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J~~~~~~~~~ DB UN ADITIVO ALIMANTICION A PAR~IR

DE SORGO (SoTghum b i c o l o r ( & e $ moench)

FdiWiiNTADO CON AL HONGO Rhizorms oliaosporus

J Nabor P. Alvarez Kiranda.

Neftalf E. E s c a l o n a Alba.

Universidad Autónoma Metropoli tana- I

Depart amento) de Bio t e cnolog fa . J I n g . Bioquímica I n d u s t r i a l .

4 s e s o r e s :

M. e n C. Eduardo E. González H. R. e n C. Oscar Monroy. H. M. en C. S e r g i o Revah M.

F ?. .

~

OBTdNCION DS UN ADIT IVO ALIT?dNYICIO A PAHTIR

D& SONGO (Sorghum bicolor (2. ). moench)

PERWNTADO CON isL EONGO Rhizopus ol igocoorus.

INFOBEIS FINAL,

Nabor P. h l v a r e z lid. (No. de cta . 76312999).

Neftalí E. f i sca lom A. (No. de cta. 77327750).

Junio, 1982.

____.," ....

9

7 ,

L .

a k

c

- i -

R E S U M E N .

Sorghum b i c o l o r (La) moench, .parcialbente desta-

nizado, se u t i l i z ó ) como sustrato básico de una fermenta-

c i ón só l i da con Rhizouus o&igosporus ATCC 22959, con

eT f i n de obtener un producto con mayor contenido, de pro-

t e ína que e i grano or ig ina l .

E1 trabajo experimentar comprende esencialmente t r e s

partes, que en una forma muy breve se exponen a continua-

ción:

l'). Aná l i s i s de l a Composición Química de l Sorgo.

Inicialmente, fue necesario l ' levar a cabo pruebas f i s i c o -

qu&micas para cuant i f i car l'os principales componentes del'

sorgo que s e r í a empieado en i a investigación.

Los resultados obtenidos en l a s determinaciones de

las sustancias de mayor re levancia para i a fermentación,

fueron: 78.87 $, para almidón; 9.91 %, para proteína 9p

2.342 $ de taninos.

2 ) . Destanización dell Sorgo. La destanización par-

c i a r d e l grano ae l l e v ó a cabo apl'icando tratamientos

térmico-alcalinos, con soluciones de NaOH'aT 5, 10 y 1 5 $;

50 C de temperatura, 10 minutos de extracción y ag i tac ión

controlada.

O

c - ii -

T

L 1

La máxima destanización se obtubo con alcriii a l

3.5 56, logrando ex t rae r e l 90.77 $ de Xos taninos to ta les .

L i ent ras que en Xos otros dos casos se extra jeron 85.75%

y 75.58 $, respectivamente.

3). Fermentación. Para Tos procesos de fermentación

se u t i i i z d como'sustrato, muestras de sorgo tratado a l a s

t r e s d i ferentes concentraciones; incl'uyendo además una

de sorgo s i n tratamiento.

Los mejores resultados fueron obtenidos en e l Lote A

d e l segundo proceso de fermentación, con l o s medios de

sorgo sometido a tratamiento con NaOH a l 5 % y sorgo s i n

tratamiento. 21 máximo incremento de proteína alcanzado

en los productos, con respecto a l a d e l grano or i g ina l ,

fue de 93.63 $ y 51.87 $, respectivamente. E l tiempo re-

queridos para l a fermentación fue de 72 horas-

c - iii -

T

En nuestro país ae han r e a l i z a d o muy pocas inves-

t i g a c i o n e s b i o t e c n o l ó g i c a s donee e l sorgo s e a u t i l i z a d o

como s u s t r a t o básico de a l g h t i p o de fermentación. Los e s t u d i o s que s e han publicado son esencialmente sobre

mejoramiento g e n é t i c o de s e m i l l a s , con el: o b j e t o de d i s -

minuir e i contenido de l a n i n o s , a c e l e r a r s u produccián

e incrementar Ea cant idad de proteína. An e s t o s traba-

j o s s e han obtenido f r u c t í f e r o s r e s u l t a d o s , pero han

surgido nuevos problemas, como i a p e r d i d a de r e s i s t e n c i a

a i ataque de los pájaros y a aigunas enfermedades causa-

das por microorganismos ( l , 2 , 3 ) .

En algunos p a í s e s de Africa e s t e c e r e a l e s u t i l i z a -

do para obtener bebidas alcohóllicas, de gran aceptac ión

popular, como e s e l caso de l a cerveza d e l BantÚ, a l sur de Africa. Se preparan también aEgunos a l imentos t r a d i -

cional'es ae consumo i n f a n t i z , e n t r e los que destaca e l

Ogi de Sorgo, en Niger ia í4,5). Ambos productos s e ob-

t i e n e n p o r fermentación sumergida con microorganismos

E á c t i c o s , principalmente. La prote ína de e s t o s a l imentos

e s de ba ja calidad y prac t i canente tampoco varia en can-

t i d a d con r e s p e c t o a l a d e l grano o r i g i n a l .

0. - i v -

f

L 4

c

t

L

Otros paises han desarrozlado var ias técnicas con

e l f i n de mejorar l a cal idad de d ie tas preparadas a ba-

se de sorgo. dntre l a s más importantes se encuentran:

l a f o r t i f i c a c i ó n de aminoáciüos, adicionando concentra-

dos prote icos; l a germinación de l a semi l la y l a fermen-

tac ión sumergida d e l grano (6,7,8,9).

i

Actualmente, l a l i t e r a tu ra sólo reporta un t rabaja

cuya f ina l i dad fue mejorar ca l idad y contenido de prote i -

na en sorgo, mediante un proceso de fermentación s ó l i da

con dicho cereal: Hesselt ine -- e t a l (1967) ( l o ) , u t i l iha-

ron semi l la comercial de grado No. I de sorgo blanco y

lo ' ferme6taron con el' hongo R. oligosporus NRRi27IO.

El' producto obtenido, a l igual' que otros preparados

con d i f e rente ce rea l , fue rebanado, metido en agua de

s a l y f r i t o en a c e i t e vege ta i , con e l ob je to de va lo rar

e l crecimiento de l hongo, a831 como e l sabor, o l o r y co-

l o r .

Los resultados de l a s pruebas anter iores indicaron

un crecimiento muy pobre, pérdida de textura, desinte-

grac ión a l rebanar10 y un c a s i inpersept ible o l o r a l e -

vadura. Por estas razones, l o s investigadores concluye-

ron que e ra un producto' poco, a t rac t i vo para consumo hu-

mano.

c

- v -

CONTENIDO

il

iii

C O N T ~ N I D O V

CUADROS Y PIGUtL4S v i i i

1-1. Obje t ivo ................................. 3

CAPITULO 11:. BMVS S T U D I O DdL SORGO 4

Cul'tivo ............................... 4

..................... Producción y Usos 4 Composición d e l Grano ................. 5

Taninos 5 Taninos en Sorgo ...................... 6,

interacciones Tanino-Proteína e Almidón ............................... TO P r o t e í n a .............................. 12

............................... .........

CAPITULO 111:: PdRiúdNTACIONdS TIWDICIONiiLdS Y4

IIId. Generalidades ......................... 1'4 111.2. P r i n c i p a l e s Alimentos Fermentaoos ..... 14 111.3. Algunos Microorganismos U t i l i z a d o s .... 15 111.3.1. Breve Descr ipc ión d e l Hongo

Rhizopus oliKosvorus ................. 17

,. - v i - 7

111.4. Tempeh .............................. 2T - 111.4.1. D e f i n i c i ó n 21

111.4.2. Propiedades ......................... 22

\I .......................... I

CAPITULO I V : ANALISIS DA LA COMEOSICION

QUIE',ICA DAL SORGO 23

P

i

IV.1.

I V . 2 .

I V . 3 . IV .3 .Y. I V . 3 . 2 .

IV.4

IV .5 . I V . 5 . 1 .

I V .5 - 2 .

S e l e c c i ó n y Pretra tamiento de l a s e m i l l a 23

E x t r a c c i ó n de Taninos ............... 24

Determinación de Taninos ............ 26

Método de l a V a i n i l l i n a (hW-HCl) ..... 26

Ldtodol d e l Complejo A z u l de P r u s i a ... 29

Determinación de Almidón ............ 32

Determinación de P r o t e í n a ........... 36

Método de B i u r e t .................... 36

Ftlétodo de Kjel.dah1 .................. 4 0

CAPITULO V : FARK.U?TACION 4 3

V . 1 .

v.2.

v.3. v.4. v.5. V.6.

v.7. V . 8 .

............ Preparación d e i S u s t r a t o 4 3 Obtención d e l 1nÓcul.o 4 3 Primer Proceso de Fermentación ...... 44

Humedad d e l Kedio, 45 Segundo Proceso de Fermentación ..... 4 6

Prueba de Rebanado 47

Secado d e l Alimento ................. 47

Fermentación Sumergida 48

............... ................... ..................

..............

- v i i -

L . CAPITULO V I : RXSULTADOS Y COXCLEIONES

VI.1.

V I .2.

V I . 3 .

VI .4.

V I . 5 .

V I -6 .

VI.6.1.

VI.6.2.

VI.6.3.

V I . 7 .

S e l e c c i ó n y P r e t r a t a m i e n t o ............. A p l i c a c i ó n de l o s t r a t a m i e n t o s

Térmico-alcal inos ............... ....... Contenido de Taninos ................... C u a n t i f i c a c i b n de P r o t e í n a ............. D e t e m i n a c i ó n de AXmidÓn ............... Procesos de Fermentación ............... Primer Proceso de Fermentación ......... Segundo Proceso de Fermentación . . . . . . . Fermentación Sumergida ................. CmclusiÓn General ...... ..... . .........

SUGEWNC IAS

B I BLI OGFZAPIA

5r

52

5 3 5 5 65

69

7 3

74

79

82

84

85

86

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1’

2

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11

1’2

1’3

CUADROS Y PIGUHirS

P r i n c i p a l e s Alimentos Producidos por Fermentación de Soya y Algunos Cerea les ..................... Extracción de Taninos ........................... Cuadro Resumen d e l Contenido de Taninos e n las

d i f e r e n t e s muestras de sorgo analimadas ......... Contenido de Taninos, medidos como^

Penoles t o t a l e s ............................... Cuadro Comparativo‘ de l o s v a l o r e s obtenidos

p o r l o s dos métodos ............................ P o r c i e n t o de P r o t e í n a determinada p o r e l método

de R j e l d h a l , en m i c e l i o y d i f e r e n t e s muestras

de sorgo ...................................... Contenido de Almidón en las d i f e r e n t e s mues-

tras de sorgo anal ivadas ...................... Evaluación visual: d e l producto obtenido en e l Pr imer Proceso de Pernsntación. Lote A ........ Cuadro comparativo d e l contenido de p r o t e í n a en

e l s u s t r a t o o r i g i n a l y en e l producto..........,

16 57

58

62

63

68

71

34

76 BvalbaciÓn Visual’ d e l Producto obtenido en e l

Primer Proceso de Fermentación. Lote B ........ 77

Lote A ...................................... 79 Contenido de E r o t e i n a d e l Lote A d e l 20. Proceso. . 80 Cuadro comparativo d e l contenido de p r o t e í n a en

ros productos de ambos procesos y en‘ s u s t r a t o

o r i g i n a l ....................................... 81

Evaluación d e l Segundot Proceso de Fermentación

, CAPIT'LJLO I.

INTRODUCCION

Actualmente uno de l o s pr inc i2a les problemas de E$-

x i c o y de muchos países de l mundo es l a excesiva e insa-

t i s f echa demanda de aliment 39, causada por l a insuf ic ien-

t e producción ag r í co l a y l a eleva(?a tasa de crecimiento

de sus poblaciones.

Ante es ta s i tuación, en nuestro país, se invest igan

diversas soluciones FOSibleS. Por una parte, se encuen-

t r a l a obtención de proteína a base de algunos microor-

ganismos t a l e s como bacterias, Ievaduras, honzos filamen-

tosos y algas, empleando para SU crecimiento sustratos

de escaso v a l o r b io lóg i co , t a l e s como almidones, residuos

ce lu lós i cos y algunos derivados de l petróleo, a s í como

desechos tanto de l a inciustria a l iment ic ia corno de l a 'a- groindus t r i a .

Por o t r o lado, i a tecno log ía agropecuaria r e a l i z a

constantes mejoramientos genét icos con e i f i n de aceie-

r a r y e l e v a r i a ca l idad y cantidad de l a producción

ag r í co l a y ganadera.

ET maíz, e l sorgoi y e l trigo, son TOS cerea les re-

presentat ivos de l a agr icul tura mexicana. E l cu l t ivo , de l

sorgo,comparado con e l de o t ros cereales, es r e l a t i va -

mente nuevo y constituye l a fuente de un gran número de

invest igaciones, principalmente de t i p o genético. Quizá

sea uno de Toe cerea les más estudiados en nuestros dias.

c

i

Un nuevo estudio de e s t e cerea l , con un enfoque d i - f e r en t e a l o s realizn.dos anter iomente en T?éxico, Consis-

t e en e fectuar una fsrnentación só l ida , u t i l i zando como

sustrato básico sorgo, y e l hongo f i lamentoso &. - oli-

Lospo ius .

El s9rgo empleado en l a fermentación, Sori;F.ulr &- co l o r (5.) aoench, es una variedad representat iva, entre

l a s miis cult ivadas en nuestro pais; se caracter i za por

t ener a l t a concentración de taninos y por su uso básico

como f o r r a j e . Se espera que e l producto de es te proceso

fermentat ivo pueda s e r u t i l i z a c o como a d i t i v o en alimen-

tos balanceados, consumidos principalnente por ganado de

engorda.

Las fermentaciones só l i das de es te t i p o ofrecen

granües ventajas sobre 2 . a ~ l í qu idas o sumergidas y l a s

semisólidas. Las ventajas encontradas son l a s siguientes:

31 eouipo requerido en fermentaciones só l idas normalinen-

t e e s peque3o) y poco so f i s t i cado , con un gasto mínimo de

energía para mantener la a i reac ión y temperatura reque-

r idas en e I proceso. No se requiere e f e c tua l procesos de

separación, ya que l a blonasa d e l microorganismo es com-

pletamente inocua y constituye parte esenc ia l de l prodcc-

t o f i n a l .

Las fermentaciones sumergidas, por l o ceneral , re-

quieren f ermentadores de grsn volumen, elevados consumos

de a i r e y energía, ag i tac ión controlada, tecnología so- f i s t i c a d a para e l cont ro l de i a fermentación, compiica-

L - 3-

1

Y dos procesos de separac ión d e l producto p r i n c i p a l y sub- productos, además s e debe i n c l u i r e l t ra tamiento de de-

sechos orgánicos para e v i t a r contaminación b i o l ó g i c a .

Consecuentemente, l o s productos obtenidos p o r e s t e t i r o

de fermentaciones tendrán un c o s t o más a l t o , aunque SUB

rendimientos sean mayoren que l o s alcanzados por v í a f e r -

mentación s ó l i d a .

&a t e c n o l o g í a para fermentaciones s ó l i d a s s e encuen-

tra muy poco desarro l lada . Consideramos que una f a s e si-

g u i e n t e de e s t a i n v e s t i g a c i ó n deberá t e n e r corno o b j e t i v o

e l d e s a r r o l l o de una t e c n o i o g i a s e n c i l l a y de b a j o c o s t o ,

de manera t a l , que pueda ser t r a n s f e r i d a a l medio rural. c e r c a de los p r i n c i p a l e s c e n t r o s de c u l t i v o de sorgo.

1 .X . Obje t ivo .

Obtener mediante una fermentación s ó l i d a , un a d i t i -

vo a l i m e n t i c i o , usando como mater ia pr ima sorgo b i c o l o r ,

(Sorghum b i c o l o r (L.) - moench), y e l hongo Bhizopus oli ,qos-

=, con e l f i n de incrementar e l contenido y c a l i d a d

de proteha, e n r e l a c i ó n a la d e l sorgo o r i g i n a l ,

E

i

CUI? ‘LO 11.

BFf3VE ESTUDI3 DZL SOZGO.

1I.l’. Cult ivo.

ET sorgo es un ce r ea l o r i g i na r i o de A f r i c a (11).

c d t i v o se ha extendido rapidamente a muchos países,’ hasta

ocupar en l’a actual’idad ei quinto fugar en i a producción

m d d i a l de cerea les c12), y e i segundo) a n i v e l nacional( l3) .

Este notable incremento se debe a su f á c i l adaptación

en 10s d‘ i ferentes medios agr í co las , que es 10, que caracte-

r i z a a e s t e cereal’. Crece en condic imes extremas de tempe-

ratura, humedad, a l t i t u d y composicioxes edáf icas de l sue-

To. Además presenta gran res i s tenc ia a sequías prolongadas

y a l ataque de pájaros, a s í como a algunas enfermedades

propias de l’os cereales. Debido a l a precocidad de su ci- c lo ) de v ida, en condiciones favorables, es posible obtener

doe cosechas por año c14).

Su

11.2. Producción y USOS.

ET Banco de México en su informe correspondiente a l a

década 1970-80, reporta que en el: c i c l o ’ an t e r i o r se cu i t i -

varon l‘,579,000 Ha, ocupando> el’ segundo) rugar en área de

siembra; con una producción t o t a l de 4,812 Toneladas y un

rendimiento de 3 TON/Ha (13). El’ usofundamental’ de e s t e ce rea l es como f o r r a j e y

piensos para arimento de ganado, tanto monogástrico como

po l i gás t r i co . ATgunas especies genéticamente mejoradas,

como i a s de so rgo blanco, se ocupan para alimentación hu-

. mana, con un v a l o r n u t r i , t i v o s u p e r i o r a l d e l maíz.

h x i s t e un gran nÚme,ro de variedades h í b r i d a s de s o r -

go. S u composición química v a r í a de acuerdo a .Ta e s p e c i e

var iedad a l a que pertenezca. Cabe s e ñ a l a r aue los agri -

c u l t o r e s generalmente s e l e c c i o n a n las variedades de semi-

x la para siembra, en las d i f e r e n t e s zonas d e l país , de-

acuerdo a las c a r a c t e r í s t i c a s arronómicas dex h í b r i d o y

nunca por su val'or n u t r i t i v o ! (15).

Entre las variedades más c u l t i v a d a s en Fnéxico s e en-

c u e n t r a l a de Sorghum b i c o l o r (4.) moench, clasificada co-

mo de a l t p > contenido, de t a n i n o s , ros c u a l e s causan proble-

mas de d i g e s t i b i l i d a d cuando s e usa e s t e cereal: como! base

en i-a aximentación de animales no:rumientes CIA) .

11.3. Composición del' Grano de Sorgo.

11.3 .I. Taninos . E l e s t u d i o d e l contenido de tan inos en e l grano de

sorgo! ha adqujlrido gran i n t e r é s . desde que s e encontró.

que l a p r e s e n c i a de é s t o s en al'gunas var iedades , reduce

considerablemente s u v a I o r b i o l ó g i c o , cuando. s e a l imenta

con e l l a s a animales monogástricos y a humanos (16).

a). D e f i n i c i ó n .

Los t a n i n o s s e def inen generaxmente como compuestos

p o l o f e n ó l i c o s , h i d r o s o l u b l e s , con un p e s o moXecular e n t r e

500 y 3 O00 q$/gmolj presentan Tas r e a c c i o n e s clásicas de '

fenoLes. Tienen como c a r a c t e r í s t i c a e s e n c i a l ia capacidad

de p r e c i p i t a r a l c a l o i d e s , g e l a t i n a s y o t r a s p r o t e í n a s . Se

0.

-6-

C

1

W

combinan también con algunos o t ros poliméros como celulo-

sa y pectina (17).

La inhib ic ión de l a 8-glucosidasa (18) y algunas

enzimas d igest ivas como l a t r ips ina, l a ac-arnuasa y l a

l i p a sa (lg),. se debe a l a combinación de l tanino con l a

f racc ión pro te i co de l a misma. La astr ingencia percibida

en e l paladar cuando se ing i e r e taninos, es caueada por

la prec ip i tac ión de l a s proteínas y g l i c op r o t ehas de l a

sa l i va , l o que reduce su propiedad lubricante (141, (15).

ii.3.2. Taninos en Sorgo.

50s taninos que se encuentran en el’ grano de sorgo,

son principalmente de l t i p o de los condensados. Se ioca-

I i izen en e i per icarp io y están asociados con l a pigmenta-

c i ón de l a t es ta 116).

Los taninos condensados son Tos más comunes en e l

r e ino vegetal . Son mezclas de productos de condensación

de moléculas t i p o f laván, combinadas en dimeros, trimeros

o polimeros. Los f lavonoides más importantes que l o s f o r -

man son los fiaván-3-oies o catequinas y los fiaván-3-4-

d i o l e s o leucoantocianidinas. A pesar de s e r economica-

mente muy importantes, han s i do poco estudiados debido a

la d i f i cu l t ad de ana l i zar l a s grandes moléculas por cro-

matografias, ya que éstas reaccionan con i a ceiuiosa de1

papel o con 10s polimeros u t i l i zados como soporte en ca-

pa f i na , dando manchas difusas por l a formación de com-

p l e jos moleculares.

-7-

I LOS únicos compuestos que pueüen s e r separados sa-

tisfactoriamente son ros fiavanes monoméricos y algunos

dimeros, pero es muy d i f i c i l oDtenerlos puros debido a l a

habi l idad que tienen de formar puentes de hidrógeno con

otras moléculas ( 20 ) .

Las fórmulas estructurales de l a s catequinas y Xas

Ducoantocianidinas, son:

Catequinas:

OH

Af cerequina R=R*'=H

Catequina R=OH; R%H

Galocatequina R=R*=OH

(21).

Leucoantocianidinas: i

R

1

b s

Leucopelargonidina R=R*,=H

Leucocianidina R=OH; R*=H

Le ucodelf i n i dina R=R *'=OH

(22)

i3n realidad l a s leucoantocianidinas se encuentran

tan extendidas en e l reino vegetal , que son l a s responsa-

b les de l a s reacciones atribuidas a ros taninos (23).

,

,*

!

L

-9-

' 11.3.3. InteracciÓn con l a s Proteínas.

Se ha sugerido que l a formación de l o s complejos ta-

nino-proteína, se i i e v a a cabo, por t r e s t i pos de interac-

ciones químicas (24), que se describen a continuación:

a). Formación de puentes de hidrógeno entre e 1 grupo

oxh id r i l o (-OH), de l o s f eno les que constituyen l a estruc-

tura de las Teucoantocianidinas, y los grupos receptores

de l a s proteínas (-NH2, -COOHI u otros poliméros.

b). iSnlaces ión icos entre Tos grupos aniónicos de 10s

taninos ( f eno les ionizados o' grupos carboxi loe 1 y grupos

cat ión icos de l o s aminoácidos de l a s proteínas, como el:

grupo amino (-NH2) éps i ion de i a i i s i na .

c). Bnlaces covalentea formados por l a unión entre

quinonas, l a s oue pueden e s t a r formando parte de l a estruc-

tura de l tanino o pueden s e r producidas POT l a oxidación,

y algunos grupos reac t i vos de i a proteína, u o t r o pol i&-

r o . Este enlace es de par t i cu lar importancia, ya que im-

parte gran es tab i l idad s i l complejo' tanino-proteína (20).

L

-10-

. L

bi

‘ 11.3.4. Almidón.

E l almidón e s uno de 1,os carbohidratos más ampliamen-

t e d i s t r i b u i d o s e?l l a natura leza . Se forma a partir de C02

y H20, en las h o j a s y p a r t e s verdes de las p l a n t a s , por medio de l a c l o r o f i l a y l a l u z s o l a r .

E l almidón e s un homopolisacárido, ya que sus monome-

ros son de un só lo t i p o . I g u a r que i a c e l u l o s a , e i almidón

e s un glucano que s e encuentra en e l r e i n o v e g e t a l , s i n

embargo t i e n e grandes d i f e r e n c i a s en s u s propiedades fhi-

cas y quimicas. hl ientras que l a c e l u l o s a t i e n e i a func ión

de s e r v i r como base e s t r u c t u r a l de las p l a n t a s , e l almidón

s e cons idera como f u e n t e de e n e r g í a de r e s e r v a . Se almace-

na en r a í c e s , tubércul’os f r u t a s y s e m i l l a s en forma de grá-

nulos i n s o l u b l e s , los c u z l e s e s t á n debidamente ordenados

para impedir i a d i f r a c c i 6 n de Rayos x (25).

a) . i?ktructura d e l liimidbn.

E1 producto comerciar l’lamado almidón e s generalmente

una mezcla de p o i i s a c á r i d o s . Los p r i n c i p a l e s componentes

son l a amilosa y l a amilopect ina . Los almidones comunes

t i e n e n de un 75-80 % de ami lopect ina y de un 20-25 $

amilosa. Los almidones de c e r e a l e s de t i p o c e r o s o , como ma-

í z , a r r o z y sorgo, cont ienen casi unicamente amiiopect ina

con una pequeña f r a c c i ó n de amilosa (Y% o menos) (26).

de

l

La amilosa e s t á c o n s t i t u i d a de grandes cadenas l i n e a -

r e s de D-Glucosa, l as c u a l e s e s t á n unidas por e n l a c e s

a ( 1 - 4 ) . Bstas cadenas s e encuentran d i s p e r s a s y s u peso

molecular v a r i a de 1x103 a 1x10 5 gr/gm>i. ds poco soiu-

I

.. -11-

b le en agua, pero’ forma nic21as hidratadas l a s cuales dan

un c o l o r azÚl con Iodo . ñn t a l e s micelas l a cadena d e l po-

I i s a cá r i do tome forma he l i c o i da l (27).

La amilopectina es tá altamente rdmificada. La longui-

tud promedio, de l a s ramif icaciones var ía de 24 a 30 r es i -

duos de glucosa., Se encuentran unidas en enlaces a: (1-4),

pero en 10s puntos de rami f icac ión los enlaces son cc(1-6).

La amilopectina da soluciones co lo ida les o ,mice la res l a s

cuales dan un c o l o r ro jo -v io l e ta con Iodo. Su peso molecu-

Tar puede s e r tan a x t o comQ 10 g/gmUl. 8

Cuando e l almidón se h i d r o l i z a con ácidos, se obtiene

unicaniente D-Glucosa como producto de I a h i d r ó l i s i s t o t a l .

La composición der a.lmidÓn d i f i e r e ampliamente depen-

diendo de l a fuente de don¿!e provenga, t a l e s como maíz,

sorgo, papas, etc., (26).

b). Almidón de Sorgo.

E l almidón de sorgo se caracter i za por su composición

d i f e r en t e a l a de otros cereales. Contiene de 20 a 30 % de

amilosa y de 70 a 80 $ de amilopectina en sorgo cornÚn, mien-

tras aue e l sorgo de t i 2 0 ceres0 contiene 1 $ de amilosa y

99 ‘$ de amilopectina (28).

La d i s t r i b u c i h d e l almidón en e l grano, obtenida por

d isecc ión manual d e l sorgo (291, es l a s iguiente:

83 $ en e l endospermo.

1 3 ’$ en e l gérmen.

34.6 $ en l a testa .

I

-12-

. 1.

Los gdnui!oe de aEmid6n &ex endosperm del eosgo’ mm l’igeramente d e grandee que ios der alhLd6nide meh. =den

aproximadamente entzis 1IQ y 25 p bd, de diámetro reepee- tivamente,, on cambio> Tom gránuToe der gerlicsspiio, a d muoh0

pequeños (30) .

c). GeBatfai%mu&n*

LOS t i pos de proteína que se encuentran en e 1 grano

de sorgo son:

Axbuminas T.3 - 1.7 s6 Globulinas 2.0 - 9.3 $

Prolaminas 32.6- 58.8 % (Ka f i r ina )

Gliltel ’ inas 19.0 - 37.4 % (39)

Como se observa, l a ka f i r ina es l a proteína represen-

t a t i v a de es te cerea l , y a l igual’ que l a s prolaminas se sa-

i ’ub i l i za en etanoli a l 70 u 80 $. Son insolubles en agua

al’cohoi e t í l i c o absoluto. y

a) . Composición de ].a i r o t e í na de l Sorgo.

La proteína de sorgo, como i a de otros cereales, t i e -

ne como pr inc ipa les aminodcidos ximitantes i i s i n a y treo-

nina, en primero y segundo lugar respectivamente. Eet ioni-

na, t r i p t o f ano, arginina y g l i c i na , también han sido seaa-

Xados cono aminoácidos Timitantes (40). - sa Ka f i r ina es tá constituida por una a l t a proporción

de ácido giutámico ( i iutamina) y aminoácidos no porares co-

mo leucina e isoleucina, pro l ina y alanina (41). Se ha observado que l a a l t a r e l ac i in : leucina/isoleu-

cina, contenida en esta proteína, causa pelagra cuando se

consumen considerables cantidades de sorgo cotno alimento

de humanos (42).

i

FRBMBNTACION& TRBDICIONALSS

111.1. Generalidades.

En algunos países de o r i e n t e , principalmente a q u e l l o s

que s e encuentran a l s u r o e s t e de Asia, l'os al imentos más n u t r i t i v o s y económicos s e preparan comunmente p o r f e r -

mentación s ó l i d a 01 semisó i iüa de soya y/.) algunos c e r e a -

l e s con hongos f i iamentosos (43) . Tales p r o d u c t o s t i e n e n

una importante c o n t r i b u c i ó n en l a d i e t a de l a gente , como

f u e n t e básica de prote ína , calorías y algunas vi taminas

(44) .

I11 -2. P r i n c i p a l e s Xlimentos Fermentados.

R 1 f r i j o l ' de soya es l'a f u e n t e 0 1 s u s t r a t o p r i n c i p a l

en l a preparación de una amplia var iedad de a l imentos f e r -

mentados. Entre 10s más importantes ss encuentran, princk-

palmente, l o s c u a t r o s i g u i e n t e s : Piso , , Shoyu, Tempeh y To-

fu . E l miso y e l shoyu se c a r a c t e r i z a n p o s su f u e r t e sa-

b o r , por l o que se usan como condimentos o agentes sabo-

r i z a n t e s , más que como'al imentos n u t r i t i v o s . E l t o f u con- t i e n e mayor cant idad de prote fna y grasa, por l o que con-

t r i b u y e sustancialmente en l a n u t r i c i ó n de l o s consumido?

r e s (43) . E l tempeh, e s e l producto más c o m h y estudiado; c o n s t i t u y e l a base de n u e s t r a i n v e s t i g a c i ó n y por ta l ra-

zón, sus propiedades se d e s c r i b i r á n ampliamente en e l pun-

t o 4.

I

!

. U

111.3. Algunos Uicroorganismos U t i l i z a d o s . ,

Generalmente l a l i teratura sobre microbio logia de a l i -

mentos y fermentaciones , micamente menciona e l u s o de es-

p e c i e s de bacterias Acido-Eáct icas , algunos A s p e r g i l l u s y

levaduras , para l a obtención de a l imentos fennentaaos , y

no hace r e f e r e n c i a a l u s o de hongos f i l a m e n t o s o s , d e l orden de Tos mucorales, t a n extensamente empleados en muchos

países A s i á t i c o s desde hace c i e n t o s de años (45). Algunos

géneros t a l e s como Rhizopus, Xucor y Actinomucor, s e ca-

r a c t e r i z a n por s u c r e c i m i e n t o extremadamente rápido. Son

capaces de formar grandes c o l o n i a s sobre e l s u s t r a t o a par-

tir de una s o l a e s p o r a ; producen gran cant idad de enzimas

y hasta donde s e sabe, d i o se han reportado una o dos m i -

c o t o x i n a s de algunos miembros d e l orden de l o s Kucorales

(46) Existe una g r a n c a n t i d a d de especies de hongos que han

s i d o u t i l i z a d o s en las fermentaciones t r a d i c i o n a l e s e n e l

o r i e n t e ; s i n embargo, casi todas e l l a s pertenecen a l o s

géneros ya mencionados a n t e r i w m e n t e . 0

En l a f i g u r a No. X, se mencionan algunas de las espe-

c i e s p r i n c i p a l e s para l a obtenc ión de tenpeh, miao, Shoyu

y t o f u .

Para l a e l a b o r a c i ó n de tempeh se usan además, las s i - g u i e n t e s e s p e c i e s de Rhizopus:

- R. s t o l o n i f e r

- R. orysae

- R. a r r h i z u s

- R. f o m a s a e n s i s

R. achlamydosporuz . (45 1.

., "

3111. do:!

]PO.

A l i - Ter-

Tc' (SO.

"'i?

- -1 6-

i:x:paies alimentos producidos por fermentación de soya y

122s consumidores y estado f í s i c o d e l producto (46). dareales; d i f e rentes especies de microorganismos u t i i i z a -

ñicroorganismo Sustrato Apariencia Pr inc ipa les usado en l a b.dSiC0 de l producto. países con-

I Fermentación - - sumidores.

- R. ol'iposporus soya só l i do

Ac. elegans soya g e l K c o r sp

As. oryzae arroz, pastoso Sc. roux i i soya Y

o t ros cerea les

- As. oryzae soya Y l í qu ido Lactobaci l lus sp t r i g o Saccharomyces sp Hansenula sp

Indonesia

China y Formosa

Japón, China y o t ros luga- res de Oriente

China, Japón, F iUp inas y ot ros países o r i enta l es

-1'7-

111.3.1. Breve Descripción d e l Hongo E= oliRosPoruS-

Uno de los hongos f i iamentosos más ampliamente usa-

dos en l a preparación t rad ic iona l de tempeh en paises o- r i en t a l e s y actualmente en Norte América, es Rhizopus

oligosporus, con l a c l a s i f i c a c i ón NBBL 2710; a is lado pr i -

meramente en e l Regional Research Center de l Cepario de

Peor ia, ILLinois , y ahora también disponible como AYCC

22959 (471.

a). c l a s i f i cac i ón .

La base para l a c l a s i f i c a c i ón e i den t i f i cac i ón de

los hongos ea l a morfología de l a s unidades fi lamentosas

o h i f a s y de su conjunto, a s í como de l a estructura re-

productora (451.

Según Alexopoulus e t a l , l a c l a s i f i c a c i ón de e s t e

hongo s e r í a (46) (48):

Super-reino: Eucarionta

División: Wastigomycota

Subdivisión: Diplomastigomycotina

Clase : Zigomycetes

Orden: Eucorale 8

Familia: Kucoraceas

Gknero: BhiZODUS Oli.&?OSROrUS

I

I

-18-

O t r a forma importante de c l a s i f i c a r a a. ol igosporus

e s l a e s t a b l e c i d a por K ü l l e r e t a l (451, (49 ) .

Reino: V e g e t a l

D i v i s i 4 n 2 Fungi

Subdivis ión: iQunycotha

Superc iase : Phycomycetes ( c l a s e

Clase: Zigomycetes ( s u b c l a s e )

Orden: Muc o r a l e s

Pamil’ia: JEucoraceas

Género: Wizopus ol igosporus .

+

+

+ La d i f e r e n c i a que e x i s t e con l a c l a s i f i c a c i ó n dada por

o.tros a u t o r e s , e s e l cambio de e s t o s términos.

b). C a r a c t e r í s t i c a s P o r f o l ó g i c a s .

- - R. o l i g o s p o r u s , presenta h i f a s no, septadas , pol inucleadas . - Posee es torones y r i z o i d e s poco d e s a r r o l l a d o s que gene-

ralmente s e oscurecen al’ enve jecer .

- P r e s e n t a e s t r u c t u r a s de r e s i s t e n c i a llamadas zigosporas ,

después de una reproducción sexual .

- Cuando l a reproducción es de t i p o a s e x u a l , sus e s t r u c -

turas de r e s i s t e n c i a son esporangiosporas. Se encuen-

t r a n dentro de un esporangio , s o s t e n i d o 3 p o r un esporan-

L

-13-

g i ó f o r o , mediante e s c i s i ó n d e l plasma e n porciones.

- Los esporangióforos son cortos y s e o r i g i n a n en nódu-

l o s , en l o s que también s e forman los r i z o i d e s .

- Los esporangios son grandes y generalmente ne&ro".

- Columela h e m i e s f é r i c a y a p ó f i s i s (base d e l esporangio)

en forma de copa.

- m i c e l i o abundante y algodonoso; puede cont inuar s u c r e -

c imiento h a s t a l l e g a r a l l e n a r l a v a s i j a que l o cont iene .

- Carece de esporangio losr

- Abundantes clamidosporas.

- Las esporangiosporas carecen de paredes gruesas y son de tamaño y medida i r r e g u l a r .

- En medio natural ' v i v e como s a p r ó f i t o .

c ) . Aspectos Bioquimicos y F i s i o l ó g i c o s .

- E s t e hongo s e c a r a c t e r i z a por t e n e r desarro l lado un s b -

tema enzimático a l tamente i i p o i i t i c o y p r o t e o i í t i c o .

- La a c t i v i d a d de s u s i s tema a m i l o l i t i c o es m u y baja y

algunas veces casi nula , dependiendo d e l s u s t r a t o por

degradar.

- Además de u t i l i z a r l i p i d o s como fuente de carbono, puede c r e c e r degradando azúcares pentosas como ia x i l o s a ;

hexosas , como l a g lucosa y l a g a l a c t o s a ; d i s a c á r i d o s

come l a t r e a l o s a y l a c e l o b i o s a , y p o l i s a c á r i d o s como

e l almidón s o l u b l e .

- .No> puede degradar e l t r i s a c á r i d o r a f i n o s a .

,. -20-

- Como f u e n t e de n i t rogeno , además de p r o t e í n a , puede in- y aminoáci- corporar sales de anonio, como L N H ~ ) ~ so4,

dos como asparagina (C H O N ), para c u b r i r sus reque-

r i m i e n t o s p r o t e i c o s . 4 8 3 2

- Cuando se cul'tiva en medio s ó l i d o Ctubos i n c l i n a d o s o'

p l a t o p e t r i ) , presenta c rec imiento superf i c i a i , desa-

r r o l l a n d o gran cant idad de h i fas e s t o l ó n ; penetra a l

medio a t r a v e z de r i z o i d e s . - S u máxima esporulación Ia a l c a n z a d e s p d s de 7 días,

incubado a 2OoC de temperatura, en medio PDA. - bn medio l í q u i d o , dependiendo de l a a g i t a c i ó n , c r e c e

formando pequeñas e s f e r a s conocidas como " P e l l e t s " .

- Por s u s b a j o s requerimientos de oxígeno, s e clasif ica

como m i c r o a e r o f f i i c o .

- P o r l a temperatura óptima de c rec imiento , s e l e c o n s i b -

ra mesóf i io .

,

L

-21-

, 111.4. Tempeh (pronunciado correctamente: Tern-pay)

IiI .4.1. Def in ic ibn.

El’ tempeh es un al’imento fermentado,, de traaicionál.

consumo en Indonesia. Comiste basicamente de soya f rag-

mentada u otras leguminosas y cerea les ( o ) por combinación

de és tos ) fermentados con R. oligosporus. Los fragmentos

de l a soya y/o r o s cereales, constituyen e l sustrato de

l a fermentación, se hayan completamente unidos por un denso y blanco m ice l i o de aspecto algodonoso durante l a

fermentación. Con e l secado e l producto toma una l i g e r a

co lorac ión café y su forma es m u y s im i l a r a l a de una pa-

lanqueta de cacahuate (dulce de consumo popular en nues-

t r o país) . Su sabor es m u y aceptable y t i ene un agradable

y ca rac t e r i s t i c o oilor a levadura u, hongo (47).

IiI 4.2 . Propiedades.

E l contenido de proteína en e l tempeh de soya es a-

r r i b a de l 46 $, en base seca, 6.19.5 6 en peso h6medo

(47). Su excelente d i g es t i b i l i dad , demostrada por Hacitier

-- e t a i (r964) (53) y s u az to val‘or nu t r i t i v o l a constitu-

ye en un buen sus t i tu to de Ila carne en l a d i e t a de huma-

nos. Se ha observado que el’ tempeh obtenido con c u l t i v a

puro de - R. ol igosporus contiene menores cantidades de vitamina Biz, que e l tempeh hecho en forma t rad ic iona l . EB- to- Be debe a que en e l segundo proceso hay una benéfica

-22-

contaminación con l a b a c t e r i a K l e b s i e l l a pneumoniae, l a

c u a l e s responsable de l incremento en el contenido de as-

t a vi tamina, ya que e s capaz &e s i n t e t i z a r l a durante e x

proceso de fermentación ( 4 4 ) (47). También s e ha encontrado que las personas que consu-

men tempeh con regular idad en s u d i e t a , d i f i c i l m e n t e pa-

decen anemia p e r n i c i o s a ( 5 4 1 , causada por d e f i c i e n c i a s de

vitamina B y presentan mayor r e s i s t e n c i a a algunas in- f e c c i o n e s b a c t e r i a n a s (55).

12

CAPITULO I V .

ANALISIS Di3 LA COK?2OGICION Q U B I C A DEL SORGO.

1 V . i . Seiecc ión y Pretratamiento, de l a Semilla.

Para f i n e s de nuestra invest igación, fue neceear io

u t i l i z a r semi l la de sorgo sin t r a t a r con fungicidas n i in-

eect ic idas , u o t ra c lase de agentes químicos de es te t i po ,

para su preservación.

Generalmente cuando se Ievanta l a cosecha de granos,

éstos se hayan infestados por plagas de insectos, a s í

como por algunos microorganismos que constituyen l a mi-

c r o f l o r a natural o nativa, que fác i ihente se desarrol lan

durante su almacenamiento. Por esta razón fue necesario

desarro l la r una técnica que nos permitiera conservar en

buen estado l a semi l la de sorgo, durante l a i n v a s t i g a c i b ,

s i n emplear agentea químicos como se hace comunmente.

i V . 1 . i . Procedimientoi

E1 eorgo. obtenido en el Edo. de Guanajuato, correa-

pondiente a l a cosecha de Septiembre (19811, se d i v i d i ó

en l o t e s de 500 gr y se tamiz¿ en mallas No.8 y No. 10,

con el proposito de obtener granos de tamaño homogdneo,,

así corno, para separar semillas contaminantes, residuos de

eorgo quebrado y basura en general.

de 250 gr y se puso en vasos de precipitados de 1 I t , pa-

ra l a v a r l o t r e s vecee consecutivas con 400 m l de agua

Terminada l a c r iba se subdividid e 1 eorgo en I o t e s

/

-24-

dest i lada a temperatura ambiente y ag i tac ión magnética

durante 5 minutos. Se desechó e l agua de lavado y e l exce-

so de humedad se q u i t & . con papel absorbente. Zn seguida

se metió a secado durante 24 horas a 50 C, en una es tu fa

"Precision" GCA Co. Yodelo> l%,, con cor r i ente de a i r e .

Transcurrido este tiempo se envasó en f rascos de vidrio,

completamente cerrados, de 500 gr, poniéndolos en conge-

l a c i ó n durante 24 horas. Concluido este tiempo se almace-

naron dichos f rascos a temperatura ambiente.

O

Durante e l desar ro l l o de e s t e procedimiento se de jó

un f r asco t e s t i g o que contenía i a misma cantidad de sorgo que los demás, pero envasado con granos unicamente ta-

mizados, con e l ob j e t i vo de observar su deter ioro, a s í

como e l rápido ataque de plagas, durante e l transcurso de

l a invest igación.

1v.2. Extracción de Taninos.

Empleando soluciones de NaOIi, KOH y Na CO , y combi-

naado l a s variables: tiempo,, temperatura y concentración,

se ensayaron aigunos métodos OJ tratamientos con e l fin de

extraer l a mayor cantidad de taninos s i n dañar l a s d i f e -

rentes partes de l a semil la . Algunos estudios a l respec-

to , rea l i zados por Bllessin C.W. e t a l , concluyen que un tratamiento con NaOH a l 20$ a 16OoP i71.11°C), en un ran-

go de 4 a 8 minutos,, se remueve unicamente e l per icarpio,

quedando intactos e l germen y e l endospermo (56).

N8OH o KOH a l 0.276 (0.05V) a 3OoC y 24 horas, o incremen-

2 3

Chavan, J.K. e t a l , reportan que un tratamiento con

. O tandoi l a temperatura a 100 C,. en 20 minutos, se l o g ra ex-

t r a e r de un 75 a 85 $ de l o s taninos t o ta l e s , Tocalizados

principalnente en el: pericarpio. Bajo condiciones s imi la-

res, Na CO se remueve un 77 46; mientras que remojando

con agua dest i lada, unicamente se extrae un 30 $ (57).

Considerando estos resultados y con e l f i n de e v i t a r e l

mínimo daño en l a semil la , se ap l i có un tratamiento térmi- co-alcal ino menos drástico, descr i to a continuación.

2 3

IV.2.l’. Procedimiento.

IniciaiiEente se fijaron l a temperatura y e l tiempo, O de extracción a 50 C y 1’0 minutos respectivamente, mane-

jando cono var iab les tres d i f e rentes concentraciones de

NaOH: 5, 10 y 1 5 $. Preparadas estas soluciones, se adi-

cionaron 25 ml a t r e s matraces erlenmeger de 125 m l , ma-

ne jando cada maestra por duplicado y etiquetando debida-

mente todos los matraces. A continuación se colocaron d i -

chos matraces en un ag i tador g i r a t o r i o con baño de agua

a temperatura constante, Giratory water bath shaker, New

Brunwick s c i e n t i f i c co. model 0-74. Cuando l a s soluciones

en el’ i n t e r i o r de l o s matraces alcanzaron los 50 C s e a-

gregaron 5 g r de sorgo n cada matraz y bajo estas condl-

ciones, se agitó durante 10.minutos. Transcurrido e s t e

tiempo,. se separó rapidamente e l ’ e x t r a c t o de l a semilla

O

se adicionaron 25 Q1‘ be agua dest i lada a cada matraz,

para neut ra l i zar con una so luc ión de ácido l á c t i c o i N, usando un potencibmetro, pH-meter E 520 Vetrohm Herisau.

Posteriormente, l a s muestras fueron puestas nuevamente en

,. , .

-26-

ag i tac ión durante 5 minutos y se midió o t ra v e z e l pH, como había algunas variaciones, se reajustó a 7. Cada

muestra se pasó por una malla No. 20, para separar e l a-

gua de l a semil la, s i n tener pérdidas considerables; e l

exceso de hmedad se qui tó con papel absorbente. Después,

se sometió a secado i a semil la , en las mismae condiciones

d e l punto IV.l. Transcurridas Ins 24 horas de secado se

pesaron nuevamente l a s 6 muestras, con e l f i n de ca l cu lar

e l porciento de materia seca perdida con los tratamien-

tos y se pulverizaron dichas muestras; e l harina se alma-

cenó en pequeños frascos de v id r i o , para comemar la dis-

ponible y en buen estadoy para l as determinaciones poste-

r i o res .

I V . 3 . Determinación de faninos.

Eo8 metodos reportados para l a cuant i f l cac ión colo-

rirnétrica de taninos en sorgo, han s ido modificados y e-

valuados por var ios autores en d i ferentes ocasiones, de-

bido a que l a composición de l a s estructuras po l i f enó l i -

cas de estos compuestos es poco conocida a h , a s í como a

l a interferencia de algunos plgmentos que se hayan asocia-

dos con l o s taninos condensados.

IV.3.l. M6todo de l a Va in i l l i na (W-HCl).

En esta inves t i gacGn e i método seleccionado para l a

determinacldn de taninos es e l establec ido por Burns - e t

- a l (1971) (58), con l a s modificaciones hechas por Naxson-

-27-

/

Booney (1972) ( 59 ) y Price-Butler (1977) (60). Se r e v i s ó

además, l a Última evaluación reportada por Barp F.C.

a l (1981) (61). Este método se basa quimicamente, en l a reacción de

La v a i n i l l i n a con e l a n i l l o "A" de las moléculas de l a s

catequinas g leucoantocianidinas para dar un complejo de

co lo rac ión ro ja , cuya tonalidad depende de l a concentra-

c i ón de estos polimeros.

a ) Procedimientot.

Se pesacon p o r dupl'icado 5 muestras de 500 mg de ña-

rina de sorgo, de l a s cuales 3 fueron de sorgo. con trata-

miento térmico-alcalino, (5,. IO JT: 1'5 % de NaOH),

muestras de harina de sorgo sin tratamiento. A I mismo dos

tiempa,. se colocaron en el' ag i tador g i r a t o r i o los matra-

ces erlenmeyer de I25 m l , l o s cuales contenha 25 mT de

RCI: a l 1% en metanol, cuando, l a solución aTcanzÓ los 40QC,

se agregaron los 500 mg de harina de cada muestra, a los

respect ivos matraces previamente etiquetados. se a g i t ó au- rante una hora . Los tapones de hule. usados para Tos ma-

t races , se cubrieron con papel garafilm,. para e v i t a r que

fueran atacados por e l HCT y se leberaran grupos sul fhi-

d r i l o j d e l hüke,, los cuales a f ec tan l a absorbancia de las muestras (14).

Después de i a ag i tac ión, se centr i fugd e r ex t rac to

a 3500 rpñi durante TO minutos. Del' sobrenadante se toma-

ron 2 al icuotas de 1 ml, de l a s cuales una fue u t i l i z ada

para l a reacción con v a i n i l l i n a y l a o t r a para e l blanco.

-2%

.

Para Xa determinación se agregaron 5 mi de l a mezcla reac-

ción: v a i n i l i i n a a i 4 $ d isue l ta en metanoi y HC1 a l 8 $

en metanoi, mezclados en proporción.T:i; e s ta mezcla se

preparó a l instante de s e r usada, pues por oxidación se

a l t e r a su c o l o r de blanco a amari l lento.

B1 blanco de cada muestra se preparó agregando 1 m i

de ex t rac to a 5 mi de o t ra mezcla semejante a l a de reac-

c i ón pero ?a v a i n i l l i n a fue sust i tu ida por HC1 (2.5 m l de

HC1 a l 4 5 en metanol + 2.5 ml de HC1 a l 8 s6 en metanol),

88 üecir , 5 m l de una solución de HC1 en metanol a l 6 5. A p a r t i r d e l instante en que se adicionaron l a s mezclas

de reacción, con in te rva los de medio minuto entre tubo y

tubo, se cronometraron 20 minutos para toner l a e lec turas

de absorbancia en un espectrofot&netro Bausch and Lomb,

Spectronic 20, puesto a funcionar una hora antes. Ajustan-

do a cero, momentos antes de s e r usado, con 6 ml d e l reac-

t i v o MV-HCl a una longuitud de onda de 525 nm. Por ot ra parte, el sedimento obtenido> en los tubos

después de l a centr i fugación, se resuspendiói con oitros

20 m l de HC1 a l 1’ $ en metanol, agitando vigoroeamente en

un Vortex-Genie, y se t r a n s f i r i ó a los matraces de 125 m i

para e fec tuar una segunda extracción, incrementando e i

tiempo, a doe horas Pasado e s t e tiempo, se hizo! l a deter-

minación de l a misma manera que l a primera vez. Con e l

sedimento> se e fec tuó~uas Última extracc ión durante 3 ho- rae B se r e p i t i ó i a determinación.

-29-

b). Curva Estandar. ?

Debido) a que no, fue posible adqu i r i r l a D-catequina,

i a curva patrón se preparó empieando.taninos naturales obtenidos de Acacia (Donados por Interco s. A,) con un

grado de pureza d e l 71.7 $, procediendo, de l a s iguiente

manera:

139.47 mg de taninos fueron pesados y disueltos en

una solución de HC1 a l 1% en metanol, a forando,a 50 m l .

Con e l f i n de separar l a materia insoluble, se filtró a

vac í o ut i l i zando una capa doble de papel Watman Nb. 5. A p a r t i r de esta solución s tock se prepararon i o di luciones,

variando l a concentración de 0.02 a 2 mg/ml!. En seguida

se tomaron a i icuotas de i m l de cada diluci.6n y se trans-

f i r i e r o n a tubos de ensaye que contenían 5 m l de l a mez-

c l a r eac t i vo ETV-HCl. Transcurridos 20 minutos se leyeron

l a s absorbancias de l a s 10 muestras.

iía preparación de l a curva patrón se hizo, junto) con

l a de las primeras extracciones de l a s muestras problema,

con e l f i n de tener un Zote de Xecturas.

IV.3.2. Método del: Complejoj Azul de Prusia.

Price y Butler (1977), (60) desarrol laron un método

cuantitativo para determinar feno les t o t a l e s en e l grano de sorgo, 20s cuales son capaces de reducir e l cl’orurs

i 6 r r i c o a c loruro f e r roso y éste reacciona con e l f e r r i -

cianuro Be potasio dando e l complejo soauble ferr ic ianuro j

i6 , r r i co de potas ia , cónociao.como h u i de Pruaia.

in ic ia lmente l a mezcla r e a c t i v a de c i o rum férricob y

- -30-

f e r r i c ianuro de potasioxes amari l la , pero en presencia de

pequeñísimas cantidades die los reductores fenó l icos , una

parte de l f err ic ianuro , reacciona con e l ión f e r roso ya

reducido por l o s fenoles, para producir e l pigmento azul

que es d i lu ido en e l r es to d e l f e r r i c ianuro en solución,

apareciendo una coloraci6n verde, que cambia a turquesa

y a azul en presencia de mayores concentraciones de feno-

les.

a)!. Erocedimiento.

La extracción de los taninos condensados fue hecha

en tuboe de centr i fuga con 6 nrl' de HC1 a2 l% en metano1

y muestras de 60 mg de harina de sorgo, a l o s d i ferentes

tratamientos y s i n t ratar , pesados en portaobjetos. Los 8

tubos que contenían e l harina y e l solvente fueron tapa-

dos con papel parafilm y se agi taron durante un minuto en

un ag i tador vortex-genie. Inmediatamente después ae cen-

trifugó a 3500 rpm durante 10 minutos. EI sobrenadante

se diluyó. en 50 m l de agua desti lada, contenida en matra-

cea erlenmeyer de 125 m l y e l aedimento se suspendió con

6 ml de agua desti lada, agitando duxmiiie un minuto. En seguida se centrifugó., adicionando e l sobrenadante a Tos

matraces respectivo€?, y se de jó reposar durante 30 minu-

tos, con e i propósito de que Be el iminara ex a i r e aisuel-

to, en e i metanox durante i a extracción.

Transcurrido e s t e tiempo, se agregaron 3 m l de l a so+

X!uciÓn de c loruro f d r r i c o 0.1 iU dieue l to en HC1 0.1N g 3 mT de f e r r i c ianuro de potasio 0.008 E, cronometrando el!

c

-31-

.

e l tiempo. de adic ión; a los 10 minutos se l e y ó l a absor-

bancia a 720 nm, a jwtandm el' espectrofotómetro, Varian-

Techtron rodelo. 634, a cero con una d i luc ión preparada de

i,cgaal forma, pero omitiendo e l extracto de harina de sor-

eco *

b). Curva Patrón.

De l a misma manera que en e l método de E V - H C l , l a

curva estandar se construyó emplean do^ taninos condensadcm

naturales, en i-ar de ácido tanino como sugieren algunos

autores, por considerar que a i ser és te un tanino s inte-

tico e h idro l i sab le , es menos representativo.

Se preparó una soluci&n stock con 139.47 mg de tani-

nos disue l tos en HC1 a l 1$ en metanal,. aforando a IO0 m l d

Se filtró, dicha solución y a p a r t i r de és ta se prepararon

l a s d i f e rentes d i im iones , variando i a concentración de

EO a 1'50 y9/"1. Posteriormente, se s iguió e l procedimien-

t o descr i to en e l primer inc i so , procurando l e e r l a s ab-

sorbancias, tanto de l a curva patrón como de las muestras,

en un sólo l o t e .

h e d i a t a m e n t e después de terminar e i l o t e de lectu-

ras, l a s f o toce ldas fueron lavadas perfectamente con una sozucián saturada de ác ido oxái ico, ya que el: c o l o r de

e s t e complejo se impregna demaaiado y resu l ta muy d i f i c i l !

qu i tar lo , si. se deja t ranscurr i r algún tiempo.

c

-32- ,

I IY.4. Determimación de Almidón. \

I

La cantidad de almidón presente en e l grano de sor-

go. u t i l i z ado , se determinó por e i método de Fairbairn,

(621 e l cual se basa teoricamente en l a h id ró l i s i s t o t a l

d e l almidón con e l reac t i vo de antrona (obtenido con an-

trona pura d isue l ta en ácido> su l fú r i co concentrado). Es- t a mezcla r e a c t i v o h id ro l i sa dichos porímero hasta su uni-

dad más simDie que es i a giucoea, y es ta forma un queia-

t o co l o r ido con l a antrona. Dependiendo) de l a concentra-

ci6n de glucosa i a coioracihn va r í a desde un tono verde

Timón transparente hasta azu l oscuro.

En e l primer paso ente técnica, es l a extracción de

1’0s carbohidratos t o ta l e s contenidos en l a s muestras de

harina de sorgo, En seguida, a l almidón se separa de a d -

care8 sojLubles como glucosa,. fructuosa y sucrosa (16), prhcipaihente, . empleando para e s t e f i n una eoiución

e tano i a i S@$. Posteriormente, se procede a d i s o l v e r e 1

almidón de l a f r acc i ón s ó l i da obtenida después de l a ex-

t racc ión e tanói ica , adicionando. una s o ~ u c i ó n de ácido1

pe rc l ó r i co a l 52%. que es un excelente so lub i l i zante de

dicho po l isacár ido , (63). 21’ almidón a s í 8olLibil izado se

a i s i a por i a formación de un querato co;lorido (armidón-

yodo) que se l o g r a al‘ ad ic ionar una solución yodo-yoduro

de potasior E1 complejo a s í formado,, e s desintegrado en almidón y Iodo. Una ve z l i b e rado e l ’ almidón se determina

co~orimetr icamente con er r e a c t i v o ae antrona.

de

-33-

a ) . Procedimiento.

Preparación de l a s muestras. Se pesan 500 m~ de se-

m i l l a de sorgo sin t r a t a r y se muelen hasta obtener una f i n a harina que pase por marla No. 40. Se toman 2 mues-

t r a s de TOO mg, y 6 más de harina de sorgo sometido a l oa

3 d i f e r en t es tratamientos térmico-aicaiinos.

Bxtracci6n de Carbohidratos. Pesadas l a s 8 muestras,

se t rans f i e ren a tubos cónicos de centr i fuga de 50 m l , hu-

medeciendo e l harina con 3 gotas de e tano i a i 80 96. Se

agregan 5 m l de agua dest i lada y se a g i t a vigorosamente

en un ag i tador Vortex-Genie, 2 minutos. En seguida los tubos se sumergen durante 2 minutos en baño de agua cal ien-

t e , entre 60 y 65 OC. Transcurrido e s t e tiempo, se sacan

y se l e s agrega 25 mr de e tano l a l 80 $ g nuevamente se

ag i t an 5 minutos, a a l t a velocidad. Poster iomente , los tubos se ponen o t r a v e z en e l baño p o r dos minutos y sea-

gitan. Ea mezcla se en f r i a a temperatura ambiente y 88

centr i fuga 10 minutos a 3500 rpm. Los sobrenaaantes 8e de-

sechan y a l o s sedimentos empacados en ToB tubos, se les rypricrr ex mismo tratamiento, de extracción 3 veces más.

SoXubilizaciÓn d e l AlBiiidÓn. Terminada l a extracc ión de

Toe carbohidratos, se adicionan 5 mP de agua dest i lada a l

& . i d o contenido en los tubos y se ag i t a fuertemente has-

t a homogenizar l a mezcla; en seguida l o s tubos se meten

en baño de agua h i r v i en t e durante 15 minutos. Se en f r ían

a temperatura ambiente y se l e s agrega 6.5 m l de ácido>

-34-

percl6ri.c temperalaid ambiente, se sacan dichos tubos y se ag i tan

3 veces en lapsos de 5 minutos. Después de es ta ag i tac ión

se l e s adiciona 20 m l de agua dest i lada, se ag i tan y se

centr i fuga 15 minutos a 3,500 rpm. E1 sobrenadante obte-

nido se t rans f i e r e a un matraz aforado y el‘ sedimento1 se

resuspende con 6.5 m l de ác ido percPÓrico; se agregan 1’0

m l de agua dest i lada, se homogeniza y se centr i fuga como en e l caso anter ior . E l sobrenadante se t r ans f i e r e a l ma-

t r a z y e l sedimento se desecha. Se a fo ra con agua desti-

Yada y e s t e ex t rac to se f i l t r a en un embudo con f i l t r o

de v i d r i o o en un buchner con f i l t r o de lana de v id r i o .

Formación de l Quelato Almid6n-yodo. Se toma una a l í cuo ta

de 1’0 r n l y se t rans f i e r e a un tubo. de centr i fuga, ad ic io-

nando 5 m1’ de NaCl a l 20% y 5 ml. de yodo-yoduro de pota-

sio, se a g i t a en Vortex 3 minutos y se deja reposar 20.

En seguida, se centr i fuga 1’0 minutos a 3,500 rpm; se de-

secha el’ sobrenadante, separándolo cuidadosamente para

e v i t a r pérdidas de l sbi ido, ex cual ’se l a va 2 veces con

10 ml de cl’oruro) de sodio en etanol‘, agitando) 4 minutos

en vor tex a a l t a ve loc idad y centrifugando 10 minutos a

3,500 rpm. En cada lavado1 se desecha el’ sobrenadante.

a l 52%. Se ponen 2 minutos en baño agi tado a

A l só l ido jobtenido en cada tubo se l e agrega 4 ml’ de

una solución de NaOH etanÓ1ico.i 0.25 N y se a g i t a hasta

que e l c o l o r azu l desaparezca completamente. Estas solu-

aiones son centrifugadas a 3,500 rpm 10 minutos, dese-

ciiando el! sobrenadante. S l s ó l i d o de l o s tubos se l a va y

.

.

1)

L

-35-

se centri fuga, como en el’ caso anter ior . B1 sedimento la -

vado se s o lub i l i z a agitando vigorosamente con 5 m l de a-

gua dest i lada a 65 C. Las soluciones que se obtienen son

t ransfer idas a matraces aforados de 50 a, lavando 10s

tubos de centr i fuga con agua dest i lada 3 veces y l a s aguas

se adicionan a l matraz afomndo finalmente con agua des-

tilada.

O

b). Determinación.

De cada matraz se tomó una a l ícuota de 1 ml de l a

solución de almidón, que contiene aproximadamente de 20

a 200 p? Y se di luye a 10 ml’ con agua desti lada. De es-

ta nueva solución se toman por duplicado ai ícuotas de i

m l y se di luyen a 2 con agua desti lada. Los tubos con es-

ta solución su sumergen en h i e l o frap.pé, hasta que l a

temperatura sea aproximadamente de 4 C, y se l e agregan

10 m l de l r eac t i vo de antrona, también a 4 C y se ag i t a

suavemente sin sacar los d e l baño de h i e l o - Una vez que l a

mezcla adquiere un c o l o r amar i l lo o amarillo-verdoso, se sacan l o s tubos y se meten a un bazo de agua h irv iente ,

durante 15 minutos o hasta que desarrol len su &imo co-

l o r . Transcurrido e l tiempo necesario,, se sacan rapida-

mente y se pasan a un baño de agua f r í a . cuando su tempe-

ratura es igual a de1 ambiente se l e en l a s absorban-

cias a 620 nm en un espectrofotómetro Spectronic 20, pre-

viamente ajustado a cero con e l r eac t i vo de antrona tra-

tado de l a misma forma que l a s muestras.

O

O

.

c

-36-

c). Curva Estándar

La curva patrón se prepara con i o di luciones de

D-Glucosa, variando l a concentración de O a 200 /llghll;,

siguiendo e l misma. procedimiento para l a determinación de

a lb idón en l a s d i f e rentes muestra8 y tratadas junto con

éstas . XV.5. Determinación de Proteína.

Los métodos seleccionados para e l a n á l i s i s de prote i -

na, en e s ta invest igac ión fueron: Biuret y Rjeldahl. Pa-

ra l a s muestras de harina de sorgo se u t i l i z ó Kjeldahl’,

miestras que l a proteína de l a biomasa se determinó p o r

ambos métodos, descr i tos a continuación.

IV.5.1. ?&todo de Biuret.

i3sta tdcnica color imdtr ica, descr i ta por Herbert fi - a l (641, es una de las más empleadas para l a determina-

ción de protefna en cé lu las microbianas. Se basa en l a

formación de l quelato Cobre-proteína que da una coloración

sa&-violeta, en soluciones aicarinaa.

En es ta determinación se requiere l i a a r previamente

l a s cé lu las con una solución concentrada de NaOH, para que sua proltefnas sean l iberadas a l medio y éstas puedan

reacionar con e l su l f a t o de cobre acuoso, agregado.

La mezcla e s centrifugada con e l f i n de separar e l exceso de cobre jun to~con e l NaOH y o t ros residuos celu-

la res .

1

I

.

En e s t e método, s i n embargo, puede haber algunas i n -

t e r f e r e n c i n s debidas a elevadas concentraciones de gluco-

sa u o t r o s azúcares reductores que s e caramelizan con e l

calentamiento alcal ino, dando; un c o l o r amarillo f u e r t e ;

a s í como a l a p r e s e n c i a de substanc ias que reducen e l

s u l f a t o de cobre a 6xido de c o b r e , por l o cual es reco-

mendable s e g u i r cuidadosamente l a t é c n i c a de pesar un

máximo de 5 mg de muestra en base s e c a .

a),. Procedimiento.

Con e l f i n de obtener s u f i c i e n t e rnicelio. para l a de-

terminación de p r o t e h a p o r los métodos de B i u r e t y Kjel -

d a h l , primeramente 88 prepararon 4 F a t r a c s a erlenmeyer

de 500 m l , l o s c u a l e s contenían 300 m l de un medio e n r i - quecido, cuya composic ión e s is s i g u i e n t e :

Glucosa Peptona

K2H?204

Ext . Cev.

Bio t i n a

CaC12

N a C l

PH

1 5 g r h t I1 8

2

2

U

U

80~1'0-~ u

11 0.1

0.1

4 -5

~ e s p u 6 a de s e r debidamente e s t e r i l i z a d o s , dichos ma- t r a c e a fueron inoculados y puestos en a g i t a c i ó n a 3 4 ' ~ y

5 unidades de ve loc idad, segiui is e s c a l a d e l a g i t a d o r (SIiratory water bath shaker , New Brunwick s c i e n t i f i c co .

-38-

Rodel G-74. El ’w t ra z que s e r í a u t i l i z ado para l a técnica de biu-

ret, unicamente se de jó en ag i tac ión 24 horas, los demás

se dejaron 84.

E l mice l i o d e l primer matraz fue separado de l medios

de crecimiento f i l t d n d o l o a vac ío en un embudo buchner,

con papel’ f i l t r o NO.. 4 y lavándolo a i mismo tiempo con

agua desti lada, var ias veces. Después del último lavado,

e l m i ce i i o fue t ransfer ido a un macerador de t e j i d o s ma-

nual, marca Pyrex, con el: propósito de obtener una suepen-

siÓn completamente homogdnea. De esta suspensión de mice-

l i o se tomaron 4 al ícuotas de 2 m i , de l a s cuales 2 se u t i l i z a r on para l a determinación coior imétr ica y l a s o-

t r as fueron t ras fe r idas a c r i so l e s , previamente puestos

a peso constante, con e l f i n de obtener e l peso seco de

l a biomasa contenida en l o s 2 m l ocupados para l a reacción

coior imétr ica.

Las muestras usadas para l a cuant i f i cac ión de prote í -

na se pusieron en tubos cónicos de centr i fuga, adicionan-

do 1’ m l de NaOH 3 N a cada tubo. En seguida los tubos se sumergieron en baño de agua hi rv i ente durante 5 minutos.

Transcurrido e s t e in te rva lo de tiempo, l o s tubos se pasa-

ron a un baño1 de agua f r í a , y cuando l a temperatura de

éstos iguaIÓ a l a de l ambiente, se agregó 1 m l de una so-

IUciÓn acuosa de su l f a t o de cobre a l 2.5s (p/v), se tapa-

ron con papel paraf i lm y se ag i taron fuertemente. Después

de 5 minutos de reposo :Los tubos son centrifugados a

P0,OOO rpm durante 10 minutos. E l sobrenadante obtenido

.

- -39-

se l e y ó en un espectrofotómetro Bausch and lomb Spectro-

n i c 20 a 555 nm. Por ot ra parte, e l m i ce l i o contenido en los 3 matra-

ces restantes fue separado de l medio de crecimiento de

l a misma manera que e l anter ior . Después de s e r lavado se

sometió a secado durante 24 horas a 7OoC y se molió para

tener e l harina l i s t a para l a determinación de proteína

por e l método de KjeldahX.

ml' de agua dest i lada en lugar de proteína eetandar o s w -

pensión de cél'ul'as. & t e blanco se m a para a justar

espectrofotómetro a cero, o bien, se l e e y l a absorbancia

de éste se resta a las de l a s muest&s.

Se prepara junto con l a s muestras, un blanco con 2

e l

b). Curva Estándar.

&a proteína de las muestras fue caicuiada ut i l i zando

una curva patrón de Absorbancia vg mg de proteína están-

dar, preparada de l a s iguiente manera:

Se tomaron 2.27 ml de una solución s tock de Q-Albu-

mina a i 2246 (p/v) y se i i e va ron a 100 mi. h p a r t i r de es-

ta solución se obtuvieron las s iguientes concentraciones:

0.5, 2, 2, 3, 4 y 5 &mi. Posteriormente se s i gu i ó e l

mismo procedimiento que en l a s muestras, hasta terminar

i s técnica.

.. -4.0-

IV.5.2. ?&todo de Kje ldahl .

E l método más usado para l a determinación cuantita- t i v a de proteína en granos, es e l de K je ldah l (65). No

es recomendable usar técnicas colorim&ricas, como Biuret

o Folin-Cicalteau, debido a l a in te r f e renc ia de taninos,

almidones y o t ros compuestos so lubi l i zadoe con e l NaOH

empzeado para l a l i s i e ce lu lar .

El método de Kje ldahl , se basa en l a oxidación d e l

nitrogen0 de l a materia biorgánica, por ebu l l i c i ón con

H2S04 concentrado, hasta amoniaco, e l cual con e l exceso

de ácido queda como su l f a t o de amonio.

E1 hidrógeno y e l carbono de l a materia son oxidados

hasta R20 y C02. La ve loc idad de reacción de es te proce-

so ox ida t i vo 8e incrementa adicionando un cata l i zador que

puede s e r F2S04, Óxido de mercurio, su l f a t o de cobre an-

Hidro, omuna mezcla de sulX'ato f e r roso y se lenio.

Después de l a ebu l l i c i ón (d igest ión t o t a l ) e l amonia-

co se l ibera por adición de NaOH y se d e s t i l a recibiendo-

se en una soluci6n de ácido bór ico a l 496.

Reacciones:

l-. Digestion:

3 C H O N S + (muestra ) H2S04

A H2S + H20 + GO2 + NH

NH + H2S04(exceso) ( m4 ) p4 3

-41-

! 2. Des t i lac ibn:

i Na2S04 + NH t+ H2Q, 3 (NH4)2S04 + NaOH

B N H 3 + H B 0 - 4 8H + H2B03

3 3

3 0 Tlitulación:

Nñ4Cp + H BO ( v i r e ) 3 3

C d l C u l O S :

(V HCG- V HCBB) x 0.014 x N X I00 $ N’= I? de M

$ N = Porciento de nitrogen0 en l a muestra

V HC1,= Volumen de HCl gastado en l a t i t u l a c i ón de l a

V H C ~ B = Volumen de HC1 gastado en l a t i t u l a c i ón del’ blan-

N = Normalidad e l ácido t i tu lante .

P de M = Peso de l a muestra, en gramos.

$ P = Porciento tie proteina.

f n f a c t o r de conversión, de porciento de a t r o g e n o a par-

muestra. ‘

co.

c i ento de proteina.

. -4.2-

i) . Procedimiento.

2 . Diges t ión . Se c o l o c a 2 g r de l a muestra en un ma-

‘Faz k j e l d h a l de c u e l l o l a r g o y se agregan 3 g r de mez- !la d i g e s t o r a , pesando cuidadosamente. S e c a l i e n t a e l ma-

+az y s e agregan 20 ni de á c i d o s u l f ú r i c o . En seguida,

% cont inúa l a d i g e s t i ó n hasta que l a mezcla reaccionan-

% quede completamente i n c o l o r a y luego durante 30 minu-

$09 más.

2. D e s t i l a c i ó n . Tenninada l a d i g e a t i ó n , s e e n f r f a n

;as muestras y s e lea agrega 1 5 0 ml de agua d e s t i l a d a ,

%O ml de NaOH al: 4046 y dos g o t a s de f e n o l f t a l e h a , para

k r s i l a s o l u c i ó n e a básica ( c o l o r rosa) : s e l e agrega

. ,araf ina , como antiespuman$e y polvo de z i n c , como cata-

Zizador. s e conec ta e l matraz a uc r e f r i g e r a n t e cuya sa-

: i d a ea sumergida en 70 m l de á c i d o b ó r i c o a l 4% y g o t a s

:e anaranjado o r o j o de meti lo , . hasta o b t e n e r un volumen

% 1‘40 m l , aproximadamente.

3. Valoración. Después de l a d e s t i l a c i ó n s e d e j a n

< a f r i a r l as muestras y s e v a l o r a n con á c i d o c l o r h í d r i c o

‘$.I Nt hasta e l v i r e a c o l o r naranja o r o j o t dependienda

C.el’ indicador u t i l i z a d o .

Se prepara también, un blanco y un estándar . El ma-

h a z con e l b lanco c o n t i e n e todos ros r e a c t i v o s excepto

Ea muestra: e l e s t á n d a r c o n t i e n e un compuesto) cuya c a n t i -

Oad de nitrogeno. e s conocida.

CAPITULO V.

i FERM?NTACION.

v.1. Preparación de l Sustrato.

El’ primer paso] para Xlevar a cabo) e s t e proceso f e r -

mentativo, fue l a ppricación de ros tratamientos térmico-

aicai inos,. seleccionados para l a destanización parcial’

d e l sorgob siguiendo e l procedimiento descr i to en e l pun-

t o IV.2.1. ; ut i l i zando en es t e caso ) l o tes de 250 g para

cada una de l a s d i ferentes concentraciones de hidroxido

de sodio,, y- modificando el’ pH a 4 con ácido l á c t i c o . Des-

pués d e l tratamiento, se f racc ionó e l grano y se aimace-

nó en f rascos de v id r i o .

V.2. Obtención del’ Inócul-o.

Con e l f i n de obtener una cantidad su f i c i ente de es-

poras se prepararon 10 tubos incl inados de 75 m l . C i n c o

de los cuales contenían 15 m i de medio papa, dextrosa

agar (PDA) y 1’0s ot ros cinco fueron preparados con 4 gr

de sorgo>fraccionado, s i n tratamiento)térmico-aicaiino 9

adicionando, 8 ml’ de agua dest i lada, acidulada con ácido

l á c t i c o a pH 4 y con ol igoelamentos (ADACLO). Poster ior-

mente l o s tubos fueron e s t e r i l i z ados a 15 lb/in , duran-

t e 1‘5 minutos, e inoculados con esporas de l’a cepa o r i g i -

nal’ de R. oligosporus, c l as i f i cada en e l cepario como

ATCC-22959, y se incubaron a 32OC durante 5 días (51),.

para que alcanzaran su máxima esporuación.

~r

2

.

-44-

La suspensión de esporas para ei i n ó c u i o s e obtuvo I

de l a s i g u i e n t e forma:. Hanteniendo la e s t e r i l i d a d , s e Bdicionaron 1 5 m l de

agua ADhCLO e s t é r i l a cada uno de Tos tubos con medio €DA

y fueron ag i tados vigorosamente en un a g i t a d o r v o r t e x ,

teniendo cuidado de no d e s t r o z a r e l medio. t a suspensión

homogénea obtenida e n los tubos f u e t r a n s f e r i d a a un ma-

t r a z erlenmeyer de 100 nil, previamente e s t e r i l i z a d o .

V.3. Primer Proceso de Fermentación.

Una vez preparado el! s u s t r a t o y obtenido el kiócul'o,

s e procedió, a e f e c t u a r l a fermentación, en l a que se ma-

ne j ó POT dupyicado sorgo a cuatro ' d i f e r e n t e s condic iones :

Sorgo sin t ra tamiento (SST).

Sorgo con t r a t a m i e n t o a l 5% (SCT5). Sorgo .con t ra tamiento a i 10% (SGTIO).

Sorgo. con t ra tamiento a l 15% (SCTT5).

B a t e primer proceso f e n n e n t a t i v o s e divididaen dos l o t e s :

a). Lote con s u s t r a t o sometido a e s t e r i l i z a c i ó n .

b). Lote con s u s t r a t o sometido a t ra tamiento a s é p t i c o

En e 1 primer l o t e , porciones de 3 gr de s u s t r a t o

fueron t r a n s f e r i d a s a ocho. cajas p e t r i pyrex (60x15), a-

dicionando 5 m2 de agua ADACLO. Poster iormente l a e cajas 2 p e t r i fueron oster i i ' izadas e n autoc lave a 1 5 lbf/in de

p r e s i ó n , durante 15 minutos. Después de l a e s t e r i l i z a c i ó n

se procedi& a i n o c u l a r 'todas las cajas p e t r i con t r e s m i

-45-

O de suspensión de esporas y se incubó a 32 C durante 96

horas. En e l segundo Tote, ocho muestras de 3 g r de sustra-

to , fueron sometidas a un tratamient0.de asepcia que con- s i s t i & , e n mantener dichafl porciones dentro de una estufa

a 65OC de temperatura, durante 6 horas. Despds de e s t e

tratamiento, l o s d i f e rentes t i pos de sustrato se trans-

f i r i e r o n a su9 respect ivas ca jas p e t r i pyrex (60x15), es-

t é r i l e s y debidamente etiquetadas. En seguida se l e s adL-

cionaron 5 ml de agua ADHCLO es té r i l ’ y se dejaron remojar

p o r una hora; transcurrido e s t e tiempo, los medios fue-

ron inoculados con 3 m i de suspensión de esporas e incu-

bados junto con e l l o t e anter ior .

Bn ambos casos se s i gu i ó l’a fermentación, haciendo

observaciones cada 6 horas; és tas s i r v i e r on basicamente

para mejorar e l segundo proceso.

V.4. Humedad de l Medio.

Ca humedad de lbs medios de fermentación se calculd

considerando ros m i l i l i t r o s de agua agregada en forma de

i n k d o , y i a empleada para i a e s t e r i l i z a c i ó n o e l remo-

jo\ del’ sustrato, La humedad i n i c i a l d e l sorgo se tomb>

como! cero. De es ta manera, l a humedad r e l a t i v a de los me-

dios se obtuvo con el’ cociente de l a ecuación dada: i

$ h p (A + B) TOO (A + B + C )

.

L

-4 6-

$ h = porciento de humedad i n i c i a l d e l medio

A = masa de l agua agregada como inócuio.

B = masa de l agua agregada para l a e s t e r i l i -

zación o remojo d e l sustrato.

C = masa del sustrato.

v.5. Segundo, Proceso1 de Fermentación.

Este proceso e fectuó siguiendo e i procedimiento an-

t e r i o r , pero modificando algunos parametros, en base a Tos resultados obtenidos en e l primer proceso fermenta-

t i v o .

l’). Se increment6 l a humedad de l mediob. adicionando 6 m l de agua en todas l a s cajas pe t r i .

2). 61‘ tamaño del’ inóculol también s e increment6 a 4 idl,

en lugar de t res , con l a misma concentración de

esporas, aproxiaadamente.

3). Se suprimió, l a fermentación en e l medio) et iqueta-

do, como SCTl’5.

4 ) . BE tiempo de fermentación se redujo, a 72 horas.

5 ) . Después de ia e s t e r i l i z a c i ón , e l sustrato conteni-

do en loa p la tos p e t r i , fue removido para desempa-

Carlo, ya que con e l c a l o r y l.a humedad, e l almi-

d6n de i a semi l l a se g e i a t in i za , d i f i cu l tando Ta

penetración de l a s h i f a s d e l m i ce l i o hasta e l fon-

Bo de l a caja. Esta operación se e fectuó mantenien-

do l a s condiciones de e s t e r i l i d ad en e l medio.

L

-4.7-

. En ambos Totes se posaron l a s cajas p e t r i entes de

meterlas a incubación.

V,6. Prueba de Sebanado.

En estos procesos de fermentación s ó l i da es m u g importante determinar l a textura y comis t enc ia d e l produc-

to , debida a l crecimiento y penetración de las h i f a s d e l hongo en e l sustrato. Por esta razón se ap l i ca l a prueba

de rebanado, l a cual consiste en hacer var ios cor tes

transversales 9; examinar l a s fracciomes en microscopio de

disección para observar l a distr ibución del’ m ice l i o sob=

e l sustrato, Xsta prueba se apXica antes de someter ei!

producto a secado.

V.7. Secado d e l Alimento.

Al’ terminar e l proceso de fermentación y despds de

r e a l i z a r l a prueba anterior,, e l al’imento,fue sometido a secado, en una estufa a 70 C durante’ 1’6 horas. Después

de este tiempo, las cajas que contenían e l producto se dejaron en f r ia r , hasta temperatura ambiente, y se pesa-

ron nuevamente.

O

Por Úl-timob. l’os diferentes Zotes fueron pu lver i zadw

e l contenido de proteína s e determinó por e l &toa0 de

kje ldahl , descr i to anteriormente, en e l punto LV.5.2.

-4 8-

.

I V . 8 . Permentación Sumergida. I

Con l a f i n a l i d a d de v e r i f i c a r s i hubo h i d r ó l i s i s de I

almidón, y pérdidas de p r o t e í n a durante el: t ra tamiento t é r m i c o - a l c a l i n o a p l i c a d o a l a s e m i l l a , se prepararon d i -

f e r e n t e s medios para fermentación sumergida, u t i l i z a n d o

eT e x t r a c t o de dichos t r a t a m i e n t o s ; y suponiendo que de

haber almidón y p r o t e í n a s o l u b i l i z a c o s y d i s p o n i b l e s e n

e l e x t r a c t o , R. o l i z i s p o a seria cap& de c r e c e r b a j o e s -

tas condic iones .

Considerando oue e l almidsn es e l p r i n c i p a l coaponen-

t e d e l sorgo y que s e encuentra , aunque en bajas c a n t i -

d a d e s , e n las &pas más cercanas a l a cáscara de l a s e v i -

l l a , s e r i a f a c t i b l e una h i d r ó l i s i s de éste s i n afectar e n a b s o l u t o a l a p r o t e í n a , que se halla en e l endosperm0

principalmente ; e n base a e s t o , se prepararon medios con

e x t r a c t o adicionando ni trogeno. La f u e n t e u t i l i z a d a , t e o -

r icamente sería de f á c i l a s i m i l a c i ó n para e l h o x o .

Finalmente, restaría a n a l i z a r l a p o s i b i l i d a d de Que

- R. ol inospn-us

z imát ico degradador de t a n i n o s , y que u t i l i z a n d o é s t o s

como f u e n t e de carbono, y no1 e1 almidón h idror izado , pu-

d i e r a c r e c e r e n los medios preparados con e x t r a c t o . Para

c o r r o b o r a r é s t o y t e n e r a lguna información d e l comporta-

miento de e s t e hongo en ta les condic iones , se prepararon medios con t a n i n o s , d e l misma t i p o de l o s que s e han veni-

do usando desde e l p r i n c i p i o de l a i n v e s t i g a c i ó n .

fuera cap& de d e s a r r o l l a r un sistema en-

. -4.9 -

(SE, n e c e s a r i o , s i n f:mbargo, a n o t a r a q u í que mayores

i n v e s t i g a c i o n e s a l r e c p e c t o d e s v i a r í a n e l o b j e t i v o Fro-

puezto i n i c i a l m e n t e . & t e punto s e r € motivo de un e s t u -

d i o complementario a nuestro t r a b a j o ) .

Los medios s e d i v i d i e r o n e n ' d o s grupos: Nedios con

faente de n i t rogeno y medios s i n f u e n t e de nitrogeno.

En e l primer caso, 50 m l de e x t r a c t o de las d i f e r e n -

t e s muestras, fueron t r a n s f e r i d a s a matraces erlenmeyer

de 125 m i , a jus tando e l pH a 4 , con ác ido . I á c t i c o , y a d i -

ckonando i gr/it de s u i f a t o de amonio. di segundo grupQ,

de matraces se preparó de i g u a l forma, pero) sin a d i c i o n a r

f u e n t e de n i t rogeno . Al mismo. tiempo. s e prepararon también d i f e r e n t e s me- . .

con tan inos de o r i g e n v e g e t a l , como fuente de carbono.

Las concentrac iones manejadas fueron: 5 , 10 y 20 gr/ l t .

S e u t i l i z ó i a mima f u e n t e de nitrogeno, en igual' cant idad.

La composición d e l medio t e s t i g o u t i l i z a d o en e s t e

l o t e , fue :

Ghcosa 30 g r / l t

dxt. de Lev. 1 I'

'2"4 I "

0.1 'I

8.1

- Ajo-

Todos los matraces de e s t e l o t e , delbidamente e t i a u e -

t a d o s , fueron e s t e r i l i z a d o s y posteriormrnte inoculados

con asa, tomando l a s esporas de hongo c r e c i d o e n un medio\

de PD.4; e n seguida se incubaron a 32 C durante 10 días ,

en un baño de agua a temperatura c o n s t a n t e y agi tac ibn

controlada.

O

Creemos que es imporatante a n o t a r que i a c o l o r a c i ó n

de l o s medios con t a n i n o s , tomó, un c o l o r café oscuro con

ia e s t e r i l i z a c i ó n , i n t e n r i z i c a n d o s e conforme se incremen-

taba la concentrac ión &e t a n i n o s .

,

CAPITULO VI.

RESULTADOS Y C0NCLUSIO:US

.

B1 a d l i s i s de l o s resultados fue hecho de acuerdo a

loa datos obtenidos en e l t raba jo experimental. La prime-

ra parte se h i zo con e l f i n de determinar la composición

química de l grano de sorgorut i i i zado.

La cuant i f i cac ión de los componentes d e l grano inclu-

ye unicamente l a s substancias de mayor re levancia para l a

fermentación, t a l e s como proteína, almidón y taninos. La presencia de otros compuestos como grasas, vitaminas, m i -

nerales, etc., s i bien, not dejan de tener impartancia por

formar parte d e l sustrat,o básico. para e s t e proceso, tampo-

co in t e r f i e r en , por t a l motivo su cuant i f i cac ión se con-

sideró innecesaria.

La segunda parte de i a invest igac ión reportada con-

t i ene l o s dos pr inc ipa les procesos de fermentación só l ida ,

donde los parametros manejados fueron: temperatura, pH,

humedad, tiempo de fermentación, tamaño de in6cul0, t i p o

de sustrato (sorgo a d i f e rentes tratamientos) y conüicio-

nee de e s t e r i l i d a d 01 asepcia.

Las pruebas rea l i zadas para f i j a r los param6tros con

los cuales se t i enen mejores resultados, indican que s i

estos funcionan y son fac i lmente reproducibles, s in duda,

es factibl 'e optimisarl'os .

. 1 1

\ VI .i. Selecc ión y Pretratamiento.

Por medio de un a d i i s i s en mtcroscopim de disección,

se pudo observar que el ’ sorgo sometido a tratamiento de

lavado y congelación, no presentaba problemas de in festa-

ción, mientras que en frasco t e s t i g o e l de te r io ro alcanzó

su mhimo grado. 23n l a3 muestras observadas, ninguna se-

m i l l a se encontró completa, y 109 residuos harinosos, a s í

como e l gran número de insectos permitian ver faci imente

l o a grandes destroeos debidos a l ataque de plagas de gor-

go jos . estos coleópteros y revisando l i t e r a tu ra apropiada,

pos ib le c l a s i f i c a r l o s de l a s iguiente manera:

considerando algunas carac te r í s t i cas morfoiógicas de

fue

Plaga i Plaga 2

Phylum: Arthropoda Arthropoda

Subphylum: Fandibulata Mandibulata

Clase : Insecta Insecta

Subclase: P te r i go tos P t e r i g o t os Orden: Coleóptera Coxe ó t e ra

Suborden: Pol’yphaga Polyphaga

Familia:. Curculionidae Tene brionidae

Género y Bspecie:

Si tophi lus Oryza Tribolium sp

SFtoRhiiUs nranarius

(66)

c

-53-

I ’ VI.2. Apl icación de los Tratamientos Térmico-Alcalinos.

Mediante una inspección v i sua l de l a s 3 muestras de

sorgo tratadas bajo l a s condiciones de tiempo, temperatu-

ra, concentración de NaOH y ag i tac ión, f i j a d a s anter ior -

mente, f u e pos ib le observar los di ferentes grsdos de des-

trucción o extracc ión de pequeñas cantidades de l a siguien-

te capa de l a semil la , denominada testa.

Como era de esperarse, e l tratamiento con NaOH a l 1549

present& mayor e f i c i e n c i a que los otros dos. En estas con-

dic iones, l a c a s ca r i l l a se destruye completamente y e l

ex t rac to es visiblemente más denso y viscoso. Presenta tarn-

bién, una coloración más intensa.

ib Tos otros dos tratamientos, e l extracto presenta

ca rac t e r í s t i cas descr ipt ivas muy s imi lares, pero gradurr’i.-

mente menos acentuadas, y fáci lmente d is t inguib les entre

ambos.

u s pérdidas de materia, en l a s muestras tratadas se

encuentra en un rango de 4.482 +I 0.475 $, en peso. S in

embargo, estos va lo res son r e l a t i v o s , ya que se obsed6

que no var ían proporcionaImente cuando se incrementa

tamafio. de l Tote. En 200 g de sorgo tratado para u t i l i z a r -

se como sustrato en ia fermentación, se tuvieron pérdidas

hasta de l 10 46.

e i

Este aná l i s i s v i sua l es meramente cua l i ta t i vo . Para

saber en una forma más conf iab le y. cuant i ta t iva qué tanta.

t

.. -54-

I ' / I

afecta e l tratamiento a l a semilla, se hlcieron determi-

naciones coiorimétricas de taninos y almidón; ia proteína

se determinó por e l rn6todo de Kjeldhal. De esta manera fue

posible e laborar tablas comparativas de los resultados ob-

tenidos en las cuatro muestras manejadas.

.

- -55-

, I

v vZ.3. Contenido de Taninos.

La cantidad de taninos medidos por e l método de MV-HC1

se calculó leyendo l a absorbancia de las muestras analiza-

&as, en i a curva patrón previamente construida con l o s s i -

guientes datos :

Concentración Absorbancia mg/ml 525 nm

0.00 o .o00

0.20 0.060 O 640 0.1'25

0.60 0.215

0.80 0.333 1 .o0 0.397 r.20 0.456

r.40 0.538 1.60 O 602 r.80 0.668 2.00 0.745

A justando. Xos datos por regresión l i nea l , obtenemos

las constantes para i a ecuación de la curva:

F=mñ+ b

m 0.3798 sO.380 b E -0.00359 S-0.0036 r = 0.998

-56-

I S us t it uy e nd o : ,

A mC f ~ b I

A 0,380 C - 0..00360

Despejando C:

C I 2.632 A + 0.00945

Datos:

Xuestra = 500 mg de harina de sorgo

Volumen = 20 m l de solvente

Cdlculos t

Concentración t o t a l : Ct= 20 C

5 Taninoa =(Ct /500)100 = Ct / 5

$ T = 20C2.632 A + 0.00945)/ 5

= 4(2.632 A + 0.00945)

Porciento ,de Taninos gxtraidos:

$ T E =cT - $ Tm /2.342)SOO, I 100 - 42.7($T,,,)

$ Tm = Borcienteo de taninos en alguna nuestra analizada.

En l a f i gu ra No. 2, se tabulan l a s absorbancias y l a s

concentraciones respectivas, correspondientes a cada mues-

t r a analizada.

En la fieura No. 3 B e encuentran tabulados 108 re-

sultados de contenido de taninos, en base 8eca y el por- c i ento de taninos extraídos con e i tratamiento.

I

L

-57- I

I 1 I \

Figura No. 2 /

Primera &,tracción.

Muestra Abs o rbancia Concentración Concentración - Erome d i o w/mi t o t a l

SST 0.1’110 O e 302

SCT5 0.0507 0.143

SCTlO O -0325 0.095

SCT1’5 0.01’82 0.054

Segunda Extracción.

6.03

2.86

1-90

1.08

]dues t r a $Transmi tancia C, oncentrac iÓn C once nt rac i Ón - Promedio mg/ml To-kal . SS T 83.61 a.214 4 e28

SCT5 99.00

SCT1’0 99 033 SCTT5 99 a 5 0

- - - - - -

Tercera Extracción.

Muestra $Transmitancia Concentración concentración. - Promedio d m 1 Total

SST 97 .o0 0.70 1’-40

Figura No. 3

Cuadro resumen del’ contenido de taninos en

l a s diferentes mueatras de sorgo analizadas . Nuestra $ Taninos $ Taninos

Analizada Base Seca iCxtra2dos

ss T 2.342 o .o0 SCT5 0.572 75.58

SCT1’0 O. 380 83 -15

SCT15 Q.216 90.77

I

L

-59-

La cuant i f i cac ión de taninos condensados por e l mé- todo de metano1 v a i n i l l i n a ácido c l o rh íd r i co (MV-HCT), es

t

s e n c i l l a y los resultados fác i lmente reproducibles. Las modificaciones apl‘icadas en l a extracción, fueron

con e l f i n de e v i t a r i a descomposición de los taninos en

medio ácido (61); f avorecer la e incrementarla, por l a di-

f e renc ia de concentraciones dada por e l cambio de solven-

te; as€ como reducir e i tiempo t o t a l empleado en e f ec tuar

i a técnica.

1

Como se observa en l a f i gu ra No. 2, l a determinación

de taninos en muestras de sorgo s i n tratamiento requiere

t r e s extracciones, mientras que en l a s de sorgo tratado,

eon una extracción fue su f i c i en t e , ya que en i a segunda

determinación se obtuvieron transmitancias m u y cercanas al’

TOO $. Cabe señalar que por e s ta razón se tabulan l a s trans-

mitancias en lugar de l a s absorbancias, como se hizo. en e l primer caso.

Con estos resultados es pos ib le reaf irmar que 1’8 ma-

yor parte de los taninos se hayan loca l i zados en e l per i -

carp io de i a semil la , y l a destrucción de é s t e con 10s tratamientos térmico-aicaiinos permite ex t raer un

porciento de estos polimeros.

arto )

Por otra parte, l a in t e r f e r enc ia de algunos pigmen-

toa naturales como.xantofi las, carotenos u o<tros, presen-

t e s en e l extracto, y que podrian a l t e r a r l a absorbancia

y, por tanto,. l a cantidad de taninos, se co r r i g e midiendo I ex c o l o r d e l ex t rac to o r i g ina l , bajo las condiciones ya l

descr i tas en is sección correspondiente.

c

-160-

.

EX oegundo método empleado para la determinación de

t a n i n o s f u e e l d e l Complejo Azul' de Prusia ( C - U ) , e l cual

mide t a n i n o s como f e n o l e s t o t a l e s .

Los d a t o s obtenidos para l a e l a b o r a c i ó n de l a c u r v a

patdn, . s o n l o s s i g u i e n t e s :

Concentrac ión Absorbancia.

720 nm wmi ~~~ ~

O0

20

40 60 80

PO0

125 r5o

o .o00 0.088 0.173 O 233 0.305 O -378 0.506

0.593 #

, Ajustando l o s d a t o s por r e g r e s i ó n l ineal , obtenemos I

1 I I

las c o n s t a n t e s para la ecuación de la curva:

Z = m X + b

= 3.9 10-3 b = 3.56 x

r = 0,9985

.

c

-61-

Sustituyendo :.

A = m C + b

A = 3.9 x IO-3~ + 3.56 x 10-3

Despe jando C:

C 256.41 A .. 0.9130

Datos :

Lueetra = 60 O00 ,ug de harina de sorgo

Volumen = 12 m l de so lvente

Cdlculoa :

% F ~ ( 2 2 C / 60 0OO)iOO = C/50. . Porc iento de Fenoles Extraídos:

% F E =(l - 46 Fm / 2 4 8 4 ) I00

% F B = 1’00 - 40.26($ Pm>

Los resultados obtenidos en este método, se encuen- *

tran tabulados en l a f i gu ra No. 4. Las abreviaturas u t i l i -

zadas son l a s mismas que en e l caso anterior.

En l a figura No. 5 se construye un cuadro comparati- 1

, I

vo Be l o s datos obtenidos por ambos métodos.

c

-62-

Figura No. 4 ~

Contenido de t a n i n o s , medidos como fenol3j-s t o t a l e s .

Muestra Abs orbancia $ P $ P i 3

~~

SST 0.488 2.844 O0 .o00

SCT5 0.117 0.583 76.580

SCTXO O .08T 0.397 84 .O20

SCT15 0.047 0.223 91 .O20 .

,. -63-

Figura No.. 5

Cuadro comparativo. de ros valores obtenidos por

los dos métodos.

.

~~ -~

SS T 2.342 O0 .o0 2 -484 00.00

SCT5 0.572 75.58 0.583 76.58

SCTl’0 O 380 83 e75 0.397 a4 .o2

SCTl5 0.216 90.77 0.223 91.02

.

Haciendo un breve aná l i s i s d e l Último cuadro se ob-

serva que ambos resultados son s imi lares, l o cual propor-

siona una mayor conf iab i l idad a l dato obtenido. En l a

mayoría de l a s muestras analizadas, por e l método d e l

C-AP, l o s datos son ligeramente más a l t o s que en e l p r i -

mer caso, l o que s i g n i f i c a que e l harina de sorgo contie-

ne una pequeña cantidad (0.142 $) de f eno lee no-taninos,

?os que pueden s e r precursores de taninos, u ottros com-

puestos que también reaccionan con dicho react ivo.

Tomando como base los resultados experimentales re-

portados por algunos autores (54) (57) (61), considera-

mos que el’ porciento encontrado en l a semilla ut i l i zada,

se haya en un rango muy aceptable, l o cual nos permite

reaf irmar que trabajamos con una variedad de sorgo previa-

mente c l as i f i cada como de a l t o contenido de taninos g co-

munmente denominadas ”pa jareras”.

Después de e f ec tuar l a s dos técnicas, podemos dec i r

que l a cuant i f i cac ión de taninos es más s e n c i i i a y exac-

ta p o r e l método de w-mi, que por e i o t ro , ya que e s t e

&timo presenta como mayor desventaja no poder usar cual- I

qu ie r fo toco lor ímetro para e f ec tuar las lec turas de ab-

eorbancia, debido a que a una l’onguitud de onda de 720 m, algunos aparatos se tornan muy sensibles y l a s lec turas

generalmente l l e v an un a l t o indice de error . 8s recomen-

dable usar un esdectrofotómetro t i p o Varian-Techtron.

( . . I

.. -65-

.

VI.4. C u a n t i f i c a c i ó n de P r o t e í n a .

La p r o t e í n a presente en m i c e l i o D de a. oiigosporus,

c u a n t i f i c a d a p o r e l método.de Biuret , . s e calculó u t i l i -

zando l a ecuación de i a curva es tándar , previamente e i a -

borada con l o s s i g u i e n t e s d a t o s :

Concentración Absorbancia

mg t o t a l e s . 555 nm

a

I!

2

4

6

8 10

o *o000 0.0680

0.1’756

O 3517

0-4983

0,6676

0..8462

La c o r r e l a c i ó n obtenida después de a j u s t a r los pun-

t o s , por r e g r e s i ó n l ineal ea :

X = m X + b

m E 0.08447

b P -0.001’606

r = 0-9995

L

-66-

Sustituyendo :

A 1 0.08447 C - 0.001'606 Despejando C :

C = 11.8385 A + 0.019

La cantidad de proteína, en peso,seco, encontrada en

biomasa de g . o l i ~ospo rus fue de 42.5 $, calculada con l a

ecuación y los datos siguientes:

Suatituyenao C :

A I 0.5997 Absorbancia promedio de l a s muestras

w = 1'6.75 mg peso seco de l a biomasa contenida en

2 ml' de suspeneión homogénea de mice-

l i o , . ut i l i zada para l a determinación.

.

- -67-

.

Con e l método de Kje ldhal , l a proteína encontrada

tanto en l a muestra de micel io. como en l a s d i ferentes

muestras de sorgo, se hayan tabuladas en l a f i gu ra No. 6

Datos:

Blknco = 0.4 m l

Normalidad d e l HC1 = 0.1

Peso de l a Muestra = 1 gr

Factor = 6.25

M.R.O. = Mice l i o de - R. ol’iaosuorus

Ecuación: (V HCXm- V HCXB) x N-x OoOT4 x 100,

$ N = P de M

$ E = $ N x f

Suet i t uyendo : (V HC1,- V H C ~ B ) x N X 0.014 X 100

$ B = 6.25 3

$ Ii = 0.875 ( HCT, - 0,04)

-68-

Porciento de proteína determinada por e l

m6todo de K jeldhal,, en .micelio y diferentes

muestras de sorgo. -

Xuestra V HC1 P Eroteína.

. SST 11 -75 9..91'

SCT5 1'1 -35 9.58

SCTlO 1'0-60 8 a925

ET .R -a. 44 a.7.0 38 e760

i c i

.

vL.5. Deteminación de Almidón. /

I

Los resultados de l a cuantificación de almidón, en

las diferentes muestras de sorgo, se hayan tabulados en

l a f i gu ra No. 7. Fueron calculados utilizando la cuma

patrón obtenida mediante un ajuste p o r regresión Tinear,

de l’os siguientes puntos:

concentración Absorbancia

620 nm P O0

20 40 60 80 100 1’20

X40 1’60 180 200

Ecuac i6n : Y i = m X + b

A = m C + b

o .o000 O .O681 O -1667 0.2560

0.3471 0.5060

0.542CI 0.5615 O -7000 0.7834 0.8400

.

c

,-?O- ‘ 1 1

I li

, I , , ), Datos:

m = 0.00432 ,, I

b 0,00339

r = 0.995

Suetituyendo datos:

C 23T.5 A - 0.7047 $ s =(C/w) x 100

S = Porciento de almidón en l a muestra

w = peso de l a muestra contenida en 1 m l .

231’ A”- 0.7847 Too % S = 20

$ S = TT57.5 A“ - 0.15694 A”= 0.9 A

$ S = P041’.75 d - 0.15694

I

I

.

.

. .

L

-71-

Figura No. 7

Contenido de almidón en i a s diferentes

muestras de sorgo analizadas.

Muestra Absorbancia $ Al’mid6n

SST .o.oai070 78.87

SCT5 O -072837 78 -72

SCTXO 0.071670 77.37

I

L

-72-

c

1 , \

Como se pudo observgr en l a s figuras No. 5,6 y 7, ex is ten algunas var isc ioaes en e l contenido de almidón y

proteína en l a s muestraslde sorgo tratadas, con respecto

a las no tratadas.

Consideramos que estas variaciones se deben posible-

mente a pérdidas de materia, debida a una hidrólisis b8-

aica de pequeñas cantidades de almidón y protefna, 01 bien,

unicamente se deben a erFores v isuales de lec tura en ell

espectroiotómetro.

Por o t ra parte, l a l i t e r a t u r a revisada, reporta que

e l contenido de almidón en sorgo var ia de 70 a 82 ’$

(67-701, y e l de protefna se encuentra en un rango de 6

a 12 46, en variedades mexicanas (71).

Los resultados expegimental’es obtenidos en esta in-

vest igación: 9.91 %, para protefna y 78.87 $ de aimid&,

nos permiten otorgar graxl con f iab i l idad a ambos datos ya

que se hayan dentro de l &ntervalo. preestablecido por o t ros

investigadores, cuyo ob j e t i v o de su estudio. fue basica-

mente ei aná i l s i s químioo d e l sorgo.

.

I V . I . 6 . PROCPSGU D E F E F E E N T A C I O N .

Preparac ión d e l Sus t ra to .

Durente Ir. a p l i c e c i ó n d e l o o t r a t s r : i e n t o s termico-aica- l i n o s y el p o s t e r i o r zlmecene.ciento, e l s u s t r c t o no presen-

t 6 p r o b l e m s de ningún t i p o , por lo que se f a c i l i t ó s u meni

p u l a c i ó n durante l a prepcrcx ión de l o s r;.ec?ios de fermenta-

c i ó n .

Obtención d e l inoculo .

El tamaiio proifiedio 6el in9ci i lo obtenido f u e de l x l 0 esporas/ ml, niismo aue s e ~ r t i l i z 6 para i n o c u l e r los nedios en

7

l o s d i f e r e n t e s procecos de fer1i:entncion. Considenrrou que la cd2.d d e l inócu.10 fue 1.0 s u f i c i e n t e a e n t e joven n ~ . r r - l o g r o r une. rápide. g e r n i n ~ c i 6 r i de 1 ~ s enpores y &si dieminuir 12 fz se Lag, l a cual e s f m c i 6 n de l a e?ad y e l tanaíio del i n ó c s l o fundementalmente, aunque tnnbién es importcnte e l t i p o de s u s t r c t o 2.1 que s e t r : ins fer i rá .

V . I . 6 . 1 Primer Proceso de Fenrentcici6n.

a) Lote con Gustrato Sometido a E a t e r i i i z e c i 6 n .

La e s t i m m i 6 n v i s u e l de dgumsi c e r a c t c r í s t i c n s encontrg I

das a las 96 horas de fermentpci6n, se i n d i c a en le figurr

N o . 8 . En l a f i g u r e No. 9, se muestra la cantidad de ficido c l a r -

ñ i d r i c o usado en ia t i t u k c i o n de p r o t e í n e y e l de e s t a , para rnuestrm de e e t e l o t e , t a n t o d e l producto obtenido c0-

no’ l e s $ e 1 RW t r c t o ?ir. fen . cn tcr .

Bueno ro DEL

HONGO.

O C O abunda; e , algodon o , l i g e r n -

Frisa eo, b i e n i s t r i b u i d o

i s t r i b u i d o .

E x e l e n t e Bueno

o c a , no pe- Poca, no oca, no pe e t r a comple n e t r a e t r n c o r q l

CION Dd HI_ r t r FAS. ( ~ J Q

t r a t o . t r z t o .

PENSTRIG

TEXTURA

(RsqA1:llno)

~ , C ~ O R U L ~ ~ - k:inina, no s blíninn, no Minima, . p e r c i b e c ae perc ibo se p e r c i b e

F. s i q l e a simple vista. v i s te.

CION. p l e vista.

r i m e , no s e Firme,rio se Firme, no desintegra ?es inte ,yrz s e d e s i n t e - 2.1 rebt-rzr. a l rebaner. Tra a l r e b a -

Pro

Pobre

No es cbun- drate, r i a snseo, 0.1~2

iíonoeo, di : - t r i b u c i ó n he t e rogénei

Nuie, e l c r e c i n i e n t c fué ouyer- f i c i c l .

Iiláxima, s e p e r c i b e e simple v i c - ta.

Firme, no I

s e d e s i t o - I ra al rebi nzr.

.- 75-

Humedad dei Kedio8

La humeded rel:. :t iva i r s c i a l pror: d i o de 10s medios en en!- boa l o t e s , p?.m es te primar proccco ? e ferner:t,?ciÓn f u k de

72.7275, le. cue se cc l cu ló de acuerdo 2. l e ecuzzci6ri eel pun-

t o V.4. Todm las nuestres d e l l o t e ( a ) , presentaron d e f i c i e n - cici de hwne<l:id. a l f i 2 e . l d e 16 fem.cr.tnción.

Les xueztrc3'í: f ie l lote (P.), quedaron ni-y compactas d.espu-

6s de la e s t e r i l i z n c i 6n debido F 1c gelntini ,acion d e l suo-

trczto, bato i ~ p i d i ó UIIP bucm Tcne t r r c i jn Pe lp.8 h i f u s d e l

hongo ai fondo de l a c R j n p e t r i . La f n se big duró aproxinn-

damente 30 horrs; es ta se eatuvo cor.trolrndo ca da 6 hr, por

medio de ectirración visu21 ptravez de un microscopio $ e diso-

ccion.

Las muestras d e l l o t e (b), Sustrrto Sorretido ?. Trata-

miento Aséptico, de es te moceco, no fueron considera?cs para los e.n,nliris s iguientes debido a que l o s renul$edon ob-

tenidos no fueron s i , y . i f j cr t i voc . d

En e l s epndo proccso de fcn;.enteci6n, se suprinio el d e

le. muectra X'Pl5, l a cual presentó inh ib ic ión en e l crecimie?

t o d e l how0 como rcsultndo ?el primer proceso. c

La evcluecion v i s u a l d e l Lote (b) se ind ica en l a fi>rar,n

No. 10.

.

. .

~

,.

Lib - ai I /

\ \ FIGURA 9. CUA-DRO COILPXRATIVO D;;L COKTER'I~G DE PROTEINA a11

SUSTRATO 0IIIGIilf.L Y PHODUCIIO. ',

c

.-77 -

XXkCTERIS

PICaS. -

YRECII~UEIITO

DUL .

HONGO.

P1GUTt;l 10. EVnLUAUIOII VISCAL DEL PRODUCTO 0ETEi:IDO EN EL PRIiBR PROCZ.50 DE FERhW:Tr.CION, LOTE ( b ) .

I

MUJ~ST~ - SST SCT5

Bueno Bueno

~XCHJO

P m m b - C I O N DE HL

YAS (REBti - I?Aí)o).

~ S P O R U U -

C I O N .

Poco Rbundan - Doco abundar t e , al.Todono - t e , al.codonc - so, i i g e r s - s o , Ligera- mente grisa- Tente -risa- s e o , b i e n seo , b i e n d i s t r i b u i d o . d i u t r i b u i d o .

Nula N u l a

Fr!!nioi3., s e hifnima, se p e r c i b e a p e r c i b e P. simple vis- simple vis-

ta.

TEXTUU

(bBma- DO).

S

SCTlO

No es f i r m e , Ro e s f i rme R e d e s i n t e - se d e s i n t e - gra al reha- ern a i reba. nar . nar .

Bueno

Poco abuni dante , qri saseo, al- Kodonoso, d i s t r i b u - c i o n h a t e r ,yenep..

Nula

Hinim, s e p e r c i b e a simple vista.

'o e s f i rme ie desinte- :ra al reba - ET.

SCT15

!&y pobre.

lo OS abw- Lante, i 1,:o- lonoso, g r i - : ?seo, epe- ES percep- i t i b l e P sir - ] l e viotr..

Nula

üáxim: : , s e J e r c i b e con nayor faci- lidad.

No e s f i r m s e des inte . p a a l reb, nar .

L

-78- ' I 1

I 1 I

I

71.6.2. Secyndo Proceso die Fermentación, proceso Be 72 horns.

A l fi-1 d_n e s t e s e p n d o proceso ninguna de 19s muestras manejadas presentó d e f i c i e n c i a de humedad. E l desempacamiento

d e l s u s t r a t o , después de l a e s t e r i l i z ~ . c i ó n , f a v o r e c i ó nota- blemente u= nnyor p e n e t r a c i ó n de l e s hifes d e l a i c c l i o n t r n

vez de todo el s u s t r a t o , l legando a l fondo .le In caj?. p e t r i . La f a s e Lag f u é de aproximadamente 30 h o r a s , l a cual s e con- t r o l 6 de l a misma f o r m que en e l primer proceso Oe ferment$ c ión . U humedad r e l a t i v a in ic ia l promedio de todas las mues - tras f u é de 7Y.9231.. l a que s e c a l c u l ó de la misma forma que

e l >roceso a n t e r i o r . E l tamaño d e l i n o c u l o fu6 e l M s n o que e l a n t e r i o r . .

U s c w a c t e r í s t i c r s cunl i tcr t ivns evaluadas e n e s t e s e p m - do proceso de f e r n e n t a c i h n , s e niuestmn en l a fi,gura 11.

E l contenido de prote ín? de los productoa obtenidos en

e s t e p r o c e s o , para e l Lote (a ) , s e muestran en Ir. fi,pra 12.

F i n e l n e n t e , e n l a figura 1 3 , s e muestra un cuadro compa- r a t i v o d e l contenido de p r o t e í n a t a n t o de los dos procesos 8

de fermentación como le d e l sorgo s i n fermentar.

L

-79 -

FIGURA 11. EVr.LUtLCION VIZUAL DEL P30DUCTO OBT3FIDO ZN XL

..

.

SEGLTUDG PRCCEUG Dn TERI.EXTJLCION, LOTZ (2).

cwcIr!?ILm- TO DEL Bueno

HONGO.

Abundente, al- Abundante l r lgo-

F I C X L I O donoso, c l a r o , b i e n d i s t r i b u i r bien

~~ ~

:ample tc ,r.trs.-?ez Completa a t r a v e z PERETI¿xCION l e 1 s u s t r n t o ,

d e l s u s t r n t o , DE I I I F A Y i iegando a1 f o n ( KEBJLI.:AU~) . lleE;r,n¿io a l f02 -

óo de 1n cage P. -

SCTlO

Bueno

Abundente, ?.lq donoso, c l e r o ,

b i e n d i c t r i b u -

ida Comple tn,ztr?.vi

d e l s u s t r c t o ,

llc@nc',o r.1 Yo: ¿!o r'e Ir. ceja

ISnim, no s e

percibe 2 eim-

p l e vista.

. 18.1562

,

15 O 5

FIGURA 13. CUADRO COXPARATITO DL CONTSNIDO

18.90

15.925

LOS PR03U,"TOS 32 AMBOS PR0;ECOS Y SI1 EL STISTRATO

0RIGIII;i .L -

18.550

14 525

- S U S T R l T O SIN

FERIJdNTAR

BLANCO

SST

SCT5

SCTlO

9.91

9.58

8.925

P R I M R

P R W S S O

SEGUIiDO

PRO'ZSO

.

-132- ‘ i /

‘ I

\ I V I . 6.3. F e m e n t a c i ó n 3xner$=iz.

I

?.1 teminar e l proceso de Fermentación Sumer$.da, las

muetras s e evaluaron visualmente , encontrando las s i ,guien - t e s c a r a c t e r i s t i c a s :

TESTIGO. P r e s e n t 6 el mejor c rec in i iento , auncue no fu6 vigo-

roso. hubo formacidn de peque::ori p e l l e t s de c o l o r l e c h o s o ,

MCT5. Su c r e c i m i e n t o f u é considerzblemente menor cl d e l t o s

t i s o , hubo formación de p e l l e t s pequexoo.

ñICT10. Su creci.xi.ento fué cons idemñlenente menor a l del t e s - t iUo; no hubo formación de p e l l e t s , e l m i c e l i o s e encontra-

b a d i s p e r s o en e l medio.

PJCT20. Es ta muestra presentó e l c rec imiento más oobre que e l de 12.s muestras NCT5 y blST10; no hubo formación de p e l l e t s .

UEDIOS CON EXTKCTO, CFN y SFN. En e s t o s medios no hubo c r e - c i m i e n t o d e l hongo.

c

., -8 3-

1 ' 1 1

Los r e s u l t a d o s neZEtivos de l a fermehtnción sumerzida, . . efectuaPte con medios a base de e x t r a c t o , (on de gran i:npor-

tancin p a r a n u e s t r a conc lus idn , ya que nos permite e s t a b l e -

c e r c o n mayor s e p r i d a d que los t ratnmientos t é r m i c o - a l c a l i -

nos a p l i c a d o s a l a s e m i l l a , no a f e c t a n e n forma significati - va e l contenido de almiddn y p r o t e i n a ; ya que de o t r a manera, con e s t o s dos compuestos d i s p o n i b l e s en e l medio, e l

hongo habria s i d o capaz de c r e c e r .

Con r e s p e c t o a l a fermentación con taminos como s u s t r a t o ,

e l c r e c i m i e n t o presentado por e l hongo podría deberse a dos

raqones:

P r i n e r o , que e l hongo haya s i d o capaz de i n c o r p o r a r ta- I ninos : o b i e n su c r e c i n i c n t o 3e d e b i s a Is d e ~ a d n c i ó n de la m a t e r i a i n s o l u b l e quo cont ienen los taninos de ori;)on r e - s i n i c o u t i l i z a d o s en c q t e >roceno; can.i:?orrznos mcis acepta- bLe l a segunda p o s i b i l i d a d , ya que como 38 . n o t 6 , e l c r e c i - miento didminuye conforme s e incrementa l a concentrac ión de

tan inos e n e l medio.

.

L

-84-

.

V I -7 . CONCLUSION GENdBBL.

De acuerdo a l o s resultados obtenidos en esta inves-

t i gac i ón fue posible l l e g a r a l a s s iguientes conclusiones:

En e l estudio químico d e l sorgo podemos estab lecer

que l a s técnicas de aná l i s i s desarrolladas, y en algunos

casos modificadas, son conf iab les ya que l o s resultados

caen en e l rango establec ido por o tros investigadores.

Con respecto a l a d e s t an i z a c ih podemos a f i m a r que

e l mejor tratamiento, para l o s ob je t i vos de l a presente

invest igac ión es e l de NaOH a l 5 %. Aunque l a mejor ex-

t racc ión de taninos se alcanzó con a l c a l i a l 1 5 %.

De l a fermentación só l ida , que constituye l a parte

de mayor re levancia en nuestra investigación, se puede

conc lu ir que e l producto con mayor cantiflad de proteína

se obtuvo en e l l o t e A de l segundo proceso, en l o s me-

d ios con sustrato tratado con Na OH

l a s s iguientes condiciones: a l 5 $ (5CT5), bajo

Temperatura 32OC

PH 4 Humedad r e l a t i v a 77 % Tiempo de fermentaoión 72 horas Tamaño, promedio de l inócuio 1 . ~ 1 0 ~ iisp/mi

Fermentadores: k latos P e t r i 60x15

!

I ! I

.

SUGBIUNCIAS

A cont inuac ión , se mencionan algunas recomendaoio-

nes, que consideramos podrían s e r de gran u t i l i d a d para

i n v e s t i g a c i o n e s p o s t e r i o r e s , re lac ionadas con e s t e tra-

ba j o c

. .

I

X). D i s t r i b u c i ó n c u a l i - c u a n t i t a t i v a de l o s aminoáci-

dos e s e n c i a l e s p r e s e n t e s en l'a p r o t e í n a d e l a i i -

mento producido.

2). Evaluación, in v i v o , de l a d i g e s t i b i l i d a d de l a

p r o t e í n a contenida en e l producto f i n a l , usando

animales de l a b o r a t o r i o o cepas microbianas.

3 ) . Evaluación técnico-económica para l a i n s t a l a c i ó n de una a g r o i n d u s t r i a , en las p r i n c i p a l e s zonas

productoras de sorgo en e l pads.

4 ) . Escalamiento de e s t e proceso , de n i v e l l a b o r a t o -

rio, a planta p i l o t o .

5) . Adaptacion de l a cepa R. ol igosporus a c r e c e r e n

medios con h a r i n a de s o r g o , e n tubo incl inado, t r a n s f i r i e n d o las esporas de un medio PDX.

6 ) . Aislar m i c r o f l o r a n a t u r a l d e l sorgo, degradadora

de tan inos .

L

-86-

I BIBLIOGRAPIA.

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