INMUNOTERAPIA : VACUNAS ANTITUMORALES

BASADAS EN CÉLULAS DENDRÍTICAS (DCs)

INTRODUCCIÓN

• Inmunoterapia y vacunas antitumorales

• Células Dendríticas (DCs)

• PROYECTO

INMUNOTERAPIA

• Es un tratamiento el cual intenta estimular

el S.I. a cualquier persona o paciente.

VACUNAS

• VACUNAS son procedimientos efectivos que se basan en generar y expandir poblaciones de linfocitos (T y B) contra un antígeno e inducir memoria a largo plazo.

• Preventiva/Terapéutica.

INMUNOTERAPIA

• Para aplicar este tipo de tratamiento necesitamos un antígeno.

• En tumores, estos son Antígenos Asociados a Tumor (AATs)

• AATs tienen expresión aumentada o disminuida de algunas proteínas normales, reprimidas o alteradas

• En menor frec. estos AATs derivan de prot. mutadas

TIPOS DE VACUNAS ANTITUMORALES

• PASIVA introduce anticuerpos contra estos AATs

• ACTIVA se introducen los AATs de diferentes formas

ACTIVA

• 1- Proteínas o péptidos solubles

• 2- Virus recombinantes o bacterias como vectores de portadoes de AATs.

• 3- Inyección de DNA desnudo o acomplejado con liposomas catiónicos (que codifican para AATs)

• 4- Células tumorales modificadas genéticamente para poder expresar moléculas coestimuladoras y/o citoquinas

• 5- DCs son CPA cargadas con AATs o transducidas con genes específicos de tumor

INMUNOTERAPIA VENTAJAS INCONVENIENTES

• Específica (va a céls tumorales )

• Muy destructiva • Pacientes sin recaídas

• Tratamiento complementario • No todos los tumores tienen

AATs• Substancias inmunosupreso-

ras • Ausencia de diferentes moléc

de membrana, como de adhesión, coestimuladoras, HLA,

CÉLULAS DENDRÍTICAS (DCs)

• DCs fueron descubiertas en 1868 en la epidermis

• En 1973 se identificaron en otros tejidos (se han identificado en todos los tejidos excepto en testículo y cerebro)

• Forman parte del sistema linfohematopoyético y su función era de centinela y iniciador de la respuesta inmunológica

OBTENCIÓN DE DCs

• 1. Sangre Periférica y en Tejidos (0.1-1%)• Se pueden diferenciar de SP a partir de

MONOCITOS

• 2.Células Progenitoras Hematopoyéticas• Médula Osea• Cordón Umbilical

BIOLOGIA DE LAS DCs

1. Céls progenitoras

2.Precursores de sangre

3. DCs inmaduras

4. DCs maduras

Estados Maduración

FUNCIONES DE DCs

• (Depende del estado de maduración)

• 1. CAPTURAR ANTÍGENOS (en tejido) y PROCESARLO

• 2. PRESENTAR EFICIENTEMENTE A LOS LINFOCITOS (estos antígenos en órganos linfoides secundarios) y INICIAR LA EXPANSIÓN Y MADURACIÓN DE LOS LINFOCITOS

DCs

Linfocitos

Células con igual antígeno

Presentación del antígeno

Proliferación de linfocitos

Transducción

”buffy-coat”

CA(monocitos)CnA(linfocitos)

DCimmaduras

DCmadurasLinfocitos

CMNs

Purificación con gradiente de densidad

Purificación por el método de adhesión al plástico

Congelación

Descongelac

+ IL-2

IL-4 + GM-CSF

Transducción Ad- GFP/GAL TNF- +

GM-CSF

Linfocitos sin pre-est.(0)Linfocitos pre-est. GFPlinfocitos pre-est. GAL

Linfocitos DCs transducidas HeLas-

HeLas sin transducirHeLas transducidas con GFPHeLas transducidas con GAL

Ensayo de proliferación con timidina tritiada

Los linfocitos pre-estimulados con un antígeno (GFP o GAL) se activan y PROLIFERAN al reconocer a este antígeno al cual esta pre-estimulado

Transducción

Ad-GFP/GAL

“Buffy-coat”

CMNs

CnA(linfocitos) CA (monocitos)

Purificación por método de gradiente de densidad

Purificación por método deadhesión al plástico

R6

Proporción de CD14 positivo

Resultados

(%)

CMNs

Céls no

adherentes

Céls

adherentes

Marcador de

CD45 89.22 80.48 97.39 Todos los leucocitos

CD14 32.00 22.03 64.28

Monocitos (alta intensidad) y

granulocitos (baja intensidad)

CD1a 0.12 0.02 0.02 DCs immaduras

CD83 0.08 0.02 0.04 DCs maduras

CD4 16.86 14.38 6.88 Linfocitos Thelper

CD8 19.39 9.30 4.67 Linfocitos Tcitotóxicos , NK y B

Monos 11.64

6.80 52.94 Intersección entre CD14 + y el

gate por tamaño de la población

de monocitos

Porcentaje de células positivas para marcadores celulares

CA (Monocitos)

DCs inmaduras

DCs maduras

IL-4 + GM-CSF

Transducción

TNF- + GM-CSF

CD14 CD1a CD83 CD8

Céls no transducidas

Céls transducidas con

Ad-GFP

Céls transducidas con

Ad-Gal

7.65

6.76

5.47

18.67

15.87

12.08

3.93

5.33

6.20

4.25

3.51

5.53

Porcentaje de células positivas para marcadores celulares

R2 R2

R3

Transducción con Ad-, Ad-GFP y Ad-GAL

DCs

HeLas

2.91% 17.34% 3.16%

2.96% 79.99% 88.17%

Linfocitos sin pre-est.(0)Linfocitos pre-est. GFPlinfocitos pre-est. GAL

Linfocitos DCs transducidas HeLas-

HeLas sin transducirHeLas transducidas con GFPHeLas transducidas con GAL

Ensayo de proliferación

Transducción

Ad-GFP/GAL

Objectivos de la proliferación

1. Observar que a mayor nº estimuladoras mayor proliferación.

Ratios (proporción de respondedoras:estimuladoras) cuando aumenta la ratio disminuye el nº de HeLas, el nº de linfocitoses siempre constante

2. Observar que cuando enfrentamos respondedoras (linfocitos) con estimuladoras (HeLas) de la misma expresión (GFP-GFP y GAL-GAL) tendríamos que observar mayor proliferación de estos linfocitos

0,00

2000,00

4000,00

6000,00

8000,00

10000,00

12000,00

14000,00

16000,00

18000,00

2,5:1 5:01 10:01 20:01 40:01 80:1

RATIOS Respondedoras:Estimuladoras

CP

M HeLa0Linfocitos 0

HeLa0LinfocitosGFPHeLa0LinfocitosbGAL 0,00

2000,00

4000,00

6000,00

8000,00

10000,00

12000,00

14000,00

16000,00

18000,00

RATIOS Respondedoras:Estimuladoras

CP

M

HelaGFP Linfocitos 0

HelaGFP Linfocitos GFP

HelaGFP LinfocitosbGAL

0,00

2000,00

4000,00

6000,00

8000,00

10000,00

12000,00

14000,00

16000,00

18000,00

RATIOS Respondedoras:Estimuladoras

CP

M

HeLAbGAL Linfocitos0

HeLAbGAL LinfocitosGFP

HeLAbGAL LinfocitosbGAL

0,00

2000,00

4000,00

6000,00

8000,00

10000,00

12000,00

14000,00

16000,00

18000,00

Linfos 0 Linfos GFP

Control +(PHA)

Control -(Medio)

HeLas sin transducir HeLas transducidas con GFP

HeLas transducidas con GAL Control negativo/positivo

HeLas sin trasducir

Linfocitos sinpre-estimular

Linfocitos pre-esti-mulados GFP

Linfocitos pre-esti-mulados GAL

0,00

1000,00

2000,00

3000,00

4000,00

5000,00

6000,00

7000,00

8000,00

Proprocion Respondedoras:Estimuladoras

CP

M

HeLa0 Linfocitos 0

HeLa0 Linfocitos GFP

HeLa0 Linfocitos bGAL

HeLas transducidas con GFP

Linfocitos sinpre-estimular

Linfocitos pre-estimulados con GFP

Linfocitos pre-estimulados con GAL

0,00

1000,00

2000,00

3000,00

4000,00

5000,00

6000,00

7000,00

8000,00

Proporcion Respondedoras:EStimuladoras

CP

M

HelaGFP Linfocitos 0

HelaGFP Linfocitos GFP

HelaGFP LinfocitosbGAL

HeLas transducidas con GAL

Linfocitos sin pre-estimularLinfocitos pre-estimulados con GFP

Linfocitos pre-estimulados con GAL

0,00

1000,00

2000,00

3000,00

4000,00

5000,00

6000,00

7000,00

8000,00

Proporcion Respondedoras: Estimuladoras

CP

M

HeLAbGAL Linfocitos0

HeLAbGAL LinfocitosGFP

HeLAbGAL LinfocitosbGAL

CONCLUSIONES (1)

• 1. Intentar ajustar el método de transducción de DCs para obtener mayor nº de células transducidas.

• 2. Repetir el experimento de proliferación para ver si los datos son reproducibles.

CONCLUSIONES (2)

• 3. En el control negativo observamos proliferación. Esto nos sugiere que estos linfocitos estan pre-estimulados contra antígenos de SBF (suero bovino fetal).

CONCLUSIONES (3)

• 4. Cuanto menor nº de estimuladoras mayor proliferación nos podría indicar que estas (HeLas) estan sintetizando substancias inhibitorias. Por tanto, cuanto mayor nº de HeLas más concentración de estas substancias y menor

proliferación. Para comprobar esta hipotesis podríamos coger SN del cultivo de HeLas y poner diferentes concentraciones y hacer crecer los linfocitos.

CONCLUSIONES (4)

• 5. Las HeLas por si solas tendrían que producir una reacción alogénica. Para evitar esto se podrían guardar células del donante y utilizarlas como céls estimuladoras.

• 6. Para evitar la problématica de si la reacción ha sido contra adenovirus o contra gen podríamos transducir las células estimuladoras con otro vector (retrovirus, electroporación,...)