INTERACCIÓN DEL SISTEMA NITRIDÉRGICO EN EL MECANISMO DE ... · Nos y su interacción con los...
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Universidad de Chile
Facultad de Medicina
Escuela de Kinesiología
INTERACCIÓN DEL SISTEMA NITRIDÉRGICO EN EL MECANISMO DE ACCIÓN DEL PIROXICAM Y
PARECOXIB
RODRIGO ÁLVAREZ IBARRA CLAUDIO OLMOS GONZÁLEZ
DIRECTOR DE TESIS PROF. ASIST. FERNANDO SIERRALTA GARCÍA, DD.
2006
“INTERACCIÓN DEL SISTEMA NITRIDÉRGICO EN EL MECANISMO DE
ACCIÓN DEL PIROXICAM Y PARECOXIB”
Tesis
Entregada a la
UNIVERSIDAD DE CHILE
En cumplimiento parcial de los requisitos
para optar al grado de
LICENCIADO EN KINESIOLOGÍA
FACULTAD DE MEDICINA
por
RODRIGO ALEJANDRO ÁLVAREZ IBARRA
CLAUDIO ROBERTO OLMOS GONZÁLEZ
2006
DIRECTOR DE TESIS
PROF. ASIST. DR. FERNANDO SIERRALTA G., DD.
PATROCINANTE DE TESIS
DRA. SILVIA ORTIZ ZÚÑIGA
FACULTAD DE MEDICINA
UNIVERSIDAD DE CHILE
INFORME DE APROBACIÓN
TESIS DE LICENCIATURA
Se informa a la Escuela de Kinesiología de la Facultad de Medicina que la Tesis de
Licenciatura presentada por los candidatos:
RODRIGO ALEJANDRO ÁLVAREZ IBARRA
CLAUDIO ROBERTO OLMOS GONZÁLEZ
Ha sido aprobada por la Comisión Informante de Tesis como requisito de Tesis para optar
al grado de Licenciado en Kinesiología, en el examen de defensa de Tesis rendido el
Viernes 15 de Diciembre de 2006
DIRECTOR DE TESIS
PROF. ASIST. DR. FERNANDO SIERRALTA GARCÍA, DD.
FIRMA
COMISION INFORMANTE DE TESIS
DRA. SILVIA ORTIZ ZÚÑIGA
FIRMA
DRA. MARTA ALISTE SILVA
FIRMA
KLGO. MARCELO CANO CAPPELLACCI
FIRMA
DEDICATORIA
Rodrigo Álvarez Ibarra
A mi madre por aguantarme y enseñarme, gracias por la ayuda todos estos años, no cabe en una vida mi gratitud.
A mi padre, gracias por la confianza y de una u otra forma guiar mi camino. A pesar de los problemas.
A mi amigo Claudio, por los lindos momentos vividos estos cuatro años, gracias por tu apoyo sin pedir nada a cambio.
A todos aquellos que han estado a lo largo de mi camino y se sienten parte de mí.
Claudio Olmos González
A mi padre por mostrarme que no importa cuan alta sea la montaña, si se está decidido a alcanzar la cima.
A mi madre por entregarme su inmensa luz cada día.
A mi hermano por enseñarme desde pequeño, el valor de la Superación.
A mi amigo Rodrigo por acompañarme sin condición en nuestro viaje fraternal.
AGRADECIMIENTOS
Claudio y Rodrigo
A Don José López y Alejandro Correa por su constante apoyo y colaboración desinteresada.
Al Dr. Gianni Pinardi por compartir su experiencia y conocimientos con nosotros
Al Dr. Fernando Sierralta por compartir su enorme riqueza como educador y como persona, desde que tomó la decisión de encabezar
este trabajo.
A todos quienes conforman el Laboratorio de Neurofarmacología, por hacer posible este estudio.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 Curva dosis-respuesta del Piroxicam i.p. en el ensayo
algesiométrico de la formalina, primera fase (5 primeros minutos). ..............................36
FIGURA 2 Curva dosis-respuesta del Piroxicam i.p. en el ensayo
algesiométrico de la formalina, segunda fase (10 minutos finales).… .......................... 36
FIGURA 3 Curva dosis-respuesta del Parecoxib i.p. en el ensayo
algesiométrico de la formalina,. primera fase (5 primeros minutos) ............................. 37
FIGURA 4 Curva dosis-respuesta del Parecoxib i.p. en el ensayo
algesiométrico de la formalina, segunda fase (10 minutos finales)................................ 37
FIGURA 5 Curva dosis-respuesta del Piroxicam i.p./ L-NAME
en el ensayo algesiométrico de la formalina ,. primera fase (5 primeros min.)……….. 38
FIGURA 6 Curva dosis-respuesta del Piroxicam i.p./ L-NAME
en el ensayo algesiométrico de la formalina, segunda fase (10 min. finales)…………..38
FIGURA 7 Curva dosis-respuesta del Parecoxib i.p./ L-NAME
en el ensayo algesiométrico de la formalina ,. primera fase (5 primeros min.)……........39
FIGURA 8 Curva dosis-respuesta del Parecoxib i.p./ L-NAME
en el ensayo algesiométrico de la formalina, segunda fase (10 min. finales)....................39
FIGURA 9 Curva dosis-respuesta del Piroxicam i.p./ 7-Nitroindazol
en el ensayo algesiométrico de la formalina ,. primera fase (5 primeros min.)……..........40
FIGURA 10 Curva dosis-respuesta del Piroxicam i.p./ 7-Nitroindazol
en el ensayo algesiométrico de la formalina, segunda fase (10 min. finales)…….............40
FIGURA 11 Curva dosis-respuesta del Parecoxib i.p./ 7-Nitroindazol
en el ensayo algesiométrico de la formalina ,. primera fase (5 primeros min.)…...............41
FIGURA 12 Curva dosis-respuesta del Parecoxib i.p./ 7-Nitroindazol
en el ensayo algesiométrico de la formalina, segunda fase (10 min. finales)…………….41
ÍNDICE ABREVIATURAS…………………………………………………...............……………..i RESUMEN………………………………………………………………...……….……….ii ABSTRACT………………………………………………………………..……...…….....iv INTRODUCCIÓN.................................................................................................................1 DEFINICIÓN DEL PROBLEMA EN ESTUDIO ................................................................1 IMPORTANCIA DEL PROBLEMA EN ESTUDIO Y POSIBLES LIMITACIONES…...............................................................................................................1 MARCO TEORICO...............................................................................................................3 FISIOPATOLOGÍA DEL DOLOR........................................................................................3 1. Nociceptores.......................................................................................................................4 2. Vías y Sinápsis....................................................................................................................5 3. Vías ascendentes……………………………………………………………………….....6 4. Neurotransmisores..............................................................................................................7 FÁRMACOS UTILIZADOS EN ANALGESIA...................................................................7 ANTI-INFLAMATORIOS NO ESTEROIDALES...............................................................8 Características Generales.......................................................................................................8 Parecoxib…………………………………………………………………………….…….13 Piroxicam…………………………………………………………………………….…….14 SISTEMA NITRIDÉRGICO................................................................................................14 Nos…………………………………………………………………………………………15 Regulación………………………………………………………………………………….15 Nos y su interacción con los receptores NMDA……………………………………….…..16 Mecanismo de acción del NO.……………………………………………………………..16 NO y el SNC……………………………………………………………………………….17 Interacción con fármacos…………………………………………………………………..17 HIPÓTESIS...........................................................................................................................19 OBJETIVO GENERAL........................................................................................................19 OBJETIVOS ESPECÍFICOS............................................................................................. ..19 MATERIALES Y METODOS.............................................................................................20 TEST DE LA FORMALINA................................................................................................20 ESTADISTICAS…………………………………………….……………………………..22 TIPO DE INVESTIGACIÓN…………………………………………………………...…22 OBTENCIÓN DE LA MUESTRA.......................................................................................22 VARIABLES........................................................................................................................23 PRESENTACIÓN Y ANÁLISIS DE RESULTADOS........................................................24 DISCUSIÓN.........................................................................................................................29 PROYECCIONES................................................................................................................31 CONCLUSIÓN.....................................................................................................................31 REFERENCIAS....................................................................................................................32 ANEXO 1 .............................................................................................................................36 ANEXO 2 .............................................................................................................................42 ANEXO 3…………………………………………………………………………………..44
ABREVIATURAS
7 Ni: 7- Nitroindazol
AINEs: Antiinflamatorios no esferoidales
ATP: Trifosfato de adenosina
Ca: Calcio
cGMP: GMP cíclico
CO: Monóxido de carbono
COX: Ciclooxigenasa
COX-1: Ciclooxigenasa 1
COX-2: Ciclooxigenasa 2
COX-3: Ciclooxigenasa 3
eNOS: Óxido nítrico sintasa endotelial
GABA: Ácido gaba amino butírico
iNOS: Óxido nítrico sintasa inducible
IP: Intraperiotoneal
Kg: Kilo
Mg: Miligramo
NMDA: N- metil- D – Aspartato
nNOS: Óxido nítrico sintasa neuronal
NO: Óxido nítrico
NOS: Óxido nítrico sintasa
NT: Neurotransmisores
PGs: Prostaglandinas
SC: Subcutánea
sGC: Guanidil ciclasa
SNC: Sistema nervioso central
Vía NO-GMP: vía nitridergica
RESUMEN
El objetivo de este estudio es evaluar el efecto antinociceptivo de los antiinflamatorios no-
esteroidales parecoxib y piroxicam, y su interacción con el sistema nitridérgico. Para este
estudio se utilizó ratones de la cepa CF/1 en el test algesiométrico de la formalina,
midiéndose el tiempo de lamido que realiza el ratón en su pata izquierda, sitio de inyección
de la formalina subcutánea, los primeros 5 minutos (primera fase) y los 10 últimos minutos,
de 30 que dura el test (segunda fase). Para la evaluación de las interacciones, se
construyeron curvas dosis-respuesta de los fármacos administrados con un mínimo de 6
animales por cada una de las dosis en estudio, primero individualmente, luego con L-
NAME, inhibidor no selectivo de la óxido nítrico sintasa (NOS) y después con 7-
Nitroindazol (7-NI), inhibidor selectivo de la NOS neuronal. La evaluación de los grupos
control fue idéntica a la del resto de los animales tratados. Se les inyectó por vía
intraperitoneal, parecoxib o piroxicam, 30 minutos antes de la administración de la
formalina. Para estudiar la participación del sistema nitridérgico, se administró, por la
misma vía, el inhibidor L-NAME o 7-NI, 45 minutos antes de la inyección de formalina.
Los resultados obtenidos en este estudio muestran que no hubo diferencias significativas
entre los grupos L-NAME/Parecoxib o Piroxicam y Parecoxib o Piroxicam sólo, mientras
que los resultados obtenidos con 7-NI suprimieron por completo la respuesta nociceptiva de
formalina, probablemente debido a lo potente que resultó ser la dosis empleada (5 mg/kg).
Por esta razón, no podemos concluir si la antinocicepción mostrada por la interacción del 7-
NI/Parecoxib o Piroxicam, se debe a un efecto sinérgico entre este inhibidor de la NOS
central y los AINEs en estudio, o solamente a la acción potente del 7-NI, sinergia que fue
más marcada con el parecoxib, llevando los valores prácticamente a un tiempo de lamido
igual a cero.
Como conclusión, podemos afirmar que los fármacos empleados en este estudio, parecoxib
y piroxicam, no presentaron una interacción en la acción antinociceptiva con el sistema
nitridérgico en el ensayo algesiométrico de la formalina.
ABSTRACT
The objective of this study is the evaluation of the antinociceptive effect of the NSAID’s
parecoxib and piroxicam, and his interaction with the nitridergic system. For this study CF-
1 mice in the algesiometric test of formalin, were used in this test, after administration of
formalin the time of licked treated mouse did in his left leg the first 5 minutes (first phase)
and the last ten minutes of this test (second phase). To evaluate interactions, dose-response
curves were built with a minimal of 6 animals per dose, before and after injection of L-
NAME, non-selective inhibitor of nitric oxide sintase enzyme (NOS) and 7-Nitroindazol,
selective inhibitor of neural nitric oxide sintase enzyme (nNOS) pretreatment. The
evaluations of control groups were identical to the other study groups. The mice were
injected intraperitoneally with, parecoxib or piroxicam, 30 minutes before the formalin
shot. To evaluate the participation of nitridergic system, doses of L-NAME and 7-
Nitroindazol were injected intraperitoneally, 45 minutes before the formalin shot.
The results obtained in this study were, showed no significative differences among groups
injected with parecoxib or piroxicam/L-NAME and parecoxib or piroxicam alone, whereas
the results obtained with 7-NI suppress completely the nociceptive effect of formalin,
probably due to the great dose used (5 mg/kg). For this reason, we cannot conclude if the
antinocicepción showed by the interaction of 7-NI and parecoxib and piroxicam, is caused
by a synergist effect between this nNOS inhibitor and the NSAID’s in study, or just to the
powerful action of 7-NI, synergy that was more marked with the parecoxib, taking the
values practically to a licking time equally to zero.
In conclusion, these results are not categorical in affirming that the nitridergic system
modulates the antinociceptive effect from the NSAID’s in study, on the algesiometric test
of formalin.
1
INTRODUCCIÓN
DEFINICIÓN DEL PROBLEMA EN ESTUDIO
¿En el efecto antinociceptivo del piroxicam y parecoxib, interviene el sistema nitridérgico
modulando esta acción?
IMPORTANCIA DEL PROBLEMA EN ESTUDIO Y POSIBLES LIMITACIONES
Desde que la raza humana existe, el dolor nos ha acompañado como una sensación
desagradable, molesta y muchas veces invalidante. Sin embargo, pese a la sensación
dolorosa frente a determinada injuria, es un mecanismo de defensa y/o de protección
fundamental para evitar que se dañe más el tejido u órgano afectado por esta noxa. La IASP
(Asociación Internacional para el Estudio del Dolor) define el dolor como una “experiencia
sensorial y emocional desagradable, asociada a un daño tisular actual o potencial”. Por esta
razón, probablemente el dolor debe ser uno de los temas más investigados a nivel mundial y
uno de los que más preocupa a los científicos.
Los mecanismos neuromoduladores espinales del dolor se pueden estudiar mediante
la administración de fármacos analgésicos, ya sean centrales o periféricos, y de los posibles
neurotransmisores, así como neuromoduladores que puedan intervenir en su acción, ya sean
agonistas o antagonistas, así como inhibidores de su síntesis y/o recaptación de ellos.
Aunque existe una gran cantidad de drogas que producen analgesia, no se ha
identificado en forma completa y detallada el mecanismo de acción farmacológico
responsable del efecto analgésico. La transmisión del impulso doloroso hacia el SNC
puede estar modulada por una o varias de las siguientes sustancias: neuropéptidos
(sustancia P, neuroquininas, etc.), aminoácidos (l-aspartato, l-glutamato, etc.),
neurotransmisores (adenosinérgicos, adrenérgicos, colinérgicos, serotonérgicos, opioides),
y neuromediadores (prostaglandinas, citoquinas, oxido nítrico, etc.) (Miranda, 1998).
2
Los fármacos que más se emplean en la práctica clínica, tanto médica como
kinesiológica, son los denominados analgésicos periféricos (por su principal mecanismo de
acción a nivel de la génesis del dolor), o también analgésicos antiinflamatorios no-
esteroidales (AINEs), por sus acciones principales y estructura química diferente a los
corticoides, los cuales tiene una industria gigantesca en la que se reconocen diferentes
fármacos ya sea por su naturaleza, como por su acción relativamente específica.
El presente trabajo intenta contribuir a un mayor conocimiento con respecto a la
participación del sistema nitridérgico, en la modulación de la expresión del dolor y cómo se
relaciona éste con los fármacos antiinflamatorios no-esteroidales.
3
MARCO TEORICO FISIOPATOLOGÍA DEL DOLOR
Luego de realizar un diagnóstico preciso, el tratamiento del dolor, es sin lugar a
dudas un importante aspecto a considerar para contribuir al bienestar del paciente;
preocupación importante en la práctica clínica. El enfoque terapéutico que se utilizará será
más adecuado si se conocen los mecanismos, neuromoduladores y neurotransmisores
involucrados en la conducción del estímulo doloroso.
Como esquema general, se puede decir que para percibir un dolor es necesario:
a) Una estructura periférica que actúe como receptor
b) Una sinapsis en la médula espinal
c) Vías de conducción desde la médula espinal hasta los centros superiores como
bulbo, diencéfalo y corteza
d) Vías descendentes desde los centros superiores: corteza, tálamo y núcleos
reticulares, que actúen como mecanismos principalmente inhibitorios, pero también
pueden ser facilitadores y provocar dolor. (Paeile, 2005)
En condiciones normales, las señales nociceptivas son producidas por un intenso
estímulo de las fibras terminales sensoriales aferentes Aδ y C, por noxas químicas, presión
y frío o calor (Chizh y cols., 2000). Las neuronas sensoriales se dividen basándose en su
histología (tamaño de la fibra, grado de mielinización, conexiones post sinápticas en la
médula espinal), características histoquímicas (presencia de péptidos, canales de iones,
receptores y otros neurotransmisores) según modalidades sensoriales y velocidad de
conducción, que no es el objetivo detallar en este trabajo (Christie y cols., 2000). La
nocicepción es un mecanismo a través del cual, estímulos nocivos son transmitidos al
sistema nervioso central (SNC) (Paeile, 2005).
La sensación del dolor que se experimenta llega al SNC el cual discrimina y analiza
la naturaleza, localización, intensidad y duración de la noxa, además recontribuir a la
4
evaluación cualitativa del dolor, gracias a los diferentes haces anatómicos tales como el haz
paleoespinotalámico, el haz neoespinotalámico y haz espinoreticulotalámico (Millán,
1999).
La agresión de una noxa genera en el tejido una serie de cambios bioquímicos, los
cuales desencadenan los mecanismos del dolor. Cuando un estímulo agresor de cualquier
origen daña las membranas celulares, se inicia la síntesis en cascada de una serie de
eicosanoides (prostaglandinas, tromboxanos, prostaciclinas y leucotrienos que se sintetizan
en la zona lesionada), a partir del ácido araquidónico. Este es un ácido poliinsaturado que
ingresa por la dieta y pasa a formar parte de los fosfolípidos de la membrana celular. Al
hidrolizarse por la fosfolipasa A2 genera diferentes prostaglandinas y leucotrienos, por
acción de las ciclo-oxigenesas o de las lipo-oxigenasas. Las prostaglandinas (PGs) al
romper el ATP, producen cambios en el potencial de membrana, disminuyendo el umbral
de excitación de los nociceptores y sensibilizando las terminaciones nerviosas aferentes, a
estímulos químicos o mecánicos. Por otro lado, hay una acción directa de la prostaglandina
E y de la bradicinina sobre los nociceptores y además hay alteración de la micro circulación
de leucocitos, al estimular la circulación sanguínea en la región inflamada (Ortega, 1995).
Nociceptores
El término nociceptor es útil para diferenciar las fibras Ab de las Aδ y C que
corresponden a los nociceptores propiamente tales. Cuya característica más destacada es
poseer un umbral de estimulación mas alto, en comparación a las fibras de grueso calibre
que son de umbral muy bajo, ya que ellas transmiten el tacto suave o ligero.
La neurona periférica o neurona en T presenta en la periferia una arborización
plexiforme carente de mielina llamada terminación libre, estas no presentan especificidad
frente a un estímulo nociceptivo sino que también trasmiten tacto leve y presión (Dennis y
Melzak, 1977).
Se encuentran distribuidas en todo el organismo: en la piel y el tejido celular
subcutáneo, vísceras, músculos y articulaciones. Son muy abundantes en el humano; en
5
efecto, se calcula un promedio de 200 por cm2, generalmente en torno a arteriolas y vénulas
(Paeile, 2005). Se diferencian de otros receptores, en que su adaptabilidad es muy baja. Y
cualquier estímulo (tacto, presión, calor, etc.) puede constituirse en una sensación dolorosa.
En general, los agentes que activan a estos receptores se denominan sustancias
algógenas. Se distinguen dos tipos de nociceptores: nociceptores mecánicos de umbral
alto o nociceptores mecano termales, que se relacionan con el dolor agudo, breve, bien
localizado y que dura sólo lo que dura el estímulo; y nociceptores polimodales o mixtos,
que se relacionan con el dolor crónico, quemante, sordo, y mal localizado (Vidal y cols.,
2004; Caterina y Julius, 1999).
Es interesante destacar que entre las neuronas periféricas existe un grupo importante
que normalmente no participa constantemente en el procesamiento de la información hacia
la segunda neurona, estos nociceptores son llamados silentes y se activarán
fundamentalmente en procesos inflamatorios crónicos (Vidal y cols., 2004)
Vías y Sinápsis
Un estímulo doloroso se sentirá primero como dolor agudo, bien localizado,
transmitido por fibras Aδ, seguido después de un pequeño retardo por un dolor ondulante,
quemante, sordo, mal definido, transmitido por fibras C. Se produce aquí la transmisión
sináptica, desde la primera a la segunda neurona, que puede ser de dos tipos: a) una que es
activada por estímulos nociceptivos propiamente tal y que se llama neurona específica
(NE); y b) otra que no presenta especificidad, neurona de rango dinámico amplio (ARD)
es multirreceptiva o de segundo orden. Esta primera sinapsis está mediada por la sustancia
P, y aminoácidos, como el glutamato, entre otras sustancias (Chizh y cols., 2000).
Muchas fibras nociceptivas, antes de su ingreso a la sustancia gris de la médula
espinal, emiten colaterales descendentes y ascendentes, constituyendo la parte más medial
del haz de Lissauer. Estas colaterales tienen la posibilidad de formar sinapsis hasta dos
segmentos medulares superiores o inferiores al del ingreso, lo que significa que la
transmisión de una neurona primaria puede propagarse a varias raíces vecinas. Esta
interrelación es de importancia pues la información de una neurona en T puede propagarse
6
a raíces vecinas, hecho que podría explicar en parte el dolor irradiado y el referido (La
Motte, 1977).
De importancia es también la sustancia gelatinosa de Rolando, que corresponde a
la lámina II de Rexed, porque existen pequeñas neuronas y de alta densidad características:
las interneuronas, que de alguna manera modulan estas sinapsis. Estos hechos tienen
importancia, ya que dan una relación anatomo–fisiológica a fenómenos como el dolor
referido y a la modulación suprasegmentaria, que pueden ejercer centros superiores sobre la
transmisión nerviosa (Paeile, 2005).
Vías ascendentes
Las segundas neuronas dan origen a tres haces ascendentes de ubicación contra
lateral: a) el neoespinotalámico y b) el paleoespinotalámico, que conforman la vía
espinotalámica y c) el espinoreticulotalámico.
El tracto neoespinotalámico de especial desarrollo en los monos sin cola y en el
hombre, es el encargado de conducir el dolor agudo bien localizado. Produce de
inmediato, el reflejo de retirada. El tracto paleoespinotalámico, que como su nombre lo
indica es el más antiguo, es el responsable de los dolores difusos crónicos. Transportado
por receptores polimodales, con axones C, no producen reflejo de retirada, sino más bien
una inmovilización por contracción muscular (Pinardi, 1993).
El haz neoespinotalámico, proyecta la información nociceptiva hacia las áreas SI y
SII de la corteza parietal somestésica para elaborar la ubicación topográfica del dolor
A su vez, el haz paleoespinotalámico lleva la información a zonas de la corteza
frontal no específica, para efectuar la evaluación cualitativa del dolor. El haz
espinoreticulotalámico, es el que aporta el componente emocional y afectivo del dolor, por
sus abundantes relaciones sinápticas con la formación reticular (Paeile, 2005).
7
Neurotransmisores
La transmisión de información nociceptiva entre neuronas se realiza mediante señales
químicas, mediadas por aminoácidos y neuropéptidos excitatorios e inhibitorios, los cuales son
producidos, almacenados y liberados en los terminales de aferencias primarias, entre neuronas
del asta dorsal y terminales de fibras descendentes del sistema supraespinal. Los agentes, en los
terminales centrales de aferencias primarias, incluyen aminoácidos como aspartato y glutamato
los que excitan los terminales nerviosos de grandes fibras mielínicas, además estas terminales
primarias liberan sustancias consideradas como neuromoduladores, entre los que se pueden
mencionar la somatostatina, péptido vasoactivo intestinal, galanina, angiotensina,
colecistocinina, ocitocina, etc. En las neuronas propias del asta dorsal de la médula espinal se
encuentran neuroquímicos excitatorios de nociceptores tales como sustancia P y neurotensina,
como también algunas sustancias inhibitorias de nociceptores como GABA, encefalinas,
endorfinas, somatostatina, y muchos otros (Chizh y cols., 2000).
Tradicionalmente, el asta dorsal medular era considerada como una simple estación de
relevo, sin embargo hoy se postula como una compleja estructura que contiene una gran variedad
de neuronas y dispositivos sinápticos que no solo permiten la recepción y transmisión de
aferencias sensitivas, sino que también un alto grado de procesamiento sensitivo que incluye la
abstracción local, integración, selección y una apropiada dispersión de impulsos sensitivos
(Herrero y cols, 2003).
FÁRMACOS UTILIZADOS EN ANALGESIA
Dentro del plano de la analgesia, podemos encontrar una gran variedad de fármacos
capaces de producir un efecto en la inhibición de la transmisión dolorosa, tanto a nivel
preclínico, en animales, como a nivel clínico, en el hombre. Dentro de esos se hallan los
fármacos antidepresivos, antiepilépticos, antiinflamatorios no-esteroidales, α-adrenérgicos,
serotonérgicos, nitridérgicos, colinérgicos, anestésicos locales, cannabinoides y opioides
(Christie y cols., 2000).
8
De todos los grupos de fármacos antes citados, los antiinflamatorios no esteroidales
(AINEs) son de los más usados por la mayoría de las especialidades médicas, tanto en dolor
agudo como crónico, y por lo tanto, también los más estudiados. Sin embargo,
independientemente de su eficacia, presentan una serie de reacciones adversas que limitan
su uso.
Los AINEs, producen varias acciones terapéuticas, entre los cuales la analgésia y su
capacidad antiinflamatoria son las de mayor relevancia clínica. En este estudio se evaluó la
actividad analgésica de parecoxib y piroxicam. Para ello se utilizará un método
algesiométrico agudo: el test de la formalina en ratones.
Aunque existe una gran cantidad de drogas que producen analgesia, no se ha
identificado en forma completa y detallada el mecanismo de acción farmacológico
responsable del efecto analgésico. La transmisión del impulso doloroso hacia el SNC
puede estar modulada por una o varias de las siguientes sustancias: neuropéptidos
(sustancia P, neuroquininas, etc.), aminoácidos (l-aspartato, l-glutamato, etc.),
neurotransmisores (adenosinérgicos, adrenérgicos, colinérgicos, serotonérgicos, opioides),
y neuromediadores (prostaglandinas, citoquinas, oxido nítrico, etc.).
ANTIINFLAMATORIOS NO- ESTEROIDALES
Son un grupo de fármacos con estructura química diferente, pero con acciones en común:
analgésicos, antipiréticos, antiinflamatorios y en algunos casos uricosúricos, además de ser
antiagregantes plaquetarios (ácido acetil salicílico).
Características Generales
1.- Propiedades Diferenciales Aunque la mayoría de los componentes de este grupo comparten las tres acciones
que los definen (analgésico, antiinflamatorio y antipirético), su eficacia relativa es diferente
9
en cada uno de ellos. A su vez la toxicidad puede coincidir con la del grupo o ser más o
menos específica. De ahí que su uso clínico dependa tanto de su eficacia clínica así como
del grado de reacciones adversas que produzca.
2.- Mecanismo General de Acción Los efectos terapéuticos y muchas de las reacciones adversas de los AINEs se
relacionan con el efecto inhibidor de las ciclooxigenasas (COX), enzimas que convierten el
ácido araquidónico en endoperóxidos y luego en prostaglandinas y tromboxanos. Algunos
de estos eicosanoides participan en el proceso de la inflamación, la fiebre y el dolor por lo
que la inhibición de su síntesis por los AINEs es responsable de su actividad terapéutica,
aunque dada su participación en determinados procesos fisiológicos, dicha inhibición es
también la causa de diversas reacciones adversas características de estos fármacos (Florez y
cols., 2003).
Los AINEs inhiben las COXs, y actualmente se describen la existencia de tres
isoformas de estas enzimas: COX-1, COX-2 y COX-3. La COX-1 es de expresión
constitutiva, producto de un gen que transcribe en forma estable y continua y estando
además implicada en los procesos de protección de la mucosa gástrica, funciones renales y
activación plaquetaria. La COX-2, de expresión inductible y que resulta de un gen con un
elevado nivel de regulación, y cataliza la producción local de prostaglandinas en
situaciones tanto fisiológicas como patológicas, basalmente su expresión está restringida,
aunque se detectan niveles elevados en sistema nervioso central y corteza renal. Además, la
expresión de COX-2 es inducida por diversos mediadores asociados con la inflamación y
crecimiento celular, desempeñando un rol esencial en la inflamación, fiebre, dolor y
proliferación celular (Florez y cols., 2003). La COX-3 es codificada del mismo gen de la
COX-1. En el hombre es abundante en el tejido cardíaco y la corteza cerebral. En estudios
con canes se comprobó que la COX-3 es inhibida selectivamente por dipirona y
acetaminofeno, y es potencialmente inhibida por algunos otros AINEs. Se sugiere que esta
10
tercera forma de COX aparece 48 horas después de iniciado el proceso inflamatorio y esta
involucrada en la biosíntesis de mediadores antiinflamatorios endógenos (González y cols.,
2002).
La mayoría de los AINEs actualmente disponibles inhiben, a concentraciones
terapéuticas, ambas isoformas de COX. Algunos AINEs, como el parecoxib y nimesulida
exhiben una selectividad preferencial por la COX-2. Se ha sugerido que el rofecoxib y el
celecoxib parecen inhibir exclusivamente la COX-2 (Florez y cols., 2003).
3.- Acciones farmacológicas
3.1.- Acción Analgésica
La actividad analgésica de los AINEs es de intensidad baja a moderada, con un
techo analgésico inferior al de los opioides, no producen alteración de la percepción o
sensación. Los AINEs se prescriben para dolores caracterizados por una participación
destacada de inflamación aguda o crónica, como los dolores articulares, musculares,
dentarios y cefaleas. La acción analgésica de los AINEs tiene lugar tanto en tejidos
periféricos, con la inhibición la síntesis de prostaglandinas, y a nivel central en el SNC,
inhibiendo preferentemente la COX-3.
3.2.- Acción antipirética
La fiebre es una respuesta autónoma, conductual compleja y coordinada que se
desencadena ante la existencia de una lesión, inflamación, infección, tumores, rechazo de
tejidos, etc., y tienen dos objetivos: alertar sobre una situación anómala y potencialmente
lesiva, y poner en marcha una serie de mecanismos fisiológicos para la defensa del
organismo. Su signo cardinal es la elevación de la temperatura corporal del orden de 1 a 4
ºC (Florez y cols., 2003). Aunque todos los AINEs tiene la capacidad de ser antipiréticos,
por inhibir la PG E2, el ibuprofeno y el paracetamol son los que se utilizan en clínica para
esos propósitos.
11
3.3.- Acción Antiinflamatoria La inflamación es una respuesta fisiopatológica con que cuenta el organismo para
defenderse frente a agresiones producidas por una gran variedad de estímulos (p. ej.,
infecciones, procesos isquémicos, traumas de diverso índole, etc.) aunque, en ocasiones, su
aumento y permanencia en el tiempo son lesivos para el organismo. La respuesta
inflamatoria se puede dividir en tres fases en las que intervienen mecanismos diferentes:
una Fase aguda, cuyos signos principales son la vasodilatación local y el aumento de la
permeabilidad capilar; una Fase sub-aguda, en la que se produce infiltración de células
fagocíticas y leucocitarias; una Fase crónica, en la cual hay signos de degeneración y
fibrosis de tejidos afectados (Florez y cols., 2003).
La capacidad de los AINEs para reducir la inflamación es diferente entre un AINE y
otro, son más eficaces frente a inflamaciones agudas que crónicas. Al inhibir la síntesis de
PG y tromboxanos, los AINEs reducen su actividad sensibilizadora de la terminaciones
sensitivas, así como la actividad vasodilatadora y quimiotáctica, interfiriendo así en uno de
los mecanismos principales de la inflamación (Florez y cols., 2003).
3.4.- Acción Antiagregante Plaquetaria No es propia de todos los AINEs. Es producida fundamentalmente por la aspirina
(ácido acetilsalicílico) inhibiendo la COX-1 de manera irreversible (Handin y Loscalzo,
1992). Por otra parte la aspirina en bajas dosis tiene un efecto positivo en la profilaxis de
fenómenos tromboembólicos coronarios y cerebro vasculares (Paeile, 2005)
3.5.- Acción Uricosúrica
Es consecuencia de la inhibición del transporte de ácido úrico desde de la luz del túbulo
renal hasta el espacio intersticial, es un proceso apreciable sólo con algunos AINEs y a
dosis elevadas.
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4.- Reacciones Adversas comunes
4.1.- Gastrointestinales El mecanismo involucrado es el de la inhibición en la síntesis de PGE1 y PGE2, las
cuales inhiben la secreción gástrica y promueven la secreción de mucus en el aparato
digestivo. Son frecuentes los efectos menores (15-25%) como diarrea, dispepsia, pirosis,
gastritis, o estreñimiento. También producen úlcera péptica y duodenal.
4.2.- Renales Los AINEs, debido al bloqueo de la síntesis de PGs, pueden disminuir el flujo renal
y la filtración glomerular, también producen retención de sodio, agua y potasio, causando
problemas por desbalances de electrolitos. La complicación más importante es la
insuficiencia renal aguda.
4.3.- Hematológicos
Aunque su frecuencia es baja, el amplio uso de los AINEs y la gravedad de alguna
de ellas como la anemia aplásica obliga a tenerlas en cuenta. Alguna de estas reacciones
están en relación con las propiedades mencionadas anteriormente, como un efecto en
exceso de la actividad antiagregante plaquetaria. También pueden ocurrir reacciones
adversas de hipersensibilidad (Florez y cols., 2003).
4.4.- Hipersensibilidad
Aparecen en alrededor del 1 a 2% de los pacientes bajo tratamiento con AINEs este
tipo de reacciones (como rinitis alérgica, asma bronquial, hipotensión). Pueden ser de
carácter alérgico, de mecanismo inmunológico con anticuerpos, o seudo alérgico, que son
más frecuentes y relacionado con la inhibición de la síntesis de PGs en conexión con una
sensibilidad individual especial.
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Parecoxib Dentro de los AINEs, éste fármaco pertenece al grupo de los inhibidores selectivos de la
COX-2, estos producen a concentraciones terapéuticas, una inhibición selectiva de la
COX-2, con lo que se evitan los efectos secundarios más frecuentes e importantes de los
AINEs (toxicidad gastrointestinal, renal y problemas hemorrágicos) relacionados con la
inhibición de la COX-1. (Florez y cols., 2003)
Poseen actividad analgésica, antiinflamatoria y antipirética comparable a la de los AINEs
convencionales. No poseen efecto antiagregante plaquetario, al no inhibir la síntesis del
tromboxano dependiente de la COX-1 y sí la de prostaciclina, dependiente de la COX-2.
Tampoco poseen efecto uricosúrico.
Son claramente menos lesivos que otros AINEs para la mucosa gastrointestinal, pero no son
totalmente inocuos. En ocasiones en su administración crónica se han descrito gastritis,
úlceras y hemorragias. Su uso está limitado, con preferencia sobre el resto de los AINEs a
los pacientes con riesgo elevado de padecer reacciones adversas gastrointestinales serias.
Los efectos adversos más frecuentes son: prurito, dolor abdominal, diarrea, dispepsia,
flatulencia, osteítis alveolar, mareo, insomnio, faringitis, rinitis, sinusitis, infección del
tracto respiratorio superior, edemas.
Presentan hipersensibilidad cruzada con otros AINEs. Está contraindicado su uso en
pacientes con alergia a sulfonamidas o a salicilatos o AINEs. También en pacientes que
hayan experimentado asma, rinitis aguda, pólipos nasales, edema angioneurótico, urticaria
u otras reacciones de tipo alérgico después de tomar AINEs. En pacientes afectos de úlcera
péptica activa o hemorragia gastrointestinal, enfermedad inflamatoria intestinal,
insuficiencia cardiaca grave (por la posible retención de líquidos y edemas), insuficiencia
hepática grave, o insuficiencia renal grave.
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Piroxicam
Pertenece al grupo de los oxicams que son ácidos enólicos que se introdujeron a finales de
los años setenta como AINEs de vida media larga que permitían sólo una dosis diaria, esto
es ventajoso para el tratamiento de procesos inflamatorios y en dolores crónicos. Dentro de
este grupo el más usado y el primero en ser introducido en la terapéutica es el piroxicam.
(Florez y cols., 2003)
El piroxicam posee actividad antiinflamatoria, analgésica, antipirética y antiagregante
plaquetaria. Sufre una importante recirculación entero hepática que condiciona una
semivida de eliminación prolongada de aproximadamente 50 horas. Se metaboliza
ampliamente por medio de reacciones de hidroxilación, de manera que tan sólo el 5-10 por
ciento de la dosis administrada se elimina sin metabolizar.
Las reacciones adversas más frecuentes son las de localización gastrointestinal.
Ocasionalmente puede producir edema, prurito, erupciones exantemáticas, incremento de
los valores de creatinina sérica y de los valores de nitrógeno ureico en sangre, disminución
de hemoglobina, cefalea, mareos, malestar general y somnolencia.
Está indicado para el tratamiento de enfermedades reumáticas como artritis reumatoide,
artritis y espondilitis anquilosante, con sólo una dosis de 20 mg/día. También se emplea en
la inflamación no reumática (bursitis, capsulitis, tendinitis), en la dismenorrea primaria y en
el ataque agudo de gota. En tratamientos agudos llegan a emplearse 40 mg/día durante 3-4
días. Debe administrarse conjuntamente con las comidas para paliar la posible irritación
gástrica.
SISTEMA NITRIDÉRGICO
El óxido nítrico (NO) es una pequeña molécula que se sintetiza en las células del
organismo a partir del aminoácido L-arginina y participa como neurotransmisor en el SNC
15
y periférico entre otras acciones, por lo que tendría una acción neuromoduladora
(Esplugues, 2002). Esta molécula es sintetizada por la óxido nítrico sintasa (NOS)
NOS
Esta enzima presenta 2 dominios, un dominio reductasa, con un lugar reconocido por la
calmodulina; y un dominio oxigenasa, con un lugar de unión para L-Arginina (Florez y
cols., 2003).
Existen 3 isoenzimas de la NOS, las cuales presentan diferente localización y regulación:
- NOS neuronal (nNOS): localizada en neuronas del SNC y periférico, productora de
un NO neurotransmisor.
- NOS endotelial (eNOS): presente en las células endoteliales, células mesangiales
renales y plaquetas, por lo tanto relacionada con la regulación de la hemostasia
vascular.
- NOS inducible (iNOS): se expresa en muchas células cuando entran en contacto
con citoquinas y/o endotoxinas que sintetizan gran cantidad de NO con efecto
citotóxico (Florez y cols., 2003).
Regulación
La isoforma nNOS que será intervenida en la presente investigación, se expresa de
forma constitutiva respondiendo a diversos estímulos y producen cantidades pequeñas de
NO. Se han identificado 5 tipos de nNOS, de los cuales la nNOSa es la que tiene más
acción en el SNC (Esplugues, 2002).
El regulador más importante de la nNOS es el Ca2+ citosólico, el cual se asocia a la
calmodulina, estimula el nNOS, a diferencia de la iNOS que es independiente del Ca2+, la
separación del Ca2+ con la calmodulina inactiva a la nNOS (Florez y cols., 2003).
Se describe también que existe una estimulación postsináptica de los receptores de
NMDA por un neurotransmisor excitatorio, como el glutamato. Por último el NO efectúa
una retroalimentación negativa que disminuye la acción de esta enzima, actuando sobre los
receptores NMDA (Esplugues, 2002).
16
NOS y su interacción con los Receptores NMDA
Dentro de las neuronas, la enzima NOS se puede encontrar en el citosol, pero
también integrada en diferentes membranas celulares. Parece ser que durante la liberación
del óxido nítrico la enzima se localiza en la membrana plasmática (por translocación de la
enzima citosólica a la membrana), en íntima asociación con receptores de glutamato del
tipo NMDA (estos receptores forman canales iónicos permeables al calcio, de manera que
cuando unen glutamato y la neurona está despolarizada, se produce la apertura del canal
con el consiguiente influjo de calcio). Esta estrecha asociación permite una vía directa del
calcio a través del receptor NMDA hasta la enzima NOS y la liberación rápida del óxido
nítrico (Herman y cols., 1995).
Mecanismo de Acción del NO
El NO sólo se sintetiza en respuesta a estímulos, difunde a través de las membranas
biológicas ahí reacciona con metales de transición, amina, grupos tiol, radicales libres como
oxígeno y súper óxido. Su acción depende principalmente de la disponibilidad de radicales
libres donde actúe. Su principal regulador es el mismo NO el cual activa principalmente la
guanidil ciclasa (sGC), la que aumenta los niveles de GMP cíclico (cGMP). Esta
distribución de sGC y cGMP es complementaria a la de nNOS. (Esplugues, 2002).
Nuevas investigaciones demuestran que el NO regula el consumo de O2
mitocondrial inhibiendo a la citocromo oxidasa. Este efecto es competitivo con el oxígeno y
reversible, por lo que sería un regulador crucial en la generación de energía (Esplugues,
2002). Además se relaciona con varios NT, entre los cuales se destacan: opioides,
acetilcolina, noradrenalina, serotonina, glutamato, GABA, ATP, dopamina, CO, y
endotelina. Los mecanismos responsables no están claros, pero la S-nitrosilación de los
receptores gatillan la cascada de fosforilación de la proteína GMP-dependiente, la cual
regula la energía neuronal y el efecto modulador de transporte de los neurotransmisores
(Esplugues, 2002).
17
NO y el SNC
El NO es un mensajero intercelular que eleva los niveles de cGMP y también activa
los receptores de glutamato. Se encuentra en casi todas las zonas del SNC. Por su parte, la
nNOS también se encuentra en una gran cantidad de zonas del SNC pre y post sinápticas y
está relacionada con la plasticidad sináptica, neurotoxicidad, excitación neural, y
modulación del dolor (Esplugues, 2002).
En relación a la percepción del dolor, el NO está implicado en varias vías tanto
periféricas como centrales. Los reflejos nociceptivos involucran la interacción del NO con
los receptores NMDA antes mencionados y establece que la síntesis de NO aumenta la
facilitación espinal de los input aferentes de los comportamientos de respuesta. La
inhibición del NO tiene un efecto antinociceptivo cuando se estimulan los terminales
nerviosos periféricos químicos y en modelos de hiperalgesia o dolor visceral. A la inversa,
el bloqueo de la síntesis de NO exacerba el dolor en problemas de hiperalgesia mecánica
(Hernandez, 2005).
Interacción con fármacos
El NO puede ser inhibido o inducida su síntesis con diversos fármacos:
- Inhibidores de la NOS: actúan en diferentes sitios de unión de la enzima.
1. Existe una familia del L-NAME, el cual compite con la L-arginina por el
sitio de unión y produce inhibición. Actúan preferentemente en procesos con
gran cantidad de NO inhibiendo la iNOS. Al no ser inhibidores específicos
causan gran cantidad de efectos colaterales como por ejemplo el aumento de
la presión arterial (Florez y cols., 2003).
2. El 7-nitroindazol es un inhibidor selectivo de la nNOS. El desarrollo de este
ha permitido explorar in vivo los posibles roles que cumple el NO liberado
por las neuronas, evitando la respuesta hipertensiva que mostraban los
inhibidores inespecíficos. Para el presente estudio se utilizará dicho
inhibidor (Nanri y cols., 1998).
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- Donantes de NO: conjunto de sustancias que son capaces de liberar NO tras su
administración en sistemas biológicos (Florez y cols., 2003).
19
HIPÓTESIS
La actividad analgésica producida por parecoxib y/o piroxicam en sus diferentes
dosis, está relacionada con el sistema nitridérgico en el ensayo algesiométrico agudo
experimental de la formalina en ratones de la cepa CF/1.
OBJETIVO GENERAL
Evaluar la relación de la actividad antinociceptiva de parecoxib y piroxicam en el
sistema de la vía NO-GMP cíclico, en el ensayo algesiométrico agudo experimental de la
formalina.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Evaluar el componente de la vía NO-GMP cíclico, por el pretratamiento con L-
NAME, en la actividad de parecoxib y piroxicam, mediante el test de la formalina
en ratones de la cepa CF/1.
- Evaluar el componente de la vía NO-GMP cíclico, por el pretratamiento con 7-
Nitroindazol, en la actividad de parecoxib y piroxicam, mediante el test de la
formalina en ratones de la cepa CF/1.
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MATERIALES Y MÉTODOS
Se usaron ratones de la cepa CF/1 (Mus musculus) machos y hembras, de 28 a 30
gramos de peso, los cuales fueron criados de acuerdo a las condiciones estándar
internacionales de experimentación, a temperatura, presión y humedad adecuados,
sometidos a 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad, procurando no sobrepasar el numero
de 9 crías. (Sufra, 1998). Luego fueron habituados al ambiente del laboratorio al menos dos
horas antes del experimento, teniendo libre acceso a comida y agua durante ese lapso de
tiempo, para evitar ansiedad y conductas de exploración durante la realización del test. El
cual se realizó de acuerdo a un protocolo aprobado por la Comisión de Ética de la Facultad
de Medicina (cada animal recibió solamente una dosis de las drogas, las observaciones
fueron efectuadas en forma ciega y randomizada). Los animales se sacrificaron después del
experimento mediante dislocación cervical.
TEST DE LA FORMALINA
Los animales controles fueron inyectados con solución salina al 0.9 % y los
animales del grupo control/L-NAME y del control/7-Nitroindazol, con una concentración
de 5 mg/kg de peso. Para estudiar la participación del sistema del nitridérgico, se
administró, por vía intraperitoneal 7-nitroindazol (5 mg/kg), un inhibidor selectivo de la
NOS, específicamente la nNOS, 45 minutos antes de la inyección de formalina, o L-
NAME (5mg/kg), un inhibidor no selectivo de la NOS, 45 minutos antes de la inyección de
formalina. Luego, los ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal (ip) con parecoxib
(0.3, 1, 3 y 10 mg/kg ) y con piroxicam (1, 3, 10 y 30 mg/kg), 30 minutos antes de la
administración de la formalina, es decir 15 minutos después de la inyección del inhibidor
nitridérgico.
Los fármacos se administraron por vía intraperitoneal (ip) en un volumen constante
para todos los fármacos empleados, de 10 ml/kg y el ensayo de la formalina se realizó al
momento de obtenerse el efecto máximo de cada droga.
21
La evaluación de la actividad antinociceptiva se efectuó utilizando el test
algesiométrico de la formalina, induciendo el estímulo doloroso. Para ello se realizó una
inyección subcutánea de 20 µL de una solución de formalina (formaldehído diluido al 5
%) en la superficie dorsal de la pata izquierda del animal (Abbott y cols, 1995).
Los ratones se colocaron en un cilindro diseñado para la observación y se contó el
tiempo total que ellos se lamían la pata inyectada durante los 5 minutos inmediatos a la
inyección de formalina, cabe destacar que el evaluador contabiliza sólo el lamido en la
pata izquierda del ratón en la zona sin vellos, indicador real de dolor. El lamido en la parte
superior con pelos de la pata y el resto del cuerpo no es contabilizado, debido a que no es
atribuible actividad nociceptiva, sino a conductas de higiene propias de la especie
(Huskaar y cols, 1985). . La conducta más específica de manifestación de dolor es el
aumento de la incidencia de autotomía, en donde el animal rasca y muerde el miembro
denervado y anestesiado. Signos más generales de dolor espontáneo incluyen diferencias
en el patrón de sueño, conducta exploratoria, estado nutricional y conducta social
(Mandegary y cols, 2004).
Por medio de cronómetro digital, se contabilizó la fase algésica aguda (primera
fase). Posteriormente transcurren 15 minutos sin contabilizar, debido a que el ratón se
encuentra en un período de quietud. Luego se contó por 10 minutos, a partir de los 20
minutos de la inyección y hasta los 30 minutos, el tiempo total durante el cual los animales
se lamían la pata inyectada, por medio de cronómetro digital y que corresponde a la fase
inflamatoria y que mide el dolor crónico (segunda fase) (Abbott y cols, 1995).
Para la evaluación de las interacciones, se construyeron curvas dosis-respuesta de
los AINEs administrados por vía intraperitoneal con un mínimo de 6 animales por cada una
de las curvas, de al menos 4 dosis logarítmicas diferentes y crecientes, antes y después del
pretratamiento con L-NAME y con 7-Nitroindazol de los animales.
22
ESTADISTICAS
Para la evaluación de las drogas, se comparó el efecto del fármaco antes y después
de la administración tanto del L-NAME y del 7-Nitroindazol, y la significación estadística
fue determinada por pruebas t de Student y análisis de varianza (ANOVA). La significación
fue considerada a un nivel de 5%.
Para el análisis estadístico, se utilizó el programa PRIMER, perteneciente al
Laboratorio de Neurofarmacología Facultad de Medicina de la Universidad de Chile.
TIPO DE INVESTIGACIÓN
El proyecto utiliza un estudio del tipo explicativo con un diseño experimental de
laboratorio con post-prueba solamente y grupo control.
OBTENCION DE LA MUESTRA
La selección de los animales se realizó en forma randomizada y la muestra es del
tipo probabilística.
23
VARIABLES PRIMERA VARIABLE
Definición conceptual: expresada como “la interacción entre el tipo de inhibidor
nitridérgico utilizado y la actividad analgésica de parecoxib y de piroxicam”, es decir, si la
inhibición selectiva y no selectiva de la NOS, influye en el mecanismo de acción
antinociceptivo de los AINEs en estudio.
Definición operacional: esta variable se medirá a través de un análisis de las curvas dosis
respuesta de los fármacos administrados vía ip.
SEGUNDA VARAIBLE
Definición conceptual: está expresada como el “efecto antinociceptivo del parecoxib y
piroxicam”, entendiéndose por efecto antinociceptivo, a la disminución de la actividad
dolorosa, expresada por el animal por su lamido de la extremidad inyectada por la solución
algógena de formalina vía sc. La escala de medición de la variable es de razón y
proporción.
Definición operacional: Este efecto se evaluará utilizando el test algesiométrico de la
formalina.
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PRESENTACION Y ANALISIS DE RESULTADOS
Para la comparación de los grupos de estudio con el grupo control salino, se utilizó la
Prueba T (P value < 0,05). Los resultados obtenidos de las mediciones, se acompañan de su
respectivo Error Estándar (ES). Los mismos son presentados en el Anexo 3.
NS: resultados estadísticamente no significativos
p<0.05: resultados estadísticamente significativos
Grupo Control Salino
En el grupo control con suero fisiológico al 0.9%, se obtuvo durante la primera fase
(0 a 5 minutos), un tiempo promedio de lamidos de 126.38 ± 8.48 segundos. En la segunda
fase (20 a 30 minutos) se obtuvo un tiempo promedio de lamidos de 155.65 ± 10.20
segundos.
Grupo control L-NAME
(Resultados comparados con respecto al Control Salino)
En este grupo durante los primeros 5 minutos, se registró un tiempo promedio de
lamidos de 113,5 ± 15,41 segundos (NS) y durante los últimos 10 minutos (segunda fase),
el tiempo promedio de lamidos fue de 94 ± 12,91 segundos (p<0.05).
Grupo control 7-Nitroindazol
(Resultados comparados con respecto al Control Salino)
En este grupo se obtuvo en la primera fase un tiempo promedio de lamidos de 1,67
± 1,09 segundos (p<0.05). En la segunda fase (20 a 30 minutos) se obtuvo un promedio de
lamidos de 0 ± 0,00 segundos (p<0.05).
25
Grupo Parecoxib
(Resultados comparados con respecto al Control Salino)
En la dosis de 0.3 mg/kg, el tiempo promedio de lamidos durante la primera fase fue
de 84.5 ± 16.72 segundos (NS) y en la segunda fase fue de 117.25 ± 13.2 segundos
(p<0.05).
En la dosis de 1 mg/kg, el tiempo promedio de lamidos durante la primera fase fue
de 55.83 ± 12,82 segundos (p<0.05) y en la segunda fase fue de 126 ± 12.66 segundos
(p<0.05).
En la dosis de 3 mg/kg, el tiempo promedio de lamidos durante la primera fase fue
de 36.4 ± 15.64 segundos (p<0.05) y en la segunda fase fue de 119.33 ± 12.5 segundos
(p<0.05).
En la dosis de 10 mg/kg, el tiempo promedio de lamidos durante la primera fase fue
de 30 ± 10.02 segundos (p<0.05) y en la segunda fase fue de 81.83 ± 27.88 segundos
(p<0.05).
Grupo Piroxicam
(Resultados comparados con respecto al Control Salino)
En la dosis de 1 mg/kg, el tiempo promedio de lamidos durante la primera fase fue
de 92.30 ± 9.61 segundos (p<0.05) y en la segunda fase fue de 99.50 ± 14.85 segundos
(NS).
En la dosis de 3 mg/kg, el tiempo promedio de lamidos durante la primera fase fue
de 81,83 ± 16.71 segundos (p<0.05) y en la segunda fase fue de 103.75 ± 20.25 segundos
(NS).
26
En la dosis de 10 mg/kg, el tiempo promedio de lamidos durante la primera fase fue
de 71.33 ± 19.98 segundos (p<0.05) y en la segunda fase fue de 94.86 ± 16.36 segundos
(p<0.05).
En la dosis de 30 mg/kg, el tiempo promedio de lamidos durante la primera fase fue
de 33.20 ± 18.58 segundos (p<0.05) y en la segunda fase fue de 96.20 ± 23.44 segundos
(p<0.05).
Grupo Parecoxib- L_NAME
(Resultados comparados con respecto al Grupo Parecoxib)
Cabe recordar que en este grupo se inyectó previamente una dosis de 5 mg/kg de
L_NAME.
En la dosis de 0.3 mg/kg, el tiempo promedio de lamidos durante la primera fase fue
de 87.50 ± 10.10 segundos (NS) y en la segunda fase fue de 101.20 ± 17.05 segundos (NS).
En la dosis de 1 mg/kg, el tiempo promedio de lamidos durante la primera fase fue
de 68 ± 12.74 segundos (NS) y en la segunda fase fue de 47.17 ± 14.07 segundos
(p<0.05).
En la dosis de 3 mg/kg, el tiempo promedio de lamidos durante la primera fase fue
de 64.33 ± 12.40 segundos (NS) y en la segunda fase fue de 41.67 ± 13.77 segundos
(p<0.05).
En la dosis de 10 mg/kg, el tiempo promedio de lamidos durante la primera fase fue
de 78 ± 12,64 segundos (p<0.05) y en la segunda fase fue de 40.16 ± 20.26 segundos
(p<0.05).
27
Grupo Parecoxib- 7-Nitroindazol
(Resultados comparados con respecto al Grupo Parecoxib)
Cabe recordar que en este grupo se inyectó previamente una dosis de 5 mg/kg de 7-
Nitroindazol.
En la dosis de 0.3 mg/kg, el tiempo promedio de lamidos durante la primera fase fue
de 2 ± 1.60 segundos (p<0.05) y en la segunda fase fue de 0 ± 0.00 segundos (p<0.05).
En la dosis de 1 mg/kg, el tiempo promedio de lamidos durante la primera fase fue
de 2 ± 1.50 segundos (p<0.05) y en la segunda fase fue de 0 ± 0.00 segundos
(p<0.05).
En la dosis de 3 mg/kg, el tiempo promedio de lamidos durante la primera fase fue
de 3.17 ± 1.45 segundos (NS) y en la segunda fase fue de 0 ± 0.00 segundos (p<0.05).
En la dosis de 10 mg/kg, el tiempo promedio de lamidos durante la primera fase fue
de 2.50 ± 12.64 segundos (NS) y en la segunda fase fue de 0 ± 0.00 segundos (p<0.05).
Grupo Piroxicam- L_NAME
(Resultados comparados con respecto al Grupo Piroxicam)
Cabe recordar que en este grupo se inyectó previamente una dosis de 5 mg/kg de L-
NAME.
En la dosis de 1 mg/kg, el tiempo promedio de lamidos durante la primera fase fue
de 83 ± 12.06 segundos (NS) y en la segunda fase fue de 77.25 ± 14.80 segundos (NS).
En la dosis de 3 mg/kg, el tiempo promedio de lamidos durante la primera fase fue
de 89.83 ± 8.15 segundos (NS) y en la segunda fase fue de 69.75 ± 19.78 segundos (NS).
28
En la dosis de 10 mg/kg, el tiempo promedio de lamidos durante la primera fase fue
de 78.83 ± 5.92 segundos (NS) y en la segunda fase fue de 47 ± 12.72 segundos (NS).
En la dosis de 30 mg/kg, el tiempo promedio de lamidos durante la primera fase fue
de 61 ± 11.41 segundos (NS) y en la segunda fase fue de 42 ± 19.06 segundos (NS).
Grupo Piroxicam –7 Nitroindazol
(Resultados comparados con respecto al Grupo Piroxicam)
Cabe recordar que en este grupo se inyectó previamente una dosis de 5 mg/kg de 7-
Nitroindazol.
En la dosis de 1 mg/kg, el tiempo promedio de lamidos durante la primera fase fue
de 37 ± 4,78 segundos (p<0.05) y en la segunda fase fue de 17,17 ± 17,10 segundos
(p<0.05).
En la dosis de 3 mg/kg, el tiempo promedio de lamidos durante la primera fase fue
de 17 ± 6,68 segundos (p<0.05) y en la segunda fase fue de 0,001 ± 16,89 segundos
(p<0.05).
En la dosis de 10 mg/kg, el tiempo promedio de lamidos durante la primera fase fue
de 11,2 ± 4,68 segundos (NS) y en la segunda fase fue de 0,6 ± 0,60 segundos (p<0.05).
En la dosis de 30 mg/kg, el tiempo promedio de lamidos durante la primera fase fue
de 2,4 ± 1,47 segundos (NS) y en la segunda fase fue de 4 ± 2,73 segundos (p<0.05).
29
DISCUSIÓN
Los principales efectos terapéuticos, así como los efectos adversos de los AINEs se
pueden explicar por su efecto inhibidor de las ciclooxigenasas (COX), enzimas que
convierten el acido araquidónico en prostaglandinas (PG) y tromboxanos. Actualmente se
ha demostrado la existencia de tres isoformas de COX, 1, 2 y 3, con funciones fisiológicas,
patológicas y ubicación bien definidas (Chandrasekharan, 2002, Florez, 2003).
La mayoría de los AINEs actualmente disponibles inhiben a concentraciones terapéuticas,
en forma no-selectiva ambas isoformas de COX, la 1 y la 2, como lo hace el piroxicam,
pero existen AINEs selectivos en su acción sobre las COX-2, como el parecoxib.
El comportamiento de los AINEs en estudio, piroxicam y parecoxib, demostraron
por la curva dosis-respuesta obtenida, su claro efecto analgésico en el test algesiométrico de
la formalina, corroborando un sinnúmero de estudios al respecto. Cabe hacer notar que a
dosis equimolares, la acción antinociceptiva del parecoxib es casi el doble de efectiva que
la acción del piroxicam. Esta diferencia en efectividad antinociceptiva, se explica en parte
por su acción selectiva a nivel de la isoforma COX-2, frente a una noxa de tipo
inflamatorio, como sería el caso de la sustancia algógena utilizada en este test
algesiométrico (formalina subcutánea).
Por otro lado, es sabido que el oxido nítrico se sintetiza por tres isoformas de oxido
nítrico sintasa (NOS) con funciones y ubicaciones diferentes, y que participa como
neurotransmisor en el SNC y periférico, siendo la nNOS (neuronal) la mas involucrada en
el proceso de neurotransmisión del dolor a nivel central, interactuando con los receptores de
NMDA y facilitando los input aferentes espinales sobre los reflejos nociceptivos (Espluges,
2002).
Al utilizar L-NAME, un inhibidor no especifico de la NOS, la inhibición del NO
tiene un efecto antinociceptivo cuando se estimulan los terminales nerviosos periféricos
químicos y en modelos de hiperalgesia o dolor visceral, pero en cambio exacerba el dolor
en problemas de hiperalgesia mecánica (Hernandez, 2005). En este estudio el L-NAME no
produjo un efecto antinociceptivo, pese a que el test usa un estimulo químico periférico
(formalina), y solo logra un cambio significativo en la segunda fase (inflamatoria del test)
revirtiendo el efecto algésico.
30
Con respecto a la interacción de L-NAME con los AINEs, no se obtuvo ningún cambio
significativo, ni antagonismo ni sinergismo, en la acción antinociceptiva de piroxicam, y
una tendencia significativa a revertir el efecto de la segunda fase en el accionar del
parecoxib, de lo cual se deduce que la inhibición no selectiva no induce cambios en el
mecanismo de acción de los AINEs en estudio.
El 7-NI es un potente inhibidor mas selectivo para la NOS, acción ejercida sobre la
NOS cerebral y sin afectar las otras dos isoformas periféricas (Wangensteen et al., 2006).
Por otra parte la interacción entre COX y NO ha sido estudiada en numerosos trabajos,
muchos de los cuales con resultados contradictorios. Algunos estudios indican que el NO
estimula la síntesis de PGs por la COX, mientras que otros observan inhibición de la
enzima ante el NO (Goodwin y cols., 1999). Otros estudios han demostrado que la
exposición a NO produce una activación de la COX-1 y una inhibición de la COX-2,
explicando los resultados contradictorios de la literatura, a que el NO afectaba a distintas
isoformas de la COX (Clancy y cols., 2000).
Los resultados obtenidos con 7-NI suprimieron por completo la respuesta
nociceptiva de formalina, tanto en la fase algésica, como en la fase inflamatoria, resultado
que está en concordancia con la acción del NO en la respuesta hiperalgésica visceral y en
estímulos periféricos químicos, y debido a la dosis empleada (5 mg/kg) que resultó ser muy
potente. Por esta misma razón, en cuanto a la interacción entre este inhibidor de la NOS
central con los AINEs en estudio, no podemos concluir si la antinocicepción se debe a la
sinergia entre ambas sustancias, o solamente a la acción potente del 7-NI, sinergia que fue
mas marcada con el parecoxib, llevando los valores prácticamente a un tiempo de lamido
igual a cero.
Por estas razones, nuestra hipótesis es rechazada, aunque los resultados obtenidos
no son categóricos ni para afirmar que el sistema nitridérgico modula el efecto
antinociceptivo de los AINEs en estudio, parecoxib y piroxicam, ni tampoco en postular
que el NO no participa modulando la acción de las PG en el mecanismo de acción
antinociceptivo de dichos AINEs. Recientemente, otras investigaciones han propuesto que
el efecto final de la actividad modulatoria del NO en las COXs no es único, puesto que el
NO endógeno, así como dadores de NO, inician y detienen la vía de las COXs,
dependiendo de los niveles basales de NO liberado, de los tipos celulares en los cuales se
31
produce la biosíntesis de PGs y de la intensidad del estímulo utilizado para liberar las PGs
(Mollace y cols., 2005).
CONCLUSIÓN
• Tal como ya se ha demostrado antes, corroboramos que Parecoxib y
piroxicam son fármacos que poseen actividad antinociceptiva al ser
administrados por vía i.p. lo que demuestra una acción segmentaria.
• El efecto antinociceptivo de parecoxib y piroxicam es del tipo dosis-
dependiente en el test de la formalina, confirmando lo que se ha dicho en un
sinnúmero de investigaciones anteriores.
• En el efecto antinociceptivo de parecoxib y piroxicam no es posible
demostrar la acción neuromoduladora nitridérgica empleando el test de la
formalina, en las dosis empleadas.
PROYECCIONES
Estudiar la posible interacción utilizando un antiinflamatorio no-esteroidal
inhibidor específico de COX-3, para ver si existe relación en la modulación del
dolor con L-NAME y con 7-nitroindazol, en el test de la formalina.
Utilizar fármacos inhibidores de COX-1, COX-2 o COX-3, pero con diferentes
ensayos algesiométricos y así conocer si tienen alguna relación con el sistema
nitridérgico, utilizando inhibidores de la oxido nitrico sintasa no selectivos y
selectivos. Luego, los resultados entre cada test se pueden comparar para
conocer la especificidad de cada uno de ellos.
32
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36
ANEXO 1: PRESENTACIÓN DE RESULTADOS
Gráfico 1. Curva dosis-respuesta del Piroxicam i.p. en el ensayo algesiométrico de la formalina. Primera fase.
Gráfico 2. Curva dosis-respuesta del Piroxicam i.p. en el ensayo algesiométrico de la formalina. Segunda fase.
Curva Dosis-Respuesta Piroxicam 20-30 minutos
0
30
60
90
120
150
180
Control 1 3 10 30
Dosis (mg/kg)
Tiem
po d
e La
mid
os (s
eg)
Curva Dosis-Respuesta Piroxicam 0-5 minutos
0
30
60
90
120
150
Control 1 3 10 30
Dosis (mg/kg)
tiem
po L
amid
os (s
eg)
Control Salino
p<0.05, respecto al control salino
p<0.05, respecto al control salino
Control Salino
37
Gráfico 3. Curva dosis-respuesta del Parecoxib i.p. en el ensayo algesiométrico de la formalina. Primera fase.
Gráfico 4. Curva dosis-respuesta del Parecoxib i.p. en el ensayo algesiométrico de la formalina. Segunda fase.
Curva Dosis-Respuesta Parecoxib 20-30 minutos
030
6090
120150
180210
Control 0,3 1 3 10
Dosis (mg/kg)
Tiem
po L
amid
os (s
eg)
Curva Dosis-Respuesta Parecoxib 0-5 minutos
0
30
60
90
120
150
Control 0,3 1 3 10
Dosis (mg/kg)
Tiem
po L
amid
os (s
eg)
Control Salino
Control Salino
p<0.05, respecto al control salino
p<0.05, respecto al control salino
38
Gráfico 5. Curva dosis-respuesta del Piroxicam/L-Name i.p. en el ensayo algesiométrico de la formalina. Primera fase. Gráfico 6. Curva dosis-respuesta del Piroxicam/L-Name i.p. en el ensayo algesiométrico de la formalina. Segunda fase.
0
50
100
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2000
- 5 m
inTi
empo
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Lam
ido,
s
*
C 1 3 10 30 A
Piroxicam/L-NAME, 0-5 min
0
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20 -
30 m
inTi
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Lam
ido,
s
C 1 3 10 30 A
Piroxicam/L-NAME, 20-30 min
p<0.05, respecto al grupo Piroxicam
p<0.05, respecto al grupo Piroxicam
39
Gráfico 7. Curva dosis-respuesta del Parecoxib/L-Name i.p. en el ensayo algesiométrico de la formalina. Primera fase. Gráfico 8. Curva dosis-respuesta del Parecoxib/L-Name i.p. en el ensayo algesiométrico de la formalina. Segunda fase.
0
50
100
150
2000
- 5 m
inTi
empo
de
Lam
ido,
sParecoxib/L-NAME, 0-5 min
C 0,3 1 3 10 A
0
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200
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30 m
inTi
empo
de
Lam
ido,
s
C 0,3 1 3 10 A
Parecoxib/L-NAME, 20-30 min
p<0.05, respecto al grupo Parecoxib
p<0.05, respecto al grupo Parecoxib
40
Gráfico 9. Curva dosis-respuesta del Piroxicam/7-Nitroindazol i.p. en el ensayo algesiométrico de la formalina. Primera fase. Gráfico 10. Curva dosis-respuesta del Piroxicam/7-Nitroindazol i.p. en el ensayo algesiométrico de la formalina. Segunda fase.
0
50
100
150
200
0 - 5
min
Tiem
po d
e la
mid
o, s
*
C 1 3 10 30 A
Piroxicam/7-Nitro, 0-5 min
0
50
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150
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20 -
30 m
inTi
empo
de
lam
ido,
s
C 1 3 10 30 A
Piroxicam/7-Nitro, 20-30 min
p<0.05, respecto al grupo Piroxicam
p<0.05, respecto al grupo Piroxicam
41
Gráfico 11. Curva dosis-respuesta del Parecoxib/7-Nitroindazol i.p. en el ensayo algesiométrico de la formalina. Primera fase. Gráfico 12. Curva dosis-respuesta del Parecoxib/7-Nitroindazol i.p. en el ensayo algesiométrico de la formalina. Segunda fase.
0
50
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- 5 m
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Lam
ido,
s
C 0,3 1 3 10 A
Parecoxib/7-Nitro, 0-5 min
0
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150
200
20 -
30 m
inTi
empo
de
Lam
ido,
s
C 0,3 1 3 10 A
Parecoxib/7-Nitro, 20-30 min
p<0.05, respecto al grupo Parecoxib
p<0.05, respecto al grupo Parecoxib
42
ANEXO 2 : PROTOCOLO EXPERIMENTAL TEST DE LA
FORMALINA
- Grupo Control Salino
Grupo de 6 ratones de la cepa CF/1 (Mus musculus) inyectados con una solución
salina al 0.9%. total de 6 ratones.
- Grupo Control/L-NAME
Grupo de 6 ratones de la cepa CF/1 (Mus musculus) inyectados con 5 mg/Kg. de L-
NAME previa a la administración de formalina. Total de 6 ratones.
- Grupo Control/7- Nitroindazol
Grupo de 6 ratones de la cepa CF/1 (Mus musculus) inyectados con 5 mg/Kg. de 7-
nitroindazol previa a la administración de formalina. Total de 6 ratones
- Grupo Piroxicam/L-NAME
Grupo de 6 ratones de la cepa CF/1 (Mus musculus) con dosis de 5 mg/kg de L-
NAME y dosis de 1, 3, 10 y 30 mg/kg de piroxicam. Total de 24 ratones.
- Grupo Parecoxib/L-NAME
Grupo de 6 ratones de la cepa CF/1 (Mus musculus) con dosis de 5 mg/kg de L-
NAME y dosis de 0.3, 1, 3 y 10 mg/kg de parecoxib. Total de 24 ratones.
43
- Grupo Piroxicam/7- Nitroindazol
Grupo de 6 ratones de la cepa CF/1 (Mus musculus) con dosis de 5mg/kg 7-
nitroindazol y dosis de piroxicam de 1, 3, 10 y 30 mg/kg. Total de 24 ratones.
- Grupo Parecoxib/ 7- Nitroindazol
Grupo de 6 ratones de la cepa CF/1 (Mus musculus) con dosis de 5mg/kg 7-
nitroindazol y dosis de parecoxib de 0.3, 1, 3 y 10 mg/kg. Total de 24 ratones.
44
ANEXO 3: Tabla 1. Evaluación del dolor en el ensayo algesiométrico utilizando Parecoxib y Piroxicam en presencia o ausencia de L-NAME y 7-Nitro
Grupos Dosis Primera Fase de 0 a 5 minutos Segunda fase de 20 a 30 minutos
(mg/Kg) Promedio de Lamidos (seg) ± ES P Promedio de Lamidos (seg) ± ES P
Control Salino 126,38 ± 8.48 155,65 ± 10,20
Control L-NAME 113,5 ± 15,41 NS 94 ± 12,91 p < 0.05(c/r al Control Salino)
Control 7 - Nitro-indazol 1,67 ± 1,09 p < 0.05 0 ± 00 p < 0.05
(c/r al Control Salino)
0,3 84,50 ± 16.72 NS 117,25 ± 13,20 p < 0.05Parecoxib 1 55,83 ± 12,82 p < 0.05 126,00 ± 12,66 p < 0.05
(c/r al Control Salino) 3 36,40 ± 15,64 p < 0.05 119,33 ± 12,50 p < 0.0510 30,00 ± 10,02 p < 0.05 81,83 ± 27,88 p < 0.05
1 92,30 ± 9,61 p < 0.05 99,50 ± 14,85 NSPiroxicam 3 81,83 ± 16,71 p < 0.05 103,75 ± 20,25 NS
(c/r al Control Salino) 10 71,33 ± 19,98 p < 0.05 94,86 ± 16,36 p < 0.0530 33,20 ± 18,58 p < 0.05 96,20 ± 23,44 p < 0.05
0,3 87,5 ± 10,10 NS 101,2 ± 17,05 NSParecoxib/L-NAME 1 68 ± 12,94 NS 47,17 ± 14,07 p < 0.05
(c/r al Grupo Parecoxib) 3 64,33 ± 12,40 NS 41,67 ± 13,77 p < 0.0510 78 ± 12,64 p < 0.05 40,16 ± 20,26 NS
Parecoxib/ 7-Nitro- 0,3 2 ± 1,60 p < 0.05 0 ± 00 p < 0.05indazol 1 2 ± 1,50 p < 0.05 0 ± 00 p < 0.05
(c/r al Grupo Parecoxib) 3 3,17 ± 1,45 NS 0 ± 00 p < 0.0510 2,5 ± 12,64 NS 0 ± 00 p < 0.05
1 83,00 ± 12,06 NS 77,25 ± 14,80 NSPiroxicam/ L-NAME 3 89,83 ± 8,15 NS 69,75 ± 19,78 NS
(c/r al Grupo Piroxicam) 10 78,83 ± 5,92 NS 47,00 ± 12,72 NS30 61,00 ± 11,41 NS 42,00 ± 19,06 NS
Piroxicam/ 7-Nitro- 1 37 ± 4,78 p < 0.05 17,17 ± 17,10 p < 0.05indazol 3 17 ± 6,68 p < 0.05 0,001 ± 16,89 p < 0.05
(c/r al Grupo Piroxicam) 10 11,2 ± 4,68 NS 0,6 ± 0,6 p < 0.0530 2,4 ± 1,47 NS 4 ± 2,73 p < 0.05