Ingenieria Genetica PDF Modificacion de los genes para su estudio
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7/25/2019 Ingenieria Genetica PDF Modificacion de los genes para su estudio
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Tema 15
Modificacin de los genes para
su estudio
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Anlisis funcional
Anlisis transcripcional
Determinacin de elementos de control de la transcripcin
Geles de retardo
Aislamiento de factores de transcripcin
Un hbrido
Anlisis del producto gnico Construccin de mutantes nulos
Mutagnesis dirigida y al azar
ARN antisentido o ARN de interferencia
Sobreexpresin
Interaccin entre protenas
Factores de transcripcin: DBD y AD
Dos-hbridos
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Modificacin de genes
Preparacin de una situacin base para el anlisis:
Eliminacin total o parcial del gen o de su expresin (mutantes
nulos)
Reversin de la mutacin por el propio gen
Mutagnesis de la regin codificante
Mutagnesis puntual Anlisis de deleciones
Modificacin de promotores
Eliminacin/substitucin de regiones de control Bsqueda de nuevas y/o mejoradas funciones del gen
Construccin de nuevos genes
Bsqueda de interacciones entre protenas
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Integracin por recombinacin homloga
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Reemplazamiento gnico
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Mutagnesis mediante la extensin de unoligonucletido
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Mutagnesis mediante la extensin de unoligonucletido
Most coloniescontain wild-type
DNA
Others, a mix of wild-
type and mutant
DNA
Again, most colonies
contain wild-typeDNA. Others, a mix
of wild- type and
mutant DNA, and
only a few, mutant
DNA
+
Transform E. col i
Transform E. coli
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Qu tenemos en el tubo de reaccin?
Una gran cantidad de molculas originales a las que no se ha unido el
oligo
Otra gran cantidad en las que se ha unido el oligo, pero no lapolimerasa
Otra gran cantidad en las que la polimerasa se ha detenido antes de
completar la reaccin
En todos estos casos E. coli va a degradar la copia mutante y va autilizar la silvestre como molde para sintetizar la doble cadena
Y una pequea cantidad de molculas con una cadena silvestre y otra
mutante, que en E. coli van a dar lugar (al menos en teora) a unamezcla equitativa de plsmidos silvestres y mutantes
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Mutagnesis mediante la extensin de unoligonucletido
Problemas:
El ADN de nuestro gen tiene que ser clonado en M13 La eficiencia de la mutagnesis es baja, y depende de:
La capacidad de unin del oligonucletido
La actividad de la polimerasa
La actividad de la ligasa
El ADN sintetizado in vitro no va a estar metilado, yser ms susceptible a los mecanismos de reparacin
de E. coli, convirtindolo en ADN tipo silvestre
Necesitamos analizar individualmente muchos clones
para encontrar nuestro ADN mutante
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Mutagnesis mediante la extensin de unoligonucletido
Soluciones:
Seleccin de la hebra mutante: uso de fosforotioato
Digestin con PstI + degradacin por Exonucleasa III
Transformacin de E. coli
dCTPS
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Mutagnesis mediante la extensin de unoligonucletido
Soluciones:
Contraseleccin de la hebra tipo silvestre: (mtodo
Kunkel)
Estirpes dut, ung
dut: dUTPasa: degrada el dUTP
dentro de la clula
ung: uracil N-glicosilasa: elimina
el uracilo del ADN
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Mutagnesis mediante casetes
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Mutagnesis al azar
Minigenotecas de oligonucletidos modificados
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Mutagnesis al azar
Minigenotecas de oligonucletidos modificados
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Mutagnesis al azar
PCR proclive al error:
Incremento de Mg Adicin de Mn
Concentracin de dNTPs
Concentracin de polimerasa
Adicin de dITP
Los productos de PCR tienen que ser analizados
funcionalmente
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La tecnologa antisentido
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ARNi y silenciamiento gnico
Rnasa III (Dicer) especfica de ARN de doble cadena genera fragmentos de
21-23 nucletidos (siRNAs) que se unirn al ARNm
RNA polimerasa dependiente de ARN (RdRp) crea ms moleculas de ARN dedoble cadena
RISC (complejo de silenciamiento inducido por ARN) degrada los dplex
mRNA-siRNA
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Sobreexpresin
Promotores fuertes
Promotores controlados
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Anlisis funcional
Anlisis transcripcional
Determinacin de elementos de control de la transcripcin
Geles de retardo Aislamiento de factores de transcripcin
Un hbrido
Anlisis del producto gnico Construccin de mutantes nulos
Mutagnesis dirigida y al azar
ARN antisentido o ARN de interferencia
Sobreexpresin
Interaccin entre protenas
Factores de transcripcin: DBD y AD
Dos-hbridos
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Factores de transcripcin
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Estructura de Gal4p
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Dominio de unin a ADN
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Dos-hbridos
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Plsmidos ms habituales
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Resultado dos-hbridos
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Controles
Diferentes Genes
Diferentes Promotores
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Tres-hbridos
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Tres-hbridos
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Anlisis de interacciones entre protenas