Interpretación práctica del antibiograma. Principales fenotipos … · 2014-10-21 · ¿Que debo...
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¿Que debo saber del Antibiograma?
Interpretación práctica
Principales fenotipos de resistencia
Dr. Freddy Roach Poblete
Médico Microbiólogo y Parasitólogo
clínico
Laboratorio clínico
Hospital Regional de Antofagasta.
En 1929, el médico y bacteriólogo escocés, Alexander Fleming descubre la penicilina.
¿De que vamos a Hablar?
1. Las Bacterias
Cronología de la vida en el planeta
Cuando apareció la resistencia
Genética Bacteriana
2. El Antibiograma
CIM
CBM
Técnicas de estudio de sensibilidad
Métodos fenotípicos
Métodos bioquímicos
Métodos genéticos
3. Lectura interpretada del antibiograma
Resistencia intrínseca
Lectura interpretada para Gram (+)
Lectura interpretada para Gram (-)
Dr. John Rudge de la Universidad de Cambridge en el año 2010
redujo la antigüedad de la tierra a 4.480 millones de años.
Las bacterias aparecieron hace unos 3.800 millones de años.
Homo sapiens, se originó hace alrededor de 150.000 años.
Anton van Leeuwenhoek en 1683, observó la 1ra bacteria.
La capacidad que tienen las bacterias de
generar resistencia a los antibióticos se
remonta a hace más de 30.000 años.
La resistencia a los antibióticos es una
propiedad natural existente en los genes de las
bacterias que precede al uso clínico de los
antibióticos.
El Resistoma:
Las bacterias del suelo y las que causan
enfermedad en los humanos intercambian
rápidamente genes con resistencia a múltiples
medicamentos.
Las Bacterias¿Cuando apareció la resistencia a los antibióticos?
La arsfenamina
Fue el primer fármaco que curó una enfermedad infecciosa.
Comercializado bajo la marca de Salvarsán en 1910 y denominado
la bala mágica.
Sintetizado por el bacteriólogo alemán Paul Ehrlich.
Era antibiótica Un evento reciente de aproximadamente 100 años
La mayoría de mecanismos de resistencia están mediados
por elementos genéticos móviles:
integrones, transposones, plásmidos.
Estos pueden transportar uno o varios genes de resistencia.
¡Hey chico! ¿Quieres ser una superbacteria? Clávate esto a tu genoma.Ni la Vancomicina te hará daño…!!!
Cromosoma bacteriano Toda la información genética de la bacteria
está contenida en una única molécula de ADN de doble cadena y
circular.
Plásmidos ADN extracromosómico, también circular y cerrado.
Se replican de forma autónoma y no se integran al cromosoma
bacteriano.
Genoma bacteriano: conjunto de elementos genéticos autorreplicativos que tiene una bacteria:
1. Cromosoma2. Plásmidos3. Genes "saltarines"
Genes "saltarines" de las bacterias
Los transposones (Tn): son segmentos de ADN capaces de
“saltar” desde una posición a otra en el genoma. Pueden
transponerse desde el cromosoma a un plásmido o viceversa.
Genética bacteriana
¿QUE ES EL ANTIBIOGRAMA?
Es un método fenotípico de estudio microbiológico realizado en el laboratorio.
Consiste en enfrentar un inóculo bacteriano estandarizado a una única o a diferentes concentraciones de antibiótico.
La interpretación de los resultados obtenidos permite clasificar a los microorganismos en categorías clínicas: sensibles, intermedios o resistentes.
Se traduce como factor predictivo de la eficacia clínica.
Al realizar el antibiograma se pueden obtener :
1. Resultados cualitativos que indican si la bacteria es
sensible o resistente a un antibiótico.
2. Cuantitativos que determinan la concentración mínima de
antimicrobiano que inhibe el crecimiento bacteriano en µg/ ml
o en mg/l (CMI) .
¿QUE ES EL ANTIBIOGRAMA? (2)
Es la concentración más baja de un antibiótico capaz de
inhibir el crecimiento del 99,9% de una determinada
población bacteriana.
La CMI es diferente para cada especie bacteriana y cada
antimicrobiano.
Las concentraciones mínimas inhibitorias pueden ser
determinadas mediante métodos de microdilución en
caldo o por difusión tiras de Etest.
Utilizando un inóculo estandarizado de una bacteria.
Se prueba un antibiótico mediante concentraciones
decrecientes, generalmente diluciones doble seriadas.
Los agentes antimicrobianos se preparan en
"soluciones madre" concentradas y luego se diluyen
en caldo hasta obtener las concentraciones
apropiadas.
Un tubo de caldo se mantiene sin inocular como
control negativo de crecimiento.
Luego de la incubación adecuada, se observa la turbidez (desarrollo bacteriano).
La CIM corresponde al 1er tubo que
no presenta turbidez.
Si se hace un traspaso a una placa de Agar, todavía habrá desarrollo bacteriano y por lo tanto están inhibidas y no muertas.
CIM
CBM:
Es la mínima concentración del
agente antibacteriano que
permite sobrevivir a < de 0,1 %
de la población bacteriana.
Es el primer inóculo que, al
traspasarlo demuestra que ya no
crecen bacterias.
Habitualmente, las cifras de CIM
y de CBM son muy cercanas,
rara vez más allá del doble. CBM
El estudio de la sensibilidad in vitro de las bacterias a los
antimicrobianos se realiza mediante:
1. Métodos fenotípicos (antibiograma):
Por dilución
- Método por dilución en caldo
- Método por dilución en Agar
Por difusión
- Método de Kirby-Bauer (Disco placa)
- Método Epsilon test
2. Métodos bioquímicos
3. Métodos genéticos.
Las técnicas de dilución
proporcionan resultados
cuantitativos (concentración mínima
inhibitoria)
Las de difusión cualitativos
(sensible, intermedio, resistente).
Ambos métodos son comparables ya
que hay una correlación directa
entre el diámetro del halo de
inhibición y la CMI.SensibleResistente
Son la base de casi todos los métodos utilizados en la
actualidad.
Este método determina la CMI utilizando un medio de dilución
en caldo para las diferentes concentraciones del
antimicrobiano.
Estos novedosos métodos utilizan sistemas de
microdilución en medio líquido sobre microplacas con
pocillos en "U" e interpretan el crecimiento bacteriano en
los diferentes pocillos por medio de un autoanalizador
(mediciones por turbidez o fluorescencia)
Sistema automatizado Vitek 2
En el caso de los sistemas más sencillos, la lectura la
realiza el tecnólogo médico o microbiólogo, a través de
un visor invertido de espejo.
Las técnicas de difusión emplean discos de papel
impregnados con una solución estandarizada para cada
tipo de antibiótico, que se disponen sobre la superficie
de un medio sólido previamente sembrado con una
suspensión bacteriana.
Tras un período de incubación, se observa el diámetro
de halos formados alrededor de los discos.
El tamaño de los halos esta en relación con el grado de
sensibilidad del microorganismo.
Al medir los halos puede establecerse una correlación
con los valores de CMI.
Halos pequeños se relacionan con valores altos de CMI
(resistentes) y halos grandes con CMI bajas (sensibles).
Método fenotípico por difusiónMétodo de Kirby-Bauer
Es una técnica por difusión, permite la
determinación directa del valor de la CMI.
Utiliza tiras de plástico impregnadas con un
antibiótico en concentraciones decrecientes.
Al contacto de la tira con el agar, el
antibiótico difunde e impide el crecimiento
del microorganismo.
Después de la incubación se observa una
zona de inhibición en forma de elipse: el
valor de la CMI es el punto de intersección
de la elipse con la tira y está indicado en la
escala impresa sobre la superficie de la tira.
Consisten en la determinación del mecanismo
bioquímico de resistencia.
.
Detección de b-lactamasa con discos impregnados con una
cefalosporina cromogénica que cambia de color cuando se hidroliza.
Utilizado para la detección rápida de la resistencia a ampicilinaen Haemophilus spp. Neisseria spp. y Moraxella spp.
Técnica de aglutinación con látex
Partículas sensibilizadas con anticuerpos monoclonales dirigidos frente a la PBP2a responsable de la resistencia a cloxacilina enStaphylococcus aureus.
Los métodos genéticos detectan genes de resistencia, generalmente
mediante técnicas de PCR, como en el caso del gen mecA que
codifica la producción de la PBP2a.
Ya obtenida la CIM o el diámetro de inhibición, se
clasifica al microorganismo frente cada antibiotico
según puntos de corte como S, I o R
Los puntos de corte se establecen basados en
propiedades microbiológicas, farmacocinéticas y de
eficacia clínica,
El factor más importante para definir las categorías es
la concentración que alcanza un antibiótico en el
plasma.
La interpretación de los resultados del antibiograma se realiza en función de los valores establecidos por diferentes comités, como: a. Clinical and Laboratory Standards Institute en Estados
Unidos (CLSI)
b. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testingen Europa (EUCAST)
¿Quien establece los puntos de corte para el antibiograma?
La Lectura del Antibiograma, es un proceso que
consiste en el reconocimiento de los fenotipos
bacterianos y de la interpretación de los
resultados obtenidos del antibiograma para guiar
al clínico en la elección del mejor tratamiento
individual.
NO confundir, categorización clínica (Sensible,
Intermedio o Resistente) o los valores de CIM,
con una lectura interpretada del antibiograma.
Su objetivo es evitar el posible fracaso
terapéutico
De su aplicación se obtienen conclusiones
como:
Favorece la adecuación del tratamiento.
Predicción del éxito terapéutico.
Condiciona la modificación de las categorías
clínicas y la deducción de los valores de
sensibilidad de antimicrobianos no incluidos
en el antibiograma
Vigilancia y detección de nuevos mecanismos
de resistencia.
Definición y control de las políticas de
antimicrobianos.
Sin interpretación
del antibiograma
Adaptado de: Lectura interpretada del antibiograma y su integración en el estudio de la sensibilidad a los antimicrobianos. Rafael Cantón Moreno, Hospital Ramón y Cajal. Vol. 20. Núm. 04. abril 2002.
El resultado terapéutico depende de muchas variables, como
enfermedad subyacente, condición clínica del huésped, las
propiedades farmacológicas del agente antimicrobiano, el sitio de la
infección, etc.
Los microbiólogos sólo pueden recomendar agentes terapéuticos
sobre la base de sus actividades in vitro.
El clínico debe tomar la decisión final, teniendo en cuenta su
conocimiento sobre todos los factores pertinentes.
Debiendo elegir entonces el agente apropiado :
El más activo contra el patógeno.
El menos tóxico para el huésped.
Con las características farmacológicas apropiadas.
Más económico.
Un requisito esencial para poder realizar una adecuada
lectura interpretada es conocer la identidad del
microorganismo, tanto el género como la especie.
De esta manera podemos identificcar el fenotipo de
sensibilidad correspondiente.
Hay bacterias que siempre son resistentes a determinados
antibióticos y otras que siempre son sensibles.
La desviación de estos patrones indica un fenotipo raro o
imposible.
Patrón de comportamiento de los microorganismos, individualizado por
género o especie, frente a cada grupo de antibióticos.
Se clasifican en habituales, raros e imposibles.
Fenotipos habituales son los aislamientos con mecanismos de
resistencia epidemiológicamente normales ( Ej. BLEE).
Fenotipo raros: mecanismos de resistencia poco frecuentes ( Ej. KPC ).
Fenotipos imposibles: No responden a
mecanismos de resistencia conocidos
y suelen representar problemas técnicos
del ATB.
¿QUE SON LOS FENOTIPOS DE SENSIBILIDAD O RESISTENCIA?
Es aquella que se desarrolla en forma natural en ausencia
de mecanismo de presión de selección antimicrobiana (no
hay exposición previa a antibióticos).
La resistencia intrínseca es por tanto especie o género
específica y delinea el espectro de actividad del
antibiótico.
ALGUNAS RESITENCIAS INTRINSECAS
Lectura interpretada del antibiogramaCocos grampositivos
Penicilina R Ampicilina R Oxacilina R Cefoxitina R AMC R
Adquisición de ADN exógeno codificantede una PBP de baja afinidad porbetalactámicos, denominada PBP2a ycodificada por el gen mecA.
Resistencia homogénea (alto nivel) oheterogénea.
R a todos los betalactámicos.
Oxacilina y Cefoxitina se usan comomarcadores de mecA.
Este mismo criterio se aplicará en el casode STACN.
Lectura interpretada del antibiogramaStaphylococcus aureus
resistente a meticilina (SARM, MRSA)
Staphylococcus aureus
resistente a meticilina (SARM, MRSA)
Penicilina R
Ampicilina R
Oxacilina S
Cefoxitina S
Penicilina R Ampicilina R Oxacilina R Cefoxitina R AMC R
Staphylococcus aureus
Sensible V/S resistente a meticilina
Antibiotico E. faecalis E. faecium
Oxacilina Resistente Resistente
TMT/SMX Resistente Resistente
Cefalosporinas Resistente Resistente
Ertapenem Resistente Resistente
Aminoglucósidos De bajo nivel De bajo nivel
Quinupristina//dalfopristina Resistente Sensible
Clindamicina Resistente Sensible
• Los enterococos adquieren resistencia de alto niveles
de betalactámicos por:
Mecanismo E. faecalis E. faecium Frecuencia
Producción de
Betalactamasa
+++ +/-
Modificación de
la PBP5
+ +++ ++
modificación de la PBP5
Enterococcus spp. resistente a vancomicina
• Resistencia heterogénea que presenta 6 fenotipos: VanA,
VanB, Van D, VanG, VanE y VanL.
• VanA es el más frecuente.
• Clúster de genes en transposón Tn 1546, que posee
genes codificantes de enzimas modificadoras de la afinidad
del péptidoglicano por la vancomicina.
Genotipo vanA
Es el único que presenta alto nivel de resistencia a vancomicina y teicoplanina
E. faecium con fenotipo vanA, se asocia también a resistencia de alto nivel a aminoglucósidos y betalactámicos.
Fenotipo vanA
Teicoplanina R
Vancomicina R
Enterococcus spp. resistente a vancomicina
Genotipo vanA, vanB
Genotipo VanB
Presenta resistencia inducible a vancomicina (CMI 16-64 mg/l) y sensibilidad a teicoplanina.
Enterococcus spp. resistente a vancomicina
Fenotipo vanB
Vancomicina R
Teicoplanina S
E. faecalis,
E. faecium
Fenotipo vanA
Vancomicina R
Teicoplanina R
E. faecalis,
E. faecium
Alto nivel de resistencia.
Cepa control
Vancomicina s
Teicoplanina s
Fenotipo vanC
Vancomicina R
Teicoplanina R
E. gallinarum,
E. casseliflavus.
Bajo nivel de resistencia
Lectura interpretada del antibiogramaBacilos gramnegativos
Proteus: presenta disminución de la sensibilidad a Imipenem debido a alteración de las porinas.
SHV
Fenotipos de resistencia cromosómica Intrínseca
AmpC
Las clasificaciones más utilizadas son las de Ambler y la de Bush-Jacoby-Medeiros.
AmblerCuatro clases de β-lactamasas en función de sus secuenciasaminoacídicas (estructura molecular).
Bush-Jacoby-MedeirosSepara las β-lactamasas en función de su perfil hidrolítico y lainhibición de su actividad (ácido clavulánico, EDTA, aztreonam).
Distingue cuatro categorías y múltiples subgrupos
CLASIFICACION DE LAS BETALACTAMASAS
CLASIFICACION DE LAS BETALACTAMASAS
Manual de Pruebas de Susceptibilidad Antimicrobiana, Stephen J. Cavalieri, (et al.)
Betalactamasas (clase A / 2be)
Sensibilidad disminuida a cefalosporinas de amplio
espectro (BLEE).
• Enzimas de clase A (Ambler) y grupo
2be (Bush, Jacoby y Medeiros).
• TEM, SHV, CTX-M son las más
habituales.
• 1ª descrita en Alemania (1983) en
Klebsiella ozaenae.
• Los genes que los codifican se
encuentran en Plásmidos facilitando su
diseminación.
• Presentan co-resistencia con
quinolonas, aminoglucósidos,
cotrimoxazol.
• Son capaces de hidrolizar penicilinas, cefalosporinas y monobactamas.
• No afectan las cefamicinas o carbapenems.
• Son inhibidas por el ácido clavulánico.
• Se informará todas las cefalosporinas resistentes (excepto cefoxitina)
• Fármacos de elección: carbapenems (infecciones graves), asociaciones con
inhibidores de las betalactamasas, si S.
• Para ITU: fosfomicina, amoxicilina/ácido clavulánico.
AMP AMC TIC PRL P-TZ CZ CXM FOX CAZ CTX FEP AZT IMP MEN
R
>128
S
8/4
R
>128
R
>128
R
>128
R
>128
R
>128
S
4
0,12
S
(R)
32 I
(R)
8 S
(R)
4 S
(R)
S
0,12
S
0,03
Betalactamasas (clase A / 2be)
Sensibilidad disminuida a cefalosporinas de amplio espectro (BLEE).
La doble difusión con discos: de cefotaxima y ceftazidima de 30 μg y AM/CL a una distancia de 20-30mm. Se ve la sinergia de sensibilidad y si aumentan los halos más de 5mm con AM/CL es BLEE. Positivo
Prueba confirmatoria para BLEE
BLEE Positivo BLEE negativo
Betalactamasas
(clase C / 1)
Hiperproductor de AmpC.
Resistencia a
amoxicilina/clavulánico
y sensibilidad disminuida a
cefalosporinas:
• Son Serin-Betalactamasa• Pertenecen al grupo 1 de la clasificación de Bush.
• La producción de AmpC puede ser constitutiva o inducible, • Los niveles de producción dependen del grado de expresión del gen
blaAmpC.
• Cuando el gen blaAmpC se expresa de forma constitutiva puede
hacerlo a niveles basales bajos, confiriendo un fenotipo de resistencia salvaje.
• Hiperexpresión de blaAmpC por mutaciones en el atenuador y/o
promotor de blaAmpC,
AMP AMC CAR TIC PRL P-
TZ
CZ CXM FOX CAZ CTX FEP AZT IMP MEN
R
>128
R
32/16
R
>128
R
>128
R
>128
I
32/4
R
>128
R
>128
R
64
R
32
I
16S
0,5
R
32
S
0,12
S
0,06
Betalactamasas (clase C)
Hiperproductor de AmpC.Resistencia a amoxicilina/clavulánico y sensibilidad disminuida a cefalosporinas:
• R a amino y acilureidopenicilinas, amoxi-clavulánico,
• R cefas de 1ª , 2ª y 3ra generación, cefoxitina
• R aztreonam.
• Sensible a cefepima y carbapenems.
• Las cefalosporinas de cuarta generación no se ven afectadas.
• P/TZ suele ser Intermedia ya que la piperacilina se hidroliza menos por el
AmpC .
1. AmpC cromosómicas
Enterobacter spp
C. freundii, Serratia spp
Providencia spp
Morganella spp.
2. AmpC plasmídicas :
E. Coli
Klebsiella spp.
Betalactamasas (clase C)
Tipos de AmpC
• Desde punto de vista clínico la alternativa más razonable es usar Cefepima.
• En caso de infecciones grave, podría considerarse el uso de carbapenémicos.
• En el caso de sensibilidad a Cefalosporinas de 3ra G, se aconseja informar la posibilidad de que se produzca un fracaso terapéutico, por la selección de mutantes AmpCdesreprimidos estables, particularmente con Enterobacterspp. y C. freundii.
• Piperacilina/Tazobactam variable, se informará según CMI.
Hiperproductor de AmpC.Tratamiento
AMP
AMC
TIC PRL
P-TZ
CZ CXM
FOX CAZ CTX FEP AZT
IMP MEN
R S R I S I/R S S S S S S S S TEM-1
R R R R R R I S S S s S S S TEM-1
Hiper
R R R R R S S S S S S S S S IRT
R I R R I S S S S S S(R) S S S OXA-1
R R R R I R R R R I
(R)S R S S AmpC
Hiper
R S R R S R R S S (R)
I (R) S(R) S(R)
S S BLEE
Las bacterias presentan múltiples mecanismos de resistencia, los
cuales recién estamos comenzando a conocer y entender.
Muchas de estas resistencias están presentes en los genes de las
bacterias desde antes de la era antibiótica.
No debe validarse el resultado de un antibiograma, sin realizar
previamente una lectura interpretada de este.
Actualmente existen métodos automatizados, que no reemplazan al
tecnólogo o microbiólogo que realiza el la lectura interpretada del
ATB.
Para interpretar correctamente el Antibiograma, debemos conocer
los fenotipos y las resistencias naturales de las bacterias.
BIBLIOGRAFÍA
• Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance standards forantimicrobial susceptibility testing;. M100-S19. Wayne, PA: CLSI; 2014.
• European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST): Expertrules in antimicrobial susceptibility testing, 2014.
Disponible en: http:// www.srga.org/eucastwt/MICTAB/index.html
• Cantón R. Lectura interpretada del antibiograma: ¿ejercicio intelectual o necesidadclínica? Enferm Infecc Microbiol Clin. 2002;20:176-85.
• ATLAS DEL ANTIBIOGRAMA, Juan Ignacio Alós, Rafael Cantón, Luis Martínez, JordiVila. Biomérieux.
• GUÍA TERAPÉUTICA ANTIMICROBIANA, J. Mensa, J. m. Gatell, J. E. García, E.Letang. E López, F. Marco.
Editorial Antares Barcelona 2013.
• Manual de Pruebas de Susceptibilidad Antimicrobiana, Stephen J. Cavalieri, (et al.)
• LECTURA INTERPRETADA DEL ANTIBIOGRAMA, capitulo 4, Carmen torres.
Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica 2002:20(7):354-64.