InmunologíaJulia Sequí Navarro (Madrid) • Células T (Sala 2) (O-021-O-031) Moderadores: Ana...

InmunologíaPublicac ión of ic ia l de la Soc iedad Española de Inmunologíawww.inmunologia.org

COMITÉ DIRECTOR

J.M. Rojo (Madrid), Director Ejecutivo, Á. Corbí (Madrid), A. Ferreira (Santiago de Chile), M. Fresno(Madrid), M. López-Botet (Barcelona), F. Lozano (Barcelona), I. Melero (Pamplona), A. Nieto(Montevideo), F. Sánchez-Madrid (Madrid).

COMITÉ EDITORIAL

J. Alberola-Ila (Pasadena), P. Aparicio (Murcia), J. Aramburu (Barcelona), C. Ardavín (Madrid),A. Arnaiz-Villena (Madrid), J.A. Brieva (Cádiz), E. Carosella (Paris), E. Cuadrado (San Sebastián),M. de la Fuente (Madrid), M. del Val (Madrid), G. Dighiero (Paris), P. Engel (Barcelona), G. Ercilla(Barcelona), E. Fernández-Cruz (Madrid), G. Fontán (Madrid), T. Gallart (Barcelona), F. García-Cozar (Cádiz), F. Garrido (Granada), M.L. Gaspar (Madrid), A. Gayá (Palma de Mallorca), C. Gelpí(Barcelona), R.F. González-Amaro (México), Á. González (Vigo), D. Jaraquemada (Barcelona), C.López-Larrea (Oviedo), M. López-Trascasa (Madrid), J. Madrenas (New London), A. Madrigal(Londres), R.A. Margni (Buenos Aires), E. Martínez-Naves (Madrid), N. Matamoros (Palma deMallorca), F. Merino (Bilbao), F. Mollinedo (Salamanca), E. Osinaga (Montevideo), P. Patiño(Medellín), J. Peña-Martínez (Córdoba), G. Rabinovich (Buenos Aires), J.R. Regueiro (Madrid), M.Rincón (Burlington), J.L. Rodríguez-Sánchez (Barcelona), J. Sancho (Granada), M. Santamaría(Córdoba), L. Santos-Argumedo (México), R. Solana (Córdoba), J.L. Subiza (Madrid), M.L. Toribio(Madrid), C. Vilches (Madrid), R. Vilella (Barcelona), J. Yagüe (Barcelona).

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SECRETARÍA DE REDACCIÓN

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SUMARIO Vol. 29, Supl. 1, Junio 2010

PROGRAMA CIENTÍFICO . . . . . . . . . . . . . . . . 6

COMUNICACIONES ORALES . . . . . . . . . . . . 11

Sesión 1: Autoinmunidad . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

Moderadores: Carmen Gelpi, Ricardo Pujol-Borrel

Sesión 2: Células B y alergia . . . . . . . . . . . . . . 15

Moderadores: Jose Antonio Brieva Romero, Julia Sequí Navarro

Sesión 3: Células T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

Moderadores: Ana Clara Carrera, Enrique Aguado

Sesión 4: Células NK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

Moderadores: Raquel Tarazona, Rafael Solana

Sesión 5: Inmunidad e infección . . . . . . . . . . . 26

Moderadores: Miguel López Botet, María Montoya

Sesión 6: Inmunidad innata e inflamación . . 29

Moderadores: J.L. Rodríguez Fernández, Francisco Sánchez Madrid

Sesión 7: Células dentríticas . . . . . . . . . . . . . . . 33

Moderadores: Alberto Varas, David Sancho

Sesión 8: Inmunogenética . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

Moderadores: M. Dolores de Juan, Manuel Muro

Sesión 9: Inmunodeficiencias I . . . . . . . . . . . . 41

Moderadores: Manel Juan, Margarita López Trascasa

Sesión 10: Inmunoterapia . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

Moderadores: Luis AlvarezVallina, Francisco Lozano

Sesión 11: Inmunodeficiencias II . . . . . . . . . . . 49

Moderadores: Nuria Matamoros, José Ramón Regueiro

Sesión 12: Inmunología tumoral . . . . . . . . . . . 53

Moderadores: Ignacio Melero, Angel M. García Lora

Sesión 13: Inmunidad y trasplante . . . . . . . . . 56

Moderadores: José Luis Vicario, Eduard Palou


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SUMARIO Vol. 29, Supl. 1, Junio 2010

PÓSTERS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

Sesión 1: Autoinmunidad . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

Moderadores: Carmen Gelpi, Ricardo Pujol-Borrel

Sesión 2: Células B y alergia . . . . . . . . . . . . . . . 70

Moderadores: José Antonio Brieva Romero, Julia Sequí Navarro

Sesión 3: Células NK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

Moderadores: Raquel Tarazona, Rafael Solana

Sesión 4: Células T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

Moderadores: Ana Clara Carrera, Enrique Aguado

Sesión 5: Inmunidad e infección . . . . . . . . . . 79

Moderadores: Miguel López Botet, María Montoya

Sesión 6: Inmunidad innata e inflamación . . 87

Moderadores: J.L. Rodríguez Fernández,Francisco Sánchez Madrid

Sesión 7: Células dentríticas . . . . . . . . . . . . . . . 92

Moderadores: Alberto Varas, David Sancho

Sesión 8: Inmunodeficiencias I . . . . . . . . . . . . 93

Moderadores: Manel Juan, Margarita López Trascasa

Sesión 9: Inmunodeficiencias II . . . . . . . . . . . 94

Moderadores: Nuria Matamoros, José Ramón Regueiro

Sesión 10: Inmunogenética . . . . . . . . . . . . . . . . 96

Moderadores: M. Dolores de Juan, Manuel Muro

Sesión 11: Inmunoterapia . . . . . . . . . . . . . . . . 108

Moderadores: Luis AlvarezVallina, Francisco Lozano

Sesión 12: Inmunidad y trasplante . . . . . . . . 110

Moderadores: José Luis Vicario, Eduard Palou

Sesión 13: Inmunología tumoral . . . . . . . . . . 117

Moderadores: Ignacio Melero, Angel M. García Lora

Índice de Autores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123


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PROGRAMA CIENTÍFICOMIÉRCOLES, 23 DE JUNIO

09.00-15.00 ENTREGA DE DOCUMENTACIÓN09.00-19.00 COLOCACIÓN DE PÓSTERS (Sala 10)

1. Autoinmunidad (P-001-P-025)2. Células B y alergia (P-026-P-032)3. Células T (P-033, P-034, P-037, O-036, P-035, P-036)4. Células NK (P-038-P-042 y P-044-P-051)5. Inmunidad e infección (P-052-P-056, P-058 y P-060-P072)6. Inmunidad innata e inflamación (P-073-P-086)

11.00-12.30 MESA REDONDA: INNOVACIÓN DOCENTE EN INMUNOLOGÍA Y CIENCIAS AFINES(Sala 1)Moderador: Francisco García Cozar (Universidad de Cádiz)Enseñanza virtual de inmunología en el contexto del espacio europeo de educación superiorJosé Peña Martínez (Universidad de Córdoba)Evaluación continuada y apredizaje basado en problemas como estrategia en la mejora de resultados académicos en inmunología.Pedro Aparicio Alonso (Universidad de Murcia)Situación de la docencia especializada en inmunología en el contexto de la nueva estructura de Grado y PosgradoRocío Álvarez López (Hospital Virgen de la Arrixaca, Murcia)

12.30 REUNIÓN JUNTA DIRECTIVA SEI (Sala 1)

15.00-17.00 TALLER AUTOINMUNIDAD (Sala Cámara)Coordinadora: Carmen Gelpí (Hospital San Pau, Barcelona)

16.00-18.00 SIMPOSIUM NEUROINMUNOLOGÍA (Sala 1)Patrocinado por: Bayer, Biogen, CLS-Behring, Serono-TevaModerador: Adofo López de Munain (Hospital Donostia, San Sebastián)

Encefalopatías sinápticas autoinmunesJosep Dalmau (Universidad de Pensilvania, Filadelfia)Anticuerpos en enfermedades neuromusculares: Su rol en el diagnóstico y en la patogeniaIsabel Illa (Hospital San Pau, Barcelona)Papel de las inmunoglobulinas en la patogenia de la eclerosis múltipleLuisa María Villar (Hospital Ramón y Cajal, Madrid)

Con la colaboración del Dr. Javier Olascoaga (Servicio de Neuroinmunología del Hospital de Donostia)


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17.00-18.15 PAUSA CAFÉ

18.15 CONFERENCIA INAUGURAL (Sala Cámara)Lymphocytes in tumor development and metastasis: Dr. Jekyll and Mr. HydeMichael Karin (Universidad de California, San Diego)

19.15 INAUGURACIÓN OFICIAL (Sala Cámara)20.30 COPA DE BIENVENIDA

JUEVES, 24 DE JUNIO

08.30-10.00 COMUNICACIONES ORALES• Autoinmunidad (Sala Cámara) (O-001-O-010)

Moderadores: Carmen Gelpi (Barcelona). Ricardo Pujol-Borrel (Barcelona)• Células B y alergia (Sala 1) (O-011-O-020)

Moderadores: José Antonio Brieva Romero (Cádiz). Julia Sequí Navarro (Madrid)• Células T (Sala 2) (O-021-O-031)

Moderadores: Ana Clara Carrera (Madrid). Enrique Aguado (Murcia)

08.30-10.00 COLOCACIÓN DE PÓSTERS (Sala 10) • Autoinmunidad (P-001-P-025)• Células B y alergia (P-026-P-032)• Células NK (P-033-P-037)• Células T (P-038-P-051)• Inmunidad e infección (P-052-P-072)• Inmunidad innata e inflamación (P-073-P-086)

10.00-11.30 SESIÓN PLENARIA: PATOLOGÍA VASCULAR E INFLAMACIÓN (Sala Cámara)Moderador: Francisco Sánchez Madrid (Hospital de la Princesa, Madrid)PANELISTASBases moleculares de la respuesta inflamatoria: papel regulador de las tetraspaninasOlga Barreiro (CNICV, Madrid)Los múltiples beneficios de la deficiencia de MBL en inflamación y daño tisularFrancisco Lozano (Hospital Clínic, Barcelona)Explorando el papel de la MMP-10 en inflamación y aterosclerosis: un ejemplo de investigación trasnacionalJosé Antonio Páramo (Clínica Universitaria de Navarra, Pamplona)Receptores tipo Toll (TLR) y de esfingosina 1-fosfato (S1P) en fisiopatología cardiovascularCarmen García Rodríguez (Instituto de Biología y Genética Molecular,Valladolid)

11.30-12.00 CAFÉ Y VISITA A PÓSTERS

12.00-12.45 INFORME CONTROL DE CALIDAD DE LA SEI: GECLID (Sala Cámara)

12.45-14.15 COMUNICACIONES ORALES• Células NK (Sala Cámara) (O-032-O-040)

Moderadores: Raquel Tarazona (Cáceres). Rafael Solana (Córdoba)• Inmunidad e infección (Sala 1) (O-041-O-047)

Moderadores: Miguel López Botet (Barcelona). María Montoya (Barcelona)• Inmunidad innata e inflamación (Sala 2) (O-048-O-056)

Moderadores: J.L. Rodríguez Fernández (Madrid). Francisco Sánchez Madrid (Madrid).

14.15-15.30 ALMUERZO DE TRABAJO (Sala Banquetes)

PROGRAMA CIENTÍFICO

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15.30-17.00 SIMPOSIO BINDING SITE: INMUNODEFICIENCIAS PRIMARIAS (Sala Cámara)Moderadora: Nuria Matamoros (Hospital Son Dureta, Palma de Mallorca)Inheritated defects in immunoglobulin class switch recombinationAne Durandy (Hospital Necker, París)Neutropenias hereditariasJuan Ignacio Aróstegui (Hospital Clínic, Barcelona)

15.30-17.00 TALLER DE CITOMETRÍA DE FLUJO (Sala 1)Coordinadores: Berta Sánchez (Hospital Virgen del Rocío, Sevilla)Marta Riñón (Hospital de Cruces, Baracaldo)

15.30-17.00 REUNIÓN DEL GRUPO DE AUTOINMUNIDAD (Sala 2)

17.00-17.30 PAUSA CAFÉ Y VISITA PÓSTERS

17.30-19.30 SIMPOSIO: INMUNIDAD E INFECCIÓNPatrocinado por ViiVModerador: José Antonio Iribarren (Hospital Donostia, San Sebastián)Desarrollo de la respuesta inmunitaria innata frente a la infección por citomegalovirusMiguel López Botet (Universidad Autónoma de Barcelona)Aportación de la biología de sistemas a la inmunopatogenia de la infección por VIHJosé Alcamí (Instituto Carlos III, Madrid)New strategies in the design of human vaccinesGiusepe del Giudice (Novartis, Siena)María Montoya (Centra Recerca en Sanitat Animal – UAB, Barcelona)

19.00-20.00 DISCUSIÓN DE PÓSTERS (Sala 2)• Autoinmunidad • Células NK• Células T• Inmunidad innata e inflamación

20.00 RECOGIDA DE PÓSTERS

VIERNES, 25 DE JUNIO

08.30-10.00 COMUNICACIONES ORALES• Células dentríticas (Sala Cámara) (O-057-O-066)

Moderadores: Alberto Varas (Madrid). David Sancho (Madrid)• Inmunogenética (Sala 1) (O-067-O-077)

Moderadores: M. Dolores de Juan (San Sebastián). Manuel Muro (Murcia)• Inmunodeficiencias I (Sala 2) (O-078-O-087)

Moderadores: Manel Juan (Barcelona). Margarita López Trascasa (Madrid)

08.30-10.00 COLOCACIÓN DE PÓSTERS (Sala 10) • Células dendríticas (P-087-P-088)• Inmunodeficiencias I (P-089-P-091)• Inmunodeficiencias II (P-092-P-095)• Inmunogenética (P-096-P-129)• Inmunoterapia (P-130-P-135)

09.15-14.00 VOTACIONES SEI


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10.00-12.00 SESIÓN PLENARIA: NUEVAS TERAPIAS INMUNOLÓGICAS (Sala Cámara)Moderador: Luis Álvarez Vallina (Clínica Puerta de Hierro, Madrid) Jose María García (Hospital de León)Ensayos clínicos terapéuticos en enfermedad celiacaFrancisco León (Alba Ther, New York)Tratamientos anti-linfocitos B en LESIñaki Sanz (URMC, Rochester)Inmunoterapia dirigida con células dendríticasDavid Sancho (CNICC, Madrid)


12.30-14.00 SIMPOSIO BECTON DICKINSON (Sala Cámara)Células Th17 en la salud y en la enfermedad Moderadora: Dolores Jaraquemada (UAB, Barcelona)IL-17 en AutoinmunidadJose María García Ruiz (Hospital de León)Balance Th17-Treg, su efecto sobre la evolución del injerto en transplante renalMª Jose Marín (Hospital de Valdecilla, Santander)Células Th17 y otros fenotipos Th en respuesta a infecciones bacterianasJosé Alberto García Sanz (Centro de Investigaciones Biológicas, Madrid)

12.30-14.00 COMUNICACIONES ORALES• Inmunoterapia (Sala 1) (O-088-O-097)

Moderadores: Luis AlvarezVallina (Madrid). Francisco Lozano (Barcelona)• Inmunodeficiencias II (Sala 2) (O-098-O-106)

Moderadores: Nuria Matamoros (Palma de Mallorca). Jose Ramón Regueiro (Madrid)

14.00-15.30 Almuerzo (Sala Banquetes)

15.30-17.30 TALLER DE HISTOCOMPATIBILIDAD (Sala Cámara)Coordinadores: Eduard Palou y Dra. Maria Jose HerreroLIRAD – Instituto de Investigación German Trías i Pujol (Laboratorio de Inmunobiología), Badalona

15.30-17.00 TALLER DE INMUNOQUÍMICA (Sala 1)Coordinadora: Maria Luisa Villar (Hospital Ramón y Cajal, Madrid)


17.00-18.00 CONFERENCIA: LA INMUNOLOGÍA EN LAS NUEVAS TERAPIAS AVANZADAS (Sala Cámara)Augusto Silva (Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid)

18.30-19.15 DISCUSIÓN DE PÓSTERS (Sala 1)• Células dendríticas• Inmunogenética• Inmunodeficiencias I• Inmunodeficiencias II

19.30 RECOGIDA DE PÓSTERS

19.30-21.00 ASAMBLEA DE LA SEI (Sala Cámara)

21.30 CENA DE CLAUSURA


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SÁBADO, 26 DE JUNIO

08.30 COLOCACIÓN DE PÓSTERS (Sala 10)• Inmunidad y trasplante (P-136-P-152)• Inmunología tumoral (P-153-P-167)

09.00-10.30 COMUNICACIONES ORALES Y DISCUSIÓN DE PÓSTERS • INMUNOLOGÍA TUMORAL (Sala Cámara) (O-0107-O-0115)

Moderadores: Ignacio Melero (Pamplona). Angel M. García Lora (Granada)• INMUNIDAD Y TRASPLANTE (Sala 1) (O-0116-O-0123)

Moderadores: José Luis Vicario (Madrid). Eduard Palou (Barcelona)

10.45-12.30 SESIÓN PLENARIA: AUTOINMUNIDAD (Sala Cámara)Moderadora: Fiona Powrie (Universidad de Oxford)David Otaegui (Hospital Donostia, San Sebastián)Ricardo Pujol-Borrel (UAB, Barcelona)Linfocitos B en enfermedades autoinmunesIñaki Sanz (Rochester)Searching for genomic signatures of antiphospholipid síndromeAna Zubiaga (Universidad País Vasco, Bilbao)


13.00-14.00 CONFERENCIA DE CLAUSURA (Sala Cámara)Fiona Powrie (Universidad de Oxford)

14.00 RECOGIDA PÓSTERS


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FÉ DE ERRATAS

P-057 Inmunidad e Infección Cambia a ORAL 24/06/2010 12:45-14:15 SALA 1

O-036 Células NK Cambia a PÓSTER 24/06/2010

O-084 Inmunodeficiencias I Cambia a PÓSTER 25/06/2010

O-116 Inmunidad y trasplante Cambia a PÓSTER 26/06/2010


SESIÓN 1: AUTOINMUNIDAD

Moderadores: Carmen Gelpi (Barcelona)Ricardo Pujol-Borrel (Barcelona)

O-001UTILIDAD DE LA DETERMINACIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-RECEPTOR DE ACETILCOLINA (ACHRAB) Y ANTI-MÚSCULOESTRIADO (SMAB) EN EL DIAGNÓSTICO DE MIASTENIA GRA-VIS. D.M. Valero Hervás, M. Sevilla Sánchez, J.L. Peña, A. AlonsoOrtiz, V. Pérez Aradas, M. Talise Astier, P. Morales Pérez, E. Paz Artal,A. Serrano Hernandez. Hospital Universitario 12 De Octubre, Madrid.

Objetivos. La Miastenia Gravis es una enfermedad autoinmu-ne de etiología desconocida, caracterizada por la presencia de auto-anticuerpos frente a los receptores de Acetilcolina situados en laplaca motora, bloqueando la función de la musculatura esqueléti-ca causando debilidad muscular generalizada. El diagnóstico tem-prano permite la atenuación de la sintomatología y mejora la cali-dad de vida, así como la adecuación al tratamiento farmacológi-co. La técnica de referencia actual es la determinación de anticuer-pos frente a musculo estriado (SMAb) vía Inmunofluorescencia-Indirecta (IFI), pero han aparecido nuevos métodos por ELISA parala detección de anticuerpos anti-receptor de Acetilcolina (AchRAb)en suero.

El objetivo del presente estudio fue comparar ambas técnicas parasu adecuación diagnostica, así como la búsqueda de posibles ventajasque pueda aportar la técnica de ELISA en pacientes tanto no diag-nosticados como diagnosticados.

Materiales y Métodos. Se incluyeron 99 pacientes bajo sospechaclínica de diversas formas de Miastenia Gravis entre Febrero de 2009y Febrero de 2010. A cada uno de ellos se le realizó la determinacióncuantitativa de Anticuerpos anti-Receptor de Acetilcolina en suero,siguiendo las instrucciones del fabricante (RSR Limited).Además serealizó la titulación de anticuerpos anti-músculo estriado en sueromediante Inmunofluorescencia Indirecta sobre portas de músculo estria-do (EUROIMMUN). Los resultados fueron analizados por el softwa-re informático SPSS v.12.

Resultados. Se diagnosticaron 19 pacientes de Miastenia Gravisde los 99. De éstos, 4 (21%) presentaron ambos parámetros negati-vos, 3 (15.7%) sólo positivos para AchRAb, 1 (5.2%) positivo paraSMAb, y 11 (58.1%) ambos parámetros positivos. La comparaciónentre técnicas mostro que la determinación de AchRAb presenta unasensibilidad del 40%, especificidad 37%, VPP de 5% y VPN de 86%comparado con éstos valores para SMAb de 12%, 77%, 66% y 85%.Sin embargo el empleo de ambas técnicas conjuntamente, AchRAbcomo cribaje y SMAb como confirmación mostró unos parámetrossignificativamente óptimos para el diagnóstico (p= 0.038): E: 92%,S: 73%, VPP: 61% y VPN: 95% comparado con el uso independien-te de ambas.

En 6 (30%) de los pacientes el tratamiento con Piridostigmina redu-jo los niveles de AchRAb, en predominando la disminución en el ini-cio del tratamiento y volviendo a aumentar con el tiempo de tratamien-to debido a la acomodación de la misma placa motora, sugiriendo lanecesidad de ajuste de dosis. Nuestro estudio mostró que ésta dismi-nución en los niveles de AchRAb debida al tratamiento es estadística-mente significativa (p= 0.006).

Se observó que en pacientes sanos bajo sospecha, máximos nive-les de AchRAb en los momentos en los que se desencadenó la sinto-matología grave y el diagnóstico de Miastenia que fue estadísticamen-te significativa (p= 0.005).

Conclusiones. El uso conjunto de ambas técnicas es la estadísti-camente más adecuada para el diagnóstico empleando AchRAb comoscreening seguida de confirmación por SMAb.

El empleo como control de pacientes de Miastenia de niveles deAchRAb parece ser un buen indicador de efectividad del tratamientoy de necesidad de ajuste de dosificación farmacológica así como ladeterminación de rutina de AchRAb podría actuar como marcador delmomento de aparición de la sintomatología clínica de Miastenia y desu diagnóstico en pacientes bajo sospecha.

O-002ESTUDIO DE SUBPOBLACIONES LINFOCITARIAS ENTRE DIS-TINTOS GRUPOS DE ENFERMOS DE ESCLERODERMIA. J.M.López Cacho1, B. Cárdaba Olombrada1, A.M. Rabasco Álvarez2, M.L.Fernández Rodríguez2, T. Mayayo3, M. Aguerri Moreno1, C. LahozNavarro1, M. Posada De La Paz4, S. Gallardo Posada1. 1Iis FundaciónJiménez Díaz, Madrid, 2Universidad De Sevilla. Facultad De Farmacia, Sevi-lla, 3Sanired, 4Instituto De Salud Carlos III, Madrid.

Objetivos. Detectar diferencias en subpoblaciones linfocitarias desangre periférica, así como su estado de activación y/o apoptosis entredistintos grupos de pacientes de esclerodermia distribuidos según eltipo (localizada, sistémica), años desde el diagnóstico, agravaciones(cardiopatías, fibrosis e hipertensión pulmonar), tipo y tiempo detratamiento.

Materiales y métodos. Se analizaron 49 casos y 49 controles. Sedeterminó el porcentaje de Linfocitos T (CD4, CD8), B (CD19), NK(CD56), Monocitos (CD4/SSC), Apoptosis (Anexina V) y Activación(CD25) por citometría de flujo utilizando un citómetro de 5 colores. Elanálisis estadístico se realizó mediante un test de Wilconxon no pare-ado.

Resultados. Hemos encontrado diferencias significativas en algu-nas poblaciones celulares entre los distintos grupos de pacientes y conrespecto a sus controles, tanto en activación como en apoptosis.

En general, hay una disminución de la apoptosis en todas las sub-poblaciones y en todos los grupos de enfermos comparados con loscontroles, aunque este efecto tiende a normalizarse con la agravaciónevolutiva de la enfermedad (fibrosis o hipertensión pulmonar, afec-tación cardiaca o en aquellos con más de diez años de evolución). En

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Comunicaciones OralesInmunología

Vol. 29 / Supl. 1/ Junio 2010: 11-59


los linfocitos B y monocitos esta disminución se produce de manerasignificativa en todos los grupos estudiados. También se produce unadisminución en la esclerodermia sistémica con respecto a la localiza-da.

Los monocitos aumentan en todas las agravaciones evaluadas yen mayor medida en la sistémica, pero únicamente hemos encontradouna disminución de su activación en enfermos tratados durante másde cuatro años con corticoides.

Los linfocitos NK son los únicos que tienen aumentada su acti-vación en los pacientes con más de cuatro años de evolución de la enfer-medad.

Con respecto a los linfocitos B, hay una disminución en aquellospacientes con fibrosis e hipertensión pulmonar y en la esclerodermiasistémica difusa con respecto a controles. La apoptosis disminuye sig-nificativamente en la sistémica con respecto a la localizada.

Conclusiones. Estos resultados pueden ser importantes para eldiagnóstico diferencial de la evolución de la enfermedad y pueden serútiles, no sólo para un mejor diagnóstico sino también para enfocarfuturos tratamientos más específicos.

O-003LA SEÑALIZACIÓN EPH/EFRINA B REGULA LA MADURACIÓNDEL EPITELIO TÍMICO. J. García-Ceca Hernández, D. Alfaro Sán-chez, A. Zapata González. Universidad Complutense/Facultad de Biolo-gia, Madrid.

Objetivos. Previamente hemos demostrado que la falta deEph/efrinas B generan profundas alteraciones histológicas y fenotípi-cas en la red epitelial tímica (TEC). En el presente trabajo profundi-zamos en algunas de estas alteraciones a fin de comprender el papelde estas moléculas en la maduración del epitelio tímico.

Material y Métodos. Se han analizado mediante citometría de flu-jo e inmunofluorescencia la diferenciación y supervivencia de las TECdurante las primeras etapas del desarrollo embrionario (13.5 y 15.5F)en ratones WT y deficientes en EphB2. Además, la supervivencia ydiferenciación de las células epiteliales fueron estudiadas in vitromediante reagregados (RTOC), cultivos organotípicos (FTOC) o culti-vos en monocapa de epitelio de lóbulos tímicos WT fetales (13,5F),mantenidos en presencia (o no) de proteínas de fusión (efrinaB1-Fc yEphB2-Fc).

Resultados. Nuestros resultados demuestran que la falta de EphB2provoca un incremento de muerte en la fracción CD45-total y, funda-mentalmente, en las TEC corticales CD45–Ly51+ a 13.5 y 15.5F. Ade-más, la proporción de células CD45-apoptóticas incrementaba signi-ficativamente en RTOC tratados con proteínas de fusión, que bloquea-ban las interacciones TEC-timocitos. Por el contrario, la estimulaciónde las señales trasmitidas por Eph/efrinas B rescataba significativa-mente de la muerte las TEC. De nuevo, el porcentaje de TEC apop-tóticas aumentaba en RTOC establecidos con TEC y/o timocitos defi-cientes en EphB2.

Por otro lado, nuestros resultados previos demostraban un retra-so en la maduración de TEC en ratones EphB2–/– junto con una desor-ganización de la red epitelial que resultaba en la aparición de grandesáreas carentes de queratinas. Un análisis fenotípico exhaustivo del con-tenido de estas áreas sugiere que en ellas está aconteciendo una trans-formación epitelio-mesénquima como consecuencia de la falta deEphB2. Además, análisis a citometría de flujo de lóbulos tímicos 13,5-15,5F deficientes en EphB2 demuestran un aumento de la proporción

de células progenitoras CD45–EpCAM+MTS20+ y una reducción de lasTEC medulares maduras CD45–EpCAM+UEA-1+. Este retraso en lamaduración del epitelio tímico se puso también de manifiesto conFTOCs 13,5F WT cultivados en presencia de EphB2-Fc o efrinaB1-Fcdurante 5 días. De nuevo, se observó un incremento significativo en laproporción de células CD45–EpCAM+MTS20+ y una reducción de lascélulas CD45–EpCAM+UEA-1+.

Conclusiones. Estos resultados demuestran la relevancia deEphB2 y sus ligandos las efrinas B en la maduración del epitelio tími-co.

O-004RELACIÓN ENTRE CÉLULAS DECIDUALES ESTROMALES YCELULAS ENDOMETRIALES ESTROMALES HUMANAS: FENO-TIPO ANTIGÉNICO Y SUSCEPTIBILIDAD A LA APOPTOSIS.E. Leno Durán, R. Muñoz Fernandez, A. Prados Martin, E. García Oli-vares, M.D.C. Ruiz Ruiz. Universidad de Granada/CIBM, Armilla.

Objetivos. Las células más abundantes del endometrio son lascélulas endometriales estromales (ESC). Durante la fase secretoria delciclo menstrual y, sobre todo si el embarazo se produce, las ESC o susequivalentes en la decidua, las células deciduales estromales (DSC) sediferencian (decidualizan) por el efecto de la progesterona. Aunquelas ESC proceden de las DSC, y ambas, de las células madre mesen-quimales (MSC), al encontrarse estas células en un entorno citoquími-co y hormonal diferente, es probable que estos dos tipos de células pre-senten diferencias fenotípicas y funcionales que podrían influir enlas actividades inmunorreguladoras de estas células. El objetivo de estetrabajo es comparar fenotipo antigénico, diferenciación por progeste-rona, susceptibilidad a la apoptosis y efecto sobre la apoptosis espon-tánea de los linfocitos.

Materiales y métodos. DSC proceden de abortos inducidos delprimer trimestre de mujeres sanas (20-30 años). ESC fueron recogi-das de sangre menstrual de mujeres sanas entre 20-30 años.

Las células fueron cultivadas en OPTI-MEM y decidualizadas conprogesterona 300 nM y AMPc 500 µM durante 30 días. El medio fuecambiado cada 3-4 días.Las células apoptóticas fueron detectadas porcitometría de flujo cuantificando las células en la fase sub-G1 del ciclocelular. El fenotipo antigénico de las células fue medido por citóme-tría de flujo.

Proteínas implicadas en la apoptosis fueron detectadas mediantewestern-blot.

Resultados. ESC y DSC presentan un fenotipo similar, práctica-mente todas las células expresan CD10, CD73 y CD29, presentandodiferencias en el marcador CD21 y CD54. Las DSC decidualizadas pro-ducen altos niveles de prolactina (marcador de decidualización), mien-tras que las ESC producen unos niveles significativamente menores.Al decidualizar, una proporción de DSC y ESC se encentra en apopto-sis, aunque la proporción de células apoptóticas de las primeras fuesuperior. Se observa que la apoptosis asociada a la decidualizacióninduce una disminución de proteínas antiapoptóticas como FLIP, BCL-xL y XIAP. Además, ESC y DSC protegen de la apoptosis espontánea alos linfocitos periféricos.

Conclusiones. Aunque las DSC y ESC presentan un fenotipo anti-génico semejante y protegen a los linfocitos de la apoptosis espontá-nea, su susceptibilidad a la decidualización, medida por la secreciónde prolactina y por la tendencia a la apoptosis fue significativamentesuperior en las DSC que en las ESC.

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COMUNICACIONES ORALES VOL. 29 SUPL. 1/ 2010


O-005TOLEROGENIC DENDRITIC CELLS AS A POTENTIAL TOOLFOR TOLERANCE INDUCTION IN MULTIPLE SCLEROSIS. D.Raïch Regué1, L. Grau López2, M. Naranjo Gómez1, C. Ramo Tello2, R.Pujol Borrell1, E. Martínez Cáceres1, F.E. Borràs Serres1. 1Institut d'In-vestigació Germans Trias i Pujol, Barcelona. 2Hospital Universitari GermansTrias i Pujol, Barcelona.

Multiple sclerosis (MS) is a chronic demyelinating autoimmunedisease of the Central Nervous System. Current MS therapies decreasethe frequency of relapses and modestly the accumulation of disability,but do not prevent MS progression. Tolerance induction to myelinantigens is a promising therapeutic strategy in MS. Dendritic cells (DC)is the main antigen presenting cells. DC therapy in tumour and infectionimmunology has been longly investigated as a potential tool to inducethe immunoresponse in those situations.

Objective. Our aim is the generation of tolerogenic dendritic cellsfrom autologous peripheral blood monocytes (MDDC) of MS patients,as a tool for cellular therapy and tolerance induction.

Methods.Peripheral blood cells were obtained from donors(n=8) and patients with relapsing-remitting MS (n=8). GM-CSF andIL-4 were used to differentiate MDDCs; maturation was induced witha proinflamatory cytokine cocktail, in the absence (mature DC [matDC])or presence of 1α,25-dihydroxyvitamin D3 [tolDC]. The morphology,viability, phenotype, cytokine production and the ability of MDDC toinduce T cell proliferation were evaluated.

Results. MDDC differentiation yield, viability and functionality weresimilar in both healthy subjects and MS patients. tolDC exhibited a reducedexpression of CD83, CD86 and HLA-DR, produced low levels of IL-12/IL-23, and showed a lower capacity to induce proliferation of allogeneic Tcells when compared to matDC. Supernatants from tolDC allostimulatedT cells revealed an impaired secretion of proinflammatory cytokines (IL-6, TNF-α, IFN-γ). In addition, tolDC were resistant to a subsequentmaturation stimulus induced by LPS. Specific binding of myelin peptidesto MDDC was shown by competition binding assay. Myelin peptide-loaded matDC induced proliferation of autologous T cells obtained fromMS patients, thus confirming the specificity of the assay.

Conclusions. Tolerogenic MDDC may be generated from monocytesof MS patients, and loaded with myelin peptides might be an effectivetool to restore antigen-specific tolerance in MS. The generation of specificT cell responding population (i.e. regulatory T cells) merits furtherinvestigation.

O-006EL ANÁLISIS MEDIANTE UNA APROXIMACIÓN DE PROTEÓ-MICA CUANTITATIVA COMBINADA REVELA UN INCREMEN-TO DE APOPTOSIS TRAS LA EXPRESIÓN DEL REGULADORAUTOINMUNE (AIRE) EN CÉULAS EPITELIALES. N. Colomé1, J.Collado2, J.J. Bech-Serra1, I. Liiv3, L.C. Antón4, P. Peterson3, F. Canals1,D. Jaraquemada2, I. Álvarez2. 1Institut d´Oncologia. Vall d´Hebron, Bella-terra. 2Unitat d´Immunologia. Institut de Biotecnologia i Biomedicina. 3Biome-dicum, Tartu, Estonia. 4Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa", Madrid.

Objetivos. APECED es una enfermedad autoinmune recesiva mul-tiorgánica que se asocia a la pérdida de función de un único gen lla-mado AutoImmune REgulator (AIRE). Ratones deficientes en este gendesarrollan diversos procesos autoinmunes. AIRE se expresa principal-mente en células epiteliales medulares tímicas (mTECs) y su ausencia

resulta en la pérdida de tolerancia a antígenos específicos de tejido (TRAs).Experimentos con microarrays han demostrado que AIRE induce latranscripción de TRAs en mTECs. Otra función que se ha descrito es supapel de inductor de apoptosis en mTECs, que podría generar mayorcross-presentation por parte de las células dendríticas medulares. Hastael momento no se ha estudiado el efecto de AIRE sobre la célula a nivelproteico. El objetivo de este trabajo ha sido analizar el impacto sobre elproteoma de la expresión de AIRE en células epiteliales humanas.

Material y Métodos. Se transfectó la línea epitelial humana HT93con el gen de AIRE. Diversos extractos proteicos celulares se analiza-ron mediante una aproximación que combinó dos técnicas de prote-ómica cuantitativa (2D-DIGE e ICPL). Los datos se confirmaron porwestern blot y por citometría de flujo. Finalmente se realizaron ensa-yos de apoptosis con anexina V y etopósido.

Resultados. Los resultados mostraron que algunas chaperonas(HSC70, HSP27 y tubulin-specific chaperone A) se encontraban enmayor abundancia en las células AIRE+, mientras que varias proteínasrelacionadas con el citoesqueleto (transgelin, caldesmon, tropomyosinalpha-1 chain, myosin regulatory light polypeptide 9 y myosin-9) esta-ban en menor cantidad. Además se observaron cambios cuantitati-vos en diversas proteínas relacionadas con apoptosis. La diferencia deabundancia de algunas proteínas se confirmó por Western blot y cito-metría de flujo. Estos datos sugerían que las células transfectadas conAIRE presentan un perfil proteico compatible con un incremento deapoptosis. Mediante experimentos con anexina V y etopósido se con-firmó que las células que expresan AIRE sufren más apoptosis espon-tánea y son más sensibles a la inducción de apoptosis.

Conclusiones. El uso de técnicas de proteómica cuantitativa hapermitido demostra que las células AIRE+ sufren más apoptosis quelas células AIRE-, lo que revela que AIRE puede jugar papeles diferen-tes de la regulación transcripcional en el control de la autoinmunidad.

O-007ESTUDIO DE LA SÍNTESIS INTRATECAL DE ANTICUERPOS ENLA ENCEFALITIS AUTOINMUNE EXPERIMENTAL. N. Marin1, M.J.Mansilla2, J.C. Alvarez-Cermeño1, X. Montalban2, C. Guaza3, L. Villar4,C. Espejo2. 1Unidad De Esclerosis Múltiple, Hospital Ramón Y Cajal, Madrid.2Unidad De Neuroinmunología Clínica, Hospital Universitario Vall D´Hebron,Barcelona. 3Instituto Cajal, Consejo Superior De Investigaciones Científicas,Madrid. 4Unidad De Esclerosis Múltiple, Hospital Ramón Y Cajal, Madrid.

Objetivos. La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) esuna enfermedad desmielinizante que se induce en ratones medianteinmunización con distintos antígenos de la mielina. Se utiliza comomodelo experimental para el estudio de la esclerosis múltiple. Nues-tro objetivo fue estudiar la evolución de la síntesis intratecal de anti-cuerpos a lo largo del tiempo en la EAE inducida mediante inmuniza-ción de ratones SJL con la proteína proteolipídica (PLP).

Métodos. Se obtuvieron muestras de líquido cefalorraquídeo y sue-ro a día 0, 7 14, 31 y 38 tras inmunización. Así mismo, se valoró diaria-mente la puntuación clínica de los signos neurológicos. Se determinóel título de anticuerpos anti-PLP y frente a otras proteínas mayoritariasde la mielina [proteína básica de mielina (MBP) y glicoproteína de la mie-lina del oligodendrocito (MOG)] mediante ELISA. Se estudió la síntesisintratecal de IgG e IgM mediante isoelectroenfoque e inmunodetección.

Resultados. Síntesis intratecal de IgG: Aparece un patrón en espe-jo a partir del día 7 postinmunización, que se mantiene a lo largo delseguimiento.

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INMUNOLOGÍA COMUNICACIONES ORALES


Síntesis intratecal de IgM: Se detecta en las muestras de día 7 y 31post inmunización coincidiendo con el primer y segundo brote de laenfermedad. No se detectó en los periodos de remisión.

Anticuerpos anti-PLP, IgM: Alcanzan un máximo a los 14 días, a par-tir de ese punto, los títulos decrecen. IgG: Aumentan hasta los 14 días. Apartir de este punto se mantienen estables durante el seguimiento.

Anticuerpos anti-MBP: Se detecta un aumento a partir del día 31que se mantiene durante el seguimiento.

Anticuerpos anti-MOG: Se detectan títulos muy bajos a partirdel día 31.

Conclusiones. Los ratones hacen una respuesta temprana a la PLPque induce una diseminación de epítopos, detectándose anticuerposfrente a otros antígenos de la mielina a partir del segundo brote de laenfermedad.También se detecta la presencia de un patrón oligoclo-nal de IgG en suero, con la aparición de nuevas bandas a lo largo dela evolución. La síntesis intratecal de IgM coincide con los periodos deactividad de la enfermedad. Estos hallazgos pueden contribuir a dilu-cidar el papel de la síntesis de anticuerpos en la EAE.

O-008EVIDENCIA DE ALTERACIONES EN LOS COMPARTIMENTOSDE LINFOCITOS B Y DE LA ACTIVACION DE CÉLULA T EN ELSÍNDROME ANTIFOSFOLÍPIDO TROMBÓTICO. J. Carbone Cam-poverde, A. Gallego López, N. Lanio Amador, C. Chean Pacheco, J.Navarro Caspistegui, J. Dale, E. Sarmiento Marchese. Hospital Grego-rio Marañón, Madrid.

Introducción. Existe evidencia de que el síndrome de anticuerposantifosfolípidos (SAAF) no sólo es una patología pro-trombótica sinoque también asocia un componente inflamatorio. Nosotros hemos des-crito que en el SAAF obstétrico existe una mayor activación de linfo-citos T CD4+ (J Rheumatol 2009; 36:1217).

Objetivos. Caracterizar alteraciones inmunofenotípicas de sangreperiférica en pacientes con SAAF trombótico.

Métodos. Pacientes: 13 pacientes con SAAF trombótico (diagnos-ticados según criterios de clasificación de Sidney) y 52 controles sanosde edad similar. Las subpoblaciones linfocitarias T, B y NK se estudia-ron en fresco, en sangre periférica, mediante citometría de flujo de trescolores (sangre total), incluyendo distintas combinaciones de anticuer-pos monoclonales anti: CD3, CD4, CD8, CD25, CD45RA, CCR7, CD38,HLA-DR, CD19, CD27, IgD, CD5, CD40, CD16 y CD56. Estadística:prueba T de Student con dos colas.

Resultados. En relación con los controles sanos, los pacientes conSAAF trombótico tenían: mayor porcentaje de linfocitos B naive(CD19+CD27-IgD+: 67 vs 58%, p= 0,04) y menor de linfocitos B de memo-ria con cambio de isotipo (CD19+CD27+IgD–: 14 vs 22%, p=0.009); aumen-to de la expresión de marcadores de activación tanto en células T CD4+

(CD4+CD25+DR+: 5 vs 3.7%, p=0.01) como CD8+ (CD8+DR+: 27 vs 21%,p=0.03). En los pacientes con SAAF trombótico no observamos alteracio-nes en el porcentaje de células T CD4 o CD8 reguladoras (CD4+CD25high,CD8+CD28–), ni en el porcentaje de células NK (CD3–CD16+CD56+).

Conclusiones. En pacientes con SAAF trombótico se observan dis-tintas alteraciones inmunofenotípicas en linfocitos de sangre periféri-ca, algunas de ellas potencialmente implicadas en la patogenia del sín-drome, lo que aporta más evidencia al concepto de que este síndromese extiende más allá de la producción de autoanticuerpos. A la vista delos resultados, un aumento de células B naive evidenciaría la posibili-dad de que esta subpoblación no sólo puede participar en procesos

de presentación antigénica sino en la misma producción de anticuer-pos. El aumento de marcadores de activación sobre células T CD4+ sepodría enmarcar en la posible presencia de células T autoreactivas.

O-009RECLUTAMIENTO DE SUBPOBLACIONES ESPECIFICAS DE LIN-FOCITOS T CD8+ REGULADORES EN LIQUIDO CEFALORRA-QUIDEO DE PACIENTES DE PACIENTES EN PRIMER BROTE DEESCLEROSIS MULTIPLE. M. Tejera Alhambra, R. Teijeiro, B. Alon-so, C. De Andrés, E. Fernández-Cruz, S. Sánchez-Ramón. Hospital Gene-ral Universitario Gregorio Marañón, Madrid.

La esclerosis múltiple (EM) es una grave enfermedad inflamato-ria desmielinizante y progresiva del sistema nervioso central (CNS),en la que diferentes subpoblaciones de linfocitos T CD4+ y CD8+ jue-gan un importante papel en el daño tisular y en la supresión de la res-puesta efectora. Se desconoce la presencia y función de los linfocitosT CD8+ reguladores (Ts) en la fisiopatología de la EM.

Objetivo. Estudiar la presencia de subpoblaciones de linfocitos Ts(CD8+CD25+, CD8+CD28–, CD8+CD25+CD28–, CD8+CD25+FoxP3+ yCD8+CD25+CD127lo) y efectores (CD8+CD45Ra+CCR7–) en el líquidocefalorraquídeo (LCR) y sangre periférica (SP) de pacientes con pri-mer brote de EM.

Materiales y Métodos. Se analizaron en paralelo mediante cito-metría de flujo multiparamétrica muestras de LCR y SP de pacientescon EM (n= 13).

Resultados. Los porcentajes de linfocitos Ts CD8+CD28–,CD8+CD25+CD28–, CD8+CD25+CD127– y CD8+CD25+FOXP3+ fueronsuperiores en LCR que en SP (p= 0,05; p= 0,06; p= 0,004 y NS, respec-tivamente), indicando un reclutamiento específico de estas células enel LCR en brote. Por el contrario, los linfocitos T CD8+CD25+ totalesfueron más abundantes en SP (p=0,03). Los porcentajes de células TCD4 y CD8 naïve fueron menores en LCR (p<0,0001 y p=0,004, respec-tivamente) respecto a SP, mientras que las células T CD4 pre-efectoras(p=0,004), memoria (p=0,002) y efectoras (p= 0,07) fueron mayoresen LCR. Las células CD8 pre-efectoras fueron mayores en LCR(p=0,004), mientras que las células CD8+ memoria (p=0,04) en SP.

Conclusiones. En nuestra cohorte de pacientes en primer brotede EM observamos un enriquecimiento específico de subpoblacionesde Ts y de células T CD4+ y CD8+ pre-efectoras y CD4+ efectoras en elLCR. Estos datos podrían sugerir el reclutamiento específico de Ts quemodulan a la baja la molécula CD28 y expresan el factor de trans-cripción FoxP3 para inhibir la respuesta efectora T CD4 y CD8 antíge-no específica en un intento de controlar la enfermedad.

O-010A ROLE FOR AIM, A MACROPHAGE SOLUBLE MEMBER OF THESRCR SUPERFAMILY, AS A PATTERN RECOGNITION RECEPTOR.V.G. Martínez1, C. Escoda I Ferran1, C. Miró1, A. Castrillo2, F. Lozano3.1Fundació Clínic per a la Recerca Biomèdica, Institut d’Investigacions Biomè-diques August Pi i Sunyer (IDIBAPS), Barcelona. 2Departamento de Bioquí-mica-Biología Molecular, Universidad de Las Palmas. 3Departamento de Bio-logía Celular, Inmunología y Neurociencias, Universidad de Barcelona.*Authors contributed equally to this work (Oral). No beca Inmunidad Innata.

Mouse AIM (Apoptosis Inhibitor expressed in Macrophages), ahomologue of human Spα, is a soluble member of the scavenger receptor

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cysteine-rich (SRCR) superfamily, a group of proteins involved in boththe innate and adaptive immune response. Pleiotropic functions havebeen ascribed to AIM, from survival support of lymphocytes duringthymic selection to anti-inflammatory effects in autoimmune pathologies.To further explore its functional capabilities we successfully expresseda recombinant form of AIM (rAIM) using an episomal system in HEK293-EBNA cells. We used rAIM to generate AIM-specific rat mAbs and toidentify conserved epitopes cross-reactive with anti-Spα mouse mAbspreviously generated by our group. Additionally, the pathogen-bindingproperties of rAIM were also explored. The results obtained showthat rAIM binds to a number of Gram-positive as well as Gram-negativebacterial strains. Furthermore, rAIM induced aggregation of both Gram-positive and Gram-negative bacteria, which could imply the existenceof multiple bacterial binding domains. Bacterial binding and aggregationwas insensitive to EDTA, suggesting that divalent ions do not influencebinding of rAIM to bacteria. Interestingly, Interestingly, some of the ratanti-AIM and mouse anti-Spα mAbs used in this study competed thebinding of both rAIM and rSpα to bacteria. Altogether, these data suggesta role for AIM in innate immune defence against bacteria.

SESIÓN 2: CÉLULAS B Y ALERGIA

Moderadores: Jose Antonio Brieva Romero (Cádiz)Julia Sequí Navarro (Madrid)

O-011MODULACIÓN DE LA MIGRACIÓN DE CÉLULAS B NAIVE PORLIGANDOS DE INTEGRINAS. J. Saez De Guinoa Corral, L. BarrioCano, M. Mellado, Y. R. Carrasco. FCSIC/Centro Nacional de Biotecno-logía, Madrid.

Las células B naive migran activamente dentro de los órganos lin-foides secundarios (OLS) en busca de antígeno específico. Este movi-miento está regulado principalmente por la quimioquina CXCL13 y,en menor medida, la quimioquina CXCL12, ambas producidas porcélulas foliculares dendríticas (FDC) y otras células estromales presen-tes en los OLS. Datos obtenidos mediante técnicas de microscopía con-focal y multifotón indican que las células B se desplazan siguiendo lared de “caminos” formada por la superficie de las FDC. Poco se sabea cerca del posible efecto modulador del contexto molecular sobre elcual la célula B migra. En este trabajo, hemos puesto a punto un mode-lo bidimensional de membranas artificiales donde podemos estudiarla dinámica en tiempo real de células B naive en respuesta a CXCL13y CXCL12 mediante técnicas de microscopía confocal. Con este siste-ma hemos analizado cómo las moléculas de adhesión ICAM-1 y VCAM-1, ligandos de las integrinas LFA-1 y VLA-4, respectivamente, modifi-can la migración de las células B naive. Los resultados obtenidos indi-can que las quimioquinas CXCL13 y CXCL12 inducen la polariza-ción de las células B naive en igual proporción, y de manera indepen-diente a la presencia de ambos ligandos de integrinas. Por otra parte,la migración sí requiere de la presencia de ICAM-1 y/o VCAM-1; ade-más, su densidad juega un papel crítico en la modulación de los pará-metros dinámicos de la célula B naïve. Es necesaria una densidad míni-ma de estos ligandos para promover la migración de la célula B; a den-sidades óptimas, los parámetros dinámicos alcanzan valores muy simi-lares a los descritos in vivo por microscopía multifotón en ganglios lin-fáticos; altas densidades de ICAM-1 y/o VCAM-1 retardan, sin embar-

go, el movimiento de la célula B. Por último, también hemos observa-do que, a iguales densidades, ICAM-1 promueve una mayor veloci-dad de migración y, por tanto, una dinámica más activa, que VCAM-1. En conjunto, estos datos ponen de manifiesto el importante papelmodulador de ambas moléculas de adhesión en la dinámica de las célu-las B y, por tanto, en los procesos de búsqueda y reconocimiento delantígeno específico en los OLS.

O-012UTILIDAD DEL TEST DE ACTIVACIÓN DE BASÓFILOS EN ELDIAGNÓSTICO DE LA ANAFILAXIA A FÁRMACOS. A. MarinSánchez, P. García Ortega, I. Salvador Corres, A. Teniente Serra, E.Ruiz-Ortiz De Arrizabaleta, R. Pujol-Borrell, E. Martínez-Cáceres.Hospital Germans Trias i Pujol, Badalona.

Objetivo. Evaluar la utilidad de la test de activación de basófilos(TAB) en el diagnóstico de la alergia a fármacos en pacientes con anafi-laxia grave en los que las pruebas in vivo se consideran de alto riesgo.

Materiales y Métodos.Se seleccionaron pacientes que consulta-ron después de una anafilaxia potencialmente mortal que se había pro-ducido en menos de una hora tras la administración de un sólo fárma-co. Después de la anamnesis detallada, los pacientes con otras etiolo-gías posibles fueron descartados por la historia clínica y/o pruebascutáneas. Entre 2 a 6 meses después de la reacción se realizaron tantoel TAB (Basotest, Orpegen, Alemania) como la determinación de IgEespecífica (ImmunoCAP, Phadia, Suecia). Las pruebas cutáneas se efec-tuaron sólo a pacientes con reacciones menos graves que aceptaronel riesgo y que firmaron un consentimiento informado.

Resultados. Se recogieron 24 pacientes que cumplían las condi-ciones del estudio. La clínica fue de paro respiratorio (3 casos), shock(10 casos), edema laríngeo (2 casos), pérdida de conciencia (4 casos),disnea (4 casos) y obnubilación (1 caso). Los fármacos implicados fue-ron la amoxicilina en 14 pacientes, metamizol en 5, el ibuprofeno en2 y cloxacilina, ácido pipemídico y diclofenaco en el resto. El TAB fuepositivo en 10 pacientes (42%), negativo en 12 (50%) y no evaluable en2 (8%), estos últimos correspondientes a un paciente no respondedorfrente al control con anti-IgE y otro con menos del 5% basófilos acti-vados frente al fármaco. La IgE específica fue positiva en sólo 3 / 17pacientes (18%) con TAB negativo (n=1) o dudoso (n=2).

Conclusiones. A pesar de que las pruebas cutáneas siguen sien-do la herramienta más fiable para determinar alergia a fármacos gra-ve, cuando estas pruebas no se pueden realizar por razones éticas oporque son rechazadas por los pacientes, la combinación del TAB y laIgE específica puede identificar el fármaco responsable en más del 50%de los pacientes con anafilaxia potencialmente mortal.

O-013MECANISMOS REGULADORES IMPLICADOS EN LA RESPUES-TA ALÉRGICA: MODELO DE RESPUESTA AL POLEN DE OLIVO.M. Aguerri Moreno1, F. Florido2, J. Quiralte3, J. Delgado4, A. Miranda5,J.M. López-Cacho1, S. Gallardo1, P. Palomino1, L. Carlos1, B. CárdabaOlombrada1. 1IIS-Fundación Jiménez Díaz-CIBERES, Madrid. 2HospitalUniversitario San Cecilio, Granada. 3Hospital Universitario Virgen del Rocío,Sevilla. 4Policlínico, Sevilla. 5Hospital Civil, Málaga

Objetivo. La sensibilización y la tolerancia (natural o inducida)a los alérgenos puede ser debida a diferentes mecanismos molecula-

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res. El objetivo del trabajo es analizar alguno de estos mecanismos,usando como modelo la respuesta al polen de olivo.

Material y Métodos. Se seleccionaron 84 sujetos distribuidos en5 grupos: Grupo 1 (no alérgicos, N=17), Grupo 2 (asintomáticos conanticuerpos IgE frente a olivo, N=10), Grupo 3 (alérgicos no relaciona-dos, N=20), Grupo 4 (alérgicos al olivo, no tratados, N=22) y Grupo 5(alérgicos al olivo con inmunoterapia específica, N=15). Se obtuvo sue-ro, plasma, PBMCs, ARN y ADN durante y fuera del periodo de poli-nización.

En el suero se determinaron los niveles de anticuerpos IgE total,IgE, IgA e IgG4 específicos al polen de olivo mediante CAP, así comocitoquinas Th1 (IFN-γ), Th2 (IL-4, IL-5, IL-9, IL-13), reguladoras (IL-10,TGF-β) e IL-17 y TNF-α mediante ensayos inmunoenzimáticos (ELI-SA).

El RNA se extrajo de las PBMCs por el método de Trizol y se ana-lizó la expresión del mRNA del gen FOXP3 mediante RT-PCR.

Resultados. Los niveles más altos de anticuerpos IgE específicosse observaron en los sujetos alérgicos al olivo (tratados y no tratados)aunque los tratados mostraron los niveles más altos de anticuerposIgG4 específicos. El grupo de asintomáticos mostró los mayores nive-les de IgE total.

El resultado más relevante del análisis de citoquinas fue el descen-so significativo de los niveles de TGF-β en el grupo de alérgicos no tra-tados durante la polinización. En este mismo grupo encontramos undescenso significativo en la expresión de FOXP3.

Conclusiones. Los resultados de la respuesta humoral junto aldescenso de TGF-β en suero y de FOXP3 en el grupo de sujetos alérgi-cos al olivo en el periodo de mayor exposición polínica, sugieren undescenso de los mecanismos reguladores en los pacientes alérgicos, ycómo la respuesta puede ser normalizada mediante la inmunoterapia.

O-014DESCUBRIMIENTO DE BIOMARCADORES ÚTILES EN EL DIAG-NÓSTICO PRECOZ DE LEUCEMIAS LINFOIDES B. M. FuentesGarcía1, R. Bartolome Casado1, M. Gonzalez-Gonzalez1, R. Góngora2,J.M. Sayagües2, F. Lund-Johansen3, A. Orfao1. 1Universidad de Salaman-ca-CSIC, Salamanca. 2Universidad de Salamanca, Salamanca. 3University ofOslo, Oslo, Norway.

En este proyecto se ha desarrollado una estrategia metodológicaque permita relacionar el inmunfenotipo de células B neoplásicas indi-viduales con sus niveles de expresión para un amplio abanico de pro-teínas. Para ello, se han combinado técnicas de purificación celular porcitometría de flujo y que permiten además una caracterización inmu-nofenotípica básica de las células B aberrantes, junto con la utilizaciónde arrays de proteínas (basados en esferas) para establecer patronesde expresión proteica a nivel de las poblaciones celulares purificadassubyacentes a los diferentes inmunofenotipos celulares encontrados.

Objetivos. 1. Diseño y desarrollo de un array de partículas mag-néticas para la purificación mediante citometria de flujo de poblacio-nes de células B aberrantes de pacientes con leucemia linfoide B, desubpoblaciones B neoplásicas muy minoritarias (pequeños clones designificado incierto detectados en individuos aparentemente sanos)y su contrapartida normal. 2.Rastreo dirigido hacia la detección de anti-cuerpos frente a proteínas potencialmente antigénicas de las líneas decélulas B neoplásicas. 3. Análisis de arrays basados en anticuerpos parala determinación de patrones proteicos de expresión, incluyendo lacuantificación de proteínas individuales intracelulares, la evaluación

de niveles de fosforilación, ... en células aberrantes B comparado concélulas normales.

Metodología. Se incluirán un total de 100 individuos; n=50 LLC-B u otros SLPC-B leucemizados (n=50). Inicialmente se les proporcio-nará a todos los individuos un cuestionario de salud y sobre sus mues-tras de sangre periférica obtenidas en ese momento, se realizará el ras-treo diagnóstico de la presencia de células B clonales mediante cito-metría de flujo, con anticuerpos monoclonales en combinaciones cuá-druples/séxtuples. En los casos en los que se detecte la presencia decélulas B aberrantes se realizará una amplia caracterización de la/spoblación/es B aberrante/s purificada/s: a) Caracterizacion inmuno-fenotipica completa y exhaustiva de dichas poblaciones de celulas Bpor citometria de flujo. b) Rastreo de muestras de plasma de la presen-cia de Ac frente a una amplia gama de bacterias, virus y otros micro-organismos mediante tecnicas inmunoenzimaticas; c) Estudios de expre-sión proteica diferencial mediante técnica de microarrays de proteinas.Finalmente, se hara la integracion y analisis de los datos obtenidos ycorrelacion con los hallazgos clinicos y biologicos.

Resultados y Conclusión. Se han obtenido resultados relevantesy útiles mediante la comparación de los perfiles proteicos de expresióndiferencial de poblaciones de células B aberrante de pacientes con leu-cemia linfoide B, de subpoblaciones B neoplásicas muy minoritarias(pequeños clones de significado incierto detectados en individuos apa-rentemente sanaos) y su contrapartida normal, como por ejemplo dife-rencias claras en la expresión de proteínas como AKT1, JAK-STAT, etc.así como diferentes factores de transcripción incluyendo mutacionespuntuales en p53 y Mdm2.

O-015EXPRESIÓN DE HLA-G POR LAS CÉLULAS FOLICULARES DEN-DRÍTICAS HUMANAS. A. Prados Martín, E. Leno Durán, R. MuñozFernandez, E. García Olivares. Universidad de Granada/CIBM, Armilla.

Objetivos. Las Células Foliculares Dendríticas (FDC, FolicularDendritic Cells) constituyen la fracción estromal de los centros germi-nales, los cuales se forman tras la activación de los linfocitos B en losfolículos linfoides. La función de las FDC consiste en capturar y rete-ner antígenos nativos en su superficie, los cuales son presentados a lascélulas B para su selección positiva, durante la maduración de la afi-nidad. Además, durante la presentación del antígeno, las FDC les apor-tan señales de supervivencia y proliferación a estos linfocitos. El HLA-G es una molécula perteneciente al MHC-I no clásica, implicada enprocesos de tolerancia inmunológica y capaz de formar dímeros a tra-vés de una cisteína en posición 42, característica inusual dentro delMHC. Dichos dímeros presentan una elevada afinidad por el receptorILT-2, expresado en células B vírgenes y memoria, entre otras. El obje-tivo de este trabajo es determinar la expresión de HLA-G en líneasde Células Foliculares Dendríticas humanas.

Material y Métodos. Se aislaron FDC humanas de amígdalas,obtenidas de pacientes de entre 3 y 10 años con amigdalitis crónica, encompleta remisión antes de la intervención. Se realizo un análisis feno-típico y funcional mediante citometría de flujo de las líneas y la expre-sión de HLA-G fue determinada mediante Western-Blot.

Resultados. Nosotros aislamos líneas de FDC y las mantuvimosen cultivo durante varios meses. Estas líneas expresaron CD10, CD21,CD23, CD29, CD73, ICAM-1, BAFF, α-SM Actina y STRO-1, un feno-tipo característico de FDC. Además, las líneas de FDC fueron capa-ces de rescatar de la apoptosis a linfocitos B de amígdalas, al ser co-

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cultivadas durante 72h. Finalmente, mostramos la expresión de díme-ros de HLA-G1 mediante Western-Blot.

Conclusiones. En este trabajo, demostramos la expresión de díme-ros de HLA-G en FDC. La expresión de esta molécula inhibidora brin-da una nueva perspectiva sobre la función de las FDC, caracteriza-das por transmitir señales activadoras. Los dímeros de HLA-G podrí-an impedir la proliferación de linfocitos B vírgenes o memoria, puesestas células expresan el recetor ILT-2 hasta el momento de ser acti-vadas vía BCR. Así, el HLA-G regularía el efecto que las citocinas pro-ducidas por las FDC pudieran tener sobre linfocitos no activados.

O-016RELACIÓN ENTRE CÉLULAS DECIDUALES ESTROMALES YCÉLULAS FOLICULARES DENDRÍTICAS. R. Muñoz Fernández, A.Prados Martín, E. Leno Durán, E. García Olivares. Universidad de Gra-nada / CIBM, Armilla.

Objetivos. Las células deciduales estromales (decidual stromal cells,DSC) se localizan en la decidua, tejido transitorio, que procede del endo-metrio gestante por efecto de la progesterona, y en íntimo contacto conel trofoblasto (origen fetal). Estas células inhiben la apoptosis de linfo-citos deciduales, ejerciendo un papel inmunorregulador en la interfasematerno-fetal. Las células foliculares dendríticas (follicular dendriticcells, FDC) se encuentran en los folículos linfoides, donde captan y retie-nen antígenos nativos durante largos periodos de tiempo y cuya fun-ción principal es rescatar de la apoptosis a las células B foliculares. Enla diferenciación a FDC interviene el TNFα, mientras que las DSC sediferencian por la progesterona. A pesar de que DSC y FDC son dos tiposcelulares aparentemente distintos, ambos han sido relacionados con lascélulas madre mesenquimales (mesenchymal stem cells, MSC). El obje-tivo de este trabajo es determinar la posible relación entre DSC y FDCen cuanto a su fenotipo antigénico y funcionalidad.

Material y Métodos. Muestras: Las FDC se obtuvieron de amíg-dalas de pacientes con amigdalitis (3-10 años) y las DSC de decidua deabortos inducidos del primer trimestre (6-11) de mujeres sanas (20-30años). Las DSC y FDC fueron cultivadas en Opti-MEM y en su fase decrecimiento se procedió al estudio del fenotipo antigénico y a la pro-ducción de la quimiocina CXCL-13, por citometría de flujo y E.L.I.S.Arespectivamente. Para el papel funcional, se realizaron co-cultivos deDSC o FDC con células B y se determinó la apoptosis en células B cuan-tificando la fase sub-G1 por citometría de flujo. DSC fueron tratadascon TNF y se estudio su efecto sobre el fenotipo antigénico de estascélulas Por otra parte, las FDC fueron tratadas con progesterona yAMPc, y se determinó la secreción de prolactina mediante E.L.I.S.A.

Resultados. DSC y FDC presentaron morfología fibroblástica invitro y fenotipo similar. Fueron positivas para CD10, CD29, CD54(ICAM-1) y CD73, marcadores relacionados con MSC, y para CD21,CD23, BAFF y secretaron CXCL-13 (quimiocina), marcadores pro-pios de FDC. Funcionalmente, las DSC al igual que FDC, inhibieron laapoptosis de células B, requiriendo contacto celular. El TNFα, aumen-tó la expresión ICAM-1 (CD54) tanto en DSC como en FDC. Cuandolas FDC fueron tratadas con progesterona y AMPc, se detectaron nive-les de prolactina en el sobrenadante, aunque en niveles significativa-mente inferiores a los presentados por las DSC.

Conclusiones. Aunque las DSC y FDC son células aparentemen-te distintas y realmente distantes, y se encuentran en entornos funcio-nales muy diferentes, comparten unas características fenotípicas y fun-cionales semejantes.

O-017EFECTO DE LA ADICIÓN DE CITOQUINAS SOBRE LA PROLI-FERACIÓN Y SUPERVIVENCIA DE CÉLULAS PLASMÁTICASCIRCULANTES HUMANAS. B. Rodríguez-Bayona, A. Ramos-Ama-ya, J.A. Brieva. Hospital Universitario Puerta de, Cádiz.

Objetivos. Las células plasmáticas (CP) constituyen la fase finalde diferenciación del linfocito B, siendo las responsables de la respues-ta inmune humoral. Las CP conforman un compartimento heterogé-neo que engloba células con características fenotípicas y funcionalesdistintivas dependiendo de su localización anatómica, mostrando ungradiente de maduración en el sentido amígdala (A) - sangre periféri-ca (SP) - médula ósea (MO). El objetivo del presente estudio consistióen la identificación de los factores implicados en la transición de CPcirculantes a CP de larga vida.

Materiales y métodos. Se obtuvieron muestras de SP de volunta-rios sanos 6 días después de inmunización convencional con toxoidetetánico (tet). Esta vacunación induce una rápida respuesta frente a tet,desencadenado la aparición de una oleada de CP circulantes que secre-tan IgG-tet, que es máxima a los 6 días de la inmunización. Sobre lafracción mononuclear deplecionada de linfocitos T se analizaron laincorporación de BrdU, la frecuencia de CP caspasa-3 activada posi-tivas y la recuperación celular mediante citometría de flujo (CF), y laproducción de IgG-tet mediante ELISA en cultivos control y con lamezcla de citoquinas.

Resultados. La adición de una mezcla de seis citocinas (SDF-1α,IGF-I, IL-21, BAFF, VEGF121 y APRIL) provocaba un claro aumen-to de la producción de IgG-tet. Este efecto se debía a un incrementode la proliferación inicial de las CP circulantes. Además se observóuna mayor recuperación celular y un aumento notable en la produc-ción de Ac cuando se añadían estos factores, sin que se afectara latasa basal de apoptosis de las CP. Estos efectos potenciadores, sinembargo, no se mantenían en el tiempo, como revelaban los estudioscinéticos de recuperación celular y de acumulación de la IgG-tet secre-tada.

Conclusiones. La adición de la mezcla de factores descrita a cul-tivos de CP de SP da lugar a un aumento de su proliferación y, por tan-to, del número de precursores que justifican la mayor recuperacióncelular y producción de IgG-tet. No obstante, estos factores no produ-cen mayor supervivencia de las CP.

O-018UNA FASE DE PROLIFERACIÓN INICIAL Y SEÑALES MEDIA-DAS POR INTERLEUQUINA-6/STAT3 SON DOS REQUISITOSPARA LA SUPERVIVENCIA DE LAS CÉLULAS PLASMÁTICASCIRCULANTES HUMANAS. A. Ramos-Amaya, B. Rodríguez-Bayo-na, J.A. Brieva. Hospital Universitario Pueta Del Mar, Ubrique.

Objetivos. El compartimento de células plasmáticas (CP) circu-lantes humanas contiene una fracción de células proliferantes no obser-vado en CP de médula ósea (MO). Por otro lado, IL-6 es una citoqui-na implicada en los procesos de diferenciación y supervivencia de CP.El objetivo de este estudio consistió en la caracterización de la cinéti-ca de formación, capacidad proliferativa, de desarrollar apoptosis, pro-ducción de Ac y respuesta a IL-6 de las CP circulantes.

Materiales y métodos. Se obtuvieron muestras de SP de volun-tarios sanos 6 días después de inmunización convencional con toxoi-de tetánico (tet). Esta vacunación induce una rápida respuesta fren-

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te a tet, desencadenado la aparición de una oleada de CP circulantesque secretan IgG-tet, que es máxima a los 6 días de la inmunización.Sobre la fracción mononuclear deplecionada de linfocitos T se anali-zaron la incorporación de BrdU, la frecuencia de CP caspasa-3 activa-da positivas y la recuperación celular mediante citometría de flujo(CF), y la producción de IgG-tet mediante ELISA en cultivos controly en presencia de anti-IL6 y de hidroxiurea, como inhibidor de la pro-liferación.

Resultados. Los datos obtenidos en el trabajo indican que in vitroexiste una fase de proliferación temprana (primeras 24 horas de cul-tivo) de las CP circulantes tet-inducidas; esta fase parece importan-te en la biología de estas CP ya que, si es bloqueada, disminuye lasupervivencia de las células en cultivo, y disminuye aún en mayorproporción la producción de IgG-tet por parte de las CP. Tambiénse ha visto que existe una baja, pero continua, tasa de apoptosis enlos cultivos de CP circulantes lo que hace que la recuperación celu-lar disminuya con el tiempo. La actividad apoptótica se ve fuerte-mente potenciada si se bloquea la IL-6 endógena con Ac anti-IL-6,por lo que esta citoquina estaría implicada en procesos de supervi-vencia de las CP.

Conclusiones. Las CP circulantes inducidas tras una inmuniza-ción presentan una actividad proliferativa inicial y una baja pero con-tinua tasa de apoptosis. La IL-6 es un factor de supervivencia para lasCP, ya que su bloqueo induce un aumento de apoptosis.

O-019CARACTERIZACION FENOTIPICA Y FUNCIONAL DE LAPOBLACION DE LINFOCITOS B CD19+CD45R–, SECRETORA DEINMUNOGLOBULINAS IGG E IGA PRESENTE EN EL BAZO DERATONES ADULTOS. B. De Andres1, B. Palacios1, A.R. Sánchez-Archidona1, N. Serrano2, I. Cortegano1, C. Ruiz1, F. Martínez1, M. Alia1,M.A. R. Marcos2, M.L. Gaspar1. 1Instituto De Salud Carlos III, Aran-juez. 2Centro De Biologia Molecular Severo Ochoa.

La población murina de linfocitos B, con fenotipo CD19+CD45R–

presente en bazo de individuos adultos, fue identificada por nos-otros como secretora de forma espontánea de altos niveles de IgG eIgA. Esta subpoblación se encuentra ya en edades tempranas de lavida, y sus progenitores tienen un origen embrionario. En el estudioactual caracterizamos de forma extensa su fenotipo por citometríade flujo, identificándola como diferente de otras subpoblaciones decélulas B presentes en el bazo, tales como: las transicionales (T, CD93+),las células B foliculares (Fo, IgD+CD23+CD21+), las de zona marginal(MZ, CD21++) y las células B1 peritoneales (B1, CD5+CD11b+). Ade-más, mediante estudios de incorporación de BrdU in vivo y por trans-ferencias adoptivas de la población purificada CD19+CD45R–, en ani-males inmunodeficientes RAG2.γchain–/–, hemos caracterizado surecambio celular y sus tasas de supervivencia en condiciones home-ostáticas. Hemos también analizado su participación en respuestasT-dependientes y T independientes mediante activación in vivo e invitro con diversos estímulos. Finalmente, estamos caracterizando elrepertorio de las inmunoglobulinas que secretan estas célulasCD19+CD45R–, mediante la amplificación por RT-PCR de las regio-nes VDJ de las inmunoglobulinas que se expresan y su secuencia-ción.

Finalmente, podemos concluir que la población CD19+CD45R–

representa un nuevo subset del tipo innato, adscrito dentro del siste-ma inmune adaptativo.

O-020B CELL COMMITMENT PROGRAM IS DRIVEN BY THE PROTO-ONCOGENE C-MYC. I. Moreno De Alborán, M. Vallespinós , D. Fer-nández, L. Rodríguez, J. Alvaro-Blanco, E. Baena, M. Ortiz, D. Dukovs-ka, A. Rojas, M.R. Campanero. National Center for Biotechnology, Madrid.

c-Myc, a member of the Myc family of transcription factors, isinvolved in numerous biological functions including the regulationof cell proliferation, differentiation and apoptosis in various celltypes. Of all its functions, the role of c-Myc in cell differentiation isone of the least understood. We addressed the role of c-Myc in Blymphocyte differentiation. We found that c-Myc is essential fromearly stages of B lymphocyte differentiation in vivo, and regulatesthis process by providing B cell identity via direct transcriptionalregulation of the ebf-1 gene. Our data show that c-Myc influencesearly B lymphocyte differentiation by promoting activation of B cellidentity genes, thus linking this transcription factor to the EBF-1-Pax-5 pathway.

SESIÓN 3: CÉLULAS T

Moderadores: Ana Clara Carrera (Madrid)Enrique Aguado (Murcia)

O-021VIRAL LIGANDS, CONSERVED AMONG ORTHOPOXVIRUSES,NATURALLY PRESENTED IN TAP-DEFICIENT VACCINIAVIRUS-INFECTED CELLS. D. López1, E. Lorente1, S. Infantes1, E.Barnea2, I. Beer2, R. García1, F. Lasala1, M. Jiménez1, C. Vilches3, A.Admon2. 1Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III,Majadahonda. 2Department of Biology, Technion-Israel Institute of Techno-logy. 3Laboratorio de Inmunogenética-HLA, Hospital Universitario Puer-ta de Hierro, Madrid.

The transporters associated with antigen processing (TAP) deliverthe products generated by the proteolytic activity of proteasomes inthe cytosol to the rough endoplasmic reticulum lumen. This classicalendogenous antigen processing pathway is the main source ofpathogen HLA ligands that are later specifically recognized bycytotoxic T lymphocytes (CTL) on the surface of infected cells. Severalviral epitopes in individuals with non functional TAP complexesand both TAP-deficient cell lines and mice models have been identified.Except for Epstein-Barr virus, no systematic studies of pathogenderived TAP-independent ligands have been reported. Using massspectrometry analysis of complex HLA-bound peptide pools isolatedfrom large amounts of TAP-deficient vaccinia virus-infected cells,we identified six naturally processed either HLA-A*0201 or B*2705class I molecules in the same infected cells. All sequences are conservedin several vaccinia virus strains, variola virus and other orthopoxviruses.In addition to two high-affinity ligands, one low-affinity peptiderestricted by each HLA class I molecule studied was identified. Bothhigh- and low-affinity ligands generate CTL long-term memoryresponse against vaccinia virus in an HLA-A*0201 transgenic mousemodel. These data have implications for the analysis of the CTLresponse, for the vaccine development, and for the study of effectivenessof early empirical vaccination with cowpoxvirus against smallpoxdisease.

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O-022ALTERACIONES EN LA DISTRIBUCIÓN DE LAS POBLACIONESDE LINFOCITOS T Y EN SU PATRÓN DE SECRECIÓN DE CITO-QUINAS SEGÚN LA EXPRESIÓN DE ZAP-70 EN PACIENTES CONLLC-B. M.Á. Sánchez Luengo1, L. Ortega Moreno1, G. Parada Hermo-za1, Z. Moreno Villegas1, D. Díaz Martín1, H. Barcenilla Rodríguez1, J.Monserrat Sanz1, A. Prieto Martín1, E. Reyes Martín1, M. Álvarez DeMon-Soto2. 1Universidad de Alcalá de Henares, Alcalá de Henares. 2Hospi-tal Universitario Príncipe de Asturias.

Introducción. Los nuevos criterios para definir el grado de acti-vación de linfocitos T están basados en la expresión combinada de laisoforma del antigeno CD45RA y del marcador CD27. En el caso de laLLC-B se ha observado que existía un incremento de las células Tmemoria y descenso de células novatas en pacientes categorizados enmorfología atípica o elevado número de linfocitos circulantes. ZAP-70se muestra como un factor pronóstico de gran importancia para pre-decir la evolución de los pacientes con LLC-B.

Objetivos. Estudiar la distribución de los linfocitos T según sugrado de activación y el patrón de producción de citoquinas en pacien-tes con LLC-B según el valor pronóstico ZAP-70.

Materiales y métodos. Se utilizaron células mononucleares desangre periférica de 34 pacientes con LLC-B que se categorizaron porcitometría de flujo en dos grupos según la expresión de ZAP-70 (ZAP-70+ y ZAP-70–) y de 18 controles sanos de edad y sexo pareado. Lascélulas fueron cultivadas durante 6 horas en presencia de PMA, iono-micina y nomensina. El estudio inmunofenotípico y de producción decitoquinas se realizó por citometría de flujo de 8 colores utilizando anti-cuerpos frente a los antígenos de superficie CD3, CD8, CD27, CD28,CD45RA, CD62L y anticuerpos para el marcaje intracelular de las cito-quinas INFγ, TNFα, IL-2, IL-4 e IL-10.

Resultados. Los pacientes con LLC-B y de forma significativamen-te mayor en los ZAP-70+ que en los ZAP-70– presentaron una profun-da redistribución del compartimento linfocitario T, tanto CD4+ comoCD8+, con incremento de los linfocitos T CD4+ efectores y T CD8+ memo-ria central así como descensos significativos de linfocitos T CD4+ yCD8+ novatos. Por otra parte se observó diferencias en la producciónde citoquinas entre los diferentes grupos de pacientes con LLC-B segúnla expresión de ZAP-70 además de mostrar diferencias significativascon los controles sanos.

Conclusiones. Existe una profunda alteración en los pacientes conLLC-B y en concreto en los ZAP-70+ en el compartimento de célulasT tanto en su distribución como en su capacidad de producción y secrec-ción de citoquinas que puede estar relacionado con el peor pronósticoy evolución de estos pacientes.

O-023AUMENTO DE LA ACTIVACIÓN DE LINFOCITOS T Y CÉLULASREGULADORAS FOXP-3+ EN PACIENTES CON LLC-B ZAP-70+.M.Á. Sánchez Luengo1, Z. Moreno Villegas1, G. Parada Hermoza1, L.Ortega Moreno1, D. Díaz Martín1, H. Barcenilla Rodríguez1, J. Monse-rrat Sanz1, A. Prieto Martín1, E. Reyes Martín1, M. Álvarez De Mon-Soto2. 1Universidad de Alcalá de Henares, Alcalá de Henares. 2Hospital Uni-versitario Príncipe de Asturias.

Introducción. La patogenia de la LLC-B no sólo esta ocasionadapor las alteraciones existentes en los linfocitos B. Existen alteracionesen otros compartimentos del sistema inmune incluidos los linfocitos

T, siendo estas alteraciones tanto a nivel de distribución poblacionalcomo también fenotípica y funcionalmente.

Objetivos. Estudiar la distribución de diferentes subpoblacionesde linfocitos T y su estado de activación en pacientes con LLC-B segúnla expresión de ZAP-70 por parte de las células B tumorales.

Materiales y métodos. Se realizó estudio inmunofenotípico porcitometría de flujo de 4 colores, para lo cual se obtuvieron PBMCs desangre periférica de 34 pacientes con LLC-B que se categorizaron enZAP-70+ (n=16) y ZAP-70– (n=18), y de 18 controles sanos. Para el estu-dio de las distribución y activación de las diferentes subpoblacionesde linfocitos T se utilizaron anticuerpos frente a los antígenos de super-ficie CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD40L, CD62L, CD45RA, CD45RO,CD95. También se estudio la distribución de células reguladorasmediante el marcaje con anticuerpos frente a los antígenos CD4, CD25y FOXP-3.

Resultados. Los pacientes con LLC-B ZAP-70+ mostraron incre-mentos significativos con respecto de los pacientes ZAP-70– y loscontroles sanos del número absoluto de linfocitos T. Sin embargo sibien los pacientes con LLC-B muestran incrementos importantes ysignificativos tanto de linfocitos T CD4+ como CD8+ respecto de loscontroles sanos, no hay diferencias significativas entre pacientes conLLC-B según la expresión de ZAP-70. Los pacientes con LLC-B ZAP-70+ además se caracterizan por un incremento significativo de los lin-focitos T CD4+ y T CD8+ que expresan CD454RO, CD62L, CD95 y sinembargo por una disminución significativa de los números absolu-tos y porcentajes de los linfocitos T CD4+ y T CD8+ que expresan CD28.Por otra parte los pacientes ZAP-70+ mostraron un incremento signi-ficativo de células CD4+FOXP-3+ con respecto de los otros dos gru-pos estudiados.

Conclusión. Existe una importante alteración en la distribuciónasí como en la activación de los linfocitos T, tanto CD4+ como CD8+ enlos pacientes con LLC-B ZAP-70+, mostrando estos pacientes un mayorgrado de activación celular y una mayor proporción de células regu-ladoras FOXP-3+.

O-024INCREMENTO DE LA APOPTOSIS DE LOS LINFOCITOS T ENPACIENTES CON LLC-B ZAP-70+. M.Á. Sánchez Luengo1, G. ParadaHermoza1, Z. Moreno Villegas1, L. Ortega Moreno1, D. Díaz Martín1, H.Barcenilla Rodríguez1, J. Monserrat Sanz1, A. Prieto Martín1, E. ReyesMartín1, M. Álvarez De Mon-Soto2. 1Universidad de Alcalá de Henares,Alcalá de Henares. 2Hospital Universitario Príncipe de Asturias.

Introducción. La LLC-B se caracteriza por una acumulación len-ta y progresiva de células B debido a un aumento anormal de su resis-tencia a la apoptosis. Sin embargo la apoptosis ha sido un fenómenopoco estudiado en las células T en aquellos pacientes con LLC-B notratados, si bien hay algunos estudios atendiendo a la expresión demoléculas relacionadas con los procesos de apoptosis.

Objetivos. Estudiar el grado de apoptosis de diferentes subpobla-ciones de linfocitos T en pacientes con LLC-B según la expresión deZAP-70 y en comparación con controles sanos.

Materiales y métodos. Se obtuvieron células mononucleares desangre periférica por separación por gradiente de densidad con Ficollde sangre periférica de 34 pacientes con LLC-B que se categoriza-ron en ZAP-70+ (n=16) y ZAP-70– (n=18), y de 18 controles sanos deedad y sexo pareados. El estudio de la apoptosis se realizó median-te el marcaje con Anexina-V en FITC y uso de citometría de flujo de

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8 colores. Los marcadores escogidos para la determinación de lasdiferentes poblaciones celulares fueron: CD3, CD4, CD8, CD27,CD28, CD62L y CD45RA. Se calculó el AI (Apoptotic index o por-centaje de células apoptoticas) a tiempo basal y tras cultivo de 24horas.

Resultados. Observamos como el AI tanto en los linfocitos T CD4+

como CD8+ a tiempo basal son significativamente más bajos en lospacientes con LLC-B ZAP-70+ respecto a los pacientes ZAP-70– y loscontroles sanos, sin embargo tras 24 horas de cultivo la situación serevierte siendo en los pacientes ZAP-70+ donde estás células presen-tan porcentajes significativamente superiores respecto a las células delos otros dos grupos estudiados llegando a alcanzar valores superio-res al 50%. Por otra parte existe en los pacientes con LLC-B ZAP-70+

una correlación significativa entre la coexpresión de CD45RO y CD95y el porcentaje de apoptosis que presentan los linfocitos T CD4+ (r =0,72 p < 0.01) y CD8+ (r = 0,80 p < 0.01) tras cultivo de 24 h.

Conclusiones. En los pacientes con LLC-B ZAP-70+ los linfoci-tos T muestran una alteración en su apoptosis que puede estar relacio-nada con el defecto de este compartimento en el control de la enferme-dad.

O-025CARACTERIZACIÓN ESPACIO-TEMPORAL DE LA SEÑALIZA-CIÓN POR NOTCH1 IN VIVO EN EL TIMO HUMANO. M.J. Gar-cía Leon1, G. Del Monte Nieto2, J.L. de la Pompa2, M.L. Toribio García3.1Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, Madrid. 2Centro Nacional deInvestigaciones Cardiovasculares. 3Centro de Biologia Molecular Severo Ochoa

El desarrollo T es un proceso mediado por gran variedad de tiposcelulares dispuestos en diferentes localizaciones en el timo. Estas célu-las forman una organizada red estromal que proporciona una com-binación precisa de interacciones celulares, citoquinas y quimioqui-nas que inducen la migración, proliferación y diferenciación de losprogenitores hematopoyéticos intratímicos (HPCs). El entendimien-to y la caracterización de estas señales complejas es imprescindiblepara aportar claves de cómo se regulan los procesos asociados al des-arrollo de los distintos linajes intratímicos. Los diferentes ligandosdel receptor Notch1 expresados en el timo son esenciales para la pro-liferación y diferenciación de los HPCs, lo que sugiere la participa-ción selectiva de diferentes ligandos en eventos concretos de la timo-poyesis. Para validar esta hipótesis, hemos analizado, mediante inmu-nohistoquímica y microscopía confocal, la identificación in vivo en eltimo humano de los nichos intratímicos definidos por la activacióndel receptor Notch1 y por la expresión de sus ligandos. Hemos mos-trado la primera evidencia in vivo de que Notch1 se activa específi-camente en HPCs CD34hi/+, en timocitos subcapsulares y, lo que esmás novedoso, en células epiteliales medulares (mTECs) y corticales(cTECs) subcapsulares, sugiriendo la implicación de Notch1 en ladiferenciación y homeostasis de las células epiteliales tímicas. Asi-mismo, mostramos la existencia de microambientes especializadosen la presentación de ligandos específicos de Notch1. Además, obser-vamos niveles variables de los ligandos de Notch en distintas regio-nes histológicas y tipos celulares, lo que sugiere un nivel de regula-ción funcional dependiente de la intensidad de la señal ligando-espe-cífica. En concreto, el ligando Delta-like-4, imprescindible para el des-arrollo T, muestra una amplia y heterogénea distribución, con eleva-dos niveles en endotelio y células mieloides y niveles más bajos entimocitos y cTECs. Además, la expresión de los ligandos parece regu-

larse con la edad, lo que podría contribuir a la degeneración fun-cional del timo asociada a la edad. Por tanto, la señalización porNotch1 en el timo humano comprende una compleja regulación deinteracciones ligando-específicas entre timocitos y células estroma-les restringidas en el espacio y en el tiempo, con posibles implicacio-nes funcionales en la generación de linfocitos T y células no-T intra-tímicas.

O-026ANÁLISIS DE LA FUNCIÓN DE DIVERSOS MOTIVOS NO BASA-DOS EN TIROSINA DEL ADAPTADOR LAT. A. García-Blesa1, M.Martínez-Florensa2, J. Yélamos3, F. García-Cózar1, P. Aparicio4, A. Alon-so5, E. Aguado5. 1Universidad de Cádiz, Puerto Real. 2Hospital Clinic, Barce-lona. 3IMIM-Hospital del Mar, Barcelona. 4Universidad de Murcia, Murcia.5Hospital Carlos Haya - Universidad de Málaga, Málaga.

La proteína adaptadora LAT (“Linker for Activation of T cells”)tiene una función prominente en la transducción de señales intrace-lulares generadas a partir del complejo TCR/CD3. Tras la estimula-ción de linfocitos T a través de su TCR se produce la fosforilación devarios residuos de tirosina del adaptador LAT. Esto permite el reclu-tamiento hasta la membrana plasmática de varias proteínas citosóli-cas, implicadas en etapas más tardías de la transducción de señalesintracelulares que conducen a la activación de las células T. Sin embar-go, se sabe muy poco acerca del papel de otras secuencias consensono basadas en tirosina presentes en el adaptador LAT. En este tra-bajo presentamos evidencia de la función de varios motivos consen-so basados en serinas presentes en la secuencia de aminoácidos deLAT. Estos motivos son esenciales para la correcta transducción deseñales de activación dependientes del complejo TCR/CD3, ya quesu mutación impide en células Jurkat la correcta generación de flu-jos de calcio, la activación de la ruta de las MAP-kinasas y la produc-ción de IL-2. Además, estos motivos basados en serina parecen tenerun papel de protección frente a la apoptosis, ya que las células Jur-kat que expresan una forma mutante de LAT para esos motivos sonmás propensas a la muerte celular inducida tras estimulación delcomplejo TCR/CD3. La función de estos motivos no se reduce a seña-les intracelulares tardías, sino que parece afectar a eventos tempra-nos como la activación de la kinasa ZAP-70. En consecuencia, nues-tro trabajo demuestra que secuencias consenso del adaptador LAT,no basadas en tirosina, son esenciales para el desempeño de sus fun-ciones.

O-027EFECTO DIFERENCIAL DE CEPAS PROBIÓTICAS DE BIFIDO-BACTERIUM EN LA POLARIZACIÓN DE CÉLULAS T CD4+. P.López Suárez1, M. Gueimonde Fernández2, I. González Rodríguez2, A.Margolles Barros2, A. Suárez Díaz3. 1Universidad de Oviedo/Instituto deProductos Lácteos de Asturias – Consejo Superior de Investigaciones Cientí-ficas (IPLA-CSIC), Oviedo. 2Instituto de Productos Lácteos de Asturias – Con-sejo Superior de Investigaciones Científicas (IPLA-CSIC). 3Universidad deOviedo.

Objetivo. Estudiar el efecto de distintas cepas de Bifidobacteriumsobre la maduración de células dendríticas derivadas de monocitos(Mo-DCs) y su papel en la polarización de linfocitos CD4+ hacia célu-las efectoras o reguladoras.

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Material y métodos. El efecto de las bifidobacterias sobre los nive-les de citocinas en cultivos de Mo-DCs, células mononucleares de san-gre periférica (PBMCs) y co-cultivos de Mo-DCs con linfocitos T vír-genes se cuantificó mediante ensayos citométricos multianálisis. Laexpresión de marcadores de maduración en Mo-DCs (HLA-DR/CD80/CD86/CD1a) y de células Treg (CD25/Foxp3/CD127) seestudió mediante citometría de flujo.

Resultados. Todas las cepas de bifidobacterias estudiadas (n=20)indujeron la maduración de Mo-DCs, pero mostraron importantesdiferencias en la producción de citocinas (IL-12p70, IL-10, TNFα, IL-6, IL-8 e IL-1b). Así, B. bifidum LMG13195 y DSM20239 presentaronuna relación IL-1‚/IL-12 elevada y niveles bajos de TNFα/IL-10 e IL-10/IL-12, lo que sugería su capacidad para inducir células Th17, mien-tras que B. breve BM12/11 y BM13/14 presentaron una relaciónTNFα/IL-10 alta e IL-10/IL-12 baja, indicativo de perfil Th1. De acuer-do con estos resultados, el cultivo de PBMCs con las mismas cepasmostró diferencias importantes en la capacidad de inducir citocinas.En particular, B. bifidum IF10/10, A8, DSM20239 y LMG13195 indu-jeron los mayores niveles de IL-17, así como una baja producciónde IFNγ y TNFα, lo que sugería un perfil Th17. Por el contrario, B.animalis Bb12, B. breve BM12/11 y B. bifidum KCTC5082 mostraronmayor inducción de TNFα e IFNγ, indicativa de una polarizaciónTh1. Estos resultados se confirmaron analizando la producción decitocinas por linfocitos CD4+CD45RA+ co-cultivados con Mo-DCsmadurados con 5 cepas seleccionadas de bifidobacterias. Sin embar-go, el análisis de la población de células Treg inducidas tras los co-cultivos, mostró que las cepas de B. bifidum que habían inducidomenor producción de TNFα e IFNγ, y mayor de IL-17, generaban unelevado porcentaje de células CD25high/CD127low/Foxp3+, sugirien-do una respuesta reguladora.

Conclusiones. Bifidobacterium sp. es capaz de madurar Mo-DCs,induciendo un perfil de citocinas específico de cepa que conduciría ala polarización de linfocitos T hacia células efectoras o reguladoras,potencialmente útiles en la selección de cepas probióticas con aplica-ción clínica o biotecnológica.

O-028PAPEL DE LAS SUBUNIDADES CATALÍTICAS DE PI-3 CINASAP11ALFA Y P110DELTA EN LA COESTIMULACIÓN POR ICOS(INDUCIBLE COSTIMULATOR, CD278). Y.Y. Acosta1, M.P. Zafra1,G. Ojeda2, P. Portolés2, J.M. Rojo1. 1Centro de Investigaciones Biológicas,CSIC, Madrid. 2Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud CarlosIII, Majadahonda.

Objetivo. ICOS por linfocitos T activados. El motivo Y191MFMde su región citoplasmica une subunidades reguladoras de PI3-cinasade clase IA (p85α, p50-55α, p85β). Aunque las células T expresan p110αy p110δ, y se sabe que p110δ es importante en la activación de linfo-citos T por TCR/CD3, ICOS coprecipita preferentemente la subunidadcatalítica p110α. Aquí se analiza en distintas células la asociación dep110α a ICOS, y el papel de p110α y p110δ en la activación porTCR/CD3, en la coestimulación por ICOS, y en señales exclusivas deICOS.

Material y métodos. Se ha analizado la co-precipitación de p110αy p110δ con subunidades reguladoras de PI3-cinasa de clase IA en dis-tintos tipos de linfocitos T CD4+, incluyendo linfocitos de bazo de ratón.Además se ha estudiado mediante siRNA e inhibidores selectivos elpapel de p110α y p110δ en la coestimulación por ICOS de la activación

por TCR/CD3 y en los cambios morfológicos y en el citoesqueleto deactina inducido por ICOS.

Resultados. La asociación selectiva de p110α a ICOS se debe a laco-precipitación preferente de esta subunidad catalítica con las subu-nidades reguladoras en líneas de células T CD4+ o en linfocitos T CD4+

de bazo. El silenciamiento tanto de p110α como de p110δ inhibe par-cialmente la activación (fosforilación) temprana de Akt/PKB induci-da por anti-CD3, particularmente cuando se coestimula con anti-ICOS.Curiosamente, el silenciamiento de p110α aumentó, y el de p110δ inhi-bió la activación de Erk. Los inhibidores de p110α o de p110δ bloquea-ron la activación por TCR, con o sin ICOS, de la fosforilación de Akt yErk o la secreción de IL-4. En cambio, sólo los inhibidores de p110αinhibieron los cambios morfológicos (alargamiento) inducido por ligan-dos de ICOS en linfocitos T.

Conclusiones. Estos resultados confirman datos previos sobre elpapel de p110δ en la activación de linfocitos T, pero también muestranque p110α es esencial para la activación óptima de linfocitos T. Ade-más, la abundancia y actividad de las subunidades catalíticas de PI3-cinasa regulan de modo diferente distintas vías de la señalización porICOSe s una molécula coestimuladora de la familia de CD28 expre-sada típicamente.

O-029T REGULADORAS NATURALES COESTIMULADAS A TRAVÉSDEL REGULADOR DE COMPLEMENTO CRRY/P65 MANTIENENSUS PROPIEDADES IN VITRO Y ATENUAN LA ARTRITIS INDU-CIDA POR PROTEOGLICANO. P. Portolés1, G. Ojeda1, E. Pini1, C.Eguiluz1, M. Montes-Casado1, F. Broere2, W. Van Eden2, J.M. Rojo3.1Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III, Majadahon-da. 2Utrecht University, Utrecht, Netherlands. 3Centro de InvestigacionesBiológicas, CSIC, Madrid.

Las células T reguladoras (Treg) CD4+CD25+ contribuyen de for-ma importante a la tolerancia y a la homeostasis inmune; sin embar-go, su potencial terapéutico está dificultado por sus propias caracte-rísticas. Las señales emitidas por el regulador de complemento muri-no Crry/p65, homólogo funcional de CD46 humano, aumentan la pro-liferación de células CD4+ in vitro.

Objetivos. En este estudio, hemos investigado el efecto del coes-tímulo mediado por Crry/p65 sobre la expansión y función de célu-las Treg naturales, y su capacidad para mejorar la artritis inducida porproteoglicano (PGIA) en ratones Balb/c, un modelo de enfermedadinflamatoria en el que el papel de las Treg naturales no está bien esta-blecido.

Métodos. Treg naturales obtenidas de ratones Balb/c fueron acti-vadas in vitro y coestimuladas a través de Crry/p65. Las células expan-didas fueron caracterizadas por citometría de flujo y se ensayó su efec-to supresor sobre la proliferación in vitro de células T. Se estudió el efec-to terapéutico potencial de esta población comparada con la poblaciónTreg natural en el modelo de PGIA en ratones Balb/c. Hemos analiza-do el grado de enfermedad, la histología y el isotipo de anticuerposAg-específicos, la respuesta in vitro de células T y la presencia de Tregen las extremidades de los animales.

Resultados. El coestímulo de Crry facilitó la expansión in vitrode Treg naturales manteniendo su fenotipo y propiedades supreso-ras. Las células Treg naturales CD4+CD25+ coestimuladas in vitroa través de Crry mantuvieron sus propiedades supresoras in vivo,produciendo un efecto de mejoría de la inflamación en el modelo

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de PGIA que es mas duradero que el efecto de Treg naturales. Latransferencia de Treg expandidas a través de coestímulo de Crrysuprimió las respuestas T y B-dependientes en animales en los quese había inducido artritis por proteoglicano, cambiando el patrónde isotipo patogénico y disminuyendo la secreción Ag-dependien-te de IFN-γ, IL-12, IL-17 y otras citoquinas implicadas en inflama-ción.

Se detectó un incremento de células Foxp3+ en las extremida-des de animales tratados con Treg coestimuladas a través de Crry.

Conclusión. El coestímulo mediado por Crry facilita la expansiónin vitro de células Treg naturales purificadas, mientras mantiene suspropiedades supresoras in vitro e in vivo en el modelo de artritis indu-cida por proteoglicano. Estos resultados resaltan el potencial de la molé-cula reguladora de complemento Crry/p65 para coestimular y expan-dir Treg naturales con la capacidad de suprimir enfermedad en condi-ciones de inflamación artrítica crónica.

O-030ESTUDIO DE ALTERACIONES FUNCIONALES EN LAS CELU-LAS INKT ASOCIADO AL ENVEJECIMIENTO. M.D.C. Campos1,I. Gayoso1, E. Peralbo1, A. Pera1, N. Rojas-Colonelli1, R. Tarazona2, R.Solana1. 1Hospital Universitario Reina Sofia de Córdoba, Córdoba. 2Universi-dad de Extremadura.

La respuesta inmune se encuentra afectada con la edad, procesodenominado inmunosenescencia. Existen estudios prévios que inclu-yen a las células “invariantes NKT” (iNKT) dentro de las poblacio-nes afectadas por la inmunosenescencia. Las células iNKT en huma-nos se caracterizan por la expresión del receptor NK CD161 y de unreceptor T (TCR) formado por una cadena Vα24JαQ y una cadenaVβ11 que reconoce antígenos glucolopídicos presentados por unMHC-I no clásico denominado CD1d. Existen 3 subpoblaciones decélulas NKTi en función de la expresión de los receptores CD4 y CD8:NKT-CD8+, iNKT-CD4+ e iNKT-Dobles Negativas. Tras la activaciónlas células iNKT proliferan liberando citoquinas tipo Th1 y Th2. Lascélulas iNKT actúan durante la respuesta innata del sistema inmuney está implicadas en la eliminación de tumores y en enfermedadesautoinmunes.

Nuestro trabajo pretende estudiar ex vivo el fenotipo y función,secreción de citoquinas y proliferación, de células iNKT procedentesde donantes jóvenes y ancianos sanos.

Para ello se obtuvieron las PBMCs de donantes jóvenes (18-35años) y ancianos (70-95 años) sanos. La identificación de las iNKT seanalizó mediante citometría de fujo. Se utilizaron AcMo anti-Vα24,anti-Vβ11, CD8, CD4, y otros marcadores para identificar las célu-las NKTi. Para analizar la secreción de citoquinas las PBMCs se incu-baron con PMA, Ionomicina y Brefeldina durante 6 horas La capa-cidad proliferativa se determinó mediante el marcaje con CFSE, sem-bradas en medio de cultivo durante 5 días con IL-2 y KRN (estímu-lo específico de NKTi in vitro semejante al α-Galactosil Ceramida queestá identificado como un potente inductor de la activación de lascélulas iNKT vía TCR).

Cuando analizamos la secreción de citoquinas tras la estimulacióncon KRN vemos una disminución de la secreción de IFN-γ en célulasNKTi de ancianos. Este descenso es significativo en las subpoblacio-nes NKTi-CD8 y NKTi-CD4.

En cuanto al estudio de proliferación con CFSE, transcurridos 5días de cultivo in vitro, observamos una mayor proliferación de las

células iNKT de donantes jóvenes que en ancianos. Con respecto a lasdiferentes subpoblaciones de iNKT, vimos como las células CD4-NKTson las que principalmente proliferan en jóvenes y las únicas que pro-liferan en ancianos.

El descenso de la capacidad proliferativa de las células iNKT deancianos y el descenso de producción de IFN-γ indican que las célulasiNKT se encuentran entre las poblaciones linfocitarias afectadas por lainmunosenescencia. Y además dichos cambios podrían alterar la fun-ción y respuesta de las células NKTi en ancianos.

O-031EL IFNα FOMENTA EL DESARROLLO DE CÉLULAS T CD8MEMORIAS ALTAMENTE RESPONDEDORAS. S. Hervás-Stubbs,M.D.C. Ochoa, J. Dubrot, A. Palazón, I. Martínez-Forero, U. Manche-ño, I. Gabari, I. González, J.I. Riezu-Boj, E. Larrea, I. Melero. Centro deInvestigación Médica Aplicada (CIMA), Pamplona.

Objetivos. Estudios previos realizados en el modelo del ratónhan demostrado que las citoquinas pro-inflamatorias, tales comola IL-12 y el IFN-α/β, actúan directamente sobre los linfocitos TCD8 que han reconocido específicamente a sus antígenos, afectan-do aspectos cruciales de su diferenciación hacia células efectorasy/o memorias. Recientemente hemos mostrado que el IFN-α pro-porciona también señales directas a linfocitos T CD8 humanos naï-ve favoreciendo su diferenciación a células efectoras. Nuestrosiguiente objetivo fue investigar sin el IFN-αpodría estar implica-do en la diferenciación de los linfocitos T CD8 humanos a célulasmemorias.

Material y métodos. Se aislaron mediante autoMACS (selecciónnegativa) linfocitos T CD8 humanos totales a partir de PBLs y, tras tin-ción con anticuerpos frente a CD27 y CD45RA, se separaron linfocitosT CD8 naïves (CD27+CD45RA+) mediante FACS. Los linfocitos purifi-cados fueron teñidos con CFSE y estimulados con bolitas de látex quellevaban unidos anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28, en presencia oausencia de IFN-α. Tras 6 días de estimulación, las células que habí-an proliferado (CFSElow) se aislaron mediante FACS y se mantuvieronen cultivo (20 días) en presencia de IL-15. Tras este periodo, los linfo-citos fueron estimulados por segunda vez con antígeno (mimetizadopor las bolitas anti-CD3/CD28)

Resultados. Los linfocitos T CD8 humanos naïve estimuladosen presencia del IFN-α adquieren muchos de los marcadores feno-típicos típicos de los linfocitos T centrales memorias(CD45RAlowCXCR3hi CD62LhiCCR7hiIL-7RαhiCD27hiCD28hi). El IFN-α regula positivamente la expresión de IL-15Rα, Eomesodermin yT-bet. Como consecuencia del incremento de la expresión de IL-15Rα, y de IL-7Rα, los linfocitos estimulados en presencia de IFN-α muestran una mayor capacidad proliferativa cuando se estimu-lan con IL-15 o IL-7. Tras la segunda exposición con el antígeno, loslinfocitos T CD8 inicialmente estimulados en presencia de IFN-αproliferan más y muestran una mayor capacidad efectora (alta pro-ducción de IFN-γ, Granzima B y TRAIL) tras una segunda estimu-lación antigénica que aquellos linfocitos que habían sido estimula-dos en ausencia de IFN-α.

Conclusiones. Nuestros resultados solidamente sugieren que lasseñales derivadas del reconocimiento del IFN-α durante el primerencuentro de los linfocitos T CD8 humanos con el antígeno son críti-cas para el desarrollo y la calidad de la respuesta T CD8 memoria sub-siguiente.

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SESIÓN 4: CÉLULAS NK

Moderadores: Raquel Tarazona (Cáceres)Rafael Solana (Córdoba)

O-032CÉLULAS NK DE TIMO HUMANO: ¿UNA SUBPOBLACIÓN DECÉLULAS NK DIFERENTES? L. Hidalgo1, A. Entrena1, V.G. Martí-nez1, J. Valencia1, M.N. Vázquez1, A. Zapata2, R. Sacedón1, C. Hernán-dez-López1, A. Varas1, Á. Vicente1. 1Facultad De Medicina UniversidadComplutense, Madrid. 2Facultad De Biología Universidad Complutense,Madrid.

Objetivos. Las células NK son las principales células efectoras dela inmunidad innata y desempeñan un papel fundamental en las res-puestas antivirales y antitumorales. Si bien tanto en humanos como enratón, se asume que la médula ósea es el principal sitio de maduraciónde las células NK, diferentes órganos como timo, ganglio linfático,intestino,o útero soportan su diferenciación, indicando que la produc-ción de las células NK humanas tiene lugar en múltiples localizacio-nes anatómicas. En relación con el timo humano, son muy escasoslos datos existentes en la literatura. En el presente estudio se ahondaen las características fenotípicas y funcionales de las células NK detimo humano en comparación con las subpoblaciones de células NKCD56LowCD16+ y CD56BrightCD16– de sangre periférica.

Material y Métodos. Los análisis fueron realizados en muestrasde timo humano, procedentes de niños sometidos a cirugía cardiacacorrectora, y en muestras de sangre periférica de donantes sanos. Lascélulas NK aisladas mediante separación electrónica por sorting o ais-lamiento inmunomagnético, fueron utilizadas para la determinacióndel repertorio de receptores, perfiles génicos, capacidad citolítica y per-files de producción de citocinas utilizando para ello técnicas de cito-metría de flujo, PCR cuantitativa, técnicas de citotoxicidad y ELISA.

Resultados. Las células NK tímicas activadas con IL-12 e IL-15exhibieron una escasa capacidad citotóxica similar a la exhibida porlas células CD56Bright periféricas siendo a su vez, en ambos casos infe-riores a los resultados obtenidos para la subpoblación CD56Low. Encorrelación, el perfil de expresión de distintos marcadores de activa-ción de las células NK fue similar a la de la subpoblación CD56Bright desangre periférica. Por el contrario, en el caso de la producción de IFNγ,el comportamiento de las células NK de timo se asemejaba a aquél queexhibían las células CD56Low de sangre. En correlación los niveles detránscritos para T-BET, fueron 3 veces inferiores a los de las célulasCD56Bright de sangre.

Conclusión. A tenor de los resultados obtenidos, las células NKde timo humano presentan características diferenciales respecto a lasdos subpoblaciones de células NK descritas en periferia, pudiendorepresentar, una población con características funcionales distintas.

O-033REGULACIÓN DE LA MIGRACIÓN DE CÉLULAS NK POR LAACTIVACIÓN DE NKG2D. E. Serrano Pertierra, E. Cernuda Moro-llón, C. López Larrea. Hospital Universitario Central de Asturias, Oviedo.

Objetivos. NKG2D es un receptor transmembrana expresado fun-damentalmente en células Natural Killer (NK) y T CD8+. La liberaciónde sus ligandos solubles resulta en un descenso en la expresión deNKG2D, uno de los mecanismos propuestos de evasión de la respues-

ta inmune por células tumorales, aunque la existencia de mecanismosalternativos no ha sido explorada. En el presente estudio analizamosla regulación de la migración de las células NK por activación deNKG2D, y exploramos el papel de las Rho-GTPasas en este efecto.

Métodos. Células NKL se preincubaron con anticuerpos anti-NKG2D o ligandos o IgG como control. Los ensayos de migración fue-ron realizados en transwell recubiertos con ICAM-1 o fibronectina, enpresencia o ausencia de CXCL12 como quimioatrayente. La activi-dad de miembros de la familia de proteínas de las Rho-GTPasas comoRac1, RhoA y Cdc42 fue analizada mediante ensayos de pull down yposterior western blot. La implicación de la activación de Rac fue ana-lizada mediante la inhibición farmacológica de la proteína.

Resultados. La activación de NKG2D inhibe la migración de lascélulas NK tanto en los ensayos de migración randomizada como dequimiotaxis. Rac1 y Cdc42 se activan downstream NKG2D, mientrasque RhoA se inhibe. La estatmina, una proteína implicada en la regu-lación de la dinámica de microtúbulos, y MLC (Myosin Light Chain)se fosforilan tras la activación de NKG2D. Se observa también una dis-minución en la fosforilación de ERM (Ezrin-Radixin-Moesin). Se hadescrito que estas proteínas están implicadas en la regulación de lapolarización de linfocitos. La inhibición de la activación de Rac dismi-nuye la fosforilación de estatmina pero no es capaz de rescatar la migra-ción celular en las diferentes dosis estudiadas, aunque se observa unincremento en la migración basal.

Conclusiones. La activación de NKG2D por anticuerpos especí-ficos o ligandos inhibe la migración de las células NK. El entrecruza-miento con anti-NKG2D regula la actividad de miembros de las Rho-GTPasas e inicia cascadas de señalización que pueden estar implica-das no sólo en la formación de la sinapsis inmunológica sino tam-bién en la migración y polarización celular.

O-034MÚLTIPLES INTERACCIONES LIGANDO-RECEPTOR CONTRO-LAN EL RECONOCIMIENTO Y ELIMINACIÓN DE CÉLULAS DEMELANOMA. S. Morgado1, J.G. Casado1, B. Sánchez-Correa1, I. Gayo-so2, R. Solana2, G. Pawelec3. 1Facultad de Veterinaria. Universidad de Extre-madura, Cáceres. 2Facultad de Medicina Universidad de Córdoba(3) Center forMedical Research, University of Tübingen.

Objetivos. Las células Natural Killer (NK) son un componente delsistema inmune innato que contribuyen a la respuesta inmune frentea tumores, puesto que son capaces de matar células tumorales sin unainmunización previa. El papel de las células NK en el reconocimien-to y eliminación de células de melanoma es un importante punto deestudio en la actualidad, dado que el melanoma es considerado la for-ma más letal de cáncer de piel. Por tanto, el conocimiento de las inter-acciones entre los ligandos presentes en células tumorales y los recep-tores activadores de las células NK, como NKG2D, NCRs y DNAM-1,es esencial para introducir en la práctica clínica protocolos de inmu-noterapia basados en células NK.

Material y métodos. Hemos analizado mediante citometría deflujo, la expresión superficial de ligandos para los receptores activa-dores de las células NK en un amplio panel de líneas celulares (n=124)procedentes de "European Searchable Tumour Cell Line and Data Bank"(ESTDAB, http://www.ebi.ac.uk/ipd/estdab/). Con objeto de anali-zar la activación de las células NK se realizaron ensayos de desgranu-lación, analizando la expresión de CD107a/b en la superficie de lascélulas NK después de la activación frente a células de melanoma. Los

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experimentos de bloqueo se realizaron incubando las células con anti-cuerpos monoclonales contra MICA/B o NKG2D. Por último, la detec-ción de MICA soluble en el sobrenadante de cultivo de las líneas celu-lares de melanoma se realizó utilizando el kit DuoSet ELISA Develop-ment kit (R&D Systems) de acuerdo con las instrucciones del fabrican-te.

Resultados. El análisis de los ligandos para NKG2D en nuestropanel de líneas celulares de melanoma muestra que más del 80% delas líneas expresa MICA/B, y en menor porcentaje, ULBPs. Hemosestudiado la contribución de NKG2D a la lisis de las células de mela-noma utilizando la línea celular humana de NK, NKL, y células NKpoliclonales. La lisis mediada por células NK de la mayoría de las líne-as de melanoma fue dependiente de NKG2D, aunque la lisis de algu-nas de las líneas de melanoma, sin expresión o con baja expresión deligandos para NKG2D, fue independiente de NKG2D.

El uso de proteínas quiméricas de los receptores NCR para anali-zar la expresión de los ligandos para NCR en células de melanomamostró que las células de melanoma expresan bajos niveles de estosligandos, principalmente para el receptor NKp44, mientras que el aná-lisis de los ligandos para otros receptores activadores y coestimulado-res puso de manifiesto que el 95% expresa ligandos para DNAM-1,la mayoría CD155, mientras que la expresión de CD112 fue menos fre-cuente. Esto concuerda con recientes hallazgos en el papel de los NCRy DNAM-1 en el reconocimiento de las células de melanoma por par-te de las NK.

Nuestros resultados utilizando la línea de melanoma ESTDAB-067, negativa para ligandos de NKG2D, muestra que la línea de célu-las NK, NKL se activa principalmente a través de NCR y DNAM-1, manteniendo que NCRs y NKG2D son los principales receptoresque contribuyen a la lisis de melanoma mediada por NK. Tambiénencontramos que en ausencia de señales inhibidoras de MHC claseI, varios melanomas DNAM-1L+/NKG2DL+ son resistentes a la lisismediada por células NK sugiriendo la existencia de mecanismos deinmunoescape como la liberación de ligandos para los receptoresactivadores, lo que contribuiría a la activación deficiente de las célu-las NK.

Conclusiones. La expresión de ligandos para los receptores acti-vadores de células NK es variable en diferentes líneas de melano-ma y la activación simultánea de varios receptores activadores con-tribuye a la lisis eficiente de las células de melanoma. Además, laconexión entre DNAM-1 y NKG2D podría contribuir a la activa-ción de las células T. Por tanto, la caracterización fenotípica de lascélulas de melanoma y el desarrollo de estrategias de inmunoterapiapara incrementar la expresión de ligandos para receptores activado-res de NK contribuiría a la creación de terapias más efectivas parapacientes individuales.

O-035REGULACIÓN EPIGENÉTICA DEL RECEPTOR ACTIVADOR DENKS, NKG2D/DAP10. A. Fernández-Sánchez, B. Suárez-Álvarez, C.López-Larrea. Hospital Universitario Central de Asturias, Oviedo.

Objetivos. NKG2D es un receptor activador expresado en célulasNK, linfocitos T CD8αβ y γδ en humanos pero no en linfocitos T CD4.Sin embargo, una población de linfocitos T CD4 NKG2D+ aparece endeterminadas situaciones patológicas tales como infecciones, enferme-dades autoinmunes y en cáncer. La señalización intracelular mediadapor NKG2D así como su expresión en la membrana celular requiere

exclusivamente de la molécula adaptadora DAP10 en humanos. Lacaracterización de los factores que regulan la expresión de NKG2D/DAP10 podría tener un gran interés por sus importantes aplicacio-nes terapéuticas. En este trabajo se han estudiado las modificacionesepigenéticas de los promotores de NKG2D y DAP10 en líneas celula-res (Jurkat, HUT78 y NKL) y en linfocitos de sangre periférica (CD4,CD8 y NK).

Material y métodos. La metilación en los promotores de NKG2Dy DAP10 se ha estudiado mediante técnicas de modificación de ADNgenómico con bisulfito mientras que modificaciones de histonas acti-vadoras (AcH4, AcH3, AcH3K9 y H3K4 3me) e inhibidoras (H3K273 me, H3K9 2me/3me) se han determinado mediante ensayos deinmunoprecipitación de la cromatina (ChIP). Se han analizado lasvariaciones en los niveles de expresión de NKG2D / DAP10 median-te tratamiento con inhibidores de histonas deacetilasas (sirtinol, SB,VPA y TSA) y con inhibidores de DNA metiltransferasas (5azaC yDAC).

Resultados. Se han visto diferencias en el nivel de metilación dela región proximal del promotor de NKG2D entre las posiciones -400y -100, encontrándose metilado en linfocitos T CD4 pero no en CD8 ycélulas NK. Adicionalmente, hemos determinado que modificacionesen las histonas H3 y H4 participan en la regulación de estos genes. Lasmodificaciones asociadas a eucromatina transcripcionalmente activacomo son la AcH3K9 y la H3K4 3me parecen tener un papel destaca-do en la regulación de NKG2D puesto que tienen una presencia nota-ble en linfocitos T CD8, mientras que en linfocitos T CD4 no esta pre-sentes. Confirmando los resultados previos, el tratamiento con inhibi-dores epigenéticos conlleva un aumento en los niveles de expresiónde NKG2D y DAP10.

Conclusiones. En conclusión, determinamos que la expresión deNKG2D/DAP10 puede estar regulada mediante mecanismos epige-néticos y esto puede emplearse como diana farmacológica.

O-036LA EXPRESIÓN DE NKG2D EN LINFOCITOS T CD4+ ES UN MAR-CADOR DE LA SENESCENCIA DEL SISTEMA INMUNE. R. Alon-so Arias1, M.A. Moro García1, I. Cuevas Pérez1, F.M. Suárez García2, J.J.Solano Jaurrieta3, C. López Larrea1. 1Hospital Central de Asturias, Oviedo.2Consejería de Salud y Servicios Sanitarios del Principado de Asturias. 3Hos-pital Monte Naranco.

Objetivos. El proceso de envejecimiento se caracteriza por unaserie de cambios en el sistema inmune. En los linfocitos T los cam-bios se producen fundamentalmente en el compartimento CD8+, mien-tras que no se dispone de marcadores de senescencia bien definidospara los CD4+. La expresión “aberrante” de NKG2D en células CD4+

se ha descrito en determinadas patologías autoinmunes e infecciosascaracterizadas por alto grado de inmunosenescencia. El objetivo deeste estudio fue analizar si la expresión de la molécula NKG2D seencuentra incrementada en las células CD4+ de los individuos de edadavanzada y puede considerarse un marcador de envejecimiento delsistema inmune.

Material y métodos. Se analizó por citometría de flujo la expre-sión de NKG2D en un grupo de 100 ancianos y 50 individuos jóvenes.Se realizó caracterización fenotípica (marcadores activación y diferen-ciación), funcional (respuesta a antígenos, producción de citocinas) yontogénica (cuantificación de TRECs por PCR “real-time”) de la sub-población CD4+NKG2D+.

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Resultados. La mediana del porcentaje de CD4+NKG2D+ en ancia-nos fue significativamente mayor que en individuos jóvenes (5,3% [IR:8,74%] vs 1.4% [IR: 1,7%], p=0,3x10–10). La expresión de CD28 distin-guió dos subpoblaciones de células CD4+NKG2D+ claramente diferen-ciadas. Las CD28+ fueron células muy inmaduras, con alto porcentajede expresión de CD45RA y CD31. Las CD28null, mayoritarias en losindividuos de edad avanzada, presentaron características fenotípicasde células CD4+ muy diferenciadas, con bajos niveles de CD25 y altosde HLA-DR, perforina y granzima B. La respuesta específica de estascélulas CD28nullNKG2D+ frente a CMV no presentó diferencias con res-pecto al resto de las células CD4+, sin embargo fueron significativa-mente menores frente a un antígeno de reciente contacto como la vacu-na de la gripe estacional. Dentro de las células CD4+CD28null la expre-sión de NKG2D se asoció con estadio de diferenciación más avanza-do, presentando estas células mayor producción de IFN-γ en respues-ta a la activación con anti-CD3 (40.56%±13.7% versus 24%±8.8%,p=0.015), un menor umbral de activación y un menor contenido enTRECs.

Conclusiones. La expresión de NKG2D en linfocitos TCD4+CD28null define una subpoblación de células CD4+ con un alto gra-do de diferenciación que caracteriza la senescencia del sistema inmu-nológico.

O-037ALTERACIÓN DE RECEPTORES ACTIVADORES E INHIBIDO-RES EN CÉLULAS NK DE ANCIANOS. I.C. Gayoso Cabada, B. Sán-chez-Correa, N. Rojas, A. Pera, C. Campos, S. Morgado, J. Casado, R.Tarazona, R. Solana Lara. Instituto Maimónides de Investigación Biomédi-ca, Córdoba.

Las células NK son una población heterogénea de linfocitos defi-nidas por un fenotipo de membrana CD3–CD56+ que se caracterizanpor su capacidad para lisar gran variedad de tipos celulares transfor-mados o infectados por virus. Las células NK son un componente muyimportante de la respuesta innata, tanto por su función efectora comopor su función reguladora de la iniciación de la respuesta inmune adap-tativa. Se sabe que el envejecimiento afecta al número y función decélulas NK. Se han definido diferentes cambios en las células NK aso-ciados a la edad como son, el incremento en ancianos del porcentajede células NK, el descenso de la respuesta a IL-2 o el descenso en laproducción de citoquinas. Las células NK poseen receptores de mem-brana encargados de la activación o inhibición de su función citotó-xica. La activación de las células NK está determinada por el balanceentre señales inhibidoras y activadoras procedentes de dichos recep-tores. De esta forma el balance entre señales activadoras e inhibitoriasdetermina la activación de las células NK.

Nuestro trabajo estudia la expresión de receptores activadores einhibidores de la citotoxicidad NK en jóvenes y ancianos y la influen-cia sobre los cambios en la capacidad funcional de las células NK enancianos.

Para la realización de este estudio se tomaron las PBMCs dedonantes voluntarios jóvenes (18-35 años) y ancianos (70-95 años)sanos. Se identificaron las células NK por citometría de flujo y se ana-lizó la expresión de los receptores NK activadores e inhibidores enlas subpoblaciones de células NK de voluntarios jóvenes y ancia-nos sanos

Los resultados muestran un descenso en la expresión del recep-tor NKp30 y del receptor DNAM1 en células NK de ancianos. Tam-

bién encontramos un incremento del receptor KIR2DL1 en célulasNK de ancianos. La alteración del patrón de expresión de receptoresactivadores e inhibidores podría provocar un descenso en la capa-cidad citotóxica en células NK de ancianos. Además, el descenso dela expresión de NKp30 y DNAM1 puede contribuir no solo al des-censo en la capacidad citotóxica natural de estas células, sino que,dado el importante papel de este receptor en la interacción de célu-las NK con células dendríticas, puede influir en las alteraciones en lainiciación de la respuesta inmune adaptativa observadas en ancia-nos.

O-038EFFECTS OF DACLIZUMAB, BASILIXIMAB, THYMOGLOBULINAND CAMPATH-1H ON HUMAN NATURAL KILLER CELLS. E.Sarmiento Marchese1, D. Stauch1, J. Carbone2, K. Kotsch1. 1Institute ofMedical Immunology, Charité Universitätsmedizin Berlin, Germany. 2Gre-gorio Maranon University Hospital, Madrid.

Introduction. MoAb against the anti-IL2Ralpha-chain (anti-CD25)have been efficiently implemented in transplantation induction protocolsincluding the humanized antibody daclizumab (DAC) as well as thechimeric antibody basiliximab (BAS). Alternatively, rabbit anti-thymocyteglobulin (rATG) or the humanized anti-CD52 MoAb (Campath-1H)are used.

Aim and methods. As natural killer (NK) cells are functionallyrelevant for an effective clearance of opportunistic viral infectionsand anti-tumor activity post transplantation, we analyzed the effectsin vitro of these agents at a concentration of 10ug/ml on NK cellphenotype, viability, cytokine release (IFNγ, TNFα), apoptosis(FasL) and activation (CD25) by flow cytometry and real-time RT-PCR.

Results. Within the first hour of co-incubation with rATG andCampath-1H, NK cells (CD3–CD56+) revealed a significant mRNAexpression of IFNg (40 fold) and TNFa (30 fold) in contrast to DACand BAS. Gene expression data were confirmed by illustrating thatrATG and Campath-1H resulted in an early (1h) and significantsecretion of IFNg (133pg/ml for rATG; 68 pg/ml for Campath-1H)and TNFα (313 pg/ml for rATG; 223 pg/ml for Campath-1H) detectablein the supernatant. Whereas induction of TNFa reached the highestlevel after 6h (404 and 582 pg/ml, respectively) and declined rapidly,IFNg secretion was still significantly elevated after 24h (731 and 828pg/ml). In contrast, DAC and BAS did not induce significant cytokinerelease. Both, rATG and Campath-1H induced necrosis (70,7% and69,5%) and apoptosis (14,6% and 14,2%) compared with DAC andBAS (<2% respectively). Specially, FcγRIII (CD16) present inCD56dimCD16+NK, ist targeted with rATG and Campath-1H showinga complete depletion. FasL (7 fold) and CD25 mRNA expression wasalso significantly enhanced. Whereas FasL expression declined rapidly,CD25-mRNA illustrated constant enhancement after 24 hourscorresponding with the increase of CD3-CD56+CD25+NK cells after24 hours: from 0,5% in the control to 17% with rATG and 23% withCampath-1H.

Conclusion. Therapeutic anti-CD25 antibodies do not havedeleterious effects on NK cells whereas rATG and Campath-1H inducescell apoptosis, necrosis and pro-inflammatory activity of NK cells. Thelatter observation needs to be considered for the risk of cytokine releasesyndrome after antibody application and for the selection of the optimaltherapeutic strategy in clinical settings.

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Funds. European Molecular Biology Organization (ERA-EDTA),Spanish National Health Ministry (FIS PI 081430) and the MedicalImmunolgy Institut Charitè, Berlin, Germany.

O-039INHIBITION OF NKG2D EXPRESSION IN NK CELLS BY CYTO-KINES SECRETED IN RESPONSE TO HUMAN CYTOMEGALO-VIRUS INFECTION. A. Muntasell1, G. Magri1, D. Pende2, A. Angu-lo3, M. López-Botet1. 1Universidad Pompeu Fabra, Barcelona. 2Istituto Nazio-nale per la Ricerca sul Cancro. 3Institut d'Investigacions Biomèdiques AugustPi i Sunyer.

The NKG2D receptor activates NK cell cytotoxicity and cytokineproduction upon recognition of self-molecules induced by cellularstress under different conditions such as viral infections. The importanceof NKG2D in the immune response to Human Cytomegalovirus (HCMV)is supported by the identification of several viral molecules that preventthe expression of NKG2D ligands by infected cells. In this study wereport that, paradoxically, a significant, selective and transient reductionof NKG2D expression on NK cells is detected during HCMV infectionof peripheral blood mononuclear cells (PBMC). Antagonizing type IIFN, IL-12 and IFNÁ prevented HCMV-induced down-regulation ofsurface NKG2D. Moreover, treatment of purified NK cells with recombinantIFN‚1 and IL-12 mimicked the effect, supporting a direct role of thesecytokines in regulating NKG2D surface expression in NK cells. Theloss of NKG2D expression selectively impaired NK cell cytotoxicityagainst cells expressing NKG2D-ligands, but preserved the responsetriggered through other activating receptors. These results support thatdown-regulation of NKG2D expression on NK cells by cytokines witha key role in anti-viral immune response may constitute a physiologicalmechanism to control NK cell reactivity against normal cells expressingNKG2D ligands in the context of inflammatory responses to viralinfections.

O-040ANÁLISIS DE RECEPTORES NK Y FUNCIONALIDAD EN UNPACIENTE CON LINFOCITOSIS NK DE FENOTIPO CD16+/CD56–.L. Arriarán, A. Muntasell, M. Sáenz, A. López De Arcuate , M. López-Botet , P. Echaniz, E. Cuadrado. Laboratorio de Inmunología del HospitalDonostia.

Caso clínico. Varón de 42 años clínicamente asintomático, sin ade-nopatías ni visceromegalias con serología POSITIVA para AcHbc, VHC,VHA, Epstein-Barr, Toxoplasma, Citomegalovirus, Herpes simple yVaricela Zoster. VIH: NEGATIVO.

El paciente presenta una linfocitosis de 13.000 cel/ul con unapoblación expandida (67%) de linfocitos NK de fenotipoCD16+/CD56–/ CD57+/CD2+/CD3–. El análisis de receptores NK(NKG2D, NKG2C, NKG2A, NKp30, NKp46, NKp44, ILT2, KIR,DNAM) en dicha población mostró un marcaje alto y uniforme paraNKG2A, ILT2, KIR y DNAM así como la ausencia o baja expre-sión de los receptores NCR: NKp30 y NKp46. Las células expan-didas presentaban marcadores de activación temprana (CD69), eranpositivas para HLA-DR. La expresión de mediadores de citotoxici-dad (perforina y granzima) se comprobó mediante tinción intraci-toplásmica. Para analizar la actividad citotóxica de la población NKexpandida se empleó un ensayo de degranulación por citometría

de flujo (expresión de CD107a). Los PBMC del paciente se incuba-ron con 50UI/ml de rIL-2 y al día siguiente se cultivaron con dife-rentes células dianas, no observándose defectos en la función. Trasel cultivo de las células del paciente con IL-2+ IL – 15 se constató dela expresión de los receptores NKp30 y NKp46 en las células delpaciente.

Conclusiones. Los estudios realizados indican un origen mono-clonal de la expansión de células NK con un fenotipo heterogéneo paraalgunos KIRs. La falta de expresión de receptores NCR en la poblaciónexpandida, no excluye su actividad citotóxica ya que estas células soncapaces de expresarlas en respuesta a citocinas.

SESIÓN 5: INMUNIDAD E INFECCIÓN

Moderadores: Miguel López Botet (Barcelona)Maria Montoya (Barcelona)

O-041LAS CÉLULAS T REGULADORAS BLOQUEAN LA ACTIVIDADINMUNOESTIMULADORA DE LA IL-12 Y LA RESPUESTA INMU-NE FRENTE A ANTÍGENOS VIRALES EN LA INFECCIÓN CRÓ-NICA POR EL VIRUS DE LA HEPATITIS DE LA MARMOTA(WHV): REVERSIÓN PORINHIBIDORES DE TGF-µ. I. OtanoAndrés1, J.D. Dotor1, A. Benito1, J. Crettaz1, C. Olagüe1, S. Menne2, J.Prieto1, G. González-Aseguinolaza1. 1Universidad de Navarra, Pamplo-na. 2Cornell University, , United States.

Introducción. El tratamiento con análogos de nucleósidos/nucleótidos de la infección crónica por virus de la hepatitis B (VHB)ha de mantenerse durante largo tiempo ya que estos fármacos sonpoco eficaces en la inducción de una respuesta inmune antiviral.Ello comporta costos elevados y limita la eficacia del tratamiento.En un estudio reciente hemos comprobado que la expresion intra-hepática de IL-12 durante 40 días induce una respuesta inmune anti-viral capaz de eliminar la infeccion vírica en marmotas con hepati-tis cronica por WHV. Sin embargo, en animales con carga viral igualo por encima de 1010 pv/ml el tratamiento con IL-12 no logra indu-cir una inmunidad protectiva. Se hace necesario el desarrollo deestrategias capaces de vencer la anergia inmune que también estápresente en aquellos pacientes con hepatitis crónica B que presen-tan una alta carga viral. En este trabajo hemos analizado la activi-dad de las Treg en el modelo de la hepatitis de la marmota y loscambios en la función de las Treg tras la administración de un blo-queante de TGF-β.

Metodos. Se cuantificaron mediante citometria de flujo (FACS) lascélulas Treg de sangre periférica de marmotas crónicamente infecta-das con WHV. Las Treg fueron purificadas utilizando bolitas inmuno-magnéticas y se estimularon con anticuerpos anti CD3 analizándosela proliferación celular con CFSE y la produccion de citoquinas median-te PCR cuantitativa. Se evaluó in vitro e in vivo el efecto del TGF-β sobrela función de Treg utilizando un péptido bloqueante de esta citoquina(P17).

Resultados. Se observó que las Treg purificadas de sangre perifé-rica de marmota ejercen un potente efecto inhibidor sobre la actividadde los linfocitos T efectores. El P17 fue capaz de bloquear in vitro estaactividad inhibidora. Mientras que los linfocitos de sangre periféricade marmotas con viremias superiores a 1010 vg/ml no responden con


producción de IFNgamma a la estimulación con IL-12, la administra-ción a estos animales del péptido P17 por vía intraperitoneal restau-ró la capacidad de los linfocitos T de producir IFNgamma tras adiciónde IL-12.

Conclusión. Los animales con infección crónica por hepadna-virus con una viremia mayor de 1010 pv/ml presentan un aumentode la actividad Treg causante de la inhibición de las respuestas efec-toras antivirales. El TGF-β juega un papel relevante en esta anergiainmunológica. El bloqueo de TGF-β puede contribuir a facilitar larespuesta al tratamiento inmunomoestimulante de la hepatitis cró-nica B.

O-042ASOCIACIÓN DEL PORCENTAJE DE LINFOCITOS T CD8+ CMV-ESPECÍFICOS CON FENOTIPO “EMRA” CON LA DURACIÓNDE LA VIREMIA POR CITOMEGALOVIRUS EN TRASPLANTA-DOS DE ÓRGANO SÓLIDO. S. Cantisán Bohórquez1, J. Torre-Cis-neros1, R. Lara Contreras1, I. Gayoso Cabada1, A. Rodríguez-Benot1,F. Santos Luna1, M. Casal Román1, M. Montejo Baranda3, R. SolanaLara1. 1Instituto Maimónides para la Investigación Biomédica de Córdoba(IMIBIC)-Universidad de Córdoba-Hospital Reina Sofía, Córdoba. 2Hospitalde Cruces, Bilbao.

Introducción. Las células T CD8+ effector-memory (EM) (CD45RA-CCR7–) intervienen durante la infección aguda por citomegalovirus(CMV), mientras que, una vez resuelta la viremia, un porcentaje deestas células re-expresan CD45RA, denominándolas como “EMRA”(CD45RA+CCR7–). Las células “EMRA” han sido descritas reciente-mente como linfocitos memoria de larga vida, y parecen representar alas verdaderas células memoria en la infección por CMV.

Objetivo. Estudiar si existe relación entre el porcentaje de célu-las EMRA (CD45RA+CCR7–, CD45RA+CD28– y CD45RA+CD27–) y laduración de la viremia por CMV.

Material y método. Estudio transversal de 42 pacientes HLA-A*02 trasplantados de órgano sólido. Para estudiar los linfocitosT CD8+ CMV-específicos se extrajo una muestra de sangre periféri-ca de cada paciente, entre 1-3 años tras el trasplante. Los PBMCs seincubaron con pentámeros CMVpp65 HLA-A*0201(APC) en com-binación con anticuerpos monoclonales frente a CD8, CD28, CD27,CCR7 y CD45RA. Se analizó por citometría de flujo de cuatro colo-res.

Se utilizó el test de Spearman para determinar la existencia decorrelación y la regresión lineal múltiple para determinar los factoresasociados con el porcentaje de células T EMRA.

Resultados. Se observó correlación estadísticamente significa-tiva entre la duración de la viremia por CMV tras el trasplante y elporcentaje de células T CD8+ CMV-específicas CD45RA+CD27– (r =0.609; p = 0.004), CD45RA+CD280– (r = 0.579; p = 0.008) yCD45RA+CCR7– (r=0.488; p=0.029). En el análisis multivariante, porcada incremento de 10 días en la duración de la viremia de CMVlos porcentajes de CD45RA+CD27–, CD45RA+CD28– y CD45RA+CCR7-

incrementaban un 5.58% (p=0.001), 5.35% (p = 0.001) y 4.49% (p =0.012), respectivamente, cuando se ajustaba por el seroestatus paraCMV, tipo de órgano y edad. Luego, mientras más tiempo está repli-cando el virus mayor es el porcentaje de linfocitos T CD8+ CMV-espe-cíficos con fenotipo “EMRA”.

Conclusiones. Los resultados demuestran que, en nuestrospacientes trasplantados de órgano sólido, existe una asociación

clara entre el porcentaje de células T CD8+ CMV-específicas confenotipo “EMRA” y la duración de la viremia de CMV tras el tras-plante. Sin embargo, será necesario llevar a cabo estudios prospec-tivos para establecer la relación de causalidad entre estos doshechos.

O-043DIVERSIDAD DE LOS GENES HLA, KIR Y FCGR Y SU RELA-CIÓN CON LA VARIABILIDAD CLÍNICA DE LA INFECCIÓN PORVIRUS HERPES SIMPLEX TIPO 1. M. Moraru, E. Cisneros, N. Gómez-Lozano, R. De Pablo, F. Portero, M. Vaquero, G. Roustán, C. Vilches.Hospital Universitario Puerta de Hierro, Madrid.

El virus Herpes simplex tipo 1 (HSV-1) establece infeccioneslatentes de por vida que pueden mantenerse asintomáticas o cursarcon reactivaciones ocasionales o recurrentes. Aunque la mayoría delos individuos adultos han estado expuestos al virus, la clínica de lainfección es altamente variable, lo que apunta hacia un componen-te genético implicado en esta diversidad de respuesta. Se conocenvarias estrategias desarrolladas por el virus para evadir la respues-ta inmunitaria del huésped. Sin embargo, los mecanismos de defen-sa frente al patógeno no están bien esclarecidos. La gran variabili-dad del sistema HLA y de los receptores KIR (killer-cell immuno-globulin-like receptors) y su implicación en la respuesta inmunita-ria frente a infecciones virales, así como la capacidad del virus parasubvertir la presentación antigénica, hace que sean buenos candida-tos para explicar la diversidad interindividual de la respuesta pro-tectora frente a HSV-1. Las diferencias de afinidad de los receptorespara la fracción cristalizable de las inmunoglobulinas (FcγR), confe-ridas por polimorfismos en los genes que los codifican, podríaninfluir también en la eficacia de la respuesta inmunitaria frente alvirus, y en su capacidad para competir con señuelos virales (glico-proteínas gE y gI).

En este trabajo hemos analizado la contribución de la diversidadgenética del sistema HLA, de los KIR, y de los receptores para la IgGFcγRIIa (CD32A) y FcγRIIIa (CD16A) a la variabilidad clínica de la infec-ción por HSV-1. Para ello, se ha recogido información clínica de la infec-ción por HSV-1 y muestras de sangre de 301 individuos, en las quese han determinado los genotipos HLA, KIR, FCGR2A y FCGR3A y lapresencia de anticuerpos tipo IgG frente a HSV.

Hemos observado una desviación coincidente, pero no significa-tiva, con los resultados publicados previamente en una poblaciónitaliana, en la que se demostró una asociación negativa con el aleloB*35. Además, encontramos asociaciones no descritas hasta ahora conlos alelos HLA-B*18 (p=0.003) y HLA-C*15 (p=0.01). No hemos obser-vado ninguna asociación significativa entre la distribución de los genesKIR y sus ligandos y la clínica de la infección; en particular, la relaciónpreviamente descrita entre la infección sintomática y la presencia delos genes KIR2DL2 y KIR2DS2 no tiene significación estadística en lanueva muestra. Por último, nuestros resultados apuntan hacia una rela-ción directa entre la presencia del alelo CD16A de alta afinidad enhomozigosis y la menor frecuencia de sintomatología herpética(p=0.037).

El elevado número de comparaciones realizado en este estudio([71 alelos HLA, 16 genes KIR, 4 ligandos, 6 genotipos FCGR] x cuatrogrupos de estratificación clínica) aumenta la probabilidad de encon-trar asociaciones significativas espurias. No obstante, nuestros datosapuntan, en conjunto, hacia una contribución modesta de los polimor-

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fismos relacionados con la inmunidad adaptativa y con la vigilanciade su sabotaje, a la predisposición genética a sufrir reactivaciones dela infección por HSV-1.*Este estudio ha sido financiado con el proyecto BFU2005-04622 (Mº Educación y Cien-cia).

O-044RESPUESTA INMUNITARIA EN PULMÓN DURANTE UNAINFECCIÓN EXPERIMENTAL MIXTA CON EL VDVB Y HVB-1.1.M.Á. Risalde Moya, V. Molina Hernández, M. Pedrera Mazarro, P.J. Sán-chez Cordón, F. Romero Palomo, J.C. Gómez Villamandos. Universidadde Córdoba, Córdoba.

El virus de la diarrea vírica bovina (vDVB) se considera el prin-cipal factor predisponente para la aparición de infecciones respira-torias secundarias en bovino, desconociéndose con exactitud las estra-tegias utilizadas por este virus para evadir la respuesta inmune enpulmón y facilitar la instauración de agentes concomitantes. Así, elobjetivo de este trabajo fue estudiar los cambios cuantitativos y secre-tores que experimentan las diferentes poblaciones y subpoblacio-nes de linfocitos en el pulmón de animales coinfectados experimen-talmente con el vDVB y el herpesvirus bovino tipo 1.1 (HVB-1.1), conel fin de determinar el papel de estas células inmunocompetentes enla patogenia de la enfermedad y el tipo de respuesta inmune estable-cida (Th1 o Th2).

Para ello, 8 terneros fueron inoculados intranasalmente con la cepano citopática 7443 del vDVB y coinfectados a los 12 días post-inocula-ción (dpi) con la cepa Iowa del HVB-1.1. Los animales fueron sacrifica-dos en grupos de dos a los 2, 4, 7 y 14 dpi del HVB-1.1. Además, 2 ani-males control se inocularon con medio estéril y fueron sacrificados alfinal de la experiencia. Se tomaron muestras de sangre en días pre-vios y posteriores a ambas inoculaciones, analizándose las distintaspoblaciones de linfocitos periféricos (CD4, CD8, δγ y B) por inmuno-fluorescencia indirecta mediante citometría de flujo. Las muestras depulmón fueron procesadas de forma rutinaria para su posterior estu-dio histopatológico e inmunohistoquímico (CD79, CD3, CD4. CD8,WC1, INFγ e IL-4).

Los animales inoculados con vDVB mostraron, tras la infeccióncon HVB-1.1, un descenso en sangre periférica de linfocitos CD4+ yCD8+ (2 y 4 dpi), así como de los linfocitos γδ+ y B+ que se pro-longó durante todo el proceso. Coincidiendo con el mayor declivede las diferentes poblaciones linfocitarias en sangre, observamosen pulmón la aparición de un infiltrado mononuclear, constituidoprincipalmente por linfocitos T y macrófagos. Unido a los cambioscuantitativos, el estudio de la expresión de mediadores químicosindicativos de activación de los linfocitos e instauración de la res-puesta inmune reveló que, tras la inoculación con HVB-1.1, se pro-duce un incremento en el número de linfocitos reactivos frente a laIL-4.

Estos resultados sugieren una migración de las células inmuno-competentes sanguíneas al pulmón como respuesta a la infección conHVB-1.1. Sin embargo, pese a producirse un incremento en el núme-ro de estas poblaciones, no se instaura una respuesta celular correcta(Th1) frente a la coinfección, sino que se mantiene la respuesta Th2 pre-viamente instaurada, lo que impide una respuesta de defensa adecua-da frente a agentes secundarios.*Este trabajo ha sido financiado por la Junta de Andalucía a través del proyecto de Exce-lencia PO9-AGR-4671.

O-045IMPORTANCIA DE LOS DIFERENTES RECEPTORES NK EN ELDETERIORO DE LA RESPUESTA INMUNE INNATA OBSERVA-DA EN PACIENTES HIV+ VIRÉMICOS. M. Frias Casas, L. CastroOrgaz, R. González Fernández, M. Cobo Medina, L. Montes Torres, J.Peña Martínez. Hospital Universitario Reina Sofia de Córdoba, Córdoba.

Objetivo. Ciertos defectos funcionales de las células NK en la infec-ción por HIV tienen un efecto directo en la expresión anormal tanto enlos receptores inhibidores como en los activadores. Debido a que lainteracción de estos receptores interviene en la función innata del sis-tema inmune del individuo, el objetivo de este estudio es analizar laexpresión de estas moléculas, como son NKG2A, NKG2C, NKp30,NKp44, NKp46 y en particular CD85j, con su ligando HLA-G, en indi-viduos HIV+ que poseen un buen control de la viremia a pesar dehabérseles retirado el tratamiento comparándolo a su vez con pacien-tes avirémicos.

Material y métodos. Para la realización de este estudio se utiliza-ron PBMCs previamente congeladas de pacientes HIV+ a los que seles retiró el HAART durante al menos dos años (n=21), PBMCs conge-ladas de donantes sanos (n=24) y PBMCs congeladas de pacientes HIV+con HAART (n=22). El análisis de las poblaciones celulares se realizómediante citometría de flujo de cuatro colores. El paquete estadísticousado para el análisis de los datos fue el SPSS (V.17)

Resultados. En el caso de las moléculas CD85j y HLA-G los resul-tados obtenidos muestran un incremento significativo en todas las sub-poblaciones NK conocidas, CD56dim, CD56bright y CD56neg en pacien-tes a los que se les ha retirado el HAART. En el caso de pacientes sanosy HIV+ tratados encontramos los niveles de CD85j y HLA-G norma-les. Este incremento significativo de la molécula CD85j y su ligandoHLA-G está correlacionado positivamente con la carga viral de lospacientes (P<0,05). Por el contrario respecto a los receptores lectina tipoC (NKG2A y NKG2C) y receptores de citotoxicidad no encontramosningún cambio significativo en su expresión entre pacientes virémicosy avirémicos.

Conclusión. Estos resultados sugieren que un nivel alto de car-ga viral HIV induce el aumento de la expresión de receptores inhibi-dores, en este caso, CD85j así como su ligando HLA-G, mientras queen los demás grupos este incremento fue restringido como resultadode una replicación de HIV significativamente menor.

O-046THE VIRAL PROTEIN A238L INHIBITS CICOOXYGENASE-2 ANDMETALLOPROTEINASE-9 EXPRESSION IN HUMAN COLOREC-TAL CARCINOMA CELLS. E. G. Sánchez1, A. G. Granja2, P. Sabina3,I. Bañon-Rodríguez4, I. Antón5, M. Fresno1, Y. Revilla1. 1Centro de Biolo-gia Molecular Severo Ochoa (CBMSO), MADRID. 2Cancer Research UK Lon-don, , United Kingdom. 3Centro de Biologia Molecular Severo Ochoa. 4CentroNacional de Biotecnologia (CNB). 5Centro Nacional de Biotecnologia (CNB).

Introduction. Cyclooxygenase-2 (COX-2), an inducibleprostaglandin synthase, is overexpressed in several human cancersand affects many processes that have implicated in different stagesof carcinogenesis. Multiple lines of evidence indicate that COX-2 isa “bona fide” pharmacologica target for anti-cancer therapy. Bothtumor formation and growth are reduced in animals that are eitherengineered to be COX-2 deficient or treated with selective COX-2inhibitors. The mechanisms of the pro-tumorogenic activity of COX-

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2 are: production of angiogenic factors, increasing of cells proliferation,inhibition of inmmune surveillance, prevencion of apoptosis andincreased metastatic potencial. Previously, we have demonstratedthat the viral protein A238L, of African Swine Fever Virus, is ableto inhibit COX-2 expression through the NFAT transactivationpathway in Jurkat T cells.

Objetives. To study if the viral protein A238L has an antitumor orantimetastatic function in human colorectal carcinoma cells, Caco-2.

Materials and methods. We generated Caco-2 cells that stablyexpress the A238L gene by transfection with an expression plasmid.We analysed COX-2 promoter expression and transcriptional activityof NFAT, NFkB and the activity of the p300 coactivator by luciferaseassays. COX-2, metalloproteinase-9 (MMP-9) and ICAM-1 mRNAexpression were measured by PCR assays, and MMP-9 secretion andactivity through a gelatin zymografy. Finally, we performed chamberassays to analyze migration ability of Caco-A238L cells and ELISAassays to measure prostaglandin E2 levels.

Results and conclusions. The viral protein A238L inhibits COX-2 promoter activity, mRNA expression and PGE2 synthesis in Caco-2cells, and this inhibition is mediated by blocking NFAT, NFkB and p300transcriptional activity. Moreover, we have observed that the presenceof this viral protein disminished the migration ability of Caco-2 cellsprobably due to inhibit the expression and secretion of MMP-9, andA238L is able to modulate the expression of other molecules involvedin cellular adhesion as ICAM-1.

Taken together, this date indicate that A238L could be a potencialtool for anti-tumor therapy.

O-047NKP46 AND DNAM-1 NK CELL RECEPTORS DRIVE THE RES-PONSE TO HUMAN CYTOMEGALOVIRUS INFECTED MYELOIDDENDRITIC CELLS OVERCOMING VIRAL IMMUNE EVASIONSTRATEGIES. G. Magri1, A. Muntasell1, N. Romo1, A. Sáez-Borderías1,D. Pende2, A. Angulo3, A. Moretta4, M. López-Botet1. 1Universitat Pom-peu Fabra , Barcelona. 2Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro. 3Institutd'Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer. 4Università di Genova.

Myeloid dendritic cells play a central role in the biology of humancytomegalovirus (HCMV) infection as they differentiate from myeloidprogenitors, which constitute a main site for viral latency, and arethemselves susceptible to direct infection. NK cells are involved inimmune defence against HCMV though information on the nature ofNK cell receptors involved is limited. In the present study we analysedthe response of NK cell populations against autologous monocyte-derived dendritic cells (moDC) infected by the TB40/E HCMV strain,assessing the antagonistic effect of monoclonal antibodies (mAbs)specific for different activating NK cell receptors.

Interaction with autologous HCMV-infected moDC, whichdown-regulated the expression of HLA class I and II molecules,specifically activated NK cells, triggering IFNÁ production andcytotoxicity. NKp46 and DNAM-1-specific mAbs inhibited NK cellactivation in response to HCMV-infected moDC, despite that DNAMligands (PVR and Nectin-2) were down-regulated. Differences inthe efficiency of CD94/NKG2A+ and CD94/NKG2C+ NK cell subsetsfrom HCMV seropositive donors to respond against infected moDCwere noticed.

Our results indicate that NK cells efficiently respond against HCMV-infected immature moDC, overcoming putative viral immune evasion

strategies, and support that the NKp46 and DNAM-1 receptors play acentral role in this process.

SESIÓN 6: INMUNIDAD INNATA E INFLAMACIÓN

Moderadores: J.L. Rodríguez Fernández (Madrid) Francisco Sánchez Madrid (Madrid)

O-048PAPEL DE COT/TPL2 EN HIPERNOCICEPCIÓN INFLAMATORIAINDUCIDA POR TLR. I. Soria Castro, A. Krzyzanowska, M. LópezPeláez, M. Fernández, S. Alemany. IIB, Alberto Sols, CSIC, Madrid.

Objetivos• Determinar el papel de Cot/tpl2 en la inflamación inducida por

zymosan.• Identificación de los distintos mecanismos empleados por Cot/tpl2

en procesos de inflamación in vivo.• Estudio del papel de Cot/tpl2 en hipernocicepción asociada a infla-

mación.Materiales y Métodos • Modelos de inflamación in vivo en ratones Cot/tpl2+/+ y Cot/tpl2–/–:

inyección i.p. con zymosan (2 mg/ml , 0,5 ml) e inyección intra-plantar i.pl.con zymosan (30 µg/µl).

• Luminiscencia in vivo: actividad MPO en pata y peritoneo, IVISLUMINA (Gross et al, 2009).

• Cuantificación de células del peritoneo y marcaje de neutrófilos(Ly6G+/F4/80–) y macrófagos ( F4/80+/Ly6G+) por citometría deflujo.

• Medida de citoquinas y quimioquinas por Citometría, por el méto-do de CBA.

• Medida de PGE2 y LTB4 por inmunoensayo encimático, CaymanChemical.

• Test de nocicepción: método validado por Cunha (Cunha et al,2004) con anestesiómetro eléctrico, tras la i.pl. con zymosan y conLPS.Resultados. La ausencia de Cot/tpl2 redujo significativamente la

hipernocicepción asociada a inflamación inducida por lipopolisacá-rido y por zymosan. Los ratones deficientes en Cot/tpl2 mostraronuna reducción del 40% de la actividad MPO in vivo a las 6 horas trasla inyección intraplantar con zymosan. Consecuentemente, en el mode-lo de peritonitis inducida con zymosan, los ratones deficientes enCot/tpl2 mostraron una reducción de un 30% de la actividad MPO asícomo un 25 menos de neutrófilos y un 65% de macrófagos en el lava-dos peritoneal. La ausencia de Cot/tpl2 también determinó la reduc-ción de los niveles de ciertas citoquinas y quimioquinas detectadasdurante la inflamación con zymosan. Así mismo, mientras que en ensa-yos in vitro realizados en macrófagos estimulados con zymosanCot/tpl2 es necesario para generar TNF-α y PGE2, en modelos in vivo,los ratones deficientes en Cot/tpl2 tan solo mostraron una pequeñareducción de los niveles de TNF-α así como una inducción de los nive-les de PGE2.

Conclusiones. Nuestros datos muestran como Cot/tpl2 es unabuena diana terapéutica para reducir la inflamación aguda así comola hipernocicepción asociada a inflamación, debido a su capacidadpara controlar el reclutamiento de células inflamatorias. Tambiénhemos demostrado como el papel de Cot/tpl2 descrito para ensa-

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yos in vitro no es extrapolable en estudios de animal entero, lo quedebería ser considerado a la hora de desarrollar fármacos contraCot/tpl2.

O-049EFECTO POTENCIADOR DE LA DEFICIENCIA EN APOE SOBREEL DESARROLLO DE ARTRITIS EN ROEDORES. J. Postigo1, F.Genre1, M. Iglesias1, L. Buelta2, M. Fernandez-Rey1, J. Merino1, R. Meri-no1. 1Universidad de Cantabria, Santander. 2Universidad de Cantabria.

Diversos estudios epidemiológicos han mostrado un incrementoen la frecuencia de arteriosclerosis en los pacientes con artritis reuma-toide (AR) que no se explica unicamente en base a factores de riesgovascular tradicionales. Todo ello sugiere que mecanismos inmuno-inflamatorios implicados en la patogenia de la AR también influyenen la aceleración de la arterioesclerosis en estos pacientes. Un aspec-to que aun no se ha evaluado en este contexto es hasta que punto laaparición de arteriosclerosis y/o las anomalías metabólicas asociadas,influyen en el propio desarrollo de AR.

En el presente trabajo se evalua como la deficiencia en ApoE y lahipercolesterolémia asociada influyen en la inducción y evolución dela artritis autoinmune experimental (CIA), la cual inducimos inmu-nizando con colágeno de tipo II bovino (C-II) a ratones B10RIII, defi-cientes o no en ApoE, lo cual les hace susceptibles al padecimientode arteriosclerosis

El seguimiento clínico complementado con técnicas radiológicasy anatomopatológicas muestra que los ratones B10RIII-ApoE–/– inmu-nizados con C-II padecen una CIA mucho más severa que los rato-nes B10RIII control. En correlación con estos hallazgos, mediante Q-PCR, hemos observado que los ratones B10RIII-ApoE–/– inmuniza-dos con C-II, tienen incrementada la expresión articular de citoci-nas pro-inflamatorias artritogénicas (TNFα e IL-1β) y las citocinas yfactores de transcripción asociados a la diferenciación de linfocitos TCD4+ hacia los subtipos Th1 y Th17 (IFNγ, TGFβ, IL-6, IL-21, T-bety RORγt), en comparación con los ratones silvestres inmunizados.Así mismo, en los ratones B10RIII-ApoE–/– se observa un incremen-to importante de linfocitos Th17 (CD4+ IL-17+) y en menor grado deTh1 (CD4+ IFNγ+) en los ganglios linfáticos 3 semanas tras la inmu-nización con C-II en comparación con los ratones silvestres inmuni-zados.

En conjunto, nuestros resultados demuestran que la deficiencia enApoE y/o la hipercolesterolémia asociada a dicha deficiencia, agravanel curso clínico de la CIA en ratones susceptibles promoviendo res-puestas Th1 y Th17.

O-050LA SOBRE-EXPRESIÓN DE BCL-2 INCREMENTA LA ACTIVIDADSUPRESORA DE LOS LINFOCOTOS CD4+CD25+ REGULADORESPOR UN MECANISMO DEPENDIENTE DE TGFB. M. Iglesias1, I.Santiuste1, L. Buelta1, J. Postigo2, J. Merino2, R. Merino3. 1Instituto de Bio-medicina y Biotecnología de Cantabria-CSIC, SANTANDER. 2Universidad deCantabria. 3Instituto de Biomedicina y Biotecnología de Cantabria (IBBTEC)-CSIC.

Recientemente nuestro grupo ha demostrado la protección con-tra el desarrollo de patologías autoinmunes en un modelo de ratóntransgénico (Tg) que sobre-expresaba Bcl-2 humano (hBcl-2) en linfo-

citos B y en una subpoblación de linfocitos T. Este efecto protectorestaba mediado por linfocitos T CD4+CD25+ reguladores (Treg) quese encontraban expandidos en los animales Tg. Con la finalidad deprofundizar en los mecanismos responsables de dicha protección,hemos estudiado el número y actividad funcional de los linfocitosTreg así como el desarrollo de artritis autoinmune tras inmuniza-ción con colágeno de tipo II bovino (CIA) en ratones (DBA/1xC57BL/6)F1 Tg para hBcl-2 en linfocitos T (F1-hBcl-2-TgT). A diferen-cia de lo descrito en los ratones hBcl-2 Tg en linfocitos B y T, el por-centaje de células Tregs en los ratones F1-hBcl-2-TgT es similar al obser-vado en ratones F1 no-Tg controles. Sin embargo, experimentos fun-cionales in vitro muestran que la sobre-expresión de hBcl-2 en los lin-focitos Tregs potencia en más de 10 veces su actividad supresora. Deacuerdo con estos hallazgos, los ratones F1-hBcl-2-TgT no desarrollanCIA tras inmunización con colágeno de tipo II. En correlación con laausencia de CIA, los ratones F1-hBcl-2-TgT expresan niveles norma-les de las citocinas pro-inflamatorias TNFα IL-1β e IL-6 a nivel articu-lar, cuantificadas por Q-PCR, mientras que la expresión de la citoci-na anti-inflamatoria TGFβ se encuentra incrementada. La eliminaciónin vivo de las células Tregs en los ratones F1-hBcl-2-TgT, mediante unAc monoclonal anti-CD25, induce el desarrollo de CIA similar a laobservada en los controles no-Tg que no fueron tratados con este AcMy promueve un incremento en la expresión articular de TNFα IL-1β eIL-6, indicando que la ausencia de patología autoinmune en esta líneade ratones Tg también es dependiente de los linfocitos Tregs. Por últi-mo, el tratamiento local con un anticuerpo anti-TGFβ incrementa laseveridad de la artritis en los ratones F1 no-Tg y sobre todo, promue-ve la aparición de CIA en los ratones F1-hBcl-2-TgT. Estos resulta-dos ponen en evidencia que la sobre-expresión de hBcl-2 en linfocitosTregs potencia su actividad supresora y que dicho incremento estámediado por TGFβ.

O-051CRITICAL ROLE OF PI3K IN THE UPREGULATION OF KC ANDMIP-2 BY HISPANOLONE DERIVATIVE IN TLR4-ACTIVATEDMACROPHAGES. S. Hortelano1, P.G. Traves2, R. López-Fontal3, G.Bergazyn3, L. Boscá2, B. Rodríguez4, B. De Las Heras5. 1Unidad de Infla-mación y Cáncer, Área de Biología Celular y del Desarrollo, Centro Nacionalde Microbiología, Majadahonda. 2Instituto de Investigaciones Biomédicas Alber-to Sols (CSIC-UAM), Madrid. 3CNIC. Madrid. 4Instituto de Química Orgá-nica (CSIC), Madrid. 5Departamento de Farmacología Facultad de Farmacia,Universidad Complutense, Madrid.

Background. The search for new anti-inflammatory natural productshas enormously increased in last years. We have recently describedthat hispanolone derivative 8,9-Dehydrohispanolone-15,16-lactol (T11)inhibits LPS-dependent NO release through a mechanism that involvesinhibition of NF-κB activation.

Objective. In this study, we want to extend our results to otherTLR ligands and demonstrated the differential regulation of inflammatorychemokines in the presence of T11 in mouse peritoneal macrophages.

Material and methods. Mouse peritoneal macrophages weremaintained in culture and activated with pro-inflammatory stimuli inthe absence or presence of T11. Expression of inflammatory cytokines,mediators and chemokines was determined.

Results. We show that T11 exerts potent inhibitory effects on theexpression of NF-κB responsive genes such as NOS-2 and COX-2 afterstimulation with TLR2, TLR3 and TLR4 ligands. In addition, using

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microarray and quantitative RT-PCR analysis, we observed a clearinhibition of the expression of proinflammatory cytokines such as IL-1α, IL-1‚ and IL-6 and chemokines including CCL2, CCL4, CCL5, CCL7,CCL12, CCL17, and CXCL10 in T11-treated cells after LPS stimulation.In contrast, the chemoattractants CXCL1/KC and CXCL2/MIP-2chemokines were highly upregulated. This synergistic effect was onlyobserved after LPS stimulation and was dependent on PI3K inhibitionas demonstrated the upregulation of KC and MIP-2 in LPS-stimulatedmacrophages after treatment with the specific inhibitor of PI3K LY294002.Consisting with this, treatment of LPS-stimulated macrophages withT11 resulted in a decreased activity of PI3K and Akt phosphorylation.

Conclusions. Taken together, these results demonstrate that T11differentially affects the ability of TLR4 signaling pathway to inducepro-inflammatory cytokines and describe a novel negative role of PI3Kfor the regulation of TLR signaling. *This work was supported by grants from the FIS PI05.0050, PI08/0070 and the FundaciónMutua Madrileña to S.H, and by a Santander-Complutense grant to S.H. and B.de las H.

O-052EFFECTS OF ULTRAVIOLET RADIATION IN DIFFERENT SUB-POPULATIONS OF PERIPHERAL BLOOD MONOCYTES. Z. More-no Villegas1, D. Diaz Martin1, G. Parada Hermoza1, L. Ortega Moreno1,H. Barcenilla Rodríguez1, M.Á. Sánchez Luengo1, L. Chara Velarde1, J.Monserrat Sanz1, A. Prieto Martín1, M. Álvarez De Mon-Soto2. 1Univer-sidad Alcalá de Henares. 2Hospital Universitario Príncipe de Asturias.

Background. Ultraviolet (UV) irradiation has cytotoxic effectson the skin and the immune system as a consequence of oxidative stress.Several effects have been described in different immune cellular types.However, there are no studies about its effects in recently describedmonocyte subpopulations.

Objetive. To determine the UV irradiation effects on the differentsubsets of peripheral blood monocytes.

Material and methods. Peripheral blood mononuclear cells wereisolated from healthy donors by standard Ficoll-Paque density gradientcentrifugation. Monocytes were irradiated with an UV-emitting lamp(I=1319W/m2) over different times (7, 14 and 28 minutes). Later, cellswere cultured for 3, 6, 24 and 48 hours and were adquired in a FACSCaliburflow cytometer using fluorochrome-labeled monoclonal antibodies.Monocytes were selected in a FSC-SSC dot plot, and defined as CD3negative and CD14 positive. Monocyte subpopulations were identifiedas classic monocytes (CD14+ CD16–), inflammatory monocytes (CD14+high

CD16+) and resident monocytes (CD14+dim CD16+). The absolute numberof viable (7-AAD-) monocytes were calculated using microbeads as aninternal reference.

Results. We observed that in both CD16+ monocyte subsets UVexposure caused a rapid and dramatical decrease in the absolute numberof viable cells. However, the absolute number of viable classic monocytes(CD14+ CD16–) increased progressively after 7 minutes of UV exposition.Meanwhile, 14 minutes of irradiation caused at 3 hours a slow increaseof viable cell number, but after 6 h decreased strongly. For all subpopulationsstudied, 28 minutes of UV induced a massive cell death. We also observeda very slight and progressive increase in viable classic monocytesabsolute number from 6 and 24 yours for 28 and 14 minutes of irradiationrespectively.

Conclusion. Classic monocytes are much more resistant to ultravioletemissions than inflammatory and residents subsets, which disappearat 3 hours of cultured.

O-053SVT003407 Y SVT008294: NUEVOS COMPUESTOS CON ACTIVI-DAD DUAL ANTI-PROLIFERATIVA Y ANTI-INFLAMATORIACOMO POTENCIALES FÁRMACOS ANTIPSORIÁTICOS. S. Mar-chán, C. Herrero, J. Cabellos, C. Lagunas. Laboratorios Salvat, Espluguesde Llobregat.

Objetivos. La psoriasis es una enfermedad inflamatoria crónicade la piel caracterizada por una hiperproliferación y diferenciaciónanormal de queratinocitos y un aumento en la producción de cito-quinas proinflamatorias. Las terapias actuales abordan ambos aspec-tos de la patología. El objetivo de este estudio es evaluar el potencialterapéutico para el tratamiento de la psoriasis de dos agonistas delreceptor PPARγ, SVT003407 y SVT008294.

Materiales y métodos. Actividad PPARγ: la actividad fue deter-minada por estudios de afinidad con un radioligando competitivo asícomo ensayos celulares de transactivación.

Actividad antiproliferativa y citotoxicidad: se determinó median-te métodos colorímetros en las líneas celulares HEKn (queratinocitosepidérmicos humanos) y HDFa (fibroblastos dérmicos humanos).

Actividad anti-inflamatoria: La inhibición de la producción de cito-quinas inflamatorias in vitro se determinó en PBMC humanos estimu-lados con LPS mediante qRT-PCR. La capacidad anti-inflamatoria invivo se determinó en un modelo de inflamación tópico inducido porTPA en oreja de ratón.

Resultados. Los agonistas del receptor PPARγ SVT003407 ySVT008294 son dos nuevos compuestos en desarrollo preclínico parael tratamiento tópico de la psoriasis que muestran una actividad dualanti-proliferativa y anti-inflamatoria. Ambos productos presentan unamarcada inhibición de la proliferación de queratinocitos sin efectoscitotóxicos asociados. Dado que estos compuestos no muestran activi-dad anti-proliferativa sobre fibroblastos, su administración tópica nodebería conllevar atrofía dérmica, tal como sucede con otros fármacos.Por otro lado, en un modelo celular basado en la estimulación dePBMC’s con LPS, estos productos son capaces de inhibir la producciónde las citoquinas inflamatorias validadas clínicamente para el trata-miento de psoriasis como TNFα, IL-1α, IL-12p40 (subunidad presen-te en las citoquinas IL-12 e IL-23). Finalmente, estos compuestos soneficaces en un modelo in vivo de inflamación tópica, siendo la respues-ta anti-inflamatoria de éstos superior al estándar terapéutico tazarote-no.

Conclusiones. SVT003407 y SVT008294 presentan un potencialterapéutico elevado para el tratamiento de la psoriasis dado que actú-an en las dos principales causas responsables del desarrollo de la pato-logía: proliferación de queratinocitos y producción de mediadores infla-matorios.

O-054RIAM (RAP1-INTERACTING ADAPTOR MOLECULE) ES ESEN-CIAL PARA LA FAGOCITOSIS MEDIADA POR COMPLEMEN-TO EN CÉLULAS PROMIELOCITICAS. I. Medraño Fernández1, I.M.Olazabal Olearreaga2, J. Merino Gracia1, F. Sánchez Madrid2, V.A. Bous-siotis3, C. Cabañas Gutiérrez4, E.M. Lafuente Duarte1. 1Facultad de Medi-cina, UCM, Madrid. 2Hospital de La Princesa. 3BIDMC, Harvard, United Sta-tes. 4CBM-SO, CSIC.

Introducción. Los receptores del complemento CR3 y CR4 (αMβ2y αxβ2, respectivamente), son miembros de la familia de integrinas β2.

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Estímulos pro-inflamatorios inician cascadas de señalización inside-outque incrementan la afinidad de estas integrinas, induciendo una acti-vación de la fagocitosis. Algunos componentes de esta vía de señali-zación inside-out a αMβ2 han sido definidos, como Rap1, cuya activa-ción incrementa la fagocitosis de partículas opsonizadas por comple-mento, y Talina cuya unión a la región citoplasmática de la integrinaβ2 es esencial para la activación de αMβ2. Sin embargo, se desconoceel mecanismo por el que Rap1 induce la unión de talina a αMβ2. Recien-temente hemos identificado a RIAM, un efector de Rap1 que funcionacomo una proteína adaptadora interaccionando directamente con Rap1-GTP y con Talina. Se ha descrito que la asociación Rap1-RIAM con-tribuye al reclutamiento de Talina a la subunidad ‚ en otras integrinas.

Objetivos. Estudiar la implicación de RIAM en fagocitosis media-da por complemento y adhesión a través de integrinas β2 (αMβ2 yαxβ2), en células promielocíticas.

Materiales y métodos. Hemos estudiado las siguientes activida-des en la línea HL-60 interferida establemente para RIAM (shRNA) ydiferenciada a neutrófilo con ATRA: 1) Adhesión a Fibrinógeno/iC3b,soluble y en placa. 2) Fagocitosis mediada por complemento (FACS).3) Detección de Rap1-GTP (Pull-Down). 4) Reclutamiento de Talina ala copa fagocítica (confocal).

Resultados. La línea celular promielocitica HL-60 interferida esta-blemente para la expresión de RIAM y diferenciada a neutrófilo mues-tra un defecto en adhesión a fibrinógeno e iC3b, ligandos de αMβ2 yαxβ2, y un defecto en fagocitosis mediada por complemento. Este defec-to es especifico de CR3 y CR4 ya que no se observa en la fagocitosismediada por FcR. La activación de Rap1 mediada por 8-CPT-2Me-cAMP, un activador de EPAC (GEF específica de Rap1) induce un incre-mento en fagocitosis que es inhibido por la interferencia de la expre-sión de RIAM. Además la interferencia de expresión de RIAM resul-ta en un menor reclutamiento de Talina a la copa fagocítica, lo que pro-duciría un defecto en la activación de las integrinas αMβ2 y αxβ2.

Conclusión. Nuestros datos sugieren que RIAM funciona comoel nexo de unión entre la forma activa de Rap1 y el reclutamiento deTalina a la región citoplasmática de la subunidad beta de las integri-nas αMβ2 y/o αxβ2. RIAM, por tanto actuaría como el efector de Rap1que regula la activación de las receptores fagocíticos del complemen-to CR3 y CR4.

O-055LOS LIGANDOS DE RECEPTORES TOLL-LIKE REGULAN ELPATRÓN MIGRATORIO DE LOS LEUCOCITOS EN SANGREPERIFÉRICA. J.C. Nieto Sáchica, E. Cantó, M.A. Ortiz, C. Zamora, S.Vidal. Institut De Recerca Hospital De Santa Creu I Sant Pau, Barcelona.

Los leucocitos juegan un papel central en la regulación de la res-puesta inmune, conocer las vías que regulan la migración y la dinámi-ca del tránsito celular, nos permitirán entender la progresión del pro-ceso inflamatorio.

Nosotros hemos investigado como ligandos de TLR2 (Pam3CSK4,FSL-1), TLR4 (LPS) o algunos mediadores inflamatorios (IFN-γ, IL-10,TNF-α) producidos tras el estímulo con ligandos de TLRs pueden regu-lar la expresión de los receptores de quimiocinas (CCR2, CCR4, CCR5,CCR6, CXCR3) en las diferentes poblaciones leucocitarias.

Resultados. Primero por citometría de flujo se analizó la expre-sión de los receptores de quimiocinas en monocitos, linfocitos y neu-trofilos en sangre total. Los monocitos expresaban CCR2, CCR4, CCR5,mientras que los linfocitos expresaban CXCR3, CCR6 y CCR4. Tras esti-

mular cultivos de sangre total con ligandos de TLR2 y TLR4 durante20 horas observamos que disminuía la expresión de CCR2, aumenta-ba la expresión de CCR4, CCR5, CXCR3 en monocitos y aumentaba laexpresión de CXCR3 en linfocitos. Los principales mediadores infla-matorios detectados en estos cultivos fueron IL-10, IL-6, TNFα. En cons-cuencia determinamos la influencia de estos mediadores inflamatoriossobre la expresión de los receptores de quimiocinas. Al estimular san-gre total con IL-10 y TNF-α disminuía la expresión de CCR2 y aumen-taba la expresión del CCR4 y el CXCR3 en monocitos. Para validar elefecto de la IL-10, bloqueamos con anti IL-10 neutralizante los cultivosde sangre total estimulada con el ligando de TLR4.

Conclusión. El reconocimiento de patógenos por las diferentespoblaciones leucocitarias en especial por los monocitos, altera su reper-torio de receptores quimiocinas, lo que condicionaría su tránsito a tra-vés de los tejidos.

O-056LA ACTIVACION CONSTITUTIVA DE NOTCH1 DESEQUILIBRAEL BALANCE PROLIFERACIÓN/DIFERENCIACION EN LASCELULAS HEMATOPOIETICAS EN EL EMBRIÓN DE RATÓNPOSTGASTRULACIÓN. I. Cortegano, L. Luna, P. Melgar, M. Alia, B.Palacios, N. Serrano, A. Sánchez-Archidona, B. De Andrés, J. De La Pom-pa , M. Marcos, M. Gaspar. Centro Nacional de Microbiología, Instituto deSalud Carlos III, Madrid.

Objetivo. Estudiar el efecto de la activación constituida de Notch1a lo largo del desarrollo embrionario en el embrión postgastrulaciónde ratón.

Material y Métodos. Modelo murino Cre-lox en el cual la regiónintrcitoplásmica del receptor Notch1 (N1ICD) se encuentra constituti-vamente activa y es expresada en todas las células que en algún momen-to del desarrollo son Tie-2+, además esta construcción está unida a laproteína fluorescente GFP para la identificación de las células mutan-tes. Se ha realizado la caracterizacion fenotípica de las poblaciones adía 9 de gestación en saco vitelino mediante citometría de flujo multi-paramétrica. Se han aislado las poblaciones GFP+ para estudiar supotencial hematopoiético (ensayos de methocult), su expresión géni-ca (PCR a tiempor real).

Resultados. Nuestros resultados muestran que, al igual que ocu-rre en el caso de la delección de Notch1, su hiperactivación de célu-las Tie2+ da lugar a la desaparación de los islotes sanguíneos de la aor-ta-dorsal y al bloqueo de la hematopoyesis definitiva en los embrio-nes de día 9.5 de gestación. El potencial hematopoiético de los proge-nitores aislados de los ratones transgénicos se reduce en 10-20 vecesen comparación con el ratón control. Los estadios inmaduros e inter-medios en el proceso de diferenciación eritroide y mieloide en los rato-nes mutantes se ven incrementados y presentan mayor capacidad deproliferación; sin embargo, tanto el proceso de hemoglobinización comola diferenciación a estadíos más maduros de estos linajes están blo-queados. El análisis de la expresión génica de muestras purificadas porcitometría de flujo de las poblaciones progenitoras GFP+ muestra unaumento en la expresión tanto de los ligandos de Notch como de susdianas directas (Dll4, Jagged 1 y 2, Hes1 y HRT2), así como de los genesimplicados en la vía no canónica de Wnt (Dkk1 y Wnt5a). En cuantoal análisis de los genes esenciales para la hematopoiesis, la hiperacti-vación de Notch1 en estos estadios celulares reduce en gran medidala expresión de SCL, Fli1 y GATA2 y no altera la expresión de LMO2y LDB1. El análisis de los genes de ciclo celular muesta alteraciones en

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la expresión de ciclinas importantes en la regulación de este procesocomo la ciclina E1 y la ciclina B2.

Conclusión. La hiperactivación de Notch1 en células embriona-rias Tie2+ produce un bloqueo en la diferenciación final hematopoié-tica mieloeritroide con acúmulo de precursores intermedios de los lina-jes eritroide y mieloide.

SESIÓN 7: CÉLULAS DENTRÍTICAS

Moderadores: Alberto Varas (Madrid)David Sancho (Madrid)

O-057LANGERHANS CELLS CONTROL ANTIGEN-SPECIFIC SKININFLAMMATION. M. Gomez De Agüero Tamargo1, M. Vocanson1, A.Kissenpfenning2, B. Malissen2, K. Dominique1, B. Dubois1. 1INSERM U851, Lyon, France. 2Centre d'Immunologie Inserm-CNRS de Marseille-Luminy, France.

We previously reported that induction of CD8+ cytotoxic T cellresponses by skin immunization does not involve skin resident Langerhanscells (LC) (Kissenpfennig et al. Immunity 2005) and requires recruitmentof inflammatory DC from blood (Le Borgne et al. Immunity 2006). Inparticular, we showed using Langerin-DTR transgenic mice that LCwere dispensable for induction of contact hypersensitivity (CHS)responses to the strong contact sensitizer DNFB. We now show usingthe cross-reactive and tolerogenic hapten DNTB, and Langerin-GFPand -DTR knock-in mice, that LC mediate hapten-specific skin CD8+

T cell tolerance and prevent CHS to this hapten. A single skin paintingwith DNTB induces LC activation and emigration to skin draininglymph nodes (dLN). Skin-derived LC constitute the major DC subsetthat is present in dLN as soon as 24 hours after skin DNTB paintingand able to present the tolerogenic hapten to specific CD8+ T cells.Remarkably, while skin immunization with DNTB is unable to primespecific CD8+ effector T cells and results in lack of CHS, in vivo ablationof LC induced by injection of Diphteria toxin into Langerin-DTR miceallowed for priming of hapten-specific CD8+ CTL, indicating a tolerogenicrole for LC. Alternatively, repeated skin delivery of DNTB results inthe priming of CHS effectors cells and correlates with mobilization ofboth LC and non LC Ag-presenting DC into dLN. Thus, LC induce Ag-specific tolerance via the skin and this can be overcome by the mobilizationof other subsets of myeloid DC.

O-058ACTIVATION OF CDCS INDUCES SPECIFIC PDC COOPERA-TION TO PROMOTE A COORDINATED IMMUNE RESPONSE.B. Pérez-Cabezas1, P. Bastos-Amador1, M. Naranjo-Gomez1, M. Bofill2,F. Carmona3, F. Nuñez4, R. Pujol-Borrell1, F.E. Borras1. 1Fundació Ins InvGermans Trias i Pujol, Badalona. 2Fundació Irsicaixa. 3Dpto Estadistica UB.4UCTS, Ins Inv Vall d'Hebron, Barcelona.

Two well-characterized blood dendritic cell populations, conventional(cDC) and plasmacytoid (pDC) have been described. Both populationsexhibit multiple differences including phenotype, TLR-expression andcytokine and chemokine secretion. cDCs are highly efficient at exogenousantigen presentation and they traffic from tissues to local lymph nodes

for antigen presentation via apherent lymphatic vessels. In contrast,pDCs are less competent in antigen uptake, they are present in thethymus and secondary lymph nodes and are rarely found in non-inflamed tissues and apherent lymphatics. These marked differencesand some evidences reported by our and other laboratories suggestspecialized and may be complementary and coordinated functionsbetween DC subsets to induce a potent immune response.

AIMS. To verify the coordination between pDC and cDC in thegeneration of immune responses, determining the mechanisms of pDCs-conditioning by activated cDCs and looking for specific differencesdepending on the cDC activation stimulus.

Methods. cDCs and pDCs were sorted from buffy coats obtainedfrom healthy blood donors. Sorted cDCs were stimulated with LPSor R848 during 16h. Meanwhile, pDCs from the same donor were CFSE-labeled and maintained in IL3. Then, CFSE-pDCs and stimulated-cDCswere mixed (2:1) and co-cultured for additional 5h. CFSE-pDCs weresorted again and the RNA was extracted for microarray analyses andreal time-PCR. Functional features of the conditioned-pDC includedphenotype changes, induction of alloproliferation and production ofIFNa.

Results. Phenotypically, activated cDC induced the up-regulationof several maturation markers in pDCs, including CD25, CD83 andCD86. Also, conditioning of pDC by activated-cDC promoted theexpression of several genes such as chemokines and proinflammatorycytokines such as IL6. Qualitatively, the gene expression profile of pDCsconditioned by LPS-cDCs or by R848-cDCs was very similar and bothwere able to induce alloresponses. However, as expected, the highernumber of changes in gene expression was found when pDCs wereconditioned by R848-cDC.

Conclusions. Our results demonstrate that different types of cDCactivating factors promote specialized gene and functional activationprofiles in pDC that may in turn contribute to establish an appropriateimmune-regulatory environment.

Acknowledgments. This work is being supported by a grant fromthe ‘‘Fondo de Investigaciones Sanitarias’’ FIS 06/0453 to FEB.

O-059REDISTRIBUCIONES DE CÉLULAS DENDRÍTICAS Y MONOCI-TOS EN PACIENTES CON LLC-B ZAP-70+. M.Á. Sánchez Luengo,G. Parada Hermoza, Z. Moreno Villegas, L. Ortega Moreno, D. DíazMartín, H. Barcenilla Rodríguez, A. Prieto Martín, J. Monserrat Sanz,E. Reyes Martín, M. Álvarez De Mon-Soto. Dpto. Medicina, Unidad I+Dasociada UAH/CSIC/IMMPA, Alcalá de Henares.

Introducción. Las células dendríticas (DCs) son muy importan-tes en la protección frente a agentes infecciosos y en la defensa antitu-moral, alteraciones en estas poblaciones celulares repercuten de mane-ra muy significativa en estas respuestas. Una de las principales causasde morbilidad y mortalidad en los pacientes con LLC-B son las infec-ciones producidas por agentes infecciosos.

Objetivos. Estudiar mediante la citometría de flujo las posiblesalteraciones en DCs y monocitos relacionadas con la expresión de ZAP-70 en pacientes con LLC-B.

Materiales y métodos. Se realizó estudio inmunofenotípico porcitometría de flujo de 4 colores en 34 pacientes con LLC-B que se cate-gorizaron en ZAP-70+ (n=16) y ZAP-70– (n=18), los resultados se com-pararon con 18 controles sanos. Para la determinación inmunofenotí-pica de células dendríticas se utilizo un kit de enumeración de DCs,

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que permite discriminar entre DCs mieloides tipo I, tipo II y DCs plas-macitoides. En el caso de la determinación de monocitos se utilizó mar-caje mediante CD14 y CD16 para discernir entre las distintas poblacio-nes de monocitos, y se evaluó la expresión en las diferentes poblacio-nes monocitarias de los marcadores de coestimulación CD80 y CD86,y los marcadores de migración CX3CR1 y CD62L.

Resultados. En los pacientes con LLC-B ZAP-70+ se observórespecto a los pacientes ZAP-70- y los controles sanos una dismi-nución de las DCs mieloides tipo I (mDC 1) y una disminución delas DCs plasmacitoides (pDC) contrarestada por un incrementoen las DCs mieloides tipo II (mDC 2). A su vez estos pacientes ZAP-70+ presentaron también una importante redistribución de las pobla-ciones monocitarias con un descenso importante de los monocitosclásicos CD14+hiCD16–, y de los monocitos CD14+highCD16+high yCD14+highCD16+low presentando estas últimas poblaciones descen-sos importantes en la expresión de moléculas implicadas en la migra-ción y coestimulación celular. El descenso observado en estas pobla-ciones monocitarias se debe al fuerte incremento en los pacientescon LLC-B ZAP-70+ de los monocitos CD14+lowCD16+high y CD14-CD16+high.

Conclusiones. Los pacientes con LLC-B y concretamente los ZAP-70+ se caracterizan por presentar una fuerte alteración en el compar-timento de DCs y monocitos que podría estar asociado al peor pronós-tico de estos pacientes y una mayor susceptibilidad de sufrir infeccio-nes.

O-060LA VÍA CANÓNICA DE SEÑALIZACIÓN BMP PARTICIPA EN LAMADURACIÓN DE LAS CÉLULAS DENDRÍTICAS HUMANAS.V.G. Martínez, C. Hernández-López, L. Hidalgo, A. Entrena, J. Valen-cia, A. Zapata, A. Vicente, R. Sacedón, A. Varas. Facultad Medicina, Uni-versidad Complutense, Madrid.

Objetivos. Las Proteínas Morfogenéticas Óseas (BMPs) son facto-res de crecimiento secretados bien conocidos por sus funciones duran-te el desarrollo embrionario, aunque cada vez son más las evidenciasque las implican también en procesos de diferenciación y proliferacióncelular en tejidos adultos, incluyendo el sistema inmunitario. Parteesencial de este sistema son las células dendríticas (DCs) por su eleva-do potencial inmunogénico. En este estudio, se pretende demostrar laexpresión y funcionalidad de la vía de señalización BMP en las célu-las dendríticas humanas.

Material y Métodos. A partir de monocitos de sangre periféricase obtuvieron células dendríticas inmaduras (iDCs) tras cultivo en AIM-V suplementado con IL-4 y GM-CSF. La adición posterior de diferen-tes estímulos madurativos permitió obtener células dendríticas madu-ras (mDCs). La expresión y funcionalidad de los componentes de lavía de señalización BMP se realizó por PCR cuantitativa. Los efectosde la activación de la vía BMP en la supervivencia de iDCs y mDCsfueron analizados por citometría de flujo tras cultivo con BMP-4. Asi-mismo, las iDCs se trataron con BMP-4 para analizar, por citometríade flujo, ELISA y PCR cuantitativa, los cambios en expresión de mar-cadores de maduración, niveles de producción de citoquinas, y capa-cidad aloestimuladora.

Resultados. Tanto iDCs como mDCs expresaban los componen-tes de la vía de señalización BMP. El incremento en la expresión deproteínas Id tras la estimulación con BMP-4 demostró que la vía deseñalización era funcional, y el pre-tratamiento con dorsomorfina

indicó que ocurría mayoritariamente a través de la ruta canónicade las proteínas Smad. El tratamiento con BMP4 disminuyó la tasade apoptosis fundamentalmente en iDCs, mediante un incrementoen la expresión de Bcl-2. La activación de la vía BMP en iDCs condu-jo a la adquisición paulatina de un fenotipo maduro por aumento enla expresión de CD40, CD80, CD86, CD83, PD-L1 y PD-L2, acompa-ñado de un incremento en la secreción de determinadas citoquinas yde la capacidad aloestimuladora. Finalmente, se demostró en iDCsla inducción mediada por BMP-4 de los factores de transcripciónde la familia Runx, cuyos niveles están incrementados en mDCs vsiDCs.

Conclusiones. El presente estudio demuestra que la vía canónicade señalización BMP está implicada en la maduración y superviven-cia de las DCs humanas.

O-061EFECTO IN VITRO DE LA LENALIDOMIDA (REVLIMID®) SOBRECÉLULAS HUMANAS PRESENTADORAS DE ANTÍGENO CD1DPOSITIVAS. J. López Relaño, M. Gómez Del Moral, B. Abós Gracia,E. Martínez-Naves. Facultad de Medicina Universidad Complutense deMadrid.

Introducción. La Lenalidomida es un análogo de la Talidomidacon una reconocida función inmunomoduladora y antitumoral. Es usa-da en el tratamiento de diferentes cánceres hematológicos, síndro-mes mielodisplásicos y tumores sólidos. Se ha descrito su capacidadde activar a las células NKT (Natural Killer T cells), un tipo de linfoci-to T con funciones inmunomoduladoras que reconoce antígenos lipí-dicos presentados por la molécula CD1d, expresada en células presen-tadoras de antígeno, principalmente células dendríticas y monocitos.

Objetivos. Estudiar el efecto de la Lenalidomida en el proceso dediferenciación in vitro de monocitos a células dendríticas inmaduras(iDCs) y a macrófagos.

Material y métodos. Se generaron iDCs y macrófagos a partirde monocitos extraídos de Buffy coats de donantes sanos utilizandoGM-CSF e IL-4, en presencia o ausencia de Lenalidomida. Por citome-tría de flujo se analizó la expresión en superficie de las moléculas deHLA no clásicas CD1d y CD1a; la molécula de HLA clásica HLA-DR;y la molécula coestimuladora de la presentación antigénica CD86 duran-te el proceso de diferenciación de los monocitos a iDCs y macrófa-gos. Se estudió la expresión génica de las moléculas de CD1d y CD1adurante el proceso de diferenciación, mediante la valoración de RNApor la técnica de q-RT-PCR.

Resultados. Las iDCs generadas a partir de monocitos en pre-sencia de Lenalidomida presentaron un aumento de la expresión ensuperficie de las moléculas CD86 y HLA-DR, utilizadas como mar-cadores de maduración, con respecto a las células control. Tambiénse observó un aumento de la expresión en superficie de la moléculapresentadora de antígenos lipídicos CD1d. Existió un aumento deltránscrito del gen de CD1d observado mediante q-RT-PCR bajo estascondiciones.

Conclusiones. La Lenalidomida modifica el proceso de diferen-ciación in vitro de monocitos a macrófagos, generándose iDCs conuna mayor expresión en superficie de las moléculas CD86 y HLA-DR, lo que sugiere un efecto positivo de la droga sobre la madura-ción de las DC y su capacidad presentadora. Así mismo, el efectode la Lenalidomida sobre el aumento de la expresión, tanto a nivelde RNA como en superficie, de la molécula CD1d de las DC gene-

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radas a partir de monocitos, afectará a su reconocimiento por célu-las NKT, como ya ha sido descrito en estudios de citotoxicidad ante-riores.

O-062CÉLULAS NKT HUMANAS RESPONDEN A CÉLULAS DENDRÍ-TICAS TRATADAS CON LÍPIDOS DEL POLEN DE OLIVO (OLEAEUROPEAE) A TRAVÉS DE CD1D. B. Abós Gracia1, M. Gómez delMoral1, J. López Relaño1, L. Castro de las Cuevas2, M.T. Villalba Díaz2,E. Martínez Naves1. 1Facultad de Medicina, Universidad Complutense deMadrid. 2Facultad de Química, Universidad Complutense de Madrid.

Introducción. CD1d es una molécula de tipo MHC no polimór-fica que restringe a células NKT (Natural Killer T). CD1d presenta antí-genos de naturaleza lipídica, tanto endógenos como exógenos, a célu-las NKT.

El polen es uno de los principales agentes ambientales que puedeactuar como antígeno estimulando respuestas alérgicas. En este traba-jo se muestra como las células NKT pueden responder a células den-dríticas tratadas con lípidos del polen de olivo (Olea europeae) a travésde CD1d.

Objetivo. Estudiar si las células dendríticas (DCs) son capaces depresentar antígenos lipídicos procedentes del polen de olivo a las célu-las NKT.

Material y métodos. DCs inmaduras fueron generadas in vitro apartir de monocitos de sangre periférica de donantes sanos mediantesu cultivo con GM-CSF e IL-4. iDCs se trataron durante 48 h con lípi-dos totales del polen de olivo, con la fracción polar (fosfolípidos –PLs–)y la fracción apolar (triglicéridos –TGs–), separadas por cromatogra-fía en capa fina (TLC). Las células NKT se expandieron a partir de célu-las mononucleares de sangre periférica (PBMCs), por cultivo con IL-2 y α-Galactosilceramida. Se analizó la expresión en iDCs de las molé-culas CD1a, CD1d, CD86 y HLA-DR, por citometría de flujo. Los nive-les de ARNm de CD1D, CD1A, CD1B y CD1C fueron cuantificadospor PCR cuantitativa. Por último, se analizaron la producción de IL-4 e IFN-γ (ELISA) y la citotoxicidad (detección con Lactato Deshidro-genasa –LDH–) de NKTs frente a iDCs tratadas con lípidos.

Resultados. Las iDCs tratadas con lípidos de polen de olivo incre-mentaron la expresión de CD1d y de CD86 respecto a las células con-trol. El aumento de CD1d fue aún mayor con la fracción de fosfolípi-dos. La expresión de CD1a y HLA-DR no varió significativamente entrelas células tratadas con lípidos totales y las células sin tratar. Tampo-co hubo variación con la fracción fosfolipídica y de triglicéridos. A niveltranscripcional, la expresión génica de CD1D en iDCs tratadas con lípi-dos totales de polen fue mayor respecto a las células control. Por elcontrario, los niveles de tránscritos de CD1A, CD1B y CD1C disminu-yeron. Las células NKT lisaron de forma eficiente las iDCs tratadas conlípidos totales de polen, pero no las iDCs tratadas con PLs y TGs. Encuanto a la producción de IFN-γ e IL-4 por las NKTs, se detectó unaumento de ambas citoquinas en las iDCs tratadas con lípidos totales.

Conclusiones. Las iDCs tratadas con extractos lipídicos del polende olivo aumentaron la expresión de CD1d, siendo este aumento mayoral tratar con la fracción de PLs. Esto apunta a los lípidos polares comoresponsables de dicho aumento. Por otro lado, las NKTs fueron capa-ces de responder frente a los lípidos del polen, lisando las iDCs trata-das y produciendo además IFN-γ e IL-4.Todos estos datos sugieren quelas células NKT pueden jugar un papel importante en la respuestainmune frente a alergenos como el polen de olivo.

O-063DIVERSIDAD FUNCIONAL DE LOS LIGANDOS DE NOTCH ENLA GENERACION DE LOS DISTINTOS SUBTIPOS DE CELULASDENDRITICAS EN EL TIMO HUMANO. E. Martín Gayo1, M.J. Gar-cía Leon1, B. De Andrés2, M.L. Gaspar2, M.L. Toribio García1. 1Centrode Biología Molecular "Severo Ochoa", Madrid. 2Centro Nacional de Micro-biología. Instituto de salud Carlos III, Madrid.

Previos estudios han identificado dos subtipos de células den-dríticas (DCs) en el timo humano, plasmacitoides (pDCs) y convencio-nales (cDCs), cuya relación ontogénica sigue en debate. Nuestros tra-bajos previos indicaron que las cDCs derivan de los progenitores mul-tipotenciales (MHPs) que colonizan el timo humano a través de unaruta alternativa a la ruta linfoide T, que implica la generación de pro-genitores intermediarios con características mieloides. Estos progeni-tores han perdido el potencial pro-T (progenitores no-T) y mantienenpotencial NK y granulo-monocítico, pero su capacidad de generarpDCs se desconoce. La generación de progenitores no-T se inhibe porla señalización a través de receptores Notch, en favor de la generaciónpro-T. Sin embargo, se desconoce el impacto de Notch en los proge-nitores no-T una vez generados, así como la función de Notch en lageneración de los subtipos de células intratímicas no-T a partir de ellos.Con el fin de analizar estas cuestiones, hemos derivado sistemas expe-rimentales de diferenciación in vitro de MHPs intratímicos humanosCD34+ sobre células estromales de médula ósea (OP9) que carecen deligandos de Notch o expresan selectivamente el ligando Delta-like 1(DLL1) o Jagged-1 (JAG1). Además, hemos realizado estudios de genó-mica comparativa por macroarrays para definir las relaciones ontogé-nicas de diferentes linajes intratímicos T y no-T. Nuestros resultadosindican que, en ausencia de ligandos de Notch, los MHPs se diferen-cian in vitro en progenitores no-T CD5loCD123+ que expresan genesasociados con el linaje DC y con la vía de Notch y son capaces de gene-rar células NK, cDCs y pDCs. Por el contrario, la señalización media-da por DLL1 inhibe la generación de progenitores no-T, aunque JAG1la permite, y ambos ligandos promueven la supervivencia y expansiónde los progenitores CD5loCD123+ una vez generados. Finalmente, DLL1y JAG1 regulan diferencialmente la generación de células NK, cDC ypDC a partir de estos progenitores. En conclusión, nuestros datosdemuestran una función estadio-específica de los diferentes ligandosde Notch y sugieren que su expresión diferencial en el timo humanopodría regular de forma nicho-específica la generación de diferentestipos de DCs y células NK a partir de un progenitor intratímico común.

O-064CALICIVIRUS-LIKE PARTICLES MODULATE PORCINE DEN-DRITIC CELLS IN VITRO. E. Crisci1, C. Lorena1, L. Fraile1, T. Mus-sá1, J. Domínguez2, I. Mena3, J. Bárcena3, M. Montoya1. 1Centre de Recer-ca en Sanitat Animal (CReSA), UAB-IRTA, Campus de la Universitat Autò-noma de Barcelona, Bellaterra, Barcelona. 2 Dpto Biotecnología Instituto Nacio-nal de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA), Madrid.3Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA-INIA), Madrid.

Objective. We have analyzed the immunogenic potential of virus-like particles (VLPs) from rabbit hemorrhagic disease virus (RHDV)in porcine bone marrow-derived dendritic cells (poBMDCs), as wehave previously described in mice(1).

Materials and Methods. VLPs from the capsid protein of RHDVwere generated and constructions correctly assembled into RHDV-

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VLPs. PoBMDCs were generated as previously described(2). Briefly,poBMDC were generated by cultivating porcine bone marrow cells for8 days in RPMI-1640 supplemented with 100 ng/ml recombinant porcinegranulocyte-macrophage colony-stimulating factor (rpGM-CSF, R&D).PoBMDCs were incubated with RHDV-VLPs at two different concentrations(50 and 10 µg/ml) or stimulated with TLR-4 ligand (LPS, 10 µg/ml,SIGMA) as positive control.

PoBMDCs in our assays were CD172a+ SLAI+, SLAII+, CD80/86+,CD11R3+, CD16low, CD163low, CD1low, CD11R1– and CD4– . At four timepoints (4, 8, 16, 24 hours) poBMDC phenotype and production ofcytokines (IFN-α, TNF-α, IL-18, IL6) were analysed.

Results. RHDV-VLPs-stimulated poBMDCs presented activatedphenotype compared with untreated cells. SLAII, SLAI, CD80/86were up-regulated in a dose dependent manner after 24 hours ascompared with untreated cells. Moreover, RHDV-VLPs activatedpoBMDCs for TNF-α, IFN-α, IL-18 and IL-6 secretion in a dosedependent manner.

PoBMDCs were high responders to LPS and RHDV-VLPs comparedto unstimulated cell by cytokine secretion. Sequential kinetics wereinduced whereby IFN-α peaked at 8 hours, IL-18 and TNF-α at 16hours, and IL-6 production progressively increased after 4 hours up to24 hours.

Conclusions. Our data showed that the RHDV-VLPs modulatethe poBMDCs response in vitro supporting their immunogenic potentialfor new vaccine development against animal viral infections.

References1. Crisci E. et al., Virology (2009).2. Kekarainen T. et al., Vet Immunol Immunopathol (2008).

O-065INFECTION BY SWINE, AVIAN AND THE PANDEMIC HUMANINFLUENZA A 2009 VIRUS DIFFERENTIALLY UP-REGULATESURFACE MARKERS AND CYTOKINE SECRETION ON PORCI-NE DENDRITIC CELLS IN VITRO. T. Mussá1, M. Pujol1, C. Rodrí-guez-Cariño1, L. Córdoba1, E. Crisci1, N. Busquets1, J. Maldonado2, J.Dominguez3, L. Fraile1, M. Montoya1. 1Centro de Recerca en Sanidad Ani-mal, Bellaterra. 2Laboratórios HIPRA. 3Departamento de Biotecnología, INIA

Introduction and objective. Dendritic cells (DC) link innate andadaptive immune system, expressing specialized pattern-recognitionreceptors which recognise particular pathogen-associated molecularpatterns. Furthermore, there is growing evidence that the so-called“early” cytokines play an important role in influenza virus infection.Our main goal was to characterize the interaction of porcine bonemarrow derived dendritic cells (poBMDC) with swine, avian and humaninfluenza virus in vitro.

Material and methods. Porcine BMDC were generated and DCmorphology and virus infection evaluated by transmission electronmicroscopy (TEM). poBMDC were stimulated with TLR agonists (Poly-IC, LPS, R837 or CpG or infected with 104 TCID50/f the following virusesA/Swine/Spain/80598-LP1/2007(H3N2), pandemic A/Catalonia/63/2009(H1N1),high pathogenic A/Ckicken/Italy/13474/99(H7N1) andlow pathogenic A/Anas plathyrhynchos/Spain/1877/2009(H7N2).TLR agnonists-stimulated cells were analysed by flow cytometry at24h whereas infected-DC phenotype was analysed at 16 and 24 hours.IFN-α, TNF-α, IL-12 and IL-18 secretion were analysed by ELISA at4, 8, 16 and 24 hours post infection (pi). Virus replication was evaluated

by titration of infected cells-supernatants in Madin-Darby canine kidneycells (MDCK) and by RT-qPCR of infected cells at 4, 8, 16, 24h and48h pi.

Results. Porcine BMDC revealed a defined vacuolar aspect withseveral dendritic processes in the cells by TEM. Control poBMDC inour assays were CD172a+, SLAI+, SLAII+,CD1low, CD4–, CD11R1–,CD11R3low, CD14low, CD16low, CD40–, CD80/86+ and CD163low. Stimulationwith TLR agonists induced up-regulation of SLAI, SLAII and CD80/86and different kinetic profile in secreted cytokines, being high respondersto Poly-IC and moderate responders to LPS. Infected-poBMDC presenteddifferent phenotype by means of SLAI, SLAII and CD80/86 up-regulation.Different cytokine kinetic profile of IFN-α, TNF-α, IL-18 and IL-12 wereobserved depending on the virus used. No viral progeny was detectedin the supernatant of infected-DC. Ultrastructural changes were alsodetected in influenza infected-DC at TEM.

Conclusions. The different responses observed in TLR-stimulatedor influenza infected poBMDC pave the way for understanding therelation between those virus and porcine DC for triggering immuneresponse in swine, a crucial host in this viral infection.

O-066EXOSOME CAPTURE AND PRESENTATION BY HUMAN PLAS-MACYTOID DENDRITIC CELLS. P. Bastos-Amador, B. Pérez-Cabe-zas, M. Naranjo-Gómez, R. Pujol-Borrell, F.E. Borràs Serres. Institu-to de Investigación Germans Trias i Pujol , Badalona.

Introduction. Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) constitute aminor population of blood cells whose best-known function is thesecretion of IFN-I in response to viral infections. It has been broadlyshown that pDCs are also capable of antigen presentation. Yet, theability of these cells to capture and present exogenous antigens has notbeen addressed. Several authors have demonstrated that pDCs maycapture soluble proteins or antigens bound to antibodies. Recently,their ability to phagocytose and present antigens entrapped intomicroparticles has been reported. Since exosomes were described asvesicles bearing functional MHC-peptide complexes the interest in thestudy of their function has increased enormously. These particles (50-100nm) have an endocytic origin, are secreted by several cell types andmight function as a mechanism to spread alloantigens between dendriticcells.

Aim. To evaluate exosome capture by human plasmacytoid dendriticcells.

Methods. Peripheral dendritic cells were isolated from blood ofhealthy donors by sorting. Fluorescent exosomes were purified fromsupernatants of Jurkat T cell line labeled with the lipophilic probeVybrant Dio. Capture of exosomes were performed at 37ºC or 4ºC ascontrol. The uptake was analyzed by flow cytometry and confocalmicroscopy. After 24 hours of capture, pDCs were incubated withautologous T cells (ratio 1:20) to measure exo-induced proliferationusing CFSE loss as a marker.

Results. pDCs capture exosomes in a temperature dependentmanner, although not as efficiently as their counterparts conventionaldendritic cells. In some samples exosome capture by pDCs may reachednearly 70% at 24h but it was never as efficient as obtained for cDCswhich could be nearly 90% positive for Vybrant Dio-labeled exosomesat shorter time points (12h). Exosome uptake doesn’t induce nor preventpDCs maturation induced by specific stimuli. Finally, pDCs are ableto present alloantigens derived from exosomes.

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Conclusions. Recent data pointed out pDCs as a critical cell typein tolerance induction in transplantation and autoimmunity. Captureof exosomes by pDCs may represent a way of alloantigen presentationfor tolerance induction or graft rejection. The mechanism of interactionbetween pDCs and exosomes and their consequences need furtherstudies.

SESIÓN 8: INMUNOGENÉTICA

Moderadores: M. Dolores de Juan (San Sebastián)Manuel Muro (Murcia)

O-067ARTRITIS REUMATOIDE: PREDICCIÓN DEL RIESGO PRODU-CIDO POR LA COMBINACIÓN DE FACTORES AMBIENTALESY GENÉTICOS. J. Varade López1, L. Rodríguez1, M. Fuentes Ferrer1,A. Balsa2, S. Cano3, D. Pascual-Salcedo2, B. Fernandez-Gutierrez3, E.Gomez de la Concha3. 1Hospital Clinico San Carlos, Mostoles. 2HospitalUniversitario La Paz, Madrid. 3Hospital Clinico San Carlos, Madrid

Introducción. La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad auto-inmune de etiología compleja con múltiples factores, tanto ambienta-les como genéticos, implicados en su desarrollo. El locus HLA-DRB1es el principal contribuyente a su desarrollo. Otras regiones involucra-das en la susceptibilidad a AR son PTPN22, STAT4, TRAF1/C5 oOLIG3/TNFAIP3. Dado que los polimorfismos de riesgo asociados aAR solamente incrementan moderadamente la predisposición la com-binación de estos factores junto con otros factores ambientales podríaayudar a anticipar el diagnóstico de esta enfermedad.

En este trabajo analizamos el riesgo de desarrollar la enferme-dad combinando la información de múltiples variantes genéticas yambientales asociadas a la AR.

Material y métodos. Para ello analizamos 737 pacientes de AR y489 individuos sanos como controles. El genotipado de polimorfismosde un solo nucleótido (SNPs) localizados en los loci PTPN22 (rs2476601),STAT4 (rs7574865), 6q23 (rs6920220 y rs10499194 y TRAF1/C5 (rs3791847)se realizó mediante sondas TaqMan. La caracterización de los alelosHLA-DRB1 se realizó por tecnología Luminex. La presencia de anti-cuerpos frente a péptidos citrulinados (anti-CCP) fue analizada porELISA. La información sobre el hábito tabáquico se obtuvo medianteencuesta. Las OR fueron calculadas mediante regresión ordinal con elnúmero de alelos de riesgo como variable independiente para anali-zar el desarrollo de la enfermedad. El análisis de tendencias se realizómediante el test de x2.

Resultados. Los individuos portadores de varios factores de sus-ceptibilidad presentar un riesgo incrementado a padecer AR respec-to al observado para cada marcador de forma independiente (p=2.8x10-9; OR: 3.69 vs. 2.56-1.42 respectivamente), siendo este efecto más pro-nunciado en los individuos que presentan anticuerpos anti-CCP(p=1.08x10-7, OR= 4.58). O más acentuado incluso en los individuosque son o han sido fumadores (p=0.0004, OR=6.28), observándose eneste último caso un efecto similar al encontrado al estratificar la cohor-te simultáneamente por presencia de anticuerpos anti-CCP y el hábi-to tabáquico (p=0.0005; OR=6.38).

Conclusiones. Nuestros datos sugieren que el tabaco actúa prin-cipalmente mediante la inducción de la generación de epítopos citru-linados.

O-068ASOCIACIÓN DEL GENOTIPO IL-10/TNFA EN PACIENTES DEARTRITIS REUMATOIDE CON LA RESPUESTA CLÍNICA A COR-TICOIDES, NIVELES DE CITOCINAS Y CÉLULAS TREG. B. dePaz Cazón1, M. Alperi López2, F.J. Ballina García2, C. Prado Cueto1,C. Gutiérrez Martín2, A. Suárez Díaz1. 1Universidad de Oviedo, Oviedo.2Hospital Universitario Central de Asturias, Oviedo.

Objetivos. Analizar la posible influencia de los genotipos funcio-nales de IL-10 y TNFα en la respuesta clínica al tratamiento en pacien-tes de artritis reumatoide (AR) así como su efecto sobre los nivelesde citocinas y células Treg.

Métodos. Se determinaron los polimorfismos genéticos presentesen el promotor de IL-10 (-1082G/A) y TNFα (-308G/A) mediante ampli-ficación e hibridación con sondas aleloespecíficas. Los niveles séricosde citocinas se cuantificaron mediante ELISA, el porcentaje de célulasCD4+CD25high por citofluorimetría y la expresión de Foxp3 medianteRT-PCR a tiempo real. La respuesta clínica tras 6 meses de tratamien-to (n= 125) se determinó mediante el cambio en la actividad de la enfer-medad (ΔDAS28) y el porcentaje de respuesta al tratamiento (ACR).

Resultados. Mediante análisis de regresión lineal se encontró queel genotipo alto productor de IL-10 se asocia con una mayor respues-ta al tratamiento, específicamente a la terapia con prednisona (p=0,0003).El estudio del efecto combinado de los polimorfismos de ambas cito-cinas indicó una asociación del genotipo alto IL-10/bajo TNFα con labuena respuesta a este tratamiento (p=0,001). Por otra parte, la cuan-tificación de citocinas séricas mostró niveles incrementados de TNFα,IL-6 e IL-18 en pacientes (n=196) comparados con controles, encon-trándose una disminución de TGFβ e IL-10. Sin embargo, en los pacien-tes analizados al diagnóstico (n=32) sólo se encontraron diferenciassignificativas en los niveles de IL-6 y TGFβ. No se encontraron dife-rencias en los niveles de IL-17, el porcentaje de células CD4+CD25high

y la expresión de Foxp3. El tratamiento recibido por los pacientes nomostró efectos significativos sobre los niveles de citocinas o de célulasTreg. Sin embargo, los pacientes tratados con prednisona portadoresdel genotipo buen respondedor a corticoides presentaron niveles máselevados de TGFβ, FoxP3 y células Treg que los pacientes con otrosgenotipos, mientras que los niveles relativos de TNFα e IL-17 eranmenores.

Conclusión. Los pacientes de AR con el genotipo alto productorde IL-10/bajo de TNFα presentan una mejor respuesta al tratamien-to con prednisona, que puede ser debida, al menos en parte, a un incre-mento en los niveles de Foxp3 y células Treg junto con una reducciónde mediadores inflamatorios.

O-069PATRÓN DE EXPRESIÓN DE MICRORNAS EN CÉLULAS CD4DE PACIENTES CON LUPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO. J.M.Lucena, A.M. Escalera Cardenas, C. Abad Molina, A. Nuñez Roldan,J.R. García Lozano, M.F. Gonzalez Escribano. Hospital UniversitarioVirgen Del Rocio, Sevilla.

Objetivo. Determinar el patrón de expresión de microRNA encélulas T CD4+ de sangre periférica en pacientes con lupus eritema-toso sistémico (LES).

Material y Métodos. Se incluyeron muestras de 7 pacientes conLES: 4 asintomáticos y 3 en fase activa y 3 controles sanos. Las célu-las T CD4+ se aislaron a partir de sangre periférica mediante micropar-


tículas magnéticas conjugadas con anti-CD4. El RNA se obtuvo con elmiRNeasy Mini Kit separándolo en dos fracciones: una que contieneel RNAm y otra con los RNA de menos de 200 nucleótidos que inclu-ye los microRNA. El cDNA se sintetizó con sistema Multiplex RT y elanálisis de expresión se realizó mediante Real-Time PCR con las tarje-tas microfluídicas TaqMan® Low Density Array A Human MicroRNAPanel v2.0 que incluyen 378 microRNA. El análisis estadístico se rea-lizó con el programa StatMainer. Como controles internos se utiliza-ron RNU48, RNU44 y U6.

Resultados. El microRNA U6 tuvo que ser descartado como con-trol interno porque se obtuvieron diferencias significativas en cuantoa su nivel de expresión entre el grupo de pacientes y controles. LosmicroRNA, miR-224, miR-143, miR-376c y miR-485-3p se encontraronsobreexpresados en pacientes con LES respecto a controles sanos. ElmicroRNA, miR-576-5p, por el contrario, presentaba una expresiónmás baja en pacientes con LES que en controles sanos.

Conclusiones. Las células T CD4+ de sangre periférica de pacien-tes con LES presentan un patrón de expresión de microRNA distintoal de población sana.

O-070ASOCIACIÓN DEL GEN TNF∞ CON LA SÍNTESIS INTRATECALDE IGM EN PACIENTES DE ESCLEROSIS MÚLTIPLE. M. L. Cava-nillas1, J.C. Álvarez-Cermeño2, M. Bartolomé1, M. Espiño2, R. Arroyo1,E. Urcelay1, L.M. Villar2. 1Hospital Clínico San Carlos, Madrid. 2HospitalRamón y Cajal.

Introducción. La heterogeneidad entre los pacientes de esclerosismúltiple (EM) en el curso de la enfermedad y en la respuesta a fárma-cos, podría reflejar distintos mecanismos patogénicos derivados deuna heterogeneidad genética. Esta diversidad también se evidencia alestudiar las bandas oligoclonales IgM. La síntesis intratecal de IgM seproduce en un 40% de los pacientes de EM que presentan brotes y estárelacionada con un curso más agresivo.

El factor de necrosis tumoral α (TNFα) es una citoquina secretadapor macrófagos activados presente en lesiones crónicas y agudas deEM. Existe síntesis intratecal de TNFα en pacientes con EM, y el nivelde esta citoquina en LCR podría correlacionar con la progresión de laenfermedad, pues su secreción aumenta durante los brotes.

Estudios en distintas poblaciones caucásicas asociaron polimor-fismos del promotor del gen TNFα, localizado en el complejo HLA,con la susceptibilidad a EM independientemente del HLA-DRB1*1501.

Objetivo. Analizar si la síntesis intratecal de anticuerpos IgM oli-goclonales pudiera asociarse con polimorfismos del gen TNFα.

Material y métodos. El estudio se realizó en 44 pacientes de EMcon bandas oligoclonales IgM restringidas en LCR (M+), en 100 pacien-tes sin dichos anticuerpos (M-) y en 600 controles. Se procedió al geno-tipado de 4 polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) del promotordel gen TNFα, utilizando tecnología Taqman y se analizaron tambiéndos microsatélites. El genotipado de las muestras de EM fue ciego parael estatus IgM de los pacientes. El análisis estadístico se realizó con eltest Chi-cuadrado (Epi Info v. 6.02). Las frecuencias haplotípicas fue-ron estimadas con el algoritmo de expectación-maximización (Haplo-view 6.0).

Resultados. Los SNPs TNF-238 y TNF-376 mostraron diferenciassignificativas en sus frecuencias alélicas entre los dos grupos de EM(29M+ y 59M–) en una primera población y la replicación en una pobla-ción independiente obtuvo resultados concordantes. El análisis global

evidenció diferencias fuertemente significativas al comparar las fre-cuencias alélicas entre los grupos M+ y M– (TNF-238: 19% vs. 4%; p=0.0003 y TNF-376: 17% vs. 2%; p=0.0002). Las frecuencias de los alelosminoritarios de TNF-376 y TNF-238 se asociaron con una OR de 3.97(p=9.6x10-6) y de 2.54 (p=0.0034), al comparar el grupo M+ con el gru-po de controles. El análisis haplotípico con los dos microsatélites noaportó información adicional.

Conclusión. La frecuencia del alelo TNF-376A aumenta casi 4 vecesen el grupo de pacientes de EM con síntesis intratecal de IgM.

O-071ANÁLISIS DE POLIMORFISMOS FUNCIONALES DEL GEN LIL-RA3 (ILT6) POR SECUENCIACIÓN DIRECTA. D. Ordóñez Del Valle,C. Vilches Ruiz. Hospital Universitario Puerta de Hierro, Madrid.

En el Leukocyte Receptor Complex (LRC, 19q13.4) se encuentranvarias familias génicas de receptores del Sistema Inmunológico (LILR,LAIR y KIR) que activan o inhiben a diferentes subpoblaciones leuco-citarias linfoides y mieloides, y que reconocen principalmente molé-culas HLA de clase I. El gen A3 de la familia LILR (denominado pre-viamente ILT6, LIR-4, CD85e o HM43) presenta en el 23,3% de los espa-ñoles una deleción de 6’7 kb que afecta prácticamente a toda su regióncodificante. Esta deleción se asocia de manera significativa a un mayorriesgo de padecer ciertas enfermedades autoinmunes, como la Escle-rosis Múltiple (EM) o el Síndrome de Sjögren. Nosotros hemos demos-trado que el riesgo de padecer EM se ve potenciado (Odds Ratio = 9,2;95% CI = 4.08 - 20.75; p-valor < 10-6) por la presencia conjunta de ladeleción de LILRA3 y del alelo HLA-DRB1*1501.

Por otra parte, en la población japonesa son frecuentes las inser-ciones y los cambios de base que alteran el marco de lectura de LIL-RA3. Estas alteraciones tienen un significado biológico idéntico a lapresencia de la deleción porque inactivan funcionalmente a LILRA3.Además, en la población caucasoide británica se han descrito variospolimorfismos en la secuencia codificante de LILRA3 que inducen cam-bios de aminoácido.

La identificación de todas estas variaciones requiere un análisispreciso del gen completo, tanto de sus regiones codificantes, comode las no codificantes. En este trabajo presentaremos un método deobtención y análisis de la secuencia genómica de LILRA3 mediante unaPCR de larga distancia que cubre toda su porción codificante (4,95 Kb),así como un resumen de los resultados obtenidos hasta el momento. *Este trabajo ha sido financiado por un proyecto de investigación de la Funda-ción LAIR

O-072VARIACIONES GENÉTICAS EN IL28B E INFECCIÓN DEL VIRUSDE LA HEPATITIS POR DIFERENTES GENOTIPOS VIRALES. C.Abad Molina, M.A. Montes Cano, J.R. García Lozano, M. RomeroGomez, N. Barroso, J. Aguilar Reina, A. Nuñez Roldan, M.F. Gonza-lez Escribano. Hospital Universitario Virgen del Rocío, Sevilla.

Introducción. Factores genéticos del hospedador pueden modifi-car el curso de la infección por el virus de la hepatitis C (VHC). Recien-temente, se ha asociado el locus IL28B con la respuesta al tratamien-to en personas infectadas con el VHC.

Objetivo. Investigar la relación del locus IL28B con la infecciónpor VHC.

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Material y Métodos. Se incluyeron un total de 731 individuos: 284con infección persistente (210 infectados por genotipo viral 1 y 66 porgenotipo viral no-1), 69 individuos aclaradores espontáneos y 378 noinfectados como grupo control. Los datos de respuesta al tratamientose conocían en 219 pacientes, 113 de ellos tenían una respuesta soste-nida al tratamiento y 106 no la presentaban. El genotipado se realizóusando sondas Taqman. La comparación de la distribución de frecuen-cias genotípicas y alélicas se realizó mediante x2.

Resultados. El genotipo CC se encontró aumentado en: a) Pacien-tes infectados por genotipo viral no-1 (66.7% frente a 39.1% en pacien-tes infectados por el genotipo viral 1, p = 8.5 x 10-5, OR = 0.32, 95%CI0.17-0.60); b) Pacientes que presentan aclaramiento viral espontáneo(72.5% frente a 45.6% de los individuos que presentan infección per-sistente, p = 6.2 x 10-5, OR = 0.32, 95%CI 0.18-0.57); y por último, c)Pacientes con respuesta sostenida al tratamiento (60.2% frente a 32.1%encontrado en pacientes que no tienen una respuesta sostenida altratamiento, p = 3.2 x 10-5, OR = 0.31, 95%CI 0.17-0.56)

Conclusión. Nuestros resultados sugieren una preferencia del geno-tipo viral por infectar a determinadas variantes de IL28B, así como aso-ciación de este locus a la respuesta natural y mediada por tratamiento.

O-073ANÁLISIS DE POLIMORFISMOS EN EL GEN IRF5 EN SUBGRU-POS DE PACIENTES CON ESCLEROSIS MÚLTIPLE. M.D.C. CénitLaguna1, K. Vandenbroeck2, I. Alloza2, A. Antigüedad3, D. Otaegui4,J. Olascoaga4, M. García Barcina3, V. De Las Heras1, R. Alvarez-Lafuen-te1, M. Fernández-Arquero1. 1Hospital Clínico San Carlos, Madrid. 2Neu-rogenomiks, Universidad del País Vasco. 3Hospital de Basurto. 4Inst. Inves-tigación Sanitaria Biodonostia.

Objetivos. La Esclerosis Múltiple (EM) es una enfermedad infla-matoria crónica desmielinizante que afecta al sistema nervioso central.Aparece en individuos genéticamente predispuestos tras la exposicióna ciertos factores ambientales. Solamente se conoce el 50% de la car-ga genética responsable de dicha enfermedad. Esto pudiera ser debi-do, entre otras causas, a la existencia de genes que afecten solamentea un subgrupo de pacientes o a genes cuyo efecto se vea modificadopor la interacción con otros genes o con el ambiente. El gen IRF5 hasido asociado a varias enfermedades de carácter autoinmune. Un recien-te estudio mostró asociación de polimorfismos en IRF5 con la sus-ceptibilidad a padecer EM.

Evaluamos la asociación de polimorfismos en IRF5 con la suscep-tibilidad a EM y analizamos su posible asociación con el subgrupode pacientes de EM con replicación activa de Herpes Virus 6 (HHV-6A) y con el grado de respuesta a interferón-β.

Materiales y métodos. Genotipamos los SNPs rs4728142 yrs3807306 en 1496 pacientes de EM y 1506 controles mediante tecno-logía TaqMan. Los pacientes tratados con interferón-β fueron clasifi-cados como respondedores y no respondedores a dicha terapia aten-diendo a criterios clínicos. Mediante PCR cuantitativa a tiempo real sedeterminó la presencia del HHV-6A en suero. Se comparan las frecuen-cias génicas mediante el test x2.

Resultados. El análisis combinado de nuestros datos con los delestudio previo publicado muestra la asociación de los polimorfismosrs4728142 y rs3807306 con la susceptibilidad a padecer EM (ORMantel-

Haenszel=1,14 (p≤ 0,002)).Observamos que la frecuencia del alelo rs3807306T está signifi-

cativamente incrementada en el subgrupo de pacientes con replicación

activa del HHV-6A con respecto al subgrupo de pacientes que no pre-sentan replicación (p=0,05) y con respecto a controles (p=0,016, OR(95% CI)= 1,61 (1,07- 2,43)).

Además, la frecuencia del alelo rs3807306T parece incrementadaen el subgrupo de pacientes respondedores a interferón-β con res-pecto a los pacientes no respondedores (p=0,09) y con respecto a con-troles (p=0,15, OR (95% CI)= 1,24 (0,91- 1,68)).

Conclusiones. El efecto descrito en EM del gen IRF5 parece deber-se principalmente al subgrupo de pacientes que presentan replicacióndel HHV6-A. El gen IRF5 pudiera tener cierto papel en el grado de res-puesta a interferón-β.

O-074ANÁLISIS DEL REPERTORIO DE PÉPTIDOS ASOCIADOS AHLA-DR EN BAZO HUMANO. J.A. Collado Miguens, I. ÁlvarezPérez, L. Muixí Ponsà, M. Carrascal Pérez, D. Jaraquemada. Univer-sidad Autónoma de Barcelona, Bellaterra.

Introducción. El bazo es el principal órgano linfoide secundariodonde se desarrolla la respuesta inmune adaptativa frente a antíge-nos procedentes del torrente sanguíneo. Para ello es necesaria la inter-vención de los linfocitos T CD4+, que responden a complejos for-mados por las moléculas de MHC de clase II propio con péptidosantigénicos procedentes de patógenos o proteínas propias alteradas.En condiciones no patológicas, las células presentadoras muestranpéptidos propios a los linfocitos T. El conjunto de estos péptidos esrepresentativo de los proteomas celulares presentes en el bazo, asícomo del material extracelular captado por las APCs. Aunque hayuna gran base de datos sobre los péptidos asociados a moléculas deHLA en células linfoblastoides, sólo recientemente se ha empezadoa abordar el análisis sistemático de los repertorios peptídicos asocia-dos a moléculas de HLA procedentes de tejido humano, aunque aúnno hay estudios sobre qué péptidos se presentan en bazo en ausen-cia de infección.

Objetivo. Estudio del repertorio de péptidos asociados a HLA declase II, presentados en condiciones fisiológicas, en el bazo humano

Material y métodos. Se partió de muestras de tejido congeladas(N=3) que se sometieron individualmente a un proceso de homogeni-zación mecánica y se lisaron en presencia de un detergente no iónico(NP-40) para la solubilización de los complejos péptido-MHC. Se hizouna inmunopurificación del lisado con un anticuerpo anti-HLA-DR(B8.11.2), acoplado a sefarosa. Se eluyeron los complejos pMHC en con-diciones ácidas, desnaturalizando todo el complejo. Los péptidos aso-ciados al HLA-DR se purificaron mediante ultrafiltración utilizandocentricones con un tamaño de corte de 10kDa. Los péptidos purifica-dos se desalaron y se fraccionaron por SCX-HPLC. Las diferentes frac-ciones peptídicas se analizaron por espectrometría de masas en un LTQacoplado “on line” a una RP-HPLC para una mejor resolución de losespectros de secuenciación.

Resultados. Se han secuenciado 1678 péptidos correspondientesa 646 proteínas, algunas comunes entre las diferentes muestras. Losdatos han permitido el estudio de la procedencia de las proteínasparentales, la distribución de tamaño y la importancia de la ruta depresentación de los péptidos asociados a HLA-DR en condicionesfisiológicas. Los repertorios fisiológicos de péptidos de clase II pro-venientes de bazo humano se han comparado con sistemas no fisio-lógicos como son las líneas celulares linfoblastoides. Los datos mues-tran un gran solapamiento de los repertorios de cada alelo estudia-

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do, con una diferencia notable: un porcentaje considerable de pép-tidos del bazo (entre el 34 y el 56%) proceden del espacio extracelu-lar, de proteínas parentales tanto solubles como componentes del cito-esqueleto.

Conclusiones. Se presenta el mayor análisis del repertorio pep-tídico asociado a HLA-DR en un tejido linfoide secundario. A pesar deser muestras heterozigotas, la asignación a alelo de los péptidos hasido posible. Los péptidos provienen principalmente de proteínas expre-sadas en células B y de suero y mayoritariamente degradadas en la víaendocítica. La característica principal de estos repertorios en compa-ración de los datos estándar utilizados hasta ahora para definirlos, esla presencia de péptidos de origen extracelular.

O-075IMPLICACIÓN DE LA MOLÉCULA PDCD1 EN LA RESPUESTAAL TRATAMIENTO DE LA INFECCIÓN CRÓNICA POR EL VIRUSDE LA HEPATITIS C. J.R. Vidal Castiñeira, A. López Vázquez, R. DiazPeña, R. Pérez, C. López Larrea. Hospital Universitario Central de Astu-rias, Oviedo.

Objetivos. PDCD-1 (programmed cell death-1) es una moléculareguladora inhibidora de linfocitos T. Varios estudios han descrito unaasociación de diversos polimorfismos del gen PDCD-1 con una seriede enfermedades autoinmunes, como el lupus eritematoso sistémicoo la artritis reumatoide, así como en infección por CMV en trasplanta-dos renales. El presente trabajo tiene como objetivo analizar la posibleimplicación de los polimorfismos de PDCD-1 y sus haplotipos, conla respuesta al tratamiento de la infección crónica por el virus de laHepatitis C (HCV).

Material y métodos. Se incluyeron en este estudio 274 pacientescon infección por HCV. Estos pacientes fueron monitorizados duran-te el tratamiento combinado (Peg-IFN-Alpha y rivabirina) y duranteel periodo post-tratamiento. Al final de este periodo se clasificaron enno respondedores (NR) y en respondedores (R) en función de la pre-sencia de RNA-HCV en suero. Se analizaron los polimorfismos PD-1.3G/A, PD-1.5 C/T y PD-1.9 T/C mediante PCR-RFLP. La expresión dePD-1 en CD4+ y CD8+ se determinó mediante citometría de flujo en 32pacientes. Las frecuencias haplotípicas se determinaron mediante elprograma PLINK.

Resultados. 121 pacientes se clasificaron como NR y 153 pacien-tes alcanzaron una respuesta sostenida. Encontramos una distribuciónde PD-1.3 diferente en los 2 grupos. PD-1.3 A estaba aumentado enpacientes respondedores mientras que PD-1.3 G estaba aumentado enpacientes NR (p=0.008, OR= 2.97, 95% CI=1.28-7.07). No se encontróninguna asociación adicional con la respuesta al tratamiento viral. Seobservó además que el haplotipo CGC (wild-type) se encontraba másaumentado en pacientes NR frente a pacientes que respondían ade-cuadamente al tratamiento (p<0.05, OR= 1.73, 95% CI=1.04-2.88). Final-mente observamos que los pacientes con el polimorfismo PD-1.3 A pre-sentaban una menor expresión PD-1 en CD8+ en comparación con elwild-type.

Conclusiones. Con este estudio identificamos un nuevo factorgenético asociado a la respuesta al tratamiento viral de la infecciónpor HCV. La presencia del polimorfismo PD-1.3 A, asociado a unamenor expresión de PD-1, parece condicionar una mejor respuestaal tratamiento de la infección por HCV, probablemente a causa deuna menor inhibición de la respuesta mediada por linfocitos CD4+

y CD8+.

O-076CONTRIBUCIÓN DE MARCADORES SNPS A LA SUSCEPTIBI-LIDAD A ESPONDILITIS ANQUILOSANTE EN LA REGIÓN CRO-MOSÓMICA 19Q13. R. Díaz Peña1, A.M. Aransay Bañares2, J. Bru-ges Armas3, C. López Larrea1. 1Unidad de Histocompatibilidad y Trasplan-te, Servicio de Inmunología, Hospital Universitario Central de Asturias, Ovie-do, Asturias. 2Unidad de Genómica Funcional, CIC bioGUNE, Parque Tec-nológico de Bizkaia, Derio, Bizkaia. 3Servicio Especializado de Epidemiologíay Biología Molecular, Hospital de Santo Espírito de Angra do Heroísmo, Angrado Heroísmo, Azores, Portugal

Objetivos. Este estudio fue diseñado con el objetivo de llevar acabo un genotipado de alta densidad mediante marcadores SNP enpoblación HLA-B27 positiva dentro de la región cromosómica 19q13y observar su asociación con EA. También se analizaron otros genescandidatos, como IL23R, ERAP1, IL17A, IL10RA, IL17RA, TNFRSF11B,TNFSF11, TNFRSF11A, NOD2, CYP2D6, y otras regiones cromosómi-cas en las que se localizan genes de interés, como el cromosoma 5q (IL3,CSF2, IL4, IL5 y IL13), el cromosoma 21q (IL10RB, IFAR2, IFNAR1 yIFNGR2) y el cromosoma 2 (genes de familia IL1).

Material y métodos. Se analizaron 249 pacientes EA y 302 contro-les sanos, HLA-B27 positivos. Se diseñó un panel a la carta que conte-nía 1536 tag SNPs entre los genes y regiones candidatas seleccionadas,basándose en las frecuencias alélicas europeas descritas por el proyec-to HapMap. El genotipado de alta densidad se llevó a cabo utilizandola tecnología Golden-Gate (Illumina-Inc.’s). Todos los individuos fue-ron tipados para HLA-B.

Resultados. Dos SNPs (rs8111398 y rs1055234) en dos genes dife-rentes (LAIR2 y CNOT3) revelaron asociaciones significativas con EA(P<10-3). Análisis de haplotipos también revelaron implicación de regio-nes en EA: Región comprendida entre los genes CDC42EP5 y LAIR2(~15.5 kb; P<0.0005); y entre CNOT3 y TMC4 (~6.7 kb; P<0.001). Ade-más, definiendo bloques haplotípicos, 2 bloques de 2 y 3 SNPs locali-zados entre los genes CDC42EP5 y LAIR2 mostraron asociacion conEA (P=9.0x10-4 y P = 0.001, respectivamente).

Conclusiones. El trabajo permitió encontrar regiones localizadasdentro del cromosoma 19q asociadas a EA. Estas regiones se localizanpróximas a genes candidatos en la susceptibilidad a EA, concretamen-te LAIR2 y CNOT3. En el estudio se hipotetiza con el papel que LAIR2podría tener en el incremento de la susceptibilidad a EA, ya que escapaz de unir péptidos de colágeno, pudiendo actuar de mediadorproinflamatorio.

O-077IDENTIFICACIÓN DE LIGANDOS DE HLA-DR DERIVADOS DELA SEMENOGELINA-1 EN TIMO HUMANO. I. Álvarez1, R. Colo-brán2, J. Collado1, F. Canals3, B. Kyewski4, R. Pujol-Borrell2, D. Jara-quemada1. 1Unitat dÍmmunologia. Institut de Biotecnologia i Biomedicina.,Bellaterra. 2Institut dÍnvestigació en Ciències de la Salut Germans, Trias iPujol. 3Institut dÓncologia. Hospital Vall d´Hebron. 4German Cancer Rese-arch Center, Heidelberg, Germany.

Objetivos. El timo es el órgano linfoide donde maduran los linfo-citos T y se genera el repertorio inmunocompetente. Para que los lin-focitos T no reconozcan tejidos propios en periferia, los timocitos sufrenprocesos exhaustivos de selección en el timo, donde los TCRs interac-cionan con complejos de MHC-péptidos propios. Para generar tole-rancia, los péptidos deberían representar todos los potenciales ligan-

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dos de los linfocitos T en periferia, incluyendo aquellos derivados deantígenos específicos de tejido (TRAs). La expresión de algunos TRAsse regula por el Autoimmune Regulator (AIRE). En este trabajo noshemos propuesto describir el repertorio peptídico asociado a HLA-DRen timo humano y comprobar la existencia de péptidos asociados aHLA-DR provenientes de TRAs.

Material y métodos. Se utilizaron muestras de timos procedentesde cirugía cardíaca pediátrica. El tejido se homogeneizó y los péptidosasociados a las moléculas de HLA-DR se purificaron mediante croma-tografía de inmunoafinidad y ultrafiltración. Para la identificaciónde los péptidos asociados a HLA-DR, las muestras peptídicas se ana-lizaron por espectrometría de masas de trampa iónica. Se realizaronexperimentos de PCR cuantitativa (qPCR) para estudiar la transcrip-ción de autoantígenos en diferentes muestras.

Resultados. Se identificaron 131 ligandos naturales de HLA-DRde timo humano. La mayoría de péptidos provenían de proteínas demembrana o extracelulares. Se identificaron dos péptidos (que formanun nested set) procedentes de la semenogelina 1 (codificado por el genSEMG1), una proteína abundante en el semen y potencial TRA. Median-te qPCR se confirmó que la semenogelina-1 es un TRA dependiente deAIRE. Se confirmó la transcripción de la SEMG1 en timo al mismo nivelque otros TRAs. La expresión de SEMG1 estaba restringida a una pobla-ción de células epiteliales tímicas medulares (mTECs) con niveles altosde MHC de clase II.

Conclusión. Mediante el uso de espectrometría de masas y qPCRhemos identificado un ligando natural de HLA-DR procedente de lasemenogelina-1 en timo humano. La semenogelina-1 es un TRA conexpresión tímica similar a otros autoantígenos. La expresión de SEMG1es dependiente de AIRE. La población celular que expresa SEMG1 esuna población de mTECs de alta expresión de MHC de clase II.

SESIÓN 9: INMUNODEFICIENCIAS I

Moderadores: Manel Juan (Barcelona)Margarita López Trascasa (Madrid)

O-078NUEVAS MUTACIONES EN EL GEN TNFRSF6 EN PACIENTESESPAÑOLES CON SINDROME LINFOPROLIFERATIVO AUTOIN-MUNE. L. Martínez-Martínez1, C. González-Santesteban1, M.V. Rubia-les1, M. Pradas1, M.Á. Martínez-Carretero1, Y. Barrios2, P. Soler3, I.Badell1, O. de la Calle-Martín1. 1Hospital Sant Pau- UAB, Barcelona. 2Hos-pital Universitario de Canarias. 3Hospital de la Vall d'Hebrón, Barcelona.

Objetivos. El Síndrome Linfoproliferativo Autoinmune (ALPS) esuna alteración genética que afecta a la apoptosis. El ALPS se caracte-riza por la aparición durante la infancia de linfoadenopatías, hepato-esplenomegalia, citopenias autoinmunes y aumento (>1,5%) de lin-focitos T doble negativos (DNT: CD3+/TCRalfa-beta+/CD4-/CD8-) ensangre periférica. La mayoría de los casos (>65%), conocidos comoALPS tipo Ia, están causados por mutaciones herterozigotas dominan-tes en la línea germinal en el gen TNFRSF6, que codifica la proteínaCD95 (Fas).

Material y Métodos. El estudio incluyó a 32 pacientes proceden-tes de diferentes hospitales españoles que cumplían criterios clínicos(linfoadenopatía, esplenomegalia y/o citopenias) y de laboratorio(hipergammaglobulinemia y elevadas células T DN) de ALPS. Se ana-

lizó el gen TNFRSF6 en todos los pacientes. En casos seleccionados enlos que no se hallaron mutaciones en dicho gen, se analizaron TNFSF6(Fas ligando) y CASP-10 (caspasa-10).

Resultados. 26 de los pacientes (86%) eran heterocigotos para unamutación única en el gen TNFRSF6 (ALPS Ia). Se describieron 7 alte-raciones diferentes que afectaban a los exones 2, 8 y 9. Cuatro de estasmutaciones no habían sido previamente descritas (E20X, Y216fsX13,IVS8+3A->G y L226P). Estas mutaciones incluían inserciones, defectosde splicing, mutaciones missense y nonsense. Los otros 6 pacientes notenían mutaciones ni en TNFRSF6, TNFSF6 ni CASP-10, por lo que fue-ron clasificados como ALPS tipo III. Los pacientes ALPS Ia tenían nive-les séricos muy elevados de IL-10 e IgE comparado con los controlesy familiares portadores de la misma alteración. Estos marcadores seencontraron elevados en los pacientes ALPS III pero de una forma notan remarcable, a excepción de un caso. Este último caso es una niñacon una clínica muy severa de ALPS con niveles muy elevados de IL-10, IgG, IgA e IgE. En esta paciente se descartaron mutaciones enTNFRSF6, TNFSF6, CASP-8, CASP-10, N-Ras y FADD.

Conclusiones. La combinación de elevados linfocitos T DN(>1,5%) con niveles séricos incrementados de IL-10 e IgE está fuerte-mente asociado a mutaciones en Fas. Esto permite la orientación de lospacientes con signos clínicos de ALPS a una evaluación más directahacia la secuenciación del gen TNFRSF6 y otros genes relacionadoscon la apoptosis. En estos pacientes se han descrito 4 nuevas mutacio-nes en TNFRSF6 (E20X, Y216fsX13, IVS8+3A->G y L226P), así como2 familias con numerosos miembros afectos.

O-079DIVERSIDAD CLÍNICA EN UNA FAMILIA CONSANGUÍNEACON MUTACIONES EN EL GEN RAG-1. L. Martínez-Martínez1, C.González-Santesteban1, M.V. Rubiales1, M. Pradas1, I. Badell1, P. Soler2,O. de la Calle-Martín1. 1Hospital Sant Pau- UAB, Barcelona. 2Hospital dela Vall d'Hebrón, Barcelona.

Objetivos. Las mutaciones en los genes RAG causan Inmunode-ficiencia Severa Combinada (SCID), Síndrome de Omenn (OS) o unfenotipo intermedio denominado Omenn-like. Además de la mutaciónexisten otros factores que determinan el fenotipo final. Presentamos3 casos de una misma familia con presentación clínica y evolución muydiferentes.

Material y métodos. El caso clínico 1 es un varón caucásico naci-do en el año 2005, que a partir del segundo mes de vida sufre múlti-ples cuadros infecciosos (pielonefritis, muguet oral, enteritis) acompa-ñados de eritrodermia exfoliativa. Es trasplantado a los 8 meses devida de un hermano no HLA idéntico (9/10). La evolución del TMOfue excelente, sin embargo, a los 21 meses post-TPH se detecta un súbi-to empeoramiento con resultado fatal. El caso 2 es un varón prema-turo, hermano del caso 1, nacido en 2009, que desde el nacimiento sufreeritrodermia exfoliativa generalizada con todo tipo de complicacionessistémicas que le llevan al exitus en el segundo mes de vida. El caso 3es una niña prematura, prima hermana de los dos casos anteriores,nacida en 2010 y también con eritrodermia generalizada. Se trata deuna familia consanguínea con antecedentes previos de fallecimientosen la infancia.

Ante la sospecha diagnóstica de SCID/OS, se realizan estudios depoblaciones linfocitarias por citometría de flujo, ensayos de linfopro-liferación y determinación de niveles de inmunoglobulinas. Así mis-mo, se secuencian los genes RAG-1 y RAG-2.

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Resultados. El caso 1 presentaba linfopenia con ausencia de lin-focitos B e inversión del cociente CD4/CD8. Los linfocitos T eran pro-pios y expresaban CD45RO en superficie, pero los ensayos de linfo-proliferación demostraron que eran anérgicos. Tras el TPH, las pobla-ciones se normalizaron, incluyendo los linfocitos B. Sin embargo, elinfiltrado masivo acompañado de sepsis coincide con una nueva ausen-cia de linfocitos B y aumento de IgE. El caso 2 presentaba linfocitosis,sin inversión del cociente CD4/CD8 pero también con ausencia de lin-focitos B. Los linfocitos T eran de memoria con marcadores de acti-vación (HLA-DR), de lo que se deduce una expansión en periferia. Elcaso 3 presentaba linfopenia, con ausencia de linfocitos B y sin inver-sión del cociente CD4/CD8. Sus linfocitos T también eran CD45RO+.Los niveles de IgG, IgA, IgM e IgE eran indetectables en los casos 1 y2; por el contrario, en el caso 3, a pesar de la ausencia del resto deisotipos, los niveles de IgE eran muy elevados (364 UI/mL), lo quetambién ocurrió en el caso 1 tras la recidiva post-TPH de su enferme-dad (313 UI/mL).

El análisis de los genes RAG mostró una deleción en homocigosisen el gen RAG-1 de todos ellos: c.631delT (mutación previamente des-crita). Los padres eran portadores de la misma.

Conclusiones. Los 3 pacientes tenían la mutación c.631delT, sinembargo, el caso 1 debutó con un SCID aunque tras el TPH rebrotócomo un OS; el caso 2 presentó un síndrome mixto SCID/OS, mien-tras que el caso 3 tiene una presentación típica de Omenn.

O-08030 ANOS DE EXPERIENCIA EN EL HOSPITAL DOCE DE OCTU-BRE EN EL SEGUIMIENTO DE LA ENFERMEDAD GRANULO-MATOSA CRÓNICA (CGD). V. Pérez-Aradas, E. Mancebo, S. Lermo-Rojo, P. Talayero, J. Ruíz-Contreras, L.I. González-Granado, P. Rojo,D. Blázquez, M.J. Torres Collado, L.M. Allende. Hospital Doce de Octu-bre, Valdemoro.

Objetivos. El presente estudio describe las características clínicasy epidemiológicas, las infecciones detectadas, y los principales micro-organismos que infectan al grupo de pacientes con CGD en estudio(1980-2010).

Materiales y métodos. En este trabajo se incluyen 14 pacientescon CGD procedentes de la Unidad de Inmunodeficiencias en un perio-do de 30 años. Los pacientes con sospecha clínica de CGD se les rea-lizó estudio inmunológico: NBT, bioluminiscencia o citometría de flu-jo utilizando el ensayo oxidativo DHR y se confirmó mediante estu-dio genético.

Resultados. Un total de 14 casos fueron diagnosticados de CGD,provenientes de 10 familias distintas; de los cuales el 86% mostró unaherencia ligada al X y el resto herencia autonómica recesiva. La edadde inicio de síntomas estuvo comprendida entre los 4 y 144 meses, conuna media de 34 meses. La edad media del diagnóstico fue de 11,5 años(6 m– 17a). Los procesos infecciosos más frecuentes fueron: la neumo-nía (15,4%), la adenitis cervical (12,5%), fiebre de origen desconocido(10,2%), osteomielitis (8,8%) abscesos (8,1%), entre otros. De estos, seaisló organismo causal en el 28,6% de los casos. Los principales gérme-nes aislados fueron: Staphylococcus aureus y Salmonella sp (23%cada uno),Serratia marcescens, Streptococcus, Nocardia y Aspergillus fumigatus (5,8%cada uno), entre otros. Se objetivó la presencia de granulomas en un5,1% de los casos, siendo ésta la principal complicación no infecciosa.

Conclusiones. La clínica de la CGD es heterogénea, sin embargo,es la neumonía su forma de presentación más frecuente. El tiempo trans-

currido desde el inicio de los síntomas hasta el diagnóstico genéticoes prolongado, por tanto, consideramos de gran importancia el cono-cimiento de esta patología por parte de los equipos clínicos, para queante la sospecha de una probable CGD se pueda actuar de forma inme-diata con los procedimientos diagnósticos y terapéuticos pertinentes.

O-081DOS NUEVAS MUTACIONES EN ATM EN UN CASO DE ATAXIA-TELANGIECTASIA. R. López Blanco1, M.J. Bernal1, M.T. Martínezde Saavedra1, M. Ley1, A. Brusco2, C. Rodríguez1, F. Mora1. 1H.U. Puer-ta del Mar, Cádiz. 2Universidad de Turín, Italy

Un niño de 3 años y 6 meses fue remitido a consulta de Inmuno-logía con sospecha de Ataxia-telangiectasia para valoración de funcióninmune y estudio genético. Presentaba ataxia de la marcha y alteracio-nes oculomotoras, leves telangiectasas oculares y niveles de alfafeto-proteína elevados. Presentó infecciones respiratorias de repetición yun episodio de neumonía, con buena respuesta al tratamiento antibió-tico. Había completado el calendario vacunal para la edad, incluyen-do triple vírica, sin reacciones adversas. El estudio de inmunidad mos-tró las siguientes alteraciones: deficiencia de IgG2 e IgG3 y niveles ele-vados de IgM. La producción de Ac frente a polisacáridos y VHB fueadecuada, pero no produjo niveles protectores de Ac frente a saram-pión, rubeola ni parotiditis. El fenotipo linfocitario mostró elevaciónde células NK, de linfocitos T de memoria y de linfocitos T gammadel-ta. La respuesta proliferativa in vitro a mitógenos fue normal.

La secuenciación del mensajero el gen ATM mostró una deleciónde dos pares de bases (c.8873_8874delTT) en heterocigosis. Esta muta-ción no está descrita en la literatura. A nivel de la proteína la mutacióndaría lugar a un codón de STOP en el primer triplete después de ladeleción (p.F2958X) como resultado se produciría un proteína trunca-da que carece de los 99 aminoácidos del extremo carboxilo terminal.Con una probabilidad muy alta se trata de una mutación patogénicadada la importancia del cambio estructural que ocurriría en la prote-ína, el cual afecta al domino catalítico de la misma.

Mediante MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) seconsiguió detectar la segunda mutación: una gran deleción que afec-ta a varios exones del gen ATM. Esta deleción se consiguió caracteri-zar a nivel de ARN mensajero y de ADN genómico. La deleción se pro-duce entre el exon 34 y el intrón 38: (c.5129_5762+1116del9264). EncDNA se detecta un tránscrito que carece de los exones 34 a 38. La pér-dida de estos exones da lugar a un frameshift (p.Glu1669AspfsX16).La proteína que produciría este transcrito carecería de los 1388 amino-ácidos finales. Aunque esta deleción no está descrita, sin duda se tra-ta de una mutación patogénica dadas las importantes consecuenciasdeducidas para la proteína.

O-082CARACTERIZACIÓN INMUNOLÓGICA Y MOLECULAR DE LAPRIMERA FORMA AUTOSÓMICA RECESIVA DE SÍNDROMEHIPER IGE (DOCK8) EN ESPAÑA. S. Lermo-Rojo, E. Mancebo, P.Talayero, V. Pérez-Aradas, J. Ruíz-Contreras, L.I. González-Granado,M. Menchén, M.J. Díaz-Madroñero, S. Sanromán, L.M. Allende. Hos-pital 12 de Octubre, Madrid.

Objetivos. Diagnóstico genético de un paciente con sospecha clí-nica de síndrome Hiper IgE (HIES).

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Paciente y métodos. Paciente varón de 17 años de edad, nacidode progenitores no consanguíneos, madre fallecida de un linfoma. Elpaciente sufre candidiasis mucocutánea desde el primer año de vida,alergia al huevo, asma e infecciones respiratorias recurrentes. Ha des-arrollado enfermedad pulmonar crónica de patrón obstructivo y bron-quiectasias en ambos pulmones. Infecciónes cutáneas por Molluscumcontagiosum. Pápulas en la cara compatibles con epidermodisplasiaverruciforme y numerosas verrugas planas. En el examen inmunoló-gico se aprecian cadenas kappa en sangre y orina, compatibles con unagammapatía monoclonal de significado incierto, eosinofilia con nive-les elevados de IgE y respuesta linfoproliferativa normal. Se realizaestudio genético de la forma autosómica dominante (STAT3) y de larecesiva más frecuente (DOCK8).

Resultados. El paciente no presenta alteraciones en el gen STAT3,mientras que en DOCK8 se detecta una deleción del exón 16 a nivel demRNA, debido a una mutación puntual en DNAg en heterocigosis enposición +5 del intrón 16 (GTAAG por GTAAA). Esta mutación cam-bia la pauta de lectura, provocando la aparición de un codón stop pre-maturo. Se observan tanto en el paciente como en su padre, dos SNPsen homocigosis en la región inicial del gen (exones 2 y 3), lo que sugie-re una gran deleción en heterocigosis en esa zona. Los resultados delanálisis de dosis génica apoyan esta sospecha.

Conclusiones. Nuestros resultados documentan el primer casodescrito en España de HIES autosómico recesivo por mutaciones enDOCK8. Los defectos de este gen han de considerarse en pacientes conHIES de clínica típica de la forma recesiva: infecciones cutáneas vira-les, carcinoma o epidermodisplasia de células escamosas, infeccionespulmonares sin pneumatoceles y ausencia de alteraciones extrainmu-nológicas a excepción de afección del sistema nervioso central. El diag-nóstico genético, aunque laborioso es necesario para confirmar el diag-nóstico clínico y proporcionar consejo genético.

O-083CUATRO NUEVAS FAMILIAS ESPAÑOLAS CON DEFICIENCIACOMPLETA DE FACTOR I . M. Alba Domínguez1, M.J. Melero2, J.I.González-Granado3, J.A. Trujillo4, P. Soler5, S. Garrido1, A. López-Lera1,P. Nozal1, M. López-Trascasa1. 1Hospital Universitario La Paz, Madrid.2Hospital Infanta Cristina, Badajoz. 3Hospital Doce de Octubre, Madrid. 4Hos-pital San Pedro de Alcántara, Cáceres. 5Hospital Vall de Hebrón, Barcelona.

Objetivos. El Factor I (FI) es una serín proteasa circulante queactúa como regulador esencial de la cascada del Complemento. Rom-pe e inactiva a C3b y C4b (constituyentes de la C3 y C5 convertasas).

La proteína humana es un heterodímero compuesto por una cade-na pesada (H) no catalítica de 50KDa, unida mediante dos puentesdisulfuro a una cadena ligera (H) catalítica de 38KDa.

La deficiencia de FI, un defecto de herencia autosómica recesiva,ocasiona un consumo incontrolado de C3 (elemento central de las tresvías de activación del Complemento), así como de FB y FH. Esto impi-de tener un mecanismo eficaz de defensa mediado por dicho sistemaperteneciente a la Inmunidad Innata.

Hemos caracterizado bioquímica y genéticamente cuatro familiasque presentaban un perfil clínico sugerente de esta inmunodeficienciaprimaria asociada a bajos niveles de C3.

Material y Métodos. Se obtienen muestras de suero y ADN de 4pacientes y sus familiares directos.

Los niveles de inmunoglobulinas, C3 y C4 se midieron mediantenefelometría. Los niveles de factor I, factor H así como la presencia de

anticuerpos anti-Factor H se analizaron mediante técnicas de ELISA.Además, se ha realizado un análisis cualitativo de Factor I circulantemediante Western Blot.

La actividad hemolítica del complemento (CH-50) y la presenciadel anticuerpo C3 NeF se realizaron mediante ensayos hemolíticos.

Se ha abordado el estudio molecular en los cuatro pacientesmediante técnicas de PCR y secuenciación.

Resultados. Los cuatro pacientes presentaban un perfil compati-ble con activación de la vía Alternativa del Complemento (bajos nive-les de C3, Factor B, Factor H) y ausencia de Factor I.

El estudio molecular está permitiendo identificar las mutacionesresponsables del defecto en cada uno de los cuatro pacientes.

Uno de los pacientes es homocigoto para una mutación ya carac-terizada. Dos pacientes son heterocigotos compuestos para 2 mutacio-nes nuevas y 2 descritas. En el último paciente, aún en estudio, hemoscaracterizado una mutación, ya descrita, en heterocigosis.

Conclusiones. La deficiencia completa del Factor I, regulador delSistema del Complemento, se presenta con una clínica y un perfil deComplemento característico. La clínica se caracteriza por la presen-cia de diversas infecciones de repetición y en algunas ocasiones porprocesos autoinmunes.

Ante la presencia de un perfil de consumo de Complemento pro-longado en el tiempo, deberían incluirse en el estudio de los pacientesel estudio de factores que regulan la vía Alternativa como son: el Fac-tor H, el C3NeF, la Properdina y el Factor I.

La deficiencia de factor I, es un defecto genético que posiblemen-te esté subestimado como ocurre en otras inmunodeficiencias prima-rias, aunque actualmente los análisis de este regulador se realizan enel despistaje bioquímico-genético por la implicación de mutaciones enheterocigosis con el Síndrome Hemolítico Urémico atípico (aHUS).

O-084HIPOGAMMAGLOBULINEMIA SECUNDARIA A RITUXIMABEN PACIENTES CON LNH DE CÉLULA B: IMPORTANCIA CLÍ-NICA, VALORACIÓN Y VALIDEZ DE LA CITOMETRÍA DE FLU-JO EN LA VALORACIÓN DE POLIMORFISMOS DE FC–RIII. P.Carrasco, J. Iglesias, N. Matamoros. Hospital Son Dureta, Palma deMallorca, Llucmajor.

Objetivos. La evidencia científica ha revelado en los últimos añosuna serie de casos clínicos de pacientes con LNH tratados con Rituxi-mab (RTX) que después de la suspensión (mayor a 9 meses) del trata-miento, continúan con una severa depleción de célula B e hipogamma-globulinemia. La importancia de las variantes alélicas en algunos FcγRs,en particular en el receptor de baja afinidad FcγRIIIa (CD16), es cadavez mayor para valorar la eficacia en la terapia con anticuerpos mono-clonales. El polimorfismo G559T del gen FCGR3A (CD16A) resulta endos alotipos del FCγRIIIa; con valina o fenilalanina en la posición 158.Este polimorfismo, modula la unión a IgG1 y el mecanismo de citoxici-dad celular dependiente de anticuerpos (CCDA). Nuestro objetivo esrealizar una evaluación de estos pacientes, determinando la impor-tancia clínica de la hipogammaglobulinemia y estudiar si la presenciadel polimorfismo en el FCγRIIIa es relevante en el contexto de la deple-ción crónica de célula B presente en estos pacientes. Por otra parte pre-tendemos determinar la validez y utilidad clínica de la citometría deflujo (CF) como técnica de screening para valorar dicho polimorfismo.

Material y métodos. Para la estandarización de la técnica de valo-ración de los polimorfismos de FCγRIIIa mediante CF se estudiaron 40

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controles sanos. Se utilizaron los siguientes anticuerpos monoclonales:CD16-FITC (MEM154; Santa Cruz Biotechnology) que requiere la pre-sencia de valina en la posición aminoacídica 158, CD16-FITC (3G8; San-ta Cruz Biotechnology) que presenta igual reactividad para la valina ofenilalanina en la posición 158, Goat anti mouse-FITC (Dako), CD56-PE(BD) y CD3-ECD (BC). Se analizó la expresión de MEM-154 y 3G8 encélulas NK y granulocitos. También se estudiaron 4 pacientes con LNHde célula B que presentaban hipogammaglobulinemia tras 9 meses desuspensión del tratamiento con RTX. Se evaluaron los niveles de inmu-noglobulinas circulantes, población linfocitaria B, historia clínica de infec-ciones y necesidad de terapia sustitutiva con gammaglobulina (GGIV).

Resultados. Todos los pacientes presentaron niveles de IgG<500mg/dl, disminución severa de isotipos IgA e IgM, disminución de sub-clases de IgG, persistencia de depleción linfocitaria de célula B (<3%)y presencia de infecciones de repetición (respiratorias, digestivas y uri-narias principalmente). Al cabo de 6 meses de seguimiento, todoscomenzaron terapia sustitutiva con GGIV. Los resultados prelimina-res de la valoración de la CF como técnica de screening para el estu-dio de los polimorfismos, muestran que no es capaz de discriminarentre los diferentes polimorfismos (F/F, F/V, V/V), si bien estos resul-tados deben ser comprobados por biología molecular.

Conclusiones. Los pacientes estudiados con hipogammaglobuli-nemia secundaria presentaban una importante clínica de infeccionesy confirman que esta nueva inmunodeficiencia requiere de un estudioprevio exhaustivo, seguimiento y probablemente terapia sustitutivacon GGIV. Por otra parte la persistencia de la depleción linfocitaria decélula B, incluso después de 2 años en algunos pacientes, reafirmalas diferencias individuales en respuesta al tratamiento con RTX, loque nos sugiere en relación al polimorfismo de FcγRIIIa la necesidadde su estudio. Los hallazgos de las alteraciones moleculares en estospacientes, clínicos y analíticos, superponibles a los pacientes con Inmu-nodeficiencia Variable Común (IVC), pueden ser útiles para conocerla etiopatogenia de las alteraciones en el stop madurativo de la pobla-ción B que se ha descrito en estos pacientes.

O-085PAPEL DE LA MUTACIÓN A91V EN LINFOHISTIOCITOSISHEMOFAGOCÍTICA FAMILIAR TIPO 2: PREVALENCIA ENPOBLACIÓN MARROQUÍ Y ESPAÑOLA. N. Lanio1, V. Daza1, N.Martínez-Pomar1, N. Romo2, A. Ferreira3, M.C. García3, J.A. Salinas1,G. Fontán3, M. López-Botet2, N. Matamoros1. 1Hospital UniversitarioSon Dureta, Palma de Mallorca. 2Universitat Pompeu Fabra, Barcelona. 3Hos-pital La Paz, Madrid.

Introducción. Mutaciones en el gen de la Perforina-1 (PRF1) se aso-cian a Linfohistiocitosis Hemofagocítica Familiar tipo 2 (FHL2), síndro-me raro de herencia autosómica recesiva, caracterizado por prolifera-ción de histiocitos con marcada actividad hemofagocítica. La sustituciónaminoacídica A91V (c.272C>T) ha sido descrita como un polimorfis-mo neutral en base a su alta frecuencia en algunas poblaciones. Sin embar-go, la evidencia clínica y ensayos funcionales posteriores, han demos-trado que podría tratarse de una mutación que afecta tanto el nivel deexpresión de la proteína, como su capacidad citolítica, especialmente enindividuos heterocigotos compuestos que portan otra mutación en PRF1.

Objetivos. Establecer la prevalencia de dicha mutación en pobla-ción sana marroquí y española. Esclarecer el posible papel patogénicode la mutación A91V en individuos heterocigotos con familiares afec-tos de FHL2.

Paciente y métodos. Estudio molecular del gen PRF1 por secuen-ciación directa de ADN en 145 controles (100 españoles-45 marroquíes).Análisis por citometría de flujo de la expresión de perforina en célu-las NK y ensayo de citotoxicidad contra la línea celular K562, de mujerclínicamente sana de origen marroquí (A91V/G149S), madre de niñoafecto (G149S/G149S).

Resultados. El análisis molecular del gen PRF1 en los controlesrevela que la frecuencia de la mutación A91V es similar a la descritaen series anteriores para raza caucásica y superior en poblaciones endo-gámicas. Los ensayos funcionales realizados para el caso descrito(A91V/G149S), demuestran afectación, tanto en la expresión de per-forina como en la capacidad citotóxica de las NKs. Sin embargo, alpreincubar las células con IL-2 se restaura parcialmente la función cito-tóxica, sin observarse este efecto en el paciente homocigoto(G149S/G149S).

Conclusiones. Los resultados descritos demuestran que la muta-ción A91V en individuos heterocigotos compuestos podría causar defi-ciente función citotóxica y convertir a los portadores en candidatos asufrir un cuadro clínico más suave y/o de aparición tardía. Por tan-to, recomendamos un seguimiento clínico preventivo, especialmentesi se detecta otra mutación en PRF1, UNC13D o STX11. La alta frecuen-cia observada de la mutación A91V en la población control, aconsejaampliar el estudio molecular a los familiares de pacientes con FHL2,valorando siempre su presencia.

O-086LOS LINFOCITOS B DE PACIENTES CON INMUNODEFICIEN-CIA VARIABLE COMÚN PRODUCEN NIVELES REDUCIDOS DEINMUNOGLOBULINAS EN RESPUESTA A LIGANDOS DE TLR9(CPG-ODN) O ANTI-CD40 + IL-21. A. Clemente Ximenis, J. Pons DeVes, N. Matamoros Flori, J. Iglesias Alzueta, C. Martínez García, J.M.Ferrer Balaguer. Instituto Universitario de Investigación en Ciencias de laSalud (IUNICS), Hospital Universitario Son Dureta, Palma de Mallorca.

La Inmunodeficiencia Variable Común (IVC) es un defecto humo-ral caracterizado por hipogammaglobulinemia, pobre respuesta a vacu-nación y mayor susceptibilidad a padecer infecciones recurrentes cau-sadas por bacterias capsuladas. Algunas mutaciones genéticas y/opolimorfismos descritos apuntan a defectos intrínsecos del linfocito By de la colaboración T/B durante la respuesta inmunitaria. Sin embar-go se desconoce la causa subyacente a la inmunodeficiencia en la mayo-ría de pacientes.

Objetivos. Estudiar la diferenciación y producción de inmuno-globulinas de los linfocitos B de pacientes con IVC y controles sanosen respuesta a la estimulación con ligandos bacterianos específicos deTLR9 (CpG-ODN) o simulando la colaboración con el linfocito Tmediante anti-CD40 combinado con IL-21. Evaluar la contribución dela señalización a través del BCR.

Material y métodos. Los linfocitos B de 16 pacientes y 17 con-troles sanos se purificaron mediante selección negativa a partir demuestras de sangre periférica. Posteriormente, se cultivaron (1x105

células/pocillo) durante 11 días en presencia de CpG-ODN (0,6 μg/ml)o anti-CD40 (1 μg/ml) + IL-21 (100 ng/ml) en combinación o no conanti-IgM (5 μg/ml).

El nivel de expresión de CD38 en membrana, como marcador dediferenciación, se determinó por citometría de flujo. La producción deIgG, IgA e IgM se cuantificó mediante CBA FlexSet en los sobrenadan-tes de cultivo.

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Resultados. El grado de diferenciación alcanzado (expresión deCD38) fue inferior en los linfocitos B de los pacientes sólo al estimularcon anti-CD40+IL21+anti-IgM.

La secreción de IgG e IgA fue inferior en linfocitos B de pacien-tes independientemente del estímulo utilizado.

La producción de IgM fue también inferior en IVC tras estimula-ción con CpG-ODN, pero comparable a los controles en respuesta aanti-CD40+IL-21.

La adición de anti-IgM a los cultivos no aumentó la secreción deinmunoglobulinas en los controles ni la restauró en los pacientes.

Conclusiones. Los linfocitos B de pacientes con IVC no se dife-rencian óptimamente ni en respuesta a ligandos de TLR9 (CpG-ODN)ni a las moléculas mediadoras de la interacción T/B estudiadas (anti-CD40+IL-21). Ello sugiere un amplio defecto en las vías de señaliza-ción responsables de la diferenciación del linfocito B a célula produc-tora de anticuerpos.

O-087MÉTODOS DIAGNÓSTICOS EN EL ESTUDIO DE INMUNODE-FICIENCIAS ASOCIADAS CON DEFECTOS DE REPARACIÓNDE DNA. M.J. Recio Hoyas1, E. Martínez Busto1, L. Woodbine2, E.Riballo2, J.R. Regueiro1, P. Jeggo2. 1Facultad de Medicina. UniversidadComplutense, Madrid. 2Genome Damage and Stability Centre. Sussex Uni-versity, United Kingdom.

Las inmunodeficiencias asociadas con defectos de reparación deDNA, constituyen un grupo de desórdenes caracterizados por linfo-penia T y/o B, radiosensibilidad clínica y, en algunos casos, apariciónde determinados tipos de tumores. Los genes responsables de estaspatologías codifican para una serie de proteínas implicadas en las víasde reparación de DNA, entre las que se encuentran Artemis, Ligasa IVy Cernnunos (XLF).

En este trabajo se describen los estudios de reparación realiza-dos en dos pacientes con clínica de inmunodeficiencia y radiosensi-bilidad clínica.

Casos clínicos. Paciente 1. Numerosos episodios de infeccionespor bacterias y hongos en piel y mucosas, linfopenia T severa y nive-les disminuidos de inmunoglobulinas. Fallece a los 3 meses de edad.

Paciente 2. Varón de 4 meses de edad que presenta clínica SCID,expansión T oligoclonal y varios rasgos dismórficos, entre los que des-taca la presencia de microcefalia.

Los análisis de reparación, en ambos pacientes, se llevaron a caboen fibroblastos irradiados (γ-IR) obtenidos a partir de biopsia de piel.Los estudios de supervivencia celular mostraron una disminución delnúmero de colonias respecto a individuos control, lo que nos indicaque las células de estos pacientes son radiosensibles. Por otro lado, losestudios de inmunofluorescencia (anticuerpos α-γH2AX y α-CENP-f) realizados para monitorizar la cinética de reparación de roturas deDNA de doble cadena en las distintas fases del ciclo celular mostrarondefectos en fase G2. Los resultados en fase G1 fueron similares a losobtenidos en individuos control.

Los resultados obtenidos apuntan a un posible defecto en algunas delas proteínas reparadoras de daño en el DNA. Los estudios de secuencia-ción realizados en el paciente 2 han descartado Ligasa IV y Cernunnoscomo genes responsables de la patología. Por el contrario, el Western-blotde Artemis realizado en el paciente 1, revela una banda de menor tama-ño que podría corresponder a una proteína truncada. Actualmente esta-mos realizando el estudio molecular para confirmar este resultado.

Conclusión. Estas técnicas sirven para diagnosticar con rapidezposibles inmunodeficiencias asociadas con defectos de reparación deDNA y para profundizar en el papel de las proteínas reparadoras enel desarrollo de tumores. Es importante recordar que se necesitan fibro-blastos, bien de biopsia o bien de raspados bucales.

SESIÓN 10: INMUNOTERAPIA

Moderadores: Luis AlvarezVallina (Madrid)Francisco Lozano (Barcelona)

O-088T CELL ALLOREACTIVITY IS ENHANCED BY CTLA-4 BLOCKA-DE WITH TREMELIMUMAB ONLY WHEN CD4+ CD25+ REGULA-TORY T LYMPHOCYTES ARE DEPLETED IN VITRO AND INVIVO. C. Alfaro Alegria1, N. Suarez2, J. Dubrot1, A. Palazon1, S. Her-vas-Stubbs1, I. Martínez-Forero1, S. Martin-Algarra2, B. Sangro2, F.Lecanda1, J.L. Pérez-Gracia2, I. Melero1. 1CIMA, Pamplona. 2CUN.

Anti-CTLA-4 monoclonal antibodies that block the interaction ofCTLA-4 with CD80 and CD86 such as tremelimumab and ipilimumabare currently being tested in the clinic for cancer treatment exploitingtheir properties to de-repress tumor-specific cellular immunity. Additionof the fully human anti-CTLA-4 (tremelimumab) to cultures of humanT cells with allogenic dendritic cells did not increase proliferation.Magnetic bead-mediated elimination of CD4+ CD25+ Treg cells beforesetting up those alloreactive cultures also largely failed to increaseprimary proliferation. In contrast, pre-depletion of CD4+ CD25+ Treg

and culture in the presence of tremelimumab synergistically resultedin increased proliferation and DC:T cell aggregation. These effects weremuch more prominent in CD4 than in CD8 T cells. The synergy mechanismcan be traced to enhanced CTLA-4 expression in effector cells as a resultof Treg elimination, thereby offering more targets to the blocking antibody.Human T cells and allogenic DC were coinjected in the peritoneumof Rag2–/– IL-2Rγ–/– mice. In these conditions, tremelimumab injectedintravenously did not significatively enhance alloreactive proliferationunless Treg cells had been pre-depleted. Synergistic effects e in vivowere again largely restricted to the CD4 T cell compartment. Similarresults were observed with PBL and allogenic DC obtained from patientssuffering from advanced solid malignancies. These experiments indicatethat tremelimumab therapy may benefit from previous or concomitantTreg depletion.

O-089IMMUNOTHERAPEUTIC AGONIST ANTI-CD137 MAB ACT ONTUMOR ENDOTHELIAL CELLS TO ENHANCE ADHESIONMOLECULES AND RECRUITMENT OF ACTIVATED TLYMPHOCYTES. A. Palazón García1, J. Dubrot Armendariz1, A. Rou-zaut Subirá1, S. Hervás-Stubbs1, I. Martínez-Forero1, A. Morales-Kas-tresana1, A. Teijeira1, A. Martínez2, M. Jure-Kunkel3, I. Melero1. 1CIMA,Pamplona. 2CIBIR. 3Bristol Myers-Squibb Pharmaceutical Research Institu-te.

Agonist anti-CD137 mAb are being used for the treatment ofcancer in mice and in clinical trials based on their co-stimulatoryeffects on primed T cells and perhaps on other cells of the immune

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system. We provide evidence both at the protein and the mRNAlevel, indicating that CD137 is selectively expressed on the surfaceof tumor endothelial cells. Interestingly CD137 is up-regulated onmouse endothelial cell lines under conditions of hypoxia. Treatmentwith anti-CD137 mAb in Rag–/– mice does not result in any measurableanti-angiogenic effects. By contrast, CD137-mediated in vivo stimulationof tumor endothelial cells with monoclonal antibodies increases thesurface expression of the adhesion molecules ICAM-1, VCAM-1 andE-selectin. As a result, CD137–/– activated T lymphocytes enteredmore avidly into tumor tissue when adoptively transferred to micethat are being treated with agonist anti-CD137 mAb. The enhancedentrance of activated T lymphocytes into the malignancy can beneutralized with anti-ICAM-1 and anti-VCAM-1 blocking antibodies.Accordingly, stimulation of CD137 does not only enhance T cellactivation but also augments their traffic into the malignant tissuethrough direct actions on the blood vessels that irrigate the tumor,thereby providing an additional mechanism of action for theimmunotherapeutic effects.

O-090TREATMENT WITH ANTI-CD137 MABS CAUSES INTENSEACCUMULATIONS OF LIVER T CELLS WITHOUT SELECTIVEANTITUMOR IMMUNOTHERAPEUTIC EFFECTS IN THISORGAN. J. Dubrot1, F. Milheiro1, C. Alfaro1, A. Palazón1, I. Martínez-Forero1, A. Morales-Kastresana1, M.C. Ochoa1, S. Hervás-Stubbs1,M. Jure-Kunkel2, L. Chen3, I. Melero1. 1CIMA, Pamplona. 2Bristol Myers-Squibb Pharmaceutical Research Institute, United States. 3Sidney KimmelCancer Center. Johns Hopkins Medical School, United States.

Background/Aims. Cancer therapy with agonist anti-CD137mAbs has been shown to induce immune-mediated tumor rejectionsin mice and equivalent agents of this kind are currently being testedin cancer patients. Previous reports indicated that CD137 stimulationinduces polyclonal infiltrates of T lymphocytes in the liver. Thisstudy characterizes the liver infiltrates, the target-dependency of thephenomena and addresses the question of whether tumors nestedin the liver are a more favourable target for CD137-basedimmunotherapy.

Methods. Liver infiltrates were studied with conventional histologyand multiple colour flow cytometry of total liver leukocytes. CD137–/–

mice, mice with a single rearrangement of the TCR (OT-1 mice) andRag–/– mice were used to clarify molecular requirements. Mice implantedwith MC38 colon carcinomas either subcutaneously or inside the liverwere used for comparative studies under treatment with agonist anti-CD137 mAbs.

Results. CD137 treatment caused mononuclear inflammation inportal spaces of the liver, which gave rise to moderate increases intransaminases without signs of cholestasis. Marked increases in thenumbers of CD8+ T cells were observed, including CD8+ T lymphocytesco-expressing CD11c. Infiltrates were absent in CD137–/– mice andmitigated in mice harbouring a single transgenic TCR on their CD8 Tcells. Despite of the tumor-independent accumulation of T cells inthe liver, immunotherapeutic effects were not more prominent againsttumors located in this organ

Conclusions. Target-dependent effects of CD137 stimulation leadto liver infiltration with T cells, but lymphocyte enrichment in thisorgan does not privilege this site for immunotherapeutic effects againsttransplanted tumors.

O-091CUANTIFICACION DE ENFERMEDAD MINIMA RESIDUAL PORCITOMETRIA DE FLUJO CON ALTA SENSIBILIDAD. E. Domin-go, C. Moreno, A. Sánchez-Ibarrola, C. Panizo, J.A. Páramo, J. Meri-no. Clínica Universidad de Navarra, Pamplona.

La citometría de flujo es la técnica de elección para la cuantifica-ción rutinaria de enfermedad mínima residual (EMR) en pacientes conneoplasias hematológicas. Sin embargo, su sensibilidad es 10-4, un loga-ritmo por debajo de las técnicas moleculares. En el presente trabajo nosplanteamos el objetivo de desarrollar un protocolo de citometría deflujo que permita alcanzar una sensibilidad similar al PCR cuantitati-vo y que pueda aplicarse de forma rutinaria en el laboratorio diagnós-tico.

Material y Métodos. Se utilizaron 16 muestras EMR+ (MielomaMúltiple y LLC-B) con una infiltración en torno a 0.01%. La cuantifi-cación del grado de infiltración se llevó a cabo por procedimiento están-dar en un citómetro FACSCanto (Becton-Dickinson) con técnica de 6colores (se calculó la media de 5 procedimientos independientes demarcaje y análisis). Estas muestras se diluyeron 10 veces con leucoci-tos normales con el fin de obtener una infiltración en torno a 10-5. Elanálisis de EMR en las muestras diluidas se llevó a cabo por medio dela adquisición de 6 millones de leucocitos, que se marcaron y adqui-rieron en tubos independientes, a razón de 2 millones por tubo.

Resultados. En primer lugar se comprobó que la adquisición de6 millones de leucocitos en tubos independientes es realizable (estabi-lidad de la fluorescencia inter-tubo) y aplicable al análisis diario de unlaboratorio diagnóstico (se exploró la posibilidad de acortar el tiempopor medio del aumento en la tasa de adquisición sin que se afecten losresultados). El procedimiento se validó comparando la cuantifica-ción de EMR por citometría de flujo y PCR cuantitativo en dilucionessucesivas de una muestra de Leucemia Linfoblástica Aguda BII Phi+(10-3 a 10-5).

Con este protocolo se cuantificó EMR en muestras de MielomaMúltiple y LLC-B con una infiltración en torno a 10-5, obteniéndose entodos los casos una medición exacta y precisa. La especificidad de latécnica se confirmó por medio del análisis de 10 millones de leucoci-tos normales, tanto de médula ósea como de sangre periférica (n =6).

Conclusión. La adquisición de 6 millones de leucocitos es reali-zable con un citómetro digital de forma rutinaria, permitiendo alcan-zar una sensibilidad de 10-5 en análisis de EMR, manteniéndose la exac-titud, precisión y especificidad de la técnica.

O-092TERAPIA GÉNICA DE PACIENTES CON HIPER-IGM LIGADAAL CROMOSOMA X (XHIM1) MEDIANTE EL USO DE VECTO-RES LENTIVIRALES REGULADOS. S. Torres Rusillo, Z. RomeroGarcía, M. Cobo , P. Muñoz, J.D. Unciti Broceta, A.K. Vega Bogado, F.Martín, I.J. Molina. Universidad De Granada / CIBM, Armilla.

Objetivos. El Síndrome de hiper IgM ligado al cromosoma X (X-HIGM1) es una inmunodeficiencia primaria causada por mutacionesen el gen que codifica para la proteína CD40L, presente en linfocitos TCD4+. Recientes estudios en animales revelan que corregir el defectoen progenitores hematopoyéticos puede llevar consigo el desarrollode un severo síndrome linfoproliferativo, probablemente a consecuen-cia de la expresión no regulada del vector terapeútico. Así, nuestro

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objetivo será transducir de forma eficiente linfocitos T primarios depacientes XHIM1 con un vector lentiviral terapeútico inducible y teji-do-específico, en el que la expresión del transgén CD40L se encuentredirigida por el propio promotor de éste.

Material y métodos. Se construyó el vector lentiviral pCD40L-CD40L, con el promotor específico de CD40L y el gen terapéutico. Lascélulas diana fueron linfocitos T de pacientes XHIM1. Tras la transduc-ción, los linfocitos fueron aloestimulados, para obtener la poblaciónCD4+. La detección de la proteína CD40L se realizó por citometría deflujo.

Resultados. Los linfocitos T de pacientes XHIM1 transducidos porel vector lentiviral pCD40L-CD40L, expresan CD40L sólo tras aloes-timulación y estimulación con PMA+Ionomicina. Esta situación refle-ja la capacidad del vector de expresar la proteína CD40L sólo en con-diciones de activación.

Conclusión. El vector lentiviral pCD40L-CD40L es capaz deaumentar, de forma específica y regulada, la expresión en superficiede CD40L en linfocitos T de pacientes XHIM1.

O-093ESTUDIO DE LA BIOCOMPATIBILIDAD Y TOXICIDAD DENANOPARTÍCULAS INORGÁNICAS EN LÍNEAS CELULARESHUMANAS. B. Díaz Freitas1, T. Lozano1, M. Peleteiro1, I. PastorizaSantos2, M. Arruebo3, R. Ibarra3, L. Liz Marzan4, A. Gonzalez Fernan-dez1. 1Universidad de Vigo. Laboratorio de Inmunologia, Vigo. 2Universidadde Vigo. 3Instituto de Nanociencia de Aragón (INA), Zaragoza. 4Universidadde Vigo.

Introducción. Los recientes avances en el campo de la Nanotecnologíahan permitido desarrollar nuevos nanomateriales y herramientas con gran poten-cial e impacto socio-económico, principalmente en el campo biomédico dondeestos materiales pueden permitir mejorar las técnicas de diagnóstico y la terapiade muchas enfermedades, especialmente en la detección y en el tratamiento delcáncer. Los nanomateriales ofrecen oportunidades únicas en el diseño de nuevosinstrumentos clínicos y en la mejora de los ya existentes, pero sobre todo, las nano-partículas (NPs) se han propuesto como transportadores de fármacos, en eldesarrollo de biosensores y de vacunas, en la destrucción de células tumoralesmediante hipertermia y como agentes de contraste debido a su gran versatilidaden composición, tamaño y funcionalidad.

Objetivo. El uso de NPs en aplicaciones biomédicas puede ofrecerclaros beneficios, pero antes de su uso in vivo es importante tener encuenta su potencial toxicidad y si son capaces de inducir una respues-ta inmunológica. Las NPs pueden inducir agregación, inflamación, toxi-cidad, fagocitosis, alergia, etc. por lo que es necesario poner a punto téc-nicas que permitan evaluar estas cuestiones antes de su aplicación.

Métodos. Se han estudiado a través de diferentes técnicas la toxi-cidad y la biocompatibilidad (MTT, LDH, QSSC, Azul Tripán, fagoci-tosis, activación del complemento, producción de ROS, modelación demarcadores de membrana, etc.) de NPs inorgánicas de diferente com-posición y tamaño en varios tipos celulares humanos.

Resultados. Muchas de las NPs analizadas se agregan en condi-ciones fisiológicas, además, se ha encontrado que la toxicidad es depen-diente de la dosis y existe variabilidad entre diferentes tipos celulares,la técnica empleada y el lote de NPs estudiado. Por otro lado, algunasNPs interfieren con las técnicas utilizadas.

Conclusiones. Se han puesto a punto diferentes técnicas que per-miten analizar la toxicidad y la respuesta inmunológica dependiendode las características y propiedades de cada tipo de NP. Nuestros resul-

tados muestran que debido a variabilidad encontrada según el tipocelular analizado y las características de las NPs es necesario utilizardiferentes técnicas y líneas celulares para estudiar la toxicidad y bio-compatibilidad de los nanomateriales.

O-094EL “TARGETING” EX VIVO A CÉLULAS DENDRÍTICAS DE UNADENOVIRUS QUE EXPRESA EL ANTÍGENO NS3 DEL VHCAUMENTA SU MADURACIÓN Y LA INDUCCIÓN DE RESPUES-TAS ANTIVIRALES IN VITRO E IN VIVO. I. Echeverria Beistegui1,A. Pereboev2, L. Silva1, A. Zabaleta1, J.I. Riezu-Boj1, F. Borrás-Cues-ta1, J.J. Lasarte1, J.I. Esteban1, J. Prieto1, P. Sarobe1. 1CIMA Universidadde Navarra, Pamplona. 2University of Alabama at Birmingham, United Sta-tes.

Objetivos. La eliminación del virus de la hepatitis C (VHC) estáasociada a la inducción de potentes respuestas celulares mediadas porlinfocitos T. Para activar a los linfocitos T es necesaria la correcta pre-sentación del antígeno por las células dendríticas (CD) maduras. Elobjetivo de este trabajo ha sido desarrollar una estrategia que sea capazde aumentar las funciones de las CD, con el fin de mejorar su inmu-nogenicidad.

Metodología. Se han utilizado moléculas adaptadoras que con-tienen el receptor coxsackie-adenovirus unido al CD40L murino ohumano (CFm40L o CFh40L) para transducir ex vivo CD con un ade-novirus recombinante que codifica la proteína NS3 del VHC (AdNS3).Se analizó la transducción, maduración e inmunogenicidad de las CDin vitro e in vivo.

Resultados. CFm40L potenció la maduración de las CD de ratón,la producción de IL-12, y aumentó la expresión de moléculas coesti-muladoras 4-1BBL, OX40L y CD70. La transducción de las CD conAdNS3 y CFm40L aumentó la presentación del antigeno NS3 in vitro,resultando en una mayor activación de linfocitos T productores de IFN-γ. Además, la inmunización de ratones con estas CD activó potentesrespuestas CD4 y CD8 frente al antígeno NS3. Del mismo modo,CFh40L aumentó la transducción y maduración de las CD humanasderivadas de monocitos. La comparación de las CD transducidas conAdNS3 y CFh40L de pacientes con hepatitis crónica C o donantes sanosmostraron niveles similares de maduración. Por último, en pacientescon hepatitis crónica C, estas CD indujeron respuestas específicas fren-te a NS3, a diferencia de las CD transducidas únicamente con AdNS3.

Conclusión. Los resultados muestran que esta molécula adapta-dora aumenta la eficacia de las CD transducidas con AdNS3, sugirien-do que esta estrategia podría aplicarse como vacuna terapéutica fren-te al VHC.

O-095EFICACIA DEL RITUXIMAB EN EL TRATAMIENTO DEL PÉN-FIGO FOLIÁCEO: ESTUDIO DE UNA PACIENTE. E. Zumaquero1,S. Arias-Santiago2, S. García-Rodríguez1, A. García-Pérez1, P. Nava-rro1, M.A. Fernández-Pugnaire2, M. Zubiaur1, J. Sancho1. 1Instituto deParasitología y Biomedicina "López-Neyra", CSIC, Armilla (Granada), Armi-lla. 2Hospital Clínico Universitario San Cecilio, Granada.

Una mujer de 65 años ingresa en el Servicio de Dermatología porcuadro de lesiones ampollosas y costrosas de dos meses de evoluciónsiendo diagnosticada de pénfigo foliáceo. La necesidad de dosis eleva-

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das de corticoides para controlar el cuadro determinan un síndrome deCushing yatrógeno por lo que se decidió iniciar tratamiento con Rituxi-mab, a dosis de 375 mg/m2 una vez a la semana durante 4 semanas.

Objetivo del estudio. Hacer un seguimiento de los parámetrosinmunológicos y clínicos de la paciente antes y después del tratamien-to con Rituximab.

Materiales y Métodos. Previo al tratamiento y después de cada infu-sión de Rituximab se procede a la extracción de sangre de la paciente yde un control sano obteniéndose plasma y células mononucleares(PBMCs). Usando un sistema multiparamétrico (BioPlex) se han cuan-tificado simultáneamente los niveles de 10 citoquinas en el plasma de lapaciente. El análisis de marcadores de superficie se lleva a cabo median-te citometría de flujo. Tras estimulación de los PBMCs con una mezclade los superantígenos SEE y SEB se estudia la formación de conjugadosy expresión de marcadores de activación por citometría de flujo, la for-mación de sinapsis inmunológicas maduras mediante microscopía con-focal y la secreción de citoquinas en los sobrenadantes por BioPlex.

Resultados. Tras el tratamiento con Rituximab se observa: Deple-ción total de linfocitos B CD19+ desde la primera infusión, con des-censo de los niveles de IgA sérica y mantenimiento de la IgG. Dismi-nución de los niveles de IL-6 en plasma al inicio del tratamiento e incre-mento en fases posteriores. Aparición de una subpoblación de linfoci-tos T muy positiva para CD38. Fuerte disminución en la formación dela sinapsis inmunológica, menor expresión de CD69 en respuesta asuperantígenos y menor producción de citoquinas. Sin embargo, lamejora clínica no se hace evidente hasta trascurridos tres meses, noapareciendo nuevas lesiones a lo largo de los dos años de seguimien-to. La reconstitución parcial de linfocitos B CD19+CD20+ solo se obser-va a partir de 21 meses de tratamiento.

Discusión y Conclusiones. La disminución de la producción decitoquinas y la menor capacidad de activación de los linfocitos T invitro parecen estar directamente relacionados con la ausencia de linfo-citos B CD19+ en sangre periférica y la menor capacidad de presen-tación antigénica derivada de ello. Desde el punto de vista clínico, eltratamiento con Rituximab permitió la reducción de dosis de corticoi-des y azatioprina, que producían importantes efectos adversos, condesaparición de la mayoría de las lesiones a partir de los tres meses deiniciarse el tratamiento. Rituximab se presenta como un tratamientode segunda línea para aquellos casos de pénfigo foliáceo rebeldes altratamiento convencional o para disminuir los efectos secundarios clá-sicos de los corticoides o inmunosupresores.

O-096ESTUDIO DEL HLA SOLUBLE COMO MARCADOR DE RESPUES-TA AL TRATAMIENTO INMUNOMODULADOR EN LA ESCLE-ROSIS MÚLTIPLE. S. Mirete Bachiller1, R. Álvarez Lafuente2, L. Cos-ta Frossard1, M. García Montojo2, N. Marín Crespo1, M.I. DomínguezMozo2, M. Espiño Martínez1, J.C. Álvarez Cermeño1, L.M. Villar Guime-rans1. 1Hospital Ramón y Cajal, Madrid. 2Hospital Clinico San Carlos, Madrid.

Objetivo. Los antígenos de Clase I solubles (sHLA) ejercen unpapel inmunomodulador, induciendo la apoptosis de los linfocitos Tantivados. Los niveles séricos de estas moléculas aumentan en lospacientes de esclerosis múltiple (EM) tratados con interferon beta(IFNB). En este trabajo estudiamos si los niveles séricos de estas molé-culas también aumentan durante el tratamiento con Acetato de Gla-tiramero y Natalizumab, otros fármacos que se utilizan actualmenteen la EM También comparamos la cinética del aumento de sHLA en

las distintas presentaciones de IFNB y relacionamos los niveles de estasmoléculas con la respuesta clínica al tratamiento.

Materiales y Métodos. Se siguió durante 1 año a 65 pacientes conEM que iniciaron diferentes tratamientos (14 Rebif, 11 Betaferon, 20Avonex, 14 Copaxone, 6 Tysabri). Se monitorizó la aparición de broteso el aumento de discapacidad durante este tiempo.

La detección de sHLA en suero se realizó a través de un ELISApuesto a punto en nuestro laboratorio. Se midió al inicio del tratamien-to y a un mes, tres, seis y 12 meses. Además, se ensayó la presencia deanticuerpos neutralizantes anti IFNB en todos los pacientes, a fin dedescartar que los resultados del estudio estuviesen afectados por laaparición de dichos anticuerpos.

El análisis estadístico se realizo mediante Tests de Anova y U-MannWhitney

Resultados. Los niveles de sHLA no aumentan durante el trata-miento con Acetato de Glatiramero o Natalizumab. En cuanto al IFNB,la cinética de aumento fue similar y más temprana en los pacientes tra-tados con IFNB a dosis más altas (Rebif y Betaferón). El aumento se apre-cia al mes de tratamiento, alcanza el máximo a los tres meses y se man-tiene constante a partir de entonces. La cinética de aumento de sHLApara de pacientes tratados con IFNB a dosis más bajas (Avonex) fue mástardía, alcanzando valores similares a los de Rebif y Betaferón a los 6meses de tratamiento. Los porcentajes de aumento fueron similares enlos pacientes con una respuesta clínica completa y en aquellos que expe-rimentaron brotes o aumento de discapacidad durante el tratamiento,pero los valores basales fueron más bajos en estos últimos (0=.01).

Conclusiones. Pacientes tratados con interferón a altas dosis pre-sentan un aumento temprano en las concentraciones de sHLA. La con-centración de sHLA soluble de pacientes tratados con Avonex tambiénexperimenta un aumento, que se iguala a partir de los 6 meses con losde Rebif y Betaferon. Los niveles basales de sHLA fueron más eleva-dos en pacientes con respuesta clínica completa. Esto podría indicaruna relación entre los niveles de estas moléculas y la respuesta a IFNBen la EM. Sin embargo, no se observaron aumentos de sHLA en rela-ción a los tratamientos con Acetato de Glatiramero o Natalizumab Estodemuestra que esta molécula no se relaciona con el mecanismos deacción de estos dos fármacos.

O-097¿QUÉ INFLUENCIA TIENE LA EXPRESIÓN DE ZAP-70 EN LACAPACIDAD MIGRATORIA DE LAS CÉLULAS DE LEUCEMIALINFÁTICA CRÓNICA? M. Alfonso Pérez1, A.E. Beltrán1, S. GuaschVidal1, C. Cuesta Mateos1, J.M. Zapata2, C. Muñoz Calleja1. 1HospitalUniversitario de La Princesa, Madrid. 2Instituto de Investigaciones Biomé-dicas “Alberto Sols”, CSIC/UAM.

Introducción y objetivo. La tirosina kinasa ZAP-70 (“70 Kd zeta asso-ciated protein”), en condiciones fisiológicas, se expresa en linfocitos T,donde tiene un papel esencial en la transducción de señales tras la acti-vación del receptor de células T. También se ha demostrado su expresiónectópica en células tumorales de varios síndromes linfoproliferativos decélulas B, entre ellos, la leucemia linfática crónica (LLC). En esta enfer-medad, la positividad para ZAP-70 se considera un factor de mal pro-nóstico, si bien su papel patogenético no está bien caracterizado.

El receptor de quimioquinas CCR7 y sus ligandos, las quimioqui-nas homeostáticas CCL19 y CCL21, median el “homing” linfocitariohacia órganos linfoides secundarios (OLS) y parecen responsables dela localización de las células tumorales de LLC en OLS, considerados

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nichos de supervivencia para dichas células. En este sentido, se hasugerido que el peor pronóstico de los pacientes ZAP-70+ podría estaren relación con una mayor capacidad migratoria de sus células tumo-rales en respuesta a los ligandos de CCR7 presentes en los OLS.

Objetivo. Estudiar cómo afecta la expresión de ZAP-70 a: 1) laintensidad de expresión de CCR7 y su endocitosis tras la activación;2) a los procesos de migración y adhesión celular en presencia de losligandos de CCR7.

Materiales y métodos. Se obtuvieron muestras de sangre perifé-rica de pacientes que cumplían los criterios morfológicos e inmunofe-notípicos de LLC, tras la firma de consentimiento informado segúnrequisitos de la declaración de Helsinki. La expresión de CCR7, ZAP-70 y VLA-4 se analizó mediante citometría de flujo en las células BCD19+. La expresión de ZAP-70 se cuantificó en forma de índice (MIFlinfocitos B/MIF linfocitos T), estableciéndose un punto de corte a par-tir del análisis de muestras de donantes sanos. Con células mononu-cleares aisladas mediante centrifugación en gradiente de densidad,realizamos ensayos de migración en Transwell, de endocitosis de CCR7y adhesión a fibronectina en presencia de CCL19 y CCL21.

Resultados

Conclusiones. La expresión de CCR7 en células de LLC es ligera-mente inferior en pacientes ZAP-70+ aunque los resultados no alcan-zan significación estadística (p=0,089) A pesar de esta pequeña dife-rencia, ni la migración ni la adhesión a fibronectina en presencia deCCL19 ó CCL21, son diferentes entre células de LLC ZAP-70+ y ZAP-70-. Sin embargo, de forma interesante, la migración y la adhesión enausencia de estímulo tienden a ser mayores en células ZAP-70+, si biensomos conscientes de la necesidad de aumentar el número de mues-tras. Por su parte, la endocitosis de CCR7 en presencia de sus ligandosocurre con igual intensidad en células de LLC ZAP-70+ que ZAP-70–.

Es por tanto posible que la capacidad invasiva “constitutiva” entérminos de migración y adhesión de las células de LLC ZAP-70+ seamayor que la de las ZAP-70-, diferencia que desaparecería ante un estí-mulo quimiotáctico.

SESIÓN 11: INMUNODEFICIENCIAS II

Moderadores: Nuria Matamoros (Palma de Mallorca)Jose Ramón Regueiro (Madrid)

O-098FORMA GRANULOMATOSA DE LA INMUNODEFICIENCIAVARIABLE COMUN, A PROPOSITO DE UN CASO. I. Hidalgo Iza-guirre, A. De Andres Martin, J.L. Castañer Alabau, G. Silva Carre-ras, E. Roldan Santiago. Hospital Ramon y Cajal, Madrid.

Objetivos.Plantear la necesidad de consensuar protocolos de feno-tipaje y manejo clínico de una de las formas más graves e incapacitan-tes de la IDVC.

Materiales y métodos. Presentamos a una mujer que a los 57 añosse le diagnostica de IDVC; actualmente se encuentra en tratamientocon inmunoglobulina intravenosa (IGIV). Al diagnostico presentababronquiectasias e infecciones de repetición de vías respiratorias altascon 1 episodio de neumonía extra-hospitalaria y artralgias, sin otra sin-tomatología típica de la IDVC. Las radiografías de tórax realizadas nomostraron alteraciones patológicas, siendo consideradas normales, rea-lizándose un TAC en el que se describe la presencia de bronquiecta-sias sin adenopatías ni otras alteraciones significativas.

Al año del diagnóstico la paciente acude al servicio de urgenciaspor disfagia alta para sólidos de una semana de evolución acompaña-da de afonía intermitente y sensación de cuerpo extraño. No presen-ta síndrome constitucional asociado. Siendo valorada por otorrinola-ringología, se constata la existencia de una adenopatía de 1 cm, blan-da, no adherida y no dolorosa, que comprime estructuras anatómicas.Se realiza una PAAF con diagnóstico de linfadenitis reactiva, sin pre-sencia de células malignas en ganglio ni en sangre periférica. En apro-ximadamente 2 años, aparecen múltiples adenopatías látero-cervica-les, submandibulares, mediastínicas, retroperitoneales y pélvicas, hepa-to-esplenomegalia, afectación difusa y generalizada del parénquimapulmonar con múltiples imágenes nodulares. En ninguno de los estu-dios anatomopatológicos ni inmunológicos se ha observado maligni-dad siendo diagnosticados como granulomas no caseificantes.

Durante este tiempo debuta con trombopenia (168.000-140.000/μl)de posible origen autoinmune, sin anemia ni otras citopenias.

Actualmente presenta un importante deterioro clínico general conuna gran disminución de su capacidad pulmonar y aparición de dia-rreas intermitentes sin aparente causa infecciosa, que no presentaba almomento del diagnostico; el empeoramiento clínico está claramenterelacionado con el aumento del tamaño y numero de sus granulomas.

Resultados. En la IDVC está indicada la realización del estudiode las sub-poblaciones linfocitarias, especialmente los linfocitos B (LB)en estadios madurativos. Al diagnóstico, en la paciente se observó unadisminución de los LB de memoria (CD19+CD27+), inversión delcociente CD4/CD8 y aumento de los linfocitos T activados; sin reali-zarse otros estudios de fenotipo. Posteriormente, a raíz de la clínicaque desarrolló la paciente, el estudio inmunofenotípico fue ampliadoacorde con lo descrito actualmente para las formas severas de la IDVCgranulomatosa (clasificación EUROclass).

Conclusión. Las alteraciones encontradas, sobre todo fenotipicas,se correlacionan con la forma severa de la IDVC granulomatosa. Actual-mente no se contempla dentro del protocolo de estudio la realizaciónde fenotipos especiales para detectar estas formas, ya que tampocose sabe si las alteraciones fenotípicas descritas actualmente se produ-cen desde el comienzo de la enfermedad o aparecen evolutivamente.Sin embargo, una vez establecida la forma granulomatosa, el deterio-ro es rápido y no se observa regresión de a pesar de las terapias actual-mente aplicadas (corticoides, anti-TNF).

O-099DEFICIENCIA DE ADA EN PACIENTE CON LINFOPENIA SEVE-RA Y NEUMONITIS INTERSTICIAL BILATERAL POR VIRUS DELA GRIPE H1N1. P. Talayero, E. Mancebo, S. Lermo-Rojo, V. Pérez-Ara-das, L.I. González-Granado, J. Ruiz-Contreras, M. Menchén, M.J. Díaz-Madroñero, M.J. Castro, L.M. Allende. Hospital 12 de Octubre, Madrid.

Objetivo. Diagnóstico genético de lactante de 6 meses de edad remi-tido por sospecha clínica de Inmunodeficiencia Combinada Severa.

CCR7 Migración (%) Adhesión (%) Endocitosis (%)n MFI n Basal CCL19 CCL21 n Basal CCL19 CCL21 n CCL19 CCL21

ZAP-70 + 11 182.7 ± 10 3.3 ± 51.4 ± 45.3 ± 4 40.3 ± 41.9 ± 36.7 ± 4 51.1 ± 37.9 ±

107.6 5.0 61.5 52.7 42.4 52.6 53.8 18.0 14.9

ZAP 15 294.4 ± 11 1.6 ± 27.6 ± 39.1 ± 3 7.9 ± 7.2 ± 4.6 ± 7 46.6 ± 25.3 ±-70 - 186.5 1.4 22.0 25.0 6.8 8.5 4.4 13.7 15.2

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Paciente y métodos. Varón de 6 meses de edad con neumonitisintersticial bilateral por virus de la gripe A H1N1, gastroenteritis agu-da por rotavirus y malnutrición grave. Se realizó estudio inmunológi-co de poblaciones linfocitarias e inmunoglobulinas y estudio genéticode secuenciación de las regiones codificantes de los genes RAG1, RAG2y ADA.

Resultados. El estudio inmunológico reveló una linfopenia seve-ra (100 células/µL) con fenotipo T- B- NK+ e hipogammaglobulinemia(IgG 270 mg/dL, IgA <40 mg/dL, IgM <25 mg/dL). Ante la gravedaddel cuadro clínico e inmunológico presentado, se le realizó trasplantede médula ósea de donante no emparentado con buen prendimiento.Los resultados del estudio genético (que se obtuvieron tras la realiza-ción del trasplante) no revelaron ningún cambio respecto a la secuen-cia consenso en los genes RAG1 y RAG2, sin embargo se evidenciarondos cambios en heterocigosis (Leu107Pro; 1050-1054delGAAGA) en elgen ADA. Dichos cambios ya estaban descritos como causantes deSCID, y su presencia en heterocigosis fue confirmada en los progeni-tores.

Conclusiones. La deficiencia de ADA supone el 15% de las SCIDy el 30% de las SCID de herencia autosómica recesiva, siendo por tan-to una de las etiologías genéticas más frecuentes. Este hecho hace que,ante un cuadro clínico de patología pulmonar infecciosa severa o recu-rrente acompañado de la presentación de linfopenia muy severa, sedirija el estudio genético hacia el gen ADA.

O-100DEFECTOS EN LA EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL TCR EN HETE-ROCIGOTOS PARA MUTACIONES EN CD3GAMMA O DELTA.M. Muñoz-Ruiz, V. Pérez-Flores, L.M. Allende, H. Takada, W.W. Scha-mel, S.S. Kiliç, O. Sanal, C.M. Roifman, E. Fernández-Malavé , J.R.Regueiro. Universidad Complutense de Madrid/Facultad de Medicina,Madrid.

Introducción. Los portadores de mutaciones graves en CD3G (γ+/–)o CD3D (δ+/–) son sanos, pero muestran una pequeña reducción en elnúmero total de linfocitos αβ y γδ en sangre periférica. Tratamos, eneste contexto, de averiguar si presentan otros defectos en linfocitos Ty extender el trabajo a ratón.

Métodos. Citometría de flujo comparativa, biotinilación y ensa-yos funcionales.

Resultados. Un análisis detallado de la expresión en superficie delTCR/CD3 usando un amplio rango de anticuerpos CD3-específicosmuestra una reducción consistente de su unión en heterocigotos (60-90% de los controles). Esta reducción es estable in vitro en células T γ+/–

transformadas (40-60% de los controles). La biotinilación en superfi-cie y el marcaje intracelular confirman estas observaciones, sugiriendoque hay menos proteína CD3 en linfocitos humanos γ+/– y δ+/–. Las célu-las T primarias de ratones γ+/–, δ+/– y ε+/– también muestran una uniónreducida de anticuerpos anti-CD3 (40-50% de los controles). De hecho,algunos anticuerpos anti-CD3 (17A2, 7D6) no pueden distinguir entreγ+/– y γ–/– en células Tαβ de ratón. La disminución en la expresión delTCR en humanos y ratones correlaciona con defectos en parámetrosfuncionales tardíos (proliferación inducida por anti-CD3, pero no porIL-2 o PMA+ionomicina), mientras que los eventos tempranos de acti-vación se encuentran disminuidos en humanos (inducción de CD69 enγ+/–) y normales en ratones (inducción de CD69 en γ+/–, δ+/– o ε+/– ).

Conclusiones. Los heterocigotos portadores de mutacionesen CD3G, CD3D y CD3E muestran un deterioro parcial pero con-

sistente de la expresión y función del TCR/CD3. Estos resultadospodrían ser de valor diagnóstico (detección de portadores de muta-ciones en CD3), pero también pueden dar información de la fun-ción específica de cada cadena si se objetivan defectos específicosde cadena.

O-101ESTUDIO POBLACIONAL DE LA DISTRIBUCIÓN DE LA MUTA-CIÓN E52DEL EN MYD88. L. Carretero-Iglesia1, M. Pascal1, O. Fer-nández1, D. Comas2, M. López-Nevot3, R. De Pablo4, O. Vall5, J.I. Arós-tegui1, J. Yagüe1, A. Más6, M. Juan Otero1. 1Hospital Clinic i Provincial deBarcelona, Barcelona. 2CEXS-UPF-PRBB, Spain. 3Hospital UniversitarioVirgen de las Nieves, Universidad de Granada, Granada. 4Hospital Puerta deHierro, Madrid. 5Hospital del Mar, Barcelona. 6Australia, India, Francia.

La deficiencia de MyD88 es una Inmunodeficiencia primaria delsistema inmune innato definida a través de 9 pacientes homozigotospara mutaciones que bloquean la función de la molécula señalizado-ra de la vía TIR (Receptores TLR e IL1). Característicamente estospacientes presentan sensibilidad a Pneumococo, Staphylococcus aureusy algunos gram negativos, desarrollando cuadros infecciosos habitual-mente con poca inflamación e incluso sin fiebre. Además hacia los 9-10 años parece que desaparece esta sensibilidad y los individuos nomuestran mayor número de infecciones de lo habitual. De las 5 fami-lias de la descripción inicial (von Bernuth H et al, Science 2008, 321:691)3 de ellas acumulaban 6 individuos con la mutación 160del3, designa-da como E52del, todas ellas familias de la etnia gitana.

Objetivos. Definir el grado de penetración de la mutación E52delen nuestra población especialmente en DNAs de población gitana sana,y en otras poblaciones relacionadas.

Material y Métodos. Muestras de DNA genómico: 400 gitanosespañoles de diversos orígenes geográficos (Barcelona, Madrid y Gra-nada), 100 gitanos de Bulgaria, 300 donantes no-gitanos españolessanos, 200 individuos de muestras de la India (estado de Gujarat). Elcribaje de la mutación se hace con Qiaxcel System (Qiagen) o con HRM(High Resolution Melting) por PCR en tiempo real y se recompruebalos casos de mutación por secuenciación convencional.

Resultados. En los resultados preliminares de 200 individuos deetnia gitana, 9 de ellos eran heterozigotos para E52del (frecuencia alé-lica = 1,63 %), mientras que ninguno de los 200 no gitanos ni de los 100hindúes estudiados mostraron la mutación.

Conclusiones. La inesperadamente alta prevalencia de esta muta-ción observada en estos estudios preliminares en la etnia gitana, tieneuna relevancia especial dada la alta consanguinidad observada en estegrupo. Los resultados obtenidos nos impulsan a ampliar el análisis auna población mayor y a considerar que la posibilidad de detectar des-cendientes afectos es mayor de lo esperado.

O-102EL GEN MSH5 NO ES UN FACTOR ETIOLÓGICO EN LA DEFI-CIENCIA SELECTIVA DE IGA PERO DEFINE AL SUBGRUPO DESUSCEPTIBILIDAD DE HLA-DRB1*0102. N. Del Pozo Rodríguez1,L.M. Medrano1, A. Ferreira2, M.C. García Rodríguez1, C. Núñez1. 1Hos-pital Clínico San Carlos, Madrid. 2Hospital La Paz, Madrid.

Introducción. La etiología de la deficiencia selectiva de IgA(DIgA) está influenciada por variantes genéticas en la región cromo-

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sómica 6p21, donde se localiza el HLA, aunque la susceptibilidadobservada no ha sido adscrita a ningún gen o genes específicos. Basán-dose en aspectos funcionales y estudios de asociación previos, seha propuesto un posible papel etiológico del gen MSH5, ubicadoen esa misma región cromosómica. Sin embargo, el extenso desequi-librio de ligamiento en la región HLA obliga a realizar análisis adi-cionales.

Nuestro objetivo ha sido evaluar el papel de ciertos SNPs del genMSH5 en DIgA, considerando su desequilibrio de ligamiento conotros marcadores HLA clásicamente asociados (DRB1*0102 y B*08-DR*03).

Material y Métodos. Realizamos un estudio con 146 tríos com-puestos por individuos con DIgA y ambos progenitores, todos ellos deorigen caucásico. Todas las muestras fueron genotipadas mediante son-das TaqMan para 2 SNPs del gen MSH5: rs28381349 (L85F), en el exón3; y rs3131378, en el intrón 12. El genotipado de otros marcadores HLAse llevó a cabo mediante PCR-SSOP (Polymerase Chain Reaction – Sequen-ce Specific Oligonucleotide Probe) o mediante ensayos TaqMan para SNPsaltamente correlacionados. El alelo minoritario de cada uno de los SNPsde MSH5 estudiados se encuentra en un haplotipo de susceptibili-dad HLA a DIgA (85F en HLA-DRB1*0102 y rs3131378_C en B*08-DR*03), por ello los datos familiares se usaron para establecer los haplo-tipos incluyendo dichos marcadores, lo que permitió realizar análisisestratificados.

Resultados. Los análisis TDT mostraron resultados significati-vos al considerar los polimorfismos estudiados en el MSH5. Sinembargo, los análisis estratificados considerando otros alelos delHLA excluyen un posible papel etiológico del gen MSH5. No obs-tante, el alelo minoritario del polimorfismo L85F define al sub-grupo portador de susceptibilidad dentro de los portadores delhaplotipo DRB1*0102.

Conclusiones. El gen MSH5 no parece tener un papel etiológicoen DIgA, como previamente se había postulado. Sin embargo, el alelo85F (rs28381349_T) permite definir, junto con DRB1*0102, un haploti-po de susceptibilidad a esta enfermedad. El factor causal dentro de esehaplotipo ha de encontrarse en el extremo telomérico de HLA de cla-se II ó en HLA de clase I ó III, puesto que marcadores centroméricosen HLA II presentan la misma composición alélica en todos los haplo-tipos que presentan DRB1*0102.

O-103EFECTOS INMUNOLÓGICOS SECUNDARIOS AL ESTRÉS PSI-COLÓGICO PRODUCIDO POR EL DIAGNÓSTICO DE CÁNCERDE MAMA. A. Corell1, P. Mora2, N. López-Fernández1, M. Nocito2,L. Barrero2, R. Reinoso3, M.E. Mateo1, M. Martino3. 1Universidad DeValladolid, Valladolid. 2Hospital Clínico Universitario de Valladolid, Valla-dolid. 3IOBA-Universidad de Valladolid.

Objetivos. Determinar las alteraciones inmunológicas secun-darias al estrés psicológico asociado al diagnóstico de cáncer demama en mujeres españolas y evaluar su evolución al año del diag-nóstico.

Material y métodos. 80 mujeres diagnosticadas de cáncer demama participaron en este estudio prospectivo. El nivel de estrés psi-cológico y la ansiedad atribuible al diagnóstico del cáncer fueron eva-luados mediante tests psicológicos (STAI). Para la evaluación del sis-tema inmune se analizaron diferentes parámetros inmunológicos: 1)inmunoglobulinas séricas y factores de complemento; 2) subpobla-

ciones linfocitarias, viabilidad y etapa apoptótica, capacidad fagocí-tica y explosión oxidativa de monocitos y granulocitos; 3) funcióncelular adaptativa, medida como la producción de ATP de los linfo-citos CD4 tras la estimulación con PHA. Todos estos parámetros fue-ron analizados en el momento de la intervención quirúrgica (extir-pación del tumor) y un año después de la operación, tras haber con-cluido todos los tratamientos quimioterápicos y/o radioterápicospost-quirúrgicos.

Resultados. La respuesta funcional de las células CD4 aumentósignificativamente al año de la intervención. El índice de producciónde ATP (estimuladas/basal) en el momento de la intervención fue de5.3 mientras en la segunda visita (tras cirugía y tratamiento) dichoíndice de ATP ascendió a 11.9, siendo esta diferencia estadísticamen-te significativa. En cuanto a la inmunidad innata, tanto la capacidadfagocítica como la respuesta oxidativa de los monocitos fueron sig-nificativamente superiores al año de haber sido tratadas respecto almomento de la cirugía. Hubo correlaciones significativas entre elnivel de estrés y/o ansiedad y los parámetros inmunológicos estu-diados.

Conclusiones. El estrés psicológico asociado al cáncer de mamaprovoca alteraciones inmunológicas disminuyendo la respuesta celu-lar innata y adaptativa. Estas alteraciones son dependientes del gradode estrés y ansiedad. Una vez que el estrés cesa y se ha “superado”la enfermedad, se produce una recuperación de la capacidad fagocíti-ca y de la respuesta oxidativa de los monocitos, así como una claramejoría de la respuesta funcional de los linfocitos T CD4.

O-104HIPERZINCEMIA: SÍNDROME AUTOINFLAMATORIO CRÓNI-CO E INFECCIÓN RECURRENTE. I. Sologuren Marrero1, I. BarriosDel Pino2, E. Herrera Ramos1, R. López Almaraz2, E. Santiago Quin-tana1, Y. Florido Ortega1, N. Gonzálrz Quevedo1, E. Colino Gil3, O.De La Calle4, J.I. Aróstegui Gorospe5, C. Rodríguez Gallego5. 1Hospi-tal Universitario de Gran Canaria "Dr" Negrín, Las Palmas De Gran Cana-ria. 2Hospital Universitario De Canarias, Santa Cruz De Tenerife. 3Hos-pital Universitario Insular Materno Infantil, Las Palmas De Gran Cana-ria. 4Hospital Sant Pau, Barcelona. 5Hospital Clínic De Barcelona, Barce-lona.

Introducción. Las inmunodeficiencias primarias (IDP) son ungrupo heterogéneo de enfermedades. Los pacientes presentan gene-ralmente infecciones recurrentes, aunque los síndromes autoinfla-matorios se caracterizan por episodios no provocados de inflama-ción. Entre estos últimos cabe destacar las inflamasomopatías (alte-raciones en la activación de IL-1β, Fiebre Mediterránea Familiar–FMF-, Síndrome hiper IgD –HIDS-, criopirinopatías –FCAS, MWS,NOMID/CINCA-) y los defectos del TNF-receptor (TRAPS), quepresentan episodios de inflamación estériles, crónicos o general-mente periódicos.

Paciente. Varón con infecciones recurrentes por Gram negativosdesde los 17 días de edad: abscesos perianales y de glúteo, abscesohepático por E. coli y sepsis nosocomial por P. aeruginosa. El pacientepresentaba frecuentemente neutropenia, anemia y trombocitopeniasgraves. Retraso estaturo-ponderal.

Resultados. En cultivos de sangre total no activados se observa-ron valores muy altos de citocinas inflamatorias, que no respondíana la estimulación con lipopolisacáridos. Se confirmó un síndrome deinflamación crónico: PCR 75-206 mg/L; VSG 72-164 mm/hora; ferri-

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tina 941-4652 mg/dL; fibrinógeno 713 mg/dL y fiebre persistente, inclu-so en ausencia de infección. Se descartaron IDP clásicas, los síndromesautoinflamatorios asociados a inflamasoma, TRAPS y otros síndromesautoinflamatorios.

La presentación clínica sugirió síndrome de hiperzincemia e hiper-calprotectinemia, una enfermedad muy rara (7 casos descritos), que secree debida a una alteración de la producción de calprotectina(S100A8/A9). Se confirmaron valores extremadamente altos de Zn yS100A8/A9. Al compararlo con pacientes con HIDS, FMF, CINCA/NOMID, o TRAPs, el niño presentaba valores hasta 1000 veces máselevados de S100A8/A9 y de S100A12 (dos alarminas del citoplasmadel neutrófilo con potente actividad proinflamatoria), niveles simila-res de IL-6 y elastasa de neutrófilos e inferiores de IL-8. El paciente fuetratado con ciclosporina A (CsA) y seguido durante dos años. Se apre-cia una remisión de los síntomas de la enfermedad (fiebre, PCR, hemo-globina, clínica), que correlaciona perfectamente con la bajada de nive-les de IL-6, pero no se aprecia efecto en otros mediadores proinfla-matorios (S100A8/A9, S100A12, TNF-α, IL-1B, IL-8) o con niveles deZn.

Conclusiones. El déficit de hiperzincemia causa una IDP conaumento de susceptibilidad a infección y síndrome autoinflamatoriopersistente, no periódico. Responde a tratamiento con CsA, con unefecto clínico que correlaciona con bajada de niveles de IL-6 sérica. Nose conoce la etiología. Nuestros datos indican que no es debido a des-regulación de S100A8/A9.

O-105LINFOPENIA CD4+ IDIOPÁTICA Y NIVELES DE EXPRESIÓNCD95/FAS: CORRELACIÓN CON SUSCEPTIBILIDAD A LA APOP-TOSIS. F. Silva Carreras , I. Hidalgo Izaguirre, R. Alenda Asensi, E.Roldan Santiago, J.L. Castañer Alabau, A. Andrés Martín. HospitalRamon y Cajal, Madrid.

Objetivos. Caracterizar la linfopenia CD4+ idiopática como unaentidad asociada a la sobreexpresión de CD95/Fas mediante análisispor citometría de flujo.

Material y Métodos. Dos pacientes varones de 48 y 65 añosen los que se observó una progresiva inversión del cocienteCD4/CD8 con serología negativa para VIH, virus linfotrópicos T yausencia de otras inmunodeficiencias primarias. Caso 1: asintomá-tico desde el inicio remitido por linfopenia importante (346/μL)observado en un hemograma. Caso 2: asintomático y remitido porinversión de cociente CD4/CD8 (0,6 y valor absoluto de linfocitosT CD4+ 282/μL), hallazgo durante seguimiento por una adenopa-tía en la que el estudio citológico por PAAF fue compatible con pro-ceso reactivo.

Se estudió el porcentaje y el nivel de expresión del antígeno CD95en los linfocitos CD4+ de ambos pacientes y de controles sanos, asícomo la inducción in vitro de apoptosis con el anticuerpo anti-CD95(clon CH11), determinada como células Anexina + en cultivos de 24horas.

Resultados. El porcentaje de células positivas para el antígenoCD95 en la población T CD4+ en controles sanos fue muy variable, porlo que no fue un buen parámetro diferenciador con respecto a los enfer-mos. Por el contrario, se detectó una población con intensidad mediade fluorescencia (IMF) para CD95-PE ≥ 300 (unidades arbitrarias),población no presente en sanos. Tal IMF correlacionó con la apoptosisin vitro, tanto espontánea como inducida con el clon CH11 (apoptosis

espontánea: 48% en enfermos, 8% en sanos; apoptosis inducida: 64%en enfermos, 15% en sanos).

Conclusiones. El nivel de expresión de CD95 es un excelente indi-cador de la linfopenia CD4 idiopática que, además, indica un “switch”del antígeno desde su forma inactiva hasta su forma activa.

O-106INMUNODEFICIENCIA TAB-GD+B+NK+ DE COMIENZO TAR-DÍO CAUSADA POR UNA MUTACIÓN DE SPLICING EN EL GENCD3D. C. Chean Pacheco1, J. Navarro Capistegui1, D. Gurbindo Gutie-rrez1, I. Gordillo Gutierrez1, P. Pérez Breña2, M.C. García Rodríguez3,P. Aparicio Rubio3, M.J. Recio4, J.R. Regueiro4, J. Gil Herrera1. 1Hospi-tal General Universitario Gregorio, Madrid. 2Centro Nacional de Microbio-logia, Madrid. 3Hospital Universiario La Paz, Madrid. 4Universidad Com-plutense ee Madrid.

Introducción. Todos los pacientes descritos con defectos en CD3‰presentan inmunodeficiencia combinada severa (IDCS) en el primersemestre de vida y ausencia completa de linfocitos T incluyendo amboslinajes α/β y γ/δ.

Objetivo. Estudiar las características diferenciales de un caso deIDCS causada por una mutación de splicing en el gen CD3D.

Paciente y Métodos. Varón diagnosticado de IDCS a los 14meses, con retraso ponderoestatural, dermatitis atópica, muguet,neumonía, crisis epileptiformes, diarrea por Cryptosporidium y colan-gitis esclerosante. Sometido a trasplante de progenitores hemato-poyéticos (TPH, alogénico de donante familiar haploidéntico) a los22 meses; el día +10 post-TPH presentó recuperación leucocitaria,y +12 un 100% de células del donante en sangre periférica (XX, porFISH con sonda CrX/Y). Utilizamos citometría de flujo (BD Bios-cience), incorporación de H3Thy, nefelometría, ELISA y hemaglu-tinación.

Resultados. Al ingreso, los linfocitos totales eran normales (3300células/μL) con linfopenia T (14%, 532 células/μL) a expensas de célu-las TCR αβ+ (CD4+ y CD8+, fenotipo de memoria y repertorio Vβ limi-tado), y un número normal de células TCRγδ+; ambas coexpresabanCD25 y eran de origen antólogo. El tamaño del timo era normal perolas células T CD4+CD45RA+CD31+ permanecieron muy bajas hasta elTPH. A pesar de la expresión reducida de CD3, TCRαβ y TCRγδ, encon-tramos respuestas linfoproliferativas T in vitro. Los linfocitos NK (29%,1102 células/μL) y B (54%, 2054 células/μL) eran normales, así comola IgG, IgA e IgM séricas.

Sin embargo, no se indujeron respuestas específicas tras inmu-nización (toxoide tetánico, virus Influenza y VHB). La hiperIgE(2141-4525 KU/L) e hipereosinofilia (800 – 5200/μL) se mantuvie-ron durante toda la evolución pre-trasplante. 9 meses post-TPH, loslinfocitos CD3+ (3496/μL) se han normalizado, revertido la relaciónentre TCRα/β (36%) γ/δ (1%), aumentado la cifra deCD4+CD45RA+CD31+, y descendido la IgE sérica a 235 KU/L. Lasintomatología digestiva ha mejorado, y desaparecido la presenciade Cryptosporidium en heces.

Conclusión. Se trata del primer caso de inmunodeficienciaselectiva de células T α/β (Tα/β–γδ+B+NK+), y se asocia con unrepertorio limitado de células T funcionales, comienzo tardío delas manifestaciones clínicas y rasgos Ommen-like. La reversiónde las alteraciones inmunológicas y mejoría clínica del pacientetras el TPH apoyan la patogenicidad de esta nueva mutación en elgen CD3D.

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SESIÓN 12: INMUNOLOGÍA TUMORAL

Moderadores: Ignacio Melero (Pamplona)Angel M. García Lora (Granada)

O-107REGRESIÓN DE METÁSTASIS TRAS INMUNOTERAPIA: IMPLI-CACIÓN DE GENES EFECTORES DE LA RESPUESTA INMUNI-TARIA Y LA PRESENTACIÓN ANTIGÉNICA. R. Carretero1, E.Wang2, A.I. Rodríguez1, A. Engle1, M.L. Ascierto1, F. Camacho3, F.M.Marincola2, F. Garrido1, T. Cabrera4. 1Hospital Universitario Virgen de lasNieves, Granada. 2National Institutes of Health. 3Hospital Universitario Vir-gen del Rocio, Sevilla. 4Universidad de Granada, Granada.

Objetivos. Los tratamientos contra el cáncer basados en la activaciónde la respuesta inmunitaria no están demostrando los resultados espe-rados. Solo un bajo porcentaje de pacientes muestran una completa regre-sión tumoral, mientras que otro gran porcentaje no muestra una respues-ta a la terapia, existiendo un grupo de respuesta mixta (regresoras y pro-gresoras). El objetivo de este estudio es el análisis del patrón de expresióngenómica de las diferentes lesiones de un paciente con respuesta mixta.

Material y metodos. Tras tratamiento inmunoterápico con célu-las tumorales antólogas más BCG, se obtuvieron 5 metástasis, 3 pro-gresoras y 2 regresoras. El patrón de expresión génica analizado median-te microchips de expresión génica (30000 genes). Mediante el progra-ma IPA se estudiaron las interacciones entre los genes diferencialmen-te expresados y las rutas metabólicas afectadas. Los resultados se con-firmaron mediante marcaje con anticuerpos monoclonales.

Resultados. Se detectaron diferencias significativas en 424 genes(p<0,05) entre metástasis regresoras y progresoras. 131 de los genes sobre-expresados en metástasis regresoras están implicados directamente enla respuesta inmunitaria, incluyendo HLA clase I y II, genes activadospor interferón (ISGs)como IRF1 y STAT 1 y moléculas efectoras (IEFs)como granzima B CD16, TCR… Las rutas metabólicas activadas duran-te la regresion son la presentación antigénica y el rechazo inmunitario.Las tinciones inmunohistoquímicas mostraron que existe un patrón deinfiltración diferente entre los 2 grupos de metástasis, y que las metás-tasis progresoras no tienen expresión de HLA B y C

Discusión. Los análisis demostraron claramente que las metásta-sis en regresión tienen mucho más activadas las vías del rechazo inmu-nitario (ISGs e IEFs). Por lo tanto se demuestra que la inmunoterapiaes capaz de activar la eliminación de alguna metástasis, pero otras pue-den evitarla y progresar. Los datos muestran que las moléculas HLAjuegan un papel fundamental en el reconocimiento y eliminación tumo-ral. Si la inmunoterapia no puede recuperar la presentación de antíge-nos tumorales a los linfocitos, se impide que el sistema inmunitariopueda reconocerlo y activar la respuesta de rechazo frente al tumor.

O-108NIVELES SÉRICOS DE INTERLEUCINA 6 EN PACIENTES SOME-TIDOS A COLONOSCOPIA DIAGNÓSTICA POR SOSPECHA DECÁNCER COLORRECTAL. A. Fernández Suárez, M.A. Marín More-no, J.L. Domínguez Jiménez, J.M. Aguilar Benítez, J.J. Puente Gutié-rrez, D. Fatela Cantillo, M.J. De La Torre Calzada, O. Elorza Maza,J.M. Díaz Iglesias. Hospital Alto Guadalquivir, Andújar.

Introducción. La interleucina-6 (IL-6) es una citocina pleiotrópi-ca perteneciente a la familia de las hematopoyetinas. Está implicada

en la activación de los hepatocitos para provocar la síntesis de prote-ínas de fase aguda La producción de IL-6 se induce rápidamente enlas reacciones inflamatorias que acompañan la muerte cerebral, lesio-nes, traumas, estrés, infecciones y diversas neoplasias.

Objetivos. Determinar los niveles séricos de la IL-6 en pacientescon sospecha de cáncer colorrectal (CCR) sometidos a colonoscopiadiagnóstica, para evaluar su utilidad como marcador en esta patolo-gía. Como objetivo secundario se intentará averiguar si existe algunarelación entre la concentración de IL-6 y las principales variables pro-nósticas (anatomía patológica).

Material y Métodos. Los pacientes incluidos procedían de treshospitales de la provincia de Jaén adscritos a la Empresa Pública Hos-pital Alto Guadalquivir. Todos los pacientes presentaban sospecha clí-nica de CCR, siendo remitidos por Aparato Digestivo a la Unidad deEndoscopias para realizar una colonoscopia diagnóstica. Se recogie-ron muestras de suero consecutivamente entre abril de 2008 y julio de2009. Todos los análisis fueron realizados antes del procedimiento decolonoscopia. Se tuvieron en cuenta los ritmos circadianos de la IL-6,realizando todas extracciones de suero a la misma hora de la mañana(10:30 horas). Los niveles séricos de IL-6 (pg/mL) se analizaron median-te un inmunoensayo "ECLIA" de electroquimioluminiscencia concebi-do para ser utilizado en los analizadores cobas e601 del Modular cobas®

6000 (Roche Diagnostics). Los niveles séricos de IL-6 no seguían unadistribución normal. Los datos se analizaron mediante el programaSPSS, versión 11.0.

Resultados. Se recogieron muestras de suero a 170 pacientes [edadmedia 61.5 años (20-93), 54.1% mujeres]. La colonoscopia seguida dela anatomía patológica confirmó el diagnóstico de CCR en 30 pacien-tes. El resto de diagnósticos encontrados fueron: 36 pacientes presen-taron pólipos (20 hiperplásicos y 16 adenomas, siendo 11 de ellos ade-nomas avanzados), 59 enfermedades digestivas benignas, 5 neoplasiasno CCR, 4 otras patologías no tumorales ni digestivas (cólico nefríti-co, EPOC, síndrome de Sjögren, pólipos endometriales), y en 36 pacien-tes no se evidenció ninguna patología relevante. La mediana (per-centil 25 – percentil 75) de la concentración sérica de IL-6 para el gru-po con CCR fue 5.68 pg/mL (3.77-10.17), para el grupo de pólipos 3.09pg/mL (2.00-6.16), para el grupo con enfermedades digestivas benig-nas 2.48 pg/mL (1.58-6.05), para otros cáncer no CCR 8.55 pg/mL (1.63-11.73) y para los pacientes sin evidencia de enfermedad 2.77 pg/mL(1.66-3.96). De acuerdo a la clasificación TNM, los niveles de IL-6 paraT1, T2, T3 y T4 fueron 1,75 pg/mL (1.50-2.00), 4.72 pg/mL (2.93-8.55),5.54 pg/mL (4.00-9.40) y 30.03 pg/mL (20.10-51.65) respectivamente.Sólo se encontraron diferencias significativas para T4 (p=0.021). Seencontraron valores muy elevados para N3 y M1. Los niveles de IL-6sólo correlacionaron con las variables tamaño tumoral (cm) y tumorprimario (Rho de Spearman 0.433, p=0.027 y 0.435, p=0.021 respecti-vamente). La IL-6 no mostró ninguna variación en su concentracióndentro del grupo de pólipos (tamaño, morfología o número de póli-pos, tipo de adenoma, presencia de adenoma avanzado). El área bajola curva ROC (95% CI) para la IL-6 fue de 0.691 (0.587–0.795). Un pun-to de corte de 6.7 pg/mL de IL-6 mostraba una sensibilidad del 43.3%con una especificidad del 80.7% para la detección del CCR.

Conclusiones. La rentabilidad diagnóstica de la IL-6 para la detec-ción del CCR es limitada, mostrando una sensibilidad similar a la delantígeno carcinoembrionario (CEA). Por otra parte, su especificidades moderada, y no está restringida a este tipo de tumor, comportándo-se como una proteína de fase aguda. Su correlación con las variablestamaño tumoral y tumor primario (T) podría indicar una potencialaplicación como marcador pronóstico.

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O-109DESCUBRIMIENTO DE BIOMARCADORES ÚTILES EN EL DIAG-NÓSTICO PRECOZ EN CÁNCER COLO-RECTAL MEDIANTE LADETECCIÓN DE AUTO-ANTÍGENOS. M. Fuentes García1, M. Gon-zález González1, J.M. Sayagües1, R. Bartolome Casado1, J. Labaer2, J.García1, A. Orfao1. 1Universidad de Salamanca-CSIC, Salamanca. 2Cen-ter for Personalized Medicine, Tempe, United States.

Los biomarcadores, particularmente aquellos con un alto valor pre-dictivo, tienen un elevado potencial en Oncología, incluyendo la moni-torización de la terapia o indicando progresión y/o detección precoz.Para descubrimiento de biomarcadores se ha empleado el propio siste-ma inmune del individuo, el cual produce respuestas humorales fren-te a proteínas antigénicas tumorales provenientes de alteraciones enniveles de expresión, mutación, degradación y/o localización. La pre-sencia de anticuerpos frente proteínas tumorales antigénicas puede rea-lizarse incluso antes de la aparición del cáncer. El reciente desarrollo dearrays de proteínas ofrece una herramienta ideal para el cribado selec-tivo de miles de proteínas frente a los sueros de los pacientes.

Objetivos. Detectar auto-anticuerpos frente a proteínas tumora-les antigénicas de pacientes de cáncer colo-rectal en diferentes estadiossin presentar metástasis y su posterior validación.

Metodología. Mediante un novedoso sistema de arrays de prote-ínas, denominado NAPPA (Nucleic Acids Programmable Protein Arrays)(Science 2004, 305:86-90, Nature Methods 2008, 5:535-8) se realizaráel screening de 25 sueros de pacientes con Cancer-Colorectal y 25 pacien-tes pre-y post- tratamiento neoadyuvante frente a más de 2000 prote-ínas humanas tumorales antigénicas.

Resultados y Conclusión. Se han detectado anticuerpos frente aproteínas tumorales como por ejemplo entre otras: K-RAS, p53,CXCL1,SPARC, gastrin,… Estos resultados se han validado medianteiFISH (Fluorescence in situ hybridization) y SNPs arrays mostrando alte-raciones genéticas en aquellas células tumorales diferentes en aquellospacientes con respuesta favorable en el tratamiento neoadyuvante.

O-110INFILTRACIÓN DE CÉLULAS T REGULADORAS (CD4+ FOXP3+) Y CD8+

LAP+ Y AUSENCIA DE CÉLULAS TH17 EN PIEZAS TUMORALES DEPACIENTES CON ADENOCARCINOMAGÁSTRICO.A. Aguinaga Barri-lero1, A. Gutiérrez Calvo2, J.M. Martín Villa1. 1Facultad de Medicina, UCM, Madrid.2Hospital Universitario Príncipe de Asturias.

Objetivo. Se han realizado diversos estudios sobre la posibleinfluencia de las células T reguladoras de las células Th17 en la proli-feración de los tumores. Nuestro objetivo es valorar simultáneamentela presencia de ambas poblaciones en pacientes con adenocarcinomagástrico.

Material y métodos. Se han obtenido muestras de tejido tumoraly de sangre de 4 pacientes, 2 muestras de sangre adicionales de pacien-tes y 5 muestras de sangre de individuos control. Se han valorado porcitometría de flujo marcadores de superficie y citoquinas específicasde las distintas poblaciones T (CD3, CD4, CD8, CD25, FOXP3, IL-17,IL-4, IFNγ). Como citoquina asociada a las células T reguladoras se haanalizado en este estudio el TGF‚ a través de la expresión de LAP(latency associated peptide), que forma el complejo inactivo latenteTGF‚ y se detecta en la superficie celular.

Resultados. Los resultados obtenidos revelan un aumento significa-tivo de células T reguladoras (CD4+CD25+FOXP3+) infiltrantes del tumor

en los pacientes con respecto al porcentaje de dichas células encontradoen las muestras de sangre de los individuos control (3,3±2,5% vs 0,4±0,5%;p=0,014). Las diferencias son casi significativas cuando se consideran lasmuestras de sangre de los pacientes (3,3±2,5% vs 0,8±1%; p=0,052). Tam-bién hay diferencias significativas en la proporción de células CD4+FOXP3+

(CD25–), que se ve aumentada en el tejido tumoral con respecto a la encon-trada en sangre tanto de pacientes (3,2±2,1% vs 0,6±0,7%; p=0,03) comode individuos control (3,2±2,1% vs 0,14±0,1%; p=0,014).

Además, hemos encontrado células CD8+ LAP+ en el tejido tumo-ral de pacientes, significativamente incrementadas con respecto a loencontrado en la sangre de individuos control (2,6±1,8% vs 0,4±0,6%;p=0,034). Sin embargo, no hay diferencias significativas en la pobla-ción CD4+ LAP+. Si consideramos el parámetro LAP+ (independien-temente del fenotipo CD4+ o CD8+) se alcanza una significación mar-ginal (p=0,05) cuando comparamos tejido tumoral y sangre de contro-les. Creemos que es la primera vez que se describe este hallazgo enhumanos. Estudios previos habían descrito la presencia de células CD8+

LAP+ en un modelo animal de EAE con un papel supresor. En conjun-to, nuestros datos sugieren un incremento de la expresión de LAP enpacientes respecto a sanos, independientemente del origen (sangre otejido) o el tipo (CD4 o CD8) de la población celular analizada.

Finalmente, no se han encontrado datos relevantes con relacióna la población de células Th17.

Conclusiones. Estos resultados sugieren que los mecanismos inmu-nológicos de inmunosupresión (Treg) están más presentes en el ambien-te tumoral que mecanismos de proinflamación (Th17) y que, dentro dela función reguladora/inmunosupresora, no sólo las células del lina-je CD4, ampliamente estudiadas, tienen un papel, sino también lascélulas CD8.*Este trabajo ha sido financiado por el Fondo de Investigación Sanitaria (FIS) (PS09/02096).Ana Aguinaga Barrilero es beneficiaria de una beca predoctoral concedida por la Univer-sidad Complutense de Madrid (UCM).

O-111LA DEFECTUOSA EXPRESIÓN DE LA CADENA CD3ZETA ENLINFOCITOS T DE SANGRE PERIFÉRICA DE PACIENTES CONADENOCARCINOMA GÁSTRICO NO SE DEBE A CAMBIOS ENLA SECUENCIA DEL CDNA NI A BAJOS NIVELES DEL CORRES-PONDIENTE ARNM. A. Aguinaga Barrilero1, M. Pérez Blas1, A. Gutié-rrez Calvo2, N. Rodríguez Pérez1, A. Blázquez2, I. Lasa2, J. Martín2, J.M.Martín Villa1. 1Facultad de Medicina, UCM, Madrid. 2Hospital Universi-tario Príncipe de Asturias.

Objetivo. Estudiar la expresión de la cadena CD3ζ en linfocitos Tde sangre periférica en un grupo de pacientes con adenocarcinomagástrico.

Material y métodos. Se obtuvieron muestras de sangre median-te venopunción de 34 pacientes con adenocarcinoma gástrico y 19 indi-viduos sanos control y se aislaron linfocitos T de sangre periférica. Ade-más, se obtuvo ARNm mediante extracción con Trizol y se retrotrans-cribió a cDNA. La determinación de los marcadores celulares (CD3ζ,CD3ε y CD45), se realizó mediante citometría de flujo. Se realizó secuen-ciación del cDNA obtenido y se midieron los niveles de ARNm median-te PCR cuantitativa.

Resultados. Se observó una expresión disminuida de la cadenaCD3ζ en linfocitos T de pacientes, tanto en porcentaje de células queexpresan esta cadena (91±8% vs 93±9%, p=0.04) como en valor de fluo-rescencia media (Mean Fluorescence Intensity, MFI; 405±516 vs 729±479,

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p=0.057). De una manera concordante, otras cadena pertenecientes alcomplejo TCR-CD3, (tal como CD3ε) mostraron también una menorexpresión (68±15% vs 77±6%, p=0.03; MFI 265±64 vs 334±74, p=0.002),mientras que otras moléculas fuera de este complejo (CD45) no mos-traron diferencias. Estudios adicionales de secuenciación del cDNA deCD3ζ y medición de niveles del correspondiente ARNm, no revelarondiferencias entre los pacientes y los individuos control.

Conclusiones. Se confirma una baja expresión de la cadena CD3ζen linfocitos T de sangre periférica en pacientes con adenocarcinomagástrico. El hecho de no encontrar diferencias en el cDNA ni en losniveles de ARNm apunta a que el defecto responsable de esta bajaexpresión parece estar localizado a nivel post transcripcional.*Este trabajo ha sido financiado por el Fondo de Investigación Sanitaria (FIS) (PI050572).Ana Aguinaga Barrilero y Noelia Rodríguez Pérez son beneficiarias de una beca pre-doctoral concedida por la Universidad Complutense de Madrid (UCM).

O-112INDUCCIÓN DE APOPTOSIS EN CÉLULAS T LEUCÉMICAS PORLOS INHIBIDORES DE METILACIÓN DE ADN ZEBULARINE YDECITABINE. M.J. Ruiz Magaña, J.C. Morales Camino, M.A. Saldi-via, M.D.C. Ruiz Ruiz. Universidad de Granada/Cibm, Armilla.

Objetivos. Las alteraciones epigenéticas juegan un papel funda-mental en el desarrollo y progresión de tumores. Una de las princi-pales modificaciones epigenéticas en humanos es la metilación delADN, alteración que suele provocar el silenciamiento de genes supre-sores de tumores. Existen compuestos farmacológicos que inducen lahipometilación del ADN y pueden revertir estas mutaciones siendo degran interés en la terapia antitumoral. El objetivo de este trabajo hasido conocer el efecto de los agentes desmetilantes decitabine y zebu-larine en células T leucémicas y en linfocitos T normales y su capaci-dad para inducir apoptosis en dichas células.

Material y métodos. Como células T leucémicas se usaron las líne-as celulares Jurkat, CEM-6 y MOLT-4. Los linfocitos T normales se ais-laron por selección negativa a partir de muestras de sangre de donan-tes voluntarios sanos; se activaron con fitohemaglutinina y anti-CD28durante 20 horas y se mantuvieron 5 días en medio suplementado conIL-2. La determinación de células apoptóticas se realizó mediantetinción con ioduro de propidio y análisis citofluorimétrico. La expre-sión de proteínas se analizó mediante Western Blot. La producción deespecies reactivas de oxígeno, la caída de potencial de membrana mito-condrial y la activación de la proteína pro-apoptótica Bak se ensaya-ron mediante citometría de flujo. El daño al ADN se determinó median-te ensayo cometa.

Resultados. Decitabine y zebularine inducen apoptosis depen-diente de caspasas y de la activación de la ruta intrínseca o mitocon-drial en líneas celulares T leucémicas, pero no en células T normales,en reposo o activadas. Además, estos agentes desmetilantes inducendaño al ADN y regulan la expresión de proteínas relacionadas con lainducción de apoptosis (como Apaf-1, Bax o c-IAP2). Las cinéticas deinducción de apoptosis, de inducción de daño al ADN y de regulaciónde proteínas sugieren que el mecanismo de acción antitumoral de estosagentes podría ser en cierto modo independiente de su actividad comoinhibidores de la metilación del ADN.

Conclusiones. Los agentes desmetilantes decitabine y zebularinepueden ser una estrategia terapéutica interesante en el tratamiento deleucemias de células T dados sus múltiples efectos y su acción selecti-va sobre células leucémicas.

O-113REGULACIÓN DE LA ACCIÓN CITOTÓXICA DE LINFOCITOST ACTIVADOS POR INHIBIDORES DE HISTONA DEACETILA-SAS. C. Ruiz-Ruiz, C. Gómez-Jiménez, M.J. Ruiz-Magaña, M.A. Sal-divia. Universidad de Granada, Armilla

Objetivos. Los inhibidores de histona deacetilasas (HDACi) regu-lan la expresión de proteínas relacionadas con apoptosis, como ligan-dos y receptores de muerte, en células tumorales, induciendo así apop-tosis en dichas células y modulando su sensibilidad a otras drogas tera-péuticas. Nosotros hemos estudiado la posible capacidad de los HDA-Ci para regular la expresión de ligandos de muerte en células con capa-cidad citotóxica y de esta manera potenciar la acción de las mismassobre células tumorales.

Material y métodos. Se obtuvieron PBMCs de donantes volunta-rios sanos por centrifugación en gradiente Ficoll-Histopaque y se des-cartaron los monocitos tras adhesión al frasco de cultivo. Las células Tse aislaron por selección negativa mediante separación magnética y suactivación se llevó a cabo por incubación durante 20 horas en presenciade fitohemoaglutinina-M y anti-CD28. Las células T activadas se utili-zaron tras 5 días de cultivo en medio suplementado con IL-2. Comomodelos de células tumorales se usaron células HeLa, SKBr3 y MCF-7y como células normales células dediduales estromales. Los HDACi uti-lizados fueron vorinostat, MS-275, ácido valproico y butirato sódico. Ladeterminación de células apoptóticas se realizó mediante citometríade flujo tras tinción del ADN con ioduro de propidio. El análisis de expre-sión de proteínas de membrana se llevó a cabo mediante citometría deflujo y la expresión de ARNm se determinó mediante PCR a tiempo real.

Resultados. El cocultivo de células tumorales con células T acti-vadas en presencia de los mencionados HDACi, potencia la acción cito-tóxica de dichas células T. Este efecto no se observa cuando se utilizancélulas T en reposo y ocurre específicamente sobre células tumorales.Analizamos la capacidad de dichos inhibidores para regular la expre-sión de ligandos de muerte en células T activadas encontrando que nohay cambios en la expresión de TRAIL, aunque sí se incrementa laexpresión de CD95L. Además las células tumorales, tras el tratamien-to con los HDACi, son más sensibles a la apoptosis mediada por CD95Ly otros ligandos de muerte.

Conclusiones. Los inhibidores de HDAC pueden regular la accióncitotóxica de células T activadas sobre células tumorales ejerciendo undoble efecto: aumentando la sensibilidad de las células tumorales eincrementando la capacidad citotóxica de los linfocitos T.

O-114GENERACIÓN DE ANTICUERPOS MULTIVALENTES PARA ELDIAGNÓSTICO DE TUMORES SÓLIDOS IN VIVO. Á. Cuesta Mar-tínez1, D. Sánchez-Martín1, L. Sanz1, M. Compte1, L. Kremer2, F.J. Blan-co3, L. Álvarez-Vallina1. 1Hospital Universitario Puerta de Hierro, Maja-dahonda. 2Centro Nacional de Biotecnología, Consejo Superior de Investiga-ciones Científicas. 3CIC bioGUNE, Parque Tecnológico de Bizkaia.

Objetivos. A partir del desarrollo de la tecnología del hibridomapara la generación de anticuerpos monoclonales y junto con el desarro-llo de las técnicas de ingeniería genética, se han generado una granvariedad de anticuerpos recombinantes (AcR) con capacidad para loca-lizar depósitos tumorales in vivo.

En este trabajo estudiamos las propiedades estructurales y funcio-nales in vitro e in vivo de un nuevo armazón proteico de origen euca-

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riótico capaz de generar AcR trivalentes, denominado Trimerbody, for-mado por un anticuerpo monocadena (scFv) unido al dominio NC1,responsable de la trimerización del colágeno XVIII.

Material y métodos. Se realizaron estudios estructurales para ladeterminación de su naturaleza multimérica y estudios funcionales deELISA frente al antígeno específico del scFv. Para determinar la ganan-cia en afinidad funcional (avidez) del Trimerbody frente al scFv mono-mérico, se realizaron estudios de Resonancia del Plasmón de Super-ficie (SPR). La localización de depósitos tumorales in vivo se realiza-ron mediante la conjugación del los anticuerpos con un fluorocromode emisión cercana al infrarrojo

Resultados. Los estudios estructurales (centrifugación analítica ycromatografía de afinidad) demuestran que el Trimerbody se presen-ta en solución como una estructura trimérica perfecta, con un pesomolecular de 110 kDa.

Los estudios funcionales demuestran que el nuevo formato Tri-merbody presenta mayor capacidad de unión que el formato monomé-rico, indicando que el armazón NC1 no altera la capacidad de unióndel scFv a su antígeno. Los datos obtenidos mediante SRP demuestranque el Trimerbody aumenta las constantes de unión respecto del scFv,con una mejora en 100 veces la afinidad funcional por su antígeno.

Los ensayos de localización de depósitos tumorales in vivo demues-tran que el Trimerbody presenta mejores características para la localiza-ción de tumores sólidos, con mayor intensidad de señal y mayor tiem-po de retención, que el mismo anticuerpo en formato monomérico.

Conclusiones. Estos datos indican que el armazón NC1 para latrimerización de scFvs mejora las propiedades funcionales in vitro, asícomo sus propiedades farmacocinéticas para la localización tumoralin vivo. Estos datos abren nuevas alternativas para la mejora y el des-arrollo de procedimientos diagnósticos no invasivos del cáncer huma-no.

O-115LA QUINASA ROCK: ¿UNA NUEVA DIANA TERAPÉUTICA ENEL TRATAMIENTO DE LA LEUCEMIA LINFÁTICA CRÓNICA?C. Cuesta Mateos, M. Alfonso Pérez, S. Guasch, A. Beltran Nuñez, J.M.Zapata, C. Muñoz Calleja. Hospital Universitario de la Princesa, Madrid.

Introducción. La Leucemia Linfática Crónica de células B (LLC-B) es una neoplasia incurable a fecha de hoy, caracterizada por unainfiltración diseminada de células tumorales en médula ósea y órga-nos linfoides secundarios (OLS). Estos OLS proporcionan microam-bientes de supervivencia para las células de LLC que pueden así esca-par a las terapias citotóxicas contribuyendo a la progresión de la enfer-medad.

En este sentido, el receptor de quimioquinas CCR7 y sus ligandos,las quimioquinas homeostaticas CCL19 y CCL21, parecen jugar unpapel esencial en la entrada de las células de LLC en los OLS. Previa-mente, nuestro grupo ya demostró que células de LLC de pacientescon linfadenopatía clínica migraban más eficientemente a los ligandosde CCR7 y que una de las vías principales implicadas en esta migra-ción es la vía de la pequeña GTPasa RhoA.

Fasudil es un inhibidor químico de ROCK, la molécula efectora deRhoA, que actualmente se utiliza para el tratamiento de enfermeda-des cardiovasculares y para mejorar la capacidad cognitiva de las víc-timas de infarto o en pacientes con Alzheimer.

Objetivo. Investigar el papel del fasudil en las vías de señaliza-ción dependientes de CCR7 tras activación con sus ligandos CCL19

y CCL21, implicadas en migración y supervivencia celular de las célu-las de LLC, en busca de nuevas aplicaciones en el campo de la onco-hematología.

Material y métodos. Se realizaron estudios de quimiotaxis y deapoptosis en presencia de fasudil y de los ligandos de CCR7, las qui-mioquinas CCL19 y CCL21. La activación de la GTPasa RhoA se estu-dió mediante ensayos de pull-down y el papel de la inhibición del fasu-dil sobre los sustratos de Rho mediante ensayos de inmunoblot.

Resultados. La actividad quimiotáctica inducida por los ligandosde CCR7, CCL19 y CCL21, en células de LLC se redujo significativa-mente en presencia de fasudil. Para descartar que la inhibición de lamigración fuera debida a un efecto tóxico se realizaron experimentosde viabilidad celular en presencia de fasudil a 24, 48 y 96 horas quedemostraron que la viabilidad de las células tratadas con fasudil esequiparable a la de las células sin tratar. Con el fin de confirmar que lainhibición de la migración tiene lugar a través del bloqueo de la víaRho/ROCK/MLC se realizaron ensayos de inmunoblot en los que seconstató que fasudil inhibe la fosforilación de MLC inducida por CCL19o CCL21.

Conclusión. Estos resultados sugieren que los inhibidores de lavía RhoA/ROCK/MLC pueden tener una aplicación terapéutica en laLLC-B ya que bloquearíamos la entrada de las células de LLC en losnichos de supervivencia que constituyen los OLS, haciéndolas mássensibles a la terapia de elección empleada en cada caso. Pretendemosexplorar esta posibilidad en ensayos preclínicos en un modelo muri-no de la enfermedad utilizando fasudil como agente único o en com-binación con agentes terapéuticos de primera elección como fludara-bina, ciclofosfamida o rituximab.

SESIÓN 13: INMUNIDAD Y TRASPLANTE

Moderadores: : Jose Luis Vicario (Madrid)Eduard Palou (Barcelona)

O-116VALOR PRONÓSTICO DE LA DETERMINACION DE IL-10 YANTICUERPOS ANTI-HLA SOLUBLE TRAS RECHAZO EN TRAS-PLANTE DE CORAZON. B. Manzanares Martin, R. Gonzalez Fer-nandez, J.M. Arizon Del Prado, M. Frias Casas, A. López Granados, J.Peña Martínez. Hospital Reina Sofia, Cordoba.

La IL-10 se postula que pueda jugar un importante papel en la tole-rancia de los órganos trasplantados debido a su acción inmunosu-presora y antiinflamatoria. También la determinación de Acs anti-HLAsoluble resulta de interés en el diagnóstico del rechazo.

Objetivos. Establecer si los niveles de IL-10 y de anticuerpos anti-HLA soluble tienen valor pronóstico en la evolución tras rechazo deltrasplante de corazón y su importancia para predecir el riesgo poste-rior de padecer infecciones y rechazo.

Material y métodos. Se analizaron 25 pacientes trasplantadosde corazón en nuestro hospital. Se recogieron muestras pretrasplantey postrasplante (días 1, 3, 5, 7, 15, 30 y posteriormente un control almes hasta el año). Durante un cuadro infeccioso o de rechazo se rea-lizaron determinaciones cada 2 días. Para la determinación en suerode IL-10 se utilizó la técnica Quantikine de R&D Systems. Tambiénse determinaron Ac anti-HLA soluble (técnica Pra-stat de Sangstat). Eldiagnóstico y grado de rechazo se hizo por criterios clínicos y anato-

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mopatológicos según protocolos de seguimiento vigentes en este hos-pital. Los cuadros infecciosos fueron diagnosticados según los crite-rios establecidos en cada caso.

Resultados. La elevación de las cifras de IL-10 en el período pos-terior al episodio de rechazo se relaciona con una buena evolución deltrasplante mientras que la falta de elevación de los valores de IL-10 ola disminución de ellos después del rechazo parece estar relacionadocon una mala evolución del trasplante. La disminución de las cifras deacs anti-HLA soluble después del rechazo se relaciona con pronósti-co favorable y buena evolución del rechazo. La falta de disminución ola elevación de las cifras de Anticuerpo anti-HLA soluble (PRA) des-pués del rechazo se van a relacionar con mal pronóstico y mala evolu-ción del trasplante,

Conclusión. Estos resultados podrían aconsejar la monitorizaciónde los enfermos trasplantados de forma rutinaria con estas determina-ciones.

O-117ESTUDIO DE ANTICUERPOS ANTI-HLA POR TECNOLOGÍALUMINEX EN LA PREDICCIÓN DEL RECHAZO AGUDO ENPACIENTES DE TRASPLANTE RENAL. J.L. Santiago, M.Á. Figue-redo, A. Rodríguez De La Peña, A. Sánchez-Fructuoso, I. Pérez-Flores,A. Barrientos. Hospital Clínico San Carlos, Madrid.

El trasplante renal sigue siendo a día de hoy la mejor terapia enpacientes con insuficiencia renal terminal para mejorar tanto su super-vivencia como su calidad de vida. Aunque el rechazo agudo del injer-to ha disminuido considerablemente en los últimos años, debido fun-damentalmente a la mejora de los tratamientos inmunosupresores, larealidad es que su impacto en la supervivencia del injerto a largo pla-zo ha sido menos eficaz de lo esperado. Es de sobra conocido que losanticuerpos donante específicos (ADEs) son un factor importante tan-to en la aparición de episodios de rechazo como en la supervivenciadel riñón. Sin embargo, el papel de los anticuerpos anti-HLA presen-tes en los pacientes antes del trasplante sigue siendo controvertido.

El propósito del estudio fue analizar si los pacientes con ADEs pre-sentes en su suero antes del trasplante tenían peor pronóstico que lospacientes con anticuerpos anti-HLA pre-trasplante pero que no erandonante específicos. Los que presentaron algún episodio de rechazofueron biopsiados y todos los pacientes híper-inmunizados (HI) fue-ron sometidos al mismo protocolo de inducción: Timoglobulina, Tacro-limus, Micofenolato y esteroides.

Se analizó el suero del día del trasplante de 23 pacientes HI median-te el estudio Single Antigen por Luminex. Encontramos ADEs preforma-dos en 13 pacientes que presentaron una mayor incidencia de rechazohumoral (OR=6.4; p=0.057) y celular (OR=14.4; p=0.02) que los pacien-tes con anticuerpos anti-HLA no donantes específicos. Además, lasupervivencia del injerto a 2 años fue significativamente inferior eneste mismo grupo (60% vs 100; p=0.01), de hecho los 5 pacientes quefueron trasplantectomizados presentaban ADEs pre-trasplante. El valorpredictivo de estos anticuerpos fue casi del 100% en los pacientes conADEs positivos pre-trasplante que habían perdido el injerto anterioren el primer año post-trasplante.

En conclusión, los anticuerpos anti HLA específicos frente al donan-te presentes en el suero del receptor antes del trasplante se asocian conun mayor riesgo de rechazo agudo y una supervivencia del injertomenor y se deben evitar en pacientes con perdida temprana del injer-to en trasplante previos.

O-118ALTA PREVALENCIA DE ANTICUERPOS ANTI-HLA-DQ EN ELTRASPLANTE RENAL, EN PACIENTES CON GLOMERULOPA-TIA DEL TRASPLANTE. A. López Vázquez, J.M. Baltar, R. AlonsoArias, B. Suárez Álvarez, P. Menéndez, C. Díaz Corte, E. Gómez Huer-tas, F. Ortega Suárez, C. López Larrea. Hospital Universitario Central deAsturias, Oviedo.

Introducción. La Glomerulopatía del trasplante (GT) es una pato-logía caracterizada por el depósito de C4d en capilares peritubularesy la multilaminación de la membrana basal glomerular con imáge-nes en doble contorno. Se encuadra en el rechazo crónico activo media-do por Ac de la clasificación de Banff-07. Se ha descrito la alta preva-lencia de anticuerpos anti HLA de clase II en pacientes con esta pato-logía.

Objetivos. Analizar la prevalencia y especificidad de los Ac anti-HLA en la GT.

Métodos. Estudio retrospectivo con 11 trasplantes renales diag-nosticados de GT. Se realizó la determinación de la presencia de anti-cuerpos anti HLA mediante los kits One-Lambda Labscreen SingleAntigen de clase I y II.

Resultados. Solamente 3 pacientes presentaban Anticuerpos anti-HLA de clase I, que ya habían sido detectados pretrasplante y en nin-gún caso resultaron ser específicos de donante. La totalidad de lospacientes estudiados presentaban Ac anti-HLA de clase II, 8/11 fren-te a HLA-DQ solamente (73%), 1/11 frente a HLA-DR y DQ (9%), 1/11frente a HLA-DR y DP (9%) y 1/11 frente a HLA-DP (9%). En ningu-no de los casos estudiados se detectaron Ac anti HLA de clase II pre-trasplante. Dada la elevada prevalencia de Ac anti HLA-DQ, se eva-luó mediante inmunohistoquímica y utilizando un anticuerpo mono-clonal específico de esta molécula, su expresión en biopsias renales,encontrando un patrón de tinción similar a los depósitos de C4d queaparecen en el rechazo humoral, mayoritariamente en el endoteliode capilares peritubulares. En 9 de las 11 biopsias estudiadas se detec-taron además depósitos de complemento,

Conclusiones. La elevada prevalencia de Ac anti-HLA-DQ asícomo la expresión de esta molécula en biopsias de pacientes conGT sugieren que HLA-DQ juega un papel predominante en el des-arrollo de dicha patología. La determinación y el seguimiento pos-trasplante de estos anticuerpos puede ser una herramienta muy útilen la detección precoz de la GT lo cual podría permitir el tratamien-to de esta patología previo al establecimiento de un daño irreversi-ble del injerto.

O-119LABSCREEN SINGLE ANTIGEN CORRELACIONA MEJOR CONEL CROSSMATCH POR CITOMETRÍA DE FLUJO QUE LABSCRE-EN MIX. L. Burgos Rodríguez, C. Moreno Parado, E. Domingo Rodrí-guez, J. Merino Roncal, A. Sánchez Ibarrola. Clinica Universidad DeNavarra, Pamplona.

La producción de anticuerpos frente a antígenos HLA se consi-dera un claro factor de mal pronóstico para la supervivencia del órga-no trasplantado. Sin embargo bajos niveles de anticuerpos anti HLApueden no ser perjudiciales, sino incluso beneficiosos para el pronós-tico del injerto. La mayor sensibilidad de las técnicas de fase sólida(Luminex) para la detección de anticuerpos anti HLA obliga a corre-lacionar estos datos con los obtenidos mediante otras técnicas de

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menor sensibilidad. En general los datos disponibles en la bibliogra-fía son datos reales de series de trasplantados que correlacionan elcrossmatch con datos previos de Luminex. Estas correlaciones handefraudado las expectativas debido presumiblemente a las caracte-rísticas técnicas del ensayo y a la variabilidad de los anticuerpos quese detectan.

Material y Métodos. En el presente estudio hemos analizado lareactividad de 37 sueros de pacientes con anticuerpos anti HLA median-te las técnicas de Luminex, citometría de flujo y microlinfocitotoxici-dad. Para la citometría de flujo (n=71 crossmatches) hemos enfrenta-do los sueros a 16 células tipadas para HLA de clase I, de tal forma quecada uno de los sueros presentan reactividad frente a un único antíge-no de los expresados en los linfocitos tipados. Finalmente hemos com-parado los resultados obtenidos de la citometría de flujo con los de fasesólida tanto en sistemas que detectan mezclas antigénicas (LABScre-en Mix, One Lambda) como antígenos únicos (LABScreen Single Anti-gen, One Lambda).

Resultados. Se comprueba una correlación estadísticamente sig-nificativa (r=0,83) entre los valores de Luminex antígeno único ylos movimientos de canal en la citometría de flujo. Hemos realiza-do un cálculo matemático para la definición del punto de corte de lafase sólida (MFI= 6883). Como cabría esperar, el LABScreen SingleAntigen correlaciona mejor con la citometría de flujo que el LABS-creen Mix (r=0,49).

Conclusiones. En este estudio hemos definido la intensidad mediade fluorescencia con significado clínico relevante en la tecnología Lumi-nex, mediante correlación con los datos de citometría de flujo y citoto-xicidad.

O-120VALORACIÓN DEL ESTADO INMUNOLÓGICO DE PACIENTESTRASPLANTADOS HEPÁTICOS INFECTADOS CON VHC. J.M.Lucena, L. Barrera, C. Bernal Pulido, M.Á. Gómez Bravo, A. NúñezRoldán, M.F. González Escribano. Hospital Universitario Virgen DelRocio, Sevilla.

Objetivo. Valorar el estado inmune de pacientes trasplantados dehígado con infección por virus de hepatitis C (VHC) tanto antes deltrasplante como durante el primer año post-trasplante mediante lamonitorización de la activación de células T CD4+.

Material y métodos. Se incluyeron 13 pacientes infectados conVHC y trasplantados de hígado. El nivel de activación de células TCD4+ se monitorizó en función de la concentración de ATP (Immuk-now®, Cylex). En cada paciente se realizaron 5 determinaciones: unaantes del trasplante y las demás a los 15, 30, 90 y 180 días post-tras-plante. Para establecer los niveles de concentración de ATP en célu-las CD4+ en individuos sanos se utilizaron muestras de sujetos sin pato-logía hematológica ni hepática. En cada muestra, además de la canti-dad total de ATP en sangre, se determinó la concentración de célulasCD4+ mediante citometría de flujo y la concentración de ATP/célulaCD4+. El análisis estadísitico se realizó mediante el test no paramétri-co Mann-Whitney U.

Resultados. En las muetras pre-trasplante, los pacientes infecta-dos VHC presentan una cantidad total de ATP inferior a los controlessanos (133.3 ng/ml vs. 375.1 ng/ml, p<0.0001). Sin embargo, no seencontraron diferencias significativas con respecto a la concentraciónde ATP/célula CD4+ entre pacientes y controles sanos (0.33 pg/cel vs0.42 pg/cel, p=0.271). A lo largo de estudio post-trasplante, se obser-

vó un incremento de la cantidad de ATP/célula CD4+ en los prime-ros 30 días (p<0.0001) y una disminución posterior hasta alcanzar losniveles previos del trasplante a los 180 días (p=0.16).

Conclusiones. La determinación de la concentración de ATP/célu-la CD4+ es más útil para comparar el nivel de activación de las célulasCD4. Durante el primer mes post-trasplante las células T CD4+ pre-sentan un nivel de activación mayor como consecuencia de la reacciónfrente al órgano trasplantado. Pasado este tiempo el nivel de activa-ción vuelve a los niveles previos al trasplante.

O-121CARACTERIZACION DE SUBPOBLACIONES FUNCIONALES TY B EN TRASPLANTE CARDIACO: ASOCIACION CON RECHA-ZO CELULAR. J. Carbone Campoverde, A. Gallego López, N. LanioAmador, J. Navarro Caspistegui, N. Del Pozo Rodríguez, J. FernandezYañez, E. Fernandez-Cruz, E. Sarmiento Marchese. Hospital GregorioMarañon, Madrid.

Introducción. Se desconoce el rol exacto de distintas subpoblacio-nes funcionales linfocitarias en la patogenesis del rechazo definido clá-sicamente como celular tras el trasplante cardiaco. El rechazo celularse caracteriza por un infiltrado inflamatorio que incluye predominan-temente linfocitos.

Objetivo. En este estudio evaluamos prospectivamente la diná-mica de distintas poblaciones funcionales de linfocitos T y B en sangreperiférica de 46 receptores adultos de trasplante cardiaco y su asocia-ción con el desarrollo de rechazo celular.

Métodos. Inducción: 2-dosis de Daclizumab, 1 mg/kg IV (día 0 y14); mantenimiento: tacrolimus o ciclosporina, micofenolato mofetil yprednisona. Estudios inmunológicos: Determinaciones seriadas de lin-focitos B naïve y memoria; linfocitos T naïve, memoria, activados, regu-ladores y efectores CD4+ y CD8+. Estudio realizado mediante citome-tría de flujo en sangre total. Subpoblaciones linfocitarias expresadascomo porcentaje del total de linfocitos CD19+, CD4+ o CD8+. Tiemposde estudio: Pre-trasplante, 7 días, 1 mes, 3 meses, 6 meses y un añopost-trasplante. Los episodios de rechazo celular se definieron segúncriterios de la ISHLT incluyendo sólo grados 2R o superiores. El diag-nóstico de rechazo celular se hizo a través de biopsia endomiocárdi-ca realizada por protocolo o cuando aconteció clínica sugestiva. Losrechazos fueron tratados con bolos IV de metilprednisolona (250-500mg/d) por 3 días, o prednisona 100 mg PO por 3 días consecutivosseguidos de reducción de la dosis.

Resultados. Los pacientes que tuvieron rechazo celular modera-do o severo (n=9) en comparación con aquellos que tuvieron funciónestable del injerto mostraron a día 7 porcentajes más bajos de linfoci-tos B naive (CD19+CD27–IgM+IgD+, p=0.04), de células reguladorasCD4+ (CD4/CD127lowFoxP3+, p=0.081) y más altos de células CD8+ dememoria efectoras (CD8+CD45RA–CCR7–, p=0.037). A los 3 y 6 meses,los porcentajes de linfocitos B naïve fueron más bajos en los pacien-tes con rechazo (p=0.06 and p=0.019, respectivamente), mientras queel porcentaje de linfocitos B de memoria con cambio de isotipo(CD19+CD27+IgM–IgD–) fueron más altos (p=0.022 y p=0.064, respec-tivamente).

Conclusión. Los datos sugieren que niveles más altos de linfoci-tos B de memoria podrían estar implicados en la patogenia del recha-zo celular. El rol potencial de las alteraciones de los distintos com-partimentos de linfocitos B como biomarcadores de rechazo queda pordefinir.

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O-122VIGILANCIA DE ANTICUERPOS ESPECÍFICOS ANTI-HAEMO-PHILUS INFLUENZAE EN PACIENTES CON TRASPLANTE CAR-DIACO E INFECCIONES. N. Del Pozo Rodríguez, E. Sarmiento, J.Navarro, J. Rodríguez-Molina, P. Muñoz, J. Fernández-Yañez, J. Palo-mo, E. Fernández-Cruz, J. Carbone. Hospital General Universitario Gre-gorio Marañón, Madrid.

Introducción. Se ha descrito que la hipogammaglobulinemia IgGpuede ser un parámetro útil para identificar pacientes de trasplantecardiaco (TC) en riesgo de infecciones después del TC. La medición deanticuerpos específicos anti-polisacárido capsular Haemophilus influen-zae tipo B (IgG anti-Hib) puede ser útil en la evaluación del estatus dela inmunidad humoral en pacientes con inmunodeficiencias. La vacu-na anti-Haemophilus influenzae no se encuentra en el calendario vacu-nal previo al trasplante.

Objetivo. Evaluación de anticuerpos específicos IgG anti-Hib enuna cohorte de pacientes TC con o sin complicaciones infecciosas bac-terianas.

Materiales y Métodos. Realizamos estudio prospectivo en 70 pacien-tes con TC 2003-2009 (edad media=53,34 años, rango:22-69); Hombres=48(68,6%), Mujeres=22 (31,4%). Se realizó la medición en suero de nive-les de anticuerpos específicos IgG anti-Hib, mediante ELISA (BindingSite®): pre-trasplante (basal), 7 y 30d post-TC. Todas las muestras pre ypost-trasplante fueron estudiadas al mismo tiempo.Terapia de induc-ción utilizada: Metilprednisolona y anticuerpos monoclonales anti-CD25.Terapia inmunosupresora de mantenimiento: Tacrolimus/Ciclospori-na, Micofenolato mofetil y Prednisona. Se utilizó profilaxis universal conganciclovir. Episodio Clínico: infección bacteriana que requirió terapiaintravenosa durante el primer año de seguimiento post-TC.

Resultados. 21 pacientes TC (30%) tuvieron infecciones bacteria-nas. Microorganismos aislados: Acinetobacter baumanii, Corynebacteriumspp, Enterobacter aerogenes, Enterococo spp, Escherichia coli, Haemophilusinfluenzae B, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeru-ginosa, Staphilococcus aureus, Staphilococcus epidermidis, Sternotrophomo-nas malthophilia, Streptococo viridians. En los pacientes TC observamosuna disminución significativa de IgG anti-Hib tanto a día 7 (0,765mg/L)como a 30 días (0,655mg/L) post-TC respecto al basal (1,05mg/L), ran-go=0,11-9mg/L; p=0,008 y p<0,001 respectivamente, IC: 95%. Obser-vamos en pacientes infectados una tendencia a disminución de IgGanti-Hib al mes (1,10±1,28mg/L) vs basales (2,00±2,56mg/L) p=0,055;IC:95%. Se observó una tendencia a menor concentración IgG anti-Hib7 días post-TC en pacientes infectados vs no infectados (1,21±1,99 vs2,01±2,47mg/L). Los niveles IgG anti-Hib basales y 30d post-trasplan-te eran similares en infectados y no infectados. Se ha sugerido que nive-les anti-Hib >1mg/L son protectores a largo plazo.

Conclusiones. La vigilancia de IgG específica anti-Hib, en el segui-miento del trasplante cardiaco, tiene el potencial de identificar a aque-llos receptores en alto riesgo de desarrollar infecciones bacterianas.

O-123SIMULTANEOUS IMMUNE MONITORING OF SPECIFIC ANTI-CYTOMEGALOVIRUS HUMORAL AND CELLULAR RESPON-SES IN HEART TRANSPLANT PATIENTS. E. Sarmiento Marchese1,N. Lanio Amador1, J. Carbone Campoverde1, A. Gallego López1, J. Nava-rro Caspistegui1, J. Fernandez-Yañez1, R. Alonso1, P. Muñoz1, F. Kern2.1Gregorio Marañon University Hospital, Madrid. 2Brighton and Sussex Medi-cal School, Sussex, UK, United Kingdom.

Background. CMV reactivation is frequent and not harmless afterheart transplantation (HT). Kern and Sarmiento have previously observedthat assessment of specific humoral and cellular responses could identifypatients at risk of CMV disease(1, 2).

Objective. To prospectively define combined quantitative thresholdsof protective humoral and cellular CMV-specific responses after HTthat discriminate patients at risk of CMV reactivation.

Patients. 38 CMV-seropositive adult HT patients receiving prophylacticIV ganciclovir (5 mg/kg bid during 14 days). Induction: daclizumab(day 0 and 14). Maintenance: tacrolimus or cyclosporine, mofetilmycophenolate and prednisone. Nine patients (24%) presented CMVreactivation, three of whom developed CMV disease.

Methods. Proportions of interferon-gamma producing peripheralblood CD4 and CD8 T-lymphocytes after ex vivo activation with CMV-IE-1 and pp65 peptide pools and serum titers of anti-CMV IgG weremeasured by flow-cytometry and ELISA, respectively. Pre-HT and 30dsamples were collected. CMV antigenemia was detected by IF andconfirmed by PCR during six months follow up.

Results. Pre-HT: CMV-IgG titer was higher in patients withoutantigenemia (24375 vs 9009, p=0.009). This difference remained at 30d(18162 vs 5682, p=0.002). Pre and 30d median values of CD8 responseswere not statically different between the two groups but intra-patientanalysis of IE1 responses showed that frequencies diminished moremarkedly over time in patients who developed CMV reactivation.Optimum Cut-off values after ROC analysis were 15500 titer for CMV-IgG and 0.41% for IE1-CD8/IFNγ+ frequencies at 30d post-HT. Tocalculate the positive and the negative predictive value (PPV and NPV),cases presenting both results below the cut-off were defined as “positive”and the rest as “negative”. Cross-table analysis and the Wilson methodprovided PPV of 47% and NPV of 100% a sensitivity of 100% andspecificity of 64% with and accuracy of 73% (95%CI). There were notsignificant differences among distinct clinical variables. Post-HT bacterialinfections were more prevalent in patients who developed CMVreactivation.

Conclusion. The combined analysis of quantitative humoraland cellular responses could be a valuable monitoring tool for thedesign of prolongued prophylaxis strategies in selected patients.References1. JEM 2005,201(7):1031-36. 2. Int Immunopharmacol 2009,9(6):649-52.


SESIÓN 1: AUTOINMUNIDAD

Moderadores: Carmen Gelpi (Barcelona)Ricardo Pujol-Borrel (Barcelona)

P-001ESCLEROSIS SISTÉMICA Y ANTICUERPOS ANTI-RNA POLI-MERASA III. V. Pérez Aradas, B. Joven, E. Pérez Aradas, M. TaliseAstier, S. Lermo, M. Sevilla Sánchez, Y. Paredes, D. Valero Hervas, J.Alfaro, A. Serrano, P. Carreira. Hospital Doce de Octubre, Valdemoro

La Esclerosis sistémica (ES) es una enfermedad reumática autoin-mune muy heterogénea caracterizada por daño microvascular y fibro-sis de la piel y otros órganos. Estos pacientes presentan anticuerposantinucleares como son los anticuerpos anticentrómero (ACA) y anti-topoisomerasa (Scl-70) (ATA) que se encuentran relacionados con dis-tintas manifestaciones clínicas de la enfermedad. Sin embargo, estosdos son positivos en aproximadamente el 50% de los pacientes conesclerosis sistémica. Existen otros anticuerpos con características dis-tintas cuyas principales dianas son las RNA polimerasas I, II y III(ARA) y que son los que se relacionan con mayor frecuencia con laenfermedad. Los pacientes con positividad para anticuerpos RNApolimerasa III no presentan ninguno de los demás anticuerpos quesuelen encontrarse en pacientes con ES, como los ACA, ATA y anti-PM/Scl. Por tanto estos pacientes forman un grupo serológico sepa-rado. La prevalencia de este anticuerpo puede variar desde un 5% al25%. Se ha demostrado que estos pacientes tienen un mayor riesgode sufrir la forma cutánea difusa de la esclerodermia y una elevadaprobabilidad de desarrollar afectación cutánea mayor y nefropatíahipertensiva.

Objetivos. 1) Analizar la incidencia de anticuerpos anti RNA Poli-merasa 3 (pol3) en pacientes con esclerosis sistémica (ES), y 2) Com-parar las características clínicas del grupo de pacientes Pol3 (+) con losgrupos de pacientes anti-toposiomerasa I (aScl70) (+) y anticentró-mero (ACA) (+).

Pacientes y métodos. Pacientes con ES vistos en la consulta dereumatología entre enero y mayo de 2009, cuyas características habí-an sido incluidas previamente en una base de datos con informa-ción demográfica y clínica recogida prospectivamente. Se analizóel suero para la presencia de anticuerpos Pol-3, mediante ELISA.Las características clínicas de los pacientes Pol-3 (+) se compararoncon las de otros dos grupos de pacientes: uno con aScl70 (+) y otrocon ACA (+). Se utilizó Odds ratio con IC del 95% para medir lafuerza de asociación entre las variables cualitativas, y prueba t paramuestras independientes para analizar las diferencias entre varia-bles cuantitativas.

Resultados. De los 73 pacientes con ES analizados, 16% eran posi-tivos para Pol3 y negativos para ACA y aScl70. Cinco tenían enferme-dad difusa, 3 afectación muscular, 3 fibrosis pulmonar y 1 crisis renal,pero ninguno tenía hipertensión pulmonar (HP). Comparando el 16%

Pol3 (+) con el grupo de 65 pacientes con ES y aScl70 (+), los pacientesPol3 (+) tenían una incidencia menor de fibrosis pulmonar (OR=0,02;95%CI 0,05-0,85; p=0,04); y con el grupo de 98 pacientes ACA (+), lospacientes Pol3 (+) eran más jóvenes al inicio de la enfermedad (33 vs48 años, p=0,02), y presentaban más enfermedad difusa (OR=4,6; 95%CI1,2-16,8; p=0,03), más áreas avasculares en la capilaroscopia (OR=6,5;95%CI 1,6-26,8; p=0,01), más contracturas en flexión (OR=7,0; 95%CI1,2-41,7; p=0,05) y mayor afectación muscular (OR=6,9; 95%CI 1,4-34,7;p=0,03).

Conclusiones. Los anticuerpos anti-RNA polimerasa 3 aparecenen el 16% de nuestra población de pacientes con una edad menor alinicio de la enfermedad, afectación cutánea difusa, mayor afectaciónmuscular y menor frecuencia de fibrosis pulmonar.

P-002EXPRESIÓN DE FOXP3 Y OTROS MARCADORES DE CÉLULASREGULADORAS EN PACIENTES DE LUPUS ERITEMATOSO SIS-TÉMICO. C. Prado Cueto1, J. Gómez Arbesú2, B. De Paz Cazón1, J.Rodríguez Carrio1, P. López Suárez1, C. Gutiérrez Martín2, A. SuárezDíaz1. 1Universidad de Oviedo, Oviedo.2Hospital Universitario Central deAsturias.

Objetivos. El análisis de las células Treg Foxp3+ en el LES ha mos-trado resultados contradictorios, habiéndose descrito recientementeuna elevada expresión de este marcador en linfocitos CD25-. Por ellonos propusimos cuantificar la expresión de marcadores de células Tregen linfocitos CD4+ de pacientes de LES en función de su expresión deCD25.

Pacientes y métodos. Mediante citometría de flujo se analizó laexpresión de CD4, CD25, Foxp3, CD127, CD45RO, CCR4 y CCR6 asícomo los niveles séricos de IFNα, RANTES y MIP1α en 19 controles y69 pacientes de LES, de los que se registraron parámetros clínicos einmunológicos, actividad (SLEDAI) y tratamiento recibido durante losúltimos tres meses.

Resultados. El porcentaje de células FoxP3+ y Foxp3+CD127-/lowaparece significativamente elevado en pacientes comparado con con-troles (p<0,001 y p<0,007, respectivamente). Este incremento no se debea las células Treg clásicas, ya que la frecuencia de células CD25high-Foxp3+ y CD25highCD127-/low es similar en ambos grupos, mien-tras que la población CD25highCCR4+CCR6+ desciende (p<0,041). Elalto porcentaje de células Foxp3+ en pacientes se debe a la elevadaexpresión de este marcador en linfocitos CD25- (p<0,0005) y CD25low(p<0,0004), observándose también una mayor proporción de célulasCD25lowCD127-/low (p<0,008), de acuerdo con su estado de activa-ción celular. Además, se encontró una correlación negativa entre losporcentajes de CD25-Foxp3+ y CD4+ (r=-0.404, p<0,00009), poblaciónque disminuye en pacientes de LES durante el transcurso de la enfer-medad, siendo significativo un año después del diagnóstico (p<0,004).De hecho, clasificando a los pacientes en función de este parámetro,sólo aquéllos con una evolución mayor de 1 año presentan un porcen-

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PóstersInmunología

Vol. 29 / Supl. 1/ Junio 2010: 60-122


taje elevado de células Foxp3+ (p<0,0003) y CD127-/low (p<0,002) enla supoblación CD25-, mientras que en los pacientes de diagnósticoreciente los porcentajes son similares a los controles. No se observócorrelación con SLEDAI, título de anti-dsDNA o niveles séricos deIFNα, RANTES o MIP1α.

Conclusiones. Los linfocitos CD4+CD25-Foxp3+ están aumenta-dos en el LES, fundamentalmente en pacientes con una duración de laenfermedad mayor de 1 año. Este incremento podría deberse en par-te a la apoptosis o muerte selectiva de células activadas Foxp3- enpacientes con un proceso inflamatorio crónico.

P-003EVALUACIÓN DEL VALOR DIAGNÓSTICO DE LAS BIOPSIASDE BULBO DUODENAL EN NIÑOS CON ENFERMEDAD CELÍ-ACA. A. Andrés Martín, N. Marín Crespo, S. Mirete Bachiller, C.Camarero Salces, G. Roy Ariño. Hospital Ramón Y Cajal De Madrid,Madrid.

Objetivos. Comparar la distribución de las distintas sub-pobla-ciones de linfocitos intra-epiteliales (LIEs) en bulbo duodenal frentea duodeno distal, con el fin de poder ser utilizado en el diagnóstico dela enteropatía celíaca.

Material y métodos. Se han analizado por citometría de flujo (CTM)81 biopsias procedentes de pacientes celíacos (C), 33 de no celíacos(NC) y 9 de celíacos en tratamiento (DSG), obtenidas de duodeno dis-tal y bulbo, comparando las 3 sub-poblaciones que se utilizan en eldiagnóstico rutinario en nuestro Servicio: CD45+, CD3+TCRγδ+,CD103+CD3- (NK intestinales). Todos los resultados se confirman conlos datos histológicos y serológicos.

Resultados. En la tabla 1 se muestran los porcentajes (media ± ES)de las diferentes sub-poblaciones analizadas comparando los datosobtenidos en duodeno (D) frente a bulbo (B), sin que se observen dife-rencias estadísticamente significativas.

En el bulbo se reproducen las diferencias estadísticamente signi-ficativas (P<0,001) que se observan en la distribución de las sub-pobla-ciones del duodeno entre los diferentes grupos diagnósticos (Fig. 1).

Conclusiones. Confirmamos una buena técnica diagnóstica parala enfermedad celíaca basada en las alteraciones inmunológicas de laenfermedad, que no es parcheada y se mantiene constante a lo largodel duodeno, pudiendo también utilizarse en los casos de diagnósticodudoso (dato que se presentará en la sesión).

P-004CARACTERIZACIÓN DE PACIENTES CON ANTICUERPOSANTI PÉPTIDOS CITRULINADOS. E. Ruiz Ortiz De Arrizabale-ta1, D. Grados2, A. Marín1, I. Salvador1, A. Teniente Serra1, A. Brie-ga1, S. Holgado2, M. Martínez-Morillo2, X. Tena2, R. Pujol-Borrell1,E. Martínez-Cáceres1. 1LIRAD-BST-HUGTIP, Badalona. 2REUMATO-LOGÍA-HUGTIP.

Introducción. La determinación de Ac anti-péptidos citrulina-dos tiene valor diagnóstico y pronóstico en la artritis reumatoide (AR),con una sensibilidad similar a la del factor reumatoide y una mayorespecificidad. A pesar de eso, se ha descrito su presencia en otras enfer-medades y en personas sanas.

Objetivo. Describir las características clínicas de una cohorte depacientes con Ac anti-péptidos citrulinados positivos.

Pacientes y métodos. Estudio retrospectivo realizado en el HUG-TiP (población de referencia: 700.000 habitantes) durante el perio-do 2007- Febrero 2010. Se revisaron las historias clínicas de lospacientes con valores de Ac anti-péptidos citrulinados (anti-vimen-tina citrulinada mutada) ≥20 U/ml excluyendo aquellos casos sininformación clínica. Técnica utilizada: ELISA Anti-VMC (Orgen-tec).

Resultados. Se realizaron 1.310 determinaciones, de las cuales 449fueron positivas (34,3%). Se analizaron 335 pacientes (109 hombres(32,5%) y 226 mujeres (67,5%)).

En 240 casos (71,6%) los pacientes presentaron una enfermedadreumática asociada. El 67,9% de los pacientes con AR presentaronvalores >100 U/ml; eran especialmente elevados en las formas sero-positivas y erosivas. En los casos de conectivopatías y vasculitis losvalores encontrados fueron entre 20 y 50 U/ml. Siendo >50 U/mlsolo en 7 pacientes: 3 LES, 3 Sínd. Sjögren (SS) y 1 poliarteritis nodo-sa (PAN). La distribución en enfermedad de Still, reumatismo palin-drómico y AR del anciano fue similar para todos los valores. El 73%de artritis no filiadas presentaron valores entre 20-50 U/ml. En el gru-po miscelánea (artritis psoriásica, artritis por microcristales, polimial-gia reumática, sarcoidosis, artritis asociada a enfermedad inflamato-ria intestinal y artritis postinfecciosa) el 71,4% presentó valores <50U/ml. Tan solo superó el valor de 100 U/ml 1 caso de polimialgiareumática, 1 caso de condrocalcinosis y 1 paciente con neoplasia depulmón.

Noventa y cinco casos (28,4%) no presentaron enfermedad reu-mática asociada. 16 pacientes (17%) presentaron valores >50 U/ml (3fumadores). En 6 casos los valores fueron >100: 2 casos de nefropa-tía hipertensiva, 2 de pneumopatía (hipertensión pulmonar y fibro-sis pulmonar idiopática), 1 de anemia hemolítica autoimune y 1 casode drepanocitosis.

Conclusiones. A pesar que los Ac anti-péptidos citrulinados sonmuy específicos de AR, se han descrito en otras enfermedades reumá-ticas. Valores >50 U/ml tienen un valor predictivo positivo (VPP) del66% (76% si >100 U/ml) para el diagnóstico de AR, mientras que siconsideramos como positivo un valor >20 U/ml, el VPP baja hasta el39,1%. Por ello, en pacientes sin patología articular, valores entre 20-

Tabla 1.

Celíacos No celíacos DSGD B D B D B

CD45+ 19,9 ± 0,7 18,7 ± 0,7 8,9 ± 0,7 7,8 ± 0,9 11,7 ± 1,7 9,3 ± 1,4CD3+ TCRÁ‰+ 29,9 ± 1,4 30,7 ± 1,6 6,7 ± 1,1 5,8 ± 0,8 29,0 ± 4,8 29,9 ± 4,7i-NK 1,5 ± 0,2 1,4 ± 0,2 31,8 ± 3,0 26,2 ± 2,7 7,0 ± 1,3 5,6 ± 1,5

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INMUNOLOGÍA PÓSTERS


50 U/ml deben considerarse negativos y esta determinación ha de servalorada sólo en el contexto de una enfermedad reumática.

P-005ALTERACIONES DE LAS SUBPOBLACIONES LINFOCITARIASEN PACIENTES CON ESCLEROSIS MÚLTIPLE. L. García Ortiz1,O.M. Garibay Vargas1, G. García Castillo1, M.E. Vargas Camaño1,M.D.C. Chima Galán1, J.C. Pérez Razo1, J. Gutiérrez Salinas1, J.J.M.Zaragoza Saavedra2. 1Centro Medico Nacional 20 De Noviembre ISS-STE, Ciudad De México, Mexico. 2Instituto Nacional De Cancerologia,Mexico.

Objetivo. Identificar si existe diferencia en la cuenta de subpobla-ciones linfocitarias (CD3, CD4, CD8) y en el cociente CD4/CD8 entrepacientes con esclerosis múltiple y controles sanos.

Introducción. La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad neu-rológica que con frecuencia causa invalidez, se caracteriza por una res-puesta inflamatoria en la sustancia blanca, en donde las células T acti-vadas entran al SNC y desencadenan una respuesta autoinmune. Laliberación de citocinas por los linfocitos CD4+ cerca de las vainas demielina puede mediar el daño directo y aumentar el ataque citolíticode los macrófagos y otras células inflamatorias. La cronicidad de laenfermedad puede inducir a las células CD8+ a inhibir la producciónde IgG por medio de las células B y la disminución de las células CD4+parece correlacionarse con supresión funcional. Al inicio de las recaí-das los linfocitos CD8 están disminuidos en sangre periférica, secun-dariamente la relación CD4/CD8 esta aumentada. Aún no se sabe siesta alteración es resultado de la enfermedad o si se trata de una inmu-nodeficiencia que predispone a este padecimiento. No existen estudiosdonde se evalúen alteraciones en las subpoblaciones de linfocitos enpacientes con EM.

Material y métodos. Se realizó una investigación de casos y con-troles, de tipo observacional, transversal, prospectiva, comparativa yabierta, en donde se estudiaron 38 pacientes con esclerosis múltiplediagnosticados de acuerdo a los criterios de McDonald1 de 18 a 65 añosde edad, atendidos por los servicios de Neurología e Inmunología delCentro Médico Nacional “20 de Noviembre” – ISSSTE. El grupo con-trol estuvo constituido por 38 personas sanas, pareadas por sexo y sinantecedentes de enfermedades autoinmunes ni neurológicas, que acu-dieron al Banco de Sangre del mismo Centro Médico. Se tomaron mues-tras sanguíneas, previo consentimiento informado, de cada uno de losparticipantes para la determinación de CD3, CD4 y CD8 por citome-tría de flujo. Se realizó un análisis exploratorio de las medidas de ten-dencia central de cada variable, y para determinar diferencias estadís-ticamente significativas entre los grupos su utilizó la prueba de T deStudent.

Resultados. Las medias de las determinaciones de CD3, CD4, CD8y del cociente CD4/CD8 en los pacientes con EM fueron las siguien-tes: 1109, 732, 383 y 2.45; mientras que en los controles se encontró:1592, 953, 614 y 1.78, respectivamente. Los valores de t (3.52, 2.45, 3.92y 2.21, gl= 75, α= 0.05) mostraron diferencias estadísticamente signifi-cativas para CD3, CD8 y el cociente CD4/CD8 (P<0,05).

Conclusiones, CD3 en los pacientes con EM los muestra portado-res de linfocitopenia T. Los linfocitos CD8 también se encontraron dis-minuidos, lo cual condiciona un aumento en la relación CD4/CD8,como se ha reportado en este y otros trabajos. Queda por demostrar siesta disminución está asociada a una respuesta a infección viral cróni-ca o es constitucional en estos enfermos.

P-006ESTUDIO DE ANTICUERPOS ANTIHIPOFISARIOS (AAH) ENPACIENTES CON TRAUMATISMO CRANEOENCEFÁLICO (TCE).B. Dávila De Las Fuentes, A. Madrazo Atutxa, I.M. Martínez Morán,F. Murillo Cabezas, A. Leal Cerro, M.A. Montes Cano, A. Núñez Rol-dán. HHUU Virgen Del Rocío, Dos Hermanas, Sevilla.

Introducción. El hipopituitarismo es una complicación frecuentedel TCE. Los posibles mecanismos que subyacen tanto en la recupera-ción como en el agravamiento de la función de la glándula pituitariano están claros. La dinámica de cambios observados en la función dela hipófisis sugiere que el TCE podría disparar mecanismos de autoin-munidad responsables de esta alteración.

Objetivo. Investigar la prevalencia de AAH en pacientes con TCE.Métodos. Se han estudiado 31 pacientes con TCE (26 varones/5

mujeres), con una edad media de 32,40 ± 9,71 años y con una GCS ≤ 8,seguidos durante un año tras el TCE. Ninguno tenía antecedentes depatología autoinmune ni alteración hipofisaria. Se realizó un estudiode AAH durante la fase aguda, a los 6 y 12 meses del seguimientomediante técnica de inmunofluorescencia indirecta, utilizando comosustrato secciones de lóbulo hipofisario anterior de primate (Euroim-mun, Lubeck, Germany) e IgG preabsorbida con tejido de mono conel fin de minimizar el ruido de fondo.

Resultados. El 51,6% (16/31) presentaron un déficit aislado de hor-mona del crecimiento (GH). El resto no presentó déficit hormonal algu-no. La presencia de AAH se detectó en 7 (22,6%). En 1 caso se detectóAAH a los 6 meses y en otro a los 12 meses, teniendo ambos un défi-cit aislado de GH. En los 5 casos restantes la presencia de AAH se detec-tó en la fase aguda. En 2 de ellos los AAH persistieron durante el segui-miento y no presentaron alteración hormonal. En los tres restantes,se negativizaron los anticuerpos, presentando solo uno de ellos défi-cit de GH.

Conclusión. Hemos encontrado una prevalencia elevada de AAHen los pacientes de nuestra población (TCE). Sin embargo, la presen-cia de alteraciones hipofisarias no parece estar relacionada con la exis-tencia de AAH.

P-007ESTUDIO COMPARATIVO ENTRE DOS ENZIMOINMUNOEN-SAYOS E INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA PARA EL ANÁ-LISIS DE ANTICUERPOS ANTINUCLEARES. M.J. Martínez Bece-rra, C. Serrano Del Castillo, P. Tramón Gutierrez, M.J. Rodríguez Igle-sias, P. Palomino Díaz. Fundación Jiménez Díaz-Capio, Madrid.

Objetivos. El objetivo de nuestro estudio es comparar los resulta-dos obtenidos al estudiar los anticuerpos antinucleares (ANA) por dosenzimoinmunoensayos (ELISA) diferentes con los observados porinmunofluorescencia indirecta (IFI) así como con los datos de las his-torias clínicas para evaluar su sensibilidad y especificidad.

Material y métodos. El estudio consiste en una evaluación pros-pectiva de un total de 144 sueros procedentes de diferentes serviciosclínicos recopilados entre Noviembre 2009-Abril 2010.

Cada suero se analizó por dos técnicas de ELISA diferentes: ELiAANA CTD Screen - Phadia® Diagnostics, Uppsala, Sweden- y el kit deQUANTA Lite® ANA -INOVA Diagnostics®, San Diego, CA-. Simultá-neamente analizamos estos sueros por IFI (utilizando portas con dostipos de sustrato diferentes: líneas celulares hep2 y cortes de triple teji-do de rata -estómago, riñón e hígado-, ambos de INOVA®).

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PÓSTERS VOL. 29 SUPL. 1/ 2010


Las especificidades antigénicas correspondientes a los patronesobservados en la IFI se confirmaron en cada caso mediante Inmuno-blot (BlueDot. D-tek®) y ELiA® IgG InmunoCap (Phadia® Diagnostics).

Resultados. Los datos de sensibilidad y especificidad que se obtu-vieron al comparar ELiA ANA CTD Screen frente a IFI fueron 76% y80% (VPP 0,71, VPN 0,84), mientras que con QUANTA Lite® ANA fue-ron 96% y 58% respectivamente (VPP 0,60, VPN 0,96).

Cuando comparamos los datos clínicos con los resultados obteni-dos por ELiA ANA CTD Screen se observa una sensibilidad del 82% yuna especificidad del 89%, con un VPP de 0,85 y un VPN de 0,86; losdatos de sensibilidad y especificidad obtenidos con QUANTA Lite®

ANA fueron 94% y 62% (VPP 0.66, VPN 0.92), mientras que por IFIfueron 75% y 88% respectivamente (VPP 0.84, VPN 0.81)

Conclusiones. Los resultados obtenidos reflejan que ELIA ANACTD Screen presenta unos datos de especificidad similares a los obte-nidos por IFI, considerado actualmente el método gold-standard parael cribado de ANA; sin embargo, QUANTA Lite® muestra una mayorsensibilidad y una menor especificidad; esto nos hace plantearnos cuales el balance sensibilidad-especificidad deseado en un método preli-minar de cribado de ANA. La incorporación de extractos de célulashep2 podría explicar la mayor sensibilidad de QUANTA Lite® ANA.

P-008VALOR DIAGNÓSTICO DE LOS ANTICUERPOS ANTI PÉPTIDODE GLIADINA DEAMINADA. M. Alba Domínguez, E. Martínez-Ojinaga Nadal, J. Sarria Oses, B. San José, R. Álvarez Doforno. Hos-pital Universitario La Paz, Madrid.

Antecedentes. La enfermedad celíaca (EC) es una enteropatía inmu-ne causada por una sensibilidad al gluten en individuos genéticamen-te susceptibles, que afecta al 1% de la población.

Los métodos de diagnostico serológico constituyen una herramien-ta no invasiva de cribado de individuos de riesgo y población general.El conocimiento de la eficacia diagnostica de los marcadores serológi-cos en el diagnostico de la EC varia de forma considerable de unosestudios a otros debido a múltiples factores, como son la selección depacientes, diferencias poblacionales y variabilidad metodologica. Ladisponibilidad de nuevos kits comerciales para determinar anticuer-pos contra péptido específico de la gliadina, ha creado expectativaspara mejorar la detección serologica de la EC.

Objetivos. Estudiamos la validez diagnóstica de los marcadoresserologicos utilizados en la rutina diaria para despistaje de EC y de losnuevos Anticuerpos anti péptido de Gliadina Deaminada isotipo IgG(GDG) e IgA (GDA).

Pacientes y Métodos. Se estudiaron 156 pacientes con un diagnos-tico especifico, 41 celiacos sin gluten, 44 celiacos con gluten y 71 noceliacos. En la muestra total hay 131 pacientes en edad pediátrica (74son ≤ de 3 años) y 25 pacientes adultos (≥16 años).

Se realizó la detección de Ac anti endomisio (EM) mediante Inmu-nofluorescencia Indirecta (IFI) utilizando portas de esófago de mono(IMMCO).

Se determinaron los niveles de anticuerpos anti Transglutamina-sa (anti TG), anti gliadina (AG) y anti péptido de gliadina deamina-da (anti GD) de isotipo IgA e IGG mediante EliA en InmunoCAP 250(Phadia), punto de corte sugerido por la casa comercial ≥10 UI/mL.

Los resultados se analizaron empleando el programa estadísticoSPSS. La validez diagnostica de los ensayos fue calculada por análisisde la curva ROC (Receiver operating characteristic).

Resultados. Del análisis estadístico concluimos que para nuestramuestra, los marcadores que ofrecen diferencias estadísticamente sig-nificativas entre los grupos estudiados son los Ac anti endomisio, Acanti TGA, Ac anti TGG y Ac anti GDG.

La especificidad y sensibilidad de los Ac anti EM fue del 97,2 y95,5% respectivamente. El mejor punto de corte para los Ac anti TGAes de 15 UI/mL obteniéndose una sensibilidad y especificidad del 88,6%y 90,1% respectivamente.

Con respecto a los Ac anti TGG, para el punto de corte sugeridopor la casa comercial 10UI/mL, obtenemos un 54.5% y un 100% de sen-sibilidad y especificidad, no siendo mejorado al cambiar dicho punto.

Para el marcador de los Ac anti GDG se ha obtenido un 93,2% desensibilidad y una especificidad del 91,5%, ajustando el punto de cor-te a 7UI/mL.

Se analizaron los marcadores en los pacientes menores ó iguales a3 años y se encontró una especificidad y sensibilidad para los Ac antiTGA del 96% y 94% y para los Ac anti GDG del 96% y 91,6% respec-tivamente.

Conclusiones. En función de los resultados obtenidos en este estu-dio se aconseja realizar el despistaje inicial de enfermedad celiaca conla prueba Ac anti TGA estableciendo el punto de corte para esa técni-ca de 15 UI/mL. En niños ≤ 3 años deberá ir acompañada de la deter-minación de Ac anti GDG aconsejándose un punto de corte de 7UI/mL.

Los Ac anti endomisio se utilizarían como técnica de apoyo en loscasos dudosos.

P-009METHOTREXATE EFFECT IN DISTRIBUTION AND APOPTOSISOF LYMPHOCYTE POPULATIONS IN PATIENTS WITH RECENT-ONSET RHEUMATOID ARTHRITIS. G. Parada Hermoza1, D. DíazMartín1, L. Chara Velarde1, J. Chevarria Montesinos1, A. Sánchez Atrio2,Z. Moreno Villegas1, L. Ortega Moreno1, J. Monserrat Sanz1, A. PrietoMartín1, M. Álvarez De Mon-Soto2. 1Universidad de Alcalá de Henares,Alcalá de Henares. 2Hospital Universitario Príncipe de Asturias.

Purpose. To determine the effect and response to treatment withmethotrexate on the distribution and susceptibility to apoptosis ofdifferent peripheral blood lymphocyte subsets of patients with recent-onset rheumatoid arthritis (RA).

Methods. We obtained peripheral blood samples of 21 patientsdiagnosed with recent-onset RA, before treatment and after 3 and 6months of methotrexate treatment. We calculated the DAS-28 scoreto determine response to treatment and classifying patients into twogroups:Satisfactory response (SRP) (n=15) (DAS28<3,2) and unsatisfactoryresponse (URP) (n=6) (DAS28≥3,2). Peripheral blood mononuclear cellswere isolated and characterized using monoclonal antibodies andannexin-V by flow cytometry. The susceptibility to spontaneous andPhytohemaglutinina induces apoptosis was determined after 24hour culture.

Results. We observed a significant increase in the percentage ofactivated helper T cells (CD3+CD4+ CD25+) in patients compared tocontrols, initially and during treatment. We also observed significantdecrease of NK-cells in URP respect to SRP and controls, except at 6months of treatment. In the course of treatment we observed a lowerpercentage of apoptotic T lymphocytes (CD3+) in URP and apoptoticactivated helper T cells (CD3+CD4+CD25+) in both groups comparedto controls. We also observed a decrease in the percentage of apoptoticNK- cells in SRP. At 24 hours of cultures, there was an increased

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percentage of apoptotic cytotoxic T lymphocytes (CD3+CD8+CD28-)in URP with respect to SRP and controls, as well as a decrease in thepercentage of apoptotic B lymphocytes compared to controls duringtreatment.

In Phytohemaglutinina induced apoptosis, during treatment weobserved a significant decrease in the percentage of apoptotic cytotoxicT lymphocytes (CD3+CD8+) of patients with respect to controls. Wealso found an increase in the percentage of apoptotic B lymphocytesin PRS compared with controls.

Conclusions. Patients with recent-onset RA, showed alterationsin the distribution and apoptosis of lymphocytes characterized byincreased percentage of activated helper T cells and reduction of thepercentage of apoptotic NK-cells. Methotrexate alters the distributionand apoptosis, increasing the percentage of activated helper T cells,apoptotic NK-cells and apoptotic CD3+CD8+CD28- cells while decreasingthe percentage of T lymphocytes (CD3+) and B apoptotic in PRI butnot in PRS.

P-010UTILIDAD DE LOS ANTICUERPOS ANTI-PÉPTIDOS DEAMI-NADOS DE GLIADINA COMO PARÁMETRO ADICIONAL PARAEL DIAGNOSTICO DE ENFERMEDAD CELÍACA EN EL LABO-RATORIO CLÍNICO. P. Carrasco1, J.M. Ferrer1, S. Gordillo2, R. Ferrer1,N. Matamoros1, E. Bravi3. 1Hospital Son Dureta, Llucmajor. 2InvernessMedical Ibérica3 Eurospital, Trieste.

Objetivo. La sensibilidad y especificidad de los anticuerpos anti-transglutaminasa (ATGA) para la detección de enfermedad celíaca seaproxima al 100%. Los anticuerpos anti-gliadina (AGA) tienen un valorlimitado debido a su baja sensibilidad y especificidad. Recientementese han desarrollado nuevos kits para la identificación de anticuerposespecíficos contra péptidos deaminados de gliadina (PDG) para pro-porcionar una herramienta sensible y específica.

Nuestro objetivo fue evaluar la sensibilidad, especificidad y ren-dimiento de PDG en comparación a ATGA y AGA, actualmente utili-zados en nuestro laboratorio.

Materiales y métodos. 216 muestras enviadas a nuestro laborato-rio para estudio serológico de EC: Grupo 1: 137 muestras selecciona-das por ser positivas para ATGA y/o AGA. Estas incluyeron 67 celia-cos, 6 pacientes celíacos con deficiencia selectiva de IgA, 4 celíacosen dieta sin gluten y 60 pacientes no celíacos. Grupo 2: 79 muestrasseleccionadas por ser negativas para ATGA y AGA.

La detección serológica de ATGA y AGA se realizó mediante kitsElisa de Eurospital (Eu-tTG-IgA, Eu-tTG-IgG y α-gliatest IgA) y ladetección de PDG IgA e IgG se realizó mediante Gliapep-A y GliaPep-G, respectivamente. Los anticuerpos anti-endomisio IgA (EMA) fue-ron detectados mediante inmunofluorescencia indirecta sobre portasde esófago de mono (IMMCO).

Resultados. Grupo 1: En los 67 pacientes con EC, Eu-tTG-IgA fuepositiva en 99% de los casos, EMA en 89% y AGA en 73%. La positivi-dad de GliaPep-A fue de 79% y para GliaPep-G de un 86% mientrassu uso combinado obtuvo un positividad en 89% mostrando un mejorrendimiento que AGA.

Los pacientes con deficiencia de IgA fueron correctamente identi-ficados por Eu-tTG-IgG y GliaPep-G.

De los 60 no celiacos, sólo 8 fueron positivos para Eu-tTG-IgA, 9para GliaPep-G y 24 para GliaPep-A. 59 de 60 pacientes no celiacosfueron positivos para AGA.

Grupo 2: De los 79 sueros negativos para ATGA y AGA, todos fue-ron negativos para GliaPep-A y sólo 5 fueron positivos para GliaPep-G. Uno de ellos presentó un titulo alto de GliaPep-G y fue posterior-mente diagnosticado como celíaco con deficiencia de IgA. Los otros 4pacientes presentaban títulos bajos de GliaPep-G (<20 UI/ml) y corres-pondieron a pacientes pediátricos en estudio de EC pendientes de diag-nóstico.

Conclusiones.• PDG no pueden sustituir a ATGA en el diagnóstico de enferme-

dad celíaca, debido a su menor sensibilidad y especificidad.• PDG pueden ser útiles por su alto valor predictivo negativo. PDG-

IgG muestran una alta especificidad comparados con AGA, evi-tando la biopsia intestinal innecesaria de pacientes afectados porotros desordenes gastrointestinales.

• PDG-IgG son útiles para detección de pacientes celíacos con defi-ciencia selectiva de IgA. Usados en combinación con ATGA pue-den evitar la cuantificación sérica de IgA en todos los sueros.

• PDG pueden ser utilizados en el diagnóstico precoz de enferme-dad celiaca en niños con ATGA y AGA negativos.

P-011UTILIDAD DEL RECUENTO E INMUNOFENOTIPAJE DE LINFO-CITOS INTRAEPITELIALES EN LA MUCOSA INTESTINAL ENEL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDAD CELIACA. J. Melero Ruiz,M. García Cerrada, M.L. Vargas Pérez, J.J. Fernández De Mera, M.I.Muñoz Sanjuan, E. Doblaré Castellano, C. Gonzalez Roiz. HospitalInfanta Cristina, Badajoz.

Introducción. El recuento elevado de los linfocitos intraepitelia-les (LIE) totales es un hallazgo histológico clave en la EnfermedadCeliaca (EC). Los rangos de normalidad varían dependiendo de la téc-nica empleada.

Objetivo. Determinar el rango normal de los LIE y su lifograma(LIE-TCRγδ y LIE-NK-Like) por citometría de flujo y establecer su ren-tabilidad diagnóstica en EC (población infantil y adulta).

Material y métodos. Se obtuvo biopsia duodenal y suero de 246niños y 461 adultos con sospecha de EC. El diagnóstico histológico sebasó en criterios histológicos clásicos (Marsh I o mayor) y/o serologíapositiva para EC (221 niños y 98 adultos con EC activa). El grupo con-trol se constituye por individuos con biopsia Marsh 0 y serología celia-ca negativa (25 niños y 363 adultos). Se realizó contaje de los LIE porcitometría de flujo(y la proporciCD3+) (se expresan la media±DS). Secomparan los grupos con el test U de Mann-Whitney.

Resultados. Comparados con la población control, los niños conEC activa muestran aumento de la población de LIE (24,25±10,06 fren-te a 8,48±4,12), aumento de la proporción de TCRγδ (29,26±13,18 fren-te a 11,48±6,78); y disminución de LIE-NK-Like (4,74±9,25 frente a30,49±20,50). Al analizar el linfograma intraepitelial en la poblaciónadulta los resultados son: LIE (22,69±10,43 frente a 9,69±5,5), LIE-TCRγδ(26,85±13,02 frente a 8,45±7,86) y LIE-NK-like (2,08±2,62 frente a19,67±14,86). Se eligieron los puntos de corte de mayor rentabilidadclínica según las curvas ROC. En la población infantil se establecieroncomo puntos de corte: %LIE >14,2% (ABC 0,946; 95% IC 0,916-0,976);%TCRγδ>16,5% (ABC 0,898; 95% IC 0,852-0,945); y de %NK-Like<10,1%(ABC 0,944; 95% IC 0,915-0,973). En la población adulta:%LIE > 14,2% ( ABC 0,887; 95% IC 0,848-0,927); %TCRγδ>16,1% (ABC0,903; 95% IC 0,872-0,934) y %Nk-Like < 4,4% (ABC 0.960; 95% IC 0,942-0,977).

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Conclusiones. La alteración del linfograma, fuera de los rangosestablecidos de los 3 parámetros analizados, muestra una especifici-dad del 100% para el diagnóstico de EC Activa en el niño y en el adul-to. El inmunofenotipaje de los LIE es una técnica muy útil en el diag-nóstico de la EC que complementa el estudio anatomopatológico clá-sico aumentando su especificidad.

P-012DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL ENTRE PANCREATITIS AUTOIN-MUNE Y CÁNCER DE PANCREAS: UTILIDAD DE LOS ANTI-CUERPOS ANTI-ANHIDRASA CARBÓNICA II Y ANTI-ALFA 2AMILASA. M. Sánchez Castañón, G. De Las Heras, C. Gomez, M.López Hoyos. Hospital Universitario Marques De Valdecilla, Santander.

Se ha descrito la presencia de diversos autoanticuerpos (autoAcs)en el suero de pacientes con pancreatitis autoinmune (PAI), aunque suempleo como marcadores diagnóstico y el perfil de autoAcs a emple-ar es materia de debate. Los más frecuentemente asociados son los Acanti-anhidrasa carbónica II (AC-II) y, más recientemente, los anti-alfa2 amilasa (AMY). En este trabajo hemos analizado la utilidad de dis-tintas combinacions de autoAcs junto con los niveles séricos de IgG4para el diagnóstico de PAI. Estudiamos 106 pacientes con sospecha clí-nica de PAI y 94 como control de enfermedad que fueron vistos ennuestras consultas entre Junio de 2003 y Octubre de 2009. Los Acs anti-AC-II y anti-AMY se midieron mediante ELISA casero, mientras quelos niveles de IgG4 se cuantificaron mediante nefelometría. Los resul-tados mostraron una sensibilidad igual para ambos autoAcs (83%) perola especificida fue mayor para los Ac anti-AMY (88%) que para los anti-AC-II (76%). La presencia de niveles elevados de IgG4 fue el marcadormás específico (95%) pero con la sensibilidad más baja (58%). La com-binación de niveles elevados de IgG4 y Ac anti-AMY o la combinaciónde IgG4 elevada junto con Acs anti-AC-II y –AMY tuvo la mayor espe-cificidad (99%) y VPP (86%), pero con la sensibilidad más baja (50%).Cuando se combinó sólo la presencia de ambos autoAcs, la sensibili-dad fue la más alta (75%) con un VPN elevado (98%). Sin embargo,la especificidad y VPP fue de 93% y 47%, respectivamente. Fue muyimportante la ausencia total de Acs anti-AMY en los pacientes con cán-cer de páncreas. En resumen, la combinación de la presencia de Acsanti-AC-II y –AMY con niveles elevados séricos de IgG4 es de gran uti-lidad en el diagnóstico diferencial entre PAI y cáncer de páncreas. Finan-ciación.- FIS, IFIMAV.

P-013DESPISTAJE DE ANTICUERPOS ANTINUCLEARES ASOCIADOSA CONECTIVOPATÍAS MEDIANTE ELISA. ESTUDIO EN PARA-LELO FRENTE A INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA. J.A.García Trujillo, S. Romero Chala, C. Cámara Hijón, L. Fernández Perei-ra. Hospital San Pedro de Alcántara, Cáceres.

Introducción. El estudio de anticuerpos antinucleares (ANA) seha convertido en una determinación rutinaria de laboratorio y su soli-citud ha crecido exponencialmente en los últimos años. Su interpreta-ción requiere considerable experiencia, y existen numerosas discrepan-cias interlaboratorios. Aunque su sensibilidad es buena para las enfer-medades del tejido conectivo, su especificidad es baja, pudiendo apa-recer en numerosas enfermedades autoinmunes, infecciones, tumorese incluso en personas sanas. Se han hecho muchos esfuerzos en des-

arrollar un sistema no subjetivo y automatizado que pueda distinguirentre ANAs específicos de enfermedades del tejido conectivo y no espe-cíficos.

Objetivos. En este estudio hemos evaluado y comparado los ANAsrealizados por Inmunofluorescencia indirecta y un nuevo ELISA auto-matizado desarrollado para detectar anticuerpos asociados a enferme-dades del tejido conectivo (Elia CTD Screen, Phadia).

Métodos. 213 sueros enviados consecutivamente al laboratoriopara descartar ANAs fueron analizados en paralelo mediante Inmu-nofluorescencia indirecta y Elia CTD screen (UNICAP 250). Los casospositivos fueron confirmados por Inmunoblot (IB) de ENAs, dsDNApor ELISA y por Crithidia luciliae.

Resultados. • 144 sueros fueron negativos por ambas técnicas.• 20 sueros fueron positivos por ambas técnicas. 18 de ellos fueron

también positivos por inmunoblot o EIA-DNAds. Los 12 pacien-tes que tenían una enfermedad del tejido conectivo estuvieronen este grupo (SLE, Sjögren, esclerodermia y EMTC). 2 de estos 20que habían dado un resultado positivo débil fueron negativos porIB y EIA DNAds (tenían una gastritis atrófica y una poliartralgia).

• 8 sueros fueron Elia-CTD screen positivos pero ANA-IFI negati-vos, uno de ellos tenía un Ro52 y VHC, 1 RNP y conectivopatíaindiferenciada, 3 fueron EIA-DNAds positivos pero no tenían unaenfermedad específica. En 3 no pudimos detectar ningún antíge-no por IB.

• 41 sueros fueron ANA-IFI positivos pero CTD negativos. Ningu-no de ellos tenía una enfermedad del tejido conectivo. Conclusiones. Elia CTD screen tuvo una sensibilidad comparable

a ANA-IFI y una especificidad superior (94,3% vs 78.8%). Creemos quepodría ser una buena técnica de cribado, al menos en pacientes de Aten-ción Primaria, donde el número de pacientes ANA negativos llega ennuestra experiencia al 80% de los casos.

P-014RELACIÓN DE LOS ANTICUERPOS ANTI-NUCLEOSOMA CONLA ACTIVIDAD DEL LUPUS ERITEMATOSO SISTEMICO. L.Mozo Avellaned, J. Gómez Arbesú, J.L. Martín Alonso, A. MenéndezGonzález, C. Gutiérrez Martín. Hospital Universitario Central de Astu-rias, Oviedo.

Objetivos. Análisis de la eficacia de los Ac anti-nucleosoma (NC),cuantificados mediante dos ELISA con distinta composición antigéni-ca, en la evaluación de la actividad y la nefropatía en el lupus eritema-toso sistémico (LES). Los NC han sido propuestos como el principalantígeno en la patofisiología del LES y, además, existe una amplia evi-dencia sobre la asociación de los Ac anti-nucleosoma (anti-Nc) con eldaño orgánico. A pesar de ello, existen datos contradictorios sobre laeficacia de la determinación de estos autoAc en el diagnóstico y segui-miento del LES. Debido a la complejidad del antígeno, se ha sugeri-do que la composición antigénica utilizada en el método de evalua-ción puede ser una de las causas de estas diferencias observadas.

Tabla 1.

ANA-CTDPos Neg

ANA-IFI Pos 20 41 61Neg 8 144 153

28 186 213

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Material y métodos. Un ELISA utiliza mononucleosomas intactoshumanos mientras que el otro utiliza NC altamente purificados. Elestudio incluyó 106 pacientes de LES que cumplen los criterios delACR. La actividad de la enfermedad se evaluó en 49 pacientes median-te un SLEDAI modificado en el que se excluyó la puntuación corres-pondiente a los Ac anti-dsDNA. En 28 pacientes, se confirmó la nefri-tis lúpica mediante biopsia.

Resultados. El SLEDAI se correlacionaba significativamente conlos niveles de Ac anti-NC obtenidos con el ELISA con NC intactos comoantígeno (0,387, p<0,01, test Spearman) pero no con ELISA que empleaNC purificados. No se encontró asociación entre nefritis y la presen-cia de Ac anti-NC por ninguno de los dos métodos aunque los nivelesde significación eran claramente mayores en el caso del ELISA con NCpurificados. Finalmente, los niveles de Ac anti-dsDNA se correlacio-naban mejor con el SLEDAI y nefritis que los de los anti-NC.

Conclusiones. La correlación entre los niveles de Ac anti-NC yla actividad del LES está influenciada por la composición antigénica,siendo mayor cuando se utilizan NC intactos. La pérdida de proteínasantigénicamente importantes durante el proceso de purificación pue-de ser una de las causas.

P-015ALTA EFICACIA DIAGNOSTICA DE LOS ANTICUERPOS ANTI-PEPTIDOS DEAMIDADOS DE GLIADINA DE ISOTIPO IGGPARA EL DIAGNOSTICO DE LA ENFERMEDAD CELIACA ENNIÑOS. L. Mozo Avellaned, J. Gómez Arbesú, E. Escanlar Montese-rín, C. Bousoño García, C. Gutiérrez Martín. Hospital Universitario Cen-tral de Asturias, Oviedo.

Objetivo. Evaluar la eficacia diagnóstica para la enfermedad celí-aca (EC) de dos tests anti-péptidos deamidados de gliadina (dGp) IgAe IgG (Phadia, Freiburg, Alemania) en comparación con la de los anti-gliadina nativa IgA (anti-Glia).

Material y métodos. Se analizaron los sueros al diagnóstico de 100pacientes con EC (37 niños ≤5 años y 63 >5 años), positivos para Acanti-transglutaminasa IgA y biopsia duodenal Marsh I-IV. El grupocontrol consistió en 100 individuos (32 ≤5 años y 68 > 5 años) con biop-sia negativa, otras enfermedades autoinmunes o alergia a alimentos.La determinación de Ac anti-dGP IgG también fue evaluada en 6 pacien-tes celíacos con déficit de IgA.

Resultados. Los tres Ac analizados mostraban potencias diagnós-ticas (AUC) elevadas y similares. La más alta se obtuvo con anti-dGpIgG (99,5%) y la más baja con anti-Glia IgA (97,8%). Los Ac anti-dGpde ambos isotipos presentaron una sensibilidad y VPN similares ysuperiores a los obtenidos con los Ac anti-Glia IgA. Respecto a la espe-cificidad y al VPP, los Ac anti-dGp IgG mostraron los valores más ele-vados. En los niños ≤5 años, los Ac anti-dGp IgG presentaron los valo-res más altos para todos los parámetros, llegando al 100% en todosellos. En el grupo >5 años, los Ac anti-dGp IgG e IgA mostraron unaeficacia diagnóstica diferente a la observada en el grupo de niños ≤5años. Así, los Ac anti-dGpIgA eran superiores a los IgG respecto a sen-sibilidad, VPP y VPN mientras que los Ac anti-dGp mostraron la máxi-ma especificidad. Finalmente, los 6 pacientes celíacos con déficit deIgA presentaban Ac anti-dGp IgG mientras que los anti-Glia IgG úni-camente eran detectados en 5 pacientes.

Conclusiones. La eficacia diagnóstica para la EC de los Ac anti-dGp IgA e IgG depende de la edad del grupo estudiado. Así, los anti-dGp IgG muestran la mayor eficacia en niños para todos los paráme-

tros estudiados mientras que, en adultos, sólo son superiores a los deisotipo IgA respecto a la especificidad. Además, la incorporación de ladeterminación de Ac anti-dGP IgG en la rutina facilitaría el diagnósti-co en pacientes con déficit de IgA.

P-016NIÑO DE 5 MESES CON ALTOS NIVELES CIRCULANTES DEANTICUERPOS ANTI-µ2 GLICOPROTEÍNA Y PÚRPURA TROM-BOCITOPÉNICA IDIOPÁTICA. J.A. García Trujillo, S. Romero Cha-la, L. Fernández Pereira, C. Cámara Hijón. Hospital San Pedro de Alcán-tara, Cáceres.

Objetivos. Dilucidar el papel patogénico que juegan los anticuer-pos anti-β2 glicoproteína (‚2GPI) en un niño de cinco meses con trom-bocitopenia como único criterio diagnóstico de síndrome antifosfolí-pido.

Material y métodos. Se determinaron anticuerpos anticardiolipi-na (aCL IgG e IgM) y anti β2GPI por ELISA (Elia, Phadia, Sweden) adiferentes momentos.

Resultados. La trombocitopenia se resolvió con corticoides y unainfusión de gammaglobulina IV, no repitiéndose más episodios. Encambio, los altos niveles de β2GPI se mantuvieron elevados hasta los2 años de edad.

Conclusiones. Si bien se ha descrito la presencia ocasional de anti-cuerpos anti β2GPI en niños sanos, siempre ha sido a títulos bajos. Sinembargo, en este caso además de presentarse a título elevado, coinci-den en el tiempo con la aparición de la trombocitopenia y del antico-agulante lúpico. Todo esto parece indicar que realmente están jugan-do un papel patogénico en este paciente, siendo el caso más joven des-crito hasta el momento.

P-017AUTOANTICUERPOS EN PACIENTES POST TRASPLANTEHEPÁTICO PEDIÁTRICO. M. Alba Domínguez, R. Álvarez Dofor-no, P. Jara, L. Álvarez. Hospital Universitario La Paz, Madrid.

Antecedentes. El trasplante hepático es el tratamiento más efecti-vo para la enfermedad hepatobiliar en estadio final que presenta sín-tomas intratables. Los autoanticuerpos son detectados frecuentemen-te en receptores de un trasplante hepático y su aparición es un fenó-meno relativamente frecuente. La presencia de estos autoanticuerpos,de los que se desconoce el significado, puede estar relacionada con unadisfunción o daño hepático ya sea por una situación de rechazo delinjerto, recurrencia de la patología de base o el desarrollo de una enfer-medad autoinmune de Novo.

Objetivo. El objetivo de este estudio es 1) Conocer la prevalenciade los anticuerpos no órgano-específicos en un grupo de pacientes

Tabla 1.

Edad Plaquetas (*109/L) ββ2 GPI IgG aCL IgG e IgM Anticoagulante(UI/mL) ββ2 GPI IgM lúpico

5 meses 4 139,4 Negativos No determ.6 meses 480 142 Negativos Positivo10 meses 329 140 Negativos Negativo14 meses 445 177 Negativos Negativo19 meses 515 58 Negativos Negativo29 meses 291 22 Negativos Negativo

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pediátricos trasplantados de hígado y seguidos en el laboratorio. 2)Detección de autoanticuerpos raros e inusuales en triple tejido y HEp-2. 3) Identificación de los antígenos reconocidos por los autoanticuer-pos.

Materiales y métodos. En este estudio se han incluido 96 pacien-tes pediátricos trasplantados de hígado y con un tiempo postrasplan-te igual o mayor de 12 meses. Se detectaron Autoanticuerpos no órga-no-específicos: anticuerpos antinucleares (ANA), anti músculo liso(AML), antimitocondriales (AMA) y antimicrosomales de hígado yriñón (LKM), anti citosol hepático tipo 1 (LC1) por inmunofluorescen-cia indirecta (IFI) sobre portas de triple tejido de rata y células HEp-2humanas (Euroimmun) considerándose positivo los títulos > 1/80.Para la identificación de los antígenos se empleó un Inmunoblot (IMB)sobre extracto de hígado humano donante y un dot-blot perfil hepáti-co de proteínas purificadas ó recombinantes (Liver dot De-TEC).

Resultados. 1) De los 96 pacientes se detectaron 14 ANA positivos(14,6%), 2 con patrón homogéneo, 9 con patrón moteado y 3 con patrónnucleolar, todos a titulo medio-bajo excepto un caso que presentó títu-los elevados. En tres pacientes se detectaron AML (3,1%) todos a títu-los elevados. Un paciente con AMA (1%) a título elevado. Un pacien-te con Ac anti LKM (1%) a título elevado. Un paciente con LC1 (1%).2) Dentro de los patrones inusuales específicos de hígado, se encuen-tra la tinción de canalículos biliares y sinusoides hepáticos. Sobre célu-las HEp-2 destaca la presencia de un patrón citoplásmico granular ycitoesqueleto. 3) Los antígenos identificados reconocidos por los auto-anticuerpos en HEp-2 fueron midbody, NuMa y fibrilarina. Los AMLreconocieron F-actina. Los AMA reconocieron la deshidrogenasa decetoácidos de cadena ramificada. La especificidad del Ac anti LKM fueel citocromo P450-IID6. Los Ac anti citosol hepático reconocieron a laproteína formiminotransferasa ciclodeaminasa (LC1). La identificacióndel antígeno reconocido por los Ac anti canalículos biliares fue la pro-teína BSEP que se expresa exclusivamente en hígado.

Conclusión. En nuestra serie aparecen con poca frecuencia auto-anticuerpos no órgano-específicos a título elevado después del tras-plante hepático pediátrico.

De los autoanticuerpos raros e inusuales específicos del tejido hepá-tico, hemos identificado el antígeno de la mayoría de los anticuerposanti canalículos biliares como la proteína BESEP.

Es importante, en el seguimiento de los pacientes post-trasplantehepático, la detección de anticuerpos, la determinación de su especi-ficidad antigénica y el estudio de la relación de los parámetros clíni-cos con los resultados del laboratorio.

P-018ANÁLISIS DE LAS ALTERACIONES EN LA EXPRESIÓN DE CITO-QUINAS Y DE FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN EN PACIENTESCON LUPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO. S. García-Rodríguez1,E. Zumaquero-Martínez1, E.J. Pavón-Castillero1, P. Navarro-Cuesta1,S. Arias-Santiago2, J.L. Callejas-Rubio3, N. Ortego-Centeno3, J. San-cho-López1, M. Zubiaur-Marcos1. 1Instituto Parasitologia y Biomedicina,López-Neyra,CSIC, ARMILLA. 2Servicio de Dermatología. Hospital ClínicoUniversitario San Cecilio, Granada. 3Unidad de Enfermedades AutoinmunesSistémicas, Hospital Clínico San Cecilio, Granada.

Objetivo. En la patogénesis del Lupus Eritematoso Sistémico (LES)están implicados factores genéticos y ambientales que tienen comoconsecuencia alteraciones en la regulación del sistema inmune. Se hanevaluado las alteraciones en los niveles plasmáticos y de expresión de

un panel de citoquinas (pro-inflamatorias y anti-inflamatorias), asícomo de los factores de transcripción que determinan la selección delinaje de células T en células mononucleares de sangre periférica(PBMCs) de pacientes con LES respecto a controles sanos.

Material y métodos. Se determinó la concentración plasmática de10 citoquinas: IL-1beta, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12 (p70), IL-13,IFN-gamma y TNF-alfa en 56 pacientes con LES (SLEDAI 0-20) y 49controles sanos mediante Bio-Plex precision pro assay (Bio-rad). En unsubgrupo de 13 pacientes (SLEDAI 0-4) y 5 controles sanos se anali-zó en PBMCs la expresión génica relativa a controles sanos, median-te PCR cuantitativa a tiempo real de IL-1 beta, IL-2, IL-5, IL-6, IL-10,IL-12 (p70), IFN-gamma y TNF-alfa y de los factores de transcripción:T-bet (Th1), GATA3 (Th2), Foxp3 (Treg) y ROR-gamma-t (Th17); asícomo la expresión de los genes que codifican para las proteínas cina-sas implicadas en señalización y supervivencia celular: MAPK1 y AKT1.

Resultados. Los pacientes con LES presentaron niveles plasmáti-cos significativamente elevados de las 10 citoquinas testadas. IL-6, IL-2, IL-5, IL-10, e IL-13 eran las que mostraban un mayor incremento enrelación a los controles sanos. En el subgrupo de 13 pacientes estaaumentada la expresión génica respecto a los controles sanos de IL-2,IL-6, IL-10, IL-12 e IFN-gamma estos aumentos son paralelos a susniveles plasmáticos.

Se observó que la ratio T-bet (Th1)/GATA3 (Th2) esta aumentada entodos los pacientes de LES analizados con respecto a controles sanos, nose observó correlación con el SLEDAI. Se observa una correlación entrelos niveles de expresión de T-bet con ROR-gamma-t (Th17) (Spearmanr=0.8956, p< 0,0001); así como entre la expresión de IL-6 y ROR-gamma-t (r=0.6264, p<0,0220). 3) 7 de los 13 pacientes de LES que presentanaumentos en la expresión de T-bet, presentan igualmente aumentos enla expresión de Foxp3 (Treg), ROR-gamma-t(Th17), MAPK1 y AKT1.

Conclusiones. Los pacientes con LES presentan niveles plasmáti-cos aumentados de citoquinas proinflamatorias (IL-6), Th0 (IL-2) y Th2(IL-5, IL-10 e IL-13), confirmándose dicha desregulación a nivel deexpresión de los genes que codifican para algunas de estas citoquinas.Esta situación proinflamatoria se confirma con el aumento del balan-ce T-bet (Th1)/GATA3 (Th2) y de la expresión ROR-gamma-t (Th17).

P-019ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE PROTEÍNASEN EL SUERO DE RATONES C57BL/6 SILVESTRES RESPECTO ARATONES C57BL/6 DEFICIENTES PARA CD38 EN UN MODELODE ARTRITIS REUMATOIDE. A. Rosal-Vela1, J. Postigo2, S. García-Rodríguez1, E. Zumaquero1, M.V. Longobardo1, A. Lario1, P. Nava-rro1, R. Merino3, J. Merino2, M. Zubiaur1, J. Sancho1. 1Instituto de Para-sitología y Biomedicina "López-Neyra", CSIC, Armilla, Spain. 2Facultad deMedicina, Universidad de Cantabria, Santander. 3Instituto de Biomedicina yBiotecnología de Cantanbria, CSIC.

El suero es una herramienta de diagnóstico muy válida y fuentede información acerca del estado fisiológico del individuo. El estu-dio de la expresión diferencial de proteínas séricas puede ser útil en labúsqueda de biomarcadores específicos de enfermedad. La técnica deProteominer® permite reducir el rango dinámico del proteoma séricodisminuyendo la concentración de las proteínas mayoritarias y aumen-tando la de las menos abundantes, consiguiéndose una mayor diver-sidad de especies proteicas.

Objetivo. Análisis proteómico del suero mediante expresión dife-rencial 2-D-DIGE para el diagnóstico molecular de la artritis por inmu-

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nización con colágeno de tipo II, modelo animal de artritis reumatoi-de, empleando ratones silvestres (wt) y ratones deficientes en CD38(CD38ko). Los ratones CD38ko presentan diversas deficiencias en larespuesta inmunológica antígeno-específica, de ahí su interés en estu-dio de la artritis reumatoide como patología autoinmune.

Materiales y métodos. Utilización del kit Proteominer ProteinEnrichment (BioRad) de pequeña capacidad con el suero de los rato-nes wt o CD38ko afectados por la enfermedad; precipitación de la mues-tra mediante 2-D Cleanup Kit (BioRad) y resuspensión en buffer com-patible con marcaje DIGE. El diseño experimental de DIGE compren-de el marcaje alternativo de las muestras wt y CD38ko con el Cy3 yCy5; un pool de todas las muestras se marca con Cy2 como estándarinterno. Se mantuvo la proporción de 50Ìg proteína/400pmol CyDyerecomendada. Sistema Protein IEF Cell (BioRad) para la 1ª dimensióny sistema Criterion (BioRad) para la 2ª. La digitalización de los gelesse realizó mediante Typhoon Imager 9400 (GE Healhcare) y el análisisde las imágenes mediante el software DeCyder 6.0 (GE Healhcare).Identificación de proteínas por espectrometría de masas (MS-MALDI-TOF). Validación por Western-blot.

Resultados. Tras el análisis de los geles 2-D, se detectaron aproxi-madamente unas 300 manchas proteicas presentando 30 de ellas dife-rencias de expresión notables entre wt y CD38ko. De estas últimas, el30% presentan una variación en la expresión ≤ -1,5 veces y el 70% de≥1,5 veces.

Conclusiones. La utilización del Proteominer® en combinacióncon el análisis diferencial de proteínas (sistema DIGE), la identifica-ción de las proteínas por MS-MALDI-TOF y la posterior validación portécnicas alternativas nos ha permitido detectar proteínas relativamen-te poco abundantes cuya expresión varía significativamente en rato-nes deficientes en CD38 respecto a ratones silvestres en el contexto dela artritis reumatoide experimental. Estudios posteriores irán dirigi-dos hacia tejidos linfoides como ganglios o bazo.

P-020EL DESCENSO DE LA SUBPOBLACIÓN DE LINFOCITOS BCD27IGMIGD EN PACIENTES CON LUPUS ERITEMATOSO SIS-TÉMICO SE ASOCIA A LA PRODUCCIÓN DE AUTO-ANTICUER-POS. B. Rodríguez-Bayona1, A. Ramos-Amaya1, J.J. Pérez Venegas2,C. Rodríguez1, J.A. Brieva1. 1Hospital Universitario Puerta del Mar, Cádiz.2Hospital de Jerez, Cádiz.

Objetivos. El lupus eritematoso sistémico (LES) es una enferme-dad autoinmune caracterizada por la hiperreactividad de las células By la producción de gran variedad de auto-anticuerpos (Ac). Estudiosprevios realizados en nuestro laboratorio han puesto de manifiesto,entre otras alteraciones, una reducción significativa de la subpoblaciónde linfocitos B CD27IgM IgD en la sangre de pacientes con LES, alte-ración que es más acusada en pacientes en fase de actividad clínica,pero que incluso se observa en la mayoría de los pacientes en fase deremisión clínica. El objetivo del presente estudio consistió en valorarla relación existente entre las alteraciones en la distribución de las sub-poblaciones B circulantes observadas y el estado de autoinmunidadsistémica, reflejado por la presencia de auto-Ac séricos.

Materiales y métodos. El estudio de subpoblaciones B se realizóen un grupo de 69 pacientes con LES reclutados consecutivamente yen 31 controles sanos. El marcaje combinado con CD19, CD27 e IgDpor citometría de flujo permite diferenciar 5 subpoblaciones linfoi-des B: linfocitos B naïve (CD19+CD27-IgD+), linfocitos B CD27 IgM

IgD (CD19+CD27+IgD+), de memoria switched (SW) (CD19+CD27+IgD-), de memoria doble-negativa (DN) (CD19+CD27-IgD-) y célulasplasmáticas (CP) (CD19+CD27++IgD-). En pacientes con LES se deter-minó la presencia de ANA, Ac anti-ENA y anti-ADNdc.

Resultados. En el grupo de pacientes con LES se observó unaumento de las subpoblaciones de linfocitos B de memoria DN yde CP, y una disminución de la subpoblación B CD27 IgM IgD. Ade-más, la disminución de la subpoblación CD27IgMIgD estaba en rela-ción con la detección de elevados niveles de auto-Ac séricos (ANA,anti-DNAdc y anti-ENA) mientras que el aumento de CP y de lin-focitos B de memoria DN se asociaba exclusivamente a la presenciade Ac anti-ADNdc.

Conclusiones. El grado de disminución de la subpoblación de lin-focitos B CD27 IgM IgD está ligado a un estado general de autoin-munidad, asociándose a la producción de gran variedad de auto-Ac,mientras que el aumento de CP y de linfocitos de memoria DN se rela-ciona específicamente con la producción de Ac anti-ADNdc. Estoshallazgos sugieren un posible papel de los linfocitos B CD27 IgM IgDen la patogénesis del LES.

P-021SV.¿UN NUEVO ANTIGENO TUMORAL IMPLICADO EN UNSINDROME PARANEOPLASICO? M.T. Ciudad García, M. Agustí,M.V. Rubiales, C. Gelpí. Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Unidaddocente Universidad Autónoma de Barcelona, Córdoba.

Muchas enfermedades paraneoplásicas del sistema nervioso cen-tral son inmunomediadas. La presencia de autoanticuerpos antineu-ronales en suero y líquido cefalorraquídeo de estos pacientes es laprincipal evidencia que lo confirma. Estos anticuerpos reaccionancon proteínas neuronales que a su vez están expresadas en las célu-las del tumor. Por tanto, su caracterización es la base para un testrápido, útil y diagnóstico, de forma que se pueda asociar una sinto-matología a un tipo de neoplasia que aún no se haya conseguidodetectar físicamente.

El objetivo de este trabajo es el estudio de una nueva especificidadde anticuerpo antineuronal presente en el suero de una paciente consíndrome paraneoplásico asociado a carcinoma de ovario.

Material y métodos. En el análisis de anticuerpos antineurona-les empleamos test comerciales con proteínas recombinantes; inmuno-fluorescencia indirecta sobre cortes de tejidos y sobre células en culti-vo; inmunoblot con extractos de cerebro y cerebelo de rata fetal, de car-cinoma de ovario y de cerebro humano.

Resultados. Mediante inmunofluorescencia indirecta estos anti-cuerpos reconocen un antígeno nuclear en cortes de cerebro y cere-belo de cobaya, en cerebro humano y en las líneas de carcinoma deovario humano, UV-20 y UVH1. No reconocen otras líneas celularesde carcinoma de pulmón, laringe y cérvix. Tampoco se detecta fluores-cencia en tejidos de hígado, riñón, estomago y timo de rata y riñónhumano, ni en neutrófilos humanos de sangre periférica. Medianteinmunoblotting el suero de esta paciente reconoce dos proteínas deaproximadamente 90 y 45 kDa de peso molecular tanto en extractosde cerebro y cerebelo de rata fetal como en extractos de las líneas decarcinoma de ovario mencionadas. No muestra reactividad con extrac-tos de otras líneas celulares.

Conclusiones. Presentamos una nueva especificidad de anticuer-pos antineuronales asociados a un síndrome paraneoplásico, que pue-de ser útil en la investigación y diagnóstico de estas enfermedades.

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Asimismo serán una herramienta útil para el estudio del antígeno aso-ciado al tumor. Estudios de reactividad cruzada de estos anticuerposnos permitirán demostrar su especificidad para antígenos del sistemanervioso central y carcinoma de ovario.

Finalmente demostramos la utilidad de las técnicas descritas parael estudio de posibles nuevos anticuerpos ligados a tumor y síndromeneurológico.

P-022VALOR DIAGNÓSTICO DEL INMUNOFENOTIPO DE LIES PARAEL ESTUDIO DE ENFERMEDAD CELÍACA EN POBLACIONESPEDIÁTRICA Y ADULTA. M. Sáenz Cuesta, L. Arriarán, P. Etxa-niz, A. Prada, M.D. De Juan, E. Cuadrado, A. Muñagorri, A. Gómez, I.Urreta, J. Eizaguirre. Hospital Donostia, Donostia-San Sebastián.

Introducción. Para el diagnóstico de Enfermedad Celíaca (EC)se utilizan diferentes pruebas: anatomía patológica (AP) de biopsiaintestinal según grados de Marsh; anticuerpos anti tTG IgA; genotipode HLA-DQ e inmunofenotipo de LIEs. En los algoritmos actualesno está considerado este último. La documentación sobre su poderdiagnóstico es limitada.

Objetivo. Evaluar cuál es el aporte del inmunofenotipo de LIEsen el diagnóstico de EC en dos poblaciones estudiadas.

Material y método. Población pediátrica: 146 niños: 103 con diag-nóstico de EC; 43 descartada EC.

Población adulta: 203 pacientes: 37 con diagnóstico de EC; 118 des-cartada EC; 48 sin diagnóstico definitivo.

La AP de biopsias se estableció según grados de Marsh; los anti-cuerpos anti tTG IgA se midieron con ELISA; el estudio de inmunofe-notipo de LIEs se realizó mediante citometría de flujo y el análisis deHLA-DQ con técnica de PCR-SSP-DNA.

El estudio estadístico fue confeccionado con “systat package”.Resultados

El valor predictivo negativo de la prueba HLA-DQ2/8 en EC esde 93,3% (IC de 70.2-98.8) para adultos y de 77% (IC de 49,7-91,8) enniños.

Conclusiones• En adultos el inmunofenotipo de LIEs incrementa la Especificidad

en un 7,6% al sumarse a la AP y en un 6,8% junto a tTG.• En niños el estudio de LIEs presenta mayor Sensibilidad que los

resultados de AP.• Las diferencias de Sensibilidad y Especificidad para una misma

prueba entre las dos poblaciones puede deberse al diferente crite-rio clínico utilizado en el diagnóstico.

• Consideramos al estudio de LIEs como prueba adyuvante en laconfirmación de EC.

P-023DEFICIENTE ACTIVACIÓN DE LOS LINFOCITOS T DE SANGREPERIFÉRICA DE PACIENTES CON PÉNFIGO EN RESPUESTA ALA ESTIMULACIÓN CON SUPERANTÍGENOS. E. Zumaquero1, S.Arias-Santiago2, S. García-Rodríguez1, A. García-Pérez1, P. Navarro1,M.A. Fernández-Pugnaire2, M. Zubiaur1, J. Sancho1. 1Instituto de Para-sitología y Biomedicina "López-Neyra", CSIC, Armilla (Granada), Armi-lla, Spain. 2Hospital Clínico Universitario San Cecilio, Granada.

El pénfigo es una enfermedad autoinmune grave considerada rarapor su baja frecuencia. Se caracteriza por la formación de autoanticuer-pos (antidesmogleína 1 y 3) que destruyen los puentes de unión inter-celulares de la piel y mucosas favoreciendo las formación de ampollasintraepidérmicas.

Objetivo del estudio. Hacer un estudio de los parámetros inmu-nológicos de un conjunto de 8 pacientes diagnosticados de pénfigo.

Materiales y métodos. Se procede a la extracción de sangre de lospacientes y controles sanos obteniéndose plasma y células mononu-cleares (PBMCs). Usando un sistema multiparamétrico (BioPlex) sehan cuantificado simultáneamente los niveles de 10 citoquinas en elplasma de los pacientes y controles sanos. El análisis de marcadoresde superficie se lleva a cabo mediante citometría de flujo. Tras estimu-lación de los PBMCs con una mezcla de los superantígenos SEE y SEBse estudia la formación de sinapsis inmunológica mediante microsco-pía confocal, la formación de conjugados y la expresión de marcado-res por citometría de flujo, la secreción de citoquinas por BioPlex.

Resultados. Se observa: Niveles de citoquinas similares en plas-ma de pacientes y de controles, a excepción de un paciente con malarespuesta al tratamiento con final de exitus que presentaba niveles ele-vados de IL-6. Incremento de una subpoblación de células B con fuer-te expresión de CD38, probablemente células plasmáticas responsa-bles de la producción de anticuerpos. Menor porcentaje de la subpo-blación CD56bright en células NK con propiedades inmunorregula-doras. Aparición de una población de granulocitos de baja densidaden PBMCs. Disminución en la formación de conjugados T:B, menorincremento en la expresión de CD38 en células T y menor produc-ción de citoquinas en respuesta a superantígenos.

Discusión y conclusiones. La deficiente activación de los linfo-citos T de pacientes con pénfigo inducida por superantígenos, que seconstata por una deficiente formación de conjugados linfocito T:linfo-cito B y/o una disminución en la formación de sinapsis inmunológi-cas maduras, podría estar relacionada con una menor capacidad depresentación antigénica por parte de los linfocitos B de sangre perifé-rica de estos pacientes. Para demostrarlo definitivamente sería nece-sario realizar experimentos con péptidos específicos para desmoglei-na 1 o 3.

P-024ESTUDIO COMPARATIVO DE GLIADINA Y GLIADINA DEAMI-DADA EN PACIENTES CON ENFERMEDAD CELIACA. S. ToroLlamas. Hh.Uu. Virgen Del Rocio, Estepa.

Introducción. La enfermedad celíaca (EC) es una patología autoin-mune que se manifiesta tras la ingesta de gluten en individuos gené-ticamente predispuestos. Se caracteriza por inflamación del intestinodelgado, atrofia vellositaria, malabsorción y otras complicaciones deri-vadas. El diagnóstico definitivo se basa en la biopsia duodeno-yeyu-nal, aunque actualmente disponemos de marcadores serológicos que

Tabla 1.

Variable Punto de corte S (IC 95%) E (IC 95%)

AdultosLIEs TCRγδ>10 y 103ζ3{<5 75,7 (59,9-86,6) 92,4 (86,1-95,9)AP 60,0 (46,6-74,4) 96,4 (91,2-98,6)Ac anti tTG 12 64,9 (48,8-78,2) 96,4 (91,2-98,6)LIEs + AP 45,7 (30.5-61,8) 100 (96,8-100)LIEs + tTG 54,1 (38,4-69,0) 99,2 (95,4-99,9)NiñosLIEs TCRγδ>10 y 103ζ3{<5 82,5 (74,1-88,7) 100 (91,6-100)AP 76,8 (67,5-84,0) 95,2 (84,2-98,7)Ac anti tTG 12 93,1 (86,4-96,6) 97,6 (87,7-99,6)LIEs + AP 66,0 (56,3-74,5) 100 (91,8-100)LIEs + tTG 80,2 (71,4-86,8) 100 (91,8-100)

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apoyan su diagnóstico. Entre ellos, los anticuerpos frente a Gliadina(AGA), Transglutaminasa (tTG) y Endomisio (EMA) que presentanaltos valores de sensibilidad y especificidad. Recientemente se ha incor-porado una variante deamidada de la gliadina.

Objetivo. Comparar si la determinación de anticuerpos frente aGliadina vs Gliadina deamidada mejora la sensibilidad y especifici-dad en pacientes diagnosticados de EC.

Pacientes y métodos. Se incluyeron un total de 42 sujetos con sos-pecha de EC, de los cuales tras la biopsia se confirmó el diagnóstico en37 pacientes, de los cuales 32 eran pediátricos (un caso diagnosticadocon déficit selectivo de IgA) y 5 adultos. La determinación de anticuer-pos se llevó a cabo mediante la técnica ELISA usando UNICAP- 250de Phadia.

Resultados. Al comparar los resultados de ambos parámetros enel grupo completo observamos que el 36.1% (13/36) fueron positivospara gliadina y el mismo porcentaje se obtuvo para la gliadina deami-dada 36,1% (13/36). Cuando seleccionamos los pacientes con EC y anti-cuerpos frente a tTG positivos los resultados fueron de un 27.8 % (10/36)y de un 47,2% (17/36) para la gliadina y gliadina deamidada respecti-vamente. Cuando estudiamos el grupo pediatrico, observamos que lossujetos afectados por EC y positivos para tTG y gliadina fue de 22,6%(7/31) frente al 42% (13/31) de los pacientes de EC positivos para tTGy gliadina deamidada.

Conclusión. Nuestros resultados sugieren que la tTG junto a lagliadina deamidada proporcionan mayor especificidad y sensibilidaden el estudio serológico de la EC que la tTG y Gliadina.

P-025DETECCIÓN DE AUTOANTICUERPOS ASOCIADOS A NEURO-PATÍAS PARANEOPLÁSICAS. R. Alenda Asensi, J.M. Vazquez Mira-lles, F.G. Silva Carreras, Á. Carrasco Sayalero. Hospital UniversitarioRamón Y Cajal, Madrid.

Objetivo. Destacar la importancia de los anticuerpos onconeuro-nales, en la búsqueda de una neoplasia, presentes en un paciente consíndrome neurológico: síndrome paraneoplásico (PNS).

Material y métodos. Varón de 81 años, procedente del servicio deNeurología de nuestro Hospital con diagnóstico de “Leve Polineuro-patía Sensitiva Mixta en MMII”, para el cual nos pidieron estudio deanticuerpos onconeuronales en muestra de suero.

Realizamos el estudio de estos anticuerpos por dos técnicas, debende dar positivas ambas para informar la presencia de anticuerpos:• Inmuno-fluorescencia indirecta (IFI) con anticuerpos de la clase

IgG (Euroimmun) con diluciones en suero a 1/10 y 1/100.• Inmuno-Blot (Enzimo-inmunoensayo) (Euroimmun)

Resultados. En el estudio por IFI se observó un patrón compati-ble con anticuerpo anti-Hu.

En el estudio por inmuno-blot se observó una banda clara a la altu-ra del antígeno Hu.

Con el informe por el Servicio de Neurología de: “polineuropa-tía mixta sensitiva” y la detección de los anticuerpos anti-Hu se reali-zaron estudios complementarios que dieron con el hallazgo en el estu-dio por TAC de un aumento en la masa parahiliar izquierda de 4’5 cm,la cual se confirmó por biopsia como carcinoma epidermoide con zonasbasaliodes.

Conclusión. Los anticuerpos anti-Hu son de gran utilidad duran-te el estudio de un síndrome neurológico para orientar al clínico haciala búsqueda de una posible neoplasia.

SESIÓN 2: CÉLULAS B Y ALERGIA

Moderadores: Jose Antonio Brieva Romero (Cádiz)Julia Sequí Navarro (Madrid)

P-026CLINICAL SIGNIFICANCE OF CROSS-REACTIVITY BETWE-EN TOBACCO AND LATEX. A. San Miguel, F.J. Martin Gil, A.Armentia Medina, B. Bartolome. Hospital Universiatario Rio Horte-ga, Valladolid.

Background. Recently, allergen cross-reactivity was observedbetween tobacco and other species of Solanaceae family (tomato, potato,aubergine and egg plant). We have recently studied IgE response totobacco in asthmatic patients sensitised to Lolium perenne (rye grasspollen) and have found that 30 % of tobacco responsive patients hadalso latex sensitisation.

Objective. The aim of our study was to investigate the possibilityof cross-reactivity among tobacco and latex in asthmatic patients withIgE response to latex.

Methods. We performed a study on tobacco and latex exposure in15 patients suffered from asthma and latex sensitisation that wererandomly chosen from our data base of sensitive-latex patients. Allthese patients were tested in order to try to identify tobacco and latexas possible allergens that might cause clinical specific response (prick-tests, specific IgE to tobacco, latex and related allergens, bronchialchallenge (BC), patch tests with tobacco, latex and nicotine, rubbingtests) and immunological response: immunoblotting, immunoblotting-inhibition and EAST-inhibition.

Results. Positive prick and BC with specific IgE > 0,35 kU/L totobacco was demonstrated in 11 asthmatics that were also sensitisedto rye grass. Tobacco IgE level was related with sensitisation to latex(p<0.002), but not with other vegetables that belong to the Solanaceaefamily. EAST-inhibition and immunoblotting-inhibition showed theexistence of cross-reactivity between tobacco and latex.

Conclusions. There exists cross-reactivity between latex and tobaccoallergens. Smoking patients with IgE response to tobacco may be a riskpopulation for latex sensitisation.

P-027ALERGIA ALIMENTARIA A SEMILLAS Y SINDROME ANTI-FOSFOLIPIDICO (SAP). A. San Miguel Hernandez1, A. ArmentiaMedina1, M.A. Mazon Ramos1, F. Pineda2, J. Crespo1, J. García Frade1, B. Martin Armentia1, M. Herrrero1. 1Hospital UniversitarioRio Hortega. Valladolid, Valladolid, Spain. 2Laboratorios Diater. Madrid.

Es conocido que las reacciones alérgicas severas por alimentosinvolucran los sistemas gastrointestinal, cutáneo, ocular, respirato-rio y cardiovascular.

Las reacciones anafilácticas a alimentos casi siempre se produ-cen de un modo inmediato al estímulo y pueden ser diagnostica-das por pruebas cutáneas, determinaciones de IgE específica y pro-vocación oral si es necesario, pero las complicaciones clínicas deeste síndrome están aún por establecer.

Hemos detectadocasos de anafilaxia alimentaria seguidos detrombosis severa en menos de tres meses. En todos los casos, la ana-

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filaxia fue producida por ingestión de alérgenos vegetales (semillasy frutas).

Material y métodos. Se han seleccionado aleatoriamente 52 pacien-tes afectados por anafilaxia producida por semillas o frutos. Tambiénse han seleccionado aleatoriamente 30 pacientes, que presentan crite-rios de SAP, procedentes del Servicio de Medicina Interna y de la basede datos del Servicio de Hematología. Todos los pacientes han sidoestudiados en la misma forma: una detallada historia clínica de aler-gia, pruebas cutaneas con una completa batería de 36 alergenos, inclu-yendo “Prick” con el alergeno vegetal sospechoso, IgE específica medi-da por el método CAP y provocación bronquial en caso de asma. Losestudios controlados a doble ciego con placebo de provocación oral sehan realizado sólo en caso necesario. Se han incluido 10 controles noatópicos a los que se les ha realizado las mismas pruebas. El consen-timiento informado fue obtenido en todos los pacientes.

Los sueros utilizados en este estudio han sido los de 52 pacientescon anafilaxia, 30 pacientes que sufrían de SAP, un grupo de 10 pacien-tes no alérgicos y 4 controles con SAP y lupus eritematoso sistémico(LES) con trombosis. Ninguno de los pacientes control registraron sín-tomas de alergia.

La sensibilización a las semillas o frutos fue considerada como lapresencia de: a) una o más pruebas cutáneas positivas. b) un test CAP-FEIA Phadia positivo > 0,35 UI/ml o c) una provocación específicapositiva. Todos los pacientes fueron informados de los objetivos delestudio y ensayos del estudio a fin de tratar de identificar la sensibi-lización a un alergeno vegetal como factor de riesgo de SAP.

También se ha llevado a cabo la medición de anticuerpos anti-cardiolipina IgG e IgE específica para los alimentos vegetales median-te ELISA y CAP-FEIA (Phadia), respectivamente. Además, hemos rea-lizado estudios de inhibición de inmunotransferencia para los aler-genos vegetales sospechosos, utilizando la avellana como alergenocomún.

Resultados. Entre los pacientes afectados de anafilaxia, 15 (28,84%)presentaron niveles positivos (moderados y ligeramente altos) de anti-cuerpos anticardiolipina y síntomas secundarios. De estos pacientes,11 tuvieron trombosis: 2 de ellos presentaron trombosis de ambas venas;4 de una vena iliaca, 1 de ambas venas iliacas y cava inferior; 1 diarreacon sangrado y daño abdominal; y 3 pérdida fetal.

Entre los pacientes diagnosticados previamente como SAP, algu-nos presentaron hipersensibilidad a semillas y a frutas, ambas confir-madas por el estudio alergológico anteriormente descrito.

Los sueros de los pacientes mostraron unión IgE a varias proteí-nas incluidas en las fracciones hidro e liposoluble (contenidas en lafracción oleosa de las lipoproteínas de membrana) de las oleosinas (dePM entre 16.7 y 14.7 KDa).

De los 9 pacientes con Prick negativo, 4 mostraron IgE positiva yrespuesta a las fracciones liposolubles de la avellana. Todos los pacien-tes eran jóvenes (20 ± 6 años) y mujeres.

Las lipoproteínas de membrana (contenidas en la fracción oleosa)podrían aparecer como un grupo de proteínas con capacidad de sen-sibilización, no demostrada hasta la fecha.

Conclusiones. En resumen, a pesar de la fuerte asociación entreanticuerpos anticardiolipina y trombosis, el papel patogénico de latrombosis en el desarrollo de la misma permanece por elucidar. Sinembargo, hemos descrito un nuevo mecanismo que involucra la hiper-sensibilidad a alérgenos lipoproteínicos. El conocimiento de estosnuevos enfoques patogénicos podría identificar nuevas dianas tera-peúticas y, por consiguiente, mejorar la monitorización de estospacientes.

P-028TLR4-INDEPENDENT UPREGULATION OF ACTIVATION MAR-KERS IN MOUSE B LYMPHOCYTES INFECTED BY HRSV. D.López, M.Á. Rico, S. Infantes, M. Ramos, A. Trento, C. Jonhstone, J.A.Melero, M. Del Val. Centro Nacional de Microbiología. Instituto de SaludCarlos III, Majadahonda.

Human respiratory syncytial virus (HRSV) is the most commoncause of severe respiratory infections in infants and young children,often leading to hospitalization. In addition, HRSV poses a serioushealth risk in immunocompromised individuals and the elderly. It hasbeen reported that this virus can infect mouse antigen-presenting cells,including B lymphocytes. In these B cells, HRSV infection upregulatesthe expression of activation markers, including MHC class II and CD86,but not MHC class I molecules. Here, we report that HRSV infectionof spleen B lymphocytes downregulated TLR4. Either blocking withanti-TLR4 antibody or genetic deletion, but not functional deficiencyof TLR4, moderately reduced the infectivity of HRSV in B lymphocytes.HRSV-infected B lymphocytes with deleted TLR4 upregulated MHCclass II and CD86 molecules to the same levels as TLR4+ wild type Bcells. Since the activation of monocytes and macrophages by HRSVwas previously reported to depend on TLR4, the current study indicatesthat these cells and B lymphocytes respond to HRSV infection withdifferent activation pathways.

P-029ALTERACIONES EN EL COMPARTIMENTO DE CÉLULAS B ENPACIENTES CON LLC-B ASOCIADAS A LA EXPRESIÓN DE ZAP-70. M.Á. Sánchez Luengo1, Z. Moreno Villegas1, G. Parada Hermoza1,L. Ortega Moreno1, D. Díaz Martín1, H. Barcenilla Rodríguez1, J. Mose-rrat Sanz1, A. Prieto Martín1, E. Reyes Martín1, M. Álvarez De Mons-Soto2. 1Universidad de Alcalá de Henares, Alcalá de Henares. 2Hospital Uni-versitario Príncipe de Asturias.

Introducción. Las células B de los pacientes con LLC-B son muysimilares morfológicamente a las células B maduras de de individuossanos a excepción de los casos de LLC-B atípica o mixta. Sin embar-go presentan características fenotípicas propias que sirven para su diag-nóstico algunas de estas características fenotípicas pueden relacionar-se con el estado pronóstico, supervivencia y/o posible respuesta a tra-tamiento.

Objetivos. Estudiar el fenotipo de células B en pacientes con LLC-B según el factor pronóstico ZAP-70.

Materiales y métodos. Se realizó estudio inmunofenotípico porcitometría de flujo de 4 colores, para lo cual se obtuvieron PBMCs desangre periférica de 34 pacientes con LLC-B que se categorizaron enZAP-70+ (n=16) y ZAP-70– (n=18), y de 18 controles sanos. Para el estu-dio de las distribución y activación de las células B se utilizaron anti-cuerpos frente a los antígenos de superficie CD3, CD5, CD19, CD21,CD23, CD38, CD40, CD80, CD86, HLA-DR.

Resultados. Se observó un fuerte incremento significativo en elnúmero absoluto de células B en los pacientes con LLC-B ZAP-70+ res-pecto a los pacientes ZAP-70– y los controles sanos (18.261,61 vs11.613,38 y 163,20 respectivamente) así como de su porcentaje (83,11vs 69,39 y 9,79). El estudio de la expresión de los diferentes marcado-res de células B reflejó notables diferencias entre los dos grupos depacientes con LLC-B según la expresión de ZAP-70 mostrando lospacientes ZAP-70+ un incremento significativo respecto a los pacien-

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tes ZAP-70– tanto del número absoluto como del porcentaje de célu-las B CD38+, CD5+ y CD40+, y porcentajes más bajos de células BCD21+. Por otra parte los pacientes ZAP-70+ presentaron un descen-so significativo del porcentaje de células B que expresan las moléculasde coestimulación CD80+ y CD86+.

Conclusiones. La expresión de ZAP-70 se asocia con una linfo-citosis de células B CD5+, CD38+ y CD40+ y una disminución delporcentaje de células B que expresan CD80+ y CD86+. Lo cual pue-de estar relacionado con la mayor agresividad del tumor en estospacientes y su peor respuesta a tratamientos y por tanto a su peorpronóstico.

P-030PAPEL DE LAS DISTINTAS SUBPOBLACIONES LINFOCITA-RIAS B EN LA SÍNTESIS INTRATECAL DE INMUNOGLOBULI-NAS EN LA ESCLEROSIS MÚLTIPLE. M. Espiño Martínez, J.C.Álvarez Cermeño, M.C. Sádaba Argaiz, N. Marín Crespo, E. RoldánSantiago, P. González Porqué, L.M. Villar Guimerans. Hospital Ramóny Cajal, Madrid.

Objetivo. Estudio de las subpoblaciones de linfocitos B CD5- yCD5+ en el líquido cefalorraquídeo (LCR) de los pacientes con escle-rosis múltiple remitente-recidivante (EM-RR) y su relación con la sín-tesis intratecal de IgM e IgG.

Materiales y métodos. Pacientes: se estudiaron 51 pacientescon EM-RR que presentaban bandas oligoclonales de IgM frente alos lípidos de la mielina (ML+), 141 pacientes con EM-RR que nopresentaban dichas bandas (ML-), 26 pacientes con otras enferme-dades neurológicas inflamatorias del SNC (OENI) y 43 pacientescon otras enfermedades neurológicas no inflamatorias del SNC(OENN).

Métodos. La detección de bandas oligoclonales de IgM se reali-zó mediante isoelectroenfoque e inmunoblotting. La cuantificación dela IgG, IgM y albúmina se llevó a cabo mediante nefelometría. La exis-tencia de síntesis intratecal de IgG e IgM se determinó a través de losíndices de IgG e IgM. Los valores del índice de IgG mayores de 0,77indican síntesis intratecal de IgG. Los valores del índice de IgM porencima de 0,1 indican síntesis intratecal de IgM. Las células de sangreperiférica y LCR se marcaron con los anticuerpos monoclonales: antiCD19-FITC, anti CD5-PE y anti CD45-PercP. El análisis de las pobla-ciones celulares se realizó en un citómetro de flujo FACSCanto (Bec-ton Dickinson). Los resultados se analizaron con el test de Mann-Whit-ney y el test exacto de Fisher.

Resultados. El porcentaje de linfocitos CD5+ está claramenteaumentado en los pacientes con síntesis intratecal de IgM (1,44±0,22%vs 0,82±0,11, p<0,0001). Además, los valores del índice de IgM se corre-lacionan estrechamente con los porcentajes de las células B CD5+ enLCR (p<0,0001). Esto demuestra que esta subpoblación está implica-da en la síntesis intratecal de IgM en la EM. Sin embargo, no hay dife-rencias en esta subpoblación entre los pacientes con y sin síntesis intra-tecal de IgG (0,94±0,14% y 0,91±0,11%, NS). Los valores del índice deIgG se correlacionan con los porcentajes de la población de linfocitosB CD5- en el LCR. Esta población parece ser responsable de la síntesisintratecal de IgG.

Conclusiones. La subpoblación de linfocitos B CD5+ es la prin-cipal responsable de la síntesis intratecal de IgM en los pacientes ML+mientras que la subpoblación B CD5- esta implicada en la síntesis intra-tecal de IgG en la EM.

P-031EXPRESIÓN DE LA CADENA ALFA DE LA IL15 Y SU RELACIÓNCON MARCADORES GENÉTICOS DE LA ENFERMEDAD CELIA-CA. V. Benito Zamorano1, J.A. Garrote Adrados2, B. Martínez Abad1,S. Vallejo Diez1, E. Montalvillo Álvarez1, J.M. Marugán De Miguel-sanz2, L. Fernández Salazar2, E. Arranz Sanz1. 1Facultad De Medicina-I.B.G.M. Universidad De Valladolid, Valladolid. 2Hospital Clínico Universi-tario De Valladolid.

Estudios previos de nuestro laboratorio indican que los pacientescon enfermedad celiaca (EC) tienen una mayor expresión de IL15Rαen muestras de biopsia duodenal.

Objetivo. Caracterizar la expresión de IL-15Rα en células mono-nucleares de sangre periférica (CMSP), tanto de individuos con gené-tica positiva de enfermedad celiaca (HLA-DQ2+) como individuossanos control. A su vez, dentro de cada grupo se diferencian poblaciónadulta e infantil. Identificar las sub-poblaciones celulares que lo expre-san y cuantificar si existen diferencias cuantitativas en su expresión.

Material y métodos. Se utilizaron muestras de sangre periféricade individuos control sanos sin alteraciones relacionadas con la enfer-medad celiaca (14 adultos, edad media 50 años, rango 20-73; 23 niños,edad media 6,2 años, rango 2-14) y de pacientes con sospecha clínicade enfermedad celiaca y genética positiva para HLA-DQ2 (4 adultos,edad media 41 años; 13 niños, edad media 4,2 años, rango 1-12 años).

Las células fueron extraídas de las muestras de sangre por gradien-te de densidad. Se identificaron mediante anticuerpos monoclonalesdiferentes sub-poblaciones celulares (linfocitos T CD4+, linfocitos TCD8+, Linfocitos B, células NKs, iNKTs) y se detectaron por citometríade flujo los niveles de expresión de IL15Rα en dichas poblaciones.

Resultados. En los adultos, se observa una disminución estadís-ticamente significativa en la población de linfocitos T CD4 + (p= 0,01)y en la expresión de IL-15Rα en linfocitos T CD8+ (p=0,03).

En la población infantil se observan diferencias estadísticamentesignificativas en las poblaciones de linfocitos T CD8+ (p=0,01); linfo-citos iNKT (p=0,03) y en linfocitos B (p= 0,04); sin embargo, no se obser-van cambios estadísticamente significativos en la expresión de IL-15Rαentre las diferentes poblaciones.

Conclusión. Se estudian por separado población infantil y pobla-ción adulta, ya que previamente se ha observado que los niveles deexpresión de las diferentes células y moléculas difieren.

El aumento de la expresión de IL15Rα no se refleja en los linfoci-tos de la sangre periférica, al contrario que en biopsias intestinales.Esto podría indicar que el aumento observado en biopsias intestinalesen pacientes con enfermedad celiaca no es constitutivo, sino inducidoen la mucosa intestinal.

P-032PAPEL DE N-RAS EN LA DIFERENCIACIÓN FUNCIONAL DELINFOCITOS T CD8+ MADUROS EFECTORES Y DE MEMORIA.S. Iborra1, M. Ramos1, S. Lázaro1, F. Aguilar1, E. Santos2, D. López1, E.Fernández-Malavé3, M. Del Val4. 1Centro Nacional de Microbiología, Ins-tituto de Salud Carlos III, Majadahonda, Madrid. 2Centro de Investigacióndel Cáncer, IBMCC, CSIC-USAL, Universidad de Salamanca. 3UniversidadComplutense de Madrid. 4Centro Nacional de Microbiología, Instituto deSalud Carlos III y Universidad Complutense de Madrid.

Objetivos. Determinar la relevancia individual de la isoforma N-ras en la función de linfocitos T CD8+ maduros.

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Material y métodos. a) Estudio de la activación de linfocitos TCD8+ normales y deficientes en N-ras in vitro e in vivo. b) Caracteri-zación de la respuesta de memoria de linfocitos T CD8+ tras inmuni-zación con células dendríticas y péptido, así como tras infección conel virus vaccinia. c) Estudio de la expresión de factores de transcrip-ción y vías de señalización implicados en la diferenciación funcionalde linfocitos T CD8+ de memoria o efectores.

Resultados y conclusiones. N-ras no es necesario para la activa-ción de un linfocito T CD8+, ni para la adquisición de un fenotipo efec-tor durante una respuesta primaria. Por el contrario, la señalización através de N-ras es esencial para la supervivencia de linfocitos T CD8+durante la fase de contracción de la respuesta así como para la diferen-ciación funcional a memoria. Este fenotipo en linfocitos T CD8+ defi-cientes en N-ras correlaciona con la expresión defectiva del factor detranscripción eomesodermina, característico de células de memoria.

SESIÓN 3: CÉLULAS NK

Moderadores: Raquel Tarazona (Cáceres)Rafael Solana (Córdoba)

P-033NORMAL 0 21 MICROSOFTINTERNETEXPLORER4. J.G. Casado1,E. Delgado2, M.C. Guarnizo2, R.G. Roncero1, S. Morgado1, B. Sánchez-Correa1, J.J. Gordillo1, J. De Julián2, R. Tarazona1. 1Universidad de Extre-madura/Facultad de Veterinaria, Cáceres. 2Norba, Ginecología y Reproduc-ción S.L., Cáceres.

Introducción. Los prostasomas son pequeñas vesículas secretadaspor la glándula prostática que se fusionan al espermatozoide transfie-rendo iones, lípidos y proteínas de superficie que mejoran su movili-dad, licuefacción y capacitación. En el tracto genital femenino, el des-censo de pH incrementa la fusión de prostasomas con espermatozoi-des permitiendo así la adquisición de nuevas proteínas que protegenal espermatozoide de las defensas inmunitarias. Por otro lado, el apa-rato reproductor femenino se considera un ambiente potencialmentehostil para los espermatozoides con diferentes subpoblaciones de célu-las NK en el tracto genital superior e inferior.

Objetivos. Puesto que se ha sugerido que las células NK represen-tan un importante componente de la repuesta inmune innata en el trac-to reproductor, en este trabajo se ha analizado el papel de los prosta-somas en la regulación de la actividad NK.

Material y métodos. Los prostasomas en pacientes normozoos-pérmicos (definidos según los criterios de la OMS) se aislaron por ultra-centrigugación y cromatografía y se analizaron fenotípicamente porcitometría de flujo después de su acoplamiento con microsferas de car-boxilato. El fenotipo y la funcionalidad de las células NK se determi-nó mediante citometría de flujo (expresión de CD244, IFN-gammaintracelular y CD107a/b en membrana) tras el cocultivo de células NKcon diferentes concentraciones de prostasomas.

Resultados. El análisis por citometría demostró que los prosta-somas expresan altos niveles de CD48 y ausencia de ligandos parareceptores activadores NKG2D y DNAM-1. La interacción de célulasNK con prostasomas provocó un descenso de la expresión de CD244así como un descenso de la actividad NK en términos de producciónde IFN-gamma y capacidad de desgranulación.

Conclusiones. Los resultados obtenidos in vitro demuestran el papelde los prostasomas en la inmunomodulación de la actividad NK. El des-censo de la actividad NK observado en células NK cocultivadas en pre-sencia de prostasomas sugiere que estas vesículas podrían inmunomodu-lar el microambiente del tracto genital femenino. La interacción NK-pros-tasomas podría ser considerado un nuevo mecanismo para prolongar lasupervivencia del espermatozoide e incrementar el éxito reproductivo.

P-034ALTERACIONES EN LA EXPRESIÓN DE DNAM-1 EN LAS CÉLU-LAS NK DE PACIENTES DE LEUCEMIA MIELOIDE AGUDA. B.Sánchez Correa1, I. Gayoso2, J. Bergua3, J. García Casado1, S. Morga-do1, R. Solana2, R. Tarazona1. 1Facultad De Veterinaria, Caceres. 2Imibic-Universidad De Cordoba-Hospital Reina Sofia, Cordoba, 3Hospital San PedroDe Alcantara, Caceres.

Objetivos. Estudios realizados en pacientes diagnosticados deLeucemia Mieloide Aguda (LMA) sugieren que las células NK jueganun papel esencial en la defensa del organismo frente a neoplasias deorigen hematológico. Sin embargo, la rápida progresión de la enfer-medad y la elevada incidencia de recaídas tras el tratamiento sugiereque los blastos de leucemia escapan del reconocimiento por las célu-las del sistema inmune. Se han descrito anormalidades en la expresiónde algunos receptores activadores de la citotoxicidad y/o de sus ligan-dos en el momento del diagnóstico que podrían estar relacionadas conesta respuesta deficiente de las células NK y por tanto con la resis-tencia de las células leucémicas a la lisis. En el presente trabajo pro-cedemos a analizar en profundidad las alteraciones en la expresión delreceptor activador DNAM-1 en las células NK de pacientes de LMA,así como el mecanismo implicado en dicho fenómeno.

Material y métodos. Las muestras analizadas se obtuvieron de san-gre periférica de 40 pacientes diagnosticados de LMA en el Hospital SanPedro de Alcántara y de 47 individuos control. El estudio se realizó deacuerdo con la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el ComitéÉtico de la UEX y del Hospital. Una vez aisladas, las células de sangreperiférica fueron analizadas por citometría de flujo empleando para ellolos anticuerpos de interés. En los ensayos en los que se realizaron cocul-tivos se emplearon PBMCs de individuos control y células leucémicas(ratio 1:5). Tras 48 horas de incubación se analizó la expresión en super-ficie del receptor DNAM-1 en las células NK. El análisis estadístico delos resultados se realizó empleando el programa SPSS15.

Resultados.• Los pacientes de LMA menores de 65 años presentan un descen-

so significativo en la expresión de DNAM-1 en la superficie de lascélulas NK al compararlos con los individuos control del mismorango de edad.

• El análisis de los ligandos de DNAM-1 en la superficie de los blas-tos leucémicos muestra que la mayoría de los pacientes de LMAexpresan al menos un ligando para dicho receptor activador. Dichaexpresión no presenta correlación con la edad ni con el subtipoFAB.

• Existe una correlación inversa entre la expresión de DNAM-1 y suligando CD112 en las células NK de los pacientes de leucemiamenores de 65 años.

• Los resultados obtenidos tras realizar los cocultivos entre PBMCsde individuos sanos y células leucémicas con diferentes fenotipossugieren que el descenso en la expresión de DNAM-1 observadoen las células NK de los pacientes de LMA es consecuencia del con-

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tacto directo entre DNAM-1 y los ligandos de dicho receptor expre-sados en la superficie de los blastos leucémicosConclusiones. Las células leucémicas son capaces alterar la expre-

sión en superficie del receptor activador DNAM-1. Esta alteraciónpodría considerarse un mecanismo de escape tumoral, que podríaemplearse como nuevo marcador pronóstico de la supervivencia enpacientes con LMA.

P-035INCREMENTO DE CÉLULAS INKT V∞24+ EN EL EPITELIO DUO-DENAL DE PACIENTES CELIACOS. POSIBLE PAPEL EN LA PATO-GENIA DE LA ENFERMEDAD CELIACA. E. Montalvillo Álvarez1,J.A. Garrote Adrados2, B. Martínez Abad1, S. Vallejo Diez1, V. BenitoZamorano1, C. Calvo Romero2, L. Fernández Salazar2, E. Arranz Sanz1.1Facultad De Medicina/IBGM, Universidad De Valladolid, Laguna De Due-ro. 2Hospital Clínico Universitario de Valladolid.

Objetivo. Establecer las diferencias en la población intraepitelialde células iNKT en el duodeno de pacientes celiacos en actividad conrespecto a los pacientes no celiacos, tanto con afectación de la mucosaduodenal por otras patologías como con duodeno no afectado.

Pacientes y método. Se utilizaron explantes de duodeno obteni-dos por técnica endoscópica. 8 pacientes celiacos en actividad no tra-tados (aEC; serología y genética positivas, atrofia vellositaria y altera-ciones en el linfograma propias de Enfermedad Celiaca, EC), 6 pacien-tes no celiacos sin afectación duodenal (CsNo-EC; serología y genéti-ca negativas, sin alteraciones histológicas ni de linfograma) y 7 pacien-tes con algún tipo de patología diferente a EC en la mucosa duode-nal (CpNo-EC; serología y genética negativas, sin atrofia vellositariay con alteraciones en el linfograma diferentes a las de EC).

Los explantes se procesaron para la extracción de los LinfocitosIntraepiteliales (LIEs). Las células iNKT fueron identificadas median-te anticuerpos específicos para la cadena Vα24 del TCR, detectadospor citometría de flujo. Los datos se analizaron estadísticamentemediante el test ANOVA (significación estadística p<0,05).

Resultados. Se observa un aumento estadísticamente significativode la población de células iNKT en los celiacos en actividad (aEC mean=7,46% del total de LIEs) comparado con el resto de los grupos (CsNo-EC mean= 1,81% del total de LIEs, CpNo-EC mean= 2,90% del total deLIEs). Además, en los celiacos en actividad predomina claramente elfenotipo de célula iNKT Vα24+CD4+CD8- sobre el resto (aEC mean=84,39% del total de iNKTs), mientras que en los CsNo-EC y CpNo-ECel porcentaje de iNKTs con fenotipo Vα24+CD4+CD8- es mucho menor(mean= 47,20% y 51,14% del total de iNKTs respectivamente).

Conclusión. Los pacientes celiacos presentan un mayor porcentajede células iNKT en el compartimento intraepitelial del duodeno, las cua-les desarrollan principalmente un fenotipo Vα24+CD4+CD8-. De acuer-do a estudios moleculares previos de nuestro grupo, los celiacos en acti-vidad expresan un aumento de Vα24 (representativo de las iNKTs) y deIFNγ comparado con el resto de grupos, lo que refuerza los datos presen-tados aquí. Teniendo en cuenta que las células iNKT Vα24+CD4+CD8- sehan descrito como células duales que tras su estimulación son capaces deproducir de forma rápida grandes cantidades de citoquinas tanto de tipoTh1 (IFNγ) como Th2 (IL4) (La Cava, A. et al. 2006), nuestros resultadossugieren que esta población intraepitelial de iNKTs podría estar impli-cada en la inmunopatogénesis de la EC y, posiblemente, contribuyen deforma importante a la secreción de IFNγ (sin mediación de IL12), princi-pal citoquina implicada en la lesión tisular propia de esta enfermedad.

P-036PAPEL DE NCR EN LA INTERACCIÓN ENTRE CÉLULAS NK YCÉLULAS DENDRÍTICAS EN ANCIANOS. N. Rojas-Colonelli1, I.Gayoso1, B. Sánchez-Correa2, M.D.C. Campos1, A. Pera1, R. Tarazona2,R. Solana1. 1Hospital Universitario Reina Sofía, Córdoba. 2Universidad deExtremadura.

Las células dendríticas (DC) y las células asesinas naturales (NK)interaccionan por contacto celular, resultando una activación bi-direc-cional de ambas. Las células NK activan sus funciones citotóxicas y sefavorece la maduración de las DC. Asimismo tras esta interacción seeliminan las DC inmaduras. En estas interacciones intervienen losreceptores NKp30 y DNAM1. Estudios en nuestro laboratorio indicanque existe un descenso significativo en la expresión de estos recepto-res en células NK de ancianos. En este trabajo analizamos la interac-ción entre células NK y células dendríticas y los receptores implicadosen la misma en jóvenes y ancianos.

Las DC se generaron in vitro a partir de PBMCs de donantes sanos.Por cultivo durante 6 días, en presencia de IL-4 y GM-CSF. Se estu-dió la expresión de CD11c como marcador de células dendríticas. Lascélulas NK fueron enriquecidas mediante inmunoseparación magné-tica (>80% son CD3negCD56+). Ambos tipos celulares fueron co-cul-tivados a razón de 5:1 DC:NK durante 48 horas. Como control de laactivación las DCs se estimularon con LPS (DC maduras) o se dejaronsin tratar (DC inmaduras). Las células fueron evaluadas fenotípica-mente por medio de citometría de flujo.

Las DC de jóvenes maduradas con LPS mostraron un aumento enla expresión en superficie de los marcadores de activación CD86 yCD83, al compararlas con las DC sin estimular. La interacción DC-NKindujo la activación y maduración de las DCs, observándose un aumen-to en superficie tanto de CD86 como CD83, similares a los encontra-dos en las DC estimuladas con LPS. En ancianos la expresión de estosmarcadores en células dendríticas resultó descendida al compararlocon jóvenes, lo que indica una alteración en la interacción DC-NK.

La interacción de las NK con las DC induce la maduración de éstasúltimas, lo que posiblemente esté implicado en la respuesta inmuneinnata de ambos tipos celulares. Nuestros resultados previos que mues-tran un descenso en la expresión de los receptores NKp30 y DNAM1en ancianos, ambos implicados en la interacción NK:DC, sugieren queeste descenso puede participar en la alteración en la interacción DC-NK y contribuir al deterioro de la respuesta inmune adaptativa en per-sonas de avanzada edad.

P-037ESTUDIO DE EXPANSIÓN DE POBLACIONES LGL EN PACIEN-TES CON LINFOCITOSIS PERIFÉRICA. L. Arriarán Aronés, M.Sáenz Cuesta, M.D.C. Montes Fernandez, P. Echaniz Aizpuru, M.D. DeJuan Echavarri, A. Prada Iñurrategui, E. Cuadrado Del Barrio. Hospi-tal Donostia, San Sebastián.

Introducción. Los linfocitos granulares grandes (LGL) son célu-las efectoras de la respuesta inmune que intervienen tanto en la inmu-nidad innata (NK CD3-) como en la respuesta adaptativa (NK CD3+),su expansión es muy frecuente en la clínica, pudiendo presentarse des-de una forma indolente hasta proliferaciones agresivas sobre todo aso-ciadas a las células NK.

Diseño. Estudio retrospectivo de estas expansiones y su asocia-ción a determinados procesos clínicos.

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Material y métodos. Estudio retrospectivo de 1.431 linfocitosis recibi-das en nuestro laboratorio durante el periodo 2008-2009, de los cuales 179fueron expansiones NK (12,5%). Sólo en 92 se pudo completar el estudio.

La metodología del estudio incluyó inmunofenotipo linfoide LGLy realización de reordenamiento de TCR por biología molecular.

Resultados. Fenotipo NK según patologías

Discusión- conclusiones. 1) Se observa una linfocitosis LGL abso-luta (>400cel/ul) en todos los grupos estudiados, siendo más signifi-cativa en el grupo de los procesos infecciosos y en el grupo de postTPH. 2) La expansión más frecuente es la NK/CD3+ (70%) lo que noslleva a continuar el estudio de reordenamiento de TCR por Biologíamolecular. 3) En todos los pacientes post TPH la expansión es de célu-las NK+/CD3+ de carácter monoclonal. Se recomienda realizar segui-miento de estos pacientes hasta la reconstitución del repertorio de célu-las T y estudiar la influencia del quimerismo en el desarrollo de esterepertorio. 4) En los procesos neoplásicos se observa un mayor por-centaje de células con fenotipo NK+/CD3-.

SESIÓN 4: CÉLULAS T

Moderadores: Ana Clara Carrera (Madrid)Enrique Aguado (Murcia)

P-038LAS PROTEÍNAS MORFOGENÉTICAS ÓSEAS MODULAN LAPROLIFERACIÓN DE LOS LINFOCITOS T CD4+ PERIFÉRICOS.A. Varas, V.G. Martínez, C. Hernández-López, L. Hidalgo, A. Entrena,J. Valencia, M.N. Vázquez, A. Zapata, R. Sacedón, A. Vicente. FacultadMedicina, Universidad Complutense, Madrid.

Objetivos. Las Proteínas Morfogenéticas Óseas (BMPs) desempe-ñan un papel crucial durante la embriogénesis y organogénesis de ver-tebrados, y también se ha descrito que llevan a cabo diversas funcio-nes en tejidos adultos con capacidad auto-renovadora. Varios auto-res han demostrado que distintas BMPs están implicadas en el controlde la proliferación de células precursoras hematopoyéticas y tam-bién de linfocitos B. En el timo, se ha descrito previamente que lasBMPs regulan la proliferación, supervivencia y diferenciación de lostimocitos. Asimismo, se ha demostrado la expresión de receptores paraBMPs en líneas celulares linfoblastoides así como en la línea JurkatTAg. En este estudio, se pretende estudiar la expresión y posible fun-ción de las BMPs en los linfocitos T CD4+ periféricos.

Material y métodos. Linfocitos T CD4+ naive fueron aisladosmediante selección negativa inmunomagnética a partir de ganglios lin-foides de ratones BALB/c mantenidos en condiciones SPF. Las célulasT se cultivaron en medio libre de suero y se estimularon con anticuer-

pos anti-CD3 con o sin anticuerpos anti-CD28. En algunos cultivosse añadieron diferentes dosis de rhBMP2 o rhBMP4. La expresión yfuncionalidad de la vía de señalización BMP se estudió por citometríade flujo, y la influencia de las BMPs en la tasa proliferativa de los lin-focitos T se analizó tras incorporación de BrdU y detección por ELISA.

Resultados. En este estudio nosotros evidenciamos que las célulasT CD4+ periféricas expresan los tres tipos de receptores tipo I de BMP(BMPRIA, BMPRIB, ActRIA), y que la proporción de células T que expre-san los receptores para BMPs incrementa notablemente tras estimula-ción con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD3 más anti-CD28. La vía de seña-lización BMP es funcional en estas células T CD4+ periféricas puesto queal cultivarlas en presencia de BMP4 se incrementan los niveles de Smad1fosforilada. Además, nuestros resultados demuestran que la adición deBMP2 y BMP4 durante la estimulación con anti-CD3/CD28 modula demanera diferencial la proliferación de las células T CD4+.

Conclusiones. En conjunto, los resultados indican que la vía deseñalización BMP juega un papel en las respuestas de células T.

P-039MULTIPLE, NON-CONSERVED, INTERNAL VIRAL LIGANDSNATURALLY PRESENTED BY HLA-B27 IN HUMAN RESPIRA-TORY SYNCYTIAL VIRUS-INFECTED CELLS. D. López1, S. Infan-tes1, E. Lorente1, E. Barnea2, I. Beer2, J.J. Cargnolini3, R. García1, F. Lasa-la1, M. Jiménez1, A. Admon2. 1Centro Nacional de Microbiología, Institutode Salud Carlos III,, Majadahonda. 2Department of Biology, Technion-IsraelInstitute of Technology. 3Centro de Biología Molecular Severo Ochoa,CSIC/Universidad Autónoma de Madrid, Madrid.

Cytotoxic T lymphocyte (CTL)-mediated death of virus-infectedcells requires prior recognition of short viral peptide antigens thatare presented by HLA class I molecules on the surface of infected cells.The CTL response is critical for the clearance of human respiratorysyncytial virus (HRSV) infection. Using mass spectrometry analysis ofcomplex HLA-bound peptide pools isolated from large amounts ofHRSV-infected cells, we identified nine naturally processed HLA-B27 ligands. The isolated peptides derive from six internal, not envelope,proteins of the infective virus. The sequences of most of these ligandsare not conserved between different HRSV strains, suggesting amechanism to explain recurrent infection with virus of different HRSVantigenic subgroups. In addition, these nine ligands represent a significantfraction of the proteome of this virus, which is monitored by thesame HLA class I allele. These data have implications for vaccinedevelopment as well as for analysis of the CTL response.

P-040UNUSUAL VIRAL LIGAND WITH ALTERNATIVE INTERAC-TIONS IS PRESENTED BY HLA-CW4 IN HUMAN RESPIRATORYSYNCYTIAL VIRUS-INFECTED CELLS. D. López1, S. Infantes1, E.Lorente1, J.J. Cargnolini2, M. Ramos1, R. García1, M. Jiménez1, S. Ibo-rra1, M. Del Val1. 1Centro Nacional de Microbiología. Instituto de Salud Car-los III, Majadahonda. 2Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, CSIC/Uni-versidad Autónoma de Madrid, Madrid.

Short viral antigens bound to human major histocompatibilitycomplex (HLA) class I molecules are presented on infected cells. Vaccinedevelopment frequently relies on synthetic peptides to identify optimalHLA class I ligands. However, when natural peptides are analyzed,

Tabla 1. Fenotipo NK según patologías

Patologías n = 92 Fenotipo Fenotipo CD3+ Linfocitosis Nro casosNK % TCR + TCR - media absoluta LGL>400

LGL

Procesos endocrinos 11 27 54 18 1734 9/11Proceso reumatológicos 1 1 - 1 789 1/1Procesos infecciosos 12 25 42 33 2527 12/12Procesos neoplásicos 9 55 33 11 2389 4/9TPH 8 12 87 - 2365 8/8Procesos hematológicos: 16 25 44 31 911 9/11Otras causas 35 37 43 20 1344 29/35

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more complex mixtures are found. By immunoproteomics analysis, weidentify here a physiologically processed HLA ligand derived fromhuman respiratory syncytial virus matrix protein that is very differentfrom what was expected from studies with synthetic peptides. Thisnatural HLA-Cw4 class I ligand uses alternative interactions to theanchor motifs previously described for its presenting HLA-Cw4 classI molecule. Finally, this octameric peptide shares its C-terminal corewith the H-2Db nonamer ligand previously identified in the mousemodel. These data have implications for the identification of antiviralCTL responses and for vaccine development.

P-041CASPASES IN VIRUS-INFECTED CELLS CONTRIBUTE TORECOGNITION BY CD8+ T LYMPHOCYTES. D. López1, M. Gar-cía-Calvo2, G. Smith3, M. Del Val1. 1Centro Nacional de Microbiología,Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda. 2Department of Metabolic Disor-ders & Diabetes, Merck Research Laboratories. 3Department of Virology,Faculty of Medicine, Imperial College London.

CD8+ cytotoxic T lymphocytes recognize infected cells in whichMHC class I molecules present pathogen-derived peptides that havebeen processed mainly by proteasomes. Many infections induce a setof proteases, the caspases involved in apoptosis or inflammation. Herewe report that processing and presentation of a short vaccinia virus-encoded antigen can take place also by a non-proteasomal pathway,which was blocked in infected cells with chemical inhibitors of caspases.By cleaving at non-canonical sites, at least two caspases generatedantigenic peptides recognised by T lymphocytes. The sites and thepeptidic products were partially overlapping but different to thoseused and produced by proteasomes in vitro. Antigenic natural peptidesproduced in infected cells by either pathway were quantitatively andqualitatively similar. Finally, co-expression of the natural vaccinia virusprotein B13, which is an inhibitor of caspases and apoptosis, impairedantigen presentation by the caspase pathway in infected cells. Thesedata support the hypothesis that the numerous cellular proteolyticsystems, including those induced during infection, such as caspasesinvolved in apoptosis or in inflammation, contribute to the repertoireof presented peptides, thereby facilitating immunosurveillance.

P-042DISTRIBUCIÓN DIFERENCIAL DE CÉLULAS INKT Y NTREGSEN EL TEJIDO DIANA DE LA RESPUESTA AUTOINMUNE. L. Use-ro Redrejo1, E. Codina1, M. Boshuizen1, C. Xufré1, R. Planas2, M. Vives-Pi2, D. Jaraquemada1, M. Martí1, C. Roura-Mir1. 1Institut de Biotecnolo-gia i Biomedicina, Bellaterra. 2Fundació Institut d’Investigació en Ciènciesde la Salut Germans Trias i Pujol, Badalona.

En enfermedades autoinmunes humanas se ha descrito una fre-cuencia y función reducida de células inmunoreguladoras, T NaturalKiller invariantes (iNKT) y células T reguladoras (nTregs), ambas impor-tantes en el control de la autoreactividad. Estas células además de regu-lar otros tipos celulares se regulan mutuamente. Partiendo de la hipó-tesis que estas dos poblaciones de células cooperan en el control delproceso autoinmune, nos propusimos analizar su coexistencia en mues-tras de tejido humano con autoinmunidad.

Se analizaron muestras de páncreas total (TD), islotes purificados(ILL) y bazo (B) de un paciente diabético en el debut de la enfermedad así

como muestras de tiroides de pacientes con Graves-Basedow (GB) y Tiroi-ditis de Hashimoto (HT) y muestras control. El análisis se realizó por qPCR,amplificando la cadena Vα24-Jα18 del TCR o Foxp3 para cuantificar célu-las iNKT y nTregs respectivamente. Asimismo, se analizó la presenciade ambos tipos celulares in situ por inmunofluorescencia en tejido pan-creático de ratón NOD en diferentes fases de la patogénesis de T1D.

El análisis no detectó la expresión del TCR Vα24Jα18 en el páncreascontrol pero si en las muestras de T1D donde, además, la expresión fuesuperior en TD que en ILL. Contrariamente, la expresión de Foxp3 fuemás elevada en ILL que en TD del páncreas diabético. Así, las células iNKTse concentraban preferentemente fuera de los islotes pancreáticos, mien-tras que las células nTregs eran reclutadas preferentemente en su interior.Sólo se pudo confirmar esta distribución diferencial por inmunofluores-cencia en el páncreas de ratones NOD diabéticos (20 semanas), pero noen ratones prediabéticos (9 semanas) o en el debut de la enfermedad (14semanas) donde no existía un patrón de distribución evidente.

En las muestras de tiroides autoinmune la expresión del TCRVα24/Jα18 fue más alta que en los controles, detectando una impor-tante variabilidad en muestras de GB. Contrariamente, la expresión deFoxp3 fue más elevada en las muestras control que en los tiroidesautoinmunes. El análisis de los resultados mostró una correlación inver-sa entre la frecuencia de células T Foxp3+ y células Vα24/Jα18+ en lostiroides con autoinmunidad.

Estos resultados indicarían que las células nTreg e iNKT migransecuencialmente al tejido diana de la respuesta autoinmune donde lascélulas nTregs regularían inicialmente la insulitis con la colaboraciónde las células iNKTs en etapas posteriores.

P-044APOPTOSIS ALTERATION OF NAIVE/EFFECTOR/MEMORY TCELL SUBSETS IN PATIENTS WITH RHEUMATOID ARTHRITIS.D. Díaz Martín1, L. Chara Velarde1, J. Chevarria Montesinos1, A. Sán-chez Atrio2, G. Parada Hermoza1, Z. Moreno Villegas1, L. Ortega More-no1, J. Monserrat Sanz1, A. Prieto Martín1, M. Álvarez De Mon-Soto2.1Universidad de Alcalá de Henares, Alcalá de Henares. 2Hospital Universi-tario Príncipe de Asturias.

Background. Dysregulation of T lymphocyte apoptosis has beeninvolved in the pathogenesis of rheumatoid arthritis (RA).

Purpose. To investigate the spontaneous and induced apoptosisin specifically defined naïve/effector/memory subsets in circulatingT lymphocytes from untreated and methotrexate (MTX) or anti-TNFαantibodies treated RA patients.

Methods. Peripheral blood mononuclear cells from untreated(20 patients) or treated with MTX (27 patients) or anti-TNFα antibodies(16 patients) RA patients and 14 healthy controls were purified andcharacterized using monoclonal antibodies and annexin V by eightcolor flow cytometry in a FACSAria sorter. The percentage of apoptoticlymphocytes was determined after 24 hour culture.

Results. A statistically significant decrease (p<0.05) in spontaneousex vivo apoptosis was found in naïve CD3+CD4+ cells (CD45RA+CD27+)from RA patients with respect to healthy controls. In CD3+CD8+ Tlymphocytes, we found a significant increase in spontaneous apoptosisin untreated patients that normalized after treatment in terminated andnon terminated effector subsets (CD45RA+/-CD27-). In mitogen-inducedapoptosis, we found a significant decrease of apoptosis from RA patientswith respect to healthy controls in CD4+ T cell subsets but no in CD8+ Tcell subsets. Conclusions: Patients with RAshow alterations in spontaneous

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and mitogen-induced apoptosis within circulating naïve/effector/memoryCD4+ and CD8+ T-cell subsets. MTX or anti-TNFα treatment normalizesthe apoptosis misbalance in several T cell subsets.

P-045N-RAS ES UN REGULADOR NEGATIVO DE LA EXPRESIÓN DEIL-17 EN LINFOCITOS. T. E. Fernández-Malavé1, L. Stark Aroeira2,S. Iborra2. 1Inmunología, Fac. Medicina, UCM, Madrid. 2Unidad de Inves-tigación, Hosp. la paz, Madrid.

La citocina IL-17(A) identifica al linaje funcional Th17 y contribu-ye de forma esencial a la actividad fisiopatológica de estas células.La expresión de IL-17 es inducida en linfocitos T por señales iniciadaspor el receptor de antígeno (TCR), pero la naturaleza de estas señalesno ha sido establecida claramente. Las proteínas de la familia Ras (H-, K- y N-ras) son activadas rápidamente a través del TCR y actúan comointerruptores moleculares que controlan respuestas celulares a distin-tos estímulos externos.

El presente estudio tuvo por objetivo la caracterización del papelde N-ras en la regulación de la expresión de IL-17 en linfocitos T, a tra-vés del uso de ratones deficientes de N-ras (N-ras-/-).

Los linfocitos T de los ratones N-ras-/- mostraron una produc-ción aumentada de IL-17 en respuesta a la estimulación vía TCR invitro con anticuerpo anti-CD3 ó concanavalina A, en comparación conlos animales N-ras+/+ y H-ras-/-. Esta sobreproducción de IL-17 por lascélulas T N-ras-/- activadas fue observada también en respuesta a antí-geno en un modelo TCR transgénico, y en animales infectados con elparásito L. major. Sorprendentemente, a pesar de esta respuesta de IL-17 exacerbada, los ratones N-ras-/- fueron menos susceptibles a la induc-ción de EAE, un modelo de neuroinflamación mediada de forma crí-tica por las células Th17.

En conclusión, nuestros resultados identifican a N-ras como un regu-lador negativo de la expresión de IL-17 en linfocitos T activados, y sugie-ren que otros factores, adicionalmente a la respuesta Th17, juegan unpapel importante en el desarrollo de inflamación autoinmunitaria.

P-046PAPEL DE LOS DOMINIOS DE CD3GAMMA EN LA EXPRESIONY FUNCION DEL TCR/CD3. B. Garcillán1, A.C. Guardo1, V. Pérez-Flo-res1, J.M. Martín-Fernández1, B. Nielsen2, C. Geisler2, O. Sanal3, L. Allen-de4, J.R. Regueiro1. 1Universidad Complutense, madrid. 2Universty of Copen-hagen. 3Hacettepe University Children´s Hospital. 4Hospital 12 de Octubre.

La ausencia de CD3γ (γ–) se asocia a una linfopenia leve, con lin-focitos T maduros cuyo TCR se expresa y señaliza mal y no se interna-liza por ésteres de forbol (PMA). Estos defectos se normalizan al reex-presar la cadena CD3γ, pero no está claro en qué dominios reside esacapacidad en estas células.

Objetivos. Definir el papel de los distintos dominios de CD3γ encomparación con los de CD3δ en la expresión y función del TCRαβhumano deficiente de CD3γ.

Material y métodos. Se analizó la expresión y función del TCR/CD3tras introducir vectores retrovirales bicistrónicos que portaban las cade-nas completas (dominios EC, TM e IC) CD3γ (γγγ) y CD3δ (δδδ) y cons-trucciones quiméricas con diferentes dominios de ambas cadenas δγγ,γγδ, γδδ y γγ- (CD3γ sin dominio intracitoplásmico) en la línea celular JGN(Jurkat Gamma Negative) y en linfocitos T de individuos γ–.

Resultados. El dominio extracelular de CD3γ, pero no el de CD3δ,es necesario y suficiente para la reexpresión del TCR/CD3 en JGN. Encontraste, para la normalización de la expresión del TCR/CD3 en loslinfocitos T de individuos γ- no basta con CD3γ EC, si no que se requie-re una cadena completa con al menos un dominio EC o IC de CD3γ. Cier-tas funciones (modulación por PMA) requieren el dominio IC de CD3γ,otras (inducción de citocinas) requieren un dominio IC de CD3γ o CD3δ,otras (inducción de CD69, reclutamiento de Nck y monovalencia) sonmás débiles en quimeras con CD3δ IC y otras (fosforilación de CD3Ây flujo de calcio) son independientes del dominio IC de la quimera.

Conclusiones. La cadena CD3γ tiene funciones no redundantes conCD3δ necesarias para la modulación del TCR/CD3 por PMA (en sudominio IC) y para su expresión normal en membrana (en sus dominiosEC e IC), pero no para la inducción de diversas funciones analizadas

P-047PAPEL DIFERENCIAL DE LAS CADENAS CD3° Y CD3D EN LAEXPRESIÓN Y FUNCIÓN DEL COMPLEJO TCR/CD3 EN CÉLU-LAS T MADURAS. J. Reiné Gutiérrez, E. Martínez Busto, B. Garci-llán, E. Fernández-Malavé, M.J. Recio Hoyas, J.R. Regueiro. Facultadde Medicina Universidad Complutense, Madrid.

Introducción. El receptor del linfocito T es un complejo multimé-rico integrado por diferentes cadenas, en las cuales las cadenas varia-bles TCR (TCRα y TCRβ) son las encargadas del reconocimiento anti-génico, mientras que las cadenas invariantes CD3 (CD3ε, CD3γ, CD3δy CD3ζ) son responsables del ensamblaje y expresión del complejoTCR/CD3, así como de las señalización intracelular. El papel específi-co de cada una de las cadenas CD3 dentro del complejo TCR, siguesiendo materia de discusión.

Objetivos. a) Determinar el papel de la cadena CD3γ en la señali-zación del TCR en células deficientes de CD3γ transformadas con Her-pesvirus saimiri b) Silenciamiento de las cadenas CD3γ y CD3δ en laexpresión y función de linfocitos T maduros.

Material y métodos. En los estudios de señalización monitoriza-mos: a) La fosforilación de las determinadas proteínas (ERK, JNK yp38) de la ruta de las MAPK quinasas en respuesta a anticuerpos anti-CD3 b) La expansión de iNKT (Vα24+Vβ11+) en respuesta a α-GalCer(α-Galactosil-ceramida). En los estudios de silenciamiento los linfoci-tos T Jurkat fueron electroporados con un pool de oligos siRNA espe-cíficos. La expresión del complejo TCR/CD3 se monitorizó por cito-metría de flujo (SK7; BMA031) al cabo de 24 horas post-tratamiento.Para evaluar el grado de interferencia de las proteínas CD3γ y CD3δse realizaron tinciones intracelulares con el antisuero α-CD3γ (TG5) ywestern-blot con el anticuerpo α-CD3δ (APA1/2), respectivamente.

Resultados y conclusiones. Nuestros resultados indican que laausencia de CD3γ no afecta a la fosforilación de ERK y p38 tras la esti-mulación (JNK no es informativo debido a su elevada actividad basal).Por otra parte, la expansión de las células iNKT en células deficien-tes de CD3γ fue similar a la observada en células control. Por lo tan-to, podemos concluir que en los linfocitos T maduros, la cadena CD3γno participa a través de las rutas analizadas. Los resultados de silen-ciamiento mostraron un papel diferencial de las cadenas CD3γ y CD3δen la topología final del complejo TCR/CD3. Sin embargo, no se obser-varon diferencias funcionales, salvo la modulación mediada por PMA,selectivamente afectada en las células silenciadas con CD3γ. Estos resul-tados sugieren la existencia de funciones redundantes y específicaspara ambas cadenas.

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P-048IMPLICACIONES FUNCIONALES DE LA ROTURA PROTEOLÍ-TICA DEL ADAPTADOR LAT. A. García-Blesa1, M. Martínez-Flo-rensa2, C. López-Osuna3, A. Alonso4, F. García-Cózar1, E. Aguado4.1Universidad de Cádiz, Puerto Real. 2Hosp. Clinic, Barcelona. 3Hosp. Uni-versitario de Puerto Real. 4Hospital Carlos Haya-Universidad de Málaga.

El reconocimiento de antígenos por parte de los linfocitos T es unode los requisitos esenciales para una adecuada respuesta inmune a deter-minadas infecciones. Tras este reconocimiento a través del TCR, se desen-cadenan en las células T una serie de señales intracelulares en las que eladaptador de membrana LAT (“Linker for the Activation of T cells”) tie-ne un papel central como plataforma sobre la que se unen y activan otrasproteínas que intervienen en la cascada de señalización intracelular.

La correcta transducción de esas señales intracelulares puede con-ducir a la activación y proliferación de las células T, aunque en deter-minadas condiciones pueden provocar su entrada en apoptosis. La apop-tosis es por tanto un fenómeno de enorme relevancia no sólo en el des-arrollo y la homeostasis de organismos multicelulares, sino también parael correcto desarrollo de las respuestas inmunes. Cuando las células Tentran en el proceso de muerte celular, se produce la activación de unaserie de proteasas llamadas caspasas que, entre otras, tienen como dia-nas a varias moléculas implicadas en la transducción de señales de célu-las T. En este trabajo, nuestro grupo demuestra que el adaptador de mem-brana LAT sufre una rotura proteolítica tras la inducción de apoptosis decélulas T. Además, hemos demostrado que LAT se rompe por al menosdos sitios y hemos encontrado cuáles son esos sitios. Por último, se hananalizado las implicaciones funcionales de la rotura proteolítica de LATpara su función de transmisión de señales de activación de células T.

P-049FUNCIONALIDAD DE LINFOCITOS T CD8 E INMUNOSENESCEN-CIA: RELACIÓN CON LA INFECCIÓN POR CMV. A. Pera, I. Gayoso,M.D.C. Campos, N. Rojas, S. Cantisan, B. Sánchez, S. Morgado, J. Casa-do, R. Tarazona, R. Solana. Hospital Reina Sofia de Cordoba, Cordoba.

Los linfocitos T pueden producir múltiples citoquinas en cadamomento, definiéndose un perfil de linfocitos principalmente monofun-cionales o polifuncionales. A este respecto, se ha demostrado que exis-te una correlación entre la multifuncionalidad y una adecuada respues-ta inmunitaria. Las células T CD8 multifuncionales se encuentran pre-sentes en individuos con infecciones víricas bien controladas de viruscomo el Epstein-Barr, CMV, Influenza y VIH en no progresores. Los lifo-citos T CD4 multifuncionales se correlacionan con protección frente aLeishmania en un modelo murino. En estos modelos la multifunciona-lidad predice la progresión. Por tanto, la “calidad” de los linfocitos Tque responden (entendida como la capacidad de una determinada célu-la de desarrollar múltiples funciones) es más importante que la “canti-dad” de linfocitos T específicos. El objetivo de este trabajo se ha cen-trado en el estudio de la multifuncionalidad de linfocitos T CD8 de indi-viduos jóvenes y ancianos sanos, y su posible relación con la infecciónpor CMV. Para ello se ha estudiado el efecto de la edad sobre la capaci-dad multifuncional de las células T CD8 mediante la detección por cito-metría de flujo de CD107/INFγ/TNF, en individuos sanos en respuestaal péptido de CMV pp65 y a SEB (superantígeno). Los resultados indi-can que existen distintas poblaciones de linfocitos T CD8 con una, doso tres de las funciones estudiadas tanto en individuos jóvenes como enindividuos ancianos. Se encontraron diferencias en la respuesta frente a

pp65 o a SEB, observándose que la edad tiene un efecto sobre la capaci-dad multifuncional de las células estudiadas, en respuesta a CMV.

P-050EL DOMINIO IG DE CD3D ES NECESARIO PARA EL DESARRO-LLO DE LOS LINFOCITOS TAB, PERO NO GD EN HUMANOS.E. Martínez Busto1, J. Reiné1, Á. Mencía2, J. Couso1, D. Gurbindo3, J.Gil3, M.Á. Moreno-Pelayo2, M.J. Recio1, J.R. Regueiro1. 1Facultad deMedicina. UCM, Madrid. 2Unidad de Genética Molecular. Hospital Ramóny Cajal. 3Hospital General Universitario Gregorio Marañón.

La ausencia completa de CD3δ en humanos se asocia a SCID tem-prana (5 meses) y con inmunofenotipo Tα‚- Tγδ-B+NK+. Estamos ana-lizando un paciente con SCID tardía (14 meses) e inmunofenotipo Tαβ-Tγδ+B+NK+. El análisis molecular realizado en el paciente, muestra unanueva mutación localizada en el intrón 2 (IVS2+5G>A) del gen CD3D.La mutación afecta a una posición conservada del sitio donador para elprocesamiento del RNA mensajero y causa la pérdida del exón 2. Estecambio se encuentra en homocigosis en el paciente y en heterocigosisen los padres. Ninguno de los 70 controles sanos analizados, utilizandoel análisis de restricción con la enzima BsaI, presenta el cambio descri-to, lo que lo excluye como un posible polimorfismo.

La proteína CD3δ resultante pierde el dominio Ig, pero conservael motivo CXXCXEXXX, que linda con la región transmembranal yes necesario para el correcto ensamblaje del complejo TCR/CD3. Losestudios de transfección realizados en células 293T muestran que estaproteína CD3δ sin exón 2, pero no sin exón 3, es estable in vitro. Esteresultado explicaría la expresión, aunque disminuida, del complejoTCR/CD3 en los linfocitos T del paciente y la tinción normal con elanticuerpo APA1/2 específico de CD3δ intracelular. El hecho de queexista una linfopenia Tα‚ selectiva refleja el papel diferencial del domi-nio Ig de CD3δ en la selección tímica de linfocitos T αβ vs γδ. Los esca-sos linfocitos Tα‚ del paciente son oligoclonales y se asocian a inmu-nopatología Th2 (hiperIgE, eosinofilia). Se especula sobre el posiblepapel protector de los linfocitos Tγδ en el paciente.

Conclusiones. Esta es la primera inmunodeficiencia de CD3δ des-crita asociada con una linfopenia Tα‚ selectiva (Tαβ-Tγδ+B+NK+) yayuda a establecer en el papel del dominio Ig de CD3δ en el desarro-llo de los linfocitos Tαβ, pero no en γδ en humanos.

P-051RELEVANCIA DE LAS INTERACCIONES LIGANDO/RECEPTORMEDIADAS POR CD5 EN LA HOMEOSTASIS DE POBLACIONESLINFOCITARIAS CON POSIBLE FUNCIÓN REGULADORA. R.Fenutria1, V. Gil2, J. Sintes3, J. Merino4, C. Raman5, R. Merino6, P. Engel7,M. Ramos-Casals2, G. Soldevilla8, F. Lozano9. 1Fundació Clínic per a laRecerca Biomèdica, Institut d'Investigacions Biomédiques August Pi i Sun-yer, Barcelona. 2Hosp. Clínico de Barcelona. 3Dpto. de Biología Celular, Inmu-nología y Neurociencias, Univ. de Barcelona. 4Dpto. de Biología Molecular,Univ. de Cantabria, Santander. 5Dpt. of Medicine, University of Alabama.6Dpto. de Biología Molecular, Univ. de Cantabria, Santander. 7Dpto. de Bio-logía Celular, Inmunología y Neurociencias, Univ. de Barcelona. 8Institutode Investigaciones Biomédicas, Univ. Nacional Autónoma de México. 9Dpto.de Biología Celular, Inmunología y Neurociencias, Univ. de Barcelona.

CD5 es una glicoproteína tipo I linfocitaria perteneciente a la Super-familia de Receptores Scavenger Ricos en Cisteina (SRCR), que inclu-

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ye tanto proteínas de membrana (e.g. CD6) como secretadas (e.g. Spα),que están implicadas en el desarrollo del Sistema Inmune y en la regu-lación de sus respuestas. CD5 está constitutivamente expresado entimocitos, en todos los linfocitos T maduros y en la subpoblación B1ade células B. Del estudio de modelos knock-out se ha demostrado queCD5 tiene un papel modulador negativo de las señales liberadas porel receptor de antígeno de las células T y células B.

En el presente estudio se describen datos fenotípicos obtenidos deun modelo transgénico murino generado en nuestro laboratorio queexpresa una forma recombinante soluble del receptor CD5 humano(rshCD5tg) bajo el control del enhancer de las cadenas pesadas µ (Eµ).Dichos animales presentan niveles séricos elevados de dichas formassolubles circulantes, susceptibles de unirse al/los ligando/s todavíadesconocido/s de CD5 y de bloquear las señales intracelulares media-das por este receptor. De acuerdo con esta hipótesis el análisis citofluo-rimétrico de distintas poblaciones linfocitarias, demostró una dismi-nución significativa de células T reguladoras (CD4+CD25+FoxP3+) anivel de timo y ganglios linfáticos, así como de células B1a (CD5+)en peritoneo y de Natural Killer (NK1.1+) en bazo. Estos datos sugie-ren que las interacciones moleculares mediadas por CD5 son relevan-tes para la homeostasis de determinadas poblaciones linfocitarias confunciones reguladoras.

Consecuentemente, los animales rshCD5tg presentaron formasmás severas de modelos experimentales murinos de enfermedad autoin-mune (Encefalitis Autoinmune Experimental y Artritis inducida porColágeno II).

SESIÓN 5: INMUNIDAD E INFECCIÓN

Moderadores: Miguel López Botet (Barcelona)Maria Montoya (Barcelona)

P-052ACTIVIDAD BACTERICIDA DEL SUERO HUMANO FRENTE ARHODOCOCCUS EQUI. PAPEL DEL COMPLEMENTO. S. Remuz-go Martínez1, L. Pilares Ortega2, I. Beares Gómez2, D. Padilla Casti-llo3, J. Navas Méndez4, J. Ramos Vivas1. 1Hospital Santa Cruz de Lien-cres, Instituto de Formación e Investigación Marqués de Valdecilla IFIMAV,Liencres. 2Hospital Santa Cruz de Liencres, Santander. 3Instituto Universi-tario de Sanidad Animal (IUSA), Arucas. 4Universidad de Cantabria, San-tander.

Objetivos. El objetivo del presente trabajo es evaluar la actividadbactericida del suero humano frente a distintas cepas del patógenooportunista humano Rhodococcus equi.

Material y métodos. Bacterias: 10 aislados clínicos de R. equi pro-cedentes de pacientes con neumonía. Las cepas han sido clasificadaspor métodos genotípicos y fenotípicos para determinar sus caracterís-ticas de virulencia. Suero: Hemos obtenido sangre a partir de pacien-tes sanos y posteriormente hemos conseguido un pool de suero con elque hemos realizado ensayos de cinéticas de resistencia a la actividadantibacteriana del complemento.

Resultados y conclusiones. R. equi es un patógeno oportunista enpersonas inmunodeprimidas del que se tiene poca información res-pecto a la biología de su infección. En el presente trabajo hemos demos-trado que la capacidad bactericida del suero humano depende del feno-

tipo de R. equi, evidenciando la presencia de cepas resistentes a dichaactividad bactericida. Hemos demostrado además, que entre los feno-tipos y genotipos de esta especie, hay cepas que presentan una altaresistencia al suero humano y a las proteínas del complemento, la pri-mera línea de defensa contra microorganismos patógenos.

P-053CEPAS SUPER-INVASIVAS DE RHODOCOCCUS EQUI INDUCENLA PRODUCCIÓN DE CITOQUINAS PRO-INFLAMATORIAS ENCÉLULAS PULMONARES HUMANAS. J. Ramos Vivas1, S. Remuz-go Martínez1, L. Álvarez Rodríguez2, L. Pilares Ortega3, C. Santa CruzLlata2, I. Beares Gómez2, F. Acosta Arbelo4, M. López Hoyos5, J. NavasMéndez3. 1Hospital Santa Cruz de Liencres, Instituto de Formación e Inves-tigación Marqués de Valdecilla, Liencres. 2Hospital Santa Cruz de Liencres,Liencres. 3Universidad de Cantabria. 4Instituto Universitario de Sanidad Ani-mal (IUSA), Arucas. 5Hospital Santa Cruz de Liencres, Liencres.

Objetivos. Examinar la inducción de citoquinas proinflamatoriaspor cepas de Rhodococcus equi aisladas de humanos, en células pul-monares.

Material y métodos. Hemos testado una batería de cepas de R.equi para determinar en qué medida esta especie es capaz de invadircélulas epiteliales humanas e inducir una respuesta pro-inflamatoria.Hemos producido un anticuerpo contra esta especie, para realizar estu-dios de inmunofluorescencia y ensayos de tinción diferencial. Tambiénhemos aplicado ensayos de protección con antibióticos para estudiarel tráfico intracelular de R. equi en células pulmonares A-549. Poste-riormente, hemos utilizado citometría de flujo para determinar la pro-ducción de citoquinas mediante ensayos CBA.

Resultados y conclusiones. Hemos demostrado por primera vezque el patógeno oportunista R. equi es capaz de invadir células pulmo-nares humanas, lo que puede ser importante para establecer un esta-do de portador, y resistir al sistema inmunológico innato. Hemosdemostrado también que en esta especie, el plásmido al que se atribu-ye su virulencia no es necesario para la invasión, y que las cepas super-invasivas sobreviven en el interior celular y son capaces de inducir IL-6 e IL-8 en células pulmonares humanas.

P-054INTERACCIÓN DEL PATÓGENO HUMANO OPORTUNISTAHAFNIA ALVEI CON LA LÍNEA CELULAR FAGOCÍTICA J774.S. Remuzgo Martínez1, I. Beares Gómez2, L. Pilares Ortega3, D. Padi-lla Castillo4, F. Acosta Arbelo4, J. Ramos Vivas1. 1Hospital Santa Cruzde Liencres, Instituto de Formación e Investigación Marqués de Valdecilla,Liencres2. Hospital Santa Cruz de Liencres3. Universidad de Cantabria4. Ins-tituto Universitario de Sanidad Animal (IUSA),

Objetivos. Evaluar la capacidad de adherencia del patógeno opor-tunista Hafnia alvei sobre la línea celular de macrófagos J774.

Material y métodos. Hemos caracterizado una colección de aisla-dos clínicos de la especie Hafnia alvei mediante PCR, para identificarfactores de virulencia implicados en la adherencia de esta especie a célu-las fagocíticas. Hemos desarrollado anticuerpos contra diferentes cepasde H. alvei para estudiar mediante inmunofluorescencia las interaccio-nes de este patógeno con células del sistema inmunitario. Mediantecinéticas de adherencia e internalización hemos estudiado el compor-tamiento de esta enterobacteria en contacto con macrófagos J774.

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Resultados y conclusiones. Hemos comprobado como la diversi-dad fenotípica de H. alvei puede ser determinante para el control dela infección por parte de células del sistema inmunitario innato. Hemosevidenciado por primera vez que esta especie muestra “variación defase” en presencia de células fagocíticas, ya que una misma cepa pue-de presentar células en fase ON (fenotipo rugoso, expresando fimbrias)o en fase OFF (fenotipo liso, sin producción de fimbrias). Esta varia-ción de fase podría ser determinante en la evasión o en la adherenciaa células del sistema inmunitario. Mediante microscopía electrónicade transmisión y microscopía láser confocal hemos estudiado en deta-lle tanto la superficie de las diferentes cepas, como su interacción conlas células fagocíticas.

P-055LA INTENSIDAD DE LA RESPUESTA A CMV CONDICIONA ELESTADO FUNCIONAL E INMUNOLÓGICO EN LOS INDIVI-DUOS DE EDAD AVANZADA. M.A. Moro García1, R. Alonso Arias1,I. Cuevas Pérez1, F.M. Suárez García2, J.J. Solano Jaurrieta3, C. LópezLarrea1. 1Hospital Central de Asturias, Oviedo. 2Consejería de Salud YServicios Sanitarios Del Principado de Asturias. 3Hospital Monte Naranco,Oviedo.

Objetivos. El deterioro del sistema inmune se asocia con una menorsupervivencia en ancianos, habiéndose definido incluso un perfil deriesgo inmunológico que incluye la inversión del cociente CD4/CD8y la seropositividad a CMV. La capacidad funcional también se rela-ciona con su longevidad y existen determinados índices, como el deBarthel (IB), que permiten su clasificación. El objetivo de este trabajofue estudiar si existe asociación entre el deterioro funcional e inmuno-lógico en individuos de edad avanzada.

Material y métodos. Se estudiaron 100 ancianos procedentes dela residencia Santa Teresa de Oviedo, que fueron divididos en cuatrogrupos, homogéneos en edad, según su IB. De mayor a menor capaci-dad funcional: grupo 0 (n=25), grupo 1 (n=25), grupo 2 (n=27) y gru-po 3 (n=23). Se realizó caracterización de las subpoblaciones celularespor citometría de flujo, cuantificación de TRECs mediante "real time-PCR" y respuesta proliferativa y de activación (CD69, IFN-γ por ELIS-POT) de células T frente a anti-CD3 y CMV. También se realizó cuan-tificación por ELISA del título de anticuerpos específicos frente al virusde la gripe y CMV.

Resultados. Los individuos con peor estado funcional presenta-ron niveles significativamente aumentados de células NK y disminui-dos de linfocitos B, no encontrándose diferencias en otras poblacionesleucocitarias como polimorfonucleares, monocitos y linfocitos T. Pre-sentaban también una proporción significativamente menor de célu-las CD4+ y mayor de CD8+, con un cociente CD4/CD8 disminuido.Los niveles de TRECs en linfocitos T CD4+ fueron significativamentemenores en los individuos de los grupos 2/3, correlacionándose conuna menor frecuencia de las subpoblaciones de células naïve(CD45RA+CCR7+) y mayor de células efectoras (CD45RA-CCR7-). Larespuesta celular frente a anti-CD3 disminuyó gradualmente a medi-da que empeoraba el estado funcional y aumentaba la respuesta decélulas específicas a CMV y el título de anticuerpos frente al virus.Inversamente, la respuesta funcional in vivo, valorada por el título deanticuerpos generados tras la vacunación frente al virus de la gripe fuemayor en los individuos con mejor estado funcional.

Conclusiones. Existe una clara asociación entre el deterioro fun-cional de los individuos de edad avanzada y el envejecimiento de su

sistema inmune, estando ambos parámetros directamente relaciona-dos con la intensidad de la respuesta a CMV.

P-056UTILIDAD DE UN TEST IN VITRO DE PRODUCCIÓN DE INTER-FERÓN-G EN RESPUESTA A M. TUBERCULOSIS EN PACIENTESCON UVEITIS CRÓNICA POSTERIOR. S. Calleja Antolín, M. Cor-dero Coma, H.E. Torres Rivas, C. Cuellas, N. Aller, O. Del Árbol, A.I.De Castro, M.I. Sánchez Salazar, J.M. García Ruiz De Morales. Hos-pital de León, León.

Objetivos. Evaluar la utilidad de los nuevos test in vitro de pro-ducción de interferón-g en respuesta específica a antígenos de M tuber-culosis en una población seleccionada de pacientes inmunosuprimi-dos con uveítis posterior crónica idiopática.

Material y métodosDiseño. Estudio prospectivo, intervencional; Estudio caso-control.Método. Se investigó a 31 pacientes con uveítis crónica idiopática,

o panuveítis para una respuesta inmune frente a tuberculosis. Se con-sideró una posible uveítis tuberculosa cuando los hallazgos oftalmo-lógicos eran compatibles y se confirmaba una respuesta inmune espe-cífica frente a M tuberculosis, con la realización in vitro de un ensayode producción de interferón-g en respuesta a antígenos específicos(Quantiferon-TB GOLD, Cellestis). Se registro la respuesta a tratamien-to antituberculostático.

Resultados. En 8 de 52 controles (15,38%) y en 10 de los 31 pacien-tes con uveítis (32,25%), el test del quantiferón-TB resultó positivo (OR:2,69, IC: 0,90-7,59, p= 0,07). En 2 pacientes el resultado de la pruebafue indeterminado. Ocho pacientes positivos y uno negativo para Quan-tiferon, fueron inicialmente tratados para uveítis tuberculosa. Sólo unode ellos tenía evidencia de afectación sistémica, ninguno había sidodiagnosticado previamente de tuberculosis, habiendo recibido medi-cación inmunosupresora sistémica diversa, sin resultados óptimossobre su patología inflamatoria ocular. Tras nueve meses de tratamien-to antituberculostático, siete de los pacientes previamente Quantife-ron positivo y uno de los quantiferon negativo mostraron un descen-so de la inflamación ocular, con mejoría de su agudeza visual. No seobservaron recaídas.

Conclusiones. El test de Quantiferón fue de utilidad en la tomade decisiones terapeúticas en pacientes inmunosuprimidos con uvei-tis crónica posterior en un área geográfica de prevalencia interme-dia-alta de tuberculosis

P-057PRESENCIA DE CÉLULAS NKT HUMANAS Y EXPRESIÓN DECD1D EN LA INFECCIÓN CUTÁNEA POR LEISHMANIA INFAN-TUM. Y. Campos-Martín1, P. Algara1, Y. Ruano1, J.A. Arribas1, D. Gar-cía Almagro1, E. Martínez-Naves2, M. Mollejo1. 1Hospital Virgen de laSalud, Toledo. 2Universidad Complutense, Madrid.

Introducción. La respuesta inmue frente a Leishmania infantumha sido estudiada principalmente en animales de experimetación. LasLeishmanias poseen una enorme capacidad de resistencia a ambien-tes hidrolíticos debido a una densa superficie de glicolípidos que pose-en en su cubierta, siendo CD1d el principal candidato para presentar-los. CD1d presenta antígenos a células T conocidas como NKTs. Enhumanos, ha sido estudiada la infección de células dendríticas in vitro

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por L. infantum y se ha observado un aumento de expresión de CD1dtras la infección en la superficie celular. En estudios funcionales, célu-las NKT autólogas responde a ese aumento de expresión, con una acti-vidad citolítica frente a las células infectadas y con una producciónINF-gamma, de gran importancia para el comienzo de una respuestainmune efectiva.

Objetivo. Estudiar la presencia de células CD1d+ y NKT en mues-tras cutáneas humanas diagnosticadas de Leishmaniasis.

Metodología. Se han incluido las siguientes muestras: 15 biopsiascutáneas con leishmaniasis con amplificación por PCR de secuenciasrepetidas de Leishmania infantum; 15 biopsias cutáneas con proce-sos inflamatorios sin L infantum (PCR negativas) y 8 biopsias cutá-neas con psoriasis utilizadas como control. Los estudios de expresiónde CD1d y NKT se han realizado con técnicas inmunohistoquímicas(CD1d) y de inmunofluorescencia (Valpha24). El estudio de reordena-miento del TCR semi-invariante (Valpha24JalphaQ/Vbeta11) en célu-las NKT se ha realizado por PCR.

Resultados. En todas las biopsias cutáneas estudiadas con L. infan-tum la dermis muestra un denso infiltrado inflamatorio con un altoporcentaje de células que expresan CD1d, mientras que en las biopsiascutáneas inflamatorias sin L infantum incluidas en el estudio, la expre-sión de CD1d es observada en menor número de células. La presenciade células NKT se observa en el 100% de las infecciones cutáneas L.infantum positivas, no observándose en los otros procesos inflama-torios sin leishmanias. En los casos incluidos de psoriasis, la expresiónde CD1d es principalmente en la epidermis y en todos los casos se hademostrado la presencia de células NKT por PCR, como ha sido des-crito.

Conclusiones. Los resultados obtenidos en este trabajo apoyan losya obtenidos in vitro y confirman la alta expresión de CD1d y la impor-tancia que juegan las células NKT en el comienzo de la respuesta inmu-ne frente a la infección cutánea por L. infantum.

P-058DESCENSO DEL NUMERO ABSOLUTO DE LINFOCITOS CD4+ASOCIADO A NEUMONÍA POR PNEUMOCISTIS JIROVECII ENEL TRANSCURSO DE UNA INFECCION POR VIRUS INFLUEN-ZA H1N1. P. Jiménez Gámiz, J.M. Gonzalez De Vega, M. Bernal, F.Valero, E.M. García Huertas, F. Garrido Torres-Puchol, F. Ruiz-Cabe-llo Osuna. Hospital Universitario Virgen de las Nieves, Granada.

Una paciente de 49 años ingresó en Octubre de 2009 en el Serviciode Respiratorio de nuestro hospital presentando un cuadro de fiebre,disnea, tos e infiltrados bibasales en la radiografía de torax. El cua-dro clínico se atribuyó a una infección por virus influenza H1N1 quefue confirmada mediante el análisis molecular de una muestra de unfrotis faríngeo. La paciente mejoró clínicamente tras la instauración deltratamiento específico del proceso, pero una semana más tarde sufreun empeoramiento originado por una sobreinfección por Pneumicistisjirovecii, detectado en el lavado broncoalveolar. Durante la evolucióndel proceso las cifras de linfocitos totales experimentaron un descen-so progresivo: desde 969 c/µL en el momento del ingreso hasta 562c/µL cuando acontece la sobreinfección por Pneumicistis jirovecii. Elanálisis de las subpoblaciones linfocitarias mediante citometría de flu-jo reveló que la linfopenia era generalizada, afectando a las cifras delinfocitos T CD4+ (212 c/µL), linfocitos T CD8+ (153 c/µL) y de lin-focitos B (38 c/µL). No se detectaron defectos funcionales en los linfo-citos T CD4+ en un ensayo in vitro de activación linfocitaria tras la esti-

mulación con mitógenos. La linfopenia fue transitoria y las cifras delinfocitos recuperaron los niveles normales al resolverse el cuadro clí-nico.

La respuesta inmune del huésped se ve afectada en el curso demúltiples infecciones virales. La mayoría de las infecciones causadaspor el virus H1N1 tienen un curso leve, sin embargo un pequeño núme-ro de pacientes presentan complicaciones respiratorias. Es posible queen estos casos el efecto del virus H1N1 sobre la respuesta inmune delpaciente esté implicado. Sin embargo, debido a su reciente aparición,la inmunopatogénesis de la infección por el virus influenza H1N1 espoco conocida. El Pneumicistis jirovecii es un patógeno que causa neu-monías en los pacientes inmunodeprimidos. El riesgo de neumoníapor Pneumicistis jirovecii está asociado al descenso del número absolu-to de los linfocitos T CD4+, incrementándose cuando este desciendepor debajo de 200 c/µL. En el caso que presentamos el descenso tran-sitorio y progresivo de las cifras de linfocitos T CD4 se asocia a unasobreinfección por Pneumicistis jirovecii. Otros autores han detectadodescenso en las cifras de linfocitos T CD4+ y de linfocitos B en pacien-tes infectados por el virus influenza H1N1. Sin embargo, serán nece-sarios más estudios para establecer la asociación entre la linfopeniaCD4 y la neumonía por Pneumicistis jirovecii en los pacientes infecta-dos por el virus influenza H1N1. En este sentido, la determinación delnúmero absoluto de linfocitos T CD4+ puede constituir un marcadormuy útil para monitorizar el riesgo de desarrollar infecciones oportu-nistas e implantar la profilaxis específica.

P-060PURIFICACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE RICINA EN MATRICESCOMPLEJAS UTILIZANDO ANTICUERPOS ESPECÍFICOS. M.D.V.Jiménez Pérez, B. Fernández Frutos, I. Peraile Muñoz, J.C. Cabria Ramos.Instituto Tecnológico La Marañosa, San Martín de la Vega.

La toxina ricina, presente en las semillas de la planta “Ricinuscomunnis” (Castor beans) pertenece a una familia de proteínas cono-cidas como inactivantes de los ribosomas (ribosome-inactivating pro-teins, RIPs), y es prototipo de toxinas de estructura A-B. La cadena Bes una lectina que se une a una galactosa de la superficie celular, faci-litando la entrada de la subunidad A al interior del citosol. La cadenaA inhibe la síntesis de proteínas mediante la inactivación de los ribo-somas de las células eucariotas conduciendo a la muerte celular.

Debido a su alta letalidad (LD50 de 2g/Kg), su elevada estabilidadasí como su facilidad de obtención está considerada como un arma bio-lógica potencial.

Por todo ello es necesaria su identificación por métodos rápidos yespecíficos a partir de matrices de diferente complejidad.

Objetivos. Los objetivos de este trabajo y, por tanto, de la Unidadde Defensa Biológica del Instituto Tecnológico la Marañosa: • Detección de ricina mediante la técnica inmunoenzimática ELISA

(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay).• Utilización de anticuerpos para la purificación de la Ricina de

muestras complejas.Material y métodos

• ELISA sandwich para detectar las subunidades A y B de la Ricina:la ricina al ser una molécula de elevado peso molecular (65 kDa)permite la obtención de anticuerpos monoclonales frente a dife-rentes regiones de la molécula. En concreto, para este trabajo sehan utilizado anticuerpos monoclonales frente a la cadena A y fren-te a la cadena B respectivamente. Se han desarrollado métodos de

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amplificación de la señal marcando con biotina el Anticuerpomonoclonal frente a la cadena B.

• Para la purificación de la Ricina de matrices complejas se utilizóuna separación inmunomagnética. La aplicación de un campo mag-nético permite separar la ricina, previamente unida a las bolasmagnéticas mediante un anticuerpo, del resto de la matriz. Resultados. Los resultados obtenidos han sido la puesta a punto

de una tecnología eficaz para la identificación de ricina, basada en unaseparación inmunomagnética previa a una cuantificación medianteELISA tipo sandwich. Los resultados se expresan extrapolando los mis-mos en una curva patrón donde se representa la media de los resul-tados de absorbancia frente a diferentes concentraciones de ricina.La curva obtenida se ajusta a una ecuación logística de cuatro paráme-tros según la siguiente ecuación:

donde A es la absorbancia mínima, B es la absorbancia máxima y C esla concentración que produce un 50% de absorbancia máxima (EC50)de la curva sigmoidal. El intervalo de confianza de la curva se basa enel cálculo de la t de Student.

Conclusiones. Este inmunoensayo, mediante la utilización de anti-cuerpos monoclonales específicos, ha demostrado ser una técnica ver-sátil, robusta y simple en su realización, que permite la purificación eidentificación de ricina en matrices complejas.

P-061IDENTIFICACIÓN DE ESPORAS DE BACILLUS ANTHRACISMEDIANTE LA CITOMETRÍA DE FLUJO COMO TÉCNICAINMUNOLÓGICA. I. Peraile Muñoz, M.D.V. Jiménez Pérez, B. Fer-nández Frutos, J.C. Cabria Ramos. Instituto Tecnológico La Marañosa,San Martín de la Vega.

Bacillus anthracis (B. anthracis) es el agente etiológico del ántrax,enfermedad que presenta asociada una alta tasa de mortalidad. Lasesporas de B. anthracis se diseminan fácilmente, se encuentran de for-ma natural en el suelo de muchas regiones y son altamente resistentesfrente a condiciones medioambientales extremas. Todo esto explica porqué las esporas de B. anthracis han sido históricamente utilizadas comoarmas biológicas. Por lo tanto la puesta a punto de técnicas capaces dedetectar la presencia de esporas de B. anthracis con rapidez y precisiónes un objetivo prioritario en la Unidad de Defensa Biológica del Ins-tituto Tecnológico La Marañosa.

Objetivo. El objetivo de este trabajo es la utilización de la citome-tría de flujo como técnica inmunológica para la determinación de espo-ras de B. anthracis en diversas matrices.

Material y métodos. B. anthracis presenta gran similitud genéti-ca con muchas especies del género Bacillus, con las que, además, com-parte hábitat, lo que dificulta su determinación específica e inequívo-ca en matrices ambientales. La detección precisa de esporas de B. anth-racis mediante ensayos tradicionales que requieren la germinaciónde la espora y el crecimiento de células vegetativas tienen el inconve-niente de ser lentos; otras técnicas, como las de Biología Molecular, sonrápidas, no requiren la germinación de la espora, pero llevan asocia-dos complicados protocolos para el tratamiento de la muestra. Las téc-nicas inmunológicas surgen como una poderosa alternativa en la detec-ción de agentes susceptibles de ser utilizados como armas de guerra

biológica, dada la gran especificidad y rapidez de las reacciones antí-geno - anticuerpo. Entre las técnicas inmunológicas destaca la citome-tría de flujo, que permite determinar simultáneamente diversos epíto-pos característicos de la espora de B. anthracis, en su mayoría presen-tes en el exosporium, mediante su unión específica a anticuerpos y/opéptidos marcados con distintos fluorocromos. Esta técnica, ademásde ser rápida y específica, no exige un laborioso procesamiento de lamuestra, con lo que se minimizan los riesgos asociados a su manipu-lación.

Resultados. La detección específica de esporas de B. anthracis porcitometría de flujo es posible mediante la utilización de marcadoresespecíficos de su exosporium, como lo es el péptido ATYPLPIRGGGC(Williams y col., 2003) o determinados anticuerpos (Kuehn y col., 2009),diferenciándolas así de manera fiable y rápida de otras esporas delmismo género como B. cereus o B. thuringiensis. Además, también esposible determinar la posible virulencia de la cepa mediante el uso deun anticuerpo específico contra el antígeno protector PA (Schumachery col., 2008).

Conclusiones. La citometría de flujo mediante la utilización con-junta de marcadores específicos, permite detectar específicamente y alinstante esporas de B. anthracis, y determinar su posible virulencia, noexigiendo la muestra prácticamente ningún procesamiento.

P-062ESTUDIO DE LA SUBPOBLACIÓN NK CD56- CD16+ DE PACIEN-TES HIV+ EN DIVERSAS SITUACIONES CLÍNICO-TERAPÉUTI-CAS. L. Castro Orgaz, M. Frias Casas, R. González Fernández, B. Man-zanares Martín, M. Cobo Medina, L. Montes Torres, J. Peña Martínez.Hospital Universitario Reina Sofía de Córdoba, Córdoba.

Objetivos. Un importante componente de la inmunidad innatason las células Natural Killer. De estas células se han descrito tres sub-poblaciones: CD56dim (función citotóxica), CD56bright (función inmu-norreguladora) y una tercera población menos estudiada CD56-CD16+(baja citotoxicidad). Ciertos cambios en esta última población fueroninicialmente descritos en pacientes HIV+. Una de las características deesta población es su baja capacidad citotóxica, basado en esto el obje-tivo de este estudio es analizar la población CD56-CD16+ en pacien-tes HIV+ en diversas situaciones clínico-terapéuticas entre los que seencuentran aquellos pacientes a los que se les ha retirado el tratamien-to.

Material y métodos. Para la realización de este estudio se utiliza-ron PBMCs previamente congeladas de pacientes HIV+ sin HAARTdurante al menos dos años (n=22), PBMCs congeladas de donantessanos (n=21) y PBMCs congeladas de pacientes HIV+ con HAART(n=24). El análisis de las poblaciones celulares se realizó mediante cito-metría de flujo de cuatro colores (FACScalibur. Becton Dickinson. SanDiego, California). El paquete estadístico usado para el análisis delos datos fue el SPSS (V.17. SPSS Inc., Chicago).

Resultados. Los resultados obtenidos muestran un incremento sig-nificativo de la subpoblación CD56-CD16+ en pacientes HIV+ sinHAART respecto a aquellos pacientes HIV+ con HAART y a los donan-tes sanos (p<0,05). Este incremento sería en detrimento del resto desubpoblaciones CD56+ (dim y bright) que tienen tendencia a dismi-nuir.

Conclusión. El análisis fenotípico de las células NK en pacientesHIV+ sin HAART ha mostrado que hay una pérdida selectiva de lapoblación citolítica CD56+CD16+ y una expansión en la subpoblación

D0 = A + B – A-Cconcentración

EC50

1+ ( )

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CD56-CD16+. En estos pacientes sin HAART dicha subpoblación expre-sa unos elevados niveles de iNKRs, principalmente el receptor inhibi-dor CD85j ó ILT2 y bajos niveles de NCRs, en comparación con la pobla-ción CD56+.

P-063CÉLULAS T CD4+ REGULADORAS EN NEONATOS DE MUYBAJO PESO Y RIESGO DE SEPSIS. M. Cianchetta Sívori, M. Sán-chez-Luna, E. Zamora, E. Maderuelo, S. Villar, B. Alonso, B. Padilla,S. Sánchez-Ramón. Hospital General Universitario Gregorio Marañon,Madrid.

La sepsis neonatal es una complicación grave en neonatos de muybajo peso (MBP) y causa importante de secuelas graves y mortalidaden esta población. Por tanto, es necesario identificar marcadores pre-dictivos tempranos de sepsis neonatal. Las células T reguladoras (Treg)son una subpoblación especializada de células T de origen tímico queparticipan en la tolerancia inmunológica y en la supresión de las res-puestas efectoras.

Objetivo. Determinar los marcadores clínicos e inmunológicoscapaces de predecir el riesgo de sepsis neonatal. Materiales y Méto-dos: Se incluyeron de forma consecutiva 37 neonatos de MBP (<1.500g).Se evaluaron parámetros clínicos y se realizó un estudio inmunofeno-típico en sangre periférica mediante citometría de flujo de 4 colores(sangre del cordón umbilical (CU), 7 días y 1 mes de vida). Resultados:De los 37 neonatos de MBP incluidos en el estudio, 25 (67%) desarro-llaron sepsis nosocomial a los 9,9 ± 3,4 días de vida, y 3 de los 25 (12%)niños que desarrollaron sepsis fallecieron. El único marcador clínicopredictivo de sepsis fue la edad gestacional (EG), que fue significati-vamente menor en los neonatos de MBP que desarrollaron sepsis noso-comial (p=0,005). No se observaron diferencias en las células T CD4+naïve, memoria, pre-efectoras y/o efectoras entre los neonatos de MBPque desarrollaron sepsis nosocomial y los que no desarrollaron sepsis.Por el contrario, los neonatos MBP que desarrollaron sepsis presen-taban porcentajes de células Treg (CD4+CD25+hi y CD4+CD25+FoxP3+) aumentados (UCB p<0,02 y p=0,29, respectivamente). Obser-vamos además una expresión significativamente mayor de perforinaen las Treg en los neonatos MBP que desarrollaron sepsis (p= 0,05). Lascélulas Treg se presentaban una correlación inversa con la EG (r=-0,46;p=0,005).

Conclusiones. La expansión de células Treg en neonatos de MBPpuede estar reflejando el desarrollo fisiológico del sistema inmunoló-gico en el neonato durante el período de aprendizaje de tolerancia tími-ca. Los neonatos de MBP se enfrentan a los patógenos y otras amena-zas durante una fase temprana del aprendizaje del timo, lo que puedeinterferir con las respuestas inmunológicas efectoras frente a patóge-nos, generando una respuesta tolerogénica, lo que conlleva un mayorriesgo de sepsis.

P-064ESTUDIO DE PEPSINA EN LAVADO BRONCOALVEOLAR PARADETECTAR REFLUJO GASTROESOFÁGICO EN PACIENTESASMÁTICOS GRAVES. I. Toboso De Lamo, A. Pacheco, L.M. Villar,P. González. Hospital Universitario Ramón y Cajal, Madrid.

Objetivos. El asma y otras patologías neumológicas crónicas supo-nen un grave problema sociosanitario en España. Estudios recientes

sugieren una asociación entre las formas graves de estas patologías yel reflujo esofagogástrico (REG), debido a que el epitelio laríngeo esmucho más sensible a los daños por la pepsina en medio ácido que elesofágico.

Este estudio pretende poner a punto un método sensible y pocoinvasivo de detección y cuantificación de pepsina por ELISA, en lava-dos broncoalveolares (LBA) de pacientes asmáticos de difícil manejo.

Material y métodos. Muestras biológicas: Como control positivose utilizó jugo gástrico de pacientes sometidos a gastroscopias con finesdiagnósticos. Las muestras de LBA se obtuvieron por aspiración bron-queoalveolar, se centrifugaron a 2500 rpm, se alicuotaron y se almace-naron a -80ºC hasta su utilización.

Pacientes: Se estudiaron 30 muestras de 15 pacientes con asma gra-ve.

Reactivos del ELISA. Placas Greiner bio-one, anticuerpo monoclo-nal de ratón frente a Pepsina A humana (Santa Cruz Biotechnology),anticuerpo IgG antipepsina porcina conjugado con biotina (Rockland)y Estreptavidina-peroxidasa (Jackson Inmunoresearch).

Condiciones finales del ensayo:• Se tapiza la placa de ELISA con anticuerpo antipepsina A huma-

na, durante toda la noche a 4ºC.• Se bloquea 1 hora con PBS BSA 1% a temperatura ambiente.• Se incuban las muestras en el mismo tampón durante 45 minu-

tos a temperatura ambiente.• Se incuba con el anticuerpo conjugado con biotina 45 minutos y

se revela la placa con OPD y H2O2.Resultados. El límite de detección del ELISA fue de 0,1 ng/mL de

pepsina. El coeficiente de variación inter e intraensayo fue inferior al10%.

Comparamos los resultados de las muestras de LBA con una rec-ta patrón de jugo gástrico. Consideramos positivas, aquellas muestrasde LBA cuya concentración de pepsina fue al menos el doble que laconcentración media de pepsina en suero (49,8-86,6 µg/ml), para des-cartar posibles contaminaciones hemáticas. Cuatro de las 30 muestrasde BAL estudiadas, resultaron ser positivas.

Discusión. Este ELISA, constituye un método sencillo, reprodu-cible y eficaz, para la detección y cuantificación de pepsina en LBA.Futuros estudios, demostrarán la importancia del reflujo en las com-plicaciones de los pacientes con patologías neumológicas y demostra-rán si la cuantificación de pepsina en LBA puede ser de utilizada comomarcador clínico en dichos pacientes.

P-065IMPORTANCIA EN EL DIAGNÓSTICO DE LA TUBERCULOSISPULMONAR LATENTE DE LA PRODUCCIÓN ANTÍGENO-ESPE-CÍFICA DE CXCL9, CXCL10 Y OTRAS CITOCINAS Y SU CORRE-LACIÓN CON LA PRODUCCIÓN DE INTERFERON-GAMMA YLA REACCIÓN DE MANTOUX. N. Villegas1, J.L. Arroyo2, A. Ferre-ro1, F. Ausín1, P. Sánchez-Velasco1, F. Leyva-Cobián1, J.G. Ocejo-Vin-yals1. 1Hospital Universitario Marqués de Valdecilla, Liencres. 2Banco deSangre y Tejidos de Cantabria.

Objetivos. El objetivo de nuestro estudio ha sido: (i) evaluar si lacuantificación de CXCL9 y CXCL10 y otras citocinas (CCL5, IL-10, IL-12p40 e IL-12p70) producidas por células de sangre circulante tras esti-mulación con antígenos de Mycobacterium tuberculosis (MTB) (ESAT-6, CFP10 y TB7.7), podría ser de utilidad en el diagnóstico de la infec-ción pulmonar latente causada por MTB en una población de bajo ries-

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go para la infección, y (ii) evaluar la correlación entre la producción deestas citocinas con la producción antígeno-especifica de IFNγ y conla prueba de Mantoux.

Material y métodos. Participaron en el estudio 303 donantes sanosprocedentes del Banco de Sangre y Tejidos de Cantabria. Todos losdonantes participantes en el estudio fueron evaluados clínica y epide-miológicamente y los datos registrados. En las muestras de sangre cir-culante se determinó la producción basal y tras estimulación con tresantígenos de MTB (ESAT-6, CFP10 y TB7.7) de las siguientes citocinas:IFN-γ, CXCL9, CXCL10, CCL5, IL-10, IL-12p40 e IL-12p70. Las concen-traciones de IFN-Á se determinaron mediante ELISA y las de las otrascitocinas mediante luminometría con un panel preformado comercial-mente de las citocinas mencionadas.

Resultados. En 46 individuos (15,18%) la concentración de IFN-γespecífico para MTB estaba elevada significativamente. Se descartó enellos la presencia de una tuberculosis pulmonar activa. Se realizó laprueba de Mantoux en 29, resultando positiva en 27 de ellos. La pro-ducción de CXCL9 y CXCL10 se correlacionó con la producción deIFN-γ. Sin embargo, la producción de CXCL9 y CXCL10 estaba signi-ficativamente elevada en algunos donantes con producción normal deIFN-γ. En estos, la prueba de Mantoux fue positiva. Todos estos indi-viduos habían sido vacunados con BCG.

Conclusiones. Estos resultados, indicarían que junto con la deter-minación de IFN-γ, la determinación de CXCL9 y de CXCL10 podríaser un complemento útil en el diagnóstico de la infección por MTB. Sinembargo, su especificidad es menor que la proporcionada por la deter-minación de IFN-γ, puesto que en aquellos individuos vacunados conBCG se obtienen resultados falsamente positivos.

P-066PAPEL INMUNOMODULADOR DE LA TONSILA FARÍNGEA YMUCOSA NASAL EN LA PATOGENESIS DEL HERPESVIRUSBOVINO-1. V. Molina Hernández, M.Á. Risalde Moya, M. PedreraMazarro, P.J. Sánchez Cordón, G. García Jurado, J.C. Gómez Villa-mandos. Universidad de Córdoba, Córdoba.

El herpesvirus bovino tipo 1.1 (HVB-1.1), agente causal de la rino-traqueítis infecciosa bovina (IBR), es un alphaherpesvirus conside-rado el agente etiológico más importante del cuadro de enfermeda-des respiratorias bovinas, responsable de elevadas pérdidas econó-micas en la industria ganadera mundial. El virus penetra en el ani-mal por vía aerógena, y replica en la mucosa de tonsilas y tracto res-piratorio superior. Las tonsilas son estructuras linfoepiteliales consi-deradas de gran importancia en la inmunidad mucosa local. Traba-jos previos sugieren que están implicadas en la patogénesis del her-pesvirus bovino-1, hecho que, unido a su localización estratégica, lashace de especial interés para su estudio. Con el fin de profundizar enel estudio del papel inmunomodulador de las tonsilas en la patogé-nesis de dicho agente, hemos trabajado sobre la caracterización inmu-nofenotípica y cuantificación de las subpoblaciones de células efec-toras del sistema inmune, así como su actividad biosintética, en latonsila faríngea y mucosa nasal de terneros infectados experimental-mente con HVB-1.1.

Para ello, se inocularon 8 terneros intranasalmente con la cepa Iowadel HVB-1.1 y se tomaron muestras de sangre en días previos y poste-riores a la inoculación. Tras el sacrificio secuencial de los animales, secogieron muestras de tonsila faríngea y mucosa nasal. La caracteri-zación inmunofenotípica se realizó mediante técnicas de citometría de

flujo e inmunohistoquímica utilizando anticuerpos monoclonales fren-te a linfocitos T (CD3), linfocitos T cooperadores (CD4), linfocitos Tcitotóxicos/supresores (CD8), linfocitos Tγ/δ y linfocitos B. El estudiode los mediadores químicos (INF-γ e IL-4) se llevó a cabo por inmuno-histoquímica.

Los resultados obtenidos muestran un descenso significativo enel número de linfocitos CD4+ y CD8+ circulantes al principio de laexperiencia. Coincidiendo con el descenso de ambas subpoblacio-nes, existe una activación intensa de las estructuras linfoides enlos órganos estudiados, que origina una recuperación de estas pobla-ciones a nivel sistémico. Los linfocitos Tγ/δ, asociados a la protec-ción de mucosas, presentan el mismo comportamiento de las pobla-ciones anteriores. A diferencia de éstas, los linfocitos B no muestrancambios significativos durante la experiencia. Unido a los cambioscuantitativos descritos, se observa una activación linfocitaria carac-terizada por la expresión de INF-γ, indicativa de la instauración deuna respuesta inmunitaria tipo I. Así, una adecuada respuesta inmu-ne celular en la puerta de entrada del HVB-1.1 lograría detener sudiseminación.*Este trabajo ha sido financiado por la Junta de Andalucía a través del proyecto de Exce-lencia PO9-AGR-4671.

P-067RESPUESTA PROINFLAMATORIA DE LOS MACRÓFAGOS ENINFECCIONES VÍRICAS CONCOMITANTES DEL TRACTO RES-PIRATORIO SUPERIOR. V. Molina Hernández, M.Á. Risalde Moya,M. Pedrera Mazarro, P.J. Sánchez Cordón, F. Romero Palomo, J.C.Gómez Villamandos. Universidad de Córdoba, Córdoba.

La diarrea vírica bovina (DVB) y la rinotraqueitis infecciosa bovi-na (IBR) son enfermedades del ganado bovino ampliamente distri-buidas a nivel mundial, asociadas a importantes pérdidas económi-cas, que producen graves patologías gastrointestinales y respirato-rias, respectivamente. El estudio de la mucosa nasal y tonsila, comoórgano de entrada y replicación vírica primaria, es crucial para pro-fundizar en la patogénesis de dichos procesos víricos. Los macrófa-gos, importantes elementos del sistema inmune, gracias a su capaci-dad fagocítica, función de presentación de antígenos y producciónde citoquinas, son las principales células blanco de ambos virus. Porello, el objetivo de este trabajo fue el estudio de los macrófagos entonsila faríngea y mucosa nasal, tanto a nivel cuantitativo como deactivación secretora, en terneros coinfectados experimentalmente conel virus de la diarrea vírica bovina (vDVB) y el herpesvirus bovinotipo 1.1 (HVB-1.1).

Con este fin, 8 terneros, inoculados vía intranasal con la cepa nocitopática 7443 del vDVB, se coinfectaron 12 días después intranasal-mente con la cepa Iowa del HVB-1.1. Tras el sacrificio de los animales,se tomaron muestras de tonsila faríngea y mucosa nasal. El estudio delos cambios cuantitativos en la población de macrófagos se realizómediante inmunohistoquímica utilizando el anticuerpo monoclonalMCA387. La activación secretora de los macrófagos se corfirmó tam-bién mediante técnicas inmunohistoquímicas para la detección de dis-tintos mediadores químicos (TNF-α e IL-1α) sintetizados y liberadospor estas células.

La presencia de macrófagos inmunomarcados fue considerable-mente superior en las áreas interfoliculares que en el interior de lasestructuras linfoides de la tonsila a lo largo de la experiencia. Sinembargo, los macrófagos intraepiteliales no mostraron cambios, mien-

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tras que en la lámina propia, se observa un incremento tanto a nivelde tonsila como de mucosa nasal. A su vez, se observó un incremen-to significativo de células, principalmente macrófagos, reactivas fren-te TNFα en las áreas interfoliculares de la tonsila. Sin embargo nien folículos y en el resto de las estructuras tonsilares estudiadas seobservaron cambios significativos en la expresión de los mediadoresestudiados en las muestras empleadas. Se demuestra que los macró-fagos no sólo no experimentan una activación proinflamatoria cuan-do están inoculados con DVB, sino que estos animales al coinfectar-se con HVB-1.1 están incapacitados para experimentar una activa-ción proinflamatoria.*Este trabajo ha sido financiado por la Junta de Andalucía a través del proyecto de Exce-lencia PO9-AGR-4671.

P-068DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN MEDIANTE RT-PCR EN TIEM-PO REAL DEL VIRUS DE LA DIARREA VÍRICA BOVINA EN SAN-GRE Y TEJIDOS DE TERNEROS INFECTADOS EXPERIMENTAL-MENTE. V. Molina Hernández1, P.J. Sánchez Cordón1, M.Á. RisaldeMoya1, J.C. Gómez Villamandos1, B. Rodríguez Sánchez2, M. PedreraMazarro1. 1Universidad de Córdoba, Córdoba. 2Universidad Complutensede Madrid.

Objetivos. Hasta la fecha, son escasos los estudios que hayan eva-luado los cambios que se producen en los niveles del virus de la Dia-rrea Vírica Bovina (vDVB) en el transcurso de una infección median-te el empleo de técnicas de PCR cuantitativas. Con la finalidad de rela-cionar la presencia y evolución del virus, tanto en sangre como en losprincipales órganos linfoides, con el estado de inmunosupresión quecaracteriza la infección, el principal objetivo de este estudio fue deter-minar y monitorizar, de manera secuencial, la concentración de geno-ma vírico tanto en sangre como en tejidos durante el curso de una infec-ción aguda experimental.

Materiales y métodos. 8 terneros sin encalostrar fueron inocula-dos por vía intranasal una cepa no citopática de genotipo 1 del vDVB.2 animales permanecieron como controles sin inocular, siendo sacri-ficados al final del experimento. Se tomaron muestras de sangre ente-ra a los 1, 2, 3, 5, 6, 8, 9, 12, 13 y 14 días post-inoculación (dpi), las cua-les fueron congeladas a -80ºC. Los animales fueron sacrificados en gru-pos de dos a los 3, 6, 9 y 14 dpi, siendo sometidos a una necropsia ruti-naria en la que se tomaron y congelaron muestras de distintos tejidos.Tras la extracción del RNA, se llevó a cabo una RT-PCR en tiempo realempleando sondas TaqMan. Con el fin de normalizar diferencias entrelas distintas muestras se empleó el gen de referencia GAPDH comocontrol endógeno.

Resultados y conclusiones. Esta técnica demostró ser un métodocon una alta sensibilidad y especificidad para la detección y cuantifi-cación del vDVB tanto en muestras de sangre como en tejidos, mos-trándose como una herramienta de gran utilidad para el estudio de losmecanismos de diseminación y acantonamiento del virus. Desde elcomienzo del experimento se pudieron detectar elevados niveles degenoma vírico en las tonsilas, lo que confirmó a este órgano como unode los primeros lugares de replicación del virus. Además, se confirmóel especial tropismo del vDVB por órganos y tejidos linfoides secun-darios con predominio de linfocitos B, así como el papel secundariodel pulmón y del hígado en la replicación del virus.*Este trabajo ha sido financiado por la Junta de Andalucía a través del proyecto de Exce-lencia PO9-AGR-4671.

P-069EL DNA DE VIH-1 ASOCIADO A CÉLULAS MONONUCLEA-RES DE SANGRE PERIFÉRICA (VIH-1 DNA-PBMC) COMOMARCADOR PRONÓSTICO DE EVOLUCIÓN VIROLÓGICAEN LA INFECCIÓN CRÓNICA POR EL VIH-1. C. Rodríguez-Sáinz,R. Ramos, L. Valor, D.C. Hernández, J. Modrego, D. Alecsandru, E.Fernández-Cruz. Hospital General Universitario Gregorio Marañón,Madrid.

Objetivos. Recientemente en la infección aguda por el VIH-1 seha analizado la carga viral de VIH-1 DNA-PBMC como un marcadorpredictivo en la progresión de la enfermedad alternativo a los marca-dores surrogados estándar, VIH-1 RNA y células T CD4+. El objetivodel estudio es analizar en la infección crónica asintomática por el VIH-1 el valor pronóstico del VIH-1 DNA-PBMC para predecir la progre-sión virológica de la infección VIH-1.

Material y Métodos. En 115 individuos que han participado pre-viamente en el ensayo clínico STIR-2102, analizamos de forma retros-pectiva la carga DNA VIH-1 asociada a PBMC mediante PCR cuanti-tativa a tiempo real. Pacientes naïve para la terapia antirretroviral fue-ron evaluados en el momento basal (basal pre-ART) y tras recibir seissemanas de ART previo a la aleatorización (basal post-ART). Se anali-zó mediante análisis de Kaplan–Meier y de Regresión de Riegos Pro-porcionales de Cox el valor pronóstico de las variables VIH-1 DNA-PBMC, VIH-1 RNA plasmática y linfocitos T CD4+ en las basales pre-ART, post-ART y al final del estudio (mes 36).

Resultados. Tras el tratamiento (basal post-ART) los pacientesredujeron significativamente los niveles de VIH-1 RNA (siendo el 82%indetectable), manteniendo los valores de PBMC DNA VIH-1 eleva-dos (media geométrica: 690 copias/106 PBMC). Las curvas de super-vivencia Kaplan-Meier mostraron que los niveles de DNA-PBMC pre-ART y post-ART tienen poder predictivo (Log-Rank test: p < 0,001 y p< 0,001, respectivamente). Los niveles pre-ART de RNA VIH-1 mos-traron un Log-Rank test: p= 0,003. Analizadas las variables en un mode-lo multivariante se observó que el nivel de DNA-PBMC post-ART tie-ne el valor predictivo más fuerte (HR ajustado, 2.51 [95% IC, 1,33-4,73,p = 0,004]) y es independiente del VIH-1 RNA (HR 1,74 [95% IC,1,16–2,60, p = 0,007]).

Conclusiones. El VIH-1 DNA asociado a PBMC es un marcadorcon valor clínico para predecir la evolución virológica de individuoscon infección crónica asintomática por el VIH-1. Este método de PCRpermite cuantificar las formas lábiles de DNA asociadas a la replica-ción viral, que desaparecen tras ART, y las formas intracelulares per-manentes, integradas y no integradas de DNA de mayor valor pronós-tico.

P-070ASOCIACIÓN DEL ALELO KIR3DS1 CON LA PÉRDIDA DECORRELACIÓN ENTRE LA VIREMIA PLASMÁTICA RNA VIH-1 Y LA ACTIVACIÓN DE LOS LINFOCITOS T CD8+ EN INFEC-CIÓN CRÓNICA ASINTOMÁTICA. D. Hernández Flórez, L. Valor,J. Modrego Ruiz, J. Navarro, E. Fernández-Cruz, C. Rodríguez-Sáinz.Hospital General Universitario Gregorio Marañon, Madrid.

Objetivos. Las formas activadoras e inhibidoras de los receptoresKIR que expresan las células NK y los linfocitos T CD8+ participan enlos mecanismos de defensa frente a la infección VIH-1. En la infecciónVIH-1 existe una correlación positiva entre la viremia plasmática VIH-

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1 RNA y el % de linfocitos T CD8+ CD38+ activados. En individuosnaïve para la terapia antirretroviral (ART) con infección reciente se haasociado la presencia del receptor activador KIR3DS1 con la ausenciade correlación positiva entre los linfocitos T CD8+ CD38+ y los nive-les de VIH-1 RNA en plasma. Hemos analizado la prevalencia del ale-lo KIR3DS1 en una cohorte de pacientes con infección VIH-1 crónicaasintomática y su asociación con los linfocitos T CD8+ CD38+ y la vire-mia plasmática.

Materiales y métodos: Analizamos retrospectivamente el geno-tipo KIR3DS1/KIR3DL1 mediante PCR-SSP en la cohorte de 185individuos incluida en el ensayo clínico STIR-2102. En 37 pacien-tes de la cohorte se cuantificó el VIH-1 RNA pre-ART, las subpobla-ciones T CD4+ y T CD8+ y la expresión del marcador de activaciónCD38. En las comparaciones de grupos se utilizó el test no para-métrico de Mann-Whitney y para el análisis de correlación el coe-ficiente de Spearman.

Resultados. En los 185 individuos genotipados 82 fueron posi-tivos para KIR3DS1 (44,3%). En el subgrupo de 37 pacientes, 19fueron positivos para KIR3DS1 y 18 negativos para KIR3DS1. Enlos individuos portadores del alelo KIR3DS1 no se observó corre-lación entre la viremia VIH-1 RNA y el % de linfocitos T CD8+

CD38+ (Coeficiente de Correlación de Spearman r= 0,284; p = 0,254).Sin embargo, en los pacientes que carecían del alelo KIR3DS1 seobservó una correlación positiva entre la viremia plasmática VIH-1 RNA y el % de células T CD8+ CD38+ activadas (r= 0,503; p =0,028).

Conclusión. En pacientes naïve con infección VIH-1 crónica asin-tomática la presencia del receptor activador KIR3DS1 se asoció a laausencia de correlación entre el % de linfocitos T CD8+ CD38+ activa-dos y los niveles de la viremia plasmática VIH-1 RNA. Estos datos con-firman el potencial papel del receptor activador KIR3DS1 en los meca-nismos inmunológicos frente al VIH-1.

P-071ESTUDIO DEL POLIMORFISMO TER99GLN DEL GEN QUECODIFICA LA QUIMIOCINA CXCL10 EN UNA COHORTE DE 135PACIENTES ASINTOMÁTICOS CON INFECCIÓN POR EL VIH-1. C. Rodríguez-Sáinz, I. Martínez, J. Modrego, D.C. Hernández, D.Alecsandru, R. Ramos, E. Fernández-Cruz. Hospital General Universita-rio Gregorio Marañón, Madrid.

Objetivo. En la infección por el VIH-1 se ha descrito que la qui-miocina CXCL10 puede favorecer la propagación del virus debi-do a que estimula la migración de los linfocitos T activados y mono-citos hacia los órganos linfoides secundarios y a su capacidad deactivar in vitro la replicación viral. No se han descrito variantes poli-mórficas del gen CXCL10 implicadas en la infección VIH-1. El obje-tivo de este estudio es determinar la prevalencia del polimorfis-mo CXCL10 Ter99Gln (rs11 26858) y su asociación con el VIH-1 DNAintracelular en PBMC (VIH-1 DNA-PBMC).y la carga viral RNAVIH-1 plasmática (RNA VIH-1) en una cohorte de 135 individuosasintomáticos, naïve para la terapia antirretroviral (ART) con infec-ción crónica por el VIH-1 que han participado en el ensayo clínicoSTIR-2102.

Material y métodos. El polimorfismo rs11 26858 se determinóretrospectivamente en 135 pacientes mediante discriminación alélicacon PCR a tiempo real y sondas Taqman. Se analizaron también el VIH-1 DNA-PBMC y la RNA VIH-1 plasmática. Estos pacientes naïve para

la terapia antirretroviral fueron evaluados en el momento basal (basalpre-ART) y tras recibir seis semanas de ART.

Resultados. El genotipado mostró 134 individuos homocigotospara el alelo wild-type y un sólo individuo heterocigoto para el poli-morfismo Ter99Gln. La prevalencia de la heterocigosis en la cohortedel estudio es 0,7% y la prevalencia del alelo 99Gln es 0,4%. Esta pre-valencia es similar a la descrita para la población sana (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi? rs=1126858). El paciente portadorde la heterocigosis presentó la carga de DNA-PBMC mas elevada(32.560 copias/106 PBMC) en relación con la del resto de individuosVIH-1+ de la cohorte (mediana= 655 copias/106 PBMC). Después deseis semanas de ART los niveles de DNA VIH-1 del paciente heteroci-goto se mantuvieron más elevados (10.645 copias/106 ) en relación conla respuesta al tratamiento del resto de individuos de la cohorte (media-na= 560 copias/106 ).

Conclusiones. La prevalencia de la heterocigosis para el polimor-fismo rs1126858 en una cohorte de 135 individuos asintomáticos coninfección crónica VIH-1 es del 0,7%. En nuestro caso el polimorfismoTer99Gln se asoció a unos niveles intracelulares elevados de VIH-1DNA y a una pobre respuesta al tratamiento antiretroviral.

P-072REGULACIÓN DE LA MAQUINARIA TRADUCCIONAL CELU-LAR POR EL VIRUS DE LA PESTE PORCINA AFRICANA. A. Quin-tas1, A. Castelló2, E. García-Sánchez1, P. Sabina1, M. Nogal1, L. Carras-co1, Y. Revilla1. 1Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CBMSO),Madrid. 2European Molecular Biology Laboratory (EMBL).

Introducción. El Virus de la Peste Porcina Africana (VPPA) es unvirus DNA con un genoma complejo capaz de infectar distintas espe-cies de cerdo, causando una enfermedad aguda, altamente infecciosay en la mayoría de los casos, letal. La infección por VPPA se caracte-riza por la ausencia de una respuesta inmune capaz de neutralizar lainfección, lo que ha impedido el desarrollo de una vacuna conven-cional. Como parásitos intracelulares, los virus son altamente depen-dientes de la maquinaria traduccional celular para llevar a cabo la sín-tesis de sus proteínas. Durante la infección por VPPA se produce unafuerte inhibición de la síntesis de proteínas celulares, mientras que lasproteínas virales son eficientemente sintetizadas. Poco es lo que seconoce sobre los mecanismos moleculares a través de los cuales el viruscontrola la maquinaria traduccional celular.

Objetivo. Análisis del efecto de la infección de VPPA en el estadoy localización de los componentes de la maquinaria traduccional celu-lar.

Materiales y métodos. Análisis del estado funcional, la integridady activación de los factores de iniciación de la traducción medianteensayos de unión a proteína A sepharosa y Western Blot. Análisis dela localización de los mismos y otros orgánulos celulares, así comode proteínas virales mediante ensayos de microscopia confocal y micros-copia electrónica.

Resultados. A pesar de la activación de caspasa-3 producida conla infección de VPPA, los niveles del factor de iniciación eIF4G perma-necen constantes. Además, durante la infección los factores de inicia-ción eIF4G y eIF4E son fosforilados en los residuos Ser1108 y Ser209,respectivamente; mientras que el factor de regulación de eIF4E, 4E-BPes hiperfosforilado a tiempos tempranos de la infección e hipofosfori-lado a partir de las 18 horas post-infección, lo que provoca un incre-mento de la asociación de los factores eIF4G y eIF4E para formar el

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complejo eIF4F. La infección no solo promueve la formación de eIF4F,si no que además provoca la redistribución del mismo a los sitios dereplicación viral, conocidos como factorías virales. La activación deeIF4F es esencial para infección de VPPA puesto que la depleción deeIF4G y eIF4E en células COS-7 impide la acumulación de la proteí-na mayoritaria de la cápsida viral, p72. Otros componentes del com-plejo de iniciación de la traducción, como eIF2, eIF2a y eIF3b asi comolos ribosomas también se encuentran enriquecidos en la periferia delas factorías virales. En las células infectadas la red mitocondrial seencuentra polarizada, colocalizando con los ribosomas, mientras quea tiempos tardíos de la infección se observa una disminución de losARNm polyadenilados del citoplasma y un incremento de los mismosen las factorias virales, correspondiendo probablemente a los ARNmvirales.

Conclusión. El Virus de la Peste porcina africana activa la maqui-naria de traducción celular y la distribuye alrededor de las factoríasvirales, junto con otros componentes celulares como los ribosomas ylas mitocondrias, para favorecer la síntesis de sus proteínas. Este reclu-tamiento de la maquinaria traduccional, junto con la degradación delos ARNm polyadenilados parecen formar parte del mecanismo porel cual el virus inhibe la síntesis de proteínas celulares, facilitando laproducción de las partículas virales.

SESIÓN 6: INMUNIDAD INNATA E INFLAMACIÓN

Moderadores: J.L. Rodríguez Fernández (Madrid)Francisco Sánchez Madrid (Madrid)

P-073ACTIVACIÓN SELECTIVA DE TOLL-LIKE RECEPTOR 7 (TLR7)EN PACIENTES CON POLIMIALGIA REUMÁTICA Y ARTERITISDE CÉLULAS GIGANTES. L. Alvarez-Rodríguez1, V.M. Martínez-Taboada1, C. Mata2, J. Calvo Alen2, J.I. Beares-Gomez1, M.J. Marin1,A. Fontalba1, J.L. Fernandez-Luna1, M. Aranzamendi1, J. Agüero1, M.López-Hoyos1. 1Hospital U. Marques de Valdecilla, Santander. 2HospitalSierrallana, Torrelavega.

Objetivo. Estudiar la expresión y función de los miembros de lafamilia de los Toll-like receptor (TLR) en células mononucleares circu-lantes (PBMC) de pacientes con arteritis de células gigantes (GCA) ypolimialgia reumática (PMR).

Material y métodos. Analizamos PBMC de 70 PMR, 20 GCA y24 controles sanos de la misma edad (HC). La expresión de los TLR endistintas subpoblaciones de PBMCs se determinó por citometría deflujo. La función de los TLR se estudió estimulando PBMCs con ligan-dos específicos. Estos estudios también se realizaron en un subgrupode pacientes con PMR/GCA en remisión clínica con corticosteroides(CS).

Resultados. Encontramos un aumento significativo en la expre-sión de TLR7 en células B, T y monocitos de pacientes con enferme-dad activa comparado con los HC. A pesar del aumento en la expre-sión de TLR7, los monocitos circulantes de pacientes con enferme-dad activa mostraron una respuesta in vitro disminuida (producciónde citocinas circulantes pro-inflamatorias) tras estimulación con ago-nistas específicos de TLR7. Un posible defecto genético fue descarta-do tras no encontrarse cambios en varios SNPs en el gen promotor

de TLR7, y tras demostrar una respuesta normal a los agonistas espe-cíficos en pacientes en remisión completa sin tratamiento con CS. Laestimulación de PBMCs de HC con plasma de pacientes con enferme-dad active indujo un aumento en la expresión de genes de la respues-ta mediada por interferón-INF (IFN-β, IFIT1, IRF7 y USP18) determi-nada por RT-PCR, sugiriendo que la respuesta disminuida a los ago-nistas de TLR7 podría ser secundaria a una saturación de los recep-tores por un ligando natural. Como TLR7 reconoce fundamentalmen-te virus ssRNA, intentamos identificar la presencia de varios virus res-piratorios en el plasma de los pacientes con resultados no concluyen-tes.

Conclusión. Estos datos sugieren una activación selectiva de TLR7por un ligando(s) natural(es) en pacientes con PMR y GCA. A pesarde no poder identificar el posible agente causal en el plasma de lospacientes, el aumento en la expresión de genes de la respuesta media-da por IFN-tipo I tras estimular con plasma de pacientes sugiere unaposible etiología viral en estos dos síndromes.*El presente trabajo está financiado por becas de: MSC-Instituto de Salud Carlos III(PI050475 / PI080098), IFIMAV y la Fundación Mutua Madrileña

P-074LA EDAD Y LOS NIVELES DISMINUIDOS DE VITAMINA D SEASOCIAN CON ALTERACIONES EN LA RESPUESTA INMUNEINNATA Y EN LOS NIVELES DE CITOCINAS CIRCULANTES. L.Alvarez-Rodríguez, V.M. Martínez-Taboada, J. Beares-Gomez, M.J.Marin, M. García-Unzueta, J.A. Amado, M. Gonzalez-Paz, C. SantaCruz Llata, M. López-Hoyos. Hospital U. Marques de Valdecilla, Santan-der.

Objetivo. Estudiar in vivo la influencia de la edad y los niveles devitamina D en la función de la inmunidad innata y la producción decitocinas circulantes en individuos sanos.

Material y métodos. Los niveles séricos de 25-hidroxi-vitamina D(25-(OH)-D) se midieron en 71 individuos sanos. Las citocinas circu-lantes se determinaron por CBA. Las citocinas intracelulares se deter-minaron en células CD3+ y CD14+ por citometría de flujo. La expre-sión de los TLR en diferentes subpoblaciones de PBMCs y su funcióntras estimulación con ligandos específicos se determinaron tambiénpor citometría de flujo.

Resultados. Los niveles de 25-(OH)-D disminuían con la edad (r=-0,399; p=0,001). La expresión de TLR7 en células B (r=-0,39; p=0,02), T(r=-0,35; p=0,05) y monocitos (r=-0,43; p=0,01) se correlaciono negati-vamente con los niveles de 25-(OH)-D. La respuesta in vitro de TLR7a agonistas específicos se correlacionó de forma significativa con losniveles séricos de 25-(OH)-D, especialmente en individuos controlesmayores de 60 años. La expresión de TLR5 en células T (r=-0,34; p=0,04)y TLR8 en monocitos (r=-0,37; p=0,04) también se correlaciono de for-ma negativa con la 25-(OH)-D. La expresión de TLR1 en células T(r=0,32; p=0,04) y monocitos (r=0,40; p=0,01) se correlaciono con laedad. La función de TLR2, TLR4, TLR5, TLR6 y 8 se correlacionó nega-tivamente con la edad. Los niveles de 25-(OH)-D se correlacionaronnegativamente con las citocinas pro-inflamatorias (TNF-α e IL-6) y lacitocina anti-inflamatoria IL-10. La edad se correlacionó positivamen-te con los niveles de citocinas pro-inflamatorias (TNF-α, IL-1β e IL-6), IL-10 y la citocina Th1, IL-12.

Conclusión. Los niveles séricos de 25-(OH)-D disminuyen conla edad y se acompañan de cambios en la expresión y función de deter-minados TLRs, especialmente los envueltos en respuesta viral. La edad

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y los niveles de vitamina D tienen un claro impacto en la producciónde citocinas circulantes.*El presente trabajo está financiado por becas de: MSC-Instituto de Salud Carlos III(PI050475 / PI080098) e IFIMAV.

P-075ANGIOEDEMA HEREDITARIO POR DEFICIENCIA HOMOCI-GOTA DE C1-INHIBIDOR. ESTUDIOS FUNCIONALES EN UNPACIENTE CON LA MUTACIÓN R378C REVELAN UN RESIDUOIMPORTANTE PARA LA REGULACIÓN DE LA VÍA DE LAS CINI-NAS. A. López Lera1, B. Favier2, C. Drouet3, M. López Trascasa1. 1Hos-pital Universitario La Paz. CIBERER, Madrid. 2Université J. Fourier. 3Uni-té d’Exploration de l’Angioedème, CHU Grenoble, Francia.

Objetivos. El angioedema hereditario por deficiencia de C1-inhi-bidor (HAE, OMIM#106100) es una enfermedad rara con un patrónde herencia autosómico dominante en la que se han descrito más de200 mutaciones heterocigotas distintas. Los únicos pacientes con defi-ciencia en homocigosis estudiados hasta la fecha, dos hermanos de ori-gen consanguíneo con la mutación c.1576T>G (I440S), se caracteriza-ban por desarrollar un fenotipo de enfermedad inusual, con un patrónde consumo de complemento, ausencia de C1q circulante y variabili-dad clínica (Blanch et al, JACI, 2006). En el presente trabajo, describi-mos un paciente de HAE con la mutación c.1198C>T (R378C) en homo-cigosis y profundizamos en el estudio funcional y conformacional dela proteína mutante. Así mismo, analizamos los mecanismos causan-tes del perfil de consumo de complemento que caracteriza a estospacientes homocigotos y su evolución bioquímica y clínica durante 28meses de tratamiento con andrógenos atenuados (Stanozolol).

Métodos. El perfil de complemento se caracterizó por nefelome-tría, ensayos hemolíticos especíicos e inmunodifusión radial. Las alte-raciones conformacionales del mutante R378C y su capacidad funcio-nal de unión a dos de sus proteasas diana (C1s y Kalikreína), se estu-diaron mediante ELISA y western blot en muestras de plasma frescoy sobrenadantes de células Cos-7 transfectadas de forma estable. Losniveles de expresión del gen de C1-inhibidor se analizaron por RT-qPCR y la activación del sistema ubiquitina-proteasoma se cuantificómediante ensayos de fluorescencia con el sustrato marcado LLVY-AMCen lisados de monocitos del paciente.

Resultados. La proteína R378C circula en plasma en una confor-mación parcialmente latente. El C1-inhibidor R378C tiene una capaci-dad normal de unión a C1s, pero muy disminuida frente a Kalikreína,tanto en plasma como en sobrenadantes de células Cos-7. Los nivelesde mRNA del paciente están marcadamente disminuidos en PBMCs.Los ensayos de fluorescencia demuestran una activación significativadel sistema ubiquitina-proteasoma, lo que sugiere, junto con los datosde expresión en células Cos-7, que existe un plegamiento anómalo yretención intracelular de esta proteína durante su procesamiento. Ade-más, tanto los niveles y función de C1-inhibidor, como el perfil de con-sumo de complemento, se recuperaron por completo tras 28 meses detratamiento con Stanozolol.

Conclusión. La mutación R378C en homocigosis causa un perfilde consumo de complemento similar al descrito en otros pacientes conmutaciones homocigotas. Esta sustitución induce una conformaciónparcialmente latente que reduce de forma específica la capacidad deunión a Kalikreína, lo que sugiere que la Arginina en posición 378 jue-ga un papel central en la regulación de la vía de las cininas por C1-inhibidor.

P-076ANALISIS DE SNPS DEL CLUSTER DE INTERLEUCINA-1 YENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL. R. López-Hernan-dez, D. Lucas, G. Salgado, J.A. Campillo, P. Martínez-García, H. Sala-ma, F. Boix, M. Miras, M.R. Alvarez-López, F. Carballo, M. Muro. Hos-pital Virgen de la Arrixaca, Murcia.

The interleukin-1 (IL-1) system epitomises the highly regulatedmechanism required for this to be achieved. Several related gene pro-ducts interact with each other to adjust the response according tocellular requirements. IL-1 signalling via the IL-1 receptor type I (IL-1RI) is an important pathway in the inflammatory process, innateimmunity and the immune response. IL-1 is a potent proinflamma-tory cytokine involved in the pathophysiology of several inflam-matory and autoimmune diseases, is important for the synthesis ofacute phase proteins, and it is a pyrogen cytokine. These physiologi-cal effects are mediated at the molecular level by the activation ofJNK and p38 MAP kinases, and consequent up-regulation of genesvia the transcription factors NF-kB, AP-1 and C/EBPb. However, therelationship of these gene cluster polymorphisms with the immuneresponse in inflammatory bowel disease (IBD) patients has not beenexplored. Thus, the aim of this study was to determine the relations-hip between IL-1 gene cluster polymorphism and the differential IBDpathologies in a Spanish population. In this case–control study, weevaluated 84 patients with IBD and 154 healthy subjects. The follo-wing polymorphisms were determined by luminex assay by PCR-SSOP technique: IL-1alpha (-889C/T), IL-1beta (-511C/T and+3962C/T) (rs1143634 and rs1143633), IL-1R (Pst-1 1970C/T) and IL-1RA (Mspa-1 11100C/T). Furthermore, the genotypes were correla-ted with IBD, Crohn disease and Ulcerative Colitis pathologies. Wheninvestigating each polymorphism separately and in conjunction, nostatistical differences in the IL-1 gene cluster genotype and allele dis-tributions between the diagnosis groups and controls were found. Inconclusion, IL-1 gene cluster polymorphisms do not seem to be asso-ciated with IBD pathologies.

P-077PAPEL DE LOS FACTORES DEPENDIENTES DEL HUÉSPED(GENES HLA Y KIR) EN LA EVOLUCIÓN DE LA ENFERMEDADPOR CMV EN PACIENTES TRASPLANTADOS DE ÓRGANOSÓLIDO. D.M. Valero Hervas, M. Castillo Rama, R. San Juan Garri-do, F. López Medrano, J.C. Meneu, J. Delgado, J.M. Morales, P. Mora-les Pérez, M.J. Castro Panete, J.M. Aguado, E. Paz Artal. Hospital Uni-versitario 12 De Octubre, Madrid.

Objetivos. La infección por Citomegalovirus (CMV) es una de lasprincipales complicaciones tras el trasplante de órgano sólido (TOS)incrementando la morbilidad y mortalidad y favoreciendo mayorespérdidas de injerto. Dado que la inmunosupresión actual está dirigi-da a eliminar las células T efectoras la principal línea de defensa que-da limitada a las células Natural Killer (NK) a través de sus recepto-res de superficie. Los principales receptores implicados son los Killer-like Immunooglobulin Receptors (KIR) que a través de la interaccióncon sus ligandos innatos, las moléculas HLA (C, B y A), mediarán lacitolisis de las células infectadas.

El objetivo de éste trabajo ha sido establecer la influencia de losfactores genéticos dependientes del huésped, HLA y KIR, en la predis-posición al desarrollo de infección o enfermedad por CMV, así como

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buscar posibles relaciones entre éstos factores y el desarrollo de com-plicaciones post- trasplante.

Materiales y métodos. Se incluyeron 138 receptores de órgano sóli-do (79 renales, 42 hepáticos y 17 cardiacos) trasplantados en nuestrocentro entre Marzo 2003 y Diciembre 2004. Se cuantificó la antigene-mia CMV mediante PCR a tiempo real (Light Cycler). El perfil genéti-co para HLA-C se obtuvo por Dot Blot Reverso (Innogenetics), mien-tras que el tipaje de HLA –A y –B se determinó mediante placas comer-ciales con anticuerpos anti-HLA monoclonales (One Lambda). Final-mente, los haplotipos KIR se determinaron mediante técnicas de PCR-SSP (Invitrogen). Los resultados fueron analizados por el softwareinformático SPSS v.12.

Resultados. No se observaron diferencias en el desarrollo de enfer-medad e infección por CMV cuando se compararon los haplotipos KIR,aunque se observó mayor tendencia de enfermedad en aquellos conBx frente a los que presentaron AA. Tampoco se observaron diferen-cias en la comparación por número de receptores KIR totales, activa-dores e inhibidores.

Los diferentes perfiles genéticos no ejercieron ningún efecto enla infección por CMV, sin embargo en el caso de enfermedad los pacien-tes con homocigosis para C1 presentaban mayor tendencia a presen-tarla con respecto a los homocigotos para C2. Se observo una rela-ción estadísticamente significativa entre la presencia de alelos seroló-gicos Bw4 y el desarrollo de enfermedad por CMV (OR=7.98; p= 0.05).

El análisis en función del número de interacciones de cada pacien-te entre su dotación de receptores KIR y de sus ligandos HLA-A, -B y–C no reveló ninguna asociación significativa en el desarrollo de infec-ción o enfermedad.

Por último, en trasplante hepático se observó en el límite de la sig-nificación estadística, que un mayor número de receptores KIR totales(p=0,052) y receptores KIR activadores (p=0,054) ejercían una fun-ción protectora frente al desarrollo de enfermedad frente a CMV.

Conclusiones. La influencia en TOS de los sistemas HLA y KIRestá por determinar. Aunque no parecen ejercer de forma global unpapel protector, en el caso del trasplante hepático los resultados delestudio indican que si podría proteger frente a la enfermedad. Ade-más el alelo Bw4 podría considerarse como factor de predisposición aenfermedad por CMV en éste tipo de pacientes.

P-078IDENTIFICACION DE UN ANTICUERPO MONOCLONAL CONACTIVIDAD ANTI FACTOR H EN UNA PACIENTE CON ENFER-MEDAD POR DEPOSITOS DENSOS. P. Nozal Aranda1, S. Aguerreve-re2, M. Jozsi3, P. Sánchez-Corral1, M. Ibernon4, M. López-Trascasa1. 1HospitalUniversitario La Paz, Madrid. 2Hospital Germans Trias i Pujol. Badalona. 3Leib-niz Institute for Natural Product Research and Infection Biology. Hans KnöllInstitute, Jena, Germany. 4Hospital Germans Trias i Pujol., Badalona.

Objetivos. En la enfermedad por depósitos densos (EDD) se hadescrito una incapacidad para controlar la vía alternativa del comple-mento en el plasma, que puede ser debida a la presencia de autoanti-cuerpos frente a la convertasa de C3 (C3Nef), a la ausencia o falta defunción del Factor H (FH), o a la inactivación de este regulador del sis-tema del complemento por anticuerpos. Esta última causa sólo ha sidodescrita una vez en un paciente con glomerulonefritis membranopro-liferativa tipo II. Aquí describimos la presencia de un autoanticuerpoanti-FH en una paciente diagnosticada de EDD con una gammapatíamonoclonal.

Material y métodos. En el suero de la paciente se analizaron losniveles de inmunoglobulinas, factores del complemento (C3, C4, FH,FI) y la presencia de anticuerpos frente a ellos mediante nefelometríay técnicas de ELISA. Posteriormente se purificó su IgG mediante cro-matografía de afinidad en columnas de Proteína G- Sepharosa. Por últi-mo se determinó la especificidad del anticuerpo y se caracterizó median-te técnicas de ELISA y Western Blot.

Resultados. La paciente presentaba un perfil de complementocompatible con una activación de la vía alternativa, presentando al ini-cio cifras bajas de C3 (54 mg/dl) y normales de C4, con C3Nef negati-vo. Entre los hallazgos serológicos destacaban un FH muy bajo (2.7mg/dl) y la presencia de una paraproteína monoclonal IgG-lambda.Mediante ELISA se detectó la presencia de anticuerpos anti-FH, queresultaron estar mediados por la fracción IgG-lambda y que parecenreconocer la región N-terminal de la molécula (SCRs 1-7). Se detectótambién que esta IgG además tiene actividad antiplasminógeno.

Conclusiones. En esta paciente, la incapacidad para controlar laactivación del complemento se ve favorecida por la existencia de anti-cuerpos anti-FH, que parecen reconocer la región con actividad regu-ladora de esta molécula, impidiendo su función, lo que acaba provo-cando la aparición de la glomerulopatía de la EDD.

Los anticuerpos anti-FH han sido descritos en otras patologías,como en el Síndrome Hemolítico Urémico atípico, en cuyo caso estándirigidos contra el extremo C-terminal de la proteína lo que podría jus-tificar la asociación de este anticuerpo a la EDD en esta paciente.

Existe además una actividad antiplasminógeno en la fracción IgGde la paciente, cuya aparición podría estar relacionada con los anti-FH,ya que numerosos patógenos poseen en su superficie proteínas queunen ambas moléculas para evadir su eliminación por el sistema delcomplemento en la respuesta inmune innata.

P-079ANALYSIS OF LONG PENTRAXIN 3 AS A BIOMARKER IN PIGS.E. Crisci1, L. Fraile1, S. Valentino2, M. Simon-Grifé1, G.E. Martín-Valls1,T. Mussá1, B. Bottazzi2, A. Mantovani2, M. Montoya1. 1Centre de Recer-ca en Sanitat Animal (CReSA), UAB-IRTA, Campus de la Universitat Autò-noma de Barcelona, Barcelona. 2Istituto Clinico Humanitas, Rozzano, Italy.

Objective. The aim of our study was to investigate the possiblerole of PTX3 as a biomarker in vivo and in vitro in pigs.

Materials and methods. For in vitro study, porcine bone marrow-derived DC (poBMDC) were generated and infected with a H3N2 swineinfluenza virus (A/Swine/Spain/80598-LP1/2007).

For in vivo study, sixteen conventional pig farms with history ofpleuritis lesions and cranio-ventral lung consolidation were used. Bloodfrom 20 randomly selected pigs from each farm was collected andselected acute phase proteins were determined in serum. Haptoglobin(Hp) was quantified by a spectrophotometric method (haemoglobinbinding assay) (Tridelta Development Limited, Ireland). Pig-MAP levelswere assessed with an ELISA kit (PigCHAMP ProEuropa, Spain) andCRP was determined using a commercial immunoturbidimetric method(Olympus System Reagent, OSR 6147). Moreover, sera from 48 conventionalsows from parity one to eight showing high swine influenza virus (SIV)antibody titres were also used. PTX3 concentration in sera and culturesupernatant was determinate by sandwich ELISA against murine PTX3with the following cross-reactive antibodies: 2C3 and 6B11 (Salio et al.,2008. Circulation 117 : 1055-1064). All the statistical analysis wareperformed using SPSS 15.0 software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

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Results. The in vitro study showed that porcine myeloid bonemarrow-derived DC produced PTX3 after infection with porcineinfluenza virus H3N2.

The in vivo results have shown that PTX3 serum levels did notcorrelate neither with Hp, CRP or Pig-MAP nor with lung lesions scorein conventional swine farms. PTX3 concentration in SIV antibodypositive sera of studied sows increased with the parity number showingstatistical tendency between the youngest and the oldest sows (p=0.07).Moreover, there was no statistical correlation between SIV antibodytitres and PTX3 amount in serum.

Conclusions. The present study has shown PTX3 in vitro productionin porcine myeloid DC after SIV infection.

In vivo results have shown that PTX3 is not a good biomarker forchronic lung lesion status in swine farms when compared with Hp andPig-MAP. However, PTX3 concentration in SIV antibody positive seracorrelated with a greater exposure to infections, indicating that PTX3might be used as a biomarker under certain conditions. *This is the first analysis of PTX3 role in pigs but future studies will further characterizeits possible implication in pathogenesis.

P-080INFLUENCIA DE LA VARIABLIDAD GENÉTICA DE LAS PRO-TEINAS SURFACTANTES A1, A2 Y D EN LA SUSCEPTIBILIDADY GRAVEDAD DE LA NEUMONÍA EN ADULTOS. E. HerreraRamos1, M.I. García Laorden1, F. Rodríguez De Castro1, J. Solé Vio-lán1, O. Rajas Naranjo2, N. González Quevedo1, Y. Florido Ortega1,I. Sologuren Marrero1, A.R. Domínguez Acosta1, J.A. Marcos Y Ramos3,J.C. Rodríguez Gallego1. 1Hospital Universitario de Gran Canaria Doc-tor, Las Palmas de Gran Canaria. 2Hospital Universitario de la Princesa,Madrid. 3Hospital Doctor Jose Molina Orosa, Lanzarote

La neumonía es la primera causa de mortalidad por enfermedadinfecciosa en países desarrollados. Además de las inmunodeficienciasprimarias, variantes genéticas en otros genes con menor penetranciapueden variar la susceptibilidad y gravedad de la enfermedad conherencia compleja. En pulmón sano, la inmunidad innata es debidaprincipalmente a los macrófagos alveolares y a las proteínas surfac-tantes, (SP) A1, A2 y D, que actúan como opsoninas y son antiinflama-torias en ausencia de infección. Los genes de estas colectinas (SFTPA1,SFTPA2 y SFTPD) están organizados en un cluster en 10q21-24. Losratones deficientes en SP-A y SP-D son muy susceptibles a la infecciónrespiratoria.

Objetivos. Evaluar la asociación de SNPs no sinónimos y los haplo-tipos SFTPA1 (6An), SFTPA2 (1An) y SFTPD con la susceptibilidad ygravedad de la neumonía adquirida en la comunidad (NAC). Evaluarel desequilibrio de ligamiento (LD). Evaluar el efecto de las variantesen niveles de SP-A y SP-D.

Materiales y métodos. Se analizaron SNPs no sinónimos deSFTPA1, SFTPA2 y SFTPD (por SSP-PCR y RFLP) en 682 pacientes adul-tos con NAC y en 789 controles. Se infirieron haplotipos y se calculóel LD. Se estudió el efecto de la variabilidad genética en los nivelesséricos de SP-A y SP-D.

Resultados. El alelo SFTPD aa11-C se asoció con niveles séricosmás bajos de SP-D. No se observó asociación del genotipo con los nive-les totales de SP-A. Tras correción de Bonferroni, los haplotipos SFTPA16A2 (OR=0,78; p=0,0009), SFTPA2 1A0 (OR=0,79; p=0,0017), SFTPA1-SFTPA2 6A2-1A0 (OR=0,77; p=0,0005) y SFTPD- aa11-C-(6A2-1A0)(OR=0,65; P=0,00001) se asociaron a un efecto protector frente a NAC,

mientras que SFTPA2 1A10 (OR=6,58; p=0,00007) y SFTPA1-SFTPA26A3-1A (OR=3,92; p=0,00065) predisponen a NAC.

Los haplotipos 1A10 y 6A-1A se asociaron con mayor mortalidad(a los 28 y 90 días), y con fracaso multiorgánico (FMO) y síndromede distrés respiratorio agudo (SDRA) respectivamente. SFTPD aa11-Cse asoció con el desarrollo de FMO y SDRA.

Conclusión. Este es el primer estudio de variabilidad de SP-A1,A2 y D en neumonía. Algunas variantes genéticas de SFTPA1, SFTPA2y SFTPD se asocian significativamente con la susceptibilidad y la gra-vedad de la NAC.

P-081UNA DIETA MUY BAJA EN CALORÍAS ANTES DE LA CIRUGÍABARIÁTRICA PUEDE MEJORAR LOS PARÁMETROS INFLAMA-TORIOS Y LA RESISTENCIA A INSULINA UNA DIETA MUYBAJA EN CALORÍAS ANTES DE LA CIRUGÍA BARIÁTRICA PUE-DE MEJORAR LOS PARÁMETROS INFLAMATORIOS Y LARESISTENCIA A INSULINA. S. Calleja Antolín, R. Díez Rodríguez,M. Ballesteros Pomar, A. Calleja Fernández, N. Aller, M. Sánchez Sala-zar, O. Del Árbol Del Árbol, C. Cuellas, J.L. Olcoz Goñi, A.I. De Cas-tro Rodríguez, J.M. García Ruiz. Hospital de León, León.

Objetivos. Evaluar la influencia de una dieta muy baja en calorí-as en pacientes obesos que van ser sometidos a cirugía bariátrica, sobrediversos parámetros inflamatorios que han sido involucrados en eldesarrollo del síndrome metabólico de resistencia a insulina.

Material y métodos. Se incluyó prospectivamente a 45 pacientesen espera de cirugía bariátrica. Todos fueron sometridos a una dietamuy baja en calorías durante seis semanas antes de la cirugía. Se estu-diaron antes y después de la dieta los siguientes parámetros: peso,HOMA, circunferencia en la cintura, CRP, IL1b, IL6, IL8, IL10, IL12,TNF-α, MCP 1, IP10, Resistina y Leptina (CBA Becton Dickinson, ELI-SA R&D).

Las variables cuantitativas fueron comparadas por el test de T-Stu-dent para muestras pareadas.

Resultados. La media de eda fue de 44 años (des viación estándar:10,3), el 78% de los sujetos fueron mujeres.

La tabla 1 muestra los cambios estadísticamente significativos trasla dieta muy baja en calorías (VLCD). No se encontró significaciónen los valores de IL1b, IL6, IL8, IL10, IL12, TNF-α, y resistina.

Conclusión. Una dieta muy baja en calorías antes de la cirugíabariátrica puede ser útil para modificar algunos parámetros inflama-torios, pudiendo mejorar la Resistencia a la insulina. Los efectos a lar-go plazo de la dieta muy baja en calorías, sumada a la cirugía bariátri-ca deben ser evaluados en posteriores estudios.

Tabla 1. (p<0,05)

Antes VLCD Después VLCD

Peso (kg) 121,8 (16,8) 113 (16,6)BMI (kg/m2) 46 (5) 42,6(4,58)P. cintura (cm) 130, 3 (13) 123,7 (11,9)HOMA 6,1 (3,9) 3,9 (4,2)MCP 1 (pg/ml) 437,4 (411) 1172 (966,53)IP10 (pg/ml) 1324,2 (824,6) 356,7 (259,4)Leptina (pg/ml) 79453,6 (48509,8) 50796,1 (37506,2)CRP 10,4 (9,1) 7,9 (6,6)

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P-082ANÁLISIS DE CÉLULAS EPITELIALES Y LINFOCITOS INTRAE-PITELIALES EN PACIENTES CON SÍNDROME DE OJO SECO. R.Reinoso1, M. Calonge1, E. Castellanos1, M. Martino1, I. Fernández1, A.Corell2. 1IOBA-Universidad de Valladolid, Valladolid. 2Universidad de Valla-dolid, Valladolid.

Objetivo. Caracterizar fenotípica y funcionalmente células epi-teliales conjuntivales y linfocitos intraepiteliales obtenidos mediantetécnicas mínimamente invasivas en pacientes con síndrome de ojo seco.

Material y métodos. Las células conjuntivales fueron obtenidasmediante citología por cepillado en 23 pacientes diagnosticados de ojoseco de tipo evaporativo. La recolección de las células de la superfi-cie ocular fue realizada antes y después de que los pacientes fueransometidos durante dos meses a un tratamiento anti-inflamatorio tópi-co. Además, se analizaron 17 individuos sanos para realizar el análi-sis comparativo con la población enferma. Se realizaron diferentes ensa-yos mediante citometría de flujo para determinar el fenotipo de lascélulas epiteliales y los subtipos de linfocitos intraepiteliales (IELs) pre-sentes, la viabilidad y/o etapa apoptótica y el ciclo celular de las mues-tras obtenidas.

Resultados. La viabilidad celular del epitelio conjuntival fue nota-blemente inferior en los pacientes de ojo seco que en los individuossanos. Además, se observó un descenso significativo de IELs CD4+ yde la proporción CD4/CD8 en los pacientes de ojo seco después deltratamiento anti-inflamatorio. La capacidad proliferativa del epitelioconjuntival fue significativamente menor en los pacientes de ojo secoque en los sujetos sanos.

Conclusiones. Las células epiteliales conjuntivales obtenidasmediante citología por cepillado de pacientes de ojo seco de tipo eva-porativo presentan diferente viabilidad, apoptosis y capacidad proli-ferativa que las obtenidas de sujetos sanos. Después de 2 meses de tra-tamiento, las células CD8+ incrementaron mientras que las célulasCD4+ y la proporción CD4/CD8 disminuyeron, demostrando la natu-raleza inflamatoria de esta patología ocular.

P-083ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DE SLAMF8 EN MACRÓFAGOSHUMANOS Y DE RATÓN. L. Calvache, D. Rojas, M. Alemán, F. Aba-día-Molina, A.C. Abadía-Molina. Universidad de Granada, Armilla.

Objetivo. Las moléculas de la familia de SLAM (signalinglymphocyte activation molecule, SLAM) consiste en nueve miembros,SLAMf1-9, que se vienen describiendo como moléculas de adhesióncon un papel fundamental en la modulación de la respuesta inmuni-taria específica e innata. SLAMf8 es uno de los miembros de la fami-lia descrito más recientemente y que se expresa principalmente en leu-cocitos humanos. Previamente, se ha observado que la expresión deSlAMf8 aumenta en células mononucleares humanas CD14+ con INFγy disminuye tras ser estimuladas con LPS. Nosotros hemos queridoanalizar la expresión de SLAMf8, en células humanas y macrófagos deratón con distintos estímulos, con objeto de determinar si se repite eneste patrón.

Métodos. Distintas líneas celulares humanas y de ratón han sidoestimuladas con bacteria, LPS y PMA. La Expresión de BLAME ha sidoanalizada mediante RT-PCR y mediante anticuerpos monoclonales.También analizamos la expresión de SLAMf8 en distintos tejidos deratón mediante RT-PCR.

Resultados. De acuerdo con lo descrito previamente por Kings-bury et al, (2001) hemos observado que SLAMf8 se expresa en mono-citos y macrófagos humanos cuando estos son estimulados con INFγ,aunque al contrario que éstos vemos que la expresión de SLAMf8también aumenta una vez son estimulados con LPS o PMA. De acuer-do con lo observado en humanos, en líneas monocíticas de ratón ymacrófagos derivados de peritoneo la expresión también aumentacuando son estimulados, tanto con bacteria como en presencia de LPSo PMA.

Conclusión. Estos resultados indican que la expresión de SLAMf8varía en función del estado de activación o reposo del macrófago, ysugiere por tanto que este receptor tiene una función relevante en lasfunciones inmunitarias de los macrófagos, tanto en células humanascomo de ratón.

P-084MOUSE S5D-SRCRB, A NEW MULTIFUNCTIONAL RECEPTORINTERACTING WITH MICROBIAL AND ENDOGENOUS STURC-TURES. C. Miró Julià1, S. Roselló2, D.F. Rosenbek Finkfink3, C. Esco-da Ferran1, C. Vázquez-Echeverría4, C. Pujades4, A. García-Pardo5,C. Serra-Pagès2, U. Holmskov3, J. Yélamos6, F. Lozano2. 1Fundació Clí-nic per a la Recerca Biomèdica, cardedeu. 2Hospital clínic de Barcelona,, Spain.3Institute of Molecular Medicine, Denmark. 4Departament de Ciències Expe-rimentals i de la Salut. 5Centro de Investigaciones Biológicas (CIB-CSIC).6Hospital del Mar, Barcelona.

The members of the Scavenger Receptor Cysteine-Rich Superfamily(SRCR-SF) are transmembrane and/or secreted proteins exhibiting oneor several repeats of a well-defined and conserved cysteine-rich proteinmodule of ~100-110 aa, named SRCR. Two types of SRCR domains(A or B) have been reported, which exhibit similar core structure butdiffer in the number of exons coding for each domain and the numberof intradomain cysteines. Although no unifying function has beenreported for the SRCR-SF members, recognition of pathogen-associatedmolecular patterns has been recently shown for some of them. A newmember of the group B of SRCR-SF, mouse S5D-SRCRB (soluble 5domains of SRCR type B), has been structural and functional characterized.The gene encodes a mature protein with a predicted Mr of 144.6 kDa,and encompassing 5 group B SRCR domains (interspersed by Pro-Ser-Thr-rich sequences) and 1 Syndecan-like C-terminal region. Using anepisomal mammalian expression system (pCEPPu/HEK293-EBNA),a N- and O-glycosylated soluble recombinant form of >200 kDa, wasobtained and used as immunogen for the generation of specific ratmAbs. Subsequent immunohistochemical and real-time RT-PCR analysesshowed significant S5D-SRCRB expression in genitourinary and digestivetract. Interestingly, s5d-srcrb mRNA was detected in placodes (athickening structure in the embryonic epithelial layer where someorgans or structure later develops) at 9 dpc (days post coitum). Additionally,S5D-SRCRB was found to bind to some extracellular matrix components(Fibronectin, Laminin) and Galectin-1, a lectin-type sugar-bindingprotein. On the other hand, S5D-SRCRB was also shown to bind tostructural components on the surface of several fungi (β-glucans), andGram-negative (LPS) and Gram-positive bacteria (peptidoglycan), andto induce fungal and bacterial aggregation as well. The binding abilitiestogether with a restricted tissue expression pattern in adults and embryossuggest S5D-SRCRB might subserve different functions related to innatedefence and homeostasis of epithelial surfaces, as well as differentiationand developmental processes.

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P-085ESTUDIO SECUENCIAL DE LOS MACRÓFAGOS PULMONARESEN LA IBR Y SU IMPLICACIÓN EN LA PATOGENIA DE LAENFERMEDAD. M.Á. Risalde Moya1, V. Molina Hernández1, M. Pedre-ra Mazarro1, P.J. Sánchez Cordón1, A. Moreno Parra2, J.C. Gómez Villa-mandos2. 1Universidad de Córdoba, Córdoba. 2Laboratorios HIPRA.

El herpesvirus bovino tipo-1.1 (HVB-1.1) es el agente causal dela rinotraqueitis infecciosa bovina (IBR), una de las enfermedades víri-cas de mayor incidencia a nivel mundial en el ganado bovino, oca-sionando elevados costes de producción en esta especie. La infeccióncon este virus afecta sobre todo al tracto respiratorio superior, siendola implicación directa del HVB-1.1 en las lesiones pulmonares objetode discrepancia. Así, el objetivo de este trabajo fue determinar los cam-bios cuantitativos y biosintéticos que se producen en los macrófagospulmonares de animales inoculados experimentalmente con HVB-1.1.

Para ello, 8 terneros fueron inoculados intranasalmente con la cepaIowa del HVB-1.1 y sacrificados en grupos de dos a los 2, 4, 7 y 14 díaspost-inoculación (dpi). Asimismo, 2 animales control se inocularon conmedio estéril y se sacrificaron al final del experimento. Las muestrasde pulmón fueron procesadas de forma rutinaria para su estudio his-topatológico e inmunohistoquímico (MAC387, TNFα e IL-1α).

Las lesiones histopatológicas observadas en el pulmón de los ani-males inoculados con HVB-1.1, se caracterizaron por la presencia deintensos cambios vasculares como congestión, edema o hemorragias,así como por el engrosamiento de los septos interalveolares y la apa-rición de un infiltrado de tipo mixto desde el inicio de la experiencia.

El estudio inmunohistoquímico reveló un incremento en el núme-ro de macrófagos pulmonares alveolares desde el inicio del proceso,población que actúa como primera línea de defensa frente a patógenosaerógenos. Este incremento se vio acompañado de una mayor expresiónde IL-1α por parte de las distintas poblaciones de macrófagos pulmo-nares, que podría tener un efecto sinérgico con la expresión de TNFα.

Así, los cambios inflamatorios observados en este órgano ocurri-rían como resultado de la expresión de citoquinas proinflamtorias porlos macrófagos pulmonares, dando lugar a un incremento de la per-meabilidad vascular y adhesión de las células inflamatorias que migranpor quimiotaxis al pulmón. Este hecho podría ser importante para larápida instauración de una protección local en estadios tempranosde la infección, previniendo así la colonización de este órgano por elvirus. Además, el papel que los niveles de citoquinas proinflamatoriasexpresadas localmente pueden jugar en la respuesta de fase aguda sis-témica debe ser estudiado en trabajos posteriores.*Este trabajo ha sido financiado por la Junta de Andalucía a través del proyecto de Exce-lencia PO9-AGR-4671.

P-086EVALUATION OF ANTINUCLEAR RO/SS-A AND LA/SS-B ANTI-BODIES BY MULTIPLEX TECHNOLOGY AT THE UNIVERSITYHOSPITAL "12 DE OCTUBRE" (MADRID-SPAIN). M. Talise Astier,V. Pérez Aradas, S. Lermo, M. Sevilla, E. Pérez Aradas, L. Borque, A.Serrano. Hospital Universitario 12 de Octubre, Madrid.

Introduction. Autoantibodies to Ro/SS-A and La/SS-Bribonucleoproteins are found in autoimmune diseases such as primarySjögren´s syndrome, systemic lupus erythematousus and rheumatoidarthritis1. Two types of anti-Ro/SSA antibodies have been described,anti-SSA-52 kDa and anti-SSA-60kDa, historically, these autoantibodies

were considered as a uniform autoantibody-system. However, recentstudies provided evidence that Ro60 and Ro52 are not part of a stablemacromolecular complex and that anti-Ro52 and anti-Ro60 (SS-A)antibodies have different clinical associations and each specific todifferent antigens2, for this reason it is necessary to be able to individuallyidentify these antibodies in the laboratory of autoimmunity and theautomated system Bioplex TM 2200 offers this advantage; we comparethis technique with the immunofluorescence (IIF) and AtheNA Multi-lyte® ANA test system a multiplex fluorescent microsphere immunoassayfor the semi-quantitative of Ig G class antibody to 9 separate analytes(DNA, SSA, SSB, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, Centromere B, and Histone).

Methodology. We studied sera from 600 patients randomly admittedto the autoimmunity section during May and June 2009. Antinuclearantibodies (ANA´s ) were determined by immunofluorescence (IIF) onHEp-2 cell, Athena-Luminex, a multiplex technique that detects 9different antibodies simultaneously and BioPlex™2200 (by Bio-RadLaboratories, Hercules, CA) a fully automated Luminex-based systemdeveloped for analysis of 13 antibodies including anti-SSA-52 kDa andanti-SSA-60 kDa in a primary tube and SS-B, Sm, Sm/RNP, RNPA,RNP-68, Scl70, Centromere-B, dsDNA, chromatin, Jo1, ribosomal P.

Results. 33 sera were positive to anti-SSA-52; 42 anti-SSA-60,and 17 anti-La/SS-B by Bioplex 2200; 37 sera were positive to anti SS-A and 11 anti-La/SS-B by Athena-Luminex, with a global concordanceof 96.5% and 98.33% respectively; by IIF we obtained 48 positivesera, 25 (52.08%) with coarse and fine speckled pattern, 18 (37.50%)homogeneous, 2 (4.20%) Centromere-B, 2 (4,20%) Nuclear dots. Finally,80.70% of the patients had at least one diagnosis of autoimmune disease.

Conclusions. We conclude that BioPlex2200 offers a good percentageof concordance with other methods, and can be a good solution as amultiplex approach to diagnose autoimmune diseases like Sjögren´ssyndrome, systemic lupus erythematousus and rheumatoid arthritisbecause the separation of Ro / SSA 52 and 60 antigens conferredincreased sensitivity.

SESIÓN 7: CÉLULAS DENTRÍTICAS

Moderadores: Alberto Varas (Madrid)David Sancho (Madrid)

P-087EFECTO DE WNT5A SOBRE LA DIFERENCIACIÓN DE LASCÉLULAS DENDRÍTICAS CONVENCIONALES DERIVADAS DEPROGENITORES CD34+ DE SANGRE DE CORDÓN UMBILICAL.J. Valencia Mahón1, V. García Martínez1, L. Hidalgo Lumbreras1, A.Entrena Martínez1, A. González Zapata2, C. Henández López1, A. Vicen-te López1, A. Varas Fajardo1, R. Sacedón Ayuso1. 1Facultad de Medici-na, UCM, Madrid. 2Facultad de Biología, UCM.

Objetivos. La familia de proteínas de secreción Wnt ha sido impli-cada en diversos fenómenos biológicos relacionados con el desarro-llo y la diferenciación, tales como la determinación de los diferentesdestinos celulares, la proliferación de células progenitoras, el estable-cimiento del eje dorsal y el control de la división celular asimétrica.Diferentes trabajos muestran como los ligandos Wnt participan en elmantenimiento de los precursores hematopoyéticos humanos regulan-do su diferenciación, expansión y supervivencia. En el presente estu-

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dio analizamos el efecto de Wnt5a, ligando Wnt no-canónico, sobre ladiferenciación de las células dendríticas convencionales (cDC) huma-nas producidas a partir de progenitores CD34+ procedentes de sangrede cordón umbilical (CBCD34+).

Material y métodos. Los progenitores CBCD34+ fueron obtenidosmediante selección positiva por separación inmunomagnética y utili-zados para el establecimiento de cultivos en suspensión dirigidos a laproducción de cDC (8 días en presencia de SCF, FLT3L y GMCSF segui-dos de un periodo de 4 días en presencia de GM-CSF e IL-4), a los quese adicionó o no la proteína Wnt5a. Los intermedios de diferenciaciónCD34-CD1a- CD14- y CD14+ CD1a- fueron aislados a partir de estoscultivos mediante sorting. El fenotipo y supervivencia de las célulasrecuperadas fueron analizados por citometría de flujo.

Resultados y conclusiones. La adición de Wnt5a a los cultivos deprogenitores CBCD34+ reduce significativamente el número de cDCs(CD14-CD1a+HLA-DR+CD11c+) recuperadas produciéndose, por elcontrario, un número mayor de células CD14+CD1a- que, tras la adi-ción de IL-4, no diferencian a células CD14-CD1a+. Es más, las cDCsrecuperadas a partir de los cultivos tratados con Wnt5a muestran impor-tantes cambios en los niveles de expresión de moléculas coestimula-doras, esenciales para la función de las cDCs. Estos resultados sugie-ren que Wnt5a ejerce un efecto negativo sobre la diferenciación delos progenitores CBCD34+ hacia cDCs.

P-088EFECTO DE LA COMBINACIÓN DE ÁCIDO RETINOICO Y VITA-MINA D3 EN LA FUNCIÓN DE CÉLULAS DENDRÍTICAS DERI-VADAS DE MONOCITOS. I. Luque Llarena1, R. Atencia Arruti1, N.Maruri Machado1, Á. Prada Iñurrategi2, A. Arrieta Gutiérrez1, M. RiñónMartínez-Gallo1, S. Larrucea Bilbao1. 1Hospital de Cruces, Barakaldo, Bil-bao. 2Hospital Donostia, San Sebastian.

Objetivos. Obtener células dendríticas (DCs) inmaduras tolero-génicas a partir de monocitos de sangre periférica para aplicarlas altratamiento de enfermedades autoinmunes y al rechazo de los tras-plantes. Una las estrategias para promover la tolerogenicidad de lascélulas es el uso de fármacos que suprimen la maduración de las DCs.Hemos valorado el efecto potenciador del ácido 9-cis retinoico (9cRA),uno de los metabolitos activos de la vitamina A, cuando se combinacon 1,25-dihidroxivitamina D3 (1,25(OH)2-D3), el metabolito activo dela vitamina D3.

Metodología. Obtención de DCs: las células mononucleares desangre periférica se obtuvieron mediante centrifugación en gradientede Ficoll. Posteriormente se aislaron los monocitos mediante selecciónnegativa y se derivaron a DCs en cultivo con interleucina 4 y factorestimulante de colonias de granulocitos y macrófagos durante 7 díasen presencia o ausencia de las hormonas analizadas. Finalmente seindujo la maduración de las DCs con factor de necrosis tumoral, inter-leucina 1 beta, interleucina 6 y prostaglandina E2 durante 48 h.

Fagocitosis. Las DCs se incubaron con dextrano marcado con iso-tiocianato de fluoresceína y se analizaron por citometría de flujo.

Adhesión. las células adheridas a placa se fotografiaron median-te un microscopio óptico invertido.

Cuantificación de IL-10. se realizó en los sobrenadantes de los cul-tivos de las células mediante ELISA.

Resultados. La capacidad fagocítica de las DCs tratadas con 1,25(OH)2-D3 se potencia por la adición de 9cRA. La combinación de ambas hormo-nas aumenta sinérgicamente la extensión y adhesión a placa de las DCs.

Se observa un aumento de la producción de interleucina 10 en las DCstratadas con 1,25(OH)2-D3 y 9cRA con respecto a las células control.

Conclusiones. Los resultados obtenidos en este trabajo muestrancómo el 9cRA potencia el efecto tolerogénico de 1,25(OH)2-D3 en las DCsderivadas de monocitos. Por lo tanto, el uso de estos fármacos inmuno-supresores podrían modular la actividad de las DCs en el tratamiento deenfermedades autoinmunes y mejorar el rechazo en los trasplantes.

SESIÓN 8: INMUNODEFICIENCIAS I

Moderadores: Manel Juan (Barcelona)Margarita López Trascasa (Madrid)

P-089HLA-B35-CW4 AUMENTA TANTO LA TRANSMISIÓN VERTICALDEL VIH COMO SU PROGRESIÓN. A. Arnaiz-Villlena1, J. Martí-nez-Laso2, J.M. Martin-Villa2, D. Rey1, P. Gomez-Prieto1, C. Parga-Lozano1, N. Martínez-Quiles1. 1Departamento de Inmunología, Facultadde Medicina, Universidad Complutense. Centro de Transfusiones de la CAM,Madrid. 2Departamento de Inmunología, Facultad de Medicina, UniversidadComplutense, Madrid.

Objetivos. La transmisión madre-hijo durante el embarazo es unmodelo único para el estudio de correlación entre el fenotipo HLA yla susceptibilidad a la infección por VIH. Se ha estudiado dicha rela-ción en un grupo de parejas madre/hijo en la población española.

Material y métodos. Se han determinado las frecuencias de alelosHLA de clase I y clase II de 120 niños nacidos de madres infectadaspor el VIH, y de 67 madres infectadas por métodos standard. Aunquese han encontrado diferencias en la frecuencia de HLA-B35 entre madrestransmisoras y no transmisoras, el alelo fue también significativamentemás frecuente en niños infectados que en no infectados. HLA-B35 hasido considerado como un factor de riesgo para la progresión del SIDAen nacidos de madres VIH positivas. Además, se ha propuesto que si undeterminado alelo puede conferir susceptibilidad hacia, o proteccióncontra dicha progresión depende del patrón de herencia materna fren-te a la paterna, ya que el niño hereda un virus que refleja la historia delos encuentros de células T citotóxicas de la madre.

Resultados y conclusiones. Nuestros resultados en la transmi-sión vertical del HIV combinan por vez primera las teorías de “la des-ventaja HLA-B35” y “patrón de herencia” y además sitúan el factor desusceptibilidad HLA en el haplotipo B35-CW4-DR4 mas cerca del locusHLA-DRB1 que del locus HLA-C.

P-090ESTUDIO GENÉTICO DE UNA FAMILIA CON AGAMMAGLO-BULINEMIA LIGADA AL CROMOSOMA X Y EXPRESIÓN POSI-TIVA DE BTK. APLICACIÓN AL DIAGNÓSTICO PRENATAL. C.Abad Molina1, A.J. Álvarez Márquez1, G. Pérez Pérez2, M. Navarro2,C. Guzmán Espinosa1, J.M. Lara Ruiz1, C. Morales Galán1, A. NúñezRoldán1, B. Sánchez Sánchez1. 1HHUU Virgen del Rocío, Sevilla. 2HU Vir-gen Macarena, Sevilla.

Introducción. La ausencia de expresión de btk suele ser la princi-pal causa fenotípica de la agammaglobulinemia ligada al cromoso-

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ma X, aunque en un número minoritario de casos encontramos expre-sión de btk no funcional. Es importante profundizar en el estudio delos pacientes con déficit de anticuerpos, ya que existe una base gené-tica conocida para la enfermedad y se halla ligada al cromosoma X. Eneste sentido, se pueden identificar posibles portadoras, nuevos casosen las fases iniciales así como poder ofrecer un consejo genético.

Objetivo. Establecer las bases genéticas en un paciente con expre-sión positiva de btk, ausencia de células B y agammaglobulinemia, yestudiar a su familia.

Material y Métodos. Caso índice (P1): Se estudió a un varón de23 años con cuadro clínico sugerente de enfermedad de Bruton des-de que tenía un año de edad, que presentaba infecciones de repeti-ción y niveles muy reducidos de inmunoglobulinas. Por citometríade flujo se estudiaron las subpoblaciones de linfocitos y la expresiónde btk, detectándose ausencia de linfocitos B y expresión positiva debtk. Se comenzó a secuenciar el gen btk. Posteriormente, un sobri-no del caso índice (P2) de 2 años presentaba infecciones respiratoriasde vías altas y bajas desde los primeros meses de vida. En su estudiopresentó un fenotipo idéntico al del caso índice. Secuenciamos los 19exones del gen btk, comenzando por aquellos con mutaciones des-critas en la bibliografía que conllevan a la expresión de una btk nofuncional.

Resultados. Encontramos en P1 y P2 una mutación descrita: R520Qen el exón 15 del gen btk, y establecimos el estatus de portadoras en lafamilia. Mediante el análisis por secuenciación de la mutación R520Qen el ADN extraído de las vellosidades coriónicas, encontramos dichamutación en el feto varón de la madre de P2.

Conclusión. La identificación del caso genético subyacente en elsíndrome de Bruton permite la confirmación diagnóstica en pacientessin antecedentes familiares para dicha inmunodeficiencia, permite ladetección del estado de portadora y descartar a las no portadoras, datoindispensable para realizar un consejo genético adecuado, y posibili-ta la realización de diagnostico prenatal.

P-091USO DOMICILIARIO DE GAMMAGLOBULINA INTRAVENO-SA EN PACIENTES CON DEFICIENCIA DE ANTICUERPOS. J.Carbone Campoverde, N. Del Pozo Rodríguez, C. Chean Pacheco, J.Rodríguez Molina, J. Navarro Caspistegui, C. Esteban, E. SarmientoMarchese. Hospital Gregorio Marañon, Madrid.

El uso domiciliario de gammaglobulina intravenosa (GGIV) parala terapia sustitutiva de pacientes con deficiencias de anticuerpos espráctica habitual en distintos países europeos como Suecia e Ingla-terra. En España no hay experiencia previa con la administración adomicilio de GGIV. Describimos datos inmunológicos y la prevalen-cia de reacciones adversas en una serie corta de pacientes con defi-ciencia de anticuerpos que reciben terapia con GGIV en el domici-lio.

Pacientes y Métodos. 3 pacientes (2 con hipogammaglobuline-mia IgG secundaria a LLC y neumonía recurrente y 1 con inmunode-ficiencia variable común) pasaron de recibir la GGIV en el hospital asu administración en el domicilio a petición propia. La media de IgGen el momento del diagnóstico de deficiencia de anticuerpos fue de161 (rango 35-300) mg/dl. El tiempo medio de administración de GGIVprevia en el hospital fue de 62 (rango 3-180) meses. Ninguno de lospacientes había tenido reacciones adversas moderadas o graves pre-vias. Preparado de GGIV: Concentración al 5%, líquida, pasteurizada,

no precisa mantener cadena de frío y puede almacenarse a tempera-tura ambiente. Velocidad de infusión: 0,01-0,04 ml/kg/min. Las infu-siones fueron realizadas por personal de enfermería. No se utilizaronbombas de infusión. La prescripción y dispensación del hemoderiva-do así como los controles clínicos periódicos de los pacientes se hicie-ron en el hospital.

Resultados. El tiempo de seguimiento durante la administra-ción domiciliaria de GGIV ha sido de 26 (rango 7-61) meses. Duranteel seguimiento ninguno de los pacientes experimentó reacciones adver-sas moderadas o graves. La media de concentración de IgG durante lafase domiciliaria de tratamiento fue de 716 mg/dl. De un total de 126infusiones realizadas, la prevalencia de reacción adversa fue de 1,59%:febrícula post-infusión (n=2). La periodicidad de las infusiones (cada2-3 semanas) pudo ajustarse mejor que en el hospital al no dependerde la disponibilidad de plazas en los hospitales de día. Los pacientescontinúan recibiendo sus infusiones de GGIV en el domicilio. Se haestimado un ahorro para el SNS de 12000 euros derivado de la no uti-lización del hospital de día para la administración de GGIV en estospacientes.

Conclusión. La administración de GGIV en el domicilio fue unapráctica segura en una serie corta de pacientes con deficiencia de anti-cuerpos.

SESIÓN 9: INMUNODEFICIENCIAS II

Moderadores: Nuria Matamoros (Palma de Mallorca)Jose Ramón Regueiro (Madrid)

P-092EL POLIMORFISMO C.657C>T EN EL EXÓN 3 DEL GEN CIAS1NO SE ENCUENTRA ASOCIADO A NOMID (NEONATAL-ONSETMULTISYSTEM INFLAMMATORY DISEASE). J. Reiné Gutiérrez1, A.Torrelo2, J.C. López-Robledillo2, E. Martínez Busto1, M. Muñoz-Ruíz1,B. Garcillán1, J.R. Regueiro1, D. Gurbindo2, M.J. Recio Hoyas2. 1Facul-tad de Medicina Universidad Complutense, Madrid. 2Hospital UniversitarioGregorio Marañón, Madrid.

Introducción. La enfermedad neonatal multisistémica inflamato-ria (NOMID) se caracteriza fundamentalmente por exantemas cutáne-os e inflamación articular que se manifiestan en la mayoría de los casosdurante los primeros meses de vida. La mayor parte de las mutacio-nes identificadas se encuentran en el exón 3 del gen CIAS1, que codi-fica para el dominio central de la criopirina, implicado en la regula-ción de las vías proinflamatorias, caspasa-1/IL-1b y NK-κβ. La des-regulación de estas vías da lugar al desorden inflamatorio sistémicoque presentan la mayoría de los pacientes diagnosticados.

Caso clínico. Presentamos un caso clínico de un paciente con 14años de edad diagnosticado de un posible NOMID, con una histo-ria clínica de lesiones lesiones máculo-papulosas y eritematosas, sig-nos inflamatorios en articulaciones interfalángicas y numerosos epi-sodios de poliartritis de grandes articulaciones (rodillas, manos ypies) en los primeros meses de vida. Analíticamente desde el comien-zo del cuadro clínico ha presentado anemia hemolítica hipocrómi-ca, leucocitosis y trombocitosis con reactantes de fase aguda eleva-dos. El tratamiento con AINES y corticoides no ha dado buenos resul-tados.

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Resultados. El análisis molecular realizado en el paciente, utili-zando oligonucleótidos específicos del exón 3 del gen CIAS1, revelaun cambio en heterocigosis de C>T en la posición 657 (c.657C>T), queno da lugar a cambio de aminoácido, éste no se encuentra presente enla madre ni el resto de controles estudiados. Por otro lado, el análisisde las subpoblaciones linfocitarias en el paciente, utilizando anticuer-pos monoclonales específicos, muestra una leve linfopenia TCD8+.

Conclusiones. Los resultados obtenidos sugieren que aunque elpolimorfismo c.657C>T encontrado en el exón 3 del gen CIAS1 no esresponsable de esta patología, no se puede descartar que existan muta-ciones en el resto de exones no estudiados.

P-093SÍNDROME DE GOOD: CASO CLÍNICO DE UN PACIENTE CONTIMOMA Y AUSENCIA DE LINFOCITOS B.N. Olivares Beobide1,N. Maruri Machado1, M. Riñón Martínez-Gallo1, A. Pacho De Lucas1,C. Martínez Bilbao2, C. Esteban González2, M.D. De Juan Echava-rri3, A. Arrieta Gutiérrez1. 1Hospital de Cruces, Bilbao. 2Hospital de Galdá-cano, Galdácano. 3Hospital Donostia, San Sebastián.

Objetivos. Presentar el caso de un paciente con hipogammaglo-bulinemia, pancitopenia y antecedentes de timoma intervenido, en elque se sospecha un síndrome linfoproliferativo y se diagnostica unainmunodeficiencia.

Caso clínico. Varón de 63 años, con antecedentes mórbidos desinupatía crónica y bronquiectasias. Intervenido de timoma en enerode 2009. Controlado por neumólogo por reagudizaciones infecciosasque requieren ingreso hospitalario, el último por empiema con derra-me pleural. Microbiología de líquido pleural y hemocultivos positivospara Morganella Morganii. La analítica objetivó anemia y leucopenia.El proteinograma mostró hipoalbuminemia e hipogammaglobuline-mia. Serología para VHB, VHC y VIH negativa. Tras resolución delcuadro agudo se realizó estudio inmunológico para descartar un sín-drome linfoproliferativo.

Material y métodos. Se ha realizado el inmunofenotipo de san-gre periférica (SP) y médula ósea (MO) al diagnóstico, y SP tras trata-miento sustitutivo con gammaglobulina, caracterizando las subpobla-ciones linfocitarias, incluída la exclusión de cadena ligera de los linfo-citos B. Otros estudios inmunológicos: reordenamientos JH y TCR porPCR-SSP para estudio de clonalidad B y T; recuento absoluto de leu-cocitos y linfocitos; cuantificación de inmunoglobulinas y subclases;valoración de autoanticuerpos; pruebas funcionales: test de transfor-mación linfoblástica y cuantificación de anticuerpos frente a haemo-philus, neumococo y tétanos.

Resultados. Al diagnóstico, en la muestra de SP se constató unaleucopenia y una ausencia de linfocitos B, así como una relaciónCD4/CD8 invertida en linfocitos T. En muestra de MO el porcentajede linfocitos B CD19+ fue un 0,05% respecto al total de linfocitos (18%),con cadena ligera de superficie de carácter policlonal.

Conclusiones. El inmunofenotipo por CF es útil para la deteccióny monitorización de la inmunodeficiencia y el posible desarrollo de unlinfoma no Hodgkin en pacientes con timoma.

Los parámetros prácticos para el diagnóstico y manejo de las inmu-nodeficiencias primarias de 2005 definen el síndrome de Good comoun subtipo de inmunodeficiencia variable común.

El bajo porcentaje de linfocitos B e incluso su ausencia en pacien-tes adultos con antecedentes de timoma sugieren el diagnóstico de sín-drome de Good.

P-094NUEVA MUTACIÓN COMPLEJA DEL GEN WAS EN PACIENTECON SINDROME DE WISKOTT-ALDRICH. V. Daza Cajigal1, N.Martínez-Pomar1, S. Torres2, K. Vega2, A. Iglesias1, M.R. Juliá1, J.A.Salinas1, I. Molina1, D. Heine-Suñer1, J. Rosell1, N. Matamoros1. 1Hos-pital Universitario Son Dureta, Palma De Mallorca. 2Universidad De Gra-nada, Granada.

El síndrome de Wiskott-Aldrich (WAS) es un trastorno recesivoligado al cromosoma X, que se caracteriza por la presencia de trombo-citopenia, eccema y diferentes grados de inmunodeficiencia. Se ori-gina por mutaciones en el gen WAS, ubicado en la región Xp11.22-23,que codifica la proteina WASp implicada en los procesos de formacióny reorganización del citoesqueleto de las células hematopoyéticas. Exis-te una correlación genotipo-fenotipo que relaciona la severidad de lasmanifestaciones clínicas con la ausencia de expresión de la proteínaWASp.

Materiales y métodos. Extracción de ADN genómico de sangreperiférica y análisis mutacional de los exones del gen WAS con primersespecíficos por secuenciación directa del DNA. Estudios de expresiónde RNA mediante RT-PCR. Estudio de expresión proteica de WASpmediante técnica de Western blot.

Resultados. Se presenta el primer caso de un paciente afecto deSíndrome de Wiskott-Aldrich debido a una mutación compleja de novo,con probable traslocación de un segmento de 5.121 pb del gen WASque origina la pérdida de los exones 2-11. Se realiza estudio de secuen-ciación con primers flanqueantes para los diferentes exones, con impo-sibilidad de amplificar el exón 11 y amplificación normal del resto deexones. Mediante secuenciación del gen se localiza a nivel genómicoel punto de corte con pérdida de los exones 2-11. Los estudios de expre-sión mediante RT-PCR no detectaron el transcrito correspondiente,posiblemente debido a la inestabilidad del fragmento. Así mismo,los estudios proteicos revelaron ausencia de expresión de WASp, quese correlaciona con el fenotipo severo del paciente.

Conclusión. En vista de los hallazgos encontrados, evidenciandoque la presencia de una traslocación puede posibilitar la secuenciaciónindependientemente de exones, consideramos de gran importancia larealización del análisis de expresión proteica como complemento delestudio molecular. Estudios futuros mediante Primer in Situ DNA Synthe-sis (PRINS) Technique podrán confirmar y localizar la ubicación dedicha traslocación.

P-095SÍNDROME DE GOOD: EVALUACIÓN INMUNOLÓGICA. M.G.Salgado-Cecilia1, R. López-Hernández1, M. Gil Ortega2, A. BernalRamos1, M.V. Martínez-Sánchez1, E. Santos Medina3, P. De La More-na Barrios2, J. Torres Lanzas1, J.A. Campillo Marquina1, M.R. Alva-rez-López1, A.M. García-Alonso1. 1Hospital Universitario Virgen de laArrixaca, Murcia. 2Hospital Universitario J. M. Morales Meseguer, Murcia.3Residencia San Basilio. Rey Dº Pedro, Murcia.

Las inmunodeficiencias primarias más frecuentes son las humo-rales cuyo defecto predominante es el déficit de anticuerpos, entre ellas,el Síndrome de Good, que es una hipogammaglobulinemia asociadaa timoma, es una entidad poco frecuente, de etiología desconocida yque normalmente se presenta en la cuarta o quinta década de vida. Lostumores tímicos son normalmente benignos pero alrededor de un 6-11% de pacientes con timoma desarrollan una inmunodeficiencia.

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Se presenta el caso de una mujer de 73 años que en 2003 padecióuna infección pulmonar de evolución tórpida, en cuya radiografía seapreciaba la presencia de una masa mediastínica anterior de 9 cm dediámetro, ligeramente heterogénea. Cinco años antes la paciente habíasufrido astenia, pérdida de peso, tos con mucosidad y expectoraciónabundante. Fue timectomizada en el 2004 y varios meses despuésingresó con un shock séptico secundario a un cuadro de mediasti-nitis purulenta y dehiscencia de sutura esternal donde se coleccionó400 c.c. de pus denso. La paciente no mejoraba su estado clínico ycontinuó padeciendo infecciones respiratorias. Tras el diagnóstico deun déficit de anticuerpos en sangre periférica fue remitida a nues-tro Hospotal para una evaluación inmunológica por sospecha de Sín-drome de Good.

Los resultados de laboratorio mostraban una hipogammaglobuli-nemia severa: IgG <7,67 mg/dL, IgA 2,09 mg/dL e IgM < 0,88 mg/dL.El recuento de leucocitos de sangre periférica era de 11.000 céls/µl yel numero de linfocitos de 3.900 céls/µl con sólo 1,7% de céls B mayo-ritariamente CD19+5+, NK (137 céls/µl) y una inversión del cocienteCD4+/CD8+ (0,24) por incremento del número de céls TCD3+CD8+CD57+CD11b-TCRalfa.beta+ (1775 cels/µl) y bajo numerode células T naive. No se encontraron otras alteraciones inmunológi-cas.

Tras la instauración de un tratamiento con inmunoglobulinas intra-venosas mensual la paciente mejoró significativamente y actualmen-te sigue asintomática. Dado el porcentaje de pacientes con timoma quepueden desarrollar inmunodeficiencia, sería recomendable sometera estos pacientes a seguimiento con objeto de detectar tempranamen-te las alteraciones inmunológicas y poder iniciar el tratamiento ade-cuado para mejorar su calidad de vida y evitar posibles complicacio-nes que puedan poner en riesgo su vida.

SESIÓN 10: INMUNOGENÉTICA

Moderadores: M. Dolores de Juan (San Sebastián)Manuel Muro (Murcia)

P-096IDENTIFICACIÓN DE UN NUEVO ALELO HLA-A*80 (A*8002)CON TRES SUSTITUCIONES AMINOACÍDICAS RELEVANTESEN EL DOMINIO ALFA-1. A. Teniente, P. Caro, J. Gil, E. Campos, S.Mantecón, C. Ambrós, L. Mongay, R. Pujol-Borrell, M.J. Herrero, E.Palou. LIRAD-BST, Mataró.

Introducción. Hasta el momento sólo ha sido descrito un alelo enel grupo HLA-A*80, el A*8001. Este alelo se encuentra predominante-mente en las poblaciones africanas, pero también se observa, con unafrecuencia mucho menor en los individuos españoles.

Objetivos. Caracterizar un nuevo alelo HLA-A*80 a partir de unaunidad de sangre de cordón umbilical de origen caucásico del Bancode Sangre de Cordón Umbilical de Cataluña.

Material y métodos: Al llevar a cabo la tipificación de HLAmediante PCR-SSO se detectó un patrón anómalo, lo que llevó a suclonación y secuenciación de nucleótidos, de los exones 2, 3 y 4 .

Resultados. El nuevo alelo se diferencia de A*8001 por tres cam-bios de nucleótidos en las posiciones 292 (A ->G), 299 (C -> T) y 301 (A-> G), dando lugar a tres cambios de aminoácido en el codón 74 (AAC

-> GAC) de asparagina en ácido aspártico, en el codón 76 (GCG ->GTG) de alanina por valina, y en el codón 77 (AAC -> GAC) de aspa-ragina en ácido aspártico, respectivamente.

El nuevo alelo fue designado oficialmente como HLA-A*8002 porel Comité de Nomenclatura de la OMS en Enero de 2010.

Las tres posiciones con cambios de aminoácidos (74, 76 y 77) seencuentran en una de las alfa-hélices que forman las paredes del sur-co peptídico, formando parte de algunos de los bolsillos del sitio deunión del péptido.

Los tres cambios de nucleótidos se encuentran en la mayoría delos alelos HLA-A*03 y HLA-A*11, pero no en los alelos HLA-A*01, queconstituyen en conjunto la familia HLA-A1/3/11/80.

Conclusiones. Caracterización de un nuevo alelo HLA-A*80(A*8002) cuyos cambios de nucleótidos podrían indicar que ha surgi-do de una conversión génica interalélica entre un alelo A*03/11 y elA*8001.

P-097EVALUACION DEL TIPAJE HLA CLASE II ALTA RESOLUCIONMEDIANTE PCR SSO LUMINEX®. EXPERIENCIA EN EL BANCODE CORDÓN UMBILICAL DE MALAGA. F.D.P. Sánchez Gordo, J.Jaen García, A.M. Carrasco Hidalgo, E. Christensen Pedersen, I. PratArrojo. Centro de Transfusión de Málaga y Banco de Cordón de Andalucía,Málaga.

Introducción. Los requerimientos del tipaje HLA en sangre de cor-dón para transplante son de compatibilidad en baja resolución paraHLA-A y –B y alta para DRB1. Dado el número de muestras y el volu-men de éstas, el tipaje HLA por técnicas de biología molecular requie-re la utilización de un método rápido, económicamente asequible, yde resultados fiables. Una vez validado en nuestro laboratorio, en estetrabajo estudiamos el tipaje HLA clase II por PCR SSO Luminex® dealta resolución.

Material y métodos. Analizamos los tipajes realizados en 1000muestras de sangre de cordón umbilical tipadas entre el 17 de Noviem-bre de 2009 y el 24 de Febrero de 2010 mediante el kit RSSOH2B1 lote05 ( One Lambda, PCR SSO Luminex®). Las muestras de DNA se extra-jeron mediante sistema automático Magtration® MagaZorb® Kit , y seevaluó el rendimiento mediante espectofotometría (Eppendorf).

Resultados. Se alcanzó un nivel de resolución de 4 dígitos en el76% de las muestras. (240 muestras no alcanzan los cuatro dígitos, deellas 172 por imposibilidad de discriminación del método, y 168 porsondas complejas de alelos raros con reacciones peri-cutoff). Se mues-tras las frecuencias encontradas de los diferentes alelos y el nivel dediscriminación. Limitaciones encontradas, fueron la no discriminaciónentre DRB1*1401/54; *1201/06/10/17;(en ambos casos la secuenciadel exón 2 es idéntica) *0403/52; *0404/23;*0405/08; ambigüedad *0102*1104 vs *0120 *1106; siendo la principal limitación a la alta resoluciónla dificultad de establecer el adecuado cutoff en beds que diferencian*0301/16/18/28 (especialmente en muestra 0301 homozigotas) y el*0701/16.

Conclusiones. Empleado como técnica inicial única, se alcanza elnivel de resolución de cuatro dígitos en el 76% de las muestras, si tene-mos en cuenta las exigencias de la EFI (exón 2), el porcentaje se elevaal 86%. Y alcanzaría el 91% en caso de normalización en los “beds”complejos (múltiples sondas) que diferencian 0301 de 0316 y 0701 de0716 en muestras homozigotas. Como conclusión se trata de una téc-nica fiable y con adecuada relación calidad/precio.

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P-098DIFERENCIAS GENÉTICAS DE HLA ENTRE AMERINDIOS, NA-DENE, ESKIMO Y ALEUTIANOS AMERICANOS. A. Arnaiz-Ville-na, P. Gomez-Prieto, C. Parga-Lozano, C. Areces, D. Rey, P. Peña-randa, L. Barbolla. Departamento de Inmunologia, Facultad de medici-na, Universidad Complutense de Madrid. Centro de transfusiones de laCAM, Madrid.

Objetivos. Se hipotetiza que los Amerindios fueron los primeroshabitantes de Norte y Sudamérica. Se ha postulado que alcanzaronel continente americano entre hace 30.000 y 12.000 años. Sin embargo,han sido encontrados asentamientos humanos más antiguos en el surde Sudamérica. Actualmente, muchas de sus lenguas parecen no estarrelacionadas y algunos autores dudan de que hayan surgido de un úni-co grupo poblacional. Se cree que los hablantes de lenguas Na Dene(Atabascos de Canadá, Navajo, Apache) alcanzaron América hace unos8.000 años antes del presente, y que los Eskimo-Aleutianos lo hicieronhace unos 6.000 años antes del presente. Este modelo de poblamien-to de América basado en la antropología física y la lingüística es dema-siado general y deja sin explicar algunos puntos clave.

En este trabajo, nuestro objetivo ha sido estudiar tanto la genea-logía como la comparación de distancias de frecuencia alélicas de HLAentre estos tres grupos pioneros con el fin de contrastar la robustez deeste modelo de poblamiento de América y establecer las relacionesgenéticas de estos grupos.

Material y métodos. Se han utilizado los haplotipos HLA exten-didos para trazar genealogías entre poblaciones y las matrices de dis-tancias genéticas DA de las frecuencias alélicas de HLA para construirlos dendogramas. También ha sido calculada la variación de frecuen-cias alélicas de HLA mediante análisis de correspondencia. Se hanempleado los programas Arlequin, GNKdist y Vista, una vez obteni-das las frecuencias alélicas de HLA por metodología estandarizada.

Resultados y conclusiones. 1) los Aleutianos parecen tener unamayor relación con el grupo de Siberianos y Saami (Lapones, Escan-dinavia); parecen no estar tan relacionados con Esquimales, siendomenos claro el momento de su llegada al continente americano; 2) Ata-bascos y Esquimales parecen tener una mayor relación con Siberianosy otros orientales y, 3) los Amerindios parecen estar alejados de susvecinos y del resto de poblaciones mundiales al usar únicamente com-paración de frecuencias. Sin embargo, la existencia de un alelo HLAtotalmente específico de Amerindios no se ha encontrado. De todosmodos, se han hallado haplotipos que son específicos de poblacionesamerindias aisladas. El aspecto más específico de haplotipos HLA encomparación con los alelos se discutido. Se exponen las causas del par-ticular perfil HLA de Amerindios.

P-099LA VARIABILIDAD DE LOS INTRONES DEL COMPLEJO MAYORDE HISTOCOMPATIBILIDAD EN AVES CANTORAS SALVAJES(PASSERINES) SUGIEREN QUE EL ALELISMO ES GENERADOPOR CONVERSIÓN GÉNICA. A. Arnaiz-Villena1, D. Rey1, P. Gomez-Prieto1, S. Abd El Fatah Khalil2, P. Peñaranda2, C. Areces1, C. Parga-Lozano1. 1Departamento de Inmunología, Facultad de Medicina, Universi-dad Complutense de Madrid. Centro de transfusiones de la CAM, Madrid.2Centro de transfusiones de la CAM, Madrid.

Objetivos. Estudiar el mecanismo de generación de alelos MHCen un modelo de aves silvestres.

Material y métodos. Se han obtenido muestras de DNA de avesde canto salvajes de todo el mundo.Se ha extraído DNA y determina-do sus genes de histocompatibilidad por métodos Standard automá-ticos de extracción y secuenciación.

Resultados y conclusiones. Se supone que los intrones no siguenun “reloj molecular” de cambio de bases del ADN. Esto hace que nosean de utilidad para establecer filogenias. Sin embargo, el estudio decambios intrónicos en grupos de modelos ya definidos filogenética-mente por genes que si siguen un “reloj molecular” como ciertas avesde canto de los géneros: Carduelis, Serinus, y la tribu Carduelini, pue-den darnos respuestas a preguntas evolutivas específicas. En este artí-culo, se ha analizado el intrón 2 del complejo principal de histocom-patibilidad (MHC) de clase I con el fin de estudiar la evolución delos genes MHC de estas aves de canto salvajes. Se han analizado indels,distancias genéticas, y el promedio de variabilidad (variabilidad media).No se ha encontrado en estas aves de canto salvajes la conservaciónesperada del intrón 2, al contrario se ha registrado una amplia varia-bilidad. A pesar de que hay una tendencia de los grupos de aves can-toras filogenéticamente definidos a preservar un intrón 2 similar, se haobservado una gran variabilidad. Esto concuerda que la mayoría de lavariabilidad alélicas de MHC se ha efectuado por conversión génica(por participación de intrones) y no por mutaciones puntuales.

P-100EVOLUCIÓN DEL COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILI-DAD –C, -G Y DE RECEPTORES “NATURAL KILLER” EN PRIMA-TES. A. Arnaiz-Villena1, D. Rey1, P. Gomez-Prieto1, S. Abd El Fatah Kha-lil2, P. Peñaranda2, C. Areces1, C. Parga-Lozano1. 1Departamento de Inmu-nología, Facultad de Medicina, Universidad Complutense de Madrid. Centro deTransfusiones de la CAM., Madrid. 2Centro de Transfusiones de la CAM, Madrid.

Objetivos. Estudiar la evolución en primates de MHC-G y –C.Material y métodos. Se obtuvieron líneas celulares de los pri-

mates a estudiar. Se extrajo ADN y se tipificaron los alelos MHC méto-dos estándar de secuenciación automática.

Resultados y conclusiones. Las moléculas del complejo mayor dehistocompatibilidad (MHC) –C, y –G son ligandos de receptores de inmu-noglobulinas de las células NK (KIR). La evolución de MHC-G en prima-tes presenta importantes anomalías: 1) en simios del Nuevo Mundo, lasmoléculas MHC-G muestran un elevado polimorfismo y lo más probablees que sean presentadores de antígenos clásicos, también se agrupan comosi fuesen moléculas MHC-E en dendograma de emparentamiento mole-cular. Además, sus genes carecen de la deleción del intrón 2, la cual es típi-ca de otros primates en lo que respecta a MHC-G; 2) los primates Euroa-síaticos-Africanos de mediano tamaño, muestran un codon stop (de ter-minación) en el exón 3: únicamente son posibles las isoformas de MHC-G sin exón 3; 3) los grandes primates, orangután, gorila, y chimpancé, asícomo el hombre, muestran un limitado polimorfismo de MHC-G. Por otraparte no se han encontrado genes MHC-C en simios Euroasiáticos-Afri-canos de mediano tamaño, sin embargo nosotros encontramos secuenciasde ADN de MHC-C en los simios del Nuevo Mundo, que son más anti-guas en la escala evolutiva. Teniendo en cuenta que en el hombre las molé-culas MHC-C (HLA) dominan la señal de los receptores inhibidores KIR,nuestros hallazgos sugieren que tanto las moléculas MHC-C y sus ligan-dos en los linfocitos “natural killer” KIR también existen en los primatesmás antiguos: los simios del Nuevo Mundo estaban presentes en la Tie-rra antes de hace 40 millones de años. Asimismo esto concuerda con quelos receptores KIR se han encontrado en promates del Nuevo Mundo.

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P-101LOS PRIMEROS HABITANTES DE AMÉRICA (AMERINDIOS)TIENEN GENES HLA COMUNES CON ABORIGENES AUSTRA-LIANOS, POBLACIONES DE LAS ISLAS DEL PACÍFICO Y CONOTRAS POBLACIONES ASIÁTICAS. A. Arnaiz-Villena1, P. Gomez-Prieto1, D. Rey1, C. Areces1, L. Barbolla2, P. Peñaranda3, C. Parga-Loza-no4. 1Departamento de Inmunología, Facultad de Medicina, UniversidadComplutense de Madrid. Centro de transfusiones de la CAM., Madrid. 2Cen-tro de transfusiones de la CAM. 3Centro de transfusiones de la CAM. 4Depar-tamento de Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad Complutensede Madrid. Centro de transfusiones de la CAM, Madrid.

Objetivos. Estudiar el origen de los Amerindios mediante genes HLA.Material y métodos. Se han utilizado los haplotipos HLA exten-

didos para trazar genealogías entre poblaciones y las matrices de dis-tancias genéticas DA de las frecuencias alélicas de HLA para construirlos dendogramas. También ha sido calculada la variación de frecuen-cias alélicas de HLA mediante análisis de correspondencia. Se hanempleado los programas Arlequin, GNKdist y Vista, una vez obteni-das las frecuencias alélicas de HLA por metodología estandarizada.

Resultados y conclusiones. El problema del origen de los Amerin-dios no ha sito todavía resuelto. Mientras que el ADN mitocondrial,el cromosoma Y, HLA y otros marcadores muestran que los primeroshabitantes americanos na-dene y esquimales tienen muchas caracterís-ticas genéticas comunes con orientales, en particular con siberianos, losAmerindios más antiguos muestran un perfil HLA completamente dife-rente a orientales y siberianos, y presentan alelos HLA “propios” queno han sido detectados en otras poblaciones del mundo. En este traba-jo, no se ha comparado solamente las frecuencias de alelos HLA de lapoblación amerindia con las frecuencias de alelos de otras poblaciones,sino que también se ha llevado a cabo una comparación genealógica delos alelos HLA amerindios relevantes, entre las poblaciones. Las rela-ciones genéticas HLA de Amerindios han sido comparadas con los otrosprimeros habitantes de America (na-dene y esquimales), asiáticos, aus-tralianos, poblaciones de las islas del Pacífico y otras poblaciones delmundo a través de los programas Arlequin, GNKdist y Vista. Nuestrosresultados muestran que algunos alelos raros amerindios también seencuentran en poblaciones del este de Australia, de las islas del Pací-fico, en siberianos y otras poblaciones de Asia. En particular, los resul-tados en Atabascos NaDene (que viven en el norte de Canadá, próxi-mos a Beringia) muestran que: 1) el paso a través de Beringia no ha sidola única vía de entrada para el poblamiento de América, 2) no se pue-de descartar una migración inversa (de America hacia Asia) en diferen-tes épocas, 3) nuestros resultados no concuerdan con el modelo clásicode “tres oleadas” para el poblamiento de las Américas a través de Berin-gia. En resumen, son posibles otros modelos en el que la entrada fue-ra también a través de la costa pacífica de América del norte y del sur.

P-102DIMORFISMO MOLECULAR MICA-129 VAL/MET (DÉBIL/FUER-TE LIGADOR DEL RECEPTOR NKG2D) Y SUSCEPTIBILIDAD AENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL. R. López-Hernán-dez, D. Lucas, J.A. Campillo, G. Salgado, F. Boix, A. Bosch, A. Mingue-la, M. Miras, R. Alvarez, F. Carballo, M. Muro. Hospital Virgen de laArrixaca, Murcia.

Este trabajo fue subvencionado por el proyecto 05748/PI/07 de laFundación Séneca de la Región de Murcia y CIBERehd (FIS). Ciberehd

es subvencionado por el Instituto de Salud Carlos III. Ministerio deSanidad y Consumo.

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) son desórdenes cróni-cos multifactoriales que comprenden principalmente a Enfermedadde Crohn (EC) y Colitis Ulcerosa (CU). Estudios genómicos han mos-trado una consistente evidencia de ligamiento a IBD3 (6p21.1-23), unárea que comprende el complejo HLA. En este sentido, MICA esta loca-lizado a 46 kb centromérico al locus HLA-B, es altamente polimórfi-co e interacciona con NKG2D, su receptor en la superficie de los linfo-citos NK, Tγδ y T CD8. Una variación en la posición aminoacídica129 del dominio α2 de la cadena pesada parece categorizar a los ale-los MICA en fuertes o débiles ligadores del receptor NKG2D y, por tan-to, influye en las funciones de las células efectoras.

Objetivos. El propósito de este trabajo fue estudiar el polimorfis-mo alélico del gen MICA y el dimorfismo funcionalmente relevante(129 val/met) del gen MICA en pacientes EII en nuestra población.

Materiales y métodos. El DNA fué obtenido de pacientes EII ycontroles sanos no relacionados (CG) y utilizados para el genotipajede MICA por PCR-SSOP por tecnología luminex mediante amplifica-ción y detección del polimorfismo de exones 2, 3 y 4 (OL, CA).

Resultados. En el grupo CG, MICA*008 fue el alelo más frecuen-te, seguido por MICA*002, MICA*004, MICA*001, MICA*009 yMICA*016, similarmente a otras poblaciones Caucasoides. No encon-tramos diferencias estadísticas en la distribución de alelos MICA entrelos grupos EII y CG. Sin embargo, encontramos mas alta frecuencia delgenotipo MICA-129met/met y más baja frecuencia de MICA-129val/met en EII (principalmente en CU) que en CG (Pc= 0,02).

Puede ser hipotetizado que la presencia de MICA-129 met/mety MICA-129 val/met puede modificar la activación de células NK, Tγδy T CD8 y permitir una exacerbada respuesta inmune en el microam-biente intestinal con un fuerte componente inflamatorio. Podemos tam-bién especular que la producción de sMICA podría estar relacionadaa MICA-129, con los genotipos MICA-129 met/met y MICA-129val/met ejerciendo posiblemente su efecto en susceptibilidad a travésde la disminución regulada de la expresión de sMICA.

Conclusión. Estos datos preliminares podrían sugerir un papelrelevante del SNP MICA-129-val/met (débil/fuerte ligador del recep-tor NKG2D) en la patogénesis de la EII.

P-103ALELOS DQB1*, HLA CLASE II, EN LA POBLACION DE CASTI-LLA Y LEON. V. Leon Moya1, A. Leon Arroyo2, J.L. Cacho Gutierrez1.1Hospital Universitario de Salamanca, Galindo y Perahuy. 2Internacional Ins-titute of Infection and Immunity. Division of Immunology. Shantou Univer-sity. Guangdong. R P China.

Los estudios de alelos HLA en poblaciones localizadas tienen ungran interés a fin de disponer de datos basales de poblaciones concre-tas, aplicable a una gran diversidad de estudios , desde los simplemen-te poblacionales a servir de base comparativa en los estudios de cier-tas enfermedades, sobre todo las que presentan un componente autoin-mune.

Material y Métodos. Hemos estudiado la distribución de poli-morfismos del gen DPQB1* en nuestra población (n= 128) de Castillay León.

Muestras de sangre de 50 a 200 mcl, fueron depositadas en un papelWhatman 3MM secadas a almacenadas a temperatura ambiente has-ta su utilización. El ADN fue extraído con el kit DNA Direct II de Dynal,

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obteniendo de 1- 4 mcg de ADN. El locus DQB1* fué estudiado conel kit Dynal SSP allset DQB1*. Hemos cambiado las condiciones gene-rales de la PCR a fin de adaptarla a nuestras cantidades de ADN, 2-4ng y 0,1 U de Taq Polymerasa, por tubo (en vez de 100 ng de ADN y0,4 U de Taq del protocolo original).

Las condiciones de la PCR fueron: 1) 94ºC, 2 min., 1 ciclo. 2) 94ºC10 sec., 65ºC 60 sec. 10 ciclos. 3) 94ºC 10 sec., 61ºC 50 sec., 72ºC 30 sec.30 ciclos. 4) 72ºC 3 min. Los productos PCR fueron visualizados porelectroforesis en agarosa al 2%.

Resultados. Las frecuencias de los alelos DQB1* halladas fue-ron: HLA DQB1*02, 29,7%; DQB1*03, 27,3; DQB1*04, 1,5; DQB1*05,19,4; y DQB1*06 , 21,8.

No se hallaron diferencias significativas con otros estudios efec-tuados en poblaciones españolas y portuguesas.

P-104POSIBLE ASOCIACION ENTRE EL GEN CYP46 Y LA ENFERME-DAD DE ESCLEROSIS MULTIPLE. V. Leon Moya, J. Arcaya, D.Cembrero Fuciños, A. Hernández Villalon. Hospital Universitario deSalamanca.

La Enfermedad de Esclerosis Múltiple, EM, es un desorden com-plejo con multitud de factores genéticos implicados en su desarrollo ypatología clínica. Cada vez existen más evidencias que implican altransporte transmembrana celular del colesterol en con la EM. El genCYP 46 codifica la enzima 24 colesterol hydrolasa juega un papel impor-tante en la salida al exterior celular del colesterol citoplasmático.

Recientemente se ha comenzado a asociar un polimorfismo delIntron 2 del gen CYP 46 corre el riesgo de adquirir la EM. En el presen-te estudio, examinamos la posible asociación del polimorfismo del genCYP 46 EM .

Material y Métodos. El presente estudio se efectuó en 38 pacien-tes de EM, de acuerdo con los criterios de POSER, y 48 sujetos control.

El gen CYP 46 fue estudiado mediante una PCR empleando losprimers For 5'-TGA AAA CGA GTT TCC CGT CC-3' y Rev 5'-GTGTGA CCA GGT AAC AGT CA-3', las condiciones de la PCR fueron:95 durante 5 min, 1 ciclo; 95º 30 s, 53º 30 s, 72º 30s 34 ciclos, y final-mente 72º 10 min. El amplicon de 285 bp fué digerido con la enzi-ma de restricción MspI, el alelo CYP C presenta dos fragmentos de209 y 76 bp.

Resultados. La distribución del polimorfismo en EM es: 47,7% TT,48,3% TC,4,0 % CC, en el grupo control: 42,8 TT, 46,9 TC 10,2 CC Exis-ten diferencia significativa ente el grupo control y los grupos de enfer-mos (Chi-cuadrado test P< 0,001).

P-105ESTUDIO DEL POLIMORFISMO SER326CYS DEL GEN HOGG1EN ENFERMOS DE ALZHEIMER. V. Leon Moya1, M.D. Sevillano1,E. Polo-Hernández2. 1Hospital Universitario de Salamanca. 2Instituto Neu-rociencias Castilla y Leon Universidad de Salamanca.

La acumulación de daños en el ADN de las celulas cerebrales alo largo del tiempo, parece jugar un importante papel en la patoge-nesis del de Enfermedad de Alzheimer, EA. El tipo de daño al ADNque más influye en la degeneración neuronal es el daño oxidativo, estasalteraciones se van acumulando con el tiempo en el ADN neuronalsiendo reparado mediante la escinsion de bases oxidadas. Se ha suge-

rido que el cerebro en EA el incremento de bases oxidadas puede deber-se a un doble mecanismo, bien al incremento del stress oxidativo ó adeficiencias en la reparación de los mecanismos responsables de la eli-minación de las bases oxidadas. Hay evidencias que apuntan a queel polimorfismo Ser326Cys del gen de la 8 oxoguanina DNA glicolida-sa 1 , h OGG1, esta asociado con la reparación del ADN reducido, enel presente estudio pretendemos ver la posible asociación de este poli-morfismo con la EA.

Material y métodos. 36 pacientes diagnosticados de Probable EAsegún criterios NINCDS-ADRDA y 66 controles fueron el objeto denuestro estudio. El ADN fue extraído mediante el kit DNA direct II(Dynal) fundamentado en una resina con núcleo metálico que permi-te separar el complejo ADN-resina mediante un imán. El gen hOGG1fue estudiado mediante PCR utilizando los primers: For 5´- CCC AACCCC AgT ggA TTC TCA TTG C -3’ y Reverse 5’-TTg gAA CCC TTTCTg CgC TT-3’. Las condiciones de la PCR fueron: 95º durante 5 min,1 ciclo; 95º 30 s, 53º 30 s, 72º 30s 34 ciclos, y finalmente 72º 10 min. Elamplicon de 234 bp fué digerido con el enzima de restricción Fnu4HI,el alelo salvaje Ser326 presenta dos fragmentos de 213 y 21 bp, y el ale-lo mutante Cys326 tres fragmentos 164, 49 y 21 bp. Los fragmentos sonpuestos de manifiesto mediante electroforesis en gel de agarosa al2% conteniendo bromuro de etidio.

Resultados. La distribución del polimorfismo en EA es: 62,3% SS,33% SC 4,7 % CC, en el grupo control: 66,4 SS, 30,4 SC 3,2 CC . No Exis-ten diferencias significativas entre el grupo control y los grupo EA (Chi-cuadrado test P< 0,05).

P-106ESTUDIO DEL POLIMORFISMO DEL PRION P M129V ENPACIENTES CON ARTRITIS REUMATOIDE. V. Leon Moya, S.Gomez-Castro, M.L. Rivera Reigada, J. Barón Sánchez. Hospital Uni-versitario de Salamanca.

La Artritis Reumatoide, AR, es un desorden inmuno degenerati-vo que ha sido asociado con la presencia de depósitos de proteínasanormales, en los cuales pueden influir de la Proteína PrPC (PrionC)en sus formas insolubles PrPSC. Los Priones están localizados en lamembrana citoplasmática. Presentan radicales a los que se ligan molé-culas de Cobre, y juegan un papel esencial en el transporte transmem-brana del cobre y en el mecanismo antioxidante celular. los heteroci-gotos del PrNP al polimorfismo Met 129 Val presentan un efecto pro-tector ó al menos un mayor periodo de incubación de ciertas enfer-medades con componente autoinmune. El propósito del presenteestudio es relacionar la presencia de este polimorfismo en enfermosde AR.

Material y Métodos. Nuestro estudio se efectuó sobre 56 pacien-tes de AR, de y 86 sujetos control. Un fragmento de 775 bp del genPrNP fué amplificado empleando los primers (for: 5'-GTG GCC ACATGG AGT GAC CTG GGC CTC -3'; rev: 5'-GTG AAA CAG GAA GACC -3'). La PCR fue efectuada utilizando 10 ng de ADN genómico en 20mcl de mezcla de reacción. Las condiciones de la PCR fueron: 95º duran-te 5 min, 1 ciclo; 95º 30 seg, 30º 30 seg, 72º 60 seg 34 ciclos, y 72º 10 min.El producto de la PCR fué digerido con el enzima de restricción NspIy revelado en geles de agarosa al 2%.

Resultados. La distribución alélicas en el grupo control fue: 42%M/M, 45% M/V, 13% V/V. En pacientes de AR : 44% M/M, 44% M/V,12% V/V. No hemos encontrado diferencias entre el grupo control yenfermos de EM (El test Chi-cuadrado, p< 0,05).

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P-107ESTUDIO DE POLIMORFISMOS EN EL GEN CD24 Y SU ASOCIA-CIÓN CON LA DISFUNCIÓN NEUROLÓGICA EN PACIENTESCON ESCLEROSIS MÚLTIPLE. M.D.C. Chima Galán1, C.S. Rodrí-guez Mandujano1, J.J.M. Zaragoza Saavedra2, L. García Ortiz1, J.C.Pérez Razo1, J. Gutiérrez Salinas1, V. Dircio Delgado1, N. PlascenciaAlvárez1, L. Núñez Orozco1, D. Soto Candia1, M.E. Vargas Camaño1.1Centro Médico Nacional 20 de Noviembre - ISSSTE, Ciudad de México,México. 2Instituto Nacional de Cancerología, México.

Objetivos. Determinar si los polimorfismos CD24v y P1527delse asocian con la presencia de esclerosis múltiple en un grupo de pacien-tes mexicanos, en comparación con población sana.Evaluar si los poli-morfismos del gen CD24 se encuentran relacionados con el grado dedisfunción neurológica en el grupo de pacientes.

Introducción. La esclerosis múltiple (EM) es un padecimiento desmie-linizante del sistema nervioso central (SNC), de etiología multifactorial. Esla segunda causa de discapacidad en adultos jóvenes, en México tiene unaprevalencia de 13 por 100,000 habitantes y es más frecuente en mujeres conuna relación 2:11. La EM resulta de una respuesta autoinmune a antígenospropios, donde las células T específicas de la mielina son activadas y migranal SNC, los mediadores inmunes inician una respuesta inflamatoria quedestruye la mielina causando degeneración axonal2. Se ha demostrado laasociación de genes que participan en la respuesta inmune, con la pre-sencia de EM. La proteína de superficie CD24 promueve la activación ymigración de las células T al SNC3. En población estadounidense, españo-la e iraní, el polimorfismo CD24v se ha asociado con una progresión másrápida4,5,6. Mientras que P1527del se ha considerado como un marcador deprotección para el desarrollo de enfermedades autoinmunes como la EM7.

Material y métodos. Se llevó a cabo un estudio de casos y controles,de tipo observacional, transversal, prospectivo, comparativo y abierto. Seestudiaron 102 pacientes atendidos en la Clínica de esclerosis múltiple delCentro Médico Nacional “20 de Noviembre” – ISSSTE, de 18 a 65 años deedad, diagnosticados con EM de acuerdo a los criterios de McDonald8,variedad remitente-recurrente; en quienes se determinó el grado de dis-función neurológica, de acuerdo con los parámetros de Expanded Disa-bility Status Scale (EDSS)9. El grupo control estuvo constituido por 259 per-sonas sanas, pareadas por sexo y sin antecedentes de enfermedades autoin-munes ni neurológicas. Previo consentimiento informado se tomó unamuestra de sangre periférica a cada uno de los participantes para extraerDNA, por medio de un método de precipitación salina diferencial10. Paraidentificar los polimorfismos CD24v (T226C, de la región codificante delexón 2) y P1527del (1527delTG, en la región no traducida 3’ del gen) se rea-lizó la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), análisis de fragmentosde restricción de longitud polimórfica (RFLP´s) y secuenciación confirma-toria. Se utilizó la prueba de ji cuadrada y Odds Ratio para identificar dife-rencias estadísticamente significativas de las frecuencias alélicas y geno-típicas de los polimorfismos entre los grupos de estudio, una ANOVA y laprueba de diferencia mínima significativa (DMS), para determinar la corre-lación de los alelos y genotipos con la disfunción neurológica.

Resultados. Existe diferencia estadísticamente significativa de la dis-tribución del polimorfismo CD24v entre casos y controles (X2= 13,33,gl= 2, α= 0,5, P= 0,01). No así en la distribución alélica ni genotípica deP1527del entre los grupos estudiados (X2= 0,16, gl= 2, α= 0,05 y X2= 0,14,gl=1, α= 0,05). Con respecto a la relación de los polimorfismos de CD24con la disfunción neurológica (EDSS>6) se obtuvo DMS= 8,28 (p= 0,058).

Conclusión. Se demostró asociación de los polimorfismos CD24v yP1527del con la disfunción neurológica de los pacientes con esclerosis múl-tiple estudiados. Así como, una asociación de los genotipos y alelos de CD24v

con la EM, tal como se ha reportado en otras poblaciones estudiadas, lo queapoya que este polimorfismo participa en la susceptibilidad a EM.Bibliografía1. Porras B, et al. Esclerosis Múltiple. Rev Mex Neuroci 2007;8 (1): 58-66. 2. Farreras Rozman. Enfermedades desmielinizantes en Medicina Interna. Edit. Hartcourt,

14ª. ed. 2002. Cap. 12. 3. Hahne M, et al. The heat stable antigen can alter very late antigen can alter very late

antigen 4 mediated adhesión. J Exp Med 1994. 179, 1391-95.4. Zhou Q, et al. CD24 is a genetic modifier for risk and progresión of multiple sclero-

sis. PNAS 2003;25 (100): 15041-46.5. Otaegui D, et al. CD24 V/V is an allele associated with the risk of developing multiple

sclerosis in the Spanish population. Mult Scler 2006;12(4): 511-4.6. Ronaghi Mohammad, et al. CD24 gene polymorphism is associated with the disease

progresión and susceptibility to multiple sclerosis in the Iranian population. PsychiatryResearch 2009;170:271-272.

7. Wang L, et al. A dinucleotide deletion in CD24 confers protection against autoinmunediseases. PLOS GENETICS 2007;4(3):508-17.

8. McDonald WI, Recommended diagnostic criteria for multiple sclerosis. Guidelines from theinternational panel on the diagnosis on multiple sclerosis. Ann Neurol 2001;50:121-7.

9. Kurtzke JF, Rating neurological impairment in multiple sclerosis: an expanded disabi-lity status scale (EDSS). Neurology 1983;33:1444-1452.

10. Sambrook J, et al. Molecular Cloning a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Labo-ratory Press, Cold Spring Harbor, USA, 1989.

P-108DETECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE UN NUEVO ALELOHLA-B, B*07:77. D. Planelles1, A. Balas2, G.F. Sanz3, P. Solves1, F. Gar-cía-Sánchez2, N. Puig1, R.J. Roig1, J.L. Vicario2. 1Centro de Transfusiónde la Comunidad Valenciana, Valencia. 2Centro de Transfusión de Madrid ,Madrid. 3Hospital Universitario La Fe, Valencia.

En este estudio se describe cómo una combinación de técnicasmoleculares llevaron a la identificación de un nuevo alelo HLA-B*07durante el genotipaje de rutina para trasplante de progenitores hema-topoyéticos (TPH). El nuevo alelo identificado se compara con otrosrelacionados de secuencia conocida.

El estudio HLA de un paciente rumano con indicación de bús-queda de donante para TPH se realizó inicialmente por resoluciónintermedia mediante PCR-rSSO (LABType® SSO-Luminex®) dandocomo resultado HLA-A*01:DEKY, 26:EBHE; B*07:07, 44:AXJM;C*04:DGVY, 07:DGVZ. El subtipaje alélico posterior mediante PCR-SSP (Olerup SSP) fue A*01:01, 26:01; B*07:07, 44:03; y C*04:01, pero ladefinición del grupo C*07 mostró resultados inconcluyentes caracte-rizados por la presencia de amplificaciones extra (C*07:02+B*40:60;C*07:38+B*40:60; C*07:15+B*40:60). El tipaje por PCR-rSSO con reac-tivos LifeMatch® resultó B*07:ZYC, 44:ARJA; C*04:CZAB, 07:CZAC.Para determinar de forma exacta el tipaje HLA-B y -C, se realizósecuenciación por amplificación genómica completa y secuenciaciónsubsiguiente de los exones 2, 3 y 4 con oligonucleótidos de intrón.

El tipaje HLA-C y -B por secuenciación dio como resultadoC*04:01:01:01, 07:02:01:03; B*44:03:01 y un nuevo subtipo HLA-B*07,oficialmente reconocido como B*07:77, que presentaba una sustitución99Y>99S respecto a su alelo más próximo B*07:07. El análisis de segre-gación familiar definió el haplotipo que lo incluye como A*01:01, B*07:77,C*07:02:01, DRB1*15:01:01, DQB1*06:02:01. B*07:07 muestra tambiénasociación haplotípica con A*01 y C*07. La alineación del dominio α-2HLA-B denota la presencia de un residuo 99S en unas pocas moléculasHLA-B, principalmente en alelos B*37 y otros muy poco frecuentes comoB*40:60, B*53:07, B*39:09 y B*18:18. El aminoácido en posición 99 estálocalizado en la cadena β S1, contribuyendo a sus propiedades de unión,especificidad de la molécula HLA y probablemente de relevancia en el

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TPH. La presencia del residuo 99S en el alelo B*40:60 podría explicarlas reacciones extra de amplificación específicas de B*40:60 observadasen el subtipaje HLA-C*07 mediante Olerup-SSP.

En conclusión, aunque la técnica PCR-SSP sugirió la presenciade un nuevo alelo HLA de clase I, el hecho de que ni ésta ni la PCR-rSSO lo detectaran confirma que el tipaje basado en la secuenciaciónes el más resolutivo para el estudio de histocompatibilidad en TPH.

P-109POLIMORFISMO EN LA 3’UTR -1188 A/C DEL GEN DE LA INTER-LEUKINA-12P40 (IL-12B) SE ASOCIA CON COLITIS ULCERO-SA Y ENFERMEDAD DE CROHN. F. Boix Giner, R. López-Hernán-dez, H. Salama, G. Salgado, J.A. Campillo, D. Lucas, A. Minguela,M. Miras, M.R. Álvarez-López, F. Carballo, M. Muro. Hospital Virgende la Arrixaca, Murcia.

Interleukin (IL)-12p40, a subunit of IL-12p70 and IL-23, has previouslybeen shown to inhibit IL-12p70 activity and IFN-gamma production.IL-12p40 is induced in excess over the other subunits of IL-12 and IL-23 and can exist in a monomeric or homodimeric form. Its most widelyappreciated function is to provide a negative feedback loop by competitivelybinding to the IL-12 receptor. However, IL-12p40 acts as a chemoattractantfor macrophages and promotes the migration of bacterially stimulateddendritic cells. IL-12 plays a key role in promoting Th1 responsesand is associated with several pathogenic inflammatory responses.Several SNPs have been identified in the IL-12 gene such as 3’UTR 1188A/C polymorphism (rs3212227), which is associated with differentdiseases. The variant C allele of the 1188A/C polymorphism hasbeen associated with enhanced IL-12 production. However, the relationshipof this polymorphism with the immune response in inflammatorybowel disease (IBD) patients has not been explored. In this case–controlstudy, we evaluated patients with IBD and healthy subjects. We aimedto determine the relationship between 3’UTR -1188 A/C polymorphismof IL-12 p40 and the differential IBD pathologies, Crohn´s disease (CD)and ulcerative colitis (UC). Genotype frequencies were 50,9% A/A,43,8% A/C, and 5,2% C/C in CD patients, and 81,5% A/A, 14,8% A/C,and 3,7% C/C in UC (p= 0,017; OR= 4,49). Allele frequencies were72,8% -1188A and 27,2% -1188C in CD patients, and 88,9% A and 11,1%C in UC (p= 0,03. OR= 4,62).Thus, the -1188A allele was increased inUC patients and the -1188C allele (high IL-12p40 production) wasincreased in CD patients. These data are in concordance with the factof that CD has been shown to be associated with a Th1 T-cell mediatedinflammation and high IL-12/IFN-gamma production at histologicallyaffected sites. These data suggest that the IL-12 p40 3’UTR -1188 A/Cpolymorphism seems to be associated with a differential IBD development.

P-110ANÁLISIS Y MODELADO DE LA ACTIVIDAD CATALÍTICA DELINMUNOPROTEASOMA Y DEL PROTEASOMA CONSTITUTI-VO. C.M. Diez Rivero, E.M. Lafuente, P.A. Reche. Facultad de Medici-na, Universidad Complutense de Madrid, Madrid.

Objetivos. El proteasoma tiene un papel fundamental en el procesa-miento de antígenos presentados por moléculas del complejo principal dehistocompatibilidad de clase I (MHCI). Es el responsable de la degrada-ción proteolítica de las proteínas citoplasmáticas, generando el extremo C-terminal de los epítopos de células T CD8 y en general de los péptidos res-

tringidos por las moléculas MHCI (residuo P1 del sitio de corte). Existendos tipos distintos de proteasomas, la forma constitutiva, expresada en lamayoría de los tipos celulares, y el inmunoproteasoma, que se expresade manera constitutiva en las células dendríticas. Los epítopos de célulasT CD8 protectivos son aquellos generados tanto por el inmunoproteaso-ma como por el proteasoma constitutivo, y por ello, aquí hemos modela-do y analizado la actividad catalítica de estas dos proteasas. Además, hemoscombinado las predicciones de unión de péptidos a moléculas MHCI y lasde corte por el proteasoma y/o inmmunoproteasoma intentando mejo-rar los resultados de predicción de epítopos de células T CD8.

Material y métodos. La actividad proteolítica del inmunoprotea-soma y del proteasoma se modelaron a partir de dos conjuntos de datosdistintos no solapantes, uno formado por 553 epítopos de células TCD8 –procesados naturalmente y restringidos por moléculas MHCIhumanas–, y otro compuesto por 382 péptidos eluidos de moléculasMHCI humanas, respectivamente, usando N-grams. Los modelos decorte se generaron considerando fragmentos de los epítopos y de lospéptidos eluídos de moléculas MHCI de distinto tamaño con el mis-mo número de residuos a cada lado del C-terminal, y se evaluaronusando una validación cruzada de orden 5.

Resultados. A juzgar por el índice de correlación de Matthews(MCC), los modelos óptimos para el proteasoma (MCC = 0,43 ± 0,07)y el inmunoproteasoma (MCC = 0,36 ± 0,06) se obtienen a partir defragmentos de 12 residuos. Cuando estos modelos se evalúan usan-do un test independiente los modelos de corte del inmunoproteasomay del proteasoma alcanzan valores de 0,30 y 0,18, respectivamente, queson comparativamente mejores que los valores alcanzados por otrosmétodos relacionados. Mediante un análisis ROC, hemos demostradoque la combinación de las predicciones de unión de péptidos a molé-culas MHCI junto con las predicciones de corte por el inmunoprotea-soma y/o el proteasoma incrementan de manera significativa la tasade descubrimiento de epítopos de células T CD8 restringidos por dis-tintas moléculas MHCI, como A*0201, A*0301, A*2403, B*0702, B*2705.

Conclusiones. Hemos desarrollado dos modelos diferentes parapredecir los sitios de corte por el proteasoma y el inmunoproteasoma,que sin duda serán instrumentales para identificar epítopos de célu-las T CD8 protectivos. La predicción de sitios de corte por el inmu-noproteasoma y el proteasoma usando nuestros modelos está dispo-nible para uso público en http://imed.med.ucm.es/Tools/PCPS/.

P-111IDENTIFICACIÓN DE HAPLOTIPOS DEL GEN HAVCR1 ASO-CIADOS CON LOS NIVELES DE EXPRESIÓN DE ARNM Y SUS-CEPTIBILIDAD A ENFERMEDADES AUTOINMUNES. A.M. Esca-lera Cardenas, J.R. García Lozano, C. Abad Molina, B. Torres, O. Fer-nández, A. García, J. Sánchez, A. Nuñez Roldan, J. Martin, M.F. Gon-zález Escribano. Hospital Universitario Virgen del Rocío, Sevilla.

Introducción. El gen HAVCR1 se encuentra localizado en 5q33.2,una región asociada a alergia y enfermedades autoinmunes.

Objetivos. 1) Definir haplotipos en el gen HAVCR1 teniendo en cuen-ta tanto los haplotipos de SNPs disponibles en el Proyecto HapMap comolas variantes estructurales descritas en el exón 4. 2) Investigar la posiblerelación entre estos haplotipos y los niveles de expresión de ARNm. 3)Valorar la posible asociación entre el gen HAVCR1 y la susceptibilidad aartritis reumatoide (AR) y lupus eritematoso sistémico (LES).

Material y métodos. Las 3 variantes ins/del del exón 4 del genHAVCR1 fueron genotipadas mediante análisis de longitud de frag-

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mentos. Los genotipos de 5 “tagSNPs” en este locus y los niveles deARNm fueron determinados usando ensayos TaqMan. Las variablescualitativas se compararon mediante ¯2 y las cuantitativas medianteKruskal-Wallis seguida del test de Dunn para comparaciones múltiples.

Resultados. Definimos 4 haplotipos mayoritarios en nuestra pobla-ción, los dos más frecuentes (haplotipos A y B) llevan las mismas varian-tes estructurales en el exón 4 y cada uno de ellos presenta una de lasdos combinaciones de tagSNPs más comunes en población CEU. Elanálisis de cuantificación reveló que el genotipo B/B presentaba lamayor mediana de nivel de expresión de ARNm (1.870, 0,430-6.110,vs. BX+XX p< 0,0001). Además, la frecuencia del genotipo BB fue sig-nificativamente más alta en pacientes con AR que en controles (12,3%vs. 5,9% en controles, p= 0,046, pc= 0,014, OR=2,23 95% CI 1,23-4,10).

Conclusiones. Nuestros resultados sostienen una relación entrelos haplotipos de HAVCR1 y los niveles de expresión de ARNm y sugie-ren asociación de este gen con enfermedades autoinmunes.

P-112MARCADORES DE RIESGO PARA ENFERMEDADES AUTOIN-MUNES EN LA RUTA CD40/NF-KB Y NIVELES DE EXPRESIÓN DEARNM DE TNFAIP3, TRAF1, C5 Y CD40. A.M. Escalera Cardenas, J.R.García Lozano, C. Abad Molina, J.M. Lucena, A. Nuñez Roldan, M.F.González Escribano. Hospital Universitario Virgen del Rocío, Sevilla.

Introducción. La ruta de señalización CD40/NF-κB ha sido invo-lucrada en la patogénesis de enfermedades autoinmunes. Entre los locirelevantes de esta ruta se encuentran: TNFAIP3, TRAF1-C5 y CD40.

Objetivos. Valorar el posible efecto regulador de 4 alelos de sus-ceptibilidad para artritis reumatoide (RA) y/o lupus eritematoso sis-témico (LES) sobre los niveles de expresión de ARNm de genes impli-cados en la ruta de señalización de CD40/NF-κB.

Material y métodos. Para este estudio de expresión, se seleccio-naron 120 de un total de 384 muestras de donantes de sangre genoti-padas para 4 SNPs confirmados como de riesgo para AR y/o LES. EstosSNPs marcan las regiones donde se encuentran: TNFAIP3 (rs6920220y rs5029939), TRAF1 y C5 (rs3761847) y CD40 (rs4810485). El genoti-pado se realizó utilizando sondas TaqMan. Las 120 muestras se selec-cionaron de manera que los genotipos de los 4 SNPs estuvieran homo-génea y suficientemente representados. Para el estudio de expresiónla cuantificación relativa de ARNm se realizó con ensayos TaqMandiseñados específicamente para los transcritos de TNFAIP3, TRAF1-C5 y CD40. Se compararon los niveles de expresión de cada transcri-to para los diferentes genotipos de los SNPs descritos como de riesgoen cada región utilizando el test de Kruskal-Wallis.

Resultados. No se observaron diferencias estadísticamente signi-ficativas para los diferentes SNPs de riesgo en la expresión de los dife-rentes transcritos estudiados.

Conclusiones. Los alelos de susceptibilidad estudiados no afec-tan a la expresión de los genes TNFAIP3, TRAF1, C5 y CD40.

P-113DETECCION Y CARACTERIZACION DE DOCE NUEVOS ALE-LOS HLA. A. Balas Pérez, F. García Sánchez, J.L. Vicario Moreno. Cen-tro de Transfusión de Madrid, Madrid.

Doce nuevos alelos HLA fueron detectados y posteriormente carac-terizados mediante secuenciación: A*32:19N, B*39:50, B*49:07, Cw*02:23,

Cw*04:42, Cw*05:25, Cw*07:04:03, Cw*07:57, Cw*08:25, Cw*17:05,DRB1*16:15 y DQA1*05:10.

La detección de nuevas variantes alélicas se realizó en el tipaje deintermedia resolución mediante PCR-SSO y tecnología Luminex, debi-do a patrones anómalos de hibridación así como en el tipaje median-te secuenciación de los exones 2/3/4 para genes de clase I y exones2/3 para clase II. La detección del alelo A*32:19N fue motivada pordiscrepancias entre el tipaje serológico y molecular.

Todos los nuevos alelos HLA de clase I presentaron cambios en losexones 2 o 3, produciendo cambios aminoacídicos con la excepción deCw*07:04:03. La secuenciación completa, exon 1 a exon 8, no supusocambios adicionales. En la tabla se detallan los cambios encontradosrespecto al alelo más homologo en cada caso, así como los haplotiposdeducidos que incluyen a cada una de las nuevas variantes HLA.

P-114ESTUDIO DEL HLA Y LA INSULINA, GENES CLÁSICOS DE SUS-CEPTIBILIDAD A DIABETES TIPO 1, EN UNA POBLACIÓN CONDEBUT PEDIÁTRICO Y ADULTO DE LA ENFERMEDAD. L. Espi-no Paisán1, M.Á. Figueredo1, H. De La Calle2, J.L. Santiago1. 1HospitalClínico San Carlos, Madrid. 2Hospital General Universitario Ramón y Cajal,Madrid.

Objetivos. La diabetes tipo 1 (DT1) es una enfermedad autoinmu-ne caracterizada por la destrucción de las células beta del páncreas.Los dos primeros factores genéticos asociados a la enfermedad fueronel HLA de clase II y un VNTR cercano al gen de la insulina que influ-ye en los niveles de expresión del gen.

La edad de debut de la DT1 tiene una distribución bimodal,con un pico alrededor de los 10-12 años y otro pico en la treintena,pero tradicionalmente se ha puesto poco énfasis en las posiblesdiferencias genéticas entre el debut temprano y tardío de la enfer-medad.

El objetivo de este estudio es comprobar si existen diferencias enla susceptibilidad a DT1 conferida por dos loci clásicos, el HLA y lainsulina, en función de la edad de debut.

Métodos. Se han estudiado 417 enfermos de DT1 del área deMadrid, diagnosticados según los criterios de la American DiabetesAssociation (ADA) y 737 controles sanos provenientes de donantes desangre (edad 18-60 años). Se dispone de la edad de debut para 410pacientes de DT1 (1 a 65 años, media=18,43 ± 11,04, mediana=16 años).

Nuevo Alelo A. homólogo Codon/S.nucleot./S. Amino Haplotipo

A*31:19N A*32:01:01 167 TGG>TGA W>Stop A*32:19N-B*14:01-Cw*08:02B*39:50 B*39:06:02 163 ACG>GAG T>E B*39:50-Cw*07:02:01:01B*49:07 B*49:01:01 163 CTG>GAG L>E A*23-B*49:07-Cw*07:01Cw*02:23 Cw*02:02:02 113 TAT>CAT Y>H B*27:05:02-Cw*02:23

116 TCC>TAC S>Y177 GAG>GAC E>D178 ACG>AAG T>K180 CAG>GAG Q>E

Cw*04:42 Cw*04:16 9 TAC>GAC Y>D A*24:02-Cw*04:42-B*35:0211 GCT>GCC21 CAC>CGC H>R

Cw*05:25 Cw*05:01 90 GCC>GAC A>D B*18:01:01-Cw*05:25Cw*07:04:03 Cw*07:04:01 99 TAT>TAC Y>Y A*68:01:02-Cw*07:04:03-B*15:18Cw*07:57 Cw*07:01:05 182 GCG>ACG A>T B*41:01-Cw*07:57Cw*08:25 Cw*08:05 35 CAG>CGG Q>R B*35:03:01-Cw*08:25Cw*17:05 Cw*17:01 35 CGG>CAG R>Q B*41-Cw*17:05DRB1*16:15 DRB1*16:01:01 86 GGT>TGG G>V DRB1*16:15-DQB1*05:02:01DQA1*05:10 DQA1*05:05 76 ATT>GTT I>V DRB1*11-DQA1*05:10-DQB1*03

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El tipaje de HLA se realizó mediante inmunoblot y tecnologíaLuminex. El SNP rs689, en desequilibrio de ligamiento con el VNTRoriginalmente descrito en el gen de la insulina, se genotipó mediantetecnología TaqMan. El análisis estadístico se realizó mediante el testde Chi-cuadrado y test de Mann-Whitney para el análisis de la edadcomo variable continua.

Resultados. En el estudio del HLA, la presencia de DR3 y/o DR4,DR3 homocigoto, DR4 homocigoto, DQ8 o el haplotipo de protec-ción DR2 no mostraron diferencias significativas en función de la edadde debut.

Replicamos el efecto protector del alelo minoritario del polimor-fismo rs689 de la insulina (OR= 0,54 [0,43-0,67]; p= 8,3 x 10-9). El aná-lisis por edad no muestra diferencias significativas (p= 0,43).

Conclusiones. Los alelos de susceptibilidad y protección pre-sentes en el HLA y en la insulina están asociados a la DT1 en la pobla-ción estudiada independientemente de la edad de debut.

P-115EL FENOTIPO HLA INFLUYE EN EL RIESGO Y PRESENTACIONDE DAÑO HEPATICO INDUCIDO POR AMOXICILLIN-CLAVU-LAMICO. F. Ruiz-Cabello Osuna1, C. Stephens2, M. Crespo3, A. More-no1, R. Andrade4, E. Ulzurrun2, M. Romero-Gomez2, Y. Borraz2, M. Luce-na5, M. López-Nevot1. 1Hospital Universitario Virgen de las Nieves, Gra-nada. 2Hospital Universitario Virgen De La Victoria. 3Universidad de Gra-nada. 4Centro de Investigación Biomedica en Red: Ciberehd. 5Facultad deMedicina, Universidad De Málaga; CIBERehd.

La mayoría de las reacciones adversas hepáticas atribuibles amedicamentos son hepatitis de naturaleza idiosincrásica. Aunque elmecanismo patogénico de esta forma de reacción adversa es esca-samente comprendido. El daño hepático (DILI) por Amoxicillin-cla-vulanate (AC-DILI) tiene principalmente una manifestación colesta-sico/mixta (Chol/Mix) en población Norte-Europea. Sin embargohasta un 30% de población española presentan daño hepatocelular(HC). El AC-DILI, puede por tanto tener una base genética.

Objetivos. Investigar la posible asociación entre los alelos HLA yla susceptibilidad a desarrollar AC-DILI y a su asociación al fenotipoclínico.

Material y métodos. Se ha realizado genotipado de alta resolu-ción de los locus de HLA clase I (A, B y C) y clase II (DRB1, DQB1)mediante PCR y SBT en 57 pacientes españoles diagnosticados de AC-DILI y 400 controles Caucasianos sanos.

Resultados. El alelo HLA B*1801 fue encontrado significaniva-mente incrementado en pacientes con DILI y daño de tipo HC (10/17,59%; P= 0,00005) si se comparan con el grupo control. B*1801 apareciótambién en pacientes más jóvenes (55 vs 66 years), que requirieron hop-sitalización (76% vs 46%) y en general de peor pronóstico de DILI (1fallecido, 2 transplantados vs 0). En contraste pacientes portadores delos alelos HLA de clase II DRB1*1501-DQB1*0602, predominó el dañoChol/Mix (12/13, 92%; P= 0,009). El alelo HLA-A*0101 y el haplotipoDRB1*0701-DQB1*0202 pereció estar menos frecuentemente represen-tado en los pacientes con AC-DILI (23,5% vs 7%; P= 0,006 y 30% vs15%; P= 0,03, respectivamente).

Conclusiones. En conclusión, el alelo HLA B*1801 parece predis-poner a AC-DILI de tipo HC con peor pronóstico, mientras que el haplo-tipo DRB1*1501-DQB1*0602 parece jugar un papel en el daño Chol/Mix.Diferencias étnicas entre las distintas poblaciones en el alelo B*1801podría explicar las variaciones del daño hepatocelular en AC-DILI.

P116INTERACCIÓN ENTRE IL23R Y TLR9 EN LA SUSCEPTIBILIDADA ENFERMEDAD DE CROHN. L.M. Medrano De Dios, B. DemaJiménez, J.L. Mendoza, M.C. Núñez Pardo De Vera. Hospital Clínico SanCarlos, Madrid.

Objetivos. La enfermedad de Crohn es una enfermedad inflama-toria intestinal de etiología desconocida. Se conoce la implicación deIL23R en la enfermedad, y se ha postulado una interacción entre poli-morfismos de este gen y de TLR9. Dado el papel de ambos en el man-tenimiento de la homeostasis intestinal, nuestro estudio se centró enla búsqueda de interacciones entre polimorfismos de ambos genes.

Material y métodos. Se llevó a cabo un estudio caso-control, inclu-yendo 416 individuos con enfermedad de Crohn y 495 individuos sanosempleados como control. Todas las muestras correspondían a individuosblancos de origen español y fueron recogidas en la comunidad de Madrid(Hospital Clínico San Carlos). Se estudiaron 6 polimorfismos de un úni-co nucleótido (SNPs): rs10004819, rs7517847 y rs11209026, pertenecien-tes al gen IL23R; y rs352162, rs187084 y rs5743836, pertenecientes al genTLR9. El genotipado se llevó a cabo mediante tecnología TaqMan.

La comparación de las frecuencias génicas en el caso-control serealizó mediante el test chi-cuadrado o test exacto de Fisher. Las inter-acciones se evaluaron en primer lugar en el grupo de enfermos, median-te tablas estratificadas considerando los distintos polimorfismos estu-diados en IL23R respecto a los analizados en TLR9. La detección deuna interacción en este grupo, conllevó su posterior análisis en el gru-po de controles y la comparación caso-control.

Resultados. El estudio caso-control para el gen TLR9 no mostróningún resultado significativo, aunque la frecuencia del alelo mino-ritario del polimorfismo rs352164 se encontraba ligeramente aumen-tada en enfermos (p=0,09).

Al estudiar la interacción génica previamente descrita, se observóuna interacción entre los polimorfismos IL23R_rs10004819 yTLR9_rs5717847. Sin embargo, el efecto no era similar al publicado. Lainteracción estaba presente en el grupo de enfermos (p=0,0098) y noen los controles (p=0,77), pero el estudio caso-control no llegaba a sersignificativo (p= 0,08; OR= 1,48 I.C. 95%= 0,93-2,36 para la presenciadel alelo TLR9 rs5743836_C en individuos IL23R rs10004819_CC). Adi-cionalmente, se obtuvo un resultado significativo al analizar los SNPsIL23R_rs7517847 y TLR9_rs352162, observándose un efecto protectoren individuos portadores del alelo minoritario en este polimorfismode IL23R sólo si además presentaban el genotipo CC en TLR9_rs352162(p=0,0003, OR= 0,43 I.C. 95% = 0,26-0,70).

Conclusiones. El efecto protector del alelo minoritario del poli-morfismo IL23R_ rs7517847 parece afectar sólo al subgrupo de pacien-tes caracterizados por poseer el genotipo CC en TLR9_ rs352162.

P-117ANÁLISIS DE CARACTERÍSTICAS INMUNOGÉNICAS EN EPÍ-TOPOS DE LINFOCITOS T. D. De Pereda, C.M. Diez Rivero, P.A. RecheGallardo. Facultad de Medicina - Universidad Complutense de Madrid, Madrid.

Objetivos. La respuesta inmune de las células T está mediada porel reconocimiento a través de su receptor (TCR) de los antígenos pre-sentados por moléculas del complejo principal de histocompatibilidadde clase I (MHCI). Aquí, hemos estudiado si existen característicasintrínsecas en los péptidos inmunogénicos que les hagan más fácil-mente reconocibles por el TCR.

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Material y Métodos. El análisis de los péptidos inmunogénicos seha realizado a partir de dos conjuntos distintos no solapantes de pépti-dos de 9 aminoácidos con alta afinidad de unión a moléculas MHCI obte-nidos de las bases de datos EPIMHC, NHCBN y MHCPEP. Uno de losconjuntos está compuesto por 101 péptidos inmunogénicos (HH), mien-tras que el otro está formado por 470 péptidos no-inmunogénicos (HN).

Hemos analizado la frecuencia de cada aminoácido en cada posi-ción del péptido para cada conjunto. Para ello, hemos utilizado los 101péptidos HH y 101 péptidos del conjunto HN –elegidos aleatoriamen-te–, para analizar la misma cantidad de péptidos de cada conjunto.

También hemos analizado las propiedades físico-químicas de losaminoácidos que conforman los péptidos de ambos conjuntos. El estu-dio ha sido realizado con 101 péptidos HH y 101 HN. El análisis se harepetido 100 veces utilizando 100 conjuntos de 101 péptidos HN dife-rentes seleccionados al azar.

Por último, el modelado de la diferencia entre estos dos conjuntosde péptidos se ha abordado como un problema de clasificación, utili-zando algoritmos de inteligencia artificial en el entorno WEKA y emple-ando diversas codificaciones de secuencias distintas, así como combi-nación de las mismas: binaria, Blosum, propiedades de secuencia, com-posición de aminoácidos, composición de dipéptidos y propiedadesglobales. Estos análisis se han realizado tanto considerando los 9 resi-duos del péptido, como únicamente aquellos residuos relevantes porsu interacción con el TCR (P1, P4, P7 y P8). Los resultados de las cla-sificaciones han sido evaluados en experimentos de validación cruza-da determinando la sensitividad (SE), la especificidad (SP), la exacti-tud (ACC) y el coeficiente de correlación de Matthews (MCC).

Resultados. Hemos obtenido diferencias en las frecuencias de ami-noácidos para cada posición de los péptidos de ambos conjuntos. Deigual manera, las propiedades físico-químicas de los aminoácidos decada posición difieren entre un conjunto y otro. En ambos casos estasdiferencias denotan cierta tendencia, pero no podemos extraer ningu-na norma clara de ellas.

Los modelos óptimos de clasificación se obtienen al utilizar algo-ritmos SMO (“Sequential Minimal Optimization”) con una codifica-ción basada en las propiedades físico-químicas de los aminoácidos.Tomando un umbral tal que la sensitividad y la especificidad sean igua-les (SE = SP = 0,67), obtenemos un valor de ACC = 0,67 y MCC = 0,24.Considerando únicamente las posiciones de contacto con el TCR losresultados obtenidos son significativamente peores.

Conclusiones. El análisis de los péptidos inmunogénicos y no-inmunogénicos demuestra que, basándonos en la abundancia de ami-noácidos o en sus propiedades físico-químicas, ambos conjuntos noson claramente distinguibles. Sin embargo, los modelos de clasifica-ción desarrollados sí son capaces de diferenciar entre ambos conjun-tos. Si las propiedades inmunogénicas de los péptidos dependieran dela restricción por una molécula MHC específica, nuestros modelosde clasificación podrían mejorar si fueran entrenados únicamente conpéptidos restringidos por los mismos alelos MHC.

P-118ESTUDIO DE EPISTASIS GENÉTICAS EN PACIENTES ESPAÑO-LES DE ARTRITIS REUMATOIDE. M.N. Perdigones Borderías1, B.Fernández-Gutiérrez1, D. Pascual-Salcedo2, M.Á. Figueredo Delgado1.1Hospital Clínico San Carlos, Madrid. 2Hospital Universitario La Paz, Madrid

Objetivos. A pesar de los grandes avances obtenidos en los últimosaños en el conocimiento de la base genética de la artritis reumatoide (AR),

restan por descubrir el 50% de los factores hereditarios asociados a estaenfermedad. Por ello, tras la era de estudios de barrido genómico com-pleto (GWAS), cada vez más trabajos se centran en el análisis de interac-ciones genéticas implicadas en la susceptibilidad a esta enfermedad. Dis-tintos estudios han propuesto la existencia de epistasis entre polimorfis-mos de un solo nucleótido (SNPs) localizados en los genes IL1-SELS,RTN4-GLIS3, MIF-TRAF1 y MIF-CTLA4, aunque no existen publicacio-nes que validen su implicación. Nuestro trabajo tiene como objetivo repli-car estas interacciones genéticas en pacientes españoles de AR.

Materiales y mñetodos. hemos analizado aproximadamente 900pacientes de AR diagnosticados según los criterios del ACR (AmericanCollege of Rheumatology) procedentes de dos hospitales madrileños (Hos-pital Clínico San Carlos y Hospital Universitario La Paz). El DNA seextrajo mediante una técnica estándar a partir de sangre periférica yel genotipado de los SNPs rs16944 (IL1), rs28665122 (SELS), rs17046477(RTN4), rs7033413 (GLIS3), rs755622 (MIF), rs3761847 (TRAF1) yrs3087243 (CTLA4) fue realizado mediante tecnología Taqman. El estu-dio de interacciones se realizó mediante recuento directo y el análisisestadístico con el software EpiInfo v.6.02.

Resultados. En nuestro estudio de la interacción IL1-SELS no seobservaron diferencias significativas en la distribución de portadores/noportadores del alelo A del rs28665122 (SELS) entre individuos homo-zigotos para el alelo minoritario del rs16944 (IL1) (38 de 123, 30,9%) yel resto de enfermos de AR (228 de 889, 25,6%; p=0,215; OR=1,30 (0,84-1,99)), a pesar de que la potencia para detectar ese efecto descrito ini-cialmente (OR=2,26) era de un 97%. El análisis de la interacción RTN4-GLIS3 no detecta variaciones significativas de las frecuencias genotí-picas del marcador rs17046477 (RTN4) al ser estratificado por los dis-tintos genotipos del marcador rs7033413 (GLIS3). Tampoco se obser-varon diferencias estadísticamente significativas de la distribución delrs755622 (MIF) al ser estratificado por los distintos genotipos de losSNPs rs3761847 (TRAF1) o rs3087243 (CTLA4) a pesar de que la poten-cia de nuestros estudios era suficiente.

Conclusiones. Las interacciones genéticas descritas entre SNPslocalizados en los genes IL1-SELS, RTN4-GLIS3, MIF-TRAF1 y MIF-CTLA4 no se replican en pacientes españoles de AR.

P-119UN MÉTODO SIMPLIFICADO PARA EL CRIBADO Y LA IDEN-TIFICACIÓN EXACTA DEL ALELO ASOCIADO A LA ESCLERO-SIS MÚLTIPLE HLA-DRB1*1501. E. Cisneros, M. Moraru, R. De Pablo,C. Vilches. Hospital Puerta De Hierro, Majadahonda.

La investigación en esclerosis múltiple requiere con frecuencia ladetección de individuos portadores del alelo HLA-DRB1*15:01. Sinembargo, la complejidad del sistema HLA hace que esta labor puedaquedar restringida a laboratorios especializados en Histocompatibi-lidad. Para superar esta limitación, hemos desarrollado un método quepermite la detección simple, robusta y altamente específica del aleloDRB1*15:01 a laboratorios no especializados en Histocompatibilidad.Nuestro método combina, en una sola reacción, las ventajas de dos téc-nicas de uso generalizado para la tipificación HLA: la simplicidad y larapidez de la PCR- SSP y la alta resolución del SBT. Además, el méto-do supera las complejidades técnicas asociadas a cada abordaje porseparado. La realización de una única reacción de amplificación en unsolo tubo permite hacer un cribado de los individuos DR2 positivossin necesidad de realizar una tipificación HLA completa. El remanen-te de la reacción sirve para identificar el alelo DRB1*15:01 mediante

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secuenciación directa con un único cebador; a diferencia del SBT con-vencional, los ADNs DR2-positivos no necesitan ser reamplificados.Finalmente, la secuencia de nucleótidos así obtenida se compara “online” con las secuencias HLA oficiales depositadas en la base de datospública IMGT/HLA (http://www.ebi.ac.uk/Tools/blast2/nucleoti-de. html?IMGTHLA). En comparación con otros ensayos clásicos parala detección de alelos asociados a la esclerosis múltiple (PCR-SSP, PCR-SSOP y PCR en tiempo real), donde se requiere un número de cebado-res o de sondas muy elevado para obtener una tipificación de alta reso-lución, nuestro método resulta menos complejo y permite asignar elalelo DRB1*15:01 sin ninguna ambigüedad.

En conclusión, nuestro abordaje permitiría facilitar y agilizar lainvestigación en esclerosis múltiple haciendo accesible la identifica-ción específica del alelo DRB1*15:01 a los laboratorios de investigaciónen Neurociencias.*Este estudio ha sido financiado con el proyecto BFU2005-04622 (Mº Educación y Ciencia).

P-120OLIGOMORFISMOS DE HLA-E Y VARIANTES EN LOS PÉPTI-DOS DE UNIÓN DERIVADOS DE HLA-B EN EL SÍNDROME DEBEHÇET. A. Clemente Ximenis, A. Cambra Conejero, C. Crespí Bes-tard, N. Matamoros Florí, M.R. Julià Benique. Hospital Universitari SonDureta, Palma de Mallorca.

Objetivos. El único ligando conocido de los receptoresCD94/NKG2A, B o C es el complejo compuesto por la molécula HLA-E ligada al péptido que presenta. Dicho complejo colabora en la regula-ción de la respuesta citotóxica mediada por las células NK y otros linfo-citos. HLA-E presenta específicamente péptidos derivados de la secuen-cia líder de moléculas HLA clásicas y HLA-G. Existen dos oligomorfis-mos principales de HLA-E y la funcionalidad del complejo HLA-E/pép-tido depende de cuál de ellos interviene y también de la segunda posi-ción aminoacídica del péptido (P2), que puede ser Met o Thr. HLA-B*51está fuertemente asociado al Síndrome de Behçet (SB) y la configuraciónde su secuencia líder (Thr en P2) apunta a una inhibición ineficiente dela respuesta citotóxica mediada por HLA-E. El objetivo del presentetrabajo consiste en definir la distribución de oligomorfismos de HLA-Een pacientes con SB, evaluar su asociación con las variantes de HLA-Bque presentan Thr en P2 y analizar su correlación con la clínica.

Métodos. Tipificación de HLA-E mediante PCR-SSP con ceba-dores específicos de secuencia, diseñados para discriminar los cam-bios de nucleótido en los codones 107 y 157. Tipificación de HLA-Bmediante PCR-SSP comercial. Se estudian 44 pacientes diagnosticadosde SB y 100 individuos sanos.

Resultados. Sólo se detectaron 2 alelos en ambos grupos, E*0101y E*0103, con frecuencias alélicas similares a las descritas en poblacióncaucasoide. No encontramos diferencias estadísticamente significati-vas en la distribución genotípica de los alelos de HLA-E ni en la pre-sencia de Thr o Met en la P2 de la secuencia líder de HLA-B entrepacientes y controles.

Conclusiones. Según nuestros resultados, en la predisposición gené-tica a padecer el Síndrome de Behçet no son determinantes los alelos deHLA-E, contrariamente a otros estudios en los que se asocia un riesgoreducido a HLA-E*0101. Tampoco se observa asociación entre la dis-tribución de los diferentes péptidos derivados de HLA-B y el riesgo depadecer la enfermedad. Son necesarios estudios funcionales para com-probar si en la regulación de los linfocitos citotóxicos de estos pacientesson determinantes las diferencias en los complejos HLA-E/péptido.

P-121ANALISIS DE LOS MARCADORES CELIACOGÉNICOS HLA-DQA1 Y –DQB1 EN PACIENTES CON ENFERMEDAD INFLAMA-TORIA INTESTINAL. D. Planelles1, M.M. Bosca2, M. Minguez2, M.Rodríguez-Cebria1, J. Tosca2, E. Alba1, R. Granell1, D. Jarque1, E. Laguar-da1, A. Benages2, R. Roig1. 1Centro de Transfusión de La Comunidad Valen-ciana, Valencia. 2Hospital Clínico Universitario, Valencia.

Se ha sugerido que la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y laenfermedad celíaca (EC) puedan tener alguna relación debido al hechode que ambas son patologías inflamatorias crónicas que comprome-ten el intestino, desarrollan una respuesta inmune similar relacionadacon un patrón Th1 de citocinas y se consideran enfermedades poligé-nicas complejas en cuya etiopatogenia interaccionan factores genéti-cos, inmunológicos y ambientales. Entre los genes de susceptibilidadal desarrollo de EC se ha identificado el haplotipo HLA-DQA1*05:01-DQB1*02:01 como factor de riesgo primario. Sin embargo, los estudiosde asociación de genes candidatos en la EII han resultado inconsisten-tes y heterogéneos. El objetivo de este estudio ha sido evaluar la pre-valencia de los alelos celiacogénicos HLA-DQA1 y -DQB1 en pacien-tes con EII.

El estudio ha incluido una serie de 332 pacientes con EII en los quese ha realizado un análisis de frecuencias de los haplotipos marcado-res clásicos de celiaquía (HLA-DQA1*05:01-DQB1*02:01 y DQA1*03-DQB1*03:02) y no-clásicos (HLA-DQA1*02:01-DQB1*02:02). Los resul-tados obtenidos han sido comparados frente a un grupo control de 577individuos sanos y con respecto a una serie de 185 pacientes celíacos,todos ellos de la misma región geográfica.

En la población de pacientes con EII la frecuencia del haplotipoHLA-DQA1*05:01-DQB1*02:01 fue estadísticamente similar a la delgrupo control (16,7% vs 20,6%) y significativamente diferente de la delgrupo de pacientes celíacos (71,3%). Tampoco se observó variación sig-nificativa cuando se comparó la frecuencia del genotipo heterocigotoHLA-DQA1*02:01-DQB1*02:02 + DQA1*05:05-DQB1*03:01 entre pacien-tes con EII y controles (3,3% y 3,4%, respectivamente); por el contra-rio, sí se observó un incremento significativo de la frecuencia de estegenotipo en los pacientes celíacos (21,6%). La frecuencia del haplotipoHLA-DQA1*03-DQB1*03:02, similar entre el grupo de pacientes conEII (12,5%) y la población control (18%), apareció significativamentedisminuida en los pacientes con EC (5,4%).

En conclusión, mientras que en nuestra población el haplotipoHLA-DQA1*05:01-DQB1*02:01 y el genotipo HLA-DQA1*02:01-DQB1*02:02 + DQA1*05:05-DQB1*03:01 se confirman como marcado-res de alto riesgo de celiaquía, no parecen ser factores de predisposi-ción para desarrollar EII, por lo que el mecanismo de la potencial aso-ciación entre EII y EC no parece tener base en los genes HLA de claseII DQA1-DQB1.

P-122¿EL GENOTIPO -1478 DEL/DEL EN EL GEN SOCS1 PROTEGECONTRA EL DESARROLLO DE LA LEISHMANIASIS CUTÁNEALOCALIZADA? K. Sánchez, M. Fernández-Mestre. IVIC, DependenciaFederal, Venezuela.

Objetivo. La Leishmanisis es una enfermedad infecciosa causada porel parásito protozoario Leishmania. En Venezuela, específicamente enel Estado Miranda (Municipios Brión y Zamora) existen varias zonasagrícolas que son endémicas para la forma localizada de la Leishmania-

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sis Cutánea (LCL). Sin embargo, en esas zonas existen individuos queno llegan a padecer la enfermedad, sugiriendo la existencia de algún fac-tor que confiere protección al desarrollo de LCL. En virtud de ello, nosplanteamos evaluar la distribución del polimorfismo -1478 CA/del enla región promotora del gen supresor de la señalización de citoquinas 1(SOCS1) en individuos venezolanos sanos y con LCL, con la finalidadde determinar posibles asociaciones entre alelos y/o genotipos del genevaluado con el desarrollo o expresión clínica de la enfermedad.

Materiales y Métodos. La sangre total fue colectada de 100 indi-viduos con LCL, diagnosticados clínica, inmunológica y parasitoló-gicamente y 71 individuos sanos, procedentes de la misma zona, conprueba de Montenegro negativa, sin cicatrices sospechosas de leishma-niasis, ni historia clínica de LCL. El polimorfismo -1478 CA/del sedeterminó mediante PCR-RFLP. Las frecuencias alélicas y genotípicasse determinaron por conteo directo, las diferencias entre grupos conla prueba de Ji-cuadrado y la intensidad de la asociación como OR.

Resultados. Se detectó la presencia de la eliminación en la posi-ción -1478 del gen SOCS1. La distribución genotípica en el grupo depacientes fue CA/CA: 0,77; CA/del: 0,22 y del/del: 0,01; y en el gru-po control CA/CA 0,78; CA/del: 0,14 y del/del 0,8. Al establecer com-paraciones, observamos una frecuencia significativamente disminui-da del genotipo recesivo del/del en los pacientes LCL con respecto algrupo control (p 0,021; OR= 0,13; IC95%=0,01-0,92).

Conclusión. Los resultados indican que el polimorfismo del genestudiado puede ser relevante en la infección y desarrollo de la LCL.Sugiriendo que la presencia del genotipo del/del estaría confiriendoprotección a al desarrollo de la infección por Leishmania.

P-125FRECUENCIA DEL ALELO HLA-B*57:01 EN LA POBLACIÓN DECANTABRIA INFECTADA POR HIV Y SU ASOCIACIÓN CON ELHAPLOTIPO ANCESTRAL B57.1. M.Á. Hoz, P. Sánchez-Velasco,M.C. Fariñas, S. Echevarría, D. García-Palomo, M. Gutiérrez-Cuadra,F. Ausín, F. Leyva-Cobián, J.G. Ocejo-Vinyals. Hospital UniversitarioMarqués de Valdecilla, Santander.

Objetivos. Los objetivos de este estudio son: (i) estudiar la preva-lencia del alelo HLA-B*57:01 en la población de Cantabria infectadacon el HIV y atendida en la Unidad de Enfermedades Infecciosas denuestro centro; (ii) determinar la frecuencia de HLA-A y HLA-Cw y(iii) estudiar la asociación con el haplotipo ancestral B57.1 (HLA-A*01,B*57:01, Cw*06, DRB1*07, y DQB1*03:03) en aquellos individuos por-tadores del B*57:01 y su asociación con polimorfismos de otros genesmuy próximos en el cromosoma 6 (Hsp70-Hom, HCP5, HLA-Cw* enla región 5’ no traducida)

Material y métodos. Se analizaron 1000 muestras de sangre de indi-viduos caucásicos infectados con HIV. El DNA genómico se extrajomediante un método semiautomático. La determinación de HLA-I (A*,B*, Cw* y HLA-II (DRB1* y DQB1*) se realizó mediante SSO-xMAP enun Luminex. En las muestras que resultaron ser HLA-B*57 o DQB1*03se determinaron los alelos mediante PCR-SSP. En el caso del polimor-fismo de Hsp70-Hom se empleó la técnica de PCR-ARMS. Para los otrosdos polimorfismos (HCP5 y HLA-Cw*), los genotipos se determinaronmediante secuenciación utilizando el kit MegaBACE sNuPe.

Resultados. Setenta y cuatro pacientes (7,4%) resultaron fueronHLA B*57, 67 (90,5%) de los cuales mostraron el alelo B*57:01. Veinti-cinco de estos 67 individuos con el alelo B*57:01 (37%), no presenta-ban el haplotipo ancestral DRB1*07, DQB1*03:03.

Veintiocho pacientes (41,8%) no presentaban el antígeno Cw*06.Ocho de los pacientes con HIV portando el alelo B*57:01 presentabanun genotipo Hsp70-Hom CC, siendo 8 TT y el resto CT. La frecuenciade los dos alelos C y T fue de un 50 % cada uno.

Conclusiones. La presencia del haplotipo ancestral 57,1, y en con-creto, del haplotipo parcial DRB1*07, DQB1*03:03 y de Cw*06 en nues-tra población fue menor que la descrita en otras poblaciones. Igual-mente, las frecuencias de los alelos C y T del gen Hsp70-Hom son muydistintas a las comunicadas para individuos normales de raza caucá-sica. Se analizan estos y los resultados obtenidos de los polimorfismosen HCP5 y HLA Cw*.

Aunque la presencia del alelo B*57:01 junto con el haplotipoDRB1*07, DQB1*03:03 se ha asociado con un valor predictivo positivodel 100% y negativo del 97%, respectivamente, de hipersensibilidadfrente al abacavir, la falta de estudios concluyentes hizo que en aque-llos individuos que portaban el alelo B*57:01 pero con ausencia delhaplotipo ancestral B57.1 se desanconsejase también el tratamiento conabacavir.

P-126EL LOCUS IGH DEL PEZ TELEÓSTEO MEDAKA (ORYZIAS LATI-PES). S. Magadán1, C. Sánchez Espinel2, F. Gambón Deza3. 1InstitutoEspañol de Oceanografía (IEO). Centro Oceanográfico de Vigo. 2Facultadde Biología, Universidad de Vigo. 3 Hospital Meixoeiro, Complejo Hospitala-rio Universitario de Vigo (CHUVI).

Introducción. Los peces óseos presentan un sistema inmunológi-co que ha evolucionado de forma independiente de los animales quepasaron a tierra desde hace 400 millones de años.

Objetivo. Estudio y análisis del locus IGH del pez teleósteo Ory-zias latipes, uno de los peces más estudiados en laboratorio.

Métodos. Para llevar a cabo la búsqueda de los anticuerpos quepueden producirse buscamos en múltiples librerías EST que se hanhecho de este animal y que están introducidas en el Genbank. Para elanálisis informático se empleó software diverso como NTI-invitroge-ne Vector program, FGNES y MEGA4 para el estudio filogenético.

Resultados. Hemos encontrado cinco zonas en una región del cro-mosoma ocho donde existen exones de tipo Cµ y Cδ.

Encontramos tres formas diferentes del anticuerpo de la clase IgMy no encontramos ninguna secuencia de la clase IgD. Dos de las IgMencontradas son de membrana. Una de ellas es una IgM transmembra-na corta en la que faltan los dominios CH3 y CH4 siendo codificadapor la zona 1 del locus. Las otras dos IgM encontradas son codificadasen la Zona 4 del locus siendo una transmembrana y la otra secretada.En la forma transmembrana el splicing con el exón transmembrana serealizan desde un lugar críptico dentro del exón Cµ3. La IgM secreta-da está compuesta por los cuatro dominios clásicos de esta inmuno-globulina.

Interpuestos entre las zonas donde se encuentran los genes paralas regiones constantes están las regiones VH. Hemos identificado 26regiones que conforman cuatro familias.

Conclusiones. La disposición de lo exones, aparentemente desor-denada, indica la presencia de recientes procesos de recombinación yduplicación que han barajado los genes. Esta disposición hace suges-tivo de que muchos de ellos no formen parte de anticuerpos reales.El hecho de que se encuentren interpuestos exones de un anticuerpou otro lo asevera. La expansión de las familias VH ha sido reciente yestán relacionadas con las presentes en otros teleósteos.

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P-127FRECUENCIA DEL POLIMORFISMO FUNCIONAL MMP-9 -1562(C>T) EN MUJERES CON PREECLAMPSIA EN LA REGIÓNDE CANTABRIA. I.C. Vaquero Mejia, J.G. Ocejo-Vinyals , F.J. LlorcaDiaz, J. De Miguel Sesmero, F. Leyva Cobian. Hospital UniversitarioMarques de Valdecilla, Santander.

Objetivos. Los mecanismos implicados en el desarrollo de la pre-eclampsia son desconocidos. Aunque se conocen muchos de sus aspec-tos, otros permanecen sin ser esclarecidos. Múltiples factores genéti-cos y ambientales parecen intervenir en la fisiopatología de esta enfer-medad. Las metaloproteinasas de la matriz extracelular (MMPs), fami-lia de enzimas que descomponen el colágeno en diferentes partes delorganismo incluida la decidua materna, especialmente la MMP-9, hansido previamente involucradas en preeclampsia. Se ha descrito un poli-morfismo en el gen de la MMP-9, (C-1562T), que afecta la actividad dela enzima.

Nuestro objetivo ha sido determinar si el genotipo C-1562T MMP-9 puede tener alguna relación con un mayor riesgo de preeclampsiaen mujeres embarazadas de la región de Cantabria.

Material y Métodos. Se estudiaron 110 mujeres con antecedentede preeclampsia diagnosticadas entre el 2004 y 2010 en el hospital uni-versitario Marques de Valdecilla y 221 controles sanos. Se extrajo elDNA genómico de todas las muestras mediante un procedimientosemiautomático. Mediante técnica de PCR-RFLP se analizó el polimor-fismo de MMP-9.

Se analizaron los diferentes alelos y genotipos y se realizó el estu-dio estadístico mediante el uso de Chi cuadrado o test exacto de Fis-her.

Resultados. La presencia de los alelos C y T entre casos y con-troles mostró una diferencia estadísticamente significativa (p= 0,001,OR 2,09). El genotipo homocigoto TT se encontró en un 12,7% de muje-res con preeclampsia y en un 2,7% de los controles (p= 0,0008, OR 5,23).

Discusión. Nuestros datos se correlacionan con resultados obte-nidos en la población brasileña y difieren de los reportados en otraspoblaciones. Aunque el alelo T no está presente en un elevado porcen-taje de pacientes con preeclampsia versus controles (21,8% vs 11,8%)),de estos resultados, podría deducirse una asociación del mismo condesordenes hipertensivos del embarazo. Harían falta más estudios deeste tipo para demostrar su papel en la fisiopatología de la preeclamp-sia.

P-128ASOCIACION DEL POLIMORFISMO FUNCIONAL C677T DELGEN MTHFR CON PREECLAMPSIA EN LA POBLACION DECANTABRIA. I.C. Vaquero Mejia, J. Ocejo-Vinyals , F.J. Llorca Díaz, J. De Miguel Sesmero, F. Leyva Cobian. Hospital Universitario Marquesde Valdecilla, Santander.

Objetivos. El gen MTHFR localizado en el cromosoma 1(1p36.3)codifica para una proteína de 77 K Da, la enzima metiltetrahidrofola-to reductasa. Esta proteína resulta clave en el metabolismo del folatoy la homocisteína. Se ha descrito una variante polimórfica funcionalC>T en la posición 677 (C677T) del gen, localizada en el exón 4, quedetermina la sustitución del aminoácido valina por alanina en su domi-nio catalítico. Esta sustitución da lugar a una variante termolábil de laenzima la cual presenta una actividad del 50%. Los individuos que pre-sentan dicha variante en homozigosis, presentan niveles elevados de

homocisteína en sangre. El polimorfismo C677T se ha estudiado comofactor de riesgo en mujeres con complicaciones durante el embarazo.Nuestro objetivo principal es valorar si la hiperhomocisteinemia deri-vada de este polimorfismo podría ser utilizada como marcador de ries-go para enfermedad vascular placentaria y / o preeclampsia.

Material y Métodos. Se estudiaron 110 mujeres con antecedentede preeclampsia y 221 controles sanos (mujeres con embarazo normal).Se extrajo el DNA genómico de todas las muestras mediante un pro-cedimiento semiautomático. Mediante técnica de PCR-RFLP se anali-zó el polimorfismo de este gen. El estudio estadístico de la distribu-ción de los diferentes genotipos se realizó mediante el test de Chi cua-drado o test exacto de Fisher.

Resultados. La distribución genotípica entre grupos mostró dife-rencias estadísticamente significativas, encontrando el genotipo homo-cigoto CC en un 39% de mujeres con preeclampsia vs 73% de los con-troles (p< 0,00001, OR 0,23). El genotipo homocigoto TT estaba presen-te en el 16% de los casos vs el 1,35% de los controles (p< 0,00001, OR14,22); finalmente, el genotipo heterocigoto CT se encontró en un 44%de casos y en un 25% de los controles (p=0,0006, OR 2,37).

Conclusiones. La hiperhomocisteinemia determinada por la pre-sencia del alelo T en homozigosis podría jugar un papel en la fisiopa-tología de la preeclampsia. En conclusión, en nuestra población, elgenotipo TT del polimorfismo C677T del gen de la MTHFR parece estarasociado a una susceptibilidad de desarrollar preeclampsia durante elembarazo.

P-129COEXISTENCIA EN UN MISMO PACIENTE DE 3 SINDROMESLINFOPROLIFERATIVOS. ESTUDIO FENOTIPICO Y DE CLONA-LIDAD PRE Y POST-TRATAMIENTO. P. Garrido, P. Jiménez, C. Sán-chez, F. Valero, P. López, M. Almagro, J.M. De Pablos, P. Navarro, A.Cabrera, M. Jurado , F. Ruiz-Cabello. Hospital Universitario Virgen delas Nieves, Granada.

Introducción. Se presenta el caso de un paciente de 63 años en quese diagnostican de forma simultánea 3 Sindromes Linfoproliferativos:Tricoleucemia, Linfocitosis B monoclonal con criterios de LeucemiaLinfática Crónica (LLC-B) y Leucemia de Linfocitos Grandes Granu-lares (LGL). A destacar el predominio en sangre periférica (sp) tantopor mielograma como por Citometría de Flujo de linfocitos de LLC yLGL, mientras que en médula ósea (MO) la célula predominante erael tricoleucocito.

Material y métodos. El análisis por Citometría de Flujo se ha rea-lizado mediante marcaje directo con Ac monoclonales en 3-5 colores(BD Biosciences) en un Citómetro FACSCanto empleando el FACS-Diva software (BD Biosciences) para su análisis. El estudio de clona-lidad del receptor del linfocito B (BCR) y T (TCR) se obtuvo a partir deDNA extraído tanto en sangre periférica como en médula ósea siguien-do el protocolo BIOMED-2 descrito por Van Dongen.

Resultados. En la fase pre-tratamiento destaca el predominio porinmunofenotipo de sp de un 13% de células con fenotipo de LLC-B yun 4% de células con fenotipo de tricoleucocitos mientras que en MOla célula predominante era el tricoleucocito (21%). Tras la instauraciónde tratamiento disminuyó de forma considerable la población de tri-coleucocitos en M.O. En el estudio de clonalidad basal destacaban 2expansiones en FR2 en MO a 229 pb correspondiente a los tricoleuco-citos y otra de menor intensidad a 264 pb de los linfocitos de LLC y 3expansiones en FR3 a 106pb, 123 y 126 pb respectivamente. En sangre

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periférica predominaba por el contrario la expansión en FR2 de 264pb(LLC-B). Tras el tratamiento han desaparecido en MO las expansionesen FR2 y FR3 y en sangre periférica sólo persiste una pequeña expan-sión en FR3 a 106pb (LLC-B). La población de LGL ha permanecidoconstante en todo momento.

Discusión. Se presenta el caso de un paciente con diagnósticosimultáneo de 3 Síndromes Linfoproliferativos en el que se ha ins-taurado tratamiento quimioterápico frente a la clona predominante.Como aportación de esta comunicación se documentan los estudiosde clonalidad realizados tanto pre como post-tratamiento, mostrándo-se la evidencia molecular de la efectividad terapeútica.

SESIÓN 11: INMUNOTERAPIA

Moderadores: Luis AlvarezVallina (Madrid)Francisco Lozano (Barcelona)

P-130TECNOLOGÍA PUNTA EN LOS PROCESOS Y PLANTAS DE PRO-DUCCIÓN DE IGG. T. De Agustin De Oro, L. Höfferer, A. Nigsch. CSLBehring, Esplugues del Llobregat.

CSL Behring ha desarrollado una nueva tecnología punta en losprocesos de producción de inmunoglobulinas, consiguiendo dos pro-ductos líquidos, uno al 20% para la administración subcutánea, IgPro20y otro al 10% para administración intravenosa (IgPro10, Privigen®).Ambos están formulados con L- Prolina y concentrados para la obten-ción de una cantidad final de proteína de 200g/l o 100 g/l. Debido alos puntos en común de los procesos de producción, ambos se fabri-can en las mismas plantas de producción. En Berna (Suiza), se cons-truyeron dos plantas con tecnología punta, la M99 y la IgLAB, de acuer-do con los estándares tecnológicos actuales y altamente automatiza-das. Todos los procesos y actividad se registran electrónicamente, inclu-yendo el registro de cada lote. Los procesos de producción se realizanbajo control medio ambiental (climatización automatizada, ventilacióny sistemas de aire acondicionado). La planta IgLAB tiene una capaci-dad anual de 3 millones de litros de plasma. El primer paso en los pro-cesos de producción de las IgPro10 / IgPro20 es la precipitación dela fracción de IgG del plasma para la creación de precipitado NA (frac-cionamiento Kistler-Nitschmann) o precipitado II+III (precipitación enfrío de Cohn). El precipitado sobrenadante NA o II+III se somete a frac-cionamiento por ácido octanoico, eliminándose las proteínas de altopeso molecular y los lípidos. Después de una ultra/diafiltración, lasolución se incuba a pH 4 (para la inactivación viral), seguido por unacromatografía de intercambio aniónico, mediante el cual las impure-zas (sobre todo IgA e IgM) se unen a la resina. La solución resultanteconteniendo IgG se somete a filtración DV20 (específica para elimina-ción viral) y finalmente el filtrado se concentra al 10 o 20%, y se esta-biliza con 250mM de L-Prolina. El proceso dura unos 4 días, segui-dos por 1 día adicional para el llenado en condiciones estériles. Debi-do al alto grado de automatización, solo se necesitan 15 personas parala producción de IgPro10 / IgPro20 en dos turnos diurnos.

Conclusión. El proceso de producción simple pero a la vez sofis-ticado, así como la tecnología punta y la automatización de las insta-laciones, consigue productos con IgG altamente purificados cumplien-do con garantías los requerimientos de calidad.

P-131EFECTOS ANTIINFLAMATORIOS DE LAS INMUNOGLOBULI-NAS MEDIADOS POR LA INHIBICIÓN DEL COMPLEMENTO:MECANISMOS DE ACCIÓN CONOCIDOS Y PAPEL DE LOS ISO-TIPOS DE INMUNOGLOBULINAS. T. De Agustin De Oro, R. Rie-ben, K. Matozan, S. Mischer, M. Spycher. CSL Behring, Esplugues delLlobregat.

Se sabe que el sistema del complemento juega un papel importan-te en la inflamación y que está involucrado en el daño celular y tisu-lar en muchas enfermedades autoinmunes. La capacidad de inhibicióndel complemento que ejercen las inmunoglobulinas intravenosas(GGIV) se conoce desde hace al menos 20 años, y este mecanismo deacción antiinflamatorio de las GGIV se considera importante en el tra-tamiento de patologías como la dermatomiositis, la neuropatía multi-focal motora y, potencialmente, en otras patologías autoinmunes. Sehan descrito algunos de los mecanismos por los que las GGIV inhibenal complemento, incluyendo el “scavenging” del C3 y C4 activados, launión competitiva de la molécula de Ig por el C1, el aumento de lainactivación fisiológica del C3b por factores I y H, y la neutralizaciónde las anafilotoxinas C3a y C5a mediadas por Fab (Basta M. Mol ImmRev 2008; 45:4073-9). Para el scavenging de fragmentos activados delcomplemento, se han descrito diferencias en la actividad basadas enlas composiciones de las GGIV en isotipos (mayor actividad de IgM[Rieben R, et al. Blood 1999; 93:942-51]) y diferencias en los procesosde producción.

Mientras que la inhibición del complemento por las GGIV es unefecto antiinflamatorio deseado durante la infusión intravenosa, lasinmunoglobulinas también pueden producir una activación perjudi-cial del sistema del complemento en el caso de que existan agrega-dos en el preparado. Para poder identificar los lotes de GGIV que con-tienen agregados activados de Ig, se han realizado estudios in vitrodurante el desarrollo de las inmunoglobulinas con uso intravenoso(hace al menos medio siglo), en los cuáles se midió el consumo delcomplemento inducido por activación. A pesar de ello, estos estudiosno pueden diferenciar la inhibición beneficiosa del complemento dela perjudicial. Los estudios que incluyen la medición de los marcado-res de activación del complemento (C5a y C3a) y los análisis indirec-tos del complemento-scavenging por GGIV pueden ofrecer un nove-doso sistema de análisis para la evaluación de las GGIV in vitro.

P-132ESCAPE INMUNOLÓGICO DE CÉLULAS CON ALTERACIONESIRREVERSIBLES EN EL GEN BETA 2-MICROGLOBULINA: ANÁ-LISIS DE LA EXPRESIÓN HLA DE CLASE I EN LESIONES METAS-TÁTICAS OBTENIDAS DE UN PACIENTE DE MELANOMAANTES Y DESPUES DEL TRATAMIENTO CON DCS TRANSFEC-TADAS CON MRNA TUMORAL. A.B. Del Campo1, J. CarreteroCoca1, R. Méndez2, I. Maleno2, J. Amund Kyte3, G. Gaudernak3, T. Cabre-ra1, N. Aptsiauri1, F. Ruiz-Cabello1, F. Garrido1. 1Hospital Universita-rio Virgen de las Nieves. Universidad de Granada, Granada. 2Hospital Uni-versitario Virgen de las Nieves. 3The Norwegian Radium Hospital, Oslo, Nor-way, , Norway.

Las células T citotóxicas (CTLs) juegan un papel central en la eli-minación de células infectadas por virus y células tumorales, siendonecesario para ello la expresión de moléculas HLA de clase I. No obs-tante, la pérdida total de estas moléculas en la superficie celular es un

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mecanismo frecuente empleado por el tumor para evadir la inmuno-vigilancia. Se han descrito tres mecanismos principales en células tumo-rales con pérdida total de clase I: mutaciones en beta-2-microglobuli-na (b2m), deficiencias en TAP, y baja afinidad en la unión de los ele-mentos reguladores de estos genes.

Se han analizado las alteraciones en las moléculas HLA de claseI presentes en las muestras de tejido procedente de biopsias conserva-das en parafina, así como una línea celular obtenida de un pacientecon melanoma metastásico (Kyte et al, 2006). En el análisis medianteinmunohistoquímica con anticuerpos anti-cadena pesada HLA-ABCy anti-beta-2-microglobulina se encuentran biopsias positivas, mues-tras con áreas débilmente positivas, y muestras con zonas tumoralesnegativas para dichas moléculas.

El mRNA aislado de una de las lesiones metastásicas con un patróninmunohistoquímica fundamentalmente negativo para beta-2-micro-globulina, con una mutación puntual en un alelo del gen b2m, y unaLOH en el cromosoma 15, fue usado para desarrollar una vacuna decélulas dendríticas, tras la cual, el paciente desarrolló una nueva lesiónmetastásica de la que se estableció una línea celular a partir de unacitología. El análisis por FACS mostró una pérdida total de expresiónen superficie de HLA de clase I, debida a una mutación en b2m, asícomo una LOH en los cromosomas 6 y 15.

La expresión normal de HLA de clase I en la línea celular fue recu-perada mediante la transfección con el vector adenoviral AdCMVb2m(del Campo et al, 2009) confirmándose la actividad funcional del com-plejo HLA de clase I recuperado en superficie.

En este paciente, las células tumorales portan alteraciones en HLAde clase I (mutación en b2m, LOH en el cromosoma 15) y muestran unapérdida total de expresión de HLA de clase I tras la inmunoterapia. Estosugiere que las variantes generadas HLA negativas son capaces de eva-dir el sistema inmune proporcionando a las células tumorales el esca-pe al reconocimiento inmune por CTLs, lo que podría explicar la evo-lución clínica del paciente y el fallo de la inmunoterapia aplicada.

P-133INMUNOGLOBULINAS INTRAVENOSAS EN ENFERMEDADESNEUROMUSCULARES AUTOINMUNES: ANALISIS COMPARA-TIVO DE REGIMEN DE 5 DÍAS VS 2 DÍAS. M. García Ormaechea,E. Moga Naranjo, E. Martínez, L.A. Querol Gutierrez, C. Juárez Rubio,I. Illa. Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, Barcelona.

Introducción. Las inmunoglobulinas endovenosas (IVIg) se utili-zan como tratamiento inmunomodulador en numerosas enfermeda-des autoinmunes e inflamatorias. La dosis de 2g/kg se administra entre1 y 5 días sin que haya evidencia de los beneficios de cada régimen.Nuestro objetivo es estudiar las posibles diferencias clínicas y biológi-cas entre las dos pautas de infusión, 5 días vs 2 días.

Métodos. Los pacientes (n=5) recibieron las dos pautas de infu-sión, 2 y 5 días. Se realizaron estudios en sangre periférica pre- y post-infusión (inmediatamente, a los 10 y 30 días). Se determinó la expre-sión de los receptores Fcγ (FcγRI, FcγRII and FcγRIII), HLA Clase I (A,B y C) y HLA Clase II (DR) en monocitos por citometría de flujo, y seanalizaron los niveles de STAT1 y STAT3 fosforilados en monocitostras estimulación con IFN-γ e IL-10 respectivamente. Se estudiaron lasescalas clínicas INCAT y QMG antes y a los 10 y 30 días después de lainfusión.

Resultados. No se han observado diferencias entre ambas pautasde administración en la expresión de los receptores Fcγ, HLA Clase I

y II, así como tampoco en la mejoría clínica y efectos adversos. Sinembargo, en la pauta de 2 días, había un descenso de los niveles depSTAT1 (88,67% ± 0,22% vs 73,75% ± 0,75%, antes vs día 10 despuésde la infusión, respectivamente; p=0,022) y un aumento en los nivelesde pSTAT3 (35,35 ± 5,3% vs 54,34% ± 4,36%, antes vs día 30 despuésde la infusión, respectivamente; p= 0,031), no observada en la pautade 5 días.

Conclusión. Estas 2 pautas diferentes de infusión podrían estaralterando los niveles de activación de pSTAT1 y pSTAT3 sin diferen-cias en la evolución clínica de los pacientes. Sin embargo, se necesitaun número elevado de pacientes para corroborar estos hallazgos.

P-134EVALUATING THE ACTIVITY OF QUINTON SOLUTIONS ONTHE IMMUNE SYSTEM. P. Maseres Javaloy, J.E. Martínez López, P.Martínez Peinado, M. García Irles, J.M. Sempere Ortells. Universidadde Alicante, Alicante.

Objectives. We have recently described an in vitro modulatingeffect of QI (Quinton Isotonic® solution; ultrafiltrated cold processedseawater) on PBMNc from healthy controls.QI is able to emulate manyof the results observed when using conventional culture media suchas RPMI, in terms of cell-morphology, -viability, -proliferation and -aggregation. It also exerts a protective effect on erythrocytes avoidingspontaneous lysis.

Our aim is to amplify the in vitro study of QI on the immune systemand to evaluate the in vivo effect of QH (Quinton Hypertonic® solution)after oral administration.

Methods. Isolated PBMNc from ten healthy volunteers werecultured under the following conditions: RPMI, QI and Saline solution(SS). Cell-activation was measured by flow cytometry according to theexpression of membrane antigens and production of intracellularcytokines.

QH was orally administered to 5 healthy controls (2+2+2 ampoulesin six hours) and leukocyte activation measured by flow cytometryaccording to the expression of membrane antigens and adhesionmolecules vs. pre-administration values.

Results. QI but not SS increased the percentage of culturedlymphocytes coexpressing CD25, athough in a lesser extent than RPMI.Cells cultured with QI vs. SS and RPMI also showed an increasedintracellular expression of TNF-α, IL-2 and INF-γ.

QH was able to increase in vivo the lymphocyte expression of CD25,CD28 and CD45RO membrane antigens as well as the leukocyteexpression of CD11a and CD11b.

Conclusion. QI seems to activate the immune system both in vitroand in vivo, by increasing the expression of some activationmarkers/adhesion molecules and by stimulating a Th1 cytokine profile.

P-135ESTABILIDAD DE LA EXPRESIÓN DE CD90 EN HFA-MSCS SOME-TIDAS A CULTIVO INDEFINIDO. N. Fernandez Arcas1, J.M. Miran-da Sayago1, C. Benito López1, A. Reyes Engel2, J. Carrera Rodríguez1, A.Alonso Ortiz1. 1HRU Carlos Haya, Malaga. 2Universidad de Malaga.

Las células madre mesenquimales humanas (hMSCs) se han con-vertido en una de las principales promesas en la medicina regenera-tiva, debido a su capacidad para diferenciarse hacia diferentes linajes

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de potencial uso en terapias celulares. Las hMSCs pueden ser aisladasdesde diferentes tejidos mediante técnicas más o menos invasivas yson caracterizadas mediante un criterio mínimo internacional.

Junto a la capacidad de diferenciarse hacia poblaciones de interés,las MSCs han demostrado tener capacidades inmunomoduladoras. Enla actualida múltiples son las investigaciones que se están realizandocon el fin de esclarecer cuáles son los mecanismos implicados en lainmunomodulación que ejercen estas células.

La médula ósea es la principal fuente para la obtención de pobla-ciones mesenquimales (BM-MSC), pero recientemente nuevas fuenteshan surgido como contrapunto a las BM-MSCs. Una de estas nuevasfuentes es el líquido amniótico. El líquido amniótico es obtenidomediante técnicas mínimamente invasivas en los procedimientos deamniocentesis para diagnóstico prenatal y se ha demostrado como unaimportante fuente para el aislamiento de hMSCs.

Hoy por hoy se desconoce cuál es el comportamiento que pre-sentan las células madre mesenquimales humanas derivadas del líqui-do amniótico (hAF-MSCs), y si poseen las mismas capacidades deinmunomodulación que las hBM-MSCs. Lo que sí está confirmadoes que el líquido amniótico presenta capacidades inmunomodulado-ras.

Campioni et al. proponen al marcador CD90, uno de los emplea-dos para la caracterización de las hMSCs, como un indicador de lascapacidades inmunomoduladoras. Observan que una disminución enlos niveles de expresión de CD90 se asocian directamente con una dis-minución en las capacidades inmunomoduladoras de las hBM-MSCsconforme el cultivo progresa.

En el presente trabajo, se realiza una caracterización de las AF-MSCs en cultivo in vitro indefinido, centrándonos especialmente en lasvariaciones en los niveles de expresión de CD90.

SESIÓN 12: INMUNIDAD Y TRASPLANTE

Moderadores: Jose Luis Vicario (Madrid)Eduard Palou (Barcelona)

P-136VALOR PRONÓSTICO DE LA DETERMINACION DE IL-10 TRASUN RECHAZO EN TRASPLANTE DE HIGADO. B. ManzanaresMartin, R. González Fernández, M. De La Mata García, S. Rufián Peña,L. Castro Orgaz, J. De La Torre Cisneros, J. Peña Martínez. HospitalReina Sofia, Córdoba.

Actualmente sigue resultando de gran interés definir diferentes mar-cadores que puedan determinarse de forma rutinaria y sirvan de ayu-da para establecer una inmunosupresión individualizada en los enfer-mos trasplantados. En concreto, la IL-10 podría ser un buen candidatodebido a su potente acción inmunosupresora y antiinflamatoria.

Objetivos. Establecer el valor pronóstico de los niveles de IL-10tras un rechazo en trasplantados de hígado. Determinar el riesgo pos-terior de infección y rechazo.

Material y métodos. Se analizaron muestras de 25 pacientes tras-plantados de hígado en nuestro hospital recogidas en el pretrasplan-te inmediato y postrasplante (días 1, 3, 5, 7, 15, 30 y posteriormente uncontrol al mes hasta el año. Este control se intensificó durante los cua-dros infecciosos o de rechazo. Para la determinación en suero de IL-10

se utilizó la técnica Quantikine de R&D Systems. El diagnóstico y gra-do de rechazo se hizo por criterios clínicos y anatomopatológicos segúnprotocolos de seguimiento vigentes en este hospital. Los cuadros infec-ciosos fueron diagnosticados según los criterios establecidos en cadacaso.

Resultados. La elevación de IL-10 en el periodo inmediato poste-rior a un rechazo se correlaciona con pronóstico favorable en cuantose observa un bajo índice de rechazos e infecciones durante la evolu-ción del paciente. Sin embargo la disminución de IL-10 en este mismoperiodo se correlaciona con pronóstico desfavorable. La etiología dela infección observada parece no depender de los niveles de IL-10.En la evolución posterior, bajos valores de IL-10 en suero, o disminu-ción respecto a valores anteriores, se relacionan con rechazo en pacien-tes trasplantados de hígado y al contrario si los valores de IL-10 estánelevados. Se presentarán también los datos de cada paciente en loscasos que sufrieron rechazo.

En conclusión, estos resultados podrían aconsejar la monitori-zación de IL-10 de los enfermos trasplantados de Hígado una vez hayantenido un episodio de rechazo.

P-137LA ELECCIÓN DE INMUNOSUPRESOR TIENE UN PAPEL FUN-DAMENTAL EN EL DESARROLLO DE HEPATITIS INMUNE DENOVO MEDIADA POR ANTICUERPOS ANTI-GLUTATION S-TRANSFERASA T1. I. Aguilera García1, J.M. Sousa Martín2, J.M.Praena3, M.A. Gómez Bravo2, L. Barrera Pulido2, A. Núñez Roldán1.1Instituto de Biomedicina de Sevilla, H. U. Virgen del Rocío, Sevilla. 2H. U.Virgen del Rocío. 3Fundación Pública Andaluza para la investigación.

Objetivos. Analizar la influencia potencial que un grupo de fac-tores puede tener sobre el proceso denominado hepatitis inmune denovo, complicación a largo plazo del trasplante hepático. Resultadosexperimentales de nuestro grupo demuestran que este proceso es unaforma especial de rechazo debido a la incompatibilidad para el gen dela Glutation S-transferasa T1 (GSTT1) entre donante (positivo) y recep-tor (nulo), con presencia de anticuerpos anti-GSTT1 donante-específi-cos. Sin embargo, no en todos los casos se desencadena la respuestainmune.

Materiales y métodos. El estudio incluye 162 pacientes con unseguimiento medio de 32 meses (17-47). El genotipo GSTT1 se deter-minó mediante PCR. Los anticuerpos se detectaron por IFI y ELISA.Las variables estudiadas fueron las siguientes: causa del fallo hepáti-co, edad y sexo de donante y receptor, terapia inmunosupresora, infec-ción por citomegalovirus, episodios de rechazo agudo y crónico, gam-mapatía monoclonal, picos de IgG y presencia de otros anticuerpos.Los análisis estadísticos se realizaron mediante el sistema SPSS (¯2, testexacto de Fisher).

Resultados. 35 de los 162 pacientes (21,6%) conformaban el gru-po de receptores GSTT1 nulos con donantes GSTT1 positivos. Con ellosse continuó el estudio, dado que es el único grupo donde pueden ocu-rrir los dos acontecimientos de interés: producción de anticuerpos anti-GSTT1 y desarrollo de hepatitis inmune de novo. 18 de los 35 (51,4%)produjeron anticuerpos y 9 de los 35 (25,7%) desarrollaron la enferme-dad. La mayoría de las variables analizadas, no parecen tener efectosobre los acontecimientos de interés, excepto la terapia inmunosupre-sora. Cuando comparamos el grupo que tomaba ciclosporina (CsA)con el grupo que tomaba tacrolimus (Tac)(en ambos casos podía estarcombinado con MMF) vemos que la utilización de Tac tiene una cla-

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ra influencia en que se evite la producción de anticuerpos y en la pre-vención de la hepatitis inmune de novo. El número de pacientes sin anti-cuerpos en el grupo de Tac fue significativamente mas alto que en elde CsA (94,1% vs 5,9%, p= 0,001). Con respecto al desarrollo de la enfer-medad se observó un efecto protector del Tac frente a CsA (80,8% vs19,2%, p= 0,003).

Conclusión. La elección de inhibidor de la calcineurina pue-de tener consecuencias en cuanto al desarrollo de la hepatitis inmu-ne de novo post-trasplante hepático mediada por anticuerpos anti-GSTT1.

P-138PLASMAPHERESIS/IVIG/ANTI-CD20 COMBINATION DOESNOT MODIFY PRA PERCENTAGE BY LUMINEX TECHNOLOGYBUT DECREASE THE DSA MFI LEVELS IN KIDNEY TRANS-PLANT: IS THE PRA CONCEPT OBSOLETE? F. Boix Giner, S. Llo-rente, G. Salgado, J.M. Alemany, M. López, R. López, M.J. González,J.A. Campillo, A. Minguela, M.R. Álvarez-López, M. Muro. HospitalVirgen de la Arrixaca, Murcia.

Anti–donor specific HLA antibodies (DSA) have been recognizedas a major cause of graft loss in the last few years. Particularly, in HLAclass II antibody screening, newer serum screening methods, such asLuminex technology, have greatly enhanced specificity analysis of anti-HLA class II antibodies in sensitized patients. Con el analizador luminex,la fluorescencia de las microesferas expresada como intensidad mediade fluorescencia (MFI) es directamente proporcional a la cantidad deanticuerpo unido a las microesferas.

Objetives. This work presents a very interesting clinical case withdesensitization protocol with plasmapheresis/IVIG and anti-CD20 andas the values of MFI units indicate the successful treatment evolution,in opposite to PRA data outcome.

Clinical case. A Caucasian 70-year-old-woman was transplantedin our hospital with a deceased donor (71 years-old). The HLA matchingbetween donor-recipient was zero (only matched age). Our patient wasnot sensitized to HLA antigens, with a PRA level approaching 0% byluminex and CDC techniques. Before transplantation, cross-matching(CM) by standard CDC assay was negative.

In the immediate post-transplant (PO) period, the patient hadimportant instability in renal function. In the post-transplantationmonitoring (15th PO), we detected anti-HLA class II antibodies(IgG) by Luminex (LabscreenMix, OneLambda, CA). Anti-HLA classI and anti-MICA antibodies screening was negative. Secondly, wedetected anti-DRB1*04 and DQB1*0302 (donor´s typing had thesealleles) antibodies with MFI=5673 and PRA=36% (LabscreenPRA,OL). A week later (22th PO), the patient was more highly positivereaching MFI=7986 and PRA=34%. With these facts, nephrologists inour hospital indicated a renal biopsy which was compatible withhumoral rejection, positive for C4d deposition. She was pulsedwith corticosteroids, plasmapheresis and IVIG without functionalimprovement. The MFI data one week later was not different to theprevious samples.

Thus, we added anti-CD20 (Rituxan) and the initial clinical responsewas highly favorable. Biopsies on 45th PO resulted in suggestivereversion of the rejection. Analysis of the serum on the 45th PO disclosedthat the MFI of the anti-donor DR4 had fallen to 2.021 (PRA=35%) andseven days later to 1176 (PRA=34%). However, all samples in this studyshowed a similar PRA level of 34-36%.

Conclusion. The PRA concept with respect to humoral rejectionevolution by luminex technology could be apparently obsolete and itcould be more useful the MFI level cuantification.

P-139LAS CÉLULAS T REGULADORAS (CD25+CD127LOW/- CD4+

FOXP3+) COMO MARCADOR DE ALTERACIONES DE LA GLU-COSA EN EL TRASPLANTE RENAL. A. Marín, B. Bayés, M. Gra-nada, M.C. Pastor, A. Sánchez, R. Lauzurica, R. Romero, R. Pujol-Borrell, E. Martínez-Cáceres. Hospital Germans Trias i Pujol (LIRAD-BST), Badalona.

Estudios en la población general han demostrado el papel de lascélulas T reguladoras y la inflamación en la aparición de diabetes melli-tus (DM).

Objetivo. Determinar la incidencia de alteraciones de la glucosa(AG) en el post-trasplante renal. Determinar la relación entre las AG yel fenotipo linfocitario así como con los niveles de citocinas proinfla-matorias/inmunomoduladoras.

Metodología. 55 pacientes no diabéticos sometidos a trasplanterenal (TR). 66% hombres. Edad: 48±13 años. Inmunosupresión (IMS):basiliximab, prednisona, tacrolimus y micofenolato. A los 3 meses pos-transplante se realizó Test de tolerancia oral a la glucosa (TTOG)(75gglucosa)para clasificar las AG según criterios de la American DiabetesAssociation (ADA). El análisis de subpoblaciones linfocitarias CD3,CD4, CD8, DP γδ, Treg (CD25+127low/– CD4+Foxp3+), NK (CD16+/56+),NK CD56high, iNKT, CD19+, LB transicionales (CD19+CD27–

CD24+CD38+) se realizó por citometría de flujo en muestras de san-gre fresca preTR, 1m-postTR y 3 m-postTR, junto a la determinaciónsérica de PCR, IL6, TNFγ, IL10, RsIL2, TGFβ. También se determina-ron los niveles de glucosa, insulina, hemoglobina glicosilada (HbA1c),triglicéridos y adiponectina.

Resultados. Tras el trasplante se observó un incremento de laHbA1c y triglicéridos y disminuyeron la adiponectina y los niveles decitocinas pro-inflamatorias (p< 0,05). El fenotipo linfocitario se vió alte-rado por el tratamiento IMS en la mayoría de las subpoblaciones ana-lizadas, de forma más acentuada a 1m post-TR. El % de Treg descien-de al mes del TR y posteriormente se recupera sin llegar a alcanzar, alos 3m, las concentraciones basales.

Un 32% de los pacientes presentaron AG, siendo la intoleranciaoral a la glucosa la AG más frecuente. PreTR no se observaron diferen-cias entre normoglicémicos (NG) y AG en: glicemia, HbA1c, triglicé-ridos, adiponectina y niveles de citocinas, aunque los pacientes conAHG presentaron a los 3 m postTR una menor concentración de TGFβ(p= 0,028). En relación a las subpoblaciones celulares, el análisis esta-dístico mostró que existe una relación inversa entre Treg y glucemia(r= -0,271, p= 0,05) e insulina (r= -0,328, p= 0,026). El % de Treg respec-to al total de CD4+Foxp3+ era menor en los pacientes que desarrolla-ron AG (preTR: NG 76 ± 8% vs AG 70 ± 9% p= 0,038 y 3 m postTR: NG72 ± 8% vs AG 65 ± 10% p= 0,018) no observándose diferencias signi-ficativas en las otras subpoblaciones. La regresión logística de altera-ciones de la glucosa a los 3 meses posTR frente a la edad, Treg preTRy adiponectina preTR puso de manifiesto que el porcentaje de Treges un factor de riesgo independiente de AG en el postTR (Treg: β=-1,94,sig= 0,041, Exp β= 0,143).

Conclusiones. Las AG son frecuentes en el postTR. Los marcado-res clásicos como las citocinas pro-inflamatorias y la adiponectina nopermiten predecir qué paciente presentará AG. El porcentaje de Treg

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es un predictor de AG, lo que sugiere que en la aparición de AG post-TR puede existir un componente inmunitario.

P-140TRATAMIENTO DE DESENSIBILIZACIÓN CON UN INHIBIDORDEL PROTEOSOMA EN UN PACIENTE HIPERINMUNIZADO. M.Vilches, T. García Álvarez, A. Mazuecos Blanca, A. Nieto. Hospital Puer-ta del Mar, Cádiz.

Muy recientemente, algunas series de casos han sugerido que elinhibidor del proteosoma bortezomib tiene efecto directo sobre las célu-las plasmáticas secretoras de anticuerpos en pacientes con rechazo delinjerto. Sin embargo, la capacidad de este agente para desensibilizarcandidatos a trasplante, los cuales no reciben inmunosupresión, esactualmente desconocida.

En el presente trabajo, un paciente altamente sensibilizado (CDCPRA= 92%) en lista de espera tras un primer trasplante fue sometidoa tratamiento de desensibilización con inmunoglobulinas iv a altasdosis (días 0 y 31) y Rituximab (días 7 y 22). Dado que no se observa-ron variaciones en los niveles de anticuerpos anti-HLA, se ensayó laadministración de bortezomib, 1,3 mg/m2 a días 1, 4, 8 y 11. Se toma-ron muestras antes del inicio del tratamiento, y a los 10 y 28 días pos-tratamiento. Se realizó monitorización de anticuerpos anti-HLA median-te microesferas de antígeno único clase I y clase II con suero puro ydilución 1/100. Asimismo, se procedió a determinación de PRA porCDC, y se midieron las concentraciones de inmunoglobulinas, de anti-cuerpos específicos frente a una batería de virus y de poblaciones lin-focitarias.

Con los sueros puros se observó una discreta disminución progre-siva en la intensidad de fluorescencia de los sueros postratamiento entodos y cada uno de los antígenos HLA positivos (32 de clase I y 27 declase II). Esta disminución fue mucho más evidente en los sueros a dilu-ción 1/100 (disminución media del 15,4% y 39,5% a los 10 y 28 díaspostratamiento respectivamente en antígenos de clase I, y del 38,1% y56,6% en antígenos de clase II). Sin embargo, no se observó disminu-ción en el PRA (93%).

En conclusión, un ciclo aislado de bortezomib puede tener un efec-to insuficiente en pacientes con una concentración elevada de anticuer-pos anti-HLA.

P-141EL EMPLEO DE PCR EN TIEMPO REAL PROPORCIONA UNINCREMENTO EN LA CAPACIDAD DE PREDICCION DE RECAI-DAS TUMORALES POST-TRASPLANTE ALOGENICO DE PRO-GENITORES HEMATOPOYETICOS. A. Balas Pérez, F. García Sán-chez, J.L. Vicario Moreno. HICENTRO de Transfusión de Madrid, Madrid.

La recidiva tumoral es una de las causas más frecuentes de mor-talidad post-trasplante de progenitores hematopoyéticos en pacientescon leucemia.

Tras el trasplante de progenitores, es de especial interés determinarsi el nuevo sistema hematopoyético es de origen autólogo, perteneceal donante o existe una mezcla de ambos. En la actualidad este tipo deinformación se obtiene mediante estudios de quimerismo genético, uti-lizando como metodología básica el estudio de sistemas VNTR (Varia-ble Number of Tamden Repeats) o STR (Short Tamden Repeats). Recien-temente se han desarrollado estrategias basadas en el empleo de tec-

nología de PCR cuantitativa en tiempo real (qrt-PCR), empleando poli-morfismos de un único nucleótido (SNP) o de inserción-deleción (indels).

El objetivo del presente trabajo es la comparación de las tecnolo-gías de STR y qrt-PCR en un estudio retrospectivo de pacientes some-tidos a trasplante, con el fin de determinar correlación entre ambos sis-temas así como su nivel de sensibilidad comparado. Asimismo, se ana-lizó un grupo de pacientes que han sufrido recaída tumoral, con el finde determinar cual de las dos metodologías permite una mayor pre-dicción de recaída y en que grado.

El estudio de quimerismo mediante sistemas STR se llevo a cabo uti-lizando un panel de 10 sistemas genéticos (VWA, F13A1, LPL/LPS, TPOX,D16S539, D21S11, D22S689, Amelogenina, D7S820, D18S51) analizadosen un secuenciador ABI 3130. Por otro lado, para el análisis mediante qrt-PCR se emplearon 34 indels englobados en el AlleleSEQR chimerism assay(Celera Corporation, Alameda,CA) empleando un equipo ABI 7500.

De la comparación de ambas metodologías se puede concluir que:1. En el 100% de las parejas receptor/donante analizadas mediante

qrt-PCR se han encontrado al menos un sistema informativo, obte-niéndose una media de 4 y 7 sistemas informativos para donan-tes emparentados y no emparentados respectivamente.

2. La comparación de los resultados obtenidos mediante ambas meto-dologías sobre muestras control obtenidas por dilución límitedel componente menor, demuestra una sensibilidad del 1% y 0,01%para PCR-STR y qrt-PCR respectivamente. La correlación entreambos métodos se ha estimado en R2=0,988. Asimismo la correla-ción entre la dilución teórica y la obtenida por qrt-PCR es 0,989para diluciones del 25% al 0,05%, siendo aún mayor, 0,999, paralas diluciones en el rango 1%-0,05%. Para este rango de dilución,la correlación con el teórico para STR fue solo del 0,88%.

3. El análisis de recidivas mostró que en 11 de las 15 recaídas anali-zadas se detecto incremento de quimera mediante qrt-PCR y nomediante STR, obteniéndose una anticipación media en el diag-nóstico de recaída de 75 días.La metodología de qrt-PCR aplicada al estudio de quimerismo

post-trasplante hematopoyético proporciona una mayor sensibilidady aplicabilidad clínica que métodos basados en PCR convencional.

P-142GSTT1, UNA NUEVA DIANA POTENCIAL PARA LA ENFERMEDADINJERTO CONTRA HUÉSPED CON AFECTACIÓN HEPÁTICA TRASEL TRASPLANTE ALOGÉNICO DE PROGENITORES HEMATOPO-YÉTICOS. M.J. Martínez-Bravo1, I. Tallón2, I. Espigado2, Á. Urbano-Ispi-zúa2, A. Núñez-Roldán1, I. Aguilera1. 1Hospital Universitario Virgen del Rocío-IBIS, Sevilla. 2Hospital Universitario Virgen del Rocío, Sevilla.

Introducción. La GSTT1 (Glutatión S-Transferasa T1) se ha descri-to como sistema menor de histocompatibilidad en trasplante hepáticoy renal, debido a la presencia de un 20% de genotipo nulo en la pobla-ción caucásica. En ambos trasplantes se observó un rechazo mediadopor anticuerpos en pacientes GSTT1 negativos que recibieron un injer-to de un donante GSTT1 positivo. El objetivo de este estudio es ana-lizar el papel de los anticuerpos anti-GSTT1 en un paciente sometidoa Trasplante Alogénico de Progenitores Hematopoyéticos (TAPH) afec-tado por Enfermedad Injerto Contra Huésped (EICH) hepática.

Materiales y métodos. La presencia de anticuerpos se realizó usan-do técnicas de Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) sobre tejido triplede rata. Se confirmó mediante ELISA, con la GSTT1 recombinantehumana. El genotipo para la GSTT1 se realizó por PCR.

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Resultados. Varón, de 33 años, fue sometido a un TAPH de sangreperiférica de su hermana, HLA idéntica, de 31 años y multípara. El día+30, el paciente tenía aumentados los niveles de enzimas hepáticas ensangre periférica (ALT 234 UI/L; AST 129 UI/L, γ-GTP 926 UI/L; ALP1918 UI/L, Bilirrubina Total (BT) 9,78 mg/dL). Fue diagnosticado deEICH hepática aguda, sin afectación intestinal ni cutánea, tratándosecon Prednisona (PDN) (1 mg/kg/d) a partir del día +35. La funciónhepática se normalizó el día +74, retirándosele la PDN. En el mes +5, elnivel de enzimas hepáticas volvió a aumentar reintroduciéndose laPDN. En este momento se sospechó una posible hepatitis autoinmune.El suero del paciente presentaba anticuerpos anti-nucleares y anti-GSTT1.Se analizó el ADN y se comprobó que el paciente era heterozigoto parala GSTT1, mientras que su donante era homozigota nula. La donanteposeía un bajo título de anticuerpos anti-GSTT1 (1:40) en suero resul-tado de la exposición al antígeno que tuvo lugar durante tres embara-zos de embriones GSTT1 positivos. El paciente fue sometido a un segun-do TAPH en el mes +11, reactivándose la hepatitis causada por GSTT1el día +61. Se trató con PDN y mejoró en el día +90. En el mes +8 ingre-sa con EICH crónica cutánea y hepática (BT 65 mg/ dL) alcanzandoel exitus por encefalopatía hepática un mes después.

Conclusión. Se propone que las células B memoria anti-GSTT1presentes en el injerto, una vez activadas en el organismo huésped porlas moléculas GSTT1 expresadas en el hígado del paciente, produje-ron la síntesis de anticuerpos anti-GSTT1. El antígeno GSTT1 debe serconsiderado una nueva diana para la EICH con afectación hepática.

P-143CUANTIFICACION DE CADENAS LIBRES LIGERAS (SCLL) SÉRI-CAS EN TRASPLANTE RENAL. IMPLICACIÓN EN LA MONITO-RIZACIÓN DE GAMMAPATÍAS MONOCLONALES (GMM) TRASTRASPLANTE. M. Sánchez Castañon, M. Gago, G. Fernández-Fres-nedo, C. Gomez, J. Ruiz-Criado, M. López-Hoyos, M. Arias. HospitalUniversitario Marques de Valdecilla, Santander.

Introducción. Las GMN son causa de patología renal. Reciente-mente se han introducido metodologías muy sensibles de cuantifica-ción de sCLL. Se ha descrito variabilidad de estos métodos relaciona-da con la función renal y no se han estudiado en el trasplante renal.Hemos analizado la asociación entre los niveles de sCLL policlonalesen trasplantados renales(TR) con diferente función renal.

Material y métodos. Se estudiaron 100 pacientes TR y 53 enfer-mos renales crónicos estratificados por función renal (K/DOQI). Nin-gún paciente tenía GMN. Los niveles de sCLL policlonales se cuanti-ficaron mediante nefelometría (The Binding Site).

Resultados. La concentración de sCLL κ y λ aumentó con el esta-dío K/DOQI tanto en los trasplantados (9 veces superior en estadio5 para κ y 5 para λ respecto a estadio 1) como en los no trasplantados(6 veces superior para κ y λ respecto a estadio 1). Dichos niveles secorrelacionaron significativamente (p<0,001) con creatinina sérica (0,532y 0,513 en trasplantados y 0,783 y 0,849 en no trasplantados), cistatinasérica (0,648 y 0,614 en trasplantados y 0,800 y 0,837 en no trasplan-tados) y β2 microglobulina (0,722 y 0,688 en trasplantados y 0,912 y0,875 en no trasplantados). El ratio κ/λ no varió en ninguno de los dosgrupos de estudio ni mostró correlación la función renal. Estos datosno se influyeron por la inmunosupresión empleada.

Conclusión. Los niveles séricos de CLL deben interpretarse concautela por su clara asociación con la función renal. El trasplante renalno induce cambios diferentes de los derivados de la función renal.

P-144ANÁLISIS DEL POLIMORFISMO KIR EN TRASPLANTE HEPÁ-TICO. I. Legaz Pérez1, J.A. Campillo Marquina1, M.D.R. López-Álva-rez1, J.M. Bolarín Guillén1, B. Las Heras Ferre1, S. Soriano Díaz1, N.Gómez-Lozano2, C. Alonso Blanco3, M.D.R. Álvarez-López1, C. Vil-ches Ruiz2, A. Minguela Puras1. 1Hospital Virgen de la Arrixaca y Cen-tro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Hepáticas y Diges-tivas (CIBEREHD). Murcia, Churra. 2Hospital Universitario Puerta DelHierro. Madrid. 3Hospital Universitario Juan Canalejo, A Coruña.

El aloinjerto hepático es bien aceptado en ausencia de compati-bilidad HLA, sin embargo recientemente se ha sugerido un papel dellocus HLA-C en la evolución del mismo a corto y largo plazo. Pre-viamente se ha propuesto la participación de las células NK en la alo-rrespuesta contra injertos. Tanto las células NK como los linfocitos Tpueden expresar receptores KIR (del inglés, Killer Inmunoglobulin-likereceptors), los cuales a través de la interacción con sus correspondien-tes ligandos HLA de clase I son capaces de regular la actividad citotó-xica de dichas células. Se sabe que las células NK son importantes enel trasplante de células madre hematopoyéticas, en el que los recepto-res KIR pueden ejercer un papel modulador. Sin embargo hay pocostrabajos referidos al trasplante de órganos sólidos. El interés del pre-sente trabajo fue analizar si los genes KIR ejercen algún papel en tras-plante hepático.

Un total de 402 trasplantes hepáticos fueron incluidos en el estu-dio. Los trasplantes se clasificaron en dos grupos de acuerdo a la pre-sencia o ausencia de episodios de rechazo agudo: RA (n=110) y NRA(n=292). El DNA genómico se extrajo usando QIAamp DNA BloodMidi Kit a partir de sangre periférica de pacientes y nódulos linfáticoso bazo de donantes y el genotipaje KIR de pacientes y donantes se rea-lizó mediante PCR-SSP.

La frecuencia de genes y genotipos KIR observada en nuestro gru-po de receptores hepáticos resultó similar a la de la población control,así como a la frecuencia previamente observada en otras poblacionescaucasoides, con la excepción del gen KIR2DS5 cuya frecuencia apa-reció significativamente aumentada en el grupo de pacientes con res-pecto al de donantes sanos (34% vs 25%; P= 0,016). Por otra parte elanálisis de genes y genotipos KIR en los grupos de pacientes en RA yNRA tampoco mostraban diferencias significativas.

En conclusión, no se detectó una asociación entre el polimorfismoKIR y la aceptación o el rechazo agudo temprano de injertos hepáti-cos, pero consideramos que se requieren futuros estudios para anali-zar si los receptores KIR en combinación con sus correspondientes ligan-dos HLA-I pueden estar implicados en el desenlace de estos injertos.

P-145SEGURIDAD DEL USO DE GAMMAGLOBULINA INTRAVENO-SA EN PACIENTES CON HIPOGAMMAGLOBULINEMIA EINFECCIONES GRAVES POST TRASPLANTE CARDIACO: 14AÑOS DE EXPERIENCIA. J. Carbone Campoverde, N. Del PozoRodríguez, J. Rodríguez Molina, J. Navarro Caspistegui, J. Fernandez-Yañez, J. Palomo, P. Muñoz, C. Rodríguez, M. Ruiz, E. Sarmiento Mar-chese. Hospital Gregorio Marañon, Madrid.

Introducción. La hipogammaglobulinemia IgG y la deficiencia deanticuerpos específicos son factores de riesgo de infección en el tras-plante cardiaco. Evaluamos la eficacia inmunológica y la seguridad dela terapia sustitutiva con gammaglobulina intravenosa (GGIV) en

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pacientes con hipogammaglobulinemia IgG tras el trasplante asocia-da a infecciones graves.

Métodos. 55 receptores cardiacos tratados con GGIV (Grupo-GGIV)desde 1996. 55 pacientes trasplantados sin infecciones severas y queno recibieron GGIV fueron estudiados como controles (Grupo sin-GGIV). Definición de hipogammaglobulinemia IgG: IgG < 600 mg/dl(nefelometría). Definición de infección: toda infección grave que requi-rió tratamiento IV. Indicación de GGIV (uso compasivo): Terapia dereposición en trasplante cardiaco con hipogammaglobulinemia secun-daria e infección grave. El 85% de las infecciones se produjeron duran-te los primeros 3 meses. Las infusiones de GGIV se iniciaron tras eldiagnóstico de infección. Protocolo: GGIV al 5% pasteurizada; dosisde 300-400 mg/kg/mes. Objetivo: alcanzar concentraciones normalesde IgG (>700 mg/dl). Velocidad de infusion: 0,01 a 0,04 ml/kg/min.

Resultados. Distribución de infecciones: Bacterianas, n=19; bacte-riana+infección CMV, n=8; bacteriana+fúngica, n=4; bacteriana+clos-tridium difficile (CD), n=2; infección por CMV tratada con gancyclovir,n=15; infección CMV+CD, n=2; infección CMV+bacteriana+aspergilo-sis, n=4; nocardiosis pulmonar, n=1. En el grupo-GGIV se documentóuna menor concentración de IgG sérica antes del trasplante (936 vs 1.235mg/dl, p= 0,012), a los 7d (577 vs 778, p< 0,001), 1 m (553 vs 684, p=0,003) y cuando se detectó la infección [475 vs 684, p< 0,001]. Tras el usode GGIV, las concentraciones de IgG de los pacientes tratados fueronsimilares a las del grupo control sin-GGIV a los 3 m (681 vs 737, p= 0,25)y 6 m (736 vs 769, p= 0,46), mientras que la concentración de álbuminafue menor en estos pacientes en ambos puntos. No hubieron pacientescon hipercatabolismo de IgG. Las infusiones de GGIV fueron bien tole-radas. No se observaron reacciones adversas moderadas ni graves. Nohubo complicaciones trombóticas. Las concentraciones post-tratamien-to de urea, creatinina, GOT, GPT, GGT, bilirrubina, C3 y C4 al mes, 3 m,6 m y 12 m post-trasplante fueron similares en ambos grupos.

Conclusión. La terapia con GGIV se asoció con reconstitución deniveles de IgG y fue bien tolerada en pacientes sometidos a trasplan-te cardiaco con hipogammaglobulinemia IgG e infecciones graves post-trasplante.

P-146PRESENCIA DE ANTICUERPOS DONANTE ESPECÍFICOS FREN-TE A DIVERSOS SISTEMAS DE HISTOCOMPATIBILIDAD ENPACIENTES CON SIGNOS DE RECHAZO HUMORAL. J.L. CaroOleas1, A. Álvarez Márquez2, M.J. Acevedo Calado1, G. Bernal1, R. Cabre-ra1, M.Á. Gentil1, I. Aguilera1, A. Núñez Roldán1. 1Hospital UniversitarioVirgen del Rocío, Sevilla. 2Coordinación Autonómica de trasplante.

Como continuación de un trabajo anterior (2009), mostramos 14nuevos casos de pacientes trasplantados renales con sospecha de recha-zo humoral y depósitos de C4d en biopsias. Objetivo: Estudiar la rele-vancia de ciertos sistemas de histocompatibilidad (GSTT1 y MICA),así como de los anticuerpos anti-HLA detectados por Luminex, en elrechazo.

Material y métodos. 14 pacientes trasplantados con una pruebacruzada por CDC negativa que desarrollan rechazo humoral, puestode manifiesto por la detección de C4d en biopsias renales y el deterio-ro en la función renal. Estudiamos la presencia, en sueros previos yposteriores al trasplante de, anticuerpos anti-HLA clase I y clase II espe-cíficos del donante y de anticuerpos anti-MICA, todos ellos, median-te Luminex (Single Antigen y/ó crossmatch Luminex). Además, estu-diamos anticuerpos anti-GSTT1 mediante ELISA.

Resultados. En el suero pre-trasplante estudiamos retrospecti-vamente, la presencia de anticuerpos (anti-HLA, anti-MICA y anti-GSTT1). Detectamos anticuerpos anti-HLA clase I en 3 pacientes, anti-HLA clase II en 1 paciente, anti-HLA clase I+II en 1 paciente y anti-HLA clase II+MICA en un caso. En los 8 casos restantes no detectamosningún anticuerpo en el suero pre-trasplante. En los sueros post-tras-plante coincidentes con la biopsia C4d positiva, detectamos la produc-ción de anticuerpos de novo, no detectados en el suero pre-trasplan-te en 4 casos. En total, hay un paciente con anti-HLA clase I, 2 con anti-HLA clase II, 1 con anti-GSTT1, y 3 con una mezcla de anticuerpos, cla-se HLA I+II=3 casos, HLA clase II+MICA=2 y HLA clase I+GSTT1=1.En otros 4 pacientes no detectamos ninguno de éstos anticuerpos. Res-pecto a la evolución clínica de los pacientes, 2 de ellos fallecieron conel órgano funcionante (1 sin anticuerpos detectables y el otro con anti-HLA clase I+II), 4 pacientes han vuelto a hemodiálisis (1 con HLA cla-se II+MICA, 1 con HLA clase I+GSTT1, 1 con GSTT1 y 1 con HLAclase I+II). Y los 8 restantes tienen una buena función renal a pesarde que en la mitad de ellos detectamos algún anticuerpo (4/8).

Conclusiones. Entre los pacientes con signos de rechazo humo-ral, encontramos un alto porcentaje que presentan anticuerpos anti-HLA donante específicos detectables por Luminex tanto previos comoposteriores al trasplante, así como algunos otros con anticuerpos anti-GSTT1 y anti-MICA.

P-147COMPARACIÓN DE DOS MÉTODOS BASADOS EN LA TECNO-LOGÍA LUMINEX PARA EL ESTUDIO DE ANTICUERPOSDONANTE ESPECÍFICOS. J.L. Caro Oleas, M.F. González Escriba-no, S. Toro Llamas, M.J. Acevedo Calado, M.J. Martínez Bravo, I. Agui-lera García, A. Núñez Roldán. Hospital Universitario Virgen del Rocío/Servicio de Inmunologia, Sevilla.

Al objeto de conocer si el rechazo de un órgano trasplantado es denaturaleza humoral, es preciso detectar la presencia de anticuerposdonante específicos en el suero del receptor (criterios de Banff). Paraello, se dispone de 2 métodos: 1) Single Antigen (SA), que emplea micro-esferas recubiertas con antígenos recombinantes y 2) crossmatch Lumi-nex (Xm-DSA) que se realiza a partir de moléculas HLA aisladas de delos propios donantes.

Objetivo. Comparar la sensibilidad entre ambos ensayos.Material y métodos. 24 sueros de mujeres embarazadas, que reco-

nocían por CDC distintas especificidades tanto de clase I (14 sueros)como de clase II (10 sueros). Estos sueros se estudiaron mediante SAy Xm-DSA netos y diluidos. En el Xm-DSA un mismo suero se enfren-tó con diferentes lisados (total lisados: 42 y total Xm-DSA: 61, 42 paraclase I y 19 para clase II). Analizamos diferencias de sensibilidad entreambos ensayos evaluando la máxima dilución positiva (MDP). Tam-bién analizamos la posible influencia de la dosis antigéncia (DA), esdecir, la coincidencia de mas de 1 antígeno HLA reconocido por el sue-ro en lisado o la presencia de homocigosis.

Resultados. En general, la máxima dilución positiva fue mayoren la técnica del SA (66,7% de los sueros anti HLA-A, 57% de los sue-ros anti HLA-B y 87% de los sueros anti HLA-DR). En el caso de lossueros anti-DQ, la técnica Xm-DSA fue incapaz de detectar anticuer-pos en 2 de 4 casos. En los otros dos, el SA fue más sensible.

Dosis antigénica: se incluyeron 40 casos (18 con 1 DA y 22 con >1DA). No observamos incremento en la sensibilidad de la técnica cuan-do teníamos mas de 1 DA.

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Conclusiones. En general, la sensibilidad del SA es mayor quela del Xm-DSA, sobre todo para los antígenos DQ, que se captan menoseficientemente. Las discrepancias entre ambos métodos no son atribui-bles a la DA por lo que otros factores deben ser postulados.

P-148DESARROLLO DE UNA LEUCEMIA AGUDA MONOCÍTICA (M5)EN UNA PACIENTE 17 AÑOS DESPUES DE UN TMO POR UNALEUCEMIA AGUDA PROMIELOCÍTICA (M3). P. Jiménez Gámiz , J.Palacios , P. Garrido , A. Cabrera , A. Fernández, J.M. De Pablos, F. Garri-do, F. Ruiz-Cabello. Hospital Universitario Virgen de las Nieves, Granada.

Una mujer de 29 años fue diagnosticada en marzo de 1993 de Leu-cemia Aguda Promielocítica, M3 de la clasificación FAB. Como trata-miento se realizó un trasplante de médula ósea alogenico de una her-mana HLA idéntica. Después de 17 años asintomática, en marzo de2010 la paciente es ingresada nuevamente en el servicio de hemato-logía y se le diagnostica una Leucemia Aguda Monocítica, M5 de laclasificación FAB. Puesto que el fenotipo de los blastos, determinadopor citometría de flujo, difería de los detectados en el primer diagnós-tico, investigamos el origen de la hematopoyesis mediante análisis deSTRs, confirmándose que el proceso leucémico tenía su origen en lascélulas del donante.

El desarrollo de un proceso leucémico en las células del donantees una rara complicación del trasplante de médula ósea que puede apa-recer tras un periodo de latencia de 4 a 164 meses. En la patogénesisde esta complicación se ha implicado a varios factores como la quimio-terapia y la radioterapia utilizada en el tratamiento y en el acondicio-namiento previo al trasplante, la existencia de una respuesta inmunedeficitaria en el huesped y el estres originado por la respuesta aloge-nica del donante en el microambiente de la médula ósea del hues-ped, lo que conduce a la aparición de alteraciones genéticas en las célu-las del huesped. No disponemos de datos sobre estudios genéticos dela primera leucemia. La segunda leucemia se estudió mediante FISHno detectándose la t(15;17), sin embargo detectamos una delecciónen el cromosoma 11q23. Otros autores han evidenciado anomalías enel cromosoma 11 (específicamente en 11q23) asociadas a la administra-ción de inhibidores de la topoisomerasa II. Asímismo, las deleccio-nes 5q y 7q se han asociado a los tratamientos con agentes alquilantes.

Creemos que es necesario realizar un estudio exhaustivo de losprocesos leucémicos post-trasplante hematológico mediante la com-binación de diversas técnicas (citometría de flujo, FISH y técnicas mole-culares). El análisis profundo de estos procesos contribuirá a su correc-to diagnóstico y al esclarecimiento de los mecanismos que intervienenen la génesis de las leucemias.

P-149SEGUIMIENTO DE UN CASO DE MIELOMA MÚLTIPLE IGE. I.Toboso De Lamo, P. Herrera, M. Cuevas, R. Alenda, L.M. Villar, P. Gon-zález. Hospital Universitario Ramón y Cajal, Madrid.

Objetivos. El Mieloma Múltiple IgE (MM IgE) está consideradocomo una patología de muy baja frecuencia, existen menos de 50 casosdescritos en el mundo. El objetivo de nuestro estudio fue establecer lamejor herramienta para el seguimiento de este tipo de pacientes y estu-diar su evolución. Hemos realizado el seguimiento del primer caso deMieloma Múltiple IgE descrito en España, en una mujer de 62 años de

edad, diagnosticada de MM IgE estadio III-B en Marzo de 2009 en elhospital de Alcorcón y remitida a nuestro hospital para la realizaciónde un transplante autólogo de células hematopoyéticas (TMO).

Material y métodos. Se realizaron las siguientes pruebas:• Estudio clínico del paciente.• Espectro Electroforético de suero y orina.• Inmunofijación (IF) y caracterización del pico monoclonal de IgE.• Cuantificación de IgE en suero mediante InmunoCap.• Valoración de proteinuria de Bence-Jones por Inmunofijación.• Valoración de crioglobulinas.

Resultados. La paciente presentaba lesiones osteolíticas, anemia,hipogammaglobulinemia e hipercalcemia.

En el proteinograma y la IF previos al transplante, se observa lapresencia de un pico monoclonal IgE lambda en suero, que desapa-reció tras el TMO. También se detectó la presencia de cadenas ligeraslambda de aspecto monoclonal en orina (Bence-Jones Lambda) queigualmente se negativizaron tras el TMO.

Los valores de cadenas lambda libres en suero fueron 22,5 mg/Lantes del transplante y 0,05 mg/L 3 meses después del mismo.

La valoración de crioglobulinas resultó negativa.Se realizaron dos cuantificaciones de IgE previas al transplante:

En la primera se detectaron unos niveles de IgE lambda de 680.000KU/L (163,2 mg/dl) y en la segunda se detectaron unos niveles de IgElambda de 1890000 KU/L (453,6 mg/dl). Destacar que estos valoresson los más altos que se han encontrado en un mieloma múltiple IgE(Valores normales 0-30 KU/L).

La cuantificación post-transplante fue de 175 KU/L (0,042 mg/dl)de IgE lambda.

Conclusión. Dada la baja incidencia de estos mielomas, es impor-tante realizar la mejor caracterización posible de la patología y el esta-blecimiento de los procedimientos de laboratorio que nos permitan suseguimiento. En este caso, concluimos que la cuantificación en suerode la IgE fue la determinación más sensible. Tras el TMO, el pico mono-clonal desapareció de suero y orina en la IF y los valores de cadenaslibres en suero se normalizaron, pero los niveles de IgE eran todavíasuperiores a los niveles de referencia. Además se constató que estapaciente mostraba una respuesta óptima inicial al TMO. Futuros estu-dios demostraran su evolución a largo plazo.

P-150COMPLEMENTACIÓN DEL ESTUDIO DE ANTICUERPOS ANTI-HLA POR CITOMETRÍA Y EL ANÁLISIS ESTRUCTURAL DE EPI-TOPOS EN LA DEFINICIÓN DE LA RESPUESTA HUMORAL ALO-GÉNICA. S. Mirete, N. Marín, A. De Andrés, J.L. Castañer. HospitalRamon y Cajal, Madrid.

Objetivo. Estudio de la respuesta humoral alogénica en un casode rechazo agudo acelerado.

Materiales y Métodos. La reactividad de los sueros pre- (inclui-da la muestra de la prueba cruzada) y post-trasplante se han estudia-do mediante citometría de flujo (LABScan 100™): tanto mediante elscreening para la presencia de anticuerpos anti-HLA-I,-II y MICA(LSMIX, One Lambda), como para la detección de especificidades declase I (LS1SA, One Lambda). El análisis estructural de los epítoposimplicados en dicha respuesta fue realizado con el algoritmo HLA-MatchMaker Versión 1.3.

Resultados. Varón de 43 años con IRC secundaria a GMN crónica enhemodiálisis desde agosto de 2001, tipaje HLA-A3, A24, B45, B53, DR1 sin

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sensibilización alogénica previa. Recibe un primer trasplante renal en ene-ro de 2003 con incompatibilidades HLAA26, B35, B64, DR07,DR14, prue-ba cruzada negativa y función tardía del injerto. El día 14 postrasplantese realiza biopsia renal en la que se observan lesiones histopatológicasatribuibles a rechazo agudo III de la clasificación Banff 97. Vuelta a hemo-diálisis en septiembre de 2004 y nefrectomía en 2005. Recibe un segundoinjerto renal en enero de 2010 con incompatibilidades HLA -A23, A29; B27,B61, DR11, DR13 y prueba cruzada negativa. Injerto no funcionante querequiere transplantectomía el día 6 postrasplante. En la biopsia se iden-tifica un intenso infiltrado inflamatorio mixto y signos de isquemia.

Tras la nefrectomía del primer injerto se detecta la presencia deanticuerpos anti-HLA de clase I y II. El análisis de las especificidadesmuestra la presencia de anticuerpos dirigidos frente a los antígenosHLA-A26+25+66+43 (> 1000 MFI) y HLA-A34+B08+B64 (500-1000MFI), este espectro de especificidades se mantiene a lo largo del tiem-po. Tras la pérdida del segundo injerto se detecta un espectro de espe-cificidades más amplio (HLA-A26+29+25+66+43+34, >5000 MFI; anti-B64, > 2000 MFI; anti- B27+61, >1000 MFI y anti-B08, >500 MFI) asícomo anticuerpos frente a antígenos de los CREG 1C, 5C y 8C (>500MFI) que se pueden explicar por una reactividad cruzada. La cinéti-ca de aparición de estos anticuerpos sugiere una respuesta secunda-ria. El análisis estructural de la respuesta sugiere la posible implica-ción de los epítopos a76n, a193Av, a207S, a246S, a253Q, presentes enA26, y b45Ee, b66qlc, b103VgP, en B64).

Conclusiones. El empleo de técnicas de detección y estudio de lasespecificidades anti-HLA de alta sensibilidad junto con el análisis estruc-tural de la respuesta permite la identificación de combinaciones donan-te-receptor de alto riesgo.

P-151ESTUDIO DEL POLIMORFISMO GENÉTICO DEL RECEPTOR DELA INTERLEUKINA 1 (IL1RN 86-BP DUP) EN UNA COHORTE DEPACIENTES RECEPTORES DE TRASPLANTE CARDÍACO. D. Her-nández Flórez, L. Valor, N. Del Pozo Rodríguez, C. Rodríguez-Sáinz,R. Teijeiro, E. Sarmiento Marchese, E. Fernández-Cruz , J. CarboneCampoverde. Hospital General Universitario Gregorio Marañon, Madrid.

Objetivo. El gen IL-1RN codifica el antagonista del Receptor dela IL-1, que inhibe la unión de las citocinas IL-1alfa e IL-1beta a susreceptores. Se ha descrito un polimorfismo en el intrón 2 del gen cau-sado por un número variable de repeticiones en tándem (VTNR) deuna secuencia de 86 pares de bases (IL-1RN 86-bp DUP) que puedeinfluir en los niveles de expresión del la proteína. Los pacientes homo-cigotos para el alelo 2 de este polimorfismo (IL-1RN*2) muestran unatendencia a desarrollar respuestas proinflamatorias de mayor dura-ción y severidad en comparación con el resto de pacientes. La pre-sencia de IL-1RN*2 se ha asociado con enfermedades inflamatoriasentre ellas la enfermedad arterial coronaria. Nuestro objetivo es ana-lizar la prevalencia de los genotipos que contienen el alelo IL-1RN*2en individuos trasplantados cardiacos.

Materiales y Métodos. Se evaluaron prospectivamente 59 pacientesreceptores de trasplante cardiaco y de 208 controles sanos. Se purificó elDNA genómico a partir de la sangre periférica. Se amplificó mediante PCRla región polimórfica que contiene el VTNR de 86 pares de bases. De acuer-do al número de repeticiones (rp) del fragmento de 86pb se distinguen 6alelos del 1 al 6. El alelo 1 (410 pb) tiene 4rp, el alelo 2 (240 pb) 2rp, elalelo 3 (500 pb) 5rp, el alelo 4 (325 pb) 3rp y el alelo 5 (595 pb) 6rp. Se deter-minó la frecuencia alélica y genotípica de este polimorfismo.

Resultados. El genotipo IL-1RN*2/ IL-1RN*2 mostró frecuenciasmuy similares en los individuos trasplantados y en los controles sanos(11,1% vs 11,1%). La frecuencia del genotipo IL-1RN*1/IL-1RN*2 se encon-tró ligeramente incrementada en los pacientes receptores de trasplantecardiaco en comparación con el grupo de controles sanos (50,8% vs 43,8%)sin que las diferencias tuvieran significación estadística (p=0,206).

Conclusión. Los resultados obtenidos no muestran diferencias enla distribución de los genotipos A2/A2 y A1/A2 comparando recep-tores cardíacos con controles sanos. Es necesario el aumento del tama-ño muestral para determinar si existe relación entre este polimorfismocon la patología cardiovascular de base pre-trasplante y con comorbi-lidades y/o complicaciones en la fase post-trasplante.

P-152ESTUDIO PRELIMINAR DE LA INMUNIDAD INNATA ENPACIENTES CON TRASPLANTE CARDIACO: LECTINA LIGA-DORA DE MANOSA (MBL) E INFECCIONES BACTERIANAS. N.Del Pozo, E. Sarmiento, J. Navarro, J. Rodríguez Molina, P. Muñoz, J.Palomo, J. Fernández-Yañez, E. Fernández-Cruz, J. Carbone. HospitalGeneral Universitario Gregorio Marañón, Madrid.

Introducción. La lectina ligadora de manosa (MBL) es una molé-cula importante del sistema inmune innato, participa en la defensacontra microorganismos activando la vía del complemento indepen-dientemente de anticuerpos. Se ha descrito que la deficiencia de MBLpuede predisponer a infecciones en diversas poblaciones. La mediciónde MBL puede ser útil para identificar pacientes en riesgo de infeccio-nes post-operatorias. La deficiencia de MBL se ha visto asociada a infec-ciones severa en post-trasplante renal.

Objetivo. Evaluación de concentración de MBL en una cohorte deTC con/sin complicaciones infecciosas bacterianas. Determinación deprevalencia de deficiencia de MBL en pacientes de TC con y sin infec-ciones.

Materiales y Métodos. Realizamos estudio descriptivo prospec-tivo en 36 pacientes con TC entre 2003 y 2009 (edad media= 52,61 años,rango: 24-69); Hombres= 25 (69,4%), Mujeres= 11 (30,6%). Terapia deinducción utilizada: Metilprednisolona y anticuerpos monoclonalesanti-CD25. Terapia inmunosupresora de mantenimiento:Tacrolimus/Ciclosporina, Micofenolato mofetil y Prednisona. Profila-xis universal con ganciclovir. Estudio inmunológico realizado: Medi-ción de concentración sérica de MBL mediante técnica de ELISA: pre-trasplante (basal), 7 y 30d post-TC. Las muestras pre/post trasplantefueron conservadas a -70ºC hasta su estudio y evaluadas al mismotiempo. Episodio Clínico: infección bacteriana que requirió terapiaintravenosa durante el 1er año de seguimiento post-TC.

Resultados. En pacientes TC observamos una disminución signi-ficativa en niveles séricos de MBL al mes post-TC vs basales (1152 ±1075 ng/mL vs 1088 ± 996 ng/mL p= 0,032; prueba T-2 colas). Los nive-les MBL pre-TC estaban disminuídos en relación a 40 controles sanos(1152 ± 1075 ng/mL vs. 2184 ± 1355 ng/mL, p<0,01; prueba T-2 colas).La prevalencia de deficiencia de MBL es variable según el nivel de refe-rencia utilizado, siendo mayor en pacientes TC vs. controles sanos(MBL < 200 ng/mL: 25% vs 7,5%). No observamos diferencias entreniveles basales, 7 y 30 días post-TC entre grupos de pacientes con infec-ciones (n= 8) vs. sin infecciones (n= 28). Los microorganismos aisladosen los pacientes infectados fueron: Acinetobacter baumanii, Enterococcusfaecalis, Legionella, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphiloco-cus aureus, Staphilococus epidermidis.

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Conclusiones. El componente de inmunidad innata, MBL, dismi-nuye en suero en el contexto del seguimiento del trasplante cardiaco.La prevalencia de deficiencia de MBL en variable según el nivel de refe-rencia utilizado.

SESIÓN 13: INMUNOLOGÍA TUMORAL

Moderadores: Ignacio Melero (Pamplona)Angel M. García Lora (Granada)

P-153GAMMAPATIAS MONOCLONALES Y BICLONALES TRABAJODE LABORATORIO. V.L. Pérez Mestre, D. Sánchez Costilla, S.M.Pollio. Fuerza Aerea Laboratorio DIBPFA, Capital Federal, Argentina.

La observación del aumento estadístico del requerimiento de dosa-je de inmunoglobulinas G, A y M y de las bandas monoclonales halla-das por inmunofijacion nos motivaron a la realización de este trabajoestadístico realizado durante 30 meses a partir del 01 enero 2001.

La llamada crisis del 2001 produjo en la población que recibe asis-tencia de nuestra obra social patologías que cada profesional de la saludobservó según su particular lugar de trabajo y especialidad.

En mi caso, bioquímica que trabaja en la División Inmunoserología,me llamo la atención el aumento de la prescripción médica de Inmuno-fijación y sus correspondientes dosajes de inmunoglobulinas G, A, M ensangre y eventualmente en algunos en orina. Esto significó no sólo unaumento de trabajo técnico-científico sino también un cambio en los pre-supuestos habituales de consumo y provisión de reactivos.

Fue una ardua y enriquecedora tarea, pues me permitió acercar-me a los pacientes y médicos, sortear obstáculos propios de nuestraespecialidad Bioquímica y la respuesta inmunológica de cada pacien-te para llegar al diagnóstico correcto.

Permitío la comprobación de la existencia de cuadros que se agra-vaban con el desarrollo de una nueva banda monoclonal adicionadaa la ya existente en los últimos estadíos de la enfermedad, o bien elincremento desmedido la inmunoglobulina patológica que deterio-raba mortalmente al paciente estudiado.

P-154DIFERENCIAS EN LA EXPRESION DE MARCADORES DE DIFE-RENCIACION TH1 EN RELACION A LA RESOLUCION O RECI-DIVA DE LESIONES ASOCIADAS A LA INFECCION POR VPH.A. Gonzalez, J. Canton, R. Carretero, P. Saenz-López, P. Jimenez, P.Jimenez, P. Jimenez, F. Garrido, F. Ruiz-Cabello, L.M. Torres. HospitalUniversitario Virgen de las Nieves, Granada.

Objetivos. Evidencias epidemiológicas y experimentales sostie-nen que el sistema inmunológico juega un papel relevante sobre el con-trol y progresión de las lesiones inducidas por el virus del papiloma.De hecho, se observa una alta incidencia de infecciones persistentes deVPH y de lesiones displásicas en pacientes inmunosuprimidos. Tam-bién en algunas pacientes en las que no se produce aclaración viral, elvirus ocasiona un estado de inflamación crónica persistente que se aso-cia a su vez al desarrollo neoplásico. Hemos querido investigar si exis-ten diferencias en la expresión de marcadores asociados a respuestas

TH1/TH2, activación y senescencia en pacientes que desarrollan lesio-nes inflamatorias SIL y también en pacientes que desarrollan lesio-nes recurrentes después de un tratamiento escisional (LEEP).

Material y métodos. Para este estudio se han comparado las sub-poblaciones linfocitarias entre una cohorte de mujeres con displasiaoriginada por VPH y en una población libre de enfermedad. Las dife-rentes poblaciones se estudiaron mediante marcaje con anticuerposmonoclonales contra marcadores especificos y lectura mediante cito-metría de flujo.

Resultados. Los análisis muestran cambios significativos en laproporción de células con expresión de marcadores efector/memoriaCD4/CXCR3/CCR5/CD62 bajo (TH1); Treg (CD4/CD25brillantes) yde apoptosis (CD4/CD95) que son compatibles con un estado de infec-ción crónica persistente, y de una diferenciación terminal (pérdidade CD27/CD28). Este fenotipo se asocia a disfunción de la poblaciónefectora CD4 y a una situación próxima a la apoptosis. El incrementode estas células fue significativo y se observó tanto al comparar el gru-po de pacientes /control y sobre todo en pacientes con recidivas des-pués del tratamiento escisional. Interesantemente el incremento en laproporción de células con expresión de CD95/CD4 se pudo relacionarcon el grado y la evolución de las lesiones (CIN-I-III).

Conclusiones. Nuestros datos revelan que un estímulo crónicopersistente puede favorecer la aparición de alteraciones funcionalesde los linfocitos (senescencia replicativa), peomoviendo una situaciónde inmunosupresión que favorece el desarrollo tumoral, tal y como seha visto en otros tipos de neoplasias.

P-155EXPRESIÓN DE CD133, MARCADOR DE CÉLULAS MADRE, ENTUMORES CEREBRALES. L. Cillero, J. Subiza, H. Zimman. HospitalClinico San Carlos, Madrid.

Introducción. Recientes trabajos describen que la presencia de célu-las madre tumorales (CSC) puede ayudar a explicar la heterogeneidadcelular y la resistencia a la terapia, (Reya et al., 2001). La formación deneurosferas es la característica propia de células madre neurales. El usode factores de crecimiento en cultivos in-vitro ha permitido el manteni-miento del estado indiferenciado de estas células además de acelerar suproliferación. (Reynolds BA and Weiss, S, 1996). El gen CD133 ubicadoen la posición 4p15.32 codifica una glicoproteína cinco-transmembrana(5-TM), marcador de superficie celular para identificar y aislar célulasmadre del tumor cerebral (BCSCs), (Beier D, 2007).

Objetivo. Fue evaluar el número de células CD133 positivas en lostumores estudiados y su relación con la formación de tumoresferas.

Materiales y Métodos. Se realizó cultivo primario de 11 muestrastumorales de pacientes diagnosticados de glioma de alto grado (OMSIII y IV) en medio DMEM-F12 libre de suero conteniendo factores decrecimiento tales como: EGF, bFGF y LIF, para la selección de célulasmadre tumorales y un posterior estudio de la expresión del fenotipoCD133 con el anticuerpo monoclonal CD133/2 marcado con ficoeritri-na (Miltenyi Biotec) por citometría de flujo.

Resultados. En nuestra serie, ocho de los once tumores crecie-ron in-vitro como agregados celulares a los seis días de cultivo, ade-más de presentar expresión de CD133+ fueron clasificados histológi-camente como tumores astrocíticos y oligoastrocitarios. Aunque sola-mente se detectó un pequeño porcentaje de células altamente positi-vas para CD133. La ausencia de estos clones celulares se observó entres tumores diagnosticados como oligodendrogliales.

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Conclusiones. Se puede especular que hay por lo menos dos tiposde células madre cancerosas en el tumor cerebral que varían en suexpresión de CD133, se pone de relieve la necesidad de más marcado-res de superficie de CSC. Sugerimos que cultivos prolongados en pre-sencia de oxígeno superior a la estimada en el cerebro (1-5%) podríaestar dando lugar a una reducción en la expresión de CD133.

P-156ERP5 Y GRP78 ESTÁN ASOCIADAS CON LA PRODUCCIÓN DEMICA SOLUBLE EN LA LEUCEMIA LINFÁTICA CRÓNICA. S.Gonzalez Rodríguez1, A. Gonzalez Rodríguez2, J. Contesti3, A. Fernan-dez Guizan1, A. Acebes Huerta1, C. López Larrea2, L. Huergo Zapico1.1IUOPA Universidad de Oviedo, Oviedo. 2Hospital Central de Asturias, Ovie-do. 3Hospital de Cabueñes, Oviedo.

El receptor activador NKG2D interacciona con una serie de ligan-dos inducidos en cáncer. La interacción de NKG2D con sus ligandosactiva a las células NK promoviendo la respuesta inmune contra elcáncer. Muchos tumores avanzados contrarrestan esta actividad anti-tumoral mediante el corte proteolítico de MICA y su liberación en for-ma MICA soluble que inhibe la respuesta inmune citotóxica. Recien-temente hemos demostrado que ERp5 y GRP78 interaccionan con MICAen la superficie de la célula tumoral y desempeñan un papel clave enla producción de MICA soluble. Aquí demostramos que los pacien-tes de leucemia linfática crónica (LLC) tienen una elevada resistenciaa la citotoxicidad mediada por NKG2D. Esto se debe a que las célu-las leucémicas no expresan o expresan pequeñas cantidades de losligandos de NKG2D, MICA y ULBP1-3. Asociado a la baja expresiónde MICA se observa una producción heterogénea de MICA soluble enlos pacientes (entre 0 a 535,5 pg/ml). El 38% de los pacientes presen-tan cantidades significativas de MICA soluble. Además mostramosque ERp5 y GRP78 se expresan en la superficie de las células leucémi-cas y de los linfocitos B. En las células leucémicas, ERp5 y GRP78 secolocalizan en la superficie celular con MICA y están asociados fun-cionalmente con la producción de MICA soluble, lo que convierte aestas moléculas en interesantes dianas terapéuticas en la LLC. Ademásla expresión de ERp5 y GRP78 en la superficie de los linfocitos B sugie-re una función desconocida de estas moléculas independiente de laregulación de la expresión de MICA.

P-157LA EXPRESIÓN DE MICA ESTÁ REPRIMIDA EN TUMORES EPI-TELIALES POR LA DESACETILASA DE HISTONAS 3. S. Gonza-lez Rodríguez1, A. López Soto1, R. Tejedor Vaquero1, L. Huergo Zapi-co1, A. Acebes Huerta1, S. Rodríguez Rodero1, C. López Larrea2, A. Fer-nández Guizán2. 1IUOPA Universidad de Oviedo, Oviedo. 2Hospital Cen-tral de Asturias, Oviedo.

NKG2D es un receptor activador de las células NK que desempe-ña un papel clave en la respuesta inmune contra el cáncer. Los ligan-dos de NKG2D, MICA y las ULBPs, se inducen por el daño genotóxi-co, favoreciendo la eliminación de la célula tumoral por el sistemainmune. Los tumores avanzados contrarrestan el efecto antitumoralde NKG2D reprimiendo la expresión de los ligandos de NKG2D en lasuperficie de la célula tumoral. La expresión de MICA se encuentrareprimida en numerosos tumores epiteliales, en particular en tumoresen estadios avanzados. En este trabajo estudiamos si la represión de la

expresión de MICA en tumores epiteliales puede estar mediada pormecanismos epigenéticos. Nuestros experimentos sugieren que la meti-lación del ADN no está implicado en la represión de la expresión deMICA en tumores epiteliales, sin embargo el tratamiento de líneastumorales epiteliales con el inhibidor de las desacetilasas de histonas(HDACs) tricostatina A (TSA) incrementa notablemente la citotoxici-dad mediada por NKG2D y este efecto está mediado en parte por lainducción de la expresión de MICA. Nuestros experimentos indicanque el factor de transcripción NFY desempeña un papel crucial en esteproceso. Además mediante el silenciamiento génico y la sobreexpre-sión de las HDAC1-3 demostramos que HDAC3 es un represor de latranscripción de MICA. HDAC3 está sobreexpresado en adenocarci-noma de colon lo que favorece la represión de la expresión de MICAfavoreciendo la evasión tumoral de la respuesta inmune.

P-158IMPORTANCIA PRONÓSTICA DE LOS LINFOCITOS T CD8 YCD4 EN LA LEUCEMIA LINFÁTICA CRÓNICA. S. Gonzalez Rodrí-guez1, J. Contesti1, L. Huergo Zapico1, A. Fernandez Guizan1, A. Ace-bes Huerta1, A.P. Gonzalez Rodríguez2. 1IUOPA Universidad de Ovie-do, Oviedo. 2Hospital Central de Asturias, Oviedo.

El número absoluto de linfocitos es un factor pronóstico indepen-diente para la supervivencia en diversas enfermedades hematológi-cas, pero todavía no ha sido determinado en la leucemia linfática cró-nica (LLC). Para analizar el papel pronóstico en la LLC, las células NKy T fueron cuantificadas en un grupo de 256 pacientes de LLC diag-nosticados entre 1997 y 2007. Estos pacientes mostraron un númeroelevados de células NK y de linfocitos T CD4 y CD8 respecto a los indi-viduos normales. La relación CD4/CD8 estaba invertida en un 39,7%de los casos. Además, los pacientes diagnosticados en los estadios tem-pranos de Rai mostraron un número relativo más alto de CD4 (p= 0,03),CD8 (p= 0,02) y células NK (p= 0,01). El análisis multivariante Coxidentificó el número relativo de linfocitos T CD8 (radio Hazard =1.464;p=< 0,006) y linfocitos T CD4 (radio Hazard = 0,091; p=< 0,01) comomarcadores independientes de supervivencia. No se observó correla-ción significativa entre las células NK y la supervivencia de los pacien-tes. Adicionalmente, los pacientes con un número relativo de CD8>0,074 o CD4> 0,1 tenían mayor supervivencia global a los 10 años queaquellos que presentaban menor número de linfocitos T (p= 0,002). Enparticular, pacientes con un número de CD8> 0,074 tenían un tiempomedio de supervivencia significativamente mayor (149,33 vs. 82,06meses). En resumen, este estudio muestra que las características cuan-titativas del sistema inmune de los pacientes pueden modificar la pro-gresión de la LLC, sugiriendo un papel del sistema inmune en la pato-genia de esta enfermedad.

P-159EL FENOTIPO DE INESTABILIDAD DE MICROSATELITES (MSI)DETERMINA EL PATRON DE INFILTRACION LEUCOCITARIAEN EL CANCER DE COLON. F. Ruiz-Cabello Osuna, M. Bernal, A.Concha, T. Cabrera, M.D. Galvez, A.I. Rodríguez, R. López, F. Garri-do. Hospital Universitario Virgen De Las Nieves, Granada.

Objetivos. Los carcinomas colorectales (CCRs) con fenotipo MSIhan sido descritos con anterioridad, como tumores muy inmunogéni-cos que escaparían de la acción del sistema inmunitario a través de la

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pérdida de moléculas de HLA de clase I. Hemos estudiado la infiltra-ción tumoral en tres grupos de CCRs clasificados en función del feno-tipo MSI y de la expresión de moléculas HLA clase I.

Material y Métodos. El primer grupo tumoral: tumores MSI conpérdida total de HLA clase I (MSI+/HLA-) (n=8); segundo grupo: tumo-res con estabilidad de microsatélites y HLA clase I negativos en super-ficie (MSI-/HLA-)(n=8); y tercer grupo (Control): tumores sin altera-ciones en genes HLA o en el gen β2-m (MSI-/HLA+) (n=8). Las muta-ciones en el gen de la β2-m fueron estudiadas por secuenciación . Enel estudio inmunohistiquímico sobre tejidos, se emplearon anticuer-pos monoclonales dirigidos frente a CD45, CD3, CD4, CD8, CD56,CD64, CD163, CD206 y Hemo-Oxigenasa 1.

Resultados. Detectamos cuatro casos MSI+/HLA- con mutacio-nes que afectaban al gen de la β2-microglobulina, y sólo un tumor MSI-/HLA- con alteraciones en dicho gen. Observamos que los tumoresMSI+/HLA- se caracterizaban por una alta infiltración de células CD45+,con una destacable presencia de linfocitos T CD8+ que aparecían conlocalización intra y peri-tumoral. El grupo tumoral MSI-/HLA- teníael grado de infiltración linfocitaria menos intenso de los tres gruposde estudio, con escasa o nula presencia de linfocitos CD8+, que apa-recían con localización intersticial o estromal, nunca infiltraban el inte-rior de la glándula tumoral. Los tumores Control MSI-/HLA+ se carac-terizaban por tener una intensidad de infiltración intermedia, con bajacantidad de células CD8+, que aparecían con distribución estromal eintersticial, y una presencia intratumoral menos intensa que en lostumores MSI+/HLA-. No se encontraron diferencias en la infiltraciónpor macrófagos tipo I ( macrófagos clásicos) y tipo II (actividad inmu-nosupresora) entre los grupos tumorales.

Conclusiones. Los tumores MSI+/HLA- presentan una alta infil-tración compatible con mayor inmunogenicidad. El escape a la inmu-novigilancia no se explica, en todos los casos, por la inmunoselecciónde mutaciones de β2-microglobulina. Los tumores MSI-/HLA- debenutilizar otros mecanismos que justifiquen el fenotipo HLA-, a parte delescape a CTLs, dada la menor infiltración linfocitaria, y en particular,la baja presencia de linfocitos T CD8+.

P-160CARCINOMAS DE COLON CON INESTABILIDAD GENOMICAPRESENTAN PERFILES DE EXPRESION GENICA COMPATIBLESCON TUMORES MAS INMUNOGENICOS. F. Ruiz-Cabello Osu-na, M. Bernal, T. Cabrera, A. Concha, A.I. Rodríguez, M.D. Galvez, F.Garrido. Hospital Universitario Virgen De Las Nieves, Granada.

Objetivos. La Inestabilidad de Microsatélites (MSI) es uno delos principales mecanismos moleculares implicados en el desarrollodel cáncer colorectal (CCR). Estos CCRs con fenotipo MSI han sido des-critos con anterioridad, como tumores muy inmunogénicos, con unadestacable presencia de CTLs. Hemos estudiado los perfiles de expre-sión génica de tres grupos de CCRs clasificados en función del fenoti-po MSI y de la expresión de moléculas HLA clase I.

Material y Métodos. Primer grupo tumoral: tumores MSI con pér-dida total de HLA clase I (MSI+/HLA-) (n=8); segundo grupo: tumo-res con estabilidad de microsatélites y HLA clase I negativos en super-ficie (MSI-/HLA-) (n=8); tercer grupo (Control): sin alteraciones engenes HLA o en el gen β2-m (MSI-/HLA+ )(n=8). El análisis de expre-sión génica fue realizado mediante la tecnología GeneChip de Affy-metrix empleando el array HT_HG-U133_Plus 24, que puede proce-sar 24 muestras de forma simultánea.

Resultados. Como resultado inicial, obtuvimos clusters jerárqui-cos en los que observamos que los tumores MSI+/HLA- tendían a agru-parse entre sí y a mostrar un perfil de expresión de secuencias génicasestadísticamente significativas (p< 0,05) que era muy diferente delde los otros dos grupos del estudio. Los casos MSI-/HLA- y los delgrupo MSI-/HLA+ (Controles) también mostraban una tendencia aclusterizar, sin embargo ambos agrupaciones mostraban perfiles deexpresión similares. En la comparación MSI+/HLA- vs MSI-/HLA+,obtuvimos 635 secuencias génicas significativas (p< 0,05) y cuando secomparaban los grupos MSI-/HLA- vs MSI-/HLA+, el número degenes estadísticamente significativos (p< 0,05) fue de 217. Los tumo-res MSI-/HLA- mostraban una mayor expresión de genes de la vía delTGF-β. Observamos, también, que los casos MSI+/HLA- expresabangenes relacionados con la respuesta inflamatoria (genes de quimioqui-nas (CCL3, CCL18, CXCL13…); genes relacionados con la vía del TLR(TLR2, TLR8, Ly96, PELI1, TICAM2…); genes marcadores de macró-fagos (CD14, CD16, CD32, CD64…)) y con la actividad citotóxica(TCRalfa, cadena ζ del complejo CD3, perforinas, granulisinas, facto-res de transcripción implicados en la activación de linfocitos T…).

Conclusiones. Estos resultados son consistentes con los datos obte-nidos del estudio inmunohistoquímico de la infiltración leucocitariatumoral, donde observamos que los casos MSI+/HLA- presentaban lamayor intensidad de infiltración por parte linfocitos T CD8+.

P-161EXPRESIÓN DE ANTÍGENOS HLA DE CLASE I Y II EN LÍNEASCELULARES Y TUMORES DE PROSTATA. J. Carretero1, A.B. DelCampo2, R. Méndez2, S. Zichenko2, S. Ward3, F. Ruiz-Cabello2, T. Cabre-ra2, N. Apstiauri2, F. Garrido2. 1Universidad de Granada, Granada. 2Hos-pital Universitario Virgen de las Nieves. 3St George University of London, ,United Kingdom.

Objetivos. Conocer la frecuencia de alteraciones y mecanismosmoleculares implicados en la expresión anómala de HLA de clase I enel cáncer de próstata, el segundo más frecuente en hombres y cuyainformación sobre estas alteraciones es limitada.

Material y métodos. Hemos analizado la expresión de HLA declase I y II en trece líneas celulares humanas inmortalizadas, ocho deellas establecidas a partir de tumores primarios y cinco a partir de teji-do adyacente normal de próstata. Se han comparado los resultadoscon los patrones de expresión de líneas celulares tumorales de prósta-ta no inmortalizadas obtenidas de ATCC: DU145, PC3 y LNCap. Seestudió la expresión de HLA en 46 muestras criopreservadas de tumo-res de próstata, de las cuales once se seleccionaron para ser microdi-sectadas y realizar en ellas un análisis de microsatélites para deter-minar la presencia de LOH. Para ello se llevaron a cabo diferentes téc-nicas entre las que se incluye inmunohistoquímica, microdisecciónlaser, análisis de microsatélites y análisis por Citometría de flujo.

Resultados. La inmunohistoquímica reveló que un 90% de lostumores poseían algún tipo de alteración de la expresión de HLA declase I en membrana. Además, hasta un 50% de los tumores microdi-sectados presentaban LOH en la región HLA-I. En una línea celulardetectamos una pérdida total de expresión de HLA-I debido a unaLOH y una delección en el gen de la beta-2-microglobulina (b2m). Lainfección de estas células con un adenovirus portador del gen silves-tre de la b2m humana recuperó la expresión normal de HLA de claseI. En dos líneas celulares encontramos pérdida de haplotipo y pérdi-da de locus. En varias líneas celulares observamos baja regulación de

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locus A y B. Ninguna de las líneas celulares expresaba HLA de clase IIen condiciones basales, pero tras el tratamiento con IFN-gamma, nue-ve de las líneas celulares expresaron HLA-DR, y una expresó HLA-DP.

Conclusiones. Los resultados preliminares indican que las altera-ciones (reversibles e irreversibles) de HLA de clase I en cáncer de prós-tata son comparables a las que encontramos en otros tipos de tumo-res.

P-162DIFERENTES TRATAMIENTOS DE INMUNOTERAPIA INHIBENMETÁTASIS ESPONTANEAS CON ALTERACIONES REVERSI-BLES EN LA EXPRESIÓN DE MHC-I EN UN MODELO PRECLÍ-NICO MURINO. C. Garrido López1, I. Romero García2, I. Linares Dic-kler2, E. Berruguilla Pérez2, A. Collado Torres2, I. Algarra López DeDiego3, F. Garrido Torres-Puchol4, Á.M. García Lora2. 1Universidad deGranada, Granada. 2Hospital Universitario Virgen de las Nieves, Granada.3Universidad de Jaén, Jaen. 4Universidad de Granada, Hospital Universita-rio Virgen de las Nieves, Granada.

La pérdida de expresión de moléculas MHC-I en células tumora-les es un mecanismo de escape de la respuesta inmunológica, frecuen-te en los procesos de metastatización. En pacientes de melanoma, laadministración de inmunoterapia produjo la regresión de aquellasmetástasis con alteraciones reversibles en la expresión de HLA-I. Eneste ensayo analizamos la efectividad de diferentes tratamientos deinmunoterapia en un modelo preclínico, de fibrosarcoma murino conmetástasis espontáneas que presentan alteraciones reversibles en laexpresión MHC-I.

Se realizó un ensayo de metástasis espontáneas con la línea defibrosarcoma GR9-A7 en ratones BALB/c. Estableciendo cinco gru-pos de 20 ratones, los cuales recibieron sus respectivos tratamientosdurante 6 semanas tras la extirpación del tumor primario: Control,CpG+A7-100Gy, PKS, Docetaxel y PSK+Docetaxel. 6 ratones de cadagrupo fueron sacrificados a mitad del tratamiento para estudiar laevolución del proceso metastásico. Los 14 restantes se sacrificaron alfinalizar los tratamientos. Los ratones fueron examinados, extirpan-do las metástasis encontradas, para adaptarlas a cultivo y analizarsu fenotipo MHC-I. Subpoblaciones linfocitarias fueron analizadasen bazo y sangre periférica.

La línea GR9-A7 presenta expresión de Kd, Dd y Ld. En el gru-po Control metastatizó en 18/20 ratones produciendo 17-58 metás-tasis pulmonares y 1-3 linfáticas. Al final de los tratamientosCpG+A7-100Gy, PSK y PSK+Docetaxel curaron las metástasis, mien-tras Docetaxel sólo redujo el número de metástasis. En los gruposCpG+A7-100Gy, PSK y Docetaxel se encontraron metástasis en losratones sacrificados a mitad del tratamiento, pero en menor medi-da que en el grupo control. El análisis del fenotipo mostró que un70% de las metástasis del grupo control tenían alteraciones en laexpresión MHC-I reversibles con IFN-gamma. Un porcentaje simi-lar se encontró en las metástasis del grupo Docetaxel. Los tratamien-tos de inmunoterapia indujeron una mayor inmunoselección, pro-duciendo una pérdida de la expresión de MHC del 80% CpG+A7-100Gy y del 100% PSK. El estudio de las poblaciones linfocitariasdemostró una inducción de la respuesta inmunológica, destacablepor el aumento de linfocitos T CD8+ en CpG+A7-100Gy y de T y NKen PSK y PSK+Docetaxel.

Los tratamientos de CpG+A7-100Gy, PSK y PSK+Docetaxel pro-dujeron una inducción en la respuesta inmunológica capaz de elimi-

nar las metástasis con alteraciones reversibles en la expresión de MHC-I, producidas por GR9-A7.

P-163RELACIÓN DE LOS POLIMORFISMOS EN GENES DE LA RES-PUESTA INMUNOLÓGICA INNATA CON EL RIESGO Y PROGRE-SIÓN DEL CÁNCER VESICAL. M. Guirado, R. Carretero, E. Gills,P. Saenz-López, F. Garrido, F. Ruiz-Cabello, J.M. Cozar. Hospital Uni-versitario Virgen de las Nieves, GranadaHospital Universitario Virgen de lasNieves, Granada.

Objetivos. Existen estudios que muestran el papel de la respues-ta inmunitaria innata en el control de los procesos tumorales. El obje-tivo de este estudio es analizar la relación de los polimorfismos enRIPK2, NOD2, Toll 2 y c13orf31, con el riesgo y las características clí-nicopatológicas del cáncer de vejiga.

Material y métodos. Se analizaron los polimorfismos (snp) enNOD2 (rs9302752), RIPK2 (rs42490), c13orf31 (rs3764147) y Toll2(rs5743708), mediante PCR a tiempo real usando sondas Taqman fren-te a los distintos alelos. Se estudiaron 303 casos de pacientes con cán-cer vesical y 384 casos control. C13orf31 es una proteína sin caracteri-zar que ha sido asociada a la respuesta innata frente a la lepra.

Resultados. De los estudios realizados se extraen los siguientesresultados: el polimorfismo c13orf31 se relaciona con el riesgo de sufrircáncer. El genotipo cc predispone a padecer la enfermedad (p< 0,001OR= 4.00 IC= 2,09-7,69). Al estudiar la relación de los polimorfismosindicados con las características clínicopatológicas de la enfermedadobtuvimos: C13orf31: su genotipo se relaciona con grado de diferen-ciación (G) (p< 0,001) y grado de infiltración del tumor (T) (p= 0,013)y muestra una tendencia con el desarrollo de metástasis (p= 0,092).Toll2 se relaciona con tamaño tumoral (p= 0,048), recidiva (p= 0,012)y progresión del tumor (p= 0,048). NOD2 se asocia con metástasis enganglios (N) (p= 0,018) y en recidiva tras BCG (p= 0,045). RIPK2 estáimplicado en metástasis en ganglios (p= 0,047) y en grado de infiltra-ción (p= 0,021).

Conclusiones. Nuestros análisis revelan que los polimorfismosestudiados, RIPK2, NOD2, Toll2 y c13orf31, influyen en el riesgo depadecer cáncer urotelial y en el desarrollo de la enfermedad. Estosdatos apoyan la hipótesis de la influencia del sistema inmunitario inna-to y la enfermedad con el riesgo y progresión de cáncer vesical.

P-164EL EXOPOLISACÁRIDO BACTERIANO B100 SULFATADO INDU-CE APOPTOSIS POR LA VÍA MITOCONDRIAL EN CÉLULAS TLEUCÉMICAS. C. Ruiz-Ruiz, D. Carranza, G. Srivastava, I. Llamas,E. Quesada, I.J. Molina. Universidad de Granada, Armilla.

Objetivos. Los exopolisacáridos bacterianos (EPS) son políme-ros heterogéneos formados por diferentes monosacáridos y otros sus-tituyentes no sacarídicos, como pueden ser grupos sulfatos. Dichosgrupos parecen contribuir a las propiedades biológicas atribuidas aestos EPS: antivirales, antitumorales e inmunomoduladoras, entresotras. El objetivo de este trabajo es estudiar la actividad antitumo-ral del EPS obtenido de bacterias halófilas, B100, en estado nativo ysulfatado.

Material y métodos. Linfocitos T primarios: Se obtuvieron a par-tir de muestras de sangre de donantes sanos y de pacientes con leuce-

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mia de células T. Fueron mantenidos en RPMI 1640 completo en unincubador a 37ºC con 5% de CO2 durante 24 o 48h.

Líneas celulares: Jurkat, HEL, CEM, MOLT-4, HPB-ALL, Raji, DAU-DI, NAMALWA, HL-60, K562, U937, SKBr3, EVSA-T y HSV fueronmantenidas en el mismo medio de cultivo y condiciones que los linfo-citos T primarios.

Las células apoptóticas y la caída de potencial de membrana mito-condrial fueron analizadas en un citómetro FACScan tras tinción conioduro de propidio (IP) y DiOC6, respectivamente.

La detección de proteínas se realizó mediante inmunoblot.Resultados. La forma sulfatada del EPS B100 es capaz de inhibir

totalmente el crecimiento de diferentes líneas celulares como Jurkaty HEL. La forma nativa de B100 y las formas nativa y sulfatada del EPSN12 (estrechamente relacionado con B100) también lo hacen aunquecon menor eficacia. Sin embargo, solo B100S induce apoptosis de for-ma dosis-dependiente en las líneas leucémicas T MOLT-4 y Jurkat. Esteefecto proapoptótico se observa de manera restringida en el linaje hema-topoyético, dentro del cual existe un gradiente de sensibilidad. Laslíneas leucémicas T son las más sensibles. B100S también induce unamoderada apoptosis en leucemias T primarias pero no en linfocitos Tnormales. La apoptosis inducida por B100S va acompañada de unacaída del potencial de membrana mitocondrial y es dependiente decaspasas, siendo la primera en activarse la caspasa-9. Estos datos indi-can que dicha inducción de apoptosis tiene lugar a través de la rutaintrínseca o mitocondrial.

Conclusiones. B100S es el primer exopolisacárido bacteriano des-crito capaz de inducir apoptosis de manera potente y selectiva en célu-las T leucémicas, lo que sugiere su uso potencial en el tratamiento deeste tipo de tumores.

P-165ALTERACIONES SUCESIVAS EN LA EXPRESIÓN DE MOLÉCU-LAS HLA-I ORIGINAN INMUNOESCAPE Y CÉLULAS DE MELA-NOMA DIRECTAMENTE MÁS ONCOGÉNICAS. C. Garrido López1,E. Berruguilla Pérez2, I. Linares Dickler2, I. Romero García2, A. Colla-do Torres2, I. Algarra López De Diego3, F. Garrido Torres-Puchol4, Á.M.García Lora2. 1Universidad de Granada, Granada. 2Hospital UniversitarioVirgen de las Nieves, Granada. 3Universidad de Jaén, Jaen. 4Universidad deGranada, Hospital Universitario Virgen de las Nieves, Granada.

La línea tumoral Ando-2 procede de una metástasis de unpaciente de melanoma, la cual presenta la pérdida de un haplotipoHLA. Se estableció una línea transfectada con el alelo A2, Ando-TA2. Tras el crecimiento in vivo de Ando-2 en ratones BALB/c-nudese obtuvo la línea Ando-nude, que perdió completamente la expre-sión HLA-I. En este estudio analizamos el comportamiento onco-génico de estas tres líneas que presentan diferente expresión demoléculas HLA-I.

Se analizó la presencia de precursores de CTLs en la sangre delpaciente. El crecimiento local in vivo fue analizado mediante inyecciónde diferentes dosis de células en ratones inmunodeficientes. La tasa deproliferación in vitro se analizó por ensayos con Alamar blue y MTT, ylos resultados se correlacionaron con la expresión de genes del ciclocelular (RT-PCR). La capacidad metastásica se estudió mediante ensa-yos in vitro de invasión y migración.

Ando-2, tiene expresión superficial de moléculas HLA-I, con lapérdida de un haplotipo. Ando-TA2, recupera la expresión superficialdel alelo A2. La línea Ando-nude no expresa moléculas HLA debido a

la down-regulación de la APM. En la sangre del paciente fueron encon-trados CTLs específicos contra Ando-TA2. En crecimiento in vivo Ando-2-nude crece en todas las concentraciones inyectadas, mientras queAndo-2 sólo crece al inyectar 5,106 de células, y la transfectante no cre-ce a ninguna concentración. Estos resultados se correlacionan con elmayor rango de proliferación in vitro de Ando-nude, seguida de Ando-2 y Ando-TA2. En el estudio de los genes del ciclo celular la transfec-tante presenta expresión muy alta de ciclinaA1 y Mdm2. Ando-nudetiene una mayor expresión de Cdk2, Cdc25A y E2F1. Los ensayos deinvasión y de migración, Ando-nude mostró un mayor potencial, segui-da por Ando-2 y finalmente por Ando-TA2.

La línea Ando-2 es el resultado de la fase de inmunoselección enel paciente, en la que se seleccionan aquellas células tumorales con alte-raciones en la expresión HLA-I. Una segunda pérdida de HLA-I enestas células originó células más oncogénicas per se y con mayor capa-cidad migratoria e invasiva.

P-166CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DE LÍNEAS CELULARES DEMELANOMA: BUSCANDO MARCADORES DE CÉLULAS INI-CIADORAS Y DE PRONÓSTICO. M. Caballero-Baños, J. Milà, R.Vilella. Hospital Clínic, Barcelona.

La teoría de las “Cancer Stem Cells” (CSCs) nos propone que todala masa tumoral estaría formada a partir de poblaciones minoritariascon características similares a las “Stem Cells” convencionales; es decir,en el estadio final de la masa tumoral, podríamos encontrar una granproporción de células tumorales diferenciadas, y una pequeña propor-ción de células con capacidad tumorigénica (CSCs). Una posible expli-cación de los pobres resultados observados en la terapia del melano-ma metastático, sería que los tratamientos empleados atacarían la pobla-ción diferenciada de la masa tumoral, dejando intacta la poblaciónde “Melanoma Stem Cells”, la cual respondiendo posteriormente a dife-rentes y desconocidos estímulos microambientales, sería capaz de rege-nerar la masa tumoral.

Objetivo. Definir algún marcador de superficie que nos permitaidentificar a las células iniciadoras de melanoma así como algún mar-cador o grupo de marcadores que nos permitan definir subtipos demelanoma de valor pronóstico.

Metodología. Cultivamos líneas de melanoma establecidas in vitrocon dos medios diferentes: DMEM y Knockout-DMEM (específico paracélulas embrionarias, cultivo teóricamente enriquecido en Cancer StemCells). Realizamos un fenotipado de superficie con 59 monoclonalesque determinan la expresión de 56 moléculas de superficie.

Resultados. Obtenemos el nivel de expresión de 56 moléculasde superficie en dos condiciones diferentes (medio DMEM y Knoc-kout-DMEM), de 13 líneas de melanoma criopreservadas. A partir deestos resultados, calculamos la expresión diferencial de los diferentesmarcadores en cada línea en concreto, observando marcadores queaumentan su expresión en cultivo con medio Knockout-DMEM, asícomo otros que disminuyen.

Conclusiones. 6 marcadores de superficie aumentan su expre-sión cuando las líneas son cultivados en medio específico para célu-las embrionarias (teóricamente, podrían considerarse marcadores decélulas iniciadoras de melanoma). Así mismo encontramos 13 mar-cadores que se expresan de forma heterogénea en ambas condicio-nes (posibles marcadores de subtipos de melanoma de valor pronós-tico).

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P-167IDENTIFICACIÓN DE GENES PROANGIOGÉNICOS Y ANTIO-XIDATIVOS EN MONOCITOS PRIMARIOS HUMANOS SOME-TIDOS A HIPOXIA. I. Guijarro Muñoz, A. Cuesta Martínez, L. Alva-rez Vallina, L. Sanz Alcober. Hospital Puerta de Hierro, Madrid.

Objetivos. Los monocitos son reclutados por los tumores y se acu-mulan en áreas hipóxicas, contribuyendo a la angiogénesis tumoral.En este trabajo, estudiamos la influencia de un microambiente hipóxi-co sobre el perfil de expresión génica de monocitos primarios para

identificar la modulación selectiva de genes que puedan jugar un papelen dicho proceso.

Métodos. Para caracterizar cómo los monocitos se adaptan almicroambiente hipóxico, estudiamos el patrón de expresión génica demonocitos humanos expuestos 24h a 1% O2 con respecto a los cultiva-dos en condiciones de normoxia usando el microarray GeneChip Gene1.0 ST (Affymetrix). Como control de respuesta a hipoxia, el incremen-to en la expresión de VEGFA se comprobó en cada experimento. Losresultados se analizaron usando la base de datos de ontología génicaDAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Disco-very).

Resultados. De los 28.869 genes analizados en el microarray(correspondientes a 19.734 transcritos primarios), un total de 379 fue-ron modulados al menos dos veces con respecto a los controles nor-móxicos. Además de VEGF, demostramos la sobreexpresión de másde 50 genes relacionados con angiogénesis (incluyendo FLT-1, ANGy MMP-19), componentes de la matriz o reguladores de la misma(como ADAM8, SPP1, TFP1 and TSN1), respuesta inmune (CD16,CD32, CD300, y COLEC12) y el metabolismo glicolítico y no glicolí-tico que habían sido previamente identificados como inducibles porhipoxia.

De especial interés fue la identificación de un cluster de genesimplicados en la unión a metales y a la prevención del daño oxidati-vo, no descritos previamente. Su asociación con hipoxia no es extraña,ya que el flujo sanguíneo en los tumores es irregular, causando perio-dos de hipoxia seguidos de reperfusión. Las especies reactivas de oxí-geno (ROS) producidas durante la reperfusión son causa de estrés oxi-dativo.

Conclusiones. Estos resultados apoyan el papel protector frenteal estrés oxidativo atribuido a una familia de genes antioxidantes ysugieren que su expresión puede suponer una ventaja adaptativa delos monocitos al cambiante entorno tumoral.

Tabla 2. Marcadores de expresión heterogénea en líneas de malanoma

DMEM Knockout DMEM

β2-micro CD16 CD54 W6/32 CD26 CD58Locus A CD26 CD55 β2-micro CD38 CD74

DE CD38 CD57 Locus A CD45RO CD81CD1 CD45 CD58 DR CD46CD4 CD45RO CD71 CD1 CD55CD13 CD46 CD146 CD13 CD57

Tabla 1. Marcadores que aumentan su exposición en medio Knockout-DMEM

Marcador Aumento en medioKnockout DMEM (%)

CD1 (2) 3,92CD11a 4,54CD26 6,00CD31 2,92CD36 2,77CD84 2,46

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AAbad Molina C, 37, 38, 93, 101, 102Abadía-Molina AC, 91Abadía-Molina F, 91Abd El Fatah Khalil S, 97Abós Gracia B, 34, 35Acebes Huerta A, 118Acevedo Calado MJ, 114Acosta Arbelo F, 79Acosta YY, 21Admon A, 18, 75Aguado E, 20, 78Aguado JM, 88Agüero J, 87Aguerrevere S, 89Aguerri Moreno M, 11, 15Aguilar Benítez JM, 53Aguilar F, 72Aguilar Reina J, 38Aguilera García I, 110, 114Aguilera I, 112, 114Aguinaga Barrilero A, 54Agustí M, 68Alba Domínguez M, 43, 63, 66Alba E, 105Alecsandru D, 85, 86Alemán M, 91, 111Alemany S, 29Alenda Asensi R, 52, 70Alenda R, 115Alfaro Alegria C, 45Alfaro C, 46Alfaro J, 60Alfaro Sánchez D, 12Alfonso Pérez M, 48, 56Algarra López de Diego I, 120I, 121Alia A, 32Alia M, 18Allende L, 77Allende LM, 42, 49, 50Aller N, 90Alloza I, 39Almagro M, 107Alonso A, 20, 78Alonso Arias R, 24, 57Alonso B, 14, 83Alonso Blanco C, 113Alonso E, 59Alonso Ortiz A, 11, 109Alperi López M, 37Álvarez Cermeño JC, 48, 72Álvarez de Mon-Soto M, 19, 31, 63, 71, 76Álvarez Doforno R, 63, 66Álvarez I, 13, 40, 66Álvarez Lafuente E, 48Álvarez Márquez AJ, 93, 114Álvarez Pérez I, 39Alvarez R, 98Álvarez Rodríguez L, 79Alvarez Vallina L, 122Alvarez-Cermeño JC, 13, 38Alvarez-Lafuente R, 39Álvarez-López MDR, 113Alvarez-López MR, 88, 95 , 101Alvarez-Rodríguez L, 87Álvarez-Vallina L, 55, 56Alvaro-Blanco J, 18Amado JA, 87Ambrós C, 96Amund Kyte J, 108Andrade R, 103Andrés Martín A, 52, 61

Angulo A, 26, 29Antigüedad A, 39Antón I, 28Antón LC, 13Aparicio P, 20Aparicio Rubio P, 52Aptsiauri N, 108, 119Aransay Bañares AM, 40Aranzamendi M, 87Arcay J, 99Areces C, 97 , 98Arias M, 113Arias-Santiago S, 47, 67, 69Arizon del Prado JM, 56Armentia Medina A, 70Arnaiz-Villena A, 93, 97, 98 Aróstegui Gorospe JI, 50, 51Arranz Sanz E, 72, 74Arriarán L, 26, 69, 74Arrieta Gutiérrez A, 93, 95Arroyo JL, 83Arroyo R, 38Arruebo M, 47Ascierto ML, 53Atencia Arruti R, 93Ausín F, 83, 106

BBadell I, 41Baena E, 18Balas A, 100, 102, 112Ballesteros Pomar M, 90Ballina García FJ, 37Balsa A, 37Baltar JM, 57Bañon-Rodríguez I, 28Barbolla L, 97, 98Bárcena J, 35Barcenilla Rodríguez H, 19, 31, 33, 71Barnea E, 18, 75Barón Sánchez J, 99Barrera L, 58, 110Barrero L, 51Barrientos A, 57Barrio Cano L, 15Barrios del Pino I, 51Barrios Y, 41Barroso N, 38Bartolome B, 70Bartolome Casado R, 16, 54Bartolomé M, 38Bastos-Amador P, 33, 36Bayés B, 111Beares Gómez I, 79, 87Bech-Serra JJ, 13Beer I, 18, 75Beltrán AE, 48Beltran Nuñez A, 56Benages A, 105Benito A, 26Benito López C, 109Benito Zamorano V, 72, 74Bergazyn G, 30Bergua J, 73Bernal G, 114Bernal M, 42, 118, 119Bernal Pulido C, 58Bernal Ramos A, 95Berruguilla Pérez E, 120, 121Blanco FJ, 55, 56Blázquez A, 54Blázquez D, 42

Bofill M, 33Boix F, 88, 98, 101, 111Bolarín Guillén JM, 113Borque L, 92Borras FE, 33Borràs Serres FE, 13, 36Borrás-Cuesta F, 47Borraz Y, 103Boscá L, 30Bosca MM, 105Bosch A, 98Boshuizen M, 76Bottazzi B, 89Bousoño García C, 66Boussiotis VA, 31Bravi E, 64Briega A, 61Brieva JA, 17, 68Broere F, 21Bruges Armas J, 40Brusco A, 42Buelta L, 30Burgos Rodríguez L, 57Busquets N, 36

CCaballero-Baños M, 121Cabañas Gutiérrez C, 31Cabellos J, 31Cabrera A, 107, 115Cabrera R, 114Cabrera T, 53, 108, 118, 119Cabria Ramos JC, 82Cacho Gutierrez JL, 98Calleja Antolín S, 90Calleja Fernández A, 90Callejas-Rubio JL, 67Calonge M, 91Calvache L, 91Calvo Alen J, 87Calvo Romero C, 74Camacho F, 53Cámara Hijón C, 65, 66Camarero Salces C, 61Cambra Conejero A, 105Campanero MR, 18Campillo JA, 88, 98, 101, 111Campillo Marquina JA, 95, 113Campos C, 25Campos E, 96Campos MDC, 22, 74, 78Canals F, 13, 40Cano S, 37Cantisán Bohórquez S, 27Cantisan S, 78Cantó E, 32Canton J, 117Carballo F, 88, 98, 101Carbone Campoverde J, 14, 58, 59, 94, 113, 116Carbone J, 25, 59, 116Cárdaba Olombrada B, 11, 15Cargnolini JJ, 75Carlos L, 15Carmona F, 33Caro Oleas JL, 114Caro P, 96Carranza D, 120Carrascal Pérez M, 39Carrasco Hidalgo AM, 96Carrasco L, 86Carrasco P, 43, 64Carrasco Sayalero Á, 70

Índice de autores


Carrasco YR, 15Carreira P, 60Carrera Rodríguez J, 109Carretero Coca J, 108Carretero J, 119Carretero R, 53, 117, 120Carretero-Iglesia L, 50Casado J, 25, 78Casado JG, 23, 73Casal Román M, 27Castañer Alabau JL, 49, 52Castañer JL, 115Castellanos E, 91Castelló A, 86Castillo Rama M, 88Castrillo A, 14Castro de las Cuevas L, 35Castro MJ, 49Castro Orgaz L, 28, 82, 110Castro Panete MJ, 88Cavanillas ML, 38Cembrero Fuciños D, 99Cénit Laguna MDC, 39Cernuda Morollón E, 23Chara Velarde L, 31, 63, 76Chean Pacheco C, 14, 52, 94Chen L, 46Chevarria Montesinos J, 63, 76Chima Galán MDC, 62, 100Christensen Pedersen E, 96Cianchetta Sívori M, 83Cillero, 117Cisneros E, 27, 104Ciudad García MT, 68Clemente Ximenis A, 44, 105Cobo Medina M, 28, 46Codina E, 76Colino Gil E, 51Collado J, 13, 40Collado Miguens JA, 39Collado Torres A, 120, 121Colobrán R, 40Colomé N, 13Comas D, 50Compte M, 55, 56Concha A, 118, 119Contesti J, 118Córdoba L, 36Corell A, 51, 91Cortegano I, 18, 32Costa Frossard L, 48Couso J, 78Cozar JM, 120Crespí Bestard C, 105Crespo J, 70Crespo M, 103Crettaz J, 26Crisci E, 35, 36, 89Cuadrado E, 26, 69, 74Cuellas C, 90Cuesta Martínez Á, 55, 56, 122Cuesta Mateos C, 48, 56Cuevas M, 115Cuevas Pérez I, 24

DDale J, 14Dávila de las Fuentes B, 62Daza Cajigal V, 95Daza V, 44de Agustin de Oro T, 108de Andrés A, 115

de Andres B, 18, 32, 35de Andrés C, 14de Andres Martin A, 49de Castro Rodríguez AI, 90de Juan Echavarri MD, 74, 95de Juan MD, 69de Julián J, 73de la Calle H, 102de la Calle-Martín O, 41, 51de la Mata García M, 110de la Morena Barrios P, 95de la Pompa JL, 20, 32de la Torre Calzada MJ, 53de La Torre Cisneros J, 110de las Heras B, 30de las Heras G, 65de las Heras V, 39de Miguel Sesmero J, 107de Pablo R, 27, 50, 104de Pablos JM, 107, 115 de Paz Cazón B, 37, 60de Pereda D, 103del Árbol O, 90 del Campo AB, 108, 119del Monte Nieto G, 20del Pozo Rodríguez N, 50, 58, 59, 94, 113, 116del Val M, 71, 72, 75, 76Delgado E, 73Delgado J, 15, 88Dema Jiménez B, 103Díaz Corte C, 57Díaz Freitas B, 47Díaz Iglesias JM, 53Díaz Martín D, 19, 31, 33, 63, 71, 76Díaz Peña R, 40Díaz-Madroñero MJ, 42, 49Diez Rivero CM, 101, 103Díez Rodríguez R, 90Dircio Delgado V, 100Doblaré E, 64Domingo E, 46, 57Domínguez Acosta AR, 90Dominguez J, 35, 36Domínguez Jiménez JL, 53Domínguez Mozo MI, 48Dominique K, 33Dotor JD, 26Drouet C, 88Dubois B, 33Dubrot Armendariz J, 45Dubrot J, 22, 45, 46Dukovska D, 18

EEchaniz Aizpuru P, 74Echaniz P, 26Echevarría D, 106Echeverria Beistegui I, 47Eguiluz C, 21Eizaguirre J, 69Elorza Maza O, 53Engel P, 78Engle A, 53Entrena A, 23, 34, 75, 92Escalera Cardenas AM, 37, 101, 102Escanlar Monteserín E, 66Escoda C, 14, 91Espejo C, 13Espigado I, 112Espino Paisán L, 102Espiño M, 38, 48, 72Esteban C, 94, 95

Esteban JI, 47Etxaniz P, 69

FFariñas MC, 106Fatela Cantillo D, 53Favier B, 88Fenutria R, 78Fernández A, 115Fernández Arcas N, 109Fernández-Arquero M, 39Fernández-Cruz E, 14, 58, 59, 85, 86, 116Fernández D, 18Fernández de Mera JJ, 64Fernández-Fresnedo G, 113Fernández Frutos B, 82Fernández Guizan A, 118Fernández-Gutierrez B, 37, 104Fernández I, 91Fernández-Luna JL, 87Fernández M, 29Fernández-Malavé E, 50, 72, 77Fernández-Mestre M, 105Fernández O, 50, 101Fernández Pereira L, 65, 66Fernández-Pugnaire MA, 47, 69Fernandez-Rey M, 30Fernández Rodríguez ML, 11Fernández Salazar L, 72, 74Fernández -Sánchez A, 24Fernández Suárez A, 53Fernandez Yañez J, 58, 59, 113, 116Ferran I, 14Ferreira A, 44, 50Ferrer Balaguer JM, 44Ferrer JM, 64Ferrer R, 64Ferrero A, 83Figueredo MÁ, 57, 102, 104Florido F, 15Florido Ortega Y, 51, 90Fontalba A, 87Fontán G, 44Fraile L, 35, 36Fraile L, 89Fresno M, 28Frias Casas M, 28, 56, 82Fuentes Ferrer M, 37Fuentes García M, 16, 54

GGabari I, 22Gago M, 113Gallardo Posada S, 11Gallardo S, 15Gallego López A, 14, 58, 59Galvez MD, 118, 119Gambón Deza F, 106García A, 101García-Alonso AM, 95García Álvarez T, 112García Barcina M, 39García-Blesa A, 20, 78García-Calvo M, 76García Casado J, 73García Castillo G, 62García-Ceca Hernández J, 12García Cerrada M, 64García-Cózar F, 20García Frade J, 70García Irles M, 109García J, 54

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ÍNDICE DE AUTORES VOL. 29 SUPL. 1/ 2010


García Jurado G, 84García Laorden MI, 90Garcóa Leon MJ, 20, 35García Lora ÁM, 120, 121García Lozano JR, 37, 38, 101, 102García Martínez V, 92García MC, 44García Montojo M, 48García Olivares E, 12, 16, 17García Ormaechea M, 109García Ortega P, 15García Ortiz L, 62, 100García-Palomo D, 106García-Pardo A, 91García-Pérez A, 47, 69García R, 18, 75García Rodríguez MC, 50, 52García-Rodríguez S, 47, 67, 69García Ruiz JM, 90García-Sánchez E, 86García Sánchez F, 100, 102, 112García Trujillo JA, 65, 66García-Unzueta M, 87Garcillán B, 77, 94Garibay Vargas OM, 62Garrido F, 53, 120, 108, 115, 117, 118, 119Garrido López C, 120, 121Garrido P, 107, 115Garrido S, 43Garrido Torres-Puchol F, 120, 121Garrote Adrados JA, 72, 74Gaspar ML, 18, 35Gaudernak G, 108Gayoso Cabada IC, 25, 27Gayoso I, 22, 23, 73, 74, 78Geisler C, 77Gelpí C, 68Genre F, 30Gentil MA, 114Gil Herrera J, 52Gil J, 78, 96Gil Ortega M, 95Gil V, 78Gills E, 120Gómez A, 69Gómez Arbesú J, 60, 65, 66Gómez Bravo MA, 58, 110Gomez C, 65, 113Gomez de Agüero Tamargo M, 33Gomez de la Concha E, 37Gómez del Moral M, 34, 35Gómez Huertas E, 57Gómez Villamandos JC, 28, 84, 85, 92Gomez-Castro S, 99Gómez-Jiménez C, 55, 56Gómez-Lozano N, 27, 113Gomez-Prieto P, 93, 97, 98Góngora R, 16González A, 117González-Aseguinolaza G, 26González Escribano MF, 37, 38, 58, 102, 114González Fernandez A, 47González Fernández R, 28, 56, 82, 110González González M, 16, 54González-Granado JI, 43González-Granado LI, 42, 49Gordillo Gutierrez I, 52González I, 22González MJ, 111González P, 83, 115Gonzalez-Paz M, 87González Porqué P, 72

González Quevedo N, 51, 90González Rodríguez A, 118González Rodríguez AP, 118González Rodríguez I, 20González Rodríguez S, 118González-Santesteban C, 41González Zapata A, 92Gordillo JJ, 73Gordillo S, 64Grados D, 61Granada M, 111Granell R, 105Granja AG, 28Grau López L, 13Guardo AC, 77Guarnizo MC, 73Guasch S, 48, 56Guaza C, 13Gueimonde Fernández M, 20Guijarro Muñoz I, 122Guirado M, 120Gurbindo D, 78, 94Gurbindo Gutierrez D, 52Gutiérrez Calvo A, 54Gutiérrez-Cuadra M, 106Gutiérrez Martín C, 37, 60, 65, 66Gutiérrez Salinas J, 62, 100Guzmán Espinosa C, 93

HHeine-Suñer D, 95Henández López C, 92Hernández DC, 86Hernández Flórez D, 85, 116Hernández Villalon A, 99Hernández-López C, 23, 34, 75Herrera P, 115Herrera Ramos E, 51, 90Herrero C, 31Herrero MJ, 96Herrrero M, 70Hervás-Stubbs S, 22, 45, 46Hidalgo Izaguirre I, 49, 52Hidalgo L, 23, 34, 75Hidalgo Lumbreras L, 92Höfferer L, 108Holgado S, 61Holmskov U, 91Hortelano S, 30Hoz MÁ, 106 Huergo Zapico L, 118

IIbarra R, 47Ibernon M, 89Iborra S, 72, 75, 77Iglesias A, 95Iglesias Alzueta J, 44Iglesias J, 43Iglesias M, 30Illa I, 109Infantes S, 18, 71, 75

JJaen García J, 96Jara P, 66Jaraquemada D, 13, 39, 40, 76Jarque D, 105Jeggo P, 45Jiménez Gámiz P, 115Jiménez M, 18, 75Jiménez P, 107, 117

Jiménez Pérez MDV, 82Jonhstone C, 71Joven B, 60Jozsi M, 89Juan Otero M, 50Juárez Rubio C, 109Julià Benique MR, 105Juliá MR, 95Jurado M, 107Jure-Kunkel M, 45, 46

KKern F, 59Kiliç SS, 50Kissenpfenning A, 33Kotsch J, 25Kremer L, 55, 56Krzyzanowska A, 29Kyewski B, 40

LLabaer J, 54Lafuente Duarte EM, 31Lafuente EM, 101Laguarda E, 105Lagunas C, 31Lahoz Navarro C, 11Lanio Amador N, 14, 44, 58, 59Lara Contreras R, 27Lara Ruiz JM, 93Lario A, 67Larrea E, 22Larrucea Bilbao S, 93las Heras Ferre B, 113Lasa I, 54Lasala F, 18Lasala F, 75Lasarte JJ, 47Lauzurica R, 111Lázaro S, 72Leal Cerro A, 62Lecanda F, 45Legaz Pérez I, 113Leno Durán E, 12, 16, 17Leon Arroyo A, 98Leon Moya V, 98, 99Lermo S, 60 , 92Lermo-Rojo S, 42, 49Ley M, 42Leyva Cobian F, 83, 106, 107Liiv I, 13Linares Dickler I, 120, 121Liz Marzan L, 47Llamas I, 120Llorca Diaz FJ, 107Llorente S, 111Longobardo MV, 67López Almaraz R, 51López-Álvarez MDR, 113López Blanco R, 42López-Botet M, 26, 29, 44López Cacho JM, 11, 15López D, 18, 71, 72, 75, 76López de Arcuate A, 26López-Fernández N, 51López-Fontal R, 30López Granados A, 56López-Hernandez R, 88, 95, 98, 101López Hoyos M, 65, 79, 87, 113López Larrea C, 23, 24, 40, 57, 118López Lera A, 43, 88López M, 111

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INMUNOLOGÍA ÍNDICE DE AUTORES


López Medrano F, 88López-Nevot M, 50, 103López-Osuna C, 78López P, 107López Peláez M, 29López R, 111, 118López Relaño J, 34, 35López-Robledillo JC, 94López Soto A, 118López Suárez P, 20, 60López-Trascasa M, 43, 88, 89López Vázquez A, 40, 57Lorena C, 35Lorente E, 18, 75Lozano F, 14, 78, 91Lozano T, 47Lucas D, 88, 98, 101Lucena JM, 37, 58, 102Lucena M, 103Luna L, 32Lund-Johansen F, 16Luque Llarena I, 93

MMaderuelo E, 83Madrazo Atutxa A, 62Magadán S, 106Magri G, 26, 29Maldonado J, 36Maleno I, 108Malissen B, 33Mancebo E, 42, 49Mancheño U, 22Mansilla MJ, 13Mantecón S, 96Mantovani A, 89Manzanares Martin B, 56, 82, 110Marchán S, 31Marcos JA, 90 Marcos M, 32Marcos MAR, 18Margolles Barros A, 20Marín A, 61, 111Marín Crespo N, 48, 61, 72Marin MJ, 87Marín Moreno MA, 53Marin N, 13, 115Marin Sánchez A, 15Marincola FM, 53Martí M, 76Martín Alonso JL, 65Martin Armentia B, 70Martín F, 46Martín Gayo E, 35Martin Gil FJ, 70Martín J, 54Martín Villa JM, 54Martin-Algarra S, 45Martín-Fernández JM, 77Martín-Valls GE, 89Martin-Villa JM, 93Martínez A, 45Martínez Abad B, 72 74Martínez Becerra MJ, 62Martínez Bilbao C, 95Martínez Bravo MJ, 114Martínez Busto E, 45, 77, 78, 94Martínez Cáceres E, 13Martínez de Saavedra MT, 42Martínez E, 109Martínez F, 18

Martínez García C, 44Martínez I, 86Martínez López JE, 109Martínez Morán IM, 62Martínez Naves E, 35Martínez Peinado P, 109Martínez VG, 14, 23, 34Martínez VG, 75Martínez-Bravo MJ, 112Martínez-Cáceres E, 15, 61, 111Martínez-Carretero MÁ, 41Martínez-Florensa M, 20, 78Martínez-Forero I, 22, 45, 46Martínez-García P, 88Martínez-Laso J, 93Martínez-Martínez L, 41Martínez-Morillo M, 61Martínez-Naves E, 34Martínez-Ojinaga Nadal E, 63Martínez-Pomar N, 44, 95Martínez-Quiles N, 93Martínez-Sánchez MV, 95Martínez-Taboada CM, 87Martínez-Taboada VM, 87Martino M, 51, 91Marugán de Miguelsanz JM, 72Maruri Machado N, 93, 95Más A, 50Maseres Javaloy P, 109Mata C, 87Matamoros Flori N, 44, 105Matamoros N, 43, 44, 64, 95Mateo ME, 51Matozan K, 108Mayayo T, 11Mazon Ramos MA, 70Mazuecos Blanca A, 112Medrano de Dios LM, 103Medrano LM, 50Medraño Fernández U, 31Melero I, 22, 45, 46Melero JA, 71Melero MJ, 43Melero Ruiz J, 64Melgar P, 32Mellado M, 15Mena I, 35Menchén M, 42, 49Mencía Á, 78Méndez R, 108, 119Mendoza JL, 103Menéndez González A, 65Menéndez P, 57Meneu JC, 88Menne S, 26Merino R, 30Merino Gracia J, 31Merino J, 30, 46, 67, 78Merino R, 30, 67, 78Merino Roncal J, 57Milà J, 121Milheiro F, 46Minguela A, 98, 101, 111Minguela Puras A, 113Minguez M, 105Miranda A, 15Miranda Sayago JM, 109Miras M, 88, 98, 101Mirete Bachiller S, 48, 61Mirete S, 115Miró C, 14, 91

Mischer S, 108Modrego J, 85, 86Modrego Ruiz J, 85Moga Naranjo E, 109Molina Hernández V, 28, 84, 85, 92Molina I, 95Molina IJ, 46, 120Mongay L, 96Monserrat Sanz J, 19, 31, 33, 63, 76Montalban X, 13Montalvillo Álvarez E, 72, 74Montejo Baranda M, 27Montes Cano MA, 38, 62Montes Fernandez MDC, 74Montes Torres L, 28, 82Montes-Casado M, 21Montoya M, 36, 89Montoya N, 35Mora F, 42Mora P, 51Morales Camino JC, 55, 56Morales Galán C, 93Morales JM, 88Morales Pérez P, 11, 88Morales-Kastresana A, 45, 46Moraru M, 27, 104Moreno A, 103Moreno C, 46Moreno de Alborán I, 18Moreno Parado C, 57Moreno Parra A, 92Moreno Villegas Z, 19, 31, 33 63, 71, 76Moreno-Pelayo MÁ, 78Moretta A, 29Morgado S, 23, 25, 73, 78Moro García MA, 24Moserrat Sanz J, 71Mozo Avellaned L, 65, 66Muixí Ponsà L, 39Muntasell A, 26, 29Muñagorri A, 69Muñoz Calleja C, 48, 56Muñoz Fernandez R, 12, 16, 17Muñoz P, 46, 59, 113, 116Muñoz Sanjuan MI, 64Muñoz-Ruiz M, 50, 94Murillo Cabezas F, 62Muro M, 88, 98, 101, 111Mussá R, 35Mussá T, 36, 89

NNaranjo Gómez M, 13, 33, 36Navarro Caspistegui J, 14, 52, 58, 59, 94, 113Navarro J, 59, 85, 116Navarro M, 93Navarro P, 47, 67, 69Navarro, 107Navas Méndez J, 79Nielsen B, 77Nieto A, 112Nieto Sáchica JC, 32Nigsch A, 108Nocito M, 51Nogal M, 86Nozal P, 43, 89Nuñez A, 101Núñez C, 50Nuñez F, 33Núñez Orozco L, 100Núñez Pardo de Vera, MC, 103

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Nuñez Roldan A, 37, 38, 58, 62, 93, 102, 110, 112, 114

OOcejo-Vinyals J, 107Ocejo-Vinyals JG, 83, 106, 107Ochoa MC, 46Ochoa MDC, 22Ojeda G, 21Olagüe C, 26Olascoaga J, 39Olazabal Olearreaga IM, 31Olcoz Goñi JL, 90Olivares Beobide N, 95Ordóñez del Valle D, 38Orfao A, 16, 54Ortega Moreno L, 19, 31, 33, 63, 71, 76Ortega Suárez F, 57Ortego-Centeno N, 67Ortiz M, 18Ortiz MA, 32Otaegui D, 39Otano Andrés I, 26

PPacheco A, 83Pacho de Lucas A, 95Padilla B, 83Padilla Castillo D, 79Palacios B, 18, 32Palacios J, 115Palazón A, 22, 45, 46Palazón García A, 45Palomino Díaz P, 62Palomino P, 15Palomo J, 113, 116Palomo P, 59Palou E, 96Panizo C, 46Parada Hermoza G, 19, 31, 33, 63, 71, 76Páramo JA, 46Paredes Y, 60Parga-Lozano C, 93, 97, 98Pascal M, 50Pascual-Salcedo D, 37, 104Pastor MC, 111Pastoriza Santos I, 47Pavón-Castillero EJ, 67Pawelec G, 23Paz Artal E, 11, 88Pedrera Mazarro M, 28, 84, 85, 92Peleteiro M, 47Pende D, 26 , 29Peña JL, 11Peña Martínez J, 28, 56, 82, 110Peñaranda P, 97, 98Pera A, 22, 25, 74Peraile Muñoz I, 82Peralbo E, 22Perdigones Borderías MN, 104Pereboev A, 47Pérez Aradas E, 60, 92Pérez Aradas V, 11, 60, 92Pérez Blas M, 54Pérez Breña P, 52Pérez Mestre VL, 117Pérez Pérez G, 93Pérez R, 40Pérez Razo JC, 62, 100Pérez Venegas JJ, 68Pérez-Aradas V, 42, 49Pérez-Cabezas B, 33, 36

Pérez-Flores I, 57Pérez-Flores V, 50, 77Pérez-Gracia JL, 45Peterson P, 13Pilares Ortega L, 79Pineda F, 70Pini E, 21Planas R, 76Planelles D, 105, 100Plascencia Alvárez N, 100Polli SM , 117Polo-Hernández E, 99Pons De Ves J, 44Portero F, 27Portolés P, 21Posada De La Paz M, 11Postigo J, 30, 67Prada A, 69Prada Iñurrategui A, 74, 93Pradas M, 41Prado Cueto C, 37, 60Prados Martin A, 12, 16, 17Praena JM, 110Prat Arrojo I, 96Prieto J, 26, 47Prieto Martín A, 19, 31, 33, 63, 71, 76Puente Gutiérrez JJ, 53Puig N, 100Pujades C, 91Pujol Borrell R, 13Pujol M, 36Pujol-Borrell R, 15, 33, 36, 40, 61, 96, 111

QQuerol Gutierrez LA, 109Quesada E, 120Quintas A, 86Quiralte J, 15

RRabasco Álvarez AM, 11Raïch Regué D, 13Rajas Naranjo O, 90Raman V, 78Ramo Tello C, 13Ramos M, 71, 72, 75, 85Ramos Vivas J, 79Ramos Y, 90Ramos-Amaya A, 17, 68Ramos-Casals M, 78Reche Gallardo PA, 103Reche PA, 101Recio Hoyas MJ, 45, 77, 94Recio MJ, 52 , 78Regueiro JR, 45, 50, 52, 77, 78, 94Reiné Gutiérrez J, 77, 94Reiné J, 78Reinoso R, 51, 91Remuzgo Martínez S, 79Revilla Y, 28, 86Rey D, 93, 97, 98Reyes Engel A, 109Reyes Martín E, 19, 33 Reyes Martín E, 71Riballo E, 45Rico MÁ, 71Rieben R, 108Riezu-Boj JI, 22, 47Riñón Martínez-Gallo M, 93, 95Risalde Moya MA, 28, 84, 85, 92Rivera Reigada ML, 99Rodríguez AI, 53, 118, 119

Rodríguez B, 30Rodríguez C, 42, 68, 113Rodríguez Carrio J, 60Rodríguez de Castro F, 90Rodríguez de La Peña , 57Rodríguez Gallego C, 51, 90Rodríguez Iglesias MJ, 62Rodríguez L, 18, 37Rodríguez Mandujano CS, 100Rodríguez Molina J, 94, 113, 116Rodríguez Pérez N, 54Rodríguez Rodero S, 118Rodríguez Sánchez B, 85Rodríguez-Bayona B, 17, 68Rodríguez-Benot A, 27Rodríguez-Cariño C, 36Rodríguez-Cebria M, 105Rodríguez-Molina J, 59Rodríguez-Sáinz C, 85, 86, 116Roifman CM, 50Roig R, 105Roig RJ, 100Rojas A, 18Rojas D, 91Rojas N, 25, 78Rojas-Colonelli N, 22, 74Rojo JM, 21Rojo P, 42Roldan Santiago E, 49, 52Roldán Santiago E, 72Romero Chala S, 65, 66Romero García I, 120I, 121Romero García Z, 46Romero Gomez M, 38Romero Palomo F, 28, 84Romero R, 111Romero-Gomez M, 103Romo N, 29, 44Roncero RG, 73Rosal-Vela A, 67Rosell J, 95Roselló S, 91Rosenbek Finkfink DF, 91Roura-Mir C, 76Roustán G, 27Rouzaut Subirá A, 45Roy Ariño G, 61Rubiales MC, 41, 68Rufián Peña S, 110Ruiz C, 18Ruiz M, 113Ruiz Magaña MJ, 55, 56Ruiz Ortiz de Arrizabaleta E, 61Ruiz Ruiz MDC, 12, 55, 56Ruiz-Cabello F, 107, 108, 115, 117, 119, 120Ruiz-Cabello Osuna F, 103, 118, 119Ruíz-Contreras J, 42, 49Ruiz-Criado J, 113Ruiz-Magaña MJ, 55, 56Ruiz-Ortiz de Arrizabaleta E, 15Ruiz-Ruiz C, 55, 56, 120

SSabina P, 28, 86Sacedón Ayuso R, 92Sacedón E, 23Sacedón R, 34, 75Sádaba Argaiz MC, 72Sáenz Cuesta M, 69, 74Sáenz M, 26Saenz-López P, 117, 120Saez de Guinoa Corral J, 15

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INMUNOLOGÍA ÍNDICE DE AUTORES


Sáez-Borderías A, 29Salama H, 88, 101 Saldivia MA, 55, 56Salgado G, 88, 98,101, 111Salgado-Cecilia MG, 95Salinas JA, 44, 95Salvador Corres I, 15Salvador I, 61San José B, 63San Juan Garrido R, 88San Miguel A, 70Sanal O, 50, 77Sánchez A, 111Sánchez Atrio A, 63, 76Sánchez B, 78Sánchez C, 107Sánchez Castañón M, 65, 113Sánchez Cordón PJ, 28, 84, 85, 92Sánchez Correa B, 73Sánchez Costilla D, 117Sánchez EG, 28Sánchez Espinel C, 106Sánchez Gordo FDP, 96Sánchez Ibarrola A, 57Sánchez J, 101Sánchez K, 105Sánchez Luengo MA, 19, 31, 33, 71Sánchez Madrid F, 31Sánchez Salazar M, 90Sánchez Sánchez B, 93Sánchez-Archidona AR, 18, 32Sánchez-Corral P, 89Sánchez-Correa B, 23, 25, 73, 74Sánchez-Fructuoso ASánchez-Ibarrola A, 46Sánchez-Luna M, 83Sánchez Luengo MA, 19Sánchez-Martín D, 55, 56Sánchez-Ramón S, 14, 83Sánchez-Velasco, 106, 106Sánchez-Velasco P, 83Sancho J, 47, 67, 69Sancho-López J, 67Sangro B, 45Sanromán S, 42Santa Cruz Llata C, 79, 87Santiago JL, 57, 102Santiago Quintana E, 51Santiuste I, 30Santos E, 72Santos Luna F, 27Santos Medina E, 95Sanz Alcober L, 122Sanz GF, 100Sanz L, 55, 56Sarmiento E, 59, 116Sarmiento Marchese E, 14, 25, 58, 59, 94, 113, 116Sarobe P, 47Sarria Oses J, 63Sayagües JM, 16, 54Schamel WW, 50Sempere Ortells JM, 109Serra-Pagès C, 91Serrano A, 60, 92Serrano del Castillo C, 62Serrano Hernandez A, 11Serrano N, 18, 32Serrano Pertierra E, 23Sevilla M, 92Sevilla Sánchez M, 11, 60

Sevillano MD, 99Silva Carreras F, 52Silva Carreras FG, 70Silva Carreras G, 49Silva L, 47Simon-Grifé M, 89Sintes J, 78Smith G, 76Solana E, 22Solana Lara R, 25, 27Solana R, 23, 73, 74, 78Solano Jaurrieta JJ, 24Soldevilla G, 78Solé Violán J, 90Soler P, 41, 43Sologuren Marrero I, 51, 90Solves P, 100Soria Castro I, 29Soriano Díaz S, 113Soto Candia D, 100Sousa Martín JM, 110Spycher M, 108Srivastava G, 120Stark Aroeira L, 77Stauch D, 25Stephens C, 103Suárez Álvarez B, 57Suárez Díaz A, 37, 60Suárez García FM, 24Suarez N, 45Suárez-Álvarez B, 24Subiza J, 117

TTakada H, 50Talayero P, 42, 49Talise Astier M, 11, 60, 92Tallón I, 112Tarazona E, 22Tarazona R, 25, 73, 74, 78Teijeira A, 45Teijeiro R, 14, 116Tejedor Vaquero R, 118Tejera Alhambra M, 14Tena X, 61Teniente Serra A, 15, 61, 96Toboso de Lamo I, 83, 115Toribio García ML, 20, 35Toro Llamas S, 69 , 114Torre-Cisneros J, 27Torrelo A, 94Torres B, 101Torres Collado MJ, 42Torres Lanzas J, 95Torres LM, 117Torres Rusillo S, 46Torres S, 95Tosca J, 105Tramón Gutierrez P, 62Traves PG, 30Trento A, 71Trujillo JA, 43

UUlzurrun E, 103Unciti Broceta JD, 46Urbano-Ispizúa Á, 112Urcelay E, 38Urreta I, 69Usero Redrejo L, 76

VValencia J, 23, 34, 75Valencia Mahón J, 92Valentino S, 89Valero F, 107Valero Hervás DM, 11, 60, 88Vall O, 50Vallejo Diez S, 72, 74Vallespinós M, 18Valor L, 85, 116Van Eden W, 21Vandenbroeck K, 39Vaquero M, 27Vaquero Mejia IC, 107Varade López J, 37Varas A, 23, 34, 75Varas Fajardo A, 92Vargas Camaño ME, 62, 100Vargas Pérez ML, 64Vazquez Miralles JM, 70Vázquez MN, 23, 75Vázquez-Echeverría C, 91Vega Bogado AK, 46Vega K, 95Vicario JL, 100Vicario Moreno JL, 102, 112Vicente Á, 23, 34, 75Vicente López A, 92Vidal Castiñeira JR, 40Vidal S, 32Vilches C, 18, 27, 104Vilches M, 112Vilches Ruiz C, 38, 113Vilella R, 121Villalba Díaz MT, 35Villar Guimerans LC, 48Villar Guimerans LM, 72Villar L, 13, 115Villar LM, 38, 83Villar S, 83Villegas N, 83Vives-Pi M, 76Vocanson M, 33

WWang E, 53Ward S, 119Woodbine L, 45

XXufré C, 76

YYagüe J, 50Yélamos J, 20, 91

ZZabaleta A, 47Zafra MP, 21Zamora C, 32Zamora E, 83Zapata A, 23, 34, 75 Zapata González A, 12Zapata JM, 48 56Zaragoza Saavedra JJM, 62, 100Zichenko S, 119Zimman H, 117Zubiaur M, 47, 67, 69Zumaquero E, 47, 67, 69

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