso infectivo de los Hongos Entomopatógenos (Tomado de Thomas y Read,
2007) ............................................................................................................................... 12
Figura 3. Procedimiento experimental. ............................................................................. 27
Figura 4. Diagrama de Pareto de los efectos estandarizados de los componentes del
medio de cultivo sobre la producción de esporas. Agua de cocimiento de maíz (acm). ... 33
Figura 5.Superficie de respuesta de los efectos interactivos de la melaza y del agua de
cocimiento de maíz (ACM) sobre la concentración de esporas de Metarhizium anisopliae a
120 horas. ........................................................................................................................ 37
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1. Introducción
La biotecnología agrícola está enfocada a dar solución a problemas de baja
producción y pérdidas económicas de cultivos, provocadas por factores bióticos y
abióticos del campo, y se enfoca principalmente a lograr una agricultura
sustentable. Un objetivo de la biotecnología es reducir la dependencia de químicos
sin afectar, o incluso, incrementar la productividad del campo, lo cual traerá como
consecuencia la reducción en costos de los insumos y ayudará a reducir los
problemas ambientales.
El control biológico es una práctica agrícola en constante crecimiento que busca la
destrucción total o parcial de patógenos e insectos plaga, frecuentemente
mediante el uso de sus enemigos naturales. Existen numerosos reportes sobre la
utilización de microorganismos entomopatógenos, que por su capacidad de
producir enfermedad y muerte en insectos, son utilizados como agentes de control
biológico.
El término entomopatógeno se usa para definir aquellos microorganismos capaces
de atacar insectos, y que reduce las poblaciones de insectos plaga a niveles que
no causan daño económico a los cultivos.
Hasta el momento se han descrito más de 750 especies de hongos
entomopatógenos y el aislamiento de nuevas cepas continúa. Dentro de los más
utilizados a nivel mundial se encuentran Metarhizum anisopliae (33.9%),
Beauveria bassiana (33.9%), Isaria fumosorosea (antes Paecilomyces
fumosoroseus) (5.8%) y Beauveria brongniartii (4.1%) (de Faria y Wraight, 2007).
En 1878, Metchnikoff utilizó el hongo Metarhizium anisopliae para el control del
escarabajo de cereales, con este hecho Metchnikoff es la primera persona que
utilizó un hongo como agente de control de plagas (Glare, 2004).
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1.1 Metarhizium anisopliae
Metarhizium anisopliae es un hongo entomopatógeno importante que ha sido un
modelo para el estudio del control biológico de insectos plaga, este hongo se
utiliza comercialmente en Brasil para controlar el salivazo (Mahanarva bipars), que
afecta a la caña de azúcar, y también se utiliza en otros países, como Colombia,
Australia y E.U para controlar una variedad de plagas. El amplio rango de
hospederos de insectos del género Metarhizium lo hace comercialmente atractivo
como agente de control biológico (Dalla Pria y col., 2008).
Metarhizium anisopliae se caracteriza por ser mesófilo, con una temperatura
óptima para germinación y crecimiento de 25 a 30°C, una máxima de 32 a 35°C y
una mínima de 10 a 12°C, es un hongo imperfecto de color verde oliva, pertenece
a la subdivisión Deuteromycotina, clase Hyphomycetes, caracterizado por la
formación de micelio septado con producción de conidias de aproximadamente 0.5
a 0.8 micrómetros de diámetro o formas de reproducción asexual, en conidióforos
que nacen a partir de hifas ramificadas.
Presenta una colonia pegada al medio, completamente redonda, de colores
oliváceo, amarillento, verdoso, marrón oscuro, dependiendo del aislamiento, con
un revés incoloro a marrón, a veces verdoso citrino (figura 1). Las conidias son
unicelulares, cilíndricas y truncadas, formadas en cadenas muy largas, hialinas a
verde oliváceo, miden de 3.5 micrómetros a 9 micrómetros de longitud por 1.5
micrómetros a 3.5 micrómetros de diámetro (Cañedo y Ames, 2004).
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Figura 1. Morfología macroscópica y microscópica de Metarhizium anisopliae (Pik-Kheng y col., 2009).
Este hongo es capaz de adherirse a la cutícula de los insectos y de entrar a su
interior por las partes blandas o por vía oral. La evidencia del ataque de M.
anisopliae sobre insectos, en condiciones naturales, ha sido descrita como
"muscardina verde" en más de 200 especies de insectos, exhibiendo diferentes
grados de especificidad, la cual está influenciada por las características del
patógeno y de la cutícula del hospedero.
Este hongo entomopatógeno ataca naturalmente más de 300 especies de insectos
de diversos órdenes (tabla 1). Algunas plagas que son afectadas por este hongo
son la salivita de la caña de azúcar (Aeneolamia varia), y chinches plagas de
diversos cultivos. Los insectos muertos por este hongo son cubiertos
completamente por micelio, el cual inicialmente es de color blanco pero se torna
verde cuando el hongo forma esporas.
Tabla 1. Cultivos y sus principales plagas, que son sensibles al ataque de Metarhizium anisopliae.
Café Hypothenemus hampei.
Papa Ancognatha sp, Phyllophaga sp.
Caña de
azúcar
Aeneolamia sp, Perkinsiella saccharicida.
Pastos Collaria columbiensis.
Arroz Spodoptera frugiperda, Tagosodes oryzicola, Euetheola, Sogata, Tibraca
y Euschistus
12
1.3 Ciclo de vida de Metarhizium anisopliae
De modo general, el mecanismo de acción de los hongos entomopatógenos sobre
los insectos se desarrolla en varias fases (Figura 2), que son: germinación,
formación de apresorios, formación de estructuras de penetración, colonización y
reproducción. La unidad infectiva son las estructuras de reproducción sexual o
asexual, es decir las esporas o los conidios.
El proceso se inicia cuando la espora o conidia se adhiere a la cutícula del insecto,
luego desarrolla un tubo germinativo y un apresorio, con éste se fija en la cutícula
y con el tubo germinativo o haustorio (hifa de penetración) se da la penetración al
interior del cuerpo del insecto. La germinación ocurre aproximadamente a las 12
horas post-inoculación y la formación de apresorios se presenta de 12 a 18 horas
post-inoculación.
Figura 2.Proceso infectivo de los Hongos Entomopatógenos (Tomado de Thomas y Read, 2007)
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En la penetración participa un mecanismo físico y uno químico, el primero consiste
en la presión ejercida por la estructura de penetración, la cual rompe las áreas
esclerosadas y membranosas de la cutícula.
El mecanismo químico consiste en la acción enzimática, principalmente proteasas,
lipasas y quitinasas, las cuales causan descomposición del tejido en la zona de
penetración, lo que facilita el ingreso del hongo.
Después de la penetración, la hifa se ensancha y ramifica dentro del tejido del
insecto, colonizando completamente la cavidad del cuerpo del insecto, esto
sucede en 3 ó 4 días después de la inoculación.
A partir de la colonización se forman pequeñas colonias y estructuras del hongo, lo
que corresponde a la fase final de la enfermedad del insecto, ocurre 4 ó 5 días
después de la inoculación.
Al agotarse los nutrientes dentro del insecto, el hongo inicia un crecimiento
miceliar invadiendo los órganos del hospedero. Finalmente, las hifas penetran la
cutícula desde el interior del insecto y emergen a la superficie iniciando la
formación de conidios, con lo que se puede completar el ciclo infectivo (Pucheta y
col., 2006). El ciclo total de la enfermedad es de 8 a 10 días.
Otra forma mediante la cual el hongo puede causar la muerte del insecto, es
mediante la producción de toxinas. Los hongos entomopatógenos tienen la
capacidad de sintetizar toxinas que son utilizadas en el ciclo de la relación
patógeno-hospedante. Entre estas toxinas se han encontrado dextruxinas,
demetildextruxina y protodextruxina, las cuales son sustancias de baja toxicidad,
pero de mucha actividad tóxica sobre insectos, ácaros y nematodos.
Al final, la muerte del insecto se debe a una combinación de factores como: la
acción de toxinas del hongo, obstrucción física de la circulación de la hemolinfa, la
privación de nutrientes y la invasión de órganos (Goettel e Inglis, 1997).
14
1.2 Producción de Metarhizium anisopliae
Una de las especies de hongos entomopatógenos con las que más se ha
trabajado en todo el mundo, en relación con su producción masiva y
comercialización como bioplaguicida es M. anisopliae (Faria y Wraight, 2007). La
producción de hongos entomopatógenos se basa en la multiplicación masiva del
hongo y sus estructuras reproductivas en diversos sustratos. También, los hongos
se pueden producir en diferentes tipos de cultivos, como el cultivo en sustrato
sólido, en fase líquida y en cultivo bifásico.
1.2.1. Cultivo en sustrato sólido
Entre los diversos grupos de microorganismos utilizados en el cultivo sólido, los
hongos filamentosos son los más explotados, por su capacidad para crecer en
sustratos sólidos complejos y producir una amplia gama de enzimas celulares y
conidiosporas (Bhanu y col., 2008).
La producción de conidios en gran escala se puede realizar sobre diferentes
sustratos sólidos de origen vegetal, como papa, trigo, soya y arroz (Kassa y col.,
2008), siendo este último el substrato comúnmente seleccionado para la
producción de conidios fúngicos, probablemente por su balance nutricional, bajo
costo, disponibilidad en todo el mundo; además, de presentar características
físicas como: tamaño, forma e integridad estructural; aún después de ser
colonizado por el hongo (Jenkins y col., 1998).
En cultivo en sustrato sólido, los hongos entomopatógenos, como Metarhizium
producen conidios hidrofóbicos. Dorta y col., (1996), encontraron para M.
anisopliae un rendimiento de 2.3 x 1010 conidios/g sustrato utilizando como
sustrato salvado de arroz.
15
También se indica en ese estudio que esto representó solo el 80.4 % de la
producción que teóricamente se puede obtener en este tipo de cultivos.
Sin duda, la relación carbono-nitrógeno (C/N) en el medio es uno de los
parámetros más críticos para aumentar la producción de conidios, por ejemplo,
Shah y col., (2005), reportaron 1.1 X107 conidios/cm2 con la cepa V25 de M.
anisopliae creciendo en PDA; mientras que adicionando 1% de extracto de
levadura, obtuvieron 2.5 X 107 conidios/cm2, mejorando la germinación de 54 a
79%.
Por su parte, Mustafa y Kaur (2009) reportaron que con la cepa UM2 de M.
anisopliae obtuvieron 1X109 conidios/cm2 en una relación C/N de 75:1, mientras
que con una C/N de 35:1, obtuvieron 5.1 X108 conidios/cm2. La fuente de carbono
utilizada en ese estudio fue glucosa y la fuente de nitrógeno, peptona.
En cuanto a estudios que consideran el estrés como factor de inducción de la
conidiación, se ha observado en Metarhizium anisopliae, que los conidios
producidos bajo estrés osmótico (cloruro de potasio 0.8 M) aumentaron la
mortalidad (%) de larvas de Tenebrio molitor, comparados con los producidos en
agar papa dextrosa con extracto de levadura. Sin embargo, la mortalidad
disminuyó cuando la concentración de sal se redujo a 0.6 M (Rangel y col., 2008),
en ese estudio se reportó que el estrés nutricional también provocó un aumento en
la mortalidad de larvas, al infectarlas con conidios que provenían de medio
mínimo, también los conidios sometidos a estrés osmótico y nutricional
aumentaron su germinación (%) a 6h de incubación.
Con el objetivo de obtener la mayor cantidad de conidios de hongos
entomopatógenos se han aplicado pulsos de oxígeno enriquecido (26%) en el
cultivo de Metarhizium anisopliae, obteniendo que la máxima producción de
conidios (4.25X107 conidios/cm2) después de 156 h de cultivo, fue el doble con
respecto a los niveles de conidios producidos bajo una atmósfera normal (Tlecuitl-
Beristain y col., 2010).
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La transferencia de oxígeno es el fenómeno de mayor interés sobre el cual se
sostiene la actividad de los microorganismos aerobios, siendo la tasa de
transferencia del oxígeno el factor limitante que determina la tasa de conversión
biológica (Thibault y col., 2000). Lo anterior se debe a que en el metabolismo
aeróbico, el oxígeno es el aceptor final en el transporte de electrones, mediante el
sistema de oxidasas en las mitocondrias de los hongos (Mathews y col., 2002).
Por otra parte, se ha reconocido que la exposición de la hifa al aire es un estímulo
en el inicio de la conidiogénesis en hongos filamentosos (Roncal y Ugalde, 2003).
La aireación cumple con cuatro principales funciones en el cultivo sólido: mantiene
las condiciones aerobias, desabsorbe dióxido de carbono, regula la temperatura
del substrato y el nivel de humedad. La atmósfera gaseosa afecta
significativamente el nivel relativo de producción de biomasa y la producción de
enzimas (Krishna, 2005), tal como se describió anteriormente.
1.2.2 Cultivo en fase líquida
El micelio, las blastosporas y los conidios sumergidos que se obtienen por
fermentación líquida también son propágulos infecciosos, pero son hidrofílicos por
lo tanto no pueden ser suspendidos en aceites, además pierden viabilidad más
rápido durante el almacenamiento que los conidios (Arzumanov y col., 2005;
Glare, 2004).
La información del cultivo de Metarhizium anisopliae en fermentación liquida es
escasa; debido a que actualmente la producción industrial de este hongo se
realiza principalmente en sustrato sólido.
17
1.2.3 Cultivo bifásico
Como se mencionó anteriormente, el método común para la producción masiva
involucra el cultivo en medio sólido, pero también puede utilizarse un sistema de
cultivo en dos etapas (bifásico), en el que se cultiva el inóculo en medio líquido y
después se agrega a un substrato sólido para la producción masiva. En ambas
técnicas el producto deseado son los conidios, por su gran virulencia y
persistencia a condiciones ambientales adversas (Dorta y col., 1996; Arcas y col.,
1999).
Respecto al cultivo bifásico de M. anisopliae, Barajas y col. (2010), obtuvieron
1X109 conidios/g utilizando arroz como sustrato. Es necesario mencionar que en
este tipo de cultivos se invierten 12 h en la obtención de propágulos en medio
líquido y después de 12 d en medio sólido, los autores obtienen la mencionada
producción de conidios.
1.2.4 Comparación de los tipos de cultivos
Doelle y col. (1992) consideran como ventajas del cultivo en sustrato sólido los
siguientes aspectos:
Los medios de cultivo son simples, generalmente subproductos agrícolas
que presentan un alto contenido de los nutrientes necesarios.
La baja actividad del agua es de gran ayuda para evitar las
contaminaciones, especialmente de bacterias y levaduras.
La concentración natural del sustrato permite utilizar reactores más
pequeños en comparación con los utilizados en otro tipo de fermentación.
Tienen mayor productividad volumétrica.
18
La aireación forzada es facilitada por la porosidad del soporte, lo que
permite una alta transferencia de oxígeno al microorganismo.
Los conidios de los hongos que se producen son mucho más resistentes y
tienen mejor adaptabilidad a las condiciones en las que se aplican como
agente de biocontrol.
Entre las principales desventajas del cultivo en sustrato sólido se encuentran:
Su aplicación se limita a microorganismos que crecen en bajos contenidos
de humedad.
La naturaleza sólida del sustrato trae problemas al medir los parámetros de
la fermentación tales como el pH, la temperatura, el contenido de humedad
y la concentración de sustrato y productos.
Los procesos de transferencia de masa son limitados por la difusión.
Muchos aspectos ingenieriles como el diseño de reactores y el escalado
están muy poco caracterizados.
El tiempo de fermentación es mayor debido a que generalmente se utilizan
microorganismos que presentan bajas velocidades específicas de
crecimiento.
19
1.3 Medios de cultivo
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros
componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los
microorganismos. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para
ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones químicas que
tengan lugar.
Todos los medios de cultivo utilizados en micología deben contener los nutrientes
suficientes para asegurar el desarrollo de los hongos (carbono, nitrógeno,
vitaminas, oligoelementos, etc.).
El pH ha de ser ligeramente ácido para facilitar el crecimiento de los hongos e
inhibir al mismo tiempo el desarrollo de otros microorganismos. Además se deben
añadir antibióticos antibacterianos para inhibir el crecimiento de las bacterias
saprófitas que suelen contaminar las muestras. Los más usados son el
cloranfenicol y la gentamicina.
Existen tres tipos de medios de cultivo para los hongos de acuerdo a su
procedencia y origen de sus componentes:
1). Medios naturales, se caracterizan por estar preparados por compuestos de
origen natural y su composición no es exacta, como pedazos o infusiones de
frutas, vegetales, granos de cereales o tejidos animales. Estos medios varían
mucho en su composición, no son fácilmente reproducibles, ni de amplio uso.
2). Medios semisintéticos, están conformados por compuestos de origen natural y
químico, estos medios de cultivo están preparados con peptonas, extractos de
plantas, agar y otros compuestos de procedencia desconocida o variable.
20
3). Medios sintéticos, presentan composición química definida cuantitativa y
conocida. La mayoría de las fórmulas de los medios de cultivo utilizados para
hongos contienen peptona, algún carbohidrato y agar (Pelczar y cols. 1997).
1.4 Formulación de medios de cultivo
Un microorganismo necesita para crecer nutrientes que le aporten energía y
elementos químicos para la síntesis de sus constituyentes celulares. El
conocimiento de la fórmula elemental del microorganismo que se cultiva facilita la
formulación del medio de cultivo más adecuado para el mismo.
La fórmula elemental de un microorganismo es, aproximadamente, C4H7O2N lo
que supone que los componentes de las células son: carbono que representa
alrededor del 50% del peso seco, oxígeno (32%), nitrógeno (14%), fósforo (3%),
azufre (en torno al 1%) y otros elementos traza entre los que se encuentran Fe, K,
Mg, Mn, Co, Mb, Cu y Zn.
La elaboración de medios de cultivo requiere proporcionar los elementos antes
citados en una forma asimilable. Así, por ejemplo, el C debe estar en forma de
carbono orgánico para los heterótrofos y como CO2 para los autótrofos. El N en
forma de NH4, de NO3 - o de NO2
- , o en forma de aminoácidos a los que se pueda
tomar su grupo amino. El P debe estar en forma de PO4 3-. El S procede de
aminoácidos sulfurados o de SO4 2-, etc. Además, en ciertos casos, es necesario
añadir a los medios de cultivo algunos aminoácidos o vitaminas que determinados
tipos de microorganismos no pueden sintetizar.
21
1.5 Selección de componentes del medio de cultivo
Existen diferentes sustancias que se pueden usar como fuentes de carbono, otras
tantas como fuente de nitrógeno y varias más como fuentes de vitaminas, etc.
Precisamente la amplia diversidad de sustancias que se pueden emplear como
componentes de un medio de cultivo, hace que una de las primeras etapas en la
formulación de un medio de cultivo, sea precisamente llevar a cabo una etapa de
selección de componentes del medio de cultivo, la cual consiste en realizar una
serie de experimentos en los que se prueba el efecto de cada uno de los
componentes deseados sobre el crecimiento celular y formación de productos.
Uno de los diseños experimentales empleados para llevar a cabo la selección de
los componentes del medio de cultivo, es el método de Plackett Burman. Los
diseños Plackett Burman son conocidos como diseños de efecto principal, porque
todos los grados de libertad son utilizados para estimar los efectos principales.
Este diseño es muy eficaz en los experimentos de selección, ya que detecta un
gran número de efectos principales de forma económica, asumiendo que todas las
interacciones son insignificantes comparadas con los efectos principales.
Por ejemplo, uno de los diseños consiste en un arreglo de 12 ensayos, que
consiste en probar hasta 11 factores (pueden ser componentes del medio o alguna
condición de operación) a dos niveles, realizando 12 experimentos. Los dos
niveles son uno bajo (baja concentración de un componente) y uno alto (alta
concentración de un componente).
Los diseños Plackett Burman no constituyen métodos de optimización, pues si
bien prueban dos niveles de cada uno de los componentes del medio de cultivo,
no son capaces de determinar la cantidad exacta requerida de cada constituyente.
Sin embargo, sí indican de manera confiable la importancia de cada elemento en
el medio de cultivo y de cómo pueden afectar en el crecimiento y la formación de
productos. Por tanto, constituyen herramientas auxiliares muy valiosas para la
optimización de medios de cultivos.
22
1.6 Optimización del medio de cultivo
Una vez que se ha hecho la selección de los componentes del medio de cultivo, la
siguiente etapa en la formulación del medio de cultivo, es la optimización de las
concentraciones de los componentes del medio, con las que se alcancen las más
altas concentraciones celulares o de productos.
Existen diferentes métodos de optimización, que junto con diversos métodos de
regresión y técnicas de diseño experimental, forman la metodología de superficies
de respuesta.
Una superficie de respuesta está representada por un modelo matemático que
relaciona la respuesta y los niveles de los factores probados. Si el número de
factores es 1, entonces la superficie está en dos dimensiones; mientras que si el
número de factores es de 2, la superficie de respuesta está en tres dimensiones.
El propósito de la superficie de respuesta es encontrar los niveles óptimos de cada
factor sobre una respuesta. Se hacen pocos experimentos y se enfoca la atención
sobre los niveles donde la respuesta es óptima.
Un modelo matemático de segundo orden resulta de un diseño experimental que
debe tener al menos tres niveles de cada factor (-1, 0, +1). Además, el diseño
debe ser rotable. Un diseño es rotable cuando la varianza de la respuesta
predicha en algún punto es función solo de la distancia del punto al centro y no es
una función de la dirección. La rotabilidad es una propiedad impotante, dado que
la finalidad de la metodología de superficies de respuesta es optimizar y
desconocemos la localización del óptimo. Entonces, tiene sentido utilizar un
diseño que proporcione estimaciones precisas en todas direcciones. Dentro de los
diseños rotables de segundo orden se incluye el diseño compuesto central.
23
El diseño compuesto central consiste en un factorial o factorial fraccionado 2k,
donde los factores son codificados de tal manera que el centro sea (0, 0, …,0),
aumentado por 2k puntos axiales (±α, 0, 0, …0), (0, ±α, 0, …0), (0, 0, ±α, …, 0), (0,
0, 0, …, ±α), y nc puntos centrales (0, 0, …, 0). De acuerdo a Montgomery (1991)
este diseño es probablemente el más usado.
Este diseño se convierte en rotable mediante la elección de α, ésta se calcula de
la siguiente manera (Montgomery, 1991):
( )
Donde f es el número de puntos en la porción factorial del diseño.
Otra propiedad útil del diseño es que puede crecer a partir de un diseño 2k de
primer orden, agregando puntos axiales y quizás algunos puntos centrales
(Montgomery, 1991). Con la elección del número de puntos centrales (n0), el
diseño puede hacerse ortogonal o se puede transformar en uno de precisión
uniforme.
En un diseño de precisión uniforme, la varianza de la respuesta predicha en el
origen es igual a la predicha a una distancia unitaria del origen. Este proporciona
mayor protección que el ortogonal contra el sesgo de los coeficientes, debido a la
presencia de términos de tercer y mayor orden.
24
2. Justificación
La utilización de los hongos entomopatógenos en la agricultura ha ido en aumento
en los últimos años debido al gran potencial que tienen en el manejo de plagas,
representando una alternativa eficiente al uso de insecticidas químicos,
considerados altamente nocivos para la salud del hombre y los ecosistemas.
El desarrollo de hongos entomopatógenos para el control de plagas de insectos ha
experimentado un considerable progreso en los últimos años. El empleo de estos
agentes de control biológico presenta ventajas, como son: seguridad para la salud
humana y para la fauna útil, reducción de residuos de insecticidas en los alimentos
e incremento de la biodiversidad del medio.
Los hongos sobresalen entre los microorganismos entomopatógenos porque
infectan a los insectos a través del tegumento, acción por contacto, lo que les
permite el control de varios grupos de insectos, siendo los conidios las unidades
infectivas más utilizadas.
Sin embargo, un empleo más eficiente y generalizado de estos agentes en el
control depende en gran medida de la mejora de su velocidad de acción y
virulencia, es decir en la reducción de los tiempos letales a concentraciones
menores de conidios (Quesada y col., 2009).
En México, el desarrollo de la tecnología para la producción de estos hongos
entomopatógenos se realiza con la finalidad de utilizar herramientas alternativas al
uso exclusivo de insecticidas químicos.
Para incrementar el consumo de bioinsecticidas en México se requiere de mayor
investigación científica y de factibilidad económica, que se enfoquen a mejorar la
producción y calidad de los mismos, con el fin de garantizar la efectividad del
producto final.
25
El diseño de un medio de cultivo responde a las exigencias del microorganismo en
cuestión y a la finalidad que se persigue con su multiplicación; por tanto, la
selección y la concentración adecuada de los nutrientes es un factor de vital
importancia para obtener un producto de buena calidad y que a la vez nos permita
reducir los costos de operación en el proceso.
Es por lo anterior que en este trabajo, se deben seleccionar los componentes del
medio de cultivo y establecer las concentraciones a las que se deben de usar,
para alcanzar altas concentraciones de esporas, con mínimos costos de
producción.
26
3. Objetivos
3.1 Objetivo General
Optimizar el medio de cultivo para Metarhizium anisopliae.
3.2 Objetivos Específicos
Seleccionar las fuentes de carbono y nitrógeno del medio de cultivo.
Determinar el efecto de fosfatos en la producción de esporas.
Optimizar el medio de cultivo utilizando un diseño compuesto central.
27
4. Metodología
El procedimiento experimental desarrollado para el cumplimiento de los objetivos
de este trabajo se muestra en la figura 1.
Figura 3. Procedimiento experimental.
4.1 Microorganismo.
La cepa de Metarhizium anisolpiae fue proporcionada por el CIIDIR Sinaloa. La
conservación y propagación de la cepa durante este trabajo, fue realizada en
medio inclinado de agar papa dextrosa (PDA).
Preparación de inoculo A
Selección de componentes (Plackett Burman)
Optimización del medio (Diseño compuesto central)
Metarhizium anisopliae
Preparación de inoculo B
28
4.2 Preparación de inoculo A.
El inoculo para los experimentos de selección de componentes se preparó de la
siguiente manera:
Se sembró la cepa proporcionada por el CIIDIR Sinaloa en botellas que contenían
el medio agar papa dextrosa (PDA) durante 21 días, posteriormente se recupero
con solución de tween al 5% para después cosecharla en un matraz.
4.3 Selección de componentes del medio de cultivo
La selección de los componentes del medio de cultivo se realizó mediante un
diseño de Plackett Burman (PB) de 7 factores con 2 niveles (Tabla 2). Se requirió
preparar 8 matraces de 250 ml con 100 ml de medio de cultivo cada uno.
Los factores fueron: fuentes de carbono (melaza, glucosa y sacarosa), fuentes de
nitrógeno (agua de cocimiento de maíz, harina de soya y extracto de levadura) y
una sal (K2HPO4).
Posteriormente se inocularon con una solución de esporas con una concentración
de 1.4X107 esporas/ml, para obtener una concentración inicial del orden 10 5
esporas/ml, después se llevo a cabo una cinética por 7 días con las siguientes
condiciones de operación 250 rpm, pH 7 y temp. 23°C .Se tomo muestra cada 24
h y se realizó la cuantificación de las esporas respectivamente mediante la cámara
de Neubauer, todo lo anterior se realizo por triplicado.
Después los datos obtenidos se introducen a Statgraphics para que los analice y
nos arroje la fuente de carbono y nitrógeno idóneos para el microorganismo.
29
Tabla 2.Arreglo de Plackett Burman.
Matraz No. Glucosa g/L
Sacarosa g/L
Melaza g/L
Harina soya
Ext. Levadura g/L
ACM g/L
K2HPO4
1 50 5 5 10 0 30 3.5
2 50 50 5 1 10 3 3.5
3 50 50 50 1 0 30 0.35
4 5 50 50 10 0 3 3.5
5 50 5 50 10 10 3 0.35
6 5 50 5 10 10 30 0.35
7 5 5 50 1 10 30 3.5
8 5 5 5 1 0 3 0.35
4.4 Preparación de inoculo B
Se utilizo como inoculo para la etapa de optimización el matraz número 7 de la
etapa de selección de componentes.
La concentración de sales que contenía fue 0.1 g/L de NaCl, 0.1 g/L de CaCl2, 0.5
g/L MgSO4, 0.0142 g/L de ZnSO4, x g/L de K2HPO4.
4.5 Optimización del medio de cultivo.
En la primera etapa de la formulación del medio de cultivo, que fue la selección de
las fuentes de carbono y nitrógeno, dos variables o factores (la melaza y el agua
de cocimiento de maíz) fueron seleccionadas para realizar los estudios de
optimización, usando un método de superficie de respuesta, y más
específicamente un diseño compuesto central.
30
El diseño compuesto central fue de 2 factores (22) con estrella. En este diseño
cuatro puntos centrales fueron seleccionados, tal que la distancia α, del centro del
diseño a cualquier punto axial es α= 2 2/4 = 1.4142. Como se muestra en la tabla 3,
cada uno de los dos factores fue probado a 5 diferentes niveles y cuatro puntos
centrales fueron incluidos.
Los experimentos se llevaron a cabo en matraces Erlenmeyer de 250 ml con 100
ml de medio con la concentración de fuente de carbono y nitrógeno indicada en el
diseño anterior (tabla 3). Los matraces se inocularon con una suspensión de
esporas que tiene una concentración de 9X107 esporas/mL, bajo las siguientes
condiciones de operación: 250 rpm, pH 7 y 23°C, durante 7 días. La toma de
muestra fue cada 24 horas y las esporas se contaron con cámara de Neubauer,
todo lo anterior se realizo por triplicado.
Los resultados obtenidos fueron analizados con el software STATGRAPHICS, el
cual nos muestra como resultado la concentración óptima de cada una de las
fuentes y la influencia que tiene cada una sobre la producción de las esporas, así
como la concentración teórica que se espera llegar con esas concentración de
fuentes de carbono y nitrógeno.
Tabla 3. Valores codificados y concentraciones de los factores usados en el diseño compuesto central.
Experimento Melaza ACM
Melaza (g/L)
ACM (g/L)
1 +1 -1 55 6
2 0 0 32.5 18
3 -1 -1 10 6
4 -1 +1 10 30
5 0 +α 32.5 34.9
6 0 0 32.5 18
7 +1 +1 55 30
8 -α 0 0.8 18
9 +α 0 64.2 18
10 0 0 32.5 18
11 0 -α 32.5 1.1
12 0 0 32.5 18
31
5. Resultados y discusión
5.1 Selección de componentes del medio
Los componentes del medio de cultivo que fueron probados en este trabajo, fueron
escogidos de acuerdo a resultados obtenidos en experimentos previos, realizados
en laboratorio (datos no mostrados) y a una revisión bibliográfica, donde la
esporulación del hongo fue en sustrato sólido. Los componentes del medio de
cultivo, que son los factores usados en el método de Plackett Burman, fueron
como fuentes de carbono: melaza, glucosa y sacarosa; como fuentes de
nitrógeno: agua de cocimiento de maíz, harina de soya y extracto de levadura.
Además, también se probó una sal: K2HPO4. Las concentraciones de cada uno de
los componentes del medio de cultivo que fueron probadas, se presentan en la
tabla 2, que está en la sección de Metodología.
Las concentraciones de esporas obtenidas en los experimentos del arreglo de
Plackett Burman, realizados por triplicado, se muestran en la tabla 4. Las
concentraciones de esporas alcanzadas fueron del orden 107 esporas/ml, en los
experimentos 3 y 7, mientras que en los demás experimentos solo se llega al
orden de 105 esporas/ml (tabla 4). En algunos casos la desviación estándar es
mínima y en otros representa hasta el 37% de variación con respecto al valor
promedio.
El análisis de regresión lineal múltiple de la concentración de esporas obtenidas al
hacer los experimentos de acuerdo al arreglo de Plackett Burman, se muestran en
la tabla 5. Todos los componentes del medio de cultivo probados, o factores
empleados en el arreglo Packett Burman, fueron estadísticamente significativos en
la formación de esporas, pues tuvieron una p<0.05.
32
Tabla 4.Concentración de esporas obtenidas a los 7 días en los experimentos del arreglo de Plackett Burman.
La relación que existe entre la concentración de esporas obtenidas y los 7
componentes del medio de cultivo probados, se describe mediante el siguiente
modelo de regresión lineal múltiple.
Concentración de esporas = 2.08389x106 - 249556*glucosa - 189815*sacarosa +
427852*melaza - 2.29352x106*harina soya + 984167*ext levadura + 833025*acm
+ 2.2709x106*K2HPO4
Dicho modelo tiene un nivel de confianza de predicción del 99.53%, lo que nos
indica que hay una buena correlación obtenida entre los valores observados y los
predichos, como lo indica el valor de r2 de 0.9967.
A pesar de que todos los componentes fueron significativos para la producción de
esporas, hubo algunos que se destacaron por tener una mayor significancia
estadística sobre la producción de esporas. Ellos son la melaza como fuente de
carbono y el agua de cocimiento de maíz como fuente de nitrógeno, pues tienen
un mayor valor absoluto de T (figura 4). Ambos valores de T son positivos,
indicando que la producción de esporas es mayor cuando las concentraciones de
melaza y agua de cocimiento de maíz fueron altas (50 g/L y 30 g/L,
respectivamente.
Experimento esporas/ml Desviación estándar Réplica 1 Réplica 2 Réplica 3 Promedio
1 1.10E+06 5.00E+05 8.00E+05 8.00E+05 3.00E+05
2 2.50E+05 2.50E+05 2.50E+05 2.50E+05 0.00E+00
3 2.40E+07 2.60E+07 2.50E+07 2.50E+07 1.00E+06
4 2.50E+05 2.50E+05 2.50E+05 2.50E+05 0.00E+00
5 2.50E+05 2.50E+05 2.50E+05 2.50E+05 0.00E+00
6 7.10E+06 5.25E+06 6.18E+06 6.18E+06 9.25E+05
7 6.55E+07 5.80E+07 6.18E+07 6.18E+07 3.75E+06
8 2.90E+06 3.15E+06 3.03E+06 3.03E+06 1.25E+05
33
Tabla 5. Análisis de regresión múltiple de los resultados obtenidos en el Método de Plakett Burman.
Figura 4. Diagrama de Pareto de los efectos estandarizados de los componentes del medio de cultivo sobre la producción de esporas. Agua de cocimiento de maíz (acm).
-40 -20 0 20 40 60
1
acm
harina soya
melaza
glucosa
ext levadura
sacarosa
K2HPO4
t=2.1
Parámetro Coeficiente Error Std T Valor-P
constante 2.08389E6 956548. 2.17855 0.0447
glucosa -249556. 12839.9 -19.436 0.0000
sacarosa -189815. 12839.9 -14.7832 0.0000
melaza 427852. 12839.9 33.3221 0.0000
harina soya -2.29352E6 64199.3 -35.725 0.0000
ext levadura 984167. 57779.4 17.0332 0.0000
acm 833025. 21399.8 38.9268 0.0000
K2HPO4 2.2709E6 183427. 12.3804 0.0000
34
Los componentes del medio de cultivo empleados fueron desde componentes
puros (glucosa, sacarosa), sustancias grado técnico (extracto de levadura,
K2HPO4) y hasta desechos industriales (agua de cocimiento de maíz –acm-, y
melaza).
La razón de obtener mayores concentraciones de esporas con melaza y agua de
cocimiento de maíz, en comparación con los demás componentes probados del
medio de cultivo, se puede atribuir a su contenido de vitaminas, aminoácidos,
proteínas y antioxidantes, que son sustancias que favorecen el crecimiento de
microorganismos, y por lo tanto, pueden producir una mayor cantidad de esporas.
Un hecho relevante de que con la melaza y el agua de cocimiento de maíz, se
obtuvieran mayores cantidades de esporas, es que ambos son desechos
industriales de muy bajo costo, por lo que son idóneos como componentes de un
medio de cultivo a emplear a nivel industrial, manteniendo bajos costos de
producción.
También se estudió el efecto del fósforo como fosfatos sobre la producción de
esporas. Como se muestra en la tabla 5, el K2HPO4 tiene un valor de T positivo,
sin embargo no es alto (12.38) comparado con los demás factores con valores
positivos. Lo anterior indica que una concentración alta de fosfatos (3.5 g/L) está
relacionada con la obtención de una mayor concentración de esporas.
35
5.2 Optimización del medio de cultivo
Una vez que se llevó a cabo la selección de los componentes del medio de cultivo,
se procedió a realizar los experimentos de optimización de dicho medio. La fuente
de carbono y la fuente de nitrógeno seleccionadas fueron la melaza y el agua de
cocimiento de maíz. Para la optimización se empleó un diseño compuesto central
22 + estrella con cuatro puntos centrales (tabla 3). De esta manera, se estudió el
efecto de las concentraciones de la melaza y del agua de cocimiento de maíz
sobre la producción de esporas de Metarhizium anisopliae.
Como se muestra en la tabla 6, la concentración de esporas varió de 2.52x107
(promedio del experimento 8) a 1.06x108 (promedio del experimento 7) y el resto
de los resultados se distribuyeron uniformemente dentro de este intervalo.
Tabla 6. Concentración de esporas obtenidas en los experimentos del diseño compuesto central.
Experimento Promedio* Desv. Est.
(esporas/mL)
1 7.38E+07 1.14E+07
2 6.77E+07 8.61E+06
3 3.07E+07 1.48E+07
4 7.25E+07 8.05E+06
5 1.04E+08 1.68E+07
6 7.18E+07 5.41E+07
7 1.06E+08 1.62E+07
8 2.52E+07 2.06E+07
9 9.05E+07 4.09E+07
10 8.43E+07 1.13E+07
11 2.58E+07 4.80E+06
12 8.43E+07 2.91E+07
36
Efectivamente, el diseño compuesto central 22 con estrella y cuatro puntos
centrales, permitió optimizar la concentración de esporas, pues se alcanzaron
mayores concentraciones que las obtenidas en los experimentos del arreglo de
Plackett Burman, el cual sirvió para la selección de los componentes que tuvieron
mayor influencia sobre la producción de esporas.
La más alta concentración de esporas (1.06x108 esporas/mL) se obtuvo con una
formulación del medio de cultivo cuyas concentraciones fueron: 55 g/L de melaza
y 30 g/L de agua de cocimiento de maíz (experimento 7 entablas 3 y 6). Sin
embargo, también se obtuvo una concentración de esporas de 1.04x108
esporas/mL, con concentraciones de 34.9 g/L de agua de cocimiento de maíz (la
más alta empleada) y de 32.5 g/L de melaza (experimento 5). Prácticamente la
concentración de esporas en los experimentos 5 y 7 fue la misma, aunque hubo
una diferencia de 12.5 g/L de melaza. Una explicación a esto puede ser que el
agua de cocimiento de maíz fue el factor limitante del crecimiento y/o de la
formación de esporas, puesto que para ambas concentraciones de agua de
cocimiento de maíz se alcanzó una concentración similar de esporas. Es decir, ya
no hubo fuente de nitrógeno disponible para formar más esporas, aunque la fuente
de carbono estaba en exceso.
La figura 5 muestra la superficie de respuesta del efecto de las concentraciones de
melaza y agua de cocimiento de maíz sobre la producción de esporas. A mayor
concentración de melaza y a mayor concentración de agua de cocimiento de maíz,
corresponden mayores concentraciones de esporas producidas. El modelo que
describe la superficie de respuesta es:
Concentración = -2.23654x107 + 2.09886x106*Melaza + 4.04231x106*ACM -
14311.4*Melaza2 - 29784.0*Melaza*ACM - 23783.1*ACM2
37
El modelo tiene una r2 de 0.745377, lo que significa que dicho modelo explica el
74.5% de la variabilidad en concentración de esporas debido a cambios en
concentraciones de agua de cocimiento de maíz y de melaza.
Figura 5.Superficie de respuesta de los efectos interactivos de la melaza y del agua de cocimiento de maíz (ACM) sobre la concentración de esporas de Metarhizium anisopliae a 120 horas.
El modelo predice que se puede obtener una concentración de 1.09x108
esporas/ml, empleando concentraciones de 37 g/L de melaza y 34.9 g/L de agua
de cocimiento de maíz.
Un hecho relevante es que el modelo obtenido en la optimización, predice una
concentración óptima de 1.09x108 esporas/ml, empleando concentraciones de
34.9 g/L de agua de cocimiento de maíz y de 37 g/L de melaza. Es importante
notar que la concentración del agua de cocimiento de maíz de 34.9 g/L coincidió
cuando se alcanzaron altas concentraciones de esporas obtenidas tanto
experimentalmente (1.04x108 esporas/ml) como la predicha por el modelo
(1.09x108 esporas/ml).
Superficie de Respuesta Estimada
0 20 40 60 80Melaza
010
2030
40
ACM
-3
0
3
6
9
12
15
(X 1.E7)
Co
ncen
tracio
n
38
Para las mismas altas concentraciones de esporas mencionadas en el párrafo
anterior, las concentraciones de melaza fueron de 32.5 g/L y 37 g/L,
respectivamente. Esto enfatiza el hecho de que probablemente el agua de
cocimiento de maíz pudo haber limitado el crecimiento y/o la formación de
esporas, mientras que la concentración de melaza (50 g/L) aún era suficiente para
soportar mayor formación de esporas, puesto que con 55 g/L de melaza y 30 g/L
de agua de cocimiento de maíz se alcanzó experimentalmente una concentración
de 1.06x108 esporas/mL
Una desventaja que se tiene al utilizar la melaza y el agua de cocimiento de maíz
como fuente de carbono y nitrógeno respectivamente, es que como son desechos
de otros procesos, su composición no siempre es la misma, pues depende de la
época del año. Por lo tanto, aunque se estandarice el medio de cultivo en cuanto a
las concentraciones de cada componente, puede que la composición del medio de
cultivo no siempre sea la misma, pudiendo ocasionar variaciones en la
concentración de esporas obtenida. Sin embargo, el precio de dichos
componentes compensa las variaciones que pudiera haber en la concentración de
esporas.
39
6. Conclusiones
El análisis estadístico de los resultados mostró que la fuente de carbono y la
fuente de nitrógeno que influyen significativamente en la esporulación del hongo,
son la melaza y el agua de cocimiento de maíz, respectivamente. Esto tiene gran
importancia en el costo del medio de cultivo, que puede ser bajo.
Una concentración de fosfatos de 3.5 g/L está relacionada con la obtención de una
mayor concentración de esporas.
El diseño compuesto central 22 con estrella permitió optimizar el medio de cultivo
para producir esporas del hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae,
alcanzando 1.04x108 esporas/mL, empleando concentraciones de agua de
cocimiento de maíz de 34.9 g/L y de melaza de 32.5 g/L.
El modelo matemático de la superficie de respuesta, predice la obtención de
1.09x108 esporas/mL, empleando concentraciones de agua de cocimiento de maíz
de 34.9 g/L y de melaza de 37 g/L.
40
7. Referencias
1.- Arcas, J. A., Díaz, B. M., y Lecuona, R. E. (1999). Bioinsecticidal activity of
conidia and dry mycelium preparations of two isolates of Beauveria bassiana
against the sugar cane borer Diatraea saccharalis. Journal of Biotechnology, 67,
151-158.
2.- Arzumanov, T., Jenkins, N., y Roussos, S. (2005). Effect of aeration and
substrate moisture content on sporulation of Metarhizium anisopliae var. acridum.
Process Biochemistry, 40, 1037-1042.
3.- Barajas, C.G., del Pozo, E.M., García, I., y Méndez, A. (2010). Obtención de
conidios del aislamiento ma-002 de Metarhizium anisopliae (metsch.) sorokin
mediante una alternativa de cultivo bifásico. Revista de Protección Vegetal, 25(3),
174-180.
4.- Bhanu-Prakasha, G. V. D., Padmaja, V.,Siva Kiran, R. R. (2008). Statistical
optimization of process variables for the large-scale production of Metarhizium
anisopliae conidiospores in solid-state fermentation. Bioresource Technology, 99,
1530-1537
5.- Dalla Pria, J. W., Teixeira, L. P., Messias, C. L., Azevedo, J. L., y Magalhães
Lacava, P. (2008). Bioassay assessment of Metarhizium anisopliae (metchnikoff)
sorokin (deuteromycota: hyphomycetes) against Oncometopia facialis (signoret)
(hemiptera: cicadellidae). Brazilian Journal of Microbiology, 128-132.
6.- Doelle H. W., Mitchell D. A. y Rolz C. E. (1992). Solid Substrate Cultivation.
Elsevier Applied Science, London, N. York, Chapter 3, 35.
7.- Dorta, B., Ertola R., J., Arcas, J., A. (1996). Characterization of growth and
sporulation of Metarhizium anisopliae in solid substrate fermentation. Enzyme and
Microbial Technology, 19, 434-439.
8.- Faria, M., y Wraight, S. (2007). Mycoinsecticides and mycoacaricides: A
comprehensive list with worldwide coverage and international classification of
formulation types. Biological Control, 43, 237-256.
9.- Frank R. van Breukelen, Sebastiaan Haemers, René H. Wijffels, Arjen
Rinzema. (2010). Bioreactor and substrate selection for solid-state cultivation of
the malaria mosquito control agent Metarhizium anisopliae. 2011, de elsevier
41
10.- Glare, T. (2004). Biotechnological potencial entomopathogenic Fungi. En:
Fungal Biotecnology in Agricultural, Food and Enviromental Applications. D. K.
Marcel. New York, USA: Dekker Inc. Capítulo7. 79-90
11.- Goettel, M. e Inglis, D. (1997). Fungi: Hyphomycetes. En: Manual of
Techniques in Insect Pathology. L. Lacey (Ed.). California, USA: Academic Press,
INC. 213-249
12.- Horaczek, A., y Viernstein, H. (2004). Comparison of three commonly used
drying technologies with respect to activity and longevity of aerial conidia of
Beauveria brongniartii and Metarhizium anisopliae. Biological Control, 31(1), 65-71
13.- Jenkins, N. E., Heviefo, G., Langewald, J., Cherry, A., y Lomer, C. (1998).
Development of mass production technology for aerial conidia for use as
mycopesticides. Biocontrol News and Information, 19(1), 21N-31N.
14.- Kassa, A., Brownbridge, M., Parker. B., Skinner, M., Gouli, V., y Gouli, S.
(2008). Whey for mass production of Beauveria bassiana and Metarhizium
anisopliae. Mycological Research, 112(4), 583- 591.
15.- Krishna, C. (2005). Solid-state fermentation systems, an overview. Critical
Review in Biotechnology , 25, 1-30.
16.- Mathews, K. C., Van Holden, E. K., y Ahern, G. K. (2002). Bioquímica. México:
Addison Wesley. 583-618
17.- Mier, T., Ayala-Zermeño, M. A., Toriello, C., Navarro-Barranco, y Hortensia.
(2005). Conservación de hongos entomopatógenos para el control biológico de
plagas agrícolas. México: Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco.
18.- Miranda, F., Alatorre, R., Saucedo, G., y Loera, O. (2011). Influencia del
incremento de oxígeno en la producción y termotolerancia de conidios de hongos
entomopatógenos. XIV Congreso Nacional de Biotecnología y Bioingeniería.
Queretaro: Sociedad Méxicana de Biotecnología y Bioingeniería.
19.- Montesinos-Matías, R. (2008). Relación entre variables de crecimiento y
virulencia en aislados de Beauveria bassiana. México: Tesis de maestría,
Universidad Autónoma Metropolitana- Iztapalapa
20.- Montgomery, D. C. (1991). Design and analysis of experiments. John Wiley
and Sons. New York. USA.
42
21.-Mustafa, U., y Kaur, G. (2009). Effects of carbon and nitrogen sources and
ratio on the germination, growth and sporulation characteristics of Metarhizium
anisopliae and Beauveria bassiana isolates. African Journal of Agricultural
Research , 3(10), 922-930.
22.- Pucheta Díaz, M., Flores Macias, A., Rodríguez Navarro, S., De la Torre, M.
(2006). Mecanismos de acción de los Hongos Entomopatógenos. Interciencia,
31(12), 856-860
23.- Quesada-Moraga, E., Ortiz-Urquiza, A., Garrido-Jurado, I., Muñoz-Ledesma,
F., García-Fernández, P., y SantiagoÁlvare, C. (2009). Los hongos
entomopatógenos y sus proteínas insecticidas en el control de plagas de insectos.
III Jornadas de Divulgación de la Investigación en Biología Molecular, Celular y
Biotecnología., (págs. 15-19). Córdoba
24.- Rangel, D.E.N., Alston, D.G, y Roberts D.W. (2008). Effects of physical and
nutritional stress conditions during mycelial growth on conidial germination speed,
adhesion to host cuticle, and virulence of Metarhizium anisopliae, an
entomopathogenic fungus. Mycological Research, 112, 1355-1361.
25.- Rodríguez- Gómez, D., Saucedo-Castañeda, G., Loera, O., y Viniegra-
González, G. (2009). Substrate influence on physiology and virulence of Beauveria
bassiana acting on larvae and adults of Tenebrio molitor. World Journal of
Microbiology and Biotechnology 25 (3), 513-518
26.- Roncal, T., y Ugalde, U. (2003). Conidiation induction in Penicillium. Research
in Microbiology, 154, 539-546.
27.- Shah, A. F., Allen, N., Wright, J. C., y Butt, M. T. (2007). Repeated in vitro
subculturing alters spore surface properties and virulence of Metarhizium
anisopliae. FEMS Microbiology Letters, 276 (1), 60-66.
28.- Shah, F., Wang, C., y TM, B. (2005). Nutrition influences growth and virulence
of the insect-pathogenic fungus Metarhizium anisopliae. FEMS Microbiology
Letters, 251(2), 251, 259-266.
29.- Tamez-Guerra, P., Galán-Wong, L. J., Medrano-Roldán, H., García-Gutiérrez,
C., Rodríguez-Padilla, C., Gómez-Flores, R. A., y Tamez-Guerra, R. S. (2001).
Bioinsecticidas: su empleo, producción y comercialización en México. Ciencia
UANL, 143-152.
43
30.- Thibault, J., Pouliot, K., Agosin, E. y Pérez-Correa, R. (2000). Reassessment
of the estimation of dissolved oxygen concentration profile and KLa in solid-state
fermentation. Process Biochemistry, 36, 9-18.
31.- Thomas, M., y Read, A. (2007). Can fungal biopesticides control malaria?
Nature Reviews Microbiology, 5(5), 377-382.
32.- Tlecuitl-Beristain, S., Viniegra-González, G., Díaz-Godínez, G., y Loera, O.
(2010). Medium selection and effect of higher oxygen concentration pulses on
Metarhizium anisopliae var. lepidiotum conidial production and quality.
Mycopathologia. 169(5): 387-394
33.-Toegel, S., Salazar-Behzadi, S., Horaczek-Clausen, A., y Viernstein, H. (2010).
Preservation of aerial conidia and biomasses from entomopathogenic fungi
Beauveria brongniartii and Metarhizium anisopliae during lyophilization. Journal of
Invertebrate Pathology, 105 (1), 16-23.
