José Luis Cárdenas López 2014-1 - Universidad de Sonora...1 kat = 60 mol min -1= 6 x 10 7...
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Ensayos enzimáticos
José Luis Cárdenas López
2014-1
Actividad
• Normalmente la actividad se evalúa siguiendo
la formación de producto vs tiempo
A
tiempo
[pro
du
cto
]
Inicia con una relación Lineal, pero va declinando
¿Porqué?
• Uso del sustrato
• Se aproxima al equilibrio (remover producto)
• El producto causa inhibición
• Inestabilidad de los reactantes• Inestabilidad de los reactantes
• Dependencia del tiempo
• Artefactos del método
• Cambios (pH)
• SOLUCIÓN: “velocidad inicial”
Velocidad inicial
• Trazar una tangente mediante regresión lineal
de los puntos iniciales, mientras se observa la
linearidad
y = a+bx
A
tiempo
[pro
du
cto
]
y = a+bx
Tipos de ensayos enzimáticos• Fotométricos (ley de Lambert Beer)
• Radiométricos (sustratos etiquetados con
isotopos radiactivos)
• Fluorométricos
• HPLC
• ELISA (ligados a inmunología)
• Electroquímicos (electrodos)
• Después de electroforesis (zimograma)
• Ensayos acoplados (medir una reacción
secundaria)
Radiometría
fluorometría
Kit para medir actividad de la HDAC (histona desacetilasa)…DNA
Se mide la fluorescencia de la aminometil cumarina (AMC)
ELISA
zimogramasIncorporar sustrato al gel
Ensayos acoplados
Enzima glutamiltransferasa
Glutatione
Remueve el glutamil del glutatione y lo pasaa un aceptor
Usada para medir glutatione
Enzima leucil aminopeptidasa Cys se lee facilmente
Capiello, et al 2013
Fotométricos (colorimétricos)
BApNA
Tripsina
BA + pNA
Absorbe en el Amarillo 410 nm
Sustrato cromogénicocromófero
Las unidades
• La unidad más utlizada es la U (unidad)
• La comisión internacional de nomenclatura de
bioquímica recomienda el uso del catal (kat)
como parte del SI (sistema internacional de como parte del SI (sistema internacional de
unidades)
• 1 catal corresponde a la conversión de 1 mol
de sustrato por segundo
• Inconvenientemente grande!!!
conversión
1 kat = 60 mol min -1 = 6 x 107 Unidades1 Unidad = 1 mM min-1 = 16.67 nkat
En la práctica se sigue usando más la Unidad, sobre todo en América, En la práctica se sigue usando más la Unidad, sobre todo en América, pero para fines de consistencia el catal puede ser la opción
Condiciones para la medición de
actividad
• Volúmenes pequeños = grandes errores al
convertir a moles o M
• Tiempo es crítico, debe ser muy exacto
• Temperatura• Temperatura
• pH
• Actividad = condiciones operativas
• Mantener activa la enzima (hielo)
Ley de Lambert-Beer
Dr. José Luis Cárdenas López
2014-1
cIo I
b
Si consideramos un rayo de luz monocromático que pasa a través de una disolución de un material que absorbe luz, la intensidad de la luz incidente disminuye de Io a I, al pasar por la muestra, debido a que la disolución la absorberá.
cIo I
Se le denomina transmitancia (T), a la cantidad de luz que pasa a través de una sustancia y se define por:
El logaritmo negativo de la transmitancia, la absorbancia (A), es directamente proporcional a la cantidad de luz absorbida y a la longitud del paso de la luz a través de la sustancia
Ley de Lambert
K1 es una constante y b es la longitud del medio
Ley de Beer
El logaritmo negativo de la transmitancia es también directamenteproporcional a la concentración de la sustancia absorbente c
Ley de Lambert-Beer
Si se combinan ambas leyes se obtiene :
Donde a es una constante llamada coeficiente de extinción (combinación de K1 y K2). Este coeficiente es dependiente de la longitud de onda (λλλλ) que atraviesa la sustancia y de la naturaleza química de la misma,
b es el paso de luz en cm (generalmente 1 cm) y c, la concentración de la sustancia.
Unidades
Las unidades del coeficiente de extinción dependen de las de c y viceversa. Si se expresa a como coeficiente de extinción molar (εεεε), cSi se expresa a como coeficiente de extinción molar (εεεε), cse expresa como moles por litro, o si a se expresa como milimolar, la concentración se expresará en milimolar.
Cálculos
Abs
403
nm
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
Para la Vo
Usar ecuación de la regresión en la
tiempo (seg)
0 100 200 300 400 500 600 700
Abs
403
nm
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
tiempo
dAbs
Usar ecuación de la regresión en la
región inicial
EjemploFosfatasa alcalina
Tiempo Abs 403
0.7
0.8
0.90.05 0.50015712
10.0500002 0.55144584
20.0499992 0.5940221
30.0499992 0.62339956
40.0499992 0.64703828
50.0499992 0.66614646
60.0499992 0.68148702
70.0500031 0.69441003
80.0500031 0.70636261
90.0500031 0.71745592
100.050003 0.72665113
tiempo (segundos)
0 50 100 150 200 250 300 350
abs
403
0.4
0.5
0.6
0.7
Col 1 vs Col 2 Y=0.00365716 (X)+ 0.50988651
100.050003 0.72665113
110.050003 0.73463792
120.050003 0.74266666
130.050003 0.75084096
140.050003 0.75919402
150.050003 0.76732302
160.050003 0.77470923
170.050003 0.78061092
180.050003 0.78854549
190.050003 0.79529941
200.050003 0.80309194
210.050003 0.80963796
220.050003 0.8161602
230.050003 0.8238216
240.050003 0.83128041
250.050003 0.83928275
260.049988 0.84640175
270.049988 0.85312891
280.049988 0.85917383
290.049988 0.86543709
300.049988 0.87281275
¿No se sabe el coeficiente de
extinción molar?curva estándar de paranitrofenol
0.8
1.0
[paranitrofenol (M)]
0 1e-5 2e-5 3e-5 4e-5 5e-5
ans
403
nm
0.0
0.2
0.4
0.6
Coefficients: b[0] -4.9412451362e-3 b[1] 18974.59
r ² 0.9995664551
Pendiente de la curva de calibración
literatura: (a 405 nm)18,000 M-1 cm-1
Convertir Abs a vo
tiempo
dAbs403
1min221.min
60
40
147.0 −=
= seg
segvo
Pendiente de la región inicial
ANÁLISIS DIMENSIONAL
clA ε=Usando la ley de Lambert-Beer
Vo en M/min)1*18974(
min)/221.0(11 cmcmM
vo −−=
Vo= 1.162 x 10-5 M/min