Interacciones Genéticas Sintéticas - FBMC · Identificar todos los genes, las proteínas y sus...
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Interacciones Genéticas Sintéticas
Gen A(mutante)
Gen B(mutante)
Gen A (mutante)Gen B (mutante)
Monday, October 22, 12
No es suficiente para entender cómo vuelva el
avión
?
Identificar todos los genes, las proteínas y sus conecciones en un organismo es como tener la lista completa de las partes y del plano de un avión.
Luego de la reducción, la integración
Monday, October 22, 12
Por qué estudiar interacciones genéticas sintéticas?
1- Para entender la “homeostasis molecular”
2- Para entender como el genotipo se traduce en fenotipo
3- Para entender cómo funciona la célula
Monday, October 22, 12
Homeostasis molecular
Cómo interactúan los productos génicos (interactiones sintéticas)
Cómo se logra rubustez ante cambios ambientales o cambios genéticos.
Cómo es que una célula con aberraciones cromosómicas, no solo sobrevive sino que prolifera (cáncer)
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Genotipo y fenotipo
Cómo se compensa la variabilidad genética (buffering). Es decir, cómo predecir en qué casos un gen mutado va a llevar a enfermedad y en qué casos no,etc.
Hay aproximadamente 1 SNP c/1000pb en el genoma humano
?
Monday, October 22, 12
Geno%po''''(''''Feno%poAún'las'enfermedades'gené%cas'que'se'heredan'en'forma'mendeliana'
(causadas'por'un'gen)'se'heredan'en'forma'compleja,'cuan%ta%va
La'misma'mutación'%ene'efectos'diferentes'en'dis%ntos'hijos
Interacción*con*el*resto*del*geno0po
Monday, October 22, 12
Geno%po''''(''''Feno%po
Ejemplo:'fenilcetonuria'(PKU)autosómica*+>*gen*PHA*(fenilalanina*hydroxilasa)*funciona*mal*o*nada
PHA5A104Dsuave
26%'ac%vidad'total
PHA5R154Nsevera
4%'ac%vidad'total
igual*catálisismás*proteína menos*proteína
estabilidad proteasas,'chaperonas
Interacción*con*el*resto*del*geno0posupresores
enhancers
modificadores
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CanalizaciónWaddington 1942
tiempode desarrollo
celula en diferenciación
Destinos posiblesCómo se logra que sean tan discretos estos destinos, teniendo en cuenta la variabilidad ambiental/genética?
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Canalization
(Buffering)
Distribución fenotípica
Frec
uenc
ia
Carácter en ambientefavorable
Carácter NO canalizado luego de perturbación (genética o ambiental)
Carácter canalizado luego de perturbación (genética o ambiental)
Jaroz&Lindquist, AnnRevGen2010
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El problema de los organismos modelo
Endocriados escasa/nula variación alélica
No se ha explorado la complejidad de la variación natural
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Interactoma(IP+MALDI)
2010
S.*cerevisiae
'Mucha'información
Chips*de*proteínas
2001
Cerveza*y*pan*(Babilonia,*Egipto)
6000+3000*a.C.******
Genoma*secuenciado
1996
**Chips*de*DNA
1997
Localizoma(fusión*a*GFP)
2003
Interactoma(SGA)
2004
'Hongo'unicelular
•'1996'función'asociada'a'30%'de'los'genes•'2011'aumentó'a'90%
11
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Similitud'con'humanos
•*17%*de*los*genes*ortólogos*de*levaduras*están*asociados*a*enfermedades*humanas
•*Muchos*de*los*genes*de*humanos*están*representados*en*levaduras
Ventaja'de'levaduras
Levaduras**vs.**humanos
•*Menor*complejidad
•*6000*genes*vs.*25000
•*No*hay*splicing*alternaYvo*+>*menos*proteínas*
•*Mucha*información
•*Fácil*manipulación
•*Velocidad*de*trabajo
•*Económico
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Tetradas(meiosis y esporulación)
Ciclo Vegetativo ciclo(mitótico)
Pseudohifas(crecimiento tipo filamentoso)
Shmoos(ciclo sexual)
dipliode
haploide
Ciclo de vida de S.cerevisiae
Pseudohifas(crecimiento tipo filamentoso)
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M
G1
S
G2Metafase
Anafase
Telofase
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Hoepfner et al, MCB 2000(Philippsen lab, Suiza)
10 min/sec
Dinámica nuclear durante el ciclo celular(histona H4, Hhf2-GFP)
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Hoepfner et al, MCB 2000(Philippsen lab, Suiza)
Jakobs et al JCS 2003(Stefan W Hell lab, Alemania)
GFP-Tub1
20 min/sec
mls-GFP
Dinámica de los microtúbulos y la mitocondria
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Genética: Perturbar para entender cómo funcionan los organismos ->
“ingeniería reversa”
? tomar un objeto/sistema que no sé cómo funcionadesarmarlotestear como funciona sacando/cambiando partesderivar los principios generales del “diseño”hacer otro con el mismo principio, igual o mejor
Ingeniería
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Cuán informativas son las mutaciones únicas?
El ~20% de los genes en S.cerevisiae son esenciales.
Gen esencial: su deleción impide el crecimiento en medio rico con glucosa
y el resto?
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Distribución de “tasas de crecimiento máximo” entre 750 cepas knock out en medio completo (YPD).
Datos de Jasnos & Korona (Evolution 2009)
wt
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Distribución de “coeficientes de selección” entre las cepas knock out viables en medio completo (YPD).
©2010 by The Royal Society
Datos de Steinmetz et al. (Nature Genetics 2002)
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• Muchas de las proteínas no son necesarias en la condición donde se testeó el fitness
• S.cerevisiae es robusta a perturbaciones genéticas/ambientales y eso se debe a redundancia a nivel génico y de sistema
Otras explicaciones (más probables)
!Combinar perturbaciones genéticas!
Una posible explicación: S.cerevisiae usa sólo el 20% del genoma
BufferingHipótesis:
los mecanismos de bufferinggenético se solapan con los
mecanismos de buffering ambiental
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El problema con hacer perturbaciones combinadas es que es combinatorial
200 screens genómicos/mesLaboratorio de Charlie Boone (Synthetic Genetic Array technology)
Consideremos la levadura, ~6000 genes
~18 million pares ~ 1010 triples
Es indispensable usar técnicas “High throughput”
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Tecnologías experimentales para estudiar interacciones genéticas
• Synthetic Genetic Arrays (SGA)
• Epistatic Mini Array Profiles (EMAP)
• Diploid-based Synthetic Lethality Analysis with Microarrays (dSLAM)
• Genetic Interaction Mapping (GIM)
• Combinatorial RNAi-based screens
(Para colonias: yeast, bacteria)
(Microarray-based, or colony yeast)
(Worm, Drosophila, mammalian systems)
Tong, A.H.Y. et al. Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants. Science 294, 2364-2368 (2001).Schuldiner et al: Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell 2005, 123(3):507-519.Pan et al.: dSLAM analysis of genome-wide genetic interactions in Saccharomyces cerevisiae. Methods 2007, 41(2):206-221. Decourty et al.: Linking functionally related genes by sensitive and quantitative characterization of genetic interaction profiles. Proc Natl Acad Sci U S A 2008, 105(15):5821-5826.Lehner et al. Systematic mapping of genetic interactions in Caenorhabditis elegans identifies common modifiers of diverse signaling pathways. Nat Genet 2006, 38(8):896-903.
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Cuántos “screens” ya hechos...
• Levaduras– S. cerevisiae:
• >5 million dobles– S. pombe:
• ~200k dobles• E. coli
• ~100k dobles• Worm
• ~75k dobles• Human
• Algunos estudios de pequeña escala
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• Technología: Como medir interacciones (con foco en levadura)?
• Analisis: Qué podemos aprender?
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Robots
Laboratorio de Charlie Boone (U. Toronto)
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http://www.blitzconditioning.com/files/2012/02/genetic-274x300.jpg
Tong et al, Science, 2001.
SGA: synthetic genetic analysis
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http://www.blitzconditioning.com/files/2012/02/genetic-274x300.jpg
! Crecimiento residual (círculos amarillos) es donde hay interacción letal/enferma
! bni1 + bnr1 y bni1 + cla4 dobles KO son inviables (no forman colonias)
! bni1 + bud6 doble KO tienen un defecto sintético de crecimiento (enfermas, flechas amarillas).
Tong et al, Science, 2001.
SGA: synthetic genetic analysisY se evalúa el crecimiento…
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http://www.blitzconditioning.com/files/2012/02/genetic-274x300.jpgRepaso Meiosis
Analizar las tétradas no es más que observar el resultado de la meiosis.
El diploide es 2n: tiene 2 cromosomas de cada uno de los 16pero el ADN se duplica antes de empezar la meiosis, de modo que hay 2 cromosomas con 2 cromátidas idénticas.
En profase I los cromosomas se alinean y ocurre recombinación homóloga.
Luego, durante la primera división meiótica se separan los cromosomas homólogos
En la segunda división se separan las cromátidas hermanas, cada espora representa esencialmente, una cromátida
Profase I
Anafase I
Meiosis II
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http://www.blitzconditioning.com/files/2012/02/genetic-274x300.jpg
Las interacciones sintéticas letales identifican pathways o complejos
Función esencial
Respuesta esencial
Función esencial
Pathways paralelos Subunidades de complejos
Prevención del daño o respuesta a él
daño
Interacciones sintéticasQué clase de relaciones entre genes se pueden
detectar?
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http://www.blitzconditioning.com/files/2012/02/genetic-274x300.jpg
Tong et al, Science, 2001.
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Una medida quantitativa de interacción genética
Fitness esperado
Epistasis negativa
Epistasis Positiva
observada esperada
observadaMonday, October 22, 12
Synthetic Genetic Array
SGA cuantitativo
Fitness esperado
Epistasis negativa
Epistasis Positiva
observada esperada
observada
midiendo el tamaño de las colonias
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Michael Costanzo,1,2* Anastasia Baryshnikova,1,2* Jeremy Bellay,3 Yungil Kim,3 Eric D. Spear,4Carolyn S. Sevier,4 Huiming Ding,1,2 Judice L.Y. Koh,1,2 Kiana Toufighi,1,2 Sara Mostafavi,1,5
Jeany Prinz,1,2 Robert P. St. Onge,6 Benjamin VanderSluis,3 Taras Makhnevych,71,2 1,2 1,2 1,2 1,2 Franco J. Vizeacoumar, Solmaz Alizadeh, Sondra Bahr, Renee L. Brost, Yiqun Chen,Murat Cokol,8 Raamesh Deshpande,3 Zhijian Li,1,2 Zhen-Yuan Lin,9 Wendy Liang,1,2
Michaela Marback,1,2 Jadine Paw,1,2 Bryan-Joseph San Luis,1,2 Ermira Shuteriqi,1,2
Amy Hin Yan Tong,1,2 Nydia van Dyk,1,2 Iain M. Wallace,1,2,10 Joseph A. Whitney,1,5
Matthew T. Weirauch,11 Guoqing Zhong,1,2 Hongwei Zhu,1,2 Walid A. Houry,7 Michael Brudno,1,5
12 13 13 8 2,10 Sasan Ragibizadeh, Balázs Papp, Csaba Pál, Frederick P. Roth, Guri Giaever,Corey Nislow,1,2 Olga G. Troyanskaya,14 Howard Bussey,15 Gary D. Bader,1,2
Anne-Claude Gingras,9 Quaid D. Morris,1,2,5 Philip M. Kim,1,2 Chris A. Kaiser,4 Chad L. Myers,3† Brenda J. Andrews,1,2† Charles Boone1,2†
Science 20
10
5.4 millones de pares(>75% de todos los genes con perfil cuantitativo de interacciones genétics)
~170 000 interacciones genéticas!procesos biológicos similares se agrupan juntosconexiones entro TODOS los procesos biológicos
el “paisaje” genético da claves sobre la acción de drogas y sirve para identificar targets.
intensa pleiotropía funcional
1712 genes contra toda la colección de knock outs no esenciales
The Genetic Landscape of a Cell
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Distribución+global+de+interac2onsNú
mero
de
pare
s
Neg: ~110k, Pos: ~60k
observada
Grado de interacción genética
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Vista global 2D de la red de interacciones en yeast
Array*genes
Que
ry*gen
es~*1800*x*4000*genes*(~6*million)*pairs*
nega%ve posi%ve
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RAD55RAD57RAD51RAD54RAD52
RAD5
5RA
D57
RAD5
1RA
D54
RAD5
2
REV7
REV1
REV3
RAD55RAD57RAD51RAD54RAD52
Interacciones dentro de complejos/
pathways
Interacciones Entre pathways
(compensatorias)
Positivo Negativo
Función esencial
(reparación del ADN)
Matriz de interacción
Interpretación en formato lógico
enzimas de síntesis de
ADN translesión
enzimas que reparan ADN
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http://www.blitzconditioning.com/files/2012/02/genetic-274x300.jpg
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Un+mapa+mul2escala
Nivel*Global
Nivel*Proceso
Nivel*Pathway/complejo
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Gene ontology (GO)Una sistema de organización de la información de los genes para poder informaticarla
Es “tratable” en forma computacional, ya que usa palabras estandar
Para cada gene describe 3 dominios:
Componente celular
Función molecular
Proceso biológico
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F� factor
Fus3
Pheromone Pathway
Cytoplasma
Nucleo Ste12
Ste7
Kss1
PPKss1
Ste5
PP
Fus3Fus3
MAPKKKMAPKKMAPK
Ste18Ste2
Gpa1 Ste4 Cdc24
Ste20
Ste50
Cdc24Cdc42
Ste11
Genes respondedoresApareamiento
http://www.blitzconditioning.com/files/2012/02/genetic-274x300.jpg
Ejemplo'GO
Fus3Molecular Function
Manually curated•! MAP kinase activity (IDA)
High-throughput•! protein kinase activity (IDA)
Biological Process
Manually curated•! cell cycle arrest (IMP)•! invasive growth in response to glucose limitation (IMP)•! negative regulation of MAPK cascade (IPI)•! negative regulation of transposition, RNA-
mediated (IMP)•! pheromone-dependent signal transduction involved in
conjugation with cellular fusion (IDA)•! protein phosphorylation (IDA)
High-throughput•! protein phosphorylation (IDA)
Cellular Component
Manually curated•! cytoplasm (IDA)•! mating projection tip (IDA)•! nucleus (IDA)
High-throughput•! mitochondrion (IDA)
http://yeastgenome.org
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http://www.blitzconditioning.com/files/2012/02/genetic-274x300.jpgLas interacciones genéticas
conectan funciones
42
Tong&Boone Science 2004
Cada nodoes un atributo de GO(hay ~300 000 atributos)
Cada línea conectora (edge)representa interacciones genéticas entre gene
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Las interacciones entre pathways y complejos de complejos son MONOcromáticas
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Los “hubs” de redes genéticas
El 10% hubs connect ~ al 40% de todas las interacciones
Distribución de grados de conexión
Número de interacciones (%)
Frac
ción
de
gene
s
HUBs
en general muestrandefectos aún comodeleción simple
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Propiedades de los HUBs
Se expresan más
Están más conservados
Menos duplicados, etc.
Evolucionan más lento (dN/dS)-> restricción evolutiva
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Genes muestran sesgo respecto del tipo de interacciones que tienen
Distribución de interaccciones
Positivas/negativas
Traducción, procesamiento de
rRNA y degradacion de
mRNAs
Ciclo celular!
Frac
ción
de
gene
s
Positivos:negativos
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Segregación'cromosómica/Nocodazole
Replicación'DNA'&'repación/Hydroxiurea'
Glycosilación'&'pared'celular/Tunicamicina
Se+puede+usar+el+mapa+para+iden2ficar+targets+de+drogas
Monday, October 22, 12
Como se pueden usar las interacciones genétcias para estudiar/tratar enfermedades?
Mensaje: Las interacciones genéticas nos revelan vulnerabilidades ocultas, que se pueden explotar
Supongamos que:
(1) gen humano A, y gen B tienen interacción genética (son sintéticos letales)
(2) mutationes en A están asociadas al cáncer
Célula tumoral
Célula normal
A
A
+ B(diseño de droga que
inhiba a B)
AB
AB
Célula muere!
Célula vive
Monday, October 22, 12
BRCA1: supresor tumoral de cancer de mama
Mutantes BRCA1 son completamente dependientes de PARP1 (poly ADP ribosa polymerase)
PARP1 no es esencial para la función de la célula normal
=> Un inhibidor de PARP1 ya está en ensayos clínicos Maxwell et al. Molecular Cancer (2008).
~25,000 synthetic letales entre ortólogos humanos
Ejemplo real:
Monday, October 22, 12
Highlights IG en levaduras
Inmensa cobertura, casi toda la célula explorada
Las IG revelan funciones -> GO vs IG
Las IG revelan cómo se conectan las funciones entre sí GO1 <-> IG <-> GO2
Vía las IG, se puede estudiar la accion de drogas y diseñar nuevas -> investigación translacional
El análisis de las IG globales permite un nivel de abstracción mayor al molecular -> biología de sistemas
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Determinación de la concentración externa de
feromona
d αa
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Las cascadas de MAP kinasas en S.cerevisiae
54
α factorHiper-osmolaridad Stress a la pared celular:
hipo-osmolaridadtemperatura
MAPKKK
MAPKK
MAPK
MAPKKK
MAPKK
MAPK
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Mission Control La respuesta a feromona lleva a una decisión
sobre el destino celular
Nolan et al, MBC 2006
MATa cells express GFPMATα cells express DsRed
a α
a factor
α factor
Cigotaa/α
Arresto en G1
shmoo
Antes
durante
Después
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Mission Control
sin gradiente de α factor con gradietne de α factor
Buscando al compañero
Segall PNAS 1993
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Mission Control Encontrar al compañero es un problema de
contar con la información correcta
concentración de feromona externad αa
Gradiente
Información sobre:
Distancia
Dirección
El único sensor es el receptor de feromona
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Mission Control
Dos determinationes para realizar
highmediumlow
concentration determination gradient direction determination
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La#ruta#de#respuesta#a#feromona#en#S.cerevisiae
antes durante
•Arresto'del'ciclo'celular'en'G1'(START)•Cambios'morfológicos'(shmoo)•Inducción'de'genes'de'apareamiento
Monday, October 22, 12
Bar1
Sst2
Msg5
Cdc28
Cln2
Dinámica de la activación de la ruta de respuesta a feromona (feedbacks y escalas de tiempo)
Rápido fb (sec)
Lento fb positivo (min)
Lento fb negativo
Far1 -P
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La respuesta transcripcional a α factor es estable en el tiempo
factor (nM)
PPR
M1-
mC
herry
(A.U
.)
10-1 100 101
400
800
1200
time EC50 dEC50 nHill dnHill 45.00000 3.63000 0.43000 1.12000 0.17000 60.00000 3.69000 0.34000 1.11000 0.13000 96.00000 4.97000 1.17000 1.04000 0.24000 131.00000 4.43000 0.32000 1.08000 0.08770 178.00000 3.49000 0.43000 1.04000 0.16000 207.00000 3.30000 0.21000 1.24000 0.11000
Tim
eGustavo Pesce
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Curva dosis respuesta
YFP signal
α−factor (M)10
00 b
ound
mol
ecul
es /
cell
EC50
Alta concentraciónBaja concentración
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factor (nM)
Res
pons
e (%
of m
axim
um)
0.01 0.1 1 10 100 10000
20
40
60
80
100
0.01 0.1 1 10 100 10000
20
40
60
80
100
Transcription 170 minF binding
La curva de unión de α factor al receptor y la curva de respuesta transcripcional están alineadas (Dose Response Alignment o DoRA)
YFP signal
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Efectos de desalinear la curva dosis respuesta
Sys
tem
resp
on
se (%
max.)
0
100
Log pheromone concentration (M)–11 –9 –7–13
ba
Path
way
ou
tpu
t (%
max.)
0
100
Receptor occupancy (% max.)
0 100
d
Path
way
ou
tpu
t (%
max.)
0
100
Receptor occupancy (% max.)0010
Log pheromone concentration (M)–11 –9 –7–13
Receptor occupancyPathwayoutput (P)
Sys
tem
resp
on
se (%
max.)
0
100
c
Receptor occupancy
Misalignedpathwayoutput
Path
way
ou
tpu
t (%
max.)
0
100
Receptor occupancy (% max.)0 100
Path
way
ou
tpu
t (%
max.)
0
100
Receptor occupancy (% max.)0 100
fe
Sin DoRa
DoRA mejora la capacidad de
distinguir inputs
Sys
tem
resp
onse
(%
max.)
0
100
Log pheromone concentration (M)–11 –9 –7–13
ba
Path
way
outp
ut
(% m
ax.)
0
100
Receptor occupancy (% max.)
0 100
d P
ath
way
outp
ut
(% m
ax.)
0
100
Receptor occupancy (% max.)0010
Log pheromone concentration (M)–11 –9 –7–13
Receptor occupancyPathwayoutput (P)
Sys
tem
resp
onse
(%
max.)
0
100
c
Receptor occupancy
Misalignedpathwayoutput
Path
way
outp
ut
(% m
ax.)
0
100
Receptor occupancy (% max.)0 100
Path
way
outp
ut
(% m
ax.)
0
100
Receptor occupancy (% max.)0 100
fe
Con DoRA
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Sys
tem
resp
on
se (%
max.)
0
100
Log pheromone concentration (M)–11 –9 –7–13
ba
Path
way
ou
tpu
t (%
max.)
0
100
Receptor occupancy (% max.)
0 100
d
Path
way
outp
ut
(% m
ax.)
0
100
Receptor occupancy (% max.)0010
Log pheromone concentration (M)–11 –9 –7–13
Receptor occupancyPathwayoutput (P)
Sys
tem
resp
onse
(%
max.)
0
100
c
Receptor occupancy
Misalignedpathwayoutput
Path
way
outp
ut
(% m
ax.)
0
100
Receptor occupancy (% max.)0 100
Path
way
outp
ut
(% m
ax.)
0
100
Receptor occupancy (% max.)0 100
fe
con DoRA sin DoRA
sin DoRA se amplifica el ruido
Efectos de desalinear la curva dosis respuesta
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input
signalingsystem
output
signal
signaltuning
b
input
signalingsystem
output
signal
a
Dos modos extremos para alinear las curvas dosis respuesta
Requiere un ajuste fino muy preciso de las tasas de las reacciones y el resto de los parámetros del sistema
Tolera desvíos internos, ya que el feedback puede ajustar el output al input
Con control por feedbackSin control por feedback
20 40 60 80 100
0
40
80
120
input
Response
20 40 60 80 100
0
40
80
120
response
20 40 60 80 100
0
40
80
120
response
20 40 60 80 100
0
40
80
120
response
20 40 60 80 100
0
40
80
120
response
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M 0 1 1.5 2.5 3.5 5 7 10 12.5 15Time after stimulation (min)
51 kDa
37 kDa
Kss1
Kss1-P
Fus3
Fus3-P
Dinámica de fosforilación de la MAPK
67
0 5 10 15Time (min)
0.000
0.015
0.030
0.005
0.010
0.015
0.000 phos
phoK
ss1
inte
nsity
/tota
l Kss
1 in
tens
ity
phos
phoF
us3
inte
nsity
/tota
l Fus
3 in
tens
ityFus3Kss1
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Sys
tem
out
put (
% m
ax.)
0
50
100 Receptor occupancy (calculated)
Fus3 phosphorylation
Pathway output P
Pheromone (M)10-11 10-10 10-9 10-8 10-710-13 10-12 10-6
La curva D-R medida a nivel de la fosforilación de la MAPK también se alinea con la ocupación del
receptor
68
YFP signal
Monday, October 22, 12
0 5 10 150
25
50
75
100
125
150
Rel
ativ
e Fu
s3 p
hosp
hory
latio
n (%
) pher + Fus3 inhpherFus3 inh
fus3-as2
Time (min)
+inh
-inh
La caída en la señal depende de la actividad de Fus3(feedback negativo)
0 5 10 15Time (min)
0.000
0.015
0.030
0.005
0.010
0.015
0.000 phos
phoK
ss1
inte
nsity
/tota
l Kss
1 in
tens
ity
phos
phoF
us3
inte
nsity
/tota
l Fus
3 in
tens
ity
Fus3Kss1
Monday, October 22, 12
pheromone
Ste2
Ste7Ste11
Fus3
Ste5
Ste20Sst2
Fus3 P
Ste18Ste4Gpa1
70
Nor
mal
ized
Fus
3 ph
osph
oryl
atio
n (%
)
0
50
100
Pheromone (M)10-11 10-10 10-9 10-8 10-710-13 10-12
Fus3 inhibitedFus3 not inhibited
El alineamiento requiere un feedback negativo que se origina en Fus3
Yu et al., Nature 2008Monday, October 22, 12