Inmovilización
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inmovilizacin
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i d l i iUna estrategia metodolgica interesante que sepresenta como alternativa al empleo de clulas ensuspensin es la inmovilizacin de clulas vegetalessuspensin es la inmovilizacin de clulas vegetales.
El primer trabajo reportado en 1966 fue sobre lap e b jo epo do e 9 ue sob eespecie Umbilicaria pustulata y se emplearon gelesde poliacrilamida.
Toda la tecnologa de inmovilizacin de clulasi bl h d ll d b l b d lviables se ha desarrollado sobre la base de los
conocimientos existentes de inmovilizacin deenzimasenzimas.
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El empleo de clulas enteras inmovilizadas presenta una serie de ventajas frente a las enzimas aisladas:
Se evita los procesos de aislamiento y purificacinenzimticaenzimtica.
Las enzimas de inters se hallan en su ambiente celulart l l t t bilid d t tnatural con lo que aumenta su estabilidad y consecuentemente
la vida til del sistema permitiendo la reutilizacin del materialcataltico.
El ambiente celular provee a las enzimas de los cofactores, coenzimas y dems compuestos necesarios para asegurar unacoenzimas y dems compuestos necesarios para asegurar una ptima actividad, adems de brindar buenas condiciones de temperatura y pH.
Los sistemas celulares permiten el desarrollo de reacciones multienzimticas.
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Inmovilizacin celular
Condiciones bsicas que debe reunir un mtodo
Sencillez de preparacin Sencillez de preparacin Baja toxicidad de la matriz y de los elementos de preparacinpreparacin Bajo costo Alta resistencia mecnica Baja o nula interferencia en los procesos de purificacin de productos
Posibilidad de alternar ciclos de crecimiento y ciclos yde produccin y/o biotransformacin
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Inmovilizacin celular
Por adsorcin Por entrampamiento
Adsorcin aInclusin en estructuras
Adsorcin a soportes inertes
Entrampamiento en matrices
preformadas
Entrampamiento en matricespolimricas
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Inmovilizacin celular
Adsorcin a soportes inertes
Bolillas de vidrioBolillas de vidrio Virutas de madera, etc
Inclusin en estructuras preformadas
Biorreactores de fibra hueca Espumas de poliuretanoM b d lMembranas de nylon
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Inmovilizacin celular
Entrampamiento en matrices polimricas
Matrices que polimerizan por reacciones de radicales Matrices que polimerizan por reacciones de radicales libres (Geles de poliacrilamida)
M i li i f i i (A ) Matrices que polimerizan por enfriamiento (Agar)
Matrices que polimerizan por cross-linking (Alginato, Carragenanos, Celulosas, etc)
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Las matrices que polimerizan por enfriamientocomo el agar pueden ser quebradasmecnicamente y colocadas en una fase lquidahidrfoba.
El problema fundamental de los mtodos queutilizan poliacrilamida es la toxicidad de losiniciadores y agentes de entrecruzamiento
ili d l d li i iutilizados en el proceso de polimerizacin queen muchos casos han sido causantes de unab j i bilid d l lbaja viabilidad celular.
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El -carragenanoH t li id t i i l d d lHeteropolisacrido no txico aislado de algas
marinas.
Esta compuesto por sulfato de -D-galactosa y 3,6-anhidro--D-galactosagGelifica por enfriamiento o en solucin con algn
i dagente inductor como K+, NH4+, Ca++, Cu++, Mg++ o Fe+++, aminas o solventes orgnicos miscibles con aguaagua.
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Inmovilizacin celular:en esferas de celulosa-polidimetilpirrolidilamoniop p
OO
OOO
-O4SO
Sulfato de celulosa
N
Cloruro de polidimetilpirrolidilamonio
+OSO4-n
N
n+
OO
O
O
-O4SO
OO
O
O
-O4SO
OO
OOO
-O4SO
OSO4- OSO4- OSO4-
N N N N N N N
N N N N N N N
-O4SO -O4SO -O4SO
OO
O
OSO4-
O OO
O
OSO4-
O OO
OO
OSO4-
O
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Inmovilizacin celular: en esferas alginato
OH
Alginato (Acido manurnico 1,4)
O C Cl+OO
OO
OH
O
n
O
O
CaCl2+
n
O- O-
CaCa
OO
O
O-
O
O
O
OO
OO
O-
O
O
O
OO
O
O
O-
O
OO
OOO
O-
O
CaCa
O
O-O
O
O-O
Ca Ca
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Inmovilizacin celular: Metodologa de trabajo
Mezcla de solucin de alginatoY cultivo celular en medio libre De agentes complejantes de Ca++
Solucin de Ca++Solucin de Ca
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La captacin pasiva de los sustratos no polares limitala cintica de conversinla cintica de conversin
La penetracin al interior celular debe de ocurrir en la escala detiempo de la bioconversintiempo de la bioconversin
El transporte no deben controlar la velocidad global del proceso si sep g pquiere analizar reactividades de una serie de compuestos
La degradacin de los productos es ms rpida cuando se forman en la etapa de crecimiento que en fase estacionaria
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Algunos ejemplos de metabolitos de inters comercialproducidos en sistemas de clulas vegetalesp ginmovilizadas
Especie Matriz Producto ComentariosCatharanthus roseus Agarosa Catelamina Suministro de
ajmalicinaajmalicinaCatharanthus roseus Alginato Alcaloides
indlicosProlonga capacidad biosinttica
Catharanthus roseus Alginato Ajmalicina Prolonga estabilidad ycapacidad biosinttica(220 dias con cambiod di )de medio)
Catharanthus roseus Xantanos/poliacrilamida
Serpentina Prolonga estabilidad ycapacidad biosinttica(180 dias con cambiode medio)
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Algunos ejemplos de metabolitos de inters comercialproducidos en sistemas de clulas vegetalesp ginmovilizadas
Daucus carota Alginato 5--hidroxidigi- Suministro de Especie Matriz Producto Comentarios
g gtoxigenina digitoxigenina
Daucus carota Alginato fenoles No hay variaciones
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Algunos ejemplos de metabolitos de inters comercialproducidos en sistemas de clulas vegetalesp ginmovilizadas
Especie Matriz Producto Comentarios
Digitalis lanata Alginato - Suministro de -metildi-Digitalis lanata Alginato metildigoxina
Suministro de metildigitoxina
Di it li l t Al i t di i S i i t dDigitalis lanata Alginato digoxina Suministro dedigitoxina
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Algunos ejemplos de metabolitos de inters comercialproducidos en sistemas de clulas vegetalesp ginmovilizadas
Especie Matriz Producto Comentarios
Beta vulgaris Nylon Betacianina IncrementaBeta vulgaris Nylon Betacianina Incrementaacumulacin
Capsicum frutescen Espuma de Capsaicina Incrementa
poliuretanorendimiento
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Algunos ejemplos de metabolitos de inters comercialproducidos en sistemas de clulas vegetalesp ginmovilizadas
Especie Matriz Producto ComentariosSolanum
Especie Matriz Producto Comentarios
Morinda citrifolia Alginato Antraquinonas Incrementa acumulacinintracelular
Talictrum minus Alginato Berberina Incrementa liberacin
S l t Alginato Solasodina Incrementa liberacinSolanum surretense Alginato Solasodina Incrementa liberacin
Lithospermun Fibra fenoles Incrementa rendimiento.erithrorhysum hueca
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Mtodos para inmovilizar por entrampamiento
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Parmetros a controlar en un sistema inmovilizado:
viabilidad crecimiento celular capacidad biosinttica
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Mtodos para evaluar la viabilidad de un cultivo inmerso en una matriz inerte
C l i t i l d E di t t dColorimtricos: azul de Evans y diacetato de fluorescena
Medicin de parmetros de crecimiento como consumo de O2 y produccin de CO2 con electrodos selectivos en 2 y p 2 cultivos no continuos.
d d i ( l ) iMtodos no destructivos (Parr et al.) que permite determinar y expresar de manera porcentual el volumen ocupado por clulas viables en una matriz deocupado por clulas viables en una matriz de inmovilizacin.
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Se basa en la determinacin de la dilucin diferencial de dosSe basa en la determinacin de la dilucin diferencial de dos molculas marcadas radioactivamente.
Una de ellas debe ser excluida del plasmalema y la otra debe difundir libremente
La primera es manitol u otro polialcohol no metabolizable marcado con 14C y la otra es agua marcada con 3H.
El mtodo determina el "volumen viable" expresado como el espacio porcentual que excluye manitol pero no agua expresado de otra manera las clulas viables se sacan de la relacin entre el 3H y el 14C puesto que excluyen al manitol y utilizan el agua. g
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Tambin pueden monitorearse por RMN lap pcantidad de metabolitos fosforilados comondice de actividad metablica
este es un mtodo no invasivo que se basa entifi l tid d d ATP l t k dcuantificar la cantidad de ATP o el uptake de
fosfatos por medio de 31P-RMN.
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Capacidad biosinttica: Debe ser evaluadaespecficamente de acuerdo con elespecficamente de acuerdo con elpropsito del sistema en particular
ya sea en su capacidad de producir unmetabolito determinado por sntesis denovo, o a partir de precursores sistemas obien en su actividad enzimtica especfica
d i i d bi ipara producir reacciones de bioconversin.
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El empleo de clulas inmovilizadas ofrece una serie de ventajasvinculadas al estado fisiolgico y al diseo y modo de operacin del g y y pproceso fermentativo.
El entrampamiento en matrices inertes permite un gran contactoEl entrampamiento en matrices inertes permite un gran contacto intercelular y la generacin de gradientes fsicos y qumicos que conducen a un mayor grado de diferenciacin.
Al estar minimizada la tasa de reproduccin celular la inestabilidad gnica se disminuye notablemente.gnica se disminuye notablemente.
Se alcanzan fases estacionarias prolongadas lo cual es muy importante d l d i t i d l idi f l fi l d l tcuando la produccin esta asociada a la idiofase o al final de la etapa
exponencial
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Estos sistemas permiten desacoplar las fases de crecimiento y produccin facilitando el empleo de estrategias como la elicitacin p p gbitica y abitica o la permeabilizacin para incrementar la produccin
Es posible realizar ciclos alternantes de rejuvenecimiento/crecimientopara mantener la viabilidad y capacidad biosinttica.
las clulas inmovilizadas permiten operar en sistemas continuos a altas velocidades de disolucin sin riesgo de lavado de los cultivos
Es posible controlar el tamao de los agregados celulares en caso de ser importante esa variable para la acumulacin y/o produccin de metabolitos.
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Con la biomasa entrampada es ms sencillo trabajar con procesos en dos fases, lo ms comn es realizar una de crecimiento previo a la , pinmovilizacin y la segunda de produccin inmovilizando cuando el cultivo ha llegado a su etapa estacionaria.
En cultivos inmovilizados se facilita la remocin de inhibidoresmetablicos
se protege a las paredes celulares de las fuerzas de corte
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Con inmovilizacin es posible lograr: sistemas de produccin de t b lit d id til l d t dmetabolitos de una vida til prolongada puesto que se puede
reutilizar la biomasa y realizar una recuperacin continua de los productos.
Es posible inducir la liberacin al medio extracelular los metabolitos de inters que naturalmente no son excretados mediante el empleo deinters que naturalmente no son excretados mediante el empleo de agentes permeantes, especialmente DMSO
El empleo de estos sistemas se encuentra limitado a la produccin de compuestos secundarios y la realizacin de procesos de bioconversin dnde los productos de inters se liberen al medio debioconversin dnde los productos de inters se liberen al medio de cultivo.
