INSTITUTO MEXICANO DEL PETRÓLEO

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA

DE BIOTECNOLOGÍA

PROYECTO DE INVESTIGACION CLAVE CGPI: 20051204

CARACTERIZACIÓN DE BACTERIAS ANAEROBIAS

AISLADAS DE GASODUCTOS

M. EN C. GLORIA LOPEZ JIMÉNEZ DR. LUIS FERNÁNDEZ LINARES DRA. SILVIE LE BORGNE

Pág 1. INTRODUCCION................................................................................. 1

1.1 Metabolismo energético microbiano.......................................... 1 1.1.1 Captación de energía............................................................ 1 1.1.2 Nutrición microbiana.............................................................. 2

1.2 Crecimiento bacteriano............................................................... 3 1.2.1 Medida del crecimiento de poblaciones bacterianas............. 3 1.2.2 Método Indirecto.................................................................... 3

1.2.3 Cultivo en sistemas cerrados................................................ 4 1.2.4 Curva de crecimiento............................................................ 4

1.3 Factores ambientales.................................................................. 5 1.3.1 Efecto de los agentes físicos................................................. 5

1.4 Relación de las bacterias con el oxígeno.................................. 6 1.4.1 Bacterias aerobias................................................................. 6 1.4.2 Bacterias anaerobias............................................................. 7

2. ANTECEDENTES................................................................................ 8 3. JUSTIFICACIÓN.................................................................................. 9 4. HIPÓTESIS.......................................................................................... 9 5. OBJETIVOS......................................................................................... 9

5.1 General y específicos.................................................................... 9 6. METODOLOGÍA.................................................................................. 10

6.1 Condiciones de crecimiento 10 6.2 Caracterización fisiológica 12

6.2.1 Fuente de Carbono............................................................... 12 6.2.2 Temperatura óptima.............................................................. 12 6.2.3 Concentración óptima de sales (NaCl)................................. 13 6.2.4 pH óptimo.............................................................................. 13 6.2.5 Aceptor de electrones........................................................... 14

7. RESULTADOS.................................................................................... 16 8. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN.................................................................... 24 9. CONCLUSIONES PREVIAS............................................................... 27 10. METAS................................................................................................. 28 11. BIBLIOGRAFÍA................................................................................... 29

CARACTERIZACION DE BACTERIAS ANAEROBIAS AISLADAS DE GASODUCTOS

1. INTRODUCCIÓN

1.1 Metabolismo energético microbiano

El metabolismo de las bacterias es el conjunto de las reacciones bioquímicas que permiten su

crecimiento y es muy importante por que con este sabemos que tipo de energía utilizan para

degradar un sustrato.

Las bacterias requieren aporte continuo y de acceso inmediato de energía, que es usada en

procesos de: biosíntesis (anabolismo), transporte activo, translocación de proteínas a través de

la membrana citoplásmica, movimiento flagelar, bioluminiscencia.

En bacterias, al igual que en eucariotas, la conservación intracelular de energía ocurre

principalmente por medio de la síntesis de ATP:

ADP3- + H+ + PO4H2- --------> ATP4- + H2O

1.1.1 Captación de energía

En general, las bacterias para obtener su energía (principalmente ATP), la captan de alguna

fuente externa; las bacterias fotótrofas la obtienen si su energía procede de radiaciones y las

bacterias quimiótrofas si su energía se desprende a partir de moléculas químicas en reacciones

biológicas de oxido reducción.[10]

Cuadro I. Tipos de energía que captan las bacterias y su correspondiente metabolismo

energético.

FUENTE DE ENERGIA FUENTE DE CARBONO CAPTACIÓN DE ENERGÍA

Quimiorganotrofos Química a partir de sustancias orgánicas Quimiotrofos

Quimiolitotrofos Química a partir de sustancias inorgánicas

Fotoorganotrofos Lumínica con requerimiento de sustancias orgánicas Fototrofos

Fotolitotrofos Lumínica en presencia de sustancias inorgánicas

El conocimiento de la fisiología y del metabolismo microbiano tiene algunas aplicaciones

prácticas:

- Permite conocer el modo de vida y el hábitat de diferentes especies microbianas:

Aspectos físicos y químicos (temperatura, fuente de carbono, concentración de O2, pH,

presión osmótica, etc.) en los cuales pueden crecer y multiplicarse, de acuerdo a sus

requerimientos nutricionales.

- Permite formular medios de cultivo para su aislamiento e identificación.

- Desde el punto de vista terapéutico nos permite conocer y entender el modo de acción

de algunos antimicrobianos que bloquean una vía metabólica o la síntesis de alguna

macromolécula esencial para la bacteria.[10]

1.1.2 Nutrición microbiana

La nutrición es el proceso por el que los seres vivos toman del medio donde habitan las

sustancias químicas que necesitan para crecer. Dichas sustancias se denominan nutrientes, y

se requieren para dos objetivos:

Fines energéticos (reacciones de mantenimiento);

Fines biosintéticos (reacciones plásticas o anabolismo).

Todas las bacterias necesitan captar una serie de elementos químicos, que se pueden clasificar

(según las cantidades en que son requeridos) como:

Macronutrientes (C, H, O, N, P, S, K, Mg), y

Micronutrientes o elementos traza (Co, Cu, Zn, Mo...)

Podemos clasificar los nutrientes en las siguientes categorías:

Universales (es decir, aquellos que son requeridos por todos los procariotas): agua,

CO2, fosfatos, sales minerales y otros (oligoelementos);

Particulares (nitrógeno, azufre);

Factores de crecimiento (moléculas orgánicas especificas: coenzimas, vitaminas, etc).

1.2 Crecimiento bacteriano Se define como el incremento ordenado de todos los elementos componentes de un sistema

biológico, lo cual implica un aumento de la masa celular que eventualmente conduce a la

multiplicación celular. En organismos pluricelulares dicha multiplicación se traduce en un

aumento del tamaño del individuo, mientras que en unicelulares que se dividen por fisión o por

gemación, lo que ocurre es un aumento de la población.

El estudio del crecimiento a nivel de poblaciones incluye los siguientes tópicos:

1.2.1 Medida del crecimiento de poblaciones bacterianas

En la práctica habitual del laboratorio, los experimentos se realizan con poblaciones bacterianas

y el crecimiento de una población o cultivo bacterianos se puede expresar en función de:

aumento de masa del cultivo

aumento del número de células

1.2.2 Método Indirecto

Turbidimétrico (óptico). Son muy usados en la práctica cotidiana del laboratorio. La base

común de estos métodos consiste en la medición de la cantidad de luz dispersada o transmitida

a través de un cultivo bacteriano.

Recordemos aquí que las suspensiones bacterianas dispersan la luz, al igual que cualquier

partícula pequeña suspendida en agua (efecto Tyndall). La dispersión de la luz es, dentro de

ciertos límites, proporcional a la masa del cultivo.

Cinética del crecimiento;

Factores que afectan al tiempo de generación (g);

Factores ambientales que limitan el crecimiento.

a) Espectrofotómetro: Este aparato es de uso habitual en cualquier laboratorio

de Microbiología o Bioquímica. Mide la densidad óptica (D.O.), es decir la

absorbancia (una medida de la luz transmitida a través de la suspensión).

Por supuesto, hay que realizar una curva estándar para relacionar los valores de

A con la masa bacteriana en una muestra problema.

1.2.3 Cultivo en sistemas cerrados

En los sistemas cerrados (pueden ser líquidos o sólidos), no existe aporte continuo de nutrientes, ni drenaje de células ni de sustancias de desecho.

En estos sistemas la fase exponencial de crecimiento balanceado no restringido dura sólo unas cuantas generaciones, debido al agotamiento de nutrientes y/o a la acumulación de desechos.

1.2.4 Curva de crecimiento

Fig. 1.- Grafica de las etapas principales en una curva de crecimiento

a. Fase de latencia: Las bacterias transferidas de un cultivo en fase estacionaria a un medio

fresco, sufren un cambio en su composición química antes de ser capaces de iniciar la

multiplicación. Hay un marcado aumento de los componentes macromoleculares y de la

actividad metabólica, casi sin división celular, asociado a un incremento de la susceptibilidad a

los agentes físicos y químicos. Como vemos, la mal llamada fase de latencia implica intensa

actividad metabólica.

b. Fase exponencial: Las células se dividen a una velocidad constante determinada por la

naturaleza intrínseca de la bacteria y por las condiciones del medio. Existe un marcado

aumento del número total de células viables, que puede ser expresado en forma exponencial.

Próximo al final de esta fase, ocurre la liberación de exotoxinas por algunas de las bacterias

que las producen.

c. Fase estacionaria: Eventualmente el agotamiento de los nutrientes o la acumulación de

productos tóxicos determina el cese del crecimiento. Hay una pérdida de células por muerte,

que es balanceada por la formación de nuevas células. Cuando esto ocurre, el conteo total de

células se incrementa levemente, aunque el conteo de bacterias viables permanece constante.

Sobre el final de esta etapa puede ocurrir la esporulación en aquellas bacterias que poseen

este mecanismo de resistencia.

d. Fase de muerte: Luego de la fase estacionaria, la tasa de muerte se incrementa, el número

de

bacterias viables disminuye rápidamente, por lo que la curva declina en forma franca.

1.3 Factores ambientales

1.3.1 Efecto de los factores físicos

Los factores ambientales, es decir, una serie de agentes físicos y químicos:

1) modifican la velocidad de crecimiento, provocando cambios que, a determinados valores de dichos factores pueden llegar a ocasionar la muerte de microorganismos;

2) condicionan la distribución de los microorganismos en sus ecosistemas y hábitat naturales;

3) permiten a los humanos controlar el crecimiento microbiano, por medio de la fijación de parámetros para:

a) la mutagénesis,

b) la esterilización y desinfección,

c) la quimioterapia.

No todos los microorganismos toleran del mismo modo un determinado factor ambiental.

Así, unas determinadas condiciones pueden ser nocivas para una especie bacteriana, y en

cambio ser neutras o beneficiosas para otra.

Antes de abordar el estudio de distintos agentes ambientales, conviene distinguir entre

los efectos que un determinado agente puede tener sobre la viabilidad y los efectos que pueden

simplemente afectar al crecimiento, a la capacidad de diferenciación (si la hubiera) o de

reproducción.

Los principales tipos de factores a considerar se pueden desglosar de la siguiente manera:

Cuadro II. Agentes físicos a considerar en el crecimiento microbiano

1.4 Relación de las bacterias con el oxígeno

Dependen en buena medida de la disponibilidad de las enzimas eliminadoras de peróxidos y superóxidos. Veamos los tipos de bacterias según sus relaciones con el oxígeno:

1.4.1 Bacterias aerobias:

Necesitan O2 para crecer, ya que lo usan (al menos en algunas ocasiones) como aceptor final de electrones para la captación de energía química.

Algunos aerobios requieren para crecer tensiones de oxígeno inferiores a la atmosférica (del 2 al 10% de O2, en lugar del 20%). A estas bacterias se las califica como microaerófilas:

• Algunas microaerófilas lo son permanentemente (microaerófilas estrictas).

AGENTES FÍSICOS

Temperatura

Desecación

Radiaciones

Ondas sonoras

Presión hidrostática

Presión osmótica pH

• Otras se comportan como microaerófilas sólo cuando crecen usando determinadas

fuentes de energía química o de nitrógeno (microaerófilas condicionales).

1.4.2 Bacterias anaerobias: Se sabe que las bacterias anaerobias son organismos que pueden vivir en ausencia de oxígeno

en su actividad biológica, debido a que pueden utilizar aceptores de electrones distintos al

oxigeno o por que su obtención de energía la realizan mediante metabolismo fermentativo.

Se pueden distinguir tres grupos dentro de ellas:

• Bacterias anaerobias facultativas: Pueden vivir en ambientes con oxígeno o sin él,

dependiendo del ambiente y la disponibilidad de aceptores finales de electrones;

• Bacterias anaerobias aerotolerantes: Presentan un metabolismo energético anaerobio,

pero soportan el oxígeno debido a que poseen enzimas detoxificadores, y

• Bacterias anaerobias estrictas: sólo pueden sobrevivir en ambientes carentes de

oxígeno, ya que el oxígeno les resulta tóxico.

Ciertos microorganismos anaerobios en ausencia de oxígeno y, en presencia de materia

orgánica, pueden contribuir a la descomposición en ambientes extremos, como los oleoductos.

Las bacterias desnitrificantes, reductoras de sulfatos y productoras de metano (metanogénicas),

utilizan nitratos, sulfatos y dióxido de carbono, respectivamente, para generar energía, de forma

muy parecida al uso del oxígeno que hacen los microorganismos aerobios. Otros anaerobios

(bacterias de la fermentación) generan energía transformando compuestos orgánicos.

2. ANTECEDENTES

En la década pasada se encontraron en ambientes subterráneos, marítimos, chimeneas

hidrotérmicas y pozos petroleros poblaciones de bacterias anaerobias fermentativas, reductoras

de tiosulfato, mesofílicas o termofÍlicas.

Se conocen yacimientos petrolíferos en donde existen comunidades microbianas anaerobias

muy importantes. Varios autores han informado el aislamiento (estudio microbiológico) y

presencia (estudios ecológicos moleculares) de microaerofílicos en tales ecosistemas. [7]

Estas comunidades que habitan en los yacimientos de petróleo reducen Mn, Fe, S, Sulfato,

Anhídrido carbónico y nitrato. La mayoría de los estudios se han enfocado a microorganismos

metanogénicos, sulfato-reductores y heterótrofos; ahora se ha prestado atención a otras

comunidades microbianas (como fermentadoras) que se originan en este ecosistema. [6]

Las bacterias sulfato reductoras son habitantes comúnes del medioambiente petrolero y

penetran en los yacimientos de petróleo junto con el agua por inyección, contaminándolos. Por

sus actividades (la producción del sulfuro, oxidación de hidrógeno) son responsables de

problemas serios y costosos de corrosión en oleoductos; esto, se controla a menudo in situ con

el uso de biocidas como el cloro, bromo, aldehídos y aminas. [7]

3. JUSTIFICACIÓN

La comunidad microbiana que tiene capacidad de colonizar superficies metálicas ha

cobrado importancia por su capacidad de producir corrosión, actualmente se han aislado

consorcios microbianos que sobreviven en ambientes extremos en los cuales se han

caracterizado microorganismos anaerobios fermentativos y sulfatoreductores principalmente. La

caracterización de los microorganismos ha permitido determinar nuevos géneros y también

nuevas especies; En el IMP se obtuvieron cepas de microorganismos aisladas de los

gasoductos de la línea Atasta – Cd. PEMEX, que no se han caracterizado fisiológicamente, por

lo que se ha planteado el presente estudio para determinar el género y especie a las que

pertenecen y de esta forma adquirir mayor conocimiento de la flora microbiana que sobrevive en

estos ambientes.

4. HIPÓTESIS

Se obtendrá el género y especie de las bacterias que forman el consorcio de microorganismos

aislados de los gasoductos de la línea Atasta Cd. PEMEX y de la Estación 1.

OBJETIVOS

General:

Realizar la caracterización fisiológica de bacterias anaerobias aisladas de gasoductos.

Específicos:

Determinar la fuente de carbono óptima para el desarrollo de los microorganismos.

Determinar las condiciones óptimas de crecimiento de los microorganismos:

temperatura, pH, concentración de cloruro de sodio.

Determinar la capacidad de degradar otras fuentes de carbono no convencionales:

hidrocarburos y fenoles.

Determinar que aceptores finales de electrones utilizan.

Identificar por secuenciación del gen 16S del ARNr.

5. METODOLOGÍA

La cepas a caracterizar se identifican como: Cuadro III. Código para Identificación de las cepas

CODIGO GENERO C3S Sedimentibacter C3V Vibrio C3B Bacilo

6.1 Condiciones de crecimiento

Se utiliza Medio Base Mineral (MBM) que contiene por cada litro: Cuadro IV. Componentes del MBM.

REACTIVO g / L NH4Cl 1.0

K2HPO4 0.3 KH2PO4 0.3

MgCl2,. 6H2O 0.2 CaCl2.2H2O 0.1

KCl 0.1 Resarsurina al 0.1% 1.0 ml Extracto de levadura 2.0

NaCl 1.0

Para la preparación de 1 L de MBM se añaden los componentes en estricto orden en un

matraz Erlenmeyer con agua destilada, se ajusta el pH a 7.0 con KOH o HCl 1M.

El medio se transfiere a frascos serológicos sin retirar el flujo de N2, se colocan tapones

de hule y se sellan con arillos de aluminio, posteriormente se esterilizan en una autoclave a

121°C durante 20 min.

Fig. 2.- Frascos serológicos con las cepas a identificar

La pureza de cada cepa se realizó por la técnica de HUngate. Se prepara MBM-agar con

las mismas condiciones anteriormente descritas; si están solidificados se funden hasta tener un

a temperatura constante de 50°C. Se inocula el tubo no. 1 y se realizan n número de diluciones

para cada cepa. Se ruedan hasta que solidifiquen, se incuban a 30°C y se revisan cada 24 h

para verificar que crezca 1 sola colonia. [4]

6.2 Caracterización fisiológica

6.2.1 Fuente de Carbono. Se preparan tubos con MBM en condiciones anaerobias y ya

esterilizados, se agregan diferentes fuentes de carbono (Ver cuadro V) a una

concentración final de (20mM) [9], excepto para compuestos aromáticos que se maneja

de 0.5 g/l [10]; Esto se realiza por duplicado. Se incuban a 30°C y posteriormente se lee

densidad óptica a 580nm cada 12 h

Cuadro VI. Fuentes de Carbono utilizadas para la cepa aislada

FUENTES DE CARBONO

Glucosa Fumarato Ramnosa Ac. Cumarico Piruvato Manosa Ribosa Ac. Hidroximetoxicinamico

Galactosa Arabinosa Rafinosa Fenol Sacarosa Malato Formiato Fructosa Gluconato Propionato Lactato Manitol Acetato

6.2.2 Temperatura óptima. Se tienen los tubos con MBM mas la concentración (x

mg/l) de la fuente de carbono, se incuban a diferentes temperaturas (Ver cuadro

VI), se realiza por duplicado y posteriormente se lee densidad óptica a 580nm

cada 12 h

Cuadro VII. Diferentes temperaturas a utilizar

TEMPERATURA (°C) 20 22 30 35 45 70

6.2.3 Concentración óptima de sales (NaCl). Se preparan tubos con MBM más la

fuente de carbono óptima; se realiza de nuevo por duplicado a diferentes

concentraciones de NaCl (%p/v) (Ver cuadro VII), se incuban a la temperatura que

resulte óptima y posteriormente se lee densidad óptica a 580nm cada 12 h

Cuadro VIII. Diferentes concentraciones de sales a utilizar (% p/v)

[NaCl] (% p/v) 0.5 1 2 5

10 15 20 30

6.2.4 pH óptimo. Para cuantificar este parámetro se preparan 2 litros de medio de

cultivo anaerobio (MBM) con la concentración de NaCl que resulte óptima.

Un litro se ajusta a pH de 2.0 con HCl 1M y el otro litro se ajusta a pH 7.0 con KOH 1M, se

vierten en tubos de ensayo, se etiquetán y esterilizan a 121°C durante 15 min.

Después de agregar la fuente de carbono óptima, la serie de tubos del primer medio se ajusta a

valores de pH por debajo de 7.0 (5.0, 5.2, 5.5, 6.0, 6.5, 6.9) con NaHCO3 al 2%, esto por

duplicado. Otra serie de tubos, pero ahora del segundo medio, se ajusta a valores de pH por

arriba de 6.9 (7.0, 7.2, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0) con NaHCO3 al 10%. (Ver cuadro VIII)

Después de la inoculación, el segundo tubo se toma como el pH inicial; los tubos restantes se

incuban a la temperatura que resulte óptima, posteriormente se mide el pH que será el final y

determinar la variación de pH con respecto de valor inicial.

Se incuban a la temperatura que resulte óptima y posteriormente se lee densidad óptica a

580nm cada 12 h

Cuadro IX. Diferentes valores de pH a utilizar.

VALORES DE pH

5.0 7.0 5.2 7.2 5.5 7.5 6.0 8.0 6.5 8.5 6.9 9.0

6.2.5 Aceptor de electrones. Se realizan tres resiembras de la cepa por duplicado,

con diferentes compuestos como aceptores de electrones (Ver cuadro IX) a una

concentración de 20mM.

Posteriormente se mide densidad óptica (crecimiento bacteriano) en un espectrofotómetro a

580 nm.

Cuadro X. Diferentes aceptores de electrones a utilizar.

ACEPTOR DE ELECTRONES Tiosulfato de sodio

Sulfato de sodio Nitrato de sodio Azufre elemental

Fierro

6. RESULTADOS Fuente de carbono optima para la cepa C3S:

Fig. 3.- Cinética fuente de carbono óptima para la cepa C3S

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Tiempo (días)

Abs

a 58

0 nm

RIB Gluconato RAF MANITOL Propionato

FRUCT FORMATO MANOSA FUMARATO GALACTOSA

AC. HMC GLUCOSA SACAROSA LACTATO ACETATO

Fuente de carbono optima para la cepa C3V: Fig. 4.- Cinética fuente de carbono óptima para la cepa C3V

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Tiempo (días)

Abs

a 58

0 nm

RIB Gluconato RAF MANITOL Propiona

FRUCT FORMATO MANOSA FUMARATO GALACT

AC. HMC GLUCOSA SACAROSA LACTATO ACETAT

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Tiempo (dias)

Abs

RIBOSA GLUCONATO RAFINOSA MANITOL

PROPIONATO ARABINOSA MALTOSA FRUCTOSA

FORMATO MANOSA FUMARATO GALACTOSA

RAMNOSA AC. CUMARICO AC. HMC GLUCOSA

SACAROSA LACTATO ACETATO

Fuente de carbono óptima para la cepa C3B:

Fig. 5.- Cinética Fuente de carbono óptima para la cepa C3B

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Tiempo (dias)

Abs

RIBOSA GLUCONATO RAFINOSA MANITOL PROPIONATO AFRUCTOSA FORMATO MANOSA FUMARATO GALACTOSA RAC. HMC GLUCOSA SACAROSA LACTATO ACETATO

CONCENTRACION ÓPTIMA DE SALES (NaCl): Se inocularon los tubos con MBM c/Tiosulfato, agregando la fuente de carbono óptima, a diferentes concentraciones de NaCl (0.5%, 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%), e incubando a la temperatura que resultó óptima; los resultados son los siguientes:

Fig. 6.- Cinética concentración óptima de Sales (NaCl) para la cepa C3S

Fig. 7.- Cinética para la cepa C3V con diferente concentración de Sales (NaCl)

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144

TIEMPO (h)

Abs

0.50%1%2%5%10%15%20%30%

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Tiempo (dias)

Abs

0.50%

1%

2%

5%

10%

15%

20%

30%

Fig. 8.- Cinética para la cepa C3B con diferente concentración de Sales (NaCl)

pH OPTIMO Se inocularon los tubos con MBM c/Tiosulfato, agregando la fuente de carbono óptima, a la concentración de NaCl óptima e incubando a la temperatura que resultó óptima; los resultados son los siguientes:

Fig. 9.- Cinética pH óptimo para la cepa C3S

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Tiempo (dias)

Abs

0.50%

1%

2%5%

10%

15%

20%30%

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Tiempo (dias)

Abs

5.04

6.12

6.56.9

7

7.2

7.5

88.5

9

Fig. 10.- Cinética pH óptimo para la cepa C3V

Fig. 11.- Cinética pH óptimo para la cepa C3B

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Tiempo (dias)

Abs

5.046.126.56.977.27.588.59

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Tiempo (dias)

Abs

5.04

6.12

6.56.9

7

7.2

7.5

88.5

9

ACEPTOR FINAL DE ELECTRONES: Se inocularon los tubos con MBM, agregando Glucosa y diferentes tipos de aceptores de electrones (Sulfato, Tiosulfato, Nitrato, Cloruro Férrico y Azufre) e incubando a 35ºC; los resultados son los siguientes:

Fig. 9.- Cinética para la cepa C3S con diferentes aceptores de electrones

Fig. 10.- Cinética para la cepa C3V con diferentes aceptores de electrones

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

1 2 3 4 5 6 7 8 9

TIEMPO (dias)

Abs

NITRATO

AZUFRE

TIOSULFATOSULFATO

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Tiempo (dias)

Abs

TiosulfatoSulfatoNitratoAzufre

`

Fig. 11.- Cinética para la cepa C3B con diferentes aceptores de electrones

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Tiempo (dias)

Abs

Tiosulfato

Sulfato

Nitrato

Azufre

7. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN

Las cepas se incubaron en un cultivo de enriquecimiento a 30ºC durante 1 semana. Se

consideró el crecimiento como positivo cuando se observó turbidez en los frascos serológicos.

Como se menciona en la metodología se utilizó la técnica de Hungate y el proceso de dilución

en los tubos el cual se realizó por duplicado, para purificar las cepas.

Hay que recordar que en muchos casos en un cultivo discontinuo las células se

modifican durante la fase exponencial, ya que hay modificaciones continuamente, desciende la

concentración del sustrato, aumenta la densidad celular y se acumulan productos metabólicos.

Debido a la relativa constancia del tiempo de generación durante la fase log, esta resulta idónea

para la determinación de la tasa de crecimiento. (Schlegel, et al, 1997). Por ello del interés por

la tasa de crecimiento en las cinéticas, ya que es una medida de la velocidad de crecimiento

celular. En los análisis de las siguientes cinéticas tomo en cuenta este parámetro.

Sabemos que C3S es un microorganismo fermentativo, por lo tanto podríamos suponer

que degradará más rápidamente los azucares y sobre todo la glucosa.

Se observa en la Fig. 3 que el mo. C3S se adapta muy bien a las fuentes de carbono

utilizadas; se observa un mejor crecimiento con Lactato, Acetato, Glucosa y Sacarosa; y no

necesita mucho tiempo para adaptarse y comenzar a alimentarse.

El microorganismo sigue la misma tendencia en cada fuente de carbono; la temperatura

para su mejor crecimiento es de 35ºC, excepto para el Acetato ya que tuvo un mejor

crecimiento a 30ºC; entonces con esto podemos suponer que el microorganismo es mesófilo los

cuales tienen una temperatura de crecimiento óptima entre 20-35ºC; con respecto a la

temperatura de 70ºC no hay mucho crecimiento.

Ahora, para C3V, se observa que no hay mucho crecimiento (ver Fig. 4); esto es debido

a que C3V es un microorganismo sulfatoreductor y el medio donde fue inoculado contiene

tiosulfato, por lo tanto es difícil que haya un buen crecimiento. Entonces a diferencia de C3S, el

microorganismo C3V primero necesita adaptarse al medio para posteriormente poder seguir su

crecimiento y/o alimentarse.

Se observó un mejor crecimiento con Glucosa, aunque con Acetato, Lactato y Sacarosa

también hay crecimiento; su mejor crecimiento ocurrió a 70ºC. Al igual que C3S llevan una

misma tendencia, solo que con Glucosa y Sacarosa es mas significativo el crecimiento como se

mencionó anteriormente. Como crece a una temperatura considerablemente alta (70ºC),

podemos decir que es un microorganismo termófilo y estar de acuerdo con ello ya que donde

habitan, las condiciones pueden resultar extremas.

Al igual que C3V, el microorganismo C3B tampoco tiene un buen crecimiento (ver Fig. 5),

de igual forma también tiene que adaptarse al medio para posteriormente alimentarse. Tiene un

crecimiento óptimo a 70ºC para Acetato, Lactato, Glucosa, y demás fuentes de carbono a

excepción de Sacarosa el cual crece a 30ºC. Para C3B la fuente de carbono en la que crece

mejor es Acetato.

Pasando a la Concentración Optima de NaCl se observa (ver Fig. 6) que para la cepa

C3S que hay un mejor crecimiento utilizando una concentración de 15% de NaCl, aunque

también hay crecimiento de forma general a 20 y 30% de NaCl, por lo que podemos decir que

se trata de un microorganismo Halófilo extremo (hiperhalófilos), el cual necesita altas

concentraciones de NaCl, que van aproximadamente desde el 15 al 30%. Con respecto al pH

óptimo se observa (ver Fig. 9) que crece con un pH de 6.9, por lo que podemos considerarlo

como un microorganismo neutrófilo.

Ahora para la cepa C3V se observa (ver Fig. 7) que hay un mejor crecimiento utilizando

una concentración del 2% de NaCl, aunque también hay crecimiento de forma significativa al

utilizar 2 y 3% de NaCl, por lo que podemos decir que se trata de un microorganismo

Halotolerante, el cual soporta concentraciones de NaCl entre 1 y 6% y si no la hay en el medio

no representa mucha diferencia con respecto al crecimiento. Y al observar el pH para esta

misma cepa (ver Fig. 10), vemos que utiliza un pH de 7.2 como el óptimo.

Por ultimo para C3B (ver Fig. 8) crece mucho mejor a una concentración de 2% de NaCl

también tiene un buen crecimiento a 0.5 y 1% de NaCl, por lo que se considera como un

microorganismo halotolerante al igual que C3V; se observa (ver Fig.11) que utiliza un pH de 7.5

como el óptimo.

Para finalizar, con respecto a los aceptores de electrones, hay que mencionar que no se

realizaron las pruebas para determinar la oxidación o reducción de estos por parte de las cepas

a estudiar; solo mencionaremos los que podrían utilizarse mucho mejor.

La Cepa C3S puede utilizar el Tiosulfato como aceptor de electrones ya que se observa

un crecimiento considerable con respecto a las demás utilizadas; para C3V se observa con

Azufre y para C3B con Tiosulfato al igual que C3S.

La única cepa que se identifico con similitud del 98 % con la cepa Patrón fue C3S y

corresponde al género Sedimentibacter

8. CONCLUSIONES

Fuente de carbono y temperatura óptima:

• Para la cepa C3S es la Glucosa con una temperatura de 35ºC;

• Para la cepa C3V es la Glucosa con una temperatura de 70ºC;

• Para la cepa C3B es la Acetato con una temperatura de 70ºC

Concentración óptima de NaCl :

• Para la cepa C3S, requiere del 15%,

• Para la cepa C3V, requiere de 2%,

• Para la cepa C3B, requiere de 2%,

• pH óptimo:

• Para la cepa C3S es de 6.9,

• Para la cepa C3V es de 7.2

• Para la cepa C3B es de 7.5,

• Aceptor de electrones:

• Para la cepa C3S es Tiosulfato.

• Para la cepa C3V es Azufre.

• Para la cepa C3B es de Tiosulfato.

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9. BIBLIOGRAFÍA

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