TEMA Área Académica: Contaduría Profesor(a): Karina Pérez Camarillo Periodo: julio-diciembre 2015.
KARINA ANGÉLICA PÉREZ CRUZ
Transcript of KARINA ANGÉLICA PÉREZ CRUZ
UNIVERSIDAD DE CHILE
Facultad de Ciencias Quiacutemicas y Farmaceacuteuticas
Escuela de Graduados
SIacuteNTESIS CARACTERIZACIOacuteN ELECTROQUIacuteMICA Y REACTIVIDAD CON
ANIOacuteN SUPEROacuteXIDO DE NUEVAS CUMARINAS HIacuteBRIDAS
Tesis presentada a la Universidad de Chile
para optar al Grado de Doctor en Quiacutemica por
KARINA ANGEacuteLICA PEacuteREZ CRUZ
Directores de Tesis
Prof Dr Luis J Nuacutentildeez Vergaradagger
Prof Dr J Arturo Squella Serrano
Prof Patricio A Navarrete Encina
Santiago-Chile
2016
i
UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS QUIacuteMICAS Y FARMACEacuteUTICAS
INFORME DE APROBACIOacuteN TESIS DE DOCTORADO
Se informa a la Comisioacuten de Postgrado de la Facultad de Ciencias Quiacutemicas y
Farmaceacuteuticas que la Tesis de Doctorado presentada por la Candidata
KARINA ANGEacuteLICA PEacuteREZ CRUZ
ha sido aprobada por la Comisioacuten Evaluadora de Tesis como requisito para obtener el
grado de Doctora en Quiacutemica en el examen de defensa de Tesis rendido el helliphelliphellipde
Diciembre de 2016
Directores de Tesis
Prof Dr Luis J Nuacutentildeez Vergaradagger
Prof Dr Juan Arturo Squella S helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
Prof Patricio A Navarrete E helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
Comisioacuten Evaluadora de Tesis
Prof Dr Antonio Zanocco Loyola (Presidente) helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
Prof Dr Claudio Olea Azar helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
Prof Dra Mariacutea Soledad Ureta Zantildeartu helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
Prof Dr David Pessoa Mahanna helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
ii
helliprdquoPues dando se recibe
Perdonando se es perdonado
Muriendo se resucita a la vida eternardquo
San Francisco de Asiacutes
iii
Se agradece en forma especial a las siguientes Instituciones por los aportes
financieros recibidos para el desarrollo y teacutermino de esta Tesis
- Conicyt Beca de Doctorado Nacional (2010) Beca de Apoyo de Tesis
(2011) y Beca de Asistencia a Congresos (2013)
- Universidad de Chile por las Becas Mecesup UCh061 (2011) Beca de la
Vicerrectoriacutea de Asuntos Acadeacutemicos (Estadiacuteas cortas de Investigacioacuten 2013)
y a la Facultad de Ciencias Quiacutemicas y Farmaceacuteuticas por Beca de Rebaja
Arancelaria (2015-2016)
- Fondecyt Proyecto ndeg 1110039 Profesor Luis J Nuacutentildeez Vdagger
iv
A G R A D E C I M I E N T O S
Al culminar esta etapa acadeacutemica soacutelo tengo expresiones de profundo
agradecimiento
A Dios -en el cual somos nos movemos y existimos- agradezco la hermosa Familia
que me ha acogido siempre pilar que ha sostenido mi carrera en los diacuteas alegres y en
aquellos aciagos Gracias a mis Padres Joseacute Mariacutea y Elsa por su amor su sabiduriacutea el
apoyo incondicional comprensioacuten y valores entregados desde mi maacutes tierna infancia
gracias por la disciplina y prestancia que me entregaron como legado fruto de una
educacioacuten esmerada empapada de Fe y conviccioacuten tesoros que van en mi espiacuteritu
siempre A mi hermana Andrea y mi cuntildeado Juan gracias por su carintildeo todo su
apoyo y comprensioacuten Tiacuteas Mary Florita y Carmen gracias por estos antildeos de amor
alegriacutea y entrega
Agradezco a mis Profesores Tutores Al Dr Luis Nuacutentildeez V vaya mi maacutes sentido
reconocimiento por invitarme a ser parte de su Investigacioacuten y entregarme
herramientas valiosas en mi formacioacuten de pre y posgrado gracias por la confianza
que depositoacute en miacute por la acogida y comprensioacuten que me brindoacute en tiempos
complejos instancias que siempre conservareacute en mi memoria
A los Profesores Dr J Arturo Squella S y Patricio Navarrete E expreso mi sincero
agradecimiento por su guiacutea y orientacioacuten en este proceso gracias por su acogida y
todos sus aportes para que este trabajo llegase a feliz teacutermino
Expreso mi gratitud a los Profesores Dr Domingo Gonzaacutelez A y Manuel Domiacutenguez
P de la Facultad de Quiacutemica de la Universidad de Sevilla por recibirme en su grupo
de trabajo y compartir parte de esta Investigacioacuten Tener la oportunidad de viajar y
haber conocido y compartido ese corto tiempo de estadiacutea con el Profesor Domingo ha
sido una de las experiencias maacutes valiosas educativas y formativas que conservo de
este periacuteodo como doctorando Gracias por su amistad
Deseo expresar mi agradecimiento a los Profesores de la Comisioacuten Examinadora a la
Dra Soledad Ureta Z por su tiempo buena disposicioacuten y valiosos aportes a este
trabajo al Dr Antonio Zanocco L por sus aportes realizados a este trabajo y su
buena voluntad al Dr David Pessoa M gracias por sus ideas y aportes realizados en
cada instancia En forma especial quiero agradecer al Dr Claudio Olea A quien
junto con ser parte de esta Comisioacuten me abrioacute generosamente las puertas de su
Laboratorio para aprender y desarrollar diversas teacutecnicas aplicadas en esta Tesis lo
cual fue un hermoso aporte Muchas gracias por su confianza por integrarme como
una alumna maacutes por su tiempo paciencia y por todos los momentos alegres que
compartiacute con su grupo Muchas gracias a sus alumnos ex-alumnos y miembros del
Laboratorio al Dr(c) Mauricio Moncada por su dedicacioacuten carintildeo y ensentildeanza en
este proceso gracias por la amistad y el apoyo que me ha brindado
v
Al Dr Germaacuten Barriga por los aportes en el tema de estudios teoacutericos al Dr Michel
Lapier por su colaboracioacuten con los estudios en ceacutelulas al Dr Francisco Mura por su
generosidad y colaboracioacuten al Dr Benjamiacuten Aguilera por su simpatiacutea y ayuda con
temas espectroscoacutepicos a la Dra Mariacutea Carolina Zuacutentildeiga y los MC boys Jorge
Beatriz Manuel Camilo Gabriela Estefaniacutea gracias por sus aportes a este trabajo y
los momentos agradables que compartimos Al Profesor Dr Javier Morales vaya mi
agradecimiento por su ayuda en el estudio y caracterizacioacuten de mis compuestos
Gracias a la Profesora Dra Mariacutea Baeacutez C por su colaboracioacuten y disposicioacuten en la
caracterizacioacuten de mis compuestos
Agradezco a todos los compantildeeros de laboratorio que he conocido en diversas
instancias A la Dra Paulina Sierra a Viviana Claudio Julio la Dra Paola Salgado
Camila Daniela Constanza Dr David Vaacutesquez Gracias por los momentos gratos y
su compantildeerismo
Deseo destacar la valiosa contribucioacuten de los funcionarios de la Biblioteca Ceacutesar
Leyton de nuestra Facultad Muchas gracias por la prontitud y agilidad en su servicio
que siempre ha sido de muy buen nivel
Agradezco ademaacutes la valiosa colaboracioacuten de las Secretarias de Decanato Sra
Cecilia Pinchetti y Ximena Berriacuteos Gracias por su siempre buena disposicioacuten
gentileza y voluntad con cada detalle de todo este proceso
Mi agradecimiento para todo el personal de Secretariacutea de Posgrado por su gestioacuten y
colaboracioacuten en todo el proceso acadeacutemico
vi
INDICE
Informe de aprobacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip i
Agradecimientoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip iii
Iacutendicehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip vi
Iacutendice de figuras y tablashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip x
Glosariohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip xvi
Resumenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip xviii
Summaryhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip xx
1 Introduccioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 1
11 Cumarinashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 1
111 Origen vegetalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 1
112 Rutas de siacutentesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 2
113 Principales aplicacioneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 4
12 Compuestos polifenoacutelicoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 9
121 Origen vegetalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 9
122 Actividad bioloacutegicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 10
123 Polifenoles como antioxidanteshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 11
13 Compuestos hiacutebridoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 13
vii
131 Cumarinas como estructuras hiacutebridashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 15
2 Hipoacutetesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
3 Objetivoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
31 Objetivos generaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
32 Objetivos especiacuteficoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
4 Materiales y meacutetodoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 23
41 Materialeshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24
411 Reactivos y equipamiento utilizado en siacutentesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24
412 Reactivos y equipamiento utilizados en electroquiacutemicahelliphelliphelliphelliphellip 25
413 Reactivos y equipamiento utilizados en ensayos frente a especies
radicalariashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27
42 Meacutetodoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 28
421 Procedimientos de siacutentesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 28
422 Procedimientos en electroquiacutemicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 37
423 Estudio de generacioacuten de especies radicalarias mediante
espectroscopia de resonancia de espiacuten electroacutenico (REE)helliphelliphelliphelliphellip 38
424 Procedimiento experimental en el estudio de reactividad
frente a especies radicalariashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39
4241 Metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales
de oxiacutegeno (ORAC-FL)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39
4242 Metodologiacutea de capacidad reductora de hierro en plasma
(FRAP)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42
viii
4243 Capacidad de apagamiento del radical hidroxilo (OHmiddot)
mediante la teacutecnica spin traphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 44
4244 Estudio de reactividad frente al anioacuten radical superoacutexido O2bull-helliphelliphellip 45
4245 Estudio de la capacidad antioxidante celular (CAC)helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 47
4246 Estudio de hidrofobicidad relativa helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 48
4247 Estudio teoacuterico caacutelculo del Iacutendice de Fukui fkhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 49
5 Resultados y discusioacuten helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 50
51 Siacutentesis de los compuestoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 50
52 Estudios electroquiacutemicoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 54
53 Estudio de generacioacuten de especies radicalarias mediante espectroscopia
de resonancia de espiacuten electroacutenico (REE)helliphelliphelliphelliphellip 70
54 Resultados y discusioacuten de los estudios de reactividad
frente a especies radicalariashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 74
541 Metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales
oxiacutegeno-fluoresceiacutena (ORAC-FL)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 74
542 Metodologiacutea de capacidad reductora de hierro en plasma
(FRAP )helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 82
543 Determinacioacuten de capacidad de apagamiento del radical OHmiddot
teacutecnica spin trappinghelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 86
544 Estudio de reactividad frente al anioacuten radical superoacutexido O2bull-helliphelliphellip 94
545 Determinacioacuten de capacidad antioxidante celular (CAC)helliphelliphelliphelliphellip 100
546 Estudio de hidrofobicidad relativa helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 102
ix
547 Estudio teoacuterico caacutelculo del Iacutendice de Fukui fkhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 108
6 Discusioacuten generalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 113
7 Conclusiones helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 124
8 Bibliografiacuteahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 126
x
Iacutendice de figuras y tablas
Figuras
Figura 1 Esquema de los compuestos estudiados
Figure 1 Scheme of studied compounds
Figura 11 Estructura de la 2H-1-benzopiran-2-ona (cumarina)
Figura 12 Esquema general de la reaccioacuten de Pechmann
Figura 13 Estructura de la 33rsquo-metilenbis(4-hidroxicumarina) o dicumarol
Figura 14 Estructura de la suksdorfina
Figura 15 Estructura del hiacutebrido cumarina-flavona aislado de su fuente vegetal
Gnidia socotrana
Figura 16 Estructura del antibioacutetico hiacutebrido novobiocina metabolitos secundarios
en la especie Streptomyces
Figura 17 Hiacutebridos chalcona-cumarina con capacidad antioxidante
Figura 41 Aacutecidos empleados en la sustitucioacuten de la 4-clorometil-78-
dihidroxicumarina
Figura 42 Siacutentesis del derivado clorado 1
Figura 43 Siacutentesis del derivado clorado acetilado 5
Figura 44 Siacutentesis del aacutecido cafeico acetilado 6
Figura 45 Siacutentesis del aacutecido gaacutelico acetilado 7
Figura 46 Siacutentesis del aacutecido 34-dihidroxibenzoico acetilado 8
Figura 47 Siacutentesis del intermediario hiacutebrido derivado del aacutecido cafeico
xi
Figura 48 Siacutentesis del compuesto hiacutebrido final 9
Figura 49A Ruta de siacutentesis de los compuestos cumariacutenicos i) H2SO4 1 h bantildeo de
hielo ii) NaOH Ac2O 30 min bantildeo de hielo (aacutecido cafeico 6) H2SO4 Ac2O 30
min (cumarina y aacutecidos benzoicos)
Figura 49B Ruta de siacutentesis de los compuestos cumariacutenicos iii) DBU DMF (seca)
35 h 50 degC iv) NaHCO3 MeOH acetona tdeg amb 3 h N2
Figura 410 A Sonda fluoresceiacutena B 22prime-azobis (2-metilpropionamidina)
dihidrochloridrato (ABAP) C 6-hidroxi-2578-tetrametilcroman-2-aacutecido carboxiacutelico
(Trolox)
Figura 411 Actividad antioxidante ORAC para un compuesto en estudio
Figura 412 Reactivo 246-tris(2-piridil)-s-triazina (TPTZ)
Figura 413 Voltamograma ciacuteclico de la generacioacuten de anioacuten radical superoacutexido
DMF+ HFFTBA 02 M en electrodo de carbono viacutetreo
Figura 51A Voltamogramas de pulso diferencial para los precursores 1 2 3 y 4
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 51B Voltamogramas de pulso diferencial para los derivados 9 10 y 11
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 52A VC para el derivado 9 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 53A VC para el derivado 10 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 54A VC para el derivado 1a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 55 Esquema del proceso electro-oxidativo propuesto para el catecol
Figura 56 Relacioacuten Epa vs logv para el derivado de aacutecido cafeico 9 2 mM en
DMF + HFFTBA 02 M
xii
Figura 57 Graacutefica para la corriente de pico Ipa vs la raiacutez cuadrada de la velocidad de
barrido Ejemplo de correlacioacuten lineal en el aacutecido protocateacutequico 4 2 mM en
DMF + HFFTBA 02 M
Figura 58 Determinacioacuten graacutefica del valor de Eonset VC del precursor 1 01 Vs
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 59 Relacioacuten Eonset vs logv para los compuestos estudiados
Figura 510 Correlacioacuten Ipa v12
vs v12
para el precursor aacutecido protocateacutequico 4
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 511A Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido cafeico 9 estabilizado con Zn2+
en DMF+HFFTBA
(izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color
rojo)
Figura 511B Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido gaacutelico 10 estabilizado con Zn2+
en DMF+HFFTBA
(izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color
rojo)
Figura 511C Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido 11 estabilizado con Zn2+
en DMF+HFFTBA (izq)
Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color rojo)
Figura 512 Curvas para el consumo de la sonda Fluoresceiacutena para un set de
concentraciones del compuesto 11
Figura 513 Graacutefica de aacuterea neta bajo la curva ABC vs concentracioacuten del derivado 11
Figura 514 Esquema para la reaccioacuten entre el complejo de Fe3+
y el compuesto
antioxidante reductor
Figura 515 Espin aducto generado por la inactivacioacuten del radical OHbull y su espectro
simulado (derecha)
xiii
Figura 516A Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto 4-clorometil-78-dihidroxicumarina 1 B Espectro REE de inactivacioacuten
del radical hidroxilo con adicioacuten del compuesto aacutecido cafeico 2
Figura 516C Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto aacutecido gaacutelico 3 D Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con
adicioacuten del compuesto aacutecido 34-dihidroxi benzoico 4
Figura 516E Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto hiacutebrido 9 F Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con
adicioacuten del compuesto hiacutebrido 10
Figura 516G Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto hiacutebrido 11
Figura 517 Espectro REE se destaca en rojo el triplete de integracioacuten 121
formado despueacutes de la reaccioacuten de Fenton no-cataliacutetico (izq) Espectro simulado
utilizando el programa EPR-WINSIM (der)
Figura 518 Espectro simulado para la formacioacuten del spin aducto [cumarina-
DMPO] utilizando el programa EPR-WINSIM
Figura 519 Voltamogramas ciacuteclicos del par redox correspondiente al anioacuten
superoacutexido tras antildeadir aliacutecuotas del compuesto 1 DMF + HFFTBA 02 M 01 Vs
Figura 520 Graacutefica del paraacutemetro adimensional (Ipa0-Ipa
S Ipa
0) vs concentracioacuten
de sustrato para el compuesto 1 (Destacado en verde el valor de IA50)
Figura 521 Hidrofobicidad relativa de los derivados y la cumarina precursora
Figura 522 Correlacioacuten entre el valor de logD teoacuterico y CAC experimental a
10 microM de cada compuesto El valor logD se obtuvo a traveacutes de la herramienta Marvin
Sketch del software ChemAxon164
Figura 523 Estructura optimizada en 3D para el precursor 1 utilizando DFT
Figura 524 Estructura optimizada en 3D para el derivado 9 utilizando DFT
Figura 525 Estructura optimizada en 3D para el derivado 10 utilizando DFT
xiv
Figura 526 Estructura optimizada en 3D para el derivado 11 utilizando DFT
Figura 61 Esquema de reaccioacuten para un mecanismo concertado de electro-
oxidacioacuten fenoacutelica Adaptacioacuten referencia 118
Figura 62 Esquema de reaccioacuten para estructuras fenoacutelicas mecanismo electro-
oxidativo en etapas
Figura 63 Correlacioacuten entre el potencial de oxidacioacuten Eonset y los ensayos frente a
anioacuten superoacutexido
xv
Tablas
Tabla 51 Paraacutemetros experimentales para los compuestos Determinaciones en VC
2 mM DMF + HFFTBA 02 M
Tabla 52 Constantes de acoplamiento hiperfino para los derivados polifenoacutelicos
Valores en Gauss
Tabla 53 Valores experimentales de Iacutendice ORAC para los compuestos estudiados
Tabla 54 Valores calculados para el factor estequiomeacutetrico n
Tabla 55 Valores experimentales obtenidos para los compuestos en estudio ensayo
FRAP en equivalentes de Trolox10 microM de muestra
Tabla 56 Porcentajes de inactivacioacuten del radical hidroxilo (OHmiddot)
Tabla 57 Valores de IA50 obtenidos para los compuestos estudiados
Tabla 58 Valores obtenidos para la capacidad antioxidante celular (CAC)
concentraciones 1 microM y 10 microM de cada compuesto
Tabla 59 Valores obtenidos para el tiempo de retencioacuten experimental de los
compuestos
Tabla 510 Valores de Iacutendice de Fukui fk para los compuestos en estudio
Tabla 61 Cuadro comparativo de los resultados en la determinacioacuten de capacidad
antioxidante para la cumarina y sus derivados
xvi
Glosario de abreviaturas
ABAP 22-azo-bis(2-amidinopropan)diclorhidrato
ADN Aacutecido desoxiribonucleico
ATCC American Type Culture Collection
HFFTBA Hexafluorofosfato de tetrabutil amonio
CAC Capacidad antioxidante celular
CYP450 Citocromo P450
DBU 18-diazabiciclo[540]undec-7-ano
DCFH-DA 2-(6-oxido-3-oxo-3H-xanten-9-il)benzoato disoacutedico (fluoresceiacutena sal
disoacutedica)
DMF NN-dimetilformamida
DMPO 55-dimetil-1-pirroline-N-oacutexido
DMSO Dimetil sulfoacutexido
DPPHbull Radical 22-difenil-1-picrilhidrazil
Epa Potencial de pico anoacutedico
EPR Electron paramagnetic resonance
ERNs Especies reactivas de nitroacutegeno
EROs Especies reactivas de oxiacutegeno
xvii
fk Iacutendice de Fukui
FRAP Ferric reducing antioxidant in plasma
HObull Radical hidroxilo
IA50 Iacutendice antioxidante 50
Ipa Corriente de pico anoacutedica
O2˙- Anioacuten radical superoacutexido
ONOObull Radical peroxinitrito
ORAC-FL Oxygen radical antioxidant capacity-fluorescein
PBS Buffer fosfato salino
REE Resonancia de espiacuten electroacutenico
RObull Radical alcoxilo
ROOmiddot Radical peroxilo
TPTZ 246-tris(2-piridil)-s-triazina
Trolox 6-hidroxi-2578-tetrametilcroman-2-aacutecido carboxiacutelico
VC Voltametriacutea ciacuteclica
VPD Voltametriacutea de pulso diferencial
xviii
RESUMEN
Las cumarinas (2H-1-benzopiran-2-ona) son estructuras quiacutemicas presentes en
especies vegetales ampliamente distribuidas en la naturaleza con una reconocida
actividad bioloacutegica entre las que destacan sus propiedades antioxidantes
En el presente trabajo de Tesis se describe la siacutentesis de derivados polifenoacutelicos La
cumarina dihidroxilada como estructura de partida fue esterificada con distintos
aacutecidos orgaacutenicos polifenoacutelicos (Figura 1) Se estudioacute su electro-oxidacioacuten y se evaluoacute
su actividad antioxidante frente a especies reactivas de oxiacutegeno por medio de diversas
metodologiacuteas in vitro
Figura 1 Esquema de los compuestos estudiados
Se estudioacute el comportamiento anoacutedico de los compuestos mediante voltametriacutea
ciacuteclica (VC) y voltametriacutea de pulso diferencial (VPD) en medio aproacutetico como una
aproximacioacuten a los procesos redox que ocurren en membranas bioloacutegicas
Se determinoacute la presencia de especies radicalarias en el proceso electro-oxidativo a
traveacutes de la teacutecnica de resonancia de espiacuten electroacutenico (REE) Las constantes de
OOH
HO O
Cl
HO
OOH
OH
OH
OH
HO
O
OH
OH
OH
HO
OO
OHHO O
OH
OH
O
O
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
xix
acoplamiento hiperfino junto con caacutelculos teoacutericos (iacutendice de Fukui) permitieron
discriminar distintos sitios reactivos en las nuevas moleacuteculas donde se desarrolla el
proceso oxidativo
Ademaacutes se evaluoacute la capacidad antioxidante de los compuestos a traveacutes de los
ensayos capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno-fluoresceiacutena (ORAC-
FL) capacidad antioxidante reductora de hierro (FRAP) apagamiento del radical
hidroxilo mediante spin trapping inactivacioacuten de anioacuten superoacutexido y capacidad
antioxidante celular (CAC) en un modelo bioloacutegico in vitro simple
Para los ensayos antioxidantes no bioloacutegicos la introduccioacuten de las distintas
estructuras fenoacutelicas en el anillo cumariacutenico permite obtener derivados que presentan
una capacidad antioxidante mejor que el precursor cumariacutenico inicial Se establecioacute
la respectiva correlacioacuten entre el potencial de inicio del proceso electroquiacutemico
(potencial onset) y los resultados encontrados en el ensayo en medio aproacutetico frente a
anioacuten superoacutexido
Considerando el ensayo bioloacutegico de capacidad antioxidante celular eacuteste sugiere que
la actividad antioxidante de los nuevos derivados estaacute circunscrita a medios de
naturaleza lipofiacutelica
xx
SUMMARY
Coumarins (2H-1-benzopyran-2-one) are chemical structures from vegetal sources
widely distributed in vegetable species with recognized biological activities among
which their antioxidant capacity
In this Thesis work the syntheses of coumarin polyphenolic derivatives is described
Coumarin was the starter scaffold and it was sterified with different organic phenolic
acids The electro-oxidation of polyphenolic derivatives is studied and their
antioxidant capacity towards ROS through methodologies in vitro is evaluated
Figure 1 Scheme of studied compounds
The anodic behavior of the compounds by cyclic voltammetry (CV) and differential
pulse voltammetry (VPD) was studied in aprotic medium as an approximation to the
redox processes in biological membranes
The presence of radical species is determined in the electro-oxidation process through
the technique electron spin resonance (ESR)The hyperfine coupling constants and
theoretical calculations (Fukui index values) allow to discriminate between the
OOH
HO O
Cl
HO
OOH
OH
OH
OH
HO
O
OH
OH
OH
HO
OO
OHHO O
OH
OH
O
O
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
xxi
different reactive sites in the new molecules where the oxidative process is taking
place
Moreover antioxidant capacity of derivatives was evaluated through oxygen radical
antioxidant assay-fluorescein (ORAC-FL) ferric reducing ability of plasma (FRAP)
spin trapping superoxide scavenging assays and cellular antioxidant (CAC) in a
simple biological model in vitro
In the non-biological antioxidant assays the addition of various phenolic structures to
the coumarin scaffold yielded derivatives with improved antioxidant capacity related
to initial coumarin We studied the correlations between the starting potential of the
electrochemical process (onset potential) and the antioxidant results obtained in
aprotic media against superoxide anion
In regard to the biological cellular antioxidant capacity assay it suggests that the
antioxidant activity of new derivatives could be limited to lipophilic media
Introduccioacuten
1
1 Introduccioacuten
11 Cumarinas
111 Origen vegetal
Las cumarinas son una familia de compuestos cuya estructura baacutesica corresponde a la
lactona heterociacuteclica 2H-1-benzopiran-2-ona (Figura 11) En el reino vegetal estaacuten
ampliamente distribuidas habieacutendose identificado en la actualidad maacutes de 1800
cumarinas de origen natural1 eacutestas se encuentran principalmente como metabolitos
secundarios en diversas plantas tanto en sus semillas como en hojas y raiacuteces2 Su
biosiacutentesis es descrita por distintos autores como una serie de procesos catalizados
por enzimas presentes en la estructura CYP450 (citocromo P450) en algunos casos
estos compuestos son generados en la ceacutelula vegetal como una viacutea de defensa
(fitoalexinas como la escopoletina) frente a estiacutemulos de estreacutes y la presencia de fito-
patoacutegenos34
O O
3
45
6
7
81
2
Figura 11 Estructura de la 2H-1-benzopiran-2-ona (cumarina)
Introduccioacuten
2
El nombre de estos compuestos se deriva de la palabra ldquocoumarourdquo vocablo
caribentildeo que hace referencia al aacuterbol de Tonka originario de Sudameacuterica de cuya
semilla A Vogel logra aislar el compuesto y publicar su hallazgo en 18205b
A partir
de entonces el intereacutes por su caracterizacioacuten6 la obtencioacuten tanto desde fuentes
naturales7 como por rutas sinteacuteticas de la cumarina y sus derivados ha ido en
aumento encontrando su primera aplicacioacuten en la fabricacioacuten de perfumes En 1868
W H Perkin propuso la siacutentesis de una fragancia vegetal a partir de la sal soacutedica del
orto-hidroxibenzaldehiacutedo y anhiacutedrido aceacutetico obteniendo el mismo producto aislado
de la semilla de Tonka5 8(ac)
Se han estudiado los aspectos taxonoacutemicos en cuanto a la clasificacioacuten de las especies
vegetales que contienen compuestos cumariacutenicos se estima que las principales
familias donde se encuentran estos derivados son Umbelliferae Rutaceae
Leguminosae Compositae Caryopgillaceae Euphorbiaceae Hipocastanaceae
Oleaceae Thymelaeaceae8b
112 Rutas de siacutentesis
Los autores Sethna y Narsinh9 presentaron en 1944 una de las primeras revisiones del
estado del arte con respecto a la siacutentesis de cumarinas En ella se encuentran las
principales metodologiacuteas claacutesicas de obtencioacuten como la siacutentesis de Perkin
Pechmann10
y Pechmann-Duisberg11
(Figura 12) en la que se obtiene la cumarina al
Introduccioacuten
3
condensar un fenol con un β-cetoester en medio aacutecido Diversas publicaciones
plantean modificaciones a esta ruta con catalizadores12 (ab)
libre de solventes13 (ab)
con promotores aacutecidos14
asistida por microondas15
entre otras
Figura 12 Esquema general de la reaccioacuten de Pechmann
Otra metodologiacutea empleada es la de Knoevenagel16
propuesta en 1898 Consiste en
una reaccioacuten de condensacioacuten entre o-hidroxialdehiacutedos con malonato de etilo
acetoacetato de etilo o cianoacetato de etilo en medio baacutesico (piridina o piperidina)
Los autores Bigi y colaboradores17
describen el uso de un catalizador en base a
montmorillonita para la obtencioacuten de cumarinas sustituidas en posicioacuten 3 con un
grupo aacutecido Posteriormente otro grupo de trabajo (Shaabani 2009) llevoacute a cabo esta
condensacioacuten empleando radiacioacuten de microondas lo que les permitioacute obtener buenos
rendimientos en un medio ldquoamigablerdquo con el ambiente18
Se han descrito otras metodologiacuteas sinteacuteticas en las cuales se utilizan las reacciones
claacutesicas de Wittig19 ab
y Reformatsky20
ademaacutes de otras rutas con variantes tanto en
los reactivos como en el medio de reaccioacuten que permiten la obtencioacuten de derivados
OH
+
OEt
O O H2SO4
O O
Introduccioacuten
4
cumariacutenicos como la siacutentesis en presencia de bases fuertes21
reacciones libres de
solventes22
y la obtencioacuten de cumarinas policiacuteclicas utilizando compuestos
organometaacutelicos descrita por Harvey y cols23
113 Principales aplicaciones
Tras ser aisladas desde su fuente vegetal y como resultado de investigaciones
posteriores dirigidas a generar rutas sinteacuteticas viables las cumarinas han sido objeto
de numerosos estudios enfocados en la buacutesqueda de sus aplicaciones Es asiacute como en
la literatura se pueden encontrar las maacutes diversas investigaciones para este tipo de
compuestos provenientes tanto de productos de siacutentesis o como extractos de
vegetales y plantas con reconocidas propiedades en la medicina tradicional esto da
origen al estudio de sus bio-aplicaciones entre las que se destaca su capacidad como
antioxidante
A Actividad bioloacutegica
La primera aplicacioacuten en bio-medicina descrita para las cumarinas fue como
anticoagulante desde que se aislara y caracterizara el dicumarol 33rsquo-metilenbis(4-
hidroxicumarina) (Figura 13) Posteriormente aparece en el mercado su derivado
Introduccioacuten
5
sinteacutetico conocido como Warfarina que hasta la deacutecada pasada era considerado uno
de los faacutermacos anticoagulantes maacutes vendidos en Estados Unidos24 a-c
OOOO
OH HO
Figura 13 Estructura de la 33rsquo-metilenbis(4-hidroxicumarina) o dicumarol
Con posterioridad el uso de las cumarinas se ha diversificado hacia innumerables
blancos terapeacuteuticos En la literatura se describen variados estudios con respecto a sus
propiedades farmacoloacutegicas25ab
Su capacidad como agente antitumoral 26ab
se ha
estudiado en compuestos provenientes tanto de fuentes vegetales como sinteacuteticas
Riveiro ME y cols estudiaron el efecto de la 78-OH-4-metilcumarina en ceacutelulas
humanas afectadas por leucemia evidenciando el potencial que presentoacute este
derivado dihidroxilado27
En otra investigacioacuten realizada por C Ito y colaboradores
aislaron tres derivados cumariacutenicos de la especie vegetal Murraya siamensis cuyos
ensayos frente a ceacutelulas tumorales resultaron promisorios28
Con respecto a las propiedades antiinflamatorias de las cumarinas en la naturaleza se
encuentran especies como la Chamomilla recutita (manzanilla) que contiene un tipo
Introduccioacuten
6
de umbeliferona con tales propiedades En la literatura se encuentran derivados
sinteacuteticos desarrollados en cuya estructura estaacute presente el esqueleto cumariacutenico29
Lin y cols presentan los resultados de su estudio de la capacidad antiinflamatoria de
un conjunto de cumarinas los cuales fueron ademaacutes correlacionados con los
obtenidos para el apagamiento del radical hidroxilo30
HA El-Wahab y cols sintetizaron distintas tiazolo-cumarinas hiacutebridas y estudiaron
una de sus propiedades farmacoloacutegicas como agente antimicrobiano Estos
compuestos posteriormente fueron aplicados como aditivos en recubrimientos de
poliuretano confirieacutendoles tambieacuten esta propiedad microbicida a las superficies en
las que se utilizoacute31
Tambieacuten se han descrito derivados cumariacutenicos con propiedades anti-fuacutengicas 32ab
Un trabajo reciente presenta el estudio de complejos en base a Ni(II) Cu(II) y
Co(II)frente a distintas especies de hongos (Candida A niger Rhizopus)32c
Tambieacuten se han encontrado estructuras cumarina-glucoacutesidos provenientes de especies
vegetales (Hydrangea paniculata) que presentan propiedades hepatoprotectoras33
Otros estudios sentildealan tambieacuten la importancia de las estructuras cumariacutenicas como
compuesto antiviral analgeacutesico anti-tromboacutetico ulcerogeacutenico 25 34-36
inclusive con
potencial para ser usadas en terapias frente al VIH como lo sentildeala la investigacioacuten
sobre especies vegetales que contienen dipiranocumarin - calanolideos como
Introduccioacuten
7
principio activo25a
estudios que tambieacuten se han realizado con derivados de siacutentesis
disentildeados a partir de la estructura de origen vegetal (Lomatium suksdorfii) conocida
como suksdorfina (Figura 14) a partir de la cual se han generado compuestos
anaacutelogos con el objeto de estudiar su modo de accioacuten y obtener sustratos cada vez
maacutes potentes frente a la enfermedad (Yu D y cols 2003)37
O OO
O
O
OO
Figura 14 Estructura de la suksdorfina
B Propiedades antioxidantes
El equilibrio en los organismos vivos es funcioacuten de diversos factores entre ellos cabe
mencionar el balance de las especies que generan estreacutes oxidativo dentro del medio
celular estas especies pueden ser de origen endoacutegeno como las provenientes de la
cadena transportadora de electrones enzimas oxidantes ceacutelulas fagociacuteticas o de
origen exoacutegeno como sustancias reductoras oxidacioacuten de drogas tabaquismo
ultrasonido luz solar etc Entre los compuestos que generan estreacutes conocidos como
Introduccioacuten
8
EROs y ERNs (especies reactivas de oxiacutegenonitroacutegeno) se pueden mencionar el
anioacuten superoacutexido (O2˙-) peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2) radical peroxilo (ROObull) y
alcoxilo (RObull) radical hidroxilo (HObull) oacutexido niacutetrico (NObull) peroxinitrito (ONOObull)
entre otras
Dentro de este contexto en la literatura se ha descrito el potencial que poseen las
cumarinas y sus derivados como compuestos capaces de interaccionar con especies
reactivas de oxiacutegeno y nitroacutegeno lo que da cuenta de su capacidad antioxidante tema
relevante si se considera que parte importante de las patologiacuteas conocidas y
estudiadas en la actualidad a nivel mundial estaacuten iacutentimamente ligadas a cuadros de
estreacutes oxidativo presentes en el organismo 38 39
Payaacute y colaboradores presentaron un trabajo en el cual se estudia la reactividad de un
conjunto de dieciseacuteis cumarinas (naturales y sinteacuteticas) frente al radical hidroxilo
aacutecido hipocloroso y anioacuten superoacutexido encontrando que los derivados di-hidroxilados
poseiacutean mejores propiedades que aquellos mono-hidroxilados o sin sustitucioacuten40
Estos resultados se complementan con una publicacioacuten posterior del mismo grupo en
que se profundiza el estudio anterior sentildealando las propiedades terapeacuteuticas de los
derivados cumariacutenicos34
El derivado conocido como esculetina (67-dihidroxicumarina) fue ensayado frente al
radical DPPH junto con ensayos de estreacutes oxidativo en medios de cultivo celular
Introduccioacuten
9
estos autores sentildealan la importancia de los grupos catecol en su capacidad de atrapar
especies radicales (Kim y cols 2008)41
Otro estudio en el que se ensaya un extracto
vegetal (Cortex Fraxini) relaciona ademaacutes la capacidad antioxidante de las o-
dihidroxi cumarinas con su capacidad reductora42
Zhang y cols presentan un estudio reciente en el cual cumarinas dihidroxiladas en
posicioacuten 7 y 8 entre otros derivados poseen importante bio-actividad in vitro los
compuestos fueron ensayados frente a especies radicales en ceacutelulas tumorales
presentaron ademaacutes actividad como antiinflamatorios y baja toxicidad tanto en
ceacutelulas sanguiacuteneas de vertebrado como de invertebrado Junto con lo anterior se
realizoacute un anaacutelisis de estructura-reactividad correlacionando la capacidad de
apagamiento de radicales con las propiedades antiinflamatorias y antitumorales de los
derivados cumariacutenicos encontradas en esta investigacioacuten43
12 Compuestos polifenoacutelicos
121 Origen vegetal
Los polifenoles al igual que las cumarinas son una amplia familia de compuestos (se
han encontrado maacutes de 8000 de ellos) presentes en estructuras vegetales como
metabolitos secundarios cumpliendo roles tales como protector frente a radiacioacuten
UV reguladores de los ciclos de crecimiento pigmentacioacuten y defensa frente a
Introduccioacuten
10
depredadores Su estructura baacutesica es el anillo benceacutenico con sustituyentes hidroxilo
(-OH) en distintas posiciones Se clasifican en flavonoides aacutecidos fenoacutelicos
(hidroxicinaacutemicos e hidroxibenzoicos) taninos estilbenos Debido a sus interesantes
propiedades y bio-aplicaciones estos fitoquiacutemicos han sido objeto de diversos
estudios investigacioacuten y caracterizacioacuten44-46
Estos compuestos son un constituyente importante de la dieta diaria se encuentran en
forma abundante en diversos frutos como por ejemplo berries manzana mango uva
pera granada y ciacutetricos en bebidas como el vino teacute y cafeacute 47
en vegetales cereales
y semillas Junto con lo anterior se ha descrito la utilizacioacuten de aacutecidos polifenoacutelicos
provenientes de extractos vegetales y aceites esenciales como aditivos en la industria
alimentaria aplicados como preservantes naturales en reemplazo de aquellos de
origen sinteacutetico debido a las propiedades antimicrobianas que exhiben48
122 Actividad bioloacutegica
Estos compuestos se conocen tambieacuten como ldquobiofenolesrdquo (Romeo y Uccella 1996)
haciendo referencia a aquellos provenientes de fuentes naturales Las primeras
publicaciones sobre los polifenoles en general comenzaron en la deacutecada de 1950 con
la investigacioacuten de D Harman y su teoriacutea del envejecimiento y los radicales libres
estudios en los que se planteoacute prolongar la sobrevida en especies roedores enfermos a
traveacutes de la ingesta de biofenoles presentes en su dieta Es asiacute que el nuacutemero de
publicaciones concernientes al tema se incrementoacute de una treintena (entre 1900 y
Introduccioacuten
11
1950) hasta superar las 35000 publicaciones entre los antildeos 2000-2010 lo que da
cuenta del creciente intereacutes en este toacutepico49
La bio-actividad de los compuestos polifenoacutelicos es amplia se encuentran diversos
estudios como el citado anteriormente con respecto a las capacidades antimicrobianas
de los polifenoles y su uso en la industria alimentaria5051
Compuestos como la
curcumina resveratrol quercetina y derivados del aacutecido gaacutelico se enumeran dentro de
las investigaciones realizadas tanto in vitro e in vivo en la prevencioacuten del caacutencer
(Cimino y cols 2012)52
Otras propiedades descritas para estos compuestos son como cardio-protectores anti-
canceriacutegenos antiinflamatorios vaso-relajantes entre otras como lo resume el
artiacuteculo de Xia y cols (2010) En eacutel ademaacutes se presenta una revisioacuten en cuanto a los
meacutetodos de extraccioacuten purificacioacuten y caracterizacioacuten del contenido y tipos de
polifenoles especiacuteficamente en el caso de la uva fruto reconocido por su alto
contenido de fitoquiacutemicos y nutrientes53
123 Polifenoles como antioxidantes
Los polifenoles como micronutrientes presentes en los alimentos y otras estructuras
vegetales han sido un foco de intereacutes ya que sus aplicaciones terapeacuteuticas estaacuten
relacionadas con su reconocida e investigada capacidad antioxidante y quelante de
metales Con respecto a esta uacuteltima cabe mencionar la revisioacuten del estado del arte
Introduccioacuten
12
realizada por Kozlowski y cols con respecto al desbalance de Cu Zn y Fe en el
organismo en ella se indica que la presencia libre y en exceso de estos metales estaacute
directamente relacionada con patologiacuteas neurodegenerativas y caacutencer entre otras ya
que su actividad redox genera especies reactivas capaces de atacar sustratos orgaacutenicos
como la membrana lipiacutedica proteiacutenas y aacutecido desoxiribonucleico (ADN)54
Ribeiro y colaboradores presentan un estudio en el que se determina el contenido
polifenoacutelico de la especie Fistulina hepaacutetica Los extractos se ensayaron frente a
DPPH anioacuten superoacutexido radical hidroxilo y aacutecido hipocloroso Los autores plantean
que considerando los resultados obtenidos esta especie fuacutengica podriacutea tener
aplicacioacuten como suplemento o como antioxidante en la industria alimentaria55
Estudios realizados con aacutecido taacutenico comercial sentildealan que su capacidad como
antioxidante y como quelante de hierro da cuenta del potencial que tiene este aacutecido
ademaacutes como anti-mutageacutenico y anti-carcinogeacutenico Los autores indican posibilidad
de que este aacutecido el cual presenta baja toxicidad contribuye en el apagamiento de
especies reactivas de oxiacutegeno dantildeinas a nivel de ADN (Andrade y cols 2006)56
trabajo que se complementa con una publicacioacuten anterior del mismo grupo donde se
estudioacute el apagamiento del radical OHbull mediante complejos de aacutecido taacutenico-Cu
(Andrade y cols 2005)57
Los aacutecidos hidroxicinaacutemicos e hidroxibenzoicos han sido tambieacuten objeto de estudio
debido a su capacidad antioxidante58-61
Jeong y colaboradores estudiaron el extracto
de la especie vegetal Erigeron annuus el cual contiene aacutecido cafeico en su fraccioacuten
Introduccioacuten
13
butanoacutelica este extracto fue ensayado como agente neuro-protector y antioxidante en
ceacutelulas nerviosas Frente a los resultados obtenidos los autores concluyen que este
extracto podriacutea ser utilizado en terapias frente a patologiacuteas neurodegenerativas como
el Alzheimer62
Otro estudio de capacidad antioxidante realizado a un grupo de
compuestos polifenoacutelicos presentes en el propoacuteleo (aacutecido cafeico aacutecido feruacutelico
ferulato de etilo eacutester fenetiacutelico del aacutecido cafeico) sentildeala que los grupos catecol
presentes en las estructuras ensayadas incrementan la capacidad antioxidante
mientras que en estudios relacionados con bio-membranas se debe tener en cuenta
ademaacutes la hidrofobicidad que presenten los compuestos63
13 Compuestos hiacutebridos
Al considerar que las diversas enfermedades que afectan al ser humano (caacutencer
diabetes enfermedades neurodegenerativas artritis entre otras) involucran diferentes
factores patogeacutenicos se han desarrollado estrategias sinteacuteticas que permiten obtener
nuevos faacutermacos de naturaleza hiacutebrida los cuales incorporan en su estructura
distintos ingredientes activos64
Este disentildeo ldquomulti-blancordquo ha permitido que los
nuevos faacutermacos actuacuteen en distintos blancos terapeacuteuticos este tipo de terapias
implica una disminucioacuten en los problemas asociados a una multi-dosificacioacuten las
interacciones entre distintos medicamentos una disminucioacuten en la resistencia a los
faacutermacos (en el caso de enfermedades de origen microbiano) disminucioacuten en los
efectos adversos derivados de la dosificacioacuten muacuteltiple por mencionar algunos
Introduccioacuten
14
Diversas investigaciones sobre el tema dan cuenta de la relevancia que ha tenido esta
estrategia y el disentildeo racional de nuevos medicamentos65-68
La revisioacuten realizada por
los autores Mehta y Singh (2002) menciona algunos de los esqueletos que han dado
origen a estructuras hiacutebridas entre ellas esteroides antraciclinas β-lactamas
fullerenos carbohidratos-peacuteptidos En esta revisioacuten se indica el uso de este tipo de
compuestos en terapias contra el caacutencer y como neuro-protectores69
En el caso de la malaria una de las enfermedades infecciosas maacutes complejas a nivel
mundial la resistencia del paraacutesito del geacutenero Plasmodium frente a los faacutermacos
empleados (cloroquina principalmente) ha sido un tema de estudio durante antildeos Una
resentildea de este desafiacuteo se presenta en el artiacuteculo de Kouznetsov y Goacutemez-Barrio
(2009) en el que se sentildeala la siacutentesis de derivados de aminoquinolina como las
trioxaquinas70
las cuales se presentan posteriormente en una revisioacuten realizada por
Chauhan y colaboradores en ella se destaca a estos hiacutebridos como candidatos
promisorios para la formulacioacuten de nuevas drogas antimalaacutericas71
Otra patologiacutea en la que se ha utilizado faacutermacos de naturaleza hiacutebrida que en
algunos casos provienen de productos naturales es el caacutencer72
Allen y
colaboradores73
mencionan en una reciente revisioacuten de tecnologiacuteas avanzadas en las
que ademaacutes de utilizar la estrategia de compuestos hiacutebridos con dos estructuras de
propiedades anticanceriacutegenas eacutestos se combinan con nano-estructuras orientadas a
Introduccioacuten
15
blancos especiacuteficos para asiacute disminuir el riesgo de efectos colaterales en el
tratamiento de esta compleja patologiacutea
Este concepto y disentildeo de faacutermacos multi-blanco se ha aplicado ademaacutes en distintas
terapias frente a enfermedades como el Alzheimer74
en vacunas de amplio espectro
frente al coacutelera75
en la siacutentesis de compuestos antiparasitarios76
y de dihidropiridinas
las cuales poseen actividad vasodilatadora77
por mencionar algunos ejemplos
131 Cumarinas como estructuras hiacutebridas
Al considerar el estado del arte con respecto a la amplia y variada actividad bioloacutegica
que presentan los derivados cumariacutenicos se encuentra que otra de las aplicaciones que
se ha estudiado para esta familia de compuestos es su capacidad para formar parte de
estructuras hiacutebridas complejas compuestos orientados a la obtencioacuten faacutermacos multi-
blanco que den respuesta a los interrogantes y desafiacuteos actuales con respecto a
importantes patologiacuteas y sus terapias 78
En la literatura se describen ejemplos de estructuras cumariacutenicas hiacutebridas no soacutelo de
origen sinteacutetico sino que tambieacuten se pueden extraer desde su fuente natural Un
estudio realizado en hojas y ramas de la especie Gnidia socotrana (originaria de
Yemen) da cuenta de la presencia de estructuras flavona-cumarina las que fueron
extraiacutedas purificadas y caracterizadas79
(Figura 15)
Introduccioacuten
16
O
OH
HO O
OH
O
O
OH
Figura 15 Estructura del hiacutebrido cumarina-flavona aislado de su fuente vegetal
Gnidia socotrana
Entre los compuestos antibioacuteticos de origen natural que poseen el esqueleto
cumariacutenico en su estructura se encuentran la novobiocina (Figura 16) clorobiocina y
cumermicina Presentes como metabolitos secundarios en la especie Streptomyces
estos derivados deben su actividad antibioacutetica a que actuacutean inhibiendo la enzima
ADN girasa presente en bacterias impidiendo su replicacioacuten y ademaacutes genera su
muerte celular80
O
HN
OH
O
OH
O
O
MeOO
H2N
HO
Figura 16 Estructura del antibioacutetico hiacutebrido novobiocina metabolitos secundarios
en la especie Streptomyces
Introduccioacuten
17
Se ha descrito tambieacuten la capacidad antitumoral de derivados cumarina-resveratrol a
partir del precursor 7-hidroxicumarina En la publicacioacuten de Belluti y colaboradores
se presentan los ensayos realizados para 10 compuestos los cuales tuvieron como
objeto ceacutelulas tumorales de pulmoacuten humano dos de los hiacutebridos presentaron
resultados promisorios como antitumorales y pro-apoptoacuteticos comportamiento que
los autores concluyen tiene relacioacuten con la posicioacuten de los sustituyentes en la
moleacutecula81
La revisioacuten bibliograacutefica de Longhin y colaboradores describe diversas estructuras
hiacutebridas desarrolladas que cuentan con capacidad antiinflamatoria toacutepico de intereacutes si
se considera que los cuadros inflamatorios estaacuten relacionados a dolencias como el
Alzheimer asma arterioesclerosis artritis reumatoide caacutencer etc En este trabajo se
sentildeala al hiacutebrido cumarina-aacutecido lipoico donde ambas estructuras poseen ademaacutes
reconocida capacidad antioxidante y el aacutecido unido a la cumarina en posicioacuten 3
mediante un espaciador es la estructura que se describe con una actividad superior al
conocido y utilizado faacutermaco indometacina82
Junto con los estudios descritos otra importante aacuterea de investigacioacuten ha sido el
desarrollo de estructuras hiacutebridas con capacidad antioxidante (Koufaki 2006)83
actividad que permite en muchos casos restablecer el equilibrio en organismos vivos
frente al exceso de especies generadoras de estreacutes oxidativo cuadro que como ya se
Introduccioacuten
18
mencionoacute estaacute con frecuencia asociado las patologiacuteas conocidas y estudiadas en la
actualidad
El reciente estudio desarrollado por Matos Olea-Azar y colaboradores presenta la
estructura cumarina-resveratrol y diferentes derivados sinteacuteticos los cuales fueron
estudiados mediante diversas teacutecnicas in vitro como resonancia de espiacuten electroacutenico
(REE) capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno (ORAC-FL) y
voltametriacutea ciacuteclica (VC) En esta investigacioacuten se encontroacute que los compuestos
propuestos poseen una buena capacidad antioxidante84
Una investigacioacuten que da cuenta del potencial que posee esta estrategia es la
desarrollada por Kenchappa y colaboradores quienes sintetizaron derivados
cumariacutenicos unidos a pirazol e indenona posteriormente mediante estudios in vitro e
in vivo obtuvieron resultados de su capacidad antioxidante y ademaacutes como agentes
anti-hipergliceacutemicos en un modelo animal proyectaacutendolos como posibles faacutermacos
frente a la diabetes85
Dentro del mismo esquema Krishan y colaboradores
desarrollaron una serie de cumarinas unidas al benzoimidazol el cual es a su vez una
estructura con muacuteltiple y reconocida actividad bioloacutegica proponen a dos compuestos
de la serie como derivados con una buena capacidad antioxidante y anti-inflamatoria
a nivel de mucosa gaacutestrica86
Introduccioacuten
19
Un tipo de derivado hiacutebrido que ha sido estudiado es la cumarina-chalcona El trabajo
realizado por Xi y Liu presenta la siacutentesis de una serie de compuestos (Figura 17)
los que posteriormente son ensayados por distintas metodologiacuteas de determinacioacuten de
capacidad antioxidante concluyendo que estos hiacutebridos son estructuras promisorias
en los que el grupo catecol presente en el esqueleto cumariacutenico o en la chalcona es
capaz de inhibir distintos procesos oxidativos a nivel de ADN87
O O
OH
O
R1
R2
R3
Figura 17 Hiacutebridos chalcona-cumarina con capacidad antioxidante
Peacuterez-Cruz y colaboradores describen el disentildeo siacutentesis y estudio de la capacidad
antioxidante de derivados cumarina-chalcona los que presentaron buena reactividad
frente a distintas especies radicales y capacidad cito-protectora en un modelo celular
animal88
En los estudios mencionados se evidencia el continuo desarrollo que ha tenido el
disentildeo y siacutentesis de compuestos hiacutebridos como nuevos faacutermacos frente a complejas
Introduccioacuten
20
enfermedades multifactoriales Esta tendencia vigente en la actualidad se extiende a
los maacutes variados nuacutecleos estructurales entre ellos la cumarina Este heterociclo
clasificado por algunos autores como ldquoestructura privilegiadardquo debido a la amplia
gama de compuestos que se originan a partir de eacutel es el punto de partida para
diversas propuestas sinteacuteticas enfocadas a generar un producto que posea muacuteltiples
actividades bioloacutegicas de intereacutes terapeacuteutico
Hipoacutetesis y objetivos
21
2 Hipoacutetesis
Los compuestos hidroxicumariacutenicos exhiben conocidas e interesantes propiedades
antioxidantes
Al sustituir la cumarina con los compuestos aacutecido cafeico aacutecido gaacutelico y aacutecido
protocateacutequico se obtienen derivados de naturaleza hiacutebrida aumentando la actividad
de la cumarina frente a las especies reactivas de oxiacutegeno anioacuten superoacutexido radical
hidroxilo radical peroxilo y su capacidad reductora
3 Objetivos
31 Objetivos generales
- Evaluar el comportamiento electroquiacutemico oxidativo de los derivados
cumariacutenicos previamente sintetizados y caracterizados fiacutesicamente
- Evaluar la capacidad antioxidante de los nuevos compuestos derivados de
cumarina y aacutecidos benzoicos frente a distintas especies radicales mediante
diversas teacutecnicas in vitro
Hipoacutetesis y objetivos
22
32 Objetivos especiacuteficos
Objetivos en siacutentesis
- Sintetizar y caracterizar el compuesto precursor 4-clorometil-78-
dihidroxicumarina y los correspondientes derivados de la sustitucioacuten en posicioacuten-
4 con aacutecido cafeico aacutecido gaacutelico y aacutecido 34-dihidroxibenzoico
Objetivos en electroquiacutemica
- Realizar la caracterizacioacuten anoacutedica en medio aproacutetico (NN-dimetilformamida
DMF) de los compuestos por voltametriacutea ciacuteclica (VC) voltametriacutea de pulso
diferencial (VPD)
Objetivos en la determinacioacuten de capacidad antioxidante
- Estudiar la reactividad de los compuestos frente al anioacuten radical superoacutexido O2-
utilizando como teacutecnica voltametriacutea ciacuteclica
- Determinar la reactividad de los compuestos frente al radical peroxilo (ROObull)
obteniendo su iacutendice ORAC-FL
- Determinar la capacidad reductora de hierro (Fe3+
) de los compuestos a traveacutes de
la teacutecnica FRAP
- Estudiar la reactividad frente al radical OHbull mediante la teacutecnica spin trapping
utilizando espectroscopiacutea de resonancia de espin electroacutenica (REE)
Hipoacutetesis y objetivos
23
- Evaluar la capacidad antioxidante celular de los compuestos
- Establecer la existencia de correlacioacuten entre paraacutemetros fisicoquiacutemicos de los
compuestos y su actividad antioxidante
Materiales y meacutetodos
24
4 Materiales y meacutetodos
41 Materiales
411 Reactivos y equipamiento utilizado en siacutentesis
Reactivos
- Aacutecido 34-dihidroxicinaacutemico Merck
- Aacutecido 34- dihidroxibenzoico Sigma-Aldrich
- Aacutecido 345-trihidroxibenzoico Sigma-Aldrich
- Pirogalol Merck
- 4-cloro acetoacetato de etilo Sigma-Aldrich
- NN-dimetilformamida PA J T Baker
- 18-diazabiciclo[540]undec-7-ano (DBU) Sigma-Aldrich
- Carbonato aacutecido de sodio Merck
- Metanol PA JT Baker
- Acetona PA Merck
- Etanol PA Merck
- Cloroformo PA Merck
- Aacutecido sulfuacuterico 98 Merck
- Aacutecido clorhiacutedrico 37 JTBaker
- Anhiacutedrido aceacutetico Merck
- Hidroacutexido de sodio PA Merck
- Solucioacuten etanoacutelica de FeCl3
Materiales y meacutetodos
25
- Acetona d6 Sigma-Aldrich
- Dimetilsulfoacutexido d6 Sigma-Aldrich
- Cloroformo d6 Sigma-Aldrich
- Nitroacutegeno extra puro 99995 Linde Gas Chile SA
Equipamiento
Todo el material de vidrio utilizado fue clase A
- Balanza analiacutetica Precisa 125 A
- Rotavapor Heidolph VV 2000
- Sonicador Elme Transsonic Digital tipo T480H-2
- Agitador magneacutetico placa calefactora Heidolph MR 3002
- Estufa de secado al vaciacuteo Heraeus
412 Reactivos y equipamiento utilizados en electroquiacutemica
Reactivos
- NN-dimetilformamida (DMF) PA Merck
- Hexafluorofosfato de tetrabutil amonio (HFFTBA) Sigma-Aldrich
- Aacutecido 34-dihidroxicinaacutemico Merck
- Aacutecido 34- dihidroxibenzoico Sigma-Aldrich
- Aacutecido 345-trihidroxibenzoico Sigma-Aldrich
- Nitroacutegeno extra puro 99995 Linde Gas Chile SA
Materiales y meacutetodos
26
- Agua purificada (MilliQ) Millipore Merck
Equipamiento
- Estacioacuten de trabajo electroquiacutemica CH Instruments CHI 760c
- Electrodo de carbono viacutetreo CH Instruments d = 3 mm
- Alambre de platino
- Electrodo de referencia AgAgCl (KCl 3 M) CH Instruments
- Aluacutemina 03 μM y 005 μM Buheler
- Balanza analiacutetica Precisa 40SM-200ordf
413 Reactivos y equipamiento utilizados en ensayos frente a especies
radicalarias
Reactivos
- 2-(6-oacutexido-3-oxo-3H-xanten-9-il)benzoato disoacutedico (fluoresceiacutena sal
disoacutedica) Sigma-Aldrich
- 22-azo-bis(2-amidinopropan)diclorhidrato (ABAP) Sigma-Aldrich
- 246-tris(2-piridil)-s-triazina (TPTZ) Sigma Aldrich
- 6-hidroxi-2578-tetrametilcroman-2-aacutecido carboxiacutelico (Trolox) Sigma-
Aldrich
- Peroacutexido de hidroacutegeno al 30
- NN-dimetilformamida PA Sigma-Aldrich
- 55-dimetil-1-pirroline-N-oacutexido (DMPO)
- Acetato de sodio Merck
Materiales y meacutetodos
27
- Tricloruro de hierro (FeCl3) Sigma Aldrich
- Hidroacutexido de sodio Merck
- Fosfato diaacutecido de potasio Merck
- Etanol grado HPLC Merck
- Aacutecido aceacutetico glacial Merck
- N-octanol Merck
- Cloruro de zinc Merck
Equipamiento
- Balanza Precisa 40SM-200ordf
- Lector de microplacas con detector muacuteltiple Synergytrade HT Bio-Tek
Instruments Inc (Winooski VT USA)
- Espectroacutemetro ECS 106 de banda X (985 GHz) equipado con cavidad
rectangular y 50 KHz de modulacioacuten de campo (Bruker Coventry UK)
- WINSIM Software EPR Spectral Simulation for MS-Windows 9x NT
Version 098 copy PEST Public EPR Simulation Tools NIEHS USA
- Alambre de platino
- Espectrofotoacutemetro UV-Visible Specord S600 Analytik Jena
- Equipo generacioacuten agua ultrapura NanoPure Barnstead
Materiales y meacutetodos
28
42 Meacutetodo
421 Procedimientos de siacutentesis
En un primer paso se obtuvo el precursor 4-clorometil-78-dihidroxicumarina
mediante la siacutentesis de Pechmann posteriormente se realizoacute la esterificacioacuten entre el
compuesto halogenado y diferentes aacutecidos orgaacutenicos comerciales (Figura 41) Los
aacutecidos comerciales utilizados en el proceso de siacutentesis fueron los siguientes
aacutecido 34-dixidroxicinaacutemico aacutecido 345- trihidroxibenzoico
(aacutecido cafeico) (aacutecido gaacutelico)
O
OH
OH
HO
aacutecido 34-dihidroxibenzoico
(aacutecido protocateacutequico)
Figura 41 Aacutecidos empleados en la sustitucioacuten de la 4-clorometil-78-
dihidroxicumarina
OH
OH
O
HO
O
OH
OH
HO
OH
Materiales y meacutetodos
29
Todos los compuestos fueron previamente acetilados para proteger los grupos
hidroxilo presentes en sus estructuras para evitar reacciones entre siacute
A Siacutentesis de la 4-clorometil-78-dihidroxicumarina 1
Se mezclaron en proporciones equimolares el pirogalol (31 mmoles) junto con el 4-
cloroacetoacetato de etilo con agitacioacuten constante en un bantildeo de agua-hielo sobre la
mezcla se antildeadieron lentamente 25 mL de H2SO4 (tambieacuten friacuteo) esta solucioacuten se
tornoacute de color rojizo oscuro Se dejoacute reaccionar 1 h
La mezcla de reaccioacuten se agregoacute lentamente sobre un bantildeo de agua-hielo-etanol con
vigorosa agitacioacuten y se obtuvo el producto como un precipitado fino que fue lavado
con abundante agua (a fin de eliminar restos aacutecidos) y purificado por re-cristalizacioacuten
en una mezcla etanol agua obtenieacutendose un soacutelido marfil brillante 1 La ruta
sinteacutetica se presenta a continuacioacuten
Figura 42 Siacutentesis del derivado clorado 1
O
OH
OH O
Cl
HO
OH
OH
OEt
Cl
O O
+
H2SO4
1 h
1
Materiales y meacutetodos
30
B Procedimientos de acetilacioacuten
a) Acetilacioacuten de 4-clorometil-78-dihidroxi-cumarina 2
Se suspendioacute la cumarina clorada (3 g) en 6 mL anhiacutedrido aceacutetico y se antildeadioacute 1 gota
de aacutecido sulfuacuterico La solucioacuten fue agitada con calentamiento (45 degC) por 30 min y se
observoacute el progreso de la reaccioacuten mediante el test de FeCl3 el que indica la presencia
o ausencia de grupos ndashOH fenoacutelicos en solucioacuten El precipitado obtenido 5 se
recristalizoacute en etanol su ruta sinteacutetica se muestra en la Figura 43
Figura 43 Siacutentesis del derivado clorado acetilado 5
b) Acetilacioacuten del aacutecido 34-dihidroxicinaacutemico 6
Seguacuten lo descrito en la literatura89
se disolvioacute el aacutecido 34-dihidroxicinaacutemico (aacutecido
cafeico) en solucioacuten 1 M de NaOH sobre un bantildeo de hielo se agregoacute anhiacutedrido
O
OH
HO O
Cl
Ac2O H2SO4
45 degC 30 min
O
O
O O
Cl
5
O
O
Materiales y meacutetodos
31
aceacutetico y de inmediato se aprecioacute la aparicioacuten de un precipitado amarillo claro que
con el paso del tiempo se tornoacute de color marfil Se dejoacute en estas condiciones con
agitacioacuten vigorosa por 30 min El producto 6 fue filtrado y lavado prolijamente con
agua posteriormente se recristalizoacute en etanol obtenieacutendose un soacutelido blanco brillante
La reaccioacuten global se presenta en la Figura 44
HO
HO
OH
O
O
O O
NaOH 30 min
AcO
AcO
OH
O
6
Figura 44 Siacutentesis del aacutecido cafeico acetilado 6
c) Acetilacioacuten del aacutecido gaacutelico7
Se mezclaron 3 g de aacutecido con 7 mL de anhiacutedrido aceacutetico se antildeadioacute 1 gota de H2SO4
Se agitoacute durante 30 min a 47 degC Posteriormente la mezcla fue enfriada y filtrada al
vaciacuteo El producto 7 soacutelido de color blanco se recristalizoacute en etanol La reaccioacuten
global se presenta en la Figura 45
Materiales y meacutetodos
32
O
HO
HO
OH
OHO
O O
H2SO4 30 min
O
AcO
AcO
OAc
OH
7
Figura 45 Siacutentesis del aacutecido gaacutelico acetilado 7
d) Acetilacioacuten del aacutecido 34-dihidroxibenzoico 8
Se mezclaron 3 g de aacutecido con 6 mL de anhiacutedrido aceacutetico se antildeadioacute 1 gota de H2SO4
Se agitoacute por 30 min a 50 degC Luego se enfrioacute y filtroacute al vaciacuteo El producto 8 soacutelido de
color blanco fue recristalizado en etanol la reaccioacuten global se muestra en la Figura
46
O
OH
OH
OHO
O O
H2SO4 30 min
O
OAc
OAc
OH
8
Figura 46 Siacutentesis del aacutecido 34-dihidroxibenzoico acetilado 8
Materiales y meacutetodos
33
C Siacutentesis de los derivados hiacutebridos Procedimiento general
En base a una variante del procedimiento descrito (Ono y colaboradores 1978)90
los
derivados hiacutebridos se obtuvieron mediante la esterificacioacuten de la cumarina acetilada
5 y el correspondiente aacutecido tambieacuten previamente acetilado (6 7 8) Se disolvioacute el
aacutecido (32 mmoles) en 10 mL de DMF (seca recieacuten destilada) a temperatura ambiente
y se agregoacute el DBU en proporcioacuten equimolar se dejoacute reaccionar por 30 min en un
matraz provisto de codo de desecacioacuten (relleno con CaCl2) y agitacioacuten constante Se
agregoacute la cumarina (32 mmoles) y se aprecioacute el fin de la reaccioacuten tras 35 h a 50 degC
de temperatura La solucioacuten se llevoacute a tdeg ambiente y se hizo precipitar
cuidadosamente agregando agua destilada el soacutelido (9 10 y 11) fue lavado
prolijamente se filtroacute y secoacute
La Figura 47 muestra como ejemplo la ruta sinteacutetica llevada a cabo en la obtencioacuten
del derivado de aacutecido cafeico
Figura47 Siacutentesis del intermediario hiacutebrido derivado del aacutecido cafeico
O
OAc
OAc O
Cl
OAc
OAc
HO
O
+ DBU
DMF seco
O
OAc
OAc O
OAc
OAc
O
O
Materiales y meacutetodos
34
Posteriormente se procedioacute a desproteger los grupos fenoacutelicos en el soacutelido mediante
el procedimiento de desacetilacioacuten El producto crudo fue suspendido en una mezcla
de metanol (8 mL) acetona (12 mL) y solucioacuten saturada de NaHCO3 (14 mL) se
agitoacute a temperatura ambiente bajo nitroacutegeno por 3 h
Finalizada la reaccioacuten la suspensioacuten se concentroacute al vaciacuteo se antildeadioacute HCl en friacuteo
formaacutendose un precipitado claro que se filtroacute y lavoacute con abundante agua
posteriormente fue secado cuidadosamente El soacutelido se lavoacute prolijamente con CHCl3
a ebullicioacuten y fue secado al vaciacuteo de esta forma se obtuvo el producto hiacutebrido La
Figura 48 muestra la ruta de desproteccioacuten empleada
Figura48 Siacutentesis del compuesto hiacutebrido final 9
O
OAc
AcO O
OAc
OAc
O
O N2 tdeg amb
O
OH
HO O
OH
OH
O
O
9
hidroacutelisis baacutesica
Materiales y meacutetodos
35
En la Figura 49 se presenta un resumen de la ruta sinteacutetica para las cumarinas
hiacutebridas obtenidas
HO
O
OH
OH4
OH
OH
HO
O
OH
3
OH
OH
HO
O
2
O
OH
HO O
Cl1
ii
HO
O
OAc
OAc8
OAc
OAc
HO
O
OAc
7
OAc
OAc
HO
O
6
O
OAc
AcO O
Cl5
Figura 49A Ruta de siacutentesis de los compuestos cumariacutenicos i) H2SO4 1 h bantildeo de
hielo ii) NaOH Ac2O 30 min bantildeo de hielo (aacutecido cafeico 6) H2SO4 Ac2O
30 min (cumarina y aacutecidos benzoicos)
O
OH
HO O
Cl
HO
OH
OH
OEtCl
O O
+
1
i
Materiales y meacutetodos
36
HO
OOAc
OAc
OAc
OAc
HO
O
OAc
7
OAc
OAc
HO
O
6
OOH
HO O
OH
OH
O
O
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
9
10
11
OOAc
AcO O
Cl5
iiiiv
8
Figura 49B Ruta de siacutentesis de los compuestos cumariacutenicos iii) DBU DMF (seca)
35 h 50 degC iv) NaHCO3 MeOH acetona tdeg amb 3 h N2
Materiales y meacutetodos
37
422 Procedimiento experimental en electroquiacutemica
i) Celda electroquiacutemica
La celda de trabajo estuvo compuesta por tres electrodos el de trabajo de carbono
viacutetreo y superficie 0076 cm2 electrodo de referencia AgAgCl (3 M KCl) inmerso en
puente salino (DMF + HFFTBA 02 M) y alambre de platino como contra-electrodo
ii) Condiciones de trabajo
Los experimentos se realizaron utilizando como solvente aproacutetico NN-
dimetilformamida (previamente destilada y guardada con tamiz molecular 3 Aring) las
soluciones de trabajo en una concentracioacuten de 2 mM para todos los compuestos
continuamente fueron purgadas con nitroacutegeno extra puro el electrolito soporte
utilizado fue HFFTBA (hexafluorofosfato de tetrabutil amonio) en una concentracioacuten
dos oacuterdenes de magnitud superior a la de la muestra
iii) Teacutecnicas empleadas
En el desarrollo de este trabajo se utilizoacute voltamperometriacutea ciacuteclica (VC) y
voltamperometriacutea de pulso diferencial (VPD)
Materiales y meacutetodos
38
iv) Caacutelculos
El proceso de deconvolucioacuten de las graacuteficas en VC se llevoacute a cabo utilizando el
software Origin Pro 8 SR2 (Origin Lab Corporation USA) Se aplicoacute la funcioacuten
Gaussiana (Ecuacioacuten 41)
119910 = 1199100 + 119860
119908 radic120587 119890
minus2(119909minus119909119888)2
1199082 Ecuacioacuten 41
423 Estudio de generacioacuten de especies radicalarias mediante espectroscopiacutea de
resonancia de espiacuten electroacutenico
La oxidacioacuten electroquiacutemica de los compuestos se realizoacute utilizando las
mismas condiciones de potencial de voltametriacutea ciacuteclica una celda compuesta de
electrodo de trabajo de alambre de platino el medio empleado fue DMF + HFFTBA
como contra-electrodo se utilizoacute alambre de platino La estabilizacioacuten del radical
generado en la oxidacioacuten electroquiacutemica se logroacute empleando el catioacuten quelante Zn2+
el cual es silente a la teacutecnica espectroscoacutepica y forma complejos con el grupo catecol
Se utilizoacute ZnCl2 en concentracioacuten final 3 mM
Materiales y meacutetodos
39
424 Procedimiento experimental en el estudio de actividad frente a especies
radicalarias
4241 Metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno
(oxygen radical antioxidant capacity-fluorescein ORAC-FL)
Se prepararon soluciones stock en etanol para cada compuesto de ellas se obtuvieron
las soluciones de trabajo diluidas en solucioacuten buffer fosfato (pH 74) Se antildeadieron
las aliacutecuotas respectivas de concentraciones crecientes de cada compuesto en los
pocillos de la placa (concentraciones finales entre 02 microM y 109 microM que permitieron
obtener curvas de decaimiento apropiadamente separadas) posteriormente se
adicionoacute la sonda fluoresceiacutena (Figura 410 A) (solucioacuten preparada en buffer pH 74 y
concentracioacuten final 40 nM) y se pre-incuboacute 15 min a 37 degC Finalmente se adicionoacute la
aliacutecuota correspondiente de solucioacuten de 22prime-azobis(2-metiilpropionamidina)
dihidrochloridrato (ABAP) la solucioacuten fue preparada en buffer pH 74 y
concentracioacuten final 18 mM (Figura 410 B) y se llegoacute a un volumen final de 200 microL
La placa fue introducida en el lector y se midioacute el decaimiento de la sonda
fluorescente cada 1 min con agitacioacuten previa a cada medicioacuten Para cada set de
medidas fue determinado el blanco correspondiente que contiene la sonda
fluorescente y el generador de radicales peroxilo (ROObull) Se empleoacute el compuesto
Trolox como antioxidante estaacutendar de referencia (Figura 410 C) utilizaacutendose un set
Materiales y meacutetodos
40
de concentraciones entre los 3 microM y 20 microM y el procedimiento anteriormente descrito
para determinar el decaimiento de la fluorescencia de la sonda
La capacidad de inhibicioacuten expresada como valor de iacutendice ORAC se cuantificoacute
utilizando el valor integrado de aacuterea bajo la curva (ABC) de fluorescencia (Figura
411 donde F0 es el valor medido a tiempo 0 y F es el valor de fluorescencia al final
de la medicioacuten cuando se aprecioacute que el decaimiento es total) La ABC neta se obtuvo
de restar el valor del blanco al valor de cada compuesto (ver Ecuacioacuten 42)
ABC neta = ABC compuesto ndash ABC blanco Ecuacioacuten 42
ONaO O
ONa
O
A
O
HO
OH
O
C
Figura 410 A Sonda fluoresceiacutena B 22prime-azobis(2-metilpropionamidina)
dihidrochloridrato (ABAP) C 6-hidroxi-2578-tetrametilcroman-2-aacutecido carboxiacutelico
(Trolox)
-Cl H2N+
NH2
N
N+NH2 Cl-
NH2
B
Materiales y Meacutetodos
41
Figura 411 Actividad antioxidante ORAC-FL para un compuesto en estudio
Finalmente este valor de ABC neta para cada concentracioacuten se graficoacute con respecto a la
concentracioacuten obtenieacutendose una relacioacuten lineal en el rango de estudio La pendiente de
la regresioacuten de cada compuesto fue dividida por el valor de la pendiente del estaacutendar
Trolox (obtenido de la mima forma descrita para las muestras) este coeficiente es el
mencionado Iacutendice ORAC
Los datos fueron procesados mediante el software Origin Pro 8 SR2 (Origin Lab
Corporation USA) Las mediciones se realizaron en triplicado
0 1000 2000 3000 400000
02
04
06
08
10
ABCneta
Antioxidante
Blanco
F
F0
Tiempo s
Materiales y Meacutetodos
42
4242 Metodologiacutea de determinacioacuten de poder antioxidante de reduccioacuten de hierro
(FRAP)
Preparacioacuten de soluciones
i) Preparacioacuten solucioacuten tampoacuten acetato
Se disolvieron 155 g de acetato de sodio trihidrato (CH3COONamiddot3H2O) en agua
ultrapura se agregaron 8 mL de CH3COOH glacial con agitacioacuten constante y se aforoacute
a 500 mL El pH fue ajustado a 36 con NaOH concentrado
ii) Preparacioacuten de solucioacuten tampoacuten fosfato pH 74
Se mezclaron 80 mL de solucioacuten 01 M de NaOH con 100 mL de solucioacuten 01 M de
KH2PO4 se agitoacute para homogeneizar
iii) Preparacioacuten solucioacuten HCl 40 mM
En un matraz aforado (50 mL) se mezclaron 167 microL de HCl 12 M (37) con agua
ultrapura y se agitoacute hasta homogeneizar
iv) Preparacioacuten de solucioacuten TPTZ
Se pesaron 797 mg de reactivo TPTZ (Figura 412) y se aforoacute a 25 mL con solucioacuten
HCl 40 mM se agitoacute y conservoacute protegido de la luz
Materiales y Meacutetodos
43
N
N
N
N
NN
Figura 412 Reactivo 246-tris(2-piridil)-s-triazina (TPTZ)
v) Preparacioacuten solucioacuten de FeCl3 (20 mM)
Se pesaron 0054 g de FeCl3middot6H2O se aforoacute a 10 mL con agua ultrapura y se agitoacute
constantemente
vi) Preparacioacuten del reactivo FRAP
Se mezcloacute el tampoacuten acetato con solucioacuten TPTZ y solucioacuten feacuterrica en proporcioacuten
1011 se agitoacute y conservoacute al abrigo de la luz
vii) Preparacioacuten de soluciones en estudio
Se mezclaron aliacutecuotas de solucioacuten stock (en etanol) de cada compuesto con tampoacuten
fosfato luego se agitaron y se obtuvieron soluciones en concentraciones entre 15 microM y
58 microM
Materiales y Meacutetodos
44
Ensayo de capacidad reductora
En un frasco aacutembar se mezclaron 150 microL de solucioacuten de muestra con 450 microL de agua
ultrapura y posteriormente 950 microL de reactivo FRAP La solucioacuten se agitoacute e
inmediatamente se tornoacute de color azul lo que indicoacute la reaccioacuten de oxidacioacuten de Fe2+
a Fe3+
en el complejo formado con el reactivo TPTZ Se midioacute el espectro de
absorbancia en el rango del UV-visible a temperatura ambiente considerando el valor
de λmaacutex = 599 nm Los experimentos se realizaron en triplicado los valores obtenidos
para este ensayo se expresan como equivalentes de Trolox 10 microM de muestra
4243 Capacidad de apagamiento del radical hidroxilo (OHbull) mediante la teacutecnica
spin trap
Se realizoacute el ensayo mediante la metodologiacutea de Fenton no cataliacutetico comparando las
sentildeales en el espectro mediante espectroscopia de resonancia de espiacuten electroacutenico
(REE) del aducto DMPO-OH como blanco frente a las sentildeales obtenidas en las
mismas condiciones tras antildeadir los compuestos en estudio Para la generacioacuten del
radical hidroxilo se utilizoacute peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2) y solucioacuten acuosa de NaOH
metodologiacutea que presenta la ventaja de que en ausencia de iones Fe2+
(como en la
metodologiacutea Fenton) se evitoacute la reaccioacuten de quelacioacuten con los grupos catecol presentes
en las estructuras propuestas91ab
Materiales y Meacutetodos
45
-10 -08 -06 -04
Ipa0
O2 + e
- O
2
-
O2
-O
2 + e
-
10 A
E vs Ag|AgCl V
Se prepararon soluciones stock (20 mM en DMF) de cada compuesto en estudio se
tomaron aliacutecuotas de 100 microL y se agregaron 50 microL de NaOH (25 mM) 50 microL de
solucioacuten de 55-dimetil-1-pirroline-N-oacutexido (DMPO) (30 mM) y finalmente 50 microL de
agua oxigenada (30) se agitoacute cuidadosamente se incuboacute por 5 minutos y se midioacute
su espectro Los resultados se expresaron como el porcentaje de inactivacioacuten del
radical hidroxilo
4244 Estudio de reactividad frente a anioacuten radical superoacutexido O2middot -
Se evaluoacute la reactividad de cada compuesto frente al radical anioacuten superoacutexido el que
fue generado electroquiacutemicamente en la superficie del electrodo a traveacutes de la
reduccioacuten del oxiacutegeno molecular disuelto en el medio (Figura 413)
Figura 413 Voltamograma ciacuteclico de la generacioacuten de anioacuten radical superoacutexido
DMF + HFFTBA 02 M en electrodo de carbono viacutetreo
Materiales y Meacutetodos
46
i) Celda electroquiacutemica
La celda estuvo compuesta de tres electrodos el electrodo de trabajo fue carbono
viacutetreo (aacuterea = 003 cm2) el electrodo auxiliar empleado fue Ag|AgCl (KCl 3 M
inmerso en DMF + HFFTBA 02 M como puente salino) y alambre de platino como
contra-electrodo
ii) Teacutecnica empleada
La generacioacuten del radical se realizoacute mediante voltamperometriacutea ciacuteclica (VC) a
velocidad de barrido de 01 Vs en un rango de potencial entre 0 V (inicial) y -1 V
como potencial de inversioacuten de la direccioacuten de barrido (switching) 92
iii) Experimento
Los experimentos se realizaron utilizando como solvente 10 mL de NN-
dimetilformamida (previamente destilada) el electrolito soporte utilizado fue
HFFTBA (hexafluorofosfato de tetrabutil amonio) en concentracioacuten 02 M las
soluciones fueron saturadas con aire continuamente Una vez estabilizada la corriente
se antildeadieron a la celda aliacutecuotas crecientes de solucioacuten stock de cada compuesto
observaacutendose la disminucioacuten en la corriente de pico anoacutedica Ipa0 Una vez obtenidos
los voltamogramas se determinoacute el paraacutemetro adimensional ((Ipa0-Ipa
S) Ipa
0) el que
expresoacute el consumo de la especie radical este valor se graficoacute con respecto a la
concentracioacuten del sustrato cuya relacioacuten fue una regresioacuten lineal De la graacutefica se
Materiales y Meacutetodos
47
obtuvo el valor de concentracioacuten de antioxidante en que la corriente de pico anoacutedico
disminuye en un 50 (IA50)
4245 Estudio de la capacidad antioxidante celular (CAC)
Para evaluar la actividad antioxidante de los compuestos estudiados en un medio
celular se utilizoacute el meacutetodo descrito en la literatura por Wolfe93
Se emplearon ceacutelulas
EAhy 926 (ATCC CRL-2922) las que fueron sembradas con una densidad de
50000 ceacutelulas por pocillo en microplacas de 96 pocillos con medio de cultivo
RPMI 1640 Despueacutes de 24 h fue removido el medio de cultivo y los pocillos
fueron lavados con buffer fosfato salino (PBS) pH 74 Los pocillos fueron tratados
con 20 μM de la sonda DCFH-DA disuelta en RPMI 1640 libre de suero fetal bobino
Posteriormente se agregaron los compuestos en dos concentraciones diferentes 1 μM y
10 μM Luego de transcurrida 1 h de incubacioacuten a 37 degC los pocillos fueron
lavados con PBS Luego de esto se agregoacute ABAP en una concentracioacuten final de
600 μM y se midioacute la fluorescencia generada por la sonda en el multi-lector de placas
a temperatura constante de 37 degC La emisioacuten a 538 nm fue medida con una excitacioacuten
a 485 nm cada 1 min por 1 hora El ensayo se realizoacute en triplicado El valor de
capacidad antioxidante se calcula determinando el aacuterea bajo la curva para la muestra y
el control experimental utilizando la siguiente ecuacioacuten
CAC = 100 ndash (ABCmuestra ABCcontrol) 100 Ecuacioacuten 43
Materiales y Meacutetodos
48
4246 Estudio de hidrofobicidad relativa de los compuestos
La hidrofobicidad de los compuestos se correlaciona con sus coeficientes de reparto y
distribucioacuten (log P para el reparto octanolagua y log D para la distribucioacuten
octanolsolucioacuten tampoacuten pH 74) los que se determinan utilizando teacutecnicas
espectrofotomeacutetricas yo cromatograacuteficas
Para realizar estas experiencias se determina la solubilidad del analito en octanol
saturado con agua y en la solucioacuten tampoacuten pH 74 saturado con octanol Luego se
obtienen las respectivas curvas de calibracioacuten para la concentracioacuten del compuesto en
estas soluciones en funcioacuten de la absorbancia yo aacuterea bajo la curva Se espera que las
curvas de calibracioacuten obtenidas cumplan con el requisito de una linealidad apropiada
Posteriormente se debe evaluar el reparto midiendo la concentracioacuten analiacutetica en la
fase orgaacutenica y acuosa Para la determinacioacuten del reparto estaacute descrita la siguiente
ecuacioacuten
119897119900119892119875119900119888119905119886119892119906119886 = log ([119904119900119897119906119905119900]119900119888119905119886119899119900119897
[119904119900119897119906119905119900]119886119892119906119886) Ecuacioacuten 44
Mientras que para la determinacioacuten de la distribucioacuten se utiliza la siguiente ecuacioacuten
119897119900119892119875119900119888119905119886119892119906119886(119905119886119898119901oacute119899) = log ([119904119900119897119906119905119900]119900119888119905119886119899119900119897
[119904119900119897119906119905119900]119905119886119898119901oacute119899 119901119867 74) Ecuacioacuten 45
Materiales y Meacutetodos
49
Para este estudio se realizoacute la determinacioacuten de tiempos de retencioacuten como medida de
la hidrofobicidad relativa entre compuestos Se utilizoacute una columna C18 ODS Hypersil
una fase moacutevil compuesta de acetonitrilo solucioacuten H3PO4 (6535 vv) bajo
condiciones isocraacuteticas con flujo 1 mLmin volumen de inyeccioacuten 50 microL
4247 Estudio teoacuterico caacutelculo del Iacutendice de Fukui
La optimizacioacuten de estructuras de los compuestos neutros se realizoacute utilizando el
meacutetodo DFTSP-DFT basado en la Teoriacutea de Funcionales de la Densidad (DFT)94-96
Se utilizoacute el funcional hiacutebrido B3LYP el conjunto de bases empleado fue 6-31G(d)
Los caacutelculos se realizaron mediante el software Gaussianrsquo09 Los descriptores locales
se evaluaron a traveacutes de la aproximacioacuten de orbitales condensados Orbitales
Moleculares Frontera (Mulliken MOs)
Resultados y discusioacuten
50
5 Resultados y discusioacuten
51 Siacutentesis de los compuestos
Se presentan a continuacioacuten los resultados de la caracterizacioacuten fiacutesica y
espectroscoacutepica de los compuestos sintetizados durante este trabajo
4-clorometil-78-dihidroxicumarina (1)
1H RMN (DMSO d6 δ ppm) 493 (s 2H -CH2-) 641 (s 1H =CH- cumarina) 686
(d 1Harom Jorto 85) 717 (d 1Harom Jorto 85) 942 (s1H OH) 1022 (s 1H OH)
13C RMN (DMSO d6 δ ppm) 4187 11047 11129 11267 11585 13282 14358
15017 15181 16046 Rendimiento 47 Punto de fusioacuten 202-204 degC Agujas
color marfil PM 2265gmol Foacutermula molecular C10H7O4Cl
4-clorometil-78-diacetilcumarina (5)
1H RMN (DMSO d6 δ ppm) 235 (s 3H -CH3) 241 (s 3H-CH3) 506 (s 2H -
CH2-) 674 (s 1H =CH- cumarina) 739 (d 1Harom Jorto 878) 783 (d 1Harom Jorto
878)13
C RMN (DMSO d6 δ ppm) 1943 1985 3983 4073 11467 11549
11871 12238 12939 14459 14593 14999 1578716751 Rendimiento 68
Punto de fusioacuten 157-159 degC Soacutelido blanco PM 3105 gmol Foacutermula molecular
C14H11O6Cl
Resultados y discusioacuten
51
Aacutecido-34-diacetoxicinaacutemico (6)
1H RMN (acetona d6 δ ppm) 215 (s 3H -CH3) 216 (s 3H CH3) 638-643 (d 1H
Jtrans 159) 717-720 (d 1Harom Jorto 878) 748-750-756 (s Harom y Htrans) 13
C RMN
(acetona d6 δ ppm)1996 2004 11977 12333 12450 12682 13364 14323
14339 14439 16699 16809 16817 Rendimiento 56 Punto de fusioacuten
158-161 degC Soacutelido blanco PM 264 gmol Foacutermula molecular C13H12O6
Aacutecido-345-triacetilbenzoico (7)
1H RMN (acetona d6 δ ppm) 217 (s 6H -CH3) 219 (s 3H -CH3) 767 (s 2H
Harom) 13
C RMN (acetona d6 δ ppm) (2C -CH3 1865) (2C-C=O 1910) (2Carom
12160) 12790 13857 (2C 14337) 16432 16599 16789 Rendimiento 66
Punto de fusioacuten 158-160 degC Soacutelido blanco PM 296 gmol Foacutermula molecular
C13H12O8
Aacutecido 34-diacetilbenzoico (8)
1H RMN (acetona d6 δ ppm) 217 (s 6H CH3) 724-727 (d 1Harom Jorto 85) 774-
775 (d 1Harom) 781-784 (dd 1Harom) 13
C RMN (acetona d6 δ ppm) 1910 1913
(2C 12329) 12453 12729 12838 16487 16699 16729 Rendimiento 61
Punto de fusioacuten 155-158 degC Soacutelido blanco PM 238 gmol Foacutermula molecular
C11H10O6
Resultados y discusioacuten
52
4-metil-(34-dihidroxicinamoato)-78-dihidroxicumarina (9)
1H RMN (DMSOd6 δppm) 541(s 2H -CH2-) 621(s 1H =CH- cumarina) 642-
648 (d 1H Jtrans= 1591) 682-71 (Harom) 758-763 (d 1H Jtrans = 1591) 91 (s -
OH) 94 (s -OH) 97 (s -OH) 102 (s- OH)13
C RMN (DMSO d6 δppm) 6154
10820 11035 11290 11345 11526 11550 11620 12225 12566 13292
14391 14607 14686 14920 15026 15174 16055 16646ESI-MS mz 371
[M+H]+ 369 [M-H]
- 181 [M+H]
+ 163 [M-H2O+H]
+ 145 [M-H2O+H]
+ 135 [M-
HCOOH+H]+ 179 [M-H]
- 161 [M-H2O-H]
- 135 [M-CO2-H]
-Rendimiento 37
Punto de fusioacuten 246-249 degC Soacutelido amarillo opaco PM 37031 gmol Foacutermula
molecular C19H14O8
4-metil-(345-dixidroxibenzoato)-78-dihidroxicumarina ( 10 )
1H RMN (DMSO d6 δ ppm) 546 (s 2H -CH2-) 619 (s 1H =CH- cumarina) 682-
685 (d 1Harom Jorto 8508) 704 (s 2Harom) 709-712 (d 1Harom Jorto 778)13
C RMN
(DMSO d6 δppm) 6192 10821 10914 11041 11295 11533 11885 13292
13949 14394 (2Carom) 14620 15024 15184 16055 16555 16793ESI-MS mz
361 [M+H]+ 359 [M-H]
- 171 [M+H]
+ 153 [M-H2O+H]
+ 125 [M-CO2H+H]
+ 169
[M-H]- 125 [M-CO2-H]
- Rendimiento 46 Punto de fusioacuten descomposicioacuten sobre
230 degC Soacutelido amarillo opaco PM 36027 gmol Foacutermula molecular C17H12O9
Resultados y discusioacuten
53
4-metil-(34-dihidroxibenzoato)-78-dihidroxicumarina (11)
1H RMN (DMSO d6 δ ppm) 548 (s 2H -CH2-) 619 (s 1H =CH- cumarina) 685
(m 2Harom) 71 (d 1Harom) 74 (d 2Harom) 13
C RMN (DMSO d6 δ ppm) 6142
10774 10988 11242 11481 11551 11626 11957 12218 13240 14343
14520 14972 15096 15127 16001 16490 ESI-MS mz 345 [M+H]+ 343 [M-
H]- 137 [M-H2O+H]
+ 109 [M-HCOOH+H]
+ 153 [M-H]
- 108 [M-CO2-H]
-
Rendimiento 73 Punto de fusioacuten descomposicioacuten sobre 250 degC Soacutelido amarillo
opaco PM 34427 gmol Foacutermula molecular C17H12O8
Resultados y discusioacuten
54
52 Estudios de voltametriacutea ciacuteclica y voltametriacutea de pulso diferencial
El proceso de oxidacioacuten electroquiacutemico de los compuestos fue evaluado mediante
voltamperometriacutea de pulso diferencial VPD Los resultados presentaron soacutelo un pico
de oxidacioacuten para los compuestos 1 2 4 y 9 por otra parte el aacutecido gaacutelico 3 y los
hiacutebridos 10 y 11 mostraron dos o maacutes sentildeales poniendo de manifiesto las complejas
reacciones de oxidacioacuten que presentan los grupos -OH en dichas estructuras (Figura
51 A y B)97
Al analizar las sentildeales tanto para los precursores y sus derivados hiacutebridos se encontroacute
que la uacutenica sentildeal anoacutedica del compuesto 9 corresponderiacutea tanto a la oxidacioacuten del
catecol presente en la cumarina 1 (Epa 083 V) como del aacutecido cafeico 2 (Epa 076 V)
(Figura 52 A) ambos compuestos por separado tuvieron potenciales de pico anoacutedico
cercanos los que se solaparon para una dar una sola sentildeal en el derivado 9 (Epa 082
V)
Figura 51 A
Voltamperogramas de pulso
diferencial para los
precursores 1 2 3 y 4 2 mM
en DMF + HFFTBA 02 M
00 03 06 09 12 15 18 21 24
OO H
O H
H O
OOH
OH
HO
OH
OH
OH
O
HO
OOH
OH O
Cl
A
2A
E vs Ag|AgCl V
1
2
3
4
Resultados y discusioacuten
55
Figura 51 B Voltamperogramas de pulso diferencial para los derivados 9 10 y 11
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
En el caso del hiacutebrido 11 derivado del aacutecido protocateacutequico se observaron dos picos de
oxidacioacuten que corresponderiacutean a la oxidacioacuten del catecol cumariacutenico (Epa 083 V) y el
catecol del aacutecido benzoico (Epa 111 V) A diferencia del caso anterior se encontroacute
que las sentildeales anoacutedicas de ambos precursores estuvieron lo suficientemente distantes
como para solaparse como en el caso anterior Considerando que los resultados se
obtuvieron bajo las mismas condiciones experimentales se podriacutea asumir que la sentildeal
a potencial Epa1 081 V corresponde a la oxidacioacuten en el anillo de la cumarina y la
sentildeal en Epa2 094 V corresponde a la oxidacioacuten del catecol presente en el anillo
benceacutenico Para el compuesto 10 se observoacute un comportamiento semejante al descrito
para 11
00 03 06 09 12 15 18 21 24
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OH O O
O
OO H
O H
O H
OOH
OH O
OH
OH
O
O
B
E vs Ag|AgCl V
9
10
11
2A
Resultados y discusioacuten
56
Los experimentos de voltamperometriacutea ciacuteclica se llevaron a cabo a distinta velocidad
de barrido 005 Vs ndash 3 Vs con el objeto de estudiar su influencia sobre la sentildeal de
oxidacioacuten En forma graacutefica para precursores y derivados se observaron pares redox de
comportamiento irreversible debido al evidente desplazamiento del potencial de pico
Epa con respecto al aumento de la velocidad de barrido El valor de ΔEp (Epa -Epc) se
incrementoacute con el aumento en la velocidad lo que indica una disminucioacuten en la
velocidad de transferencia electroacutenica Para los compuestos 1 2 4 y 9 a la velocidad
de barrido estudiada se observoacute al igual que en VPD la aparicioacuten de una uacutenica sentildeal
de oxidacioacuten para todo el rango de velocidad (la que se desplaza a potenciales maacutes
positivos a medida que aumenta la velocidad de barrido) seguida de una sentildeal de
reduccioacuten en el barrido hacia potenciales negativos Para los compuestos 3 10 y 11 se
apreciaron dos sentildeales de oxidacioacuten seguida de la correspondiente sentildeal en el barrido
de reduccioacuten
Para cada par redox se realizaron estudios por segmentos encontraacutendose para los
compuestos 9 y 10 que el pico I (de oxidacioacuten) estaacute relacionado con el pico II (de
reduccioacuten) y para el compuesto 11 las sentildeales I y Irsquo (de oxidacioacuten) estaacuten relacionadas
con el pico II (de reduccioacuten) Esto es indicio de que en el primer barrido se observa el
proceso de oxidacioacuten de los grupos fenoles en el cual se generan especies factibles de
ser reducidas como derivados de tipo quinoacutenico (Figuras 52 a 54)
Resultados y discusioacuten
57
Figura 52A VC para el derivado 9 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 53A VC para el derivado 10 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
-03 00 03 06 09 12 15
A
II
I
OOH
OH O
OH
OH
O
O
100 A
005 Vs
3 Vs
E vs Ag|AgCl V
03 06 09 12 15
B
II
I
E vs Ag|AgCl V
0 V - 13 V
0 V - 06 V
00 03 06 09 12 15 18
A
II
I
I
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
3 Vs
005 Vs
E vs Ag|AgCl V
00 03 06 09 12
B
II
I
E vs Ag|AgCl V
-02 V - 06 V
-02 V - 11 V
Resultados y discusioacuten
58
Figura 54 A VC para el derivado 11 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
En sistemas fenoacutelicos simples como es el caso del catecol o la hidroquinona se ha
estudiado el proceso redox en distintos medios 98-101
planteaacutendose que la oxidacioacuten en
medio aproacutetico deriva en la formacioacuten de la quinona correspondiente viacutea 2e-2H
+
(Figura 55) En esta investigacioacuten se han estudiado estructuras de mayor complejidad
y considerando que en este proceso de oxidacioacuten se ha descrito la presencia de
especies radicales como intermediarios de reaccioacuten es probable que ocurran procesos
de dimerizacioacuten o ataques nucleofiacutelicos por parte de los radicales dando como
resultado la generacioacuten de compuestos diferentes a la moleacutecula de partida (por
ejemplo de mayor peso molecular) Este tipo de comportamiento se puede analizar en
profundidad realizando barridos de potencial consecutivos en VC a baja velocidad de
00 03 06 09 12 15
I
II
I
A
100 A
OHO O
O
OOH
OH
OH
005 Vs
3 Vs
E vs Ag|AgCl V
00 03 06 09 12 15
II
I
IB
E vs Ag|AgCl V
-01 V - 07 V
-01 V - 14 V
Resultados y discusioacuten
59
barrido (005 Vs o menor para observar maacutes detalladamente la reaccioacuten quiacutemica en la
escala de tiempo del experimento) Si fuese el caso se esperariacutea observar la aparicioacuten
de sentildeales nuevas en el segundo barrido de oxidacioacuten que dariacutean cuenta de la
oxidacioacuten de las nuevas estructuras fenoacutelicas generadas
OH
OH-2e- -2H+
2e- 2H+
O
O
Figura 55 Esquema del proceso electro-oxidativo propuesto para el catecol
Se realizoacute la deconvolucioacuten (mediante la funcioacuten gaussiana) sobre las curvas de
oxidacioacuten para los compuestos con el objeto de determinar los valores de corriente de
pico anoacutedica de forma independiente con esto se obtienen valores de corriente y
potencial (principalmente a alta velocidad de barrido) los cuales son maacutes exactos que
los entregados por defecto por el software electroquiacutemico utilizado Las graacuteficas y
caacutelculos correspondientes a la relacioacuten entre los diferentes paraacutemetros analizados se
realizaron considerando los valores de Ipa y Epa para el primer pico oxidativo debido a
que esta sentildeal entrega informacioacuten con respecto a la energiacutea del primer electroacuten cedido
en el proceso de oxidacioacuten etapa que generalmente es lenta y determinante de la
velocidad de reaccioacuten
Resultados y discusioacuten
60
La expresioacuten indicada en la Ecuacioacuten 51102
da cuenta de la relacioacuten entre el potencial
de pico y el logaritmo de la velocidad de barrido para una reaccioacuten electroquiacutemica
irreversible
119864119901 119894119903119903119890119907 = 11986412 + 119887
2[104 minus log (
119887
119863) minus 2119897119900119892119896119891 + 119897119900119892119907] Ecuacioacuten 51
Por tanto de la graacutefica Ep vs logv se puede obtener el valor de la pendiente de Tafel b
que es igual al doble de la pendiente de la recta obtenida
119864119901 119894119903119903119890119907 = 119862119905119890 + 119887
2(119897119900119892119907) Ecuacioacuten 52
La graacutefica de potencial de pico anoacutedico (Epa) vs logv dio como resultado una relacioacuten
de tipo lineal para todos los compuestos el potencial de oxidacioacuten se desplazoacute hacia
valores maacutes positivos con el aumento de la velocidad de barrido lo que indica el
caraacutecter irreversible del proceso oxidativo en este medio En la Figura 56 se presenta
la graacutefica obtenida para el derivado 9 como ejemplo representativo de los resultados
obtenidos
Resultados y discusioacuten
61
Figura 56 Relacioacuten Epa vs logv para el derivado de aacutecido cafeico 9 2 mM en
DMF + HFFTBA 02 M
Los valores obtenidos para la pendiente de Tafel se resumen en la Tabla 51 Los
compuestos 1 y 3 poseen valores de la pendiente de Tafel cercanos al teoacuterico (118
mVdec)103
para un proceso en que la primera transferencia electroacutenica es la etapa
lenta del proceso (por tanto la etapa determinante de la reaccioacuten de electro-oxidacioacuten)
El compuesto 4 presenta un valor de 88 mVdec lo que sugiere que el electrodo estaacute
contaminado103104
o se produce un mecanismo de oxidacioacuten complejo (que implica
una transicioacuten entre la etapa quiacutemica y la transferencia electroacutenica como determinante
de la velocidad)105
De la misma forma los valores encontrados para los derivados 9
(170 mVdec) 10 (134 mVdec) y 11 (140 mVdec) y para el aacutecido cafeico (212
mVdec) indican que en las condiciones experimentales utilizadas la superficie del
18 21 24 27 30 33 36
090
093
096
099
102
105
OOH
OH O
OH
OH
O
O
r = 098638
m = 008548
Ep
a1 (
V)
logv (mV12
s-12
)
Resultados y discusioacuten
62
electrodo se contamina (pasiva)106
con la generacioacuten de especies polimeacutericas debido a
la formacioacuten del radical fenoxilo (ArObull) el cual puede dimerizar y originar diversos
productos de reaccioacuten los cuales se adhieren a la superficie del electrodo
Para cada compuesto se establecioacute la existencia de una relacioacuten de tipo lineal entre el
logaritmo de la corriente de pico anoacutedico y el logaritmo de la velocidad de barrido
(logIpa vs logv) El valor para la pendiente de estas rectas estuvo entre 044 y 056
(Tabla 51) lo que sugiere que el proceso observado es de tipo difusivo
La corriente de pico anoacutedica se puede expresar en funcioacuten de distintos paraacutemetros
experimentales como se indica en la Ecuacioacuten 53102
119868119901 = 301 times 10minus5 119899 (23 119877 119879
119887 119865)
12
11986312 119862 11990712 Ecuacioacuten 53
Donde n es el nuacutemero de electrones transferidos R es la constante de los gases (Jmol
K) T es la temperatura (K) D es el coeficiente de difusioacuten de la especie electro-activa
(cm2s) F es la constante de Faraday (Cmol) b es la pendiente de la ecuacioacuten de
Tafel107
(η = a + b log i) C es la concentracioacuten de la especie electro-activa (molL) y v
es la velocidad de barrido (mVs) Esta expresioacuten indica que la correlacioacuten entre
Ip y vfrac12
da como resultado una recta que seraacute funcioacuten del nuacutemero de electrones n y la
pendiente de Tafel b valores que estaacuten presentes en la pendiente de esta recta
Resultados y discusioacuten
63
Considerando lo anterior se procedioacute a graficar Ipa vs vfrac12
encontraacutendose para todos los
compuestos (Figura 57) una relacioacuten de tipo lineal con valores de r entre 099988 y
099448 se presenta ademaacutes la regresioacuten para el aacutecido protocateacutequico 4 como muestra
del comportamiento encontrado para todos los compuestos con valores de intercepto
que tienden a cero Al observar la Tabla 51 se aprecia que todas las regresiones
poseen una pendiente semejante lo cual da un indicio con respecto al nuacutemero de
electrones y mecanismo involucrados en la reaccioacuten de oxidacioacuten estudiada
Figura 57 Graacutefica para la corriente de pico Ipa vs la raiacutez cuadrada de la velocidad de
barrido Ejemplo de correlacioacuten lineal en el aacutecido protocateacutequico 4 2 mM en DMF +
HFFTBA 02 M
Tomando en cuenta que los valores de C R T y F (Ecuacioacuten 53) son factores
constantes y que los coeficientes de difusioacuten D seraacuten semejantes y del mismo orden
para aquellos compuestos de estructura similar (precursores por una parte y derivados
por otra) se obtiene que la pendiente de la recta obtenida en esta correlacioacuten es un
0 10 20 30 40 50 600
50
100
150
200
250
Ipa (
A)
V12
(mV12
s-12
)
OOH
OH
HO
m = 40 10-6
r = 099988
Resultados y discusioacuten
64
indicador respecto al nuacutemero de electrones involucrados en la reaccioacuten y al valor de b
(relacionado con el mecanismo de oxidacioacuten estudiado)
En el caso de los compuestos precursores se obtuvieron valores de pendientes entre
36bull10-6
y 41bull10-6
(Tabla 51) este rango cercano indica la transferencia del mismo
nuacutemero de electrones en el proceso oxidativo observado en que para la cumarina
clorada 1 el aacutecido cafeico 2 y el aacutecido protocateacutequico 4 corresponde a la uacutenica sentildeal
de oxidacioacuten observada y en el caso del aacutecido gaacutelico 3 es el proceso correspondiente a
la primera sentildeal del voltamograma En la literatura se describen estudios en medio
aproacutetico para compuestos fenoacutelicos como por ejemplo derivados de la cumarina 78-
dihidroxilada 100ab
el aacutecido cafeico101
y la hidroquinona105
que dan cuenta de una sentildeal
en el proceso oxidativo en medio aproacutetico que involucra 2 electrones esto permite
inferir que las sentildeales observadas experimentalmente corresponden a un proceso di-
electroacutenico
Para los derivados 9 10 y 11 se observa que los valores para la pendiente Ipa vs vfrac12 se
encuentran entre 37bull10-6
y 42bull10-6
como se indica en la Tabla 51 Ademaacutes al
comparar estos resultados con los obtenidos para el caso de los precursores se deduce
que estamos frente a un proceso oxidativo que involucra dos electrones Se observa
tambieacuten que no hay cambios con respecto al mecanismo de reaccioacuten si lo hubiese se
esperariacutea encontrar diferencias del doble o superior en los valores encontrados para la
pendiente de la recta ya que eacutesta contiene el factor b (pendiente de la ecuacioacuten de
Tafel) antes mencionado
Resultados y discusioacuten
65
Posteriormente se calculoacute el valor correspondiente al potencial de inicio del proceso
electroquiacutemico (Eonset)108109
Este valor indica el potencial inicial con que el primer
electroacuten es cedido en el proceso oxidativo que tiene lugar en la superficie del
electrodo Se determina como el valor de potencial de interseccioacuten entre las recta
tangentes a la liacutenea base y la corriente de oxidacioacuten para cada velocidad de barrido
aplicada en forma experimental (005 Vs a 3 Vs en este estudio) (Figura 58) Una
vez obtenido este potencial se procede a graficar con respecto al logaritmo de la
velocidad de barrido como se presenta en la Figura 59 Se considera el valor del
intercepto de cada recta Eionset (por lo tanto a una baja velocidad de barrido) el cual
incluye el error inherente a la medicioacuten y por tanto es maacutes confiable (Tabla 51) Se
observa que estos potenciales variacutean entre 050 V y 079 V para el aacutecido gaacutelico 3 y el
aacutecido protocateacutequico 4 respectivamente potencial que da indicio de la factibilidad de
oxidacioacuten siendo el compuesto con un Eionset menor el que se oxida con mayor
facilidad Estos valores de potencial onset encontrados permitiraacuten establecer una
correlacioacuten entre el potencial de oxidacioacuten determinado de esta forma y los resultados
obtenidos en los ensayos de actividad frente a especies radicales llevados a cabo en
medio aproacutetico (seccioacuten 6)
Resultados y discusioacuten
66
Figura 58 Determinacioacuten graacutefica del valor de Eonset VC del precursor 1 01 Vs
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 59 Relacioacuten Eonset vs logv para los compuestos estudiados
-05 00 05 10 15 20
20 A
Eonset
E vs Ag|AgCl (V)
15 18 21 24 27 30 33 3606
07
08
09
10
11
12
OOH
OH
HO
OOH
OH
HO
OH
OH
OH
O
HO
OHO O
O
OOH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OOH
OH O
OH
OH
O
O
OOH
HO O
Cl
Eon
set
(V)
logv (mV12
s-12
)
Resultados y discusioacuten
67
Tabla 51 Paraacutemetros experimentales para los compuestos Determinaciones en VC
2 mM DMF + HFFTBA 02 M
Compuesto
119837119845119848119840119816119849119834120783
119837119845119848119840119855 (microAmVs
-1)
119837119816119849119834120783 119837119855120783120784
(microAmV12
s-12
)
119837119812119849119834120783
119837119845119848119840119855
(mVdec)
119835 = 120784 119837119812119849119834120783
119837119845119848119840119855
(mVdec)
Eionset
(mV)
056 36bull10-6
61 122 059
053 41bull10
-6 106 212 059
048 36bull10-6
55 110 050
O
OH
OH
HO
052 41bull10-6
44 88 079
047 40bull10-6
85 170 064
049 37bull10-6
67 134 075
044
42bull10-6
70 140 058
Con el objeto de recabar mayor informacioacuten con respecto al mecanismo de reaccioacuten
involucrado en los procesos oxidativos en estudio en base a los resultados obtenidos
OHO O
O
OOH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
O
OH
OH O
OH
OH
O
O
OOH
OH
HO
OH
OH
OH
O
HO
O
OH
HO O
Cl
Resultados y discusioacuten
68
en VC se realizoacute la graacutefica (Ipa v12
) vs v12
para los compuestos precursores 1 2 3 y
4 (escogidos por poseer un grupo catecol y ser estructuras de menor complejidad que
los derivados 9 10 y 11) Estas graacuteficas de las que se presenta el ejemplo del aacutecido
como muestra (Figura 510) presentaron una relacioacuten de tipo lineal en la que la
pendiente negativa obtenida sugiere que la reaccioacuten observada implica un mecanismo
de tipo EC considerando los estudios mencionados para compuestos fenoacutelicos
ampliamente descritos en la literatura100101105109
y el criterio de diagnoacutestico
mencionado por Pletcher y colaboradores111
Figura 510 Correlacioacuten (Ipa v12
) vs v
12 para el precursor aacutecido protocateacutequico 4
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
21 28 35 42 49 5626
28
30
32
34O
OH
OH
HO
r = -099302
V12
(mV12
s-12
)
Ipa
V12 (
A
mV
12s-1
2)
Resultados y discusioacuten
69
Diversos estudios proponen la presencia de mecanismos concertados para los procesos
redox de compuestos de tipo fenoacutelico los cuales implican la presencia de
intermediarios radicalarios y reacciones donde la transferencia de un protoacuten y un
electroacuten ocurren de forma acoplada dentro de un mismo paso Este concepto nace en la
deacutecada de 1990 a partir de los trabajos publicados por Biczoacutek y colaboradores112113
El estudio de este tipo de reacciones principalmente en derivados fenoacutelicos es de
relevancia debido al rol que eacutestos desempentildean en diferentes sistemas bioloacutegicos tanto
por su reconocida capacidad antioxidante como se evidencia en la investigacioacuten
realizada por Nakayama y colaboradores con respecto a derivados polifenoacutelicos y el
mecanismo de reaccioacuten propuesto de tipo PCET (Proton Concerted Electron Transfer)
frente al anioacuten superoacutexido114
o como en el caso de estudio de las reacciones de
transferencia electroacutenica que involucran al aminoaacutecido tirosina115ab
y otros co-factores
que forman parte esencial del proceso fotosinteacutetico que se lleva a cabo en estructuras
vegetales (Fotosistema II)116
En la deacutecada pasada los aportes a la investigacioacuten sobre el tema se tornaron maacutes
profundos y sistemaacuteticos permitiendo el modelamiento teoacuterico y anaacutelisis de este tipo
de mecanismos Debido al intereacutes concerniente a la obtencioacuten de modelos racionales
de sistemas bioloacutegicos los estudios realizados en medio proacutetico son variados como la
serie de derivados fenol-imidazol sintetizados y caracterizados por Markle y
colaboradores117
quienes entre diversos factores analizan el efecto del sustituyente
sobre el enlace O-H Otros autores como Saveacuteant Costentin y colaboradores han
abordado este toacutepico en diferentes publicaciones proponiendo distintos mecanismos
Resultados y discusioacuten
70
dependientes del pH y composicioacuten de la solucioacuten de trabajo (con buffer o sin eacutel)118
En trabajos posteriores plantean un estudio teoacuterico de modelamiento en sistemas de
tipo amino-fenol enfocados en el mencionado Fotosistema II119
y frente al sistema
enzimaacutetico superoacutexido dismutasa120
Rhile y colaboradores describen la siacutentesis
caracterizacioacuten y estudios de oxidacioacuten tanto quiacutemica como electroquiacutemica (en medio
aproacutetico acetonitrilo) de una serie de fenol-aminas junto con un anaacutelisis teoacuterico del
sistema evidenciaacutendose la presencia de especies radicales intermediarias121
junto con
valores entre 16 a 28 para la relacioacuten de efecto isotoacutepico cineacutetico (KI = kHkD) que se
estima como criterio para considerar un mecanismo concertado122
El estado del arte con respecto a los distintos mecanismos electro-oxidativos descritos
para los derivados fenoacutelicos indica que la determinacioacuten de una ruta en particular en
este proceso se puede establecer mediante estudios de naturaleza tanto experimental
como teoacuterica La obtencioacuten de paraacutemetros termodinaacutemicos como la energiacutea libre de
Gibbs el estudio de efecto isotoacutepico y la determinacioacuten de constantes de velocidad en
electroquiacutemica entre otros permiten discriminar entre las diferentes viacuteas en que se
puede llevar a cabo la electro-oxidacioacuten de fenoles
Resultados y discusioacuten
71
53 Estudio de generacioacuten de especies radicalarias mediante espectroscopia de
resonancia de espiacuten electroacutenico (REE)
A fin de evidenciar la existencia de posibles intermediarios radicalarios en el proceso
electro-oxidativo de los fenoles previamente estudiados a traveacutes de las teacutecnicas
electroquiacutemicas se procedioacute a oxidar los derivados 9 10 y 11 y medir in situ su
espectro REE Se utilizoacute la teacutecnica descrita por Le Nest y colaboradores99
en que se
describe el estudio de estructuras flavonoides polifenoacutelicas en eacutel se utiliza la
quelacioacuten con Zn2+
lo que permitioacute la estabilizacioacuten del radical formado y su posterior
estudio En primer lugar desde un punto de vista cualitativo se observoacute para cada
compuesto un evidente cambio de color en las soluciones electrolizadas las que se
tornaron de color amarillo intenso y maacutes oscuro que las soluciones de trabajo
originales lo que sugiere que tras la electroacutelisis se forma un compuesto nuevo
diferente al de partida como se esperaba En la Figura 511A-C se presentan los
espectros obtenidos junto con las respectivas simulaciones realizadas
Resultados y discusioacuten
72
Figura 511A Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido cafeico 9 estabilizado con Zn2+
en DMF + HFFTBA
(izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color
rojo)
Figura 511B Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido gaacutelico 10 estabilizado con Zn2+
en DMF + HFFTBA
(izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color
rojo)
3440 3450 3460 3470 3480 3490
O
OH
HO O
OH
OH
O
OA
Campo Magneacutetico G
3440 3450 3460 3470 3480 3490
OHO O
O
O
OH
OH
OH
OH
B
Campo Magneacutetico G
Resultados y discusioacuten
73
Figura 511C Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido protocateacutequico 11 estabilizado con Zn2+
en DMF +
HFFTBA (izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der
en color rojo)
Concordante con el resultado esperado la sentildeal espectral indica la presencia de una
especie radicalaria como intermediario de la electro-oxidacioacuten de los grupos catecol
presentes en los tres derivados en estudio
En la simulacioacuten realizada para el derivado 9 se observa el acoplamiento hiperfino de
tres aacutetomos de hidroacutegeno con los siguientes valores de constantes 132 G 098 G y
03 G que seriacutea indicio del proceso oxidativo que ocurre en el catecol del anillo
benceacutenico (Tabla 52) ya que estos valores coinciden con una interaccioacuten entre los tres
protones del anillo benceacutenico en posicioacuten 2 5 y 6 En el caso de los compuestos 10
y 11 se encontraron dos constantes de acoplamiento hiperfino lo que indica la
3440 3450 3460 3470 3480 3490
OHO O
O
OOH
OH
OH
C
Campo Magneacutetico G
Resultados y discusioacuten
74
interaccioacuten entre dos protones que seriacutean aquellos en posicioacuten 5 y 6 del anillo
cumariacutenico
Tabla 52 Constantes de acoplamiento hiperfino para los derivados polifenoacutelicos
Valores en Gauss
Compuesto aH1 G aH2 G aH3 G
132 098 030
215 156 -
235 122 -
Estos resultados concuerdan ademaacutes con lo descrito en la literatura con respecto a la
oxidacioacuten de grupos fenoacutelicos lo que permite inferir un posible mecanismo electro-
oxidativo para los derivados en estudio
O
OH
OH O
OH
OH
O
O
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
Resultados y discusioacuten
75
54 Resultados y discusioacuten de los estudios de reactividad frente a especies
radicalarias
En este punto de la investigacioacuten el objeto de estudio fue evaluar el comportamiento
de las nuevas estructuras previamente sintetizadas frente a diferentes especies
radicalarias de amplio intereacutes bioloacutegico radical peroxilo (ROObull) radical hidroxilo
(OHbull) anioacuten radical superoacutexido (O2-) junto con determinar la capacidad reductora de
los compuestos Cada ensayo fue escogido con miras de abordar el tema de la
capacidad antioxidante desde las posibilidades que permiten las experiencias de tipo in
vitro
541 Metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno
(oxygen radical antioxidant capacity-fluorescein ORAC-FL)
El estudio de especies reactivas de oxiacutegeno y nitroacutegeno asociadas a los procesos
oxidativos requiere en algunos casos del uso de compuestos denominados ldquosondasrdquo
En la teacutecnica de fluorescencia es posible implementar este tipo de metodologiacutea debido
a sus caracteriacutesticas de sensibilidad especificidad y simplicidad en la obtencioacuten de
datos convirtieacutendose en una herramienta uacutetil y ampliamente utilizada a la hora de
obtener una buena aproximacioacuten en la determinacioacuten de actividad frente a especies
EROsERNs123
Resultados y discusioacuten
76
En el caso de la metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno
(ORAC) los primeros trabajos que dan cuenta de su uso fueron descritos en la deacutecada
de 1990 a partir de la investigacioacuten de Cao y colaboradores124
En este trabajo los
autores describen la teacutecnica como un meacutetodo simple y confiable para determinar
capacidad antioxidante en serum humano en pequentildeas cantidades de muestra (del
orden de los microL) utilizando como sonda la β-ficoeritrina (proteiacutena aislada del alga roja
unicelular Porphyridium cruenturn) debido a su fluorescencia sensible a los cambios
conformacionales en su estructura en ensayos frente al radical peroxilo125
En el
desarrollo posterior Ou y colaboradores126
proponen una mejora a la teacutecnica
cambiando la sonda proteica por el compuesto fluoresceiacutena debido a su mayor foto-
estabilidad y para evitar interacciones proteiacutena-polifenol (hidrofoacutebicas y puentes de
hidroacutegeno) junto con ello realizaron la validacioacuten del meacutetodo Esta sonda es la
utilizada actualmente para este ensayo el cual es ampliamente utilizado en el estudio
de polifenoles y sus derivados127-128ab
en diferentes alimentos y bebidas129130
muestras bioloacutegicas de distinta iacutendole131
por mencionar algunos ejemplos
Para efectos de esta investigacioacuten se espera obtener un perfil de comportamiento de
cada uno de los compuestos frente al radical peroxilo (ROObull) que permita distinguir el
aporte que significa cada sustitucioacuten realizada al anillo cumarina con diferentes
grupos fenoacutelicos Cabe mencionar que las longitudes de onda maacuteximas (λmaacutex) de
absorbancia en el rango UV-visible para los compuestos ensayados estuvieron en un
rango entre los 203 nm y 329 nm En este estudio se obtuvieron los perfiles cineacuteticos
Resultados y discusioacuten
77
de consumo de la sonda fluoresceiacutena (con valores de 485525 nm para su absorcioacuten y
emisioacuten respectivamente) por induccioacuten de los radicales peroxilo (originados por
efecto de la termoacutelisis del azo-compuesto ABAP a 37 degC) A partir de estos perfiles de
decaimiento de la sonda a distintas concentraciones de compuestos antioxidantes (5 en
total) se obtuvieron curvas adecuadamente separadas como se muestra en la Figura
512 donde se muestran los resultados para el compuesto 11 como ejemplo
representativo del ensayo Posteriormente se determina para cada concentracioacuten el aacuterea
neta bajo la curva la que es graficada con respecto a las concentraciones utilizadas La
Figura 513 presenta relacioacuten lineal entre el aacuterea neta bajo la curva con respecto a la
concentracioacuten del compuesto 11 como ejemplo la que fue determinada para cada
derivado
Figura 512 Curvas para el consumo de la sonda fluoresceiacutena para un set de
concentraciones del compuesto 11
0 2000 4000 6000
02
04
06
08
10
F
F0
Tiempo (s)
control
16 M
12 M
081 M
045 M
020 M
Resultados y discusioacuten
78
Las curvas obtenidas en esta parte del experimento muestran la reaccioacuten de
competencia entre el radical y el antioxidante (el cual protege a la fluoresceiacutena del
proceso de oxidacioacuten) Posterior al procedimiento anteriormente descrito se obtuvo el
iacutendice ORAC para cada compuesto que se resume en la Tabla 54
Figura 513 Graacutefica de aacuterea neta bajo la curva ABC vs concentracioacuten del derivado 11
En este ensayo los compuestos hiacutebridos propuestos superaron en cuanto al valor de
iacutendice ORAC a la cumarina precursora 1 En los tres casos se pudo observar valores
superiores de casi el doble para el compuesto 10 y bordeando un ORAC casi tres veces
mayor en los compuestos 9 y 11 del valor obtenido para su precursor Estos resultados
evidenciaron un incremento en la capacidad antioxidante al que posee la cumarina de
manera independiente debido a la inclusioacuten de los derivados de aacutecidos
hidroxibenzoicos e hidroxicinaacutemico en su estructura (Tabla 53)
0 1 2 3 4 50
1000
2000
3000
4000
r = 099309
AB
C n
eta
Concentracioacuten (mM)
Resultados y discusioacuten
79
Tabla 53 Valores experimentales de iacutendice ORAC-FL para los compuestos
estudiados
Compuesto iacutendice ORAC-FL
(plusmnSD)
1 091 plusmn 010
2 347 plusmn 010
3 391 plusmn 009
4 069 plusmn 001
9 239 plusmn 003
10 174 plusmn 005
11 262 plusmn 004
Trolox 1
Por otra parte los valores del iacutendice ORAC de la serie fueron superiores al estaacutendar
Trolox con excepcioacuten de los compuestos 1 (cumarina de partida) y 4 (aacutecido
protocateacutequico) Para el caso de la cumarina eacutesta tuvo un valor ORAC menor a 1 En
el caso del compuesto 4 la ostensible diferencia (5 veces menor) con su homoacutelogo
aacutecido cafeico 2 deriva de la presencia del doble enlace en esta estructura aunque
ambos aacutecidos poseen igual cantidad de grupos ndashOH y en igual posicioacuten en el anillo
aromaacutetico la insaturacioacuten le confiere maacutes posibilidades de deslocalizacioacuten electroacutenica
debido a la mayor cantidad de estructuras resonantes posibles y por lo tanto mayor
Resultados y discusioacuten
80
estabilidad al formarse la especie radicalaria correspondiente en la reaccioacuten frente el
ABAP Al observar el valor obtenido para el aacutecido gaacutelico 3 se obtuvo un iacutendice
ORAC cercano al del aacutecido cafeico y aunque carece de la insaturacioacuten presente en el
derivado cinaacutemico posee en su defecto un grupo ndashOH adicional en posicioacuten 5 del
anillo aromaacutetico el cual aportoacute adicionalmente a su capacidad antioxidante (lo que no
ocurrioacute en el caso del aacutecido protocateacutequico 4)
Se observa que el aacutecido dihidroxibenzoico 4 que arrojara un valor 069 presenta un
incremento de 37 veces en su valor ORAC-FL al estar incorporado en el heterociclo
cumariacutenico En este caso se presentoacute un fenoacutemeno de sinergia positiva ya que ambos
compuestos cumarina 1 y aacutecido protocateacutequico 4 aumentaron su valor de ORAC-FL
pasando de un valor 091 y 069 de forma individual respectivamente a formar un
derivado que presentoacute un valor de ORAC-FL igual a 262 Al observar los valores
totales en los derivados 9 y 10 obtenidos no correspondieron a la sumatoria de los
iacutendices individuales de sus precursores este resultado indica que estuvo ausente el
fenoacutemeno de sinergia
Para los nuevos compuestos (9 10 y 11) se observoacute un incremento del valor de
ORAC-FL con respecto a la cumarina precursora 1 Por lo tanto la inclusioacuten delas
estructuras fenoacutelicas en el heterociclo cumariacutenico generoacute la obtencioacuten de nuevos
derivados con una mayor capacidad antioxidante en esta metodologiacutea de esta forma se
obtuvo un aporte a la reactividad de la cumarina 1
Resultados y discusioacuten
81
Los resultados obtenidos en este ensayo dan cuenta de la actividad que presentaron los
compuestos tanto precursores como derivados frente a la especie radical ROObull Un
punto importante a considerar es que este experimento ndashindependientemente de ser un
ensayo in vitro- se lleva a cabo en un medio buffer a pH 74 y a una temperatura
controlada de 37 degC lo que permite obtener una primera aproximacioacuten con respecto a
lo que seraacute la actividad de los compuestos en un medio bioloacutegico La sustitucioacuten en el
anillo cumariacutenico generoacute nuevos compuestos que superaron su capacidad antioxidante
sin embargo desde el punto de vista de los precursores aacutecidos (cafeico y gaacutelico) su
actividad se vio mermada tras la sustitucioacuten fenoacutemeno que se discute en la seccioacuten 6
La secuencia de actividad obtenida para los derivados y sus precursores fue 3 gt 2 gt 11
gt 9 gt 10 gt 1 gt 4
Junto con el ensayo anteriormente detallado se procedioacute a determinar la cantidad de
radicales que reaccionan con el compuesto antioxidante relacionando la concentracioacuten
de antioxidante aplicado la estequiometriacutea de la reaccioacuten y la velocidad de generacioacuten
de radicales peroxilo a 37 degC como se expresa en la siguiente ecuacioacuten (Burton y
colaboradores 1981)132
120591 = 119899 [119860119903119874119867]
119877119894 Ecuacioacuten 54
Resultados y discusioacuten
82
donde τ es el tiempo de induccioacuten (tiempo en el que la sonda es protegida de los
radicales peroxilo por el antioxidante) n es el valor asociado a la estequiometriacutea de la
reaccioacuten correspondiente a la cantidad de moleacuteculas de radical ROObull inactivadas por
moleacutecula de compuesto antioxidante [ArOH] es la concentracioacuten de antioxidante y Ri
es la velocidad de generacioacuten de radical peroxilo la cual estaacute directamente relacionada
con la concentracioacuten de ABAP utilizada en el ensayo (18 mM) y se determina seguacuten la
expresioacuten133
Ri = 136 bull 10-6
[ABAP] Ecuacioacuten 55
Dadas las condiciones experimentales empleadas el valor de Ri es 147 microMmin Los
resultados obtenidos del valor de la pendiente (regresioacuten lineal Ecuacioacuten 54) se
resumen en la Tabla 54
Todos los compuestos (precursores y derivados) presentan valores de n superiores a
los esperados donde en el caso extremo se tiene que una moleacutecula de aacutecido gaacutelico
estariacutea consumiendo 14 moleacuteculas de radical peroxilo resultado que es mucho mayor
al esperado Los aparentes altos valores de n como estequiometriacutea de la reaccioacuten
(n = 3 hasta n = 14) sugieren la presencia de reacciones asociadas de mayor
complejidad en las que estariacutea presente el radical alcoxilo (RObull)134
el cual se forma
por descomposicioacuten del radical peroxilo que posee una vida media del orden de los
segundos en comparacioacuten con el radical alcoxilo con una vida media del orden de los
10-6
s (y es maacutes reactivo) lo que explica esta diferencia en la estequiometria
Resultados y discusioacuten
83
Tabla 54 Valores calculados para el factor estequiomeacutetrico n
Compuesto na(plusmnSD) n
1 28 plusmn 03 3
2 39 plusmn 01 4
3 141 plusmn 14 14
4 24 plusmn 01 3
9 58 plusmn 04 6
10 49 plusmn 01 5
11 86 plusmn 01 9
a Valores calculados en triplicado
Este fenoacutemeno se ha encontrado en investigaciones previas realizadas en derivados
cumariacutenicos135
y fue descrito por Lissi y colaboradores el que se puede encontrar
ademaacutes en experimentos en los que se utiliza la sonda rojo de pirogalol (ORAC-
PGR)136137
Resultados y discusioacuten
84
542 Metodologiacutea de capacidad reductora de hierro en plasma (FRAP)
Esta metodologiacutea desarrollada por Benzie y Strain (1996)138
se propuso como una
medida de la capacidad reductora (asociada a una buena capacidad antioxidante)
enfocada a investigar procesos de estreacutes oxidativo en fluidos bioloacutegicos
Posteriormente se ha extendido al estudio de diversas matrices como extractos de
plantas medicinales139
alimentos140
compuestos puros141
por mencionar algunos
ejemplos
En este ensayo se obtuvieron los valores de la capacidad reductora de los compuestos
polifenoacutelicos la que se aprecia cualitativamente a traveacutes de la formacioacuten del complejo
de Fe2+
de color azul (Figura 514) Esta metodologiacutea involucra la reaccioacuten redox
entre el agente reductor (en este caso los derivados cumariacutenicos) y el oxidante (la sal
feacuterrica) es considerada como aproximacioacuten con respecto a la capacidad de mantener el
estatus redox dentro de la ceacutelula
En primer lugar se observoacute un comportamiento semejante al ensayo ORAC-FL en
cuanto a la tendencia que presentaron los compuestos en su capacidad reductora de
hierro lo que indica una baja probabilidad de que en este ensayo ocurriese el
fenoacutemeno de quelacioacuten propio de los catecoles La Tabla 55 presenta los datos
experimentales obtenidos
Resultados y discusioacuten
85
NN
NN
Fe 3+N
N
N
N
N
N
NN
NN
NN
Fe2+N
N
N
N
N
N
NN
Antioxidante
amarilloazul
[Fe(III) (TPTZ)2]3+ [Fe(III) (TPTZ)2]2+
Figura 514 Esquema para la reaccioacuten entre el complejo de Fe3+
y el compuesto
antioxidante reductor
Los compuestos 9 10 y 11 presentaron una mejor capacidad reductora frente a su
precursor cumariacutenico 1 Esto se explica debido a la presencia de un mayor nuacutemero de
grupos -OH presentes en las nuevas estructuras propuestas capaces de transferir
electrones y reducir la sal feacuterrica como se menciona en el trabajo de Pulido y
colaboradores142
quienes estudian una serie de polifenoles mediante esta teacutecnica
sentildealando que ademaacutes del nuacutemero de hidroxilos presentes la presencia de dobles
enlaces conjugados en el esqueleto como parte de las caracteriacutesticas estructurales
responsables de un aumento en la capacidad reductora en polifenoles
Resultados y discusioacuten
86
Tabla 55 Valores experimentales obtenidos para los compuestos en estudio ensayo
FRAP en equivalentes de Trolox10 microM de muestra
En el derivado 11 se presenta una interaccioacuten de tipo sineacutergica con respecto a los
resultados individuales de cada precursor habieacutendose obtenido un valor FRAP de
1302 y 868 equiv Trolox 10 microM de muestra para 1 y 4 respectivamente y para el
derivado final un valor de 2624 equiv Trolox 10 microM de muestra
Del mismo modo que en el ensayo anterior se observa que la sustitucioacuten en el anillo
cumariacutenico con los distintos grupos aacutecidos incrementa su potencial como especie
reductora mientras que en el caso del aacutecido cafeico y gaacutelico se aprecia una
disminucioacuten de 13 y 15 veces respectivamente en su capacidad reductora tras la
esterificacioacuten
Compuesto equiv Trolox 10 microM muestra
(plusmnSD)
1 1302 plusmn 197
2 2727 plusmn 321
3 4768 plusmn 215
4 868 plusmn 93
9 2052 plusmn 186
10 3182 plusmn 681
11 2624 plusmn 335
Resultados y discusioacuten
87
Los resultados obtenidos para esta teacutecnica entregan informacioacuten acerca de la capacidad
reductora relativa para el conjunto de compuestos ensayados capacidad que estaacute
relacionada con su actividad antioxidante Se obtuvo un orden relativo para
precursores y derivados como sigue 3 gt 10 gt 2 gt 11 gt 9 gt 1 gt 4 Con respecto a la
disminucioacuten de actividad para los aacutecidos mencionados sugiere que esta capacidad
ademaacutes del nuacutemero de ndashOH presentes estariacutea relacionada con el sustituyente ndashCOOH
que se transforma en un grupo eacutester (ver seccioacuten 6)
543 Capacidad de inactivacioacuten del radical OHmiddot teacutecnica Spin Trapping
Esta teacutecnica no destructiva permite la deteccioacuten e identificacioacuten de especies
paramagneacuteticas (con electrones desapareados) en distintas matrices El fenoacutemeno de
resonancia de espiacuten electroacutenico fue descubierto y descrito en la deacutecada de 1940 por
Zavoisky143
en sus estudios basados en sales de manganeso en distintos medios Su uso
y aplicaciones se han diversificado a numerosas aacutereas como en la determinacioacuten de
capacidad antioxidante en alimentos144
en el anaacutelisis del proceso oxidativo en
liacutepidos145
en el estudio de enfermedades parasitarias146
El creciente intereacutes de la
teacutecnica en ciencias biomeacutedicas radica en el hecho de que esta espectroscopia permite
discriminar diferentes especies radicales de intereacutes bioloacutegico estrechamente
relacionadas con el estatus redox de la ceacutelula147
cuyo desbalance se traduce en cuadros
de estreacutes oxidativo148
Resultados y discusioacuten
88
En este estudio se determinoacute la capacidad de los compuestos propuestos para inactivar
la especie radicalaria OHmiddot
mediante la teacutecnica spin trapping metodologiacutea basada en
establecer la competencia de reaccioacuten entre los antioxidantes propuestos y el spin trap
DMPO El radical se generoacute a traveacutes de la reaccioacuten de ldquoFenton no cataliacuteticordquo
(Ecuacioacuten 56) metodologiacutea que permite la generacioacuten del radical OHbull en medio
baacutesico en ausencia del ioacuten Fe como catalizador91ab
211986721198742 + 119874119867minus rarr 119874119867∙ + 1198742minus + 21198672119874 Ecuacioacuten 56
En un primer set de experimentos se procedioacute a realizar la experiencia utilizando
DMSO como solvente Se descartoacute esta opcioacuten debido a que resultoacute complejo
observar un patroacuten claro en el blanco y poder asiacute discriminar las nuevas sentildeales
espectrales a partir de la adicioacuten de los compuestos en estudio
En primer lugar se determinoacute el blanco experimental que indica la reaccioacuten de
inactivacioacuten del radical mediante el compuesto spin trap DMPO Posteriormente se
ensayaron los derivados hiacutebridos y sus precursores sinteacuteticos en dos concentraciones
033 mM y 33 mM En el caso de los experimentos realizados a la menor
concentracioacuten se aprecioacute que la disminucioacuten de la sentildeal del blanco fue miacutenima para los
siete compuestos y no se observoacute un cambio significativo en el espectro como para
obtener resultados concluyentes Considerando lo anterior los experimentos se
Resultados y discusioacuten
89
realizaron con concentracioacuten del orden de los 3 mM obtenieacutendose asiacute datos
satisfactorios en cuanto a la inactivacioacuten del radical y la posibilidad de realizar
caacutelculos sobre este valor El valor de inactivacioacuten del radical hidroxilo se calcula a
traveacutes de la disminucioacuten en la intensidad de las sentildeales al adicionar cada derivado En
cada espectro se aprecia el perfil hiperfino compuesto por cuatro liacuteneas caracteriacutesticas
correspondientes al aacutetomo de nitroacutegeno e hidroacutegeno del spin-aducto formado por
[DMPO-OH] con valores de aN y aH alrededor de 15G lo que concuerda con lo
descrito en la literatura149
para esta reaccioacuten y el espectro simulado que se presenta en
la Figura 515 El cambio experimental tras la adicioacuten de los compuestos se presenta
en color rojo (Figura 516 A-G)
N+
O-
+ OHN
O
OH
Figura 515 Espin aducto generado por la inactivacioacuten del radical OHbull y su espectro
simulado (derecha)
Resultados y discusioacuten
90
Figura 516 A Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto 4-clorometil-78-dihidroxicumarina 1 B Espectro REE de inactivacioacuten del
radical hidroxilo con adicioacuten del compuesto aacutecido cafeico 2
Figura 516 C Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto aacutecido gaacutelico 3 D Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con
adicioacuten del compuesto aacutecido 34-dihidroxi benzoico 4
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
B
Campo Magneacutetico G
compuesto 2
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
C
Campo Magneacutetico G
compuesto 3
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
D
Campo Magneacutetico G
compuesto 4
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
A
Campo Magneacutetico G
compuesto 1
control
Resultados y discusioacuten
91
Figura 516 E Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto hiacutebrido 9 F Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con
adicioacuten del compuesto hiacutebrido 10
Figura 516 G Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto hiacutebrido 11
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
G
Campo Magneacutetico G
compuesto 11
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
E
Campo Mgneacutetico G
compuesto 9
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
F
Campo Magneacutetico G
compuesto 10
control
Resultados y discusioacuten
92
Considerando los patrones espectrales obtenidos para los compuestos 9 10 y 11 se
observoacute que la sentildeal de cuadruplete correspondiente al control (spin-aducto [DMPO-
OH]) desaparecioacute casi por completo lo cual indica la inactivacioacuten del radical
hidroxilo Se observa ademaacutes un triplete con constantes de acoplamiento 1398 G y
1427 G que evidencioacute la reaccioacuten de oxidacioacuten del atrapador DMPO (Figura 517)
ya que de haberse formado el aducto entre la cumarina y el spin trap DMPO se
habriacutea obtenido el correspondiente espectro con un patroacuten de 6 liacuteneas espectrales
(Figura 518)
Figura 517 Espectro REE se destaca en rojo el triplete de integracioacuten 121
formado despueacutes de la reaccioacuten de Fenton no-cataliacutetico (izq) Espectro simulado
utilizando el programa EPR-WINSIM (der)
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
DMPO oxidado
N+
O-
+ OHNO
OH
Campo Magneacutetico G
Resultados y discusioacuten
93
cumarina + OHbull cumarinabull + H2O
cumarinabull + DMPO [cumarina-DMPO]
Figura 518 Espectro simulado para la formacioacuten del spin aducto [cumarina-
DMPO] utilizando el programa EPR-WINSIM
Como se presenta en la Tabla 56 tanto los aacutecidos orgaacutenicos como la cumarina
precursora y sus derivados presentaron reactividad muy semejante En las
condiciones de estudio para todos los compuestos se obtuvo un valor sobre el 90
indicando su poder de inactivacioacuten del radical resultado que superoacute al descrito en la
literatura para el estaacutendar Trolox
Estudios previos realizados en estructuras cumariacutenicas simples semejantes al
precursor 1 de esta investigacioacuten permiten comparar algunos resultados Peacuterez-Cruz y
colaboradores150
indican un 29 de inactivacioacuten para el derivado monohidroxilado de
la cumarina 1 diferencia que puede explicarse por la ausencia del ndashOH en posicioacuten 8
que aumenta su actividad El compuesto con grupos ndashOH en posicioacuten 6 y 7 presentoacute
un apagamiento del 51 Figueroa y colaboradores presentan tambieacuten un estudio en
que las cumarinas monohidroxiladas presentan valores de 23 y 56 de la
inactivacioacuten del radical OH corroborando lo encontrado anteriormente151
Resultados y discusioacuten
94
Tabla 56 Porcentajes de inactivacioacuten del radical hidroxilo (OHmiddot)
Compuesto de inactivacioacuten bullOH
(plusmnSD)
1 923 plusmn 74
2 983 plusmn 27
3 995 plusmn 08
4 927 plusmn 29
9 981 plusmn 18
10 982 plusmn 25
11 980 plusmn 99
Trolox 31plusmn 25a
aRef149 Figueroa R et al Future Med Chem 2013
Los resultados obtenidos con esta teacutecnica indican la reactividad relativa que tienen los
compuestos propuestos frente al radical OH Al considerar que el tiempo de vida del
radical hidroxilo y del spin trap DMPO es del orden de 10-9
s se observa que todos los
compuestos ensayados tuvieron la capacidad de competir con el DMPO en el proceso
de inactivacioacuten del radical evidenciado por la sentildeal de control que disminuyoacute casi en
su totalidad para todos los casos siendo menor en la cumarina precursora 1 y el aacutecido
4 siguiendo ambos compuestos la misma tendencia que se observara en los ensayos
Resultados y discusioacuten
95
anteriores Independientemente que el radical ensayado en este experimento es de una
alta reactividad y escasa selectividad el hecho de que se obtuvieran altos valores de
actividad para los compuestos propuestos indica que eacutestos se presentan como buenos
candidatos como inactivadores de la especie OH
Finalmente se observa que los derivados 9 10 y 11 presentaron un valor de
reactividad superior al de la cumarina precursora obtenieacutendose de esta forma un
aporte a la reactividad en cada nueva estructura propuesta frente al heterociclo de
partida 1 para este ensayo En cuanto a la reactividad relativa de la serie no se
encontroacute una diferencia significativa entre los compuestos ensayados precursores y
derivados mostraron valores cercanos en cuanto al de inactivacioacuten del radical
alrededor del 90
Resultados y discusioacuten
96
544 Estudio de reactividad frente al anioacuten radical superoacutexido O2-
Dentro de las diversas aplicaciones desarrolladas para las teacutecnicas electroquiacutemicas se
encuentran los ensayos de determinacioacuten de la capacidad antioxidante en distintos
medios152
y en muestras como bebidas153
vegetales154
mediciones in situ sobre piel
humana155
por mencionar algunos ejemplos Un reciente review (Pisoschi y
colaboradores 2015) describe las contribuciones realizadas con respecto a la
determinacioacuten de actividad antioxidante empleando exitosamente la voltametriacutea
ciacuteclica voltametriacutea de pulso diferencial voltametriacutea de onda cuadrada amperometriacutea
y potenciometriacutea156
las que ademaacutes se complementan con otras teacutecnicas en este tipo
de estudios157158
En esta parte de la investigacioacuten se determinoacute la reactividad de los compuestos frente
al anioacuten radical superoacutexido cuya generacioacuten electroquiacutemica en la superficie del
electrodo por reduccioacuten de oxiacutegeno disuelto mediante la teacutecnica de voltametriacutea ciacuteclica
ha sido ampliamente estudiada en nuestro grupo de trabajo159160110
y por otros
autores161
Como se esperaba tras la adicioacuten sucesiva de aliacutecuotas de todos los compuestos
estudiados hubo un decaimiento en la corriente de pico anoacutedica (Ipa0) (ejemplo del
resultado para el precursor 1 en la Figura 519) Esto permitioacute calcular el valor del
iacutendice antioxidante 50 (IA50) el cual se define como la concentracioacuten de sustrato
necesaria para obtener una disminucioacuten del 50 en la corriente Ipa0 Esta corriente es
Resultados y discusioacuten
97
directamente proporcional a la concentracioacuten de anioacuten superoacutexido presente por lo
que su disminucioacuten es un indicador de la capacidad del sustrato para inactivar la
especie radical generada in situ
Figura 519 Voltamogramas ciacuteclicos del par redox correspondiente al anioacuten
superoacutexido tras antildeadir aliacutecuotas del compuesto 1 DMF + HFFTBA 02 M 01 Vs
Tras obtener los voltamogramas ciacuteclicos para cada compuesto se procedioacute a
determinar el paraacutemetro adimensional (Ipa0-Ipa
SIpa
0) y se graficoacute con respecto a la
concentracioacuten de sustrato en solucioacuten (Figura 520) obtenieacutendose relaciones de tipo
lineal en que los valores del coeficiente de correlacioacuten r estuvieron entre 099777 y
097267
-10 -08 -06 -04 -02
Ipa0
10A
blanco
0049 mM
0099 mM
0149 mM
0199 mM
0249 mM
0299 mM
E vs Ag|AgCl V
Resultados y discusioacuten
98
007 014 021 02800
03
06
09
r = 099074
IA 50
(Ip
a0-
Ipa
S)
Ip
a0
Concentracioacuten mM
Figura 520 Graacutefica del paraacutemetro adimensional (Ipa0-Ipa
SIpa
0) vs concentracioacuten de
sustrato para el compuesto 1 (Destacado en verde el valor de IA50)
Junto con el valor de concentracioacuten IA50 la pendiente de las rectas entrega tambieacuten
informacioacuten con respecto a la reactividad de los compuestos frente al anioacuten
superoacutexido donde un mayor valor de la pendiente indica que el compuesto posee una
mayor actividad no obstante los autores que desarrollaron el meacutetodo hacen notar que
se utiliza preferentemente el iacutendice IA50 como valor para caracterizar de manera
adecuada la actividad de los compuestos propuestos frente el radical de forma
anaacuteloga al concepto de IC50 (concentracioacuten inhibitoria aplicada en sistemas
bioloacutegicos en relacioacuten a la cantidad de compuesto necesario para inhibir en un 50 el
crecimiento de una poblacioacuten de microorganismos)
Como se observa en los resultados (Tabla 57) la cumarina de partida 1 presenta un
valor mayor de IA50 (0187 mM) en comparacioacuten con los compuestos hiacutebridos 9 10 y
Resultados y discusioacuten
99
11 por lo que la adicioacuten de los fenoles a la estructura cumariacutenica fue un aporte a su
reactividad frente a la especie radical O2-
Tabla 57Valores de IA50 obtenidos para los compuestos estudiados
a Valor de estaacutendar Tolox ref 92
El derivado de aacutecido gaacutelico 10 presentoacute el menor valor de iacutendice antioxidante y por
consiguiente fue el mejor inactivador del anioacuten superoacutexido formado en la superficie
del electrodo puesto que se necesita una menor concentracioacuten de este derivado
(0064 mM) para apagar el 50 radical Junto con esto fue el compuesto que presentoacute
el fenoacutemeno de sinergia dentro de la serie con un valor de concentracioacuten menor
Compuesto IA 50 mM
(plusmnSD)
1 0183 plusmn 0007
2 0125 plusmn 0006
3 0104 plusmn 0004
4 0115 plusmn 0005
9 0141 plusmn 0011
10 0064 plusmn 0004
11 0137 plusmn 0002
Troloxa
197
Resultados y discusioacuten
100
requerida para inactivar el radical con respecto a cada uno de sus precursores (1 y 3)
El segundo mejor inactivador de O2-
fue el compuesto 11 con un valor de IA50 de
0137 mM y finalmente se tiene al derivado 9 con 0141 mM Este comportamiento
puede deberse a fenoacutemenos de difusioacuten de las moleacuteculas en el medio junto con su
reactividad en la superficie del electrodo
En este ensayo frente al radical O2-
al igual que el anterior (inactivacioacuten de la especie
OHbull) se pudo obtener informacioacuten con respecto al comportamiento de los
compuestos en un medio aproacutetico resultados que son de intereacutes ya que se pueden
considerar como una aproximacioacuten quiacutemica de tipo in vitro de los conocidos
fenoacutemenos de estreacutes oxidativo que ocurren en estructuras como las bio-membranas
donde participan especies reactivas oxigenadas161162
Finalmente se puede establecer un orden estimativo para la actividad de los derivados
y la cumarina 10 gt 3 gt 4 gt 2 gt 11 gt 9 gt 1 Todos los compuestos ensayados tuvieron
una reactividad superior al estaacutendar Trolox
Resultados y discusioacuten
101
545 Determinacioacuten de capacidad antioxidante celular (CAC)
Con el objeto de abordar los fenoacutemenos que involucran especies radicalarias
presentes en sistemas vivos se procede a realizar el estudio de la capacidad
antioxidante de los compuestos en un modelo bioloacutegico simple En este experimento
se utiliza la sonda DCFH-DA la cual difunde pasivamente a traveacutes de la membrana
celular al ingresar al citosol se transforma en el compuesto DCFH (no fluorescente)
que emite al entrar en contacto con especies oxidantes del tipo EROs y ERNs En los
experimentos realizados las ceacutelulas fueron estresadas mediante el compuesto ABAP
(generador de radical peroxilo) y se observoacute coacutemo los nuevos derivados en estudio
podiacutean contrarrestar este evento oxidativo al interior de la ceacutelula Los resultados
obtenidos se resumen en la Tabla 58
Los valores experimentales obtenidos en esta etapa indicaron una bio-disponibilidad
baja con una CAC menor al 50 para los nuevos compuestos 9 10 y 11 ademaacutes en
todos los casos se encontroacute un porcentaje menor de CAC de los derivados respecto a
los precursores respectivos 1 2 3 y 4 Para una concentracioacuten de 10 microM de
compuesto se obtuvieron valores muy semejantes (alrededor del 70) para los
precursores ensayados
Resultados y discusioacuten
102
Tabla 58 Valores obtenidos para la capacidad antioxidante celular (CAC)
concentraciones 1 microM y 10 microM de cada compuesto
Compuesto CAC 1 microM CAC 10 microM
1 696plusmn 50 727plusmn 13
2 730plusmn 26 739plusmn 07
3 662plusmn 19 701plusmn 01
4 477plusmn 25 665plusmn 26
9 381plusmn 55 499plusmn 66
10 178plusmn 45 395plusmn 128
11 345plusmn 31 234plusmn 108
En los resultados anteriores llaman la atencioacuten los bajos valores obtenidos en el
ensayo de CAC para los derivados polifenoacutelicos en comparacioacuten con los ensayos
realizados en sistemas no bioloacutegicos en que se obtuvieron buenos resultados en ellos
se pudo apreciar el fenoacutemeno de sinergia (en algunos casos) y un incremento en la
actividad de todos los derivados frente a la cumarina precursora de forma individual
Para explicar este comportamiento y complementar estos resultados se procedioacute a
seleccionar de manera racional los tres derivados obtenidos 9 10 y 11 y se determinoacute
su Hidrofobicidad Relativa en conjunto con el precursor cumariacutenico 1 (el cual
presentoacute valores de CAC alrededor del 70 cercano a lo obtenido en los precursores
Resultados y discusioacuten
103
aacutecidos) ensayo que entrega informacioacuten con respecto a la lipofilia relativa de la serie
(en funcioacuten de tiempos de retencioacuten) pudiendo dar respuesta al fenoacutemeno observado
555 Estudio de hidrofobicidad relativa
En el estudio de nuevos compuestos disentildeados como potenciales faacutermacos una de las
propiedades fisicoquiacutemicas de intereacutes es la lipofilia valor que puede determinarse
mediante distintos meacutetodos electroforesis capilar cromatografiacutea liacutequida de alta
resolucioacuten (HPLC) y determinando el coeficiente de particioacuten aguaoctanol entre
otras Junto con la metodologiacutea empiacuterica se han desarrollado diversas herramientas
computacionales con softwares que permiten calcular el valor para logP y logD
obtenieacutendose buenas correlaciones entre compuestos de una familia de estructuras
semejantes en los que se realizan variaciones a su esqueleto Los valores asiacute
calculados y entregados por el programa se consideran de una confiabilidad
razonable163
En el caso de este estudio se determinoacute la lipofilia relativa para los derivados 9 10 y
11 junto con el precursor 1 mediante HPLC en fase reversa donde se espera obtener
una serie relativa de tiempos de retencioacuten entre los compuestos que deacute cuenta de su
lipofilia Se utilizoacute esta teacutecnica por tratarse de una medicioacuten simple raacutepida y
ampliamente descrita en la literatura para nuevos compuestos en que la fase
estacionaria de la columna C18 simula la fase no polar y la fase moacutevil es la fase
Resultados y discusioacuten
104
acuosa asiacute a traveacutes de la columna se llevan a cabo muacuteltiples equilibrios de particioacuten
entre la fase acuosa y orgaacutenica En la medida en que el compuesto analizado sea maacutes
afiacuten a la fase estacionaria (relacionado con un mayor tiempo de retencioacuten) eacuteste seraacute
maacutes lipofiacutelico y viceversa Los resultados (Tabla 59) muestran que de acuerdo a los
tiempos de retencioacuten obtenidos (5138 5760 4031 y 4695 minutos) el orden
relativo de lipofilia fue el siguiente
Tabla 59 Valores obtenidos para el tiempo de retencioacuten experimental de los
compuestos
Compuesto Tiempo de retencioacuten
(min)
1 5138
9 5760
10 4031
11 4695
La Figura 521 indica el orden de lipofilia relativa encontrada para los derivados y su
precursor cumariacutenico En forma general se observaron valores de tiempo de
retencioacuten cercanos Se aprecioacute que el derivado de aacutecido cafeico 9 fue el compuesto
que encabezoacute la serie lo que se puede explicar debido a la presencia de un doble
enlace en su estructura confirieacutendole mayor apolaridad (por tanto hidrofobicidad) a
Resultados y discusioacuten
105
O
OH
HO O
Cl
O
OH
OH O
OH
OH
O
O
OHO O
O
O
OH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
la moleacutecula El segundo en la serie fue el compuesto clorado 1 en el cual el
sustituyente haloacutegeno es un aporte a la lipofilia del compuesto En el caso de las
estructuras 10 y 11 se encontroacute que el derivado de aacutecido gaacutelico presentoacute el menor
valor relativo debido a la presencia de un grupo ndashOH adicional en el anillo aromaacutetico
que como se esperaba tuvo la mayor tendencia hidrofiacutelica
9 1 11 10
Figura 521 Hidrofobicidad relativa de los derivados y la cumarina precursora
Para complementar este resultado experimental se realizoacute el caacutelculo teoacuterico para el
valor de logD mediante herramienta Marvin Sketch del software libre ChemAxon164
y
se establecioacute su correlacioacuten con el valor experimental obtenido para CAC en
concentracioacuten 10 microM El resultado de esta correlacioacuten se presenta en la Figura 522
Aumento de la lipofilia = aumento en el tiempo de retencioacuten
Resultados y discusioacuten
106
Figura 522 Correlacioacuten entre el valor de logD teoacuterico y CAC experimental a
10 microM de cada compuesto El valor logD se obtuvo a traveacutes de la herramienta Marvin
Sketch del software ChemAxon164
Considerando estos resultados para este modelo experimental propuesto en el ensayo
de CAC se observa que la lipofilia no seriacutea el uacutenico factor relacionado con los bajos
valores de capacidad antioxidante celular (CAC) obtenidos para los compuestos 9 10
y 11 ya que por ejemplo la cumarina 1 presentoacute valores de CAC sobre el 70 y fue
el segundo compuesto de la serie de hidrofobicidad relativa experimental con un
valor cercano de tiempo de retencioacuten al derivado 9 (el cual tuvo valores de CAC bajo
el 50) De igual forma se aprecia la misma tendencia al correlacionar el valor de
CAC con el logD teoacuterico donde el compuesto 1 independientemente de tener una
lipofilia semejante a los derivados polifenoacutelicos (al igual que en la serie de tiempos
de retencioacuten) siacute mostroacute una biodisponibilidad superior a los derivados y muy
-3 -2 -1 0 1 2 3 4
20
40
60
80
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OOH
HO O
Cl
OHO O
O
OOH
OH
OH
OOH
OH O
OH
OH
O
O
logDteor
C
AC
(1
0
32
4
Resultados y discusioacuten
107
semejante a los aacutecidos benzoicos (2 3 y 4) los cuales muestran valores negativos de
logD debido a su menor lipofilia
Por tratarse de un sistema bioloacutegico (ceacutelulas epiteliales) con muacuteltiples variables que
afectan la actividad de los compuestos estudiados se pueden considerar diversos
factores presentes en el medio ensayado que pueden dar respuesta al fenoacutemeno
observado Uno de ellos es la estructura de la membrana celular que contiene diversas
estructuras como por ejemplo el citocromo P (CYP) que es un complejo enzimaacutetico
involucrado en el metabolismo de faacutermacos siacutentesis de biomoleacuteculas y diversas
biotransformaciones de moleacuteculas a nivel celular165
Otro factor presente es la
existencia de enzimas hidroliacuteticas en el citosol celular como es el caso especiacutefico de
las carboxilesterasas (presentes en ceacutelulas epiteliales de intestino hiCE y otros
oacuterganos) las cuales son capaces de escindir diversos grupos funcionales tales como
amidas eacutesteres carbamatos y convertirlos en sus respectivos precursores (alcohol y
aacutecido) 166
Considerando que para este experimento en un modelo bioloacutegico in vitro simple se
emplearon ceacutelulas epiteliales de intestino (EAhy 926 (ATCC CRL-2922)) es posible
que el comportamiento observado se deba a la existencia de diversos fenoacutemenos e
interacciones posibles de los compuestos tanto a nivel de membrana como de
citoplasma Cabe destacar que al comparar las experiencias realizadas en un medio no
bioloacutegico los resultados en este caso se invierten al emplear una metodologiacutea que
involucra un medio bioloacutegico No necesariamente se encuentra un comportamiento
Resultados y discusioacuten
108
anaacutelogo en ambos medios de ensayo debido a la mayor complejidad y variables
asociadas a un sistema que involucra estructuras vivas independientemente de la
simplicidad o lo acotado del mismo
556 Estudios Teoacutericos optimizacioacuten de estructuras y determinacioacuten del Iacutendice
de Fukui
Con el objeto de racionalizar el estudio realizado y poder discriminar entre los
distintos sitios reactivos de los derivados se determinoacute el iacutendice de Fukui fk0
relacionado con un ataque de tipo radicalario Baacutesicamente es el promedio
correspondiente a las reacciones de ataque nucleofiacutelico fk- y electrofiacutelico fk
+(Ecuacioacuten
57) como se describe en el trabajo de Aliaga y Lissi donde se aborda el estudio
teoacuterico y experimental que compara la actividad anti-radicalaria de los polifenoles
rutina y quercetina167
1198911198960 =
119891119896minus+ 119891119896
+
2 Ecuacioacuten 57
Este iacutendice es un descriptor de reactividad local en los aacutetomos de oxiacutegeno que
participan en las reacciones de los grupos catecol presentes Este tipo de anaacutelisis
resulta adecuado para determinar los sitios de reaccioacuten preferentes en moleacuteculas
complejas con diversos centros reactivos168
Los resultados obtenidos indican que en
Resultados y discusioacuten
109
la cumarina precursora 1 el ataque radicalario ocurriraacute primero en el oxiacutegeno en
posicioacuten 7 debido al mayor valor de fk0
(0071) por otra parte no se observaron
cambios significativos en los valores de fk0 al formar parte de los derivados 10 y 11
para los aacutetomos de oxiacutegeno en posicioacuten 7 y 8 (aquellos involucrados en la capacidad
antioxidante de la moleacutecula) Al formar parte del derivado 9 si se observa una
disminucioacuten en su reactividad (fk0
O7 = 00078 y fk0
O8 = 00021) haciendo menos
probables estos dos sitios a un ataque radicalario en la moleacutecula (Tabla 510)
Los valores obtenidos para el iacutendice de Fukui indican que en el derivado 9 el sitio
maacutes probable para un ataque radicalario seraacute el catecol presente en el anillo benceacutenico
(proveniente del aacutecido cafeico) de preferencia en el oxiacutegeno en posicioacuten 4
(fk0
O4 = 00489) A diferencia del derivado de aacutecido cafeico en el caso de los
compuestos 10 y 11 el sitio preferente de reaccioacuten seraacute el anillo cumariacutenico
conservaacutendose el oxiacutegeno en posicioacuten 7 del heterociclo como sitio maacutes reactivo En
las Figuras 523 a 526 se presentan las estructuras optimizadas en 3D para el
precursor 1 y sus derivados polifenoacutelicos 9 10 y 11
Resultados y discusioacuten
110
Tabla 510 Valores de Iacutendice de Fukui fk para los compuestos en estudio
Compuesto Iacutendice de Fukui
fk0
Iacutendice de Fukui
fk-
O7 00771
O7 01373
O8 00391
O8 00757
O7 00078 O7 00072
O8 00021 O8 00036
O3 00389 O3 00779
O4 00489 O4 00890
O7 00719 O7 01276
O8 00365 O8 00716
O3 00025 O3 00050
O4 00025 O4 00049
O5 00002 O5 00004
O7 00739 O7 01316
O8 00378 O8 00742
O3 00004 O3 00008
O4 00003 O4 00005
OHO O
O
OOH
OH
OH
7
8
3
4
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
7
8
3
4
5
OOH
HO O
OH
OH
O
O
7
8
3
4
O
OH
HO O
Cl
7
8
Resultados y discusioacuten
111
OOH
OHO
Cl
Figura 523 Estructura optimizada en 3D para el precursor 1 utilizando DFT
OOH
OH O
OH
OH
O
O
Figura 524 Estructura optimizada en 3D para el derivado 9 utilizando DFT
Resultados y discusioacuten
112
Figura 525 Estructura optimizada en 3D para el derivado 10 utilizando DFT
OHO O
O
OOH
OH
OH
Figura 526 Estructura optimizada en 3D para el derivado 11 utilizando DFT
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
Resultados y discusioacuten
113
6 Discusioacuten General
Respecto del posible mecanismo de reaccioacuten electro-oxidativo se consideran las
siguientes evidencias teoacutericas y experimentales
En primer lugar como se esperaba los experimentos electroquiacutemicos de electro-
oxidacioacuten de los compuestos mostraron las sentildeales correspondientes a los grupos
ndashOH presentes en todas las estructuras Junto con esto los resultados de la graacutefica
Ipa vs vfrac12
indican la existencia de un proceso di-electroacutenico en los precursores y los
derivados (para la primera sentildeal oxidativa) lo que implica que comparten el mismo
mecanismo
Posteriormente se comproboacute la existencia de la especie radicalaria detectada mediante
oxidacioacuten electroquiacutemica seguida por resonancia de espiacuten electroacutenico con los
respectivos resultados de las simulaciones espectrales realizadas
En un siguiente punto se determinaron los valores teoacutericos de reactividad local
encontrados mediante el caacutelculo del iacutendice de Fukui El valor de fkndash
permitioacute
identificar los lugares con mayor reactividad frente a un ataque electrofiacutelico por tanto
las zonas en la moleacutecula puntuales con un alto valor para este iacutendice tenderaacuten a ceder
electrones con mayor facilidad en un proceso oxidativo Las estructuras optimizadas
en 3D indican que las zonas en color celeste (Figuras 523-526) corresponden a
aquellas con mayor densidad electroacutenica y por tanto estaacuten maacutes propensas a ceder
Resultados y discusioacuten
114
electrones en un proceso oxidativo Las zonas color lila representan los sitios con
menor densidad electroacutenica Para el compuesto 1 los ndashOH en el heterociclo presentan
mayor densidad electroacutenica lo que se aprecia de igual forma en los derivados 10 y 11
mientras que la zona del anillo benceacutenico se presenta con una baja densidad
electroacutenica Un fenoacutemeno diferente se aprecia para el derivado 9 donde la mayor
densidad electroacutenica se aprecia en la estructura benceacutenica cuyos grupos ndashOH
presentan el mayor valor de fk-
Este resultado teoacuterico racional complementa lo observado en el experimento descrito
con REE y electro-oxidacioacuten conjunta ya que los valores para las constantes de
acoplamiento hiperfino obtenidas en cada caso tambieacuten sentildealaron en cuaacutel de los dos
catecoles presentes ocurre la formacioacuten de la especie radical y por ende doacutende se
inicia el proceso de oxidacioacuten resultados corroboradas con el estudio teoacuterico
realizado De esta forma para el derivado 9 el proceso oxidativo se inicia en los -OH
ubicados en posicioacuten 3 y 4 que presentaron valores de fkndash
00779 y 00890
respectivamente y cuyas constantes de acoplamiento hiperfino son coherentes con
una interaccioacuten que involucra tres protones aquellos ubicados en las posiciones 2 5 y
6 del anillo benceacutenico El mismo anaacutelisis realizado para las estructuras 10 y 11 indica
que el proceso oxidativo ocurre primero en el anillo de la cumarina en los -OH en
posicioacuten 7 y 8 con valores del descriptor de reactividad local fkndash de 01276 y 00716
respectivamente para el derivado de aacutecido gaacutelico y en el caso del derivado de aacutecido
protocateacutequico con fkndash 01316 y 00742 para los oxiacutegenos en posicioacuten 7 y 8 De igual
forma los valores para las constantes de acoplamiento fueron consistentes con esta
Resultados y discusioacuten
115
informacioacuten experimental evidenciando la interaccioacuten entre dos protones (aquellos en
posicioacuten 5 y 6 del heterociclo cumariacutenico)
Esta diferencia encontrada para el proceso electro-oxidativo entre los derivados se
puede explicar debido a la existencia de un doble enlace conjugado adicional presente
soacutelo en el compuesto 9 derivado del aacutecido cafeico (ausente en 10 y 11) el cual le
confiere mayor deslocalizacioacuten (estabilidad) al radical que se forma como
intermediario en el proceso oxidativo
Los estudios presentes en la literatura sobre la oxidacioacuten de estructuras polifenoacutelicas
en medio aproacutetico presentan evidencias tanto teoacutericas como empiacutericas que ampliacutean la
visioacuten sobre la complejidad y posibilidades mecaniacutesticas en la oxidacioacuten de
estructuras polifenoacutelicas Basadas en modelos de naturaleza bioloacutegica como el
Fotosistema II presente en estructuras vegetales y otros ejemplos se plantea que una
viacutea de oxidacioacuten factible es a traveacutes de un mecanismo de tipo concertado donde se
obtiene el radical fenoxil (ArObull) en un paso directo en que el protoacuten y el electroacuten se
transfieren de manera conjunta (Figura 61 destacado en rojo) planteamiento que
considera factores de tipo energeacutetico a diferencia de los estudios claacutesicos con respecto
a este proceso seguacuten el cual la electro-oxidacioacuten se inicia con la peacuterdida de 1ē (etapa
electroquiacutemica) para formar el catioacuten radical(ArObull+) seguido de la peacuterdida de un
H+(etapa quiacutemica) para formar el radical fenoxil (ArObull) (Figura 62)
En el caso de los compuestos estudiados en esta investigacioacuten los valores de la
pendiente de Tafel encontrados para los compuestos (sobre 88 mVdec) sugieren que
Resultados y discusioacuten
116
el mecanismo de electro-oxidativo que maacutes se ajusta a la evidencia experimental es
por etapas
OH
HO
OH
HO
O
HO
O-
HO
-e- + B
+e- + HB+
+ B-e-
+e-
+e-
-e-
+ HB+
+ B
+HB+
Figura 61 Esquema de reaccioacuten para un mecanismo concertado de electro-
oxidacioacuten fenoacutelica Adaptacioacuten referencia 120
OH
HO - e
+ e
OH
HO
-H+
O
HO
Figura 62 Esquema de reaccioacuten para estructuras fenoacutelicas mecanismo electro-
oxidativo en etapas
Resultados y discusioacuten
117
Con respecto a los ensayos de actividad antioxidante realizados la Tabla 61 permite
comparar y estimar en conjunto los resultados obtenidos a traveacutes de las diferentes
metodologiacuteas empleadas
En forma general los resultados indican que la sustitucioacuten propuesta en esta
investigacioacuten en la cumarina dihidroxilada (utilizada como esqueleto de partida) con
distintas estructuras polifenoacutelicas entregoacute resultados positivos en cuanto al aporte
que los nuevos derivados obtenidos presentaron frente a la inactivacioacuten de especies
radicalarias tales como O2- ROO˙ OH˙ y su capacidad reductora (reflejada en el
ensayo FRAP) Para los ensayos realizados en un modelo no bioloacutegico se obtuvieron
valores de actividad en los derivados que superaron a los obtenidos para el precursor
cumariacutenico de forma individual
Cabe mencionar que en los diferentes ensayos y sus resultados se mencionan los
conceptos de reactividad y actividad de los compuestos En el caso de los ensayos
ORAC-FL y FRAP se habla soacutelo de actividad antioxidante ya que con la informacioacuten
que entregan no se puede determinar cuaacutel de los distintos grupos ndashOH presente en la
moleacutecula es el que reacciona primero Diferente es lo que ocurre en el ensayo frente
al radical hidroxilo en que se establece una competencia entre el atrapador (DMPO) y
el compuesto por inactivar al OHbull debido a que ambos tienen una vida media corta
(10-9
s) por tanto la reaccioacuten entre el antioxidante y el radical es raacutepida y el ndashOH maacutes
reactivo de la moleacutecula es el que inactiva a la especie y se puede mencionar como
reactividad Lo mismo ocurre para el ensayo frente al anioacuten radical superoacutexido en que
tambieacuten se mencionan los resultados como reactividad frente al radical
Resultados y discusioacuten
118
Tabla 61 Cuadro comparativo de los resultados en la determinacioacuten de capacidad
antioxidante para la cumarina y sus derivados
Compuesto ORAC-FL
FRAP
eq Trolox
10 microM
inactivacioacuten
OHmiddot
CAC
1 microM 10 microM
O2-
IA 50 mM
1 091 plusmn 003 1302plusmn 160 923 plusmn 74 696 plusmn 50 727 plusmn 13 0183plusmn0007
2 347 plusmn 010 2727 plusmn 321 983 plusmn 27 730plusmn 26 739plusmn07 0125 plusmn 0006
3 391 plusmn 009 4768 plusmn 215 995 plusmn 08 662plusmn 19 701plusmn01 0104 plusmn 0004
4 069 plusmn 001 868 plusmn 93 927 plusmn 29 477plusmn 25 665plusmn26 0115 plusmn 0005
9 239plusmn0027 2052 plusmn151 981 plusmn 18 381plusmn55 499 plusmn 66 0141plusmn0011
10 174 plusmn 005 28046plusmn188 982 plusmn 25 178plusmn45 395 plusmn128 0064plusmn0004
11 262 plusmn 004 2624 plusmn 236 980 plusmn 99 345plusmn31 234 plusmn 108 0137plusmn0002
Por otra parte en los ensayos ORAC-FL y FRAP se observoacute que los valores de
actividad para los aacutecidos cafeico 2 y gaacutelico 3 fueron superiores a los obtenidos para
sus derivados hiacutebridos 9 y 10 respectivamente En el ensayo frente al anioacuten
superoacutexido se encontroacute que los aacutecidos cafeico 2 y protocateacutequico 4 presentaron
resultados superiores en cuanto a reactividad que sus respectivos derivados hiacutebridos 9
y 11
Resultados y discusioacuten
119
En la literatura se encuentra la caracterizacioacuten de los aacutecidos benzoicos y otros
antioxidantes polifenoacutelicos naturales como moleacuteculas altamente polares lo que en
algunos limita su uso en medios como bio-membranas emulsiones y micelas por lo
que la formacioacuten de sus derivados eacutesteres se utiliza como una estrategia para
aumentar su lipofilia y por lo tanto la biodisponibilidad de estos compuestos en
medios no acuosos169170
investigacioacuten que ha dado origen a la formulacioacuten de los
denominados ldquoantioxidantes lipofiacutelicosrdquo171172
los que han demostrado ser eficientes
como antioxidantes en bio-membranas resultados que se describen en el trabajo
realizado por Tai y colaboradores donde se ensayaron eacutesteres de aacutecido vainilliacutenico
que ademaacutes de presentar buenos valores de iacutendice ORAC-FL inhibieron el proceso
de hemoacutelisis en eritrocitos de mamiacutefero173
Junto con lo anterior estaacute descrita la relacioacuten existente entre la estructura de los
aacutecidos benzoicos y su actividad antioxidante la que es atribuida a diversas
caracteriacutesticas presentes en su esqueleto tales como i) nuacutemero y posicioacuten de grupos ndash
OH en la moleacutecula ii) sustituyentes alcoxilo en posicioacuten orto al ndashOH iii) presencia
de grupos -COOH -COOR -CH=CH-CH2-174
Al apreciar las estructuras de los
derivados propuestos se infiere que las diferencias encontradas en la actividad de los
aacutecidos antes y despueacutes de la unioacuten a la cumarina estaacuten relacionadas con dicha
sustitucioacuten En el caso del aacutecido gaacutelico que presenta un valor de ORAC de 391 frente
a un valor de 174 para su derivado 10 y en el ensayo FRAP se encontroacute un valor de
4768 vs un 3182 para el hiacutebrido se puede sentildealar que no se aprecioacute un aumento de
Resultados y discusioacuten
120
actividad antioxidante para los eacutesteres con respecto al aacutecido del que provienen seguacuten
con lo descrito por algunos autores175176
Junto con lo anterior se forma un eacutester de
aacutecido gaacutelico con un sustituyente voluminoso (la estructura cumariacutenica) pudiendo
disminuir la coplanaridad en el sistema aromaacuteticocarbonilo lo que implica una menor
estabilizacioacuten del radical formado en la reaccioacuten frente a la especie ROObull para el
ensayo ORAC-FL y la capacidad reductora en el ensayo FRAP Otro punto a
considerar es que para este derivado se observa el fenoacutemeno mencionado por Rice-
Evans175
y otros autores con respecto a que un nuacutemero mayor de grupos ndashOH en el
anillo benceacutenico no implica necesariamente un aumento en la actividad antioxidante
de un derivado polifenoacutelico
Para el caso observado en el aacutecido cafeico y su derivado 9 se aprecia el mismo
fenoacutemeno de disminucioacuten de actividad del aacutecido 2 frente al eacutester como lo descrito
para el aacutecido gaacutelico y su derivado en los ensayos ORAC-FL y FRAP con la
diferencia que esta disminucioacuten no es tan draacutestica lo que se atribuye a la presencia del
doble enlace en la estructura que confiere mayor estabilidad por resonancia al radical
formado
El valor de reactividad local del iacutendice de Fukui fk0
-relacionado con los fenoacutemenos
de ataque radicalario- entregoacute informacioacuten con respecto a los sitios de los derivados
donde la actividad anti-radicalaria es maacutes probable Asiacute para el compuesto 9 esta
actividad ocurre en el anillo benceacutenico en primer lugar y posteriormente en la
cumarina Para los derivados 10 y 11 la mayor probabilidad de que se produzca el
Resultados y discusioacuten
121
ataque radicalario es en el heterociclo cumariacutenico y posteriormente en el catecol del
anillo benceacutenico Estos resultados corroboran con los valores experimentales y las
simulaciones realizadas en espectroscopia de resonancia electroacutenica de espiacuten (REE)
donde la actividad antioxidante del compuesto 9 ocurre con mayor probabilidad en el
anillo benceacutenico proveniente de la fraccioacuten del aacutecido cafeico (donde se encuentra el
doble enlace que le confiere mayor estabilidad al radical formado como intermediario
de reaccioacuten) mientras que en los derivados 10 y 11 esta actividad ocurre en el
heterociclo cumariacutenico
Se observa que los resultados de capacidad antioxidante para los derivados
polifenoacutelicos variaron entre un meacutetodo y otro no hubo correlacioacuten entre los valores
obtenidos en la capacidad antioxidante obtenidos en las distintas metodologiacuteas Este
resultado concuerda con lo esperado ya que cada experiencia realizada implica una
especie radicalaria diferente y cada una de ellas posee reactividades distintas (t12 O2-
del orden de los ms t12 OHbull ~ 10-9
s t12 ROObull ~ 10 ms) Para cada ensayo se
obtuvo un distinto orden relativo de reactividad entre los derivados y sus precursores
Se establece la relacioacuten entre el potencial Eonset y los resultados obtenidos en el
ensayo de capacidad antioxidante frente a anioacuten superoacutexido realizado en medio
aproacutetico (Figura 63) Para el ensayo de reactividad frente a O2-
se puede establecer
una correlacioacuten donde una disminucioacuten en el potencial de oxidacioacuten disminuye el
valor de IA50 para 5 de los 7 compuestos estudiados Por tanto a medida que el
Resultados y discusioacuten
122
potencial se hace menos positivo aumenta la reactividad de los compuestos frente al
anioacuten superoacutexido presentaacutendose una relacioacuten entre actividad antioxidante y Eonset
para este ensayo
Figura 63 Correlacioacuten entre el potencial de oxidacioacuten Eonset y los ensayos frente a
anioacuten superoacutexido
Un menor potencial de oxidacioacuten para los grupos ndashOH presentes en los compuestos
implica una mayor facilidad para oxidarse (por ende una mayor densidad de carga
electroacutenica para ceder) y por tanto un incremento en la capacidad antioxidante para
este ensayo
Se puede observar que el compuesto 4 (aacutecido protocateacutequico) posee un valor de IA50
de 0115 mM el cual se encuentra entre los valores encontrados para el aacutecido cafeico
y el aacutecido gaacutelico pero su valor de Eonset es mayor diferenciaacutendose de la tendencia
049 056 063 070 077
006
009
012
015
018
11
3
1
42
9
10
Eonset
vs Ag|AgCl V
IA50
mM
Resultados y discusioacuten
123
encontrada Junto con lo anterior el compuesto 4 presentoacute el menor valor para la
pendiente de Tafel (b = 88 mVdec) de toda la serie lo que sugiere una relacioacuten entre
el mecanismo de oxidacioacuten y la capacidad de reaccionar frente a la especie
radicalaria El compuesto 10 presentoacute el mejor valor para IA50 y tambieacuten se diferencia
de la serie de compuestos con respecto al Eonset (cercano al del compuesto 4) a
diferencia del aacutecido su pendiente de Tafel (b = 134 mVdec) indica la presencia de
dimerizaciones posteriores a la formacioacuten del radical fenoxil (y generacioacuten de
compuestos nuevos que tambieacuten pueden reaccionar con el radical) sugiriendo que
ademaacutes del mecanismo de oxidacioacuten hay otros factores que pueden influir como por
ejemplo la difusioacuten de las especies en el medio empleado
El estudio de los compuestos frente al radical hidroxilo reflejoacute que en las condiciones
experimentales empleadas los resultados fueron semejantes por cuanto los valores de
inactivacioacuten del radical en todos los casos fue sobre el 90 Debido a lo anterior se
descarta realizar la correlacioacuten con el potencial Eonset ya que no encontroacute una
diferencia significativa entre los compuestos
Finalmente al considerar los resultados obtenidos para la capacidad antioxidante
celular en un modelo bioloacutegico simple un punto a tener en cuenta es el hecho de que
esta metodologiacutea en particular adolece en cuanto a que es inespeciacutefica con respecto a
la cantidad de compuesto que ingresa en la ceacutelula ya que por las distintas lipofilias
observadas los compuestos tendraacuten una diferente capacidad de ingreso al medio y no
se puede determinar la relacioacuten existente entre la cantidad que ingresa a la ceacutelula
Resultados y discusioacuten
124
versus la reactividad Debido a lo anteriormente descrito estos resultados muestran
principalmente un reflejo de la capacidad de penetracioacuten que tienen los compuestos
hacia el interior de la ceacutelula
Un modo de abordar temaacuteticas de tipo multi-variable-donde se deben considerar
numerosos factores involucrados en un comportamiento o fenoacutemeno- es el empleo de
modelos teoacuterico-computacionales como QSAR (por su sigla en ingleacutes Quantitative
Structure-Activity Relationships) herramienta que se utiliza en la estimacioacuten de
propiedades bioloacutegicas y fisicoquiacutemicas de intereacutes en diversas moleacuteculas entre ellas
polifenoles177
El factor esteacuterico tiene un papel importante en los estudios realizados en medios
celulares siendo el tamantildeo molecular uno de los factores considerados en ensayos de
permeabilidad en futuros faacutermacos ya que un excesivo tamantildeo (entre otras cosas)
dificulta la solubilidad en medio acuoso asiacute como tambieacuten la difusioacuten pasiva de las
moleacuteculas163
Al observar el peso molecular de los compuestos derivados (entre
34427 gmol y 37031 gmol) se puede considerar que el efecto esteacuterico en este caso
no seriacutea la causa principal para el fenoacutemeno observado en el ensayo celular ya que
estaacute descrito que los compuestos no deberiacutean superar un peso de 500 gmol 163
_que no es el caso de estos derivados-
Los resultados obtenidos para este ensayo realizado en un modelo bioloacutegico simple
sugieren que la actividad de los derivados para reaccionar frente a especies
radicalarias podriacutea estar circunscrita a medios lipofiacutelicos como las membranas
Resultados y discusioacuten
125
bioloacutegicas estudio que se podriacutea profundizar empleando un modelo como el
descrito173
para estudiar procesos oxidativos en membranas de eritrocito
Conclusiones
126
7 Conclusiones
La teacutecnica de electro-oxidacioacuten complementada con espectroscopia de
resonancia de espiacuten electroacutenico (REE) resulta uacutetil para identificar especies
radicalarias como intermediarios de la reaccioacuten en este trabajo
La determinacioacuten del iacutendice de Fukui (fk-) en conjunto con los resultados de
resonancia de espiacuten electroacutenico permitieron discriminar los sitios de las
moleacuteculas donde se inicia el proceso oxidativo En el derivado 9 la oxidacioacuten
ocurre primero en el anillo benceacutenico y en los compuestos 10 y 11 el proceso
oxidativo ocurre primero en el heterociclo cumariacutenico
La inclusioacuten de las estructuras polifenoacutelicas al heterociclo cumariacutenico generoacute
un incremento en su capacidad antioxidante en los ensayos no bioloacutegicos
No se obtuvo correlacioacuten para los resultados de capacidad antioxidante entre
las distintas metodologiacuteas empleadas
Se establecioacute la correlacioacuten entre el valor de potencial de inicio de la reaccioacuten
electroquiacutemica (onset) y los resultados para el ensayo frente al anioacuten
superoacutexido A medida que el potencial se hace menos positivo aumenta la
reactividad de los compuestos lo que indica que la transferencia electroacutenica
estaacute involucrada en la etapa determinante de la velocidad
De acuerdo con los resultados de la teacutecnica CAC y la correlacioacuten tanto con la
hidrofobicidad relativa como con el logDteoacuterico la actividad de los derivados
Conclusiones
127
propuestos estaacute circunscrita a aquellos procesos oxidativos que tienen lugar en
medios lipofiacutelicos como por ejemplo membranas bioloacutegicas
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60327-517-0_16
i
UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS QUIacuteMICAS Y FARMACEacuteUTICAS
INFORME DE APROBACIOacuteN TESIS DE DOCTORADO
Se informa a la Comisioacuten de Postgrado de la Facultad de Ciencias Quiacutemicas y
Farmaceacuteuticas que la Tesis de Doctorado presentada por la Candidata
KARINA ANGEacuteLICA PEacuteREZ CRUZ
ha sido aprobada por la Comisioacuten Evaluadora de Tesis como requisito para obtener el
grado de Doctora en Quiacutemica en el examen de defensa de Tesis rendido el helliphelliphellipde
Diciembre de 2016
Directores de Tesis
Prof Dr Luis J Nuacutentildeez Vergaradagger
Prof Dr Juan Arturo Squella S helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
Prof Patricio A Navarrete E helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
Comisioacuten Evaluadora de Tesis
Prof Dr Antonio Zanocco Loyola (Presidente) helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
Prof Dr Claudio Olea Azar helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
Prof Dra Mariacutea Soledad Ureta Zantildeartu helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
Prof Dr David Pessoa Mahanna helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip
ii
helliprdquoPues dando se recibe
Perdonando se es perdonado
Muriendo se resucita a la vida eternardquo
San Francisco de Asiacutes
iii
Se agradece en forma especial a las siguientes Instituciones por los aportes
financieros recibidos para el desarrollo y teacutermino de esta Tesis
- Conicyt Beca de Doctorado Nacional (2010) Beca de Apoyo de Tesis
(2011) y Beca de Asistencia a Congresos (2013)
- Universidad de Chile por las Becas Mecesup UCh061 (2011) Beca de la
Vicerrectoriacutea de Asuntos Acadeacutemicos (Estadiacuteas cortas de Investigacioacuten 2013)
y a la Facultad de Ciencias Quiacutemicas y Farmaceacuteuticas por Beca de Rebaja
Arancelaria (2015-2016)
- Fondecyt Proyecto ndeg 1110039 Profesor Luis J Nuacutentildeez Vdagger
iv
A G R A D E C I M I E N T O S
Al culminar esta etapa acadeacutemica soacutelo tengo expresiones de profundo
agradecimiento
A Dios -en el cual somos nos movemos y existimos- agradezco la hermosa Familia
que me ha acogido siempre pilar que ha sostenido mi carrera en los diacuteas alegres y en
aquellos aciagos Gracias a mis Padres Joseacute Mariacutea y Elsa por su amor su sabiduriacutea el
apoyo incondicional comprensioacuten y valores entregados desde mi maacutes tierna infancia
gracias por la disciplina y prestancia que me entregaron como legado fruto de una
educacioacuten esmerada empapada de Fe y conviccioacuten tesoros que van en mi espiacuteritu
siempre A mi hermana Andrea y mi cuntildeado Juan gracias por su carintildeo todo su
apoyo y comprensioacuten Tiacuteas Mary Florita y Carmen gracias por estos antildeos de amor
alegriacutea y entrega
Agradezco a mis Profesores Tutores Al Dr Luis Nuacutentildeez V vaya mi maacutes sentido
reconocimiento por invitarme a ser parte de su Investigacioacuten y entregarme
herramientas valiosas en mi formacioacuten de pre y posgrado gracias por la confianza
que depositoacute en miacute por la acogida y comprensioacuten que me brindoacute en tiempos
complejos instancias que siempre conservareacute en mi memoria
A los Profesores Dr J Arturo Squella S y Patricio Navarrete E expreso mi sincero
agradecimiento por su guiacutea y orientacioacuten en este proceso gracias por su acogida y
todos sus aportes para que este trabajo llegase a feliz teacutermino
Expreso mi gratitud a los Profesores Dr Domingo Gonzaacutelez A y Manuel Domiacutenguez
P de la Facultad de Quiacutemica de la Universidad de Sevilla por recibirme en su grupo
de trabajo y compartir parte de esta Investigacioacuten Tener la oportunidad de viajar y
haber conocido y compartido ese corto tiempo de estadiacutea con el Profesor Domingo ha
sido una de las experiencias maacutes valiosas educativas y formativas que conservo de
este periacuteodo como doctorando Gracias por su amistad
Deseo expresar mi agradecimiento a los Profesores de la Comisioacuten Examinadora a la
Dra Soledad Ureta Z por su tiempo buena disposicioacuten y valiosos aportes a este
trabajo al Dr Antonio Zanocco L por sus aportes realizados a este trabajo y su
buena voluntad al Dr David Pessoa M gracias por sus ideas y aportes realizados en
cada instancia En forma especial quiero agradecer al Dr Claudio Olea A quien
junto con ser parte de esta Comisioacuten me abrioacute generosamente las puertas de su
Laboratorio para aprender y desarrollar diversas teacutecnicas aplicadas en esta Tesis lo
cual fue un hermoso aporte Muchas gracias por su confianza por integrarme como
una alumna maacutes por su tiempo paciencia y por todos los momentos alegres que
compartiacute con su grupo Muchas gracias a sus alumnos ex-alumnos y miembros del
Laboratorio al Dr(c) Mauricio Moncada por su dedicacioacuten carintildeo y ensentildeanza en
este proceso gracias por la amistad y el apoyo que me ha brindado
v
Al Dr Germaacuten Barriga por los aportes en el tema de estudios teoacutericos al Dr Michel
Lapier por su colaboracioacuten con los estudios en ceacutelulas al Dr Francisco Mura por su
generosidad y colaboracioacuten al Dr Benjamiacuten Aguilera por su simpatiacutea y ayuda con
temas espectroscoacutepicos a la Dra Mariacutea Carolina Zuacutentildeiga y los MC boys Jorge
Beatriz Manuel Camilo Gabriela Estefaniacutea gracias por sus aportes a este trabajo y
los momentos agradables que compartimos Al Profesor Dr Javier Morales vaya mi
agradecimiento por su ayuda en el estudio y caracterizacioacuten de mis compuestos
Gracias a la Profesora Dra Mariacutea Baeacutez C por su colaboracioacuten y disposicioacuten en la
caracterizacioacuten de mis compuestos
Agradezco a todos los compantildeeros de laboratorio que he conocido en diversas
instancias A la Dra Paulina Sierra a Viviana Claudio Julio la Dra Paola Salgado
Camila Daniela Constanza Dr David Vaacutesquez Gracias por los momentos gratos y
su compantildeerismo
Deseo destacar la valiosa contribucioacuten de los funcionarios de la Biblioteca Ceacutesar
Leyton de nuestra Facultad Muchas gracias por la prontitud y agilidad en su servicio
que siempre ha sido de muy buen nivel
Agradezco ademaacutes la valiosa colaboracioacuten de las Secretarias de Decanato Sra
Cecilia Pinchetti y Ximena Berriacuteos Gracias por su siempre buena disposicioacuten
gentileza y voluntad con cada detalle de todo este proceso
Mi agradecimiento para todo el personal de Secretariacutea de Posgrado por su gestioacuten y
colaboracioacuten en todo el proceso acadeacutemico
vi
INDICE
Informe de aprobacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip i
Agradecimientoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip iii
Iacutendicehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip vi
Iacutendice de figuras y tablashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip x
Glosariohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip xvi
Resumenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip xviii
Summaryhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip xx
1 Introduccioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 1
11 Cumarinashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 1
111 Origen vegetalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 1
112 Rutas de siacutentesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 2
113 Principales aplicacioneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 4
12 Compuestos polifenoacutelicoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 9
121 Origen vegetalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 9
122 Actividad bioloacutegicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 10
123 Polifenoles como antioxidanteshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 11
13 Compuestos hiacutebridoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 13
vii
131 Cumarinas como estructuras hiacutebridashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 15
2 Hipoacutetesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
3 Objetivoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
31 Objetivos generaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
32 Objetivos especiacuteficoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
4 Materiales y meacutetodoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 23
41 Materialeshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24
411 Reactivos y equipamiento utilizado en siacutentesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24
412 Reactivos y equipamiento utilizados en electroquiacutemicahelliphelliphelliphelliphellip 25
413 Reactivos y equipamiento utilizados en ensayos frente a especies
radicalariashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27
42 Meacutetodoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 28
421 Procedimientos de siacutentesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 28
422 Procedimientos en electroquiacutemicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 37
423 Estudio de generacioacuten de especies radicalarias mediante
espectroscopia de resonancia de espiacuten electroacutenico (REE)helliphelliphelliphelliphellip 38
424 Procedimiento experimental en el estudio de reactividad
frente a especies radicalariashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39
4241 Metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales
de oxiacutegeno (ORAC-FL)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39
4242 Metodologiacutea de capacidad reductora de hierro en plasma
(FRAP)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42
viii
4243 Capacidad de apagamiento del radical hidroxilo (OHmiddot)
mediante la teacutecnica spin traphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 44
4244 Estudio de reactividad frente al anioacuten radical superoacutexido O2bull-helliphelliphellip 45
4245 Estudio de la capacidad antioxidante celular (CAC)helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 47
4246 Estudio de hidrofobicidad relativa helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 48
4247 Estudio teoacuterico caacutelculo del Iacutendice de Fukui fkhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 49
5 Resultados y discusioacuten helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 50
51 Siacutentesis de los compuestoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 50
52 Estudios electroquiacutemicoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 54
53 Estudio de generacioacuten de especies radicalarias mediante espectroscopia
de resonancia de espiacuten electroacutenico (REE)helliphelliphelliphelliphellip 70
54 Resultados y discusioacuten de los estudios de reactividad
frente a especies radicalariashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 74
541 Metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales
oxiacutegeno-fluoresceiacutena (ORAC-FL)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 74
542 Metodologiacutea de capacidad reductora de hierro en plasma
(FRAP )helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 82
543 Determinacioacuten de capacidad de apagamiento del radical OHmiddot
teacutecnica spin trappinghelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 86
544 Estudio de reactividad frente al anioacuten radical superoacutexido O2bull-helliphelliphellip 94
545 Determinacioacuten de capacidad antioxidante celular (CAC)helliphelliphelliphelliphellip 100
546 Estudio de hidrofobicidad relativa helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 102
ix
547 Estudio teoacuterico caacutelculo del Iacutendice de Fukui fkhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 108
6 Discusioacuten generalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 113
7 Conclusiones helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 124
8 Bibliografiacuteahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 126
x
Iacutendice de figuras y tablas
Figuras
Figura 1 Esquema de los compuestos estudiados
Figure 1 Scheme of studied compounds
Figura 11 Estructura de la 2H-1-benzopiran-2-ona (cumarina)
Figura 12 Esquema general de la reaccioacuten de Pechmann
Figura 13 Estructura de la 33rsquo-metilenbis(4-hidroxicumarina) o dicumarol
Figura 14 Estructura de la suksdorfina
Figura 15 Estructura del hiacutebrido cumarina-flavona aislado de su fuente vegetal
Gnidia socotrana
Figura 16 Estructura del antibioacutetico hiacutebrido novobiocina metabolitos secundarios
en la especie Streptomyces
Figura 17 Hiacutebridos chalcona-cumarina con capacidad antioxidante
Figura 41 Aacutecidos empleados en la sustitucioacuten de la 4-clorometil-78-
dihidroxicumarina
Figura 42 Siacutentesis del derivado clorado 1
Figura 43 Siacutentesis del derivado clorado acetilado 5
Figura 44 Siacutentesis del aacutecido cafeico acetilado 6
Figura 45 Siacutentesis del aacutecido gaacutelico acetilado 7
Figura 46 Siacutentesis del aacutecido 34-dihidroxibenzoico acetilado 8
Figura 47 Siacutentesis del intermediario hiacutebrido derivado del aacutecido cafeico
xi
Figura 48 Siacutentesis del compuesto hiacutebrido final 9
Figura 49A Ruta de siacutentesis de los compuestos cumariacutenicos i) H2SO4 1 h bantildeo de
hielo ii) NaOH Ac2O 30 min bantildeo de hielo (aacutecido cafeico 6) H2SO4 Ac2O 30
min (cumarina y aacutecidos benzoicos)
Figura 49B Ruta de siacutentesis de los compuestos cumariacutenicos iii) DBU DMF (seca)
35 h 50 degC iv) NaHCO3 MeOH acetona tdeg amb 3 h N2
Figura 410 A Sonda fluoresceiacutena B 22prime-azobis (2-metilpropionamidina)
dihidrochloridrato (ABAP) C 6-hidroxi-2578-tetrametilcroman-2-aacutecido carboxiacutelico
(Trolox)
Figura 411 Actividad antioxidante ORAC para un compuesto en estudio
Figura 412 Reactivo 246-tris(2-piridil)-s-triazina (TPTZ)
Figura 413 Voltamograma ciacuteclico de la generacioacuten de anioacuten radical superoacutexido
DMF+ HFFTBA 02 M en electrodo de carbono viacutetreo
Figura 51A Voltamogramas de pulso diferencial para los precursores 1 2 3 y 4
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 51B Voltamogramas de pulso diferencial para los derivados 9 10 y 11
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 52A VC para el derivado 9 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 53A VC para el derivado 10 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 54A VC para el derivado 1a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 55 Esquema del proceso electro-oxidativo propuesto para el catecol
Figura 56 Relacioacuten Epa vs logv para el derivado de aacutecido cafeico 9 2 mM en
DMF + HFFTBA 02 M
xii
Figura 57 Graacutefica para la corriente de pico Ipa vs la raiacutez cuadrada de la velocidad de
barrido Ejemplo de correlacioacuten lineal en el aacutecido protocateacutequico 4 2 mM en
DMF + HFFTBA 02 M
Figura 58 Determinacioacuten graacutefica del valor de Eonset VC del precursor 1 01 Vs
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 59 Relacioacuten Eonset vs logv para los compuestos estudiados
Figura 510 Correlacioacuten Ipa v12
vs v12
para el precursor aacutecido protocateacutequico 4
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 511A Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido cafeico 9 estabilizado con Zn2+
en DMF+HFFTBA
(izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color
rojo)
Figura 511B Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido gaacutelico 10 estabilizado con Zn2+
en DMF+HFFTBA
(izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color
rojo)
Figura 511C Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido 11 estabilizado con Zn2+
en DMF+HFFTBA (izq)
Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color rojo)
Figura 512 Curvas para el consumo de la sonda Fluoresceiacutena para un set de
concentraciones del compuesto 11
Figura 513 Graacutefica de aacuterea neta bajo la curva ABC vs concentracioacuten del derivado 11
Figura 514 Esquema para la reaccioacuten entre el complejo de Fe3+
y el compuesto
antioxidante reductor
Figura 515 Espin aducto generado por la inactivacioacuten del radical OHbull y su espectro
simulado (derecha)
xiii
Figura 516A Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto 4-clorometil-78-dihidroxicumarina 1 B Espectro REE de inactivacioacuten
del radical hidroxilo con adicioacuten del compuesto aacutecido cafeico 2
Figura 516C Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto aacutecido gaacutelico 3 D Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con
adicioacuten del compuesto aacutecido 34-dihidroxi benzoico 4
Figura 516E Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto hiacutebrido 9 F Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con
adicioacuten del compuesto hiacutebrido 10
Figura 516G Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto hiacutebrido 11
Figura 517 Espectro REE se destaca en rojo el triplete de integracioacuten 121
formado despueacutes de la reaccioacuten de Fenton no-cataliacutetico (izq) Espectro simulado
utilizando el programa EPR-WINSIM (der)
Figura 518 Espectro simulado para la formacioacuten del spin aducto [cumarina-
DMPO] utilizando el programa EPR-WINSIM
Figura 519 Voltamogramas ciacuteclicos del par redox correspondiente al anioacuten
superoacutexido tras antildeadir aliacutecuotas del compuesto 1 DMF + HFFTBA 02 M 01 Vs
Figura 520 Graacutefica del paraacutemetro adimensional (Ipa0-Ipa
S Ipa
0) vs concentracioacuten
de sustrato para el compuesto 1 (Destacado en verde el valor de IA50)
Figura 521 Hidrofobicidad relativa de los derivados y la cumarina precursora
Figura 522 Correlacioacuten entre el valor de logD teoacuterico y CAC experimental a
10 microM de cada compuesto El valor logD se obtuvo a traveacutes de la herramienta Marvin
Sketch del software ChemAxon164
Figura 523 Estructura optimizada en 3D para el precursor 1 utilizando DFT
Figura 524 Estructura optimizada en 3D para el derivado 9 utilizando DFT
Figura 525 Estructura optimizada en 3D para el derivado 10 utilizando DFT
xiv
Figura 526 Estructura optimizada en 3D para el derivado 11 utilizando DFT
Figura 61 Esquema de reaccioacuten para un mecanismo concertado de electro-
oxidacioacuten fenoacutelica Adaptacioacuten referencia 118
Figura 62 Esquema de reaccioacuten para estructuras fenoacutelicas mecanismo electro-
oxidativo en etapas
Figura 63 Correlacioacuten entre el potencial de oxidacioacuten Eonset y los ensayos frente a
anioacuten superoacutexido
xv
Tablas
Tabla 51 Paraacutemetros experimentales para los compuestos Determinaciones en VC
2 mM DMF + HFFTBA 02 M
Tabla 52 Constantes de acoplamiento hiperfino para los derivados polifenoacutelicos
Valores en Gauss
Tabla 53 Valores experimentales de Iacutendice ORAC para los compuestos estudiados
Tabla 54 Valores calculados para el factor estequiomeacutetrico n
Tabla 55 Valores experimentales obtenidos para los compuestos en estudio ensayo
FRAP en equivalentes de Trolox10 microM de muestra
Tabla 56 Porcentajes de inactivacioacuten del radical hidroxilo (OHmiddot)
Tabla 57 Valores de IA50 obtenidos para los compuestos estudiados
Tabla 58 Valores obtenidos para la capacidad antioxidante celular (CAC)
concentraciones 1 microM y 10 microM de cada compuesto
Tabla 59 Valores obtenidos para el tiempo de retencioacuten experimental de los
compuestos
Tabla 510 Valores de Iacutendice de Fukui fk para los compuestos en estudio
Tabla 61 Cuadro comparativo de los resultados en la determinacioacuten de capacidad
antioxidante para la cumarina y sus derivados
xvi
Glosario de abreviaturas
ABAP 22-azo-bis(2-amidinopropan)diclorhidrato
ADN Aacutecido desoxiribonucleico
ATCC American Type Culture Collection
HFFTBA Hexafluorofosfato de tetrabutil amonio
CAC Capacidad antioxidante celular
CYP450 Citocromo P450
DBU 18-diazabiciclo[540]undec-7-ano
DCFH-DA 2-(6-oxido-3-oxo-3H-xanten-9-il)benzoato disoacutedico (fluoresceiacutena sal
disoacutedica)
DMF NN-dimetilformamida
DMPO 55-dimetil-1-pirroline-N-oacutexido
DMSO Dimetil sulfoacutexido
DPPHbull Radical 22-difenil-1-picrilhidrazil
Epa Potencial de pico anoacutedico
EPR Electron paramagnetic resonance
ERNs Especies reactivas de nitroacutegeno
EROs Especies reactivas de oxiacutegeno
xvii
fk Iacutendice de Fukui
FRAP Ferric reducing antioxidant in plasma
HObull Radical hidroxilo
IA50 Iacutendice antioxidante 50
Ipa Corriente de pico anoacutedica
O2˙- Anioacuten radical superoacutexido
ONOObull Radical peroxinitrito
ORAC-FL Oxygen radical antioxidant capacity-fluorescein
PBS Buffer fosfato salino
REE Resonancia de espiacuten electroacutenico
RObull Radical alcoxilo
ROOmiddot Radical peroxilo
TPTZ 246-tris(2-piridil)-s-triazina
Trolox 6-hidroxi-2578-tetrametilcroman-2-aacutecido carboxiacutelico
VC Voltametriacutea ciacuteclica
VPD Voltametriacutea de pulso diferencial
xviii
RESUMEN
Las cumarinas (2H-1-benzopiran-2-ona) son estructuras quiacutemicas presentes en
especies vegetales ampliamente distribuidas en la naturaleza con una reconocida
actividad bioloacutegica entre las que destacan sus propiedades antioxidantes
En el presente trabajo de Tesis se describe la siacutentesis de derivados polifenoacutelicos La
cumarina dihidroxilada como estructura de partida fue esterificada con distintos
aacutecidos orgaacutenicos polifenoacutelicos (Figura 1) Se estudioacute su electro-oxidacioacuten y se evaluoacute
su actividad antioxidante frente a especies reactivas de oxiacutegeno por medio de diversas
metodologiacuteas in vitro
Figura 1 Esquema de los compuestos estudiados
Se estudioacute el comportamiento anoacutedico de los compuestos mediante voltametriacutea
ciacuteclica (VC) y voltametriacutea de pulso diferencial (VPD) en medio aproacutetico como una
aproximacioacuten a los procesos redox que ocurren en membranas bioloacutegicas
Se determinoacute la presencia de especies radicalarias en el proceso electro-oxidativo a
traveacutes de la teacutecnica de resonancia de espiacuten electroacutenico (REE) Las constantes de
OOH
HO O
Cl
HO
OOH
OH
OH
OH
HO
O
OH
OH
OH
HO
OO
OHHO O
OH
OH
O
O
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
xix
acoplamiento hiperfino junto con caacutelculos teoacutericos (iacutendice de Fukui) permitieron
discriminar distintos sitios reactivos en las nuevas moleacuteculas donde se desarrolla el
proceso oxidativo
Ademaacutes se evaluoacute la capacidad antioxidante de los compuestos a traveacutes de los
ensayos capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno-fluoresceiacutena (ORAC-
FL) capacidad antioxidante reductora de hierro (FRAP) apagamiento del radical
hidroxilo mediante spin trapping inactivacioacuten de anioacuten superoacutexido y capacidad
antioxidante celular (CAC) en un modelo bioloacutegico in vitro simple
Para los ensayos antioxidantes no bioloacutegicos la introduccioacuten de las distintas
estructuras fenoacutelicas en el anillo cumariacutenico permite obtener derivados que presentan
una capacidad antioxidante mejor que el precursor cumariacutenico inicial Se establecioacute
la respectiva correlacioacuten entre el potencial de inicio del proceso electroquiacutemico
(potencial onset) y los resultados encontrados en el ensayo en medio aproacutetico frente a
anioacuten superoacutexido
Considerando el ensayo bioloacutegico de capacidad antioxidante celular eacuteste sugiere que
la actividad antioxidante de los nuevos derivados estaacute circunscrita a medios de
naturaleza lipofiacutelica
xx
SUMMARY
Coumarins (2H-1-benzopyran-2-one) are chemical structures from vegetal sources
widely distributed in vegetable species with recognized biological activities among
which their antioxidant capacity
In this Thesis work the syntheses of coumarin polyphenolic derivatives is described
Coumarin was the starter scaffold and it was sterified with different organic phenolic
acids The electro-oxidation of polyphenolic derivatives is studied and their
antioxidant capacity towards ROS through methodologies in vitro is evaluated
Figure 1 Scheme of studied compounds
The anodic behavior of the compounds by cyclic voltammetry (CV) and differential
pulse voltammetry (VPD) was studied in aprotic medium as an approximation to the
redox processes in biological membranes
The presence of radical species is determined in the electro-oxidation process through
the technique electron spin resonance (ESR)The hyperfine coupling constants and
theoretical calculations (Fukui index values) allow to discriminate between the
OOH
HO O
Cl
HO
OOH
OH
OH
OH
HO
O
OH
OH
OH
HO
OO
OHHO O
OH
OH
O
O
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
xxi
different reactive sites in the new molecules where the oxidative process is taking
place
Moreover antioxidant capacity of derivatives was evaluated through oxygen radical
antioxidant assay-fluorescein (ORAC-FL) ferric reducing ability of plasma (FRAP)
spin trapping superoxide scavenging assays and cellular antioxidant (CAC) in a
simple biological model in vitro
In the non-biological antioxidant assays the addition of various phenolic structures to
the coumarin scaffold yielded derivatives with improved antioxidant capacity related
to initial coumarin We studied the correlations between the starting potential of the
electrochemical process (onset potential) and the antioxidant results obtained in
aprotic media against superoxide anion
In regard to the biological cellular antioxidant capacity assay it suggests that the
antioxidant activity of new derivatives could be limited to lipophilic media
Introduccioacuten
1
1 Introduccioacuten
11 Cumarinas
111 Origen vegetal
Las cumarinas son una familia de compuestos cuya estructura baacutesica corresponde a la
lactona heterociacuteclica 2H-1-benzopiran-2-ona (Figura 11) En el reino vegetal estaacuten
ampliamente distribuidas habieacutendose identificado en la actualidad maacutes de 1800
cumarinas de origen natural1 eacutestas se encuentran principalmente como metabolitos
secundarios en diversas plantas tanto en sus semillas como en hojas y raiacuteces2 Su
biosiacutentesis es descrita por distintos autores como una serie de procesos catalizados
por enzimas presentes en la estructura CYP450 (citocromo P450) en algunos casos
estos compuestos son generados en la ceacutelula vegetal como una viacutea de defensa
(fitoalexinas como la escopoletina) frente a estiacutemulos de estreacutes y la presencia de fito-
patoacutegenos34
O O
3
45
6
7
81
2
Figura 11 Estructura de la 2H-1-benzopiran-2-ona (cumarina)
Introduccioacuten
2
El nombre de estos compuestos se deriva de la palabra ldquocoumarourdquo vocablo
caribentildeo que hace referencia al aacuterbol de Tonka originario de Sudameacuterica de cuya
semilla A Vogel logra aislar el compuesto y publicar su hallazgo en 18205b
A partir
de entonces el intereacutes por su caracterizacioacuten6 la obtencioacuten tanto desde fuentes
naturales7 como por rutas sinteacuteticas de la cumarina y sus derivados ha ido en
aumento encontrando su primera aplicacioacuten en la fabricacioacuten de perfumes En 1868
W H Perkin propuso la siacutentesis de una fragancia vegetal a partir de la sal soacutedica del
orto-hidroxibenzaldehiacutedo y anhiacutedrido aceacutetico obteniendo el mismo producto aislado
de la semilla de Tonka5 8(ac)
Se han estudiado los aspectos taxonoacutemicos en cuanto a la clasificacioacuten de las especies
vegetales que contienen compuestos cumariacutenicos se estima que las principales
familias donde se encuentran estos derivados son Umbelliferae Rutaceae
Leguminosae Compositae Caryopgillaceae Euphorbiaceae Hipocastanaceae
Oleaceae Thymelaeaceae8b
112 Rutas de siacutentesis
Los autores Sethna y Narsinh9 presentaron en 1944 una de las primeras revisiones del
estado del arte con respecto a la siacutentesis de cumarinas En ella se encuentran las
principales metodologiacuteas claacutesicas de obtencioacuten como la siacutentesis de Perkin
Pechmann10
y Pechmann-Duisberg11
(Figura 12) en la que se obtiene la cumarina al
Introduccioacuten
3
condensar un fenol con un β-cetoester en medio aacutecido Diversas publicaciones
plantean modificaciones a esta ruta con catalizadores12 (ab)
libre de solventes13 (ab)
con promotores aacutecidos14
asistida por microondas15
entre otras
Figura 12 Esquema general de la reaccioacuten de Pechmann
Otra metodologiacutea empleada es la de Knoevenagel16
propuesta en 1898 Consiste en
una reaccioacuten de condensacioacuten entre o-hidroxialdehiacutedos con malonato de etilo
acetoacetato de etilo o cianoacetato de etilo en medio baacutesico (piridina o piperidina)
Los autores Bigi y colaboradores17
describen el uso de un catalizador en base a
montmorillonita para la obtencioacuten de cumarinas sustituidas en posicioacuten 3 con un
grupo aacutecido Posteriormente otro grupo de trabajo (Shaabani 2009) llevoacute a cabo esta
condensacioacuten empleando radiacioacuten de microondas lo que les permitioacute obtener buenos
rendimientos en un medio ldquoamigablerdquo con el ambiente18
Se han descrito otras metodologiacuteas sinteacuteticas en las cuales se utilizan las reacciones
claacutesicas de Wittig19 ab
y Reformatsky20
ademaacutes de otras rutas con variantes tanto en
los reactivos como en el medio de reaccioacuten que permiten la obtencioacuten de derivados
OH
+
OEt
O O H2SO4
O O
Introduccioacuten
4
cumariacutenicos como la siacutentesis en presencia de bases fuertes21
reacciones libres de
solventes22
y la obtencioacuten de cumarinas policiacuteclicas utilizando compuestos
organometaacutelicos descrita por Harvey y cols23
113 Principales aplicaciones
Tras ser aisladas desde su fuente vegetal y como resultado de investigaciones
posteriores dirigidas a generar rutas sinteacuteticas viables las cumarinas han sido objeto
de numerosos estudios enfocados en la buacutesqueda de sus aplicaciones Es asiacute como en
la literatura se pueden encontrar las maacutes diversas investigaciones para este tipo de
compuestos provenientes tanto de productos de siacutentesis o como extractos de
vegetales y plantas con reconocidas propiedades en la medicina tradicional esto da
origen al estudio de sus bio-aplicaciones entre las que se destaca su capacidad como
antioxidante
A Actividad bioloacutegica
La primera aplicacioacuten en bio-medicina descrita para las cumarinas fue como
anticoagulante desde que se aislara y caracterizara el dicumarol 33rsquo-metilenbis(4-
hidroxicumarina) (Figura 13) Posteriormente aparece en el mercado su derivado
Introduccioacuten
5
sinteacutetico conocido como Warfarina que hasta la deacutecada pasada era considerado uno
de los faacutermacos anticoagulantes maacutes vendidos en Estados Unidos24 a-c
OOOO
OH HO
Figura 13 Estructura de la 33rsquo-metilenbis(4-hidroxicumarina) o dicumarol
Con posterioridad el uso de las cumarinas se ha diversificado hacia innumerables
blancos terapeacuteuticos En la literatura se describen variados estudios con respecto a sus
propiedades farmacoloacutegicas25ab
Su capacidad como agente antitumoral 26ab
se ha
estudiado en compuestos provenientes tanto de fuentes vegetales como sinteacuteticas
Riveiro ME y cols estudiaron el efecto de la 78-OH-4-metilcumarina en ceacutelulas
humanas afectadas por leucemia evidenciando el potencial que presentoacute este
derivado dihidroxilado27
En otra investigacioacuten realizada por C Ito y colaboradores
aislaron tres derivados cumariacutenicos de la especie vegetal Murraya siamensis cuyos
ensayos frente a ceacutelulas tumorales resultaron promisorios28
Con respecto a las propiedades antiinflamatorias de las cumarinas en la naturaleza se
encuentran especies como la Chamomilla recutita (manzanilla) que contiene un tipo
Introduccioacuten
6
de umbeliferona con tales propiedades En la literatura se encuentran derivados
sinteacuteticos desarrollados en cuya estructura estaacute presente el esqueleto cumariacutenico29
Lin y cols presentan los resultados de su estudio de la capacidad antiinflamatoria de
un conjunto de cumarinas los cuales fueron ademaacutes correlacionados con los
obtenidos para el apagamiento del radical hidroxilo30
HA El-Wahab y cols sintetizaron distintas tiazolo-cumarinas hiacutebridas y estudiaron
una de sus propiedades farmacoloacutegicas como agente antimicrobiano Estos
compuestos posteriormente fueron aplicados como aditivos en recubrimientos de
poliuretano confirieacutendoles tambieacuten esta propiedad microbicida a las superficies en
las que se utilizoacute31
Tambieacuten se han descrito derivados cumariacutenicos con propiedades anti-fuacutengicas 32ab
Un trabajo reciente presenta el estudio de complejos en base a Ni(II) Cu(II) y
Co(II)frente a distintas especies de hongos (Candida A niger Rhizopus)32c
Tambieacuten se han encontrado estructuras cumarina-glucoacutesidos provenientes de especies
vegetales (Hydrangea paniculata) que presentan propiedades hepatoprotectoras33
Otros estudios sentildealan tambieacuten la importancia de las estructuras cumariacutenicas como
compuesto antiviral analgeacutesico anti-tromboacutetico ulcerogeacutenico 25 34-36
inclusive con
potencial para ser usadas en terapias frente al VIH como lo sentildeala la investigacioacuten
sobre especies vegetales que contienen dipiranocumarin - calanolideos como
Introduccioacuten
7
principio activo25a
estudios que tambieacuten se han realizado con derivados de siacutentesis
disentildeados a partir de la estructura de origen vegetal (Lomatium suksdorfii) conocida
como suksdorfina (Figura 14) a partir de la cual se han generado compuestos
anaacutelogos con el objeto de estudiar su modo de accioacuten y obtener sustratos cada vez
maacutes potentes frente a la enfermedad (Yu D y cols 2003)37
O OO
O
O
OO
Figura 14 Estructura de la suksdorfina
B Propiedades antioxidantes
El equilibrio en los organismos vivos es funcioacuten de diversos factores entre ellos cabe
mencionar el balance de las especies que generan estreacutes oxidativo dentro del medio
celular estas especies pueden ser de origen endoacutegeno como las provenientes de la
cadena transportadora de electrones enzimas oxidantes ceacutelulas fagociacuteticas o de
origen exoacutegeno como sustancias reductoras oxidacioacuten de drogas tabaquismo
ultrasonido luz solar etc Entre los compuestos que generan estreacutes conocidos como
Introduccioacuten
8
EROs y ERNs (especies reactivas de oxiacutegenonitroacutegeno) se pueden mencionar el
anioacuten superoacutexido (O2˙-) peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2) radical peroxilo (ROObull) y
alcoxilo (RObull) radical hidroxilo (HObull) oacutexido niacutetrico (NObull) peroxinitrito (ONOObull)
entre otras
Dentro de este contexto en la literatura se ha descrito el potencial que poseen las
cumarinas y sus derivados como compuestos capaces de interaccionar con especies
reactivas de oxiacutegeno y nitroacutegeno lo que da cuenta de su capacidad antioxidante tema
relevante si se considera que parte importante de las patologiacuteas conocidas y
estudiadas en la actualidad a nivel mundial estaacuten iacutentimamente ligadas a cuadros de
estreacutes oxidativo presentes en el organismo 38 39
Payaacute y colaboradores presentaron un trabajo en el cual se estudia la reactividad de un
conjunto de dieciseacuteis cumarinas (naturales y sinteacuteticas) frente al radical hidroxilo
aacutecido hipocloroso y anioacuten superoacutexido encontrando que los derivados di-hidroxilados
poseiacutean mejores propiedades que aquellos mono-hidroxilados o sin sustitucioacuten40
Estos resultados se complementan con una publicacioacuten posterior del mismo grupo en
que se profundiza el estudio anterior sentildealando las propiedades terapeacuteuticas de los
derivados cumariacutenicos34
El derivado conocido como esculetina (67-dihidroxicumarina) fue ensayado frente al
radical DPPH junto con ensayos de estreacutes oxidativo en medios de cultivo celular
Introduccioacuten
9
estos autores sentildealan la importancia de los grupos catecol en su capacidad de atrapar
especies radicales (Kim y cols 2008)41
Otro estudio en el que se ensaya un extracto
vegetal (Cortex Fraxini) relaciona ademaacutes la capacidad antioxidante de las o-
dihidroxi cumarinas con su capacidad reductora42
Zhang y cols presentan un estudio reciente en el cual cumarinas dihidroxiladas en
posicioacuten 7 y 8 entre otros derivados poseen importante bio-actividad in vitro los
compuestos fueron ensayados frente a especies radicales en ceacutelulas tumorales
presentaron ademaacutes actividad como antiinflamatorios y baja toxicidad tanto en
ceacutelulas sanguiacuteneas de vertebrado como de invertebrado Junto con lo anterior se
realizoacute un anaacutelisis de estructura-reactividad correlacionando la capacidad de
apagamiento de radicales con las propiedades antiinflamatorias y antitumorales de los
derivados cumariacutenicos encontradas en esta investigacioacuten43
12 Compuestos polifenoacutelicos
121 Origen vegetal
Los polifenoles al igual que las cumarinas son una amplia familia de compuestos (se
han encontrado maacutes de 8000 de ellos) presentes en estructuras vegetales como
metabolitos secundarios cumpliendo roles tales como protector frente a radiacioacuten
UV reguladores de los ciclos de crecimiento pigmentacioacuten y defensa frente a
Introduccioacuten
10
depredadores Su estructura baacutesica es el anillo benceacutenico con sustituyentes hidroxilo
(-OH) en distintas posiciones Se clasifican en flavonoides aacutecidos fenoacutelicos
(hidroxicinaacutemicos e hidroxibenzoicos) taninos estilbenos Debido a sus interesantes
propiedades y bio-aplicaciones estos fitoquiacutemicos han sido objeto de diversos
estudios investigacioacuten y caracterizacioacuten44-46
Estos compuestos son un constituyente importante de la dieta diaria se encuentran en
forma abundante en diversos frutos como por ejemplo berries manzana mango uva
pera granada y ciacutetricos en bebidas como el vino teacute y cafeacute 47
en vegetales cereales
y semillas Junto con lo anterior se ha descrito la utilizacioacuten de aacutecidos polifenoacutelicos
provenientes de extractos vegetales y aceites esenciales como aditivos en la industria
alimentaria aplicados como preservantes naturales en reemplazo de aquellos de
origen sinteacutetico debido a las propiedades antimicrobianas que exhiben48
122 Actividad bioloacutegica
Estos compuestos se conocen tambieacuten como ldquobiofenolesrdquo (Romeo y Uccella 1996)
haciendo referencia a aquellos provenientes de fuentes naturales Las primeras
publicaciones sobre los polifenoles en general comenzaron en la deacutecada de 1950 con
la investigacioacuten de D Harman y su teoriacutea del envejecimiento y los radicales libres
estudios en los que se planteoacute prolongar la sobrevida en especies roedores enfermos a
traveacutes de la ingesta de biofenoles presentes en su dieta Es asiacute que el nuacutemero de
publicaciones concernientes al tema se incrementoacute de una treintena (entre 1900 y
Introduccioacuten
11
1950) hasta superar las 35000 publicaciones entre los antildeos 2000-2010 lo que da
cuenta del creciente intereacutes en este toacutepico49
La bio-actividad de los compuestos polifenoacutelicos es amplia se encuentran diversos
estudios como el citado anteriormente con respecto a las capacidades antimicrobianas
de los polifenoles y su uso en la industria alimentaria5051
Compuestos como la
curcumina resveratrol quercetina y derivados del aacutecido gaacutelico se enumeran dentro de
las investigaciones realizadas tanto in vitro e in vivo en la prevencioacuten del caacutencer
(Cimino y cols 2012)52
Otras propiedades descritas para estos compuestos son como cardio-protectores anti-
canceriacutegenos antiinflamatorios vaso-relajantes entre otras como lo resume el
artiacuteculo de Xia y cols (2010) En eacutel ademaacutes se presenta una revisioacuten en cuanto a los
meacutetodos de extraccioacuten purificacioacuten y caracterizacioacuten del contenido y tipos de
polifenoles especiacuteficamente en el caso de la uva fruto reconocido por su alto
contenido de fitoquiacutemicos y nutrientes53
123 Polifenoles como antioxidantes
Los polifenoles como micronutrientes presentes en los alimentos y otras estructuras
vegetales han sido un foco de intereacutes ya que sus aplicaciones terapeacuteuticas estaacuten
relacionadas con su reconocida e investigada capacidad antioxidante y quelante de
metales Con respecto a esta uacuteltima cabe mencionar la revisioacuten del estado del arte
Introduccioacuten
12
realizada por Kozlowski y cols con respecto al desbalance de Cu Zn y Fe en el
organismo en ella se indica que la presencia libre y en exceso de estos metales estaacute
directamente relacionada con patologiacuteas neurodegenerativas y caacutencer entre otras ya
que su actividad redox genera especies reactivas capaces de atacar sustratos orgaacutenicos
como la membrana lipiacutedica proteiacutenas y aacutecido desoxiribonucleico (ADN)54
Ribeiro y colaboradores presentan un estudio en el que se determina el contenido
polifenoacutelico de la especie Fistulina hepaacutetica Los extractos se ensayaron frente a
DPPH anioacuten superoacutexido radical hidroxilo y aacutecido hipocloroso Los autores plantean
que considerando los resultados obtenidos esta especie fuacutengica podriacutea tener
aplicacioacuten como suplemento o como antioxidante en la industria alimentaria55
Estudios realizados con aacutecido taacutenico comercial sentildealan que su capacidad como
antioxidante y como quelante de hierro da cuenta del potencial que tiene este aacutecido
ademaacutes como anti-mutageacutenico y anti-carcinogeacutenico Los autores indican posibilidad
de que este aacutecido el cual presenta baja toxicidad contribuye en el apagamiento de
especies reactivas de oxiacutegeno dantildeinas a nivel de ADN (Andrade y cols 2006)56
trabajo que se complementa con una publicacioacuten anterior del mismo grupo donde se
estudioacute el apagamiento del radical OHbull mediante complejos de aacutecido taacutenico-Cu
(Andrade y cols 2005)57
Los aacutecidos hidroxicinaacutemicos e hidroxibenzoicos han sido tambieacuten objeto de estudio
debido a su capacidad antioxidante58-61
Jeong y colaboradores estudiaron el extracto
de la especie vegetal Erigeron annuus el cual contiene aacutecido cafeico en su fraccioacuten
Introduccioacuten
13
butanoacutelica este extracto fue ensayado como agente neuro-protector y antioxidante en
ceacutelulas nerviosas Frente a los resultados obtenidos los autores concluyen que este
extracto podriacutea ser utilizado en terapias frente a patologiacuteas neurodegenerativas como
el Alzheimer62
Otro estudio de capacidad antioxidante realizado a un grupo de
compuestos polifenoacutelicos presentes en el propoacuteleo (aacutecido cafeico aacutecido feruacutelico
ferulato de etilo eacutester fenetiacutelico del aacutecido cafeico) sentildeala que los grupos catecol
presentes en las estructuras ensayadas incrementan la capacidad antioxidante
mientras que en estudios relacionados con bio-membranas se debe tener en cuenta
ademaacutes la hidrofobicidad que presenten los compuestos63
13 Compuestos hiacutebridos
Al considerar que las diversas enfermedades que afectan al ser humano (caacutencer
diabetes enfermedades neurodegenerativas artritis entre otras) involucran diferentes
factores patogeacutenicos se han desarrollado estrategias sinteacuteticas que permiten obtener
nuevos faacutermacos de naturaleza hiacutebrida los cuales incorporan en su estructura
distintos ingredientes activos64
Este disentildeo ldquomulti-blancordquo ha permitido que los
nuevos faacutermacos actuacuteen en distintos blancos terapeacuteuticos este tipo de terapias
implica una disminucioacuten en los problemas asociados a una multi-dosificacioacuten las
interacciones entre distintos medicamentos una disminucioacuten en la resistencia a los
faacutermacos (en el caso de enfermedades de origen microbiano) disminucioacuten en los
efectos adversos derivados de la dosificacioacuten muacuteltiple por mencionar algunos
Introduccioacuten
14
Diversas investigaciones sobre el tema dan cuenta de la relevancia que ha tenido esta
estrategia y el disentildeo racional de nuevos medicamentos65-68
La revisioacuten realizada por
los autores Mehta y Singh (2002) menciona algunos de los esqueletos que han dado
origen a estructuras hiacutebridas entre ellas esteroides antraciclinas β-lactamas
fullerenos carbohidratos-peacuteptidos En esta revisioacuten se indica el uso de este tipo de
compuestos en terapias contra el caacutencer y como neuro-protectores69
En el caso de la malaria una de las enfermedades infecciosas maacutes complejas a nivel
mundial la resistencia del paraacutesito del geacutenero Plasmodium frente a los faacutermacos
empleados (cloroquina principalmente) ha sido un tema de estudio durante antildeos Una
resentildea de este desafiacuteo se presenta en el artiacuteculo de Kouznetsov y Goacutemez-Barrio
(2009) en el que se sentildeala la siacutentesis de derivados de aminoquinolina como las
trioxaquinas70
las cuales se presentan posteriormente en una revisioacuten realizada por
Chauhan y colaboradores en ella se destaca a estos hiacutebridos como candidatos
promisorios para la formulacioacuten de nuevas drogas antimalaacutericas71
Otra patologiacutea en la que se ha utilizado faacutermacos de naturaleza hiacutebrida que en
algunos casos provienen de productos naturales es el caacutencer72
Allen y
colaboradores73
mencionan en una reciente revisioacuten de tecnologiacuteas avanzadas en las
que ademaacutes de utilizar la estrategia de compuestos hiacutebridos con dos estructuras de
propiedades anticanceriacutegenas eacutestos se combinan con nano-estructuras orientadas a
Introduccioacuten
15
blancos especiacuteficos para asiacute disminuir el riesgo de efectos colaterales en el
tratamiento de esta compleja patologiacutea
Este concepto y disentildeo de faacutermacos multi-blanco se ha aplicado ademaacutes en distintas
terapias frente a enfermedades como el Alzheimer74
en vacunas de amplio espectro
frente al coacutelera75
en la siacutentesis de compuestos antiparasitarios76
y de dihidropiridinas
las cuales poseen actividad vasodilatadora77
por mencionar algunos ejemplos
131 Cumarinas como estructuras hiacutebridas
Al considerar el estado del arte con respecto a la amplia y variada actividad bioloacutegica
que presentan los derivados cumariacutenicos se encuentra que otra de las aplicaciones que
se ha estudiado para esta familia de compuestos es su capacidad para formar parte de
estructuras hiacutebridas complejas compuestos orientados a la obtencioacuten faacutermacos multi-
blanco que den respuesta a los interrogantes y desafiacuteos actuales con respecto a
importantes patologiacuteas y sus terapias 78
En la literatura se describen ejemplos de estructuras cumariacutenicas hiacutebridas no soacutelo de
origen sinteacutetico sino que tambieacuten se pueden extraer desde su fuente natural Un
estudio realizado en hojas y ramas de la especie Gnidia socotrana (originaria de
Yemen) da cuenta de la presencia de estructuras flavona-cumarina las que fueron
extraiacutedas purificadas y caracterizadas79
(Figura 15)
Introduccioacuten
16
O
OH
HO O
OH
O
O
OH
Figura 15 Estructura del hiacutebrido cumarina-flavona aislado de su fuente vegetal
Gnidia socotrana
Entre los compuestos antibioacuteticos de origen natural que poseen el esqueleto
cumariacutenico en su estructura se encuentran la novobiocina (Figura 16) clorobiocina y
cumermicina Presentes como metabolitos secundarios en la especie Streptomyces
estos derivados deben su actividad antibioacutetica a que actuacutean inhibiendo la enzima
ADN girasa presente en bacterias impidiendo su replicacioacuten y ademaacutes genera su
muerte celular80
O
HN
OH
O
OH
O
O
MeOO
H2N
HO
Figura 16 Estructura del antibioacutetico hiacutebrido novobiocina metabolitos secundarios
en la especie Streptomyces
Introduccioacuten
17
Se ha descrito tambieacuten la capacidad antitumoral de derivados cumarina-resveratrol a
partir del precursor 7-hidroxicumarina En la publicacioacuten de Belluti y colaboradores
se presentan los ensayos realizados para 10 compuestos los cuales tuvieron como
objeto ceacutelulas tumorales de pulmoacuten humano dos de los hiacutebridos presentaron
resultados promisorios como antitumorales y pro-apoptoacuteticos comportamiento que
los autores concluyen tiene relacioacuten con la posicioacuten de los sustituyentes en la
moleacutecula81
La revisioacuten bibliograacutefica de Longhin y colaboradores describe diversas estructuras
hiacutebridas desarrolladas que cuentan con capacidad antiinflamatoria toacutepico de intereacutes si
se considera que los cuadros inflamatorios estaacuten relacionados a dolencias como el
Alzheimer asma arterioesclerosis artritis reumatoide caacutencer etc En este trabajo se
sentildeala al hiacutebrido cumarina-aacutecido lipoico donde ambas estructuras poseen ademaacutes
reconocida capacidad antioxidante y el aacutecido unido a la cumarina en posicioacuten 3
mediante un espaciador es la estructura que se describe con una actividad superior al
conocido y utilizado faacutermaco indometacina82
Junto con los estudios descritos otra importante aacuterea de investigacioacuten ha sido el
desarrollo de estructuras hiacutebridas con capacidad antioxidante (Koufaki 2006)83
actividad que permite en muchos casos restablecer el equilibrio en organismos vivos
frente al exceso de especies generadoras de estreacutes oxidativo cuadro que como ya se
Introduccioacuten
18
mencionoacute estaacute con frecuencia asociado las patologiacuteas conocidas y estudiadas en la
actualidad
El reciente estudio desarrollado por Matos Olea-Azar y colaboradores presenta la
estructura cumarina-resveratrol y diferentes derivados sinteacuteticos los cuales fueron
estudiados mediante diversas teacutecnicas in vitro como resonancia de espiacuten electroacutenico
(REE) capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno (ORAC-FL) y
voltametriacutea ciacuteclica (VC) En esta investigacioacuten se encontroacute que los compuestos
propuestos poseen una buena capacidad antioxidante84
Una investigacioacuten que da cuenta del potencial que posee esta estrategia es la
desarrollada por Kenchappa y colaboradores quienes sintetizaron derivados
cumariacutenicos unidos a pirazol e indenona posteriormente mediante estudios in vitro e
in vivo obtuvieron resultados de su capacidad antioxidante y ademaacutes como agentes
anti-hipergliceacutemicos en un modelo animal proyectaacutendolos como posibles faacutermacos
frente a la diabetes85
Dentro del mismo esquema Krishan y colaboradores
desarrollaron una serie de cumarinas unidas al benzoimidazol el cual es a su vez una
estructura con muacuteltiple y reconocida actividad bioloacutegica proponen a dos compuestos
de la serie como derivados con una buena capacidad antioxidante y anti-inflamatoria
a nivel de mucosa gaacutestrica86
Introduccioacuten
19
Un tipo de derivado hiacutebrido que ha sido estudiado es la cumarina-chalcona El trabajo
realizado por Xi y Liu presenta la siacutentesis de una serie de compuestos (Figura 17)
los que posteriormente son ensayados por distintas metodologiacuteas de determinacioacuten de
capacidad antioxidante concluyendo que estos hiacutebridos son estructuras promisorias
en los que el grupo catecol presente en el esqueleto cumariacutenico o en la chalcona es
capaz de inhibir distintos procesos oxidativos a nivel de ADN87
O O
OH
O
R1
R2
R3
Figura 17 Hiacutebridos chalcona-cumarina con capacidad antioxidante
Peacuterez-Cruz y colaboradores describen el disentildeo siacutentesis y estudio de la capacidad
antioxidante de derivados cumarina-chalcona los que presentaron buena reactividad
frente a distintas especies radicales y capacidad cito-protectora en un modelo celular
animal88
En los estudios mencionados se evidencia el continuo desarrollo que ha tenido el
disentildeo y siacutentesis de compuestos hiacutebridos como nuevos faacutermacos frente a complejas
Introduccioacuten
20
enfermedades multifactoriales Esta tendencia vigente en la actualidad se extiende a
los maacutes variados nuacutecleos estructurales entre ellos la cumarina Este heterociclo
clasificado por algunos autores como ldquoestructura privilegiadardquo debido a la amplia
gama de compuestos que se originan a partir de eacutel es el punto de partida para
diversas propuestas sinteacuteticas enfocadas a generar un producto que posea muacuteltiples
actividades bioloacutegicas de intereacutes terapeacuteutico
Hipoacutetesis y objetivos
21
2 Hipoacutetesis
Los compuestos hidroxicumariacutenicos exhiben conocidas e interesantes propiedades
antioxidantes
Al sustituir la cumarina con los compuestos aacutecido cafeico aacutecido gaacutelico y aacutecido
protocateacutequico se obtienen derivados de naturaleza hiacutebrida aumentando la actividad
de la cumarina frente a las especies reactivas de oxiacutegeno anioacuten superoacutexido radical
hidroxilo radical peroxilo y su capacidad reductora
3 Objetivos
31 Objetivos generales
- Evaluar el comportamiento electroquiacutemico oxidativo de los derivados
cumariacutenicos previamente sintetizados y caracterizados fiacutesicamente
- Evaluar la capacidad antioxidante de los nuevos compuestos derivados de
cumarina y aacutecidos benzoicos frente a distintas especies radicales mediante
diversas teacutecnicas in vitro
Hipoacutetesis y objetivos
22
32 Objetivos especiacuteficos
Objetivos en siacutentesis
- Sintetizar y caracterizar el compuesto precursor 4-clorometil-78-
dihidroxicumarina y los correspondientes derivados de la sustitucioacuten en posicioacuten-
4 con aacutecido cafeico aacutecido gaacutelico y aacutecido 34-dihidroxibenzoico
Objetivos en electroquiacutemica
- Realizar la caracterizacioacuten anoacutedica en medio aproacutetico (NN-dimetilformamida
DMF) de los compuestos por voltametriacutea ciacuteclica (VC) voltametriacutea de pulso
diferencial (VPD)
Objetivos en la determinacioacuten de capacidad antioxidante
- Estudiar la reactividad de los compuestos frente al anioacuten radical superoacutexido O2-
utilizando como teacutecnica voltametriacutea ciacuteclica
- Determinar la reactividad de los compuestos frente al radical peroxilo (ROObull)
obteniendo su iacutendice ORAC-FL
- Determinar la capacidad reductora de hierro (Fe3+
) de los compuestos a traveacutes de
la teacutecnica FRAP
- Estudiar la reactividad frente al radical OHbull mediante la teacutecnica spin trapping
utilizando espectroscopiacutea de resonancia de espin electroacutenica (REE)
Hipoacutetesis y objetivos
23
- Evaluar la capacidad antioxidante celular de los compuestos
- Establecer la existencia de correlacioacuten entre paraacutemetros fisicoquiacutemicos de los
compuestos y su actividad antioxidante
Materiales y meacutetodos
24
4 Materiales y meacutetodos
41 Materiales
411 Reactivos y equipamiento utilizado en siacutentesis
Reactivos
- Aacutecido 34-dihidroxicinaacutemico Merck
- Aacutecido 34- dihidroxibenzoico Sigma-Aldrich
- Aacutecido 345-trihidroxibenzoico Sigma-Aldrich
- Pirogalol Merck
- 4-cloro acetoacetato de etilo Sigma-Aldrich
- NN-dimetilformamida PA J T Baker
- 18-diazabiciclo[540]undec-7-ano (DBU) Sigma-Aldrich
- Carbonato aacutecido de sodio Merck
- Metanol PA JT Baker
- Acetona PA Merck
- Etanol PA Merck
- Cloroformo PA Merck
- Aacutecido sulfuacuterico 98 Merck
- Aacutecido clorhiacutedrico 37 JTBaker
- Anhiacutedrido aceacutetico Merck
- Hidroacutexido de sodio PA Merck
- Solucioacuten etanoacutelica de FeCl3
Materiales y meacutetodos
25
- Acetona d6 Sigma-Aldrich
- Dimetilsulfoacutexido d6 Sigma-Aldrich
- Cloroformo d6 Sigma-Aldrich
- Nitroacutegeno extra puro 99995 Linde Gas Chile SA
Equipamiento
Todo el material de vidrio utilizado fue clase A
- Balanza analiacutetica Precisa 125 A
- Rotavapor Heidolph VV 2000
- Sonicador Elme Transsonic Digital tipo T480H-2
- Agitador magneacutetico placa calefactora Heidolph MR 3002
- Estufa de secado al vaciacuteo Heraeus
412 Reactivos y equipamiento utilizados en electroquiacutemica
Reactivos
- NN-dimetilformamida (DMF) PA Merck
- Hexafluorofosfato de tetrabutil amonio (HFFTBA) Sigma-Aldrich
- Aacutecido 34-dihidroxicinaacutemico Merck
- Aacutecido 34- dihidroxibenzoico Sigma-Aldrich
- Aacutecido 345-trihidroxibenzoico Sigma-Aldrich
- Nitroacutegeno extra puro 99995 Linde Gas Chile SA
Materiales y meacutetodos
26
- Agua purificada (MilliQ) Millipore Merck
Equipamiento
- Estacioacuten de trabajo electroquiacutemica CH Instruments CHI 760c
- Electrodo de carbono viacutetreo CH Instruments d = 3 mm
- Alambre de platino
- Electrodo de referencia AgAgCl (KCl 3 M) CH Instruments
- Aluacutemina 03 μM y 005 μM Buheler
- Balanza analiacutetica Precisa 40SM-200ordf
413 Reactivos y equipamiento utilizados en ensayos frente a especies
radicalarias
Reactivos
- 2-(6-oacutexido-3-oxo-3H-xanten-9-il)benzoato disoacutedico (fluoresceiacutena sal
disoacutedica) Sigma-Aldrich
- 22-azo-bis(2-amidinopropan)diclorhidrato (ABAP) Sigma-Aldrich
- 246-tris(2-piridil)-s-triazina (TPTZ) Sigma Aldrich
- 6-hidroxi-2578-tetrametilcroman-2-aacutecido carboxiacutelico (Trolox) Sigma-
Aldrich
- Peroacutexido de hidroacutegeno al 30
- NN-dimetilformamida PA Sigma-Aldrich
- 55-dimetil-1-pirroline-N-oacutexido (DMPO)
- Acetato de sodio Merck
Materiales y meacutetodos
27
- Tricloruro de hierro (FeCl3) Sigma Aldrich
- Hidroacutexido de sodio Merck
- Fosfato diaacutecido de potasio Merck
- Etanol grado HPLC Merck
- Aacutecido aceacutetico glacial Merck
- N-octanol Merck
- Cloruro de zinc Merck
Equipamiento
- Balanza Precisa 40SM-200ordf
- Lector de microplacas con detector muacuteltiple Synergytrade HT Bio-Tek
Instruments Inc (Winooski VT USA)
- Espectroacutemetro ECS 106 de banda X (985 GHz) equipado con cavidad
rectangular y 50 KHz de modulacioacuten de campo (Bruker Coventry UK)
- WINSIM Software EPR Spectral Simulation for MS-Windows 9x NT
Version 098 copy PEST Public EPR Simulation Tools NIEHS USA
- Alambre de platino
- Espectrofotoacutemetro UV-Visible Specord S600 Analytik Jena
- Equipo generacioacuten agua ultrapura NanoPure Barnstead
Materiales y meacutetodos
28
42 Meacutetodo
421 Procedimientos de siacutentesis
En un primer paso se obtuvo el precursor 4-clorometil-78-dihidroxicumarina
mediante la siacutentesis de Pechmann posteriormente se realizoacute la esterificacioacuten entre el
compuesto halogenado y diferentes aacutecidos orgaacutenicos comerciales (Figura 41) Los
aacutecidos comerciales utilizados en el proceso de siacutentesis fueron los siguientes
aacutecido 34-dixidroxicinaacutemico aacutecido 345- trihidroxibenzoico
(aacutecido cafeico) (aacutecido gaacutelico)
O
OH
OH
HO
aacutecido 34-dihidroxibenzoico
(aacutecido protocateacutequico)
Figura 41 Aacutecidos empleados en la sustitucioacuten de la 4-clorometil-78-
dihidroxicumarina
OH
OH
O
HO
O
OH
OH
HO
OH
Materiales y meacutetodos
29
Todos los compuestos fueron previamente acetilados para proteger los grupos
hidroxilo presentes en sus estructuras para evitar reacciones entre siacute
A Siacutentesis de la 4-clorometil-78-dihidroxicumarina 1
Se mezclaron en proporciones equimolares el pirogalol (31 mmoles) junto con el 4-
cloroacetoacetato de etilo con agitacioacuten constante en un bantildeo de agua-hielo sobre la
mezcla se antildeadieron lentamente 25 mL de H2SO4 (tambieacuten friacuteo) esta solucioacuten se
tornoacute de color rojizo oscuro Se dejoacute reaccionar 1 h
La mezcla de reaccioacuten se agregoacute lentamente sobre un bantildeo de agua-hielo-etanol con
vigorosa agitacioacuten y se obtuvo el producto como un precipitado fino que fue lavado
con abundante agua (a fin de eliminar restos aacutecidos) y purificado por re-cristalizacioacuten
en una mezcla etanol agua obtenieacutendose un soacutelido marfil brillante 1 La ruta
sinteacutetica se presenta a continuacioacuten
Figura 42 Siacutentesis del derivado clorado 1
O
OH
OH O
Cl
HO
OH
OH
OEt
Cl
O O
+
H2SO4
1 h
1
Materiales y meacutetodos
30
B Procedimientos de acetilacioacuten
a) Acetilacioacuten de 4-clorometil-78-dihidroxi-cumarina 2
Se suspendioacute la cumarina clorada (3 g) en 6 mL anhiacutedrido aceacutetico y se antildeadioacute 1 gota
de aacutecido sulfuacuterico La solucioacuten fue agitada con calentamiento (45 degC) por 30 min y se
observoacute el progreso de la reaccioacuten mediante el test de FeCl3 el que indica la presencia
o ausencia de grupos ndashOH fenoacutelicos en solucioacuten El precipitado obtenido 5 se
recristalizoacute en etanol su ruta sinteacutetica se muestra en la Figura 43
Figura 43 Siacutentesis del derivado clorado acetilado 5
b) Acetilacioacuten del aacutecido 34-dihidroxicinaacutemico 6
Seguacuten lo descrito en la literatura89
se disolvioacute el aacutecido 34-dihidroxicinaacutemico (aacutecido
cafeico) en solucioacuten 1 M de NaOH sobre un bantildeo de hielo se agregoacute anhiacutedrido
O
OH
HO O
Cl
Ac2O H2SO4
45 degC 30 min
O
O
O O
Cl
5
O
O
Materiales y meacutetodos
31
aceacutetico y de inmediato se aprecioacute la aparicioacuten de un precipitado amarillo claro que
con el paso del tiempo se tornoacute de color marfil Se dejoacute en estas condiciones con
agitacioacuten vigorosa por 30 min El producto 6 fue filtrado y lavado prolijamente con
agua posteriormente se recristalizoacute en etanol obtenieacutendose un soacutelido blanco brillante
La reaccioacuten global se presenta en la Figura 44
HO
HO
OH
O
O
O O
NaOH 30 min
AcO
AcO
OH
O
6
Figura 44 Siacutentesis del aacutecido cafeico acetilado 6
c) Acetilacioacuten del aacutecido gaacutelico7
Se mezclaron 3 g de aacutecido con 7 mL de anhiacutedrido aceacutetico se antildeadioacute 1 gota de H2SO4
Se agitoacute durante 30 min a 47 degC Posteriormente la mezcla fue enfriada y filtrada al
vaciacuteo El producto 7 soacutelido de color blanco se recristalizoacute en etanol La reaccioacuten
global se presenta en la Figura 45
Materiales y meacutetodos
32
O
HO
HO
OH
OHO
O O
H2SO4 30 min
O
AcO
AcO
OAc
OH
7
Figura 45 Siacutentesis del aacutecido gaacutelico acetilado 7
d) Acetilacioacuten del aacutecido 34-dihidroxibenzoico 8
Se mezclaron 3 g de aacutecido con 6 mL de anhiacutedrido aceacutetico se antildeadioacute 1 gota de H2SO4
Se agitoacute por 30 min a 50 degC Luego se enfrioacute y filtroacute al vaciacuteo El producto 8 soacutelido de
color blanco fue recristalizado en etanol la reaccioacuten global se muestra en la Figura
46
O
OH
OH
OHO
O O
H2SO4 30 min
O
OAc
OAc
OH
8
Figura 46 Siacutentesis del aacutecido 34-dihidroxibenzoico acetilado 8
Materiales y meacutetodos
33
C Siacutentesis de los derivados hiacutebridos Procedimiento general
En base a una variante del procedimiento descrito (Ono y colaboradores 1978)90
los
derivados hiacutebridos se obtuvieron mediante la esterificacioacuten de la cumarina acetilada
5 y el correspondiente aacutecido tambieacuten previamente acetilado (6 7 8) Se disolvioacute el
aacutecido (32 mmoles) en 10 mL de DMF (seca recieacuten destilada) a temperatura ambiente
y se agregoacute el DBU en proporcioacuten equimolar se dejoacute reaccionar por 30 min en un
matraz provisto de codo de desecacioacuten (relleno con CaCl2) y agitacioacuten constante Se
agregoacute la cumarina (32 mmoles) y se aprecioacute el fin de la reaccioacuten tras 35 h a 50 degC
de temperatura La solucioacuten se llevoacute a tdeg ambiente y se hizo precipitar
cuidadosamente agregando agua destilada el soacutelido (9 10 y 11) fue lavado
prolijamente se filtroacute y secoacute
La Figura 47 muestra como ejemplo la ruta sinteacutetica llevada a cabo en la obtencioacuten
del derivado de aacutecido cafeico
Figura47 Siacutentesis del intermediario hiacutebrido derivado del aacutecido cafeico
O
OAc
OAc O
Cl
OAc
OAc
HO
O
+ DBU
DMF seco
O
OAc
OAc O
OAc
OAc
O
O
Materiales y meacutetodos
34
Posteriormente se procedioacute a desproteger los grupos fenoacutelicos en el soacutelido mediante
el procedimiento de desacetilacioacuten El producto crudo fue suspendido en una mezcla
de metanol (8 mL) acetona (12 mL) y solucioacuten saturada de NaHCO3 (14 mL) se
agitoacute a temperatura ambiente bajo nitroacutegeno por 3 h
Finalizada la reaccioacuten la suspensioacuten se concentroacute al vaciacuteo se antildeadioacute HCl en friacuteo
formaacutendose un precipitado claro que se filtroacute y lavoacute con abundante agua
posteriormente fue secado cuidadosamente El soacutelido se lavoacute prolijamente con CHCl3
a ebullicioacuten y fue secado al vaciacuteo de esta forma se obtuvo el producto hiacutebrido La
Figura 48 muestra la ruta de desproteccioacuten empleada
Figura48 Siacutentesis del compuesto hiacutebrido final 9
O
OAc
AcO O
OAc
OAc
O
O N2 tdeg amb
O
OH
HO O
OH
OH
O
O
9
hidroacutelisis baacutesica
Materiales y meacutetodos
35
En la Figura 49 se presenta un resumen de la ruta sinteacutetica para las cumarinas
hiacutebridas obtenidas
HO
O
OH
OH4
OH
OH
HO
O
OH
3
OH
OH
HO
O
2
O
OH
HO O
Cl1
ii
HO
O
OAc
OAc8
OAc
OAc
HO
O
OAc
7
OAc
OAc
HO
O
6
O
OAc
AcO O
Cl5
Figura 49A Ruta de siacutentesis de los compuestos cumariacutenicos i) H2SO4 1 h bantildeo de
hielo ii) NaOH Ac2O 30 min bantildeo de hielo (aacutecido cafeico 6) H2SO4 Ac2O
30 min (cumarina y aacutecidos benzoicos)
O
OH
HO O
Cl
HO
OH
OH
OEtCl
O O
+
1
i
Materiales y meacutetodos
36
HO
OOAc
OAc
OAc
OAc
HO
O
OAc
7
OAc
OAc
HO
O
6
OOH
HO O
OH
OH
O
O
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
9
10
11
OOAc
AcO O
Cl5
iiiiv
8
Figura 49B Ruta de siacutentesis de los compuestos cumariacutenicos iii) DBU DMF (seca)
35 h 50 degC iv) NaHCO3 MeOH acetona tdeg amb 3 h N2
Materiales y meacutetodos
37
422 Procedimiento experimental en electroquiacutemica
i) Celda electroquiacutemica
La celda de trabajo estuvo compuesta por tres electrodos el de trabajo de carbono
viacutetreo y superficie 0076 cm2 electrodo de referencia AgAgCl (3 M KCl) inmerso en
puente salino (DMF + HFFTBA 02 M) y alambre de platino como contra-electrodo
ii) Condiciones de trabajo
Los experimentos se realizaron utilizando como solvente aproacutetico NN-
dimetilformamida (previamente destilada y guardada con tamiz molecular 3 Aring) las
soluciones de trabajo en una concentracioacuten de 2 mM para todos los compuestos
continuamente fueron purgadas con nitroacutegeno extra puro el electrolito soporte
utilizado fue HFFTBA (hexafluorofosfato de tetrabutil amonio) en una concentracioacuten
dos oacuterdenes de magnitud superior a la de la muestra
iii) Teacutecnicas empleadas
En el desarrollo de este trabajo se utilizoacute voltamperometriacutea ciacuteclica (VC) y
voltamperometriacutea de pulso diferencial (VPD)
Materiales y meacutetodos
38
iv) Caacutelculos
El proceso de deconvolucioacuten de las graacuteficas en VC se llevoacute a cabo utilizando el
software Origin Pro 8 SR2 (Origin Lab Corporation USA) Se aplicoacute la funcioacuten
Gaussiana (Ecuacioacuten 41)
119910 = 1199100 + 119860
119908 radic120587 119890
minus2(119909minus119909119888)2
1199082 Ecuacioacuten 41
423 Estudio de generacioacuten de especies radicalarias mediante espectroscopiacutea de
resonancia de espiacuten electroacutenico
La oxidacioacuten electroquiacutemica de los compuestos se realizoacute utilizando las
mismas condiciones de potencial de voltametriacutea ciacuteclica una celda compuesta de
electrodo de trabajo de alambre de platino el medio empleado fue DMF + HFFTBA
como contra-electrodo se utilizoacute alambre de platino La estabilizacioacuten del radical
generado en la oxidacioacuten electroquiacutemica se logroacute empleando el catioacuten quelante Zn2+
el cual es silente a la teacutecnica espectroscoacutepica y forma complejos con el grupo catecol
Se utilizoacute ZnCl2 en concentracioacuten final 3 mM
Materiales y meacutetodos
39
424 Procedimiento experimental en el estudio de actividad frente a especies
radicalarias
4241 Metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno
(oxygen radical antioxidant capacity-fluorescein ORAC-FL)
Se prepararon soluciones stock en etanol para cada compuesto de ellas se obtuvieron
las soluciones de trabajo diluidas en solucioacuten buffer fosfato (pH 74) Se antildeadieron
las aliacutecuotas respectivas de concentraciones crecientes de cada compuesto en los
pocillos de la placa (concentraciones finales entre 02 microM y 109 microM que permitieron
obtener curvas de decaimiento apropiadamente separadas) posteriormente se
adicionoacute la sonda fluoresceiacutena (Figura 410 A) (solucioacuten preparada en buffer pH 74 y
concentracioacuten final 40 nM) y se pre-incuboacute 15 min a 37 degC Finalmente se adicionoacute la
aliacutecuota correspondiente de solucioacuten de 22prime-azobis(2-metiilpropionamidina)
dihidrochloridrato (ABAP) la solucioacuten fue preparada en buffer pH 74 y
concentracioacuten final 18 mM (Figura 410 B) y se llegoacute a un volumen final de 200 microL
La placa fue introducida en el lector y se midioacute el decaimiento de la sonda
fluorescente cada 1 min con agitacioacuten previa a cada medicioacuten Para cada set de
medidas fue determinado el blanco correspondiente que contiene la sonda
fluorescente y el generador de radicales peroxilo (ROObull) Se empleoacute el compuesto
Trolox como antioxidante estaacutendar de referencia (Figura 410 C) utilizaacutendose un set
Materiales y meacutetodos
40
de concentraciones entre los 3 microM y 20 microM y el procedimiento anteriormente descrito
para determinar el decaimiento de la fluorescencia de la sonda
La capacidad de inhibicioacuten expresada como valor de iacutendice ORAC se cuantificoacute
utilizando el valor integrado de aacuterea bajo la curva (ABC) de fluorescencia (Figura
411 donde F0 es el valor medido a tiempo 0 y F es el valor de fluorescencia al final
de la medicioacuten cuando se aprecioacute que el decaimiento es total) La ABC neta se obtuvo
de restar el valor del blanco al valor de cada compuesto (ver Ecuacioacuten 42)
ABC neta = ABC compuesto ndash ABC blanco Ecuacioacuten 42
ONaO O
ONa
O
A
O
HO
OH
O
C
Figura 410 A Sonda fluoresceiacutena B 22prime-azobis(2-metilpropionamidina)
dihidrochloridrato (ABAP) C 6-hidroxi-2578-tetrametilcroman-2-aacutecido carboxiacutelico
(Trolox)
-Cl H2N+
NH2
N
N+NH2 Cl-
NH2
B
Materiales y Meacutetodos
41
Figura 411 Actividad antioxidante ORAC-FL para un compuesto en estudio
Finalmente este valor de ABC neta para cada concentracioacuten se graficoacute con respecto a la
concentracioacuten obtenieacutendose una relacioacuten lineal en el rango de estudio La pendiente de
la regresioacuten de cada compuesto fue dividida por el valor de la pendiente del estaacutendar
Trolox (obtenido de la mima forma descrita para las muestras) este coeficiente es el
mencionado Iacutendice ORAC
Los datos fueron procesados mediante el software Origin Pro 8 SR2 (Origin Lab
Corporation USA) Las mediciones se realizaron en triplicado
0 1000 2000 3000 400000
02
04
06
08
10
ABCneta
Antioxidante
Blanco
F
F0
Tiempo s
Materiales y Meacutetodos
42
4242 Metodologiacutea de determinacioacuten de poder antioxidante de reduccioacuten de hierro
(FRAP)
Preparacioacuten de soluciones
i) Preparacioacuten solucioacuten tampoacuten acetato
Se disolvieron 155 g de acetato de sodio trihidrato (CH3COONamiddot3H2O) en agua
ultrapura se agregaron 8 mL de CH3COOH glacial con agitacioacuten constante y se aforoacute
a 500 mL El pH fue ajustado a 36 con NaOH concentrado
ii) Preparacioacuten de solucioacuten tampoacuten fosfato pH 74
Se mezclaron 80 mL de solucioacuten 01 M de NaOH con 100 mL de solucioacuten 01 M de
KH2PO4 se agitoacute para homogeneizar
iii) Preparacioacuten solucioacuten HCl 40 mM
En un matraz aforado (50 mL) se mezclaron 167 microL de HCl 12 M (37) con agua
ultrapura y se agitoacute hasta homogeneizar
iv) Preparacioacuten de solucioacuten TPTZ
Se pesaron 797 mg de reactivo TPTZ (Figura 412) y se aforoacute a 25 mL con solucioacuten
HCl 40 mM se agitoacute y conservoacute protegido de la luz
Materiales y Meacutetodos
43
N
N
N
N
NN
Figura 412 Reactivo 246-tris(2-piridil)-s-triazina (TPTZ)
v) Preparacioacuten solucioacuten de FeCl3 (20 mM)
Se pesaron 0054 g de FeCl3middot6H2O se aforoacute a 10 mL con agua ultrapura y se agitoacute
constantemente
vi) Preparacioacuten del reactivo FRAP
Se mezcloacute el tampoacuten acetato con solucioacuten TPTZ y solucioacuten feacuterrica en proporcioacuten
1011 se agitoacute y conservoacute al abrigo de la luz
vii) Preparacioacuten de soluciones en estudio
Se mezclaron aliacutecuotas de solucioacuten stock (en etanol) de cada compuesto con tampoacuten
fosfato luego se agitaron y se obtuvieron soluciones en concentraciones entre 15 microM y
58 microM
Materiales y Meacutetodos
44
Ensayo de capacidad reductora
En un frasco aacutembar se mezclaron 150 microL de solucioacuten de muestra con 450 microL de agua
ultrapura y posteriormente 950 microL de reactivo FRAP La solucioacuten se agitoacute e
inmediatamente se tornoacute de color azul lo que indicoacute la reaccioacuten de oxidacioacuten de Fe2+
a Fe3+
en el complejo formado con el reactivo TPTZ Se midioacute el espectro de
absorbancia en el rango del UV-visible a temperatura ambiente considerando el valor
de λmaacutex = 599 nm Los experimentos se realizaron en triplicado los valores obtenidos
para este ensayo se expresan como equivalentes de Trolox 10 microM de muestra
4243 Capacidad de apagamiento del radical hidroxilo (OHbull) mediante la teacutecnica
spin trap
Se realizoacute el ensayo mediante la metodologiacutea de Fenton no cataliacutetico comparando las
sentildeales en el espectro mediante espectroscopia de resonancia de espiacuten electroacutenico
(REE) del aducto DMPO-OH como blanco frente a las sentildeales obtenidas en las
mismas condiciones tras antildeadir los compuestos en estudio Para la generacioacuten del
radical hidroxilo se utilizoacute peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2) y solucioacuten acuosa de NaOH
metodologiacutea que presenta la ventaja de que en ausencia de iones Fe2+
(como en la
metodologiacutea Fenton) se evitoacute la reaccioacuten de quelacioacuten con los grupos catecol presentes
en las estructuras propuestas91ab
Materiales y Meacutetodos
45
-10 -08 -06 -04
Ipa0
O2 + e
- O
2
-
O2
-O
2 + e
-
10 A
E vs Ag|AgCl V
Se prepararon soluciones stock (20 mM en DMF) de cada compuesto en estudio se
tomaron aliacutecuotas de 100 microL y se agregaron 50 microL de NaOH (25 mM) 50 microL de
solucioacuten de 55-dimetil-1-pirroline-N-oacutexido (DMPO) (30 mM) y finalmente 50 microL de
agua oxigenada (30) se agitoacute cuidadosamente se incuboacute por 5 minutos y se midioacute
su espectro Los resultados se expresaron como el porcentaje de inactivacioacuten del
radical hidroxilo
4244 Estudio de reactividad frente a anioacuten radical superoacutexido O2middot -
Se evaluoacute la reactividad de cada compuesto frente al radical anioacuten superoacutexido el que
fue generado electroquiacutemicamente en la superficie del electrodo a traveacutes de la
reduccioacuten del oxiacutegeno molecular disuelto en el medio (Figura 413)
Figura 413 Voltamograma ciacuteclico de la generacioacuten de anioacuten radical superoacutexido
DMF + HFFTBA 02 M en electrodo de carbono viacutetreo
Materiales y Meacutetodos
46
i) Celda electroquiacutemica
La celda estuvo compuesta de tres electrodos el electrodo de trabajo fue carbono
viacutetreo (aacuterea = 003 cm2) el electrodo auxiliar empleado fue Ag|AgCl (KCl 3 M
inmerso en DMF + HFFTBA 02 M como puente salino) y alambre de platino como
contra-electrodo
ii) Teacutecnica empleada
La generacioacuten del radical se realizoacute mediante voltamperometriacutea ciacuteclica (VC) a
velocidad de barrido de 01 Vs en un rango de potencial entre 0 V (inicial) y -1 V
como potencial de inversioacuten de la direccioacuten de barrido (switching) 92
iii) Experimento
Los experimentos se realizaron utilizando como solvente 10 mL de NN-
dimetilformamida (previamente destilada) el electrolito soporte utilizado fue
HFFTBA (hexafluorofosfato de tetrabutil amonio) en concentracioacuten 02 M las
soluciones fueron saturadas con aire continuamente Una vez estabilizada la corriente
se antildeadieron a la celda aliacutecuotas crecientes de solucioacuten stock de cada compuesto
observaacutendose la disminucioacuten en la corriente de pico anoacutedica Ipa0 Una vez obtenidos
los voltamogramas se determinoacute el paraacutemetro adimensional ((Ipa0-Ipa
S) Ipa
0) el que
expresoacute el consumo de la especie radical este valor se graficoacute con respecto a la
concentracioacuten del sustrato cuya relacioacuten fue una regresioacuten lineal De la graacutefica se
Materiales y Meacutetodos
47
obtuvo el valor de concentracioacuten de antioxidante en que la corriente de pico anoacutedico
disminuye en un 50 (IA50)
4245 Estudio de la capacidad antioxidante celular (CAC)
Para evaluar la actividad antioxidante de los compuestos estudiados en un medio
celular se utilizoacute el meacutetodo descrito en la literatura por Wolfe93
Se emplearon ceacutelulas
EAhy 926 (ATCC CRL-2922) las que fueron sembradas con una densidad de
50000 ceacutelulas por pocillo en microplacas de 96 pocillos con medio de cultivo
RPMI 1640 Despueacutes de 24 h fue removido el medio de cultivo y los pocillos
fueron lavados con buffer fosfato salino (PBS) pH 74 Los pocillos fueron tratados
con 20 μM de la sonda DCFH-DA disuelta en RPMI 1640 libre de suero fetal bobino
Posteriormente se agregaron los compuestos en dos concentraciones diferentes 1 μM y
10 μM Luego de transcurrida 1 h de incubacioacuten a 37 degC los pocillos fueron
lavados con PBS Luego de esto se agregoacute ABAP en una concentracioacuten final de
600 μM y se midioacute la fluorescencia generada por la sonda en el multi-lector de placas
a temperatura constante de 37 degC La emisioacuten a 538 nm fue medida con una excitacioacuten
a 485 nm cada 1 min por 1 hora El ensayo se realizoacute en triplicado El valor de
capacidad antioxidante se calcula determinando el aacuterea bajo la curva para la muestra y
el control experimental utilizando la siguiente ecuacioacuten
CAC = 100 ndash (ABCmuestra ABCcontrol) 100 Ecuacioacuten 43
Materiales y Meacutetodos
48
4246 Estudio de hidrofobicidad relativa de los compuestos
La hidrofobicidad de los compuestos se correlaciona con sus coeficientes de reparto y
distribucioacuten (log P para el reparto octanolagua y log D para la distribucioacuten
octanolsolucioacuten tampoacuten pH 74) los que se determinan utilizando teacutecnicas
espectrofotomeacutetricas yo cromatograacuteficas
Para realizar estas experiencias se determina la solubilidad del analito en octanol
saturado con agua y en la solucioacuten tampoacuten pH 74 saturado con octanol Luego se
obtienen las respectivas curvas de calibracioacuten para la concentracioacuten del compuesto en
estas soluciones en funcioacuten de la absorbancia yo aacuterea bajo la curva Se espera que las
curvas de calibracioacuten obtenidas cumplan con el requisito de una linealidad apropiada
Posteriormente se debe evaluar el reparto midiendo la concentracioacuten analiacutetica en la
fase orgaacutenica y acuosa Para la determinacioacuten del reparto estaacute descrita la siguiente
ecuacioacuten
119897119900119892119875119900119888119905119886119892119906119886 = log ([119904119900119897119906119905119900]119900119888119905119886119899119900119897
[119904119900119897119906119905119900]119886119892119906119886) Ecuacioacuten 44
Mientras que para la determinacioacuten de la distribucioacuten se utiliza la siguiente ecuacioacuten
119897119900119892119875119900119888119905119886119892119906119886(119905119886119898119901oacute119899) = log ([119904119900119897119906119905119900]119900119888119905119886119899119900119897
[119904119900119897119906119905119900]119905119886119898119901oacute119899 119901119867 74) Ecuacioacuten 45
Materiales y Meacutetodos
49
Para este estudio se realizoacute la determinacioacuten de tiempos de retencioacuten como medida de
la hidrofobicidad relativa entre compuestos Se utilizoacute una columna C18 ODS Hypersil
una fase moacutevil compuesta de acetonitrilo solucioacuten H3PO4 (6535 vv) bajo
condiciones isocraacuteticas con flujo 1 mLmin volumen de inyeccioacuten 50 microL
4247 Estudio teoacuterico caacutelculo del Iacutendice de Fukui
La optimizacioacuten de estructuras de los compuestos neutros se realizoacute utilizando el
meacutetodo DFTSP-DFT basado en la Teoriacutea de Funcionales de la Densidad (DFT)94-96
Se utilizoacute el funcional hiacutebrido B3LYP el conjunto de bases empleado fue 6-31G(d)
Los caacutelculos se realizaron mediante el software Gaussianrsquo09 Los descriptores locales
se evaluaron a traveacutes de la aproximacioacuten de orbitales condensados Orbitales
Moleculares Frontera (Mulliken MOs)
Resultados y discusioacuten
50
5 Resultados y discusioacuten
51 Siacutentesis de los compuestos
Se presentan a continuacioacuten los resultados de la caracterizacioacuten fiacutesica y
espectroscoacutepica de los compuestos sintetizados durante este trabajo
4-clorometil-78-dihidroxicumarina (1)
1H RMN (DMSO d6 δ ppm) 493 (s 2H -CH2-) 641 (s 1H =CH- cumarina) 686
(d 1Harom Jorto 85) 717 (d 1Harom Jorto 85) 942 (s1H OH) 1022 (s 1H OH)
13C RMN (DMSO d6 δ ppm) 4187 11047 11129 11267 11585 13282 14358
15017 15181 16046 Rendimiento 47 Punto de fusioacuten 202-204 degC Agujas
color marfil PM 2265gmol Foacutermula molecular C10H7O4Cl
4-clorometil-78-diacetilcumarina (5)
1H RMN (DMSO d6 δ ppm) 235 (s 3H -CH3) 241 (s 3H-CH3) 506 (s 2H -
CH2-) 674 (s 1H =CH- cumarina) 739 (d 1Harom Jorto 878) 783 (d 1Harom Jorto
878)13
C RMN (DMSO d6 δ ppm) 1943 1985 3983 4073 11467 11549
11871 12238 12939 14459 14593 14999 1578716751 Rendimiento 68
Punto de fusioacuten 157-159 degC Soacutelido blanco PM 3105 gmol Foacutermula molecular
C14H11O6Cl
Resultados y discusioacuten
51
Aacutecido-34-diacetoxicinaacutemico (6)
1H RMN (acetona d6 δ ppm) 215 (s 3H -CH3) 216 (s 3H CH3) 638-643 (d 1H
Jtrans 159) 717-720 (d 1Harom Jorto 878) 748-750-756 (s Harom y Htrans) 13
C RMN
(acetona d6 δ ppm)1996 2004 11977 12333 12450 12682 13364 14323
14339 14439 16699 16809 16817 Rendimiento 56 Punto de fusioacuten
158-161 degC Soacutelido blanco PM 264 gmol Foacutermula molecular C13H12O6
Aacutecido-345-triacetilbenzoico (7)
1H RMN (acetona d6 δ ppm) 217 (s 6H -CH3) 219 (s 3H -CH3) 767 (s 2H
Harom) 13
C RMN (acetona d6 δ ppm) (2C -CH3 1865) (2C-C=O 1910) (2Carom
12160) 12790 13857 (2C 14337) 16432 16599 16789 Rendimiento 66
Punto de fusioacuten 158-160 degC Soacutelido blanco PM 296 gmol Foacutermula molecular
C13H12O8
Aacutecido 34-diacetilbenzoico (8)
1H RMN (acetona d6 δ ppm) 217 (s 6H CH3) 724-727 (d 1Harom Jorto 85) 774-
775 (d 1Harom) 781-784 (dd 1Harom) 13
C RMN (acetona d6 δ ppm) 1910 1913
(2C 12329) 12453 12729 12838 16487 16699 16729 Rendimiento 61
Punto de fusioacuten 155-158 degC Soacutelido blanco PM 238 gmol Foacutermula molecular
C11H10O6
Resultados y discusioacuten
52
4-metil-(34-dihidroxicinamoato)-78-dihidroxicumarina (9)
1H RMN (DMSOd6 δppm) 541(s 2H -CH2-) 621(s 1H =CH- cumarina) 642-
648 (d 1H Jtrans= 1591) 682-71 (Harom) 758-763 (d 1H Jtrans = 1591) 91 (s -
OH) 94 (s -OH) 97 (s -OH) 102 (s- OH)13
C RMN (DMSO d6 δppm) 6154
10820 11035 11290 11345 11526 11550 11620 12225 12566 13292
14391 14607 14686 14920 15026 15174 16055 16646ESI-MS mz 371
[M+H]+ 369 [M-H]
- 181 [M+H]
+ 163 [M-H2O+H]
+ 145 [M-H2O+H]
+ 135 [M-
HCOOH+H]+ 179 [M-H]
- 161 [M-H2O-H]
- 135 [M-CO2-H]
-Rendimiento 37
Punto de fusioacuten 246-249 degC Soacutelido amarillo opaco PM 37031 gmol Foacutermula
molecular C19H14O8
4-metil-(345-dixidroxibenzoato)-78-dihidroxicumarina ( 10 )
1H RMN (DMSO d6 δ ppm) 546 (s 2H -CH2-) 619 (s 1H =CH- cumarina) 682-
685 (d 1Harom Jorto 8508) 704 (s 2Harom) 709-712 (d 1Harom Jorto 778)13
C RMN
(DMSO d6 δppm) 6192 10821 10914 11041 11295 11533 11885 13292
13949 14394 (2Carom) 14620 15024 15184 16055 16555 16793ESI-MS mz
361 [M+H]+ 359 [M-H]
- 171 [M+H]
+ 153 [M-H2O+H]
+ 125 [M-CO2H+H]
+ 169
[M-H]- 125 [M-CO2-H]
- Rendimiento 46 Punto de fusioacuten descomposicioacuten sobre
230 degC Soacutelido amarillo opaco PM 36027 gmol Foacutermula molecular C17H12O9
Resultados y discusioacuten
53
4-metil-(34-dihidroxibenzoato)-78-dihidroxicumarina (11)
1H RMN (DMSO d6 δ ppm) 548 (s 2H -CH2-) 619 (s 1H =CH- cumarina) 685
(m 2Harom) 71 (d 1Harom) 74 (d 2Harom) 13
C RMN (DMSO d6 δ ppm) 6142
10774 10988 11242 11481 11551 11626 11957 12218 13240 14343
14520 14972 15096 15127 16001 16490 ESI-MS mz 345 [M+H]+ 343 [M-
H]- 137 [M-H2O+H]
+ 109 [M-HCOOH+H]
+ 153 [M-H]
- 108 [M-CO2-H]
-
Rendimiento 73 Punto de fusioacuten descomposicioacuten sobre 250 degC Soacutelido amarillo
opaco PM 34427 gmol Foacutermula molecular C17H12O8
Resultados y discusioacuten
54
52 Estudios de voltametriacutea ciacuteclica y voltametriacutea de pulso diferencial
El proceso de oxidacioacuten electroquiacutemico de los compuestos fue evaluado mediante
voltamperometriacutea de pulso diferencial VPD Los resultados presentaron soacutelo un pico
de oxidacioacuten para los compuestos 1 2 4 y 9 por otra parte el aacutecido gaacutelico 3 y los
hiacutebridos 10 y 11 mostraron dos o maacutes sentildeales poniendo de manifiesto las complejas
reacciones de oxidacioacuten que presentan los grupos -OH en dichas estructuras (Figura
51 A y B)97
Al analizar las sentildeales tanto para los precursores y sus derivados hiacutebridos se encontroacute
que la uacutenica sentildeal anoacutedica del compuesto 9 corresponderiacutea tanto a la oxidacioacuten del
catecol presente en la cumarina 1 (Epa 083 V) como del aacutecido cafeico 2 (Epa 076 V)
(Figura 52 A) ambos compuestos por separado tuvieron potenciales de pico anoacutedico
cercanos los que se solaparon para una dar una sola sentildeal en el derivado 9 (Epa 082
V)
Figura 51 A
Voltamperogramas de pulso
diferencial para los
precursores 1 2 3 y 4 2 mM
en DMF + HFFTBA 02 M
00 03 06 09 12 15 18 21 24
OO H
O H
H O
OOH
OH
HO
OH
OH
OH
O
HO
OOH
OH O
Cl
A
2A
E vs Ag|AgCl V
1
2
3
4
Resultados y discusioacuten
55
Figura 51 B Voltamperogramas de pulso diferencial para los derivados 9 10 y 11
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
En el caso del hiacutebrido 11 derivado del aacutecido protocateacutequico se observaron dos picos de
oxidacioacuten que corresponderiacutean a la oxidacioacuten del catecol cumariacutenico (Epa 083 V) y el
catecol del aacutecido benzoico (Epa 111 V) A diferencia del caso anterior se encontroacute
que las sentildeales anoacutedicas de ambos precursores estuvieron lo suficientemente distantes
como para solaparse como en el caso anterior Considerando que los resultados se
obtuvieron bajo las mismas condiciones experimentales se podriacutea asumir que la sentildeal
a potencial Epa1 081 V corresponde a la oxidacioacuten en el anillo de la cumarina y la
sentildeal en Epa2 094 V corresponde a la oxidacioacuten del catecol presente en el anillo
benceacutenico Para el compuesto 10 se observoacute un comportamiento semejante al descrito
para 11
00 03 06 09 12 15 18 21 24
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OH O O
O
OO H
O H
O H
OOH
OH O
OH
OH
O
O
B
E vs Ag|AgCl V
9
10
11
2A
Resultados y discusioacuten
56
Los experimentos de voltamperometriacutea ciacuteclica se llevaron a cabo a distinta velocidad
de barrido 005 Vs ndash 3 Vs con el objeto de estudiar su influencia sobre la sentildeal de
oxidacioacuten En forma graacutefica para precursores y derivados se observaron pares redox de
comportamiento irreversible debido al evidente desplazamiento del potencial de pico
Epa con respecto al aumento de la velocidad de barrido El valor de ΔEp (Epa -Epc) se
incrementoacute con el aumento en la velocidad lo que indica una disminucioacuten en la
velocidad de transferencia electroacutenica Para los compuestos 1 2 4 y 9 a la velocidad
de barrido estudiada se observoacute al igual que en VPD la aparicioacuten de una uacutenica sentildeal
de oxidacioacuten para todo el rango de velocidad (la que se desplaza a potenciales maacutes
positivos a medida que aumenta la velocidad de barrido) seguida de una sentildeal de
reduccioacuten en el barrido hacia potenciales negativos Para los compuestos 3 10 y 11 se
apreciaron dos sentildeales de oxidacioacuten seguida de la correspondiente sentildeal en el barrido
de reduccioacuten
Para cada par redox se realizaron estudios por segmentos encontraacutendose para los
compuestos 9 y 10 que el pico I (de oxidacioacuten) estaacute relacionado con el pico II (de
reduccioacuten) y para el compuesto 11 las sentildeales I y Irsquo (de oxidacioacuten) estaacuten relacionadas
con el pico II (de reduccioacuten) Esto es indicio de que en el primer barrido se observa el
proceso de oxidacioacuten de los grupos fenoles en el cual se generan especies factibles de
ser reducidas como derivados de tipo quinoacutenico (Figuras 52 a 54)
Resultados y discusioacuten
57
Figura 52A VC para el derivado 9 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 53A VC para el derivado 10 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
-03 00 03 06 09 12 15
A
II
I
OOH
OH O
OH
OH
O
O
100 A
005 Vs
3 Vs
E vs Ag|AgCl V
03 06 09 12 15
B
II
I
E vs Ag|AgCl V
0 V - 13 V
0 V - 06 V
00 03 06 09 12 15 18
A
II
I
I
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
3 Vs
005 Vs
E vs Ag|AgCl V
00 03 06 09 12
B
II
I
E vs Ag|AgCl V
-02 V - 06 V
-02 V - 11 V
Resultados y discusioacuten
58
Figura 54 A VC para el derivado 11 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
En sistemas fenoacutelicos simples como es el caso del catecol o la hidroquinona se ha
estudiado el proceso redox en distintos medios 98-101
planteaacutendose que la oxidacioacuten en
medio aproacutetico deriva en la formacioacuten de la quinona correspondiente viacutea 2e-2H
+
(Figura 55) En esta investigacioacuten se han estudiado estructuras de mayor complejidad
y considerando que en este proceso de oxidacioacuten se ha descrito la presencia de
especies radicales como intermediarios de reaccioacuten es probable que ocurran procesos
de dimerizacioacuten o ataques nucleofiacutelicos por parte de los radicales dando como
resultado la generacioacuten de compuestos diferentes a la moleacutecula de partida (por
ejemplo de mayor peso molecular) Este tipo de comportamiento se puede analizar en
profundidad realizando barridos de potencial consecutivos en VC a baja velocidad de
00 03 06 09 12 15
I
II
I
A
100 A
OHO O
O
OOH
OH
OH
005 Vs
3 Vs
E vs Ag|AgCl V
00 03 06 09 12 15
II
I
IB
E vs Ag|AgCl V
-01 V - 07 V
-01 V - 14 V
Resultados y discusioacuten
59
barrido (005 Vs o menor para observar maacutes detalladamente la reaccioacuten quiacutemica en la
escala de tiempo del experimento) Si fuese el caso se esperariacutea observar la aparicioacuten
de sentildeales nuevas en el segundo barrido de oxidacioacuten que dariacutean cuenta de la
oxidacioacuten de las nuevas estructuras fenoacutelicas generadas
OH
OH-2e- -2H+
2e- 2H+
O
O
Figura 55 Esquema del proceso electro-oxidativo propuesto para el catecol
Se realizoacute la deconvolucioacuten (mediante la funcioacuten gaussiana) sobre las curvas de
oxidacioacuten para los compuestos con el objeto de determinar los valores de corriente de
pico anoacutedica de forma independiente con esto se obtienen valores de corriente y
potencial (principalmente a alta velocidad de barrido) los cuales son maacutes exactos que
los entregados por defecto por el software electroquiacutemico utilizado Las graacuteficas y
caacutelculos correspondientes a la relacioacuten entre los diferentes paraacutemetros analizados se
realizaron considerando los valores de Ipa y Epa para el primer pico oxidativo debido a
que esta sentildeal entrega informacioacuten con respecto a la energiacutea del primer electroacuten cedido
en el proceso de oxidacioacuten etapa que generalmente es lenta y determinante de la
velocidad de reaccioacuten
Resultados y discusioacuten
60
La expresioacuten indicada en la Ecuacioacuten 51102
da cuenta de la relacioacuten entre el potencial
de pico y el logaritmo de la velocidad de barrido para una reaccioacuten electroquiacutemica
irreversible
119864119901 119894119903119903119890119907 = 11986412 + 119887
2[104 minus log (
119887
119863) minus 2119897119900119892119896119891 + 119897119900119892119907] Ecuacioacuten 51
Por tanto de la graacutefica Ep vs logv se puede obtener el valor de la pendiente de Tafel b
que es igual al doble de la pendiente de la recta obtenida
119864119901 119894119903119903119890119907 = 119862119905119890 + 119887
2(119897119900119892119907) Ecuacioacuten 52
La graacutefica de potencial de pico anoacutedico (Epa) vs logv dio como resultado una relacioacuten
de tipo lineal para todos los compuestos el potencial de oxidacioacuten se desplazoacute hacia
valores maacutes positivos con el aumento de la velocidad de barrido lo que indica el
caraacutecter irreversible del proceso oxidativo en este medio En la Figura 56 se presenta
la graacutefica obtenida para el derivado 9 como ejemplo representativo de los resultados
obtenidos
Resultados y discusioacuten
61
Figura 56 Relacioacuten Epa vs logv para el derivado de aacutecido cafeico 9 2 mM en
DMF + HFFTBA 02 M
Los valores obtenidos para la pendiente de Tafel se resumen en la Tabla 51 Los
compuestos 1 y 3 poseen valores de la pendiente de Tafel cercanos al teoacuterico (118
mVdec)103
para un proceso en que la primera transferencia electroacutenica es la etapa
lenta del proceso (por tanto la etapa determinante de la reaccioacuten de electro-oxidacioacuten)
El compuesto 4 presenta un valor de 88 mVdec lo que sugiere que el electrodo estaacute
contaminado103104
o se produce un mecanismo de oxidacioacuten complejo (que implica
una transicioacuten entre la etapa quiacutemica y la transferencia electroacutenica como determinante
de la velocidad)105
De la misma forma los valores encontrados para los derivados 9
(170 mVdec) 10 (134 mVdec) y 11 (140 mVdec) y para el aacutecido cafeico (212
mVdec) indican que en las condiciones experimentales utilizadas la superficie del
18 21 24 27 30 33 36
090
093
096
099
102
105
OOH
OH O
OH
OH
O
O
r = 098638
m = 008548
Ep
a1 (
V)
logv (mV12
s-12
)
Resultados y discusioacuten
62
electrodo se contamina (pasiva)106
con la generacioacuten de especies polimeacutericas debido a
la formacioacuten del radical fenoxilo (ArObull) el cual puede dimerizar y originar diversos
productos de reaccioacuten los cuales se adhieren a la superficie del electrodo
Para cada compuesto se establecioacute la existencia de una relacioacuten de tipo lineal entre el
logaritmo de la corriente de pico anoacutedico y el logaritmo de la velocidad de barrido
(logIpa vs logv) El valor para la pendiente de estas rectas estuvo entre 044 y 056
(Tabla 51) lo que sugiere que el proceso observado es de tipo difusivo
La corriente de pico anoacutedica se puede expresar en funcioacuten de distintos paraacutemetros
experimentales como se indica en la Ecuacioacuten 53102
119868119901 = 301 times 10minus5 119899 (23 119877 119879
119887 119865)
12
11986312 119862 11990712 Ecuacioacuten 53
Donde n es el nuacutemero de electrones transferidos R es la constante de los gases (Jmol
K) T es la temperatura (K) D es el coeficiente de difusioacuten de la especie electro-activa
(cm2s) F es la constante de Faraday (Cmol) b es la pendiente de la ecuacioacuten de
Tafel107
(η = a + b log i) C es la concentracioacuten de la especie electro-activa (molL) y v
es la velocidad de barrido (mVs) Esta expresioacuten indica que la correlacioacuten entre
Ip y vfrac12
da como resultado una recta que seraacute funcioacuten del nuacutemero de electrones n y la
pendiente de Tafel b valores que estaacuten presentes en la pendiente de esta recta
Resultados y discusioacuten
63
Considerando lo anterior se procedioacute a graficar Ipa vs vfrac12
encontraacutendose para todos los
compuestos (Figura 57) una relacioacuten de tipo lineal con valores de r entre 099988 y
099448 se presenta ademaacutes la regresioacuten para el aacutecido protocateacutequico 4 como muestra
del comportamiento encontrado para todos los compuestos con valores de intercepto
que tienden a cero Al observar la Tabla 51 se aprecia que todas las regresiones
poseen una pendiente semejante lo cual da un indicio con respecto al nuacutemero de
electrones y mecanismo involucrados en la reaccioacuten de oxidacioacuten estudiada
Figura 57 Graacutefica para la corriente de pico Ipa vs la raiacutez cuadrada de la velocidad de
barrido Ejemplo de correlacioacuten lineal en el aacutecido protocateacutequico 4 2 mM en DMF +
HFFTBA 02 M
Tomando en cuenta que los valores de C R T y F (Ecuacioacuten 53) son factores
constantes y que los coeficientes de difusioacuten D seraacuten semejantes y del mismo orden
para aquellos compuestos de estructura similar (precursores por una parte y derivados
por otra) se obtiene que la pendiente de la recta obtenida en esta correlacioacuten es un
0 10 20 30 40 50 600
50
100
150
200
250
Ipa (
A)
V12
(mV12
s-12
)
OOH
OH
HO
m = 40 10-6
r = 099988
Resultados y discusioacuten
64
indicador respecto al nuacutemero de electrones involucrados en la reaccioacuten y al valor de b
(relacionado con el mecanismo de oxidacioacuten estudiado)
En el caso de los compuestos precursores se obtuvieron valores de pendientes entre
36bull10-6
y 41bull10-6
(Tabla 51) este rango cercano indica la transferencia del mismo
nuacutemero de electrones en el proceso oxidativo observado en que para la cumarina
clorada 1 el aacutecido cafeico 2 y el aacutecido protocateacutequico 4 corresponde a la uacutenica sentildeal
de oxidacioacuten observada y en el caso del aacutecido gaacutelico 3 es el proceso correspondiente a
la primera sentildeal del voltamograma En la literatura se describen estudios en medio
aproacutetico para compuestos fenoacutelicos como por ejemplo derivados de la cumarina 78-
dihidroxilada 100ab
el aacutecido cafeico101
y la hidroquinona105
que dan cuenta de una sentildeal
en el proceso oxidativo en medio aproacutetico que involucra 2 electrones esto permite
inferir que las sentildeales observadas experimentalmente corresponden a un proceso di-
electroacutenico
Para los derivados 9 10 y 11 se observa que los valores para la pendiente Ipa vs vfrac12 se
encuentran entre 37bull10-6
y 42bull10-6
como se indica en la Tabla 51 Ademaacutes al
comparar estos resultados con los obtenidos para el caso de los precursores se deduce
que estamos frente a un proceso oxidativo que involucra dos electrones Se observa
tambieacuten que no hay cambios con respecto al mecanismo de reaccioacuten si lo hubiese se
esperariacutea encontrar diferencias del doble o superior en los valores encontrados para la
pendiente de la recta ya que eacutesta contiene el factor b (pendiente de la ecuacioacuten de
Tafel) antes mencionado
Resultados y discusioacuten
65
Posteriormente se calculoacute el valor correspondiente al potencial de inicio del proceso
electroquiacutemico (Eonset)108109
Este valor indica el potencial inicial con que el primer
electroacuten es cedido en el proceso oxidativo que tiene lugar en la superficie del
electrodo Se determina como el valor de potencial de interseccioacuten entre las recta
tangentes a la liacutenea base y la corriente de oxidacioacuten para cada velocidad de barrido
aplicada en forma experimental (005 Vs a 3 Vs en este estudio) (Figura 58) Una
vez obtenido este potencial se procede a graficar con respecto al logaritmo de la
velocidad de barrido como se presenta en la Figura 59 Se considera el valor del
intercepto de cada recta Eionset (por lo tanto a una baja velocidad de barrido) el cual
incluye el error inherente a la medicioacuten y por tanto es maacutes confiable (Tabla 51) Se
observa que estos potenciales variacutean entre 050 V y 079 V para el aacutecido gaacutelico 3 y el
aacutecido protocateacutequico 4 respectivamente potencial que da indicio de la factibilidad de
oxidacioacuten siendo el compuesto con un Eionset menor el que se oxida con mayor
facilidad Estos valores de potencial onset encontrados permitiraacuten establecer una
correlacioacuten entre el potencial de oxidacioacuten determinado de esta forma y los resultados
obtenidos en los ensayos de actividad frente a especies radicales llevados a cabo en
medio aproacutetico (seccioacuten 6)
Resultados y discusioacuten
66
Figura 58 Determinacioacuten graacutefica del valor de Eonset VC del precursor 1 01 Vs
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 59 Relacioacuten Eonset vs logv para los compuestos estudiados
-05 00 05 10 15 20
20 A
Eonset
E vs Ag|AgCl (V)
15 18 21 24 27 30 33 3606
07
08
09
10
11
12
OOH
OH
HO
OOH
OH
HO
OH
OH
OH
O
HO
OHO O
O
OOH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OOH
OH O
OH
OH
O
O
OOH
HO O
Cl
Eon
set
(V)
logv (mV12
s-12
)
Resultados y discusioacuten
67
Tabla 51 Paraacutemetros experimentales para los compuestos Determinaciones en VC
2 mM DMF + HFFTBA 02 M
Compuesto
119837119845119848119840119816119849119834120783
119837119845119848119840119855 (microAmVs
-1)
119837119816119849119834120783 119837119855120783120784
(microAmV12
s-12
)
119837119812119849119834120783
119837119845119848119840119855
(mVdec)
119835 = 120784 119837119812119849119834120783
119837119845119848119840119855
(mVdec)
Eionset
(mV)
056 36bull10-6
61 122 059
053 41bull10
-6 106 212 059
048 36bull10-6
55 110 050
O
OH
OH
HO
052 41bull10-6
44 88 079
047 40bull10-6
85 170 064
049 37bull10-6
67 134 075
044
42bull10-6
70 140 058
Con el objeto de recabar mayor informacioacuten con respecto al mecanismo de reaccioacuten
involucrado en los procesos oxidativos en estudio en base a los resultados obtenidos
OHO O
O
OOH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
O
OH
OH O
OH
OH
O
O
OOH
OH
HO
OH
OH
OH
O
HO
O
OH
HO O
Cl
Resultados y discusioacuten
68
en VC se realizoacute la graacutefica (Ipa v12
) vs v12
para los compuestos precursores 1 2 3 y
4 (escogidos por poseer un grupo catecol y ser estructuras de menor complejidad que
los derivados 9 10 y 11) Estas graacuteficas de las que se presenta el ejemplo del aacutecido
como muestra (Figura 510) presentaron una relacioacuten de tipo lineal en la que la
pendiente negativa obtenida sugiere que la reaccioacuten observada implica un mecanismo
de tipo EC considerando los estudios mencionados para compuestos fenoacutelicos
ampliamente descritos en la literatura100101105109
y el criterio de diagnoacutestico
mencionado por Pletcher y colaboradores111
Figura 510 Correlacioacuten (Ipa v12
) vs v
12 para el precursor aacutecido protocateacutequico 4
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
21 28 35 42 49 5626
28
30
32
34O
OH
OH
HO
r = -099302
V12
(mV12
s-12
)
Ipa
V12 (
A
mV
12s-1
2)
Resultados y discusioacuten
69
Diversos estudios proponen la presencia de mecanismos concertados para los procesos
redox de compuestos de tipo fenoacutelico los cuales implican la presencia de
intermediarios radicalarios y reacciones donde la transferencia de un protoacuten y un
electroacuten ocurren de forma acoplada dentro de un mismo paso Este concepto nace en la
deacutecada de 1990 a partir de los trabajos publicados por Biczoacutek y colaboradores112113
El estudio de este tipo de reacciones principalmente en derivados fenoacutelicos es de
relevancia debido al rol que eacutestos desempentildean en diferentes sistemas bioloacutegicos tanto
por su reconocida capacidad antioxidante como se evidencia en la investigacioacuten
realizada por Nakayama y colaboradores con respecto a derivados polifenoacutelicos y el
mecanismo de reaccioacuten propuesto de tipo PCET (Proton Concerted Electron Transfer)
frente al anioacuten superoacutexido114
o como en el caso de estudio de las reacciones de
transferencia electroacutenica que involucran al aminoaacutecido tirosina115ab
y otros co-factores
que forman parte esencial del proceso fotosinteacutetico que se lleva a cabo en estructuras
vegetales (Fotosistema II)116
En la deacutecada pasada los aportes a la investigacioacuten sobre el tema se tornaron maacutes
profundos y sistemaacuteticos permitiendo el modelamiento teoacuterico y anaacutelisis de este tipo
de mecanismos Debido al intereacutes concerniente a la obtencioacuten de modelos racionales
de sistemas bioloacutegicos los estudios realizados en medio proacutetico son variados como la
serie de derivados fenol-imidazol sintetizados y caracterizados por Markle y
colaboradores117
quienes entre diversos factores analizan el efecto del sustituyente
sobre el enlace O-H Otros autores como Saveacuteant Costentin y colaboradores han
abordado este toacutepico en diferentes publicaciones proponiendo distintos mecanismos
Resultados y discusioacuten
70
dependientes del pH y composicioacuten de la solucioacuten de trabajo (con buffer o sin eacutel)118
En trabajos posteriores plantean un estudio teoacuterico de modelamiento en sistemas de
tipo amino-fenol enfocados en el mencionado Fotosistema II119
y frente al sistema
enzimaacutetico superoacutexido dismutasa120
Rhile y colaboradores describen la siacutentesis
caracterizacioacuten y estudios de oxidacioacuten tanto quiacutemica como electroquiacutemica (en medio
aproacutetico acetonitrilo) de una serie de fenol-aminas junto con un anaacutelisis teoacuterico del
sistema evidenciaacutendose la presencia de especies radicales intermediarias121
junto con
valores entre 16 a 28 para la relacioacuten de efecto isotoacutepico cineacutetico (KI = kHkD) que se
estima como criterio para considerar un mecanismo concertado122
El estado del arte con respecto a los distintos mecanismos electro-oxidativos descritos
para los derivados fenoacutelicos indica que la determinacioacuten de una ruta en particular en
este proceso se puede establecer mediante estudios de naturaleza tanto experimental
como teoacuterica La obtencioacuten de paraacutemetros termodinaacutemicos como la energiacutea libre de
Gibbs el estudio de efecto isotoacutepico y la determinacioacuten de constantes de velocidad en
electroquiacutemica entre otros permiten discriminar entre las diferentes viacuteas en que se
puede llevar a cabo la electro-oxidacioacuten de fenoles
Resultados y discusioacuten
71
53 Estudio de generacioacuten de especies radicalarias mediante espectroscopia de
resonancia de espiacuten electroacutenico (REE)
A fin de evidenciar la existencia de posibles intermediarios radicalarios en el proceso
electro-oxidativo de los fenoles previamente estudiados a traveacutes de las teacutecnicas
electroquiacutemicas se procedioacute a oxidar los derivados 9 10 y 11 y medir in situ su
espectro REE Se utilizoacute la teacutecnica descrita por Le Nest y colaboradores99
en que se
describe el estudio de estructuras flavonoides polifenoacutelicas en eacutel se utiliza la
quelacioacuten con Zn2+
lo que permitioacute la estabilizacioacuten del radical formado y su posterior
estudio En primer lugar desde un punto de vista cualitativo se observoacute para cada
compuesto un evidente cambio de color en las soluciones electrolizadas las que se
tornaron de color amarillo intenso y maacutes oscuro que las soluciones de trabajo
originales lo que sugiere que tras la electroacutelisis se forma un compuesto nuevo
diferente al de partida como se esperaba En la Figura 511A-C se presentan los
espectros obtenidos junto con las respectivas simulaciones realizadas
Resultados y discusioacuten
72
Figura 511A Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido cafeico 9 estabilizado con Zn2+
en DMF + HFFTBA
(izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color
rojo)
Figura 511B Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido gaacutelico 10 estabilizado con Zn2+
en DMF + HFFTBA
(izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color
rojo)
3440 3450 3460 3470 3480 3490
O
OH
HO O
OH
OH
O
OA
Campo Magneacutetico G
3440 3450 3460 3470 3480 3490
OHO O
O
O
OH
OH
OH
OH
B
Campo Magneacutetico G
Resultados y discusioacuten
73
Figura 511C Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido protocateacutequico 11 estabilizado con Zn2+
en DMF +
HFFTBA (izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der
en color rojo)
Concordante con el resultado esperado la sentildeal espectral indica la presencia de una
especie radicalaria como intermediario de la electro-oxidacioacuten de los grupos catecol
presentes en los tres derivados en estudio
En la simulacioacuten realizada para el derivado 9 se observa el acoplamiento hiperfino de
tres aacutetomos de hidroacutegeno con los siguientes valores de constantes 132 G 098 G y
03 G que seriacutea indicio del proceso oxidativo que ocurre en el catecol del anillo
benceacutenico (Tabla 52) ya que estos valores coinciden con una interaccioacuten entre los tres
protones del anillo benceacutenico en posicioacuten 2 5 y 6 En el caso de los compuestos 10
y 11 se encontraron dos constantes de acoplamiento hiperfino lo que indica la
3440 3450 3460 3470 3480 3490
OHO O
O
OOH
OH
OH
C
Campo Magneacutetico G
Resultados y discusioacuten
74
interaccioacuten entre dos protones que seriacutean aquellos en posicioacuten 5 y 6 del anillo
cumariacutenico
Tabla 52 Constantes de acoplamiento hiperfino para los derivados polifenoacutelicos
Valores en Gauss
Compuesto aH1 G aH2 G aH3 G
132 098 030
215 156 -
235 122 -
Estos resultados concuerdan ademaacutes con lo descrito en la literatura con respecto a la
oxidacioacuten de grupos fenoacutelicos lo que permite inferir un posible mecanismo electro-
oxidativo para los derivados en estudio
O
OH
OH O
OH
OH
O
O
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
Resultados y discusioacuten
75
54 Resultados y discusioacuten de los estudios de reactividad frente a especies
radicalarias
En este punto de la investigacioacuten el objeto de estudio fue evaluar el comportamiento
de las nuevas estructuras previamente sintetizadas frente a diferentes especies
radicalarias de amplio intereacutes bioloacutegico radical peroxilo (ROObull) radical hidroxilo
(OHbull) anioacuten radical superoacutexido (O2-) junto con determinar la capacidad reductora de
los compuestos Cada ensayo fue escogido con miras de abordar el tema de la
capacidad antioxidante desde las posibilidades que permiten las experiencias de tipo in
vitro
541 Metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno
(oxygen radical antioxidant capacity-fluorescein ORAC-FL)
El estudio de especies reactivas de oxiacutegeno y nitroacutegeno asociadas a los procesos
oxidativos requiere en algunos casos del uso de compuestos denominados ldquosondasrdquo
En la teacutecnica de fluorescencia es posible implementar este tipo de metodologiacutea debido
a sus caracteriacutesticas de sensibilidad especificidad y simplicidad en la obtencioacuten de
datos convirtieacutendose en una herramienta uacutetil y ampliamente utilizada a la hora de
obtener una buena aproximacioacuten en la determinacioacuten de actividad frente a especies
EROsERNs123
Resultados y discusioacuten
76
En el caso de la metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno
(ORAC) los primeros trabajos que dan cuenta de su uso fueron descritos en la deacutecada
de 1990 a partir de la investigacioacuten de Cao y colaboradores124
En este trabajo los
autores describen la teacutecnica como un meacutetodo simple y confiable para determinar
capacidad antioxidante en serum humano en pequentildeas cantidades de muestra (del
orden de los microL) utilizando como sonda la β-ficoeritrina (proteiacutena aislada del alga roja
unicelular Porphyridium cruenturn) debido a su fluorescencia sensible a los cambios
conformacionales en su estructura en ensayos frente al radical peroxilo125
En el
desarrollo posterior Ou y colaboradores126
proponen una mejora a la teacutecnica
cambiando la sonda proteica por el compuesto fluoresceiacutena debido a su mayor foto-
estabilidad y para evitar interacciones proteiacutena-polifenol (hidrofoacutebicas y puentes de
hidroacutegeno) junto con ello realizaron la validacioacuten del meacutetodo Esta sonda es la
utilizada actualmente para este ensayo el cual es ampliamente utilizado en el estudio
de polifenoles y sus derivados127-128ab
en diferentes alimentos y bebidas129130
muestras bioloacutegicas de distinta iacutendole131
por mencionar algunos ejemplos
Para efectos de esta investigacioacuten se espera obtener un perfil de comportamiento de
cada uno de los compuestos frente al radical peroxilo (ROObull) que permita distinguir el
aporte que significa cada sustitucioacuten realizada al anillo cumarina con diferentes
grupos fenoacutelicos Cabe mencionar que las longitudes de onda maacuteximas (λmaacutex) de
absorbancia en el rango UV-visible para los compuestos ensayados estuvieron en un
rango entre los 203 nm y 329 nm En este estudio se obtuvieron los perfiles cineacuteticos
Resultados y discusioacuten
77
de consumo de la sonda fluoresceiacutena (con valores de 485525 nm para su absorcioacuten y
emisioacuten respectivamente) por induccioacuten de los radicales peroxilo (originados por
efecto de la termoacutelisis del azo-compuesto ABAP a 37 degC) A partir de estos perfiles de
decaimiento de la sonda a distintas concentraciones de compuestos antioxidantes (5 en
total) se obtuvieron curvas adecuadamente separadas como se muestra en la Figura
512 donde se muestran los resultados para el compuesto 11 como ejemplo
representativo del ensayo Posteriormente se determina para cada concentracioacuten el aacuterea
neta bajo la curva la que es graficada con respecto a las concentraciones utilizadas La
Figura 513 presenta relacioacuten lineal entre el aacuterea neta bajo la curva con respecto a la
concentracioacuten del compuesto 11 como ejemplo la que fue determinada para cada
derivado
Figura 512 Curvas para el consumo de la sonda fluoresceiacutena para un set de
concentraciones del compuesto 11
0 2000 4000 6000
02
04
06
08
10
F
F0
Tiempo (s)
control
16 M
12 M
081 M
045 M
020 M
Resultados y discusioacuten
78
Las curvas obtenidas en esta parte del experimento muestran la reaccioacuten de
competencia entre el radical y el antioxidante (el cual protege a la fluoresceiacutena del
proceso de oxidacioacuten) Posterior al procedimiento anteriormente descrito se obtuvo el
iacutendice ORAC para cada compuesto que se resume en la Tabla 54
Figura 513 Graacutefica de aacuterea neta bajo la curva ABC vs concentracioacuten del derivado 11
En este ensayo los compuestos hiacutebridos propuestos superaron en cuanto al valor de
iacutendice ORAC a la cumarina precursora 1 En los tres casos se pudo observar valores
superiores de casi el doble para el compuesto 10 y bordeando un ORAC casi tres veces
mayor en los compuestos 9 y 11 del valor obtenido para su precursor Estos resultados
evidenciaron un incremento en la capacidad antioxidante al que posee la cumarina de
manera independiente debido a la inclusioacuten de los derivados de aacutecidos
hidroxibenzoicos e hidroxicinaacutemico en su estructura (Tabla 53)
0 1 2 3 4 50
1000
2000
3000
4000
r = 099309
AB
C n
eta
Concentracioacuten (mM)
Resultados y discusioacuten
79
Tabla 53 Valores experimentales de iacutendice ORAC-FL para los compuestos
estudiados
Compuesto iacutendice ORAC-FL
(plusmnSD)
1 091 plusmn 010
2 347 plusmn 010
3 391 plusmn 009
4 069 plusmn 001
9 239 plusmn 003
10 174 plusmn 005
11 262 plusmn 004
Trolox 1
Por otra parte los valores del iacutendice ORAC de la serie fueron superiores al estaacutendar
Trolox con excepcioacuten de los compuestos 1 (cumarina de partida) y 4 (aacutecido
protocateacutequico) Para el caso de la cumarina eacutesta tuvo un valor ORAC menor a 1 En
el caso del compuesto 4 la ostensible diferencia (5 veces menor) con su homoacutelogo
aacutecido cafeico 2 deriva de la presencia del doble enlace en esta estructura aunque
ambos aacutecidos poseen igual cantidad de grupos ndashOH y en igual posicioacuten en el anillo
aromaacutetico la insaturacioacuten le confiere maacutes posibilidades de deslocalizacioacuten electroacutenica
debido a la mayor cantidad de estructuras resonantes posibles y por lo tanto mayor
Resultados y discusioacuten
80
estabilidad al formarse la especie radicalaria correspondiente en la reaccioacuten frente el
ABAP Al observar el valor obtenido para el aacutecido gaacutelico 3 se obtuvo un iacutendice
ORAC cercano al del aacutecido cafeico y aunque carece de la insaturacioacuten presente en el
derivado cinaacutemico posee en su defecto un grupo ndashOH adicional en posicioacuten 5 del
anillo aromaacutetico el cual aportoacute adicionalmente a su capacidad antioxidante (lo que no
ocurrioacute en el caso del aacutecido protocateacutequico 4)
Se observa que el aacutecido dihidroxibenzoico 4 que arrojara un valor 069 presenta un
incremento de 37 veces en su valor ORAC-FL al estar incorporado en el heterociclo
cumariacutenico En este caso se presentoacute un fenoacutemeno de sinergia positiva ya que ambos
compuestos cumarina 1 y aacutecido protocateacutequico 4 aumentaron su valor de ORAC-FL
pasando de un valor 091 y 069 de forma individual respectivamente a formar un
derivado que presentoacute un valor de ORAC-FL igual a 262 Al observar los valores
totales en los derivados 9 y 10 obtenidos no correspondieron a la sumatoria de los
iacutendices individuales de sus precursores este resultado indica que estuvo ausente el
fenoacutemeno de sinergia
Para los nuevos compuestos (9 10 y 11) se observoacute un incremento del valor de
ORAC-FL con respecto a la cumarina precursora 1 Por lo tanto la inclusioacuten delas
estructuras fenoacutelicas en el heterociclo cumariacutenico generoacute la obtencioacuten de nuevos
derivados con una mayor capacidad antioxidante en esta metodologiacutea de esta forma se
obtuvo un aporte a la reactividad de la cumarina 1
Resultados y discusioacuten
81
Los resultados obtenidos en este ensayo dan cuenta de la actividad que presentaron los
compuestos tanto precursores como derivados frente a la especie radical ROObull Un
punto importante a considerar es que este experimento ndashindependientemente de ser un
ensayo in vitro- se lleva a cabo en un medio buffer a pH 74 y a una temperatura
controlada de 37 degC lo que permite obtener una primera aproximacioacuten con respecto a
lo que seraacute la actividad de los compuestos en un medio bioloacutegico La sustitucioacuten en el
anillo cumariacutenico generoacute nuevos compuestos que superaron su capacidad antioxidante
sin embargo desde el punto de vista de los precursores aacutecidos (cafeico y gaacutelico) su
actividad se vio mermada tras la sustitucioacuten fenoacutemeno que se discute en la seccioacuten 6
La secuencia de actividad obtenida para los derivados y sus precursores fue 3 gt 2 gt 11
gt 9 gt 10 gt 1 gt 4
Junto con el ensayo anteriormente detallado se procedioacute a determinar la cantidad de
radicales que reaccionan con el compuesto antioxidante relacionando la concentracioacuten
de antioxidante aplicado la estequiometriacutea de la reaccioacuten y la velocidad de generacioacuten
de radicales peroxilo a 37 degC como se expresa en la siguiente ecuacioacuten (Burton y
colaboradores 1981)132
120591 = 119899 [119860119903119874119867]
119877119894 Ecuacioacuten 54
Resultados y discusioacuten
82
donde τ es el tiempo de induccioacuten (tiempo en el que la sonda es protegida de los
radicales peroxilo por el antioxidante) n es el valor asociado a la estequiometriacutea de la
reaccioacuten correspondiente a la cantidad de moleacuteculas de radical ROObull inactivadas por
moleacutecula de compuesto antioxidante [ArOH] es la concentracioacuten de antioxidante y Ri
es la velocidad de generacioacuten de radical peroxilo la cual estaacute directamente relacionada
con la concentracioacuten de ABAP utilizada en el ensayo (18 mM) y se determina seguacuten la
expresioacuten133
Ri = 136 bull 10-6
[ABAP] Ecuacioacuten 55
Dadas las condiciones experimentales empleadas el valor de Ri es 147 microMmin Los
resultados obtenidos del valor de la pendiente (regresioacuten lineal Ecuacioacuten 54) se
resumen en la Tabla 54
Todos los compuestos (precursores y derivados) presentan valores de n superiores a
los esperados donde en el caso extremo se tiene que una moleacutecula de aacutecido gaacutelico
estariacutea consumiendo 14 moleacuteculas de radical peroxilo resultado que es mucho mayor
al esperado Los aparentes altos valores de n como estequiometriacutea de la reaccioacuten
(n = 3 hasta n = 14) sugieren la presencia de reacciones asociadas de mayor
complejidad en las que estariacutea presente el radical alcoxilo (RObull)134
el cual se forma
por descomposicioacuten del radical peroxilo que posee una vida media del orden de los
segundos en comparacioacuten con el radical alcoxilo con una vida media del orden de los
10-6
s (y es maacutes reactivo) lo que explica esta diferencia en la estequiometria
Resultados y discusioacuten
83
Tabla 54 Valores calculados para el factor estequiomeacutetrico n
Compuesto na(plusmnSD) n
1 28 plusmn 03 3
2 39 plusmn 01 4
3 141 plusmn 14 14
4 24 plusmn 01 3
9 58 plusmn 04 6
10 49 plusmn 01 5
11 86 plusmn 01 9
a Valores calculados en triplicado
Este fenoacutemeno se ha encontrado en investigaciones previas realizadas en derivados
cumariacutenicos135
y fue descrito por Lissi y colaboradores el que se puede encontrar
ademaacutes en experimentos en los que se utiliza la sonda rojo de pirogalol (ORAC-
PGR)136137
Resultados y discusioacuten
84
542 Metodologiacutea de capacidad reductora de hierro en plasma (FRAP)
Esta metodologiacutea desarrollada por Benzie y Strain (1996)138
se propuso como una
medida de la capacidad reductora (asociada a una buena capacidad antioxidante)
enfocada a investigar procesos de estreacutes oxidativo en fluidos bioloacutegicos
Posteriormente se ha extendido al estudio de diversas matrices como extractos de
plantas medicinales139
alimentos140
compuestos puros141
por mencionar algunos
ejemplos
En este ensayo se obtuvieron los valores de la capacidad reductora de los compuestos
polifenoacutelicos la que se aprecia cualitativamente a traveacutes de la formacioacuten del complejo
de Fe2+
de color azul (Figura 514) Esta metodologiacutea involucra la reaccioacuten redox
entre el agente reductor (en este caso los derivados cumariacutenicos) y el oxidante (la sal
feacuterrica) es considerada como aproximacioacuten con respecto a la capacidad de mantener el
estatus redox dentro de la ceacutelula
En primer lugar se observoacute un comportamiento semejante al ensayo ORAC-FL en
cuanto a la tendencia que presentaron los compuestos en su capacidad reductora de
hierro lo que indica una baja probabilidad de que en este ensayo ocurriese el
fenoacutemeno de quelacioacuten propio de los catecoles La Tabla 55 presenta los datos
experimentales obtenidos
Resultados y discusioacuten
85
NN
NN
Fe 3+N
N
N
N
N
N
NN
NN
NN
Fe2+N
N
N
N
N
N
NN
Antioxidante
amarilloazul
[Fe(III) (TPTZ)2]3+ [Fe(III) (TPTZ)2]2+
Figura 514 Esquema para la reaccioacuten entre el complejo de Fe3+
y el compuesto
antioxidante reductor
Los compuestos 9 10 y 11 presentaron una mejor capacidad reductora frente a su
precursor cumariacutenico 1 Esto se explica debido a la presencia de un mayor nuacutemero de
grupos -OH presentes en las nuevas estructuras propuestas capaces de transferir
electrones y reducir la sal feacuterrica como se menciona en el trabajo de Pulido y
colaboradores142
quienes estudian una serie de polifenoles mediante esta teacutecnica
sentildealando que ademaacutes del nuacutemero de hidroxilos presentes la presencia de dobles
enlaces conjugados en el esqueleto como parte de las caracteriacutesticas estructurales
responsables de un aumento en la capacidad reductora en polifenoles
Resultados y discusioacuten
86
Tabla 55 Valores experimentales obtenidos para los compuestos en estudio ensayo
FRAP en equivalentes de Trolox10 microM de muestra
En el derivado 11 se presenta una interaccioacuten de tipo sineacutergica con respecto a los
resultados individuales de cada precursor habieacutendose obtenido un valor FRAP de
1302 y 868 equiv Trolox 10 microM de muestra para 1 y 4 respectivamente y para el
derivado final un valor de 2624 equiv Trolox 10 microM de muestra
Del mismo modo que en el ensayo anterior se observa que la sustitucioacuten en el anillo
cumariacutenico con los distintos grupos aacutecidos incrementa su potencial como especie
reductora mientras que en el caso del aacutecido cafeico y gaacutelico se aprecia una
disminucioacuten de 13 y 15 veces respectivamente en su capacidad reductora tras la
esterificacioacuten
Compuesto equiv Trolox 10 microM muestra
(plusmnSD)
1 1302 plusmn 197
2 2727 plusmn 321
3 4768 plusmn 215
4 868 plusmn 93
9 2052 plusmn 186
10 3182 plusmn 681
11 2624 plusmn 335
Resultados y discusioacuten
87
Los resultados obtenidos para esta teacutecnica entregan informacioacuten acerca de la capacidad
reductora relativa para el conjunto de compuestos ensayados capacidad que estaacute
relacionada con su actividad antioxidante Se obtuvo un orden relativo para
precursores y derivados como sigue 3 gt 10 gt 2 gt 11 gt 9 gt 1 gt 4 Con respecto a la
disminucioacuten de actividad para los aacutecidos mencionados sugiere que esta capacidad
ademaacutes del nuacutemero de ndashOH presentes estariacutea relacionada con el sustituyente ndashCOOH
que se transforma en un grupo eacutester (ver seccioacuten 6)
543 Capacidad de inactivacioacuten del radical OHmiddot teacutecnica Spin Trapping
Esta teacutecnica no destructiva permite la deteccioacuten e identificacioacuten de especies
paramagneacuteticas (con electrones desapareados) en distintas matrices El fenoacutemeno de
resonancia de espiacuten electroacutenico fue descubierto y descrito en la deacutecada de 1940 por
Zavoisky143
en sus estudios basados en sales de manganeso en distintos medios Su uso
y aplicaciones se han diversificado a numerosas aacutereas como en la determinacioacuten de
capacidad antioxidante en alimentos144
en el anaacutelisis del proceso oxidativo en
liacutepidos145
en el estudio de enfermedades parasitarias146
El creciente intereacutes de la
teacutecnica en ciencias biomeacutedicas radica en el hecho de que esta espectroscopia permite
discriminar diferentes especies radicales de intereacutes bioloacutegico estrechamente
relacionadas con el estatus redox de la ceacutelula147
cuyo desbalance se traduce en cuadros
de estreacutes oxidativo148
Resultados y discusioacuten
88
En este estudio se determinoacute la capacidad de los compuestos propuestos para inactivar
la especie radicalaria OHmiddot
mediante la teacutecnica spin trapping metodologiacutea basada en
establecer la competencia de reaccioacuten entre los antioxidantes propuestos y el spin trap
DMPO El radical se generoacute a traveacutes de la reaccioacuten de ldquoFenton no cataliacuteticordquo
(Ecuacioacuten 56) metodologiacutea que permite la generacioacuten del radical OHbull en medio
baacutesico en ausencia del ioacuten Fe como catalizador91ab
211986721198742 + 119874119867minus rarr 119874119867∙ + 1198742minus + 21198672119874 Ecuacioacuten 56
En un primer set de experimentos se procedioacute a realizar la experiencia utilizando
DMSO como solvente Se descartoacute esta opcioacuten debido a que resultoacute complejo
observar un patroacuten claro en el blanco y poder asiacute discriminar las nuevas sentildeales
espectrales a partir de la adicioacuten de los compuestos en estudio
En primer lugar se determinoacute el blanco experimental que indica la reaccioacuten de
inactivacioacuten del radical mediante el compuesto spin trap DMPO Posteriormente se
ensayaron los derivados hiacutebridos y sus precursores sinteacuteticos en dos concentraciones
033 mM y 33 mM En el caso de los experimentos realizados a la menor
concentracioacuten se aprecioacute que la disminucioacuten de la sentildeal del blanco fue miacutenima para los
siete compuestos y no se observoacute un cambio significativo en el espectro como para
obtener resultados concluyentes Considerando lo anterior los experimentos se
Resultados y discusioacuten
89
realizaron con concentracioacuten del orden de los 3 mM obtenieacutendose asiacute datos
satisfactorios en cuanto a la inactivacioacuten del radical y la posibilidad de realizar
caacutelculos sobre este valor El valor de inactivacioacuten del radical hidroxilo se calcula a
traveacutes de la disminucioacuten en la intensidad de las sentildeales al adicionar cada derivado En
cada espectro se aprecia el perfil hiperfino compuesto por cuatro liacuteneas caracteriacutesticas
correspondientes al aacutetomo de nitroacutegeno e hidroacutegeno del spin-aducto formado por
[DMPO-OH] con valores de aN y aH alrededor de 15G lo que concuerda con lo
descrito en la literatura149
para esta reaccioacuten y el espectro simulado que se presenta en
la Figura 515 El cambio experimental tras la adicioacuten de los compuestos se presenta
en color rojo (Figura 516 A-G)
N+
O-
+ OHN
O
OH
Figura 515 Espin aducto generado por la inactivacioacuten del radical OHbull y su espectro
simulado (derecha)
Resultados y discusioacuten
90
Figura 516 A Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto 4-clorometil-78-dihidroxicumarina 1 B Espectro REE de inactivacioacuten del
radical hidroxilo con adicioacuten del compuesto aacutecido cafeico 2
Figura 516 C Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto aacutecido gaacutelico 3 D Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con
adicioacuten del compuesto aacutecido 34-dihidroxi benzoico 4
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
B
Campo Magneacutetico G
compuesto 2
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
C
Campo Magneacutetico G
compuesto 3
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
D
Campo Magneacutetico G
compuesto 4
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
A
Campo Magneacutetico G
compuesto 1
control
Resultados y discusioacuten
91
Figura 516 E Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto hiacutebrido 9 F Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con
adicioacuten del compuesto hiacutebrido 10
Figura 516 G Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto hiacutebrido 11
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
G
Campo Magneacutetico G
compuesto 11
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
E
Campo Mgneacutetico G
compuesto 9
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
F
Campo Magneacutetico G
compuesto 10
control
Resultados y discusioacuten
92
Considerando los patrones espectrales obtenidos para los compuestos 9 10 y 11 se
observoacute que la sentildeal de cuadruplete correspondiente al control (spin-aducto [DMPO-
OH]) desaparecioacute casi por completo lo cual indica la inactivacioacuten del radical
hidroxilo Se observa ademaacutes un triplete con constantes de acoplamiento 1398 G y
1427 G que evidencioacute la reaccioacuten de oxidacioacuten del atrapador DMPO (Figura 517)
ya que de haberse formado el aducto entre la cumarina y el spin trap DMPO se
habriacutea obtenido el correspondiente espectro con un patroacuten de 6 liacuteneas espectrales
(Figura 518)
Figura 517 Espectro REE se destaca en rojo el triplete de integracioacuten 121
formado despueacutes de la reaccioacuten de Fenton no-cataliacutetico (izq) Espectro simulado
utilizando el programa EPR-WINSIM (der)
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
DMPO oxidado
N+
O-
+ OHNO
OH
Campo Magneacutetico G
Resultados y discusioacuten
93
cumarina + OHbull cumarinabull + H2O
cumarinabull + DMPO [cumarina-DMPO]
Figura 518 Espectro simulado para la formacioacuten del spin aducto [cumarina-
DMPO] utilizando el programa EPR-WINSIM
Como se presenta en la Tabla 56 tanto los aacutecidos orgaacutenicos como la cumarina
precursora y sus derivados presentaron reactividad muy semejante En las
condiciones de estudio para todos los compuestos se obtuvo un valor sobre el 90
indicando su poder de inactivacioacuten del radical resultado que superoacute al descrito en la
literatura para el estaacutendar Trolox
Estudios previos realizados en estructuras cumariacutenicas simples semejantes al
precursor 1 de esta investigacioacuten permiten comparar algunos resultados Peacuterez-Cruz y
colaboradores150
indican un 29 de inactivacioacuten para el derivado monohidroxilado de
la cumarina 1 diferencia que puede explicarse por la ausencia del ndashOH en posicioacuten 8
que aumenta su actividad El compuesto con grupos ndashOH en posicioacuten 6 y 7 presentoacute
un apagamiento del 51 Figueroa y colaboradores presentan tambieacuten un estudio en
que las cumarinas monohidroxiladas presentan valores de 23 y 56 de la
inactivacioacuten del radical OH corroborando lo encontrado anteriormente151
Resultados y discusioacuten
94
Tabla 56 Porcentajes de inactivacioacuten del radical hidroxilo (OHmiddot)
Compuesto de inactivacioacuten bullOH
(plusmnSD)
1 923 plusmn 74
2 983 plusmn 27
3 995 plusmn 08
4 927 plusmn 29
9 981 plusmn 18
10 982 plusmn 25
11 980 plusmn 99
Trolox 31plusmn 25a
aRef149 Figueroa R et al Future Med Chem 2013
Los resultados obtenidos con esta teacutecnica indican la reactividad relativa que tienen los
compuestos propuestos frente al radical OH Al considerar que el tiempo de vida del
radical hidroxilo y del spin trap DMPO es del orden de 10-9
s se observa que todos los
compuestos ensayados tuvieron la capacidad de competir con el DMPO en el proceso
de inactivacioacuten del radical evidenciado por la sentildeal de control que disminuyoacute casi en
su totalidad para todos los casos siendo menor en la cumarina precursora 1 y el aacutecido
4 siguiendo ambos compuestos la misma tendencia que se observara en los ensayos
Resultados y discusioacuten
95
anteriores Independientemente que el radical ensayado en este experimento es de una
alta reactividad y escasa selectividad el hecho de que se obtuvieran altos valores de
actividad para los compuestos propuestos indica que eacutestos se presentan como buenos
candidatos como inactivadores de la especie OH
Finalmente se observa que los derivados 9 10 y 11 presentaron un valor de
reactividad superior al de la cumarina precursora obtenieacutendose de esta forma un
aporte a la reactividad en cada nueva estructura propuesta frente al heterociclo de
partida 1 para este ensayo En cuanto a la reactividad relativa de la serie no se
encontroacute una diferencia significativa entre los compuestos ensayados precursores y
derivados mostraron valores cercanos en cuanto al de inactivacioacuten del radical
alrededor del 90
Resultados y discusioacuten
96
544 Estudio de reactividad frente al anioacuten radical superoacutexido O2-
Dentro de las diversas aplicaciones desarrolladas para las teacutecnicas electroquiacutemicas se
encuentran los ensayos de determinacioacuten de la capacidad antioxidante en distintos
medios152
y en muestras como bebidas153
vegetales154
mediciones in situ sobre piel
humana155
por mencionar algunos ejemplos Un reciente review (Pisoschi y
colaboradores 2015) describe las contribuciones realizadas con respecto a la
determinacioacuten de actividad antioxidante empleando exitosamente la voltametriacutea
ciacuteclica voltametriacutea de pulso diferencial voltametriacutea de onda cuadrada amperometriacutea
y potenciometriacutea156
las que ademaacutes se complementan con otras teacutecnicas en este tipo
de estudios157158
En esta parte de la investigacioacuten se determinoacute la reactividad de los compuestos frente
al anioacuten radical superoacutexido cuya generacioacuten electroquiacutemica en la superficie del
electrodo por reduccioacuten de oxiacutegeno disuelto mediante la teacutecnica de voltametriacutea ciacuteclica
ha sido ampliamente estudiada en nuestro grupo de trabajo159160110
y por otros
autores161
Como se esperaba tras la adicioacuten sucesiva de aliacutecuotas de todos los compuestos
estudiados hubo un decaimiento en la corriente de pico anoacutedica (Ipa0) (ejemplo del
resultado para el precursor 1 en la Figura 519) Esto permitioacute calcular el valor del
iacutendice antioxidante 50 (IA50) el cual se define como la concentracioacuten de sustrato
necesaria para obtener una disminucioacuten del 50 en la corriente Ipa0 Esta corriente es
Resultados y discusioacuten
97
directamente proporcional a la concentracioacuten de anioacuten superoacutexido presente por lo
que su disminucioacuten es un indicador de la capacidad del sustrato para inactivar la
especie radical generada in situ
Figura 519 Voltamogramas ciacuteclicos del par redox correspondiente al anioacuten
superoacutexido tras antildeadir aliacutecuotas del compuesto 1 DMF + HFFTBA 02 M 01 Vs
Tras obtener los voltamogramas ciacuteclicos para cada compuesto se procedioacute a
determinar el paraacutemetro adimensional (Ipa0-Ipa
SIpa
0) y se graficoacute con respecto a la
concentracioacuten de sustrato en solucioacuten (Figura 520) obtenieacutendose relaciones de tipo
lineal en que los valores del coeficiente de correlacioacuten r estuvieron entre 099777 y
097267
-10 -08 -06 -04 -02
Ipa0
10A
blanco
0049 mM
0099 mM
0149 mM
0199 mM
0249 mM
0299 mM
E vs Ag|AgCl V
Resultados y discusioacuten
98
007 014 021 02800
03
06
09
r = 099074
IA 50
(Ip
a0-
Ipa
S)
Ip
a0
Concentracioacuten mM
Figura 520 Graacutefica del paraacutemetro adimensional (Ipa0-Ipa
SIpa
0) vs concentracioacuten de
sustrato para el compuesto 1 (Destacado en verde el valor de IA50)
Junto con el valor de concentracioacuten IA50 la pendiente de las rectas entrega tambieacuten
informacioacuten con respecto a la reactividad de los compuestos frente al anioacuten
superoacutexido donde un mayor valor de la pendiente indica que el compuesto posee una
mayor actividad no obstante los autores que desarrollaron el meacutetodo hacen notar que
se utiliza preferentemente el iacutendice IA50 como valor para caracterizar de manera
adecuada la actividad de los compuestos propuestos frente el radical de forma
anaacuteloga al concepto de IC50 (concentracioacuten inhibitoria aplicada en sistemas
bioloacutegicos en relacioacuten a la cantidad de compuesto necesario para inhibir en un 50 el
crecimiento de una poblacioacuten de microorganismos)
Como se observa en los resultados (Tabla 57) la cumarina de partida 1 presenta un
valor mayor de IA50 (0187 mM) en comparacioacuten con los compuestos hiacutebridos 9 10 y
Resultados y discusioacuten
99
11 por lo que la adicioacuten de los fenoles a la estructura cumariacutenica fue un aporte a su
reactividad frente a la especie radical O2-
Tabla 57Valores de IA50 obtenidos para los compuestos estudiados
a Valor de estaacutendar Tolox ref 92
El derivado de aacutecido gaacutelico 10 presentoacute el menor valor de iacutendice antioxidante y por
consiguiente fue el mejor inactivador del anioacuten superoacutexido formado en la superficie
del electrodo puesto que se necesita una menor concentracioacuten de este derivado
(0064 mM) para apagar el 50 radical Junto con esto fue el compuesto que presentoacute
el fenoacutemeno de sinergia dentro de la serie con un valor de concentracioacuten menor
Compuesto IA 50 mM
(plusmnSD)
1 0183 plusmn 0007
2 0125 plusmn 0006
3 0104 plusmn 0004
4 0115 plusmn 0005
9 0141 plusmn 0011
10 0064 plusmn 0004
11 0137 plusmn 0002
Troloxa
197
Resultados y discusioacuten
100
requerida para inactivar el radical con respecto a cada uno de sus precursores (1 y 3)
El segundo mejor inactivador de O2-
fue el compuesto 11 con un valor de IA50 de
0137 mM y finalmente se tiene al derivado 9 con 0141 mM Este comportamiento
puede deberse a fenoacutemenos de difusioacuten de las moleacuteculas en el medio junto con su
reactividad en la superficie del electrodo
En este ensayo frente al radical O2-
al igual que el anterior (inactivacioacuten de la especie
OHbull) se pudo obtener informacioacuten con respecto al comportamiento de los
compuestos en un medio aproacutetico resultados que son de intereacutes ya que se pueden
considerar como una aproximacioacuten quiacutemica de tipo in vitro de los conocidos
fenoacutemenos de estreacutes oxidativo que ocurren en estructuras como las bio-membranas
donde participan especies reactivas oxigenadas161162
Finalmente se puede establecer un orden estimativo para la actividad de los derivados
y la cumarina 10 gt 3 gt 4 gt 2 gt 11 gt 9 gt 1 Todos los compuestos ensayados tuvieron
una reactividad superior al estaacutendar Trolox
Resultados y discusioacuten
101
545 Determinacioacuten de capacidad antioxidante celular (CAC)
Con el objeto de abordar los fenoacutemenos que involucran especies radicalarias
presentes en sistemas vivos se procede a realizar el estudio de la capacidad
antioxidante de los compuestos en un modelo bioloacutegico simple En este experimento
se utiliza la sonda DCFH-DA la cual difunde pasivamente a traveacutes de la membrana
celular al ingresar al citosol se transforma en el compuesto DCFH (no fluorescente)
que emite al entrar en contacto con especies oxidantes del tipo EROs y ERNs En los
experimentos realizados las ceacutelulas fueron estresadas mediante el compuesto ABAP
(generador de radical peroxilo) y se observoacute coacutemo los nuevos derivados en estudio
podiacutean contrarrestar este evento oxidativo al interior de la ceacutelula Los resultados
obtenidos se resumen en la Tabla 58
Los valores experimentales obtenidos en esta etapa indicaron una bio-disponibilidad
baja con una CAC menor al 50 para los nuevos compuestos 9 10 y 11 ademaacutes en
todos los casos se encontroacute un porcentaje menor de CAC de los derivados respecto a
los precursores respectivos 1 2 3 y 4 Para una concentracioacuten de 10 microM de
compuesto se obtuvieron valores muy semejantes (alrededor del 70) para los
precursores ensayados
Resultados y discusioacuten
102
Tabla 58 Valores obtenidos para la capacidad antioxidante celular (CAC)
concentraciones 1 microM y 10 microM de cada compuesto
Compuesto CAC 1 microM CAC 10 microM
1 696plusmn 50 727plusmn 13
2 730plusmn 26 739plusmn 07
3 662plusmn 19 701plusmn 01
4 477plusmn 25 665plusmn 26
9 381plusmn 55 499plusmn 66
10 178plusmn 45 395plusmn 128
11 345plusmn 31 234plusmn 108
En los resultados anteriores llaman la atencioacuten los bajos valores obtenidos en el
ensayo de CAC para los derivados polifenoacutelicos en comparacioacuten con los ensayos
realizados en sistemas no bioloacutegicos en que se obtuvieron buenos resultados en ellos
se pudo apreciar el fenoacutemeno de sinergia (en algunos casos) y un incremento en la
actividad de todos los derivados frente a la cumarina precursora de forma individual
Para explicar este comportamiento y complementar estos resultados se procedioacute a
seleccionar de manera racional los tres derivados obtenidos 9 10 y 11 y se determinoacute
su Hidrofobicidad Relativa en conjunto con el precursor cumariacutenico 1 (el cual
presentoacute valores de CAC alrededor del 70 cercano a lo obtenido en los precursores
Resultados y discusioacuten
103
aacutecidos) ensayo que entrega informacioacuten con respecto a la lipofilia relativa de la serie
(en funcioacuten de tiempos de retencioacuten) pudiendo dar respuesta al fenoacutemeno observado
555 Estudio de hidrofobicidad relativa
En el estudio de nuevos compuestos disentildeados como potenciales faacutermacos una de las
propiedades fisicoquiacutemicas de intereacutes es la lipofilia valor que puede determinarse
mediante distintos meacutetodos electroforesis capilar cromatografiacutea liacutequida de alta
resolucioacuten (HPLC) y determinando el coeficiente de particioacuten aguaoctanol entre
otras Junto con la metodologiacutea empiacuterica se han desarrollado diversas herramientas
computacionales con softwares que permiten calcular el valor para logP y logD
obtenieacutendose buenas correlaciones entre compuestos de una familia de estructuras
semejantes en los que se realizan variaciones a su esqueleto Los valores asiacute
calculados y entregados por el programa se consideran de una confiabilidad
razonable163
En el caso de este estudio se determinoacute la lipofilia relativa para los derivados 9 10 y
11 junto con el precursor 1 mediante HPLC en fase reversa donde se espera obtener
una serie relativa de tiempos de retencioacuten entre los compuestos que deacute cuenta de su
lipofilia Se utilizoacute esta teacutecnica por tratarse de una medicioacuten simple raacutepida y
ampliamente descrita en la literatura para nuevos compuestos en que la fase
estacionaria de la columna C18 simula la fase no polar y la fase moacutevil es la fase
Resultados y discusioacuten
104
acuosa asiacute a traveacutes de la columna se llevan a cabo muacuteltiples equilibrios de particioacuten
entre la fase acuosa y orgaacutenica En la medida en que el compuesto analizado sea maacutes
afiacuten a la fase estacionaria (relacionado con un mayor tiempo de retencioacuten) eacuteste seraacute
maacutes lipofiacutelico y viceversa Los resultados (Tabla 59) muestran que de acuerdo a los
tiempos de retencioacuten obtenidos (5138 5760 4031 y 4695 minutos) el orden
relativo de lipofilia fue el siguiente
Tabla 59 Valores obtenidos para el tiempo de retencioacuten experimental de los
compuestos
Compuesto Tiempo de retencioacuten
(min)
1 5138
9 5760
10 4031
11 4695
La Figura 521 indica el orden de lipofilia relativa encontrada para los derivados y su
precursor cumariacutenico En forma general se observaron valores de tiempo de
retencioacuten cercanos Se aprecioacute que el derivado de aacutecido cafeico 9 fue el compuesto
que encabezoacute la serie lo que se puede explicar debido a la presencia de un doble
enlace en su estructura confirieacutendole mayor apolaridad (por tanto hidrofobicidad) a
Resultados y discusioacuten
105
O
OH
HO O
Cl
O
OH
OH O
OH
OH
O
O
OHO O
O
O
OH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
la moleacutecula El segundo en la serie fue el compuesto clorado 1 en el cual el
sustituyente haloacutegeno es un aporte a la lipofilia del compuesto En el caso de las
estructuras 10 y 11 se encontroacute que el derivado de aacutecido gaacutelico presentoacute el menor
valor relativo debido a la presencia de un grupo ndashOH adicional en el anillo aromaacutetico
que como se esperaba tuvo la mayor tendencia hidrofiacutelica
9 1 11 10
Figura 521 Hidrofobicidad relativa de los derivados y la cumarina precursora
Para complementar este resultado experimental se realizoacute el caacutelculo teoacuterico para el
valor de logD mediante herramienta Marvin Sketch del software libre ChemAxon164
y
se establecioacute su correlacioacuten con el valor experimental obtenido para CAC en
concentracioacuten 10 microM El resultado de esta correlacioacuten se presenta en la Figura 522
Aumento de la lipofilia = aumento en el tiempo de retencioacuten
Resultados y discusioacuten
106
Figura 522 Correlacioacuten entre el valor de logD teoacuterico y CAC experimental a
10 microM de cada compuesto El valor logD se obtuvo a traveacutes de la herramienta Marvin
Sketch del software ChemAxon164
Considerando estos resultados para este modelo experimental propuesto en el ensayo
de CAC se observa que la lipofilia no seriacutea el uacutenico factor relacionado con los bajos
valores de capacidad antioxidante celular (CAC) obtenidos para los compuestos 9 10
y 11 ya que por ejemplo la cumarina 1 presentoacute valores de CAC sobre el 70 y fue
el segundo compuesto de la serie de hidrofobicidad relativa experimental con un
valor cercano de tiempo de retencioacuten al derivado 9 (el cual tuvo valores de CAC bajo
el 50) De igual forma se aprecia la misma tendencia al correlacionar el valor de
CAC con el logD teoacuterico donde el compuesto 1 independientemente de tener una
lipofilia semejante a los derivados polifenoacutelicos (al igual que en la serie de tiempos
de retencioacuten) siacute mostroacute una biodisponibilidad superior a los derivados y muy
-3 -2 -1 0 1 2 3 4
20
40
60
80
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OOH
HO O
Cl
OHO O
O
OOH
OH
OH
OOH
OH O
OH
OH
O
O
logDteor
C
AC
(1
0
32
4
Resultados y discusioacuten
107
semejante a los aacutecidos benzoicos (2 3 y 4) los cuales muestran valores negativos de
logD debido a su menor lipofilia
Por tratarse de un sistema bioloacutegico (ceacutelulas epiteliales) con muacuteltiples variables que
afectan la actividad de los compuestos estudiados se pueden considerar diversos
factores presentes en el medio ensayado que pueden dar respuesta al fenoacutemeno
observado Uno de ellos es la estructura de la membrana celular que contiene diversas
estructuras como por ejemplo el citocromo P (CYP) que es un complejo enzimaacutetico
involucrado en el metabolismo de faacutermacos siacutentesis de biomoleacuteculas y diversas
biotransformaciones de moleacuteculas a nivel celular165
Otro factor presente es la
existencia de enzimas hidroliacuteticas en el citosol celular como es el caso especiacutefico de
las carboxilesterasas (presentes en ceacutelulas epiteliales de intestino hiCE y otros
oacuterganos) las cuales son capaces de escindir diversos grupos funcionales tales como
amidas eacutesteres carbamatos y convertirlos en sus respectivos precursores (alcohol y
aacutecido) 166
Considerando que para este experimento en un modelo bioloacutegico in vitro simple se
emplearon ceacutelulas epiteliales de intestino (EAhy 926 (ATCC CRL-2922)) es posible
que el comportamiento observado se deba a la existencia de diversos fenoacutemenos e
interacciones posibles de los compuestos tanto a nivel de membrana como de
citoplasma Cabe destacar que al comparar las experiencias realizadas en un medio no
bioloacutegico los resultados en este caso se invierten al emplear una metodologiacutea que
involucra un medio bioloacutegico No necesariamente se encuentra un comportamiento
Resultados y discusioacuten
108
anaacutelogo en ambos medios de ensayo debido a la mayor complejidad y variables
asociadas a un sistema que involucra estructuras vivas independientemente de la
simplicidad o lo acotado del mismo
556 Estudios Teoacutericos optimizacioacuten de estructuras y determinacioacuten del Iacutendice
de Fukui
Con el objeto de racionalizar el estudio realizado y poder discriminar entre los
distintos sitios reactivos de los derivados se determinoacute el iacutendice de Fukui fk0
relacionado con un ataque de tipo radicalario Baacutesicamente es el promedio
correspondiente a las reacciones de ataque nucleofiacutelico fk- y electrofiacutelico fk
+(Ecuacioacuten
57) como se describe en el trabajo de Aliaga y Lissi donde se aborda el estudio
teoacuterico y experimental que compara la actividad anti-radicalaria de los polifenoles
rutina y quercetina167
1198911198960 =
119891119896minus+ 119891119896
+
2 Ecuacioacuten 57
Este iacutendice es un descriptor de reactividad local en los aacutetomos de oxiacutegeno que
participan en las reacciones de los grupos catecol presentes Este tipo de anaacutelisis
resulta adecuado para determinar los sitios de reaccioacuten preferentes en moleacuteculas
complejas con diversos centros reactivos168
Los resultados obtenidos indican que en
Resultados y discusioacuten
109
la cumarina precursora 1 el ataque radicalario ocurriraacute primero en el oxiacutegeno en
posicioacuten 7 debido al mayor valor de fk0
(0071) por otra parte no se observaron
cambios significativos en los valores de fk0 al formar parte de los derivados 10 y 11
para los aacutetomos de oxiacutegeno en posicioacuten 7 y 8 (aquellos involucrados en la capacidad
antioxidante de la moleacutecula) Al formar parte del derivado 9 si se observa una
disminucioacuten en su reactividad (fk0
O7 = 00078 y fk0
O8 = 00021) haciendo menos
probables estos dos sitios a un ataque radicalario en la moleacutecula (Tabla 510)
Los valores obtenidos para el iacutendice de Fukui indican que en el derivado 9 el sitio
maacutes probable para un ataque radicalario seraacute el catecol presente en el anillo benceacutenico
(proveniente del aacutecido cafeico) de preferencia en el oxiacutegeno en posicioacuten 4
(fk0
O4 = 00489) A diferencia del derivado de aacutecido cafeico en el caso de los
compuestos 10 y 11 el sitio preferente de reaccioacuten seraacute el anillo cumariacutenico
conservaacutendose el oxiacutegeno en posicioacuten 7 del heterociclo como sitio maacutes reactivo En
las Figuras 523 a 526 se presentan las estructuras optimizadas en 3D para el
precursor 1 y sus derivados polifenoacutelicos 9 10 y 11
Resultados y discusioacuten
110
Tabla 510 Valores de Iacutendice de Fukui fk para los compuestos en estudio
Compuesto Iacutendice de Fukui
fk0
Iacutendice de Fukui
fk-
O7 00771
O7 01373
O8 00391
O8 00757
O7 00078 O7 00072
O8 00021 O8 00036
O3 00389 O3 00779
O4 00489 O4 00890
O7 00719 O7 01276
O8 00365 O8 00716
O3 00025 O3 00050
O4 00025 O4 00049
O5 00002 O5 00004
O7 00739 O7 01316
O8 00378 O8 00742
O3 00004 O3 00008
O4 00003 O4 00005
OHO O
O
OOH
OH
OH
7
8
3
4
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
7
8
3
4
5
OOH
HO O
OH
OH
O
O
7
8
3
4
O
OH
HO O
Cl
7
8
Resultados y discusioacuten
111
OOH
OHO
Cl
Figura 523 Estructura optimizada en 3D para el precursor 1 utilizando DFT
OOH
OH O
OH
OH
O
O
Figura 524 Estructura optimizada en 3D para el derivado 9 utilizando DFT
Resultados y discusioacuten
112
Figura 525 Estructura optimizada en 3D para el derivado 10 utilizando DFT
OHO O
O
OOH
OH
OH
Figura 526 Estructura optimizada en 3D para el derivado 11 utilizando DFT
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
Resultados y discusioacuten
113
6 Discusioacuten General
Respecto del posible mecanismo de reaccioacuten electro-oxidativo se consideran las
siguientes evidencias teoacutericas y experimentales
En primer lugar como se esperaba los experimentos electroquiacutemicos de electro-
oxidacioacuten de los compuestos mostraron las sentildeales correspondientes a los grupos
ndashOH presentes en todas las estructuras Junto con esto los resultados de la graacutefica
Ipa vs vfrac12
indican la existencia de un proceso di-electroacutenico en los precursores y los
derivados (para la primera sentildeal oxidativa) lo que implica que comparten el mismo
mecanismo
Posteriormente se comproboacute la existencia de la especie radicalaria detectada mediante
oxidacioacuten electroquiacutemica seguida por resonancia de espiacuten electroacutenico con los
respectivos resultados de las simulaciones espectrales realizadas
En un siguiente punto se determinaron los valores teoacutericos de reactividad local
encontrados mediante el caacutelculo del iacutendice de Fukui El valor de fkndash
permitioacute
identificar los lugares con mayor reactividad frente a un ataque electrofiacutelico por tanto
las zonas en la moleacutecula puntuales con un alto valor para este iacutendice tenderaacuten a ceder
electrones con mayor facilidad en un proceso oxidativo Las estructuras optimizadas
en 3D indican que las zonas en color celeste (Figuras 523-526) corresponden a
aquellas con mayor densidad electroacutenica y por tanto estaacuten maacutes propensas a ceder
Resultados y discusioacuten
114
electrones en un proceso oxidativo Las zonas color lila representan los sitios con
menor densidad electroacutenica Para el compuesto 1 los ndashOH en el heterociclo presentan
mayor densidad electroacutenica lo que se aprecia de igual forma en los derivados 10 y 11
mientras que la zona del anillo benceacutenico se presenta con una baja densidad
electroacutenica Un fenoacutemeno diferente se aprecia para el derivado 9 donde la mayor
densidad electroacutenica se aprecia en la estructura benceacutenica cuyos grupos ndashOH
presentan el mayor valor de fk-
Este resultado teoacuterico racional complementa lo observado en el experimento descrito
con REE y electro-oxidacioacuten conjunta ya que los valores para las constantes de
acoplamiento hiperfino obtenidas en cada caso tambieacuten sentildealaron en cuaacutel de los dos
catecoles presentes ocurre la formacioacuten de la especie radical y por ende doacutende se
inicia el proceso de oxidacioacuten resultados corroboradas con el estudio teoacuterico
realizado De esta forma para el derivado 9 el proceso oxidativo se inicia en los -OH
ubicados en posicioacuten 3 y 4 que presentaron valores de fkndash
00779 y 00890
respectivamente y cuyas constantes de acoplamiento hiperfino son coherentes con
una interaccioacuten que involucra tres protones aquellos ubicados en las posiciones 2 5 y
6 del anillo benceacutenico El mismo anaacutelisis realizado para las estructuras 10 y 11 indica
que el proceso oxidativo ocurre primero en el anillo de la cumarina en los -OH en
posicioacuten 7 y 8 con valores del descriptor de reactividad local fkndash de 01276 y 00716
respectivamente para el derivado de aacutecido gaacutelico y en el caso del derivado de aacutecido
protocateacutequico con fkndash 01316 y 00742 para los oxiacutegenos en posicioacuten 7 y 8 De igual
forma los valores para las constantes de acoplamiento fueron consistentes con esta
Resultados y discusioacuten
115
informacioacuten experimental evidenciando la interaccioacuten entre dos protones (aquellos en
posicioacuten 5 y 6 del heterociclo cumariacutenico)
Esta diferencia encontrada para el proceso electro-oxidativo entre los derivados se
puede explicar debido a la existencia de un doble enlace conjugado adicional presente
soacutelo en el compuesto 9 derivado del aacutecido cafeico (ausente en 10 y 11) el cual le
confiere mayor deslocalizacioacuten (estabilidad) al radical que se forma como
intermediario en el proceso oxidativo
Los estudios presentes en la literatura sobre la oxidacioacuten de estructuras polifenoacutelicas
en medio aproacutetico presentan evidencias tanto teoacutericas como empiacutericas que ampliacutean la
visioacuten sobre la complejidad y posibilidades mecaniacutesticas en la oxidacioacuten de
estructuras polifenoacutelicas Basadas en modelos de naturaleza bioloacutegica como el
Fotosistema II presente en estructuras vegetales y otros ejemplos se plantea que una
viacutea de oxidacioacuten factible es a traveacutes de un mecanismo de tipo concertado donde se
obtiene el radical fenoxil (ArObull) en un paso directo en que el protoacuten y el electroacuten se
transfieren de manera conjunta (Figura 61 destacado en rojo) planteamiento que
considera factores de tipo energeacutetico a diferencia de los estudios claacutesicos con respecto
a este proceso seguacuten el cual la electro-oxidacioacuten se inicia con la peacuterdida de 1ē (etapa
electroquiacutemica) para formar el catioacuten radical(ArObull+) seguido de la peacuterdida de un
H+(etapa quiacutemica) para formar el radical fenoxil (ArObull) (Figura 62)
En el caso de los compuestos estudiados en esta investigacioacuten los valores de la
pendiente de Tafel encontrados para los compuestos (sobre 88 mVdec) sugieren que
Resultados y discusioacuten
116
el mecanismo de electro-oxidativo que maacutes se ajusta a la evidencia experimental es
por etapas
OH
HO
OH
HO
O
HO
O-
HO
-e- + B
+e- + HB+
+ B-e-
+e-
+e-
-e-
+ HB+
+ B
+HB+
Figura 61 Esquema de reaccioacuten para un mecanismo concertado de electro-
oxidacioacuten fenoacutelica Adaptacioacuten referencia 120
OH
HO - e
+ e
OH
HO
-H+
O
HO
Figura 62 Esquema de reaccioacuten para estructuras fenoacutelicas mecanismo electro-
oxidativo en etapas
Resultados y discusioacuten
117
Con respecto a los ensayos de actividad antioxidante realizados la Tabla 61 permite
comparar y estimar en conjunto los resultados obtenidos a traveacutes de las diferentes
metodologiacuteas empleadas
En forma general los resultados indican que la sustitucioacuten propuesta en esta
investigacioacuten en la cumarina dihidroxilada (utilizada como esqueleto de partida) con
distintas estructuras polifenoacutelicas entregoacute resultados positivos en cuanto al aporte
que los nuevos derivados obtenidos presentaron frente a la inactivacioacuten de especies
radicalarias tales como O2- ROO˙ OH˙ y su capacidad reductora (reflejada en el
ensayo FRAP) Para los ensayos realizados en un modelo no bioloacutegico se obtuvieron
valores de actividad en los derivados que superaron a los obtenidos para el precursor
cumariacutenico de forma individual
Cabe mencionar que en los diferentes ensayos y sus resultados se mencionan los
conceptos de reactividad y actividad de los compuestos En el caso de los ensayos
ORAC-FL y FRAP se habla soacutelo de actividad antioxidante ya que con la informacioacuten
que entregan no se puede determinar cuaacutel de los distintos grupos ndashOH presente en la
moleacutecula es el que reacciona primero Diferente es lo que ocurre en el ensayo frente
al radical hidroxilo en que se establece una competencia entre el atrapador (DMPO) y
el compuesto por inactivar al OHbull debido a que ambos tienen una vida media corta
(10-9
s) por tanto la reaccioacuten entre el antioxidante y el radical es raacutepida y el ndashOH maacutes
reactivo de la moleacutecula es el que inactiva a la especie y se puede mencionar como
reactividad Lo mismo ocurre para el ensayo frente al anioacuten radical superoacutexido en que
tambieacuten se mencionan los resultados como reactividad frente al radical
Resultados y discusioacuten
118
Tabla 61 Cuadro comparativo de los resultados en la determinacioacuten de capacidad
antioxidante para la cumarina y sus derivados
Compuesto ORAC-FL
FRAP
eq Trolox
10 microM
inactivacioacuten
OHmiddot
CAC
1 microM 10 microM
O2-
IA 50 mM
1 091 plusmn 003 1302plusmn 160 923 plusmn 74 696 plusmn 50 727 plusmn 13 0183plusmn0007
2 347 plusmn 010 2727 plusmn 321 983 plusmn 27 730plusmn 26 739plusmn07 0125 plusmn 0006
3 391 plusmn 009 4768 plusmn 215 995 plusmn 08 662plusmn 19 701plusmn01 0104 plusmn 0004
4 069 plusmn 001 868 plusmn 93 927 plusmn 29 477plusmn 25 665plusmn26 0115 plusmn 0005
9 239plusmn0027 2052 plusmn151 981 plusmn 18 381plusmn55 499 plusmn 66 0141plusmn0011
10 174 plusmn 005 28046plusmn188 982 plusmn 25 178plusmn45 395 plusmn128 0064plusmn0004
11 262 plusmn 004 2624 plusmn 236 980 plusmn 99 345plusmn31 234 plusmn 108 0137plusmn0002
Por otra parte en los ensayos ORAC-FL y FRAP se observoacute que los valores de
actividad para los aacutecidos cafeico 2 y gaacutelico 3 fueron superiores a los obtenidos para
sus derivados hiacutebridos 9 y 10 respectivamente En el ensayo frente al anioacuten
superoacutexido se encontroacute que los aacutecidos cafeico 2 y protocateacutequico 4 presentaron
resultados superiores en cuanto a reactividad que sus respectivos derivados hiacutebridos 9
y 11
Resultados y discusioacuten
119
En la literatura se encuentra la caracterizacioacuten de los aacutecidos benzoicos y otros
antioxidantes polifenoacutelicos naturales como moleacuteculas altamente polares lo que en
algunos limita su uso en medios como bio-membranas emulsiones y micelas por lo
que la formacioacuten de sus derivados eacutesteres se utiliza como una estrategia para
aumentar su lipofilia y por lo tanto la biodisponibilidad de estos compuestos en
medios no acuosos169170
investigacioacuten que ha dado origen a la formulacioacuten de los
denominados ldquoantioxidantes lipofiacutelicosrdquo171172
los que han demostrado ser eficientes
como antioxidantes en bio-membranas resultados que se describen en el trabajo
realizado por Tai y colaboradores donde se ensayaron eacutesteres de aacutecido vainilliacutenico
que ademaacutes de presentar buenos valores de iacutendice ORAC-FL inhibieron el proceso
de hemoacutelisis en eritrocitos de mamiacutefero173
Junto con lo anterior estaacute descrita la relacioacuten existente entre la estructura de los
aacutecidos benzoicos y su actividad antioxidante la que es atribuida a diversas
caracteriacutesticas presentes en su esqueleto tales como i) nuacutemero y posicioacuten de grupos ndash
OH en la moleacutecula ii) sustituyentes alcoxilo en posicioacuten orto al ndashOH iii) presencia
de grupos -COOH -COOR -CH=CH-CH2-174
Al apreciar las estructuras de los
derivados propuestos se infiere que las diferencias encontradas en la actividad de los
aacutecidos antes y despueacutes de la unioacuten a la cumarina estaacuten relacionadas con dicha
sustitucioacuten En el caso del aacutecido gaacutelico que presenta un valor de ORAC de 391 frente
a un valor de 174 para su derivado 10 y en el ensayo FRAP se encontroacute un valor de
4768 vs un 3182 para el hiacutebrido se puede sentildealar que no se aprecioacute un aumento de
Resultados y discusioacuten
120
actividad antioxidante para los eacutesteres con respecto al aacutecido del que provienen seguacuten
con lo descrito por algunos autores175176
Junto con lo anterior se forma un eacutester de
aacutecido gaacutelico con un sustituyente voluminoso (la estructura cumariacutenica) pudiendo
disminuir la coplanaridad en el sistema aromaacuteticocarbonilo lo que implica una menor
estabilizacioacuten del radical formado en la reaccioacuten frente a la especie ROObull para el
ensayo ORAC-FL y la capacidad reductora en el ensayo FRAP Otro punto a
considerar es que para este derivado se observa el fenoacutemeno mencionado por Rice-
Evans175
y otros autores con respecto a que un nuacutemero mayor de grupos ndashOH en el
anillo benceacutenico no implica necesariamente un aumento en la actividad antioxidante
de un derivado polifenoacutelico
Para el caso observado en el aacutecido cafeico y su derivado 9 se aprecia el mismo
fenoacutemeno de disminucioacuten de actividad del aacutecido 2 frente al eacutester como lo descrito
para el aacutecido gaacutelico y su derivado en los ensayos ORAC-FL y FRAP con la
diferencia que esta disminucioacuten no es tan draacutestica lo que se atribuye a la presencia del
doble enlace en la estructura que confiere mayor estabilidad por resonancia al radical
formado
El valor de reactividad local del iacutendice de Fukui fk0
-relacionado con los fenoacutemenos
de ataque radicalario- entregoacute informacioacuten con respecto a los sitios de los derivados
donde la actividad anti-radicalaria es maacutes probable Asiacute para el compuesto 9 esta
actividad ocurre en el anillo benceacutenico en primer lugar y posteriormente en la
cumarina Para los derivados 10 y 11 la mayor probabilidad de que se produzca el
Resultados y discusioacuten
121
ataque radicalario es en el heterociclo cumariacutenico y posteriormente en el catecol del
anillo benceacutenico Estos resultados corroboran con los valores experimentales y las
simulaciones realizadas en espectroscopia de resonancia electroacutenica de espiacuten (REE)
donde la actividad antioxidante del compuesto 9 ocurre con mayor probabilidad en el
anillo benceacutenico proveniente de la fraccioacuten del aacutecido cafeico (donde se encuentra el
doble enlace que le confiere mayor estabilidad al radical formado como intermediario
de reaccioacuten) mientras que en los derivados 10 y 11 esta actividad ocurre en el
heterociclo cumariacutenico
Se observa que los resultados de capacidad antioxidante para los derivados
polifenoacutelicos variaron entre un meacutetodo y otro no hubo correlacioacuten entre los valores
obtenidos en la capacidad antioxidante obtenidos en las distintas metodologiacuteas Este
resultado concuerda con lo esperado ya que cada experiencia realizada implica una
especie radicalaria diferente y cada una de ellas posee reactividades distintas (t12 O2-
del orden de los ms t12 OHbull ~ 10-9
s t12 ROObull ~ 10 ms) Para cada ensayo se
obtuvo un distinto orden relativo de reactividad entre los derivados y sus precursores
Se establece la relacioacuten entre el potencial Eonset y los resultados obtenidos en el
ensayo de capacidad antioxidante frente a anioacuten superoacutexido realizado en medio
aproacutetico (Figura 63) Para el ensayo de reactividad frente a O2-
se puede establecer
una correlacioacuten donde una disminucioacuten en el potencial de oxidacioacuten disminuye el
valor de IA50 para 5 de los 7 compuestos estudiados Por tanto a medida que el
Resultados y discusioacuten
122
potencial se hace menos positivo aumenta la reactividad de los compuestos frente al
anioacuten superoacutexido presentaacutendose una relacioacuten entre actividad antioxidante y Eonset
para este ensayo
Figura 63 Correlacioacuten entre el potencial de oxidacioacuten Eonset y los ensayos frente a
anioacuten superoacutexido
Un menor potencial de oxidacioacuten para los grupos ndashOH presentes en los compuestos
implica una mayor facilidad para oxidarse (por ende una mayor densidad de carga
electroacutenica para ceder) y por tanto un incremento en la capacidad antioxidante para
este ensayo
Se puede observar que el compuesto 4 (aacutecido protocateacutequico) posee un valor de IA50
de 0115 mM el cual se encuentra entre los valores encontrados para el aacutecido cafeico
y el aacutecido gaacutelico pero su valor de Eonset es mayor diferenciaacutendose de la tendencia
049 056 063 070 077
006
009
012
015
018
11
3
1
42
9
10
Eonset
vs Ag|AgCl V
IA50
mM
Resultados y discusioacuten
123
encontrada Junto con lo anterior el compuesto 4 presentoacute el menor valor para la
pendiente de Tafel (b = 88 mVdec) de toda la serie lo que sugiere una relacioacuten entre
el mecanismo de oxidacioacuten y la capacidad de reaccionar frente a la especie
radicalaria El compuesto 10 presentoacute el mejor valor para IA50 y tambieacuten se diferencia
de la serie de compuestos con respecto al Eonset (cercano al del compuesto 4) a
diferencia del aacutecido su pendiente de Tafel (b = 134 mVdec) indica la presencia de
dimerizaciones posteriores a la formacioacuten del radical fenoxil (y generacioacuten de
compuestos nuevos que tambieacuten pueden reaccionar con el radical) sugiriendo que
ademaacutes del mecanismo de oxidacioacuten hay otros factores que pueden influir como por
ejemplo la difusioacuten de las especies en el medio empleado
El estudio de los compuestos frente al radical hidroxilo reflejoacute que en las condiciones
experimentales empleadas los resultados fueron semejantes por cuanto los valores de
inactivacioacuten del radical en todos los casos fue sobre el 90 Debido a lo anterior se
descarta realizar la correlacioacuten con el potencial Eonset ya que no encontroacute una
diferencia significativa entre los compuestos
Finalmente al considerar los resultados obtenidos para la capacidad antioxidante
celular en un modelo bioloacutegico simple un punto a tener en cuenta es el hecho de que
esta metodologiacutea en particular adolece en cuanto a que es inespeciacutefica con respecto a
la cantidad de compuesto que ingresa en la ceacutelula ya que por las distintas lipofilias
observadas los compuestos tendraacuten una diferente capacidad de ingreso al medio y no
se puede determinar la relacioacuten existente entre la cantidad que ingresa a la ceacutelula
Resultados y discusioacuten
124
versus la reactividad Debido a lo anteriormente descrito estos resultados muestran
principalmente un reflejo de la capacidad de penetracioacuten que tienen los compuestos
hacia el interior de la ceacutelula
Un modo de abordar temaacuteticas de tipo multi-variable-donde se deben considerar
numerosos factores involucrados en un comportamiento o fenoacutemeno- es el empleo de
modelos teoacuterico-computacionales como QSAR (por su sigla en ingleacutes Quantitative
Structure-Activity Relationships) herramienta que se utiliza en la estimacioacuten de
propiedades bioloacutegicas y fisicoquiacutemicas de intereacutes en diversas moleacuteculas entre ellas
polifenoles177
El factor esteacuterico tiene un papel importante en los estudios realizados en medios
celulares siendo el tamantildeo molecular uno de los factores considerados en ensayos de
permeabilidad en futuros faacutermacos ya que un excesivo tamantildeo (entre otras cosas)
dificulta la solubilidad en medio acuoso asiacute como tambieacuten la difusioacuten pasiva de las
moleacuteculas163
Al observar el peso molecular de los compuestos derivados (entre
34427 gmol y 37031 gmol) se puede considerar que el efecto esteacuterico en este caso
no seriacutea la causa principal para el fenoacutemeno observado en el ensayo celular ya que
estaacute descrito que los compuestos no deberiacutean superar un peso de 500 gmol 163
_que no es el caso de estos derivados-
Los resultados obtenidos para este ensayo realizado en un modelo bioloacutegico simple
sugieren que la actividad de los derivados para reaccionar frente a especies
radicalarias podriacutea estar circunscrita a medios lipofiacutelicos como las membranas
Resultados y discusioacuten
125
bioloacutegicas estudio que se podriacutea profundizar empleando un modelo como el
descrito173
para estudiar procesos oxidativos en membranas de eritrocito
Conclusiones
126
7 Conclusiones
La teacutecnica de electro-oxidacioacuten complementada con espectroscopia de
resonancia de espiacuten electroacutenico (REE) resulta uacutetil para identificar especies
radicalarias como intermediarios de la reaccioacuten en este trabajo
La determinacioacuten del iacutendice de Fukui (fk-) en conjunto con los resultados de
resonancia de espiacuten electroacutenico permitieron discriminar los sitios de las
moleacuteculas donde se inicia el proceso oxidativo En el derivado 9 la oxidacioacuten
ocurre primero en el anillo benceacutenico y en los compuestos 10 y 11 el proceso
oxidativo ocurre primero en el heterociclo cumariacutenico
La inclusioacuten de las estructuras polifenoacutelicas al heterociclo cumariacutenico generoacute
un incremento en su capacidad antioxidante en los ensayos no bioloacutegicos
No se obtuvo correlacioacuten para los resultados de capacidad antioxidante entre
las distintas metodologiacuteas empleadas
Se establecioacute la correlacioacuten entre el valor de potencial de inicio de la reaccioacuten
electroquiacutemica (onset) y los resultados para el ensayo frente al anioacuten
superoacutexido A medida que el potencial se hace menos positivo aumenta la
reactividad de los compuestos lo que indica que la transferencia electroacutenica
estaacute involucrada en la etapa determinante de la velocidad
De acuerdo con los resultados de la teacutecnica CAC y la correlacioacuten tanto con la
hidrofobicidad relativa como con el logDteoacuterico la actividad de los derivados
Conclusiones
127
propuestos estaacute circunscrita a aquellos procesos oxidativos que tienen lugar en
medios lipofiacutelicos como por ejemplo membranas bioloacutegicas
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ii
helliprdquoPues dando se recibe
Perdonando se es perdonado
Muriendo se resucita a la vida eternardquo
San Francisco de Asiacutes
iii
Se agradece en forma especial a las siguientes Instituciones por los aportes
financieros recibidos para el desarrollo y teacutermino de esta Tesis
- Conicyt Beca de Doctorado Nacional (2010) Beca de Apoyo de Tesis
(2011) y Beca de Asistencia a Congresos (2013)
- Universidad de Chile por las Becas Mecesup UCh061 (2011) Beca de la
Vicerrectoriacutea de Asuntos Acadeacutemicos (Estadiacuteas cortas de Investigacioacuten 2013)
y a la Facultad de Ciencias Quiacutemicas y Farmaceacuteuticas por Beca de Rebaja
Arancelaria (2015-2016)
- Fondecyt Proyecto ndeg 1110039 Profesor Luis J Nuacutentildeez Vdagger
iv
A G R A D E C I M I E N T O S
Al culminar esta etapa acadeacutemica soacutelo tengo expresiones de profundo
agradecimiento
A Dios -en el cual somos nos movemos y existimos- agradezco la hermosa Familia
que me ha acogido siempre pilar que ha sostenido mi carrera en los diacuteas alegres y en
aquellos aciagos Gracias a mis Padres Joseacute Mariacutea y Elsa por su amor su sabiduriacutea el
apoyo incondicional comprensioacuten y valores entregados desde mi maacutes tierna infancia
gracias por la disciplina y prestancia que me entregaron como legado fruto de una
educacioacuten esmerada empapada de Fe y conviccioacuten tesoros que van en mi espiacuteritu
siempre A mi hermana Andrea y mi cuntildeado Juan gracias por su carintildeo todo su
apoyo y comprensioacuten Tiacuteas Mary Florita y Carmen gracias por estos antildeos de amor
alegriacutea y entrega
Agradezco a mis Profesores Tutores Al Dr Luis Nuacutentildeez V vaya mi maacutes sentido
reconocimiento por invitarme a ser parte de su Investigacioacuten y entregarme
herramientas valiosas en mi formacioacuten de pre y posgrado gracias por la confianza
que depositoacute en miacute por la acogida y comprensioacuten que me brindoacute en tiempos
complejos instancias que siempre conservareacute en mi memoria
A los Profesores Dr J Arturo Squella S y Patricio Navarrete E expreso mi sincero
agradecimiento por su guiacutea y orientacioacuten en este proceso gracias por su acogida y
todos sus aportes para que este trabajo llegase a feliz teacutermino
Expreso mi gratitud a los Profesores Dr Domingo Gonzaacutelez A y Manuel Domiacutenguez
P de la Facultad de Quiacutemica de la Universidad de Sevilla por recibirme en su grupo
de trabajo y compartir parte de esta Investigacioacuten Tener la oportunidad de viajar y
haber conocido y compartido ese corto tiempo de estadiacutea con el Profesor Domingo ha
sido una de las experiencias maacutes valiosas educativas y formativas que conservo de
este periacuteodo como doctorando Gracias por su amistad
Deseo expresar mi agradecimiento a los Profesores de la Comisioacuten Examinadora a la
Dra Soledad Ureta Z por su tiempo buena disposicioacuten y valiosos aportes a este
trabajo al Dr Antonio Zanocco L por sus aportes realizados a este trabajo y su
buena voluntad al Dr David Pessoa M gracias por sus ideas y aportes realizados en
cada instancia En forma especial quiero agradecer al Dr Claudio Olea A quien
junto con ser parte de esta Comisioacuten me abrioacute generosamente las puertas de su
Laboratorio para aprender y desarrollar diversas teacutecnicas aplicadas en esta Tesis lo
cual fue un hermoso aporte Muchas gracias por su confianza por integrarme como
una alumna maacutes por su tiempo paciencia y por todos los momentos alegres que
compartiacute con su grupo Muchas gracias a sus alumnos ex-alumnos y miembros del
Laboratorio al Dr(c) Mauricio Moncada por su dedicacioacuten carintildeo y ensentildeanza en
este proceso gracias por la amistad y el apoyo que me ha brindado
v
Al Dr Germaacuten Barriga por los aportes en el tema de estudios teoacutericos al Dr Michel
Lapier por su colaboracioacuten con los estudios en ceacutelulas al Dr Francisco Mura por su
generosidad y colaboracioacuten al Dr Benjamiacuten Aguilera por su simpatiacutea y ayuda con
temas espectroscoacutepicos a la Dra Mariacutea Carolina Zuacutentildeiga y los MC boys Jorge
Beatriz Manuel Camilo Gabriela Estefaniacutea gracias por sus aportes a este trabajo y
los momentos agradables que compartimos Al Profesor Dr Javier Morales vaya mi
agradecimiento por su ayuda en el estudio y caracterizacioacuten de mis compuestos
Gracias a la Profesora Dra Mariacutea Baeacutez C por su colaboracioacuten y disposicioacuten en la
caracterizacioacuten de mis compuestos
Agradezco a todos los compantildeeros de laboratorio que he conocido en diversas
instancias A la Dra Paulina Sierra a Viviana Claudio Julio la Dra Paola Salgado
Camila Daniela Constanza Dr David Vaacutesquez Gracias por los momentos gratos y
su compantildeerismo
Deseo destacar la valiosa contribucioacuten de los funcionarios de la Biblioteca Ceacutesar
Leyton de nuestra Facultad Muchas gracias por la prontitud y agilidad en su servicio
que siempre ha sido de muy buen nivel
Agradezco ademaacutes la valiosa colaboracioacuten de las Secretarias de Decanato Sra
Cecilia Pinchetti y Ximena Berriacuteos Gracias por su siempre buena disposicioacuten
gentileza y voluntad con cada detalle de todo este proceso
Mi agradecimiento para todo el personal de Secretariacutea de Posgrado por su gestioacuten y
colaboracioacuten en todo el proceso acadeacutemico
vi
INDICE
Informe de aprobacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip i
Agradecimientoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip iii
Iacutendicehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip vi
Iacutendice de figuras y tablashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip x
Glosariohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip xvi
Resumenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip xviii
Summaryhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip xx
1 Introduccioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 1
11 Cumarinashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 1
111 Origen vegetalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 1
112 Rutas de siacutentesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 2
113 Principales aplicacioneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 4
12 Compuestos polifenoacutelicoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 9
121 Origen vegetalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 9
122 Actividad bioloacutegicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 10
123 Polifenoles como antioxidanteshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 11
13 Compuestos hiacutebridoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 13
vii
131 Cumarinas como estructuras hiacutebridashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 15
2 Hipoacutetesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
3 Objetivoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
31 Objetivos generaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
32 Objetivos especiacuteficoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
4 Materiales y meacutetodoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 23
41 Materialeshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24
411 Reactivos y equipamiento utilizado en siacutentesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24
412 Reactivos y equipamiento utilizados en electroquiacutemicahelliphelliphelliphelliphellip 25
413 Reactivos y equipamiento utilizados en ensayos frente a especies
radicalariashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27
42 Meacutetodoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 28
421 Procedimientos de siacutentesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 28
422 Procedimientos en electroquiacutemicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 37
423 Estudio de generacioacuten de especies radicalarias mediante
espectroscopia de resonancia de espiacuten electroacutenico (REE)helliphelliphelliphelliphellip 38
424 Procedimiento experimental en el estudio de reactividad
frente a especies radicalariashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39
4241 Metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales
de oxiacutegeno (ORAC-FL)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39
4242 Metodologiacutea de capacidad reductora de hierro en plasma
(FRAP)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42
viii
4243 Capacidad de apagamiento del radical hidroxilo (OHmiddot)
mediante la teacutecnica spin traphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 44
4244 Estudio de reactividad frente al anioacuten radical superoacutexido O2bull-helliphelliphellip 45
4245 Estudio de la capacidad antioxidante celular (CAC)helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 47
4246 Estudio de hidrofobicidad relativa helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 48
4247 Estudio teoacuterico caacutelculo del Iacutendice de Fukui fkhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 49
5 Resultados y discusioacuten helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 50
51 Siacutentesis de los compuestoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 50
52 Estudios electroquiacutemicoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 54
53 Estudio de generacioacuten de especies radicalarias mediante espectroscopia
de resonancia de espiacuten electroacutenico (REE)helliphelliphelliphelliphellip 70
54 Resultados y discusioacuten de los estudios de reactividad
frente a especies radicalariashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 74
541 Metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales
oxiacutegeno-fluoresceiacutena (ORAC-FL)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 74
542 Metodologiacutea de capacidad reductora de hierro en plasma
(FRAP )helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 82
543 Determinacioacuten de capacidad de apagamiento del radical OHmiddot
teacutecnica spin trappinghelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 86
544 Estudio de reactividad frente al anioacuten radical superoacutexido O2bull-helliphelliphellip 94
545 Determinacioacuten de capacidad antioxidante celular (CAC)helliphelliphelliphelliphellip 100
546 Estudio de hidrofobicidad relativa helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 102
ix
547 Estudio teoacuterico caacutelculo del Iacutendice de Fukui fkhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 108
6 Discusioacuten generalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 113
7 Conclusiones helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 124
8 Bibliografiacuteahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 126
x
Iacutendice de figuras y tablas
Figuras
Figura 1 Esquema de los compuestos estudiados
Figure 1 Scheme of studied compounds
Figura 11 Estructura de la 2H-1-benzopiran-2-ona (cumarina)
Figura 12 Esquema general de la reaccioacuten de Pechmann
Figura 13 Estructura de la 33rsquo-metilenbis(4-hidroxicumarina) o dicumarol
Figura 14 Estructura de la suksdorfina
Figura 15 Estructura del hiacutebrido cumarina-flavona aislado de su fuente vegetal
Gnidia socotrana
Figura 16 Estructura del antibioacutetico hiacutebrido novobiocina metabolitos secundarios
en la especie Streptomyces
Figura 17 Hiacutebridos chalcona-cumarina con capacidad antioxidante
Figura 41 Aacutecidos empleados en la sustitucioacuten de la 4-clorometil-78-
dihidroxicumarina
Figura 42 Siacutentesis del derivado clorado 1
Figura 43 Siacutentesis del derivado clorado acetilado 5
Figura 44 Siacutentesis del aacutecido cafeico acetilado 6
Figura 45 Siacutentesis del aacutecido gaacutelico acetilado 7
Figura 46 Siacutentesis del aacutecido 34-dihidroxibenzoico acetilado 8
Figura 47 Siacutentesis del intermediario hiacutebrido derivado del aacutecido cafeico
xi
Figura 48 Siacutentesis del compuesto hiacutebrido final 9
Figura 49A Ruta de siacutentesis de los compuestos cumariacutenicos i) H2SO4 1 h bantildeo de
hielo ii) NaOH Ac2O 30 min bantildeo de hielo (aacutecido cafeico 6) H2SO4 Ac2O 30
min (cumarina y aacutecidos benzoicos)
Figura 49B Ruta de siacutentesis de los compuestos cumariacutenicos iii) DBU DMF (seca)
35 h 50 degC iv) NaHCO3 MeOH acetona tdeg amb 3 h N2
Figura 410 A Sonda fluoresceiacutena B 22prime-azobis (2-metilpropionamidina)
dihidrochloridrato (ABAP) C 6-hidroxi-2578-tetrametilcroman-2-aacutecido carboxiacutelico
(Trolox)
Figura 411 Actividad antioxidante ORAC para un compuesto en estudio
Figura 412 Reactivo 246-tris(2-piridil)-s-triazina (TPTZ)
Figura 413 Voltamograma ciacuteclico de la generacioacuten de anioacuten radical superoacutexido
DMF+ HFFTBA 02 M en electrodo de carbono viacutetreo
Figura 51A Voltamogramas de pulso diferencial para los precursores 1 2 3 y 4
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 51B Voltamogramas de pulso diferencial para los derivados 9 10 y 11
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 52A VC para el derivado 9 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 53A VC para el derivado 10 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 54A VC para el derivado 1a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 55 Esquema del proceso electro-oxidativo propuesto para el catecol
Figura 56 Relacioacuten Epa vs logv para el derivado de aacutecido cafeico 9 2 mM en
DMF + HFFTBA 02 M
xii
Figura 57 Graacutefica para la corriente de pico Ipa vs la raiacutez cuadrada de la velocidad de
barrido Ejemplo de correlacioacuten lineal en el aacutecido protocateacutequico 4 2 mM en
DMF + HFFTBA 02 M
Figura 58 Determinacioacuten graacutefica del valor de Eonset VC del precursor 1 01 Vs
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 59 Relacioacuten Eonset vs logv para los compuestos estudiados
Figura 510 Correlacioacuten Ipa v12
vs v12
para el precursor aacutecido protocateacutequico 4
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 511A Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido cafeico 9 estabilizado con Zn2+
en DMF+HFFTBA
(izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color
rojo)
Figura 511B Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido gaacutelico 10 estabilizado con Zn2+
en DMF+HFFTBA
(izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color
rojo)
Figura 511C Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido 11 estabilizado con Zn2+
en DMF+HFFTBA (izq)
Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color rojo)
Figura 512 Curvas para el consumo de la sonda Fluoresceiacutena para un set de
concentraciones del compuesto 11
Figura 513 Graacutefica de aacuterea neta bajo la curva ABC vs concentracioacuten del derivado 11
Figura 514 Esquema para la reaccioacuten entre el complejo de Fe3+
y el compuesto
antioxidante reductor
Figura 515 Espin aducto generado por la inactivacioacuten del radical OHbull y su espectro
simulado (derecha)
xiii
Figura 516A Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto 4-clorometil-78-dihidroxicumarina 1 B Espectro REE de inactivacioacuten
del radical hidroxilo con adicioacuten del compuesto aacutecido cafeico 2
Figura 516C Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto aacutecido gaacutelico 3 D Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con
adicioacuten del compuesto aacutecido 34-dihidroxi benzoico 4
Figura 516E Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto hiacutebrido 9 F Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con
adicioacuten del compuesto hiacutebrido 10
Figura 516G Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto hiacutebrido 11
Figura 517 Espectro REE se destaca en rojo el triplete de integracioacuten 121
formado despueacutes de la reaccioacuten de Fenton no-cataliacutetico (izq) Espectro simulado
utilizando el programa EPR-WINSIM (der)
Figura 518 Espectro simulado para la formacioacuten del spin aducto [cumarina-
DMPO] utilizando el programa EPR-WINSIM
Figura 519 Voltamogramas ciacuteclicos del par redox correspondiente al anioacuten
superoacutexido tras antildeadir aliacutecuotas del compuesto 1 DMF + HFFTBA 02 M 01 Vs
Figura 520 Graacutefica del paraacutemetro adimensional (Ipa0-Ipa
S Ipa
0) vs concentracioacuten
de sustrato para el compuesto 1 (Destacado en verde el valor de IA50)
Figura 521 Hidrofobicidad relativa de los derivados y la cumarina precursora
Figura 522 Correlacioacuten entre el valor de logD teoacuterico y CAC experimental a
10 microM de cada compuesto El valor logD se obtuvo a traveacutes de la herramienta Marvin
Sketch del software ChemAxon164
Figura 523 Estructura optimizada en 3D para el precursor 1 utilizando DFT
Figura 524 Estructura optimizada en 3D para el derivado 9 utilizando DFT
Figura 525 Estructura optimizada en 3D para el derivado 10 utilizando DFT
xiv
Figura 526 Estructura optimizada en 3D para el derivado 11 utilizando DFT
Figura 61 Esquema de reaccioacuten para un mecanismo concertado de electro-
oxidacioacuten fenoacutelica Adaptacioacuten referencia 118
Figura 62 Esquema de reaccioacuten para estructuras fenoacutelicas mecanismo electro-
oxidativo en etapas
Figura 63 Correlacioacuten entre el potencial de oxidacioacuten Eonset y los ensayos frente a
anioacuten superoacutexido
xv
Tablas
Tabla 51 Paraacutemetros experimentales para los compuestos Determinaciones en VC
2 mM DMF + HFFTBA 02 M
Tabla 52 Constantes de acoplamiento hiperfino para los derivados polifenoacutelicos
Valores en Gauss
Tabla 53 Valores experimentales de Iacutendice ORAC para los compuestos estudiados
Tabla 54 Valores calculados para el factor estequiomeacutetrico n
Tabla 55 Valores experimentales obtenidos para los compuestos en estudio ensayo
FRAP en equivalentes de Trolox10 microM de muestra
Tabla 56 Porcentajes de inactivacioacuten del radical hidroxilo (OHmiddot)
Tabla 57 Valores de IA50 obtenidos para los compuestos estudiados
Tabla 58 Valores obtenidos para la capacidad antioxidante celular (CAC)
concentraciones 1 microM y 10 microM de cada compuesto
Tabla 59 Valores obtenidos para el tiempo de retencioacuten experimental de los
compuestos
Tabla 510 Valores de Iacutendice de Fukui fk para los compuestos en estudio
Tabla 61 Cuadro comparativo de los resultados en la determinacioacuten de capacidad
antioxidante para la cumarina y sus derivados
xvi
Glosario de abreviaturas
ABAP 22-azo-bis(2-amidinopropan)diclorhidrato
ADN Aacutecido desoxiribonucleico
ATCC American Type Culture Collection
HFFTBA Hexafluorofosfato de tetrabutil amonio
CAC Capacidad antioxidante celular
CYP450 Citocromo P450
DBU 18-diazabiciclo[540]undec-7-ano
DCFH-DA 2-(6-oxido-3-oxo-3H-xanten-9-il)benzoato disoacutedico (fluoresceiacutena sal
disoacutedica)
DMF NN-dimetilformamida
DMPO 55-dimetil-1-pirroline-N-oacutexido
DMSO Dimetil sulfoacutexido
DPPHbull Radical 22-difenil-1-picrilhidrazil
Epa Potencial de pico anoacutedico
EPR Electron paramagnetic resonance
ERNs Especies reactivas de nitroacutegeno
EROs Especies reactivas de oxiacutegeno
xvii
fk Iacutendice de Fukui
FRAP Ferric reducing antioxidant in plasma
HObull Radical hidroxilo
IA50 Iacutendice antioxidante 50
Ipa Corriente de pico anoacutedica
O2˙- Anioacuten radical superoacutexido
ONOObull Radical peroxinitrito
ORAC-FL Oxygen radical antioxidant capacity-fluorescein
PBS Buffer fosfato salino
REE Resonancia de espiacuten electroacutenico
RObull Radical alcoxilo
ROOmiddot Radical peroxilo
TPTZ 246-tris(2-piridil)-s-triazina
Trolox 6-hidroxi-2578-tetrametilcroman-2-aacutecido carboxiacutelico
VC Voltametriacutea ciacuteclica
VPD Voltametriacutea de pulso diferencial
xviii
RESUMEN
Las cumarinas (2H-1-benzopiran-2-ona) son estructuras quiacutemicas presentes en
especies vegetales ampliamente distribuidas en la naturaleza con una reconocida
actividad bioloacutegica entre las que destacan sus propiedades antioxidantes
En el presente trabajo de Tesis se describe la siacutentesis de derivados polifenoacutelicos La
cumarina dihidroxilada como estructura de partida fue esterificada con distintos
aacutecidos orgaacutenicos polifenoacutelicos (Figura 1) Se estudioacute su electro-oxidacioacuten y se evaluoacute
su actividad antioxidante frente a especies reactivas de oxiacutegeno por medio de diversas
metodologiacuteas in vitro
Figura 1 Esquema de los compuestos estudiados
Se estudioacute el comportamiento anoacutedico de los compuestos mediante voltametriacutea
ciacuteclica (VC) y voltametriacutea de pulso diferencial (VPD) en medio aproacutetico como una
aproximacioacuten a los procesos redox que ocurren en membranas bioloacutegicas
Se determinoacute la presencia de especies radicalarias en el proceso electro-oxidativo a
traveacutes de la teacutecnica de resonancia de espiacuten electroacutenico (REE) Las constantes de
OOH
HO O
Cl
HO
OOH
OH
OH
OH
HO
O
OH
OH
OH
HO
OO
OHHO O
OH
OH
O
O
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
xix
acoplamiento hiperfino junto con caacutelculos teoacutericos (iacutendice de Fukui) permitieron
discriminar distintos sitios reactivos en las nuevas moleacuteculas donde se desarrolla el
proceso oxidativo
Ademaacutes se evaluoacute la capacidad antioxidante de los compuestos a traveacutes de los
ensayos capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno-fluoresceiacutena (ORAC-
FL) capacidad antioxidante reductora de hierro (FRAP) apagamiento del radical
hidroxilo mediante spin trapping inactivacioacuten de anioacuten superoacutexido y capacidad
antioxidante celular (CAC) en un modelo bioloacutegico in vitro simple
Para los ensayos antioxidantes no bioloacutegicos la introduccioacuten de las distintas
estructuras fenoacutelicas en el anillo cumariacutenico permite obtener derivados que presentan
una capacidad antioxidante mejor que el precursor cumariacutenico inicial Se establecioacute
la respectiva correlacioacuten entre el potencial de inicio del proceso electroquiacutemico
(potencial onset) y los resultados encontrados en el ensayo en medio aproacutetico frente a
anioacuten superoacutexido
Considerando el ensayo bioloacutegico de capacidad antioxidante celular eacuteste sugiere que
la actividad antioxidante de los nuevos derivados estaacute circunscrita a medios de
naturaleza lipofiacutelica
xx
SUMMARY
Coumarins (2H-1-benzopyran-2-one) are chemical structures from vegetal sources
widely distributed in vegetable species with recognized biological activities among
which their antioxidant capacity
In this Thesis work the syntheses of coumarin polyphenolic derivatives is described
Coumarin was the starter scaffold and it was sterified with different organic phenolic
acids The electro-oxidation of polyphenolic derivatives is studied and their
antioxidant capacity towards ROS through methodologies in vitro is evaluated
Figure 1 Scheme of studied compounds
The anodic behavior of the compounds by cyclic voltammetry (CV) and differential
pulse voltammetry (VPD) was studied in aprotic medium as an approximation to the
redox processes in biological membranes
The presence of radical species is determined in the electro-oxidation process through
the technique electron spin resonance (ESR)The hyperfine coupling constants and
theoretical calculations (Fukui index values) allow to discriminate between the
OOH
HO O
Cl
HO
OOH
OH
OH
OH
HO
O
OH
OH
OH
HO
OO
OHHO O
OH
OH
O
O
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
xxi
different reactive sites in the new molecules where the oxidative process is taking
place
Moreover antioxidant capacity of derivatives was evaluated through oxygen radical
antioxidant assay-fluorescein (ORAC-FL) ferric reducing ability of plasma (FRAP)
spin trapping superoxide scavenging assays and cellular antioxidant (CAC) in a
simple biological model in vitro
In the non-biological antioxidant assays the addition of various phenolic structures to
the coumarin scaffold yielded derivatives with improved antioxidant capacity related
to initial coumarin We studied the correlations between the starting potential of the
electrochemical process (onset potential) and the antioxidant results obtained in
aprotic media against superoxide anion
In regard to the biological cellular antioxidant capacity assay it suggests that the
antioxidant activity of new derivatives could be limited to lipophilic media
Introduccioacuten
1
1 Introduccioacuten
11 Cumarinas
111 Origen vegetal
Las cumarinas son una familia de compuestos cuya estructura baacutesica corresponde a la
lactona heterociacuteclica 2H-1-benzopiran-2-ona (Figura 11) En el reino vegetal estaacuten
ampliamente distribuidas habieacutendose identificado en la actualidad maacutes de 1800
cumarinas de origen natural1 eacutestas se encuentran principalmente como metabolitos
secundarios en diversas plantas tanto en sus semillas como en hojas y raiacuteces2 Su
biosiacutentesis es descrita por distintos autores como una serie de procesos catalizados
por enzimas presentes en la estructura CYP450 (citocromo P450) en algunos casos
estos compuestos son generados en la ceacutelula vegetal como una viacutea de defensa
(fitoalexinas como la escopoletina) frente a estiacutemulos de estreacutes y la presencia de fito-
patoacutegenos34
O O
3
45
6
7
81
2
Figura 11 Estructura de la 2H-1-benzopiran-2-ona (cumarina)
Introduccioacuten
2
El nombre de estos compuestos se deriva de la palabra ldquocoumarourdquo vocablo
caribentildeo que hace referencia al aacuterbol de Tonka originario de Sudameacuterica de cuya
semilla A Vogel logra aislar el compuesto y publicar su hallazgo en 18205b
A partir
de entonces el intereacutes por su caracterizacioacuten6 la obtencioacuten tanto desde fuentes
naturales7 como por rutas sinteacuteticas de la cumarina y sus derivados ha ido en
aumento encontrando su primera aplicacioacuten en la fabricacioacuten de perfumes En 1868
W H Perkin propuso la siacutentesis de una fragancia vegetal a partir de la sal soacutedica del
orto-hidroxibenzaldehiacutedo y anhiacutedrido aceacutetico obteniendo el mismo producto aislado
de la semilla de Tonka5 8(ac)
Se han estudiado los aspectos taxonoacutemicos en cuanto a la clasificacioacuten de las especies
vegetales que contienen compuestos cumariacutenicos se estima que las principales
familias donde se encuentran estos derivados son Umbelliferae Rutaceae
Leguminosae Compositae Caryopgillaceae Euphorbiaceae Hipocastanaceae
Oleaceae Thymelaeaceae8b
112 Rutas de siacutentesis
Los autores Sethna y Narsinh9 presentaron en 1944 una de las primeras revisiones del
estado del arte con respecto a la siacutentesis de cumarinas En ella se encuentran las
principales metodologiacuteas claacutesicas de obtencioacuten como la siacutentesis de Perkin
Pechmann10
y Pechmann-Duisberg11
(Figura 12) en la que se obtiene la cumarina al
Introduccioacuten
3
condensar un fenol con un β-cetoester en medio aacutecido Diversas publicaciones
plantean modificaciones a esta ruta con catalizadores12 (ab)
libre de solventes13 (ab)
con promotores aacutecidos14
asistida por microondas15
entre otras
Figura 12 Esquema general de la reaccioacuten de Pechmann
Otra metodologiacutea empleada es la de Knoevenagel16
propuesta en 1898 Consiste en
una reaccioacuten de condensacioacuten entre o-hidroxialdehiacutedos con malonato de etilo
acetoacetato de etilo o cianoacetato de etilo en medio baacutesico (piridina o piperidina)
Los autores Bigi y colaboradores17
describen el uso de un catalizador en base a
montmorillonita para la obtencioacuten de cumarinas sustituidas en posicioacuten 3 con un
grupo aacutecido Posteriormente otro grupo de trabajo (Shaabani 2009) llevoacute a cabo esta
condensacioacuten empleando radiacioacuten de microondas lo que les permitioacute obtener buenos
rendimientos en un medio ldquoamigablerdquo con el ambiente18
Se han descrito otras metodologiacuteas sinteacuteticas en las cuales se utilizan las reacciones
claacutesicas de Wittig19 ab
y Reformatsky20
ademaacutes de otras rutas con variantes tanto en
los reactivos como en el medio de reaccioacuten que permiten la obtencioacuten de derivados
OH
+
OEt
O O H2SO4
O O
Introduccioacuten
4
cumariacutenicos como la siacutentesis en presencia de bases fuertes21
reacciones libres de
solventes22
y la obtencioacuten de cumarinas policiacuteclicas utilizando compuestos
organometaacutelicos descrita por Harvey y cols23
113 Principales aplicaciones
Tras ser aisladas desde su fuente vegetal y como resultado de investigaciones
posteriores dirigidas a generar rutas sinteacuteticas viables las cumarinas han sido objeto
de numerosos estudios enfocados en la buacutesqueda de sus aplicaciones Es asiacute como en
la literatura se pueden encontrar las maacutes diversas investigaciones para este tipo de
compuestos provenientes tanto de productos de siacutentesis o como extractos de
vegetales y plantas con reconocidas propiedades en la medicina tradicional esto da
origen al estudio de sus bio-aplicaciones entre las que se destaca su capacidad como
antioxidante
A Actividad bioloacutegica
La primera aplicacioacuten en bio-medicina descrita para las cumarinas fue como
anticoagulante desde que se aislara y caracterizara el dicumarol 33rsquo-metilenbis(4-
hidroxicumarina) (Figura 13) Posteriormente aparece en el mercado su derivado
Introduccioacuten
5
sinteacutetico conocido como Warfarina que hasta la deacutecada pasada era considerado uno
de los faacutermacos anticoagulantes maacutes vendidos en Estados Unidos24 a-c
OOOO
OH HO
Figura 13 Estructura de la 33rsquo-metilenbis(4-hidroxicumarina) o dicumarol
Con posterioridad el uso de las cumarinas se ha diversificado hacia innumerables
blancos terapeacuteuticos En la literatura se describen variados estudios con respecto a sus
propiedades farmacoloacutegicas25ab
Su capacidad como agente antitumoral 26ab
se ha
estudiado en compuestos provenientes tanto de fuentes vegetales como sinteacuteticas
Riveiro ME y cols estudiaron el efecto de la 78-OH-4-metilcumarina en ceacutelulas
humanas afectadas por leucemia evidenciando el potencial que presentoacute este
derivado dihidroxilado27
En otra investigacioacuten realizada por C Ito y colaboradores
aislaron tres derivados cumariacutenicos de la especie vegetal Murraya siamensis cuyos
ensayos frente a ceacutelulas tumorales resultaron promisorios28
Con respecto a las propiedades antiinflamatorias de las cumarinas en la naturaleza se
encuentran especies como la Chamomilla recutita (manzanilla) que contiene un tipo
Introduccioacuten
6
de umbeliferona con tales propiedades En la literatura se encuentran derivados
sinteacuteticos desarrollados en cuya estructura estaacute presente el esqueleto cumariacutenico29
Lin y cols presentan los resultados de su estudio de la capacidad antiinflamatoria de
un conjunto de cumarinas los cuales fueron ademaacutes correlacionados con los
obtenidos para el apagamiento del radical hidroxilo30
HA El-Wahab y cols sintetizaron distintas tiazolo-cumarinas hiacutebridas y estudiaron
una de sus propiedades farmacoloacutegicas como agente antimicrobiano Estos
compuestos posteriormente fueron aplicados como aditivos en recubrimientos de
poliuretano confirieacutendoles tambieacuten esta propiedad microbicida a las superficies en
las que se utilizoacute31
Tambieacuten se han descrito derivados cumariacutenicos con propiedades anti-fuacutengicas 32ab
Un trabajo reciente presenta el estudio de complejos en base a Ni(II) Cu(II) y
Co(II)frente a distintas especies de hongos (Candida A niger Rhizopus)32c
Tambieacuten se han encontrado estructuras cumarina-glucoacutesidos provenientes de especies
vegetales (Hydrangea paniculata) que presentan propiedades hepatoprotectoras33
Otros estudios sentildealan tambieacuten la importancia de las estructuras cumariacutenicas como
compuesto antiviral analgeacutesico anti-tromboacutetico ulcerogeacutenico 25 34-36
inclusive con
potencial para ser usadas en terapias frente al VIH como lo sentildeala la investigacioacuten
sobre especies vegetales que contienen dipiranocumarin - calanolideos como
Introduccioacuten
7
principio activo25a
estudios que tambieacuten se han realizado con derivados de siacutentesis
disentildeados a partir de la estructura de origen vegetal (Lomatium suksdorfii) conocida
como suksdorfina (Figura 14) a partir de la cual se han generado compuestos
anaacutelogos con el objeto de estudiar su modo de accioacuten y obtener sustratos cada vez
maacutes potentes frente a la enfermedad (Yu D y cols 2003)37
O OO
O
O
OO
Figura 14 Estructura de la suksdorfina
B Propiedades antioxidantes
El equilibrio en los organismos vivos es funcioacuten de diversos factores entre ellos cabe
mencionar el balance de las especies que generan estreacutes oxidativo dentro del medio
celular estas especies pueden ser de origen endoacutegeno como las provenientes de la
cadena transportadora de electrones enzimas oxidantes ceacutelulas fagociacuteticas o de
origen exoacutegeno como sustancias reductoras oxidacioacuten de drogas tabaquismo
ultrasonido luz solar etc Entre los compuestos que generan estreacutes conocidos como
Introduccioacuten
8
EROs y ERNs (especies reactivas de oxiacutegenonitroacutegeno) se pueden mencionar el
anioacuten superoacutexido (O2˙-) peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2) radical peroxilo (ROObull) y
alcoxilo (RObull) radical hidroxilo (HObull) oacutexido niacutetrico (NObull) peroxinitrito (ONOObull)
entre otras
Dentro de este contexto en la literatura se ha descrito el potencial que poseen las
cumarinas y sus derivados como compuestos capaces de interaccionar con especies
reactivas de oxiacutegeno y nitroacutegeno lo que da cuenta de su capacidad antioxidante tema
relevante si se considera que parte importante de las patologiacuteas conocidas y
estudiadas en la actualidad a nivel mundial estaacuten iacutentimamente ligadas a cuadros de
estreacutes oxidativo presentes en el organismo 38 39
Payaacute y colaboradores presentaron un trabajo en el cual se estudia la reactividad de un
conjunto de dieciseacuteis cumarinas (naturales y sinteacuteticas) frente al radical hidroxilo
aacutecido hipocloroso y anioacuten superoacutexido encontrando que los derivados di-hidroxilados
poseiacutean mejores propiedades que aquellos mono-hidroxilados o sin sustitucioacuten40
Estos resultados se complementan con una publicacioacuten posterior del mismo grupo en
que se profundiza el estudio anterior sentildealando las propiedades terapeacuteuticas de los
derivados cumariacutenicos34
El derivado conocido como esculetina (67-dihidroxicumarina) fue ensayado frente al
radical DPPH junto con ensayos de estreacutes oxidativo en medios de cultivo celular
Introduccioacuten
9
estos autores sentildealan la importancia de los grupos catecol en su capacidad de atrapar
especies radicales (Kim y cols 2008)41
Otro estudio en el que se ensaya un extracto
vegetal (Cortex Fraxini) relaciona ademaacutes la capacidad antioxidante de las o-
dihidroxi cumarinas con su capacidad reductora42
Zhang y cols presentan un estudio reciente en el cual cumarinas dihidroxiladas en
posicioacuten 7 y 8 entre otros derivados poseen importante bio-actividad in vitro los
compuestos fueron ensayados frente a especies radicales en ceacutelulas tumorales
presentaron ademaacutes actividad como antiinflamatorios y baja toxicidad tanto en
ceacutelulas sanguiacuteneas de vertebrado como de invertebrado Junto con lo anterior se
realizoacute un anaacutelisis de estructura-reactividad correlacionando la capacidad de
apagamiento de radicales con las propiedades antiinflamatorias y antitumorales de los
derivados cumariacutenicos encontradas en esta investigacioacuten43
12 Compuestos polifenoacutelicos
121 Origen vegetal
Los polifenoles al igual que las cumarinas son una amplia familia de compuestos (se
han encontrado maacutes de 8000 de ellos) presentes en estructuras vegetales como
metabolitos secundarios cumpliendo roles tales como protector frente a radiacioacuten
UV reguladores de los ciclos de crecimiento pigmentacioacuten y defensa frente a
Introduccioacuten
10
depredadores Su estructura baacutesica es el anillo benceacutenico con sustituyentes hidroxilo
(-OH) en distintas posiciones Se clasifican en flavonoides aacutecidos fenoacutelicos
(hidroxicinaacutemicos e hidroxibenzoicos) taninos estilbenos Debido a sus interesantes
propiedades y bio-aplicaciones estos fitoquiacutemicos han sido objeto de diversos
estudios investigacioacuten y caracterizacioacuten44-46
Estos compuestos son un constituyente importante de la dieta diaria se encuentran en
forma abundante en diversos frutos como por ejemplo berries manzana mango uva
pera granada y ciacutetricos en bebidas como el vino teacute y cafeacute 47
en vegetales cereales
y semillas Junto con lo anterior se ha descrito la utilizacioacuten de aacutecidos polifenoacutelicos
provenientes de extractos vegetales y aceites esenciales como aditivos en la industria
alimentaria aplicados como preservantes naturales en reemplazo de aquellos de
origen sinteacutetico debido a las propiedades antimicrobianas que exhiben48
122 Actividad bioloacutegica
Estos compuestos se conocen tambieacuten como ldquobiofenolesrdquo (Romeo y Uccella 1996)
haciendo referencia a aquellos provenientes de fuentes naturales Las primeras
publicaciones sobre los polifenoles en general comenzaron en la deacutecada de 1950 con
la investigacioacuten de D Harman y su teoriacutea del envejecimiento y los radicales libres
estudios en los que se planteoacute prolongar la sobrevida en especies roedores enfermos a
traveacutes de la ingesta de biofenoles presentes en su dieta Es asiacute que el nuacutemero de
publicaciones concernientes al tema se incrementoacute de una treintena (entre 1900 y
Introduccioacuten
11
1950) hasta superar las 35000 publicaciones entre los antildeos 2000-2010 lo que da
cuenta del creciente intereacutes en este toacutepico49
La bio-actividad de los compuestos polifenoacutelicos es amplia se encuentran diversos
estudios como el citado anteriormente con respecto a las capacidades antimicrobianas
de los polifenoles y su uso en la industria alimentaria5051
Compuestos como la
curcumina resveratrol quercetina y derivados del aacutecido gaacutelico se enumeran dentro de
las investigaciones realizadas tanto in vitro e in vivo en la prevencioacuten del caacutencer
(Cimino y cols 2012)52
Otras propiedades descritas para estos compuestos son como cardio-protectores anti-
canceriacutegenos antiinflamatorios vaso-relajantes entre otras como lo resume el
artiacuteculo de Xia y cols (2010) En eacutel ademaacutes se presenta una revisioacuten en cuanto a los
meacutetodos de extraccioacuten purificacioacuten y caracterizacioacuten del contenido y tipos de
polifenoles especiacuteficamente en el caso de la uva fruto reconocido por su alto
contenido de fitoquiacutemicos y nutrientes53
123 Polifenoles como antioxidantes
Los polifenoles como micronutrientes presentes en los alimentos y otras estructuras
vegetales han sido un foco de intereacutes ya que sus aplicaciones terapeacuteuticas estaacuten
relacionadas con su reconocida e investigada capacidad antioxidante y quelante de
metales Con respecto a esta uacuteltima cabe mencionar la revisioacuten del estado del arte
Introduccioacuten
12
realizada por Kozlowski y cols con respecto al desbalance de Cu Zn y Fe en el
organismo en ella se indica que la presencia libre y en exceso de estos metales estaacute
directamente relacionada con patologiacuteas neurodegenerativas y caacutencer entre otras ya
que su actividad redox genera especies reactivas capaces de atacar sustratos orgaacutenicos
como la membrana lipiacutedica proteiacutenas y aacutecido desoxiribonucleico (ADN)54
Ribeiro y colaboradores presentan un estudio en el que se determina el contenido
polifenoacutelico de la especie Fistulina hepaacutetica Los extractos se ensayaron frente a
DPPH anioacuten superoacutexido radical hidroxilo y aacutecido hipocloroso Los autores plantean
que considerando los resultados obtenidos esta especie fuacutengica podriacutea tener
aplicacioacuten como suplemento o como antioxidante en la industria alimentaria55
Estudios realizados con aacutecido taacutenico comercial sentildealan que su capacidad como
antioxidante y como quelante de hierro da cuenta del potencial que tiene este aacutecido
ademaacutes como anti-mutageacutenico y anti-carcinogeacutenico Los autores indican posibilidad
de que este aacutecido el cual presenta baja toxicidad contribuye en el apagamiento de
especies reactivas de oxiacutegeno dantildeinas a nivel de ADN (Andrade y cols 2006)56
trabajo que se complementa con una publicacioacuten anterior del mismo grupo donde se
estudioacute el apagamiento del radical OHbull mediante complejos de aacutecido taacutenico-Cu
(Andrade y cols 2005)57
Los aacutecidos hidroxicinaacutemicos e hidroxibenzoicos han sido tambieacuten objeto de estudio
debido a su capacidad antioxidante58-61
Jeong y colaboradores estudiaron el extracto
de la especie vegetal Erigeron annuus el cual contiene aacutecido cafeico en su fraccioacuten
Introduccioacuten
13
butanoacutelica este extracto fue ensayado como agente neuro-protector y antioxidante en
ceacutelulas nerviosas Frente a los resultados obtenidos los autores concluyen que este
extracto podriacutea ser utilizado en terapias frente a patologiacuteas neurodegenerativas como
el Alzheimer62
Otro estudio de capacidad antioxidante realizado a un grupo de
compuestos polifenoacutelicos presentes en el propoacuteleo (aacutecido cafeico aacutecido feruacutelico
ferulato de etilo eacutester fenetiacutelico del aacutecido cafeico) sentildeala que los grupos catecol
presentes en las estructuras ensayadas incrementan la capacidad antioxidante
mientras que en estudios relacionados con bio-membranas se debe tener en cuenta
ademaacutes la hidrofobicidad que presenten los compuestos63
13 Compuestos hiacutebridos
Al considerar que las diversas enfermedades que afectan al ser humano (caacutencer
diabetes enfermedades neurodegenerativas artritis entre otras) involucran diferentes
factores patogeacutenicos se han desarrollado estrategias sinteacuteticas que permiten obtener
nuevos faacutermacos de naturaleza hiacutebrida los cuales incorporan en su estructura
distintos ingredientes activos64
Este disentildeo ldquomulti-blancordquo ha permitido que los
nuevos faacutermacos actuacuteen en distintos blancos terapeacuteuticos este tipo de terapias
implica una disminucioacuten en los problemas asociados a una multi-dosificacioacuten las
interacciones entre distintos medicamentos una disminucioacuten en la resistencia a los
faacutermacos (en el caso de enfermedades de origen microbiano) disminucioacuten en los
efectos adversos derivados de la dosificacioacuten muacuteltiple por mencionar algunos
Introduccioacuten
14
Diversas investigaciones sobre el tema dan cuenta de la relevancia que ha tenido esta
estrategia y el disentildeo racional de nuevos medicamentos65-68
La revisioacuten realizada por
los autores Mehta y Singh (2002) menciona algunos de los esqueletos que han dado
origen a estructuras hiacutebridas entre ellas esteroides antraciclinas β-lactamas
fullerenos carbohidratos-peacuteptidos En esta revisioacuten se indica el uso de este tipo de
compuestos en terapias contra el caacutencer y como neuro-protectores69
En el caso de la malaria una de las enfermedades infecciosas maacutes complejas a nivel
mundial la resistencia del paraacutesito del geacutenero Plasmodium frente a los faacutermacos
empleados (cloroquina principalmente) ha sido un tema de estudio durante antildeos Una
resentildea de este desafiacuteo se presenta en el artiacuteculo de Kouznetsov y Goacutemez-Barrio
(2009) en el que se sentildeala la siacutentesis de derivados de aminoquinolina como las
trioxaquinas70
las cuales se presentan posteriormente en una revisioacuten realizada por
Chauhan y colaboradores en ella se destaca a estos hiacutebridos como candidatos
promisorios para la formulacioacuten de nuevas drogas antimalaacutericas71
Otra patologiacutea en la que se ha utilizado faacutermacos de naturaleza hiacutebrida que en
algunos casos provienen de productos naturales es el caacutencer72
Allen y
colaboradores73
mencionan en una reciente revisioacuten de tecnologiacuteas avanzadas en las
que ademaacutes de utilizar la estrategia de compuestos hiacutebridos con dos estructuras de
propiedades anticanceriacutegenas eacutestos se combinan con nano-estructuras orientadas a
Introduccioacuten
15
blancos especiacuteficos para asiacute disminuir el riesgo de efectos colaterales en el
tratamiento de esta compleja patologiacutea
Este concepto y disentildeo de faacutermacos multi-blanco se ha aplicado ademaacutes en distintas
terapias frente a enfermedades como el Alzheimer74
en vacunas de amplio espectro
frente al coacutelera75
en la siacutentesis de compuestos antiparasitarios76
y de dihidropiridinas
las cuales poseen actividad vasodilatadora77
por mencionar algunos ejemplos
131 Cumarinas como estructuras hiacutebridas
Al considerar el estado del arte con respecto a la amplia y variada actividad bioloacutegica
que presentan los derivados cumariacutenicos se encuentra que otra de las aplicaciones que
se ha estudiado para esta familia de compuestos es su capacidad para formar parte de
estructuras hiacutebridas complejas compuestos orientados a la obtencioacuten faacutermacos multi-
blanco que den respuesta a los interrogantes y desafiacuteos actuales con respecto a
importantes patologiacuteas y sus terapias 78
En la literatura se describen ejemplos de estructuras cumariacutenicas hiacutebridas no soacutelo de
origen sinteacutetico sino que tambieacuten se pueden extraer desde su fuente natural Un
estudio realizado en hojas y ramas de la especie Gnidia socotrana (originaria de
Yemen) da cuenta de la presencia de estructuras flavona-cumarina las que fueron
extraiacutedas purificadas y caracterizadas79
(Figura 15)
Introduccioacuten
16
O
OH
HO O
OH
O
O
OH
Figura 15 Estructura del hiacutebrido cumarina-flavona aislado de su fuente vegetal
Gnidia socotrana
Entre los compuestos antibioacuteticos de origen natural que poseen el esqueleto
cumariacutenico en su estructura se encuentran la novobiocina (Figura 16) clorobiocina y
cumermicina Presentes como metabolitos secundarios en la especie Streptomyces
estos derivados deben su actividad antibioacutetica a que actuacutean inhibiendo la enzima
ADN girasa presente en bacterias impidiendo su replicacioacuten y ademaacutes genera su
muerte celular80
O
HN
OH
O
OH
O
O
MeOO
H2N
HO
Figura 16 Estructura del antibioacutetico hiacutebrido novobiocina metabolitos secundarios
en la especie Streptomyces
Introduccioacuten
17
Se ha descrito tambieacuten la capacidad antitumoral de derivados cumarina-resveratrol a
partir del precursor 7-hidroxicumarina En la publicacioacuten de Belluti y colaboradores
se presentan los ensayos realizados para 10 compuestos los cuales tuvieron como
objeto ceacutelulas tumorales de pulmoacuten humano dos de los hiacutebridos presentaron
resultados promisorios como antitumorales y pro-apoptoacuteticos comportamiento que
los autores concluyen tiene relacioacuten con la posicioacuten de los sustituyentes en la
moleacutecula81
La revisioacuten bibliograacutefica de Longhin y colaboradores describe diversas estructuras
hiacutebridas desarrolladas que cuentan con capacidad antiinflamatoria toacutepico de intereacutes si
se considera que los cuadros inflamatorios estaacuten relacionados a dolencias como el
Alzheimer asma arterioesclerosis artritis reumatoide caacutencer etc En este trabajo se
sentildeala al hiacutebrido cumarina-aacutecido lipoico donde ambas estructuras poseen ademaacutes
reconocida capacidad antioxidante y el aacutecido unido a la cumarina en posicioacuten 3
mediante un espaciador es la estructura que se describe con una actividad superior al
conocido y utilizado faacutermaco indometacina82
Junto con los estudios descritos otra importante aacuterea de investigacioacuten ha sido el
desarrollo de estructuras hiacutebridas con capacidad antioxidante (Koufaki 2006)83
actividad que permite en muchos casos restablecer el equilibrio en organismos vivos
frente al exceso de especies generadoras de estreacutes oxidativo cuadro que como ya se
Introduccioacuten
18
mencionoacute estaacute con frecuencia asociado las patologiacuteas conocidas y estudiadas en la
actualidad
El reciente estudio desarrollado por Matos Olea-Azar y colaboradores presenta la
estructura cumarina-resveratrol y diferentes derivados sinteacuteticos los cuales fueron
estudiados mediante diversas teacutecnicas in vitro como resonancia de espiacuten electroacutenico
(REE) capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno (ORAC-FL) y
voltametriacutea ciacuteclica (VC) En esta investigacioacuten se encontroacute que los compuestos
propuestos poseen una buena capacidad antioxidante84
Una investigacioacuten que da cuenta del potencial que posee esta estrategia es la
desarrollada por Kenchappa y colaboradores quienes sintetizaron derivados
cumariacutenicos unidos a pirazol e indenona posteriormente mediante estudios in vitro e
in vivo obtuvieron resultados de su capacidad antioxidante y ademaacutes como agentes
anti-hipergliceacutemicos en un modelo animal proyectaacutendolos como posibles faacutermacos
frente a la diabetes85
Dentro del mismo esquema Krishan y colaboradores
desarrollaron una serie de cumarinas unidas al benzoimidazol el cual es a su vez una
estructura con muacuteltiple y reconocida actividad bioloacutegica proponen a dos compuestos
de la serie como derivados con una buena capacidad antioxidante y anti-inflamatoria
a nivel de mucosa gaacutestrica86
Introduccioacuten
19
Un tipo de derivado hiacutebrido que ha sido estudiado es la cumarina-chalcona El trabajo
realizado por Xi y Liu presenta la siacutentesis de una serie de compuestos (Figura 17)
los que posteriormente son ensayados por distintas metodologiacuteas de determinacioacuten de
capacidad antioxidante concluyendo que estos hiacutebridos son estructuras promisorias
en los que el grupo catecol presente en el esqueleto cumariacutenico o en la chalcona es
capaz de inhibir distintos procesos oxidativos a nivel de ADN87
O O
OH
O
R1
R2
R3
Figura 17 Hiacutebridos chalcona-cumarina con capacidad antioxidante
Peacuterez-Cruz y colaboradores describen el disentildeo siacutentesis y estudio de la capacidad
antioxidante de derivados cumarina-chalcona los que presentaron buena reactividad
frente a distintas especies radicales y capacidad cito-protectora en un modelo celular
animal88
En los estudios mencionados se evidencia el continuo desarrollo que ha tenido el
disentildeo y siacutentesis de compuestos hiacutebridos como nuevos faacutermacos frente a complejas
Introduccioacuten
20
enfermedades multifactoriales Esta tendencia vigente en la actualidad se extiende a
los maacutes variados nuacutecleos estructurales entre ellos la cumarina Este heterociclo
clasificado por algunos autores como ldquoestructura privilegiadardquo debido a la amplia
gama de compuestos que se originan a partir de eacutel es el punto de partida para
diversas propuestas sinteacuteticas enfocadas a generar un producto que posea muacuteltiples
actividades bioloacutegicas de intereacutes terapeacuteutico
Hipoacutetesis y objetivos
21
2 Hipoacutetesis
Los compuestos hidroxicumariacutenicos exhiben conocidas e interesantes propiedades
antioxidantes
Al sustituir la cumarina con los compuestos aacutecido cafeico aacutecido gaacutelico y aacutecido
protocateacutequico se obtienen derivados de naturaleza hiacutebrida aumentando la actividad
de la cumarina frente a las especies reactivas de oxiacutegeno anioacuten superoacutexido radical
hidroxilo radical peroxilo y su capacidad reductora
3 Objetivos
31 Objetivos generales
- Evaluar el comportamiento electroquiacutemico oxidativo de los derivados
cumariacutenicos previamente sintetizados y caracterizados fiacutesicamente
- Evaluar la capacidad antioxidante de los nuevos compuestos derivados de
cumarina y aacutecidos benzoicos frente a distintas especies radicales mediante
diversas teacutecnicas in vitro
Hipoacutetesis y objetivos
22
32 Objetivos especiacuteficos
Objetivos en siacutentesis
- Sintetizar y caracterizar el compuesto precursor 4-clorometil-78-
dihidroxicumarina y los correspondientes derivados de la sustitucioacuten en posicioacuten-
4 con aacutecido cafeico aacutecido gaacutelico y aacutecido 34-dihidroxibenzoico
Objetivos en electroquiacutemica
- Realizar la caracterizacioacuten anoacutedica en medio aproacutetico (NN-dimetilformamida
DMF) de los compuestos por voltametriacutea ciacuteclica (VC) voltametriacutea de pulso
diferencial (VPD)
Objetivos en la determinacioacuten de capacidad antioxidante
- Estudiar la reactividad de los compuestos frente al anioacuten radical superoacutexido O2-
utilizando como teacutecnica voltametriacutea ciacuteclica
- Determinar la reactividad de los compuestos frente al radical peroxilo (ROObull)
obteniendo su iacutendice ORAC-FL
- Determinar la capacidad reductora de hierro (Fe3+
) de los compuestos a traveacutes de
la teacutecnica FRAP
- Estudiar la reactividad frente al radical OHbull mediante la teacutecnica spin trapping
utilizando espectroscopiacutea de resonancia de espin electroacutenica (REE)
Hipoacutetesis y objetivos
23
- Evaluar la capacidad antioxidante celular de los compuestos
- Establecer la existencia de correlacioacuten entre paraacutemetros fisicoquiacutemicos de los
compuestos y su actividad antioxidante
Materiales y meacutetodos
24
4 Materiales y meacutetodos
41 Materiales
411 Reactivos y equipamiento utilizado en siacutentesis
Reactivos
- Aacutecido 34-dihidroxicinaacutemico Merck
- Aacutecido 34- dihidroxibenzoico Sigma-Aldrich
- Aacutecido 345-trihidroxibenzoico Sigma-Aldrich
- Pirogalol Merck
- 4-cloro acetoacetato de etilo Sigma-Aldrich
- NN-dimetilformamida PA J T Baker
- 18-diazabiciclo[540]undec-7-ano (DBU) Sigma-Aldrich
- Carbonato aacutecido de sodio Merck
- Metanol PA JT Baker
- Acetona PA Merck
- Etanol PA Merck
- Cloroformo PA Merck
- Aacutecido sulfuacuterico 98 Merck
- Aacutecido clorhiacutedrico 37 JTBaker
- Anhiacutedrido aceacutetico Merck
- Hidroacutexido de sodio PA Merck
- Solucioacuten etanoacutelica de FeCl3
Materiales y meacutetodos
25
- Acetona d6 Sigma-Aldrich
- Dimetilsulfoacutexido d6 Sigma-Aldrich
- Cloroformo d6 Sigma-Aldrich
- Nitroacutegeno extra puro 99995 Linde Gas Chile SA
Equipamiento
Todo el material de vidrio utilizado fue clase A
- Balanza analiacutetica Precisa 125 A
- Rotavapor Heidolph VV 2000
- Sonicador Elme Transsonic Digital tipo T480H-2
- Agitador magneacutetico placa calefactora Heidolph MR 3002
- Estufa de secado al vaciacuteo Heraeus
412 Reactivos y equipamiento utilizados en electroquiacutemica
Reactivos
- NN-dimetilformamida (DMF) PA Merck
- Hexafluorofosfato de tetrabutil amonio (HFFTBA) Sigma-Aldrich
- Aacutecido 34-dihidroxicinaacutemico Merck
- Aacutecido 34- dihidroxibenzoico Sigma-Aldrich
- Aacutecido 345-trihidroxibenzoico Sigma-Aldrich
- Nitroacutegeno extra puro 99995 Linde Gas Chile SA
Materiales y meacutetodos
26
- Agua purificada (MilliQ) Millipore Merck
Equipamiento
- Estacioacuten de trabajo electroquiacutemica CH Instruments CHI 760c
- Electrodo de carbono viacutetreo CH Instruments d = 3 mm
- Alambre de platino
- Electrodo de referencia AgAgCl (KCl 3 M) CH Instruments
- Aluacutemina 03 μM y 005 μM Buheler
- Balanza analiacutetica Precisa 40SM-200ordf
413 Reactivos y equipamiento utilizados en ensayos frente a especies
radicalarias
Reactivos
- 2-(6-oacutexido-3-oxo-3H-xanten-9-il)benzoato disoacutedico (fluoresceiacutena sal
disoacutedica) Sigma-Aldrich
- 22-azo-bis(2-amidinopropan)diclorhidrato (ABAP) Sigma-Aldrich
- 246-tris(2-piridil)-s-triazina (TPTZ) Sigma Aldrich
- 6-hidroxi-2578-tetrametilcroman-2-aacutecido carboxiacutelico (Trolox) Sigma-
Aldrich
- Peroacutexido de hidroacutegeno al 30
- NN-dimetilformamida PA Sigma-Aldrich
- 55-dimetil-1-pirroline-N-oacutexido (DMPO)
- Acetato de sodio Merck
Materiales y meacutetodos
27
- Tricloruro de hierro (FeCl3) Sigma Aldrich
- Hidroacutexido de sodio Merck
- Fosfato diaacutecido de potasio Merck
- Etanol grado HPLC Merck
- Aacutecido aceacutetico glacial Merck
- N-octanol Merck
- Cloruro de zinc Merck
Equipamiento
- Balanza Precisa 40SM-200ordf
- Lector de microplacas con detector muacuteltiple Synergytrade HT Bio-Tek
Instruments Inc (Winooski VT USA)
- Espectroacutemetro ECS 106 de banda X (985 GHz) equipado con cavidad
rectangular y 50 KHz de modulacioacuten de campo (Bruker Coventry UK)
- WINSIM Software EPR Spectral Simulation for MS-Windows 9x NT
Version 098 copy PEST Public EPR Simulation Tools NIEHS USA
- Alambre de platino
- Espectrofotoacutemetro UV-Visible Specord S600 Analytik Jena
- Equipo generacioacuten agua ultrapura NanoPure Barnstead
Materiales y meacutetodos
28
42 Meacutetodo
421 Procedimientos de siacutentesis
En un primer paso se obtuvo el precursor 4-clorometil-78-dihidroxicumarina
mediante la siacutentesis de Pechmann posteriormente se realizoacute la esterificacioacuten entre el
compuesto halogenado y diferentes aacutecidos orgaacutenicos comerciales (Figura 41) Los
aacutecidos comerciales utilizados en el proceso de siacutentesis fueron los siguientes
aacutecido 34-dixidroxicinaacutemico aacutecido 345- trihidroxibenzoico
(aacutecido cafeico) (aacutecido gaacutelico)
O
OH
OH
HO
aacutecido 34-dihidroxibenzoico
(aacutecido protocateacutequico)
Figura 41 Aacutecidos empleados en la sustitucioacuten de la 4-clorometil-78-
dihidroxicumarina
OH
OH
O
HO
O
OH
OH
HO
OH
Materiales y meacutetodos
29
Todos los compuestos fueron previamente acetilados para proteger los grupos
hidroxilo presentes en sus estructuras para evitar reacciones entre siacute
A Siacutentesis de la 4-clorometil-78-dihidroxicumarina 1
Se mezclaron en proporciones equimolares el pirogalol (31 mmoles) junto con el 4-
cloroacetoacetato de etilo con agitacioacuten constante en un bantildeo de agua-hielo sobre la
mezcla se antildeadieron lentamente 25 mL de H2SO4 (tambieacuten friacuteo) esta solucioacuten se
tornoacute de color rojizo oscuro Se dejoacute reaccionar 1 h
La mezcla de reaccioacuten se agregoacute lentamente sobre un bantildeo de agua-hielo-etanol con
vigorosa agitacioacuten y se obtuvo el producto como un precipitado fino que fue lavado
con abundante agua (a fin de eliminar restos aacutecidos) y purificado por re-cristalizacioacuten
en una mezcla etanol agua obtenieacutendose un soacutelido marfil brillante 1 La ruta
sinteacutetica se presenta a continuacioacuten
Figura 42 Siacutentesis del derivado clorado 1
O
OH
OH O
Cl
HO
OH
OH
OEt
Cl
O O
+
H2SO4
1 h
1
Materiales y meacutetodos
30
B Procedimientos de acetilacioacuten
a) Acetilacioacuten de 4-clorometil-78-dihidroxi-cumarina 2
Se suspendioacute la cumarina clorada (3 g) en 6 mL anhiacutedrido aceacutetico y se antildeadioacute 1 gota
de aacutecido sulfuacuterico La solucioacuten fue agitada con calentamiento (45 degC) por 30 min y se
observoacute el progreso de la reaccioacuten mediante el test de FeCl3 el que indica la presencia
o ausencia de grupos ndashOH fenoacutelicos en solucioacuten El precipitado obtenido 5 se
recristalizoacute en etanol su ruta sinteacutetica se muestra en la Figura 43
Figura 43 Siacutentesis del derivado clorado acetilado 5
b) Acetilacioacuten del aacutecido 34-dihidroxicinaacutemico 6
Seguacuten lo descrito en la literatura89
se disolvioacute el aacutecido 34-dihidroxicinaacutemico (aacutecido
cafeico) en solucioacuten 1 M de NaOH sobre un bantildeo de hielo se agregoacute anhiacutedrido
O
OH
HO O
Cl
Ac2O H2SO4
45 degC 30 min
O
O
O O
Cl
5
O
O
Materiales y meacutetodos
31
aceacutetico y de inmediato se aprecioacute la aparicioacuten de un precipitado amarillo claro que
con el paso del tiempo se tornoacute de color marfil Se dejoacute en estas condiciones con
agitacioacuten vigorosa por 30 min El producto 6 fue filtrado y lavado prolijamente con
agua posteriormente se recristalizoacute en etanol obtenieacutendose un soacutelido blanco brillante
La reaccioacuten global se presenta en la Figura 44
HO
HO
OH
O
O
O O
NaOH 30 min
AcO
AcO
OH
O
6
Figura 44 Siacutentesis del aacutecido cafeico acetilado 6
c) Acetilacioacuten del aacutecido gaacutelico7
Se mezclaron 3 g de aacutecido con 7 mL de anhiacutedrido aceacutetico se antildeadioacute 1 gota de H2SO4
Se agitoacute durante 30 min a 47 degC Posteriormente la mezcla fue enfriada y filtrada al
vaciacuteo El producto 7 soacutelido de color blanco se recristalizoacute en etanol La reaccioacuten
global se presenta en la Figura 45
Materiales y meacutetodos
32
O
HO
HO
OH
OHO
O O
H2SO4 30 min
O
AcO
AcO
OAc
OH
7
Figura 45 Siacutentesis del aacutecido gaacutelico acetilado 7
d) Acetilacioacuten del aacutecido 34-dihidroxibenzoico 8
Se mezclaron 3 g de aacutecido con 6 mL de anhiacutedrido aceacutetico se antildeadioacute 1 gota de H2SO4
Se agitoacute por 30 min a 50 degC Luego se enfrioacute y filtroacute al vaciacuteo El producto 8 soacutelido de
color blanco fue recristalizado en etanol la reaccioacuten global se muestra en la Figura
46
O
OH
OH
OHO
O O
H2SO4 30 min
O
OAc
OAc
OH
8
Figura 46 Siacutentesis del aacutecido 34-dihidroxibenzoico acetilado 8
Materiales y meacutetodos
33
C Siacutentesis de los derivados hiacutebridos Procedimiento general
En base a una variante del procedimiento descrito (Ono y colaboradores 1978)90
los
derivados hiacutebridos se obtuvieron mediante la esterificacioacuten de la cumarina acetilada
5 y el correspondiente aacutecido tambieacuten previamente acetilado (6 7 8) Se disolvioacute el
aacutecido (32 mmoles) en 10 mL de DMF (seca recieacuten destilada) a temperatura ambiente
y se agregoacute el DBU en proporcioacuten equimolar se dejoacute reaccionar por 30 min en un
matraz provisto de codo de desecacioacuten (relleno con CaCl2) y agitacioacuten constante Se
agregoacute la cumarina (32 mmoles) y se aprecioacute el fin de la reaccioacuten tras 35 h a 50 degC
de temperatura La solucioacuten se llevoacute a tdeg ambiente y se hizo precipitar
cuidadosamente agregando agua destilada el soacutelido (9 10 y 11) fue lavado
prolijamente se filtroacute y secoacute
La Figura 47 muestra como ejemplo la ruta sinteacutetica llevada a cabo en la obtencioacuten
del derivado de aacutecido cafeico
Figura47 Siacutentesis del intermediario hiacutebrido derivado del aacutecido cafeico
O
OAc
OAc O
Cl
OAc
OAc
HO
O
+ DBU
DMF seco
O
OAc
OAc O
OAc
OAc
O
O
Materiales y meacutetodos
34
Posteriormente se procedioacute a desproteger los grupos fenoacutelicos en el soacutelido mediante
el procedimiento de desacetilacioacuten El producto crudo fue suspendido en una mezcla
de metanol (8 mL) acetona (12 mL) y solucioacuten saturada de NaHCO3 (14 mL) se
agitoacute a temperatura ambiente bajo nitroacutegeno por 3 h
Finalizada la reaccioacuten la suspensioacuten se concentroacute al vaciacuteo se antildeadioacute HCl en friacuteo
formaacutendose un precipitado claro que se filtroacute y lavoacute con abundante agua
posteriormente fue secado cuidadosamente El soacutelido se lavoacute prolijamente con CHCl3
a ebullicioacuten y fue secado al vaciacuteo de esta forma se obtuvo el producto hiacutebrido La
Figura 48 muestra la ruta de desproteccioacuten empleada
Figura48 Siacutentesis del compuesto hiacutebrido final 9
O
OAc
AcO O
OAc
OAc
O
O N2 tdeg amb
O
OH
HO O
OH
OH
O
O
9
hidroacutelisis baacutesica
Materiales y meacutetodos
35
En la Figura 49 se presenta un resumen de la ruta sinteacutetica para las cumarinas
hiacutebridas obtenidas
HO
O
OH
OH4
OH
OH
HO
O
OH
3
OH
OH
HO
O
2
O
OH
HO O
Cl1
ii
HO
O
OAc
OAc8
OAc
OAc
HO
O
OAc
7
OAc
OAc
HO
O
6
O
OAc
AcO O
Cl5
Figura 49A Ruta de siacutentesis de los compuestos cumariacutenicos i) H2SO4 1 h bantildeo de
hielo ii) NaOH Ac2O 30 min bantildeo de hielo (aacutecido cafeico 6) H2SO4 Ac2O
30 min (cumarina y aacutecidos benzoicos)
O
OH
HO O
Cl
HO
OH
OH
OEtCl
O O
+
1
i
Materiales y meacutetodos
36
HO
OOAc
OAc
OAc
OAc
HO
O
OAc
7
OAc
OAc
HO
O
6
OOH
HO O
OH
OH
O
O
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
9
10
11
OOAc
AcO O
Cl5
iiiiv
8
Figura 49B Ruta de siacutentesis de los compuestos cumariacutenicos iii) DBU DMF (seca)
35 h 50 degC iv) NaHCO3 MeOH acetona tdeg amb 3 h N2
Materiales y meacutetodos
37
422 Procedimiento experimental en electroquiacutemica
i) Celda electroquiacutemica
La celda de trabajo estuvo compuesta por tres electrodos el de trabajo de carbono
viacutetreo y superficie 0076 cm2 electrodo de referencia AgAgCl (3 M KCl) inmerso en
puente salino (DMF + HFFTBA 02 M) y alambre de platino como contra-electrodo
ii) Condiciones de trabajo
Los experimentos se realizaron utilizando como solvente aproacutetico NN-
dimetilformamida (previamente destilada y guardada con tamiz molecular 3 Aring) las
soluciones de trabajo en una concentracioacuten de 2 mM para todos los compuestos
continuamente fueron purgadas con nitroacutegeno extra puro el electrolito soporte
utilizado fue HFFTBA (hexafluorofosfato de tetrabutil amonio) en una concentracioacuten
dos oacuterdenes de magnitud superior a la de la muestra
iii) Teacutecnicas empleadas
En el desarrollo de este trabajo se utilizoacute voltamperometriacutea ciacuteclica (VC) y
voltamperometriacutea de pulso diferencial (VPD)
Materiales y meacutetodos
38
iv) Caacutelculos
El proceso de deconvolucioacuten de las graacuteficas en VC se llevoacute a cabo utilizando el
software Origin Pro 8 SR2 (Origin Lab Corporation USA) Se aplicoacute la funcioacuten
Gaussiana (Ecuacioacuten 41)
119910 = 1199100 + 119860
119908 radic120587 119890
minus2(119909minus119909119888)2
1199082 Ecuacioacuten 41
423 Estudio de generacioacuten de especies radicalarias mediante espectroscopiacutea de
resonancia de espiacuten electroacutenico
La oxidacioacuten electroquiacutemica de los compuestos se realizoacute utilizando las
mismas condiciones de potencial de voltametriacutea ciacuteclica una celda compuesta de
electrodo de trabajo de alambre de platino el medio empleado fue DMF + HFFTBA
como contra-electrodo se utilizoacute alambre de platino La estabilizacioacuten del radical
generado en la oxidacioacuten electroquiacutemica se logroacute empleando el catioacuten quelante Zn2+
el cual es silente a la teacutecnica espectroscoacutepica y forma complejos con el grupo catecol
Se utilizoacute ZnCl2 en concentracioacuten final 3 mM
Materiales y meacutetodos
39
424 Procedimiento experimental en el estudio de actividad frente a especies
radicalarias
4241 Metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno
(oxygen radical antioxidant capacity-fluorescein ORAC-FL)
Se prepararon soluciones stock en etanol para cada compuesto de ellas se obtuvieron
las soluciones de trabajo diluidas en solucioacuten buffer fosfato (pH 74) Se antildeadieron
las aliacutecuotas respectivas de concentraciones crecientes de cada compuesto en los
pocillos de la placa (concentraciones finales entre 02 microM y 109 microM que permitieron
obtener curvas de decaimiento apropiadamente separadas) posteriormente se
adicionoacute la sonda fluoresceiacutena (Figura 410 A) (solucioacuten preparada en buffer pH 74 y
concentracioacuten final 40 nM) y se pre-incuboacute 15 min a 37 degC Finalmente se adicionoacute la
aliacutecuota correspondiente de solucioacuten de 22prime-azobis(2-metiilpropionamidina)
dihidrochloridrato (ABAP) la solucioacuten fue preparada en buffer pH 74 y
concentracioacuten final 18 mM (Figura 410 B) y se llegoacute a un volumen final de 200 microL
La placa fue introducida en el lector y se midioacute el decaimiento de la sonda
fluorescente cada 1 min con agitacioacuten previa a cada medicioacuten Para cada set de
medidas fue determinado el blanco correspondiente que contiene la sonda
fluorescente y el generador de radicales peroxilo (ROObull) Se empleoacute el compuesto
Trolox como antioxidante estaacutendar de referencia (Figura 410 C) utilizaacutendose un set
Materiales y meacutetodos
40
de concentraciones entre los 3 microM y 20 microM y el procedimiento anteriormente descrito
para determinar el decaimiento de la fluorescencia de la sonda
La capacidad de inhibicioacuten expresada como valor de iacutendice ORAC se cuantificoacute
utilizando el valor integrado de aacuterea bajo la curva (ABC) de fluorescencia (Figura
411 donde F0 es el valor medido a tiempo 0 y F es el valor de fluorescencia al final
de la medicioacuten cuando se aprecioacute que el decaimiento es total) La ABC neta se obtuvo
de restar el valor del blanco al valor de cada compuesto (ver Ecuacioacuten 42)
ABC neta = ABC compuesto ndash ABC blanco Ecuacioacuten 42
ONaO O
ONa
O
A
O
HO
OH
O
C
Figura 410 A Sonda fluoresceiacutena B 22prime-azobis(2-metilpropionamidina)
dihidrochloridrato (ABAP) C 6-hidroxi-2578-tetrametilcroman-2-aacutecido carboxiacutelico
(Trolox)
-Cl H2N+
NH2
N
N+NH2 Cl-
NH2
B
Materiales y Meacutetodos
41
Figura 411 Actividad antioxidante ORAC-FL para un compuesto en estudio
Finalmente este valor de ABC neta para cada concentracioacuten se graficoacute con respecto a la
concentracioacuten obtenieacutendose una relacioacuten lineal en el rango de estudio La pendiente de
la regresioacuten de cada compuesto fue dividida por el valor de la pendiente del estaacutendar
Trolox (obtenido de la mima forma descrita para las muestras) este coeficiente es el
mencionado Iacutendice ORAC
Los datos fueron procesados mediante el software Origin Pro 8 SR2 (Origin Lab
Corporation USA) Las mediciones se realizaron en triplicado
0 1000 2000 3000 400000
02
04
06
08
10
ABCneta
Antioxidante
Blanco
F
F0
Tiempo s
Materiales y Meacutetodos
42
4242 Metodologiacutea de determinacioacuten de poder antioxidante de reduccioacuten de hierro
(FRAP)
Preparacioacuten de soluciones
i) Preparacioacuten solucioacuten tampoacuten acetato
Se disolvieron 155 g de acetato de sodio trihidrato (CH3COONamiddot3H2O) en agua
ultrapura se agregaron 8 mL de CH3COOH glacial con agitacioacuten constante y se aforoacute
a 500 mL El pH fue ajustado a 36 con NaOH concentrado
ii) Preparacioacuten de solucioacuten tampoacuten fosfato pH 74
Se mezclaron 80 mL de solucioacuten 01 M de NaOH con 100 mL de solucioacuten 01 M de
KH2PO4 se agitoacute para homogeneizar
iii) Preparacioacuten solucioacuten HCl 40 mM
En un matraz aforado (50 mL) se mezclaron 167 microL de HCl 12 M (37) con agua
ultrapura y se agitoacute hasta homogeneizar
iv) Preparacioacuten de solucioacuten TPTZ
Se pesaron 797 mg de reactivo TPTZ (Figura 412) y se aforoacute a 25 mL con solucioacuten
HCl 40 mM se agitoacute y conservoacute protegido de la luz
Materiales y Meacutetodos
43
N
N
N
N
NN
Figura 412 Reactivo 246-tris(2-piridil)-s-triazina (TPTZ)
v) Preparacioacuten solucioacuten de FeCl3 (20 mM)
Se pesaron 0054 g de FeCl3middot6H2O se aforoacute a 10 mL con agua ultrapura y se agitoacute
constantemente
vi) Preparacioacuten del reactivo FRAP
Se mezcloacute el tampoacuten acetato con solucioacuten TPTZ y solucioacuten feacuterrica en proporcioacuten
1011 se agitoacute y conservoacute al abrigo de la luz
vii) Preparacioacuten de soluciones en estudio
Se mezclaron aliacutecuotas de solucioacuten stock (en etanol) de cada compuesto con tampoacuten
fosfato luego se agitaron y se obtuvieron soluciones en concentraciones entre 15 microM y
58 microM
Materiales y Meacutetodos
44
Ensayo de capacidad reductora
En un frasco aacutembar se mezclaron 150 microL de solucioacuten de muestra con 450 microL de agua
ultrapura y posteriormente 950 microL de reactivo FRAP La solucioacuten se agitoacute e
inmediatamente se tornoacute de color azul lo que indicoacute la reaccioacuten de oxidacioacuten de Fe2+
a Fe3+
en el complejo formado con el reactivo TPTZ Se midioacute el espectro de
absorbancia en el rango del UV-visible a temperatura ambiente considerando el valor
de λmaacutex = 599 nm Los experimentos se realizaron en triplicado los valores obtenidos
para este ensayo se expresan como equivalentes de Trolox 10 microM de muestra
4243 Capacidad de apagamiento del radical hidroxilo (OHbull) mediante la teacutecnica
spin trap
Se realizoacute el ensayo mediante la metodologiacutea de Fenton no cataliacutetico comparando las
sentildeales en el espectro mediante espectroscopia de resonancia de espiacuten electroacutenico
(REE) del aducto DMPO-OH como blanco frente a las sentildeales obtenidas en las
mismas condiciones tras antildeadir los compuestos en estudio Para la generacioacuten del
radical hidroxilo se utilizoacute peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2) y solucioacuten acuosa de NaOH
metodologiacutea que presenta la ventaja de que en ausencia de iones Fe2+
(como en la
metodologiacutea Fenton) se evitoacute la reaccioacuten de quelacioacuten con los grupos catecol presentes
en las estructuras propuestas91ab
Materiales y Meacutetodos
45
-10 -08 -06 -04
Ipa0
O2 + e
- O
2
-
O2
-O
2 + e
-
10 A
E vs Ag|AgCl V
Se prepararon soluciones stock (20 mM en DMF) de cada compuesto en estudio se
tomaron aliacutecuotas de 100 microL y se agregaron 50 microL de NaOH (25 mM) 50 microL de
solucioacuten de 55-dimetil-1-pirroline-N-oacutexido (DMPO) (30 mM) y finalmente 50 microL de
agua oxigenada (30) se agitoacute cuidadosamente se incuboacute por 5 minutos y se midioacute
su espectro Los resultados se expresaron como el porcentaje de inactivacioacuten del
radical hidroxilo
4244 Estudio de reactividad frente a anioacuten radical superoacutexido O2middot -
Se evaluoacute la reactividad de cada compuesto frente al radical anioacuten superoacutexido el que
fue generado electroquiacutemicamente en la superficie del electrodo a traveacutes de la
reduccioacuten del oxiacutegeno molecular disuelto en el medio (Figura 413)
Figura 413 Voltamograma ciacuteclico de la generacioacuten de anioacuten radical superoacutexido
DMF + HFFTBA 02 M en electrodo de carbono viacutetreo
Materiales y Meacutetodos
46
i) Celda electroquiacutemica
La celda estuvo compuesta de tres electrodos el electrodo de trabajo fue carbono
viacutetreo (aacuterea = 003 cm2) el electrodo auxiliar empleado fue Ag|AgCl (KCl 3 M
inmerso en DMF + HFFTBA 02 M como puente salino) y alambre de platino como
contra-electrodo
ii) Teacutecnica empleada
La generacioacuten del radical se realizoacute mediante voltamperometriacutea ciacuteclica (VC) a
velocidad de barrido de 01 Vs en un rango de potencial entre 0 V (inicial) y -1 V
como potencial de inversioacuten de la direccioacuten de barrido (switching) 92
iii) Experimento
Los experimentos se realizaron utilizando como solvente 10 mL de NN-
dimetilformamida (previamente destilada) el electrolito soporte utilizado fue
HFFTBA (hexafluorofosfato de tetrabutil amonio) en concentracioacuten 02 M las
soluciones fueron saturadas con aire continuamente Una vez estabilizada la corriente
se antildeadieron a la celda aliacutecuotas crecientes de solucioacuten stock de cada compuesto
observaacutendose la disminucioacuten en la corriente de pico anoacutedica Ipa0 Una vez obtenidos
los voltamogramas se determinoacute el paraacutemetro adimensional ((Ipa0-Ipa
S) Ipa
0) el que
expresoacute el consumo de la especie radical este valor se graficoacute con respecto a la
concentracioacuten del sustrato cuya relacioacuten fue una regresioacuten lineal De la graacutefica se
Materiales y Meacutetodos
47
obtuvo el valor de concentracioacuten de antioxidante en que la corriente de pico anoacutedico
disminuye en un 50 (IA50)
4245 Estudio de la capacidad antioxidante celular (CAC)
Para evaluar la actividad antioxidante de los compuestos estudiados en un medio
celular se utilizoacute el meacutetodo descrito en la literatura por Wolfe93
Se emplearon ceacutelulas
EAhy 926 (ATCC CRL-2922) las que fueron sembradas con una densidad de
50000 ceacutelulas por pocillo en microplacas de 96 pocillos con medio de cultivo
RPMI 1640 Despueacutes de 24 h fue removido el medio de cultivo y los pocillos
fueron lavados con buffer fosfato salino (PBS) pH 74 Los pocillos fueron tratados
con 20 μM de la sonda DCFH-DA disuelta en RPMI 1640 libre de suero fetal bobino
Posteriormente se agregaron los compuestos en dos concentraciones diferentes 1 μM y
10 μM Luego de transcurrida 1 h de incubacioacuten a 37 degC los pocillos fueron
lavados con PBS Luego de esto se agregoacute ABAP en una concentracioacuten final de
600 μM y se midioacute la fluorescencia generada por la sonda en el multi-lector de placas
a temperatura constante de 37 degC La emisioacuten a 538 nm fue medida con una excitacioacuten
a 485 nm cada 1 min por 1 hora El ensayo se realizoacute en triplicado El valor de
capacidad antioxidante se calcula determinando el aacuterea bajo la curva para la muestra y
el control experimental utilizando la siguiente ecuacioacuten
CAC = 100 ndash (ABCmuestra ABCcontrol) 100 Ecuacioacuten 43
Materiales y Meacutetodos
48
4246 Estudio de hidrofobicidad relativa de los compuestos
La hidrofobicidad de los compuestos se correlaciona con sus coeficientes de reparto y
distribucioacuten (log P para el reparto octanolagua y log D para la distribucioacuten
octanolsolucioacuten tampoacuten pH 74) los que se determinan utilizando teacutecnicas
espectrofotomeacutetricas yo cromatograacuteficas
Para realizar estas experiencias se determina la solubilidad del analito en octanol
saturado con agua y en la solucioacuten tampoacuten pH 74 saturado con octanol Luego se
obtienen las respectivas curvas de calibracioacuten para la concentracioacuten del compuesto en
estas soluciones en funcioacuten de la absorbancia yo aacuterea bajo la curva Se espera que las
curvas de calibracioacuten obtenidas cumplan con el requisito de una linealidad apropiada
Posteriormente se debe evaluar el reparto midiendo la concentracioacuten analiacutetica en la
fase orgaacutenica y acuosa Para la determinacioacuten del reparto estaacute descrita la siguiente
ecuacioacuten
119897119900119892119875119900119888119905119886119892119906119886 = log ([119904119900119897119906119905119900]119900119888119905119886119899119900119897
[119904119900119897119906119905119900]119886119892119906119886) Ecuacioacuten 44
Mientras que para la determinacioacuten de la distribucioacuten se utiliza la siguiente ecuacioacuten
119897119900119892119875119900119888119905119886119892119906119886(119905119886119898119901oacute119899) = log ([119904119900119897119906119905119900]119900119888119905119886119899119900119897
[119904119900119897119906119905119900]119905119886119898119901oacute119899 119901119867 74) Ecuacioacuten 45
Materiales y Meacutetodos
49
Para este estudio se realizoacute la determinacioacuten de tiempos de retencioacuten como medida de
la hidrofobicidad relativa entre compuestos Se utilizoacute una columna C18 ODS Hypersil
una fase moacutevil compuesta de acetonitrilo solucioacuten H3PO4 (6535 vv) bajo
condiciones isocraacuteticas con flujo 1 mLmin volumen de inyeccioacuten 50 microL
4247 Estudio teoacuterico caacutelculo del Iacutendice de Fukui
La optimizacioacuten de estructuras de los compuestos neutros se realizoacute utilizando el
meacutetodo DFTSP-DFT basado en la Teoriacutea de Funcionales de la Densidad (DFT)94-96
Se utilizoacute el funcional hiacutebrido B3LYP el conjunto de bases empleado fue 6-31G(d)
Los caacutelculos se realizaron mediante el software Gaussianrsquo09 Los descriptores locales
se evaluaron a traveacutes de la aproximacioacuten de orbitales condensados Orbitales
Moleculares Frontera (Mulliken MOs)
Resultados y discusioacuten
50
5 Resultados y discusioacuten
51 Siacutentesis de los compuestos
Se presentan a continuacioacuten los resultados de la caracterizacioacuten fiacutesica y
espectroscoacutepica de los compuestos sintetizados durante este trabajo
4-clorometil-78-dihidroxicumarina (1)
1H RMN (DMSO d6 δ ppm) 493 (s 2H -CH2-) 641 (s 1H =CH- cumarina) 686
(d 1Harom Jorto 85) 717 (d 1Harom Jorto 85) 942 (s1H OH) 1022 (s 1H OH)
13C RMN (DMSO d6 δ ppm) 4187 11047 11129 11267 11585 13282 14358
15017 15181 16046 Rendimiento 47 Punto de fusioacuten 202-204 degC Agujas
color marfil PM 2265gmol Foacutermula molecular C10H7O4Cl
4-clorometil-78-diacetilcumarina (5)
1H RMN (DMSO d6 δ ppm) 235 (s 3H -CH3) 241 (s 3H-CH3) 506 (s 2H -
CH2-) 674 (s 1H =CH- cumarina) 739 (d 1Harom Jorto 878) 783 (d 1Harom Jorto
878)13
C RMN (DMSO d6 δ ppm) 1943 1985 3983 4073 11467 11549
11871 12238 12939 14459 14593 14999 1578716751 Rendimiento 68
Punto de fusioacuten 157-159 degC Soacutelido blanco PM 3105 gmol Foacutermula molecular
C14H11O6Cl
Resultados y discusioacuten
51
Aacutecido-34-diacetoxicinaacutemico (6)
1H RMN (acetona d6 δ ppm) 215 (s 3H -CH3) 216 (s 3H CH3) 638-643 (d 1H
Jtrans 159) 717-720 (d 1Harom Jorto 878) 748-750-756 (s Harom y Htrans) 13
C RMN
(acetona d6 δ ppm)1996 2004 11977 12333 12450 12682 13364 14323
14339 14439 16699 16809 16817 Rendimiento 56 Punto de fusioacuten
158-161 degC Soacutelido blanco PM 264 gmol Foacutermula molecular C13H12O6
Aacutecido-345-triacetilbenzoico (7)
1H RMN (acetona d6 δ ppm) 217 (s 6H -CH3) 219 (s 3H -CH3) 767 (s 2H
Harom) 13
C RMN (acetona d6 δ ppm) (2C -CH3 1865) (2C-C=O 1910) (2Carom
12160) 12790 13857 (2C 14337) 16432 16599 16789 Rendimiento 66
Punto de fusioacuten 158-160 degC Soacutelido blanco PM 296 gmol Foacutermula molecular
C13H12O8
Aacutecido 34-diacetilbenzoico (8)
1H RMN (acetona d6 δ ppm) 217 (s 6H CH3) 724-727 (d 1Harom Jorto 85) 774-
775 (d 1Harom) 781-784 (dd 1Harom) 13
C RMN (acetona d6 δ ppm) 1910 1913
(2C 12329) 12453 12729 12838 16487 16699 16729 Rendimiento 61
Punto de fusioacuten 155-158 degC Soacutelido blanco PM 238 gmol Foacutermula molecular
C11H10O6
Resultados y discusioacuten
52
4-metil-(34-dihidroxicinamoato)-78-dihidroxicumarina (9)
1H RMN (DMSOd6 δppm) 541(s 2H -CH2-) 621(s 1H =CH- cumarina) 642-
648 (d 1H Jtrans= 1591) 682-71 (Harom) 758-763 (d 1H Jtrans = 1591) 91 (s -
OH) 94 (s -OH) 97 (s -OH) 102 (s- OH)13
C RMN (DMSO d6 δppm) 6154
10820 11035 11290 11345 11526 11550 11620 12225 12566 13292
14391 14607 14686 14920 15026 15174 16055 16646ESI-MS mz 371
[M+H]+ 369 [M-H]
- 181 [M+H]
+ 163 [M-H2O+H]
+ 145 [M-H2O+H]
+ 135 [M-
HCOOH+H]+ 179 [M-H]
- 161 [M-H2O-H]
- 135 [M-CO2-H]
-Rendimiento 37
Punto de fusioacuten 246-249 degC Soacutelido amarillo opaco PM 37031 gmol Foacutermula
molecular C19H14O8
4-metil-(345-dixidroxibenzoato)-78-dihidroxicumarina ( 10 )
1H RMN (DMSO d6 δ ppm) 546 (s 2H -CH2-) 619 (s 1H =CH- cumarina) 682-
685 (d 1Harom Jorto 8508) 704 (s 2Harom) 709-712 (d 1Harom Jorto 778)13
C RMN
(DMSO d6 δppm) 6192 10821 10914 11041 11295 11533 11885 13292
13949 14394 (2Carom) 14620 15024 15184 16055 16555 16793ESI-MS mz
361 [M+H]+ 359 [M-H]
- 171 [M+H]
+ 153 [M-H2O+H]
+ 125 [M-CO2H+H]
+ 169
[M-H]- 125 [M-CO2-H]
- Rendimiento 46 Punto de fusioacuten descomposicioacuten sobre
230 degC Soacutelido amarillo opaco PM 36027 gmol Foacutermula molecular C17H12O9
Resultados y discusioacuten
53
4-metil-(34-dihidroxibenzoato)-78-dihidroxicumarina (11)
1H RMN (DMSO d6 δ ppm) 548 (s 2H -CH2-) 619 (s 1H =CH- cumarina) 685
(m 2Harom) 71 (d 1Harom) 74 (d 2Harom) 13
C RMN (DMSO d6 δ ppm) 6142
10774 10988 11242 11481 11551 11626 11957 12218 13240 14343
14520 14972 15096 15127 16001 16490 ESI-MS mz 345 [M+H]+ 343 [M-
H]- 137 [M-H2O+H]
+ 109 [M-HCOOH+H]
+ 153 [M-H]
- 108 [M-CO2-H]
-
Rendimiento 73 Punto de fusioacuten descomposicioacuten sobre 250 degC Soacutelido amarillo
opaco PM 34427 gmol Foacutermula molecular C17H12O8
Resultados y discusioacuten
54
52 Estudios de voltametriacutea ciacuteclica y voltametriacutea de pulso diferencial
El proceso de oxidacioacuten electroquiacutemico de los compuestos fue evaluado mediante
voltamperometriacutea de pulso diferencial VPD Los resultados presentaron soacutelo un pico
de oxidacioacuten para los compuestos 1 2 4 y 9 por otra parte el aacutecido gaacutelico 3 y los
hiacutebridos 10 y 11 mostraron dos o maacutes sentildeales poniendo de manifiesto las complejas
reacciones de oxidacioacuten que presentan los grupos -OH en dichas estructuras (Figura
51 A y B)97
Al analizar las sentildeales tanto para los precursores y sus derivados hiacutebridos se encontroacute
que la uacutenica sentildeal anoacutedica del compuesto 9 corresponderiacutea tanto a la oxidacioacuten del
catecol presente en la cumarina 1 (Epa 083 V) como del aacutecido cafeico 2 (Epa 076 V)
(Figura 52 A) ambos compuestos por separado tuvieron potenciales de pico anoacutedico
cercanos los que se solaparon para una dar una sola sentildeal en el derivado 9 (Epa 082
V)
Figura 51 A
Voltamperogramas de pulso
diferencial para los
precursores 1 2 3 y 4 2 mM
en DMF + HFFTBA 02 M
00 03 06 09 12 15 18 21 24
OO H
O H
H O
OOH
OH
HO
OH
OH
OH
O
HO
OOH
OH O
Cl
A
2A
E vs Ag|AgCl V
1
2
3
4
Resultados y discusioacuten
55
Figura 51 B Voltamperogramas de pulso diferencial para los derivados 9 10 y 11
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
En el caso del hiacutebrido 11 derivado del aacutecido protocateacutequico se observaron dos picos de
oxidacioacuten que corresponderiacutean a la oxidacioacuten del catecol cumariacutenico (Epa 083 V) y el
catecol del aacutecido benzoico (Epa 111 V) A diferencia del caso anterior se encontroacute
que las sentildeales anoacutedicas de ambos precursores estuvieron lo suficientemente distantes
como para solaparse como en el caso anterior Considerando que los resultados se
obtuvieron bajo las mismas condiciones experimentales se podriacutea asumir que la sentildeal
a potencial Epa1 081 V corresponde a la oxidacioacuten en el anillo de la cumarina y la
sentildeal en Epa2 094 V corresponde a la oxidacioacuten del catecol presente en el anillo
benceacutenico Para el compuesto 10 se observoacute un comportamiento semejante al descrito
para 11
00 03 06 09 12 15 18 21 24
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OH O O
O
OO H
O H
O H
OOH
OH O
OH
OH
O
O
B
E vs Ag|AgCl V
9
10
11
2A
Resultados y discusioacuten
56
Los experimentos de voltamperometriacutea ciacuteclica se llevaron a cabo a distinta velocidad
de barrido 005 Vs ndash 3 Vs con el objeto de estudiar su influencia sobre la sentildeal de
oxidacioacuten En forma graacutefica para precursores y derivados se observaron pares redox de
comportamiento irreversible debido al evidente desplazamiento del potencial de pico
Epa con respecto al aumento de la velocidad de barrido El valor de ΔEp (Epa -Epc) se
incrementoacute con el aumento en la velocidad lo que indica una disminucioacuten en la
velocidad de transferencia electroacutenica Para los compuestos 1 2 4 y 9 a la velocidad
de barrido estudiada se observoacute al igual que en VPD la aparicioacuten de una uacutenica sentildeal
de oxidacioacuten para todo el rango de velocidad (la que se desplaza a potenciales maacutes
positivos a medida que aumenta la velocidad de barrido) seguida de una sentildeal de
reduccioacuten en el barrido hacia potenciales negativos Para los compuestos 3 10 y 11 se
apreciaron dos sentildeales de oxidacioacuten seguida de la correspondiente sentildeal en el barrido
de reduccioacuten
Para cada par redox se realizaron estudios por segmentos encontraacutendose para los
compuestos 9 y 10 que el pico I (de oxidacioacuten) estaacute relacionado con el pico II (de
reduccioacuten) y para el compuesto 11 las sentildeales I y Irsquo (de oxidacioacuten) estaacuten relacionadas
con el pico II (de reduccioacuten) Esto es indicio de que en el primer barrido se observa el
proceso de oxidacioacuten de los grupos fenoles en el cual se generan especies factibles de
ser reducidas como derivados de tipo quinoacutenico (Figuras 52 a 54)
Resultados y discusioacuten
57
Figura 52A VC para el derivado 9 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 53A VC para el derivado 10 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
-03 00 03 06 09 12 15
A
II
I
OOH
OH O
OH
OH
O
O
100 A
005 Vs
3 Vs
E vs Ag|AgCl V
03 06 09 12 15
B
II
I
E vs Ag|AgCl V
0 V - 13 V
0 V - 06 V
00 03 06 09 12 15 18
A
II
I
I
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
3 Vs
005 Vs
E vs Ag|AgCl V
00 03 06 09 12
B
II
I
E vs Ag|AgCl V
-02 V - 06 V
-02 V - 11 V
Resultados y discusioacuten
58
Figura 54 A VC para el derivado 11 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
En sistemas fenoacutelicos simples como es el caso del catecol o la hidroquinona se ha
estudiado el proceso redox en distintos medios 98-101
planteaacutendose que la oxidacioacuten en
medio aproacutetico deriva en la formacioacuten de la quinona correspondiente viacutea 2e-2H
+
(Figura 55) En esta investigacioacuten se han estudiado estructuras de mayor complejidad
y considerando que en este proceso de oxidacioacuten se ha descrito la presencia de
especies radicales como intermediarios de reaccioacuten es probable que ocurran procesos
de dimerizacioacuten o ataques nucleofiacutelicos por parte de los radicales dando como
resultado la generacioacuten de compuestos diferentes a la moleacutecula de partida (por
ejemplo de mayor peso molecular) Este tipo de comportamiento se puede analizar en
profundidad realizando barridos de potencial consecutivos en VC a baja velocidad de
00 03 06 09 12 15
I
II
I
A
100 A
OHO O
O
OOH
OH
OH
005 Vs
3 Vs
E vs Ag|AgCl V
00 03 06 09 12 15
II
I
IB
E vs Ag|AgCl V
-01 V - 07 V
-01 V - 14 V
Resultados y discusioacuten
59
barrido (005 Vs o menor para observar maacutes detalladamente la reaccioacuten quiacutemica en la
escala de tiempo del experimento) Si fuese el caso se esperariacutea observar la aparicioacuten
de sentildeales nuevas en el segundo barrido de oxidacioacuten que dariacutean cuenta de la
oxidacioacuten de las nuevas estructuras fenoacutelicas generadas
OH
OH-2e- -2H+
2e- 2H+
O
O
Figura 55 Esquema del proceso electro-oxidativo propuesto para el catecol
Se realizoacute la deconvolucioacuten (mediante la funcioacuten gaussiana) sobre las curvas de
oxidacioacuten para los compuestos con el objeto de determinar los valores de corriente de
pico anoacutedica de forma independiente con esto se obtienen valores de corriente y
potencial (principalmente a alta velocidad de barrido) los cuales son maacutes exactos que
los entregados por defecto por el software electroquiacutemico utilizado Las graacuteficas y
caacutelculos correspondientes a la relacioacuten entre los diferentes paraacutemetros analizados se
realizaron considerando los valores de Ipa y Epa para el primer pico oxidativo debido a
que esta sentildeal entrega informacioacuten con respecto a la energiacutea del primer electroacuten cedido
en el proceso de oxidacioacuten etapa que generalmente es lenta y determinante de la
velocidad de reaccioacuten
Resultados y discusioacuten
60
La expresioacuten indicada en la Ecuacioacuten 51102
da cuenta de la relacioacuten entre el potencial
de pico y el logaritmo de la velocidad de barrido para una reaccioacuten electroquiacutemica
irreversible
119864119901 119894119903119903119890119907 = 11986412 + 119887
2[104 minus log (
119887
119863) minus 2119897119900119892119896119891 + 119897119900119892119907] Ecuacioacuten 51
Por tanto de la graacutefica Ep vs logv se puede obtener el valor de la pendiente de Tafel b
que es igual al doble de la pendiente de la recta obtenida
119864119901 119894119903119903119890119907 = 119862119905119890 + 119887
2(119897119900119892119907) Ecuacioacuten 52
La graacutefica de potencial de pico anoacutedico (Epa) vs logv dio como resultado una relacioacuten
de tipo lineal para todos los compuestos el potencial de oxidacioacuten se desplazoacute hacia
valores maacutes positivos con el aumento de la velocidad de barrido lo que indica el
caraacutecter irreversible del proceso oxidativo en este medio En la Figura 56 se presenta
la graacutefica obtenida para el derivado 9 como ejemplo representativo de los resultados
obtenidos
Resultados y discusioacuten
61
Figura 56 Relacioacuten Epa vs logv para el derivado de aacutecido cafeico 9 2 mM en
DMF + HFFTBA 02 M
Los valores obtenidos para la pendiente de Tafel se resumen en la Tabla 51 Los
compuestos 1 y 3 poseen valores de la pendiente de Tafel cercanos al teoacuterico (118
mVdec)103
para un proceso en que la primera transferencia electroacutenica es la etapa
lenta del proceso (por tanto la etapa determinante de la reaccioacuten de electro-oxidacioacuten)
El compuesto 4 presenta un valor de 88 mVdec lo que sugiere que el electrodo estaacute
contaminado103104
o se produce un mecanismo de oxidacioacuten complejo (que implica
una transicioacuten entre la etapa quiacutemica y la transferencia electroacutenica como determinante
de la velocidad)105
De la misma forma los valores encontrados para los derivados 9
(170 mVdec) 10 (134 mVdec) y 11 (140 mVdec) y para el aacutecido cafeico (212
mVdec) indican que en las condiciones experimentales utilizadas la superficie del
18 21 24 27 30 33 36
090
093
096
099
102
105
OOH
OH O
OH
OH
O
O
r = 098638
m = 008548
Ep
a1 (
V)
logv (mV12
s-12
)
Resultados y discusioacuten
62
electrodo se contamina (pasiva)106
con la generacioacuten de especies polimeacutericas debido a
la formacioacuten del radical fenoxilo (ArObull) el cual puede dimerizar y originar diversos
productos de reaccioacuten los cuales se adhieren a la superficie del electrodo
Para cada compuesto se establecioacute la existencia de una relacioacuten de tipo lineal entre el
logaritmo de la corriente de pico anoacutedico y el logaritmo de la velocidad de barrido
(logIpa vs logv) El valor para la pendiente de estas rectas estuvo entre 044 y 056
(Tabla 51) lo que sugiere que el proceso observado es de tipo difusivo
La corriente de pico anoacutedica se puede expresar en funcioacuten de distintos paraacutemetros
experimentales como se indica en la Ecuacioacuten 53102
119868119901 = 301 times 10minus5 119899 (23 119877 119879
119887 119865)
12
11986312 119862 11990712 Ecuacioacuten 53
Donde n es el nuacutemero de electrones transferidos R es la constante de los gases (Jmol
K) T es la temperatura (K) D es el coeficiente de difusioacuten de la especie electro-activa
(cm2s) F es la constante de Faraday (Cmol) b es la pendiente de la ecuacioacuten de
Tafel107
(η = a + b log i) C es la concentracioacuten de la especie electro-activa (molL) y v
es la velocidad de barrido (mVs) Esta expresioacuten indica que la correlacioacuten entre
Ip y vfrac12
da como resultado una recta que seraacute funcioacuten del nuacutemero de electrones n y la
pendiente de Tafel b valores que estaacuten presentes en la pendiente de esta recta
Resultados y discusioacuten
63
Considerando lo anterior se procedioacute a graficar Ipa vs vfrac12
encontraacutendose para todos los
compuestos (Figura 57) una relacioacuten de tipo lineal con valores de r entre 099988 y
099448 se presenta ademaacutes la regresioacuten para el aacutecido protocateacutequico 4 como muestra
del comportamiento encontrado para todos los compuestos con valores de intercepto
que tienden a cero Al observar la Tabla 51 se aprecia que todas las regresiones
poseen una pendiente semejante lo cual da un indicio con respecto al nuacutemero de
electrones y mecanismo involucrados en la reaccioacuten de oxidacioacuten estudiada
Figura 57 Graacutefica para la corriente de pico Ipa vs la raiacutez cuadrada de la velocidad de
barrido Ejemplo de correlacioacuten lineal en el aacutecido protocateacutequico 4 2 mM en DMF +
HFFTBA 02 M
Tomando en cuenta que los valores de C R T y F (Ecuacioacuten 53) son factores
constantes y que los coeficientes de difusioacuten D seraacuten semejantes y del mismo orden
para aquellos compuestos de estructura similar (precursores por una parte y derivados
por otra) se obtiene que la pendiente de la recta obtenida en esta correlacioacuten es un
0 10 20 30 40 50 600
50
100
150
200
250
Ipa (
A)
V12
(mV12
s-12
)
OOH
OH
HO
m = 40 10-6
r = 099988
Resultados y discusioacuten
64
indicador respecto al nuacutemero de electrones involucrados en la reaccioacuten y al valor de b
(relacionado con el mecanismo de oxidacioacuten estudiado)
En el caso de los compuestos precursores se obtuvieron valores de pendientes entre
36bull10-6
y 41bull10-6
(Tabla 51) este rango cercano indica la transferencia del mismo
nuacutemero de electrones en el proceso oxidativo observado en que para la cumarina
clorada 1 el aacutecido cafeico 2 y el aacutecido protocateacutequico 4 corresponde a la uacutenica sentildeal
de oxidacioacuten observada y en el caso del aacutecido gaacutelico 3 es el proceso correspondiente a
la primera sentildeal del voltamograma En la literatura se describen estudios en medio
aproacutetico para compuestos fenoacutelicos como por ejemplo derivados de la cumarina 78-
dihidroxilada 100ab
el aacutecido cafeico101
y la hidroquinona105
que dan cuenta de una sentildeal
en el proceso oxidativo en medio aproacutetico que involucra 2 electrones esto permite
inferir que las sentildeales observadas experimentalmente corresponden a un proceso di-
electroacutenico
Para los derivados 9 10 y 11 se observa que los valores para la pendiente Ipa vs vfrac12 se
encuentran entre 37bull10-6
y 42bull10-6
como se indica en la Tabla 51 Ademaacutes al
comparar estos resultados con los obtenidos para el caso de los precursores se deduce
que estamos frente a un proceso oxidativo que involucra dos electrones Se observa
tambieacuten que no hay cambios con respecto al mecanismo de reaccioacuten si lo hubiese se
esperariacutea encontrar diferencias del doble o superior en los valores encontrados para la
pendiente de la recta ya que eacutesta contiene el factor b (pendiente de la ecuacioacuten de
Tafel) antes mencionado
Resultados y discusioacuten
65
Posteriormente se calculoacute el valor correspondiente al potencial de inicio del proceso
electroquiacutemico (Eonset)108109
Este valor indica el potencial inicial con que el primer
electroacuten es cedido en el proceso oxidativo que tiene lugar en la superficie del
electrodo Se determina como el valor de potencial de interseccioacuten entre las recta
tangentes a la liacutenea base y la corriente de oxidacioacuten para cada velocidad de barrido
aplicada en forma experimental (005 Vs a 3 Vs en este estudio) (Figura 58) Una
vez obtenido este potencial se procede a graficar con respecto al logaritmo de la
velocidad de barrido como se presenta en la Figura 59 Se considera el valor del
intercepto de cada recta Eionset (por lo tanto a una baja velocidad de barrido) el cual
incluye el error inherente a la medicioacuten y por tanto es maacutes confiable (Tabla 51) Se
observa que estos potenciales variacutean entre 050 V y 079 V para el aacutecido gaacutelico 3 y el
aacutecido protocateacutequico 4 respectivamente potencial que da indicio de la factibilidad de
oxidacioacuten siendo el compuesto con un Eionset menor el que se oxida con mayor
facilidad Estos valores de potencial onset encontrados permitiraacuten establecer una
correlacioacuten entre el potencial de oxidacioacuten determinado de esta forma y los resultados
obtenidos en los ensayos de actividad frente a especies radicales llevados a cabo en
medio aproacutetico (seccioacuten 6)
Resultados y discusioacuten
66
Figura 58 Determinacioacuten graacutefica del valor de Eonset VC del precursor 1 01 Vs
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 59 Relacioacuten Eonset vs logv para los compuestos estudiados
-05 00 05 10 15 20
20 A
Eonset
E vs Ag|AgCl (V)
15 18 21 24 27 30 33 3606
07
08
09
10
11
12
OOH
OH
HO
OOH
OH
HO
OH
OH
OH
O
HO
OHO O
O
OOH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OOH
OH O
OH
OH
O
O
OOH
HO O
Cl
Eon
set
(V)
logv (mV12
s-12
)
Resultados y discusioacuten
67
Tabla 51 Paraacutemetros experimentales para los compuestos Determinaciones en VC
2 mM DMF + HFFTBA 02 M
Compuesto
119837119845119848119840119816119849119834120783
119837119845119848119840119855 (microAmVs
-1)
119837119816119849119834120783 119837119855120783120784
(microAmV12
s-12
)
119837119812119849119834120783
119837119845119848119840119855
(mVdec)
119835 = 120784 119837119812119849119834120783
119837119845119848119840119855
(mVdec)
Eionset
(mV)
056 36bull10-6
61 122 059
053 41bull10
-6 106 212 059
048 36bull10-6
55 110 050
O
OH
OH
HO
052 41bull10-6
44 88 079
047 40bull10-6
85 170 064
049 37bull10-6
67 134 075
044
42bull10-6
70 140 058
Con el objeto de recabar mayor informacioacuten con respecto al mecanismo de reaccioacuten
involucrado en los procesos oxidativos en estudio en base a los resultados obtenidos
OHO O
O
OOH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
O
OH
OH O
OH
OH
O
O
OOH
OH
HO
OH
OH
OH
O
HO
O
OH
HO O
Cl
Resultados y discusioacuten
68
en VC se realizoacute la graacutefica (Ipa v12
) vs v12
para los compuestos precursores 1 2 3 y
4 (escogidos por poseer un grupo catecol y ser estructuras de menor complejidad que
los derivados 9 10 y 11) Estas graacuteficas de las que se presenta el ejemplo del aacutecido
como muestra (Figura 510) presentaron una relacioacuten de tipo lineal en la que la
pendiente negativa obtenida sugiere que la reaccioacuten observada implica un mecanismo
de tipo EC considerando los estudios mencionados para compuestos fenoacutelicos
ampliamente descritos en la literatura100101105109
y el criterio de diagnoacutestico
mencionado por Pletcher y colaboradores111
Figura 510 Correlacioacuten (Ipa v12
) vs v
12 para el precursor aacutecido protocateacutequico 4
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
21 28 35 42 49 5626
28
30
32
34O
OH
OH
HO
r = -099302
V12
(mV12
s-12
)
Ipa
V12 (
A
mV
12s-1
2)
Resultados y discusioacuten
69
Diversos estudios proponen la presencia de mecanismos concertados para los procesos
redox de compuestos de tipo fenoacutelico los cuales implican la presencia de
intermediarios radicalarios y reacciones donde la transferencia de un protoacuten y un
electroacuten ocurren de forma acoplada dentro de un mismo paso Este concepto nace en la
deacutecada de 1990 a partir de los trabajos publicados por Biczoacutek y colaboradores112113
El estudio de este tipo de reacciones principalmente en derivados fenoacutelicos es de
relevancia debido al rol que eacutestos desempentildean en diferentes sistemas bioloacutegicos tanto
por su reconocida capacidad antioxidante como se evidencia en la investigacioacuten
realizada por Nakayama y colaboradores con respecto a derivados polifenoacutelicos y el
mecanismo de reaccioacuten propuesto de tipo PCET (Proton Concerted Electron Transfer)
frente al anioacuten superoacutexido114
o como en el caso de estudio de las reacciones de
transferencia electroacutenica que involucran al aminoaacutecido tirosina115ab
y otros co-factores
que forman parte esencial del proceso fotosinteacutetico que se lleva a cabo en estructuras
vegetales (Fotosistema II)116
En la deacutecada pasada los aportes a la investigacioacuten sobre el tema se tornaron maacutes
profundos y sistemaacuteticos permitiendo el modelamiento teoacuterico y anaacutelisis de este tipo
de mecanismos Debido al intereacutes concerniente a la obtencioacuten de modelos racionales
de sistemas bioloacutegicos los estudios realizados en medio proacutetico son variados como la
serie de derivados fenol-imidazol sintetizados y caracterizados por Markle y
colaboradores117
quienes entre diversos factores analizan el efecto del sustituyente
sobre el enlace O-H Otros autores como Saveacuteant Costentin y colaboradores han
abordado este toacutepico en diferentes publicaciones proponiendo distintos mecanismos
Resultados y discusioacuten
70
dependientes del pH y composicioacuten de la solucioacuten de trabajo (con buffer o sin eacutel)118
En trabajos posteriores plantean un estudio teoacuterico de modelamiento en sistemas de
tipo amino-fenol enfocados en el mencionado Fotosistema II119
y frente al sistema
enzimaacutetico superoacutexido dismutasa120
Rhile y colaboradores describen la siacutentesis
caracterizacioacuten y estudios de oxidacioacuten tanto quiacutemica como electroquiacutemica (en medio
aproacutetico acetonitrilo) de una serie de fenol-aminas junto con un anaacutelisis teoacuterico del
sistema evidenciaacutendose la presencia de especies radicales intermediarias121
junto con
valores entre 16 a 28 para la relacioacuten de efecto isotoacutepico cineacutetico (KI = kHkD) que se
estima como criterio para considerar un mecanismo concertado122
El estado del arte con respecto a los distintos mecanismos electro-oxidativos descritos
para los derivados fenoacutelicos indica que la determinacioacuten de una ruta en particular en
este proceso se puede establecer mediante estudios de naturaleza tanto experimental
como teoacuterica La obtencioacuten de paraacutemetros termodinaacutemicos como la energiacutea libre de
Gibbs el estudio de efecto isotoacutepico y la determinacioacuten de constantes de velocidad en
electroquiacutemica entre otros permiten discriminar entre las diferentes viacuteas en que se
puede llevar a cabo la electro-oxidacioacuten de fenoles
Resultados y discusioacuten
71
53 Estudio de generacioacuten de especies radicalarias mediante espectroscopia de
resonancia de espiacuten electroacutenico (REE)
A fin de evidenciar la existencia de posibles intermediarios radicalarios en el proceso
electro-oxidativo de los fenoles previamente estudiados a traveacutes de las teacutecnicas
electroquiacutemicas se procedioacute a oxidar los derivados 9 10 y 11 y medir in situ su
espectro REE Se utilizoacute la teacutecnica descrita por Le Nest y colaboradores99
en que se
describe el estudio de estructuras flavonoides polifenoacutelicas en eacutel se utiliza la
quelacioacuten con Zn2+
lo que permitioacute la estabilizacioacuten del radical formado y su posterior
estudio En primer lugar desde un punto de vista cualitativo se observoacute para cada
compuesto un evidente cambio de color en las soluciones electrolizadas las que se
tornaron de color amarillo intenso y maacutes oscuro que las soluciones de trabajo
originales lo que sugiere que tras la electroacutelisis se forma un compuesto nuevo
diferente al de partida como se esperaba En la Figura 511A-C se presentan los
espectros obtenidos junto con las respectivas simulaciones realizadas
Resultados y discusioacuten
72
Figura 511A Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido cafeico 9 estabilizado con Zn2+
en DMF + HFFTBA
(izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color
rojo)
Figura 511B Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido gaacutelico 10 estabilizado con Zn2+
en DMF + HFFTBA
(izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color
rojo)
3440 3450 3460 3470 3480 3490
O
OH
HO O
OH
OH
O
OA
Campo Magneacutetico G
3440 3450 3460 3470 3480 3490
OHO O
O
O
OH
OH
OH
OH
B
Campo Magneacutetico G
Resultados y discusioacuten
73
Figura 511C Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido protocateacutequico 11 estabilizado con Zn2+
en DMF +
HFFTBA (izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der
en color rojo)
Concordante con el resultado esperado la sentildeal espectral indica la presencia de una
especie radicalaria como intermediario de la electro-oxidacioacuten de los grupos catecol
presentes en los tres derivados en estudio
En la simulacioacuten realizada para el derivado 9 se observa el acoplamiento hiperfino de
tres aacutetomos de hidroacutegeno con los siguientes valores de constantes 132 G 098 G y
03 G que seriacutea indicio del proceso oxidativo que ocurre en el catecol del anillo
benceacutenico (Tabla 52) ya que estos valores coinciden con una interaccioacuten entre los tres
protones del anillo benceacutenico en posicioacuten 2 5 y 6 En el caso de los compuestos 10
y 11 se encontraron dos constantes de acoplamiento hiperfino lo que indica la
3440 3450 3460 3470 3480 3490
OHO O
O
OOH
OH
OH
C
Campo Magneacutetico G
Resultados y discusioacuten
74
interaccioacuten entre dos protones que seriacutean aquellos en posicioacuten 5 y 6 del anillo
cumariacutenico
Tabla 52 Constantes de acoplamiento hiperfino para los derivados polifenoacutelicos
Valores en Gauss
Compuesto aH1 G aH2 G aH3 G
132 098 030
215 156 -
235 122 -
Estos resultados concuerdan ademaacutes con lo descrito en la literatura con respecto a la
oxidacioacuten de grupos fenoacutelicos lo que permite inferir un posible mecanismo electro-
oxidativo para los derivados en estudio
O
OH
OH O
OH
OH
O
O
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
Resultados y discusioacuten
75
54 Resultados y discusioacuten de los estudios de reactividad frente a especies
radicalarias
En este punto de la investigacioacuten el objeto de estudio fue evaluar el comportamiento
de las nuevas estructuras previamente sintetizadas frente a diferentes especies
radicalarias de amplio intereacutes bioloacutegico radical peroxilo (ROObull) radical hidroxilo
(OHbull) anioacuten radical superoacutexido (O2-) junto con determinar la capacidad reductora de
los compuestos Cada ensayo fue escogido con miras de abordar el tema de la
capacidad antioxidante desde las posibilidades que permiten las experiencias de tipo in
vitro
541 Metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno
(oxygen radical antioxidant capacity-fluorescein ORAC-FL)
El estudio de especies reactivas de oxiacutegeno y nitroacutegeno asociadas a los procesos
oxidativos requiere en algunos casos del uso de compuestos denominados ldquosondasrdquo
En la teacutecnica de fluorescencia es posible implementar este tipo de metodologiacutea debido
a sus caracteriacutesticas de sensibilidad especificidad y simplicidad en la obtencioacuten de
datos convirtieacutendose en una herramienta uacutetil y ampliamente utilizada a la hora de
obtener una buena aproximacioacuten en la determinacioacuten de actividad frente a especies
EROsERNs123
Resultados y discusioacuten
76
En el caso de la metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno
(ORAC) los primeros trabajos que dan cuenta de su uso fueron descritos en la deacutecada
de 1990 a partir de la investigacioacuten de Cao y colaboradores124
En este trabajo los
autores describen la teacutecnica como un meacutetodo simple y confiable para determinar
capacidad antioxidante en serum humano en pequentildeas cantidades de muestra (del
orden de los microL) utilizando como sonda la β-ficoeritrina (proteiacutena aislada del alga roja
unicelular Porphyridium cruenturn) debido a su fluorescencia sensible a los cambios
conformacionales en su estructura en ensayos frente al radical peroxilo125
En el
desarrollo posterior Ou y colaboradores126
proponen una mejora a la teacutecnica
cambiando la sonda proteica por el compuesto fluoresceiacutena debido a su mayor foto-
estabilidad y para evitar interacciones proteiacutena-polifenol (hidrofoacutebicas y puentes de
hidroacutegeno) junto con ello realizaron la validacioacuten del meacutetodo Esta sonda es la
utilizada actualmente para este ensayo el cual es ampliamente utilizado en el estudio
de polifenoles y sus derivados127-128ab
en diferentes alimentos y bebidas129130
muestras bioloacutegicas de distinta iacutendole131
por mencionar algunos ejemplos
Para efectos de esta investigacioacuten se espera obtener un perfil de comportamiento de
cada uno de los compuestos frente al radical peroxilo (ROObull) que permita distinguir el
aporte que significa cada sustitucioacuten realizada al anillo cumarina con diferentes
grupos fenoacutelicos Cabe mencionar que las longitudes de onda maacuteximas (λmaacutex) de
absorbancia en el rango UV-visible para los compuestos ensayados estuvieron en un
rango entre los 203 nm y 329 nm En este estudio se obtuvieron los perfiles cineacuteticos
Resultados y discusioacuten
77
de consumo de la sonda fluoresceiacutena (con valores de 485525 nm para su absorcioacuten y
emisioacuten respectivamente) por induccioacuten de los radicales peroxilo (originados por
efecto de la termoacutelisis del azo-compuesto ABAP a 37 degC) A partir de estos perfiles de
decaimiento de la sonda a distintas concentraciones de compuestos antioxidantes (5 en
total) se obtuvieron curvas adecuadamente separadas como se muestra en la Figura
512 donde se muestran los resultados para el compuesto 11 como ejemplo
representativo del ensayo Posteriormente se determina para cada concentracioacuten el aacuterea
neta bajo la curva la que es graficada con respecto a las concentraciones utilizadas La
Figura 513 presenta relacioacuten lineal entre el aacuterea neta bajo la curva con respecto a la
concentracioacuten del compuesto 11 como ejemplo la que fue determinada para cada
derivado
Figura 512 Curvas para el consumo de la sonda fluoresceiacutena para un set de
concentraciones del compuesto 11
0 2000 4000 6000
02
04
06
08
10
F
F0
Tiempo (s)
control
16 M
12 M
081 M
045 M
020 M
Resultados y discusioacuten
78
Las curvas obtenidas en esta parte del experimento muestran la reaccioacuten de
competencia entre el radical y el antioxidante (el cual protege a la fluoresceiacutena del
proceso de oxidacioacuten) Posterior al procedimiento anteriormente descrito se obtuvo el
iacutendice ORAC para cada compuesto que se resume en la Tabla 54
Figura 513 Graacutefica de aacuterea neta bajo la curva ABC vs concentracioacuten del derivado 11
En este ensayo los compuestos hiacutebridos propuestos superaron en cuanto al valor de
iacutendice ORAC a la cumarina precursora 1 En los tres casos se pudo observar valores
superiores de casi el doble para el compuesto 10 y bordeando un ORAC casi tres veces
mayor en los compuestos 9 y 11 del valor obtenido para su precursor Estos resultados
evidenciaron un incremento en la capacidad antioxidante al que posee la cumarina de
manera independiente debido a la inclusioacuten de los derivados de aacutecidos
hidroxibenzoicos e hidroxicinaacutemico en su estructura (Tabla 53)
0 1 2 3 4 50
1000
2000
3000
4000
r = 099309
AB
C n
eta
Concentracioacuten (mM)
Resultados y discusioacuten
79
Tabla 53 Valores experimentales de iacutendice ORAC-FL para los compuestos
estudiados
Compuesto iacutendice ORAC-FL
(plusmnSD)
1 091 plusmn 010
2 347 plusmn 010
3 391 plusmn 009
4 069 plusmn 001
9 239 plusmn 003
10 174 plusmn 005
11 262 plusmn 004
Trolox 1
Por otra parte los valores del iacutendice ORAC de la serie fueron superiores al estaacutendar
Trolox con excepcioacuten de los compuestos 1 (cumarina de partida) y 4 (aacutecido
protocateacutequico) Para el caso de la cumarina eacutesta tuvo un valor ORAC menor a 1 En
el caso del compuesto 4 la ostensible diferencia (5 veces menor) con su homoacutelogo
aacutecido cafeico 2 deriva de la presencia del doble enlace en esta estructura aunque
ambos aacutecidos poseen igual cantidad de grupos ndashOH y en igual posicioacuten en el anillo
aromaacutetico la insaturacioacuten le confiere maacutes posibilidades de deslocalizacioacuten electroacutenica
debido a la mayor cantidad de estructuras resonantes posibles y por lo tanto mayor
Resultados y discusioacuten
80
estabilidad al formarse la especie radicalaria correspondiente en la reaccioacuten frente el
ABAP Al observar el valor obtenido para el aacutecido gaacutelico 3 se obtuvo un iacutendice
ORAC cercano al del aacutecido cafeico y aunque carece de la insaturacioacuten presente en el
derivado cinaacutemico posee en su defecto un grupo ndashOH adicional en posicioacuten 5 del
anillo aromaacutetico el cual aportoacute adicionalmente a su capacidad antioxidante (lo que no
ocurrioacute en el caso del aacutecido protocateacutequico 4)
Se observa que el aacutecido dihidroxibenzoico 4 que arrojara un valor 069 presenta un
incremento de 37 veces en su valor ORAC-FL al estar incorporado en el heterociclo
cumariacutenico En este caso se presentoacute un fenoacutemeno de sinergia positiva ya que ambos
compuestos cumarina 1 y aacutecido protocateacutequico 4 aumentaron su valor de ORAC-FL
pasando de un valor 091 y 069 de forma individual respectivamente a formar un
derivado que presentoacute un valor de ORAC-FL igual a 262 Al observar los valores
totales en los derivados 9 y 10 obtenidos no correspondieron a la sumatoria de los
iacutendices individuales de sus precursores este resultado indica que estuvo ausente el
fenoacutemeno de sinergia
Para los nuevos compuestos (9 10 y 11) se observoacute un incremento del valor de
ORAC-FL con respecto a la cumarina precursora 1 Por lo tanto la inclusioacuten delas
estructuras fenoacutelicas en el heterociclo cumariacutenico generoacute la obtencioacuten de nuevos
derivados con una mayor capacidad antioxidante en esta metodologiacutea de esta forma se
obtuvo un aporte a la reactividad de la cumarina 1
Resultados y discusioacuten
81
Los resultados obtenidos en este ensayo dan cuenta de la actividad que presentaron los
compuestos tanto precursores como derivados frente a la especie radical ROObull Un
punto importante a considerar es que este experimento ndashindependientemente de ser un
ensayo in vitro- se lleva a cabo en un medio buffer a pH 74 y a una temperatura
controlada de 37 degC lo que permite obtener una primera aproximacioacuten con respecto a
lo que seraacute la actividad de los compuestos en un medio bioloacutegico La sustitucioacuten en el
anillo cumariacutenico generoacute nuevos compuestos que superaron su capacidad antioxidante
sin embargo desde el punto de vista de los precursores aacutecidos (cafeico y gaacutelico) su
actividad se vio mermada tras la sustitucioacuten fenoacutemeno que se discute en la seccioacuten 6
La secuencia de actividad obtenida para los derivados y sus precursores fue 3 gt 2 gt 11
gt 9 gt 10 gt 1 gt 4
Junto con el ensayo anteriormente detallado se procedioacute a determinar la cantidad de
radicales que reaccionan con el compuesto antioxidante relacionando la concentracioacuten
de antioxidante aplicado la estequiometriacutea de la reaccioacuten y la velocidad de generacioacuten
de radicales peroxilo a 37 degC como se expresa en la siguiente ecuacioacuten (Burton y
colaboradores 1981)132
120591 = 119899 [119860119903119874119867]
119877119894 Ecuacioacuten 54
Resultados y discusioacuten
82
donde τ es el tiempo de induccioacuten (tiempo en el que la sonda es protegida de los
radicales peroxilo por el antioxidante) n es el valor asociado a la estequiometriacutea de la
reaccioacuten correspondiente a la cantidad de moleacuteculas de radical ROObull inactivadas por
moleacutecula de compuesto antioxidante [ArOH] es la concentracioacuten de antioxidante y Ri
es la velocidad de generacioacuten de radical peroxilo la cual estaacute directamente relacionada
con la concentracioacuten de ABAP utilizada en el ensayo (18 mM) y se determina seguacuten la
expresioacuten133
Ri = 136 bull 10-6
[ABAP] Ecuacioacuten 55
Dadas las condiciones experimentales empleadas el valor de Ri es 147 microMmin Los
resultados obtenidos del valor de la pendiente (regresioacuten lineal Ecuacioacuten 54) se
resumen en la Tabla 54
Todos los compuestos (precursores y derivados) presentan valores de n superiores a
los esperados donde en el caso extremo se tiene que una moleacutecula de aacutecido gaacutelico
estariacutea consumiendo 14 moleacuteculas de radical peroxilo resultado que es mucho mayor
al esperado Los aparentes altos valores de n como estequiometriacutea de la reaccioacuten
(n = 3 hasta n = 14) sugieren la presencia de reacciones asociadas de mayor
complejidad en las que estariacutea presente el radical alcoxilo (RObull)134
el cual se forma
por descomposicioacuten del radical peroxilo que posee una vida media del orden de los
segundos en comparacioacuten con el radical alcoxilo con una vida media del orden de los
10-6
s (y es maacutes reactivo) lo que explica esta diferencia en la estequiometria
Resultados y discusioacuten
83
Tabla 54 Valores calculados para el factor estequiomeacutetrico n
Compuesto na(plusmnSD) n
1 28 plusmn 03 3
2 39 plusmn 01 4
3 141 plusmn 14 14
4 24 plusmn 01 3
9 58 plusmn 04 6
10 49 plusmn 01 5
11 86 plusmn 01 9
a Valores calculados en triplicado
Este fenoacutemeno se ha encontrado en investigaciones previas realizadas en derivados
cumariacutenicos135
y fue descrito por Lissi y colaboradores el que se puede encontrar
ademaacutes en experimentos en los que se utiliza la sonda rojo de pirogalol (ORAC-
PGR)136137
Resultados y discusioacuten
84
542 Metodologiacutea de capacidad reductora de hierro en plasma (FRAP)
Esta metodologiacutea desarrollada por Benzie y Strain (1996)138
se propuso como una
medida de la capacidad reductora (asociada a una buena capacidad antioxidante)
enfocada a investigar procesos de estreacutes oxidativo en fluidos bioloacutegicos
Posteriormente se ha extendido al estudio de diversas matrices como extractos de
plantas medicinales139
alimentos140
compuestos puros141
por mencionar algunos
ejemplos
En este ensayo se obtuvieron los valores de la capacidad reductora de los compuestos
polifenoacutelicos la que se aprecia cualitativamente a traveacutes de la formacioacuten del complejo
de Fe2+
de color azul (Figura 514) Esta metodologiacutea involucra la reaccioacuten redox
entre el agente reductor (en este caso los derivados cumariacutenicos) y el oxidante (la sal
feacuterrica) es considerada como aproximacioacuten con respecto a la capacidad de mantener el
estatus redox dentro de la ceacutelula
En primer lugar se observoacute un comportamiento semejante al ensayo ORAC-FL en
cuanto a la tendencia que presentaron los compuestos en su capacidad reductora de
hierro lo que indica una baja probabilidad de que en este ensayo ocurriese el
fenoacutemeno de quelacioacuten propio de los catecoles La Tabla 55 presenta los datos
experimentales obtenidos
Resultados y discusioacuten
85
NN
NN
Fe 3+N
N
N
N
N
N
NN
NN
NN
Fe2+N
N
N
N
N
N
NN
Antioxidante
amarilloazul
[Fe(III) (TPTZ)2]3+ [Fe(III) (TPTZ)2]2+
Figura 514 Esquema para la reaccioacuten entre el complejo de Fe3+
y el compuesto
antioxidante reductor
Los compuestos 9 10 y 11 presentaron una mejor capacidad reductora frente a su
precursor cumariacutenico 1 Esto se explica debido a la presencia de un mayor nuacutemero de
grupos -OH presentes en las nuevas estructuras propuestas capaces de transferir
electrones y reducir la sal feacuterrica como se menciona en el trabajo de Pulido y
colaboradores142
quienes estudian una serie de polifenoles mediante esta teacutecnica
sentildealando que ademaacutes del nuacutemero de hidroxilos presentes la presencia de dobles
enlaces conjugados en el esqueleto como parte de las caracteriacutesticas estructurales
responsables de un aumento en la capacidad reductora en polifenoles
Resultados y discusioacuten
86
Tabla 55 Valores experimentales obtenidos para los compuestos en estudio ensayo
FRAP en equivalentes de Trolox10 microM de muestra
En el derivado 11 se presenta una interaccioacuten de tipo sineacutergica con respecto a los
resultados individuales de cada precursor habieacutendose obtenido un valor FRAP de
1302 y 868 equiv Trolox 10 microM de muestra para 1 y 4 respectivamente y para el
derivado final un valor de 2624 equiv Trolox 10 microM de muestra
Del mismo modo que en el ensayo anterior se observa que la sustitucioacuten en el anillo
cumariacutenico con los distintos grupos aacutecidos incrementa su potencial como especie
reductora mientras que en el caso del aacutecido cafeico y gaacutelico se aprecia una
disminucioacuten de 13 y 15 veces respectivamente en su capacidad reductora tras la
esterificacioacuten
Compuesto equiv Trolox 10 microM muestra
(plusmnSD)
1 1302 plusmn 197
2 2727 plusmn 321
3 4768 plusmn 215
4 868 plusmn 93
9 2052 plusmn 186
10 3182 plusmn 681
11 2624 plusmn 335
Resultados y discusioacuten
87
Los resultados obtenidos para esta teacutecnica entregan informacioacuten acerca de la capacidad
reductora relativa para el conjunto de compuestos ensayados capacidad que estaacute
relacionada con su actividad antioxidante Se obtuvo un orden relativo para
precursores y derivados como sigue 3 gt 10 gt 2 gt 11 gt 9 gt 1 gt 4 Con respecto a la
disminucioacuten de actividad para los aacutecidos mencionados sugiere que esta capacidad
ademaacutes del nuacutemero de ndashOH presentes estariacutea relacionada con el sustituyente ndashCOOH
que se transforma en un grupo eacutester (ver seccioacuten 6)
543 Capacidad de inactivacioacuten del radical OHmiddot teacutecnica Spin Trapping
Esta teacutecnica no destructiva permite la deteccioacuten e identificacioacuten de especies
paramagneacuteticas (con electrones desapareados) en distintas matrices El fenoacutemeno de
resonancia de espiacuten electroacutenico fue descubierto y descrito en la deacutecada de 1940 por
Zavoisky143
en sus estudios basados en sales de manganeso en distintos medios Su uso
y aplicaciones se han diversificado a numerosas aacutereas como en la determinacioacuten de
capacidad antioxidante en alimentos144
en el anaacutelisis del proceso oxidativo en
liacutepidos145
en el estudio de enfermedades parasitarias146
El creciente intereacutes de la
teacutecnica en ciencias biomeacutedicas radica en el hecho de que esta espectroscopia permite
discriminar diferentes especies radicales de intereacutes bioloacutegico estrechamente
relacionadas con el estatus redox de la ceacutelula147
cuyo desbalance se traduce en cuadros
de estreacutes oxidativo148
Resultados y discusioacuten
88
En este estudio se determinoacute la capacidad de los compuestos propuestos para inactivar
la especie radicalaria OHmiddot
mediante la teacutecnica spin trapping metodologiacutea basada en
establecer la competencia de reaccioacuten entre los antioxidantes propuestos y el spin trap
DMPO El radical se generoacute a traveacutes de la reaccioacuten de ldquoFenton no cataliacuteticordquo
(Ecuacioacuten 56) metodologiacutea que permite la generacioacuten del radical OHbull en medio
baacutesico en ausencia del ioacuten Fe como catalizador91ab
211986721198742 + 119874119867minus rarr 119874119867∙ + 1198742minus + 21198672119874 Ecuacioacuten 56
En un primer set de experimentos se procedioacute a realizar la experiencia utilizando
DMSO como solvente Se descartoacute esta opcioacuten debido a que resultoacute complejo
observar un patroacuten claro en el blanco y poder asiacute discriminar las nuevas sentildeales
espectrales a partir de la adicioacuten de los compuestos en estudio
En primer lugar se determinoacute el blanco experimental que indica la reaccioacuten de
inactivacioacuten del radical mediante el compuesto spin trap DMPO Posteriormente se
ensayaron los derivados hiacutebridos y sus precursores sinteacuteticos en dos concentraciones
033 mM y 33 mM En el caso de los experimentos realizados a la menor
concentracioacuten se aprecioacute que la disminucioacuten de la sentildeal del blanco fue miacutenima para los
siete compuestos y no se observoacute un cambio significativo en el espectro como para
obtener resultados concluyentes Considerando lo anterior los experimentos se
Resultados y discusioacuten
89
realizaron con concentracioacuten del orden de los 3 mM obtenieacutendose asiacute datos
satisfactorios en cuanto a la inactivacioacuten del radical y la posibilidad de realizar
caacutelculos sobre este valor El valor de inactivacioacuten del radical hidroxilo se calcula a
traveacutes de la disminucioacuten en la intensidad de las sentildeales al adicionar cada derivado En
cada espectro se aprecia el perfil hiperfino compuesto por cuatro liacuteneas caracteriacutesticas
correspondientes al aacutetomo de nitroacutegeno e hidroacutegeno del spin-aducto formado por
[DMPO-OH] con valores de aN y aH alrededor de 15G lo que concuerda con lo
descrito en la literatura149
para esta reaccioacuten y el espectro simulado que se presenta en
la Figura 515 El cambio experimental tras la adicioacuten de los compuestos se presenta
en color rojo (Figura 516 A-G)
N+
O-
+ OHN
O
OH
Figura 515 Espin aducto generado por la inactivacioacuten del radical OHbull y su espectro
simulado (derecha)
Resultados y discusioacuten
90
Figura 516 A Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto 4-clorometil-78-dihidroxicumarina 1 B Espectro REE de inactivacioacuten del
radical hidroxilo con adicioacuten del compuesto aacutecido cafeico 2
Figura 516 C Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto aacutecido gaacutelico 3 D Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con
adicioacuten del compuesto aacutecido 34-dihidroxi benzoico 4
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
B
Campo Magneacutetico G
compuesto 2
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
C
Campo Magneacutetico G
compuesto 3
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
D
Campo Magneacutetico G
compuesto 4
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
A
Campo Magneacutetico G
compuesto 1
control
Resultados y discusioacuten
91
Figura 516 E Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto hiacutebrido 9 F Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con
adicioacuten del compuesto hiacutebrido 10
Figura 516 G Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto hiacutebrido 11
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
G
Campo Magneacutetico G
compuesto 11
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
E
Campo Mgneacutetico G
compuesto 9
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
F
Campo Magneacutetico G
compuesto 10
control
Resultados y discusioacuten
92
Considerando los patrones espectrales obtenidos para los compuestos 9 10 y 11 se
observoacute que la sentildeal de cuadruplete correspondiente al control (spin-aducto [DMPO-
OH]) desaparecioacute casi por completo lo cual indica la inactivacioacuten del radical
hidroxilo Se observa ademaacutes un triplete con constantes de acoplamiento 1398 G y
1427 G que evidencioacute la reaccioacuten de oxidacioacuten del atrapador DMPO (Figura 517)
ya que de haberse formado el aducto entre la cumarina y el spin trap DMPO se
habriacutea obtenido el correspondiente espectro con un patroacuten de 6 liacuteneas espectrales
(Figura 518)
Figura 517 Espectro REE se destaca en rojo el triplete de integracioacuten 121
formado despueacutes de la reaccioacuten de Fenton no-cataliacutetico (izq) Espectro simulado
utilizando el programa EPR-WINSIM (der)
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
DMPO oxidado
N+
O-
+ OHNO
OH
Campo Magneacutetico G
Resultados y discusioacuten
93
cumarina + OHbull cumarinabull + H2O
cumarinabull + DMPO [cumarina-DMPO]
Figura 518 Espectro simulado para la formacioacuten del spin aducto [cumarina-
DMPO] utilizando el programa EPR-WINSIM
Como se presenta en la Tabla 56 tanto los aacutecidos orgaacutenicos como la cumarina
precursora y sus derivados presentaron reactividad muy semejante En las
condiciones de estudio para todos los compuestos se obtuvo un valor sobre el 90
indicando su poder de inactivacioacuten del radical resultado que superoacute al descrito en la
literatura para el estaacutendar Trolox
Estudios previos realizados en estructuras cumariacutenicas simples semejantes al
precursor 1 de esta investigacioacuten permiten comparar algunos resultados Peacuterez-Cruz y
colaboradores150
indican un 29 de inactivacioacuten para el derivado monohidroxilado de
la cumarina 1 diferencia que puede explicarse por la ausencia del ndashOH en posicioacuten 8
que aumenta su actividad El compuesto con grupos ndashOH en posicioacuten 6 y 7 presentoacute
un apagamiento del 51 Figueroa y colaboradores presentan tambieacuten un estudio en
que las cumarinas monohidroxiladas presentan valores de 23 y 56 de la
inactivacioacuten del radical OH corroborando lo encontrado anteriormente151
Resultados y discusioacuten
94
Tabla 56 Porcentajes de inactivacioacuten del radical hidroxilo (OHmiddot)
Compuesto de inactivacioacuten bullOH
(plusmnSD)
1 923 plusmn 74
2 983 plusmn 27
3 995 plusmn 08
4 927 plusmn 29
9 981 plusmn 18
10 982 plusmn 25
11 980 plusmn 99
Trolox 31plusmn 25a
aRef149 Figueroa R et al Future Med Chem 2013
Los resultados obtenidos con esta teacutecnica indican la reactividad relativa que tienen los
compuestos propuestos frente al radical OH Al considerar que el tiempo de vida del
radical hidroxilo y del spin trap DMPO es del orden de 10-9
s se observa que todos los
compuestos ensayados tuvieron la capacidad de competir con el DMPO en el proceso
de inactivacioacuten del radical evidenciado por la sentildeal de control que disminuyoacute casi en
su totalidad para todos los casos siendo menor en la cumarina precursora 1 y el aacutecido
4 siguiendo ambos compuestos la misma tendencia que se observara en los ensayos
Resultados y discusioacuten
95
anteriores Independientemente que el radical ensayado en este experimento es de una
alta reactividad y escasa selectividad el hecho de que se obtuvieran altos valores de
actividad para los compuestos propuestos indica que eacutestos se presentan como buenos
candidatos como inactivadores de la especie OH
Finalmente se observa que los derivados 9 10 y 11 presentaron un valor de
reactividad superior al de la cumarina precursora obtenieacutendose de esta forma un
aporte a la reactividad en cada nueva estructura propuesta frente al heterociclo de
partida 1 para este ensayo En cuanto a la reactividad relativa de la serie no se
encontroacute una diferencia significativa entre los compuestos ensayados precursores y
derivados mostraron valores cercanos en cuanto al de inactivacioacuten del radical
alrededor del 90
Resultados y discusioacuten
96
544 Estudio de reactividad frente al anioacuten radical superoacutexido O2-
Dentro de las diversas aplicaciones desarrolladas para las teacutecnicas electroquiacutemicas se
encuentran los ensayos de determinacioacuten de la capacidad antioxidante en distintos
medios152
y en muestras como bebidas153
vegetales154
mediciones in situ sobre piel
humana155
por mencionar algunos ejemplos Un reciente review (Pisoschi y
colaboradores 2015) describe las contribuciones realizadas con respecto a la
determinacioacuten de actividad antioxidante empleando exitosamente la voltametriacutea
ciacuteclica voltametriacutea de pulso diferencial voltametriacutea de onda cuadrada amperometriacutea
y potenciometriacutea156
las que ademaacutes se complementan con otras teacutecnicas en este tipo
de estudios157158
En esta parte de la investigacioacuten se determinoacute la reactividad de los compuestos frente
al anioacuten radical superoacutexido cuya generacioacuten electroquiacutemica en la superficie del
electrodo por reduccioacuten de oxiacutegeno disuelto mediante la teacutecnica de voltametriacutea ciacuteclica
ha sido ampliamente estudiada en nuestro grupo de trabajo159160110
y por otros
autores161
Como se esperaba tras la adicioacuten sucesiva de aliacutecuotas de todos los compuestos
estudiados hubo un decaimiento en la corriente de pico anoacutedica (Ipa0) (ejemplo del
resultado para el precursor 1 en la Figura 519) Esto permitioacute calcular el valor del
iacutendice antioxidante 50 (IA50) el cual se define como la concentracioacuten de sustrato
necesaria para obtener una disminucioacuten del 50 en la corriente Ipa0 Esta corriente es
Resultados y discusioacuten
97
directamente proporcional a la concentracioacuten de anioacuten superoacutexido presente por lo
que su disminucioacuten es un indicador de la capacidad del sustrato para inactivar la
especie radical generada in situ
Figura 519 Voltamogramas ciacuteclicos del par redox correspondiente al anioacuten
superoacutexido tras antildeadir aliacutecuotas del compuesto 1 DMF + HFFTBA 02 M 01 Vs
Tras obtener los voltamogramas ciacuteclicos para cada compuesto se procedioacute a
determinar el paraacutemetro adimensional (Ipa0-Ipa
SIpa
0) y se graficoacute con respecto a la
concentracioacuten de sustrato en solucioacuten (Figura 520) obtenieacutendose relaciones de tipo
lineal en que los valores del coeficiente de correlacioacuten r estuvieron entre 099777 y
097267
-10 -08 -06 -04 -02
Ipa0
10A
blanco
0049 mM
0099 mM
0149 mM
0199 mM
0249 mM
0299 mM
E vs Ag|AgCl V
Resultados y discusioacuten
98
007 014 021 02800
03
06
09
r = 099074
IA 50
(Ip
a0-
Ipa
S)
Ip
a0
Concentracioacuten mM
Figura 520 Graacutefica del paraacutemetro adimensional (Ipa0-Ipa
SIpa
0) vs concentracioacuten de
sustrato para el compuesto 1 (Destacado en verde el valor de IA50)
Junto con el valor de concentracioacuten IA50 la pendiente de las rectas entrega tambieacuten
informacioacuten con respecto a la reactividad de los compuestos frente al anioacuten
superoacutexido donde un mayor valor de la pendiente indica que el compuesto posee una
mayor actividad no obstante los autores que desarrollaron el meacutetodo hacen notar que
se utiliza preferentemente el iacutendice IA50 como valor para caracterizar de manera
adecuada la actividad de los compuestos propuestos frente el radical de forma
anaacuteloga al concepto de IC50 (concentracioacuten inhibitoria aplicada en sistemas
bioloacutegicos en relacioacuten a la cantidad de compuesto necesario para inhibir en un 50 el
crecimiento de una poblacioacuten de microorganismos)
Como se observa en los resultados (Tabla 57) la cumarina de partida 1 presenta un
valor mayor de IA50 (0187 mM) en comparacioacuten con los compuestos hiacutebridos 9 10 y
Resultados y discusioacuten
99
11 por lo que la adicioacuten de los fenoles a la estructura cumariacutenica fue un aporte a su
reactividad frente a la especie radical O2-
Tabla 57Valores de IA50 obtenidos para los compuestos estudiados
a Valor de estaacutendar Tolox ref 92
El derivado de aacutecido gaacutelico 10 presentoacute el menor valor de iacutendice antioxidante y por
consiguiente fue el mejor inactivador del anioacuten superoacutexido formado en la superficie
del electrodo puesto que se necesita una menor concentracioacuten de este derivado
(0064 mM) para apagar el 50 radical Junto con esto fue el compuesto que presentoacute
el fenoacutemeno de sinergia dentro de la serie con un valor de concentracioacuten menor
Compuesto IA 50 mM
(plusmnSD)
1 0183 plusmn 0007
2 0125 plusmn 0006
3 0104 plusmn 0004
4 0115 plusmn 0005
9 0141 plusmn 0011
10 0064 plusmn 0004
11 0137 plusmn 0002
Troloxa
197
Resultados y discusioacuten
100
requerida para inactivar el radical con respecto a cada uno de sus precursores (1 y 3)
El segundo mejor inactivador de O2-
fue el compuesto 11 con un valor de IA50 de
0137 mM y finalmente se tiene al derivado 9 con 0141 mM Este comportamiento
puede deberse a fenoacutemenos de difusioacuten de las moleacuteculas en el medio junto con su
reactividad en la superficie del electrodo
En este ensayo frente al radical O2-
al igual que el anterior (inactivacioacuten de la especie
OHbull) se pudo obtener informacioacuten con respecto al comportamiento de los
compuestos en un medio aproacutetico resultados que son de intereacutes ya que se pueden
considerar como una aproximacioacuten quiacutemica de tipo in vitro de los conocidos
fenoacutemenos de estreacutes oxidativo que ocurren en estructuras como las bio-membranas
donde participan especies reactivas oxigenadas161162
Finalmente se puede establecer un orden estimativo para la actividad de los derivados
y la cumarina 10 gt 3 gt 4 gt 2 gt 11 gt 9 gt 1 Todos los compuestos ensayados tuvieron
una reactividad superior al estaacutendar Trolox
Resultados y discusioacuten
101
545 Determinacioacuten de capacidad antioxidante celular (CAC)
Con el objeto de abordar los fenoacutemenos que involucran especies radicalarias
presentes en sistemas vivos se procede a realizar el estudio de la capacidad
antioxidante de los compuestos en un modelo bioloacutegico simple En este experimento
se utiliza la sonda DCFH-DA la cual difunde pasivamente a traveacutes de la membrana
celular al ingresar al citosol se transforma en el compuesto DCFH (no fluorescente)
que emite al entrar en contacto con especies oxidantes del tipo EROs y ERNs En los
experimentos realizados las ceacutelulas fueron estresadas mediante el compuesto ABAP
(generador de radical peroxilo) y se observoacute coacutemo los nuevos derivados en estudio
podiacutean contrarrestar este evento oxidativo al interior de la ceacutelula Los resultados
obtenidos se resumen en la Tabla 58
Los valores experimentales obtenidos en esta etapa indicaron una bio-disponibilidad
baja con una CAC menor al 50 para los nuevos compuestos 9 10 y 11 ademaacutes en
todos los casos se encontroacute un porcentaje menor de CAC de los derivados respecto a
los precursores respectivos 1 2 3 y 4 Para una concentracioacuten de 10 microM de
compuesto se obtuvieron valores muy semejantes (alrededor del 70) para los
precursores ensayados
Resultados y discusioacuten
102
Tabla 58 Valores obtenidos para la capacidad antioxidante celular (CAC)
concentraciones 1 microM y 10 microM de cada compuesto
Compuesto CAC 1 microM CAC 10 microM
1 696plusmn 50 727plusmn 13
2 730plusmn 26 739plusmn 07
3 662plusmn 19 701plusmn 01
4 477plusmn 25 665plusmn 26
9 381plusmn 55 499plusmn 66
10 178plusmn 45 395plusmn 128
11 345plusmn 31 234plusmn 108
En los resultados anteriores llaman la atencioacuten los bajos valores obtenidos en el
ensayo de CAC para los derivados polifenoacutelicos en comparacioacuten con los ensayos
realizados en sistemas no bioloacutegicos en que se obtuvieron buenos resultados en ellos
se pudo apreciar el fenoacutemeno de sinergia (en algunos casos) y un incremento en la
actividad de todos los derivados frente a la cumarina precursora de forma individual
Para explicar este comportamiento y complementar estos resultados se procedioacute a
seleccionar de manera racional los tres derivados obtenidos 9 10 y 11 y se determinoacute
su Hidrofobicidad Relativa en conjunto con el precursor cumariacutenico 1 (el cual
presentoacute valores de CAC alrededor del 70 cercano a lo obtenido en los precursores
Resultados y discusioacuten
103
aacutecidos) ensayo que entrega informacioacuten con respecto a la lipofilia relativa de la serie
(en funcioacuten de tiempos de retencioacuten) pudiendo dar respuesta al fenoacutemeno observado
555 Estudio de hidrofobicidad relativa
En el estudio de nuevos compuestos disentildeados como potenciales faacutermacos una de las
propiedades fisicoquiacutemicas de intereacutes es la lipofilia valor que puede determinarse
mediante distintos meacutetodos electroforesis capilar cromatografiacutea liacutequida de alta
resolucioacuten (HPLC) y determinando el coeficiente de particioacuten aguaoctanol entre
otras Junto con la metodologiacutea empiacuterica se han desarrollado diversas herramientas
computacionales con softwares que permiten calcular el valor para logP y logD
obtenieacutendose buenas correlaciones entre compuestos de una familia de estructuras
semejantes en los que se realizan variaciones a su esqueleto Los valores asiacute
calculados y entregados por el programa se consideran de una confiabilidad
razonable163
En el caso de este estudio se determinoacute la lipofilia relativa para los derivados 9 10 y
11 junto con el precursor 1 mediante HPLC en fase reversa donde se espera obtener
una serie relativa de tiempos de retencioacuten entre los compuestos que deacute cuenta de su
lipofilia Se utilizoacute esta teacutecnica por tratarse de una medicioacuten simple raacutepida y
ampliamente descrita en la literatura para nuevos compuestos en que la fase
estacionaria de la columna C18 simula la fase no polar y la fase moacutevil es la fase
Resultados y discusioacuten
104
acuosa asiacute a traveacutes de la columna se llevan a cabo muacuteltiples equilibrios de particioacuten
entre la fase acuosa y orgaacutenica En la medida en que el compuesto analizado sea maacutes
afiacuten a la fase estacionaria (relacionado con un mayor tiempo de retencioacuten) eacuteste seraacute
maacutes lipofiacutelico y viceversa Los resultados (Tabla 59) muestran que de acuerdo a los
tiempos de retencioacuten obtenidos (5138 5760 4031 y 4695 minutos) el orden
relativo de lipofilia fue el siguiente
Tabla 59 Valores obtenidos para el tiempo de retencioacuten experimental de los
compuestos
Compuesto Tiempo de retencioacuten
(min)
1 5138
9 5760
10 4031
11 4695
La Figura 521 indica el orden de lipofilia relativa encontrada para los derivados y su
precursor cumariacutenico En forma general se observaron valores de tiempo de
retencioacuten cercanos Se aprecioacute que el derivado de aacutecido cafeico 9 fue el compuesto
que encabezoacute la serie lo que se puede explicar debido a la presencia de un doble
enlace en su estructura confirieacutendole mayor apolaridad (por tanto hidrofobicidad) a
Resultados y discusioacuten
105
O
OH
HO O
Cl
O
OH
OH O
OH
OH
O
O
OHO O
O
O
OH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
la moleacutecula El segundo en la serie fue el compuesto clorado 1 en el cual el
sustituyente haloacutegeno es un aporte a la lipofilia del compuesto En el caso de las
estructuras 10 y 11 se encontroacute que el derivado de aacutecido gaacutelico presentoacute el menor
valor relativo debido a la presencia de un grupo ndashOH adicional en el anillo aromaacutetico
que como se esperaba tuvo la mayor tendencia hidrofiacutelica
9 1 11 10
Figura 521 Hidrofobicidad relativa de los derivados y la cumarina precursora
Para complementar este resultado experimental se realizoacute el caacutelculo teoacuterico para el
valor de logD mediante herramienta Marvin Sketch del software libre ChemAxon164
y
se establecioacute su correlacioacuten con el valor experimental obtenido para CAC en
concentracioacuten 10 microM El resultado de esta correlacioacuten se presenta en la Figura 522
Aumento de la lipofilia = aumento en el tiempo de retencioacuten
Resultados y discusioacuten
106
Figura 522 Correlacioacuten entre el valor de logD teoacuterico y CAC experimental a
10 microM de cada compuesto El valor logD se obtuvo a traveacutes de la herramienta Marvin
Sketch del software ChemAxon164
Considerando estos resultados para este modelo experimental propuesto en el ensayo
de CAC se observa que la lipofilia no seriacutea el uacutenico factor relacionado con los bajos
valores de capacidad antioxidante celular (CAC) obtenidos para los compuestos 9 10
y 11 ya que por ejemplo la cumarina 1 presentoacute valores de CAC sobre el 70 y fue
el segundo compuesto de la serie de hidrofobicidad relativa experimental con un
valor cercano de tiempo de retencioacuten al derivado 9 (el cual tuvo valores de CAC bajo
el 50) De igual forma se aprecia la misma tendencia al correlacionar el valor de
CAC con el logD teoacuterico donde el compuesto 1 independientemente de tener una
lipofilia semejante a los derivados polifenoacutelicos (al igual que en la serie de tiempos
de retencioacuten) siacute mostroacute una biodisponibilidad superior a los derivados y muy
-3 -2 -1 0 1 2 3 4
20
40
60
80
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OOH
HO O
Cl
OHO O
O
OOH
OH
OH
OOH
OH O
OH
OH
O
O
logDteor
C
AC
(1
0
32
4
Resultados y discusioacuten
107
semejante a los aacutecidos benzoicos (2 3 y 4) los cuales muestran valores negativos de
logD debido a su menor lipofilia
Por tratarse de un sistema bioloacutegico (ceacutelulas epiteliales) con muacuteltiples variables que
afectan la actividad de los compuestos estudiados se pueden considerar diversos
factores presentes en el medio ensayado que pueden dar respuesta al fenoacutemeno
observado Uno de ellos es la estructura de la membrana celular que contiene diversas
estructuras como por ejemplo el citocromo P (CYP) que es un complejo enzimaacutetico
involucrado en el metabolismo de faacutermacos siacutentesis de biomoleacuteculas y diversas
biotransformaciones de moleacuteculas a nivel celular165
Otro factor presente es la
existencia de enzimas hidroliacuteticas en el citosol celular como es el caso especiacutefico de
las carboxilesterasas (presentes en ceacutelulas epiteliales de intestino hiCE y otros
oacuterganos) las cuales son capaces de escindir diversos grupos funcionales tales como
amidas eacutesteres carbamatos y convertirlos en sus respectivos precursores (alcohol y
aacutecido) 166
Considerando que para este experimento en un modelo bioloacutegico in vitro simple se
emplearon ceacutelulas epiteliales de intestino (EAhy 926 (ATCC CRL-2922)) es posible
que el comportamiento observado se deba a la existencia de diversos fenoacutemenos e
interacciones posibles de los compuestos tanto a nivel de membrana como de
citoplasma Cabe destacar que al comparar las experiencias realizadas en un medio no
bioloacutegico los resultados en este caso se invierten al emplear una metodologiacutea que
involucra un medio bioloacutegico No necesariamente se encuentra un comportamiento
Resultados y discusioacuten
108
anaacutelogo en ambos medios de ensayo debido a la mayor complejidad y variables
asociadas a un sistema que involucra estructuras vivas independientemente de la
simplicidad o lo acotado del mismo
556 Estudios Teoacutericos optimizacioacuten de estructuras y determinacioacuten del Iacutendice
de Fukui
Con el objeto de racionalizar el estudio realizado y poder discriminar entre los
distintos sitios reactivos de los derivados se determinoacute el iacutendice de Fukui fk0
relacionado con un ataque de tipo radicalario Baacutesicamente es el promedio
correspondiente a las reacciones de ataque nucleofiacutelico fk- y electrofiacutelico fk
+(Ecuacioacuten
57) como se describe en el trabajo de Aliaga y Lissi donde se aborda el estudio
teoacuterico y experimental que compara la actividad anti-radicalaria de los polifenoles
rutina y quercetina167
1198911198960 =
119891119896minus+ 119891119896
+
2 Ecuacioacuten 57
Este iacutendice es un descriptor de reactividad local en los aacutetomos de oxiacutegeno que
participan en las reacciones de los grupos catecol presentes Este tipo de anaacutelisis
resulta adecuado para determinar los sitios de reaccioacuten preferentes en moleacuteculas
complejas con diversos centros reactivos168
Los resultados obtenidos indican que en
Resultados y discusioacuten
109
la cumarina precursora 1 el ataque radicalario ocurriraacute primero en el oxiacutegeno en
posicioacuten 7 debido al mayor valor de fk0
(0071) por otra parte no se observaron
cambios significativos en los valores de fk0 al formar parte de los derivados 10 y 11
para los aacutetomos de oxiacutegeno en posicioacuten 7 y 8 (aquellos involucrados en la capacidad
antioxidante de la moleacutecula) Al formar parte del derivado 9 si se observa una
disminucioacuten en su reactividad (fk0
O7 = 00078 y fk0
O8 = 00021) haciendo menos
probables estos dos sitios a un ataque radicalario en la moleacutecula (Tabla 510)
Los valores obtenidos para el iacutendice de Fukui indican que en el derivado 9 el sitio
maacutes probable para un ataque radicalario seraacute el catecol presente en el anillo benceacutenico
(proveniente del aacutecido cafeico) de preferencia en el oxiacutegeno en posicioacuten 4
(fk0
O4 = 00489) A diferencia del derivado de aacutecido cafeico en el caso de los
compuestos 10 y 11 el sitio preferente de reaccioacuten seraacute el anillo cumariacutenico
conservaacutendose el oxiacutegeno en posicioacuten 7 del heterociclo como sitio maacutes reactivo En
las Figuras 523 a 526 se presentan las estructuras optimizadas en 3D para el
precursor 1 y sus derivados polifenoacutelicos 9 10 y 11
Resultados y discusioacuten
110
Tabla 510 Valores de Iacutendice de Fukui fk para los compuestos en estudio
Compuesto Iacutendice de Fukui
fk0
Iacutendice de Fukui
fk-
O7 00771
O7 01373
O8 00391
O8 00757
O7 00078 O7 00072
O8 00021 O8 00036
O3 00389 O3 00779
O4 00489 O4 00890
O7 00719 O7 01276
O8 00365 O8 00716
O3 00025 O3 00050
O4 00025 O4 00049
O5 00002 O5 00004
O7 00739 O7 01316
O8 00378 O8 00742
O3 00004 O3 00008
O4 00003 O4 00005
OHO O
O
OOH
OH
OH
7
8
3
4
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
7
8
3
4
5
OOH
HO O
OH
OH
O
O
7
8
3
4
O
OH
HO O
Cl
7
8
Resultados y discusioacuten
111
OOH
OHO
Cl
Figura 523 Estructura optimizada en 3D para el precursor 1 utilizando DFT
OOH
OH O
OH
OH
O
O
Figura 524 Estructura optimizada en 3D para el derivado 9 utilizando DFT
Resultados y discusioacuten
112
Figura 525 Estructura optimizada en 3D para el derivado 10 utilizando DFT
OHO O
O
OOH
OH
OH
Figura 526 Estructura optimizada en 3D para el derivado 11 utilizando DFT
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
Resultados y discusioacuten
113
6 Discusioacuten General
Respecto del posible mecanismo de reaccioacuten electro-oxidativo se consideran las
siguientes evidencias teoacutericas y experimentales
En primer lugar como se esperaba los experimentos electroquiacutemicos de electro-
oxidacioacuten de los compuestos mostraron las sentildeales correspondientes a los grupos
ndashOH presentes en todas las estructuras Junto con esto los resultados de la graacutefica
Ipa vs vfrac12
indican la existencia de un proceso di-electroacutenico en los precursores y los
derivados (para la primera sentildeal oxidativa) lo que implica que comparten el mismo
mecanismo
Posteriormente se comproboacute la existencia de la especie radicalaria detectada mediante
oxidacioacuten electroquiacutemica seguida por resonancia de espiacuten electroacutenico con los
respectivos resultados de las simulaciones espectrales realizadas
En un siguiente punto se determinaron los valores teoacutericos de reactividad local
encontrados mediante el caacutelculo del iacutendice de Fukui El valor de fkndash
permitioacute
identificar los lugares con mayor reactividad frente a un ataque electrofiacutelico por tanto
las zonas en la moleacutecula puntuales con un alto valor para este iacutendice tenderaacuten a ceder
electrones con mayor facilidad en un proceso oxidativo Las estructuras optimizadas
en 3D indican que las zonas en color celeste (Figuras 523-526) corresponden a
aquellas con mayor densidad electroacutenica y por tanto estaacuten maacutes propensas a ceder
Resultados y discusioacuten
114
electrones en un proceso oxidativo Las zonas color lila representan los sitios con
menor densidad electroacutenica Para el compuesto 1 los ndashOH en el heterociclo presentan
mayor densidad electroacutenica lo que se aprecia de igual forma en los derivados 10 y 11
mientras que la zona del anillo benceacutenico se presenta con una baja densidad
electroacutenica Un fenoacutemeno diferente se aprecia para el derivado 9 donde la mayor
densidad electroacutenica se aprecia en la estructura benceacutenica cuyos grupos ndashOH
presentan el mayor valor de fk-
Este resultado teoacuterico racional complementa lo observado en el experimento descrito
con REE y electro-oxidacioacuten conjunta ya que los valores para las constantes de
acoplamiento hiperfino obtenidas en cada caso tambieacuten sentildealaron en cuaacutel de los dos
catecoles presentes ocurre la formacioacuten de la especie radical y por ende doacutende se
inicia el proceso de oxidacioacuten resultados corroboradas con el estudio teoacuterico
realizado De esta forma para el derivado 9 el proceso oxidativo se inicia en los -OH
ubicados en posicioacuten 3 y 4 que presentaron valores de fkndash
00779 y 00890
respectivamente y cuyas constantes de acoplamiento hiperfino son coherentes con
una interaccioacuten que involucra tres protones aquellos ubicados en las posiciones 2 5 y
6 del anillo benceacutenico El mismo anaacutelisis realizado para las estructuras 10 y 11 indica
que el proceso oxidativo ocurre primero en el anillo de la cumarina en los -OH en
posicioacuten 7 y 8 con valores del descriptor de reactividad local fkndash de 01276 y 00716
respectivamente para el derivado de aacutecido gaacutelico y en el caso del derivado de aacutecido
protocateacutequico con fkndash 01316 y 00742 para los oxiacutegenos en posicioacuten 7 y 8 De igual
forma los valores para las constantes de acoplamiento fueron consistentes con esta
Resultados y discusioacuten
115
informacioacuten experimental evidenciando la interaccioacuten entre dos protones (aquellos en
posicioacuten 5 y 6 del heterociclo cumariacutenico)
Esta diferencia encontrada para el proceso electro-oxidativo entre los derivados se
puede explicar debido a la existencia de un doble enlace conjugado adicional presente
soacutelo en el compuesto 9 derivado del aacutecido cafeico (ausente en 10 y 11) el cual le
confiere mayor deslocalizacioacuten (estabilidad) al radical que se forma como
intermediario en el proceso oxidativo
Los estudios presentes en la literatura sobre la oxidacioacuten de estructuras polifenoacutelicas
en medio aproacutetico presentan evidencias tanto teoacutericas como empiacutericas que ampliacutean la
visioacuten sobre la complejidad y posibilidades mecaniacutesticas en la oxidacioacuten de
estructuras polifenoacutelicas Basadas en modelos de naturaleza bioloacutegica como el
Fotosistema II presente en estructuras vegetales y otros ejemplos se plantea que una
viacutea de oxidacioacuten factible es a traveacutes de un mecanismo de tipo concertado donde se
obtiene el radical fenoxil (ArObull) en un paso directo en que el protoacuten y el electroacuten se
transfieren de manera conjunta (Figura 61 destacado en rojo) planteamiento que
considera factores de tipo energeacutetico a diferencia de los estudios claacutesicos con respecto
a este proceso seguacuten el cual la electro-oxidacioacuten se inicia con la peacuterdida de 1ē (etapa
electroquiacutemica) para formar el catioacuten radical(ArObull+) seguido de la peacuterdida de un
H+(etapa quiacutemica) para formar el radical fenoxil (ArObull) (Figura 62)
En el caso de los compuestos estudiados en esta investigacioacuten los valores de la
pendiente de Tafel encontrados para los compuestos (sobre 88 mVdec) sugieren que
Resultados y discusioacuten
116
el mecanismo de electro-oxidativo que maacutes se ajusta a la evidencia experimental es
por etapas
OH
HO
OH
HO
O
HO
O-
HO
-e- + B
+e- + HB+
+ B-e-
+e-
+e-
-e-
+ HB+
+ B
+HB+
Figura 61 Esquema de reaccioacuten para un mecanismo concertado de electro-
oxidacioacuten fenoacutelica Adaptacioacuten referencia 120
OH
HO - e
+ e
OH
HO
-H+
O
HO
Figura 62 Esquema de reaccioacuten para estructuras fenoacutelicas mecanismo electro-
oxidativo en etapas
Resultados y discusioacuten
117
Con respecto a los ensayos de actividad antioxidante realizados la Tabla 61 permite
comparar y estimar en conjunto los resultados obtenidos a traveacutes de las diferentes
metodologiacuteas empleadas
En forma general los resultados indican que la sustitucioacuten propuesta en esta
investigacioacuten en la cumarina dihidroxilada (utilizada como esqueleto de partida) con
distintas estructuras polifenoacutelicas entregoacute resultados positivos en cuanto al aporte
que los nuevos derivados obtenidos presentaron frente a la inactivacioacuten de especies
radicalarias tales como O2- ROO˙ OH˙ y su capacidad reductora (reflejada en el
ensayo FRAP) Para los ensayos realizados en un modelo no bioloacutegico se obtuvieron
valores de actividad en los derivados que superaron a los obtenidos para el precursor
cumariacutenico de forma individual
Cabe mencionar que en los diferentes ensayos y sus resultados se mencionan los
conceptos de reactividad y actividad de los compuestos En el caso de los ensayos
ORAC-FL y FRAP se habla soacutelo de actividad antioxidante ya que con la informacioacuten
que entregan no se puede determinar cuaacutel de los distintos grupos ndashOH presente en la
moleacutecula es el que reacciona primero Diferente es lo que ocurre en el ensayo frente
al radical hidroxilo en que se establece una competencia entre el atrapador (DMPO) y
el compuesto por inactivar al OHbull debido a que ambos tienen una vida media corta
(10-9
s) por tanto la reaccioacuten entre el antioxidante y el radical es raacutepida y el ndashOH maacutes
reactivo de la moleacutecula es el que inactiva a la especie y se puede mencionar como
reactividad Lo mismo ocurre para el ensayo frente al anioacuten radical superoacutexido en que
tambieacuten se mencionan los resultados como reactividad frente al radical
Resultados y discusioacuten
118
Tabla 61 Cuadro comparativo de los resultados en la determinacioacuten de capacidad
antioxidante para la cumarina y sus derivados
Compuesto ORAC-FL
FRAP
eq Trolox
10 microM
inactivacioacuten
OHmiddot
CAC
1 microM 10 microM
O2-
IA 50 mM
1 091 plusmn 003 1302plusmn 160 923 plusmn 74 696 plusmn 50 727 plusmn 13 0183plusmn0007
2 347 plusmn 010 2727 plusmn 321 983 plusmn 27 730plusmn 26 739plusmn07 0125 plusmn 0006
3 391 plusmn 009 4768 plusmn 215 995 plusmn 08 662plusmn 19 701plusmn01 0104 plusmn 0004
4 069 plusmn 001 868 plusmn 93 927 plusmn 29 477plusmn 25 665plusmn26 0115 plusmn 0005
9 239plusmn0027 2052 plusmn151 981 plusmn 18 381plusmn55 499 plusmn 66 0141plusmn0011
10 174 plusmn 005 28046plusmn188 982 plusmn 25 178plusmn45 395 plusmn128 0064plusmn0004
11 262 plusmn 004 2624 plusmn 236 980 plusmn 99 345plusmn31 234 plusmn 108 0137plusmn0002
Por otra parte en los ensayos ORAC-FL y FRAP se observoacute que los valores de
actividad para los aacutecidos cafeico 2 y gaacutelico 3 fueron superiores a los obtenidos para
sus derivados hiacutebridos 9 y 10 respectivamente En el ensayo frente al anioacuten
superoacutexido se encontroacute que los aacutecidos cafeico 2 y protocateacutequico 4 presentaron
resultados superiores en cuanto a reactividad que sus respectivos derivados hiacutebridos 9
y 11
Resultados y discusioacuten
119
En la literatura se encuentra la caracterizacioacuten de los aacutecidos benzoicos y otros
antioxidantes polifenoacutelicos naturales como moleacuteculas altamente polares lo que en
algunos limita su uso en medios como bio-membranas emulsiones y micelas por lo
que la formacioacuten de sus derivados eacutesteres se utiliza como una estrategia para
aumentar su lipofilia y por lo tanto la biodisponibilidad de estos compuestos en
medios no acuosos169170
investigacioacuten que ha dado origen a la formulacioacuten de los
denominados ldquoantioxidantes lipofiacutelicosrdquo171172
los que han demostrado ser eficientes
como antioxidantes en bio-membranas resultados que se describen en el trabajo
realizado por Tai y colaboradores donde se ensayaron eacutesteres de aacutecido vainilliacutenico
que ademaacutes de presentar buenos valores de iacutendice ORAC-FL inhibieron el proceso
de hemoacutelisis en eritrocitos de mamiacutefero173
Junto con lo anterior estaacute descrita la relacioacuten existente entre la estructura de los
aacutecidos benzoicos y su actividad antioxidante la que es atribuida a diversas
caracteriacutesticas presentes en su esqueleto tales como i) nuacutemero y posicioacuten de grupos ndash
OH en la moleacutecula ii) sustituyentes alcoxilo en posicioacuten orto al ndashOH iii) presencia
de grupos -COOH -COOR -CH=CH-CH2-174
Al apreciar las estructuras de los
derivados propuestos se infiere que las diferencias encontradas en la actividad de los
aacutecidos antes y despueacutes de la unioacuten a la cumarina estaacuten relacionadas con dicha
sustitucioacuten En el caso del aacutecido gaacutelico que presenta un valor de ORAC de 391 frente
a un valor de 174 para su derivado 10 y en el ensayo FRAP se encontroacute un valor de
4768 vs un 3182 para el hiacutebrido se puede sentildealar que no se aprecioacute un aumento de
Resultados y discusioacuten
120
actividad antioxidante para los eacutesteres con respecto al aacutecido del que provienen seguacuten
con lo descrito por algunos autores175176
Junto con lo anterior se forma un eacutester de
aacutecido gaacutelico con un sustituyente voluminoso (la estructura cumariacutenica) pudiendo
disminuir la coplanaridad en el sistema aromaacuteticocarbonilo lo que implica una menor
estabilizacioacuten del radical formado en la reaccioacuten frente a la especie ROObull para el
ensayo ORAC-FL y la capacidad reductora en el ensayo FRAP Otro punto a
considerar es que para este derivado se observa el fenoacutemeno mencionado por Rice-
Evans175
y otros autores con respecto a que un nuacutemero mayor de grupos ndashOH en el
anillo benceacutenico no implica necesariamente un aumento en la actividad antioxidante
de un derivado polifenoacutelico
Para el caso observado en el aacutecido cafeico y su derivado 9 se aprecia el mismo
fenoacutemeno de disminucioacuten de actividad del aacutecido 2 frente al eacutester como lo descrito
para el aacutecido gaacutelico y su derivado en los ensayos ORAC-FL y FRAP con la
diferencia que esta disminucioacuten no es tan draacutestica lo que se atribuye a la presencia del
doble enlace en la estructura que confiere mayor estabilidad por resonancia al radical
formado
El valor de reactividad local del iacutendice de Fukui fk0
-relacionado con los fenoacutemenos
de ataque radicalario- entregoacute informacioacuten con respecto a los sitios de los derivados
donde la actividad anti-radicalaria es maacutes probable Asiacute para el compuesto 9 esta
actividad ocurre en el anillo benceacutenico en primer lugar y posteriormente en la
cumarina Para los derivados 10 y 11 la mayor probabilidad de que se produzca el
Resultados y discusioacuten
121
ataque radicalario es en el heterociclo cumariacutenico y posteriormente en el catecol del
anillo benceacutenico Estos resultados corroboran con los valores experimentales y las
simulaciones realizadas en espectroscopia de resonancia electroacutenica de espiacuten (REE)
donde la actividad antioxidante del compuesto 9 ocurre con mayor probabilidad en el
anillo benceacutenico proveniente de la fraccioacuten del aacutecido cafeico (donde se encuentra el
doble enlace que le confiere mayor estabilidad al radical formado como intermediario
de reaccioacuten) mientras que en los derivados 10 y 11 esta actividad ocurre en el
heterociclo cumariacutenico
Se observa que los resultados de capacidad antioxidante para los derivados
polifenoacutelicos variaron entre un meacutetodo y otro no hubo correlacioacuten entre los valores
obtenidos en la capacidad antioxidante obtenidos en las distintas metodologiacuteas Este
resultado concuerda con lo esperado ya que cada experiencia realizada implica una
especie radicalaria diferente y cada una de ellas posee reactividades distintas (t12 O2-
del orden de los ms t12 OHbull ~ 10-9
s t12 ROObull ~ 10 ms) Para cada ensayo se
obtuvo un distinto orden relativo de reactividad entre los derivados y sus precursores
Se establece la relacioacuten entre el potencial Eonset y los resultados obtenidos en el
ensayo de capacidad antioxidante frente a anioacuten superoacutexido realizado en medio
aproacutetico (Figura 63) Para el ensayo de reactividad frente a O2-
se puede establecer
una correlacioacuten donde una disminucioacuten en el potencial de oxidacioacuten disminuye el
valor de IA50 para 5 de los 7 compuestos estudiados Por tanto a medida que el
Resultados y discusioacuten
122
potencial se hace menos positivo aumenta la reactividad de los compuestos frente al
anioacuten superoacutexido presentaacutendose una relacioacuten entre actividad antioxidante y Eonset
para este ensayo
Figura 63 Correlacioacuten entre el potencial de oxidacioacuten Eonset y los ensayos frente a
anioacuten superoacutexido
Un menor potencial de oxidacioacuten para los grupos ndashOH presentes en los compuestos
implica una mayor facilidad para oxidarse (por ende una mayor densidad de carga
electroacutenica para ceder) y por tanto un incremento en la capacidad antioxidante para
este ensayo
Se puede observar que el compuesto 4 (aacutecido protocateacutequico) posee un valor de IA50
de 0115 mM el cual se encuentra entre los valores encontrados para el aacutecido cafeico
y el aacutecido gaacutelico pero su valor de Eonset es mayor diferenciaacutendose de la tendencia
049 056 063 070 077
006
009
012
015
018
11
3
1
42
9
10
Eonset
vs Ag|AgCl V
IA50
mM
Resultados y discusioacuten
123
encontrada Junto con lo anterior el compuesto 4 presentoacute el menor valor para la
pendiente de Tafel (b = 88 mVdec) de toda la serie lo que sugiere una relacioacuten entre
el mecanismo de oxidacioacuten y la capacidad de reaccionar frente a la especie
radicalaria El compuesto 10 presentoacute el mejor valor para IA50 y tambieacuten se diferencia
de la serie de compuestos con respecto al Eonset (cercano al del compuesto 4) a
diferencia del aacutecido su pendiente de Tafel (b = 134 mVdec) indica la presencia de
dimerizaciones posteriores a la formacioacuten del radical fenoxil (y generacioacuten de
compuestos nuevos que tambieacuten pueden reaccionar con el radical) sugiriendo que
ademaacutes del mecanismo de oxidacioacuten hay otros factores que pueden influir como por
ejemplo la difusioacuten de las especies en el medio empleado
El estudio de los compuestos frente al radical hidroxilo reflejoacute que en las condiciones
experimentales empleadas los resultados fueron semejantes por cuanto los valores de
inactivacioacuten del radical en todos los casos fue sobre el 90 Debido a lo anterior se
descarta realizar la correlacioacuten con el potencial Eonset ya que no encontroacute una
diferencia significativa entre los compuestos
Finalmente al considerar los resultados obtenidos para la capacidad antioxidante
celular en un modelo bioloacutegico simple un punto a tener en cuenta es el hecho de que
esta metodologiacutea en particular adolece en cuanto a que es inespeciacutefica con respecto a
la cantidad de compuesto que ingresa en la ceacutelula ya que por las distintas lipofilias
observadas los compuestos tendraacuten una diferente capacidad de ingreso al medio y no
se puede determinar la relacioacuten existente entre la cantidad que ingresa a la ceacutelula
Resultados y discusioacuten
124
versus la reactividad Debido a lo anteriormente descrito estos resultados muestran
principalmente un reflejo de la capacidad de penetracioacuten que tienen los compuestos
hacia el interior de la ceacutelula
Un modo de abordar temaacuteticas de tipo multi-variable-donde se deben considerar
numerosos factores involucrados en un comportamiento o fenoacutemeno- es el empleo de
modelos teoacuterico-computacionales como QSAR (por su sigla en ingleacutes Quantitative
Structure-Activity Relationships) herramienta que se utiliza en la estimacioacuten de
propiedades bioloacutegicas y fisicoquiacutemicas de intereacutes en diversas moleacuteculas entre ellas
polifenoles177
El factor esteacuterico tiene un papel importante en los estudios realizados en medios
celulares siendo el tamantildeo molecular uno de los factores considerados en ensayos de
permeabilidad en futuros faacutermacos ya que un excesivo tamantildeo (entre otras cosas)
dificulta la solubilidad en medio acuoso asiacute como tambieacuten la difusioacuten pasiva de las
moleacuteculas163
Al observar el peso molecular de los compuestos derivados (entre
34427 gmol y 37031 gmol) se puede considerar que el efecto esteacuterico en este caso
no seriacutea la causa principal para el fenoacutemeno observado en el ensayo celular ya que
estaacute descrito que los compuestos no deberiacutean superar un peso de 500 gmol 163
_que no es el caso de estos derivados-
Los resultados obtenidos para este ensayo realizado en un modelo bioloacutegico simple
sugieren que la actividad de los derivados para reaccionar frente a especies
radicalarias podriacutea estar circunscrita a medios lipofiacutelicos como las membranas
Resultados y discusioacuten
125
bioloacutegicas estudio que se podriacutea profundizar empleando un modelo como el
descrito173
para estudiar procesos oxidativos en membranas de eritrocito
Conclusiones
126
7 Conclusiones
La teacutecnica de electro-oxidacioacuten complementada con espectroscopia de
resonancia de espiacuten electroacutenico (REE) resulta uacutetil para identificar especies
radicalarias como intermediarios de la reaccioacuten en este trabajo
La determinacioacuten del iacutendice de Fukui (fk-) en conjunto con los resultados de
resonancia de espiacuten electroacutenico permitieron discriminar los sitios de las
moleacuteculas donde se inicia el proceso oxidativo En el derivado 9 la oxidacioacuten
ocurre primero en el anillo benceacutenico y en los compuestos 10 y 11 el proceso
oxidativo ocurre primero en el heterociclo cumariacutenico
La inclusioacuten de las estructuras polifenoacutelicas al heterociclo cumariacutenico generoacute
un incremento en su capacidad antioxidante en los ensayos no bioloacutegicos
No se obtuvo correlacioacuten para los resultados de capacidad antioxidante entre
las distintas metodologiacuteas empleadas
Se establecioacute la correlacioacuten entre el valor de potencial de inicio de la reaccioacuten
electroquiacutemica (onset) y los resultados para el ensayo frente al anioacuten
superoacutexido A medida que el potencial se hace menos positivo aumenta la
reactividad de los compuestos lo que indica que la transferencia electroacutenica
estaacute involucrada en la etapa determinante de la velocidad
De acuerdo con los resultados de la teacutecnica CAC y la correlacioacuten tanto con la
hidrofobicidad relativa como con el logDteoacuterico la actividad de los derivados
Conclusiones
127
propuestos estaacute circunscrita a aquellos procesos oxidativos que tienen lugar en
medios lipofiacutelicos como por ejemplo membranas bioloacutegicas
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60327-517-0_16
iii
Se agradece en forma especial a las siguientes Instituciones por los aportes
financieros recibidos para el desarrollo y teacutermino de esta Tesis
- Conicyt Beca de Doctorado Nacional (2010) Beca de Apoyo de Tesis
(2011) y Beca de Asistencia a Congresos (2013)
- Universidad de Chile por las Becas Mecesup UCh061 (2011) Beca de la
Vicerrectoriacutea de Asuntos Acadeacutemicos (Estadiacuteas cortas de Investigacioacuten 2013)
y a la Facultad de Ciencias Quiacutemicas y Farmaceacuteuticas por Beca de Rebaja
Arancelaria (2015-2016)
- Fondecyt Proyecto ndeg 1110039 Profesor Luis J Nuacutentildeez Vdagger
iv
A G R A D E C I M I E N T O S
Al culminar esta etapa acadeacutemica soacutelo tengo expresiones de profundo
agradecimiento
A Dios -en el cual somos nos movemos y existimos- agradezco la hermosa Familia
que me ha acogido siempre pilar que ha sostenido mi carrera en los diacuteas alegres y en
aquellos aciagos Gracias a mis Padres Joseacute Mariacutea y Elsa por su amor su sabiduriacutea el
apoyo incondicional comprensioacuten y valores entregados desde mi maacutes tierna infancia
gracias por la disciplina y prestancia que me entregaron como legado fruto de una
educacioacuten esmerada empapada de Fe y conviccioacuten tesoros que van en mi espiacuteritu
siempre A mi hermana Andrea y mi cuntildeado Juan gracias por su carintildeo todo su
apoyo y comprensioacuten Tiacuteas Mary Florita y Carmen gracias por estos antildeos de amor
alegriacutea y entrega
Agradezco a mis Profesores Tutores Al Dr Luis Nuacutentildeez V vaya mi maacutes sentido
reconocimiento por invitarme a ser parte de su Investigacioacuten y entregarme
herramientas valiosas en mi formacioacuten de pre y posgrado gracias por la confianza
que depositoacute en miacute por la acogida y comprensioacuten que me brindoacute en tiempos
complejos instancias que siempre conservareacute en mi memoria
A los Profesores Dr J Arturo Squella S y Patricio Navarrete E expreso mi sincero
agradecimiento por su guiacutea y orientacioacuten en este proceso gracias por su acogida y
todos sus aportes para que este trabajo llegase a feliz teacutermino
Expreso mi gratitud a los Profesores Dr Domingo Gonzaacutelez A y Manuel Domiacutenguez
P de la Facultad de Quiacutemica de la Universidad de Sevilla por recibirme en su grupo
de trabajo y compartir parte de esta Investigacioacuten Tener la oportunidad de viajar y
haber conocido y compartido ese corto tiempo de estadiacutea con el Profesor Domingo ha
sido una de las experiencias maacutes valiosas educativas y formativas que conservo de
este periacuteodo como doctorando Gracias por su amistad
Deseo expresar mi agradecimiento a los Profesores de la Comisioacuten Examinadora a la
Dra Soledad Ureta Z por su tiempo buena disposicioacuten y valiosos aportes a este
trabajo al Dr Antonio Zanocco L por sus aportes realizados a este trabajo y su
buena voluntad al Dr David Pessoa M gracias por sus ideas y aportes realizados en
cada instancia En forma especial quiero agradecer al Dr Claudio Olea A quien
junto con ser parte de esta Comisioacuten me abrioacute generosamente las puertas de su
Laboratorio para aprender y desarrollar diversas teacutecnicas aplicadas en esta Tesis lo
cual fue un hermoso aporte Muchas gracias por su confianza por integrarme como
una alumna maacutes por su tiempo paciencia y por todos los momentos alegres que
compartiacute con su grupo Muchas gracias a sus alumnos ex-alumnos y miembros del
Laboratorio al Dr(c) Mauricio Moncada por su dedicacioacuten carintildeo y ensentildeanza en
este proceso gracias por la amistad y el apoyo que me ha brindado
v
Al Dr Germaacuten Barriga por los aportes en el tema de estudios teoacutericos al Dr Michel
Lapier por su colaboracioacuten con los estudios en ceacutelulas al Dr Francisco Mura por su
generosidad y colaboracioacuten al Dr Benjamiacuten Aguilera por su simpatiacutea y ayuda con
temas espectroscoacutepicos a la Dra Mariacutea Carolina Zuacutentildeiga y los MC boys Jorge
Beatriz Manuel Camilo Gabriela Estefaniacutea gracias por sus aportes a este trabajo y
los momentos agradables que compartimos Al Profesor Dr Javier Morales vaya mi
agradecimiento por su ayuda en el estudio y caracterizacioacuten de mis compuestos
Gracias a la Profesora Dra Mariacutea Baeacutez C por su colaboracioacuten y disposicioacuten en la
caracterizacioacuten de mis compuestos
Agradezco a todos los compantildeeros de laboratorio que he conocido en diversas
instancias A la Dra Paulina Sierra a Viviana Claudio Julio la Dra Paola Salgado
Camila Daniela Constanza Dr David Vaacutesquez Gracias por los momentos gratos y
su compantildeerismo
Deseo destacar la valiosa contribucioacuten de los funcionarios de la Biblioteca Ceacutesar
Leyton de nuestra Facultad Muchas gracias por la prontitud y agilidad en su servicio
que siempre ha sido de muy buen nivel
Agradezco ademaacutes la valiosa colaboracioacuten de las Secretarias de Decanato Sra
Cecilia Pinchetti y Ximena Berriacuteos Gracias por su siempre buena disposicioacuten
gentileza y voluntad con cada detalle de todo este proceso
Mi agradecimiento para todo el personal de Secretariacutea de Posgrado por su gestioacuten y
colaboracioacuten en todo el proceso acadeacutemico
vi
INDICE
Informe de aprobacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip i
Agradecimientoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip iii
Iacutendicehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip vi
Iacutendice de figuras y tablashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip x
Glosariohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip xvi
Resumenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip xviii
Summaryhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip xx
1 Introduccioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 1
11 Cumarinashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 1
111 Origen vegetalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 1
112 Rutas de siacutentesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 2
113 Principales aplicacioneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 4
12 Compuestos polifenoacutelicoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 9
121 Origen vegetalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 9
122 Actividad bioloacutegicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 10
123 Polifenoles como antioxidanteshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 11
13 Compuestos hiacutebridoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 13
vii
131 Cumarinas como estructuras hiacutebridashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 15
2 Hipoacutetesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
3 Objetivoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
31 Objetivos generaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
32 Objetivos especiacuteficoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
4 Materiales y meacutetodoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 23
41 Materialeshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24
411 Reactivos y equipamiento utilizado en siacutentesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24
412 Reactivos y equipamiento utilizados en electroquiacutemicahelliphelliphelliphelliphellip 25
413 Reactivos y equipamiento utilizados en ensayos frente a especies
radicalariashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27
42 Meacutetodoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 28
421 Procedimientos de siacutentesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 28
422 Procedimientos en electroquiacutemicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 37
423 Estudio de generacioacuten de especies radicalarias mediante
espectroscopia de resonancia de espiacuten electroacutenico (REE)helliphelliphelliphelliphellip 38
424 Procedimiento experimental en el estudio de reactividad
frente a especies radicalariashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39
4241 Metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales
de oxiacutegeno (ORAC-FL)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39
4242 Metodologiacutea de capacidad reductora de hierro en plasma
(FRAP)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42
viii
4243 Capacidad de apagamiento del radical hidroxilo (OHmiddot)
mediante la teacutecnica spin traphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 44
4244 Estudio de reactividad frente al anioacuten radical superoacutexido O2bull-helliphelliphellip 45
4245 Estudio de la capacidad antioxidante celular (CAC)helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 47
4246 Estudio de hidrofobicidad relativa helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 48
4247 Estudio teoacuterico caacutelculo del Iacutendice de Fukui fkhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 49
5 Resultados y discusioacuten helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 50
51 Siacutentesis de los compuestoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 50
52 Estudios electroquiacutemicoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 54
53 Estudio de generacioacuten de especies radicalarias mediante espectroscopia
de resonancia de espiacuten electroacutenico (REE)helliphelliphelliphelliphellip 70
54 Resultados y discusioacuten de los estudios de reactividad
frente a especies radicalariashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 74
541 Metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales
oxiacutegeno-fluoresceiacutena (ORAC-FL)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 74
542 Metodologiacutea de capacidad reductora de hierro en plasma
(FRAP )helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 82
543 Determinacioacuten de capacidad de apagamiento del radical OHmiddot
teacutecnica spin trappinghelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 86
544 Estudio de reactividad frente al anioacuten radical superoacutexido O2bull-helliphelliphellip 94
545 Determinacioacuten de capacidad antioxidante celular (CAC)helliphelliphelliphelliphellip 100
546 Estudio de hidrofobicidad relativa helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 102
ix
547 Estudio teoacuterico caacutelculo del Iacutendice de Fukui fkhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 108
6 Discusioacuten generalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 113
7 Conclusiones helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 124
8 Bibliografiacuteahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 126
x
Iacutendice de figuras y tablas
Figuras
Figura 1 Esquema de los compuestos estudiados
Figure 1 Scheme of studied compounds
Figura 11 Estructura de la 2H-1-benzopiran-2-ona (cumarina)
Figura 12 Esquema general de la reaccioacuten de Pechmann
Figura 13 Estructura de la 33rsquo-metilenbis(4-hidroxicumarina) o dicumarol
Figura 14 Estructura de la suksdorfina
Figura 15 Estructura del hiacutebrido cumarina-flavona aislado de su fuente vegetal
Gnidia socotrana
Figura 16 Estructura del antibioacutetico hiacutebrido novobiocina metabolitos secundarios
en la especie Streptomyces
Figura 17 Hiacutebridos chalcona-cumarina con capacidad antioxidante
Figura 41 Aacutecidos empleados en la sustitucioacuten de la 4-clorometil-78-
dihidroxicumarina
Figura 42 Siacutentesis del derivado clorado 1
Figura 43 Siacutentesis del derivado clorado acetilado 5
Figura 44 Siacutentesis del aacutecido cafeico acetilado 6
Figura 45 Siacutentesis del aacutecido gaacutelico acetilado 7
Figura 46 Siacutentesis del aacutecido 34-dihidroxibenzoico acetilado 8
Figura 47 Siacutentesis del intermediario hiacutebrido derivado del aacutecido cafeico
xi
Figura 48 Siacutentesis del compuesto hiacutebrido final 9
Figura 49A Ruta de siacutentesis de los compuestos cumariacutenicos i) H2SO4 1 h bantildeo de
hielo ii) NaOH Ac2O 30 min bantildeo de hielo (aacutecido cafeico 6) H2SO4 Ac2O 30
min (cumarina y aacutecidos benzoicos)
Figura 49B Ruta de siacutentesis de los compuestos cumariacutenicos iii) DBU DMF (seca)
35 h 50 degC iv) NaHCO3 MeOH acetona tdeg amb 3 h N2
Figura 410 A Sonda fluoresceiacutena B 22prime-azobis (2-metilpropionamidina)
dihidrochloridrato (ABAP) C 6-hidroxi-2578-tetrametilcroman-2-aacutecido carboxiacutelico
(Trolox)
Figura 411 Actividad antioxidante ORAC para un compuesto en estudio
Figura 412 Reactivo 246-tris(2-piridil)-s-triazina (TPTZ)
Figura 413 Voltamograma ciacuteclico de la generacioacuten de anioacuten radical superoacutexido
DMF+ HFFTBA 02 M en electrodo de carbono viacutetreo
Figura 51A Voltamogramas de pulso diferencial para los precursores 1 2 3 y 4
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 51B Voltamogramas de pulso diferencial para los derivados 9 10 y 11
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 52A VC para el derivado 9 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 53A VC para el derivado 10 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 54A VC para el derivado 1a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 55 Esquema del proceso electro-oxidativo propuesto para el catecol
Figura 56 Relacioacuten Epa vs logv para el derivado de aacutecido cafeico 9 2 mM en
DMF + HFFTBA 02 M
xii
Figura 57 Graacutefica para la corriente de pico Ipa vs la raiacutez cuadrada de la velocidad de
barrido Ejemplo de correlacioacuten lineal en el aacutecido protocateacutequico 4 2 mM en
DMF + HFFTBA 02 M
Figura 58 Determinacioacuten graacutefica del valor de Eonset VC del precursor 1 01 Vs
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 59 Relacioacuten Eonset vs logv para los compuestos estudiados
Figura 510 Correlacioacuten Ipa v12
vs v12
para el precursor aacutecido protocateacutequico 4
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 511A Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido cafeico 9 estabilizado con Zn2+
en DMF+HFFTBA
(izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color
rojo)
Figura 511B Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido gaacutelico 10 estabilizado con Zn2+
en DMF+HFFTBA
(izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color
rojo)
Figura 511C Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido 11 estabilizado con Zn2+
en DMF+HFFTBA (izq)
Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color rojo)
Figura 512 Curvas para el consumo de la sonda Fluoresceiacutena para un set de
concentraciones del compuesto 11
Figura 513 Graacutefica de aacuterea neta bajo la curva ABC vs concentracioacuten del derivado 11
Figura 514 Esquema para la reaccioacuten entre el complejo de Fe3+
y el compuesto
antioxidante reductor
Figura 515 Espin aducto generado por la inactivacioacuten del radical OHbull y su espectro
simulado (derecha)
xiii
Figura 516A Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto 4-clorometil-78-dihidroxicumarina 1 B Espectro REE de inactivacioacuten
del radical hidroxilo con adicioacuten del compuesto aacutecido cafeico 2
Figura 516C Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto aacutecido gaacutelico 3 D Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con
adicioacuten del compuesto aacutecido 34-dihidroxi benzoico 4
Figura 516E Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto hiacutebrido 9 F Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con
adicioacuten del compuesto hiacutebrido 10
Figura 516G Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto hiacutebrido 11
Figura 517 Espectro REE se destaca en rojo el triplete de integracioacuten 121
formado despueacutes de la reaccioacuten de Fenton no-cataliacutetico (izq) Espectro simulado
utilizando el programa EPR-WINSIM (der)
Figura 518 Espectro simulado para la formacioacuten del spin aducto [cumarina-
DMPO] utilizando el programa EPR-WINSIM
Figura 519 Voltamogramas ciacuteclicos del par redox correspondiente al anioacuten
superoacutexido tras antildeadir aliacutecuotas del compuesto 1 DMF + HFFTBA 02 M 01 Vs
Figura 520 Graacutefica del paraacutemetro adimensional (Ipa0-Ipa
S Ipa
0) vs concentracioacuten
de sustrato para el compuesto 1 (Destacado en verde el valor de IA50)
Figura 521 Hidrofobicidad relativa de los derivados y la cumarina precursora
Figura 522 Correlacioacuten entre el valor de logD teoacuterico y CAC experimental a
10 microM de cada compuesto El valor logD se obtuvo a traveacutes de la herramienta Marvin
Sketch del software ChemAxon164
Figura 523 Estructura optimizada en 3D para el precursor 1 utilizando DFT
Figura 524 Estructura optimizada en 3D para el derivado 9 utilizando DFT
Figura 525 Estructura optimizada en 3D para el derivado 10 utilizando DFT
xiv
Figura 526 Estructura optimizada en 3D para el derivado 11 utilizando DFT
Figura 61 Esquema de reaccioacuten para un mecanismo concertado de electro-
oxidacioacuten fenoacutelica Adaptacioacuten referencia 118
Figura 62 Esquema de reaccioacuten para estructuras fenoacutelicas mecanismo electro-
oxidativo en etapas
Figura 63 Correlacioacuten entre el potencial de oxidacioacuten Eonset y los ensayos frente a
anioacuten superoacutexido
xv
Tablas
Tabla 51 Paraacutemetros experimentales para los compuestos Determinaciones en VC
2 mM DMF + HFFTBA 02 M
Tabla 52 Constantes de acoplamiento hiperfino para los derivados polifenoacutelicos
Valores en Gauss
Tabla 53 Valores experimentales de Iacutendice ORAC para los compuestos estudiados
Tabla 54 Valores calculados para el factor estequiomeacutetrico n
Tabla 55 Valores experimentales obtenidos para los compuestos en estudio ensayo
FRAP en equivalentes de Trolox10 microM de muestra
Tabla 56 Porcentajes de inactivacioacuten del radical hidroxilo (OHmiddot)
Tabla 57 Valores de IA50 obtenidos para los compuestos estudiados
Tabla 58 Valores obtenidos para la capacidad antioxidante celular (CAC)
concentraciones 1 microM y 10 microM de cada compuesto
Tabla 59 Valores obtenidos para el tiempo de retencioacuten experimental de los
compuestos
Tabla 510 Valores de Iacutendice de Fukui fk para los compuestos en estudio
Tabla 61 Cuadro comparativo de los resultados en la determinacioacuten de capacidad
antioxidante para la cumarina y sus derivados
xvi
Glosario de abreviaturas
ABAP 22-azo-bis(2-amidinopropan)diclorhidrato
ADN Aacutecido desoxiribonucleico
ATCC American Type Culture Collection
HFFTBA Hexafluorofosfato de tetrabutil amonio
CAC Capacidad antioxidante celular
CYP450 Citocromo P450
DBU 18-diazabiciclo[540]undec-7-ano
DCFH-DA 2-(6-oxido-3-oxo-3H-xanten-9-il)benzoato disoacutedico (fluoresceiacutena sal
disoacutedica)
DMF NN-dimetilformamida
DMPO 55-dimetil-1-pirroline-N-oacutexido
DMSO Dimetil sulfoacutexido
DPPHbull Radical 22-difenil-1-picrilhidrazil
Epa Potencial de pico anoacutedico
EPR Electron paramagnetic resonance
ERNs Especies reactivas de nitroacutegeno
EROs Especies reactivas de oxiacutegeno
xvii
fk Iacutendice de Fukui
FRAP Ferric reducing antioxidant in plasma
HObull Radical hidroxilo
IA50 Iacutendice antioxidante 50
Ipa Corriente de pico anoacutedica
O2˙- Anioacuten radical superoacutexido
ONOObull Radical peroxinitrito
ORAC-FL Oxygen radical antioxidant capacity-fluorescein
PBS Buffer fosfato salino
REE Resonancia de espiacuten electroacutenico
RObull Radical alcoxilo
ROOmiddot Radical peroxilo
TPTZ 246-tris(2-piridil)-s-triazina
Trolox 6-hidroxi-2578-tetrametilcroman-2-aacutecido carboxiacutelico
VC Voltametriacutea ciacuteclica
VPD Voltametriacutea de pulso diferencial
xviii
RESUMEN
Las cumarinas (2H-1-benzopiran-2-ona) son estructuras quiacutemicas presentes en
especies vegetales ampliamente distribuidas en la naturaleza con una reconocida
actividad bioloacutegica entre las que destacan sus propiedades antioxidantes
En el presente trabajo de Tesis se describe la siacutentesis de derivados polifenoacutelicos La
cumarina dihidroxilada como estructura de partida fue esterificada con distintos
aacutecidos orgaacutenicos polifenoacutelicos (Figura 1) Se estudioacute su electro-oxidacioacuten y se evaluoacute
su actividad antioxidante frente a especies reactivas de oxiacutegeno por medio de diversas
metodologiacuteas in vitro
Figura 1 Esquema de los compuestos estudiados
Se estudioacute el comportamiento anoacutedico de los compuestos mediante voltametriacutea
ciacuteclica (VC) y voltametriacutea de pulso diferencial (VPD) en medio aproacutetico como una
aproximacioacuten a los procesos redox que ocurren en membranas bioloacutegicas
Se determinoacute la presencia de especies radicalarias en el proceso electro-oxidativo a
traveacutes de la teacutecnica de resonancia de espiacuten electroacutenico (REE) Las constantes de
OOH
HO O
Cl
HO
OOH
OH
OH
OH
HO
O
OH
OH
OH
HO
OO
OHHO O
OH
OH
O
O
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
xix
acoplamiento hiperfino junto con caacutelculos teoacutericos (iacutendice de Fukui) permitieron
discriminar distintos sitios reactivos en las nuevas moleacuteculas donde se desarrolla el
proceso oxidativo
Ademaacutes se evaluoacute la capacidad antioxidante de los compuestos a traveacutes de los
ensayos capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno-fluoresceiacutena (ORAC-
FL) capacidad antioxidante reductora de hierro (FRAP) apagamiento del radical
hidroxilo mediante spin trapping inactivacioacuten de anioacuten superoacutexido y capacidad
antioxidante celular (CAC) en un modelo bioloacutegico in vitro simple
Para los ensayos antioxidantes no bioloacutegicos la introduccioacuten de las distintas
estructuras fenoacutelicas en el anillo cumariacutenico permite obtener derivados que presentan
una capacidad antioxidante mejor que el precursor cumariacutenico inicial Se establecioacute
la respectiva correlacioacuten entre el potencial de inicio del proceso electroquiacutemico
(potencial onset) y los resultados encontrados en el ensayo en medio aproacutetico frente a
anioacuten superoacutexido
Considerando el ensayo bioloacutegico de capacidad antioxidante celular eacuteste sugiere que
la actividad antioxidante de los nuevos derivados estaacute circunscrita a medios de
naturaleza lipofiacutelica
xx
SUMMARY
Coumarins (2H-1-benzopyran-2-one) are chemical structures from vegetal sources
widely distributed in vegetable species with recognized biological activities among
which their antioxidant capacity
In this Thesis work the syntheses of coumarin polyphenolic derivatives is described
Coumarin was the starter scaffold and it was sterified with different organic phenolic
acids The electro-oxidation of polyphenolic derivatives is studied and their
antioxidant capacity towards ROS through methodologies in vitro is evaluated
Figure 1 Scheme of studied compounds
The anodic behavior of the compounds by cyclic voltammetry (CV) and differential
pulse voltammetry (VPD) was studied in aprotic medium as an approximation to the
redox processes in biological membranes
The presence of radical species is determined in the electro-oxidation process through
the technique electron spin resonance (ESR)The hyperfine coupling constants and
theoretical calculations (Fukui index values) allow to discriminate between the
OOH
HO O
Cl
HO
OOH
OH
OH
OH
HO
O
OH
OH
OH
HO
OO
OHHO O
OH
OH
O
O
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
xxi
different reactive sites in the new molecules where the oxidative process is taking
place
Moreover antioxidant capacity of derivatives was evaluated through oxygen radical
antioxidant assay-fluorescein (ORAC-FL) ferric reducing ability of plasma (FRAP)
spin trapping superoxide scavenging assays and cellular antioxidant (CAC) in a
simple biological model in vitro
In the non-biological antioxidant assays the addition of various phenolic structures to
the coumarin scaffold yielded derivatives with improved antioxidant capacity related
to initial coumarin We studied the correlations between the starting potential of the
electrochemical process (onset potential) and the antioxidant results obtained in
aprotic media against superoxide anion
In regard to the biological cellular antioxidant capacity assay it suggests that the
antioxidant activity of new derivatives could be limited to lipophilic media
Introduccioacuten
1
1 Introduccioacuten
11 Cumarinas
111 Origen vegetal
Las cumarinas son una familia de compuestos cuya estructura baacutesica corresponde a la
lactona heterociacuteclica 2H-1-benzopiran-2-ona (Figura 11) En el reino vegetal estaacuten
ampliamente distribuidas habieacutendose identificado en la actualidad maacutes de 1800
cumarinas de origen natural1 eacutestas se encuentran principalmente como metabolitos
secundarios en diversas plantas tanto en sus semillas como en hojas y raiacuteces2 Su
biosiacutentesis es descrita por distintos autores como una serie de procesos catalizados
por enzimas presentes en la estructura CYP450 (citocromo P450) en algunos casos
estos compuestos son generados en la ceacutelula vegetal como una viacutea de defensa
(fitoalexinas como la escopoletina) frente a estiacutemulos de estreacutes y la presencia de fito-
patoacutegenos34
O O
3
45
6
7
81
2
Figura 11 Estructura de la 2H-1-benzopiran-2-ona (cumarina)
Introduccioacuten
2
El nombre de estos compuestos se deriva de la palabra ldquocoumarourdquo vocablo
caribentildeo que hace referencia al aacuterbol de Tonka originario de Sudameacuterica de cuya
semilla A Vogel logra aislar el compuesto y publicar su hallazgo en 18205b
A partir
de entonces el intereacutes por su caracterizacioacuten6 la obtencioacuten tanto desde fuentes
naturales7 como por rutas sinteacuteticas de la cumarina y sus derivados ha ido en
aumento encontrando su primera aplicacioacuten en la fabricacioacuten de perfumes En 1868
W H Perkin propuso la siacutentesis de una fragancia vegetal a partir de la sal soacutedica del
orto-hidroxibenzaldehiacutedo y anhiacutedrido aceacutetico obteniendo el mismo producto aislado
de la semilla de Tonka5 8(ac)
Se han estudiado los aspectos taxonoacutemicos en cuanto a la clasificacioacuten de las especies
vegetales que contienen compuestos cumariacutenicos se estima que las principales
familias donde se encuentran estos derivados son Umbelliferae Rutaceae
Leguminosae Compositae Caryopgillaceae Euphorbiaceae Hipocastanaceae
Oleaceae Thymelaeaceae8b
112 Rutas de siacutentesis
Los autores Sethna y Narsinh9 presentaron en 1944 una de las primeras revisiones del
estado del arte con respecto a la siacutentesis de cumarinas En ella se encuentran las
principales metodologiacuteas claacutesicas de obtencioacuten como la siacutentesis de Perkin
Pechmann10
y Pechmann-Duisberg11
(Figura 12) en la que se obtiene la cumarina al
Introduccioacuten
3
condensar un fenol con un β-cetoester en medio aacutecido Diversas publicaciones
plantean modificaciones a esta ruta con catalizadores12 (ab)
libre de solventes13 (ab)
con promotores aacutecidos14
asistida por microondas15
entre otras
Figura 12 Esquema general de la reaccioacuten de Pechmann
Otra metodologiacutea empleada es la de Knoevenagel16
propuesta en 1898 Consiste en
una reaccioacuten de condensacioacuten entre o-hidroxialdehiacutedos con malonato de etilo
acetoacetato de etilo o cianoacetato de etilo en medio baacutesico (piridina o piperidina)
Los autores Bigi y colaboradores17
describen el uso de un catalizador en base a
montmorillonita para la obtencioacuten de cumarinas sustituidas en posicioacuten 3 con un
grupo aacutecido Posteriormente otro grupo de trabajo (Shaabani 2009) llevoacute a cabo esta
condensacioacuten empleando radiacioacuten de microondas lo que les permitioacute obtener buenos
rendimientos en un medio ldquoamigablerdquo con el ambiente18
Se han descrito otras metodologiacuteas sinteacuteticas en las cuales se utilizan las reacciones
claacutesicas de Wittig19 ab
y Reformatsky20
ademaacutes de otras rutas con variantes tanto en
los reactivos como en el medio de reaccioacuten que permiten la obtencioacuten de derivados
OH
+
OEt
O O H2SO4
O O
Introduccioacuten
4
cumariacutenicos como la siacutentesis en presencia de bases fuertes21
reacciones libres de
solventes22
y la obtencioacuten de cumarinas policiacuteclicas utilizando compuestos
organometaacutelicos descrita por Harvey y cols23
113 Principales aplicaciones
Tras ser aisladas desde su fuente vegetal y como resultado de investigaciones
posteriores dirigidas a generar rutas sinteacuteticas viables las cumarinas han sido objeto
de numerosos estudios enfocados en la buacutesqueda de sus aplicaciones Es asiacute como en
la literatura se pueden encontrar las maacutes diversas investigaciones para este tipo de
compuestos provenientes tanto de productos de siacutentesis o como extractos de
vegetales y plantas con reconocidas propiedades en la medicina tradicional esto da
origen al estudio de sus bio-aplicaciones entre las que se destaca su capacidad como
antioxidante
A Actividad bioloacutegica
La primera aplicacioacuten en bio-medicina descrita para las cumarinas fue como
anticoagulante desde que se aislara y caracterizara el dicumarol 33rsquo-metilenbis(4-
hidroxicumarina) (Figura 13) Posteriormente aparece en el mercado su derivado
Introduccioacuten
5
sinteacutetico conocido como Warfarina que hasta la deacutecada pasada era considerado uno
de los faacutermacos anticoagulantes maacutes vendidos en Estados Unidos24 a-c
OOOO
OH HO
Figura 13 Estructura de la 33rsquo-metilenbis(4-hidroxicumarina) o dicumarol
Con posterioridad el uso de las cumarinas se ha diversificado hacia innumerables
blancos terapeacuteuticos En la literatura se describen variados estudios con respecto a sus
propiedades farmacoloacutegicas25ab
Su capacidad como agente antitumoral 26ab
se ha
estudiado en compuestos provenientes tanto de fuentes vegetales como sinteacuteticas
Riveiro ME y cols estudiaron el efecto de la 78-OH-4-metilcumarina en ceacutelulas
humanas afectadas por leucemia evidenciando el potencial que presentoacute este
derivado dihidroxilado27
En otra investigacioacuten realizada por C Ito y colaboradores
aislaron tres derivados cumariacutenicos de la especie vegetal Murraya siamensis cuyos
ensayos frente a ceacutelulas tumorales resultaron promisorios28
Con respecto a las propiedades antiinflamatorias de las cumarinas en la naturaleza se
encuentran especies como la Chamomilla recutita (manzanilla) que contiene un tipo
Introduccioacuten
6
de umbeliferona con tales propiedades En la literatura se encuentran derivados
sinteacuteticos desarrollados en cuya estructura estaacute presente el esqueleto cumariacutenico29
Lin y cols presentan los resultados de su estudio de la capacidad antiinflamatoria de
un conjunto de cumarinas los cuales fueron ademaacutes correlacionados con los
obtenidos para el apagamiento del radical hidroxilo30
HA El-Wahab y cols sintetizaron distintas tiazolo-cumarinas hiacutebridas y estudiaron
una de sus propiedades farmacoloacutegicas como agente antimicrobiano Estos
compuestos posteriormente fueron aplicados como aditivos en recubrimientos de
poliuretano confirieacutendoles tambieacuten esta propiedad microbicida a las superficies en
las que se utilizoacute31
Tambieacuten se han descrito derivados cumariacutenicos con propiedades anti-fuacutengicas 32ab
Un trabajo reciente presenta el estudio de complejos en base a Ni(II) Cu(II) y
Co(II)frente a distintas especies de hongos (Candida A niger Rhizopus)32c
Tambieacuten se han encontrado estructuras cumarina-glucoacutesidos provenientes de especies
vegetales (Hydrangea paniculata) que presentan propiedades hepatoprotectoras33
Otros estudios sentildealan tambieacuten la importancia de las estructuras cumariacutenicas como
compuesto antiviral analgeacutesico anti-tromboacutetico ulcerogeacutenico 25 34-36
inclusive con
potencial para ser usadas en terapias frente al VIH como lo sentildeala la investigacioacuten
sobre especies vegetales que contienen dipiranocumarin - calanolideos como
Introduccioacuten
7
principio activo25a
estudios que tambieacuten se han realizado con derivados de siacutentesis
disentildeados a partir de la estructura de origen vegetal (Lomatium suksdorfii) conocida
como suksdorfina (Figura 14) a partir de la cual se han generado compuestos
anaacutelogos con el objeto de estudiar su modo de accioacuten y obtener sustratos cada vez
maacutes potentes frente a la enfermedad (Yu D y cols 2003)37
O OO
O
O
OO
Figura 14 Estructura de la suksdorfina
B Propiedades antioxidantes
El equilibrio en los organismos vivos es funcioacuten de diversos factores entre ellos cabe
mencionar el balance de las especies que generan estreacutes oxidativo dentro del medio
celular estas especies pueden ser de origen endoacutegeno como las provenientes de la
cadena transportadora de electrones enzimas oxidantes ceacutelulas fagociacuteticas o de
origen exoacutegeno como sustancias reductoras oxidacioacuten de drogas tabaquismo
ultrasonido luz solar etc Entre los compuestos que generan estreacutes conocidos como
Introduccioacuten
8
EROs y ERNs (especies reactivas de oxiacutegenonitroacutegeno) se pueden mencionar el
anioacuten superoacutexido (O2˙-) peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2) radical peroxilo (ROObull) y
alcoxilo (RObull) radical hidroxilo (HObull) oacutexido niacutetrico (NObull) peroxinitrito (ONOObull)
entre otras
Dentro de este contexto en la literatura se ha descrito el potencial que poseen las
cumarinas y sus derivados como compuestos capaces de interaccionar con especies
reactivas de oxiacutegeno y nitroacutegeno lo que da cuenta de su capacidad antioxidante tema
relevante si se considera que parte importante de las patologiacuteas conocidas y
estudiadas en la actualidad a nivel mundial estaacuten iacutentimamente ligadas a cuadros de
estreacutes oxidativo presentes en el organismo 38 39
Payaacute y colaboradores presentaron un trabajo en el cual se estudia la reactividad de un
conjunto de dieciseacuteis cumarinas (naturales y sinteacuteticas) frente al radical hidroxilo
aacutecido hipocloroso y anioacuten superoacutexido encontrando que los derivados di-hidroxilados
poseiacutean mejores propiedades que aquellos mono-hidroxilados o sin sustitucioacuten40
Estos resultados se complementan con una publicacioacuten posterior del mismo grupo en
que se profundiza el estudio anterior sentildealando las propiedades terapeacuteuticas de los
derivados cumariacutenicos34
El derivado conocido como esculetina (67-dihidroxicumarina) fue ensayado frente al
radical DPPH junto con ensayos de estreacutes oxidativo en medios de cultivo celular
Introduccioacuten
9
estos autores sentildealan la importancia de los grupos catecol en su capacidad de atrapar
especies radicales (Kim y cols 2008)41
Otro estudio en el que se ensaya un extracto
vegetal (Cortex Fraxini) relaciona ademaacutes la capacidad antioxidante de las o-
dihidroxi cumarinas con su capacidad reductora42
Zhang y cols presentan un estudio reciente en el cual cumarinas dihidroxiladas en
posicioacuten 7 y 8 entre otros derivados poseen importante bio-actividad in vitro los
compuestos fueron ensayados frente a especies radicales en ceacutelulas tumorales
presentaron ademaacutes actividad como antiinflamatorios y baja toxicidad tanto en
ceacutelulas sanguiacuteneas de vertebrado como de invertebrado Junto con lo anterior se
realizoacute un anaacutelisis de estructura-reactividad correlacionando la capacidad de
apagamiento de radicales con las propiedades antiinflamatorias y antitumorales de los
derivados cumariacutenicos encontradas en esta investigacioacuten43
12 Compuestos polifenoacutelicos
121 Origen vegetal
Los polifenoles al igual que las cumarinas son una amplia familia de compuestos (se
han encontrado maacutes de 8000 de ellos) presentes en estructuras vegetales como
metabolitos secundarios cumpliendo roles tales como protector frente a radiacioacuten
UV reguladores de los ciclos de crecimiento pigmentacioacuten y defensa frente a
Introduccioacuten
10
depredadores Su estructura baacutesica es el anillo benceacutenico con sustituyentes hidroxilo
(-OH) en distintas posiciones Se clasifican en flavonoides aacutecidos fenoacutelicos
(hidroxicinaacutemicos e hidroxibenzoicos) taninos estilbenos Debido a sus interesantes
propiedades y bio-aplicaciones estos fitoquiacutemicos han sido objeto de diversos
estudios investigacioacuten y caracterizacioacuten44-46
Estos compuestos son un constituyente importante de la dieta diaria se encuentran en
forma abundante en diversos frutos como por ejemplo berries manzana mango uva
pera granada y ciacutetricos en bebidas como el vino teacute y cafeacute 47
en vegetales cereales
y semillas Junto con lo anterior se ha descrito la utilizacioacuten de aacutecidos polifenoacutelicos
provenientes de extractos vegetales y aceites esenciales como aditivos en la industria
alimentaria aplicados como preservantes naturales en reemplazo de aquellos de
origen sinteacutetico debido a las propiedades antimicrobianas que exhiben48
122 Actividad bioloacutegica
Estos compuestos se conocen tambieacuten como ldquobiofenolesrdquo (Romeo y Uccella 1996)
haciendo referencia a aquellos provenientes de fuentes naturales Las primeras
publicaciones sobre los polifenoles en general comenzaron en la deacutecada de 1950 con
la investigacioacuten de D Harman y su teoriacutea del envejecimiento y los radicales libres
estudios en los que se planteoacute prolongar la sobrevida en especies roedores enfermos a
traveacutes de la ingesta de biofenoles presentes en su dieta Es asiacute que el nuacutemero de
publicaciones concernientes al tema se incrementoacute de una treintena (entre 1900 y
Introduccioacuten
11
1950) hasta superar las 35000 publicaciones entre los antildeos 2000-2010 lo que da
cuenta del creciente intereacutes en este toacutepico49
La bio-actividad de los compuestos polifenoacutelicos es amplia se encuentran diversos
estudios como el citado anteriormente con respecto a las capacidades antimicrobianas
de los polifenoles y su uso en la industria alimentaria5051
Compuestos como la
curcumina resveratrol quercetina y derivados del aacutecido gaacutelico se enumeran dentro de
las investigaciones realizadas tanto in vitro e in vivo en la prevencioacuten del caacutencer
(Cimino y cols 2012)52
Otras propiedades descritas para estos compuestos son como cardio-protectores anti-
canceriacutegenos antiinflamatorios vaso-relajantes entre otras como lo resume el
artiacuteculo de Xia y cols (2010) En eacutel ademaacutes se presenta una revisioacuten en cuanto a los
meacutetodos de extraccioacuten purificacioacuten y caracterizacioacuten del contenido y tipos de
polifenoles especiacuteficamente en el caso de la uva fruto reconocido por su alto
contenido de fitoquiacutemicos y nutrientes53
123 Polifenoles como antioxidantes
Los polifenoles como micronutrientes presentes en los alimentos y otras estructuras
vegetales han sido un foco de intereacutes ya que sus aplicaciones terapeacuteuticas estaacuten
relacionadas con su reconocida e investigada capacidad antioxidante y quelante de
metales Con respecto a esta uacuteltima cabe mencionar la revisioacuten del estado del arte
Introduccioacuten
12
realizada por Kozlowski y cols con respecto al desbalance de Cu Zn y Fe en el
organismo en ella se indica que la presencia libre y en exceso de estos metales estaacute
directamente relacionada con patologiacuteas neurodegenerativas y caacutencer entre otras ya
que su actividad redox genera especies reactivas capaces de atacar sustratos orgaacutenicos
como la membrana lipiacutedica proteiacutenas y aacutecido desoxiribonucleico (ADN)54
Ribeiro y colaboradores presentan un estudio en el que se determina el contenido
polifenoacutelico de la especie Fistulina hepaacutetica Los extractos se ensayaron frente a
DPPH anioacuten superoacutexido radical hidroxilo y aacutecido hipocloroso Los autores plantean
que considerando los resultados obtenidos esta especie fuacutengica podriacutea tener
aplicacioacuten como suplemento o como antioxidante en la industria alimentaria55
Estudios realizados con aacutecido taacutenico comercial sentildealan que su capacidad como
antioxidante y como quelante de hierro da cuenta del potencial que tiene este aacutecido
ademaacutes como anti-mutageacutenico y anti-carcinogeacutenico Los autores indican posibilidad
de que este aacutecido el cual presenta baja toxicidad contribuye en el apagamiento de
especies reactivas de oxiacutegeno dantildeinas a nivel de ADN (Andrade y cols 2006)56
trabajo que se complementa con una publicacioacuten anterior del mismo grupo donde se
estudioacute el apagamiento del radical OHbull mediante complejos de aacutecido taacutenico-Cu
(Andrade y cols 2005)57
Los aacutecidos hidroxicinaacutemicos e hidroxibenzoicos han sido tambieacuten objeto de estudio
debido a su capacidad antioxidante58-61
Jeong y colaboradores estudiaron el extracto
de la especie vegetal Erigeron annuus el cual contiene aacutecido cafeico en su fraccioacuten
Introduccioacuten
13
butanoacutelica este extracto fue ensayado como agente neuro-protector y antioxidante en
ceacutelulas nerviosas Frente a los resultados obtenidos los autores concluyen que este
extracto podriacutea ser utilizado en terapias frente a patologiacuteas neurodegenerativas como
el Alzheimer62
Otro estudio de capacidad antioxidante realizado a un grupo de
compuestos polifenoacutelicos presentes en el propoacuteleo (aacutecido cafeico aacutecido feruacutelico
ferulato de etilo eacutester fenetiacutelico del aacutecido cafeico) sentildeala que los grupos catecol
presentes en las estructuras ensayadas incrementan la capacidad antioxidante
mientras que en estudios relacionados con bio-membranas se debe tener en cuenta
ademaacutes la hidrofobicidad que presenten los compuestos63
13 Compuestos hiacutebridos
Al considerar que las diversas enfermedades que afectan al ser humano (caacutencer
diabetes enfermedades neurodegenerativas artritis entre otras) involucran diferentes
factores patogeacutenicos se han desarrollado estrategias sinteacuteticas que permiten obtener
nuevos faacutermacos de naturaleza hiacutebrida los cuales incorporan en su estructura
distintos ingredientes activos64
Este disentildeo ldquomulti-blancordquo ha permitido que los
nuevos faacutermacos actuacuteen en distintos blancos terapeacuteuticos este tipo de terapias
implica una disminucioacuten en los problemas asociados a una multi-dosificacioacuten las
interacciones entre distintos medicamentos una disminucioacuten en la resistencia a los
faacutermacos (en el caso de enfermedades de origen microbiano) disminucioacuten en los
efectos adversos derivados de la dosificacioacuten muacuteltiple por mencionar algunos
Introduccioacuten
14
Diversas investigaciones sobre el tema dan cuenta de la relevancia que ha tenido esta
estrategia y el disentildeo racional de nuevos medicamentos65-68
La revisioacuten realizada por
los autores Mehta y Singh (2002) menciona algunos de los esqueletos que han dado
origen a estructuras hiacutebridas entre ellas esteroides antraciclinas β-lactamas
fullerenos carbohidratos-peacuteptidos En esta revisioacuten se indica el uso de este tipo de
compuestos en terapias contra el caacutencer y como neuro-protectores69
En el caso de la malaria una de las enfermedades infecciosas maacutes complejas a nivel
mundial la resistencia del paraacutesito del geacutenero Plasmodium frente a los faacutermacos
empleados (cloroquina principalmente) ha sido un tema de estudio durante antildeos Una
resentildea de este desafiacuteo se presenta en el artiacuteculo de Kouznetsov y Goacutemez-Barrio
(2009) en el que se sentildeala la siacutentesis de derivados de aminoquinolina como las
trioxaquinas70
las cuales se presentan posteriormente en una revisioacuten realizada por
Chauhan y colaboradores en ella se destaca a estos hiacutebridos como candidatos
promisorios para la formulacioacuten de nuevas drogas antimalaacutericas71
Otra patologiacutea en la que se ha utilizado faacutermacos de naturaleza hiacutebrida que en
algunos casos provienen de productos naturales es el caacutencer72
Allen y
colaboradores73
mencionan en una reciente revisioacuten de tecnologiacuteas avanzadas en las
que ademaacutes de utilizar la estrategia de compuestos hiacutebridos con dos estructuras de
propiedades anticanceriacutegenas eacutestos se combinan con nano-estructuras orientadas a
Introduccioacuten
15
blancos especiacuteficos para asiacute disminuir el riesgo de efectos colaterales en el
tratamiento de esta compleja patologiacutea
Este concepto y disentildeo de faacutermacos multi-blanco se ha aplicado ademaacutes en distintas
terapias frente a enfermedades como el Alzheimer74
en vacunas de amplio espectro
frente al coacutelera75
en la siacutentesis de compuestos antiparasitarios76
y de dihidropiridinas
las cuales poseen actividad vasodilatadora77
por mencionar algunos ejemplos
131 Cumarinas como estructuras hiacutebridas
Al considerar el estado del arte con respecto a la amplia y variada actividad bioloacutegica
que presentan los derivados cumariacutenicos se encuentra que otra de las aplicaciones que
se ha estudiado para esta familia de compuestos es su capacidad para formar parte de
estructuras hiacutebridas complejas compuestos orientados a la obtencioacuten faacutermacos multi-
blanco que den respuesta a los interrogantes y desafiacuteos actuales con respecto a
importantes patologiacuteas y sus terapias 78
En la literatura se describen ejemplos de estructuras cumariacutenicas hiacutebridas no soacutelo de
origen sinteacutetico sino que tambieacuten se pueden extraer desde su fuente natural Un
estudio realizado en hojas y ramas de la especie Gnidia socotrana (originaria de
Yemen) da cuenta de la presencia de estructuras flavona-cumarina las que fueron
extraiacutedas purificadas y caracterizadas79
(Figura 15)
Introduccioacuten
16
O
OH
HO O
OH
O
O
OH
Figura 15 Estructura del hiacutebrido cumarina-flavona aislado de su fuente vegetal
Gnidia socotrana
Entre los compuestos antibioacuteticos de origen natural que poseen el esqueleto
cumariacutenico en su estructura se encuentran la novobiocina (Figura 16) clorobiocina y
cumermicina Presentes como metabolitos secundarios en la especie Streptomyces
estos derivados deben su actividad antibioacutetica a que actuacutean inhibiendo la enzima
ADN girasa presente en bacterias impidiendo su replicacioacuten y ademaacutes genera su
muerte celular80
O
HN
OH
O
OH
O
O
MeOO
H2N
HO
Figura 16 Estructura del antibioacutetico hiacutebrido novobiocina metabolitos secundarios
en la especie Streptomyces
Introduccioacuten
17
Se ha descrito tambieacuten la capacidad antitumoral de derivados cumarina-resveratrol a
partir del precursor 7-hidroxicumarina En la publicacioacuten de Belluti y colaboradores
se presentan los ensayos realizados para 10 compuestos los cuales tuvieron como
objeto ceacutelulas tumorales de pulmoacuten humano dos de los hiacutebridos presentaron
resultados promisorios como antitumorales y pro-apoptoacuteticos comportamiento que
los autores concluyen tiene relacioacuten con la posicioacuten de los sustituyentes en la
moleacutecula81
La revisioacuten bibliograacutefica de Longhin y colaboradores describe diversas estructuras
hiacutebridas desarrolladas que cuentan con capacidad antiinflamatoria toacutepico de intereacutes si
se considera que los cuadros inflamatorios estaacuten relacionados a dolencias como el
Alzheimer asma arterioesclerosis artritis reumatoide caacutencer etc En este trabajo se
sentildeala al hiacutebrido cumarina-aacutecido lipoico donde ambas estructuras poseen ademaacutes
reconocida capacidad antioxidante y el aacutecido unido a la cumarina en posicioacuten 3
mediante un espaciador es la estructura que se describe con una actividad superior al
conocido y utilizado faacutermaco indometacina82
Junto con los estudios descritos otra importante aacuterea de investigacioacuten ha sido el
desarrollo de estructuras hiacutebridas con capacidad antioxidante (Koufaki 2006)83
actividad que permite en muchos casos restablecer el equilibrio en organismos vivos
frente al exceso de especies generadoras de estreacutes oxidativo cuadro que como ya se
Introduccioacuten
18
mencionoacute estaacute con frecuencia asociado las patologiacuteas conocidas y estudiadas en la
actualidad
El reciente estudio desarrollado por Matos Olea-Azar y colaboradores presenta la
estructura cumarina-resveratrol y diferentes derivados sinteacuteticos los cuales fueron
estudiados mediante diversas teacutecnicas in vitro como resonancia de espiacuten electroacutenico
(REE) capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno (ORAC-FL) y
voltametriacutea ciacuteclica (VC) En esta investigacioacuten se encontroacute que los compuestos
propuestos poseen una buena capacidad antioxidante84
Una investigacioacuten que da cuenta del potencial que posee esta estrategia es la
desarrollada por Kenchappa y colaboradores quienes sintetizaron derivados
cumariacutenicos unidos a pirazol e indenona posteriormente mediante estudios in vitro e
in vivo obtuvieron resultados de su capacidad antioxidante y ademaacutes como agentes
anti-hipergliceacutemicos en un modelo animal proyectaacutendolos como posibles faacutermacos
frente a la diabetes85
Dentro del mismo esquema Krishan y colaboradores
desarrollaron una serie de cumarinas unidas al benzoimidazol el cual es a su vez una
estructura con muacuteltiple y reconocida actividad bioloacutegica proponen a dos compuestos
de la serie como derivados con una buena capacidad antioxidante y anti-inflamatoria
a nivel de mucosa gaacutestrica86
Introduccioacuten
19
Un tipo de derivado hiacutebrido que ha sido estudiado es la cumarina-chalcona El trabajo
realizado por Xi y Liu presenta la siacutentesis de una serie de compuestos (Figura 17)
los que posteriormente son ensayados por distintas metodologiacuteas de determinacioacuten de
capacidad antioxidante concluyendo que estos hiacutebridos son estructuras promisorias
en los que el grupo catecol presente en el esqueleto cumariacutenico o en la chalcona es
capaz de inhibir distintos procesos oxidativos a nivel de ADN87
O O
OH
O
R1
R2
R3
Figura 17 Hiacutebridos chalcona-cumarina con capacidad antioxidante
Peacuterez-Cruz y colaboradores describen el disentildeo siacutentesis y estudio de la capacidad
antioxidante de derivados cumarina-chalcona los que presentaron buena reactividad
frente a distintas especies radicales y capacidad cito-protectora en un modelo celular
animal88
En los estudios mencionados se evidencia el continuo desarrollo que ha tenido el
disentildeo y siacutentesis de compuestos hiacutebridos como nuevos faacutermacos frente a complejas
Introduccioacuten
20
enfermedades multifactoriales Esta tendencia vigente en la actualidad se extiende a
los maacutes variados nuacutecleos estructurales entre ellos la cumarina Este heterociclo
clasificado por algunos autores como ldquoestructura privilegiadardquo debido a la amplia
gama de compuestos que se originan a partir de eacutel es el punto de partida para
diversas propuestas sinteacuteticas enfocadas a generar un producto que posea muacuteltiples
actividades bioloacutegicas de intereacutes terapeacuteutico
Hipoacutetesis y objetivos
21
2 Hipoacutetesis
Los compuestos hidroxicumariacutenicos exhiben conocidas e interesantes propiedades
antioxidantes
Al sustituir la cumarina con los compuestos aacutecido cafeico aacutecido gaacutelico y aacutecido
protocateacutequico se obtienen derivados de naturaleza hiacutebrida aumentando la actividad
de la cumarina frente a las especies reactivas de oxiacutegeno anioacuten superoacutexido radical
hidroxilo radical peroxilo y su capacidad reductora
3 Objetivos
31 Objetivos generales
- Evaluar el comportamiento electroquiacutemico oxidativo de los derivados
cumariacutenicos previamente sintetizados y caracterizados fiacutesicamente
- Evaluar la capacidad antioxidante de los nuevos compuestos derivados de
cumarina y aacutecidos benzoicos frente a distintas especies radicales mediante
diversas teacutecnicas in vitro
Hipoacutetesis y objetivos
22
32 Objetivos especiacuteficos
Objetivos en siacutentesis
- Sintetizar y caracterizar el compuesto precursor 4-clorometil-78-
dihidroxicumarina y los correspondientes derivados de la sustitucioacuten en posicioacuten-
4 con aacutecido cafeico aacutecido gaacutelico y aacutecido 34-dihidroxibenzoico
Objetivos en electroquiacutemica
- Realizar la caracterizacioacuten anoacutedica en medio aproacutetico (NN-dimetilformamida
DMF) de los compuestos por voltametriacutea ciacuteclica (VC) voltametriacutea de pulso
diferencial (VPD)
Objetivos en la determinacioacuten de capacidad antioxidante
- Estudiar la reactividad de los compuestos frente al anioacuten radical superoacutexido O2-
utilizando como teacutecnica voltametriacutea ciacuteclica
- Determinar la reactividad de los compuestos frente al radical peroxilo (ROObull)
obteniendo su iacutendice ORAC-FL
- Determinar la capacidad reductora de hierro (Fe3+
) de los compuestos a traveacutes de
la teacutecnica FRAP
- Estudiar la reactividad frente al radical OHbull mediante la teacutecnica spin trapping
utilizando espectroscopiacutea de resonancia de espin electroacutenica (REE)
Hipoacutetesis y objetivos
23
- Evaluar la capacidad antioxidante celular de los compuestos
- Establecer la existencia de correlacioacuten entre paraacutemetros fisicoquiacutemicos de los
compuestos y su actividad antioxidante
Materiales y meacutetodos
24
4 Materiales y meacutetodos
41 Materiales
411 Reactivos y equipamiento utilizado en siacutentesis
Reactivos
- Aacutecido 34-dihidroxicinaacutemico Merck
- Aacutecido 34- dihidroxibenzoico Sigma-Aldrich
- Aacutecido 345-trihidroxibenzoico Sigma-Aldrich
- Pirogalol Merck
- 4-cloro acetoacetato de etilo Sigma-Aldrich
- NN-dimetilformamida PA J T Baker
- 18-diazabiciclo[540]undec-7-ano (DBU) Sigma-Aldrich
- Carbonato aacutecido de sodio Merck
- Metanol PA JT Baker
- Acetona PA Merck
- Etanol PA Merck
- Cloroformo PA Merck
- Aacutecido sulfuacuterico 98 Merck
- Aacutecido clorhiacutedrico 37 JTBaker
- Anhiacutedrido aceacutetico Merck
- Hidroacutexido de sodio PA Merck
- Solucioacuten etanoacutelica de FeCl3
Materiales y meacutetodos
25
- Acetona d6 Sigma-Aldrich
- Dimetilsulfoacutexido d6 Sigma-Aldrich
- Cloroformo d6 Sigma-Aldrich
- Nitroacutegeno extra puro 99995 Linde Gas Chile SA
Equipamiento
Todo el material de vidrio utilizado fue clase A
- Balanza analiacutetica Precisa 125 A
- Rotavapor Heidolph VV 2000
- Sonicador Elme Transsonic Digital tipo T480H-2
- Agitador magneacutetico placa calefactora Heidolph MR 3002
- Estufa de secado al vaciacuteo Heraeus
412 Reactivos y equipamiento utilizados en electroquiacutemica
Reactivos
- NN-dimetilformamida (DMF) PA Merck
- Hexafluorofosfato de tetrabutil amonio (HFFTBA) Sigma-Aldrich
- Aacutecido 34-dihidroxicinaacutemico Merck
- Aacutecido 34- dihidroxibenzoico Sigma-Aldrich
- Aacutecido 345-trihidroxibenzoico Sigma-Aldrich
- Nitroacutegeno extra puro 99995 Linde Gas Chile SA
Materiales y meacutetodos
26
- Agua purificada (MilliQ) Millipore Merck
Equipamiento
- Estacioacuten de trabajo electroquiacutemica CH Instruments CHI 760c
- Electrodo de carbono viacutetreo CH Instruments d = 3 mm
- Alambre de platino
- Electrodo de referencia AgAgCl (KCl 3 M) CH Instruments
- Aluacutemina 03 μM y 005 μM Buheler
- Balanza analiacutetica Precisa 40SM-200ordf
413 Reactivos y equipamiento utilizados en ensayos frente a especies
radicalarias
Reactivos
- 2-(6-oacutexido-3-oxo-3H-xanten-9-il)benzoato disoacutedico (fluoresceiacutena sal
disoacutedica) Sigma-Aldrich
- 22-azo-bis(2-amidinopropan)diclorhidrato (ABAP) Sigma-Aldrich
- 246-tris(2-piridil)-s-triazina (TPTZ) Sigma Aldrich
- 6-hidroxi-2578-tetrametilcroman-2-aacutecido carboxiacutelico (Trolox) Sigma-
Aldrich
- Peroacutexido de hidroacutegeno al 30
- NN-dimetilformamida PA Sigma-Aldrich
- 55-dimetil-1-pirroline-N-oacutexido (DMPO)
- Acetato de sodio Merck
Materiales y meacutetodos
27
- Tricloruro de hierro (FeCl3) Sigma Aldrich
- Hidroacutexido de sodio Merck
- Fosfato diaacutecido de potasio Merck
- Etanol grado HPLC Merck
- Aacutecido aceacutetico glacial Merck
- N-octanol Merck
- Cloruro de zinc Merck
Equipamiento
- Balanza Precisa 40SM-200ordf
- Lector de microplacas con detector muacuteltiple Synergytrade HT Bio-Tek
Instruments Inc (Winooski VT USA)
- Espectroacutemetro ECS 106 de banda X (985 GHz) equipado con cavidad
rectangular y 50 KHz de modulacioacuten de campo (Bruker Coventry UK)
- WINSIM Software EPR Spectral Simulation for MS-Windows 9x NT
Version 098 copy PEST Public EPR Simulation Tools NIEHS USA
- Alambre de platino
- Espectrofotoacutemetro UV-Visible Specord S600 Analytik Jena
- Equipo generacioacuten agua ultrapura NanoPure Barnstead
Materiales y meacutetodos
28
42 Meacutetodo
421 Procedimientos de siacutentesis
En un primer paso se obtuvo el precursor 4-clorometil-78-dihidroxicumarina
mediante la siacutentesis de Pechmann posteriormente se realizoacute la esterificacioacuten entre el
compuesto halogenado y diferentes aacutecidos orgaacutenicos comerciales (Figura 41) Los
aacutecidos comerciales utilizados en el proceso de siacutentesis fueron los siguientes
aacutecido 34-dixidroxicinaacutemico aacutecido 345- trihidroxibenzoico
(aacutecido cafeico) (aacutecido gaacutelico)
O
OH
OH
HO
aacutecido 34-dihidroxibenzoico
(aacutecido protocateacutequico)
Figura 41 Aacutecidos empleados en la sustitucioacuten de la 4-clorometil-78-
dihidroxicumarina
OH
OH
O
HO
O
OH
OH
HO
OH
Materiales y meacutetodos
29
Todos los compuestos fueron previamente acetilados para proteger los grupos
hidroxilo presentes en sus estructuras para evitar reacciones entre siacute
A Siacutentesis de la 4-clorometil-78-dihidroxicumarina 1
Se mezclaron en proporciones equimolares el pirogalol (31 mmoles) junto con el 4-
cloroacetoacetato de etilo con agitacioacuten constante en un bantildeo de agua-hielo sobre la
mezcla se antildeadieron lentamente 25 mL de H2SO4 (tambieacuten friacuteo) esta solucioacuten se
tornoacute de color rojizo oscuro Se dejoacute reaccionar 1 h
La mezcla de reaccioacuten se agregoacute lentamente sobre un bantildeo de agua-hielo-etanol con
vigorosa agitacioacuten y se obtuvo el producto como un precipitado fino que fue lavado
con abundante agua (a fin de eliminar restos aacutecidos) y purificado por re-cristalizacioacuten
en una mezcla etanol agua obtenieacutendose un soacutelido marfil brillante 1 La ruta
sinteacutetica se presenta a continuacioacuten
Figura 42 Siacutentesis del derivado clorado 1
O
OH
OH O
Cl
HO
OH
OH
OEt
Cl
O O
+
H2SO4
1 h
1
Materiales y meacutetodos
30
B Procedimientos de acetilacioacuten
a) Acetilacioacuten de 4-clorometil-78-dihidroxi-cumarina 2
Se suspendioacute la cumarina clorada (3 g) en 6 mL anhiacutedrido aceacutetico y se antildeadioacute 1 gota
de aacutecido sulfuacuterico La solucioacuten fue agitada con calentamiento (45 degC) por 30 min y se
observoacute el progreso de la reaccioacuten mediante el test de FeCl3 el que indica la presencia
o ausencia de grupos ndashOH fenoacutelicos en solucioacuten El precipitado obtenido 5 se
recristalizoacute en etanol su ruta sinteacutetica se muestra en la Figura 43
Figura 43 Siacutentesis del derivado clorado acetilado 5
b) Acetilacioacuten del aacutecido 34-dihidroxicinaacutemico 6
Seguacuten lo descrito en la literatura89
se disolvioacute el aacutecido 34-dihidroxicinaacutemico (aacutecido
cafeico) en solucioacuten 1 M de NaOH sobre un bantildeo de hielo se agregoacute anhiacutedrido
O
OH
HO O
Cl
Ac2O H2SO4
45 degC 30 min
O
O
O O
Cl
5
O
O
Materiales y meacutetodos
31
aceacutetico y de inmediato se aprecioacute la aparicioacuten de un precipitado amarillo claro que
con el paso del tiempo se tornoacute de color marfil Se dejoacute en estas condiciones con
agitacioacuten vigorosa por 30 min El producto 6 fue filtrado y lavado prolijamente con
agua posteriormente se recristalizoacute en etanol obtenieacutendose un soacutelido blanco brillante
La reaccioacuten global se presenta en la Figura 44
HO
HO
OH
O
O
O O
NaOH 30 min
AcO
AcO
OH
O
6
Figura 44 Siacutentesis del aacutecido cafeico acetilado 6
c) Acetilacioacuten del aacutecido gaacutelico7
Se mezclaron 3 g de aacutecido con 7 mL de anhiacutedrido aceacutetico se antildeadioacute 1 gota de H2SO4
Se agitoacute durante 30 min a 47 degC Posteriormente la mezcla fue enfriada y filtrada al
vaciacuteo El producto 7 soacutelido de color blanco se recristalizoacute en etanol La reaccioacuten
global se presenta en la Figura 45
Materiales y meacutetodos
32
O
HO
HO
OH
OHO
O O
H2SO4 30 min
O
AcO
AcO
OAc
OH
7
Figura 45 Siacutentesis del aacutecido gaacutelico acetilado 7
d) Acetilacioacuten del aacutecido 34-dihidroxibenzoico 8
Se mezclaron 3 g de aacutecido con 6 mL de anhiacutedrido aceacutetico se antildeadioacute 1 gota de H2SO4
Se agitoacute por 30 min a 50 degC Luego se enfrioacute y filtroacute al vaciacuteo El producto 8 soacutelido de
color blanco fue recristalizado en etanol la reaccioacuten global se muestra en la Figura
46
O
OH
OH
OHO
O O
H2SO4 30 min
O
OAc
OAc
OH
8
Figura 46 Siacutentesis del aacutecido 34-dihidroxibenzoico acetilado 8
Materiales y meacutetodos
33
C Siacutentesis de los derivados hiacutebridos Procedimiento general
En base a una variante del procedimiento descrito (Ono y colaboradores 1978)90
los
derivados hiacutebridos se obtuvieron mediante la esterificacioacuten de la cumarina acetilada
5 y el correspondiente aacutecido tambieacuten previamente acetilado (6 7 8) Se disolvioacute el
aacutecido (32 mmoles) en 10 mL de DMF (seca recieacuten destilada) a temperatura ambiente
y se agregoacute el DBU en proporcioacuten equimolar se dejoacute reaccionar por 30 min en un
matraz provisto de codo de desecacioacuten (relleno con CaCl2) y agitacioacuten constante Se
agregoacute la cumarina (32 mmoles) y se aprecioacute el fin de la reaccioacuten tras 35 h a 50 degC
de temperatura La solucioacuten se llevoacute a tdeg ambiente y se hizo precipitar
cuidadosamente agregando agua destilada el soacutelido (9 10 y 11) fue lavado
prolijamente se filtroacute y secoacute
La Figura 47 muestra como ejemplo la ruta sinteacutetica llevada a cabo en la obtencioacuten
del derivado de aacutecido cafeico
Figura47 Siacutentesis del intermediario hiacutebrido derivado del aacutecido cafeico
O
OAc
OAc O
Cl
OAc
OAc
HO
O
+ DBU
DMF seco
O
OAc
OAc O
OAc
OAc
O
O
Materiales y meacutetodos
34
Posteriormente se procedioacute a desproteger los grupos fenoacutelicos en el soacutelido mediante
el procedimiento de desacetilacioacuten El producto crudo fue suspendido en una mezcla
de metanol (8 mL) acetona (12 mL) y solucioacuten saturada de NaHCO3 (14 mL) se
agitoacute a temperatura ambiente bajo nitroacutegeno por 3 h
Finalizada la reaccioacuten la suspensioacuten se concentroacute al vaciacuteo se antildeadioacute HCl en friacuteo
formaacutendose un precipitado claro que se filtroacute y lavoacute con abundante agua
posteriormente fue secado cuidadosamente El soacutelido se lavoacute prolijamente con CHCl3
a ebullicioacuten y fue secado al vaciacuteo de esta forma se obtuvo el producto hiacutebrido La
Figura 48 muestra la ruta de desproteccioacuten empleada
Figura48 Siacutentesis del compuesto hiacutebrido final 9
O
OAc
AcO O
OAc
OAc
O
O N2 tdeg amb
O
OH
HO O
OH
OH
O
O
9
hidroacutelisis baacutesica
Materiales y meacutetodos
35
En la Figura 49 se presenta un resumen de la ruta sinteacutetica para las cumarinas
hiacutebridas obtenidas
HO
O
OH
OH4
OH
OH
HO
O
OH
3
OH
OH
HO
O
2
O
OH
HO O
Cl1
ii
HO
O
OAc
OAc8
OAc
OAc
HO
O
OAc
7
OAc
OAc
HO
O
6
O
OAc
AcO O
Cl5
Figura 49A Ruta de siacutentesis de los compuestos cumariacutenicos i) H2SO4 1 h bantildeo de
hielo ii) NaOH Ac2O 30 min bantildeo de hielo (aacutecido cafeico 6) H2SO4 Ac2O
30 min (cumarina y aacutecidos benzoicos)
O
OH
HO O
Cl
HO
OH
OH
OEtCl
O O
+
1
i
Materiales y meacutetodos
36
HO
OOAc
OAc
OAc
OAc
HO
O
OAc
7
OAc
OAc
HO
O
6
OOH
HO O
OH
OH
O
O
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
9
10
11
OOAc
AcO O
Cl5
iiiiv
8
Figura 49B Ruta de siacutentesis de los compuestos cumariacutenicos iii) DBU DMF (seca)
35 h 50 degC iv) NaHCO3 MeOH acetona tdeg amb 3 h N2
Materiales y meacutetodos
37
422 Procedimiento experimental en electroquiacutemica
i) Celda electroquiacutemica
La celda de trabajo estuvo compuesta por tres electrodos el de trabajo de carbono
viacutetreo y superficie 0076 cm2 electrodo de referencia AgAgCl (3 M KCl) inmerso en
puente salino (DMF + HFFTBA 02 M) y alambre de platino como contra-electrodo
ii) Condiciones de trabajo
Los experimentos se realizaron utilizando como solvente aproacutetico NN-
dimetilformamida (previamente destilada y guardada con tamiz molecular 3 Aring) las
soluciones de trabajo en una concentracioacuten de 2 mM para todos los compuestos
continuamente fueron purgadas con nitroacutegeno extra puro el electrolito soporte
utilizado fue HFFTBA (hexafluorofosfato de tetrabutil amonio) en una concentracioacuten
dos oacuterdenes de magnitud superior a la de la muestra
iii) Teacutecnicas empleadas
En el desarrollo de este trabajo se utilizoacute voltamperometriacutea ciacuteclica (VC) y
voltamperometriacutea de pulso diferencial (VPD)
Materiales y meacutetodos
38
iv) Caacutelculos
El proceso de deconvolucioacuten de las graacuteficas en VC se llevoacute a cabo utilizando el
software Origin Pro 8 SR2 (Origin Lab Corporation USA) Se aplicoacute la funcioacuten
Gaussiana (Ecuacioacuten 41)
119910 = 1199100 + 119860
119908 radic120587 119890
minus2(119909minus119909119888)2
1199082 Ecuacioacuten 41
423 Estudio de generacioacuten de especies radicalarias mediante espectroscopiacutea de
resonancia de espiacuten electroacutenico
La oxidacioacuten electroquiacutemica de los compuestos se realizoacute utilizando las
mismas condiciones de potencial de voltametriacutea ciacuteclica una celda compuesta de
electrodo de trabajo de alambre de platino el medio empleado fue DMF + HFFTBA
como contra-electrodo se utilizoacute alambre de platino La estabilizacioacuten del radical
generado en la oxidacioacuten electroquiacutemica se logroacute empleando el catioacuten quelante Zn2+
el cual es silente a la teacutecnica espectroscoacutepica y forma complejos con el grupo catecol
Se utilizoacute ZnCl2 en concentracioacuten final 3 mM
Materiales y meacutetodos
39
424 Procedimiento experimental en el estudio de actividad frente a especies
radicalarias
4241 Metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno
(oxygen radical antioxidant capacity-fluorescein ORAC-FL)
Se prepararon soluciones stock en etanol para cada compuesto de ellas se obtuvieron
las soluciones de trabajo diluidas en solucioacuten buffer fosfato (pH 74) Se antildeadieron
las aliacutecuotas respectivas de concentraciones crecientes de cada compuesto en los
pocillos de la placa (concentraciones finales entre 02 microM y 109 microM que permitieron
obtener curvas de decaimiento apropiadamente separadas) posteriormente se
adicionoacute la sonda fluoresceiacutena (Figura 410 A) (solucioacuten preparada en buffer pH 74 y
concentracioacuten final 40 nM) y se pre-incuboacute 15 min a 37 degC Finalmente se adicionoacute la
aliacutecuota correspondiente de solucioacuten de 22prime-azobis(2-metiilpropionamidina)
dihidrochloridrato (ABAP) la solucioacuten fue preparada en buffer pH 74 y
concentracioacuten final 18 mM (Figura 410 B) y se llegoacute a un volumen final de 200 microL
La placa fue introducida en el lector y se midioacute el decaimiento de la sonda
fluorescente cada 1 min con agitacioacuten previa a cada medicioacuten Para cada set de
medidas fue determinado el blanco correspondiente que contiene la sonda
fluorescente y el generador de radicales peroxilo (ROObull) Se empleoacute el compuesto
Trolox como antioxidante estaacutendar de referencia (Figura 410 C) utilizaacutendose un set
Materiales y meacutetodos
40
de concentraciones entre los 3 microM y 20 microM y el procedimiento anteriormente descrito
para determinar el decaimiento de la fluorescencia de la sonda
La capacidad de inhibicioacuten expresada como valor de iacutendice ORAC se cuantificoacute
utilizando el valor integrado de aacuterea bajo la curva (ABC) de fluorescencia (Figura
411 donde F0 es el valor medido a tiempo 0 y F es el valor de fluorescencia al final
de la medicioacuten cuando se aprecioacute que el decaimiento es total) La ABC neta se obtuvo
de restar el valor del blanco al valor de cada compuesto (ver Ecuacioacuten 42)
ABC neta = ABC compuesto ndash ABC blanco Ecuacioacuten 42
ONaO O
ONa
O
A
O
HO
OH
O
C
Figura 410 A Sonda fluoresceiacutena B 22prime-azobis(2-metilpropionamidina)
dihidrochloridrato (ABAP) C 6-hidroxi-2578-tetrametilcroman-2-aacutecido carboxiacutelico
(Trolox)
-Cl H2N+
NH2
N
N+NH2 Cl-
NH2
B
Materiales y Meacutetodos
41
Figura 411 Actividad antioxidante ORAC-FL para un compuesto en estudio
Finalmente este valor de ABC neta para cada concentracioacuten se graficoacute con respecto a la
concentracioacuten obtenieacutendose una relacioacuten lineal en el rango de estudio La pendiente de
la regresioacuten de cada compuesto fue dividida por el valor de la pendiente del estaacutendar
Trolox (obtenido de la mima forma descrita para las muestras) este coeficiente es el
mencionado Iacutendice ORAC
Los datos fueron procesados mediante el software Origin Pro 8 SR2 (Origin Lab
Corporation USA) Las mediciones se realizaron en triplicado
0 1000 2000 3000 400000
02
04
06
08
10
ABCneta
Antioxidante
Blanco
F
F0
Tiempo s
Materiales y Meacutetodos
42
4242 Metodologiacutea de determinacioacuten de poder antioxidante de reduccioacuten de hierro
(FRAP)
Preparacioacuten de soluciones
i) Preparacioacuten solucioacuten tampoacuten acetato
Se disolvieron 155 g de acetato de sodio trihidrato (CH3COONamiddot3H2O) en agua
ultrapura se agregaron 8 mL de CH3COOH glacial con agitacioacuten constante y se aforoacute
a 500 mL El pH fue ajustado a 36 con NaOH concentrado
ii) Preparacioacuten de solucioacuten tampoacuten fosfato pH 74
Se mezclaron 80 mL de solucioacuten 01 M de NaOH con 100 mL de solucioacuten 01 M de
KH2PO4 se agitoacute para homogeneizar
iii) Preparacioacuten solucioacuten HCl 40 mM
En un matraz aforado (50 mL) se mezclaron 167 microL de HCl 12 M (37) con agua
ultrapura y se agitoacute hasta homogeneizar
iv) Preparacioacuten de solucioacuten TPTZ
Se pesaron 797 mg de reactivo TPTZ (Figura 412) y se aforoacute a 25 mL con solucioacuten
HCl 40 mM se agitoacute y conservoacute protegido de la luz
Materiales y Meacutetodos
43
N
N
N
N
NN
Figura 412 Reactivo 246-tris(2-piridil)-s-triazina (TPTZ)
v) Preparacioacuten solucioacuten de FeCl3 (20 mM)
Se pesaron 0054 g de FeCl3middot6H2O se aforoacute a 10 mL con agua ultrapura y se agitoacute
constantemente
vi) Preparacioacuten del reactivo FRAP
Se mezcloacute el tampoacuten acetato con solucioacuten TPTZ y solucioacuten feacuterrica en proporcioacuten
1011 se agitoacute y conservoacute al abrigo de la luz
vii) Preparacioacuten de soluciones en estudio
Se mezclaron aliacutecuotas de solucioacuten stock (en etanol) de cada compuesto con tampoacuten
fosfato luego se agitaron y se obtuvieron soluciones en concentraciones entre 15 microM y
58 microM
Materiales y Meacutetodos
44
Ensayo de capacidad reductora
En un frasco aacutembar se mezclaron 150 microL de solucioacuten de muestra con 450 microL de agua
ultrapura y posteriormente 950 microL de reactivo FRAP La solucioacuten se agitoacute e
inmediatamente se tornoacute de color azul lo que indicoacute la reaccioacuten de oxidacioacuten de Fe2+
a Fe3+
en el complejo formado con el reactivo TPTZ Se midioacute el espectro de
absorbancia en el rango del UV-visible a temperatura ambiente considerando el valor
de λmaacutex = 599 nm Los experimentos se realizaron en triplicado los valores obtenidos
para este ensayo se expresan como equivalentes de Trolox 10 microM de muestra
4243 Capacidad de apagamiento del radical hidroxilo (OHbull) mediante la teacutecnica
spin trap
Se realizoacute el ensayo mediante la metodologiacutea de Fenton no cataliacutetico comparando las
sentildeales en el espectro mediante espectroscopia de resonancia de espiacuten electroacutenico
(REE) del aducto DMPO-OH como blanco frente a las sentildeales obtenidas en las
mismas condiciones tras antildeadir los compuestos en estudio Para la generacioacuten del
radical hidroxilo se utilizoacute peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2) y solucioacuten acuosa de NaOH
metodologiacutea que presenta la ventaja de que en ausencia de iones Fe2+
(como en la
metodologiacutea Fenton) se evitoacute la reaccioacuten de quelacioacuten con los grupos catecol presentes
en las estructuras propuestas91ab
Materiales y Meacutetodos
45
-10 -08 -06 -04
Ipa0
O2 + e
- O
2
-
O2
-O
2 + e
-
10 A
E vs Ag|AgCl V
Se prepararon soluciones stock (20 mM en DMF) de cada compuesto en estudio se
tomaron aliacutecuotas de 100 microL y se agregaron 50 microL de NaOH (25 mM) 50 microL de
solucioacuten de 55-dimetil-1-pirroline-N-oacutexido (DMPO) (30 mM) y finalmente 50 microL de
agua oxigenada (30) se agitoacute cuidadosamente se incuboacute por 5 minutos y se midioacute
su espectro Los resultados se expresaron como el porcentaje de inactivacioacuten del
radical hidroxilo
4244 Estudio de reactividad frente a anioacuten radical superoacutexido O2middot -
Se evaluoacute la reactividad de cada compuesto frente al radical anioacuten superoacutexido el que
fue generado electroquiacutemicamente en la superficie del electrodo a traveacutes de la
reduccioacuten del oxiacutegeno molecular disuelto en el medio (Figura 413)
Figura 413 Voltamograma ciacuteclico de la generacioacuten de anioacuten radical superoacutexido
DMF + HFFTBA 02 M en electrodo de carbono viacutetreo
Materiales y Meacutetodos
46
i) Celda electroquiacutemica
La celda estuvo compuesta de tres electrodos el electrodo de trabajo fue carbono
viacutetreo (aacuterea = 003 cm2) el electrodo auxiliar empleado fue Ag|AgCl (KCl 3 M
inmerso en DMF + HFFTBA 02 M como puente salino) y alambre de platino como
contra-electrodo
ii) Teacutecnica empleada
La generacioacuten del radical se realizoacute mediante voltamperometriacutea ciacuteclica (VC) a
velocidad de barrido de 01 Vs en un rango de potencial entre 0 V (inicial) y -1 V
como potencial de inversioacuten de la direccioacuten de barrido (switching) 92
iii) Experimento
Los experimentos se realizaron utilizando como solvente 10 mL de NN-
dimetilformamida (previamente destilada) el electrolito soporte utilizado fue
HFFTBA (hexafluorofosfato de tetrabutil amonio) en concentracioacuten 02 M las
soluciones fueron saturadas con aire continuamente Una vez estabilizada la corriente
se antildeadieron a la celda aliacutecuotas crecientes de solucioacuten stock de cada compuesto
observaacutendose la disminucioacuten en la corriente de pico anoacutedica Ipa0 Una vez obtenidos
los voltamogramas se determinoacute el paraacutemetro adimensional ((Ipa0-Ipa
S) Ipa
0) el que
expresoacute el consumo de la especie radical este valor se graficoacute con respecto a la
concentracioacuten del sustrato cuya relacioacuten fue una regresioacuten lineal De la graacutefica se
Materiales y Meacutetodos
47
obtuvo el valor de concentracioacuten de antioxidante en que la corriente de pico anoacutedico
disminuye en un 50 (IA50)
4245 Estudio de la capacidad antioxidante celular (CAC)
Para evaluar la actividad antioxidante de los compuestos estudiados en un medio
celular se utilizoacute el meacutetodo descrito en la literatura por Wolfe93
Se emplearon ceacutelulas
EAhy 926 (ATCC CRL-2922) las que fueron sembradas con una densidad de
50000 ceacutelulas por pocillo en microplacas de 96 pocillos con medio de cultivo
RPMI 1640 Despueacutes de 24 h fue removido el medio de cultivo y los pocillos
fueron lavados con buffer fosfato salino (PBS) pH 74 Los pocillos fueron tratados
con 20 μM de la sonda DCFH-DA disuelta en RPMI 1640 libre de suero fetal bobino
Posteriormente se agregaron los compuestos en dos concentraciones diferentes 1 μM y
10 μM Luego de transcurrida 1 h de incubacioacuten a 37 degC los pocillos fueron
lavados con PBS Luego de esto se agregoacute ABAP en una concentracioacuten final de
600 μM y se midioacute la fluorescencia generada por la sonda en el multi-lector de placas
a temperatura constante de 37 degC La emisioacuten a 538 nm fue medida con una excitacioacuten
a 485 nm cada 1 min por 1 hora El ensayo se realizoacute en triplicado El valor de
capacidad antioxidante se calcula determinando el aacuterea bajo la curva para la muestra y
el control experimental utilizando la siguiente ecuacioacuten
CAC = 100 ndash (ABCmuestra ABCcontrol) 100 Ecuacioacuten 43
Materiales y Meacutetodos
48
4246 Estudio de hidrofobicidad relativa de los compuestos
La hidrofobicidad de los compuestos se correlaciona con sus coeficientes de reparto y
distribucioacuten (log P para el reparto octanolagua y log D para la distribucioacuten
octanolsolucioacuten tampoacuten pH 74) los que se determinan utilizando teacutecnicas
espectrofotomeacutetricas yo cromatograacuteficas
Para realizar estas experiencias se determina la solubilidad del analito en octanol
saturado con agua y en la solucioacuten tampoacuten pH 74 saturado con octanol Luego se
obtienen las respectivas curvas de calibracioacuten para la concentracioacuten del compuesto en
estas soluciones en funcioacuten de la absorbancia yo aacuterea bajo la curva Se espera que las
curvas de calibracioacuten obtenidas cumplan con el requisito de una linealidad apropiada
Posteriormente se debe evaluar el reparto midiendo la concentracioacuten analiacutetica en la
fase orgaacutenica y acuosa Para la determinacioacuten del reparto estaacute descrita la siguiente
ecuacioacuten
119897119900119892119875119900119888119905119886119892119906119886 = log ([119904119900119897119906119905119900]119900119888119905119886119899119900119897
[119904119900119897119906119905119900]119886119892119906119886) Ecuacioacuten 44
Mientras que para la determinacioacuten de la distribucioacuten se utiliza la siguiente ecuacioacuten
119897119900119892119875119900119888119905119886119892119906119886(119905119886119898119901oacute119899) = log ([119904119900119897119906119905119900]119900119888119905119886119899119900119897
[119904119900119897119906119905119900]119905119886119898119901oacute119899 119901119867 74) Ecuacioacuten 45
Materiales y Meacutetodos
49
Para este estudio se realizoacute la determinacioacuten de tiempos de retencioacuten como medida de
la hidrofobicidad relativa entre compuestos Se utilizoacute una columna C18 ODS Hypersil
una fase moacutevil compuesta de acetonitrilo solucioacuten H3PO4 (6535 vv) bajo
condiciones isocraacuteticas con flujo 1 mLmin volumen de inyeccioacuten 50 microL
4247 Estudio teoacuterico caacutelculo del Iacutendice de Fukui
La optimizacioacuten de estructuras de los compuestos neutros se realizoacute utilizando el
meacutetodo DFTSP-DFT basado en la Teoriacutea de Funcionales de la Densidad (DFT)94-96
Se utilizoacute el funcional hiacutebrido B3LYP el conjunto de bases empleado fue 6-31G(d)
Los caacutelculos se realizaron mediante el software Gaussianrsquo09 Los descriptores locales
se evaluaron a traveacutes de la aproximacioacuten de orbitales condensados Orbitales
Moleculares Frontera (Mulliken MOs)
Resultados y discusioacuten
50
5 Resultados y discusioacuten
51 Siacutentesis de los compuestos
Se presentan a continuacioacuten los resultados de la caracterizacioacuten fiacutesica y
espectroscoacutepica de los compuestos sintetizados durante este trabajo
4-clorometil-78-dihidroxicumarina (1)
1H RMN (DMSO d6 δ ppm) 493 (s 2H -CH2-) 641 (s 1H =CH- cumarina) 686
(d 1Harom Jorto 85) 717 (d 1Harom Jorto 85) 942 (s1H OH) 1022 (s 1H OH)
13C RMN (DMSO d6 δ ppm) 4187 11047 11129 11267 11585 13282 14358
15017 15181 16046 Rendimiento 47 Punto de fusioacuten 202-204 degC Agujas
color marfil PM 2265gmol Foacutermula molecular C10H7O4Cl
4-clorometil-78-diacetilcumarina (5)
1H RMN (DMSO d6 δ ppm) 235 (s 3H -CH3) 241 (s 3H-CH3) 506 (s 2H -
CH2-) 674 (s 1H =CH- cumarina) 739 (d 1Harom Jorto 878) 783 (d 1Harom Jorto
878)13
C RMN (DMSO d6 δ ppm) 1943 1985 3983 4073 11467 11549
11871 12238 12939 14459 14593 14999 1578716751 Rendimiento 68
Punto de fusioacuten 157-159 degC Soacutelido blanco PM 3105 gmol Foacutermula molecular
C14H11O6Cl
Resultados y discusioacuten
51
Aacutecido-34-diacetoxicinaacutemico (6)
1H RMN (acetona d6 δ ppm) 215 (s 3H -CH3) 216 (s 3H CH3) 638-643 (d 1H
Jtrans 159) 717-720 (d 1Harom Jorto 878) 748-750-756 (s Harom y Htrans) 13
C RMN
(acetona d6 δ ppm)1996 2004 11977 12333 12450 12682 13364 14323
14339 14439 16699 16809 16817 Rendimiento 56 Punto de fusioacuten
158-161 degC Soacutelido blanco PM 264 gmol Foacutermula molecular C13H12O6
Aacutecido-345-triacetilbenzoico (7)
1H RMN (acetona d6 δ ppm) 217 (s 6H -CH3) 219 (s 3H -CH3) 767 (s 2H
Harom) 13
C RMN (acetona d6 δ ppm) (2C -CH3 1865) (2C-C=O 1910) (2Carom
12160) 12790 13857 (2C 14337) 16432 16599 16789 Rendimiento 66
Punto de fusioacuten 158-160 degC Soacutelido blanco PM 296 gmol Foacutermula molecular
C13H12O8
Aacutecido 34-diacetilbenzoico (8)
1H RMN (acetona d6 δ ppm) 217 (s 6H CH3) 724-727 (d 1Harom Jorto 85) 774-
775 (d 1Harom) 781-784 (dd 1Harom) 13
C RMN (acetona d6 δ ppm) 1910 1913
(2C 12329) 12453 12729 12838 16487 16699 16729 Rendimiento 61
Punto de fusioacuten 155-158 degC Soacutelido blanco PM 238 gmol Foacutermula molecular
C11H10O6
Resultados y discusioacuten
52
4-metil-(34-dihidroxicinamoato)-78-dihidroxicumarina (9)
1H RMN (DMSOd6 δppm) 541(s 2H -CH2-) 621(s 1H =CH- cumarina) 642-
648 (d 1H Jtrans= 1591) 682-71 (Harom) 758-763 (d 1H Jtrans = 1591) 91 (s -
OH) 94 (s -OH) 97 (s -OH) 102 (s- OH)13
C RMN (DMSO d6 δppm) 6154
10820 11035 11290 11345 11526 11550 11620 12225 12566 13292
14391 14607 14686 14920 15026 15174 16055 16646ESI-MS mz 371
[M+H]+ 369 [M-H]
- 181 [M+H]
+ 163 [M-H2O+H]
+ 145 [M-H2O+H]
+ 135 [M-
HCOOH+H]+ 179 [M-H]
- 161 [M-H2O-H]
- 135 [M-CO2-H]
-Rendimiento 37
Punto de fusioacuten 246-249 degC Soacutelido amarillo opaco PM 37031 gmol Foacutermula
molecular C19H14O8
4-metil-(345-dixidroxibenzoato)-78-dihidroxicumarina ( 10 )
1H RMN (DMSO d6 δ ppm) 546 (s 2H -CH2-) 619 (s 1H =CH- cumarina) 682-
685 (d 1Harom Jorto 8508) 704 (s 2Harom) 709-712 (d 1Harom Jorto 778)13
C RMN
(DMSO d6 δppm) 6192 10821 10914 11041 11295 11533 11885 13292
13949 14394 (2Carom) 14620 15024 15184 16055 16555 16793ESI-MS mz
361 [M+H]+ 359 [M-H]
- 171 [M+H]
+ 153 [M-H2O+H]
+ 125 [M-CO2H+H]
+ 169
[M-H]- 125 [M-CO2-H]
- Rendimiento 46 Punto de fusioacuten descomposicioacuten sobre
230 degC Soacutelido amarillo opaco PM 36027 gmol Foacutermula molecular C17H12O9
Resultados y discusioacuten
53
4-metil-(34-dihidroxibenzoato)-78-dihidroxicumarina (11)
1H RMN (DMSO d6 δ ppm) 548 (s 2H -CH2-) 619 (s 1H =CH- cumarina) 685
(m 2Harom) 71 (d 1Harom) 74 (d 2Harom) 13
C RMN (DMSO d6 δ ppm) 6142
10774 10988 11242 11481 11551 11626 11957 12218 13240 14343
14520 14972 15096 15127 16001 16490 ESI-MS mz 345 [M+H]+ 343 [M-
H]- 137 [M-H2O+H]
+ 109 [M-HCOOH+H]
+ 153 [M-H]
- 108 [M-CO2-H]
-
Rendimiento 73 Punto de fusioacuten descomposicioacuten sobre 250 degC Soacutelido amarillo
opaco PM 34427 gmol Foacutermula molecular C17H12O8
Resultados y discusioacuten
54
52 Estudios de voltametriacutea ciacuteclica y voltametriacutea de pulso diferencial
El proceso de oxidacioacuten electroquiacutemico de los compuestos fue evaluado mediante
voltamperometriacutea de pulso diferencial VPD Los resultados presentaron soacutelo un pico
de oxidacioacuten para los compuestos 1 2 4 y 9 por otra parte el aacutecido gaacutelico 3 y los
hiacutebridos 10 y 11 mostraron dos o maacutes sentildeales poniendo de manifiesto las complejas
reacciones de oxidacioacuten que presentan los grupos -OH en dichas estructuras (Figura
51 A y B)97
Al analizar las sentildeales tanto para los precursores y sus derivados hiacutebridos se encontroacute
que la uacutenica sentildeal anoacutedica del compuesto 9 corresponderiacutea tanto a la oxidacioacuten del
catecol presente en la cumarina 1 (Epa 083 V) como del aacutecido cafeico 2 (Epa 076 V)
(Figura 52 A) ambos compuestos por separado tuvieron potenciales de pico anoacutedico
cercanos los que se solaparon para una dar una sola sentildeal en el derivado 9 (Epa 082
V)
Figura 51 A
Voltamperogramas de pulso
diferencial para los
precursores 1 2 3 y 4 2 mM
en DMF + HFFTBA 02 M
00 03 06 09 12 15 18 21 24
OO H
O H
H O
OOH
OH
HO
OH
OH
OH
O
HO
OOH
OH O
Cl
A
2A
E vs Ag|AgCl V
1
2
3
4
Resultados y discusioacuten
55
Figura 51 B Voltamperogramas de pulso diferencial para los derivados 9 10 y 11
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
En el caso del hiacutebrido 11 derivado del aacutecido protocateacutequico se observaron dos picos de
oxidacioacuten que corresponderiacutean a la oxidacioacuten del catecol cumariacutenico (Epa 083 V) y el
catecol del aacutecido benzoico (Epa 111 V) A diferencia del caso anterior se encontroacute
que las sentildeales anoacutedicas de ambos precursores estuvieron lo suficientemente distantes
como para solaparse como en el caso anterior Considerando que los resultados se
obtuvieron bajo las mismas condiciones experimentales se podriacutea asumir que la sentildeal
a potencial Epa1 081 V corresponde a la oxidacioacuten en el anillo de la cumarina y la
sentildeal en Epa2 094 V corresponde a la oxidacioacuten del catecol presente en el anillo
benceacutenico Para el compuesto 10 se observoacute un comportamiento semejante al descrito
para 11
00 03 06 09 12 15 18 21 24
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OH O O
O
OO H
O H
O H
OOH
OH O
OH
OH
O
O
B
E vs Ag|AgCl V
9
10
11
2A
Resultados y discusioacuten
56
Los experimentos de voltamperometriacutea ciacuteclica se llevaron a cabo a distinta velocidad
de barrido 005 Vs ndash 3 Vs con el objeto de estudiar su influencia sobre la sentildeal de
oxidacioacuten En forma graacutefica para precursores y derivados se observaron pares redox de
comportamiento irreversible debido al evidente desplazamiento del potencial de pico
Epa con respecto al aumento de la velocidad de barrido El valor de ΔEp (Epa -Epc) se
incrementoacute con el aumento en la velocidad lo que indica una disminucioacuten en la
velocidad de transferencia electroacutenica Para los compuestos 1 2 4 y 9 a la velocidad
de barrido estudiada se observoacute al igual que en VPD la aparicioacuten de una uacutenica sentildeal
de oxidacioacuten para todo el rango de velocidad (la que se desplaza a potenciales maacutes
positivos a medida que aumenta la velocidad de barrido) seguida de una sentildeal de
reduccioacuten en el barrido hacia potenciales negativos Para los compuestos 3 10 y 11 se
apreciaron dos sentildeales de oxidacioacuten seguida de la correspondiente sentildeal en el barrido
de reduccioacuten
Para cada par redox se realizaron estudios por segmentos encontraacutendose para los
compuestos 9 y 10 que el pico I (de oxidacioacuten) estaacute relacionado con el pico II (de
reduccioacuten) y para el compuesto 11 las sentildeales I y Irsquo (de oxidacioacuten) estaacuten relacionadas
con el pico II (de reduccioacuten) Esto es indicio de que en el primer barrido se observa el
proceso de oxidacioacuten de los grupos fenoles en el cual se generan especies factibles de
ser reducidas como derivados de tipo quinoacutenico (Figuras 52 a 54)
Resultados y discusioacuten
57
Figura 52A VC para el derivado 9 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 53A VC para el derivado 10 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
-03 00 03 06 09 12 15
A
II
I
OOH
OH O
OH
OH
O
O
100 A
005 Vs
3 Vs
E vs Ag|AgCl V
03 06 09 12 15
B
II
I
E vs Ag|AgCl V
0 V - 13 V
0 V - 06 V
00 03 06 09 12 15 18
A
II
I
I
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
3 Vs
005 Vs
E vs Ag|AgCl V
00 03 06 09 12
B
II
I
E vs Ag|AgCl V
-02 V - 06 V
-02 V - 11 V
Resultados y discusioacuten
58
Figura 54 A VC para el derivado 11 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
En sistemas fenoacutelicos simples como es el caso del catecol o la hidroquinona se ha
estudiado el proceso redox en distintos medios 98-101
planteaacutendose que la oxidacioacuten en
medio aproacutetico deriva en la formacioacuten de la quinona correspondiente viacutea 2e-2H
+
(Figura 55) En esta investigacioacuten se han estudiado estructuras de mayor complejidad
y considerando que en este proceso de oxidacioacuten se ha descrito la presencia de
especies radicales como intermediarios de reaccioacuten es probable que ocurran procesos
de dimerizacioacuten o ataques nucleofiacutelicos por parte de los radicales dando como
resultado la generacioacuten de compuestos diferentes a la moleacutecula de partida (por
ejemplo de mayor peso molecular) Este tipo de comportamiento se puede analizar en
profundidad realizando barridos de potencial consecutivos en VC a baja velocidad de
00 03 06 09 12 15
I
II
I
A
100 A
OHO O
O
OOH
OH
OH
005 Vs
3 Vs
E vs Ag|AgCl V
00 03 06 09 12 15
II
I
IB
E vs Ag|AgCl V
-01 V - 07 V
-01 V - 14 V
Resultados y discusioacuten
59
barrido (005 Vs o menor para observar maacutes detalladamente la reaccioacuten quiacutemica en la
escala de tiempo del experimento) Si fuese el caso se esperariacutea observar la aparicioacuten
de sentildeales nuevas en el segundo barrido de oxidacioacuten que dariacutean cuenta de la
oxidacioacuten de las nuevas estructuras fenoacutelicas generadas
OH
OH-2e- -2H+
2e- 2H+
O
O
Figura 55 Esquema del proceso electro-oxidativo propuesto para el catecol
Se realizoacute la deconvolucioacuten (mediante la funcioacuten gaussiana) sobre las curvas de
oxidacioacuten para los compuestos con el objeto de determinar los valores de corriente de
pico anoacutedica de forma independiente con esto se obtienen valores de corriente y
potencial (principalmente a alta velocidad de barrido) los cuales son maacutes exactos que
los entregados por defecto por el software electroquiacutemico utilizado Las graacuteficas y
caacutelculos correspondientes a la relacioacuten entre los diferentes paraacutemetros analizados se
realizaron considerando los valores de Ipa y Epa para el primer pico oxidativo debido a
que esta sentildeal entrega informacioacuten con respecto a la energiacutea del primer electroacuten cedido
en el proceso de oxidacioacuten etapa que generalmente es lenta y determinante de la
velocidad de reaccioacuten
Resultados y discusioacuten
60
La expresioacuten indicada en la Ecuacioacuten 51102
da cuenta de la relacioacuten entre el potencial
de pico y el logaritmo de la velocidad de barrido para una reaccioacuten electroquiacutemica
irreversible
119864119901 119894119903119903119890119907 = 11986412 + 119887
2[104 minus log (
119887
119863) minus 2119897119900119892119896119891 + 119897119900119892119907] Ecuacioacuten 51
Por tanto de la graacutefica Ep vs logv se puede obtener el valor de la pendiente de Tafel b
que es igual al doble de la pendiente de la recta obtenida
119864119901 119894119903119903119890119907 = 119862119905119890 + 119887
2(119897119900119892119907) Ecuacioacuten 52
La graacutefica de potencial de pico anoacutedico (Epa) vs logv dio como resultado una relacioacuten
de tipo lineal para todos los compuestos el potencial de oxidacioacuten se desplazoacute hacia
valores maacutes positivos con el aumento de la velocidad de barrido lo que indica el
caraacutecter irreversible del proceso oxidativo en este medio En la Figura 56 se presenta
la graacutefica obtenida para el derivado 9 como ejemplo representativo de los resultados
obtenidos
Resultados y discusioacuten
61
Figura 56 Relacioacuten Epa vs logv para el derivado de aacutecido cafeico 9 2 mM en
DMF + HFFTBA 02 M
Los valores obtenidos para la pendiente de Tafel se resumen en la Tabla 51 Los
compuestos 1 y 3 poseen valores de la pendiente de Tafel cercanos al teoacuterico (118
mVdec)103
para un proceso en que la primera transferencia electroacutenica es la etapa
lenta del proceso (por tanto la etapa determinante de la reaccioacuten de electro-oxidacioacuten)
El compuesto 4 presenta un valor de 88 mVdec lo que sugiere que el electrodo estaacute
contaminado103104
o se produce un mecanismo de oxidacioacuten complejo (que implica
una transicioacuten entre la etapa quiacutemica y la transferencia electroacutenica como determinante
de la velocidad)105
De la misma forma los valores encontrados para los derivados 9
(170 mVdec) 10 (134 mVdec) y 11 (140 mVdec) y para el aacutecido cafeico (212
mVdec) indican que en las condiciones experimentales utilizadas la superficie del
18 21 24 27 30 33 36
090
093
096
099
102
105
OOH
OH O
OH
OH
O
O
r = 098638
m = 008548
Ep
a1 (
V)
logv (mV12
s-12
)
Resultados y discusioacuten
62
electrodo se contamina (pasiva)106
con la generacioacuten de especies polimeacutericas debido a
la formacioacuten del radical fenoxilo (ArObull) el cual puede dimerizar y originar diversos
productos de reaccioacuten los cuales se adhieren a la superficie del electrodo
Para cada compuesto se establecioacute la existencia de una relacioacuten de tipo lineal entre el
logaritmo de la corriente de pico anoacutedico y el logaritmo de la velocidad de barrido
(logIpa vs logv) El valor para la pendiente de estas rectas estuvo entre 044 y 056
(Tabla 51) lo que sugiere que el proceso observado es de tipo difusivo
La corriente de pico anoacutedica se puede expresar en funcioacuten de distintos paraacutemetros
experimentales como se indica en la Ecuacioacuten 53102
119868119901 = 301 times 10minus5 119899 (23 119877 119879
119887 119865)
12
11986312 119862 11990712 Ecuacioacuten 53
Donde n es el nuacutemero de electrones transferidos R es la constante de los gases (Jmol
K) T es la temperatura (K) D es el coeficiente de difusioacuten de la especie electro-activa
(cm2s) F es la constante de Faraday (Cmol) b es la pendiente de la ecuacioacuten de
Tafel107
(η = a + b log i) C es la concentracioacuten de la especie electro-activa (molL) y v
es la velocidad de barrido (mVs) Esta expresioacuten indica que la correlacioacuten entre
Ip y vfrac12
da como resultado una recta que seraacute funcioacuten del nuacutemero de electrones n y la
pendiente de Tafel b valores que estaacuten presentes en la pendiente de esta recta
Resultados y discusioacuten
63
Considerando lo anterior se procedioacute a graficar Ipa vs vfrac12
encontraacutendose para todos los
compuestos (Figura 57) una relacioacuten de tipo lineal con valores de r entre 099988 y
099448 se presenta ademaacutes la regresioacuten para el aacutecido protocateacutequico 4 como muestra
del comportamiento encontrado para todos los compuestos con valores de intercepto
que tienden a cero Al observar la Tabla 51 se aprecia que todas las regresiones
poseen una pendiente semejante lo cual da un indicio con respecto al nuacutemero de
electrones y mecanismo involucrados en la reaccioacuten de oxidacioacuten estudiada
Figura 57 Graacutefica para la corriente de pico Ipa vs la raiacutez cuadrada de la velocidad de
barrido Ejemplo de correlacioacuten lineal en el aacutecido protocateacutequico 4 2 mM en DMF +
HFFTBA 02 M
Tomando en cuenta que los valores de C R T y F (Ecuacioacuten 53) son factores
constantes y que los coeficientes de difusioacuten D seraacuten semejantes y del mismo orden
para aquellos compuestos de estructura similar (precursores por una parte y derivados
por otra) se obtiene que la pendiente de la recta obtenida en esta correlacioacuten es un
0 10 20 30 40 50 600
50
100
150
200
250
Ipa (
A)
V12
(mV12
s-12
)
OOH
OH
HO
m = 40 10-6
r = 099988
Resultados y discusioacuten
64
indicador respecto al nuacutemero de electrones involucrados en la reaccioacuten y al valor de b
(relacionado con el mecanismo de oxidacioacuten estudiado)
En el caso de los compuestos precursores se obtuvieron valores de pendientes entre
36bull10-6
y 41bull10-6
(Tabla 51) este rango cercano indica la transferencia del mismo
nuacutemero de electrones en el proceso oxidativo observado en que para la cumarina
clorada 1 el aacutecido cafeico 2 y el aacutecido protocateacutequico 4 corresponde a la uacutenica sentildeal
de oxidacioacuten observada y en el caso del aacutecido gaacutelico 3 es el proceso correspondiente a
la primera sentildeal del voltamograma En la literatura se describen estudios en medio
aproacutetico para compuestos fenoacutelicos como por ejemplo derivados de la cumarina 78-
dihidroxilada 100ab
el aacutecido cafeico101
y la hidroquinona105
que dan cuenta de una sentildeal
en el proceso oxidativo en medio aproacutetico que involucra 2 electrones esto permite
inferir que las sentildeales observadas experimentalmente corresponden a un proceso di-
electroacutenico
Para los derivados 9 10 y 11 se observa que los valores para la pendiente Ipa vs vfrac12 se
encuentran entre 37bull10-6
y 42bull10-6
como se indica en la Tabla 51 Ademaacutes al
comparar estos resultados con los obtenidos para el caso de los precursores se deduce
que estamos frente a un proceso oxidativo que involucra dos electrones Se observa
tambieacuten que no hay cambios con respecto al mecanismo de reaccioacuten si lo hubiese se
esperariacutea encontrar diferencias del doble o superior en los valores encontrados para la
pendiente de la recta ya que eacutesta contiene el factor b (pendiente de la ecuacioacuten de
Tafel) antes mencionado
Resultados y discusioacuten
65
Posteriormente se calculoacute el valor correspondiente al potencial de inicio del proceso
electroquiacutemico (Eonset)108109
Este valor indica el potencial inicial con que el primer
electroacuten es cedido en el proceso oxidativo que tiene lugar en la superficie del
electrodo Se determina como el valor de potencial de interseccioacuten entre las recta
tangentes a la liacutenea base y la corriente de oxidacioacuten para cada velocidad de barrido
aplicada en forma experimental (005 Vs a 3 Vs en este estudio) (Figura 58) Una
vez obtenido este potencial se procede a graficar con respecto al logaritmo de la
velocidad de barrido como se presenta en la Figura 59 Se considera el valor del
intercepto de cada recta Eionset (por lo tanto a una baja velocidad de barrido) el cual
incluye el error inherente a la medicioacuten y por tanto es maacutes confiable (Tabla 51) Se
observa que estos potenciales variacutean entre 050 V y 079 V para el aacutecido gaacutelico 3 y el
aacutecido protocateacutequico 4 respectivamente potencial que da indicio de la factibilidad de
oxidacioacuten siendo el compuesto con un Eionset menor el que se oxida con mayor
facilidad Estos valores de potencial onset encontrados permitiraacuten establecer una
correlacioacuten entre el potencial de oxidacioacuten determinado de esta forma y los resultados
obtenidos en los ensayos de actividad frente a especies radicales llevados a cabo en
medio aproacutetico (seccioacuten 6)
Resultados y discusioacuten
66
Figura 58 Determinacioacuten graacutefica del valor de Eonset VC del precursor 1 01 Vs
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 59 Relacioacuten Eonset vs logv para los compuestos estudiados
-05 00 05 10 15 20
20 A
Eonset
E vs Ag|AgCl (V)
15 18 21 24 27 30 33 3606
07
08
09
10
11
12
OOH
OH
HO
OOH
OH
HO
OH
OH
OH
O
HO
OHO O
O
OOH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OOH
OH O
OH
OH
O
O
OOH
HO O
Cl
Eon
set
(V)
logv (mV12
s-12
)
Resultados y discusioacuten
67
Tabla 51 Paraacutemetros experimentales para los compuestos Determinaciones en VC
2 mM DMF + HFFTBA 02 M
Compuesto
119837119845119848119840119816119849119834120783
119837119845119848119840119855 (microAmVs
-1)
119837119816119849119834120783 119837119855120783120784
(microAmV12
s-12
)
119837119812119849119834120783
119837119845119848119840119855
(mVdec)
119835 = 120784 119837119812119849119834120783
119837119845119848119840119855
(mVdec)
Eionset
(mV)
056 36bull10-6
61 122 059
053 41bull10
-6 106 212 059
048 36bull10-6
55 110 050
O
OH
OH
HO
052 41bull10-6
44 88 079
047 40bull10-6
85 170 064
049 37bull10-6
67 134 075
044
42bull10-6
70 140 058
Con el objeto de recabar mayor informacioacuten con respecto al mecanismo de reaccioacuten
involucrado en los procesos oxidativos en estudio en base a los resultados obtenidos
OHO O
O
OOH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
O
OH
OH O
OH
OH
O
O
OOH
OH
HO
OH
OH
OH
O
HO
O
OH
HO O
Cl
Resultados y discusioacuten
68
en VC se realizoacute la graacutefica (Ipa v12
) vs v12
para los compuestos precursores 1 2 3 y
4 (escogidos por poseer un grupo catecol y ser estructuras de menor complejidad que
los derivados 9 10 y 11) Estas graacuteficas de las que se presenta el ejemplo del aacutecido
como muestra (Figura 510) presentaron una relacioacuten de tipo lineal en la que la
pendiente negativa obtenida sugiere que la reaccioacuten observada implica un mecanismo
de tipo EC considerando los estudios mencionados para compuestos fenoacutelicos
ampliamente descritos en la literatura100101105109
y el criterio de diagnoacutestico
mencionado por Pletcher y colaboradores111
Figura 510 Correlacioacuten (Ipa v12
) vs v
12 para el precursor aacutecido protocateacutequico 4
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
21 28 35 42 49 5626
28
30
32
34O
OH
OH
HO
r = -099302
V12
(mV12
s-12
)
Ipa
V12 (
A
mV
12s-1
2)
Resultados y discusioacuten
69
Diversos estudios proponen la presencia de mecanismos concertados para los procesos
redox de compuestos de tipo fenoacutelico los cuales implican la presencia de
intermediarios radicalarios y reacciones donde la transferencia de un protoacuten y un
electroacuten ocurren de forma acoplada dentro de un mismo paso Este concepto nace en la
deacutecada de 1990 a partir de los trabajos publicados por Biczoacutek y colaboradores112113
El estudio de este tipo de reacciones principalmente en derivados fenoacutelicos es de
relevancia debido al rol que eacutestos desempentildean en diferentes sistemas bioloacutegicos tanto
por su reconocida capacidad antioxidante como se evidencia en la investigacioacuten
realizada por Nakayama y colaboradores con respecto a derivados polifenoacutelicos y el
mecanismo de reaccioacuten propuesto de tipo PCET (Proton Concerted Electron Transfer)
frente al anioacuten superoacutexido114
o como en el caso de estudio de las reacciones de
transferencia electroacutenica que involucran al aminoaacutecido tirosina115ab
y otros co-factores
que forman parte esencial del proceso fotosinteacutetico que se lleva a cabo en estructuras
vegetales (Fotosistema II)116
En la deacutecada pasada los aportes a la investigacioacuten sobre el tema se tornaron maacutes
profundos y sistemaacuteticos permitiendo el modelamiento teoacuterico y anaacutelisis de este tipo
de mecanismos Debido al intereacutes concerniente a la obtencioacuten de modelos racionales
de sistemas bioloacutegicos los estudios realizados en medio proacutetico son variados como la
serie de derivados fenol-imidazol sintetizados y caracterizados por Markle y
colaboradores117
quienes entre diversos factores analizan el efecto del sustituyente
sobre el enlace O-H Otros autores como Saveacuteant Costentin y colaboradores han
abordado este toacutepico en diferentes publicaciones proponiendo distintos mecanismos
Resultados y discusioacuten
70
dependientes del pH y composicioacuten de la solucioacuten de trabajo (con buffer o sin eacutel)118
En trabajos posteriores plantean un estudio teoacuterico de modelamiento en sistemas de
tipo amino-fenol enfocados en el mencionado Fotosistema II119
y frente al sistema
enzimaacutetico superoacutexido dismutasa120
Rhile y colaboradores describen la siacutentesis
caracterizacioacuten y estudios de oxidacioacuten tanto quiacutemica como electroquiacutemica (en medio
aproacutetico acetonitrilo) de una serie de fenol-aminas junto con un anaacutelisis teoacuterico del
sistema evidenciaacutendose la presencia de especies radicales intermediarias121
junto con
valores entre 16 a 28 para la relacioacuten de efecto isotoacutepico cineacutetico (KI = kHkD) que se
estima como criterio para considerar un mecanismo concertado122
El estado del arte con respecto a los distintos mecanismos electro-oxidativos descritos
para los derivados fenoacutelicos indica que la determinacioacuten de una ruta en particular en
este proceso se puede establecer mediante estudios de naturaleza tanto experimental
como teoacuterica La obtencioacuten de paraacutemetros termodinaacutemicos como la energiacutea libre de
Gibbs el estudio de efecto isotoacutepico y la determinacioacuten de constantes de velocidad en
electroquiacutemica entre otros permiten discriminar entre las diferentes viacuteas en que se
puede llevar a cabo la electro-oxidacioacuten de fenoles
Resultados y discusioacuten
71
53 Estudio de generacioacuten de especies radicalarias mediante espectroscopia de
resonancia de espiacuten electroacutenico (REE)
A fin de evidenciar la existencia de posibles intermediarios radicalarios en el proceso
electro-oxidativo de los fenoles previamente estudiados a traveacutes de las teacutecnicas
electroquiacutemicas se procedioacute a oxidar los derivados 9 10 y 11 y medir in situ su
espectro REE Se utilizoacute la teacutecnica descrita por Le Nest y colaboradores99
en que se
describe el estudio de estructuras flavonoides polifenoacutelicas en eacutel se utiliza la
quelacioacuten con Zn2+
lo que permitioacute la estabilizacioacuten del radical formado y su posterior
estudio En primer lugar desde un punto de vista cualitativo se observoacute para cada
compuesto un evidente cambio de color en las soluciones electrolizadas las que se
tornaron de color amarillo intenso y maacutes oscuro que las soluciones de trabajo
originales lo que sugiere que tras la electroacutelisis se forma un compuesto nuevo
diferente al de partida como se esperaba En la Figura 511A-C se presentan los
espectros obtenidos junto con las respectivas simulaciones realizadas
Resultados y discusioacuten
72
Figura 511A Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido cafeico 9 estabilizado con Zn2+
en DMF + HFFTBA
(izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color
rojo)
Figura 511B Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido gaacutelico 10 estabilizado con Zn2+
en DMF + HFFTBA
(izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color
rojo)
3440 3450 3460 3470 3480 3490
O
OH
HO O
OH
OH
O
OA
Campo Magneacutetico G
3440 3450 3460 3470 3480 3490
OHO O
O
O
OH
OH
OH
OH
B
Campo Magneacutetico G
Resultados y discusioacuten
73
Figura 511C Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido protocateacutequico 11 estabilizado con Zn2+
en DMF +
HFFTBA (izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der
en color rojo)
Concordante con el resultado esperado la sentildeal espectral indica la presencia de una
especie radicalaria como intermediario de la electro-oxidacioacuten de los grupos catecol
presentes en los tres derivados en estudio
En la simulacioacuten realizada para el derivado 9 se observa el acoplamiento hiperfino de
tres aacutetomos de hidroacutegeno con los siguientes valores de constantes 132 G 098 G y
03 G que seriacutea indicio del proceso oxidativo que ocurre en el catecol del anillo
benceacutenico (Tabla 52) ya que estos valores coinciden con una interaccioacuten entre los tres
protones del anillo benceacutenico en posicioacuten 2 5 y 6 En el caso de los compuestos 10
y 11 se encontraron dos constantes de acoplamiento hiperfino lo que indica la
3440 3450 3460 3470 3480 3490
OHO O
O
OOH
OH
OH
C
Campo Magneacutetico G
Resultados y discusioacuten
74
interaccioacuten entre dos protones que seriacutean aquellos en posicioacuten 5 y 6 del anillo
cumariacutenico
Tabla 52 Constantes de acoplamiento hiperfino para los derivados polifenoacutelicos
Valores en Gauss
Compuesto aH1 G aH2 G aH3 G
132 098 030
215 156 -
235 122 -
Estos resultados concuerdan ademaacutes con lo descrito en la literatura con respecto a la
oxidacioacuten de grupos fenoacutelicos lo que permite inferir un posible mecanismo electro-
oxidativo para los derivados en estudio
O
OH
OH O
OH
OH
O
O
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
Resultados y discusioacuten
75
54 Resultados y discusioacuten de los estudios de reactividad frente a especies
radicalarias
En este punto de la investigacioacuten el objeto de estudio fue evaluar el comportamiento
de las nuevas estructuras previamente sintetizadas frente a diferentes especies
radicalarias de amplio intereacutes bioloacutegico radical peroxilo (ROObull) radical hidroxilo
(OHbull) anioacuten radical superoacutexido (O2-) junto con determinar la capacidad reductora de
los compuestos Cada ensayo fue escogido con miras de abordar el tema de la
capacidad antioxidante desde las posibilidades que permiten las experiencias de tipo in
vitro
541 Metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno
(oxygen radical antioxidant capacity-fluorescein ORAC-FL)
El estudio de especies reactivas de oxiacutegeno y nitroacutegeno asociadas a los procesos
oxidativos requiere en algunos casos del uso de compuestos denominados ldquosondasrdquo
En la teacutecnica de fluorescencia es posible implementar este tipo de metodologiacutea debido
a sus caracteriacutesticas de sensibilidad especificidad y simplicidad en la obtencioacuten de
datos convirtieacutendose en una herramienta uacutetil y ampliamente utilizada a la hora de
obtener una buena aproximacioacuten en la determinacioacuten de actividad frente a especies
EROsERNs123
Resultados y discusioacuten
76
En el caso de la metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno
(ORAC) los primeros trabajos que dan cuenta de su uso fueron descritos en la deacutecada
de 1990 a partir de la investigacioacuten de Cao y colaboradores124
En este trabajo los
autores describen la teacutecnica como un meacutetodo simple y confiable para determinar
capacidad antioxidante en serum humano en pequentildeas cantidades de muestra (del
orden de los microL) utilizando como sonda la β-ficoeritrina (proteiacutena aislada del alga roja
unicelular Porphyridium cruenturn) debido a su fluorescencia sensible a los cambios
conformacionales en su estructura en ensayos frente al radical peroxilo125
En el
desarrollo posterior Ou y colaboradores126
proponen una mejora a la teacutecnica
cambiando la sonda proteica por el compuesto fluoresceiacutena debido a su mayor foto-
estabilidad y para evitar interacciones proteiacutena-polifenol (hidrofoacutebicas y puentes de
hidroacutegeno) junto con ello realizaron la validacioacuten del meacutetodo Esta sonda es la
utilizada actualmente para este ensayo el cual es ampliamente utilizado en el estudio
de polifenoles y sus derivados127-128ab
en diferentes alimentos y bebidas129130
muestras bioloacutegicas de distinta iacutendole131
por mencionar algunos ejemplos
Para efectos de esta investigacioacuten se espera obtener un perfil de comportamiento de
cada uno de los compuestos frente al radical peroxilo (ROObull) que permita distinguir el
aporte que significa cada sustitucioacuten realizada al anillo cumarina con diferentes
grupos fenoacutelicos Cabe mencionar que las longitudes de onda maacuteximas (λmaacutex) de
absorbancia en el rango UV-visible para los compuestos ensayados estuvieron en un
rango entre los 203 nm y 329 nm En este estudio se obtuvieron los perfiles cineacuteticos
Resultados y discusioacuten
77
de consumo de la sonda fluoresceiacutena (con valores de 485525 nm para su absorcioacuten y
emisioacuten respectivamente) por induccioacuten de los radicales peroxilo (originados por
efecto de la termoacutelisis del azo-compuesto ABAP a 37 degC) A partir de estos perfiles de
decaimiento de la sonda a distintas concentraciones de compuestos antioxidantes (5 en
total) se obtuvieron curvas adecuadamente separadas como se muestra en la Figura
512 donde se muestran los resultados para el compuesto 11 como ejemplo
representativo del ensayo Posteriormente se determina para cada concentracioacuten el aacuterea
neta bajo la curva la que es graficada con respecto a las concentraciones utilizadas La
Figura 513 presenta relacioacuten lineal entre el aacuterea neta bajo la curva con respecto a la
concentracioacuten del compuesto 11 como ejemplo la que fue determinada para cada
derivado
Figura 512 Curvas para el consumo de la sonda fluoresceiacutena para un set de
concentraciones del compuesto 11
0 2000 4000 6000
02
04
06
08
10
F
F0
Tiempo (s)
control
16 M
12 M
081 M
045 M
020 M
Resultados y discusioacuten
78
Las curvas obtenidas en esta parte del experimento muestran la reaccioacuten de
competencia entre el radical y el antioxidante (el cual protege a la fluoresceiacutena del
proceso de oxidacioacuten) Posterior al procedimiento anteriormente descrito se obtuvo el
iacutendice ORAC para cada compuesto que se resume en la Tabla 54
Figura 513 Graacutefica de aacuterea neta bajo la curva ABC vs concentracioacuten del derivado 11
En este ensayo los compuestos hiacutebridos propuestos superaron en cuanto al valor de
iacutendice ORAC a la cumarina precursora 1 En los tres casos se pudo observar valores
superiores de casi el doble para el compuesto 10 y bordeando un ORAC casi tres veces
mayor en los compuestos 9 y 11 del valor obtenido para su precursor Estos resultados
evidenciaron un incremento en la capacidad antioxidante al que posee la cumarina de
manera independiente debido a la inclusioacuten de los derivados de aacutecidos
hidroxibenzoicos e hidroxicinaacutemico en su estructura (Tabla 53)
0 1 2 3 4 50
1000
2000
3000
4000
r = 099309
AB
C n
eta
Concentracioacuten (mM)
Resultados y discusioacuten
79
Tabla 53 Valores experimentales de iacutendice ORAC-FL para los compuestos
estudiados
Compuesto iacutendice ORAC-FL
(plusmnSD)
1 091 plusmn 010
2 347 plusmn 010
3 391 plusmn 009
4 069 plusmn 001
9 239 plusmn 003
10 174 plusmn 005
11 262 plusmn 004
Trolox 1
Por otra parte los valores del iacutendice ORAC de la serie fueron superiores al estaacutendar
Trolox con excepcioacuten de los compuestos 1 (cumarina de partida) y 4 (aacutecido
protocateacutequico) Para el caso de la cumarina eacutesta tuvo un valor ORAC menor a 1 En
el caso del compuesto 4 la ostensible diferencia (5 veces menor) con su homoacutelogo
aacutecido cafeico 2 deriva de la presencia del doble enlace en esta estructura aunque
ambos aacutecidos poseen igual cantidad de grupos ndashOH y en igual posicioacuten en el anillo
aromaacutetico la insaturacioacuten le confiere maacutes posibilidades de deslocalizacioacuten electroacutenica
debido a la mayor cantidad de estructuras resonantes posibles y por lo tanto mayor
Resultados y discusioacuten
80
estabilidad al formarse la especie radicalaria correspondiente en la reaccioacuten frente el
ABAP Al observar el valor obtenido para el aacutecido gaacutelico 3 se obtuvo un iacutendice
ORAC cercano al del aacutecido cafeico y aunque carece de la insaturacioacuten presente en el
derivado cinaacutemico posee en su defecto un grupo ndashOH adicional en posicioacuten 5 del
anillo aromaacutetico el cual aportoacute adicionalmente a su capacidad antioxidante (lo que no
ocurrioacute en el caso del aacutecido protocateacutequico 4)
Se observa que el aacutecido dihidroxibenzoico 4 que arrojara un valor 069 presenta un
incremento de 37 veces en su valor ORAC-FL al estar incorporado en el heterociclo
cumariacutenico En este caso se presentoacute un fenoacutemeno de sinergia positiva ya que ambos
compuestos cumarina 1 y aacutecido protocateacutequico 4 aumentaron su valor de ORAC-FL
pasando de un valor 091 y 069 de forma individual respectivamente a formar un
derivado que presentoacute un valor de ORAC-FL igual a 262 Al observar los valores
totales en los derivados 9 y 10 obtenidos no correspondieron a la sumatoria de los
iacutendices individuales de sus precursores este resultado indica que estuvo ausente el
fenoacutemeno de sinergia
Para los nuevos compuestos (9 10 y 11) se observoacute un incremento del valor de
ORAC-FL con respecto a la cumarina precursora 1 Por lo tanto la inclusioacuten delas
estructuras fenoacutelicas en el heterociclo cumariacutenico generoacute la obtencioacuten de nuevos
derivados con una mayor capacidad antioxidante en esta metodologiacutea de esta forma se
obtuvo un aporte a la reactividad de la cumarina 1
Resultados y discusioacuten
81
Los resultados obtenidos en este ensayo dan cuenta de la actividad que presentaron los
compuestos tanto precursores como derivados frente a la especie radical ROObull Un
punto importante a considerar es que este experimento ndashindependientemente de ser un
ensayo in vitro- se lleva a cabo en un medio buffer a pH 74 y a una temperatura
controlada de 37 degC lo que permite obtener una primera aproximacioacuten con respecto a
lo que seraacute la actividad de los compuestos en un medio bioloacutegico La sustitucioacuten en el
anillo cumariacutenico generoacute nuevos compuestos que superaron su capacidad antioxidante
sin embargo desde el punto de vista de los precursores aacutecidos (cafeico y gaacutelico) su
actividad se vio mermada tras la sustitucioacuten fenoacutemeno que se discute en la seccioacuten 6
La secuencia de actividad obtenida para los derivados y sus precursores fue 3 gt 2 gt 11
gt 9 gt 10 gt 1 gt 4
Junto con el ensayo anteriormente detallado se procedioacute a determinar la cantidad de
radicales que reaccionan con el compuesto antioxidante relacionando la concentracioacuten
de antioxidante aplicado la estequiometriacutea de la reaccioacuten y la velocidad de generacioacuten
de radicales peroxilo a 37 degC como se expresa en la siguiente ecuacioacuten (Burton y
colaboradores 1981)132
120591 = 119899 [119860119903119874119867]
119877119894 Ecuacioacuten 54
Resultados y discusioacuten
82
donde τ es el tiempo de induccioacuten (tiempo en el que la sonda es protegida de los
radicales peroxilo por el antioxidante) n es el valor asociado a la estequiometriacutea de la
reaccioacuten correspondiente a la cantidad de moleacuteculas de radical ROObull inactivadas por
moleacutecula de compuesto antioxidante [ArOH] es la concentracioacuten de antioxidante y Ri
es la velocidad de generacioacuten de radical peroxilo la cual estaacute directamente relacionada
con la concentracioacuten de ABAP utilizada en el ensayo (18 mM) y se determina seguacuten la
expresioacuten133
Ri = 136 bull 10-6
[ABAP] Ecuacioacuten 55
Dadas las condiciones experimentales empleadas el valor de Ri es 147 microMmin Los
resultados obtenidos del valor de la pendiente (regresioacuten lineal Ecuacioacuten 54) se
resumen en la Tabla 54
Todos los compuestos (precursores y derivados) presentan valores de n superiores a
los esperados donde en el caso extremo se tiene que una moleacutecula de aacutecido gaacutelico
estariacutea consumiendo 14 moleacuteculas de radical peroxilo resultado que es mucho mayor
al esperado Los aparentes altos valores de n como estequiometriacutea de la reaccioacuten
(n = 3 hasta n = 14) sugieren la presencia de reacciones asociadas de mayor
complejidad en las que estariacutea presente el radical alcoxilo (RObull)134
el cual se forma
por descomposicioacuten del radical peroxilo que posee una vida media del orden de los
segundos en comparacioacuten con el radical alcoxilo con una vida media del orden de los
10-6
s (y es maacutes reactivo) lo que explica esta diferencia en la estequiometria
Resultados y discusioacuten
83
Tabla 54 Valores calculados para el factor estequiomeacutetrico n
Compuesto na(plusmnSD) n
1 28 plusmn 03 3
2 39 plusmn 01 4
3 141 plusmn 14 14
4 24 plusmn 01 3
9 58 plusmn 04 6
10 49 plusmn 01 5
11 86 plusmn 01 9
a Valores calculados en triplicado
Este fenoacutemeno se ha encontrado en investigaciones previas realizadas en derivados
cumariacutenicos135
y fue descrito por Lissi y colaboradores el que se puede encontrar
ademaacutes en experimentos en los que se utiliza la sonda rojo de pirogalol (ORAC-
PGR)136137
Resultados y discusioacuten
84
542 Metodologiacutea de capacidad reductora de hierro en plasma (FRAP)
Esta metodologiacutea desarrollada por Benzie y Strain (1996)138
se propuso como una
medida de la capacidad reductora (asociada a una buena capacidad antioxidante)
enfocada a investigar procesos de estreacutes oxidativo en fluidos bioloacutegicos
Posteriormente se ha extendido al estudio de diversas matrices como extractos de
plantas medicinales139
alimentos140
compuestos puros141
por mencionar algunos
ejemplos
En este ensayo se obtuvieron los valores de la capacidad reductora de los compuestos
polifenoacutelicos la que se aprecia cualitativamente a traveacutes de la formacioacuten del complejo
de Fe2+
de color azul (Figura 514) Esta metodologiacutea involucra la reaccioacuten redox
entre el agente reductor (en este caso los derivados cumariacutenicos) y el oxidante (la sal
feacuterrica) es considerada como aproximacioacuten con respecto a la capacidad de mantener el
estatus redox dentro de la ceacutelula
En primer lugar se observoacute un comportamiento semejante al ensayo ORAC-FL en
cuanto a la tendencia que presentaron los compuestos en su capacidad reductora de
hierro lo que indica una baja probabilidad de que en este ensayo ocurriese el
fenoacutemeno de quelacioacuten propio de los catecoles La Tabla 55 presenta los datos
experimentales obtenidos
Resultados y discusioacuten
85
NN
NN
Fe 3+N
N
N
N
N
N
NN
NN
NN
Fe2+N
N
N
N
N
N
NN
Antioxidante
amarilloazul
[Fe(III) (TPTZ)2]3+ [Fe(III) (TPTZ)2]2+
Figura 514 Esquema para la reaccioacuten entre el complejo de Fe3+
y el compuesto
antioxidante reductor
Los compuestos 9 10 y 11 presentaron una mejor capacidad reductora frente a su
precursor cumariacutenico 1 Esto se explica debido a la presencia de un mayor nuacutemero de
grupos -OH presentes en las nuevas estructuras propuestas capaces de transferir
electrones y reducir la sal feacuterrica como se menciona en el trabajo de Pulido y
colaboradores142
quienes estudian una serie de polifenoles mediante esta teacutecnica
sentildealando que ademaacutes del nuacutemero de hidroxilos presentes la presencia de dobles
enlaces conjugados en el esqueleto como parte de las caracteriacutesticas estructurales
responsables de un aumento en la capacidad reductora en polifenoles
Resultados y discusioacuten
86
Tabla 55 Valores experimentales obtenidos para los compuestos en estudio ensayo
FRAP en equivalentes de Trolox10 microM de muestra
En el derivado 11 se presenta una interaccioacuten de tipo sineacutergica con respecto a los
resultados individuales de cada precursor habieacutendose obtenido un valor FRAP de
1302 y 868 equiv Trolox 10 microM de muestra para 1 y 4 respectivamente y para el
derivado final un valor de 2624 equiv Trolox 10 microM de muestra
Del mismo modo que en el ensayo anterior se observa que la sustitucioacuten en el anillo
cumariacutenico con los distintos grupos aacutecidos incrementa su potencial como especie
reductora mientras que en el caso del aacutecido cafeico y gaacutelico se aprecia una
disminucioacuten de 13 y 15 veces respectivamente en su capacidad reductora tras la
esterificacioacuten
Compuesto equiv Trolox 10 microM muestra
(plusmnSD)
1 1302 plusmn 197
2 2727 plusmn 321
3 4768 plusmn 215
4 868 plusmn 93
9 2052 plusmn 186
10 3182 plusmn 681
11 2624 plusmn 335
Resultados y discusioacuten
87
Los resultados obtenidos para esta teacutecnica entregan informacioacuten acerca de la capacidad
reductora relativa para el conjunto de compuestos ensayados capacidad que estaacute
relacionada con su actividad antioxidante Se obtuvo un orden relativo para
precursores y derivados como sigue 3 gt 10 gt 2 gt 11 gt 9 gt 1 gt 4 Con respecto a la
disminucioacuten de actividad para los aacutecidos mencionados sugiere que esta capacidad
ademaacutes del nuacutemero de ndashOH presentes estariacutea relacionada con el sustituyente ndashCOOH
que se transforma en un grupo eacutester (ver seccioacuten 6)
543 Capacidad de inactivacioacuten del radical OHmiddot teacutecnica Spin Trapping
Esta teacutecnica no destructiva permite la deteccioacuten e identificacioacuten de especies
paramagneacuteticas (con electrones desapareados) en distintas matrices El fenoacutemeno de
resonancia de espiacuten electroacutenico fue descubierto y descrito en la deacutecada de 1940 por
Zavoisky143
en sus estudios basados en sales de manganeso en distintos medios Su uso
y aplicaciones se han diversificado a numerosas aacutereas como en la determinacioacuten de
capacidad antioxidante en alimentos144
en el anaacutelisis del proceso oxidativo en
liacutepidos145
en el estudio de enfermedades parasitarias146
El creciente intereacutes de la
teacutecnica en ciencias biomeacutedicas radica en el hecho de que esta espectroscopia permite
discriminar diferentes especies radicales de intereacutes bioloacutegico estrechamente
relacionadas con el estatus redox de la ceacutelula147
cuyo desbalance se traduce en cuadros
de estreacutes oxidativo148
Resultados y discusioacuten
88
En este estudio se determinoacute la capacidad de los compuestos propuestos para inactivar
la especie radicalaria OHmiddot
mediante la teacutecnica spin trapping metodologiacutea basada en
establecer la competencia de reaccioacuten entre los antioxidantes propuestos y el spin trap
DMPO El radical se generoacute a traveacutes de la reaccioacuten de ldquoFenton no cataliacuteticordquo
(Ecuacioacuten 56) metodologiacutea que permite la generacioacuten del radical OHbull en medio
baacutesico en ausencia del ioacuten Fe como catalizador91ab
211986721198742 + 119874119867minus rarr 119874119867∙ + 1198742minus + 21198672119874 Ecuacioacuten 56
En un primer set de experimentos se procedioacute a realizar la experiencia utilizando
DMSO como solvente Se descartoacute esta opcioacuten debido a que resultoacute complejo
observar un patroacuten claro en el blanco y poder asiacute discriminar las nuevas sentildeales
espectrales a partir de la adicioacuten de los compuestos en estudio
En primer lugar se determinoacute el blanco experimental que indica la reaccioacuten de
inactivacioacuten del radical mediante el compuesto spin trap DMPO Posteriormente se
ensayaron los derivados hiacutebridos y sus precursores sinteacuteticos en dos concentraciones
033 mM y 33 mM En el caso de los experimentos realizados a la menor
concentracioacuten se aprecioacute que la disminucioacuten de la sentildeal del blanco fue miacutenima para los
siete compuestos y no se observoacute un cambio significativo en el espectro como para
obtener resultados concluyentes Considerando lo anterior los experimentos se
Resultados y discusioacuten
89
realizaron con concentracioacuten del orden de los 3 mM obtenieacutendose asiacute datos
satisfactorios en cuanto a la inactivacioacuten del radical y la posibilidad de realizar
caacutelculos sobre este valor El valor de inactivacioacuten del radical hidroxilo se calcula a
traveacutes de la disminucioacuten en la intensidad de las sentildeales al adicionar cada derivado En
cada espectro se aprecia el perfil hiperfino compuesto por cuatro liacuteneas caracteriacutesticas
correspondientes al aacutetomo de nitroacutegeno e hidroacutegeno del spin-aducto formado por
[DMPO-OH] con valores de aN y aH alrededor de 15G lo que concuerda con lo
descrito en la literatura149
para esta reaccioacuten y el espectro simulado que se presenta en
la Figura 515 El cambio experimental tras la adicioacuten de los compuestos se presenta
en color rojo (Figura 516 A-G)
N+
O-
+ OHN
O
OH
Figura 515 Espin aducto generado por la inactivacioacuten del radical OHbull y su espectro
simulado (derecha)
Resultados y discusioacuten
90
Figura 516 A Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto 4-clorometil-78-dihidroxicumarina 1 B Espectro REE de inactivacioacuten del
radical hidroxilo con adicioacuten del compuesto aacutecido cafeico 2
Figura 516 C Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto aacutecido gaacutelico 3 D Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con
adicioacuten del compuesto aacutecido 34-dihidroxi benzoico 4
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
B
Campo Magneacutetico G
compuesto 2
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
C
Campo Magneacutetico G
compuesto 3
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
D
Campo Magneacutetico G
compuesto 4
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
A
Campo Magneacutetico G
compuesto 1
control
Resultados y discusioacuten
91
Figura 516 E Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto hiacutebrido 9 F Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con
adicioacuten del compuesto hiacutebrido 10
Figura 516 G Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto hiacutebrido 11
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
G
Campo Magneacutetico G
compuesto 11
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
E
Campo Mgneacutetico G
compuesto 9
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
F
Campo Magneacutetico G
compuesto 10
control
Resultados y discusioacuten
92
Considerando los patrones espectrales obtenidos para los compuestos 9 10 y 11 se
observoacute que la sentildeal de cuadruplete correspondiente al control (spin-aducto [DMPO-
OH]) desaparecioacute casi por completo lo cual indica la inactivacioacuten del radical
hidroxilo Se observa ademaacutes un triplete con constantes de acoplamiento 1398 G y
1427 G que evidencioacute la reaccioacuten de oxidacioacuten del atrapador DMPO (Figura 517)
ya que de haberse formado el aducto entre la cumarina y el spin trap DMPO se
habriacutea obtenido el correspondiente espectro con un patroacuten de 6 liacuteneas espectrales
(Figura 518)
Figura 517 Espectro REE se destaca en rojo el triplete de integracioacuten 121
formado despueacutes de la reaccioacuten de Fenton no-cataliacutetico (izq) Espectro simulado
utilizando el programa EPR-WINSIM (der)
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
DMPO oxidado
N+
O-
+ OHNO
OH
Campo Magneacutetico G
Resultados y discusioacuten
93
cumarina + OHbull cumarinabull + H2O
cumarinabull + DMPO [cumarina-DMPO]
Figura 518 Espectro simulado para la formacioacuten del spin aducto [cumarina-
DMPO] utilizando el programa EPR-WINSIM
Como se presenta en la Tabla 56 tanto los aacutecidos orgaacutenicos como la cumarina
precursora y sus derivados presentaron reactividad muy semejante En las
condiciones de estudio para todos los compuestos se obtuvo un valor sobre el 90
indicando su poder de inactivacioacuten del radical resultado que superoacute al descrito en la
literatura para el estaacutendar Trolox
Estudios previos realizados en estructuras cumariacutenicas simples semejantes al
precursor 1 de esta investigacioacuten permiten comparar algunos resultados Peacuterez-Cruz y
colaboradores150
indican un 29 de inactivacioacuten para el derivado monohidroxilado de
la cumarina 1 diferencia que puede explicarse por la ausencia del ndashOH en posicioacuten 8
que aumenta su actividad El compuesto con grupos ndashOH en posicioacuten 6 y 7 presentoacute
un apagamiento del 51 Figueroa y colaboradores presentan tambieacuten un estudio en
que las cumarinas monohidroxiladas presentan valores de 23 y 56 de la
inactivacioacuten del radical OH corroborando lo encontrado anteriormente151
Resultados y discusioacuten
94
Tabla 56 Porcentajes de inactivacioacuten del radical hidroxilo (OHmiddot)
Compuesto de inactivacioacuten bullOH
(plusmnSD)
1 923 plusmn 74
2 983 plusmn 27
3 995 plusmn 08
4 927 plusmn 29
9 981 plusmn 18
10 982 plusmn 25
11 980 plusmn 99
Trolox 31plusmn 25a
aRef149 Figueroa R et al Future Med Chem 2013
Los resultados obtenidos con esta teacutecnica indican la reactividad relativa que tienen los
compuestos propuestos frente al radical OH Al considerar que el tiempo de vida del
radical hidroxilo y del spin trap DMPO es del orden de 10-9
s se observa que todos los
compuestos ensayados tuvieron la capacidad de competir con el DMPO en el proceso
de inactivacioacuten del radical evidenciado por la sentildeal de control que disminuyoacute casi en
su totalidad para todos los casos siendo menor en la cumarina precursora 1 y el aacutecido
4 siguiendo ambos compuestos la misma tendencia que se observara en los ensayos
Resultados y discusioacuten
95
anteriores Independientemente que el radical ensayado en este experimento es de una
alta reactividad y escasa selectividad el hecho de que se obtuvieran altos valores de
actividad para los compuestos propuestos indica que eacutestos se presentan como buenos
candidatos como inactivadores de la especie OH
Finalmente se observa que los derivados 9 10 y 11 presentaron un valor de
reactividad superior al de la cumarina precursora obtenieacutendose de esta forma un
aporte a la reactividad en cada nueva estructura propuesta frente al heterociclo de
partida 1 para este ensayo En cuanto a la reactividad relativa de la serie no se
encontroacute una diferencia significativa entre los compuestos ensayados precursores y
derivados mostraron valores cercanos en cuanto al de inactivacioacuten del radical
alrededor del 90
Resultados y discusioacuten
96
544 Estudio de reactividad frente al anioacuten radical superoacutexido O2-
Dentro de las diversas aplicaciones desarrolladas para las teacutecnicas electroquiacutemicas se
encuentran los ensayos de determinacioacuten de la capacidad antioxidante en distintos
medios152
y en muestras como bebidas153
vegetales154
mediciones in situ sobre piel
humana155
por mencionar algunos ejemplos Un reciente review (Pisoschi y
colaboradores 2015) describe las contribuciones realizadas con respecto a la
determinacioacuten de actividad antioxidante empleando exitosamente la voltametriacutea
ciacuteclica voltametriacutea de pulso diferencial voltametriacutea de onda cuadrada amperometriacutea
y potenciometriacutea156
las que ademaacutes se complementan con otras teacutecnicas en este tipo
de estudios157158
En esta parte de la investigacioacuten se determinoacute la reactividad de los compuestos frente
al anioacuten radical superoacutexido cuya generacioacuten electroquiacutemica en la superficie del
electrodo por reduccioacuten de oxiacutegeno disuelto mediante la teacutecnica de voltametriacutea ciacuteclica
ha sido ampliamente estudiada en nuestro grupo de trabajo159160110
y por otros
autores161
Como se esperaba tras la adicioacuten sucesiva de aliacutecuotas de todos los compuestos
estudiados hubo un decaimiento en la corriente de pico anoacutedica (Ipa0) (ejemplo del
resultado para el precursor 1 en la Figura 519) Esto permitioacute calcular el valor del
iacutendice antioxidante 50 (IA50) el cual se define como la concentracioacuten de sustrato
necesaria para obtener una disminucioacuten del 50 en la corriente Ipa0 Esta corriente es
Resultados y discusioacuten
97
directamente proporcional a la concentracioacuten de anioacuten superoacutexido presente por lo
que su disminucioacuten es un indicador de la capacidad del sustrato para inactivar la
especie radical generada in situ
Figura 519 Voltamogramas ciacuteclicos del par redox correspondiente al anioacuten
superoacutexido tras antildeadir aliacutecuotas del compuesto 1 DMF + HFFTBA 02 M 01 Vs
Tras obtener los voltamogramas ciacuteclicos para cada compuesto se procedioacute a
determinar el paraacutemetro adimensional (Ipa0-Ipa
SIpa
0) y se graficoacute con respecto a la
concentracioacuten de sustrato en solucioacuten (Figura 520) obtenieacutendose relaciones de tipo
lineal en que los valores del coeficiente de correlacioacuten r estuvieron entre 099777 y
097267
-10 -08 -06 -04 -02
Ipa0
10A
blanco
0049 mM
0099 mM
0149 mM
0199 mM
0249 mM
0299 mM
E vs Ag|AgCl V
Resultados y discusioacuten
98
007 014 021 02800
03
06
09
r = 099074
IA 50
(Ip
a0-
Ipa
S)
Ip
a0
Concentracioacuten mM
Figura 520 Graacutefica del paraacutemetro adimensional (Ipa0-Ipa
SIpa
0) vs concentracioacuten de
sustrato para el compuesto 1 (Destacado en verde el valor de IA50)
Junto con el valor de concentracioacuten IA50 la pendiente de las rectas entrega tambieacuten
informacioacuten con respecto a la reactividad de los compuestos frente al anioacuten
superoacutexido donde un mayor valor de la pendiente indica que el compuesto posee una
mayor actividad no obstante los autores que desarrollaron el meacutetodo hacen notar que
se utiliza preferentemente el iacutendice IA50 como valor para caracterizar de manera
adecuada la actividad de los compuestos propuestos frente el radical de forma
anaacuteloga al concepto de IC50 (concentracioacuten inhibitoria aplicada en sistemas
bioloacutegicos en relacioacuten a la cantidad de compuesto necesario para inhibir en un 50 el
crecimiento de una poblacioacuten de microorganismos)
Como se observa en los resultados (Tabla 57) la cumarina de partida 1 presenta un
valor mayor de IA50 (0187 mM) en comparacioacuten con los compuestos hiacutebridos 9 10 y
Resultados y discusioacuten
99
11 por lo que la adicioacuten de los fenoles a la estructura cumariacutenica fue un aporte a su
reactividad frente a la especie radical O2-
Tabla 57Valores de IA50 obtenidos para los compuestos estudiados
a Valor de estaacutendar Tolox ref 92
El derivado de aacutecido gaacutelico 10 presentoacute el menor valor de iacutendice antioxidante y por
consiguiente fue el mejor inactivador del anioacuten superoacutexido formado en la superficie
del electrodo puesto que se necesita una menor concentracioacuten de este derivado
(0064 mM) para apagar el 50 radical Junto con esto fue el compuesto que presentoacute
el fenoacutemeno de sinergia dentro de la serie con un valor de concentracioacuten menor
Compuesto IA 50 mM
(plusmnSD)
1 0183 plusmn 0007
2 0125 plusmn 0006
3 0104 plusmn 0004
4 0115 plusmn 0005
9 0141 plusmn 0011
10 0064 plusmn 0004
11 0137 plusmn 0002
Troloxa
197
Resultados y discusioacuten
100
requerida para inactivar el radical con respecto a cada uno de sus precursores (1 y 3)
El segundo mejor inactivador de O2-
fue el compuesto 11 con un valor de IA50 de
0137 mM y finalmente se tiene al derivado 9 con 0141 mM Este comportamiento
puede deberse a fenoacutemenos de difusioacuten de las moleacuteculas en el medio junto con su
reactividad en la superficie del electrodo
En este ensayo frente al radical O2-
al igual que el anterior (inactivacioacuten de la especie
OHbull) se pudo obtener informacioacuten con respecto al comportamiento de los
compuestos en un medio aproacutetico resultados que son de intereacutes ya que se pueden
considerar como una aproximacioacuten quiacutemica de tipo in vitro de los conocidos
fenoacutemenos de estreacutes oxidativo que ocurren en estructuras como las bio-membranas
donde participan especies reactivas oxigenadas161162
Finalmente se puede establecer un orden estimativo para la actividad de los derivados
y la cumarina 10 gt 3 gt 4 gt 2 gt 11 gt 9 gt 1 Todos los compuestos ensayados tuvieron
una reactividad superior al estaacutendar Trolox
Resultados y discusioacuten
101
545 Determinacioacuten de capacidad antioxidante celular (CAC)
Con el objeto de abordar los fenoacutemenos que involucran especies radicalarias
presentes en sistemas vivos se procede a realizar el estudio de la capacidad
antioxidante de los compuestos en un modelo bioloacutegico simple En este experimento
se utiliza la sonda DCFH-DA la cual difunde pasivamente a traveacutes de la membrana
celular al ingresar al citosol se transforma en el compuesto DCFH (no fluorescente)
que emite al entrar en contacto con especies oxidantes del tipo EROs y ERNs En los
experimentos realizados las ceacutelulas fueron estresadas mediante el compuesto ABAP
(generador de radical peroxilo) y se observoacute coacutemo los nuevos derivados en estudio
podiacutean contrarrestar este evento oxidativo al interior de la ceacutelula Los resultados
obtenidos se resumen en la Tabla 58
Los valores experimentales obtenidos en esta etapa indicaron una bio-disponibilidad
baja con una CAC menor al 50 para los nuevos compuestos 9 10 y 11 ademaacutes en
todos los casos se encontroacute un porcentaje menor de CAC de los derivados respecto a
los precursores respectivos 1 2 3 y 4 Para una concentracioacuten de 10 microM de
compuesto se obtuvieron valores muy semejantes (alrededor del 70) para los
precursores ensayados
Resultados y discusioacuten
102
Tabla 58 Valores obtenidos para la capacidad antioxidante celular (CAC)
concentraciones 1 microM y 10 microM de cada compuesto
Compuesto CAC 1 microM CAC 10 microM
1 696plusmn 50 727plusmn 13
2 730plusmn 26 739plusmn 07
3 662plusmn 19 701plusmn 01
4 477plusmn 25 665plusmn 26
9 381plusmn 55 499plusmn 66
10 178plusmn 45 395plusmn 128
11 345plusmn 31 234plusmn 108
En los resultados anteriores llaman la atencioacuten los bajos valores obtenidos en el
ensayo de CAC para los derivados polifenoacutelicos en comparacioacuten con los ensayos
realizados en sistemas no bioloacutegicos en que se obtuvieron buenos resultados en ellos
se pudo apreciar el fenoacutemeno de sinergia (en algunos casos) y un incremento en la
actividad de todos los derivados frente a la cumarina precursora de forma individual
Para explicar este comportamiento y complementar estos resultados se procedioacute a
seleccionar de manera racional los tres derivados obtenidos 9 10 y 11 y se determinoacute
su Hidrofobicidad Relativa en conjunto con el precursor cumariacutenico 1 (el cual
presentoacute valores de CAC alrededor del 70 cercano a lo obtenido en los precursores
Resultados y discusioacuten
103
aacutecidos) ensayo que entrega informacioacuten con respecto a la lipofilia relativa de la serie
(en funcioacuten de tiempos de retencioacuten) pudiendo dar respuesta al fenoacutemeno observado
555 Estudio de hidrofobicidad relativa
En el estudio de nuevos compuestos disentildeados como potenciales faacutermacos una de las
propiedades fisicoquiacutemicas de intereacutes es la lipofilia valor que puede determinarse
mediante distintos meacutetodos electroforesis capilar cromatografiacutea liacutequida de alta
resolucioacuten (HPLC) y determinando el coeficiente de particioacuten aguaoctanol entre
otras Junto con la metodologiacutea empiacuterica se han desarrollado diversas herramientas
computacionales con softwares que permiten calcular el valor para logP y logD
obtenieacutendose buenas correlaciones entre compuestos de una familia de estructuras
semejantes en los que se realizan variaciones a su esqueleto Los valores asiacute
calculados y entregados por el programa se consideran de una confiabilidad
razonable163
En el caso de este estudio se determinoacute la lipofilia relativa para los derivados 9 10 y
11 junto con el precursor 1 mediante HPLC en fase reversa donde se espera obtener
una serie relativa de tiempos de retencioacuten entre los compuestos que deacute cuenta de su
lipofilia Se utilizoacute esta teacutecnica por tratarse de una medicioacuten simple raacutepida y
ampliamente descrita en la literatura para nuevos compuestos en que la fase
estacionaria de la columna C18 simula la fase no polar y la fase moacutevil es la fase
Resultados y discusioacuten
104
acuosa asiacute a traveacutes de la columna se llevan a cabo muacuteltiples equilibrios de particioacuten
entre la fase acuosa y orgaacutenica En la medida en que el compuesto analizado sea maacutes
afiacuten a la fase estacionaria (relacionado con un mayor tiempo de retencioacuten) eacuteste seraacute
maacutes lipofiacutelico y viceversa Los resultados (Tabla 59) muestran que de acuerdo a los
tiempos de retencioacuten obtenidos (5138 5760 4031 y 4695 minutos) el orden
relativo de lipofilia fue el siguiente
Tabla 59 Valores obtenidos para el tiempo de retencioacuten experimental de los
compuestos
Compuesto Tiempo de retencioacuten
(min)
1 5138
9 5760
10 4031
11 4695
La Figura 521 indica el orden de lipofilia relativa encontrada para los derivados y su
precursor cumariacutenico En forma general se observaron valores de tiempo de
retencioacuten cercanos Se aprecioacute que el derivado de aacutecido cafeico 9 fue el compuesto
que encabezoacute la serie lo que se puede explicar debido a la presencia de un doble
enlace en su estructura confirieacutendole mayor apolaridad (por tanto hidrofobicidad) a
Resultados y discusioacuten
105
O
OH
HO O
Cl
O
OH
OH O
OH
OH
O
O
OHO O
O
O
OH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
la moleacutecula El segundo en la serie fue el compuesto clorado 1 en el cual el
sustituyente haloacutegeno es un aporte a la lipofilia del compuesto En el caso de las
estructuras 10 y 11 se encontroacute que el derivado de aacutecido gaacutelico presentoacute el menor
valor relativo debido a la presencia de un grupo ndashOH adicional en el anillo aromaacutetico
que como se esperaba tuvo la mayor tendencia hidrofiacutelica
9 1 11 10
Figura 521 Hidrofobicidad relativa de los derivados y la cumarina precursora
Para complementar este resultado experimental se realizoacute el caacutelculo teoacuterico para el
valor de logD mediante herramienta Marvin Sketch del software libre ChemAxon164
y
se establecioacute su correlacioacuten con el valor experimental obtenido para CAC en
concentracioacuten 10 microM El resultado de esta correlacioacuten se presenta en la Figura 522
Aumento de la lipofilia = aumento en el tiempo de retencioacuten
Resultados y discusioacuten
106
Figura 522 Correlacioacuten entre el valor de logD teoacuterico y CAC experimental a
10 microM de cada compuesto El valor logD se obtuvo a traveacutes de la herramienta Marvin
Sketch del software ChemAxon164
Considerando estos resultados para este modelo experimental propuesto en el ensayo
de CAC se observa que la lipofilia no seriacutea el uacutenico factor relacionado con los bajos
valores de capacidad antioxidante celular (CAC) obtenidos para los compuestos 9 10
y 11 ya que por ejemplo la cumarina 1 presentoacute valores de CAC sobre el 70 y fue
el segundo compuesto de la serie de hidrofobicidad relativa experimental con un
valor cercano de tiempo de retencioacuten al derivado 9 (el cual tuvo valores de CAC bajo
el 50) De igual forma se aprecia la misma tendencia al correlacionar el valor de
CAC con el logD teoacuterico donde el compuesto 1 independientemente de tener una
lipofilia semejante a los derivados polifenoacutelicos (al igual que en la serie de tiempos
de retencioacuten) siacute mostroacute una biodisponibilidad superior a los derivados y muy
-3 -2 -1 0 1 2 3 4
20
40
60
80
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OOH
HO O
Cl
OHO O
O
OOH
OH
OH
OOH
OH O
OH
OH
O
O
logDteor
C
AC
(1
0
32
4
Resultados y discusioacuten
107
semejante a los aacutecidos benzoicos (2 3 y 4) los cuales muestran valores negativos de
logD debido a su menor lipofilia
Por tratarse de un sistema bioloacutegico (ceacutelulas epiteliales) con muacuteltiples variables que
afectan la actividad de los compuestos estudiados se pueden considerar diversos
factores presentes en el medio ensayado que pueden dar respuesta al fenoacutemeno
observado Uno de ellos es la estructura de la membrana celular que contiene diversas
estructuras como por ejemplo el citocromo P (CYP) que es un complejo enzimaacutetico
involucrado en el metabolismo de faacutermacos siacutentesis de biomoleacuteculas y diversas
biotransformaciones de moleacuteculas a nivel celular165
Otro factor presente es la
existencia de enzimas hidroliacuteticas en el citosol celular como es el caso especiacutefico de
las carboxilesterasas (presentes en ceacutelulas epiteliales de intestino hiCE y otros
oacuterganos) las cuales son capaces de escindir diversos grupos funcionales tales como
amidas eacutesteres carbamatos y convertirlos en sus respectivos precursores (alcohol y
aacutecido) 166
Considerando que para este experimento en un modelo bioloacutegico in vitro simple se
emplearon ceacutelulas epiteliales de intestino (EAhy 926 (ATCC CRL-2922)) es posible
que el comportamiento observado se deba a la existencia de diversos fenoacutemenos e
interacciones posibles de los compuestos tanto a nivel de membrana como de
citoplasma Cabe destacar que al comparar las experiencias realizadas en un medio no
bioloacutegico los resultados en este caso se invierten al emplear una metodologiacutea que
involucra un medio bioloacutegico No necesariamente se encuentra un comportamiento
Resultados y discusioacuten
108
anaacutelogo en ambos medios de ensayo debido a la mayor complejidad y variables
asociadas a un sistema que involucra estructuras vivas independientemente de la
simplicidad o lo acotado del mismo
556 Estudios Teoacutericos optimizacioacuten de estructuras y determinacioacuten del Iacutendice
de Fukui
Con el objeto de racionalizar el estudio realizado y poder discriminar entre los
distintos sitios reactivos de los derivados se determinoacute el iacutendice de Fukui fk0
relacionado con un ataque de tipo radicalario Baacutesicamente es el promedio
correspondiente a las reacciones de ataque nucleofiacutelico fk- y electrofiacutelico fk
+(Ecuacioacuten
57) como se describe en el trabajo de Aliaga y Lissi donde se aborda el estudio
teoacuterico y experimental que compara la actividad anti-radicalaria de los polifenoles
rutina y quercetina167
1198911198960 =
119891119896minus+ 119891119896
+
2 Ecuacioacuten 57
Este iacutendice es un descriptor de reactividad local en los aacutetomos de oxiacutegeno que
participan en las reacciones de los grupos catecol presentes Este tipo de anaacutelisis
resulta adecuado para determinar los sitios de reaccioacuten preferentes en moleacuteculas
complejas con diversos centros reactivos168
Los resultados obtenidos indican que en
Resultados y discusioacuten
109
la cumarina precursora 1 el ataque radicalario ocurriraacute primero en el oxiacutegeno en
posicioacuten 7 debido al mayor valor de fk0
(0071) por otra parte no se observaron
cambios significativos en los valores de fk0 al formar parte de los derivados 10 y 11
para los aacutetomos de oxiacutegeno en posicioacuten 7 y 8 (aquellos involucrados en la capacidad
antioxidante de la moleacutecula) Al formar parte del derivado 9 si se observa una
disminucioacuten en su reactividad (fk0
O7 = 00078 y fk0
O8 = 00021) haciendo menos
probables estos dos sitios a un ataque radicalario en la moleacutecula (Tabla 510)
Los valores obtenidos para el iacutendice de Fukui indican que en el derivado 9 el sitio
maacutes probable para un ataque radicalario seraacute el catecol presente en el anillo benceacutenico
(proveniente del aacutecido cafeico) de preferencia en el oxiacutegeno en posicioacuten 4
(fk0
O4 = 00489) A diferencia del derivado de aacutecido cafeico en el caso de los
compuestos 10 y 11 el sitio preferente de reaccioacuten seraacute el anillo cumariacutenico
conservaacutendose el oxiacutegeno en posicioacuten 7 del heterociclo como sitio maacutes reactivo En
las Figuras 523 a 526 se presentan las estructuras optimizadas en 3D para el
precursor 1 y sus derivados polifenoacutelicos 9 10 y 11
Resultados y discusioacuten
110
Tabla 510 Valores de Iacutendice de Fukui fk para los compuestos en estudio
Compuesto Iacutendice de Fukui
fk0
Iacutendice de Fukui
fk-
O7 00771
O7 01373
O8 00391
O8 00757
O7 00078 O7 00072
O8 00021 O8 00036
O3 00389 O3 00779
O4 00489 O4 00890
O7 00719 O7 01276
O8 00365 O8 00716
O3 00025 O3 00050
O4 00025 O4 00049
O5 00002 O5 00004
O7 00739 O7 01316
O8 00378 O8 00742
O3 00004 O3 00008
O4 00003 O4 00005
OHO O
O
OOH
OH
OH
7
8
3
4
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
7
8
3
4
5
OOH
HO O
OH
OH
O
O
7
8
3
4
O
OH
HO O
Cl
7
8
Resultados y discusioacuten
111
OOH
OHO
Cl
Figura 523 Estructura optimizada en 3D para el precursor 1 utilizando DFT
OOH
OH O
OH
OH
O
O
Figura 524 Estructura optimizada en 3D para el derivado 9 utilizando DFT
Resultados y discusioacuten
112
Figura 525 Estructura optimizada en 3D para el derivado 10 utilizando DFT
OHO O
O
OOH
OH
OH
Figura 526 Estructura optimizada en 3D para el derivado 11 utilizando DFT
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
Resultados y discusioacuten
113
6 Discusioacuten General
Respecto del posible mecanismo de reaccioacuten electro-oxidativo se consideran las
siguientes evidencias teoacutericas y experimentales
En primer lugar como se esperaba los experimentos electroquiacutemicos de electro-
oxidacioacuten de los compuestos mostraron las sentildeales correspondientes a los grupos
ndashOH presentes en todas las estructuras Junto con esto los resultados de la graacutefica
Ipa vs vfrac12
indican la existencia de un proceso di-electroacutenico en los precursores y los
derivados (para la primera sentildeal oxidativa) lo que implica que comparten el mismo
mecanismo
Posteriormente se comproboacute la existencia de la especie radicalaria detectada mediante
oxidacioacuten electroquiacutemica seguida por resonancia de espiacuten electroacutenico con los
respectivos resultados de las simulaciones espectrales realizadas
En un siguiente punto se determinaron los valores teoacutericos de reactividad local
encontrados mediante el caacutelculo del iacutendice de Fukui El valor de fkndash
permitioacute
identificar los lugares con mayor reactividad frente a un ataque electrofiacutelico por tanto
las zonas en la moleacutecula puntuales con un alto valor para este iacutendice tenderaacuten a ceder
electrones con mayor facilidad en un proceso oxidativo Las estructuras optimizadas
en 3D indican que las zonas en color celeste (Figuras 523-526) corresponden a
aquellas con mayor densidad electroacutenica y por tanto estaacuten maacutes propensas a ceder
Resultados y discusioacuten
114
electrones en un proceso oxidativo Las zonas color lila representan los sitios con
menor densidad electroacutenica Para el compuesto 1 los ndashOH en el heterociclo presentan
mayor densidad electroacutenica lo que se aprecia de igual forma en los derivados 10 y 11
mientras que la zona del anillo benceacutenico se presenta con una baja densidad
electroacutenica Un fenoacutemeno diferente se aprecia para el derivado 9 donde la mayor
densidad electroacutenica se aprecia en la estructura benceacutenica cuyos grupos ndashOH
presentan el mayor valor de fk-
Este resultado teoacuterico racional complementa lo observado en el experimento descrito
con REE y electro-oxidacioacuten conjunta ya que los valores para las constantes de
acoplamiento hiperfino obtenidas en cada caso tambieacuten sentildealaron en cuaacutel de los dos
catecoles presentes ocurre la formacioacuten de la especie radical y por ende doacutende se
inicia el proceso de oxidacioacuten resultados corroboradas con el estudio teoacuterico
realizado De esta forma para el derivado 9 el proceso oxidativo se inicia en los -OH
ubicados en posicioacuten 3 y 4 que presentaron valores de fkndash
00779 y 00890
respectivamente y cuyas constantes de acoplamiento hiperfino son coherentes con
una interaccioacuten que involucra tres protones aquellos ubicados en las posiciones 2 5 y
6 del anillo benceacutenico El mismo anaacutelisis realizado para las estructuras 10 y 11 indica
que el proceso oxidativo ocurre primero en el anillo de la cumarina en los -OH en
posicioacuten 7 y 8 con valores del descriptor de reactividad local fkndash de 01276 y 00716
respectivamente para el derivado de aacutecido gaacutelico y en el caso del derivado de aacutecido
protocateacutequico con fkndash 01316 y 00742 para los oxiacutegenos en posicioacuten 7 y 8 De igual
forma los valores para las constantes de acoplamiento fueron consistentes con esta
Resultados y discusioacuten
115
informacioacuten experimental evidenciando la interaccioacuten entre dos protones (aquellos en
posicioacuten 5 y 6 del heterociclo cumariacutenico)
Esta diferencia encontrada para el proceso electro-oxidativo entre los derivados se
puede explicar debido a la existencia de un doble enlace conjugado adicional presente
soacutelo en el compuesto 9 derivado del aacutecido cafeico (ausente en 10 y 11) el cual le
confiere mayor deslocalizacioacuten (estabilidad) al radical que se forma como
intermediario en el proceso oxidativo
Los estudios presentes en la literatura sobre la oxidacioacuten de estructuras polifenoacutelicas
en medio aproacutetico presentan evidencias tanto teoacutericas como empiacutericas que ampliacutean la
visioacuten sobre la complejidad y posibilidades mecaniacutesticas en la oxidacioacuten de
estructuras polifenoacutelicas Basadas en modelos de naturaleza bioloacutegica como el
Fotosistema II presente en estructuras vegetales y otros ejemplos se plantea que una
viacutea de oxidacioacuten factible es a traveacutes de un mecanismo de tipo concertado donde se
obtiene el radical fenoxil (ArObull) en un paso directo en que el protoacuten y el electroacuten se
transfieren de manera conjunta (Figura 61 destacado en rojo) planteamiento que
considera factores de tipo energeacutetico a diferencia de los estudios claacutesicos con respecto
a este proceso seguacuten el cual la electro-oxidacioacuten se inicia con la peacuterdida de 1ē (etapa
electroquiacutemica) para formar el catioacuten radical(ArObull+) seguido de la peacuterdida de un
H+(etapa quiacutemica) para formar el radical fenoxil (ArObull) (Figura 62)
En el caso de los compuestos estudiados en esta investigacioacuten los valores de la
pendiente de Tafel encontrados para los compuestos (sobre 88 mVdec) sugieren que
Resultados y discusioacuten
116
el mecanismo de electro-oxidativo que maacutes se ajusta a la evidencia experimental es
por etapas
OH
HO
OH
HO
O
HO
O-
HO
-e- + B
+e- + HB+
+ B-e-
+e-
+e-
-e-
+ HB+
+ B
+HB+
Figura 61 Esquema de reaccioacuten para un mecanismo concertado de electro-
oxidacioacuten fenoacutelica Adaptacioacuten referencia 120
OH
HO - e
+ e
OH
HO
-H+
O
HO
Figura 62 Esquema de reaccioacuten para estructuras fenoacutelicas mecanismo electro-
oxidativo en etapas
Resultados y discusioacuten
117
Con respecto a los ensayos de actividad antioxidante realizados la Tabla 61 permite
comparar y estimar en conjunto los resultados obtenidos a traveacutes de las diferentes
metodologiacuteas empleadas
En forma general los resultados indican que la sustitucioacuten propuesta en esta
investigacioacuten en la cumarina dihidroxilada (utilizada como esqueleto de partida) con
distintas estructuras polifenoacutelicas entregoacute resultados positivos en cuanto al aporte
que los nuevos derivados obtenidos presentaron frente a la inactivacioacuten de especies
radicalarias tales como O2- ROO˙ OH˙ y su capacidad reductora (reflejada en el
ensayo FRAP) Para los ensayos realizados en un modelo no bioloacutegico se obtuvieron
valores de actividad en los derivados que superaron a los obtenidos para el precursor
cumariacutenico de forma individual
Cabe mencionar que en los diferentes ensayos y sus resultados se mencionan los
conceptos de reactividad y actividad de los compuestos En el caso de los ensayos
ORAC-FL y FRAP se habla soacutelo de actividad antioxidante ya que con la informacioacuten
que entregan no se puede determinar cuaacutel de los distintos grupos ndashOH presente en la
moleacutecula es el que reacciona primero Diferente es lo que ocurre en el ensayo frente
al radical hidroxilo en que se establece una competencia entre el atrapador (DMPO) y
el compuesto por inactivar al OHbull debido a que ambos tienen una vida media corta
(10-9
s) por tanto la reaccioacuten entre el antioxidante y el radical es raacutepida y el ndashOH maacutes
reactivo de la moleacutecula es el que inactiva a la especie y se puede mencionar como
reactividad Lo mismo ocurre para el ensayo frente al anioacuten radical superoacutexido en que
tambieacuten se mencionan los resultados como reactividad frente al radical
Resultados y discusioacuten
118
Tabla 61 Cuadro comparativo de los resultados en la determinacioacuten de capacidad
antioxidante para la cumarina y sus derivados
Compuesto ORAC-FL
FRAP
eq Trolox
10 microM
inactivacioacuten
OHmiddot
CAC
1 microM 10 microM
O2-
IA 50 mM
1 091 plusmn 003 1302plusmn 160 923 plusmn 74 696 plusmn 50 727 plusmn 13 0183plusmn0007
2 347 plusmn 010 2727 plusmn 321 983 plusmn 27 730plusmn 26 739plusmn07 0125 plusmn 0006
3 391 plusmn 009 4768 plusmn 215 995 plusmn 08 662plusmn 19 701plusmn01 0104 plusmn 0004
4 069 plusmn 001 868 plusmn 93 927 plusmn 29 477plusmn 25 665plusmn26 0115 plusmn 0005
9 239plusmn0027 2052 plusmn151 981 plusmn 18 381plusmn55 499 plusmn 66 0141plusmn0011
10 174 plusmn 005 28046plusmn188 982 plusmn 25 178plusmn45 395 plusmn128 0064plusmn0004
11 262 plusmn 004 2624 plusmn 236 980 plusmn 99 345plusmn31 234 plusmn 108 0137plusmn0002
Por otra parte en los ensayos ORAC-FL y FRAP se observoacute que los valores de
actividad para los aacutecidos cafeico 2 y gaacutelico 3 fueron superiores a los obtenidos para
sus derivados hiacutebridos 9 y 10 respectivamente En el ensayo frente al anioacuten
superoacutexido se encontroacute que los aacutecidos cafeico 2 y protocateacutequico 4 presentaron
resultados superiores en cuanto a reactividad que sus respectivos derivados hiacutebridos 9
y 11
Resultados y discusioacuten
119
En la literatura se encuentra la caracterizacioacuten de los aacutecidos benzoicos y otros
antioxidantes polifenoacutelicos naturales como moleacuteculas altamente polares lo que en
algunos limita su uso en medios como bio-membranas emulsiones y micelas por lo
que la formacioacuten de sus derivados eacutesteres se utiliza como una estrategia para
aumentar su lipofilia y por lo tanto la biodisponibilidad de estos compuestos en
medios no acuosos169170
investigacioacuten que ha dado origen a la formulacioacuten de los
denominados ldquoantioxidantes lipofiacutelicosrdquo171172
los que han demostrado ser eficientes
como antioxidantes en bio-membranas resultados que se describen en el trabajo
realizado por Tai y colaboradores donde se ensayaron eacutesteres de aacutecido vainilliacutenico
que ademaacutes de presentar buenos valores de iacutendice ORAC-FL inhibieron el proceso
de hemoacutelisis en eritrocitos de mamiacutefero173
Junto con lo anterior estaacute descrita la relacioacuten existente entre la estructura de los
aacutecidos benzoicos y su actividad antioxidante la que es atribuida a diversas
caracteriacutesticas presentes en su esqueleto tales como i) nuacutemero y posicioacuten de grupos ndash
OH en la moleacutecula ii) sustituyentes alcoxilo en posicioacuten orto al ndashOH iii) presencia
de grupos -COOH -COOR -CH=CH-CH2-174
Al apreciar las estructuras de los
derivados propuestos se infiere que las diferencias encontradas en la actividad de los
aacutecidos antes y despueacutes de la unioacuten a la cumarina estaacuten relacionadas con dicha
sustitucioacuten En el caso del aacutecido gaacutelico que presenta un valor de ORAC de 391 frente
a un valor de 174 para su derivado 10 y en el ensayo FRAP se encontroacute un valor de
4768 vs un 3182 para el hiacutebrido se puede sentildealar que no se aprecioacute un aumento de
Resultados y discusioacuten
120
actividad antioxidante para los eacutesteres con respecto al aacutecido del que provienen seguacuten
con lo descrito por algunos autores175176
Junto con lo anterior se forma un eacutester de
aacutecido gaacutelico con un sustituyente voluminoso (la estructura cumariacutenica) pudiendo
disminuir la coplanaridad en el sistema aromaacuteticocarbonilo lo que implica una menor
estabilizacioacuten del radical formado en la reaccioacuten frente a la especie ROObull para el
ensayo ORAC-FL y la capacidad reductora en el ensayo FRAP Otro punto a
considerar es que para este derivado se observa el fenoacutemeno mencionado por Rice-
Evans175
y otros autores con respecto a que un nuacutemero mayor de grupos ndashOH en el
anillo benceacutenico no implica necesariamente un aumento en la actividad antioxidante
de un derivado polifenoacutelico
Para el caso observado en el aacutecido cafeico y su derivado 9 se aprecia el mismo
fenoacutemeno de disminucioacuten de actividad del aacutecido 2 frente al eacutester como lo descrito
para el aacutecido gaacutelico y su derivado en los ensayos ORAC-FL y FRAP con la
diferencia que esta disminucioacuten no es tan draacutestica lo que se atribuye a la presencia del
doble enlace en la estructura que confiere mayor estabilidad por resonancia al radical
formado
El valor de reactividad local del iacutendice de Fukui fk0
-relacionado con los fenoacutemenos
de ataque radicalario- entregoacute informacioacuten con respecto a los sitios de los derivados
donde la actividad anti-radicalaria es maacutes probable Asiacute para el compuesto 9 esta
actividad ocurre en el anillo benceacutenico en primer lugar y posteriormente en la
cumarina Para los derivados 10 y 11 la mayor probabilidad de que se produzca el
Resultados y discusioacuten
121
ataque radicalario es en el heterociclo cumariacutenico y posteriormente en el catecol del
anillo benceacutenico Estos resultados corroboran con los valores experimentales y las
simulaciones realizadas en espectroscopia de resonancia electroacutenica de espiacuten (REE)
donde la actividad antioxidante del compuesto 9 ocurre con mayor probabilidad en el
anillo benceacutenico proveniente de la fraccioacuten del aacutecido cafeico (donde se encuentra el
doble enlace que le confiere mayor estabilidad al radical formado como intermediario
de reaccioacuten) mientras que en los derivados 10 y 11 esta actividad ocurre en el
heterociclo cumariacutenico
Se observa que los resultados de capacidad antioxidante para los derivados
polifenoacutelicos variaron entre un meacutetodo y otro no hubo correlacioacuten entre los valores
obtenidos en la capacidad antioxidante obtenidos en las distintas metodologiacuteas Este
resultado concuerda con lo esperado ya que cada experiencia realizada implica una
especie radicalaria diferente y cada una de ellas posee reactividades distintas (t12 O2-
del orden de los ms t12 OHbull ~ 10-9
s t12 ROObull ~ 10 ms) Para cada ensayo se
obtuvo un distinto orden relativo de reactividad entre los derivados y sus precursores
Se establece la relacioacuten entre el potencial Eonset y los resultados obtenidos en el
ensayo de capacidad antioxidante frente a anioacuten superoacutexido realizado en medio
aproacutetico (Figura 63) Para el ensayo de reactividad frente a O2-
se puede establecer
una correlacioacuten donde una disminucioacuten en el potencial de oxidacioacuten disminuye el
valor de IA50 para 5 de los 7 compuestos estudiados Por tanto a medida que el
Resultados y discusioacuten
122
potencial se hace menos positivo aumenta la reactividad de los compuestos frente al
anioacuten superoacutexido presentaacutendose una relacioacuten entre actividad antioxidante y Eonset
para este ensayo
Figura 63 Correlacioacuten entre el potencial de oxidacioacuten Eonset y los ensayos frente a
anioacuten superoacutexido
Un menor potencial de oxidacioacuten para los grupos ndashOH presentes en los compuestos
implica una mayor facilidad para oxidarse (por ende una mayor densidad de carga
electroacutenica para ceder) y por tanto un incremento en la capacidad antioxidante para
este ensayo
Se puede observar que el compuesto 4 (aacutecido protocateacutequico) posee un valor de IA50
de 0115 mM el cual se encuentra entre los valores encontrados para el aacutecido cafeico
y el aacutecido gaacutelico pero su valor de Eonset es mayor diferenciaacutendose de la tendencia
049 056 063 070 077
006
009
012
015
018
11
3
1
42
9
10
Eonset
vs Ag|AgCl V
IA50
mM
Resultados y discusioacuten
123
encontrada Junto con lo anterior el compuesto 4 presentoacute el menor valor para la
pendiente de Tafel (b = 88 mVdec) de toda la serie lo que sugiere una relacioacuten entre
el mecanismo de oxidacioacuten y la capacidad de reaccionar frente a la especie
radicalaria El compuesto 10 presentoacute el mejor valor para IA50 y tambieacuten se diferencia
de la serie de compuestos con respecto al Eonset (cercano al del compuesto 4) a
diferencia del aacutecido su pendiente de Tafel (b = 134 mVdec) indica la presencia de
dimerizaciones posteriores a la formacioacuten del radical fenoxil (y generacioacuten de
compuestos nuevos que tambieacuten pueden reaccionar con el radical) sugiriendo que
ademaacutes del mecanismo de oxidacioacuten hay otros factores que pueden influir como por
ejemplo la difusioacuten de las especies en el medio empleado
El estudio de los compuestos frente al radical hidroxilo reflejoacute que en las condiciones
experimentales empleadas los resultados fueron semejantes por cuanto los valores de
inactivacioacuten del radical en todos los casos fue sobre el 90 Debido a lo anterior se
descarta realizar la correlacioacuten con el potencial Eonset ya que no encontroacute una
diferencia significativa entre los compuestos
Finalmente al considerar los resultados obtenidos para la capacidad antioxidante
celular en un modelo bioloacutegico simple un punto a tener en cuenta es el hecho de que
esta metodologiacutea en particular adolece en cuanto a que es inespeciacutefica con respecto a
la cantidad de compuesto que ingresa en la ceacutelula ya que por las distintas lipofilias
observadas los compuestos tendraacuten una diferente capacidad de ingreso al medio y no
se puede determinar la relacioacuten existente entre la cantidad que ingresa a la ceacutelula
Resultados y discusioacuten
124
versus la reactividad Debido a lo anteriormente descrito estos resultados muestran
principalmente un reflejo de la capacidad de penetracioacuten que tienen los compuestos
hacia el interior de la ceacutelula
Un modo de abordar temaacuteticas de tipo multi-variable-donde se deben considerar
numerosos factores involucrados en un comportamiento o fenoacutemeno- es el empleo de
modelos teoacuterico-computacionales como QSAR (por su sigla en ingleacutes Quantitative
Structure-Activity Relationships) herramienta que se utiliza en la estimacioacuten de
propiedades bioloacutegicas y fisicoquiacutemicas de intereacutes en diversas moleacuteculas entre ellas
polifenoles177
El factor esteacuterico tiene un papel importante en los estudios realizados en medios
celulares siendo el tamantildeo molecular uno de los factores considerados en ensayos de
permeabilidad en futuros faacutermacos ya que un excesivo tamantildeo (entre otras cosas)
dificulta la solubilidad en medio acuoso asiacute como tambieacuten la difusioacuten pasiva de las
moleacuteculas163
Al observar el peso molecular de los compuestos derivados (entre
34427 gmol y 37031 gmol) se puede considerar que el efecto esteacuterico en este caso
no seriacutea la causa principal para el fenoacutemeno observado en el ensayo celular ya que
estaacute descrito que los compuestos no deberiacutean superar un peso de 500 gmol 163
_que no es el caso de estos derivados-
Los resultados obtenidos para este ensayo realizado en un modelo bioloacutegico simple
sugieren que la actividad de los derivados para reaccionar frente a especies
radicalarias podriacutea estar circunscrita a medios lipofiacutelicos como las membranas
Resultados y discusioacuten
125
bioloacutegicas estudio que se podriacutea profundizar empleando un modelo como el
descrito173
para estudiar procesos oxidativos en membranas de eritrocito
Conclusiones
126
7 Conclusiones
La teacutecnica de electro-oxidacioacuten complementada con espectroscopia de
resonancia de espiacuten electroacutenico (REE) resulta uacutetil para identificar especies
radicalarias como intermediarios de la reaccioacuten en este trabajo
La determinacioacuten del iacutendice de Fukui (fk-) en conjunto con los resultados de
resonancia de espiacuten electroacutenico permitieron discriminar los sitios de las
moleacuteculas donde se inicia el proceso oxidativo En el derivado 9 la oxidacioacuten
ocurre primero en el anillo benceacutenico y en los compuestos 10 y 11 el proceso
oxidativo ocurre primero en el heterociclo cumariacutenico
La inclusioacuten de las estructuras polifenoacutelicas al heterociclo cumariacutenico generoacute
un incremento en su capacidad antioxidante en los ensayos no bioloacutegicos
No se obtuvo correlacioacuten para los resultados de capacidad antioxidante entre
las distintas metodologiacuteas empleadas
Se establecioacute la correlacioacuten entre el valor de potencial de inicio de la reaccioacuten
electroquiacutemica (onset) y los resultados para el ensayo frente al anioacuten
superoacutexido A medida que el potencial se hace menos positivo aumenta la
reactividad de los compuestos lo que indica que la transferencia electroacutenica
estaacute involucrada en la etapa determinante de la velocidad
De acuerdo con los resultados de la teacutecnica CAC y la correlacioacuten tanto con la
hidrofobicidad relativa como con el logDteoacuterico la actividad de los derivados
Conclusiones
127
propuestos estaacute circunscrita a aquellos procesos oxidativos que tienen lugar en
medios lipofiacutelicos como por ejemplo membranas bioloacutegicas
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iv
A G R A D E C I M I E N T O S
Al culminar esta etapa acadeacutemica soacutelo tengo expresiones de profundo
agradecimiento
A Dios -en el cual somos nos movemos y existimos- agradezco la hermosa Familia
que me ha acogido siempre pilar que ha sostenido mi carrera en los diacuteas alegres y en
aquellos aciagos Gracias a mis Padres Joseacute Mariacutea y Elsa por su amor su sabiduriacutea el
apoyo incondicional comprensioacuten y valores entregados desde mi maacutes tierna infancia
gracias por la disciplina y prestancia que me entregaron como legado fruto de una
educacioacuten esmerada empapada de Fe y conviccioacuten tesoros que van en mi espiacuteritu
siempre A mi hermana Andrea y mi cuntildeado Juan gracias por su carintildeo todo su
apoyo y comprensioacuten Tiacuteas Mary Florita y Carmen gracias por estos antildeos de amor
alegriacutea y entrega
Agradezco a mis Profesores Tutores Al Dr Luis Nuacutentildeez V vaya mi maacutes sentido
reconocimiento por invitarme a ser parte de su Investigacioacuten y entregarme
herramientas valiosas en mi formacioacuten de pre y posgrado gracias por la confianza
que depositoacute en miacute por la acogida y comprensioacuten que me brindoacute en tiempos
complejos instancias que siempre conservareacute en mi memoria
A los Profesores Dr J Arturo Squella S y Patricio Navarrete E expreso mi sincero
agradecimiento por su guiacutea y orientacioacuten en este proceso gracias por su acogida y
todos sus aportes para que este trabajo llegase a feliz teacutermino
Expreso mi gratitud a los Profesores Dr Domingo Gonzaacutelez A y Manuel Domiacutenguez
P de la Facultad de Quiacutemica de la Universidad de Sevilla por recibirme en su grupo
de trabajo y compartir parte de esta Investigacioacuten Tener la oportunidad de viajar y
haber conocido y compartido ese corto tiempo de estadiacutea con el Profesor Domingo ha
sido una de las experiencias maacutes valiosas educativas y formativas que conservo de
este periacuteodo como doctorando Gracias por su amistad
Deseo expresar mi agradecimiento a los Profesores de la Comisioacuten Examinadora a la
Dra Soledad Ureta Z por su tiempo buena disposicioacuten y valiosos aportes a este
trabajo al Dr Antonio Zanocco L por sus aportes realizados a este trabajo y su
buena voluntad al Dr David Pessoa M gracias por sus ideas y aportes realizados en
cada instancia En forma especial quiero agradecer al Dr Claudio Olea A quien
junto con ser parte de esta Comisioacuten me abrioacute generosamente las puertas de su
Laboratorio para aprender y desarrollar diversas teacutecnicas aplicadas en esta Tesis lo
cual fue un hermoso aporte Muchas gracias por su confianza por integrarme como
una alumna maacutes por su tiempo paciencia y por todos los momentos alegres que
compartiacute con su grupo Muchas gracias a sus alumnos ex-alumnos y miembros del
Laboratorio al Dr(c) Mauricio Moncada por su dedicacioacuten carintildeo y ensentildeanza en
este proceso gracias por la amistad y el apoyo que me ha brindado
v
Al Dr Germaacuten Barriga por los aportes en el tema de estudios teoacutericos al Dr Michel
Lapier por su colaboracioacuten con los estudios en ceacutelulas al Dr Francisco Mura por su
generosidad y colaboracioacuten al Dr Benjamiacuten Aguilera por su simpatiacutea y ayuda con
temas espectroscoacutepicos a la Dra Mariacutea Carolina Zuacutentildeiga y los MC boys Jorge
Beatriz Manuel Camilo Gabriela Estefaniacutea gracias por sus aportes a este trabajo y
los momentos agradables que compartimos Al Profesor Dr Javier Morales vaya mi
agradecimiento por su ayuda en el estudio y caracterizacioacuten de mis compuestos
Gracias a la Profesora Dra Mariacutea Baeacutez C por su colaboracioacuten y disposicioacuten en la
caracterizacioacuten de mis compuestos
Agradezco a todos los compantildeeros de laboratorio que he conocido en diversas
instancias A la Dra Paulina Sierra a Viviana Claudio Julio la Dra Paola Salgado
Camila Daniela Constanza Dr David Vaacutesquez Gracias por los momentos gratos y
su compantildeerismo
Deseo destacar la valiosa contribucioacuten de los funcionarios de la Biblioteca Ceacutesar
Leyton de nuestra Facultad Muchas gracias por la prontitud y agilidad en su servicio
que siempre ha sido de muy buen nivel
Agradezco ademaacutes la valiosa colaboracioacuten de las Secretarias de Decanato Sra
Cecilia Pinchetti y Ximena Berriacuteos Gracias por su siempre buena disposicioacuten
gentileza y voluntad con cada detalle de todo este proceso
Mi agradecimiento para todo el personal de Secretariacutea de Posgrado por su gestioacuten y
colaboracioacuten en todo el proceso acadeacutemico
vi
INDICE
Informe de aprobacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip i
Agradecimientoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip iii
Iacutendicehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip vi
Iacutendice de figuras y tablashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip x
Glosariohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip xvi
Resumenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip xviii
Summaryhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip xx
1 Introduccioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 1
11 Cumarinashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 1
111 Origen vegetalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 1
112 Rutas de siacutentesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 2
113 Principales aplicacioneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 4
12 Compuestos polifenoacutelicoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 9
121 Origen vegetalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 9
122 Actividad bioloacutegicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 10
123 Polifenoles como antioxidanteshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 11
13 Compuestos hiacutebridoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 13
vii
131 Cumarinas como estructuras hiacutebridashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 15
2 Hipoacutetesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
3 Objetivoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
31 Objetivos generaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
32 Objetivos especiacuteficoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
4 Materiales y meacutetodoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 23
41 Materialeshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24
411 Reactivos y equipamiento utilizado en siacutentesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24
412 Reactivos y equipamiento utilizados en electroquiacutemicahelliphelliphelliphelliphellip 25
413 Reactivos y equipamiento utilizados en ensayos frente a especies
radicalariashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27
42 Meacutetodoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 28
421 Procedimientos de siacutentesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 28
422 Procedimientos en electroquiacutemicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 37
423 Estudio de generacioacuten de especies radicalarias mediante
espectroscopia de resonancia de espiacuten electroacutenico (REE)helliphelliphelliphelliphellip 38
424 Procedimiento experimental en el estudio de reactividad
frente a especies radicalariashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39
4241 Metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales
de oxiacutegeno (ORAC-FL)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39
4242 Metodologiacutea de capacidad reductora de hierro en plasma
(FRAP)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42
viii
4243 Capacidad de apagamiento del radical hidroxilo (OHmiddot)
mediante la teacutecnica spin traphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 44
4244 Estudio de reactividad frente al anioacuten radical superoacutexido O2bull-helliphelliphellip 45
4245 Estudio de la capacidad antioxidante celular (CAC)helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 47
4246 Estudio de hidrofobicidad relativa helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 48
4247 Estudio teoacuterico caacutelculo del Iacutendice de Fukui fkhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 49
5 Resultados y discusioacuten helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 50
51 Siacutentesis de los compuestoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 50
52 Estudios electroquiacutemicoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 54
53 Estudio de generacioacuten de especies radicalarias mediante espectroscopia
de resonancia de espiacuten electroacutenico (REE)helliphelliphelliphelliphellip 70
54 Resultados y discusioacuten de los estudios de reactividad
frente a especies radicalariashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 74
541 Metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales
oxiacutegeno-fluoresceiacutena (ORAC-FL)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 74
542 Metodologiacutea de capacidad reductora de hierro en plasma
(FRAP )helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 82
543 Determinacioacuten de capacidad de apagamiento del radical OHmiddot
teacutecnica spin trappinghelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 86
544 Estudio de reactividad frente al anioacuten radical superoacutexido O2bull-helliphelliphellip 94
545 Determinacioacuten de capacidad antioxidante celular (CAC)helliphelliphelliphelliphellip 100
546 Estudio de hidrofobicidad relativa helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 102
ix
547 Estudio teoacuterico caacutelculo del Iacutendice de Fukui fkhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 108
6 Discusioacuten generalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 113
7 Conclusiones helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 124
8 Bibliografiacuteahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 126
x
Iacutendice de figuras y tablas
Figuras
Figura 1 Esquema de los compuestos estudiados
Figure 1 Scheme of studied compounds
Figura 11 Estructura de la 2H-1-benzopiran-2-ona (cumarina)
Figura 12 Esquema general de la reaccioacuten de Pechmann
Figura 13 Estructura de la 33rsquo-metilenbis(4-hidroxicumarina) o dicumarol
Figura 14 Estructura de la suksdorfina
Figura 15 Estructura del hiacutebrido cumarina-flavona aislado de su fuente vegetal
Gnidia socotrana
Figura 16 Estructura del antibioacutetico hiacutebrido novobiocina metabolitos secundarios
en la especie Streptomyces
Figura 17 Hiacutebridos chalcona-cumarina con capacidad antioxidante
Figura 41 Aacutecidos empleados en la sustitucioacuten de la 4-clorometil-78-
dihidroxicumarina
Figura 42 Siacutentesis del derivado clorado 1
Figura 43 Siacutentesis del derivado clorado acetilado 5
Figura 44 Siacutentesis del aacutecido cafeico acetilado 6
Figura 45 Siacutentesis del aacutecido gaacutelico acetilado 7
Figura 46 Siacutentesis del aacutecido 34-dihidroxibenzoico acetilado 8
Figura 47 Siacutentesis del intermediario hiacutebrido derivado del aacutecido cafeico
xi
Figura 48 Siacutentesis del compuesto hiacutebrido final 9
Figura 49A Ruta de siacutentesis de los compuestos cumariacutenicos i) H2SO4 1 h bantildeo de
hielo ii) NaOH Ac2O 30 min bantildeo de hielo (aacutecido cafeico 6) H2SO4 Ac2O 30
min (cumarina y aacutecidos benzoicos)
Figura 49B Ruta de siacutentesis de los compuestos cumariacutenicos iii) DBU DMF (seca)
35 h 50 degC iv) NaHCO3 MeOH acetona tdeg amb 3 h N2
Figura 410 A Sonda fluoresceiacutena B 22prime-azobis (2-metilpropionamidina)
dihidrochloridrato (ABAP) C 6-hidroxi-2578-tetrametilcroman-2-aacutecido carboxiacutelico
(Trolox)
Figura 411 Actividad antioxidante ORAC para un compuesto en estudio
Figura 412 Reactivo 246-tris(2-piridil)-s-triazina (TPTZ)
Figura 413 Voltamograma ciacuteclico de la generacioacuten de anioacuten radical superoacutexido
DMF+ HFFTBA 02 M en electrodo de carbono viacutetreo
Figura 51A Voltamogramas de pulso diferencial para los precursores 1 2 3 y 4
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 51B Voltamogramas de pulso diferencial para los derivados 9 10 y 11
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 52A VC para el derivado 9 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 53A VC para el derivado 10 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 54A VC para el derivado 1a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 55 Esquema del proceso electro-oxidativo propuesto para el catecol
Figura 56 Relacioacuten Epa vs logv para el derivado de aacutecido cafeico 9 2 mM en
DMF + HFFTBA 02 M
xii
Figura 57 Graacutefica para la corriente de pico Ipa vs la raiacutez cuadrada de la velocidad de
barrido Ejemplo de correlacioacuten lineal en el aacutecido protocateacutequico 4 2 mM en
DMF + HFFTBA 02 M
Figura 58 Determinacioacuten graacutefica del valor de Eonset VC del precursor 1 01 Vs
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 59 Relacioacuten Eonset vs logv para los compuestos estudiados
Figura 510 Correlacioacuten Ipa v12
vs v12
para el precursor aacutecido protocateacutequico 4
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 511A Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido cafeico 9 estabilizado con Zn2+
en DMF+HFFTBA
(izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color
rojo)
Figura 511B Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido gaacutelico 10 estabilizado con Zn2+
en DMF+HFFTBA
(izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color
rojo)
Figura 511C Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido 11 estabilizado con Zn2+
en DMF+HFFTBA (izq)
Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color rojo)
Figura 512 Curvas para el consumo de la sonda Fluoresceiacutena para un set de
concentraciones del compuesto 11
Figura 513 Graacutefica de aacuterea neta bajo la curva ABC vs concentracioacuten del derivado 11
Figura 514 Esquema para la reaccioacuten entre el complejo de Fe3+
y el compuesto
antioxidante reductor
Figura 515 Espin aducto generado por la inactivacioacuten del radical OHbull y su espectro
simulado (derecha)
xiii
Figura 516A Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto 4-clorometil-78-dihidroxicumarina 1 B Espectro REE de inactivacioacuten
del radical hidroxilo con adicioacuten del compuesto aacutecido cafeico 2
Figura 516C Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto aacutecido gaacutelico 3 D Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con
adicioacuten del compuesto aacutecido 34-dihidroxi benzoico 4
Figura 516E Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto hiacutebrido 9 F Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con
adicioacuten del compuesto hiacutebrido 10
Figura 516G Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto hiacutebrido 11
Figura 517 Espectro REE se destaca en rojo el triplete de integracioacuten 121
formado despueacutes de la reaccioacuten de Fenton no-cataliacutetico (izq) Espectro simulado
utilizando el programa EPR-WINSIM (der)
Figura 518 Espectro simulado para la formacioacuten del spin aducto [cumarina-
DMPO] utilizando el programa EPR-WINSIM
Figura 519 Voltamogramas ciacuteclicos del par redox correspondiente al anioacuten
superoacutexido tras antildeadir aliacutecuotas del compuesto 1 DMF + HFFTBA 02 M 01 Vs
Figura 520 Graacutefica del paraacutemetro adimensional (Ipa0-Ipa
S Ipa
0) vs concentracioacuten
de sustrato para el compuesto 1 (Destacado en verde el valor de IA50)
Figura 521 Hidrofobicidad relativa de los derivados y la cumarina precursora
Figura 522 Correlacioacuten entre el valor de logD teoacuterico y CAC experimental a
10 microM de cada compuesto El valor logD se obtuvo a traveacutes de la herramienta Marvin
Sketch del software ChemAxon164
Figura 523 Estructura optimizada en 3D para el precursor 1 utilizando DFT
Figura 524 Estructura optimizada en 3D para el derivado 9 utilizando DFT
Figura 525 Estructura optimizada en 3D para el derivado 10 utilizando DFT
xiv
Figura 526 Estructura optimizada en 3D para el derivado 11 utilizando DFT
Figura 61 Esquema de reaccioacuten para un mecanismo concertado de electro-
oxidacioacuten fenoacutelica Adaptacioacuten referencia 118
Figura 62 Esquema de reaccioacuten para estructuras fenoacutelicas mecanismo electro-
oxidativo en etapas
Figura 63 Correlacioacuten entre el potencial de oxidacioacuten Eonset y los ensayos frente a
anioacuten superoacutexido
xv
Tablas
Tabla 51 Paraacutemetros experimentales para los compuestos Determinaciones en VC
2 mM DMF + HFFTBA 02 M
Tabla 52 Constantes de acoplamiento hiperfino para los derivados polifenoacutelicos
Valores en Gauss
Tabla 53 Valores experimentales de Iacutendice ORAC para los compuestos estudiados
Tabla 54 Valores calculados para el factor estequiomeacutetrico n
Tabla 55 Valores experimentales obtenidos para los compuestos en estudio ensayo
FRAP en equivalentes de Trolox10 microM de muestra
Tabla 56 Porcentajes de inactivacioacuten del radical hidroxilo (OHmiddot)
Tabla 57 Valores de IA50 obtenidos para los compuestos estudiados
Tabla 58 Valores obtenidos para la capacidad antioxidante celular (CAC)
concentraciones 1 microM y 10 microM de cada compuesto
Tabla 59 Valores obtenidos para el tiempo de retencioacuten experimental de los
compuestos
Tabla 510 Valores de Iacutendice de Fukui fk para los compuestos en estudio
Tabla 61 Cuadro comparativo de los resultados en la determinacioacuten de capacidad
antioxidante para la cumarina y sus derivados
xvi
Glosario de abreviaturas
ABAP 22-azo-bis(2-amidinopropan)diclorhidrato
ADN Aacutecido desoxiribonucleico
ATCC American Type Culture Collection
HFFTBA Hexafluorofosfato de tetrabutil amonio
CAC Capacidad antioxidante celular
CYP450 Citocromo P450
DBU 18-diazabiciclo[540]undec-7-ano
DCFH-DA 2-(6-oxido-3-oxo-3H-xanten-9-il)benzoato disoacutedico (fluoresceiacutena sal
disoacutedica)
DMF NN-dimetilformamida
DMPO 55-dimetil-1-pirroline-N-oacutexido
DMSO Dimetil sulfoacutexido
DPPHbull Radical 22-difenil-1-picrilhidrazil
Epa Potencial de pico anoacutedico
EPR Electron paramagnetic resonance
ERNs Especies reactivas de nitroacutegeno
EROs Especies reactivas de oxiacutegeno
xvii
fk Iacutendice de Fukui
FRAP Ferric reducing antioxidant in plasma
HObull Radical hidroxilo
IA50 Iacutendice antioxidante 50
Ipa Corriente de pico anoacutedica
O2˙- Anioacuten radical superoacutexido
ONOObull Radical peroxinitrito
ORAC-FL Oxygen radical antioxidant capacity-fluorescein
PBS Buffer fosfato salino
REE Resonancia de espiacuten electroacutenico
RObull Radical alcoxilo
ROOmiddot Radical peroxilo
TPTZ 246-tris(2-piridil)-s-triazina
Trolox 6-hidroxi-2578-tetrametilcroman-2-aacutecido carboxiacutelico
VC Voltametriacutea ciacuteclica
VPD Voltametriacutea de pulso diferencial
xviii
RESUMEN
Las cumarinas (2H-1-benzopiran-2-ona) son estructuras quiacutemicas presentes en
especies vegetales ampliamente distribuidas en la naturaleza con una reconocida
actividad bioloacutegica entre las que destacan sus propiedades antioxidantes
En el presente trabajo de Tesis se describe la siacutentesis de derivados polifenoacutelicos La
cumarina dihidroxilada como estructura de partida fue esterificada con distintos
aacutecidos orgaacutenicos polifenoacutelicos (Figura 1) Se estudioacute su electro-oxidacioacuten y se evaluoacute
su actividad antioxidante frente a especies reactivas de oxiacutegeno por medio de diversas
metodologiacuteas in vitro
Figura 1 Esquema de los compuestos estudiados
Se estudioacute el comportamiento anoacutedico de los compuestos mediante voltametriacutea
ciacuteclica (VC) y voltametriacutea de pulso diferencial (VPD) en medio aproacutetico como una
aproximacioacuten a los procesos redox que ocurren en membranas bioloacutegicas
Se determinoacute la presencia de especies radicalarias en el proceso electro-oxidativo a
traveacutes de la teacutecnica de resonancia de espiacuten electroacutenico (REE) Las constantes de
OOH
HO O
Cl
HO
OOH
OH
OH
OH
HO
O
OH
OH
OH
HO
OO
OHHO O
OH
OH
O
O
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
xix
acoplamiento hiperfino junto con caacutelculos teoacutericos (iacutendice de Fukui) permitieron
discriminar distintos sitios reactivos en las nuevas moleacuteculas donde se desarrolla el
proceso oxidativo
Ademaacutes se evaluoacute la capacidad antioxidante de los compuestos a traveacutes de los
ensayos capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno-fluoresceiacutena (ORAC-
FL) capacidad antioxidante reductora de hierro (FRAP) apagamiento del radical
hidroxilo mediante spin trapping inactivacioacuten de anioacuten superoacutexido y capacidad
antioxidante celular (CAC) en un modelo bioloacutegico in vitro simple
Para los ensayos antioxidantes no bioloacutegicos la introduccioacuten de las distintas
estructuras fenoacutelicas en el anillo cumariacutenico permite obtener derivados que presentan
una capacidad antioxidante mejor que el precursor cumariacutenico inicial Se establecioacute
la respectiva correlacioacuten entre el potencial de inicio del proceso electroquiacutemico
(potencial onset) y los resultados encontrados en el ensayo en medio aproacutetico frente a
anioacuten superoacutexido
Considerando el ensayo bioloacutegico de capacidad antioxidante celular eacuteste sugiere que
la actividad antioxidante de los nuevos derivados estaacute circunscrita a medios de
naturaleza lipofiacutelica
xx
SUMMARY
Coumarins (2H-1-benzopyran-2-one) are chemical structures from vegetal sources
widely distributed in vegetable species with recognized biological activities among
which their antioxidant capacity
In this Thesis work the syntheses of coumarin polyphenolic derivatives is described
Coumarin was the starter scaffold and it was sterified with different organic phenolic
acids The electro-oxidation of polyphenolic derivatives is studied and their
antioxidant capacity towards ROS through methodologies in vitro is evaluated
Figure 1 Scheme of studied compounds
The anodic behavior of the compounds by cyclic voltammetry (CV) and differential
pulse voltammetry (VPD) was studied in aprotic medium as an approximation to the
redox processes in biological membranes
The presence of radical species is determined in the electro-oxidation process through
the technique electron spin resonance (ESR)The hyperfine coupling constants and
theoretical calculations (Fukui index values) allow to discriminate between the
OOH
HO O
Cl
HO
OOH
OH
OH
OH
HO
O
OH
OH
OH
HO
OO
OHHO O
OH
OH
O
O
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
xxi
different reactive sites in the new molecules where the oxidative process is taking
place
Moreover antioxidant capacity of derivatives was evaluated through oxygen radical
antioxidant assay-fluorescein (ORAC-FL) ferric reducing ability of plasma (FRAP)
spin trapping superoxide scavenging assays and cellular antioxidant (CAC) in a
simple biological model in vitro
In the non-biological antioxidant assays the addition of various phenolic structures to
the coumarin scaffold yielded derivatives with improved antioxidant capacity related
to initial coumarin We studied the correlations between the starting potential of the
electrochemical process (onset potential) and the antioxidant results obtained in
aprotic media against superoxide anion
In regard to the biological cellular antioxidant capacity assay it suggests that the
antioxidant activity of new derivatives could be limited to lipophilic media
Introduccioacuten
1
1 Introduccioacuten
11 Cumarinas
111 Origen vegetal
Las cumarinas son una familia de compuestos cuya estructura baacutesica corresponde a la
lactona heterociacuteclica 2H-1-benzopiran-2-ona (Figura 11) En el reino vegetal estaacuten
ampliamente distribuidas habieacutendose identificado en la actualidad maacutes de 1800
cumarinas de origen natural1 eacutestas se encuentran principalmente como metabolitos
secundarios en diversas plantas tanto en sus semillas como en hojas y raiacuteces2 Su
biosiacutentesis es descrita por distintos autores como una serie de procesos catalizados
por enzimas presentes en la estructura CYP450 (citocromo P450) en algunos casos
estos compuestos son generados en la ceacutelula vegetal como una viacutea de defensa
(fitoalexinas como la escopoletina) frente a estiacutemulos de estreacutes y la presencia de fito-
patoacutegenos34
O O
3
45
6
7
81
2
Figura 11 Estructura de la 2H-1-benzopiran-2-ona (cumarina)
Introduccioacuten
2
El nombre de estos compuestos se deriva de la palabra ldquocoumarourdquo vocablo
caribentildeo que hace referencia al aacuterbol de Tonka originario de Sudameacuterica de cuya
semilla A Vogel logra aislar el compuesto y publicar su hallazgo en 18205b
A partir
de entonces el intereacutes por su caracterizacioacuten6 la obtencioacuten tanto desde fuentes
naturales7 como por rutas sinteacuteticas de la cumarina y sus derivados ha ido en
aumento encontrando su primera aplicacioacuten en la fabricacioacuten de perfumes En 1868
W H Perkin propuso la siacutentesis de una fragancia vegetal a partir de la sal soacutedica del
orto-hidroxibenzaldehiacutedo y anhiacutedrido aceacutetico obteniendo el mismo producto aislado
de la semilla de Tonka5 8(ac)
Se han estudiado los aspectos taxonoacutemicos en cuanto a la clasificacioacuten de las especies
vegetales que contienen compuestos cumariacutenicos se estima que las principales
familias donde se encuentran estos derivados son Umbelliferae Rutaceae
Leguminosae Compositae Caryopgillaceae Euphorbiaceae Hipocastanaceae
Oleaceae Thymelaeaceae8b
112 Rutas de siacutentesis
Los autores Sethna y Narsinh9 presentaron en 1944 una de las primeras revisiones del
estado del arte con respecto a la siacutentesis de cumarinas En ella se encuentran las
principales metodologiacuteas claacutesicas de obtencioacuten como la siacutentesis de Perkin
Pechmann10
y Pechmann-Duisberg11
(Figura 12) en la que se obtiene la cumarina al
Introduccioacuten
3
condensar un fenol con un β-cetoester en medio aacutecido Diversas publicaciones
plantean modificaciones a esta ruta con catalizadores12 (ab)
libre de solventes13 (ab)
con promotores aacutecidos14
asistida por microondas15
entre otras
Figura 12 Esquema general de la reaccioacuten de Pechmann
Otra metodologiacutea empleada es la de Knoevenagel16
propuesta en 1898 Consiste en
una reaccioacuten de condensacioacuten entre o-hidroxialdehiacutedos con malonato de etilo
acetoacetato de etilo o cianoacetato de etilo en medio baacutesico (piridina o piperidina)
Los autores Bigi y colaboradores17
describen el uso de un catalizador en base a
montmorillonita para la obtencioacuten de cumarinas sustituidas en posicioacuten 3 con un
grupo aacutecido Posteriormente otro grupo de trabajo (Shaabani 2009) llevoacute a cabo esta
condensacioacuten empleando radiacioacuten de microondas lo que les permitioacute obtener buenos
rendimientos en un medio ldquoamigablerdquo con el ambiente18
Se han descrito otras metodologiacuteas sinteacuteticas en las cuales se utilizan las reacciones
claacutesicas de Wittig19 ab
y Reformatsky20
ademaacutes de otras rutas con variantes tanto en
los reactivos como en el medio de reaccioacuten que permiten la obtencioacuten de derivados
OH
+
OEt
O O H2SO4
O O
Introduccioacuten
4
cumariacutenicos como la siacutentesis en presencia de bases fuertes21
reacciones libres de
solventes22
y la obtencioacuten de cumarinas policiacuteclicas utilizando compuestos
organometaacutelicos descrita por Harvey y cols23
113 Principales aplicaciones
Tras ser aisladas desde su fuente vegetal y como resultado de investigaciones
posteriores dirigidas a generar rutas sinteacuteticas viables las cumarinas han sido objeto
de numerosos estudios enfocados en la buacutesqueda de sus aplicaciones Es asiacute como en
la literatura se pueden encontrar las maacutes diversas investigaciones para este tipo de
compuestos provenientes tanto de productos de siacutentesis o como extractos de
vegetales y plantas con reconocidas propiedades en la medicina tradicional esto da
origen al estudio de sus bio-aplicaciones entre las que se destaca su capacidad como
antioxidante
A Actividad bioloacutegica
La primera aplicacioacuten en bio-medicina descrita para las cumarinas fue como
anticoagulante desde que se aislara y caracterizara el dicumarol 33rsquo-metilenbis(4-
hidroxicumarina) (Figura 13) Posteriormente aparece en el mercado su derivado
Introduccioacuten
5
sinteacutetico conocido como Warfarina que hasta la deacutecada pasada era considerado uno
de los faacutermacos anticoagulantes maacutes vendidos en Estados Unidos24 a-c
OOOO
OH HO
Figura 13 Estructura de la 33rsquo-metilenbis(4-hidroxicumarina) o dicumarol
Con posterioridad el uso de las cumarinas se ha diversificado hacia innumerables
blancos terapeacuteuticos En la literatura se describen variados estudios con respecto a sus
propiedades farmacoloacutegicas25ab
Su capacidad como agente antitumoral 26ab
se ha
estudiado en compuestos provenientes tanto de fuentes vegetales como sinteacuteticas
Riveiro ME y cols estudiaron el efecto de la 78-OH-4-metilcumarina en ceacutelulas
humanas afectadas por leucemia evidenciando el potencial que presentoacute este
derivado dihidroxilado27
En otra investigacioacuten realizada por C Ito y colaboradores
aislaron tres derivados cumariacutenicos de la especie vegetal Murraya siamensis cuyos
ensayos frente a ceacutelulas tumorales resultaron promisorios28
Con respecto a las propiedades antiinflamatorias de las cumarinas en la naturaleza se
encuentran especies como la Chamomilla recutita (manzanilla) que contiene un tipo
Introduccioacuten
6
de umbeliferona con tales propiedades En la literatura se encuentran derivados
sinteacuteticos desarrollados en cuya estructura estaacute presente el esqueleto cumariacutenico29
Lin y cols presentan los resultados de su estudio de la capacidad antiinflamatoria de
un conjunto de cumarinas los cuales fueron ademaacutes correlacionados con los
obtenidos para el apagamiento del radical hidroxilo30
HA El-Wahab y cols sintetizaron distintas tiazolo-cumarinas hiacutebridas y estudiaron
una de sus propiedades farmacoloacutegicas como agente antimicrobiano Estos
compuestos posteriormente fueron aplicados como aditivos en recubrimientos de
poliuretano confirieacutendoles tambieacuten esta propiedad microbicida a las superficies en
las que se utilizoacute31
Tambieacuten se han descrito derivados cumariacutenicos con propiedades anti-fuacutengicas 32ab
Un trabajo reciente presenta el estudio de complejos en base a Ni(II) Cu(II) y
Co(II)frente a distintas especies de hongos (Candida A niger Rhizopus)32c
Tambieacuten se han encontrado estructuras cumarina-glucoacutesidos provenientes de especies
vegetales (Hydrangea paniculata) que presentan propiedades hepatoprotectoras33
Otros estudios sentildealan tambieacuten la importancia de las estructuras cumariacutenicas como
compuesto antiviral analgeacutesico anti-tromboacutetico ulcerogeacutenico 25 34-36
inclusive con
potencial para ser usadas en terapias frente al VIH como lo sentildeala la investigacioacuten
sobre especies vegetales que contienen dipiranocumarin - calanolideos como
Introduccioacuten
7
principio activo25a
estudios que tambieacuten se han realizado con derivados de siacutentesis
disentildeados a partir de la estructura de origen vegetal (Lomatium suksdorfii) conocida
como suksdorfina (Figura 14) a partir de la cual se han generado compuestos
anaacutelogos con el objeto de estudiar su modo de accioacuten y obtener sustratos cada vez
maacutes potentes frente a la enfermedad (Yu D y cols 2003)37
O OO
O
O
OO
Figura 14 Estructura de la suksdorfina
B Propiedades antioxidantes
El equilibrio en los organismos vivos es funcioacuten de diversos factores entre ellos cabe
mencionar el balance de las especies que generan estreacutes oxidativo dentro del medio
celular estas especies pueden ser de origen endoacutegeno como las provenientes de la
cadena transportadora de electrones enzimas oxidantes ceacutelulas fagociacuteticas o de
origen exoacutegeno como sustancias reductoras oxidacioacuten de drogas tabaquismo
ultrasonido luz solar etc Entre los compuestos que generan estreacutes conocidos como
Introduccioacuten
8
EROs y ERNs (especies reactivas de oxiacutegenonitroacutegeno) se pueden mencionar el
anioacuten superoacutexido (O2˙-) peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2) radical peroxilo (ROObull) y
alcoxilo (RObull) radical hidroxilo (HObull) oacutexido niacutetrico (NObull) peroxinitrito (ONOObull)
entre otras
Dentro de este contexto en la literatura se ha descrito el potencial que poseen las
cumarinas y sus derivados como compuestos capaces de interaccionar con especies
reactivas de oxiacutegeno y nitroacutegeno lo que da cuenta de su capacidad antioxidante tema
relevante si se considera que parte importante de las patologiacuteas conocidas y
estudiadas en la actualidad a nivel mundial estaacuten iacutentimamente ligadas a cuadros de
estreacutes oxidativo presentes en el organismo 38 39
Payaacute y colaboradores presentaron un trabajo en el cual se estudia la reactividad de un
conjunto de dieciseacuteis cumarinas (naturales y sinteacuteticas) frente al radical hidroxilo
aacutecido hipocloroso y anioacuten superoacutexido encontrando que los derivados di-hidroxilados
poseiacutean mejores propiedades que aquellos mono-hidroxilados o sin sustitucioacuten40
Estos resultados se complementan con una publicacioacuten posterior del mismo grupo en
que se profundiza el estudio anterior sentildealando las propiedades terapeacuteuticas de los
derivados cumariacutenicos34
El derivado conocido como esculetina (67-dihidroxicumarina) fue ensayado frente al
radical DPPH junto con ensayos de estreacutes oxidativo en medios de cultivo celular
Introduccioacuten
9
estos autores sentildealan la importancia de los grupos catecol en su capacidad de atrapar
especies radicales (Kim y cols 2008)41
Otro estudio en el que se ensaya un extracto
vegetal (Cortex Fraxini) relaciona ademaacutes la capacidad antioxidante de las o-
dihidroxi cumarinas con su capacidad reductora42
Zhang y cols presentan un estudio reciente en el cual cumarinas dihidroxiladas en
posicioacuten 7 y 8 entre otros derivados poseen importante bio-actividad in vitro los
compuestos fueron ensayados frente a especies radicales en ceacutelulas tumorales
presentaron ademaacutes actividad como antiinflamatorios y baja toxicidad tanto en
ceacutelulas sanguiacuteneas de vertebrado como de invertebrado Junto con lo anterior se
realizoacute un anaacutelisis de estructura-reactividad correlacionando la capacidad de
apagamiento de radicales con las propiedades antiinflamatorias y antitumorales de los
derivados cumariacutenicos encontradas en esta investigacioacuten43
12 Compuestos polifenoacutelicos
121 Origen vegetal
Los polifenoles al igual que las cumarinas son una amplia familia de compuestos (se
han encontrado maacutes de 8000 de ellos) presentes en estructuras vegetales como
metabolitos secundarios cumpliendo roles tales como protector frente a radiacioacuten
UV reguladores de los ciclos de crecimiento pigmentacioacuten y defensa frente a
Introduccioacuten
10
depredadores Su estructura baacutesica es el anillo benceacutenico con sustituyentes hidroxilo
(-OH) en distintas posiciones Se clasifican en flavonoides aacutecidos fenoacutelicos
(hidroxicinaacutemicos e hidroxibenzoicos) taninos estilbenos Debido a sus interesantes
propiedades y bio-aplicaciones estos fitoquiacutemicos han sido objeto de diversos
estudios investigacioacuten y caracterizacioacuten44-46
Estos compuestos son un constituyente importante de la dieta diaria se encuentran en
forma abundante en diversos frutos como por ejemplo berries manzana mango uva
pera granada y ciacutetricos en bebidas como el vino teacute y cafeacute 47
en vegetales cereales
y semillas Junto con lo anterior se ha descrito la utilizacioacuten de aacutecidos polifenoacutelicos
provenientes de extractos vegetales y aceites esenciales como aditivos en la industria
alimentaria aplicados como preservantes naturales en reemplazo de aquellos de
origen sinteacutetico debido a las propiedades antimicrobianas que exhiben48
122 Actividad bioloacutegica
Estos compuestos se conocen tambieacuten como ldquobiofenolesrdquo (Romeo y Uccella 1996)
haciendo referencia a aquellos provenientes de fuentes naturales Las primeras
publicaciones sobre los polifenoles en general comenzaron en la deacutecada de 1950 con
la investigacioacuten de D Harman y su teoriacutea del envejecimiento y los radicales libres
estudios en los que se planteoacute prolongar la sobrevida en especies roedores enfermos a
traveacutes de la ingesta de biofenoles presentes en su dieta Es asiacute que el nuacutemero de
publicaciones concernientes al tema se incrementoacute de una treintena (entre 1900 y
Introduccioacuten
11
1950) hasta superar las 35000 publicaciones entre los antildeos 2000-2010 lo que da
cuenta del creciente intereacutes en este toacutepico49
La bio-actividad de los compuestos polifenoacutelicos es amplia se encuentran diversos
estudios como el citado anteriormente con respecto a las capacidades antimicrobianas
de los polifenoles y su uso en la industria alimentaria5051
Compuestos como la
curcumina resveratrol quercetina y derivados del aacutecido gaacutelico se enumeran dentro de
las investigaciones realizadas tanto in vitro e in vivo en la prevencioacuten del caacutencer
(Cimino y cols 2012)52
Otras propiedades descritas para estos compuestos son como cardio-protectores anti-
canceriacutegenos antiinflamatorios vaso-relajantes entre otras como lo resume el
artiacuteculo de Xia y cols (2010) En eacutel ademaacutes se presenta una revisioacuten en cuanto a los
meacutetodos de extraccioacuten purificacioacuten y caracterizacioacuten del contenido y tipos de
polifenoles especiacuteficamente en el caso de la uva fruto reconocido por su alto
contenido de fitoquiacutemicos y nutrientes53
123 Polifenoles como antioxidantes
Los polifenoles como micronutrientes presentes en los alimentos y otras estructuras
vegetales han sido un foco de intereacutes ya que sus aplicaciones terapeacuteuticas estaacuten
relacionadas con su reconocida e investigada capacidad antioxidante y quelante de
metales Con respecto a esta uacuteltima cabe mencionar la revisioacuten del estado del arte
Introduccioacuten
12
realizada por Kozlowski y cols con respecto al desbalance de Cu Zn y Fe en el
organismo en ella se indica que la presencia libre y en exceso de estos metales estaacute
directamente relacionada con patologiacuteas neurodegenerativas y caacutencer entre otras ya
que su actividad redox genera especies reactivas capaces de atacar sustratos orgaacutenicos
como la membrana lipiacutedica proteiacutenas y aacutecido desoxiribonucleico (ADN)54
Ribeiro y colaboradores presentan un estudio en el que se determina el contenido
polifenoacutelico de la especie Fistulina hepaacutetica Los extractos se ensayaron frente a
DPPH anioacuten superoacutexido radical hidroxilo y aacutecido hipocloroso Los autores plantean
que considerando los resultados obtenidos esta especie fuacutengica podriacutea tener
aplicacioacuten como suplemento o como antioxidante en la industria alimentaria55
Estudios realizados con aacutecido taacutenico comercial sentildealan que su capacidad como
antioxidante y como quelante de hierro da cuenta del potencial que tiene este aacutecido
ademaacutes como anti-mutageacutenico y anti-carcinogeacutenico Los autores indican posibilidad
de que este aacutecido el cual presenta baja toxicidad contribuye en el apagamiento de
especies reactivas de oxiacutegeno dantildeinas a nivel de ADN (Andrade y cols 2006)56
trabajo que se complementa con una publicacioacuten anterior del mismo grupo donde se
estudioacute el apagamiento del radical OHbull mediante complejos de aacutecido taacutenico-Cu
(Andrade y cols 2005)57
Los aacutecidos hidroxicinaacutemicos e hidroxibenzoicos han sido tambieacuten objeto de estudio
debido a su capacidad antioxidante58-61
Jeong y colaboradores estudiaron el extracto
de la especie vegetal Erigeron annuus el cual contiene aacutecido cafeico en su fraccioacuten
Introduccioacuten
13
butanoacutelica este extracto fue ensayado como agente neuro-protector y antioxidante en
ceacutelulas nerviosas Frente a los resultados obtenidos los autores concluyen que este
extracto podriacutea ser utilizado en terapias frente a patologiacuteas neurodegenerativas como
el Alzheimer62
Otro estudio de capacidad antioxidante realizado a un grupo de
compuestos polifenoacutelicos presentes en el propoacuteleo (aacutecido cafeico aacutecido feruacutelico
ferulato de etilo eacutester fenetiacutelico del aacutecido cafeico) sentildeala que los grupos catecol
presentes en las estructuras ensayadas incrementan la capacidad antioxidante
mientras que en estudios relacionados con bio-membranas se debe tener en cuenta
ademaacutes la hidrofobicidad que presenten los compuestos63
13 Compuestos hiacutebridos
Al considerar que las diversas enfermedades que afectan al ser humano (caacutencer
diabetes enfermedades neurodegenerativas artritis entre otras) involucran diferentes
factores patogeacutenicos se han desarrollado estrategias sinteacuteticas que permiten obtener
nuevos faacutermacos de naturaleza hiacutebrida los cuales incorporan en su estructura
distintos ingredientes activos64
Este disentildeo ldquomulti-blancordquo ha permitido que los
nuevos faacutermacos actuacuteen en distintos blancos terapeacuteuticos este tipo de terapias
implica una disminucioacuten en los problemas asociados a una multi-dosificacioacuten las
interacciones entre distintos medicamentos una disminucioacuten en la resistencia a los
faacutermacos (en el caso de enfermedades de origen microbiano) disminucioacuten en los
efectos adversos derivados de la dosificacioacuten muacuteltiple por mencionar algunos
Introduccioacuten
14
Diversas investigaciones sobre el tema dan cuenta de la relevancia que ha tenido esta
estrategia y el disentildeo racional de nuevos medicamentos65-68
La revisioacuten realizada por
los autores Mehta y Singh (2002) menciona algunos de los esqueletos que han dado
origen a estructuras hiacutebridas entre ellas esteroides antraciclinas β-lactamas
fullerenos carbohidratos-peacuteptidos En esta revisioacuten se indica el uso de este tipo de
compuestos en terapias contra el caacutencer y como neuro-protectores69
En el caso de la malaria una de las enfermedades infecciosas maacutes complejas a nivel
mundial la resistencia del paraacutesito del geacutenero Plasmodium frente a los faacutermacos
empleados (cloroquina principalmente) ha sido un tema de estudio durante antildeos Una
resentildea de este desafiacuteo se presenta en el artiacuteculo de Kouznetsov y Goacutemez-Barrio
(2009) en el que se sentildeala la siacutentesis de derivados de aminoquinolina como las
trioxaquinas70
las cuales se presentan posteriormente en una revisioacuten realizada por
Chauhan y colaboradores en ella se destaca a estos hiacutebridos como candidatos
promisorios para la formulacioacuten de nuevas drogas antimalaacutericas71
Otra patologiacutea en la que se ha utilizado faacutermacos de naturaleza hiacutebrida que en
algunos casos provienen de productos naturales es el caacutencer72
Allen y
colaboradores73
mencionan en una reciente revisioacuten de tecnologiacuteas avanzadas en las
que ademaacutes de utilizar la estrategia de compuestos hiacutebridos con dos estructuras de
propiedades anticanceriacutegenas eacutestos se combinan con nano-estructuras orientadas a
Introduccioacuten
15
blancos especiacuteficos para asiacute disminuir el riesgo de efectos colaterales en el
tratamiento de esta compleja patologiacutea
Este concepto y disentildeo de faacutermacos multi-blanco se ha aplicado ademaacutes en distintas
terapias frente a enfermedades como el Alzheimer74
en vacunas de amplio espectro
frente al coacutelera75
en la siacutentesis de compuestos antiparasitarios76
y de dihidropiridinas
las cuales poseen actividad vasodilatadora77
por mencionar algunos ejemplos
131 Cumarinas como estructuras hiacutebridas
Al considerar el estado del arte con respecto a la amplia y variada actividad bioloacutegica
que presentan los derivados cumariacutenicos se encuentra que otra de las aplicaciones que
se ha estudiado para esta familia de compuestos es su capacidad para formar parte de
estructuras hiacutebridas complejas compuestos orientados a la obtencioacuten faacutermacos multi-
blanco que den respuesta a los interrogantes y desafiacuteos actuales con respecto a
importantes patologiacuteas y sus terapias 78
En la literatura se describen ejemplos de estructuras cumariacutenicas hiacutebridas no soacutelo de
origen sinteacutetico sino que tambieacuten se pueden extraer desde su fuente natural Un
estudio realizado en hojas y ramas de la especie Gnidia socotrana (originaria de
Yemen) da cuenta de la presencia de estructuras flavona-cumarina las que fueron
extraiacutedas purificadas y caracterizadas79
(Figura 15)
Introduccioacuten
16
O
OH
HO O
OH
O
O
OH
Figura 15 Estructura del hiacutebrido cumarina-flavona aislado de su fuente vegetal
Gnidia socotrana
Entre los compuestos antibioacuteticos de origen natural que poseen el esqueleto
cumariacutenico en su estructura se encuentran la novobiocina (Figura 16) clorobiocina y
cumermicina Presentes como metabolitos secundarios en la especie Streptomyces
estos derivados deben su actividad antibioacutetica a que actuacutean inhibiendo la enzima
ADN girasa presente en bacterias impidiendo su replicacioacuten y ademaacutes genera su
muerte celular80
O
HN
OH
O
OH
O
O
MeOO
H2N
HO
Figura 16 Estructura del antibioacutetico hiacutebrido novobiocina metabolitos secundarios
en la especie Streptomyces
Introduccioacuten
17
Se ha descrito tambieacuten la capacidad antitumoral de derivados cumarina-resveratrol a
partir del precursor 7-hidroxicumarina En la publicacioacuten de Belluti y colaboradores
se presentan los ensayos realizados para 10 compuestos los cuales tuvieron como
objeto ceacutelulas tumorales de pulmoacuten humano dos de los hiacutebridos presentaron
resultados promisorios como antitumorales y pro-apoptoacuteticos comportamiento que
los autores concluyen tiene relacioacuten con la posicioacuten de los sustituyentes en la
moleacutecula81
La revisioacuten bibliograacutefica de Longhin y colaboradores describe diversas estructuras
hiacutebridas desarrolladas que cuentan con capacidad antiinflamatoria toacutepico de intereacutes si
se considera que los cuadros inflamatorios estaacuten relacionados a dolencias como el
Alzheimer asma arterioesclerosis artritis reumatoide caacutencer etc En este trabajo se
sentildeala al hiacutebrido cumarina-aacutecido lipoico donde ambas estructuras poseen ademaacutes
reconocida capacidad antioxidante y el aacutecido unido a la cumarina en posicioacuten 3
mediante un espaciador es la estructura que se describe con una actividad superior al
conocido y utilizado faacutermaco indometacina82
Junto con los estudios descritos otra importante aacuterea de investigacioacuten ha sido el
desarrollo de estructuras hiacutebridas con capacidad antioxidante (Koufaki 2006)83
actividad que permite en muchos casos restablecer el equilibrio en organismos vivos
frente al exceso de especies generadoras de estreacutes oxidativo cuadro que como ya se
Introduccioacuten
18
mencionoacute estaacute con frecuencia asociado las patologiacuteas conocidas y estudiadas en la
actualidad
El reciente estudio desarrollado por Matos Olea-Azar y colaboradores presenta la
estructura cumarina-resveratrol y diferentes derivados sinteacuteticos los cuales fueron
estudiados mediante diversas teacutecnicas in vitro como resonancia de espiacuten electroacutenico
(REE) capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno (ORAC-FL) y
voltametriacutea ciacuteclica (VC) En esta investigacioacuten se encontroacute que los compuestos
propuestos poseen una buena capacidad antioxidante84
Una investigacioacuten que da cuenta del potencial que posee esta estrategia es la
desarrollada por Kenchappa y colaboradores quienes sintetizaron derivados
cumariacutenicos unidos a pirazol e indenona posteriormente mediante estudios in vitro e
in vivo obtuvieron resultados de su capacidad antioxidante y ademaacutes como agentes
anti-hipergliceacutemicos en un modelo animal proyectaacutendolos como posibles faacutermacos
frente a la diabetes85
Dentro del mismo esquema Krishan y colaboradores
desarrollaron una serie de cumarinas unidas al benzoimidazol el cual es a su vez una
estructura con muacuteltiple y reconocida actividad bioloacutegica proponen a dos compuestos
de la serie como derivados con una buena capacidad antioxidante y anti-inflamatoria
a nivel de mucosa gaacutestrica86
Introduccioacuten
19
Un tipo de derivado hiacutebrido que ha sido estudiado es la cumarina-chalcona El trabajo
realizado por Xi y Liu presenta la siacutentesis de una serie de compuestos (Figura 17)
los que posteriormente son ensayados por distintas metodologiacuteas de determinacioacuten de
capacidad antioxidante concluyendo que estos hiacutebridos son estructuras promisorias
en los que el grupo catecol presente en el esqueleto cumariacutenico o en la chalcona es
capaz de inhibir distintos procesos oxidativos a nivel de ADN87
O O
OH
O
R1
R2
R3
Figura 17 Hiacutebridos chalcona-cumarina con capacidad antioxidante
Peacuterez-Cruz y colaboradores describen el disentildeo siacutentesis y estudio de la capacidad
antioxidante de derivados cumarina-chalcona los que presentaron buena reactividad
frente a distintas especies radicales y capacidad cito-protectora en un modelo celular
animal88
En los estudios mencionados se evidencia el continuo desarrollo que ha tenido el
disentildeo y siacutentesis de compuestos hiacutebridos como nuevos faacutermacos frente a complejas
Introduccioacuten
20
enfermedades multifactoriales Esta tendencia vigente en la actualidad se extiende a
los maacutes variados nuacutecleos estructurales entre ellos la cumarina Este heterociclo
clasificado por algunos autores como ldquoestructura privilegiadardquo debido a la amplia
gama de compuestos que se originan a partir de eacutel es el punto de partida para
diversas propuestas sinteacuteticas enfocadas a generar un producto que posea muacuteltiples
actividades bioloacutegicas de intereacutes terapeacuteutico
Hipoacutetesis y objetivos
21
2 Hipoacutetesis
Los compuestos hidroxicumariacutenicos exhiben conocidas e interesantes propiedades
antioxidantes
Al sustituir la cumarina con los compuestos aacutecido cafeico aacutecido gaacutelico y aacutecido
protocateacutequico se obtienen derivados de naturaleza hiacutebrida aumentando la actividad
de la cumarina frente a las especies reactivas de oxiacutegeno anioacuten superoacutexido radical
hidroxilo radical peroxilo y su capacidad reductora
3 Objetivos
31 Objetivos generales
- Evaluar el comportamiento electroquiacutemico oxidativo de los derivados
cumariacutenicos previamente sintetizados y caracterizados fiacutesicamente
- Evaluar la capacidad antioxidante de los nuevos compuestos derivados de
cumarina y aacutecidos benzoicos frente a distintas especies radicales mediante
diversas teacutecnicas in vitro
Hipoacutetesis y objetivos
22
32 Objetivos especiacuteficos
Objetivos en siacutentesis
- Sintetizar y caracterizar el compuesto precursor 4-clorometil-78-
dihidroxicumarina y los correspondientes derivados de la sustitucioacuten en posicioacuten-
4 con aacutecido cafeico aacutecido gaacutelico y aacutecido 34-dihidroxibenzoico
Objetivos en electroquiacutemica
- Realizar la caracterizacioacuten anoacutedica en medio aproacutetico (NN-dimetilformamida
DMF) de los compuestos por voltametriacutea ciacuteclica (VC) voltametriacutea de pulso
diferencial (VPD)
Objetivos en la determinacioacuten de capacidad antioxidante
- Estudiar la reactividad de los compuestos frente al anioacuten radical superoacutexido O2-
utilizando como teacutecnica voltametriacutea ciacuteclica
- Determinar la reactividad de los compuestos frente al radical peroxilo (ROObull)
obteniendo su iacutendice ORAC-FL
- Determinar la capacidad reductora de hierro (Fe3+
) de los compuestos a traveacutes de
la teacutecnica FRAP
- Estudiar la reactividad frente al radical OHbull mediante la teacutecnica spin trapping
utilizando espectroscopiacutea de resonancia de espin electroacutenica (REE)
Hipoacutetesis y objetivos
23
- Evaluar la capacidad antioxidante celular de los compuestos
- Establecer la existencia de correlacioacuten entre paraacutemetros fisicoquiacutemicos de los
compuestos y su actividad antioxidante
Materiales y meacutetodos
24
4 Materiales y meacutetodos
41 Materiales
411 Reactivos y equipamiento utilizado en siacutentesis
Reactivos
- Aacutecido 34-dihidroxicinaacutemico Merck
- Aacutecido 34- dihidroxibenzoico Sigma-Aldrich
- Aacutecido 345-trihidroxibenzoico Sigma-Aldrich
- Pirogalol Merck
- 4-cloro acetoacetato de etilo Sigma-Aldrich
- NN-dimetilformamida PA J T Baker
- 18-diazabiciclo[540]undec-7-ano (DBU) Sigma-Aldrich
- Carbonato aacutecido de sodio Merck
- Metanol PA JT Baker
- Acetona PA Merck
- Etanol PA Merck
- Cloroformo PA Merck
- Aacutecido sulfuacuterico 98 Merck
- Aacutecido clorhiacutedrico 37 JTBaker
- Anhiacutedrido aceacutetico Merck
- Hidroacutexido de sodio PA Merck
- Solucioacuten etanoacutelica de FeCl3
Materiales y meacutetodos
25
- Acetona d6 Sigma-Aldrich
- Dimetilsulfoacutexido d6 Sigma-Aldrich
- Cloroformo d6 Sigma-Aldrich
- Nitroacutegeno extra puro 99995 Linde Gas Chile SA
Equipamiento
Todo el material de vidrio utilizado fue clase A
- Balanza analiacutetica Precisa 125 A
- Rotavapor Heidolph VV 2000
- Sonicador Elme Transsonic Digital tipo T480H-2
- Agitador magneacutetico placa calefactora Heidolph MR 3002
- Estufa de secado al vaciacuteo Heraeus
412 Reactivos y equipamiento utilizados en electroquiacutemica
Reactivos
- NN-dimetilformamida (DMF) PA Merck
- Hexafluorofosfato de tetrabutil amonio (HFFTBA) Sigma-Aldrich
- Aacutecido 34-dihidroxicinaacutemico Merck
- Aacutecido 34- dihidroxibenzoico Sigma-Aldrich
- Aacutecido 345-trihidroxibenzoico Sigma-Aldrich
- Nitroacutegeno extra puro 99995 Linde Gas Chile SA
Materiales y meacutetodos
26
- Agua purificada (MilliQ) Millipore Merck
Equipamiento
- Estacioacuten de trabajo electroquiacutemica CH Instruments CHI 760c
- Electrodo de carbono viacutetreo CH Instruments d = 3 mm
- Alambre de platino
- Electrodo de referencia AgAgCl (KCl 3 M) CH Instruments
- Aluacutemina 03 μM y 005 μM Buheler
- Balanza analiacutetica Precisa 40SM-200ordf
413 Reactivos y equipamiento utilizados en ensayos frente a especies
radicalarias
Reactivos
- 2-(6-oacutexido-3-oxo-3H-xanten-9-il)benzoato disoacutedico (fluoresceiacutena sal
disoacutedica) Sigma-Aldrich
- 22-azo-bis(2-amidinopropan)diclorhidrato (ABAP) Sigma-Aldrich
- 246-tris(2-piridil)-s-triazina (TPTZ) Sigma Aldrich
- 6-hidroxi-2578-tetrametilcroman-2-aacutecido carboxiacutelico (Trolox) Sigma-
Aldrich
- Peroacutexido de hidroacutegeno al 30
- NN-dimetilformamida PA Sigma-Aldrich
- 55-dimetil-1-pirroline-N-oacutexido (DMPO)
- Acetato de sodio Merck
Materiales y meacutetodos
27
- Tricloruro de hierro (FeCl3) Sigma Aldrich
- Hidroacutexido de sodio Merck
- Fosfato diaacutecido de potasio Merck
- Etanol grado HPLC Merck
- Aacutecido aceacutetico glacial Merck
- N-octanol Merck
- Cloruro de zinc Merck
Equipamiento
- Balanza Precisa 40SM-200ordf
- Lector de microplacas con detector muacuteltiple Synergytrade HT Bio-Tek
Instruments Inc (Winooski VT USA)
- Espectroacutemetro ECS 106 de banda X (985 GHz) equipado con cavidad
rectangular y 50 KHz de modulacioacuten de campo (Bruker Coventry UK)
- WINSIM Software EPR Spectral Simulation for MS-Windows 9x NT
Version 098 copy PEST Public EPR Simulation Tools NIEHS USA
- Alambre de platino
- Espectrofotoacutemetro UV-Visible Specord S600 Analytik Jena
- Equipo generacioacuten agua ultrapura NanoPure Barnstead
Materiales y meacutetodos
28
42 Meacutetodo
421 Procedimientos de siacutentesis
En un primer paso se obtuvo el precursor 4-clorometil-78-dihidroxicumarina
mediante la siacutentesis de Pechmann posteriormente se realizoacute la esterificacioacuten entre el
compuesto halogenado y diferentes aacutecidos orgaacutenicos comerciales (Figura 41) Los
aacutecidos comerciales utilizados en el proceso de siacutentesis fueron los siguientes
aacutecido 34-dixidroxicinaacutemico aacutecido 345- trihidroxibenzoico
(aacutecido cafeico) (aacutecido gaacutelico)
O
OH
OH
HO
aacutecido 34-dihidroxibenzoico
(aacutecido protocateacutequico)
Figura 41 Aacutecidos empleados en la sustitucioacuten de la 4-clorometil-78-
dihidroxicumarina
OH
OH
O
HO
O
OH
OH
HO
OH
Materiales y meacutetodos
29
Todos los compuestos fueron previamente acetilados para proteger los grupos
hidroxilo presentes en sus estructuras para evitar reacciones entre siacute
A Siacutentesis de la 4-clorometil-78-dihidroxicumarina 1
Se mezclaron en proporciones equimolares el pirogalol (31 mmoles) junto con el 4-
cloroacetoacetato de etilo con agitacioacuten constante en un bantildeo de agua-hielo sobre la
mezcla se antildeadieron lentamente 25 mL de H2SO4 (tambieacuten friacuteo) esta solucioacuten se
tornoacute de color rojizo oscuro Se dejoacute reaccionar 1 h
La mezcla de reaccioacuten se agregoacute lentamente sobre un bantildeo de agua-hielo-etanol con
vigorosa agitacioacuten y se obtuvo el producto como un precipitado fino que fue lavado
con abundante agua (a fin de eliminar restos aacutecidos) y purificado por re-cristalizacioacuten
en una mezcla etanol agua obtenieacutendose un soacutelido marfil brillante 1 La ruta
sinteacutetica se presenta a continuacioacuten
Figura 42 Siacutentesis del derivado clorado 1
O
OH
OH O
Cl
HO
OH
OH
OEt
Cl
O O
+
H2SO4
1 h
1
Materiales y meacutetodos
30
B Procedimientos de acetilacioacuten
a) Acetilacioacuten de 4-clorometil-78-dihidroxi-cumarina 2
Se suspendioacute la cumarina clorada (3 g) en 6 mL anhiacutedrido aceacutetico y se antildeadioacute 1 gota
de aacutecido sulfuacuterico La solucioacuten fue agitada con calentamiento (45 degC) por 30 min y se
observoacute el progreso de la reaccioacuten mediante el test de FeCl3 el que indica la presencia
o ausencia de grupos ndashOH fenoacutelicos en solucioacuten El precipitado obtenido 5 se
recristalizoacute en etanol su ruta sinteacutetica se muestra en la Figura 43
Figura 43 Siacutentesis del derivado clorado acetilado 5
b) Acetilacioacuten del aacutecido 34-dihidroxicinaacutemico 6
Seguacuten lo descrito en la literatura89
se disolvioacute el aacutecido 34-dihidroxicinaacutemico (aacutecido
cafeico) en solucioacuten 1 M de NaOH sobre un bantildeo de hielo se agregoacute anhiacutedrido
O
OH
HO O
Cl
Ac2O H2SO4
45 degC 30 min
O
O
O O
Cl
5
O
O
Materiales y meacutetodos
31
aceacutetico y de inmediato se aprecioacute la aparicioacuten de un precipitado amarillo claro que
con el paso del tiempo se tornoacute de color marfil Se dejoacute en estas condiciones con
agitacioacuten vigorosa por 30 min El producto 6 fue filtrado y lavado prolijamente con
agua posteriormente se recristalizoacute en etanol obtenieacutendose un soacutelido blanco brillante
La reaccioacuten global se presenta en la Figura 44
HO
HO
OH
O
O
O O
NaOH 30 min
AcO
AcO
OH
O
6
Figura 44 Siacutentesis del aacutecido cafeico acetilado 6
c) Acetilacioacuten del aacutecido gaacutelico7
Se mezclaron 3 g de aacutecido con 7 mL de anhiacutedrido aceacutetico se antildeadioacute 1 gota de H2SO4
Se agitoacute durante 30 min a 47 degC Posteriormente la mezcla fue enfriada y filtrada al
vaciacuteo El producto 7 soacutelido de color blanco se recristalizoacute en etanol La reaccioacuten
global se presenta en la Figura 45
Materiales y meacutetodos
32
O
HO
HO
OH
OHO
O O
H2SO4 30 min
O
AcO
AcO
OAc
OH
7
Figura 45 Siacutentesis del aacutecido gaacutelico acetilado 7
d) Acetilacioacuten del aacutecido 34-dihidroxibenzoico 8
Se mezclaron 3 g de aacutecido con 6 mL de anhiacutedrido aceacutetico se antildeadioacute 1 gota de H2SO4
Se agitoacute por 30 min a 50 degC Luego se enfrioacute y filtroacute al vaciacuteo El producto 8 soacutelido de
color blanco fue recristalizado en etanol la reaccioacuten global se muestra en la Figura
46
O
OH
OH
OHO
O O
H2SO4 30 min
O
OAc
OAc
OH
8
Figura 46 Siacutentesis del aacutecido 34-dihidroxibenzoico acetilado 8
Materiales y meacutetodos
33
C Siacutentesis de los derivados hiacutebridos Procedimiento general
En base a una variante del procedimiento descrito (Ono y colaboradores 1978)90
los
derivados hiacutebridos se obtuvieron mediante la esterificacioacuten de la cumarina acetilada
5 y el correspondiente aacutecido tambieacuten previamente acetilado (6 7 8) Se disolvioacute el
aacutecido (32 mmoles) en 10 mL de DMF (seca recieacuten destilada) a temperatura ambiente
y se agregoacute el DBU en proporcioacuten equimolar se dejoacute reaccionar por 30 min en un
matraz provisto de codo de desecacioacuten (relleno con CaCl2) y agitacioacuten constante Se
agregoacute la cumarina (32 mmoles) y se aprecioacute el fin de la reaccioacuten tras 35 h a 50 degC
de temperatura La solucioacuten se llevoacute a tdeg ambiente y se hizo precipitar
cuidadosamente agregando agua destilada el soacutelido (9 10 y 11) fue lavado
prolijamente se filtroacute y secoacute
La Figura 47 muestra como ejemplo la ruta sinteacutetica llevada a cabo en la obtencioacuten
del derivado de aacutecido cafeico
Figura47 Siacutentesis del intermediario hiacutebrido derivado del aacutecido cafeico
O
OAc
OAc O
Cl
OAc
OAc
HO
O
+ DBU
DMF seco
O
OAc
OAc O
OAc
OAc
O
O
Materiales y meacutetodos
34
Posteriormente se procedioacute a desproteger los grupos fenoacutelicos en el soacutelido mediante
el procedimiento de desacetilacioacuten El producto crudo fue suspendido en una mezcla
de metanol (8 mL) acetona (12 mL) y solucioacuten saturada de NaHCO3 (14 mL) se
agitoacute a temperatura ambiente bajo nitroacutegeno por 3 h
Finalizada la reaccioacuten la suspensioacuten se concentroacute al vaciacuteo se antildeadioacute HCl en friacuteo
formaacutendose un precipitado claro que se filtroacute y lavoacute con abundante agua
posteriormente fue secado cuidadosamente El soacutelido se lavoacute prolijamente con CHCl3
a ebullicioacuten y fue secado al vaciacuteo de esta forma se obtuvo el producto hiacutebrido La
Figura 48 muestra la ruta de desproteccioacuten empleada
Figura48 Siacutentesis del compuesto hiacutebrido final 9
O
OAc
AcO O
OAc
OAc
O
O N2 tdeg amb
O
OH
HO O
OH
OH
O
O
9
hidroacutelisis baacutesica
Materiales y meacutetodos
35
En la Figura 49 se presenta un resumen de la ruta sinteacutetica para las cumarinas
hiacutebridas obtenidas
HO
O
OH
OH4
OH
OH
HO
O
OH
3
OH
OH
HO
O
2
O
OH
HO O
Cl1
ii
HO
O
OAc
OAc8
OAc
OAc
HO
O
OAc
7
OAc
OAc
HO
O
6
O
OAc
AcO O
Cl5
Figura 49A Ruta de siacutentesis de los compuestos cumariacutenicos i) H2SO4 1 h bantildeo de
hielo ii) NaOH Ac2O 30 min bantildeo de hielo (aacutecido cafeico 6) H2SO4 Ac2O
30 min (cumarina y aacutecidos benzoicos)
O
OH
HO O
Cl
HO
OH
OH
OEtCl
O O
+
1
i
Materiales y meacutetodos
36
HO
OOAc
OAc
OAc
OAc
HO
O
OAc
7
OAc
OAc
HO
O
6
OOH
HO O
OH
OH
O
O
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
9
10
11
OOAc
AcO O
Cl5
iiiiv
8
Figura 49B Ruta de siacutentesis de los compuestos cumariacutenicos iii) DBU DMF (seca)
35 h 50 degC iv) NaHCO3 MeOH acetona tdeg amb 3 h N2
Materiales y meacutetodos
37
422 Procedimiento experimental en electroquiacutemica
i) Celda electroquiacutemica
La celda de trabajo estuvo compuesta por tres electrodos el de trabajo de carbono
viacutetreo y superficie 0076 cm2 electrodo de referencia AgAgCl (3 M KCl) inmerso en
puente salino (DMF + HFFTBA 02 M) y alambre de platino como contra-electrodo
ii) Condiciones de trabajo
Los experimentos se realizaron utilizando como solvente aproacutetico NN-
dimetilformamida (previamente destilada y guardada con tamiz molecular 3 Aring) las
soluciones de trabajo en una concentracioacuten de 2 mM para todos los compuestos
continuamente fueron purgadas con nitroacutegeno extra puro el electrolito soporte
utilizado fue HFFTBA (hexafluorofosfato de tetrabutil amonio) en una concentracioacuten
dos oacuterdenes de magnitud superior a la de la muestra
iii) Teacutecnicas empleadas
En el desarrollo de este trabajo se utilizoacute voltamperometriacutea ciacuteclica (VC) y
voltamperometriacutea de pulso diferencial (VPD)
Materiales y meacutetodos
38
iv) Caacutelculos
El proceso de deconvolucioacuten de las graacuteficas en VC se llevoacute a cabo utilizando el
software Origin Pro 8 SR2 (Origin Lab Corporation USA) Se aplicoacute la funcioacuten
Gaussiana (Ecuacioacuten 41)
119910 = 1199100 + 119860
119908 radic120587 119890
minus2(119909minus119909119888)2
1199082 Ecuacioacuten 41
423 Estudio de generacioacuten de especies radicalarias mediante espectroscopiacutea de
resonancia de espiacuten electroacutenico
La oxidacioacuten electroquiacutemica de los compuestos se realizoacute utilizando las
mismas condiciones de potencial de voltametriacutea ciacuteclica una celda compuesta de
electrodo de trabajo de alambre de platino el medio empleado fue DMF + HFFTBA
como contra-electrodo se utilizoacute alambre de platino La estabilizacioacuten del radical
generado en la oxidacioacuten electroquiacutemica se logroacute empleando el catioacuten quelante Zn2+
el cual es silente a la teacutecnica espectroscoacutepica y forma complejos con el grupo catecol
Se utilizoacute ZnCl2 en concentracioacuten final 3 mM
Materiales y meacutetodos
39
424 Procedimiento experimental en el estudio de actividad frente a especies
radicalarias
4241 Metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno
(oxygen radical antioxidant capacity-fluorescein ORAC-FL)
Se prepararon soluciones stock en etanol para cada compuesto de ellas se obtuvieron
las soluciones de trabajo diluidas en solucioacuten buffer fosfato (pH 74) Se antildeadieron
las aliacutecuotas respectivas de concentraciones crecientes de cada compuesto en los
pocillos de la placa (concentraciones finales entre 02 microM y 109 microM que permitieron
obtener curvas de decaimiento apropiadamente separadas) posteriormente se
adicionoacute la sonda fluoresceiacutena (Figura 410 A) (solucioacuten preparada en buffer pH 74 y
concentracioacuten final 40 nM) y se pre-incuboacute 15 min a 37 degC Finalmente se adicionoacute la
aliacutecuota correspondiente de solucioacuten de 22prime-azobis(2-metiilpropionamidina)
dihidrochloridrato (ABAP) la solucioacuten fue preparada en buffer pH 74 y
concentracioacuten final 18 mM (Figura 410 B) y se llegoacute a un volumen final de 200 microL
La placa fue introducida en el lector y se midioacute el decaimiento de la sonda
fluorescente cada 1 min con agitacioacuten previa a cada medicioacuten Para cada set de
medidas fue determinado el blanco correspondiente que contiene la sonda
fluorescente y el generador de radicales peroxilo (ROObull) Se empleoacute el compuesto
Trolox como antioxidante estaacutendar de referencia (Figura 410 C) utilizaacutendose un set
Materiales y meacutetodos
40
de concentraciones entre los 3 microM y 20 microM y el procedimiento anteriormente descrito
para determinar el decaimiento de la fluorescencia de la sonda
La capacidad de inhibicioacuten expresada como valor de iacutendice ORAC se cuantificoacute
utilizando el valor integrado de aacuterea bajo la curva (ABC) de fluorescencia (Figura
411 donde F0 es el valor medido a tiempo 0 y F es el valor de fluorescencia al final
de la medicioacuten cuando se aprecioacute que el decaimiento es total) La ABC neta se obtuvo
de restar el valor del blanco al valor de cada compuesto (ver Ecuacioacuten 42)
ABC neta = ABC compuesto ndash ABC blanco Ecuacioacuten 42
ONaO O
ONa
O
A
O
HO
OH
O
C
Figura 410 A Sonda fluoresceiacutena B 22prime-azobis(2-metilpropionamidina)
dihidrochloridrato (ABAP) C 6-hidroxi-2578-tetrametilcroman-2-aacutecido carboxiacutelico
(Trolox)
-Cl H2N+
NH2
N
N+NH2 Cl-
NH2
B
Materiales y Meacutetodos
41
Figura 411 Actividad antioxidante ORAC-FL para un compuesto en estudio
Finalmente este valor de ABC neta para cada concentracioacuten se graficoacute con respecto a la
concentracioacuten obtenieacutendose una relacioacuten lineal en el rango de estudio La pendiente de
la regresioacuten de cada compuesto fue dividida por el valor de la pendiente del estaacutendar
Trolox (obtenido de la mima forma descrita para las muestras) este coeficiente es el
mencionado Iacutendice ORAC
Los datos fueron procesados mediante el software Origin Pro 8 SR2 (Origin Lab
Corporation USA) Las mediciones se realizaron en triplicado
0 1000 2000 3000 400000
02
04
06
08
10
ABCneta
Antioxidante
Blanco
F
F0
Tiempo s
Materiales y Meacutetodos
42
4242 Metodologiacutea de determinacioacuten de poder antioxidante de reduccioacuten de hierro
(FRAP)
Preparacioacuten de soluciones
i) Preparacioacuten solucioacuten tampoacuten acetato
Se disolvieron 155 g de acetato de sodio trihidrato (CH3COONamiddot3H2O) en agua
ultrapura se agregaron 8 mL de CH3COOH glacial con agitacioacuten constante y se aforoacute
a 500 mL El pH fue ajustado a 36 con NaOH concentrado
ii) Preparacioacuten de solucioacuten tampoacuten fosfato pH 74
Se mezclaron 80 mL de solucioacuten 01 M de NaOH con 100 mL de solucioacuten 01 M de
KH2PO4 se agitoacute para homogeneizar
iii) Preparacioacuten solucioacuten HCl 40 mM
En un matraz aforado (50 mL) se mezclaron 167 microL de HCl 12 M (37) con agua
ultrapura y se agitoacute hasta homogeneizar
iv) Preparacioacuten de solucioacuten TPTZ
Se pesaron 797 mg de reactivo TPTZ (Figura 412) y se aforoacute a 25 mL con solucioacuten
HCl 40 mM se agitoacute y conservoacute protegido de la luz
Materiales y Meacutetodos
43
N
N
N
N
NN
Figura 412 Reactivo 246-tris(2-piridil)-s-triazina (TPTZ)
v) Preparacioacuten solucioacuten de FeCl3 (20 mM)
Se pesaron 0054 g de FeCl3middot6H2O se aforoacute a 10 mL con agua ultrapura y se agitoacute
constantemente
vi) Preparacioacuten del reactivo FRAP
Se mezcloacute el tampoacuten acetato con solucioacuten TPTZ y solucioacuten feacuterrica en proporcioacuten
1011 se agitoacute y conservoacute al abrigo de la luz
vii) Preparacioacuten de soluciones en estudio
Se mezclaron aliacutecuotas de solucioacuten stock (en etanol) de cada compuesto con tampoacuten
fosfato luego se agitaron y se obtuvieron soluciones en concentraciones entre 15 microM y
58 microM
Materiales y Meacutetodos
44
Ensayo de capacidad reductora
En un frasco aacutembar se mezclaron 150 microL de solucioacuten de muestra con 450 microL de agua
ultrapura y posteriormente 950 microL de reactivo FRAP La solucioacuten se agitoacute e
inmediatamente se tornoacute de color azul lo que indicoacute la reaccioacuten de oxidacioacuten de Fe2+
a Fe3+
en el complejo formado con el reactivo TPTZ Se midioacute el espectro de
absorbancia en el rango del UV-visible a temperatura ambiente considerando el valor
de λmaacutex = 599 nm Los experimentos se realizaron en triplicado los valores obtenidos
para este ensayo se expresan como equivalentes de Trolox 10 microM de muestra
4243 Capacidad de apagamiento del radical hidroxilo (OHbull) mediante la teacutecnica
spin trap
Se realizoacute el ensayo mediante la metodologiacutea de Fenton no cataliacutetico comparando las
sentildeales en el espectro mediante espectroscopia de resonancia de espiacuten electroacutenico
(REE) del aducto DMPO-OH como blanco frente a las sentildeales obtenidas en las
mismas condiciones tras antildeadir los compuestos en estudio Para la generacioacuten del
radical hidroxilo se utilizoacute peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2) y solucioacuten acuosa de NaOH
metodologiacutea que presenta la ventaja de que en ausencia de iones Fe2+
(como en la
metodologiacutea Fenton) se evitoacute la reaccioacuten de quelacioacuten con los grupos catecol presentes
en las estructuras propuestas91ab
Materiales y Meacutetodos
45
-10 -08 -06 -04
Ipa0
O2 + e
- O
2
-
O2
-O
2 + e
-
10 A
E vs Ag|AgCl V
Se prepararon soluciones stock (20 mM en DMF) de cada compuesto en estudio se
tomaron aliacutecuotas de 100 microL y se agregaron 50 microL de NaOH (25 mM) 50 microL de
solucioacuten de 55-dimetil-1-pirroline-N-oacutexido (DMPO) (30 mM) y finalmente 50 microL de
agua oxigenada (30) se agitoacute cuidadosamente se incuboacute por 5 minutos y se midioacute
su espectro Los resultados se expresaron como el porcentaje de inactivacioacuten del
radical hidroxilo
4244 Estudio de reactividad frente a anioacuten radical superoacutexido O2middot -
Se evaluoacute la reactividad de cada compuesto frente al radical anioacuten superoacutexido el que
fue generado electroquiacutemicamente en la superficie del electrodo a traveacutes de la
reduccioacuten del oxiacutegeno molecular disuelto en el medio (Figura 413)
Figura 413 Voltamograma ciacuteclico de la generacioacuten de anioacuten radical superoacutexido
DMF + HFFTBA 02 M en electrodo de carbono viacutetreo
Materiales y Meacutetodos
46
i) Celda electroquiacutemica
La celda estuvo compuesta de tres electrodos el electrodo de trabajo fue carbono
viacutetreo (aacuterea = 003 cm2) el electrodo auxiliar empleado fue Ag|AgCl (KCl 3 M
inmerso en DMF + HFFTBA 02 M como puente salino) y alambre de platino como
contra-electrodo
ii) Teacutecnica empleada
La generacioacuten del radical se realizoacute mediante voltamperometriacutea ciacuteclica (VC) a
velocidad de barrido de 01 Vs en un rango de potencial entre 0 V (inicial) y -1 V
como potencial de inversioacuten de la direccioacuten de barrido (switching) 92
iii) Experimento
Los experimentos se realizaron utilizando como solvente 10 mL de NN-
dimetilformamida (previamente destilada) el electrolito soporte utilizado fue
HFFTBA (hexafluorofosfato de tetrabutil amonio) en concentracioacuten 02 M las
soluciones fueron saturadas con aire continuamente Una vez estabilizada la corriente
se antildeadieron a la celda aliacutecuotas crecientes de solucioacuten stock de cada compuesto
observaacutendose la disminucioacuten en la corriente de pico anoacutedica Ipa0 Una vez obtenidos
los voltamogramas se determinoacute el paraacutemetro adimensional ((Ipa0-Ipa
S) Ipa
0) el que
expresoacute el consumo de la especie radical este valor se graficoacute con respecto a la
concentracioacuten del sustrato cuya relacioacuten fue una regresioacuten lineal De la graacutefica se
Materiales y Meacutetodos
47
obtuvo el valor de concentracioacuten de antioxidante en que la corriente de pico anoacutedico
disminuye en un 50 (IA50)
4245 Estudio de la capacidad antioxidante celular (CAC)
Para evaluar la actividad antioxidante de los compuestos estudiados en un medio
celular se utilizoacute el meacutetodo descrito en la literatura por Wolfe93
Se emplearon ceacutelulas
EAhy 926 (ATCC CRL-2922) las que fueron sembradas con una densidad de
50000 ceacutelulas por pocillo en microplacas de 96 pocillos con medio de cultivo
RPMI 1640 Despueacutes de 24 h fue removido el medio de cultivo y los pocillos
fueron lavados con buffer fosfato salino (PBS) pH 74 Los pocillos fueron tratados
con 20 μM de la sonda DCFH-DA disuelta en RPMI 1640 libre de suero fetal bobino
Posteriormente se agregaron los compuestos en dos concentraciones diferentes 1 μM y
10 μM Luego de transcurrida 1 h de incubacioacuten a 37 degC los pocillos fueron
lavados con PBS Luego de esto se agregoacute ABAP en una concentracioacuten final de
600 μM y se midioacute la fluorescencia generada por la sonda en el multi-lector de placas
a temperatura constante de 37 degC La emisioacuten a 538 nm fue medida con una excitacioacuten
a 485 nm cada 1 min por 1 hora El ensayo se realizoacute en triplicado El valor de
capacidad antioxidante se calcula determinando el aacuterea bajo la curva para la muestra y
el control experimental utilizando la siguiente ecuacioacuten
CAC = 100 ndash (ABCmuestra ABCcontrol) 100 Ecuacioacuten 43
Materiales y Meacutetodos
48
4246 Estudio de hidrofobicidad relativa de los compuestos
La hidrofobicidad de los compuestos se correlaciona con sus coeficientes de reparto y
distribucioacuten (log P para el reparto octanolagua y log D para la distribucioacuten
octanolsolucioacuten tampoacuten pH 74) los que se determinan utilizando teacutecnicas
espectrofotomeacutetricas yo cromatograacuteficas
Para realizar estas experiencias se determina la solubilidad del analito en octanol
saturado con agua y en la solucioacuten tampoacuten pH 74 saturado con octanol Luego se
obtienen las respectivas curvas de calibracioacuten para la concentracioacuten del compuesto en
estas soluciones en funcioacuten de la absorbancia yo aacuterea bajo la curva Se espera que las
curvas de calibracioacuten obtenidas cumplan con el requisito de una linealidad apropiada
Posteriormente se debe evaluar el reparto midiendo la concentracioacuten analiacutetica en la
fase orgaacutenica y acuosa Para la determinacioacuten del reparto estaacute descrita la siguiente
ecuacioacuten
119897119900119892119875119900119888119905119886119892119906119886 = log ([119904119900119897119906119905119900]119900119888119905119886119899119900119897
[119904119900119897119906119905119900]119886119892119906119886) Ecuacioacuten 44
Mientras que para la determinacioacuten de la distribucioacuten se utiliza la siguiente ecuacioacuten
119897119900119892119875119900119888119905119886119892119906119886(119905119886119898119901oacute119899) = log ([119904119900119897119906119905119900]119900119888119905119886119899119900119897
[119904119900119897119906119905119900]119905119886119898119901oacute119899 119901119867 74) Ecuacioacuten 45
Materiales y Meacutetodos
49
Para este estudio se realizoacute la determinacioacuten de tiempos de retencioacuten como medida de
la hidrofobicidad relativa entre compuestos Se utilizoacute una columna C18 ODS Hypersil
una fase moacutevil compuesta de acetonitrilo solucioacuten H3PO4 (6535 vv) bajo
condiciones isocraacuteticas con flujo 1 mLmin volumen de inyeccioacuten 50 microL
4247 Estudio teoacuterico caacutelculo del Iacutendice de Fukui
La optimizacioacuten de estructuras de los compuestos neutros se realizoacute utilizando el
meacutetodo DFTSP-DFT basado en la Teoriacutea de Funcionales de la Densidad (DFT)94-96
Se utilizoacute el funcional hiacutebrido B3LYP el conjunto de bases empleado fue 6-31G(d)
Los caacutelculos se realizaron mediante el software Gaussianrsquo09 Los descriptores locales
se evaluaron a traveacutes de la aproximacioacuten de orbitales condensados Orbitales
Moleculares Frontera (Mulliken MOs)
Resultados y discusioacuten
50
5 Resultados y discusioacuten
51 Siacutentesis de los compuestos
Se presentan a continuacioacuten los resultados de la caracterizacioacuten fiacutesica y
espectroscoacutepica de los compuestos sintetizados durante este trabajo
4-clorometil-78-dihidroxicumarina (1)
1H RMN (DMSO d6 δ ppm) 493 (s 2H -CH2-) 641 (s 1H =CH- cumarina) 686
(d 1Harom Jorto 85) 717 (d 1Harom Jorto 85) 942 (s1H OH) 1022 (s 1H OH)
13C RMN (DMSO d6 δ ppm) 4187 11047 11129 11267 11585 13282 14358
15017 15181 16046 Rendimiento 47 Punto de fusioacuten 202-204 degC Agujas
color marfil PM 2265gmol Foacutermula molecular C10H7O4Cl
4-clorometil-78-diacetilcumarina (5)
1H RMN (DMSO d6 δ ppm) 235 (s 3H -CH3) 241 (s 3H-CH3) 506 (s 2H -
CH2-) 674 (s 1H =CH- cumarina) 739 (d 1Harom Jorto 878) 783 (d 1Harom Jorto
878)13
C RMN (DMSO d6 δ ppm) 1943 1985 3983 4073 11467 11549
11871 12238 12939 14459 14593 14999 1578716751 Rendimiento 68
Punto de fusioacuten 157-159 degC Soacutelido blanco PM 3105 gmol Foacutermula molecular
C14H11O6Cl
Resultados y discusioacuten
51
Aacutecido-34-diacetoxicinaacutemico (6)
1H RMN (acetona d6 δ ppm) 215 (s 3H -CH3) 216 (s 3H CH3) 638-643 (d 1H
Jtrans 159) 717-720 (d 1Harom Jorto 878) 748-750-756 (s Harom y Htrans) 13
C RMN
(acetona d6 δ ppm)1996 2004 11977 12333 12450 12682 13364 14323
14339 14439 16699 16809 16817 Rendimiento 56 Punto de fusioacuten
158-161 degC Soacutelido blanco PM 264 gmol Foacutermula molecular C13H12O6
Aacutecido-345-triacetilbenzoico (7)
1H RMN (acetona d6 δ ppm) 217 (s 6H -CH3) 219 (s 3H -CH3) 767 (s 2H
Harom) 13
C RMN (acetona d6 δ ppm) (2C -CH3 1865) (2C-C=O 1910) (2Carom
12160) 12790 13857 (2C 14337) 16432 16599 16789 Rendimiento 66
Punto de fusioacuten 158-160 degC Soacutelido blanco PM 296 gmol Foacutermula molecular
C13H12O8
Aacutecido 34-diacetilbenzoico (8)
1H RMN (acetona d6 δ ppm) 217 (s 6H CH3) 724-727 (d 1Harom Jorto 85) 774-
775 (d 1Harom) 781-784 (dd 1Harom) 13
C RMN (acetona d6 δ ppm) 1910 1913
(2C 12329) 12453 12729 12838 16487 16699 16729 Rendimiento 61
Punto de fusioacuten 155-158 degC Soacutelido blanco PM 238 gmol Foacutermula molecular
C11H10O6
Resultados y discusioacuten
52
4-metil-(34-dihidroxicinamoato)-78-dihidroxicumarina (9)
1H RMN (DMSOd6 δppm) 541(s 2H -CH2-) 621(s 1H =CH- cumarina) 642-
648 (d 1H Jtrans= 1591) 682-71 (Harom) 758-763 (d 1H Jtrans = 1591) 91 (s -
OH) 94 (s -OH) 97 (s -OH) 102 (s- OH)13
C RMN (DMSO d6 δppm) 6154
10820 11035 11290 11345 11526 11550 11620 12225 12566 13292
14391 14607 14686 14920 15026 15174 16055 16646ESI-MS mz 371
[M+H]+ 369 [M-H]
- 181 [M+H]
+ 163 [M-H2O+H]
+ 145 [M-H2O+H]
+ 135 [M-
HCOOH+H]+ 179 [M-H]
- 161 [M-H2O-H]
- 135 [M-CO2-H]
-Rendimiento 37
Punto de fusioacuten 246-249 degC Soacutelido amarillo opaco PM 37031 gmol Foacutermula
molecular C19H14O8
4-metil-(345-dixidroxibenzoato)-78-dihidroxicumarina ( 10 )
1H RMN (DMSO d6 δ ppm) 546 (s 2H -CH2-) 619 (s 1H =CH- cumarina) 682-
685 (d 1Harom Jorto 8508) 704 (s 2Harom) 709-712 (d 1Harom Jorto 778)13
C RMN
(DMSO d6 δppm) 6192 10821 10914 11041 11295 11533 11885 13292
13949 14394 (2Carom) 14620 15024 15184 16055 16555 16793ESI-MS mz
361 [M+H]+ 359 [M-H]
- 171 [M+H]
+ 153 [M-H2O+H]
+ 125 [M-CO2H+H]
+ 169
[M-H]- 125 [M-CO2-H]
- Rendimiento 46 Punto de fusioacuten descomposicioacuten sobre
230 degC Soacutelido amarillo opaco PM 36027 gmol Foacutermula molecular C17H12O9
Resultados y discusioacuten
53
4-metil-(34-dihidroxibenzoato)-78-dihidroxicumarina (11)
1H RMN (DMSO d6 δ ppm) 548 (s 2H -CH2-) 619 (s 1H =CH- cumarina) 685
(m 2Harom) 71 (d 1Harom) 74 (d 2Harom) 13
C RMN (DMSO d6 δ ppm) 6142
10774 10988 11242 11481 11551 11626 11957 12218 13240 14343
14520 14972 15096 15127 16001 16490 ESI-MS mz 345 [M+H]+ 343 [M-
H]- 137 [M-H2O+H]
+ 109 [M-HCOOH+H]
+ 153 [M-H]
- 108 [M-CO2-H]
-
Rendimiento 73 Punto de fusioacuten descomposicioacuten sobre 250 degC Soacutelido amarillo
opaco PM 34427 gmol Foacutermula molecular C17H12O8
Resultados y discusioacuten
54
52 Estudios de voltametriacutea ciacuteclica y voltametriacutea de pulso diferencial
El proceso de oxidacioacuten electroquiacutemico de los compuestos fue evaluado mediante
voltamperometriacutea de pulso diferencial VPD Los resultados presentaron soacutelo un pico
de oxidacioacuten para los compuestos 1 2 4 y 9 por otra parte el aacutecido gaacutelico 3 y los
hiacutebridos 10 y 11 mostraron dos o maacutes sentildeales poniendo de manifiesto las complejas
reacciones de oxidacioacuten que presentan los grupos -OH en dichas estructuras (Figura
51 A y B)97
Al analizar las sentildeales tanto para los precursores y sus derivados hiacutebridos se encontroacute
que la uacutenica sentildeal anoacutedica del compuesto 9 corresponderiacutea tanto a la oxidacioacuten del
catecol presente en la cumarina 1 (Epa 083 V) como del aacutecido cafeico 2 (Epa 076 V)
(Figura 52 A) ambos compuestos por separado tuvieron potenciales de pico anoacutedico
cercanos los que se solaparon para una dar una sola sentildeal en el derivado 9 (Epa 082
V)
Figura 51 A
Voltamperogramas de pulso
diferencial para los
precursores 1 2 3 y 4 2 mM
en DMF + HFFTBA 02 M
00 03 06 09 12 15 18 21 24
OO H
O H
H O
OOH
OH
HO
OH
OH
OH
O
HO
OOH
OH O
Cl
A
2A
E vs Ag|AgCl V
1
2
3
4
Resultados y discusioacuten
55
Figura 51 B Voltamperogramas de pulso diferencial para los derivados 9 10 y 11
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
En el caso del hiacutebrido 11 derivado del aacutecido protocateacutequico se observaron dos picos de
oxidacioacuten que corresponderiacutean a la oxidacioacuten del catecol cumariacutenico (Epa 083 V) y el
catecol del aacutecido benzoico (Epa 111 V) A diferencia del caso anterior se encontroacute
que las sentildeales anoacutedicas de ambos precursores estuvieron lo suficientemente distantes
como para solaparse como en el caso anterior Considerando que los resultados se
obtuvieron bajo las mismas condiciones experimentales se podriacutea asumir que la sentildeal
a potencial Epa1 081 V corresponde a la oxidacioacuten en el anillo de la cumarina y la
sentildeal en Epa2 094 V corresponde a la oxidacioacuten del catecol presente en el anillo
benceacutenico Para el compuesto 10 se observoacute un comportamiento semejante al descrito
para 11
00 03 06 09 12 15 18 21 24
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OH O O
O
OO H
O H
O H
OOH
OH O
OH
OH
O
O
B
E vs Ag|AgCl V
9
10
11
2A
Resultados y discusioacuten
56
Los experimentos de voltamperometriacutea ciacuteclica se llevaron a cabo a distinta velocidad
de barrido 005 Vs ndash 3 Vs con el objeto de estudiar su influencia sobre la sentildeal de
oxidacioacuten En forma graacutefica para precursores y derivados se observaron pares redox de
comportamiento irreversible debido al evidente desplazamiento del potencial de pico
Epa con respecto al aumento de la velocidad de barrido El valor de ΔEp (Epa -Epc) se
incrementoacute con el aumento en la velocidad lo que indica una disminucioacuten en la
velocidad de transferencia electroacutenica Para los compuestos 1 2 4 y 9 a la velocidad
de barrido estudiada se observoacute al igual que en VPD la aparicioacuten de una uacutenica sentildeal
de oxidacioacuten para todo el rango de velocidad (la que se desplaza a potenciales maacutes
positivos a medida que aumenta la velocidad de barrido) seguida de una sentildeal de
reduccioacuten en el barrido hacia potenciales negativos Para los compuestos 3 10 y 11 se
apreciaron dos sentildeales de oxidacioacuten seguida de la correspondiente sentildeal en el barrido
de reduccioacuten
Para cada par redox se realizaron estudios por segmentos encontraacutendose para los
compuestos 9 y 10 que el pico I (de oxidacioacuten) estaacute relacionado con el pico II (de
reduccioacuten) y para el compuesto 11 las sentildeales I y Irsquo (de oxidacioacuten) estaacuten relacionadas
con el pico II (de reduccioacuten) Esto es indicio de que en el primer barrido se observa el
proceso de oxidacioacuten de los grupos fenoles en el cual se generan especies factibles de
ser reducidas como derivados de tipo quinoacutenico (Figuras 52 a 54)
Resultados y discusioacuten
57
Figura 52A VC para el derivado 9 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 53A VC para el derivado 10 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
-03 00 03 06 09 12 15
A
II
I
OOH
OH O
OH
OH
O
O
100 A
005 Vs
3 Vs
E vs Ag|AgCl V
03 06 09 12 15
B
II
I
E vs Ag|AgCl V
0 V - 13 V
0 V - 06 V
00 03 06 09 12 15 18
A
II
I
I
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
3 Vs
005 Vs
E vs Ag|AgCl V
00 03 06 09 12
B
II
I
E vs Ag|AgCl V
-02 V - 06 V
-02 V - 11 V
Resultados y discusioacuten
58
Figura 54 A VC para el derivado 11 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
En sistemas fenoacutelicos simples como es el caso del catecol o la hidroquinona se ha
estudiado el proceso redox en distintos medios 98-101
planteaacutendose que la oxidacioacuten en
medio aproacutetico deriva en la formacioacuten de la quinona correspondiente viacutea 2e-2H
+
(Figura 55) En esta investigacioacuten se han estudiado estructuras de mayor complejidad
y considerando que en este proceso de oxidacioacuten se ha descrito la presencia de
especies radicales como intermediarios de reaccioacuten es probable que ocurran procesos
de dimerizacioacuten o ataques nucleofiacutelicos por parte de los radicales dando como
resultado la generacioacuten de compuestos diferentes a la moleacutecula de partida (por
ejemplo de mayor peso molecular) Este tipo de comportamiento se puede analizar en
profundidad realizando barridos de potencial consecutivos en VC a baja velocidad de
00 03 06 09 12 15
I
II
I
A
100 A
OHO O
O
OOH
OH
OH
005 Vs
3 Vs
E vs Ag|AgCl V
00 03 06 09 12 15
II
I
IB
E vs Ag|AgCl V
-01 V - 07 V
-01 V - 14 V
Resultados y discusioacuten
59
barrido (005 Vs o menor para observar maacutes detalladamente la reaccioacuten quiacutemica en la
escala de tiempo del experimento) Si fuese el caso se esperariacutea observar la aparicioacuten
de sentildeales nuevas en el segundo barrido de oxidacioacuten que dariacutean cuenta de la
oxidacioacuten de las nuevas estructuras fenoacutelicas generadas
OH
OH-2e- -2H+
2e- 2H+
O
O
Figura 55 Esquema del proceso electro-oxidativo propuesto para el catecol
Se realizoacute la deconvolucioacuten (mediante la funcioacuten gaussiana) sobre las curvas de
oxidacioacuten para los compuestos con el objeto de determinar los valores de corriente de
pico anoacutedica de forma independiente con esto se obtienen valores de corriente y
potencial (principalmente a alta velocidad de barrido) los cuales son maacutes exactos que
los entregados por defecto por el software electroquiacutemico utilizado Las graacuteficas y
caacutelculos correspondientes a la relacioacuten entre los diferentes paraacutemetros analizados se
realizaron considerando los valores de Ipa y Epa para el primer pico oxidativo debido a
que esta sentildeal entrega informacioacuten con respecto a la energiacutea del primer electroacuten cedido
en el proceso de oxidacioacuten etapa que generalmente es lenta y determinante de la
velocidad de reaccioacuten
Resultados y discusioacuten
60
La expresioacuten indicada en la Ecuacioacuten 51102
da cuenta de la relacioacuten entre el potencial
de pico y el logaritmo de la velocidad de barrido para una reaccioacuten electroquiacutemica
irreversible
119864119901 119894119903119903119890119907 = 11986412 + 119887
2[104 minus log (
119887
119863) minus 2119897119900119892119896119891 + 119897119900119892119907] Ecuacioacuten 51
Por tanto de la graacutefica Ep vs logv se puede obtener el valor de la pendiente de Tafel b
que es igual al doble de la pendiente de la recta obtenida
119864119901 119894119903119903119890119907 = 119862119905119890 + 119887
2(119897119900119892119907) Ecuacioacuten 52
La graacutefica de potencial de pico anoacutedico (Epa) vs logv dio como resultado una relacioacuten
de tipo lineal para todos los compuestos el potencial de oxidacioacuten se desplazoacute hacia
valores maacutes positivos con el aumento de la velocidad de barrido lo que indica el
caraacutecter irreversible del proceso oxidativo en este medio En la Figura 56 se presenta
la graacutefica obtenida para el derivado 9 como ejemplo representativo de los resultados
obtenidos
Resultados y discusioacuten
61
Figura 56 Relacioacuten Epa vs logv para el derivado de aacutecido cafeico 9 2 mM en
DMF + HFFTBA 02 M
Los valores obtenidos para la pendiente de Tafel se resumen en la Tabla 51 Los
compuestos 1 y 3 poseen valores de la pendiente de Tafel cercanos al teoacuterico (118
mVdec)103
para un proceso en que la primera transferencia electroacutenica es la etapa
lenta del proceso (por tanto la etapa determinante de la reaccioacuten de electro-oxidacioacuten)
El compuesto 4 presenta un valor de 88 mVdec lo que sugiere que el electrodo estaacute
contaminado103104
o se produce un mecanismo de oxidacioacuten complejo (que implica
una transicioacuten entre la etapa quiacutemica y la transferencia electroacutenica como determinante
de la velocidad)105
De la misma forma los valores encontrados para los derivados 9
(170 mVdec) 10 (134 mVdec) y 11 (140 mVdec) y para el aacutecido cafeico (212
mVdec) indican que en las condiciones experimentales utilizadas la superficie del
18 21 24 27 30 33 36
090
093
096
099
102
105
OOH
OH O
OH
OH
O
O
r = 098638
m = 008548
Ep
a1 (
V)
logv (mV12
s-12
)
Resultados y discusioacuten
62
electrodo se contamina (pasiva)106
con la generacioacuten de especies polimeacutericas debido a
la formacioacuten del radical fenoxilo (ArObull) el cual puede dimerizar y originar diversos
productos de reaccioacuten los cuales se adhieren a la superficie del electrodo
Para cada compuesto se establecioacute la existencia de una relacioacuten de tipo lineal entre el
logaritmo de la corriente de pico anoacutedico y el logaritmo de la velocidad de barrido
(logIpa vs logv) El valor para la pendiente de estas rectas estuvo entre 044 y 056
(Tabla 51) lo que sugiere que el proceso observado es de tipo difusivo
La corriente de pico anoacutedica se puede expresar en funcioacuten de distintos paraacutemetros
experimentales como se indica en la Ecuacioacuten 53102
119868119901 = 301 times 10minus5 119899 (23 119877 119879
119887 119865)
12
11986312 119862 11990712 Ecuacioacuten 53
Donde n es el nuacutemero de electrones transferidos R es la constante de los gases (Jmol
K) T es la temperatura (K) D es el coeficiente de difusioacuten de la especie electro-activa
(cm2s) F es la constante de Faraday (Cmol) b es la pendiente de la ecuacioacuten de
Tafel107
(η = a + b log i) C es la concentracioacuten de la especie electro-activa (molL) y v
es la velocidad de barrido (mVs) Esta expresioacuten indica que la correlacioacuten entre
Ip y vfrac12
da como resultado una recta que seraacute funcioacuten del nuacutemero de electrones n y la
pendiente de Tafel b valores que estaacuten presentes en la pendiente de esta recta
Resultados y discusioacuten
63
Considerando lo anterior se procedioacute a graficar Ipa vs vfrac12
encontraacutendose para todos los
compuestos (Figura 57) una relacioacuten de tipo lineal con valores de r entre 099988 y
099448 se presenta ademaacutes la regresioacuten para el aacutecido protocateacutequico 4 como muestra
del comportamiento encontrado para todos los compuestos con valores de intercepto
que tienden a cero Al observar la Tabla 51 se aprecia que todas las regresiones
poseen una pendiente semejante lo cual da un indicio con respecto al nuacutemero de
electrones y mecanismo involucrados en la reaccioacuten de oxidacioacuten estudiada
Figura 57 Graacutefica para la corriente de pico Ipa vs la raiacutez cuadrada de la velocidad de
barrido Ejemplo de correlacioacuten lineal en el aacutecido protocateacutequico 4 2 mM en DMF +
HFFTBA 02 M
Tomando en cuenta que los valores de C R T y F (Ecuacioacuten 53) son factores
constantes y que los coeficientes de difusioacuten D seraacuten semejantes y del mismo orden
para aquellos compuestos de estructura similar (precursores por una parte y derivados
por otra) se obtiene que la pendiente de la recta obtenida en esta correlacioacuten es un
0 10 20 30 40 50 600
50
100
150
200
250
Ipa (
A)
V12
(mV12
s-12
)
OOH
OH
HO
m = 40 10-6
r = 099988
Resultados y discusioacuten
64
indicador respecto al nuacutemero de electrones involucrados en la reaccioacuten y al valor de b
(relacionado con el mecanismo de oxidacioacuten estudiado)
En el caso de los compuestos precursores se obtuvieron valores de pendientes entre
36bull10-6
y 41bull10-6
(Tabla 51) este rango cercano indica la transferencia del mismo
nuacutemero de electrones en el proceso oxidativo observado en que para la cumarina
clorada 1 el aacutecido cafeico 2 y el aacutecido protocateacutequico 4 corresponde a la uacutenica sentildeal
de oxidacioacuten observada y en el caso del aacutecido gaacutelico 3 es el proceso correspondiente a
la primera sentildeal del voltamograma En la literatura se describen estudios en medio
aproacutetico para compuestos fenoacutelicos como por ejemplo derivados de la cumarina 78-
dihidroxilada 100ab
el aacutecido cafeico101
y la hidroquinona105
que dan cuenta de una sentildeal
en el proceso oxidativo en medio aproacutetico que involucra 2 electrones esto permite
inferir que las sentildeales observadas experimentalmente corresponden a un proceso di-
electroacutenico
Para los derivados 9 10 y 11 se observa que los valores para la pendiente Ipa vs vfrac12 se
encuentran entre 37bull10-6
y 42bull10-6
como se indica en la Tabla 51 Ademaacutes al
comparar estos resultados con los obtenidos para el caso de los precursores se deduce
que estamos frente a un proceso oxidativo que involucra dos electrones Se observa
tambieacuten que no hay cambios con respecto al mecanismo de reaccioacuten si lo hubiese se
esperariacutea encontrar diferencias del doble o superior en los valores encontrados para la
pendiente de la recta ya que eacutesta contiene el factor b (pendiente de la ecuacioacuten de
Tafel) antes mencionado
Resultados y discusioacuten
65
Posteriormente se calculoacute el valor correspondiente al potencial de inicio del proceso
electroquiacutemico (Eonset)108109
Este valor indica el potencial inicial con que el primer
electroacuten es cedido en el proceso oxidativo que tiene lugar en la superficie del
electrodo Se determina como el valor de potencial de interseccioacuten entre las recta
tangentes a la liacutenea base y la corriente de oxidacioacuten para cada velocidad de barrido
aplicada en forma experimental (005 Vs a 3 Vs en este estudio) (Figura 58) Una
vez obtenido este potencial se procede a graficar con respecto al logaritmo de la
velocidad de barrido como se presenta en la Figura 59 Se considera el valor del
intercepto de cada recta Eionset (por lo tanto a una baja velocidad de barrido) el cual
incluye el error inherente a la medicioacuten y por tanto es maacutes confiable (Tabla 51) Se
observa que estos potenciales variacutean entre 050 V y 079 V para el aacutecido gaacutelico 3 y el
aacutecido protocateacutequico 4 respectivamente potencial que da indicio de la factibilidad de
oxidacioacuten siendo el compuesto con un Eionset menor el que se oxida con mayor
facilidad Estos valores de potencial onset encontrados permitiraacuten establecer una
correlacioacuten entre el potencial de oxidacioacuten determinado de esta forma y los resultados
obtenidos en los ensayos de actividad frente a especies radicales llevados a cabo en
medio aproacutetico (seccioacuten 6)
Resultados y discusioacuten
66
Figura 58 Determinacioacuten graacutefica del valor de Eonset VC del precursor 1 01 Vs
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 59 Relacioacuten Eonset vs logv para los compuestos estudiados
-05 00 05 10 15 20
20 A
Eonset
E vs Ag|AgCl (V)
15 18 21 24 27 30 33 3606
07
08
09
10
11
12
OOH
OH
HO
OOH
OH
HO
OH
OH
OH
O
HO
OHO O
O
OOH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OOH
OH O
OH
OH
O
O
OOH
HO O
Cl
Eon
set
(V)
logv (mV12
s-12
)
Resultados y discusioacuten
67
Tabla 51 Paraacutemetros experimentales para los compuestos Determinaciones en VC
2 mM DMF + HFFTBA 02 M
Compuesto
119837119845119848119840119816119849119834120783
119837119845119848119840119855 (microAmVs
-1)
119837119816119849119834120783 119837119855120783120784
(microAmV12
s-12
)
119837119812119849119834120783
119837119845119848119840119855
(mVdec)
119835 = 120784 119837119812119849119834120783
119837119845119848119840119855
(mVdec)
Eionset
(mV)
056 36bull10-6
61 122 059
053 41bull10
-6 106 212 059
048 36bull10-6
55 110 050
O
OH
OH
HO
052 41bull10-6
44 88 079
047 40bull10-6
85 170 064
049 37bull10-6
67 134 075
044
42bull10-6
70 140 058
Con el objeto de recabar mayor informacioacuten con respecto al mecanismo de reaccioacuten
involucrado en los procesos oxidativos en estudio en base a los resultados obtenidos
OHO O
O
OOH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
O
OH
OH O
OH
OH
O
O
OOH
OH
HO
OH
OH
OH
O
HO
O
OH
HO O
Cl
Resultados y discusioacuten
68
en VC se realizoacute la graacutefica (Ipa v12
) vs v12
para los compuestos precursores 1 2 3 y
4 (escogidos por poseer un grupo catecol y ser estructuras de menor complejidad que
los derivados 9 10 y 11) Estas graacuteficas de las que se presenta el ejemplo del aacutecido
como muestra (Figura 510) presentaron una relacioacuten de tipo lineal en la que la
pendiente negativa obtenida sugiere que la reaccioacuten observada implica un mecanismo
de tipo EC considerando los estudios mencionados para compuestos fenoacutelicos
ampliamente descritos en la literatura100101105109
y el criterio de diagnoacutestico
mencionado por Pletcher y colaboradores111
Figura 510 Correlacioacuten (Ipa v12
) vs v
12 para el precursor aacutecido protocateacutequico 4
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
21 28 35 42 49 5626
28
30
32
34O
OH
OH
HO
r = -099302
V12
(mV12
s-12
)
Ipa
V12 (
A
mV
12s-1
2)
Resultados y discusioacuten
69
Diversos estudios proponen la presencia de mecanismos concertados para los procesos
redox de compuestos de tipo fenoacutelico los cuales implican la presencia de
intermediarios radicalarios y reacciones donde la transferencia de un protoacuten y un
electroacuten ocurren de forma acoplada dentro de un mismo paso Este concepto nace en la
deacutecada de 1990 a partir de los trabajos publicados por Biczoacutek y colaboradores112113
El estudio de este tipo de reacciones principalmente en derivados fenoacutelicos es de
relevancia debido al rol que eacutestos desempentildean en diferentes sistemas bioloacutegicos tanto
por su reconocida capacidad antioxidante como se evidencia en la investigacioacuten
realizada por Nakayama y colaboradores con respecto a derivados polifenoacutelicos y el
mecanismo de reaccioacuten propuesto de tipo PCET (Proton Concerted Electron Transfer)
frente al anioacuten superoacutexido114
o como en el caso de estudio de las reacciones de
transferencia electroacutenica que involucran al aminoaacutecido tirosina115ab
y otros co-factores
que forman parte esencial del proceso fotosinteacutetico que se lleva a cabo en estructuras
vegetales (Fotosistema II)116
En la deacutecada pasada los aportes a la investigacioacuten sobre el tema se tornaron maacutes
profundos y sistemaacuteticos permitiendo el modelamiento teoacuterico y anaacutelisis de este tipo
de mecanismos Debido al intereacutes concerniente a la obtencioacuten de modelos racionales
de sistemas bioloacutegicos los estudios realizados en medio proacutetico son variados como la
serie de derivados fenol-imidazol sintetizados y caracterizados por Markle y
colaboradores117
quienes entre diversos factores analizan el efecto del sustituyente
sobre el enlace O-H Otros autores como Saveacuteant Costentin y colaboradores han
abordado este toacutepico en diferentes publicaciones proponiendo distintos mecanismos
Resultados y discusioacuten
70
dependientes del pH y composicioacuten de la solucioacuten de trabajo (con buffer o sin eacutel)118
En trabajos posteriores plantean un estudio teoacuterico de modelamiento en sistemas de
tipo amino-fenol enfocados en el mencionado Fotosistema II119
y frente al sistema
enzimaacutetico superoacutexido dismutasa120
Rhile y colaboradores describen la siacutentesis
caracterizacioacuten y estudios de oxidacioacuten tanto quiacutemica como electroquiacutemica (en medio
aproacutetico acetonitrilo) de una serie de fenol-aminas junto con un anaacutelisis teoacuterico del
sistema evidenciaacutendose la presencia de especies radicales intermediarias121
junto con
valores entre 16 a 28 para la relacioacuten de efecto isotoacutepico cineacutetico (KI = kHkD) que se
estima como criterio para considerar un mecanismo concertado122
El estado del arte con respecto a los distintos mecanismos electro-oxidativos descritos
para los derivados fenoacutelicos indica que la determinacioacuten de una ruta en particular en
este proceso se puede establecer mediante estudios de naturaleza tanto experimental
como teoacuterica La obtencioacuten de paraacutemetros termodinaacutemicos como la energiacutea libre de
Gibbs el estudio de efecto isotoacutepico y la determinacioacuten de constantes de velocidad en
electroquiacutemica entre otros permiten discriminar entre las diferentes viacuteas en que se
puede llevar a cabo la electro-oxidacioacuten de fenoles
Resultados y discusioacuten
71
53 Estudio de generacioacuten de especies radicalarias mediante espectroscopia de
resonancia de espiacuten electroacutenico (REE)
A fin de evidenciar la existencia de posibles intermediarios radicalarios en el proceso
electro-oxidativo de los fenoles previamente estudiados a traveacutes de las teacutecnicas
electroquiacutemicas se procedioacute a oxidar los derivados 9 10 y 11 y medir in situ su
espectro REE Se utilizoacute la teacutecnica descrita por Le Nest y colaboradores99
en que se
describe el estudio de estructuras flavonoides polifenoacutelicas en eacutel se utiliza la
quelacioacuten con Zn2+
lo que permitioacute la estabilizacioacuten del radical formado y su posterior
estudio En primer lugar desde un punto de vista cualitativo se observoacute para cada
compuesto un evidente cambio de color en las soluciones electrolizadas las que se
tornaron de color amarillo intenso y maacutes oscuro que las soluciones de trabajo
originales lo que sugiere que tras la electroacutelisis se forma un compuesto nuevo
diferente al de partida como se esperaba En la Figura 511A-C se presentan los
espectros obtenidos junto con las respectivas simulaciones realizadas
Resultados y discusioacuten
72
Figura 511A Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido cafeico 9 estabilizado con Zn2+
en DMF + HFFTBA
(izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color
rojo)
Figura 511B Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido gaacutelico 10 estabilizado con Zn2+
en DMF + HFFTBA
(izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color
rojo)
3440 3450 3460 3470 3480 3490
O
OH
HO O
OH
OH
O
OA
Campo Magneacutetico G
3440 3450 3460 3470 3480 3490
OHO O
O
O
OH
OH
OH
OH
B
Campo Magneacutetico G
Resultados y discusioacuten
73
Figura 511C Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido protocateacutequico 11 estabilizado con Zn2+
en DMF +
HFFTBA (izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der
en color rojo)
Concordante con el resultado esperado la sentildeal espectral indica la presencia de una
especie radicalaria como intermediario de la electro-oxidacioacuten de los grupos catecol
presentes en los tres derivados en estudio
En la simulacioacuten realizada para el derivado 9 se observa el acoplamiento hiperfino de
tres aacutetomos de hidroacutegeno con los siguientes valores de constantes 132 G 098 G y
03 G que seriacutea indicio del proceso oxidativo que ocurre en el catecol del anillo
benceacutenico (Tabla 52) ya que estos valores coinciden con una interaccioacuten entre los tres
protones del anillo benceacutenico en posicioacuten 2 5 y 6 En el caso de los compuestos 10
y 11 se encontraron dos constantes de acoplamiento hiperfino lo que indica la
3440 3450 3460 3470 3480 3490
OHO O
O
OOH
OH
OH
C
Campo Magneacutetico G
Resultados y discusioacuten
74
interaccioacuten entre dos protones que seriacutean aquellos en posicioacuten 5 y 6 del anillo
cumariacutenico
Tabla 52 Constantes de acoplamiento hiperfino para los derivados polifenoacutelicos
Valores en Gauss
Compuesto aH1 G aH2 G aH3 G
132 098 030
215 156 -
235 122 -
Estos resultados concuerdan ademaacutes con lo descrito en la literatura con respecto a la
oxidacioacuten de grupos fenoacutelicos lo que permite inferir un posible mecanismo electro-
oxidativo para los derivados en estudio
O
OH
OH O
OH
OH
O
O
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
Resultados y discusioacuten
75
54 Resultados y discusioacuten de los estudios de reactividad frente a especies
radicalarias
En este punto de la investigacioacuten el objeto de estudio fue evaluar el comportamiento
de las nuevas estructuras previamente sintetizadas frente a diferentes especies
radicalarias de amplio intereacutes bioloacutegico radical peroxilo (ROObull) radical hidroxilo
(OHbull) anioacuten radical superoacutexido (O2-) junto con determinar la capacidad reductora de
los compuestos Cada ensayo fue escogido con miras de abordar el tema de la
capacidad antioxidante desde las posibilidades que permiten las experiencias de tipo in
vitro
541 Metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno
(oxygen radical antioxidant capacity-fluorescein ORAC-FL)
El estudio de especies reactivas de oxiacutegeno y nitroacutegeno asociadas a los procesos
oxidativos requiere en algunos casos del uso de compuestos denominados ldquosondasrdquo
En la teacutecnica de fluorescencia es posible implementar este tipo de metodologiacutea debido
a sus caracteriacutesticas de sensibilidad especificidad y simplicidad en la obtencioacuten de
datos convirtieacutendose en una herramienta uacutetil y ampliamente utilizada a la hora de
obtener una buena aproximacioacuten en la determinacioacuten de actividad frente a especies
EROsERNs123
Resultados y discusioacuten
76
En el caso de la metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno
(ORAC) los primeros trabajos que dan cuenta de su uso fueron descritos en la deacutecada
de 1990 a partir de la investigacioacuten de Cao y colaboradores124
En este trabajo los
autores describen la teacutecnica como un meacutetodo simple y confiable para determinar
capacidad antioxidante en serum humano en pequentildeas cantidades de muestra (del
orden de los microL) utilizando como sonda la β-ficoeritrina (proteiacutena aislada del alga roja
unicelular Porphyridium cruenturn) debido a su fluorescencia sensible a los cambios
conformacionales en su estructura en ensayos frente al radical peroxilo125
En el
desarrollo posterior Ou y colaboradores126
proponen una mejora a la teacutecnica
cambiando la sonda proteica por el compuesto fluoresceiacutena debido a su mayor foto-
estabilidad y para evitar interacciones proteiacutena-polifenol (hidrofoacutebicas y puentes de
hidroacutegeno) junto con ello realizaron la validacioacuten del meacutetodo Esta sonda es la
utilizada actualmente para este ensayo el cual es ampliamente utilizado en el estudio
de polifenoles y sus derivados127-128ab
en diferentes alimentos y bebidas129130
muestras bioloacutegicas de distinta iacutendole131
por mencionar algunos ejemplos
Para efectos de esta investigacioacuten se espera obtener un perfil de comportamiento de
cada uno de los compuestos frente al radical peroxilo (ROObull) que permita distinguir el
aporte que significa cada sustitucioacuten realizada al anillo cumarina con diferentes
grupos fenoacutelicos Cabe mencionar que las longitudes de onda maacuteximas (λmaacutex) de
absorbancia en el rango UV-visible para los compuestos ensayados estuvieron en un
rango entre los 203 nm y 329 nm En este estudio se obtuvieron los perfiles cineacuteticos
Resultados y discusioacuten
77
de consumo de la sonda fluoresceiacutena (con valores de 485525 nm para su absorcioacuten y
emisioacuten respectivamente) por induccioacuten de los radicales peroxilo (originados por
efecto de la termoacutelisis del azo-compuesto ABAP a 37 degC) A partir de estos perfiles de
decaimiento de la sonda a distintas concentraciones de compuestos antioxidantes (5 en
total) se obtuvieron curvas adecuadamente separadas como se muestra en la Figura
512 donde se muestran los resultados para el compuesto 11 como ejemplo
representativo del ensayo Posteriormente se determina para cada concentracioacuten el aacuterea
neta bajo la curva la que es graficada con respecto a las concentraciones utilizadas La
Figura 513 presenta relacioacuten lineal entre el aacuterea neta bajo la curva con respecto a la
concentracioacuten del compuesto 11 como ejemplo la que fue determinada para cada
derivado
Figura 512 Curvas para el consumo de la sonda fluoresceiacutena para un set de
concentraciones del compuesto 11
0 2000 4000 6000
02
04
06
08
10
F
F0
Tiempo (s)
control
16 M
12 M
081 M
045 M
020 M
Resultados y discusioacuten
78
Las curvas obtenidas en esta parte del experimento muestran la reaccioacuten de
competencia entre el radical y el antioxidante (el cual protege a la fluoresceiacutena del
proceso de oxidacioacuten) Posterior al procedimiento anteriormente descrito se obtuvo el
iacutendice ORAC para cada compuesto que se resume en la Tabla 54
Figura 513 Graacutefica de aacuterea neta bajo la curva ABC vs concentracioacuten del derivado 11
En este ensayo los compuestos hiacutebridos propuestos superaron en cuanto al valor de
iacutendice ORAC a la cumarina precursora 1 En los tres casos se pudo observar valores
superiores de casi el doble para el compuesto 10 y bordeando un ORAC casi tres veces
mayor en los compuestos 9 y 11 del valor obtenido para su precursor Estos resultados
evidenciaron un incremento en la capacidad antioxidante al que posee la cumarina de
manera independiente debido a la inclusioacuten de los derivados de aacutecidos
hidroxibenzoicos e hidroxicinaacutemico en su estructura (Tabla 53)
0 1 2 3 4 50
1000
2000
3000
4000
r = 099309
AB
C n
eta
Concentracioacuten (mM)
Resultados y discusioacuten
79
Tabla 53 Valores experimentales de iacutendice ORAC-FL para los compuestos
estudiados
Compuesto iacutendice ORAC-FL
(plusmnSD)
1 091 plusmn 010
2 347 plusmn 010
3 391 plusmn 009
4 069 plusmn 001
9 239 plusmn 003
10 174 plusmn 005
11 262 plusmn 004
Trolox 1
Por otra parte los valores del iacutendice ORAC de la serie fueron superiores al estaacutendar
Trolox con excepcioacuten de los compuestos 1 (cumarina de partida) y 4 (aacutecido
protocateacutequico) Para el caso de la cumarina eacutesta tuvo un valor ORAC menor a 1 En
el caso del compuesto 4 la ostensible diferencia (5 veces menor) con su homoacutelogo
aacutecido cafeico 2 deriva de la presencia del doble enlace en esta estructura aunque
ambos aacutecidos poseen igual cantidad de grupos ndashOH y en igual posicioacuten en el anillo
aromaacutetico la insaturacioacuten le confiere maacutes posibilidades de deslocalizacioacuten electroacutenica
debido a la mayor cantidad de estructuras resonantes posibles y por lo tanto mayor
Resultados y discusioacuten
80
estabilidad al formarse la especie radicalaria correspondiente en la reaccioacuten frente el
ABAP Al observar el valor obtenido para el aacutecido gaacutelico 3 se obtuvo un iacutendice
ORAC cercano al del aacutecido cafeico y aunque carece de la insaturacioacuten presente en el
derivado cinaacutemico posee en su defecto un grupo ndashOH adicional en posicioacuten 5 del
anillo aromaacutetico el cual aportoacute adicionalmente a su capacidad antioxidante (lo que no
ocurrioacute en el caso del aacutecido protocateacutequico 4)
Se observa que el aacutecido dihidroxibenzoico 4 que arrojara un valor 069 presenta un
incremento de 37 veces en su valor ORAC-FL al estar incorporado en el heterociclo
cumariacutenico En este caso se presentoacute un fenoacutemeno de sinergia positiva ya que ambos
compuestos cumarina 1 y aacutecido protocateacutequico 4 aumentaron su valor de ORAC-FL
pasando de un valor 091 y 069 de forma individual respectivamente a formar un
derivado que presentoacute un valor de ORAC-FL igual a 262 Al observar los valores
totales en los derivados 9 y 10 obtenidos no correspondieron a la sumatoria de los
iacutendices individuales de sus precursores este resultado indica que estuvo ausente el
fenoacutemeno de sinergia
Para los nuevos compuestos (9 10 y 11) se observoacute un incremento del valor de
ORAC-FL con respecto a la cumarina precursora 1 Por lo tanto la inclusioacuten delas
estructuras fenoacutelicas en el heterociclo cumariacutenico generoacute la obtencioacuten de nuevos
derivados con una mayor capacidad antioxidante en esta metodologiacutea de esta forma se
obtuvo un aporte a la reactividad de la cumarina 1
Resultados y discusioacuten
81
Los resultados obtenidos en este ensayo dan cuenta de la actividad que presentaron los
compuestos tanto precursores como derivados frente a la especie radical ROObull Un
punto importante a considerar es que este experimento ndashindependientemente de ser un
ensayo in vitro- se lleva a cabo en un medio buffer a pH 74 y a una temperatura
controlada de 37 degC lo que permite obtener una primera aproximacioacuten con respecto a
lo que seraacute la actividad de los compuestos en un medio bioloacutegico La sustitucioacuten en el
anillo cumariacutenico generoacute nuevos compuestos que superaron su capacidad antioxidante
sin embargo desde el punto de vista de los precursores aacutecidos (cafeico y gaacutelico) su
actividad se vio mermada tras la sustitucioacuten fenoacutemeno que se discute en la seccioacuten 6
La secuencia de actividad obtenida para los derivados y sus precursores fue 3 gt 2 gt 11
gt 9 gt 10 gt 1 gt 4
Junto con el ensayo anteriormente detallado se procedioacute a determinar la cantidad de
radicales que reaccionan con el compuesto antioxidante relacionando la concentracioacuten
de antioxidante aplicado la estequiometriacutea de la reaccioacuten y la velocidad de generacioacuten
de radicales peroxilo a 37 degC como se expresa en la siguiente ecuacioacuten (Burton y
colaboradores 1981)132
120591 = 119899 [119860119903119874119867]
119877119894 Ecuacioacuten 54
Resultados y discusioacuten
82
donde τ es el tiempo de induccioacuten (tiempo en el que la sonda es protegida de los
radicales peroxilo por el antioxidante) n es el valor asociado a la estequiometriacutea de la
reaccioacuten correspondiente a la cantidad de moleacuteculas de radical ROObull inactivadas por
moleacutecula de compuesto antioxidante [ArOH] es la concentracioacuten de antioxidante y Ri
es la velocidad de generacioacuten de radical peroxilo la cual estaacute directamente relacionada
con la concentracioacuten de ABAP utilizada en el ensayo (18 mM) y se determina seguacuten la
expresioacuten133
Ri = 136 bull 10-6
[ABAP] Ecuacioacuten 55
Dadas las condiciones experimentales empleadas el valor de Ri es 147 microMmin Los
resultados obtenidos del valor de la pendiente (regresioacuten lineal Ecuacioacuten 54) se
resumen en la Tabla 54
Todos los compuestos (precursores y derivados) presentan valores de n superiores a
los esperados donde en el caso extremo se tiene que una moleacutecula de aacutecido gaacutelico
estariacutea consumiendo 14 moleacuteculas de radical peroxilo resultado que es mucho mayor
al esperado Los aparentes altos valores de n como estequiometriacutea de la reaccioacuten
(n = 3 hasta n = 14) sugieren la presencia de reacciones asociadas de mayor
complejidad en las que estariacutea presente el radical alcoxilo (RObull)134
el cual se forma
por descomposicioacuten del radical peroxilo que posee una vida media del orden de los
segundos en comparacioacuten con el radical alcoxilo con una vida media del orden de los
10-6
s (y es maacutes reactivo) lo que explica esta diferencia en la estequiometria
Resultados y discusioacuten
83
Tabla 54 Valores calculados para el factor estequiomeacutetrico n
Compuesto na(plusmnSD) n
1 28 plusmn 03 3
2 39 plusmn 01 4
3 141 plusmn 14 14
4 24 plusmn 01 3
9 58 plusmn 04 6
10 49 plusmn 01 5
11 86 plusmn 01 9
a Valores calculados en triplicado
Este fenoacutemeno se ha encontrado en investigaciones previas realizadas en derivados
cumariacutenicos135
y fue descrito por Lissi y colaboradores el que se puede encontrar
ademaacutes en experimentos en los que se utiliza la sonda rojo de pirogalol (ORAC-
PGR)136137
Resultados y discusioacuten
84
542 Metodologiacutea de capacidad reductora de hierro en plasma (FRAP)
Esta metodologiacutea desarrollada por Benzie y Strain (1996)138
se propuso como una
medida de la capacidad reductora (asociada a una buena capacidad antioxidante)
enfocada a investigar procesos de estreacutes oxidativo en fluidos bioloacutegicos
Posteriormente se ha extendido al estudio de diversas matrices como extractos de
plantas medicinales139
alimentos140
compuestos puros141
por mencionar algunos
ejemplos
En este ensayo se obtuvieron los valores de la capacidad reductora de los compuestos
polifenoacutelicos la que se aprecia cualitativamente a traveacutes de la formacioacuten del complejo
de Fe2+
de color azul (Figura 514) Esta metodologiacutea involucra la reaccioacuten redox
entre el agente reductor (en este caso los derivados cumariacutenicos) y el oxidante (la sal
feacuterrica) es considerada como aproximacioacuten con respecto a la capacidad de mantener el
estatus redox dentro de la ceacutelula
En primer lugar se observoacute un comportamiento semejante al ensayo ORAC-FL en
cuanto a la tendencia que presentaron los compuestos en su capacidad reductora de
hierro lo que indica una baja probabilidad de que en este ensayo ocurriese el
fenoacutemeno de quelacioacuten propio de los catecoles La Tabla 55 presenta los datos
experimentales obtenidos
Resultados y discusioacuten
85
NN
NN
Fe 3+N
N
N
N
N
N
NN
NN
NN
Fe2+N
N
N
N
N
N
NN
Antioxidante
amarilloazul
[Fe(III) (TPTZ)2]3+ [Fe(III) (TPTZ)2]2+
Figura 514 Esquema para la reaccioacuten entre el complejo de Fe3+
y el compuesto
antioxidante reductor
Los compuestos 9 10 y 11 presentaron una mejor capacidad reductora frente a su
precursor cumariacutenico 1 Esto se explica debido a la presencia de un mayor nuacutemero de
grupos -OH presentes en las nuevas estructuras propuestas capaces de transferir
electrones y reducir la sal feacuterrica como se menciona en el trabajo de Pulido y
colaboradores142
quienes estudian una serie de polifenoles mediante esta teacutecnica
sentildealando que ademaacutes del nuacutemero de hidroxilos presentes la presencia de dobles
enlaces conjugados en el esqueleto como parte de las caracteriacutesticas estructurales
responsables de un aumento en la capacidad reductora en polifenoles
Resultados y discusioacuten
86
Tabla 55 Valores experimentales obtenidos para los compuestos en estudio ensayo
FRAP en equivalentes de Trolox10 microM de muestra
En el derivado 11 se presenta una interaccioacuten de tipo sineacutergica con respecto a los
resultados individuales de cada precursor habieacutendose obtenido un valor FRAP de
1302 y 868 equiv Trolox 10 microM de muestra para 1 y 4 respectivamente y para el
derivado final un valor de 2624 equiv Trolox 10 microM de muestra
Del mismo modo que en el ensayo anterior se observa que la sustitucioacuten en el anillo
cumariacutenico con los distintos grupos aacutecidos incrementa su potencial como especie
reductora mientras que en el caso del aacutecido cafeico y gaacutelico se aprecia una
disminucioacuten de 13 y 15 veces respectivamente en su capacidad reductora tras la
esterificacioacuten
Compuesto equiv Trolox 10 microM muestra
(plusmnSD)
1 1302 plusmn 197
2 2727 plusmn 321
3 4768 plusmn 215
4 868 plusmn 93
9 2052 plusmn 186
10 3182 plusmn 681
11 2624 plusmn 335
Resultados y discusioacuten
87
Los resultados obtenidos para esta teacutecnica entregan informacioacuten acerca de la capacidad
reductora relativa para el conjunto de compuestos ensayados capacidad que estaacute
relacionada con su actividad antioxidante Se obtuvo un orden relativo para
precursores y derivados como sigue 3 gt 10 gt 2 gt 11 gt 9 gt 1 gt 4 Con respecto a la
disminucioacuten de actividad para los aacutecidos mencionados sugiere que esta capacidad
ademaacutes del nuacutemero de ndashOH presentes estariacutea relacionada con el sustituyente ndashCOOH
que se transforma en un grupo eacutester (ver seccioacuten 6)
543 Capacidad de inactivacioacuten del radical OHmiddot teacutecnica Spin Trapping
Esta teacutecnica no destructiva permite la deteccioacuten e identificacioacuten de especies
paramagneacuteticas (con electrones desapareados) en distintas matrices El fenoacutemeno de
resonancia de espiacuten electroacutenico fue descubierto y descrito en la deacutecada de 1940 por
Zavoisky143
en sus estudios basados en sales de manganeso en distintos medios Su uso
y aplicaciones se han diversificado a numerosas aacutereas como en la determinacioacuten de
capacidad antioxidante en alimentos144
en el anaacutelisis del proceso oxidativo en
liacutepidos145
en el estudio de enfermedades parasitarias146
El creciente intereacutes de la
teacutecnica en ciencias biomeacutedicas radica en el hecho de que esta espectroscopia permite
discriminar diferentes especies radicales de intereacutes bioloacutegico estrechamente
relacionadas con el estatus redox de la ceacutelula147
cuyo desbalance se traduce en cuadros
de estreacutes oxidativo148
Resultados y discusioacuten
88
En este estudio se determinoacute la capacidad de los compuestos propuestos para inactivar
la especie radicalaria OHmiddot
mediante la teacutecnica spin trapping metodologiacutea basada en
establecer la competencia de reaccioacuten entre los antioxidantes propuestos y el spin trap
DMPO El radical se generoacute a traveacutes de la reaccioacuten de ldquoFenton no cataliacuteticordquo
(Ecuacioacuten 56) metodologiacutea que permite la generacioacuten del radical OHbull en medio
baacutesico en ausencia del ioacuten Fe como catalizador91ab
211986721198742 + 119874119867minus rarr 119874119867∙ + 1198742minus + 21198672119874 Ecuacioacuten 56
En un primer set de experimentos se procedioacute a realizar la experiencia utilizando
DMSO como solvente Se descartoacute esta opcioacuten debido a que resultoacute complejo
observar un patroacuten claro en el blanco y poder asiacute discriminar las nuevas sentildeales
espectrales a partir de la adicioacuten de los compuestos en estudio
En primer lugar se determinoacute el blanco experimental que indica la reaccioacuten de
inactivacioacuten del radical mediante el compuesto spin trap DMPO Posteriormente se
ensayaron los derivados hiacutebridos y sus precursores sinteacuteticos en dos concentraciones
033 mM y 33 mM En el caso de los experimentos realizados a la menor
concentracioacuten se aprecioacute que la disminucioacuten de la sentildeal del blanco fue miacutenima para los
siete compuestos y no se observoacute un cambio significativo en el espectro como para
obtener resultados concluyentes Considerando lo anterior los experimentos se
Resultados y discusioacuten
89
realizaron con concentracioacuten del orden de los 3 mM obtenieacutendose asiacute datos
satisfactorios en cuanto a la inactivacioacuten del radical y la posibilidad de realizar
caacutelculos sobre este valor El valor de inactivacioacuten del radical hidroxilo se calcula a
traveacutes de la disminucioacuten en la intensidad de las sentildeales al adicionar cada derivado En
cada espectro se aprecia el perfil hiperfino compuesto por cuatro liacuteneas caracteriacutesticas
correspondientes al aacutetomo de nitroacutegeno e hidroacutegeno del spin-aducto formado por
[DMPO-OH] con valores de aN y aH alrededor de 15G lo que concuerda con lo
descrito en la literatura149
para esta reaccioacuten y el espectro simulado que se presenta en
la Figura 515 El cambio experimental tras la adicioacuten de los compuestos se presenta
en color rojo (Figura 516 A-G)
N+
O-
+ OHN
O
OH
Figura 515 Espin aducto generado por la inactivacioacuten del radical OHbull y su espectro
simulado (derecha)
Resultados y discusioacuten
90
Figura 516 A Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto 4-clorometil-78-dihidroxicumarina 1 B Espectro REE de inactivacioacuten del
radical hidroxilo con adicioacuten del compuesto aacutecido cafeico 2
Figura 516 C Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto aacutecido gaacutelico 3 D Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con
adicioacuten del compuesto aacutecido 34-dihidroxi benzoico 4
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
B
Campo Magneacutetico G
compuesto 2
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
C
Campo Magneacutetico G
compuesto 3
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
D
Campo Magneacutetico G
compuesto 4
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
A
Campo Magneacutetico G
compuesto 1
control
Resultados y discusioacuten
91
Figura 516 E Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto hiacutebrido 9 F Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con
adicioacuten del compuesto hiacutebrido 10
Figura 516 G Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto hiacutebrido 11
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
G
Campo Magneacutetico G
compuesto 11
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
E
Campo Mgneacutetico G
compuesto 9
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
F
Campo Magneacutetico G
compuesto 10
control
Resultados y discusioacuten
92
Considerando los patrones espectrales obtenidos para los compuestos 9 10 y 11 se
observoacute que la sentildeal de cuadruplete correspondiente al control (spin-aducto [DMPO-
OH]) desaparecioacute casi por completo lo cual indica la inactivacioacuten del radical
hidroxilo Se observa ademaacutes un triplete con constantes de acoplamiento 1398 G y
1427 G que evidencioacute la reaccioacuten de oxidacioacuten del atrapador DMPO (Figura 517)
ya que de haberse formado el aducto entre la cumarina y el spin trap DMPO se
habriacutea obtenido el correspondiente espectro con un patroacuten de 6 liacuteneas espectrales
(Figura 518)
Figura 517 Espectro REE se destaca en rojo el triplete de integracioacuten 121
formado despueacutes de la reaccioacuten de Fenton no-cataliacutetico (izq) Espectro simulado
utilizando el programa EPR-WINSIM (der)
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
DMPO oxidado
N+
O-
+ OHNO
OH
Campo Magneacutetico G
Resultados y discusioacuten
93
cumarina + OHbull cumarinabull + H2O
cumarinabull + DMPO [cumarina-DMPO]
Figura 518 Espectro simulado para la formacioacuten del spin aducto [cumarina-
DMPO] utilizando el programa EPR-WINSIM
Como se presenta en la Tabla 56 tanto los aacutecidos orgaacutenicos como la cumarina
precursora y sus derivados presentaron reactividad muy semejante En las
condiciones de estudio para todos los compuestos se obtuvo un valor sobre el 90
indicando su poder de inactivacioacuten del radical resultado que superoacute al descrito en la
literatura para el estaacutendar Trolox
Estudios previos realizados en estructuras cumariacutenicas simples semejantes al
precursor 1 de esta investigacioacuten permiten comparar algunos resultados Peacuterez-Cruz y
colaboradores150
indican un 29 de inactivacioacuten para el derivado monohidroxilado de
la cumarina 1 diferencia que puede explicarse por la ausencia del ndashOH en posicioacuten 8
que aumenta su actividad El compuesto con grupos ndashOH en posicioacuten 6 y 7 presentoacute
un apagamiento del 51 Figueroa y colaboradores presentan tambieacuten un estudio en
que las cumarinas monohidroxiladas presentan valores de 23 y 56 de la
inactivacioacuten del radical OH corroborando lo encontrado anteriormente151
Resultados y discusioacuten
94
Tabla 56 Porcentajes de inactivacioacuten del radical hidroxilo (OHmiddot)
Compuesto de inactivacioacuten bullOH
(plusmnSD)
1 923 plusmn 74
2 983 plusmn 27
3 995 plusmn 08
4 927 plusmn 29
9 981 plusmn 18
10 982 plusmn 25
11 980 plusmn 99
Trolox 31plusmn 25a
aRef149 Figueroa R et al Future Med Chem 2013
Los resultados obtenidos con esta teacutecnica indican la reactividad relativa que tienen los
compuestos propuestos frente al radical OH Al considerar que el tiempo de vida del
radical hidroxilo y del spin trap DMPO es del orden de 10-9
s se observa que todos los
compuestos ensayados tuvieron la capacidad de competir con el DMPO en el proceso
de inactivacioacuten del radical evidenciado por la sentildeal de control que disminuyoacute casi en
su totalidad para todos los casos siendo menor en la cumarina precursora 1 y el aacutecido
4 siguiendo ambos compuestos la misma tendencia que se observara en los ensayos
Resultados y discusioacuten
95
anteriores Independientemente que el radical ensayado en este experimento es de una
alta reactividad y escasa selectividad el hecho de que se obtuvieran altos valores de
actividad para los compuestos propuestos indica que eacutestos se presentan como buenos
candidatos como inactivadores de la especie OH
Finalmente se observa que los derivados 9 10 y 11 presentaron un valor de
reactividad superior al de la cumarina precursora obtenieacutendose de esta forma un
aporte a la reactividad en cada nueva estructura propuesta frente al heterociclo de
partida 1 para este ensayo En cuanto a la reactividad relativa de la serie no se
encontroacute una diferencia significativa entre los compuestos ensayados precursores y
derivados mostraron valores cercanos en cuanto al de inactivacioacuten del radical
alrededor del 90
Resultados y discusioacuten
96
544 Estudio de reactividad frente al anioacuten radical superoacutexido O2-
Dentro de las diversas aplicaciones desarrolladas para las teacutecnicas electroquiacutemicas se
encuentran los ensayos de determinacioacuten de la capacidad antioxidante en distintos
medios152
y en muestras como bebidas153
vegetales154
mediciones in situ sobre piel
humana155
por mencionar algunos ejemplos Un reciente review (Pisoschi y
colaboradores 2015) describe las contribuciones realizadas con respecto a la
determinacioacuten de actividad antioxidante empleando exitosamente la voltametriacutea
ciacuteclica voltametriacutea de pulso diferencial voltametriacutea de onda cuadrada amperometriacutea
y potenciometriacutea156
las que ademaacutes se complementan con otras teacutecnicas en este tipo
de estudios157158
En esta parte de la investigacioacuten se determinoacute la reactividad de los compuestos frente
al anioacuten radical superoacutexido cuya generacioacuten electroquiacutemica en la superficie del
electrodo por reduccioacuten de oxiacutegeno disuelto mediante la teacutecnica de voltametriacutea ciacuteclica
ha sido ampliamente estudiada en nuestro grupo de trabajo159160110
y por otros
autores161
Como se esperaba tras la adicioacuten sucesiva de aliacutecuotas de todos los compuestos
estudiados hubo un decaimiento en la corriente de pico anoacutedica (Ipa0) (ejemplo del
resultado para el precursor 1 en la Figura 519) Esto permitioacute calcular el valor del
iacutendice antioxidante 50 (IA50) el cual se define como la concentracioacuten de sustrato
necesaria para obtener una disminucioacuten del 50 en la corriente Ipa0 Esta corriente es
Resultados y discusioacuten
97
directamente proporcional a la concentracioacuten de anioacuten superoacutexido presente por lo
que su disminucioacuten es un indicador de la capacidad del sustrato para inactivar la
especie radical generada in situ
Figura 519 Voltamogramas ciacuteclicos del par redox correspondiente al anioacuten
superoacutexido tras antildeadir aliacutecuotas del compuesto 1 DMF + HFFTBA 02 M 01 Vs
Tras obtener los voltamogramas ciacuteclicos para cada compuesto se procedioacute a
determinar el paraacutemetro adimensional (Ipa0-Ipa
SIpa
0) y se graficoacute con respecto a la
concentracioacuten de sustrato en solucioacuten (Figura 520) obtenieacutendose relaciones de tipo
lineal en que los valores del coeficiente de correlacioacuten r estuvieron entre 099777 y
097267
-10 -08 -06 -04 -02
Ipa0
10A
blanco
0049 mM
0099 mM
0149 mM
0199 mM
0249 mM
0299 mM
E vs Ag|AgCl V
Resultados y discusioacuten
98
007 014 021 02800
03
06
09
r = 099074
IA 50
(Ip
a0-
Ipa
S)
Ip
a0
Concentracioacuten mM
Figura 520 Graacutefica del paraacutemetro adimensional (Ipa0-Ipa
SIpa
0) vs concentracioacuten de
sustrato para el compuesto 1 (Destacado en verde el valor de IA50)
Junto con el valor de concentracioacuten IA50 la pendiente de las rectas entrega tambieacuten
informacioacuten con respecto a la reactividad de los compuestos frente al anioacuten
superoacutexido donde un mayor valor de la pendiente indica que el compuesto posee una
mayor actividad no obstante los autores que desarrollaron el meacutetodo hacen notar que
se utiliza preferentemente el iacutendice IA50 como valor para caracterizar de manera
adecuada la actividad de los compuestos propuestos frente el radical de forma
anaacuteloga al concepto de IC50 (concentracioacuten inhibitoria aplicada en sistemas
bioloacutegicos en relacioacuten a la cantidad de compuesto necesario para inhibir en un 50 el
crecimiento de una poblacioacuten de microorganismos)
Como se observa en los resultados (Tabla 57) la cumarina de partida 1 presenta un
valor mayor de IA50 (0187 mM) en comparacioacuten con los compuestos hiacutebridos 9 10 y
Resultados y discusioacuten
99
11 por lo que la adicioacuten de los fenoles a la estructura cumariacutenica fue un aporte a su
reactividad frente a la especie radical O2-
Tabla 57Valores de IA50 obtenidos para los compuestos estudiados
a Valor de estaacutendar Tolox ref 92
El derivado de aacutecido gaacutelico 10 presentoacute el menor valor de iacutendice antioxidante y por
consiguiente fue el mejor inactivador del anioacuten superoacutexido formado en la superficie
del electrodo puesto que se necesita una menor concentracioacuten de este derivado
(0064 mM) para apagar el 50 radical Junto con esto fue el compuesto que presentoacute
el fenoacutemeno de sinergia dentro de la serie con un valor de concentracioacuten menor
Compuesto IA 50 mM
(plusmnSD)
1 0183 plusmn 0007
2 0125 plusmn 0006
3 0104 plusmn 0004
4 0115 plusmn 0005
9 0141 plusmn 0011
10 0064 plusmn 0004
11 0137 plusmn 0002
Troloxa
197
Resultados y discusioacuten
100
requerida para inactivar el radical con respecto a cada uno de sus precursores (1 y 3)
El segundo mejor inactivador de O2-
fue el compuesto 11 con un valor de IA50 de
0137 mM y finalmente se tiene al derivado 9 con 0141 mM Este comportamiento
puede deberse a fenoacutemenos de difusioacuten de las moleacuteculas en el medio junto con su
reactividad en la superficie del electrodo
En este ensayo frente al radical O2-
al igual que el anterior (inactivacioacuten de la especie
OHbull) se pudo obtener informacioacuten con respecto al comportamiento de los
compuestos en un medio aproacutetico resultados que son de intereacutes ya que se pueden
considerar como una aproximacioacuten quiacutemica de tipo in vitro de los conocidos
fenoacutemenos de estreacutes oxidativo que ocurren en estructuras como las bio-membranas
donde participan especies reactivas oxigenadas161162
Finalmente se puede establecer un orden estimativo para la actividad de los derivados
y la cumarina 10 gt 3 gt 4 gt 2 gt 11 gt 9 gt 1 Todos los compuestos ensayados tuvieron
una reactividad superior al estaacutendar Trolox
Resultados y discusioacuten
101
545 Determinacioacuten de capacidad antioxidante celular (CAC)
Con el objeto de abordar los fenoacutemenos que involucran especies radicalarias
presentes en sistemas vivos se procede a realizar el estudio de la capacidad
antioxidante de los compuestos en un modelo bioloacutegico simple En este experimento
se utiliza la sonda DCFH-DA la cual difunde pasivamente a traveacutes de la membrana
celular al ingresar al citosol se transforma en el compuesto DCFH (no fluorescente)
que emite al entrar en contacto con especies oxidantes del tipo EROs y ERNs En los
experimentos realizados las ceacutelulas fueron estresadas mediante el compuesto ABAP
(generador de radical peroxilo) y se observoacute coacutemo los nuevos derivados en estudio
podiacutean contrarrestar este evento oxidativo al interior de la ceacutelula Los resultados
obtenidos se resumen en la Tabla 58
Los valores experimentales obtenidos en esta etapa indicaron una bio-disponibilidad
baja con una CAC menor al 50 para los nuevos compuestos 9 10 y 11 ademaacutes en
todos los casos se encontroacute un porcentaje menor de CAC de los derivados respecto a
los precursores respectivos 1 2 3 y 4 Para una concentracioacuten de 10 microM de
compuesto se obtuvieron valores muy semejantes (alrededor del 70) para los
precursores ensayados
Resultados y discusioacuten
102
Tabla 58 Valores obtenidos para la capacidad antioxidante celular (CAC)
concentraciones 1 microM y 10 microM de cada compuesto
Compuesto CAC 1 microM CAC 10 microM
1 696plusmn 50 727plusmn 13
2 730plusmn 26 739plusmn 07
3 662plusmn 19 701plusmn 01
4 477plusmn 25 665plusmn 26
9 381plusmn 55 499plusmn 66
10 178plusmn 45 395plusmn 128
11 345plusmn 31 234plusmn 108
En los resultados anteriores llaman la atencioacuten los bajos valores obtenidos en el
ensayo de CAC para los derivados polifenoacutelicos en comparacioacuten con los ensayos
realizados en sistemas no bioloacutegicos en que se obtuvieron buenos resultados en ellos
se pudo apreciar el fenoacutemeno de sinergia (en algunos casos) y un incremento en la
actividad de todos los derivados frente a la cumarina precursora de forma individual
Para explicar este comportamiento y complementar estos resultados se procedioacute a
seleccionar de manera racional los tres derivados obtenidos 9 10 y 11 y se determinoacute
su Hidrofobicidad Relativa en conjunto con el precursor cumariacutenico 1 (el cual
presentoacute valores de CAC alrededor del 70 cercano a lo obtenido en los precursores
Resultados y discusioacuten
103
aacutecidos) ensayo que entrega informacioacuten con respecto a la lipofilia relativa de la serie
(en funcioacuten de tiempos de retencioacuten) pudiendo dar respuesta al fenoacutemeno observado
555 Estudio de hidrofobicidad relativa
En el estudio de nuevos compuestos disentildeados como potenciales faacutermacos una de las
propiedades fisicoquiacutemicas de intereacutes es la lipofilia valor que puede determinarse
mediante distintos meacutetodos electroforesis capilar cromatografiacutea liacutequida de alta
resolucioacuten (HPLC) y determinando el coeficiente de particioacuten aguaoctanol entre
otras Junto con la metodologiacutea empiacuterica se han desarrollado diversas herramientas
computacionales con softwares que permiten calcular el valor para logP y logD
obtenieacutendose buenas correlaciones entre compuestos de una familia de estructuras
semejantes en los que se realizan variaciones a su esqueleto Los valores asiacute
calculados y entregados por el programa se consideran de una confiabilidad
razonable163
En el caso de este estudio se determinoacute la lipofilia relativa para los derivados 9 10 y
11 junto con el precursor 1 mediante HPLC en fase reversa donde se espera obtener
una serie relativa de tiempos de retencioacuten entre los compuestos que deacute cuenta de su
lipofilia Se utilizoacute esta teacutecnica por tratarse de una medicioacuten simple raacutepida y
ampliamente descrita en la literatura para nuevos compuestos en que la fase
estacionaria de la columna C18 simula la fase no polar y la fase moacutevil es la fase
Resultados y discusioacuten
104
acuosa asiacute a traveacutes de la columna se llevan a cabo muacuteltiples equilibrios de particioacuten
entre la fase acuosa y orgaacutenica En la medida en que el compuesto analizado sea maacutes
afiacuten a la fase estacionaria (relacionado con un mayor tiempo de retencioacuten) eacuteste seraacute
maacutes lipofiacutelico y viceversa Los resultados (Tabla 59) muestran que de acuerdo a los
tiempos de retencioacuten obtenidos (5138 5760 4031 y 4695 minutos) el orden
relativo de lipofilia fue el siguiente
Tabla 59 Valores obtenidos para el tiempo de retencioacuten experimental de los
compuestos
Compuesto Tiempo de retencioacuten
(min)
1 5138
9 5760
10 4031
11 4695
La Figura 521 indica el orden de lipofilia relativa encontrada para los derivados y su
precursor cumariacutenico En forma general se observaron valores de tiempo de
retencioacuten cercanos Se aprecioacute que el derivado de aacutecido cafeico 9 fue el compuesto
que encabezoacute la serie lo que se puede explicar debido a la presencia de un doble
enlace en su estructura confirieacutendole mayor apolaridad (por tanto hidrofobicidad) a
Resultados y discusioacuten
105
O
OH
HO O
Cl
O
OH
OH O
OH
OH
O
O
OHO O
O
O
OH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
la moleacutecula El segundo en la serie fue el compuesto clorado 1 en el cual el
sustituyente haloacutegeno es un aporte a la lipofilia del compuesto En el caso de las
estructuras 10 y 11 se encontroacute que el derivado de aacutecido gaacutelico presentoacute el menor
valor relativo debido a la presencia de un grupo ndashOH adicional en el anillo aromaacutetico
que como se esperaba tuvo la mayor tendencia hidrofiacutelica
9 1 11 10
Figura 521 Hidrofobicidad relativa de los derivados y la cumarina precursora
Para complementar este resultado experimental se realizoacute el caacutelculo teoacuterico para el
valor de logD mediante herramienta Marvin Sketch del software libre ChemAxon164
y
se establecioacute su correlacioacuten con el valor experimental obtenido para CAC en
concentracioacuten 10 microM El resultado de esta correlacioacuten se presenta en la Figura 522
Aumento de la lipofilia = aumento en el tiempo de retencioacuten
Resultados y discusioacuten
106
Figura 522 Correlacioacuten entre el valor de logD teoacuterico y CAC experimental a
10 microM de cada compuesto El valor logD se obtuvo a traveacutes de la herramienta Marvin
Sketch del software ChemAxon164
Considerando estos resultados para este modelo experimental propuesto en el ensayo
de CAC se observa que la lipofilia no seriacutea el uacutenico factor relacionado con los bajos
valores de capacidad antioxidante celular (CAC) obtenidos para los compuestos 9 10
y 11 ya que por ejemplo la cumarina 1 presentoacute valores de CAC sobre el 70 y fue
el segundo compuesto de la serie de hidrofobicidad relativa experimental con un
valor cercano de tiempo de retencioacuten al derivado 9 (el cual tuvo valores de CAC bajo
el 50) De igual forma se aprecia la misma tendencia al correlacionar el valor de
CAC con el logD teoacuterico donde el compuesto 1 independientemente de tener una
lipofilia semejante a los derivados polifenoacutelicos (al igual que en la serie de tiempos
de retencioacuten) siacute mostroacute una biodisponibilidad superior a los derivados y muy
-3 -2 -1 0 1 2 3 4
20
40
60
80
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OOH
HO O
Cl
OHO O
O
OOH
OH
OH
OOH
OH O
OH
OH
O
O
logDteor
C
AC
(1
0
32
4
Resultados y discusioacuten
107
semejante a los aacutecidos benzoicos (2 3 y 4) los cuales muestran valores negativos de
logD debido a su menor lipofilia
Por tratarse de un sistema bioloacutegico (ceacutelulas epiteliales) con muacuteltiples variables que
afectan la actividad de los compuestos estudiados se pueden considerar diversos
factores presentes en el medio ensayado que pueden dar respuesta al fenoacutemeno
observado Uno de ellos es la estructura de la membrana celular que contiene diversas
estructuras como por ejemplo el citocromo P (CYP) que es un complejo enzimaacutetico
involucrado en el metabolismo de faacutermacos siacutentesis de biomoleacuteculas y diversas
biotransformaciones de moleacuteculas a nivel celular165
Otro factor presente es la
existencia de enzimas hidroliacuteticas en el citosol celular como es el caso especiacutefico de
las carboxilesterasas (presentes en ceacutelulas epiteliales de intestino hiCE y otros
oacuterganos) las cuales son capaces de escindir diversos grupos funcionales tales como
amidas eacutesteres carbamatos y convertirlos en sus respectivos precursores (alcohol y
aacutecido) 166
Considerando que para este experimento en un modelo bioloacutegico in vitro simple se
emplearon ceacutelulas epiteliales de intestino (EAhy 926 (ATCC CRL-2922)) es posible
que el comportamiento observado se deba a la existencia de diversos fenoacutemenos e
interacciones posibles de los compuestos tanto a nivel de membrana como de
citoplasma Cabe destacar que al comparar las experiencias realizadas en un medio no
bioloacutegico los resultados en este caso se invierten al emplear una metodologiacutea que
involucra un medio bioloacutegico No necesariamente se encuentra un comportamiento
Resultados y discusioacuten
108
anaacutelogo en ambos medios de ensayo debido a la mayor complejidad y variables
asociadas a un sistema que involucra estructuras vivas independientemente de la
simplicidad o lo acotado del mismo
556 Estudios Teoacutericos optimizacioacuten de estructuras y determinacioacuten del Iacutendice
de Fukui
Con el objeto de racionalizar el estudio realizado y poder discriminar entre los
distintos sitios reactivos de los derivados se determinoacute el iacutendice de Fukui fk0
relacionado con un ataque de tipo radicalario Baacutesicamente es el promedio
correspondiente a las reacciones de ataque nucleofiacutelico fk- y electrofiacutelico fk
+(Ecuacioacuten
57) como se describe en el trabajo de Aliaga y Lissi donde se aborda el estudio
teoacuterico y experimental que compara la actividad anti-radicalaria de los polifenoles
rutina y quercetina167
1198911198960 =
119891119896minus+ 119891119896
+
2 Ecuacioacuten 57
Este iacutendice es un descriptor de reactividad local en los aacutetomos de oxiacutegeno que
participan en las reacciones de los grupos catecol presentes Este tipo de anaacutelisis
resulta adecuado para determinar los sitios de reaccioacuten preferentes en moleacuteculas
complejas con diversos centros reactivos168
Los resultados obtenidos indican que en
Resultados y discusioacuten
109
la cumarina precursora 1 el ataque radicalario ocurriraacute primero en el oxiacutegeno en
posicioacuten 7 debido al mayor valor de fk0
(0071) por otra parte no se observaron
cambios significativos en los valores de fk0 al formar parte de los derivados 10 y 11
para los aacutetomos de oxiacutegeno en posicioacuten 7 y 8 (aquellos involucrados en la capacidad
antioxidante de la moleacutecula) Al formar parte del derivado 9 si se observa una
disminucioacuten en su reactividad (fk0
O7 = 00078 y fk0
O8 = 00021) haciendo menos
probables estos dos sitios a un ataque radicalario en la moleacutecula (Tabla 510)
Los valores obtenidos para el iacutendice de Fukui indican que en el derivado 9 el sitio
maacutes probable para un ataque radicalario seraacute el catecol presente en el anillo benceacutenico
(proveniente del aacutecido cafeico) de preferencia en el oxiacutegeno en posicioacuten 4
(fk0
O4 = 00489) A diferencia del derivado de aacutecido cafeico en el caso de los
compuestos 10 y 11 el sitio preferente de reaccioacuten seraacute el anillo cumariacutenico
conservaacutendose el oxiacutegeno en posicioacuten 7 del heterociclo como sitio maacutes reactivo En
las Figuras 523 a 526 se presentan las estructuras optimizadas en 3D para el
precursor 1 y sus derivados polifenoacutelicos 9 10 y 11
Resultados y discusioacuten
110
Tabla 510 Valores de Iacutendice de Fukui fk para los compuestos en estudio
Compuesto Iacutendice de Fukui
fk0
Iacutendice de Fukui
fk-
O7 00771
O7 01373
O8 00391
O8 00757
O7 00078 O7 00072
O8 00021 O8 00036
O3 00389 O3 00779
O4 00489 O4 00890
O7 00719 O7 01276
O8 00365 O8 00716
O3 00025 O3 00050
O4 00025 O4 00049
O5 00002 O5 00004
O7 00739 O7 01316
O8 00378 O8 00742
O3 00004 O3 00008
O4 00003 O4 00005
OHO O
O
OOH
OH
OH
7
8
3
4
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
7
8
3
4
5
OOH
HO O
OH
OH
O
O
7
8
3
4
O
OH
HO O
Cl
7
8
Resultados y discusioacuten
111
OOH
OHO
Cl
Figura 523 Estructura optimizada en 3D para el precursor 1 utilizando DFT
OOH
OH O
OH
OH
O
O
Figura 524 Estructura optimizada en 3D para el derivado 9 utilizando DFT
Resultados y discusioacuten
112
Figura 525 Estructura optimizada en 3D para el derivado 10 utilizando DFT
OHO O
O
OOH
OH
OH
Figura 526 Estructura optimizada en 3D para el derivado 11 utilizando DFT
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
Resultados y discusioacuten
113
6 Discusioacuten General
Respecto del posible mecanismo de reaccioacuten electro-oxidativo se consideran las
siguientes evidencias teoacutericas y experimentales
En primer lugar como se esperaba los experimentos electroquiacutemicos de electro-
oxidacioacuten de los compuestos mostraron las sentildeales correspondientes a los grupos
ndashOH presentes en todas las estructuras Junto con esto los resultados de la graacutefica
Ipa vs vfrac12
indican la existencia de un proceso di-electroacutenico en los precursores y los
derivados (para la primera sentildeal oxidativa) lo que implica que comparten el mismo
mecanismo
Posteriormente se comproboacute la existencia de la especie radicalaria detectada mediante
oxidacioacuten electroquiacutemica seguida por resonancia de espiacuten electroacutenico con los
respectivos resultados de las simulaciones espectrales realizadas
En un siguiente punto se determinaron los valores teoacutericos de reactividad local
encontrados mediante el caacutelculo del iacutendice de Fukui El valor de fkndash
permitioacute
identificar los lugares con mayor reactividad frente a un ataque electrofiacutelico por tanto
las zonas en la moleacutecula puntuales con un alto valor para este iacutendice tenderaacuten a ceder
electrones con mayor facilidad en un proceso oxidativo Las estructuras optimizadas
en 3D indican que las zonas en color celeste (Figuras 523-526) corresponden a
aquellas con mayor densidad electroacutenica y por tanto estaacuten maacutes propensas a ceder
Resultados y discusioacuten
114
electrones en un proceso oxidativo Las zonas color lila representan los sitios con
menor densidad electroacutenica Para el compuesto 1 los ndashOH en el heterociclo presentan
mayor densidad electroacutenica lo que se aprecia de igual forma en los derivados 10 y 11
mientras que la zona del anillo benceacutenico se presenta con una baja densidad
electroacutenica Un fenoacutemeno diferente se aprecia para el derivado 9 donde la mayor
densidad electroacutenica se aprecia en la estructura benceacutenica cuyos grupos ndashOH
presentan el mayor valor de fk-
Este resultado teoacuterico racional complementa lo observado en el experimento descrito
con REE y electro-oxidacioacuten conjunta ya que los valores para las constantes de
acoplamiento hiperfino obtenidas en cada caso tambieacuten sentildealaron en cuaacutel de los dos
catecoles presentes ocurre la formacioacuten de la especie radical y por ende doacutende se
inicia el proceso de oxidacioacuten resultados corroboradas con el estudio teoacuterico
realizado De esta forma para el derivado 9 el proceso oxidativo se inicia en los -OH
ubicados en posicioacuten 3 y 4 que presentaron valores de fkndash
00779 y 00890
respectivamente y cuyas constantes de acoplamiento hiperfino son coherentes con
una interaccioacuten que involucra tres protones aquellos ubicados en las posiciones 2 5 y
6 del anillo benceacutenico El mismo anaacutelisis realizado para las estructuras 10 y 11 indica
que el proceso oxidativo ocurre primero en el anillo de la cumarina en los -OH en
posicioacuten 7 y 8 con valores del descriptor de reactividad local fkndash de 01276 y 00716
respectivamente para el derivado de aacutecido gaacutelico y en el caso del derivado de aacutecido
protocateacutequico con fkndash 01316 y 00742 para los oxiacutegenos en posicioacuten 7 y 8 De igual
forma los valores para las constantes de acoplamiento fueron consistentes con esta
Resultados y discusioacuten
115
informacioacuten experimental evidenciando la interaccioacuten entre dos protones (aquellos en
posicioacuten 5 y 6 del heterociclo cumariacutenico)
Esta diferencia encontrada para el proceso electro-oxidativo entre los derivados se
puede explicar debido a la existencia de un doble enlace conjugado adicional presente
soacutelo en el compuesto 9 derivado del aacutecido cafeico (ausente en 10 y 11) el cual le
confiere mayor deslocalizacioacuten (estabilidad) al radical que se forma como
intermediario en el proceso oxidativo
Los estudios presentes en la literatura sobre la oxidacioacuten de estructuras polifenoacutelicas
en medio aproacutetico presentan evidencias tanto teoacutericas como empiacutericas que ampliacutean la
visioacuten sobre la complejidad y posibilidades mecaniacutesticas en la oxidacioacuten de
estructuras polifenoacutelicas Basadas en modelos de naturaleza bioloacutegica como el
Fotosistema II presente en estructuras vegetales y otros ejemplos se plantea que una
viacutea de oxidacioacuten factible es a traveacutes de un mecanismo de tipo concertado donde se
obtiene el radical fenoxil (ArObull) en un paso directo en que el protoacuten y el electroacuten se
transfieren de manera conjunta (Figura 61 destacado en rojo) planteamiento que
considera factores de tipo energeacutetico a diferencia de los estudios claacutesicos con respecto
a este proceso seguacuten el cual la electro-oxidacioacuten se inicia con la peacuterdida de 1ē (etapa
electroquiacutemica) para formar el catioacuten radical(ArObull+) seguido de la peacuterdida de un
H+(etapa quiacutemica) para formar el radical fenoxil (ArObull) (Figura 62)
En el caso de los compuestos estudiados en esta investigacioacuten los valores de la
pendiente de Tafel encontrados para los compuestos (sobre 88 mVdec) sugieren que
Resultados y discusioacuten
116
el mecanismo de electro-oxidativo que maacutes se ajusta a la evidencia experimental es
por etapas
OH
HO
OH
HO
O
HO
O-
HO
-e- + B
+e- + HB+
+ B-e-
+e-
+e-
-e-
+ HB+
+ B
+HB+
Figura 61 Esquema de reaccioacuten para un mecanismo concertado de electro-
oxidacioacuten fenoacutelica Adaptacioacuten referencia 120
OH
HO - e
+ e
OH
HO
-H+
O
HO
Figura 62 Esquema de reaccioacuten para estructuras fenoacutelicas mecanismo electro-
oxidativo en etapas
Resultados y discusioacuten
117
Con respecto a los ensayos de actividad antioxidante realizados la Tabla 61 permite
comparar y estimar en conjunto los resultados obtenidos a traveacutes de las diferentes
metodologiacuteas empleadas
En forma general los resultados indican que la sustitucioacuten propuesta en esta
investigacioacuten en la cumarina dihidroxilada (utilizada como esqueleto de partida) con
distintas estructuras polifenoacutelicas entregoacute resultados positivos en cuanto al aporte
que los nuevos derivados obtenidos presentaron frente a la inactivacioacuten de especies
radicalarias tales como O2- ROO˙ OH˙ y su capacidad reductora (reflejada en el
ensayo FRAP) Para los ensayos realizados en un modelo no bioloacutegico se obtuvieron
valores de actividad en los derivados que superaron a los obtenidos para el precursor
cumariacutenico de forma individual
Cabe mencionar que en los diferentes ensayos y sus resultados se mencionan los
conceptos de reactividad y actividad de los compuestos En el caso de los ensayos
ORAC-FL y FRAP se habla soacutelo de actividad antioxidante ya que con la informacioacuten
que entregan no se puede determinar cuaacutel de los distintos grupos ndashOH presente en la
moleacutecula es el que reacciona primero Diferente es lo que ocurre en el ensayo frente
al radical hidroxilo en que se establece una competencia entre el atrapador (DMPO) y
el compuesto por inactivar al OHbull debido a que ambos tienen una vida media corta
(10-9
s) por tanto la reaccioacuten entre el antioxidante y el radical es raacutepida y el ndashOH maacutes
reactivo de la moleacutecula es el que inactiva a la especie y se puede mencionar como
reactividad Lo mismo ocurre para el ensayo frente al anioacuten radical superoacutexido en que
tambieacuten se mencionan los resultados como reactividad frente al radical
Resultados y discusioacuten
118
Tabla 61 Cuadro comparativo de los resultados en la determinacioacuten de capacidad
antioxidante para la cumarina y sus derivados
Compuesto ORAC-FL
FRAP
eq Trolox
10 microM
inactivacioacuten
OHmiddot
CAC
1 microM 10 microM
O2-
IA 50 mM
1 091 plusmn 003 1302plusmn 160 923 plusmn 74 696 plusmn 50 727 plusmn 13 0183plusmn0007
2 347 plusmn 010 2727 plusmn 321 983 plusmn 27 730plusmn 26 739plusmn07 0125 plusmn 0006
3 391 plusmn 009 4768 plusmn 215 995 plusmn 08 662plusmn 19 701plusmn01 0104 plusmn 0004
4 069 plusmn 001 868 plusmn 93 927 plusmn 29 477plusmn 25 665plusmn26 0115 plusmn 0005
9 239plusmn0027 2052 plusmn151 981 plusmn 18 381plusmn55 499 plusmn 66 0141plusmn0011
10 174 plusmn 005 28046plusmn188 982 plusmn 25 178plusmn45 395 plusmn128 0064plusmn0004
11 262 plusmn 004 2624 plusmn 236 980 plusmn 99 345plusmn31 234 plusmn 108 0137plusmn0002
Por otra parte en los ensayos ORAC-FL y FRAP se observoacute que los valores de
actividad para los aacutecidos cafeico 2 y gaacutelico 3 fueron superiores a los obtenidos para
sus derivados hiacutebridos 9 y 10 respectivamente En el ensayo frente al anioacuten
superoacutexido se encontroacute que los aacutecidos cafeico 2 y protocateacutequico 4 presentaron
resultados superiores en cuanto a reactividad que sus respectivos derivados hiacutebridos 9
y 11
Resultados y discusioacuten
119
En la literatura se encuentra la caracterizacioacuten de los aacutecidos benzoicos y otros
antioxidantes polifenoacutelicos naturales como moleacuteculas altamente polares lo que en
algunos limita su uso en medios como bio-membranas emulsiones y micelas por lo
que la formacioacuten de sus derivados eacutesteres se utiliza como una estrategia para
aumentar su lipofilia y por lo tanto la biodisponibilidad de estos compuestos en
medios no acuosos169170
investigacioacuten que ha dado origen a la formulacioacuten de los
denominados ldquoantioxidantes lipofiacutelicosrdquo171172
los que han demostrado ser eficientes
como antioxidantes en bio-membranas resultados que se describen en el trabajo
realizado por Tai y colaboradores donde se ensayaron eacutesteres de aacutecido vainilliacutenico
que ademaacutes de presentar buenos valores de iacutendice ORAC-FL inhibieron el proceso
de hemoacutelisis en eritrocitos de mamiacutefero173
Junto con lo anterior estaacute descrita la relacioacuten existente entre la estructura de los
aacutecidos benzoicos y su actividad antioxidante la que es atribuida a diversas
caracteriacutesticas presentes en su esqueleto tales como i) nuacutemero y posicioacuten de grupos ndash
OH en la moleacutecula ii) sustituyentes alcoxilo en posicioacuten orto al ndashOH iii) presencia
de grupos -COOH -COOR -CH=CH-CH2-174
Al apreciar las estructuras de los
derivados propuestos se infiere que las diferencias encontradas en la actividad de los
aacutecidos antes y despueacutes de la unioacuten a la cumarina estaacuten relacionadas con dicha
sustitucioacuten En el caso del aacutecido gaacutelico que presenta un valor de ORAC de 391 frente
a un valor de 174 para su derivado 10 y en el ensayo FRAP se encontroacute un valor de
4768 vs un 3182 para el hiacutebrido se puede sentildealar que no se aprecioacute un aumento de
Resultados y discusioacuten
120
actividad antioxidante para los eacutesteres con respecto al aacutecido del que provienen seguacuten
con lo descrito por algunos autores175176
Junto con lo anterior se forma un eacutester de
aacutecido gaacutelico con un sustituyente voluminoso (la estructura cumariacutenica) pudiendo
disminuir la coplanaridad en el sistema aromaacuteticocarbonilo lo que implica una menor
estabilizacioacuten del radical formado en la reaccioacuten frente a la especie ROObull para el
ensayo ORAC-FL y la capacidad reductora en el ensayo FRAP Otro punto a
considerar es que para este derivado se observa el fenoacutemeno mencionado por Rice-
Evans175
y otros autores con respecto a que un nuacutemero mayor de grupos ndashOH en el
anillo benceacutenico no implica necesariamente un aumento en la actividad antioxidante
de un derivado polifenoacutelico
Para el caso observado en el aacutecido cafeico y su derivado 9 se aprecia el mismo
fenoacutemeno de disminucioacuten de actividad del aacutecido 2 frente al eacutester como lo descrito
para el aacutecido gaacutelico y su derivado en los ensayos ORAC-FL y FRAP con la
diferencia que esta disminucioacuten no es tan draacutestica lo que se atribuye a la presencia del
doble enlace en la estructura que confiere mayor estabilidad por resonancia al radical
formado
El valor de reactividad local del iacutendice de Fukui fk0
-relacionado con los fenoacutemenos
de ataque radicalario- entregoacute informacioacuten con respecto a los sitios de los derivados
donde la actividad anti-radicalaria es maacutes probable Asiacute para el compuesto 9 esta
actividad ocurre en el anillo benceacutenico en primer lugar y posteriormente en la
cumarina Para los derivados 10 y 11 la mayor probabilidad de que se produzca el
Resultados y discusioacuten
121
ataque radicalario es en el heterociclo cumariacutenico y posteriormente en el catecol del
anillo benceacutenico Estos resultados corroboran con los valores experimentales y las
simulaciones realizadas en espectroscopia de resonancia electroacutenica de espiacuten (REE)
donde la actividad antioxidante del compuesto 9 ocurre con mayor probabilidad en el
anillo benceacutenico proveniente de la fraccioacuten del aacutecido cafeico (donde se encuentra el
doble enlace que le confiere mayor estabilidad al radical formado como intermediario
de reaccioacuten) mientras que en los derivados 10 y 11 esta actividad ocurre en el
heterociclo cumariacutenico
Se observa que los resultados de capacidad antioxidante para los derivados
polifenoacutelicos variaron entre un meacutetodo y otro no hubo correlacioacuten entre los valores
obtenidos en la capacidad antioxidante obtenidos en las distintas metodologiacuteas Este
resultado concuerda con lo esperado ya que cada experiencia realizada implica una
especie radicalaria diferente y cada una de ellas posee reactividades distintas (t12 O2-
del orden de los ms t12 OHbull ~ 10-9
s t12 ROObull ~ 10 ms) Para cada ensayo se
obtuvo un distinto orden relativo de reactividad entre los derivados y sus precursores
Se establece la relacioacuten entre el potencial Eonset y los resultados obtenidos en el
ensayo de capacidad antioxidante frente a anioacuten superoacutexido realizado en medio
aproacutetico (Figura 63) Para el ensayo de reactividad frente a O2-
se puede establecer
una correlacioacuten donde una disminucioacuten en el potencial de oxidacioacuten disminuye el
valor de IA50 para 5 de los 7 compuestos estudiados Por tanto a medida que el
Resultados y discusioacuten
122
potencial se hace menos positivo aumenta la reactividad de los compuestos frente al
anioacuten superoacutexido presentaacutendose una relacioacuten entre actividad antioxidante y Eonset
para este ensayo
Figura 63 Correlacioacuten entre el potencial de oxidacioacuten Eonset y los ensayos frente a
anioacuten superoacutexido
Un menor potencial de oxidacioacuten para los grupos ndashOH presentes en los compuestos
implica una mayor facilidad para oxidarse (por ende una mayor densidad de carga
electroacutenica para ceder) y por tanto un incremento en la capacidad antioxidante para
este ensayo
Se puede observar que el compuesto 4 (aacutecido protocateacutequico) posee un valor de IA50
de 0115 mM el cual se encuentra entre los valores encontrados para el aacutecido cafeico
y el aacutecido gaacutelico pero su valor de Eonset es mayor diferenciaacutendose de la tendencia
049 056 063 070 077
006
009
012
015
018
11
3
1
42
9
10
Eonset
vs Ag|AgCl V
IA50
mM
Resultados y discusioacuten
123
encontrada Junto con lo anterior el compuesto 4 presentoacute el menor valor para la
pendiente de Tafel (b = 88 mVdec) de toda la serie lo que sugiere una relacioacuten entre
el mecanismo de oxidacioacuten y la capacidad de reaccionar frente a la especie
radicalaria El compuesto 10 presentoacute el mejor valor para IA50 y tambieacuten se diferencia
de la serie de compuestos con respecto al Eonset (cercano al del compuesto 4) a
diferencia del aacutecido su pendiente de Tafel (b = 134 mVdec) indica la presencia de
dimerizaciones posteriores a la formacioacuten del radical fenoxil (y generacioacuten de
compuestos nuevos que tambieacuten pueden reaccionar con el radical) sugiriendo que
ademaacutes del mecanismo de oxidacioacuten hay otros factores que pueden influir como por
ejemplo la difusioacuten de las especies en el medio empleado
El estudio de los compuestos frente al radical hidroxilo reflejoacute que en las condiciones
experimentales empleadas los resultados fueron semejantes por cuanto los valores de
inactivacioacuten del radical en todos los casos fue sobre el 90 Debido a lo anterior se
descarta realizar la correlacioacuten con el potencial Eonset ya que no encontroacute una
diferencia significativa entre los compuestos
Finalmente al considerar los resultados obtenidos para la capacidad antioxidante
celular en un modelo bioloacutegico simple un punto a tener en cuenta es el hecho de que
esta metodologiacutea en particular adolece en cuanto a que es inespeciacutefica con respecto a
la cantidad de compuesto que ingresa en la ceacutelula ya que por las distintas lipofilias
observadas los compuestos tendraacuten una diferente capacidad de ingreso al medio y no
se puede determinar la relacioacuten existente entre la cantidad que ingresa a la ceacutelula
Resultados y discusioacuten
124
versus la reactividad Debido a lo anteriormente descrito estos resultados muestran
principalmente un reflejo de la capacidad de penetracioacuten que tienen los compuestos
hacia el interior de la ceacutelula
Un modo de abordar temaacuteticas de tipo multi-variable-donde se deben considerar
numerosos factores involucrados en un comportamiento o fenoacutemeno- es el empleo de
modelos teoacuterico-computacionales como QSAR (por su sigla en ingleacutes Quantitative
Structure-Activity Relationships) herramienta que se utiliza en la estimacioacuten de
propiedades bioloacutegicas y fisicoquiacutemicas de intereacutes en diversas moleacuteculas entre ellas
polifenoles177
El factor esteacuterico tiene un papel importante en los estudios realizados en medios
celulares siendo el tamantildeo molecular uno de los factores considerados en ensayos de
permeabilidad en futuros faacutermacos ya que un excesivo tamantildeo (entre otras cosas)
dificulta la solubilidad en medio acuoso asiacute como tambieacuten la difusioacuten pasiva de las
moleacuteculas163
Al observar el peso molecular de los compuestos derivados (entre
34427 gmol y 37031 gmol) se puede considerar que el efecto esteacuterico en este caso
no seriacutea la causa principal para el fenoacutemeno observado en el ensayo celular ya que
estaacute descrito que los compuestos no deberiacutean superar un peso de 500 gmol 163
_que no es el caso de estos derivados-
Los resultados obtenidos para este ensayo realizado en un modelo bioloacutegico simple
sugieren que la actividad de los derivados para reaccionar frente a especies
radicalarias podriacutea estar circunscrita a medios lipofiacutelicos como las membranas
Resultados y discusioacuten
125
bioloacutegicas estudio que se podriacutea profundizar empleando un modelo como el
descrito173
para estudiar procesos oxidativos en membranas de eritrocito
Conclusiones
126
7 Conclusiones
La teacutecnica de electro-oxidacioacuten complementada con espectroscopia de
resonancia de espiacuten electroacutenico (REE) resulta uacutetil para identificar especies
radicalarias como intermediarios de la reaccioacuten en este trabajo
La determinacioacuten del iacutendice de Fukui (fk-) en conjunto con los resultados de
resonancia de espiacuten electroacutenico permitieron discriminar los sitios de las
moleacuteculas donde se inicia el proceso oxidativo En el derivado 9 la oxidacioacuten
ocurre primero en el anillo benceacutenico y en los compuestos 10 y 11 el proceso
oxidativo ocurre primero en el heterociclo cumariacutenico
La inclusioacuten de las estructuras polifenoacutelicas al heterociclo cumariacutenico generoacute
un incremento en su capacidad antioxidante en los ensayos no bioloacutegicos
No se obtuvo correlacioacuten para los resultados de capacidad antioxidante entre
las distintas metodologiacuteas empleadas
Se establecioacute la correlacioacuten entre el valor de potencial de inicio de la reaccioacuten
electroquiacutemica (onset) y los resultados para el ensayo frente al anioacuten
superoacutexido A medida que el potencial se hace menos positivo aumenta la
reactividad de los compuestos lo que indica que la transferencia electroacutenica
estaacute involucrada en la etapa determinante de la velocidad
De acuerdo con los resultados de la teacutecnica CAC y la correlacioacuten tanto con la
hidrofobicidad relativa como con el logDteoacuterico la actividad de los derivados
Conclusiones
127
propuestos estaacute circunscrita a aquellos procesos oxidativos que tienen lugar en
medios lipofiacutelicos como por ejemplo membranas bioloacutegicas
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173 Tai A Sawano Takeshi Ito H ldquoAntioxidative properties of vanillic acid esters
in multiple antioxidant assaysrdquo Biosci Biotechnol Biochem vol 76 ndeg2 pp
314ndash318 2012
174 Materska M Perucka I ldquoAntioxidant activity of the main phenolic compounds
isolated from hot pepper fruit (Capsicum annuum L)rdquo J Agric Food Chem
vol53 pp1750minus1756 2005
175 Rice-Evans C Miller N Paganga G ldquoStructure-antioxidant activity
relationships of flavonoids and phenolic acidsrdquo Free Rad Biol amp Med vol
20 ndeg 7 pp 933-956 1996
176 Mura F Silva T Castro C Borges F Zuntildeiga MC Morales J Olea-Azar C
ldquoNew insights into the antioxidant activity of hydroxycinnamic and
hydroxybenzoic systems Spectroscopic electrochemistry and cellular studiesrdquo
Free Rad Res vol 48 pp 1473 2014
177 Lučić B AmićD Trinajstić N ldquoAntioxidant QSAR Modeling as Exemplified
on Polyphenolsrdquo Methods in Molecular Biology vol 477 Advanced Protocols
in Oxidative Stress I Humana Press New York USA DOI 101007978-1-
60327-517-0_16
v
Al Dr Germaacuten Barriga por los aportes en el tema de estudios teoacutericos al Dr Michel
Lapier por su colaboracioacuten con los estudios en ceacutelulas al Dr Francisco Mura por su
generosidad y colaboracioacuten al Dr Benjamiacuten Aguilera por su simpatiacutea y ayuda con
temas espectroscoacutepicos a la Dra Mariacutea Carolina Zuacutentildeiga y los MC boys Jorge
Beatriz Manuel Camilo Gabriela Estefaniacutea gracias por sus aportes a este trabajo y
los momentos agradables que compartimos Al Profesor Dr Javier Morales vaya mi
agradecimiento por su ayuda en el estudio y caracterizacioacuten de mis compuestos
Gracias a la Profesora Dra Mariacutea Baeacutez C por su colaboracioacuten y disposicioacuten en la
caracterizacioacuten de mis compuestos
Agradezco a todos los compantildeeros de laboratorio que he conocido en diversas
instancias A la Dra Paulina Sierra a Viviana Claudio Julio la Dra Paola Salgado
Camila Daniela Constanza Dr David Vaacutesquez Gracias por los momentos gratos y
su compantildeerismo
Deseo destacar la valiosa contribucioacuten de los funcionarios de la Biblioteca Ceacutesar
Leyton de nuestra Facultad Muchas gracias por la prontitud y agilidad en su servicio
que siempre ha sido de muy buen nivel
Agradezco ademaacutes la valiosa colaboracioacuten de las Secretarias de Decanato Sra
Cecilia Pinchetti y Ximena Berriacuteos Gracias por su siempre buena disposicioacuten
gentileza y voluntad con cada detalle de todo este proceso
Mi agradecimiento para todo el personal de Secretariacutea de Posgrado por su gestioacuten y
colaboracioacuten en todo el proceso acadeacutemico
vi
INDICE
Informe de aprobacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip i
Agradecimientoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip iii
Iacutendicehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip vi
Iacutendice de figuras y tablashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip x
Glosariohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip xvi
Resumenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip xviii
Summaryhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip xx
1 Introduccioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 1
11 Cumarinashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 1
111 Origen vegetalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 1
112 Rutas de siacutentesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 2
113 Principales aplicacioneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 4
12 Compuestos polifenoacutelicoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 9
121 Origen vegetalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 9
122 Actividad bioloacutegicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 10
123 Polifenoles como antioxidanteshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 11
13 Compuestos hiacutebridoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 13
vii
131 Cumarinas como estructuras hiacutebridashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 15
2 Hipoacutetesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
3 Objetivoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
31 Objetivos generaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
32 Objetivos especiacuteficoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
4 Materiales y meacutetodoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 23
41 Materialeshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24
411 Reactivos y equipamiento utilizado en siacutentesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24
412 Reactivos y equipamiento utilizados en electroquiacutemicahelliphelliphelliphelliphellip 25
413 Reactivos y equipamiento utilizados en ensayos frente a especies
radicalariashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27
42 Meacutetodoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 28
421 Procedimientos de siacutentesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 28
422 Procedimientos en electroquiacutemicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 37
423 Estudio de generacioacuten de especies radicalarias mediante
espectroscopia de resonancia de espiacuten electroacutenico (REE)helliphelliphelliphelliphellip 38
424 Procedimiento experimental en el estudio de reactividad
frente a especies radicalariashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39
4241 Metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales
de oxiacutegeno (ORAC-FL)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39
4242 Metodologiacutea de capacidad reductora de hierro en plasma
(FRAP)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42
viii
4243 Capacidad de apagamiento del radical hidroxilo (OHmiddot)
mediante la teacutecnica spin traphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 44
4244 Estudio de reactividad frente al anioacuten radical superoacutexido O2bull-helliphelliphellip 45
4245 Estudio de la capacidad antioxidante celular (CAC)helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 47
4246 Estudio de hidrofobicidad relativa helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 48
4247 Estudio teoacuterico caacutelculo del Iacutendice de Fukui fkhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 49
5 Resultados y discusioacuten helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 50
51 Siacutentesis de los compuestoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 50
52 Estudios electroquiacutemicoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 54
53 Estudio de generacioacuten de especies radicalarias mediante espectroscopia
de resonancia de espiacuten electroacutenico (REE)helliphelliphelliphelliphellip 70
54 Resultados y discusioacuten de los estudios de reactividad
frente a especies radicalariashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 74
541 Metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales
oxiacutegeno-fluoresceiacutena (ORAC-FL)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 74
542 Metodologiacutea de capacidad reductora de hierro en plasma
(FRAP )helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 82
543 Determinacioacuten de capacidad de apagamiento del radical OHmiddot
teacutecnica spin trappinghelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 86
544 Estudio de reactividad frente al anioacuten radical superoacutexido O2bull-helliphelliphellip 94
545 Determinacioacuten de capacidad antioxidante celular (CAC)helliphelliphelliphelliphellip 100
546 Estudio de hidrofobicidad relativa helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 102
ix
547 Estudio teoacuterico caacutelculo del Iacutendice de Fukui fkhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 108
6 Discusioacuten generalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 113
7 Conclusiones helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 124
8 Bibliografiacuteahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 126
x
Iacutendice de figuras y tablas
Figuras
Figura 1 Esquema de los compuestos estudiados
Figure 1 Scheme of studied compounds
Figura 11 Estructura de la 2H-1-benzopiran-2-ona (cumarina)
Figura 12 Esquema general de la reaccioacuten de Pechmann
Figura 13 Estructura de la 33rsquo-metilenbis(4-hidroxicumarina) o dicumarol
Figura 14 Estructura de la suksdorfina
Figura 15 Estructura del hiacutebrido cumarina-flavona aislado de su fuente vegetal
Gnidia socotrana
Figura 16 Estructura del antibioacutetico hiacutebrido novobiocina metabolitos secundarios
en la especie Streptomyces
Figura 17 Hiacutebridos chalcona-cumarina con capacidad antioxidante
Figura 41 Aacutecidos empleados en la sustitucioacuten de la 4-clorometil-78-
dihidroxicumarina
Figura 42 Siacutentesis del derivado clorado 1
Figura 43 Siacutentesis del derivado clorado acetilado 5
Figura 44 Siacutentesis del aacutecido cafeico acetilado 6
Figura 45 Siacutentesis del aacutecido gaacutelico acetilado 7
Figura 46 Siacutentesis del aacutecido 34-dihidroxibenzoico acetilado 8
Figura 47 Siacutentesis del intermediario hiacutebrido derivado del aacutecido cafeico
xi
Figura 48 Siacutentesis del compuesto hiacutebrido final 9
Figura 49A Ruta de siacutentesis de los compuestos cumariacutenicos i) H2SO4 1 h bantildeo de
hielo ii) NaOH Ac2O 30 min bantildeo de hielo (aacutecido cafeico 6) H2SO4 Ac2O 30
min (cumarina y aacutecidos benzoicos)
Figura 49B Ruta de siacutentesis de los compuestos cumariacutenicos iii) DBU DMF (seca)
35 h 50 degC iv) NaHCO3 MeOH acetona tdeg amb 3 h N2
Figura 410 A Sonda fluoresceiacutena B 22prime-azobis (2-metilpropionamidina)
dihidrochloridrato (ABAP) C 6-hidroxi-2578-tetrametilcroman-2-aacutecido carboxiacutelico
(Trolox)
Figura 411 Actividad antioxidante ORAC para un compuesto en estudio
Figura 412 Reactivo 246-tris(2-piridil)-s-triazina (TPTZ)
Figura 413 Voltamograma ciacuteclico de la generacioacuten de anioacuten radical superoacutexido
DMF+ HFFTBA 02 M en electrodo de carbono viacutetreo
Figura 51A Voltamogramas de pulso diferencial para los precursores 1 2 3 y 4
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 51B Voltamogramas de pulso diferencial para los derivados 9 10 y 11
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 52A VC para el derivado 9 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 53A VC para el derivado 10 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 54A VC para el derivado 1a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 55 Esquema del proceso electro-oxidativo propuesto para el catecol
Figura 56 Relacioacuten Epa vs logv para el derivado de aacutecido cafeico 9 2 mM en
DMF + HFFTBA 02 M
xii
Figura 57 Graacutefica para la corriente de pico Ipa vs la raiacutez cuadrada de la velocidad de
barrido Ejemplo de correlacioacuten lineal en el aacutecido protocateacutequico 4 2 mM en
DMF + HFFTBA 02 M
Figura 58 Determinacioacuten graacutefica del valor de Eonset VC del precursor 1 01 Vs
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 59 Relacioacuten Eonset vs logv para los compuestos estudiados
Figura 510 Correlacioacuten Ipa v12
vs v12
para el precursor aacutecido protocateacutequico 4
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 511A Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido cafeico 9 estabilizado con Zn2+
en DMF+HFFTBA
(izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color
rojo)
Figura 511B Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido gaacutelico 10 estabilizado con Zn2+
en DMF+HFFTBA
(izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color
rojo)
Figura 511C Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido 11 estabilizado con Zn2+
en DMF+HFFTBA (izq)
Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color rojo)
Figura 512 Curvas para el consumo de la sonda Fluoresceiacutena para un set de
concentraciones del compuesto 11
Figura 513 Graacutefica de aacuterea neta bajo la curva ABC vs concentracioacuten del derivado 11
Figura 514 Esquema para la reaccioacuten entre el complejo de Fe3+
y el compuesto
antioxidante reductor
Figura 515 Espin aducto generado por la inactivacioacuten del radical OHbull y su espectro
simulado (derecha)
xiii
Figura 516A Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto 4-clorometil-78-dihidroxicumarina 1 B Espectro REE de inactivacioacuten
del radical hidroxilo con adicioacuten del compuesto aacutecido cafeico 2
Figura 516C Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto aacutecido gaacutelico 3 D Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con
adicioacuten del compuesto aacutecido 34-dihidroxi benzoico 4
Figura 516E Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto hiacutebrido 9 F Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con
adicioacuten del compuesto hiacutebrido 10
Figura 516G Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto hiacutebrido 11
Figura 517 Espectro REE se destaca en rojo el triplete de integracioacuten 121
formado despueacutes de la reaccioacuten de Fenton no-cataliacutetico (izq) Espectro simulado
utilizando el programa EPR-WINSIM (der)
Figura 518 Espectro simulado para la formacioacuten del spin aducto [cumarina-
DMPO] utilizando el programa EPR-WINSIM
Figura 519 Voltamogramas ciacuteclicos del par redox correspondiente al anioacuten
superoacutexido tras antildeadir aliacutecuotas del compuesto 1 DMF + HFFTBA 02 M 01 Vs
Figura 520 Graacutefica del paraacutemetro adimensional (Ipa0-Ipa
S Ipa
0) vs concentracioacuten
de sustrato para el compuesto 1 (Destacado en verde el valor de IA50)
Figura 521 Hidrofobicidad relativa de los derivados y la cumarina precursora
Figura 522 Correlacioacuten entre el valor de logD teoacuterico y CAC experimental a
10 microM de cada compuesto El valor logD se obtuvo a traveacutes de la herramienta Marvin
Sketch del software ChemAxon164
Figura 523 Estructura optimizada en 3D para el precursor 1 utilizando DFT
Figura 524 Estructura optimizada en 3D para el derivado 9 utilizando DFT
Figura 525 Estructura optimizada en 3D para el derivado 10 utilizando DFT
xiv
Figura 526 Estructura optimizada en 3D para el derivado 11 utilizando DFT
Figura 61 Esquema de reaccioacuten para un mecanismo concertado de electro-
oxidacioacuten fenoacutelica Adaptacioacuten referencia 118
Figura 62 Esquema de reaccioacuten para estructuras fenoacutelicas mecanismo electro-
oxidativo en etapas
Figura 63 Correlacioacuten entre el potencial de oxidacioacuten Eonset y los ensayos frente a
anioacuten superoacutexido
xv
Tablas
Tabla 51 Paraacutemetros experimentales para los compuestos Determinaciones en VC
2 mM DMF + HFFTBA 02 M
Tabla 52 Constantes de acoplamiento hiperfino para los derivados polifenoacutelicos
Valores en Gauss
Tabla 53 Valores experimentales de Iacutendice ORAC para los compuestos estudiados
Tabla 54 Valores calculados para el factor estequiomeacutetrico n
Tabla 55 Valores experimentales obtenidos para los compuestos en estudio ensayo
FRAP en equivalentes de Trolox10 microM de muestra
Tabla 56 Porcentajes de inactivacioacuten del radical hidroxilo (OHmiddot)
Tabla 57 Valores de IA50 obtenidos para los compuestos estudiados
Tabla 58 Valores obtenidos para la capacidad antioxidante celular (CAC)
concentraciones 1 microM y 10 microM de cada compuesto
Tabla 59 Valores obtenidos para el tiempo de retencioacuten experimental de los
compuestos
Tabla 510 Valores de Iacutendice de Fukui fk para los compuestos en estudio
Tabla 61 Cuadro comparativo de los resultados en la determinacioacuten de capacidad
antioxidante para la cumarina y sus derivados
xvi
Glosario de abreviaturas
ABAP 22-azo-bis(2-amidinopropan)diclorhidrato
ADN Aacutecido desoxiribonucleico
ATCC American Type Culture Collection
HFFTBA Hexafluorofosfato de tetrabutil amonio
CAC Capacidad antioxidante celular
CYP450 Citocromo P450
DBU 18-diazabiciclo[540]undec-7-ano
DCFH-DA 2-(6-oxido-3-oxo-3H-xanten-9-il)benzoato disoacutedico (fluoresceiacutena sal
disoacutedica)
DMF NN-dimetilformamida
DMPO 55-dimetil-1-pirroline-N-oacutexido
DMSO Dimetil sulfoacutexido
DPPHbull Radical 22-difenil-1-picrilhidrazil
Epa Potencial de pico anoacutedico
EPR Electron paramagnetic resonance
ERNs Especies reactivas de nitroacutegeno
EROs Especies reactivas de oxiacutegeno
xvii
fk Iacutendice de Fukui
FRAP Ferric reducing antioxidant in plasma
HObull Radical hidroxilo
IA50 Iacutendice antioxidante 50
Ipa Corriente de pico anoacutedica
O2˙- Anioacuten radical superoacutexido
ONOObull Radical peroxinitrito
ORAC-FL Oxygen radical antioxidant capacity-fluorescein
PBS Buffer fosfato salino
REE Resonancia de espiacuten electroacutenico
RObull Radical alcoxilo
ROOmiddot Radical peroxilo
TPTZ 246-tris(2-piridil)-s-triazina
Trolox 6-hidroxi-2578-tetrametilcroman-2-aacutecido carboxiacutelico
VC Voltametriacutea ciacuteclica
VPD Voltametriacutea de pulso diferencial
xviii
RESUMEN
Las cumarinas (2H-1-benzopiran-2-ona) son estructuras quiacutemicas presentes en
especies vegetales ampliamente distribuidas en la naturaleza con una reconocida
actividad bioloacutegica entre las que destacan sus propiedades antioxidantes
En el presente trabajo de Tesis se describe la siacutentesis de derivados polifenoacutelicos La
cumarina dihidroxilada como estructura de partida fue esterificada con distintos
aacutecidos orgaacutenicos polifenoacutelicos (Figura 1) Se estudioacute su electro-oxidacioacuten y se evaluoacute
su actividad antioxidante frente a especies reactivas de oxiacutegeno por medio de diversas
metodologiacuteas in vitro
Figura 1 Esquema de los compuestos estudiados
Se estudioacute el comportamiento anoacutedico de los compuestos mediante voltametriacutea
ciacuteclica (VC) y voltametriacutea de pulso diferencial (VPD) en medio aproacutetico como una
aproximacioacuten a los procesos redox que ocurren en membranas bioloacutegicas
Se determinoacute la presencia de especies radicalarias en el proceso electro-oxidativo a
traveacutes de la teacutecnica de resonancia de espiacuten electroacutenico (REE) Las constantes de
OOH
HO O
Cl
HO
OOH
OH
OH
OH
HO
O
OH
OH
OH
HO
OO
OHHO O
OH
OH
O
O
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
xix
acoplamiento hiperfino junto con caacutelculos teoacutericos (iacutendice de Fukui) permitieron
discriminar distintos sitios reactivos en las nuevas moleacuteculas donde se desarrolla el
proceso oxidativo
Ademaacutes se evaluoacute la capacidad antioxidante de los compuestos a traveacutes de los
ensayos capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno-fluoresceiacutena (ORAC-
FL) capacidad antioxidante reductora de hierro (FRAP) apagamiento del radical
hidroxilo mediante spin trapping inactivacioacuten de anioacuten superoacutexido y capacidad
antioxidante celular (CAC) en un modelo bioloacutegico in vitro simple
Para los ensayos antioxidantes no bioloacutegicos la introduccioacuten de las distintas
estructuras fenoacutelicas en el anillo cumariacutenico permite obtener derivados que presentan
una capacidad antioxidante mejor que el precursor cumariacutenico inicial Se establecioacute
la respectiva correlacioacuten entre el potencial de inicio del proceso electroquiacutemico
(potencial onset) y los resultados encontrados en el ensayo en medio aproacutetico frente a
anioacuten superoacutexido
Considerando el ensayo bioloacutegico de capacidad antioxidante celular eacuteste sugiere que
la actividad antioxidante de los nuevos derivados estaacute circunscrita a medios de
naturaleza lipofiacutelica
xx
SUMMARY
Coumarins (2H-1-benzopyran-2-one) are chemical structures from vegetal sources
widely distributed in vegetable species with recognized biological activities among
which their antioxidant capacity
In this Thesis work the syntheses of coumarin polyphenolic derivatives is described
Coumarin was the starter scaffold and it was sterified with different organic phenolic
acids The electro-oxidation of polyphenolic derivatives is studied and their
antioxidant capacity towards ROS through methodologies in vitro is evaluated
Figure 1 Scheme of studied compounds
The anodic behavior of the compounds by cyclic voltammetry (CV) and differential
pulse voltammetry (VPD) was studied in aprotic medium as an approximation to the
redox processes in biological membranes
The presence of radical species is determined in the electro-oxidation process through
the technique electron spin resonance (ESR)The hyperfine coupling constants and
theoretical calculations (Fukui index values) allow to discriminate between the
OOH
HO O
Cl
HO
OOH
OH
OH
OH
HO
O
OH
OH
OH
HO
OO
OHHO O
OH
OH
O
O
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
xxi
different reactive sites in the new molecules where the oxidative process is taking
place
Moreover antioxidant capacity of derivatives was evaluated through oxygen radical
antioxidant assay-fluorescein (ORAC-FL) ferric reducing ability of plasma (FRAP)
spin trapping superoxide scavenging assays and cellular antioxidant (CAC) in a
simple biological model in vitro
In the non-biological antioxidant assays the addition of various phenolic structures to
the coumarin scaffold yielded derivatives with improved antioxidant capacity related
to initial coumarin We studied the correlations between the starting potential of the
electrochemical process (onset potential) and the antioxidant results obtained in
aprotic media against superoxide anion
In regard to the biological cellular antioxidant capacity assay it suggests that the
antioxidant activity of new derivatives could be limited to lipophilic media
Introduccioacuten
1
1 Introduccioacuten
11 Cumarinas
111 Origen vegetal
Las cumarinas son una familia de compuestos cuya estructura baacutesica corresponde a la
lactona heterociacuteclica 2H-1-benzopiran-2-ona (Figura 11) En el reino vegetal estaacuten
ampliamente distribuidas habieacutendose identificado en la actualidad maacutes de 1800
cumarinas de origen natural1 eacutestas se encuentran principalmente como metabolitos
secundarios en diversas plantas tanto en sus semillas como en hojas y raiacuteces2 Su
biosiacutentesis es descrita por distintos autores como una serie de procesos catalizados
por enzimas presentes en la estructura CYP450 (citocromo P450) en algunos casos
estos compuestos son generados en la ceacutelula vegetal como una viacutea de defensa
(fitoalexinas como la escopoletina) frente a estiacutemulos de estreacutes y la presencia de fito-
patoacutegenos34
O O
3
45
6
7
81
2
Figura 11 Estructura de la 2H-1-benzopiran-2-ona (cumarina)
Introduccioacuten
2
El nombre de estos compuestos se deriva de la palabra ldquocoumarourdquo vocablo
caribentildeo que hace referencia al aacuterbol de Tonka originario de Sudameacuterica de cuya
semilla A Vogel logra aislar el compuesto y publicar su hallazgo en 18205b
A partir
de entonces el intereacutes por su caracterizacioacuten6 la obtencioacuten tanto desde fuentes
naturales7 como por rutas sinteacuteticas de la cumarina y sus derivados ha ido en
aumento encontrando su primera aplicacioacuten en la fabricacioacuten de perfumes En 1868
W H Perkin propuso la siacutentesis de una fragancia vegetal a partir de la sal soacutedica del
orto-hidroxibenzaldehiacutedo y anhiacutedrido aceacutetico obteniendo el mismo producto aislado
de la semilla de Tonka5 8(ac)
Se han estudiado los aspectos taxonoacutemicos en cuanto a la clasificacioacuten de las especies
vegetales que contienen compuestos cumariacutenicos se estima que las principales
familias donde se encuentran estos derivados son Umbelliferae Rutaceae
Leguminosae Compositae Caryopgillaceae Euphorbiaceae Hipocastanaceae
Oleaceae Thymelaeaceae8b
112 Rutas de siacutentesis
Los autores Sethna y Narsinh9 presentaron en 1944 una de las primeras revisiones del
estado del arte con respecto a la siacutentesis de cumarinas En ella se encuentran las
principales metodologiacuteas claacutesicas de obtencioacuten como la siacutentesis de Perkin
Pechmann10
y Pechmann-Duisberg11
(Figura 12) en la que se obtiene la cumarina al
Introduccioacuten
3
condensar un fenol con un β-cetoester en medio aacutecido Diversas publicaciones
plantean modificaciones a esta ruta con catalizadores12 (ab)
libre de solventes13 (ab)
con promotores aacutecidos14
asistida por microondas15
entre otras
Figura 12 Esquema general de la reaccioacuten de Pechmann
Otra metodologiacutea empleada es la de Knoevenagel16
propuesta en 1898 Consiste en
una reaccioacuten de condensacioacuten entre o-hidroxialdehiacutedos con malonato de etilo
acetoacetato de etilo o cianoacetato de etilo en medio baacutesico (piridina o piperidina)
Los autores Bigi y colaboradores17
describen el uso de un catalizador en base a
montmorillonita para la obtencioacuten de cumarinas sustituidas en posicioacuten 3 con un
grupo aacutecido Posteriormente otro grupo de trabajo (Shaabani 2009) llevoacute a cabo esta
condensacioacuten empleando radiacioacuten de microondas lo que les permitioacute obtener buenos
rendimientos en un medio ldquoamigablerdquo con el ambiente18
Se han descrito otras metodologiacuteas sinteacuteticas en las cuales se utilizan las reacciones
claacutesicas de Wittig19 ab
y Reformatsky20
ademaacutes de otras rutas con variantes tanto en
los reactivos como en el medio de reaccioacuten que permiten la obtencioacuten de derivados
OH
+
OEt
O O H2SO4
O O
Introduccioacuten
4
cumariacutenicos como la siacutentesis en presencia de bases fuertes21
reacciones libres de
solventes22
y la obtencioacuten de cumarinas policiacuteclicas utilizando compuestos
organometaacutelicos descrita por Harvey y cols23
113 Principales aplicaciones
Tras ser aisladas desde su fuente vegetal y como resultado de investigaciones
posteriores dirigidas a generar rutas sinteacuteticas viables las cumarinas han sido objeto
de numerosos estudios enfocados en la buacutesqueda de sus aplicaciones Es asiacute como en
la literatura se pueden encontrar las maacutes diversas investigaciones para este tipo de
compuestos provenientes tanto de productos de siacutentesis o como extractos de
vegetales y plantas con reconocidas propiedades en la medicina tradicional esto da
origen al estudio de sus bio-aplicaciones entre las que se destaca su capacidad como
antioxidante
A Actividad bioloacutegica
La primera aplicacioacuten en bio-medicina descrita para las cumarinas fue como
anticoagulante desde que se aislara y caracterizara el dicumarol 33rsquo-metilenbis(4-
hidroxicumarina) (Figura 13) Posteriormente aparece en el mercado su derivado
Introduccioacuten
5
sinteacutetico conocido como Warfarina que hasta la deacutecada pasada era considerado uno
de los faacutermacos anticoagulantes maacutes vendidos en Estados Unidos24 a-c
OOOO
OH HO
Figura 13 Estructura de la 33rsquo-metilenbis(4-hidroxicumarina) o dicumarol
Con posterioridad el uso de las cumarinas se ha diversificado hacia innumerables
blancos terapeacuteuticos En la literatura se describen variados estudios con respecto a sus
propiedades farmacoloacutegicas25ab
Su capacidad como agente antitumoral 26ab
se ha
estudiado en compuestos provenientes tanto de fuentes vegetales como sinteacuteticas
Riveiro ME y cols estudiaron el efecto de la 78-OH-4-metilcumarina en ceacutelulas
humanas afectadas por leucemia evidenciando el potencial que presentoacute este
derivado dihidroxilado27
En otra investigacioacuten realizada por C Ito y colaboradores
aislaron tres derivados cumariacutenicos de la especie vegetal Murraya siamensis cuyos
ensayos frente a ceacutelulas tumorales resultaron promisorios28
Con respecto a las propiedades antiinflamatorias de las cumarinas en la naturaleza se
encuentran especies como la Chamomilla recutita (manzanilla) que contiene un tipo
Introduccioacuten
6
de umbeliferona con tales propiedades En la literatura se encuentran derivados
sinteacuteticos desarrollados en cuya estructura estaacute presente el esqueleto cumariacutenico29
Lin y cols presentan los resultados de su estudio de la capacidad antiinflamatoria de
un conjunto de cumarinas los cuales fueron ademaacutes correlacionados con los
obtenidos para el apagamiento del radical hidroxilo30
HA El-Wahab y cols sintetizaron distintas tiazolo-cumarinas hiacutebridas y estudiaron
una de sus propiedades farmacoloacutegicas como agente antimicrobiano Estos
compuestos posteriormente fueron aplicados como aditivos en recubrimientos de
poliuretano confirieacutendoles tambieacuten esta propiedad microbicida a las superficies en
las que se utilizoacute31
Tambieacuten se han descrito derivados cumariacutenicos con propiedades anti-fuacutengicas 32ab
Un trabajo reciente presenta el estudio de complejos en base a Ni(II) Cu(II) y
Co(II)frente a distintas especies de hongos (Candida A niger Rhizopus)32c
Tambieacuten se han encontrado estructuras cumarina-glucoacutesidos provenientes de especies
vegetales (Hydrangea paniculata) que presentan propiedades hepatoprotectoras33
Otros estudios sentildealan tambieacuten la importancia de las estructuras cumariacutenicas como
compuesto antiviral analgeacutesico anti-tromboacutetico ulcerogeacutenico 25 34-36
inclusive con
potencial para ser usadas en terapias frente al VIH como lo sentildeala la investigacioacuten
sobre especies vegetales que contienen dipiranocumarin - calanolideos como
Introduccioacuten
7
principio activo25a
estudios que tambieacuten se han realizado con derivados de siacutentesis
disentildeados a partir de la estructura de origen vegetal (Lomatium suksdorfii) conocida
como suksdorfina (Figura 14) a partir de la cual se han generado compuestos
anaacutelogos con el objeto de estudiar su modo de accioacuten y obtener sustratos cada vez
maacutes potentes frente a la enfermedad (Yu D y cols 2003)37
O OO
O
O
OO
Figura 14 Estructura de la suksdorfina
B Propiedades antioxidantes
El equilibrio en los organismos vivos es funcioacuten de diversos factores entre ellos cabe
mencionar el balance de las especies que generan estreacutes oxidativo dentro del medio
celular estas especies pueden ser de origen endoacutegeno como las provenientes de la
cadena transportadora de electrones enzimas oxidantes ceacutelulas fagociacuteticas o de
origen exoacutegeno como sustancias reductoras oxidacioacuten de drogas tabaquismo
ultrasonido luz solar etc Entre los compuestos que generan estreacutes conocidos como
Introduccioacuten
8
EROs y ERNs (especies reactivas de oxiacutegenonitroacutegeno) se pueden mencionar el
anioacuten superoacutexido (O2˙-) peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2) radical peroxilo (ROObull) y
alcoxilo (RObull) radical hidroxilo (HObull) oacutexido niacutetrico (NObull) peroxinitrito (ONOObull)
entre otras
Dentro de este contexto en la literatura se ha descrito el potencial que poseen las
cumarinas y sus derivados como compuestos capaces de interaccionar con especies
reactivas de oxiacutegeno y nitroacutegeno lo que da cuenta de su capacidad antioxidante tema
relevante si se considera que parte importante de las patologiacuteas conocidas y
estudiadas en la actualidad a nivel mundial estaacuten iacutentimamente ligadas a cuadros de
estreacutes oxidativo presentes en el organismo 38 39
Payaacute y colaboradores presentaron un trabajo en el cual se estudia la reactividad de un
conjunto de dieciseacuteis cumarinas (naturales y sinteacuteticas) frente al radical hidroxilo
aacutecido hipocloroso y anioacuten superoacutexido encontrando que los derivados di-hidroxilados
poseiacutean mejores propiedades que aquellos mono-hidroxilados o sin sustitucioacuten40
Estos resultados se complementan con una publicacioacuten posterior del mismo grupo en
que se profundiza el estudio anterior sentildealando las propiedades terapeacuteuticas de los
derivados cumariacutenicos34
El derivado conocido como esculetina (67-dihidroxicumarina) fue ensayado frente al
radical DPPH junto con ensayos de estreacutes oxidativo en medios de cultivo celular
Introduccioacuten
9
estos autores sentildealan la importancia de los grupos catecol en su capacidad de atrapar
especies radicales (Kim y cols 2008)41
Otro estudio en el que se ensaya un extracto
vegetal (Cortex Fraxini) relaciona ademaacutes la capacidad antioxidante de las o-
dihidroxi cumarinas con su capacidad reductora42
Zhang y cols presentan un estudio reciente en el cual cumarinas dihidroxiladas en
posicioacuten 7 y 8 entre otros derivados poseen importante bio-actividad in vitro los
compuestos fueron ensayados frente a especies radicales en ceacutelulas tumorales
presentaron ademaacutes actividad como antiinflamatorios y baja toxicidad tanto en
ceacutelulas sanguiacuteneas de vertebrado como de invertebrado Junto con lo anterior se
realizoacute un anaacutelisis de estructura-reactividad correlacionando la capacidad de
apagamiento de radicales con las propiedades antiinflamatorias y antitumorales de los
derivados cumariacutenicos encontradas en esta investigacioacuten43
12 Compuestos polifenoacutelicos
121 Origen vegetal
Los polifenoles al igual que las cumarinas son una amplia familia de compuestos (se
han encontrado maacutes de 8000 de ellos) presentes en estructuras vegetales como
metabolitos secundarios cumpliendo roles tales como protector frente a radiacioacuten
UV reguladores de los ciclos de crecimiento pigmentacioacuten y defensa frente a
Introduccioacuten
10
depredadores Su estructura baacutesica es el anillo benceacutenico con sustituyentes hidroxilo
(-OH) en distintas posiciones Se clasifican en flavonoides aacutecidos fenoacutelicos
(hidroxicinaacutemicos e hidroxibenzoicos) taninos estilbenos Debido a sus interesantes
propiedades y bio-aplicaciones estos fitoquiacutemicos han sido objeto de diversos
estudios investigacioacuten y caracterizacioacuten44-46
Estos compuestos son un constituyente importante de la dieta diaria se encuentran en
forma abundante en diversos frutos como por ejemplo berries manzana mango uva
pera granada y ciacutetricos en bebidas como el vino teacute y cafeacute 47
en vegetales cereales
y semillas Junto con lo anterior se ha descrito la utilizacioacuten de aacutecidos polifenoacutelicos
provenientes de extractos vegetales y aceites esenciales como aditivos en la industria
alimentaria aplicados como preservantes naturales en reemplazo de aquellos de
origen sinteacutetico debido a las propiedades antimicrobianas que exhiben48
122 Actividad bioloacutegica
Estos compuestos se conocen tambieacuten como ldquobiofenolesrdquo (Romeo y Uccella 1996)
haciendo referencia a aquellos provenientes de fuentes naturales Las primeras
publicaciones sobre los polifenoles en general comenzaron en la deacutecada de 1950 con
la investigacioacuten de D Harman y su teoriacutea del envejecimiento y los radicales libres
estudios en los que se planteoacute prolongar la sobrevida en especies roedores enfermos a
traveacutes de la ingesta de biofenoles presentes en su dieta Es asiacute que el nuacutemero de
publicaciones concernientes al tema se incrementoacute de una treintena (entre 1900 y
Introduccioacuten
11
1950) hasta superar las 35000 publicaciones entre los antildeos 2000-2010 lo que da
cuenta del creciente intereacutes en este toacutepico49
La bio-actividad de los compuestos polifenoacutelicos es amplia se encuentran diversos
estudios como el citado anteriormente con respecto a las capacidades antimicrobianas
de los polifenoles y su uso en la industria alimentaria5051
Compuestos como la
curcumina resveratrol quercetina y derivados del aacutecido gaacutelico se enumeran dentro de
las investigaciones realizadas tanto in vitro e in vivo en la prevencioacuten del caacutencer
(Cimino y cols 2012)52
Otras propiedades descritas para estos compuestos son como cardio-protectores anti-
canceriacutegenos antiinflamatorios vaso-relajantes entre otras como lo resume el
artiacuteculo de Xia y cols (2010) En eacutel ademaacutes se presenta una revisioacuten en cuanto a los
meacutetodos de extraccioacuten purificacioacuten y caracterizacioacuten del contenido y tipos de
polifenoles especiacuteficamente en el caso de la uva fruto reconocido por su alto
contenido de fitoquiacutemicos y nutrientes53
123 Polifenoles como antioxidantes
Los polifenoles como micronutrientes presentes en los alimentos y otras estructuras
vegetales han sido un foco de intereacutes ya que sus aplicaciones terapeacuteuticas estaacuten
relacionadas con su reconocida e investigada capacidad antioxidante y quelante de
metales Con respecto a esta uacuteltima cabe mencionar la revisioacuten del estado del arte
Introduccioacuten
12
realizada por Kozlowski y cols con respecto al desbalance de Cu Zn y Fe en el
organismo en ella se indica que la presencia libre y en exceso de estos metales estaacute
directamente relacionada con patologiacuteas neurodegenerativas y caacutencer entre otras ya
que su actividad redox genera especies reactivas capaces de atacar sustratos orgaacutenicos
como la membrana lipiacutedica proteiacutenas y aacutecido desoxiribonucleico (ADN)54
Ribeiro y colaboradores presentan un estudio en el que se determina el contenido
polifenoacutelico de la especie Fistulina hepaacutetica Los extractos se ensayaron frente a
DPPH anioacuten superoacutexido radical hidroxilo y aacutecido hipocloroso Los autores plantean
que considerando los resultados obtenidos esta especie fuacutengica podriacutea tener
aplicacioacuten como suplemento o como antioxidante en la industria alimentaria55
Estudios realizados con aacutecido taacutenico comercial sentildealan que su capacidad como
antioxidante y como quelante de hierro da cuenta del potencial que tiene este aacutecido
ademaacutes como anti-mutageacutenico y anti-carcinogeacutenico Los autores indican posibilidad
de que este aacutecido el cual presenta baja toxicidad contribuye en el apagamiento de
especies reactivas de oxiacutegeno dantildeinas a nivel de ADN (Andrade y cols 2006)56
trabajo que se complementa con una publicacioacuten anterior del mismo grupo donde se
estudioacute el apagamiento del radical OHbull mediante complejos de aacutecido taacutenico-Cu
(Andrade y cols 2005)57
Los aacutecidos hidroxicinaacutemicos e hidroxibenzoicos han sido tambieacuten objeto de estudio
debido a su capacidad antioxidante58-61
Jeong y colaboradores estudiaron el extracto
de la especie vegetal Erigeron annuus el cual contiene aacutecido cafeico en su fraccioacuten
Introduccioacuten
13
butanoacutelica este extracto fue ensayado como agente neuro-protector y antioxidante en
ceacutelulas nerviosas Frente a los resultados obtenidos los autores concluyen que este
extracto podriacutea ser utilizado en terapias frente a patologiacuteas neurodegenerativas como
el Alzheimer62
Otro estudio de capacidad antioxidante realizado a un grupo de
compuestos polifenoacutelicos presentes en el propoacuteleo (aacutecido cafeico aacutecido feruacutelico
ferulato de etilo eacutester fenetiacutelico del aacutecido cafeico) sentildeala que los grupos catecol
presentes en las estructuras ensayadas incrementan la capacidad antioxidante
mientras que en estudios relacionados con bio-membranas se debe tener en cuenta
ademaacutes la hidrofobicidad que presenten los compuestos63
13 Compuestos hiacutebridos
Al considerar que las diversas enfermedades que afectan al ser humano (caacutencer
diabetes enfermedades neurodegenerativas artritis entre otras) involucran diferentes
factores patogeacutenicos se han desarrollado estrategias sinteacuteticas que permiten obtener
nuevos faacutermacos de naturaleza hiacutebrida los cuales incorporan en su estructura
distintos ingredientes activos64
Este disentildeo ldquomulti-blancordquo ha permitido que los
nuevos faacutermacos actuacuteen en distintos blancos terapeacuteuticos este tipo de terapias
implica una disminucioacuten en los problemas asociados a una multi-dosificacioacuten las
interacciones entre distintos medicamentos una disminucioacuten en la resistencia a los
faacutermacos (en el caso de enfermedades de origen microbiano) disminucioacuten en los
efectos adversos derivados de la dosificacioacuten muacuteltiple por mencionar algunos
Introduccioacuten
14
Diversas investigaciones sobre el tema dan cuenta de la relevancia que ha tenido esta
estrategia y el disentildeo racional de nuevos medicamentos65-68
La revisioacuten realizada por
los autores Mehta y Singh (2002) menciona algunos de los esqueletos que han dado
origen a estructuras hiacutebridas entre ellas esteroides antraciclinas β-lactamas
fullerenos carbohidratos-peacuteptidos En esta revisioacuten se indica el uso de este tipo de
compuestos en terapias contra el caacutencer y como neuro-protectores69
En el caso de la malaria una de las enfermedades infecciosas maacutes complejas a nivel
mundial la resistencia del paraacutesito del geacutenero Plasmodium frente a los faacutermacos
empleados (cloroquina principalmente) ha sido un tema de estudio durante antildeos Una
resentildea de este desafiacuteo se presenta en el artiacuteculo de Kouznetsov y Goacutemez-Barrio
(2009) en el que se sentildeala la siacutentesis de derivados de aminoquinolina como las
trioxaquinas70
las cuales se presentan posteriormente en una revisioacuten realizada por
Chauhan y colaboradores en ella se destaca a estos hiacutebridos como candidatos
promisorios para la formulacioacuten de nuevas drogas antimalaacutericas71
Otra patologiacutea en la que se ha utilizado faacutermacos de naturaleza hiacutebrida que en
algunos casos provienen de productos naturales es el caacutencer72
Allen y
colaboradores73
mencionan en una reciente revisioacuten de tecnologiacuteas avanzadas en las
que ademaacutes de utilizar la estrategia de compuestos hiacutebridos con dos estructuras de
propiedades anticanceriacutegenas eacutestos se combinan con nano-estructuras orientadas a
Introduccioacuten
15
blancos especiacuteficos para asiacute disminuir el riesgo de efectos colaterales en el
tratamiento de esta compleja patologiacutea
Este concepto y disentildeo de faacutermacos multi-blanco se ha aplicado ademaacutes en distintas
terapias frente a enfermedades como el Alzheimer74
en vacunas de amplio espectro
frente al coacutelera75
en la siacutentesis de compuestos antiparasitarios76
y de dihidropiridinas
las cuales poseen actividad vasodilatadora77
por mencionar algunos ejemplos
131 Cumarinas como estructuras hiacutebridas
Al considerar el estado del arte con respecto a la amplia y variada actividad bioloacutegica
que presentan los derivados cumariacutenicos se encuentra que otra de las aplicaciones que
se ha estudiado para esta familia de compuestos es su capacidad para formar parte de
estructuras hiacutebridas complejas compuestos orientados a la obtencioacuten faacutermacos multi-
blanco que den respuesta a los interrogantes y desafiacuteos actuales con respecto a
importantes patologiacuteas y sus terapias 78
En la literatura se describen ejemplos de estructuras cumariacutenicas hiacutebridas no soacutelo de
origen sinteacutetico sino que tambieacuten se pueden extraer desde su fuente natural Un
estudio realizado en hojas y ramas de la especie Gnidia socotrana (originaria de
Yemen) da cuenta de la presencia de estructuras flavona-cumarina las que fueron
extraiacutedas purificadas y caracterizadas79
(Figura 15)
Introduccioacuten
16
O
OH
HO O
OH
O
O
OH
Figura 15 Estructura del hiacutebrido cumarina-flavona aislado de su fuente vegetal
Gnidia socotrana
Entre los compuestos antibioacuteticos de origen natural que poseen el esqueleto
cumariacutenico en su estructura se encuentran la novobiocina (Figura 16) clorobiocina y
cumermicina Presentes como metabolitos secundarios en la especie Streptomyces
estos derivados deben su actividad antibioacutetica a que actuacutean inhibiendo la enzima
ADN girasa presente en bacterias impidiendo su replicacioacuten y ademaacutes genera su
muerte celular80
O
HN
OH
O
OH
O
O
MeOO
H2N
HO
Figura 16 Estructura del antibioacutetico hiacutebrido novobiocina metabolitos secundarios
en la especie Streptomyces
Introduccioacuten
17
Se ha descrito tambieacuten la capacidad antitumoral de derivados cumarina-resveratrol a
partir del precursor 7-hidroxicumarina En la publicacioacuten de Belluti y colaboradores
se presentan los ensayos realizados para 10 compuestos los cuales tuvieron como
objeto ceacutelulas tumorales de pulmoacuten humano dos de los hiacutebridos presentaron
resultados promisorios como antitumorales y pro-apoptoacuteticos comportamiento que
los autores concluyen tiene relacioacuten con la posicioacuten de los sustituyentes en la
moleacutecula81
La revisioacuten bibliograacutefica de Longhin y colaboradores describe diversas estructuras
hiacutebridas desarrolladas que cuentan con capacidad antiinflamatoria toacutepico de intereacutes si
se considera que los cuadros inflamatorios estaacuten relacionados a dolencias como el
Alzheimer asma arterioesclerosis artritis reumatoide caacutencer etc En este trabajo se
sentildeala al hiacutebrido cumarina-aacutecido lipoico donde ambas estructuras poseen ademaacutes
reconocida capacidad antioxidante y el aacutecido unido a la cumarina en posicioacuten 3
mediante un espaciador es la estructura que se describe con una actividad superior al
conocido y utilizado faacutermaco indometacina82
Junto con los estudios descritos otra importante aacuterea de investigacioacuten ha sido el
desarrollo de estructuras hiacutebridas con capacidad antioxidante (Koufaki 2006)83
actividad que permite en muchos casos restablecer el equilibrio en organismos vivos
frente al exceso de especies generadoras de estreacutes oxidativo cuadro que como ya se
Introduccioacuten
18
mencionoacute estaacute con frecuencia asociado las patologiacuteas conocidas y estudiadas en la
actualidad
El reciente estudio desarrollado por Matos Olea-Azar y colaboradores presenta la
estructura cumarina-resveratrol y diferentes derivados sinteacuteticos los cuales fueron
estudiados mediante diversas teacutecnicas in vitro como resonancia de espiacuten electroacutenico
(REE) capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno (ORAC-FL) y
voltametriacutea ciacuteclica (VC) En esta investigacioacuten se encontroacute que los compuestos
propuestos poseen una buena capacidad antioxidante84
Una investigacioacuten que da cuenta del potencial que posee esta estrategia es la
desarrollada por Kenchappa y colaboradores quienes sintetizaron derivados
cumariacutenicos unidos a pirazol e indenona posteriormente mediante estudios in vitro e
in vivo obtuvieron resultados de su capacidad antioxidante y ademaacutes como agentes
anti-hipergliceacutemicos en un modelo animal proyectaacutendolos como posibles faacutermacos
frente a la diabetes85
Dentro del mismo esquema Krishan y colaboradores
desarrollaron una serie de cumarinas unidas al benzoimidazol el cual es a su vez una
estructura con muacuteltiple y reconocida actividad bioloacutegica proponen a dos compuestos
de la serie como derivados con una buena capacidad antioxidante y anti-inflamatoria
a nivel de mucosa gaacutestrica86
Introduccioacuten
19
Un tipo de derivado hiacutebrido que ha sido estudiado es la cumarina-chalcona El trabajo
realizado por Xi y Liu presenta la siacutentesis de una serie de compuestos (Figura 17)
los que posteriormente son ensayados por distintas metodologiacuteas de determinacioacuten de
capacidad antioxidante concluyendo que estos hiacutebridos son estructuras promisorias
en los que el grupo catecol presente en el esqueleto cumariacutenico o en la chalcona es
capaz de inhibir distintos procesos oxidativos a nivel de ADN87
O O
OH
O
R1
R2
R3
Figura 17 Hiacutebridos chalcona-cumarina con capacidad antioxidante
Peacuterez-Cruz y colaboradores describen el disentildeo siacutentesis y estudio de la capacidad
antioxidante de derivados cumarina-chalcona los que presentaron buena reactividad
frente a distintas especies radicales y capacidad cito-protectora en un modelo celular
animal88
En los estudios mencionados se evidencia el continuo desarrollo que ha tenido el
disentildeo y siacutentesis de compuestos hiacutebridos como nuevos faacutermacos frente a complejas
Introduccioacuten
20
enfermedades multifactoriales Esta tendencia vigente en la actualidad se extiende a
los maacutes variados nuacutecleos estructurales entre ellos la cumarina Este heterociclo
clasificado por algunos autores como ldquoestructura privilegiadardquo debido a la amplia
gama de compuestos que se originan a partir de eacutel es el punto de partida para
diversas propuestas sinteacuteticas enfocadas a generar un producto que posea muacuteltiples
actividades bioloacutegicas de intereacutes terapeacuteutico
Hipoacutetesis y objetivos
21
2 Hipoacutetesis
Los compuestos hidroxicumariacutenicos exhiben conocidas e interesantes propiedades
antioxidantes
Al sustituir la cumarina con los compuestos aacutecido cafeico aacutecido gaacutelico y aacutecido
protocateacutequico se obtienen derivados de naturaleza hiacutebrida aumentando la actividad
de la cumarina frente a las especies reactivas de oxiacutegeno anioacuten superoacutexido radical
hidroxilo radical peroxilo y su capacidad reductora
3 Objetivos
31 Objetivos generales
- Evaluar el comportamiento electroquiacutemico oxidativo de los derivados
cumariacutenicos previamente sintetizados y caracterizados fiacutesicamente
- Evaluar la capacidad antioxidante de los nuevos compuestos derivados de
cumarina y aacutecidos benzoicos frente a distintas especies radicales mediante
diversas teacutecnicas in vitro
Hipoacutetesis y objetivos
22
32 Objetivos especiacuteficos
Objetivos en siacutentesis
- Sintetizar y caracterizar el compuesto precursor 4-clorometil-78-
dihidroxicumarina y los correspondientes derivados de la sustitucioacuten en posicioacuten-
4 con aacutecido cafeico aacutecido gaacutelico y aacutecido 34-dihidroxibenzoico
Objetivos en electroquiacutemica
- Realizar la caracterizacioacuten anoacutedica en medio aproacutetico (NN-dimetilformamida
DMF) de los compuestos por voltametriacutea ciacuteclica (VC) voltametriacutea de pulso
diferencial (VPD)
Objetivos en la determinacioacuten de capacidad antioxidante
- Estudiar la reactividad de los compuestos frente al anioacuten radical superoacutexido O2-
utilizando como teacutecnica voltametriacutea ciacuteclica
- Determinar la reactividad de los compuestos frente al radical peroxilo (ROObull)
obteniendo su iacutendice ORAC-FL
- Determinar la capacidad reductora de hierro (Fe3+
) de los compuestos a traveacutes de
la teacutecnica FRAP
- Estudiar la reactividad frente al radical OHbull mediante la teacutecnica spin trapping
utilizando espectroscopiacutea de resonancia de espin electroacutenica (REE)
Hipoacutetesis y objetivos
23
- Evaluar la capacidad antioxidante celular de los compuestos
- Establecer la existencia de correlacioacuten entre paraacutemetros fisicoquiacutemicos de los
compuestos y su actividad antioxidante
Materiales y meacutetodos
24
4 Materiales y meacutetodos
41 Materiales
411 Reactivos y equipamiento utilizado en siacutentesis
Reactivos
- Aacutecido 34-dihidroxicinaacutemico Merck
- Aacutecido 34- dihidroxibenzoico Sigma-Aldrich
- Aacutecido 345-trihidroxibenzoico Sigma-Aldrich
- Pirogalol Merck
- 4-cloro acetoacetato de etilo Sigma-Aldrich
- NN-dimetilformamida PA J T Baker
- 18-diazabiciclo[540]undec-7-ano (DBU) Sigma-Aldrich
- Carbonato aacutecido de sodio Merck
- Metanol PA JT Baker
- Acetona PA Merck
- Etanol PA Merck
- Cloroformo PA Merck
- Aacutecido sulfuacuterico 98 Merck
- Aacutecido clorhiacutedrico 37 JTBaker
- Anhiacutedrido aceacutetico Merck
- Hidroacutexido de sodio PA Merck
- Solucioacuten etanoacutelica de FeCl3
Materiales y meacutetodos
25
- Acetona d6 Sigma-Aldrich
- Dimetilsulfoacutexido d6 Sigma-Aldrich
- Cloroformo d6 Sigma-Aldrich
- Nitroacutegeno extra puro 99995 Linde Gas Chile SA
Equipamiento
Todo el material de vidrio utilizado fue clase A
- Balanza analiacutetica Precisa 125 A
- Rotavapor Heidolph VV 2000
- Sonicador Elme Transsonic Digital tipo T480H-2
- Agitador magneacutetico placa calefactora Heidolph MR 3002
- Estufa de secado al vaciacuteo Heraeus
412 Reactivos y equipamiento utilizados en electroquiacutemica
Reactivos
- NN-dimetilformamida (DMF) PA Merck
- Hexafluorofosfato de tetrabutil amonio (HFFTBA) Sigma-Aldrich
- Aacutecido 34-dihidroxicinaacutemico Merck
- Aacutecido 34- dihidroxibenzoico Sigma-Aldrich
- Aacutecido 345-trihidroxibenzoico Sigma-Aldrich
- Nitroacutegeno extra puro 99995 Linde Gas Chile SA
Materiales y meacutetodos
26
- Agua purificada (MilliQ) Millipore Merck
Equipamiento
- Estacioacuten de trabajo electroquiacutemica CH Instruments CHI 760c
- Electrodo de carbono viacutetreo CH Instruments d = 3 mm
- Alambre de platino
- Electrodo de referencia AgAgCl (KCl 3 M) CH Instruments
- Aluacutemina 03 μM y 005 μM Buheler
- Balanza analiacutetica Precisa 40SM-200ordf
413 Reactivos y equipamiento utilizados en ensayos frente a especies
radicalarias
Reactivos
- 2-(6-oacutexido-3-oxo-3H-xanten-9-il)benzoato disoacutedico (fluoresceiacutena sal
disoacutedica) Sigma-Aldrich
- 22-azo-bis(2-amidinopropan)diclorhidrato (ABAP) Sigma-Aldrich
- 246-tris(2-piridil)-s-triazina (TPTZ) Sigma Aldrich
- 6-hidroxi-2578-tetrametilcroman-2-aacutecido carboxiacutelico (Trolox) Sigma-
Aldrich
- Peroacutexido de hidroacutegeno al 30
- NN-dimetilformamida PA Sigma-Aldrich
- 55-dimetil-1-pirroline-N-oacutexido (DMPO)
- Acetato de sodio Merck
Materiales y meacutetodos
27
- Tricloruro de hierro (FeCl3) Sigma Aldrich
- Hidroacutexido de sodio Merck
- Fosfato diaacutecido de potasio Merck
- Etanol grado HPLC Merck
- Aacutecido aceacutetico glacial Merck
- N-octanol Merck
- Cloruro de zinc Merck
Equipamiento
- Balanza Precisa 40SM-200ordf
- Lector de microplacas con detector muacuteltiple Synergytrade HT Bio-Tek
Instruments Inc (Winooski VT USA)
- Espectroacutemetro ECS 106 de banda X (985 GHz) equipado con cavidad
rectangular y 50 KHz de modulacioacuten de campo (Bruker Coventry UK)
- WINSIM Software EPR Spectral Simulation for MS-Windows 9x NT
Version 098 copy PEST Public EPR Simulation Tools NIEHS USA
- Alambre de platino
- Espectrofotoacutemetro UV-Visible Specord S600 Analytik Jena
- Equipo generacioacuten agua ultrapura NanoPure Barnstead
Materiales y meacutetodos
28
42 Meacutetodo
421 Procedimientos de siacutentesis
En un primer paso se obtuvo el precursor 4-clorometil-78-dihidroxicumarina
mediante la siacutentesis de Pechmann posteriormente se realizoacute la esterificacioacuten entre el
compuesto halogenado y diferentes aacutecidos orgaacutenicos comerciales (Figura 41) Los
aacutecidos comerciales utilizados en el proceso de siacutentesis fueron los siguientes
aacutecido 34-dixidroxicinaacutemico aacutecido 345- trihidroxibenzoico
(aacutecido cafeico) (aacutecido gaacutelico)
O
OH
OH
HO
aacutecido 34-dihidroxibenzoico
(aacutecido protocateacutequico)
Figura 41 Aacutecidos empleados en la sustitucioacuten de la 4-clorometil-78-
dihidroxicumarina
OH
OH
O
HO
O
OH
OH
HO
OH
Materiales y meacutetodos
29
Todos los compuestos fueron previamente acetilados para proteger los grupos
hidroxilo presentes en sus estructuras para evitar reacciones entre siacute
A Siacutentesis de la 4-clorometil-78-dihidroxicumarina 1
Se mezclaron en proporciones equimolares el pirogalol (31 mmoles) junto con el 4-
cloroacetoacetato de etilo con agitacioacuten constante en un bantildeo de agua-hielo sobre la
mezcla se antildeadieron lentamente 25 mL de H2SO4 (tambieacuten friacuteo) esta solucioacuten se
tornoacute de color rojizo oscuro Se dejoacute reaccionar 1 h
La mezcla de reaccioacuten se agregoacute lentamente sobre un bantildeo de agua-hielo-etanol con
vigorosa agitacioacuten y se obtuvo el producto como un precipitado fino que fue lavado
con abundante agua (a fin de eliminar restos aacutecidos) y purificado por re-cristalizacioacuten
en una mezcla etanol agua obtenieacutendose un soacutelido marfil brillante 1 La ruta
sinteacutetica se presenta a continuacioacuten
Figura 42 Siacutentesis del derivado clorado 1
O
OH
OH O
Cl
HO
OH
OH
OEt
Cl
O O
+
H2SO4
1 h
1
Materiales y meacutetodos
30
B Procedimientos de acetilacioacuten
a) Acetilacioacuten de 4-clorometil-78-dihidroxi-cumarina 2
Se suspendioacute la cumarina clorada (3 g) en 6 mL anhiacutedrido aceacutetico y se antildeadioacute 1 gota
de aacutecido sulfuacuterico La solucioacuten fue agitada con calentamiento (45 degC) por 30 min y se
observoacute el progreso de la reaccioacuten mediante el test de FeCl3 el que indica la presencia
o ausencia de grupos ndashOH fenoacutelicos en solucioacuten El precipitado obtenido 5 se
recristalizoacute en etanol su ruta sinteacutetica se muestra en la Figura 43
Figura 43 Siacutentesis del derivado clorado acetilado 5
b) Acetilacioacuten del aacutecido 34-dihidroxicinaacutemico 6
Seguacuten lo descrito en la literatura89
se disolvioacute el aacutecido 34-dihidroxicinaacutemico (aacutecido
cafeico) en solucioacuten 1 M de NaOH sobre un bantildeo de hielo se agregoacute anhiacutedrido
O
OH
HO O
Cl
Ac2O H2SO4
45 degC 30 min
O
O
O O
Cl
5
O
O
Materiales y meacutetodos
31
aceacutetico y de inmediato se aprecioacute la aparicioacuten de un precipitado amarillo claro que
con el paso del tiempo se tornoacute de color marfil Se dejoacute en estas condiciones con
agitacioacuten vigorosa por 30 min El producto 6 fue filtrado y lavado prolijamente con
agua posteriormente se recristalizoacute en etanol obtenieacutendose un soacutelido blanco brillante
La reaccioacuten global se presenta en la Figura 44
HO
HO
OH
O
O
O O
NaOH 30 min
AcO
AcO
OH
O
6
Figura 44 Siacutentesis del aacutecido cafeico acetilado 6
c) Acetilacioacuten del aacutecido gaacutelico7
Se mezclaron 3 g de aacutecido con 7 mL de anhiacutedrido aceacutetico se antildeadioacute 1 gota de H2SO4
Se agitoacute durante 30 min a 47 degC Posteriormente la mezcla fue enfriada y filtrada al
vaciacuteo El producto 7 soacutelido de color blanco se recristalizoacute en etanol La reaccioacuten
global se presenta en la Figura 45
Materiales y meacutetodos
32
O
HO
HO
OH
OHO
O O
H2SO4 30 min
O
AcO
AcO
OAc
OH
7
Figura 45 Siacutentesis del aacutecido gaacutelico acetilado 7
d) Acetilacioacuten del aacutecido 34-dihidroxibenzoico 8
Se mezclaron 3 g de aacutecido con 6 mL de anhiacutedrido aceacutetico se antildeadioacute 1 gota de H2SO4
Se agitoacute por 30 min a 50 degC Luego se enfrioacute y filtroacute al vaciacuteo El producto 8 soacutelido de
color blanco fue recristalizado en etanol la reaccioacuten global se muestra en la Figura
46
O
OH
OH
OHO
O O
H2SO4 30 min
O
OAc
OAc
OH
8
Figura 46 Siacutentesis del aacutecido 34-dihidroxibenzoico acetilado 8
Materiales y meacutetodos
33
C Siacutentesis de los derivados hiacutebridos Procedimiento general
En base a una variante del procedimiento descrito (Ono y colaboradores 1978)90
los
derivados hiacutebridos se obtuvieron mediante la esterificacioacuten de la cumarina acetilada
5 y el correspondiente aacutecido tambieacuten previamente acetilado (6 7 8) Se disolvioacute el
aacutecido (32 mmoles) en 10 mL de DMF (seca recieacuten destilada) a temperatura ambiente
y se agregoacute el DBU en proporcioacuten equimolar se dejoacute reaccionar por 30 min en un
matraz provisto de codo de desecacioacuten (relleno con CaCl2) y agitacioacuten constante Se
agregoacute la cumarina (32 mmoles) y se aprecioacute el fin de la reaccioacuten tras 35 h a 50 degC
de temperatura La solucioacuten se llevoacute a tdeg ambiente y se hizo precipitar
cuidadosamente agregando agua destilada el soacutelido (9 10 y 11) fue lavado
prolijamente se filtroacute y secoacute
La Figura 47 muestra como ejemplo la ruta sinteacutetica llevada a cabo en la obtencioacuten
del derivado de aacutecido cafeico
Figura47 Siacutentesis del intermediario hiacutebrido derivado del aacutecido cafeico
O
OAc
OAc O
Cl
OAc
OAc
HO
O
+ DBU
DMF seco
O
OAc
OAc O
OAc
OAc
O
O
Materiales y meacutetodos
34
Posteriormente se procedioacute a desproteger los grupos fenoacutelicos en el soacutelido mediante
el procedimiento de desacetilacioacuten El producto crudo fue suspendido en una mezcla
de metanol (8 mL) acetona (12 mL) y solucioacuten saturada de NaHCO3 (14 mL) se
agitoacute a temperatura ambiente bajo nitroacutegeno por 3 h
Finalizada la reaccioacuten la suspensioacuten se concentroacute al vaciacuteo se antildeadioacute HCl en friacuteo
formaacutendose un precipitado claro que se filtroacute y lavoacute con abundante agua
posteriormente fue secado cuidadosamente El soacutelido se lavoacute prolijamente con CHCl3
a ebullicioacuten y fue secado al vaciacuteo de esta forma se obtuvo el producto hiacutebrido La
Figura 48 muestra la ruta de desproteccioacuten empleada
Figura48 Siacutentesis del compuesto hiacutebrido final 9
O
OAc
AcO O
OAc
OAc
O
O N2 tdeg amb
O
OH
HO O
OH
OH
O
O
9
hidroacutelisis baacutesica
Materiales y meacutetodos
35
En la Figura 49 se presenta un resumen de la ruta sinteacutetica para las cumarinas
hiacutebridas obtenidas
HO
O
OH
OH4
OH
OH
HO
O
OH
3
OH
OH
HO
O
2
O
OH
HO O
Cl1
ii
HO
O
OAc
OAc8
OAc
OAc
HO
O
OAc
7
OAc
OAc
HO
O
6
O
OAc
AcO O
Cl5
Figura 49A Ruta de siacutentesis de los compuestos cumariacutenicos i) H2SO4 1 h bantildeo de
hielo ii) NaOH Ac2O 30 min bantildeo de hielo (aacutecido cafeico 6) H2SO4 Ac2O
30 min (cumarina y aacutecidos benzoicos)
O
OH
HO O
Cl
HO
OH
OH
OEtCl
O O
+
1
i
Materiales y meacutetodos
36
HO
OOAc
OAc
OAc
OAc
HO
O
OAc
7
OAc
OAc
HO
O
6
OOH
HO O
OH
OH
O
O
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
9
10
11
OOAc
AcO O
Cl5
iiiiv
8
Figura 49B Ruta de siacutentesis de los compuestos cumariacutenicos iii) DBU DMF (seca)
35 h 50 degC iv) NaHCO3 MeOH acetona tdeg amb 3 h N2
Materiales y meacutetodos
37
422 Procedimiento experimental en electroquiacutemica
i) Celda electroquiacutemica
La celda de trabajo estuvo compuesta por tres electrodos el de trabajo de carbono
viacutetreo y superficie 0076 cm2 electrodo de referencia AgAgCl (3 M KCl) inmerso en
puente salino (DMF + HFFTBA 02 M) y alambre de platino como contra-electrodo
ii) Condiciones de trabajo
Los experimentos se realizaron utilizando como solvente aproacutetico NN-
dimetilformamida (previamente destilada y guardada con tamiz molecular 3 Aring) las
soluciones de trabajo en una concentracioacuten de 2 mM para todos los compuestos
continuamente fueron purgadas con nitroacutegeno extra puro el electrolito soporte
utilizado fue HFFTBA (hexafluorofosfato de tetrabutil amonio) en una concentracioacuten
dos oacuterdenes de magnitud superior a la de la muestra
iii) Teacutecnicas empleadas
En el desarrollo de este trabajo se utilizoacute voltamperometriacutea ciacuteclica (VC) y
voltamperometriacutea de pulso diferencial (VPD)
Materiales y meacutetodos
38
iv) Caacutelculos
El proceso de deconvolucioacuten de las graacuteficas en VC se llevoacute a cabo utilizando el
software Origin Pro 8 SR2 (Origin Lab Corporation USA) Se aplicoacute la funcioacuten
Gaussiana (Ecuacioacuten 41)
119910 = 1199100 + 119860
119908 radic120587 119890
minus2(119909minus119909119888)2
1199082 Ecuacioacuten 41
423 Estudio de generacioacuten de especies radicalarias mediante espectroscopiacutea de
resonancia de espiacuten electroacutenico
La oxidacioacuten electroquiacutemica de los compuestos se realizoacute utilizando las
mismas condiciones de potencial de voltametriacutea ciacuteclica una celda compuesta de
electrodo de trabajo de alambre de platino el medio empleado fue DMF + HFFTBA
como contra-electrodo se utilizoacute alambre de platino La estabilizacioacuten del radical
generado en la oxidacioacuten electroquiacutemica se logroacute empleando el catioacuten quelante Zn2+
el cual es silente a la teacutecnica espectroscoacutepica y forma complejos con el grupo catecol
Se utilizoacute ZnCl2 en concentracioacuten final 3 mM
Materiales y meacutetodos
39
424 Procedimiento experimental en el estudio de actividad frente a especies
radicalarias
4241 Metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno
(oxygen radical antioxidant capacity-fluorescein ORAC-FL)
Se prepararon soluciones stock en etanol para cada compuesto de ellas se obtuvieron
las soluciones de trabajo diluidas en solucioacuten buffer fosfato (pH 74) Se antildeadieron
las aliacutecuotas respectivas de concentraciones crecientes de cada compuesto en los
pocillos de la placa (concentraciones finales entre 02 microM y 109 microM que permitieron
obtener curvas de decaimiento apropiadamente separadas) posteriormente se
adicionoacute la sonda fluoresceiacutena (Figura 410 A) (solucioacuten preparada en buffer pH 74 y
concentracioacuten final 40 nM) y se pre-incuboacute 15 min a 37 degC Finalmente se adicionoacute la
aliacutecuota correspondiente de solucioacuten de 22prime-azobis(2-metiilpropionamidina)
dihidrochloridrato (ABAP) la solucioacuten fue preparada en buffer pH 74 y
concentracioacuten final 18 mM (Figura 410 B) y se llegoacute a un volumen final de 200 microL
La placa fue introducida en el lector y se midioacute el decaimiento de la sonda
fluorescente cada 1 min con agitacioacuten previa a cada medicioacuten Para cada set de
medidas fue determinado el blanco correspondiente que contiene la sonda
fluorescente y el generador de radicales peroxilo (ROObull) Se empleoacute el compuesto
Trolox como antioxidante estaacutendar de referencia (Figura 410 C) utilizaacutendose un set
Materiales y meacutetodos
40
de concentraciones entre los 3 microM y 20 microM y el procedimiento anteriormente descrito
para determinar el decaimiento de la fluorescencia de la sonda
La capacidad de inhibicioacuten expresada como valor de iacutendice ORAC se cuantificoacute
utilizando el valor integrado de aacuterea bajo la curva (ABC) de fluorescencia (Figura
411 donde F0 es el valor medido a tiempo 0 y F es el valor de fluorescencia al final
de la medicioacuten cuando se aprecioacute que el decaimiento es total) La ABC neta se obtuvo
de restar el valor del blanco al valor de cada compuesto (ver Ecuacioacuten 42)
ABC neta = ABC compuesto ndash ABC blanco Ecuacioacuten 42
ONaO O
ONa
O
A
O
HO
OH
O
C
Figura 410 A Sonda fluoresceiacutena B 22prime-azobis(2-metilpropionamidina)
dihidrochloridrato (ABAP) C 6-hidroxi-2578-tetrametilcroman-2-aacutecido carboxiacutelico
(Trolox)
-Cl H2N+
NH2
N
N+NH2 Cl-
NH2
B
Materiales y Meacutetodos
41
Figura 411 Actividad antioxidante ORAC-FL para un compuesto en estudio
Finalmente este valor de ABC neta para cada concentracioacuten se graficoacute con respecto a la
concentracioacuten obtenieacutendose una relacioacuten lineal en el rango de estudio La pendiente de
la regresioacuten de cada compuesto fue dividida por el valor de la pendiente del estaacutendar
Trolox (obtenido de la mima forma descrita para las muestras) este coeficiente es el
mencionado Iacutendice ORAC
Los datos fueron procesados mediante el software Origin Pro 8 SR2 (Origin Lab
Corporation USA) Las mediciones se realizaron en triplicado
0 1000 2000 3000 400000
02
04
06
08
10
ABCneta
Antioxidante
Blanco
F
F0
Tiempo s
Materiales y Meacutetodos
42
4242 Metodologiacutea de determinacioacuten de poder antioxidante de reduccioacuten de hierro
(FRAP)
Preparacioacuten de soluciones
i) Preparacioacuten solucioacuten tampoacuten acetato
Se disolvieron 155 g de acetato de sodio trihidrato (CH3COONamiddot3H2O) en agua
ultrapura se agregaron 8 mL de CH3COOH glacial con agitacioacuten constante y se aforoacute
a 500 mL El pH fue ajustado a 36 con NaOH concentrado
ii) Preparacioacuten de solucioacuten tampoacuten fosfato pH 74
Se mezclaron 80 mL de solucioacuten 01 M de NaOH con 100 mL de solucioacuten 01 M de
KH2PO4 se agitoacute para homogeneizar
iii) Preparacioacuten solucioacuten HCl 40 mM
En un matraz aforado (50 mL) se mezclaron 167 microL de HCl 12 M (37) con agua
ultrapura y se agitoacute hasta homogeneizar
iv) Preparacioacuten de solucioacuten TPTZ
Se pesaron 797 mg de reactivo TPTZ (Figura 412) y se aforoacute a 25 mL con solucioacuten
HCl 40 mM se agitoacute y conservoacute protegido de la luz
Materiales y Meacutetodos
43
N
N
N
N
NN
Figura 412 Reactivo 246-tris(2-piridil)-s-triazina (TPTZ)
v) Preparacioacuten solucioacuten de FeCl3 (20 mM)
Se pesaron 0054 g de FeCl3middot6H2O se aforoacute a 10 mL con agua ultrapura y se agitoacute
constantemente
vi) Preparacioacuten del reactivo FRAP
Se mezcloacute el tampoacuten acetato con solucioacuten TPTZ y solucioacuten feacuterrica en proporcioacuten
1011 se agitoacute y conservoacute al abrigo de la luz
vii) Preparacioacuten de soluciones en estudio
Se mezclaron aliacutecuotas de solucioacuten stock (en etanol) de cada compuesto con tampoacuten
fosfato luego se agitaron y se obtuvieron soluciones en concentraciones entre 15 microM y
58 microM
Materiales y Meacutetodos
44
Ensayo de capacidad reductora
En un frasco aacutembar se mezclaron 150 microL de solucioacuten de muestra con 450 microL de agua
ultrapura y posteriormente 950 microL de reactivo FRAP La solucioacuten se agitoacute e
inmediatamente se tornoacute de color azul lo que indicoacute la reaccioacuten de oxidacioacuten de Fe2+
a Fe3+
en el complejo formado con el reactivo TPTZ Se midioacute el espectro de
absorbancia en el rango del UV-visible a temperatura ambiente considerando el valor
de λmaacutex = 599 nm Los experimentos se realizaron en triplicado los valores obtenidos
para este ensayo se expresan como equivalentes de Trolox 10 microM de muestra
4243 Capacidad de apagamiento del radical hidroxilo (OHbull) mediante la teacutecnica
spin trap
Se realizoacute el ensayo mediante la metodologiacutea de Fenton no cataliacutetico comparando las
sentildeales en el espectro mediante espectroscopia de resonancia de espiacuten electroacutenico
(REE) del aducto DMPO-OH como blanco frente a las sentildeales obtenidas en las
mismas condiciones tras antildeadir los compuestos en estudio Para la generacioacuten del
radical hidroxilo se utilizoacute peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2) y solucioacuten acuosa de NaOH
metodologiacutea que presenta la ventaja de que en ausencia de iones Fe2+
(como en la
metodologiacutea Fenton) se evitoacute la reaccioacuten de quelacioacuten con los grupos catecol presentes
en las estructuras propuestas91ab
Materiales y Meacutetodos
45
-10 -08 -06 -04
Ipa0
O2 + e
- O
2
-
O2
-O
2 + e
-
10 A
E vs Ag|AgCl V
Se prepararon soluciones stock (20 mM en DMF) de cada compuesto en estudio se
tomaron aliacutecuotas de 100 microL y se agregaron 50 microL de NaOH (25 mM) 50 microL de
solucioacuten de 55-dimetil-1-pirroline-N-oacutexido (DMPO) (30 mM) y finalmente 50 microL de
agua oxigenada (30) se agitoacute cuidadosamente se incuboacute por 5 minutos y se midioacute
su espectro Los resultados se expresaron como el porcentaje de inactivacioacuten del
radical hidroxilo
4244 Estudio de reactividad frente a anioacuten radical superoacutexido O2middot -
Se evaluoacute la reactividad de cada compuesto frente al radical anioacuten superoacutexido el que
fue generado electroquiacutemicamente en la superficie del electrodo a traveacutes de la
reduccioacuten del oxiacutegeno molecular disuelto en el medio (Figura 413)
Figura 413 Voltamograma ciacuteclico de la generacioacuten de anioacuten radical superoacutexido
DMF + HFFTBA 02 M en electrodo de carbono viacutetreo
Materiales y Meacutetodos
46
i) Celda electroquiacutemica
La celda estuvo compuesta de tres electrodos el electrodo de trabajo fue carbono
viacutetreo (aacuterea = 003 cm2) el electrodo auxiliar empleado fue Ag|AgCl (KCl 3 M
inmerso en DMF + HFFTBA 02 M como puente salino) y alambre de platino como
contra-electrodo
ii) Teacutecnica empleada
La generacioacuten del radical se realizoacute mediante voltamperometriacutea ciacuteclica (VC) a
velocidad de barrido de 01 Vs en un rango de potencial entre 0 V (inicial) y -1 V
como potencial de inversioacuten de la direccioacuten de barrido (switching) 92
iii) Experimento
Los experimentos se realizaron utilizando como solvente 10 mL de NN-
dimetilformamida (previamente destilada) el electrolito soporte utilizado fue
HFFTBA (hexafluorofosfato de tetrabutil amonio) en concentracioacuten 02 M las
soluciones fueron saturadas con aire continuamente Una vez estabilizada la corriente
se antildeadieron a la celda aliacutecuotas crecientes de solucioacuten stock de cada compuesto
observaacutendose la disminucioacuten en la corriente de pico anoacutedica Ipa0 Una vez obtenidos
los voltamogramas se determinoacute el paraacutemetro adimensional ((Ipa0-Ipa
S) Ipa
0) el que
expresoacute el consumo de la especie radical este valor se graficoacute con respecto a la
concentracioacuten del sustrato cuya relacioacuten fue una regresioacuten lineal De la graacutefica se
Materiales y Meacutetodos
47
obtuvo el valor de concentracioacuten de antioxidante en que la corriente de pico anoacutedico
disminuye en un 50 (IA50)
4245 Estudio de la capacidad antioxidante celular (CAC)
Para evaluar la actividad antioxidante de los compuestos estudiados en un medio
celular se utilizoacute el meacutetodo descrito en la literatura por Wolfe93
Se emplearon ceacutelulas
EAhy 926 (ATCC CRL-2922) las que fueron sembradas con una densidad de
50000 ceacutelulas por pocillo en microplacas de 96 pocillos con medio de cultivo
RPMI 1640 Despueacutes de 24 h fue removido el medio de cultivo y los pocillos
fueron lavados con buffer fosfato salino (PBS) pH 74 Los pocillos fueron tratados
con 20 μM de la sonda DCFH-DA disuelta en RPMI 1640 libre de suero fetal bobino
Posteriormente se agregaron los compuestos en dos concentraciones diferentes 1 μM y
10 μM Luego de transcurrida 1 h de incubacioacuten a 37 degC los pocillos fueron
lavados con PBS Luego de esto se agregoacute ABAP en una concentracioacuten final de
600 μM y se midioacute la fluorescencia generada por la sonda en el multi-lector de placas
a temperatura constante de 37 degC La emisioacuten a 538 nm fue medida con una excitacioacuten
a 485 nm cada 1 min por 1 hora El ensayo se realizoacute en triplicado El valor de
capacidad antioxidante se calcula determinando el aacuterea bajo la curva para la muestra y
el control experimental utilizando la siguiente ecuacioacuten
CAC = 100 ndash (ABCmuestra ABCcontrol) 100 Ecuacioacuten 43
Materiales y Meacutetodos
48
4246 Estudio de hidrofobicidad relativa de los compuestos
La hidrofobicidad de los compuestos se correlaciona con sus coeficientes de reparto y
distribucioacuten (log P para el reparto octanolagua y log D para la distribucioacuten
octanolsolucioacuten tampoacuten pH 74) los que se determinan utilizando teacutecnicas
espectrofotomeacutetricas yo cromatograacuteficas
Para realizar estas experiencias se determina la solubilidad del analito en octanol
saturado con agua y en la solucioacuten tampoacuten pH 74 saturado con octanol Luego se
obtienen las respectivas curvas de calibracioacuten para la concentracioacuten del compuesto en
estas soluciones en funcioacuten de la absorbancia yo aacuterea bajo la curva Se espera que las
curvas de calibracioacuten obtenidas cumplan con el requisito de una linealidad apropiada
Posteriormente se debe evaluar el reparto midiendo la concentracioacuten analiacutetica en la
fase orgaacutenica y acuosa Para la determinacioacuten del reparto estaacute descrita la siguiente
ecuacioacuten
119897119900119892119875119900119888119905119886119892119906119886 = log ([119904119900119897119906119905119900]119900119888119905119886119899119900119897
[119904119900119897119906119905119900]119886119892119906119886) Ecuacioacuten 44
Mientras que para la determinacioacuten de la distribucioacuten se utiliza la siguiente ecuacioacuten
119897119900119892119875119900119888119905119886119892119906119886(119905119886119898119901oacute119899) = log ([119904119900119897119906119905119900]119900119888119905119886119899119900119897
[119904119900119897119906119905119900]119905119886119898119901oacute119899 119901119867 74) Ecuacioacuten 45
Materiales y Meacutetodos
49
Para este estudio se realizoacute la determinacioacuten de tiempos de retencioacuten como medida de
la hidrofobicidad relativa entre compuestos Se utilizoacute una columna C18 ODS Hypersil
una fase moacutevil compuesta de acetonitrilo solucioacuten H3PO4 (6535 vv) bajo
condiciones isocraacuteticas con flujo 1 mLmin volumen de inyeccioacuten 50 microL
4247 Estudio teoacuterico caacutelculo del Iacutendice de Fukui
La optimizacioacuten de estructuras de los compuestos neutros se realizoacute utilizando el
meacutetodo DFTSP-DFT basado en la Teoriacutea de Funcionales de la Densidad (DFT)94-96
Se utilizoacute el funcional hiacutebrido B3LYP el conjunto de bases empleado fue 6-31G(d)
Los caacutelculos se realizaron mediante el software Gaussianrsquo09 Los descriptores locales
se evaluaron a traveacutes de la aproximacioacuten de orbitales condensados Orbitales
Moleculares Frontera (Mulliken MOs)
Resultados y discusioacuten
50
5 Resultados y discusioacuten
51 Siacutentesis de los compuestos
Se presentan a continuacioacuten los resultados de la caracterizacioacuten fiacutesica y
espectroscoacutepica de los compuestos sintetizados durante este trabajo
4-clorometil-78-dihidroxicumarina (1)
1H RMN (DMSO d6 δ ppm) 493 (s 2H -CH2-) 641 (s 1H =CH- cumarina) 686
(d 1Harom Jorto 85) 717 (d 1Harom Jorto 85) 942 (s1H OH) 1022 (s 1H OH)
13C RMN (DMSO d6 δ ppm) 4187 11047 11129 11267 11585 13282 14358
15017 15181 16046 Rendimiento 47 Punto de fusioacuten 202-204 degC Agujas
color marfil PM 2265gmol Foacutermula molecular C10H7O4Cl
4-clorometil-78-diacetilcumarina (5)
1H RMN (DMSO d6 δ ppm) 235 (s 3H -CH3) 241 (s 3H-CH3) 506 (s 2H -
CH2-) 674 (s 1H =CH- cumarina) 739 (d 1Harom Jorto 878) 783 (d 1Harom Jorto
878)13
C RMN (DMSO d6 δ ppm) 1943 1985 3983 4073 11467 11549
11871 12238 12939 14459 14593 14999 1578716751 Rendimiento 68
Punto de fusioacuten 157-159 degC Soacutelido blanco PM 3105 gmol Foacutermula molecular
C14H11O6Cl
Resultados y discusioacuten
51
Aacutecido-34-diacetoxicinaacutemico (6)
1H RMN (acetona d6 δ ppm) 215 (s 3H -CH3) 216 (s 3H CH3) 638-643 (d 1H
Jtrans 159) 717-720 (d 1Harom Jorto 878) 748-750-756 (s Harom y Htrans) 13
C RMN
(acetona d6 δ ppm)1996 2004 11977 12333 12450 12682 13364 14323
14339 14439 16699 16809 16817 Rendimiento 56 Punto de fusioacuten
158-161 degC Soacutelido blanco PM 264 gmol Foacutermula molecular C13H12O6
Aacutecido-345-triacetilbenzoico (7)
1H RMN (acetona d6 δ ppm) 217 (s 6H -CH3) 219 (s 3H -CH3) 767 (s 2H
Harom) 13
C RMN (acetona d6 δ ppm) (2C -CH3 1865) (2C-C=O 1910) (2Carom
12160) 12790 13857 (2C 14337) 16432 16599 16789 Rendimiento 66
Punto de fusioacuten 158-160 degC Soacutelido blanco PM 296 gmol Foacutermula molecular
C13H12O8
Aacutecido 34-diacetilbenzoico (8)
1H RMN (acetona d6 δ ppm) 217 (s 6H CH3) 724-727 (d 1Harom Jorto 85) 774-
775 (d 1Harom) 781-784 (dd 1Harom) 13
C RMN (acetona d6 δ ppm) 1910 1913
(2C 12329) 12453 12729 12838 16487 16699 16729 Rendimiento 61
Punto de fusioacuten 155-158 degC Soacutelido blanco PM 238 gmol Foacutermula molecular
C11H10O6
Resultados y discusioacuten
52
4-metil-(34-dihidroxicinamoato)-78-dihidroxicumarina (9)
1H RMN (DMSOd6 δppm) 541(s 2H -CH2-) 621(s 1H =CH- cumarina) 642-
648 (d 1H Jtrans= 1591) 682-71 (Harom) 758-763 (d 1H Jtrans = 1591) 91 (s -
OH) 94 (s -OH) 97 (s -OH) 102 (s- OH)13
C RMN (DMSO d6 δppm) 6154
10820 11035 11290 11345 11526 11550 11620 12225 12566 13292
14391 14607 14686 14920 15026 15174 16055 16646ESI-MS mz 371
[M+H]+ 369 [M-H]
- 181 [M+H]
+ 163 [M-H2O+H]
+ 145 [M-H2O+H]
+ 135 [M-
HCOOH+H]+ 179 [M-H]
- 161 [M-H2O-H]
- 135 [M-CO2-H]
-Rendimiento 37
Punto de fusioacuten 246-249 degC Soacutelido amarillo opaco PM 37031 gmol Foacutermula
molecular C19H14O8
4-metil-(345-dixidroxibenzoato)-78-dihidroxicumarina ( 10 )
1H RMN (DMSO d6 δ ppm) 546 (s 2H -CH2-) 619 (s 1H =CH- cumarina) 682-
685 (d 1Harom Jorto 8508) 704 (s 2Harom) 709-712 (d 1Harom Jorto 778)13
C RMN
(DMSO d6 δppm) 6192 10821 10914 11041 11295 11533 11885 13292
13949 14394 (2Carom) 14620 15024 15184 16055 16555 16793ESI-MS mz
361 [M+H]+ 359 [M-H]
- 171 [M+H]
+ 153 [M-H2O+H]
+ 125 [M-CO2H+H]
+ 169
[M-H]- 125 [M-CO2-H]
- Rendimiento 46 Punto de fusioacuten descomposicioacuten sobre
230 degC Soacutelido amarillo opaco PM 36027 gmol Foacutermula molecular C17H12O9
Resultados y discusioacuten
53
4-metil-(34-dihidroxibenzoato)-78-dihidroxicumarina (11)
1H RMN (DMSO d6 δ ppm) 548 (s 2H -CH2-) 619 (s 1H =CH- cumarina) 685
(m 2Harom) 71 (d 1Harom) 74 (d 2Harom) 13
C RMN (DMSO d6 δ ppm) 6142
10774 10988 11242 11481 11551 11626 11957 12218 13240 14343
14520 14972 15096 15127 16001 16490 ESI-MS mz 345 [M+H]+ 343 [M-
H]- 137 [M-H2O+H]
+ 109 [M-HCOOH+H]
+ 153 [M-H]
- 108 [M-CO2-H]
-
Rendimiento 73 Punto de fusioacuten descomposicioacuten sobre 250 degC Soacutelido amarillo
opaco PM 34427 gmol Foacutermula molecular C17H12O8
Resultados y discusioacuten
54
52 Estudios de voltametriacutea ciacuteclica y voltametriacutea de pulso diferencial
El proceso de oxidacioacuten electroquiacutemico de los compuestos fue evaluado mediante
voltamperometriacutea de pulso diferencial VPD Los resultados presentaron soacutelo un pico
de oxidacioacuten para los compuestos 1 2 4 y 9 por otra parte el aacutecido gaacutelico 3 y los
hiacutebridos 10 y 11 mostraron dos o maacutes sentildeales poniendo de manifiesto las complejas
reacciones de oxidacioacuten que presentan los grupos -OH en dichas estructuras (Figura
51 A y B)97
Al analizar las sentildeales tanto para los precursores y sus derivados hiacutebridos se encontroacute
que la uacutenica sentildeal anoacutedica del compuesto 9 corresponderiacutea tanto a la oxidacioacuten del
catecol presente en la cumarina 1 (Epa 083 V) como del aacutecido cafeico 2 (Epa 076 V)
(Figura 52 A) ambos compuestos por separado tuvieron potenciales de pico anoacutedico
cercanos los que se solaparon para una dar una sola sentildeal en el derivado 9 (Epa 082
V)
Figura 51 A
Voltamperogramas de pulso
diferencial para los
precursores 1 2 3 y 4 2 mM
en DMF + HFFTBA 02 M
00 03 06 09 12 15 18 21 24
OO H
O H
H O
OOH
OH
HO
OH
OH
OH
O
HO
OOH
OH O
Cl
A
2A
E vs Ag|AgCl V
1
2
3
4
Resultados y discusioacuten
55
Figura 51 B Voltamperogramas de pulso diferencial para los derivados 9 10 y 11
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
En el caso del hiacutebrido 11 derivado del aacutecido protocateacutequico se observaron dos picos de
oxidacioacuten que corresponderiacutean a la oxidacioacuten del catecol cumariacutenico (Epa 083 V) y el
catecol del aacutecido benzoico (Epa 111 V) A diferencia del caso anterior se encontroacute
que las sentildeales anoacutedicas de ambos precursores estuvieron lo suficientemente distantes
como para solaparse como en el caso anterior Considerando que los resultados se
obtuvieron bajo las mismas condiciones experimentales se podriacutea asumir que la sentildeal
a potencial Epa1 081 V corresponde a la oxidacioacuten en el anillo de la cumarina y la
sentildeal en Epa2 094 V corresponde a la oxidacioacuten del catecol presente en el anillo
benceacutenico Para el compuesto 10 se observoacute un comportamiento semejante al descrito
para 11
00 03 06 09 12 15 18 21 24
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OH O O
O
OO H
O H
O H
OOH
OH O
OH
OH
O
O
B
E vs Ag|AgCl V
9
10
11
2A
Resultados y discusioacuten
56
Los experimentos de voltamperometriacutea ciacuteclica se llevaron a cabo a distinta velocidad
de barrido 005 Vs ndash 3 Vs con el objeto de estudiar su influencia sobre la sentildeal de
oxidacioacuten En forma graacutefica para precursores y derivados se observaron pares redox de
comportamiento irreversible debido al evidente desplazamiento del potencial de pico
Epa con respecto al aumento de la velocidad de barrido El valor de ΔEp (Epa -Epc) se
incrementoacute con el aumento en la velocidad lo que indica una disminucioacuten en la
velocidad de transferencia electroacutenica Para los compuestos 1 2 4 y 9 a la velocidad
de barrido estudiada se observoacute al igual que en VPD la aparicioacuten de una uacutenica sentildeal
de oxidacioacuten para todo el rango de velocidad (la que se desplaza a potenciales maacutes
positivos a medida que aumenta la velocidad de barrido) seguida de una sentildeal de
reduccioacuten en el barrido hacia potenciales negativos Para los compuestos 3 10 y 11 se
apreciaron dos sentildeales de oxidacioacuten seguida de la correspondiente sentildeal en el barrido
de reduccioacuten
Para cada par redox se realizaron estudios por segmentos encontraacutendose para los
compuestos 9 y 10 que el pico I (de oxidacioacuten) estaacute relacionado con el pico II (de
reduccioacuten) y para el compuesto 11 las sentildeales I y Irsquo (de oxidacioacuten) estaacuten relacionadas
con el pico II (de reduccioacuten) Esto es indicio de que en el primer barrido se observa el
proceso de oxidacioacuten de los grupos fenoles en el cual se generan especies factibles de
ser reducidas como derivados de tipo quinoacutenico (Figuras 52 a 54)
Resultados y discusioacuten
57
Figura 52A VC para el derivado 9 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 53A VC para el derivado 10 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
-03 00 03 06 09 12 15
A
II
I
OOH
OH O
OH
OH
O
O
100 A
005 Vs
3 Vs
E vs Ag|AgCl V
03 06 09 12 15
B
II
I
E vs Ag|AgCl V
0 V - 13 V
0 V - 06 V
00 03 06 09 12 15 18
A
II
I
I
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
3 Vs
005 Vs
E vs Ag|AgCl V
00 03 06 09 12
B
II
I
E vs Ag|AgCl V
-02 V - 06 V
-02 V - 11 V
Resultados y discusioacuten
58
Figura 54 A VC para el derivado 11 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
En sistemas fenoacutelicos simples como es el caso del catecol o la hidroquinona se ha
estudiado el proceso redox en distintos medios 98-101
planteaacutendose que la oxidacioacuten en
medio aproacutetico deriva en la formacioacuten de la quinona correspondiente viacutea 2e-2H
+
(Figura 55) En esta investigacioacuten se han estudiado estructuras de mayor complejidad
y considerando que en este proceso de oxidacioacuten se ha descrito la presencia de
especies radicales como intermediarios de reaccioacuten es probable que ocurran procesos
de dimerizacioacuten o ataques nucleofiacutelicos por parte de los radicales dando como
resultado la generacioacuten de compuestos diferentes a la moleacutecula de partida (por
ejemplo de mayor peso molecular) Este tipo de comportamiento se puede analizar en
profundidad realizando barridos de potencial consecutivos en VC a baja velocidad de
00 03 06 09 12 15
I
II
I
A
100 A
OHO O
O
OOH
OH
OH
005 Vs
3 Vs
E vs Ag|AgCl V
00 03 06 09 12 15
II
I
IB
E vs Ag|AgCl V
-01 V - 07 V
-01 V - 14 V
Resultados y discusioacuten
59
barrido (005 Vs o menor para observar maacutes detalladamente la reaccioacuten quiacutemica en la
escala de tiempo del experimento) Si fuese el caso se esperariacutea observar la aparicioacuten
de sentildeales nuevas en el segundo barrido de oxidacioacuten que dariacutean cuenta de la
oxidacioacuten de las nuevas estructuras fenoacutelicas generadas
OH
OH-2e- -2H+
2e- 2H+
O
O
Figura 55 Esquema del proceso electro-oxidativo propuesto para el catecol
Se realizoacute la deconvolucioacuten (mediante la funcioacuten gaussiana) sobre las curvas de
oxidacioacuten para los compuestos con el objeto de determinar los valores de corriente de
pico anoacutedica de forma independiente con esto se obtienen valores de corriente y
potencial (principalmente a alta velocidad de barrido) los cuales son maacutes exactos que
los entregados por defecto por el software electroquiacutemico utilizado Las graacuteficas y
caacutelculos correspondientes a la relacioacuten entre los diferentes paraacutemetros analizados se
realizaron considerando los valores de Ipa y Epa para el primer pico oxidativo debido a
que esta sentildeal entrega informacioacuten con respecto a la energiacutea del primer electroacuten cedido
en el proceso de oxidacioacuten etapa que generalmente es lenta y determinante de la
velocidad de reaccioacuten
Resultados y discusioacuten
60
La expresioacuten indicada en la Ecuacioacuten 51102
da cuenta de la relacioacuten entre el potencial
de pico y el logaritmo de la velocidad de barrido para una reaccioacuten electroquiacutemica
irreversible
119864119901 119894119903119903119890119907 = 11986412 + 119887
2[104 minus log (
119887
119863) minus 2119897119900119892119896119891 + 119897119900119892119907] Ecuacioacuten 51
Por tanto de la graacutefica Ep vs logv se puede obtener el valor de la pendiente de Tafel b
que es igual al doble de la pendiente de la recta obtenida
119864119901 119894119903119903119890119907 = 119862119905119890 + 119887
2(119897119900119892119907) Ecuacioacuten 52
La graacutefica de potencial de pico anoacutedico (Epa) vs logv dio como resultado una relacioacuten
de tipo lineal para todos los compuestos el potencial de oxidacioacuten se desplazoacute hacia
valores maacutes positivos con el aumento de la velocidad de barrido lo que indica el
caraacutecter irreversible del proceso oxidativo en este medio En la Figura 56 se presenta
la graacutefica obtenida para el derivado 9 como ejemplo representativo de los resultados
obtenidos
Resultados y discusioacuten
61
Figura 56 Relacioacuten Epa vs logv para el derivado de aacutecido cafeico 9 2 mM en
DMF + HFFTBA 02 M
Los valores obtenidos para la pendiente de Tafel se resumen en la Tabla 51 Los
compuestos 1 y 3 poseen valores de la pendiente de Tafel cercanos al teoacuterico (118
mVdec)103
para un proceso en que la primera transferencia electroacutenica es la etapa
lenta del proceso (por tanto la etapa determinante de la reaccioacuten de electro-oxidacioacuten)
El compuesto 4 presenta un valor de 88 mVdec lo que sugiere que el electrodo estaacute
contaminado103104
o se produce un mecanismo de oxidacioacuten complejo (que implica
una transicioacuten entre la etapa quiacutemica y la transferencia electroacutenica como determinante
de la velocidad)105
De la misma forma los valores encontrados para los derivados 9
(170 mVdec) 10 (134 mVdec) y 11 (140 mVdec) y para el aacutecido cafeico (212
mVdec) indican que en las condiciones experimentales utilizadas la superficie del
18 21 24 27 30 33 36
090
093
096
099
102
105
OOH
OH O
OH
OH
O
O
r = 098638
m = 008548
Ep
a1 (
V)
logv (mV12
s-12
)
Resultados y discusioacuten
62
electrodo se contamina (pasiva)106
con la generacioacuten de especies polimeacutericas debido a
la formacioacuten del radical fenoxilo (ArObull) el cual puede dimerizar y originar diversos
productos de reaccioacuten los cuales se adhieren a la superficie del electrodo
Para cada compuesto se establecioacute la existencia de una relacioacuten de tipo lineal entre el
logaritmo de la corriente de pico anoacutedico y el logaritmo de la velocidad de barrido
(logIpa vs logv) El valor para la pendiente de estas rectas estuvo entre 044 y 056
(Tabla 51) lo que sugiere que el proceso observado es de tipo difusivo
La corriente de pico anoacutedica se puede expresar en funcioacuten de distintos paraacutemetros
experimentales como se indica en la Ecuacioacuten 53102
119868119901 = 301 times 10minus5 119899 (23 119877 119879
119887 119865)
12
11986312 119862 11990712 Ecuacioacuten 53
Donde n es el nuacutemero de electrones transferidos R es la constante de los gases (Jmol
K) T es la temperatura (K) D es el coeficiente de difusioacuten de la especie electro-activa
(cm2s) F es la constante de Faraday (Cmol) b es la pendiente de la ecuacioacuten de
Tafel107
(η = a + b log i) C es la concentracioacuten de la especie electro-activa (molL) y v
es la velocidad de barrido (mVs) Esta expresioacuten indica que la correlacioacuten entre
Ip y vfrac12
da como resultado una recta que seraacute funcioacuten del nuacutemero de electrones n y la
pendiente de Tafel b valores que estaacuten presentes en la pendiente de esta recta
Resultados y discusioacuten
63
Considerando lo anterior se procedioacute a graficar Ipa vs vfrac12
encontraacutendose para todos los
compuestos (Figura 57) una relacioacuten de tipo lineal con valores de r entre 099988 y
099448 se presenta ademaacutes la regresioacuten para el aacutecido protocateacutequico 4 como muestra
del comportamiento encontrado para todos los compuestos con valores de intercepto
que tienden a cero Al observar la Tabla 51 se aprecia que todas las regresiones
poseen una pendiente semejante lo cual da un indicio con respecto al nuacutemero de
electrones y mecanismo involucrados en la reaccioacuten de oxidacioacuten estudiada
Figura 57 Graacutefica para la corriente de pico Ipa vs la raiacutez cuadrada de la velocidad de
barrido Ejemplo de correlacioacuten lineal en el aacutecido protocateacutequico 4 2 mM en DMF +
HFFTBA 02 M
Tomando en cuenta que los valores de C R T y F (Ecuacioacuten 53) son factores
constantes y que los coeficientes de difusioacuten D seraacuten semejantes y del mismo orden
para aquellos compuestos de estructura similar (precursores por una parte y derivados
por otra) se obtiene que la pendiente de la recta obtenida en esta correlacioacuten es un
0 10 20 30 40 50 600
50
100
150
200
250
Ipa (
A)
V12
(mV12
s-12
)
OOH
OH
HO
m = 40 10-6
r = 099988
Resultados y discusioacuten
64
indicador respecto al nuacutemero de electrones involucrados en la reaccioacuten y al valor de b
(relacionado con el mecanismo de oxidacioacuten estudiado)
En el caso de los compuestos precursores se obtuvieron valores de pendientes entre
36bull10-6
y 41bull10-6
(Tabla 51) este rango cercano indica la transferencia del mismo
nuacutemero de electrones en el proceso oxidativo observado en que para la cumarina
clorada 1 el aacutecido cafeico 2 y el aacutecido protocateacutequico 4 corresponde a la uacutenica sentildeal
de oxidacioacuten observada y en el caso del aacutecido gaacutelico 3 es el proceso correspondiente a
la primera sentildeal del voltamograma En la literatura se describen estudios en medio
aproacutetico para compuestos fenoacutelicos como por ejemplo derivados de la cumarina 78-
dihidroxilada 100ab
el aacutecido cafeico101
y la hidroquinona105
que dan cuenta de una sentildeal
en el proceso oxidativo en medio aproacutetico que involucra 2 electrones esto permite
inferir que las sentildeales observadas experimentalmente corresponden a un proceso di-
electroacutenico
Para los derivados 9 10 y 11 se observa que los valores para la pendiente Ipa vs vfrac12 se
encuentran entre 37bull10-6
y 42bull10-6
como se indica en la Tabla 51 Ademaacutes al
comparar estos resultados con los obtenidos para el caso de los precursores se deduce
que estamos frente a un proceso oxidativo que involucra dos electrones Se observa
tambieacuten que no hay cambios con respecto al mecanismo de reaccioacuten si lo hubiese se
esperariacutea encontrar diferencias del doble o superior en los valores encontrados para la
pendiente de la recta ya que eacutesta contiene el factor b (pendiente de la ecuacioacuten de
Tafel) antes mencionado
Resultados y discusioacuten
65
Posteriormente se calculoacute el valor correspondiente al potencial de inicio del proceso
electroquiacutemico (Eonset)108109
Este valor indica el potencial inicial con que el primer
electroacuten es cedido en el proceso oxidativo que tiene lugar en la superficie del
electrodo Se determina como el valor de potencial de interseccioacuten entre las recta
tangentes a la liacutenea base y la corriente de oxidacioacuten para cada velocidad de barrido
aplicada en forma experimental (005 Vs a 3 Vs en este estudio) (Figura 58) Una
vez obtenido este potencial se procede a graficar con respecto al logaritmo de la
velocidad de barrido como se presenta en la Figura 59 Se considera el valor del
intercepto de cada recta Eionset (por lo tanto a una baja velocidad de barrido) el cual
incluye el error inherente a la medicioacuten y por tanto es maacutes confiable (Tabla 51) Se
observa que estos potenciales variacutean entre 050 V y 079 V para el aacutecido gaacutelico 3 y el
aacutecido protocateacutequico 4 respectivamente potencial que da indicio de la factibilidad de
oxidacioacuten siendo el compuesto con un Eionset menor el que se oxida con mayor
facilidad Estos valores de potencial onset encontrados permitiraacuten establecer una
correlacioacuten entre el potencial de oxidacioacuten determinado de esta forma y los resultados
obtenidos en los ensayos de actividad frente a especies radicales llevados a cabo en
medio aproacutetico (seccioacuten 6)
Resultados y discusioacuten
66
Figura 58 Determinacioacuten graacutefica del valor de Eonset VC del precursor 1 01 Vs
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 59 Relacioacuten Eonset vs logv para los compuestos estudiados
-05 00 05 10 15 20
20 A
Eonset
E vs Ag|AgCl (V)
15 18 21 24 27 30 33 3606
07
08
09
10
11
12
OOH
OH
HO
OOH
OH
HO
OH
OH
OH
O
HO
OHO O
O
OOH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OOH
OH O
OH
OH
O
O
OOH
HO O
Cl
Eon
set
(V)
logv (mV12
s-12
)
Resultados y discusioacuten
67
Tabla 51 Paraacutemetros experimentales para los compuestos Determinaciones en VC
2 mM DMF + HFFTBA 02 M
Compuesto
119837119845119848119840119816119849119834120783
119837119845119848119840119855 (microAmVs
-1)
119837119816119849119834120783 119837119855120783120784
(microAmV12
s-12
)
119837119812119849119834120783
119837119845119848119840119855
(mVdec)
119835 = 120784 119837119812119849119834120783
119837119845119848119840119855
(mVdec)
Eionset
(mV)
056 36bull10-6
61 122 059
053 41bull10
-6 106 212 059
048 36bull10-6
55 110 050
O
OH
OH
HO
052 41bull10-6
44 88 079
047 40bull10-6
85 170 064
049 37bull10-6
67 134 075
044
42bull10-6
70 140 058
Con el objeto de recabar mayor informacioacuten con respecto al mecanismo de reaccioacuten
involucrado en los procesos oxidativos en estudio en base a los resultados obtenidos
OHO O
O
OOH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
O
OH
OH O
OH
OH
O
O
OOH
OH
HO
OH
OH
OH
O
HO
O
OH
HO O
Cl
Resultados y discusioacuten
68
en VC se realizoacute la graacutefica (Ipa v12
) vs v12
para los compuestos precursores 1 2 3 y
4 (escogidos por poseer un grupo catecol y ser estructuras de menor complejidad que
los derivados 9 10 y 11) Estas graacuteficas de las que se presenta el ejemplo del aacutecido
como muestra (Figura 510) presentaron una relacioacuten de tipo lineal en la que la
pendiente negativa obtenida sugiere que la reaccioacuten observada implica un mecanismo
de tipo EC considerando los estudios mencionados para compuestos fenoacutelicos
ampliamente descritos en la literatura100101105109
y el criterio de diagnoacutestico
mencionado por Pletcher y colaboradores111
Figura 510 Correlacioacuten (Ipa v12
) vs v
12 para el precursor aacutecido protocateacutequico 4
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
21 28 35 42 49 5626
28
30
32
34O
OH
OH
HO
r = -099302
V12
(mV12
s-12
)
Ipa
V12 (
A
mV
12s-1
2)
Resultados y discusioacuten
69
Diversos estudios proponen la presencia de mecanismos concertados para los procesos
redox de compuestos de tipo fenoacutelico los cuales implican la presencia de
intermediarios radicalarios y reacciones donde la transferencia de un protoacuten y un
electroacuten ocurren de forma acoplada dentro de un mismo paso Este concepto nace en la
deacutecada de 1990 a partir de los trabajos publicados por Biczoacutek y colaboradores112113
El estudio de este tipo de reacciones principalmente en derivados fenoacutelicos es de
relevancia debido al rol que eacutestos desempentildean en diferentes sistemas bioloacutegicos tanto
por su reconocida capacidad antioxidante como se evidencia en la investigacioacuten
realizada por Nakayama y colaboradores con respecto a derivados polifenoacutelicos y el
mecanismo de reaccioacuten propuesto de tipo PCET (Proton Concerted Electron Transfer)
frente al anioacuten superoacutexido114
o como en el caso de estudio de las reacciones de
transferencia electroacutenica que involucran al aminoaacutecido tirosina115ab
y otros co-factores
que forman parte esencial del proceso fotosinteacutetico que se lleva a cabo en estructuras
vegetales (Fotosistema II)116
En la deacutecada pasada los aportes a la investigacioacuten sobre el tema se tornaron maacutes
profundos y sistemaacuteticos permitiendo el modelamiento teoacuterico y anaacutelisis de este tipo
de mecanismos Debido al intereacutes concerniente a la obtencioacuten de modelos racionales
de sistemas bioloacutegicos los estudios realizados en medio proacutetico son variados como la
serie de derivados fenol-imidazol sintetizados y caracterizados por Markle y
colaboradores117
quienes entre diversos factores analizan el efecto del sustituyente
sobre el enlace O-H Otros autores como Saveacuteant Costentin y colaboradores han
abordado este toacutepico en diferentes publicaciones proponiendo distintos mecanismos
Resultados y discusioacuten
70
dependientes del pH y composicioacuten de la solucioacuten de trabajo (con buffer o sin eacutel)118
En trabajos posteriores plantean un estudio teoacuterico de modelamiento en sistemas de
tipo amino-fenol enfocados en el mencionado Fotosistema II119
y frente al sistema
enzimaacutetico superoacutexido dismutasa120
Rhile y colaboradores describen la siacutentesis
caracterizacioacuten y estudios de oxidacioacuten tanto quiacutemica como electroquiacutemica (en medio
aproacutetico acetonitrilo) de una serie de fenol-aminas junto con un anaacutelisis teoacuterico del
sistema evidenciaacutendose la presencia de especies radicales intermediarias121
junto con
valores entre 16 a 28 para la relacioacuten de efecto isotoacutepico cineacutetico (KI = kHkD) que se
estima como criterio para considerar un mecanismo concertado122
El estado del arte con respecto a los distintos mecanismos electro-oxidativos descritos
para los derivados fenoacutelicos indica que la determinacioacuten de una ruta en particular en
este proceso se puede establecer mediante estudios de naturaleza tanto experimental
como teoacuterica La obtencioacuten de paraacutemetros termodinaacutemicos como la energiacutea libre de
Gibbs el estudio de efecto isotoacutepico y la determinacioacuten de constantes de velocidad en
electroquiacutemica entre otros permiten discriminar entre las diferentes viacuteas en que se
puede llevar a cabo la electro-oxidacioacuten de fenoles
Resultados y discusioacuten
71
53 Estudio de generacioacuten de especies radicalarias mediante espectroscopia de
resonancia de espiacuten electroacutenico (REE)
A fin de evidenciar la existencia de posibles intermediarios radicalarios en el proceso
electro-oxidativo de los fenoles previamente estudiados a traveacutes de las teacutecnicas
electroquiacutemicas se procedioacute a oxidar los derivados 9 10 y 11 y medir in situ su
espectro REE Se utilizoacute la teacutecnica descrita por Le Nest y colaboradores99
en que se
describe el estudio de estructuras flavonoides polifenoacutelicas en eacutel se utiliza la
quelacioacuten con Zn2+
lo que permitioacute la estabilizacioacuten del radical formado y su posterior
estudio En primer lugar desde un punto de vista cualitativo se observoacute para cada
compuesto un evidente cambio de color en las soluciones electrolizadas las que se
tornaron de color amarillo intenso y maacutes oscuro que las soluciones de trabajo
originales lo que sugiere que tras la electroacutelisis se forma un compuesto nuevo
diferente al de partida como se esperaba En la Figura 511A-C se presentan los
espectros obtenidos junto con las respectivas simulaciones realizadas
Resultados y discusioacuten
72
Figura 511A Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido cafeico 9 estabilizado con Zn2+
en DMF + HFFTBA
(izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color
rojo)
Figura 511B Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido gaacutelico 10 estabilizado con Zn2+
en DMF + HFFTBA
(izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color
rojo)
3440 3450 3460 3470 3480 3490
O
OH
HO O
OH
OH
O
OA
Campo Magneacutetico G
3440 3450 3460 3470 3480 3490
OHO O
O
O
OH
OH
OH
OH
B
Campo Magneacutetico G
Resultados y discusioacuten
73
Figura 511C Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido protocateacutequico 11 estabilizado con Zn2+
en DMF +
HFFTBA (izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der
en color rojo)
Concordante con el resultado esperado la sentildeal espectral indica la presencia de una
especie radicalaria como intermediario de la electro-oxidacioacuten de los grupos catecol
presentes en los tres derivados en estudio
En la simulacioacuten realizada para el derivado 9 se observa el acoplamiento hiperfino de
tres aacutetomos de hidroacutegeno con los siguientes valores de constantes 132 G 098 G y
03 G que seriacutea indicio del proceso oxidativo que ocurre en el catecol del anillo
benceacutenico (Tabla 52) ya que estos valores coinciden con una interaccioacuten entre los tres
protones del anillo benceacutenico en posicioacuten 2 5 y 6 En el caso de los compuestos 10
y 11 se encontraron dos constantes de acoplamiento hiperfino lo que indica la
3440 3450 3460 3470 3480 3490
OHO O
O
OOH
OH
OH
C
Campo Magneacutetico G
Resultados y discusioacuten
74
interaccioacuten entre dos protones que seriacutean aquellos en posicioacuten 5 y 6 del anillo
cumariacutenico
Tabla 52 Constantes de acoplamiento hiperfino para los derivados polifenoacutelicos
Valores en Gauss
Compuesto aH1 G aH2 G aH3 G
132 098 030
215 156 -
235 122 -
Estos resultados concuerdan ademaacutes con lo descrito en la literatura con respecto a la
oxidacioacuten de grupos fenoacutelicos lo que permite inferir un posible mecanismo electro-
oxidativo para los derivados en estudio
O
OH
OH O
OH
OH
O
O
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
Resultados y discusioacuten
75
54 Resultados y discusioacuten de los estudios de reactividad frente a especies
radicalarias
En este punto de la investigacioacuten el objeto de estudio fue evaluar el comportamiento
de las nuevas estructuras previamente sintetizadas frente a diferentes especies
radicalarias de amplio intereacutes bioloacutegico radical peroxilo (ROObull) radical hidroxilo
(OHbull) anioacuten radical superoacutexido (O2-) junto con determinar la capacidad reductora de
los compuestos Cada ensayo fue escogido con miras de abordar el tema de la
capacidad antioxidante desde las posibilidades que permiten las experiencias de tipo in
vitro
541 Metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno
(oxygen radical antioxidant capacity-fluorescein ORAC-FL)
El estudio de especies reactivas de oxiacutegeno y nitroacutegeno asociadas a los procesos
oxidativos requiere en algunos casos del uso de compuestos denominados ldquosondasrdquo
En la teacutecnica de fluorescencia es posible implementar este tipo de metodologiacutea debido
a sus caracteriacutesticas de sensibilidad especificidad y simplicidad en la obtencioacuten de
datos convirtieacutendose en una herramienta uacutetil y ampliamente utilizada a la hora de
obtener una buena aproximacioacuten en la determinacioacuten de actividad frente a especies
EROsERNs123
Resultados y discusioacuten
76
En el caso de la metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno
(ORAC) los primeros trabajos que dan cuenta de su uso fueron descritos en la deacutecada
de 1990 a partir de la investigacioacuten de Cao y colaboradores124
En este trabajo los
autores describen la teacutecnica como un meacutetodo simple y confiable para determinar
capacidad antioxidante en serum humano en pequentildeas cantidades de muestra (del
orden de los microL) utilizando como sonda la β-ficoeritrina (proteiacutena aislada del alga roja
unicelular Porphyridium cruenturn) debido a su fluorescencia sensible a los cambios
conformacionales en su estructura en ensayos frente al radical peroxilo125
En el
desarrollo posterior Ou y colaboradores126
proponen una mejora a la teacutecnica
cambiando la sonda proteica por el compuesto fluoresceiacutena debido a su mayor foto-
estabilidad y para evitar interacciones proteiacutena-polifenol (hidrofoacutebicas y puentes de
hidroacutegeno) junto con ello realizaron la validacioacuten del meacutetodo Esta sonda es la
utilizada actualmente para este ensayo el cual es ampliamente utilizado en el estudio
de polifenoles y sus derivados127-128ab
en diferentes alimentos y bebidas129130
muestras bioloacutegicas de distinta iacutendole131
por mencionar algunos ejemplos
Para efectos de esta investigacioacuten se espera obtener un perfil de comportamiento de
cada uno de los compuestos frente al radical peroxilo (ROObull) que permita distinguir el
aporte que significa cada sustitucioacuten realizada al anillo cumarina con diferentes
grupos fenoacutelicos Cabe mencionar que las longitudes de onda maacuteximas (λmaacutex) de
absorbancia en el rango UV-visible para los compuestos ensayados estuvieron en un
rango entre los 203 nm y 329 nm En este estudio se obtuvieron los perfiles cineacuteticos
Resultados y discusioacuten
77
de consumo de la sonda fluoresceiacutena (con valores de 485525 nm para su absorcioacuten y
emisioacuten respectivamente) por induccioacuten de los radicales peroxilo (originados por
efecto de la termoacutelisis del azo-compuesto ABAP a 37 degC) A partir de estos perfiles de
decaimiento de la sonda a distintas concentraciones de compuestos antioxidantes (5 en
total) se obtuvieron curvas adecuadamente separadas como se muestra en la Figura
512 donde se muestran los resultados para el compuesto 11 como ejemplo
representativo del ensayo Posteriormente se determina para cada concentracioacuten el aacuterea
neta bajo la curva la que es graficada con respecto a las concentraciones utilizadas La
Figura 513 presenta relacioacuten lineal entre el aacuterea neta bajo la curva con respecto a la
concentracioacuten del compuesto 11 como ejemplo la que fue determinada para cada
derivado
Figura 512 Curvas para el consumo de la sonda fluoresceiacutena para un set de
concentraciones del compuesto 11
0 2000 4000 6000
02
04
06
08
10
F
F0
Tiempo (s)
control
16 M
12 M
081 M
045 M
020 M
Resultados y discusioacuten
78
Las curvas obtenidas en esta parte del experimento muestran la reaccioacuten de
competencia entre el radical y el antioxidante (el cual protege a la fluoresceiacutena del
proceso de oxidacioacuten) Posterior al procedimiento anteriormente descrito se obtuvo el
iacutendice ORAC para cada compuesto que se resume en la Tabla 54
Figura 513 Graacutefica de aacuterea neta bajo la curva ABC vs concentracioacuten del derivado 11
En este ensayo los compuestos hiacutebridos propuestos superaron en cuanto al valor de
iacutendice ORAC a la cumarina precursora 1 En los tres casos se pudo observar valores
superiores de casi el doble para el compuesto 10 y bordeando un ORAC casi tres veces
mayor en los compuestos 9 y 11 del valor obtenido para su precursor Estos resultados
evidenciaron un incremento en la capacidad antioxidante al que posee la cumarina de
manera independiente debido a la inclusioacuten de los derivados de aacutecidos
hidroxibenzoicos e hidroxicinaacutemico en su estructura (Tabla 53)
0 1 2 3 4 50
1000
2000
3000
4000
r = 099309
AB
C n
eta
Concentracioacuten (mM)
Resultados y discusioacuten
79
Tabla 53 Valores experimentales de iacutendice ORAC-FL para los compuestos
estudiados
Compuesto iacutendice ORAC-FL
(plusmnSD)
1 091 plusmn 010
2 347 plusmn 010
3 391 plusmn 009
4 069 plusmn 001
9 239 plusmn 003
10 174 plusmn 005
11 262 plusmn 004
Trolox 1
Por otra parte los valores del iacutendice ORAC de la serie fueron superiores al estaacutendar
Trolox con excepcioacuten de los compuestos 1 (cumarina de partida) y 4 (aacutecido
protocateacutequico) Para el caso de la cumarina eacutesta tuvo un valor ORAC menor a 1 En
el caso del compuesto 4 la ostensible diferencia (5 veces menor) con su homoacutelogo
aacutecido cafeico 2 deriva de la presencia del doble enlace en esta estructura aunque
ambos aacutecidos poseen igual cantidad de grupos ndashOH y en igual posicioacuten en el anillo
aromaacutetico la insaturacioacuten le confiere maacutes posibilidades de deslocalizacioacuten electroacutenica
debido a la mayor cantidad de estructuras resonantes posibles y por lo tanto mayor
Resultados y discusioacuten
80
estabilidad al formarse la especie radicalaria correspondiente en la reaccioacuten frente el
ABAP Al observar el valor obtenido para el aacutecido gaacutelico 3 se obtuvo un iacutendice
ORAC cercano al del aacutecido cafeico y aunque carece de la insaturacioacuten presente en el
derivado cinaacutemico posee en su defecto un grupo ndashOH adicional en posicioacuten 5 del
anillo aromaacutetico el cual aportoacute adicionalmente a su capacidad antioxidante (lo que no
ocurrioacute en el caso del aacutecido protocateacutequico 4)
Se observa que el aacutecido dihidroxibenzoico 4 que arrojara un valor 069 presenta un
incremento de 37 veces en su valor ORAC-FL al estar incorporado en el heterociclo
cumariacutenico En este caso se presentoacute un fenoacutemeno de sinergia positiva ya que ambos
compuestos cumarina 1 y aacutecido protocateacutequico 4 aumentaron su valor de ORAC-FL
pasando de un valor 091 y 069 de forma individual respectivamente a formar un
derivado que presentoacute un valor de ORAC-FL igual a 262 Al observar los valores
totales en los derivados 9 y 10 obtenidos no correspondieron a la sumatoria de los
iacutendices individuales de sus precursores este resultado indica que estuvo ausente el
fenoacutemeno de sinergia
Para los nuevos compuestos (9 10 y 11) se observoacute un incremento del valor de
ORAC-FL con respecto a la cumarina precursora 1 Por lo tanto la inclusioacuten delas
estructuras fenoacutelicas en el heterociclo cumariacutenico generoacute la obtencioacuten de nuevos
derivados con una mayor capacidad antioxidante en esta metodologiacutea de esta forma se
obtuvo un aporte a la reactividad de la cumarina 1
Resultados y discusioacuten
81
Los resultados obtenidos en este ensayo dan cuenta de la actividad que presentaron los
compuestos tanto precursores como derivados frente a la especie radical ROObull Un
punto importante a considerar es que este experimento ndashindependientemente de ser un
ensayo in vitro- se lleva a cabo en un medio buffer a pH 74 y a una temperatura
controlada de 37 degC lo que permite obtener una primera aproximacioacuten con respecto a
lo que seraacute la actividad de los compuestos en un medio bioloacutegico La sustitucioacuten en el
anillo cumariacutenico generoacute nuevos compuestos que superaron su capacidad antioxidante
sin embargo desde el punto de vista de los precursores aacutecidos (cafeico y gaacutelico) su
actividad se vio mermada tras la sustitucioacuten fenoacutemeno que se discute en la seccioacuten 6
La secuencia de actividad obtenida para los derivados y sus precursores fue 3 gt 2 gt 11
gt 9 gt 10 gt 1 gt 4
Junto con el ensayo anteriormente detallado se procedioacute a determinar la cantidad de
radicales que reaccionan con el compuesto antioxidante relacionando la concentracioacuten
de antioxidante aplicado la estequiometriacutea de la reaccioacuten y la velocidad de generacioacuten
de radicales peroxilo a 37 degC como se expresa en la siguiente ecuacioacuten (Burton y
colaboradores 1981)132
120591 = 119899 [119860119903119874119867]
119877119894 Ecuacioacuten 54
Resultados y discusioacuten
82
donde τ es el tiempo de induccioacuten (tiempo en el que la sonda es protegida de los
radicales peroxilo por el antioxidante) n es el valor asociado a la estequiometriacutea de la
reaccioacuten correspondiente a la cantidad de moleacuteculas de radical ROObull inactivadas por
moleacutecula de compuesto antioxidante [ArOH] es la concentracioacuten de antioxidante y Ri
es la velocidad de generacioacuten de radical peroxilo la cual estaacute directamente relacionada
con la concentracioacuten de ABAP utilizada en el ensayo (18 mM) y se determina seguacuten la
expresioacuten133
Ri = 136 bull 10-6
[ABAP] Ecuacioacuten 55
Dadas las condiciones experimentales empleadas el valor de Ri es 147 microMmin Los
resultados obtenidos del valor de la pendiente (regresioacuten lineal Ecuacioacuten 54) se
resumen en la Tabla 54
Todos los compuestos (precursores y derivados) presentan valores de n superiores a
los esperados donde en el caso extremo se tiene que una moleacutecula de aacutecido gaacutelico
estariacutea consumiendo 14 moleacuteculas de radical peroxilo resultado que es mucho mayor
al esperado Los aparentes altos valores de n como estequiometriacutea de la reaccioacuten
(n = 3 hasta n = 14) sugieren la presencia de reacciones asociadas de mayor
complejidad en las que estariacutea presente el radical alcoxilo (RObull)134
el cual se forma
por descomposicioacuten del radical peroxilo que posee una vida media del orden de los
segundos en comparacioacuten con el radical alcoxilo con una vida media del orden de los
10-6
s (y es maacutes reactivo) lo que explica esta diferencia en la estequiometria
Resultados y discusioacuten
83
Tabla 54 Valores calculados para el factor estequiomeacutetrico n
Compuesto na(plusmnSD) n
1 28 plusmn 03 3
2 39 plusmn 01 4
3 141 plusmn 14 14
4 24 plusmn 01 3
9 58 plusmn 04 6
10 49 plusmn 01 5
11 86 plusmn 01 9
a Valores calculados en triplicado
Este fenoacutemeno se ha encontrado en investigaciones previas realizadas en derivados
cumariacutenicos135
y fue descrito por Lissi y colaboradores el que se puede encontrar
ademaacutes en experimentos en los que se utiliza la sonda rojo de pirogalol (ORAC-
PGR)136137
Resultados y discusioacuten
84
542 Metodologiacutea de capacidad reductora de hierro en plasma (FRAP)
Esta metodologiacutea desarrollada por Benzie y Strain (1996)138
se propuso como una
medida de la capacidad reductora (asociada a una buena capacidad antioxidante)
enfocada a investigar procesos de estreacutes oxidativo en fluidos bioloacutegicos
Posteriormente se ha extendido al estudio de diversas matrices como extractos de
plantas medicinales139
alimentos140
compuestos puros141
por mencionar algunos
ejemplos
En este ensayo se obtuvieron los valores de la capacidad reductora de los compuestos
polifenoacutelicos la que se aprecia cualitativamente a traveacutes de la formacioacuten del complejo
de Fe2+
de color azul (Figura 514) Esta metodologiacutea involucra la reaccioacuten redox
entre el agente reductor (en este caso los derivados cumariacutenicos) y el oxidante (la sal
feacuterrica) es considerada como aproximacioacuten con respecto a la capacidad de mantener el
estatus redox dentro de la ceacutelula
En primer lugar se observoacute un comportamiento semejante al ensayo ORAC-FL en
cuanto a la tendencia que presentaron los compuestos en su capacidad reductora de
hierro lo que indica una baja probabilidad de que en este ensayo ocurriese el
fenoacutemeno de quelacioacuten propio de los catecoles La Tabla 55 presenta los datos
experimentales obtenidos
Resultados y discusioacuten
85
NN
NN
Fe 3+N
N
N
N
N
N
NN
NN
NN
Fe2+N
N
N
N
N
N
NN
Antioxidante
amarilloazul
[Fe(III) (TPTZ)2]3+ [Fe(III) (TPTZ)2]2+
Figura 514 Esquema para la reaccioacuten entre el complejo de Fe3+
y el compuesto
antioxidante reductor
Los compuestos 9 10 y 11 presentaron una mejor capacidad reductora frente a su
precursor cumariacutenico 1 Esto se explica debido a la presencia de un mayor nuacutemero de
grupos -OH presentes en las nuevas estructuras propuestas capaces de transferir
electrones y reducir la sal feacuterrica como se menciona en el trabajo de Pulido y
colaboradores142
quienes estudian una serie de polifenoles mediante esta teacutecnica
sentildealando que ademaacutes del nuacutemero de hidroxilos presentes la presencia de dobles
enlaces conjugados en el esqueleto como parte de las caracteriacutesticas estructurales
responsables de un aumento en la capacidad reductora en polifenoles
Resultados y discusioacuten
86
Tabla 55 Valores experimentales obtenidos para los compuestos en estudio ensayo
FRAP en equivalentes de Trolox10 microM de muestra
En el derivado 11 se presenta una interaccioacuten de tipo sineacutergica con respecto a los
resultados individuales de cada precursor habieacutendose obtenido un valor FRAP de
1302 y 868 equiv Trolox 10 microM de muestra para 1 y 4 respectivamente y para el
derivado final un valor de 2624 equiv Trolox 10 microM de muestra
Del mismo modo que en el ensayo anterior se observa que la sustitucioacuten en el anillo
cumariacutenico con los distintos grupos aacutecidos incrementa su potencial como especie
reductora mientras que en el caso del aacutecido cafeico y gaacutelico se aprecia una
disminucioacuten de 13 y 15 veces respectivamente en su capacidad reductora tras la
esterificacioacuten
Compuesto equiv Trolox 10 microM muestra
(plusmnSD)
1 1302 plusmn 197
2 2727 plusmn 321
3 4768 plusmn 215
4 868 plusmn 93
9 2052 plusmn 186
10 3182 plusmn 681
11 2624 plusmn 335
Resultados y discusioacuten
87
Los resultados obtenidos para esta teacutecnica entregan informacioacuten acerca de la capacidad
reductora relativa para el conjunto de compuestos ensayados capacidad que estaacute
relacionada con su actividad antioxidante Se obtuvo un orden relativo para
precursores y derivados como sigue 3 gt 10 gt 2 gt 11 gt 9 gt 1 gt 4 Con respecto a la
disminucioacuten de actividad para los aacutecidos mencionados sugiere que esta capacidad
ademaacutes del nuacutemero de ndashOH presentes estariacutea relacionada con el sustituyente ndashCOOH
que se transforma en un grupo eacutester (ver seccioacuten 6)
543 Capacidad de inactivacioacuten del radical OHmiddot teacutecnica Spin Trapping
Esta teacutecnica no destructiva permite la deteccioacuten e identificacioacuten de especies
paramagneacuteticas (con electrones desapareados) en distintas matrices El fenoacutemeno de
resonancia de espiacuten electroacutenico fue descubierto y descrito en la deacutecada de 1940 por
Zavoisky143
en sus estudios basados en sales de manganeso en distintos medios Su uso
y aplicaciones se han diversificado a numerosas aacutereas como en la determinacioacuten de
capacidad antioxidante en alimentos144
en el anaacutelisis del proceso oxidativo en
liacutepidos145
en el estudio de enfermedades parasitarias146
El creciente intereacutes de la
teacutecnica en ciencias biomeacutedicas radica en el hecho de que esta espectroscopia permite
discriminar diferentes especies radicales de intereacutes bioloacutegico estrechamente
relacionadas con el estatus redox de la ceacutelula147
cuyo desbalance se traduce en cuadros
de estreacutes oxidativo148
Resultados y discusioacuten
88
En este estudio se determinoacute la capacidad de los compuestos propuestos para inactivar
la especie radicalaria OHmiddot
mediante la teacutecnica spin trapping metodologiacutea basada en
establecer la competencia de reaccioacuten entre los antioxidantes propuestos y el spin trap
DMPO El radical se generoacute a traveacutes de la reaccioacuten de ldquoFenton no cataliacuteticordquo
(Ecuacioacuten 56) metodologiacutea que permite la generacioacuten del radical OHbull en medio
baacutesico en ausencia del ioacuten Fe como catalizador91ab
211986721198742 + 119874119867minus rarr 119874119867∙ + 1198742minus + 21198672119874 Ecuacioacuten 56
En un primer set de experimentos se procedioacute a realizar la experiencia utilizando
DMSO como solvente Se descartoacute esta opcioacuten debido a que resultoacute complejo
observar un patroacuten claro en el blanco y poder asiacute discriminar las nuevas sentildeales
espectrales a partir de la adicioacuten de los compuestos en estudio
En primer lugar se determinoacute el blanco experimental que indica la reaccioacuten de
inactivacioacuten del radical mediante el compuesto spin trap DMPO Posteriormente se
ensayaron los derivados hiacutebridos y sus precursores sinteacuteticos en dos concentraciones
033 mM y 33 mM En el caso de los experimentos realizados a la menor
concentracioacuten se aprecioacute que la disminucioacuten de la sentildeal del blanco fue miacutenima para los
siete compuestos y no se observoacute un cambio significativo en el espectro como para
obtener resultados concluyentes Considerando lo anterior los experimentos se
Resultados y discusioacuten
89
realizaron con concentracioacuten del orden de los 3 mM obtenieacutendose asiacute datos
satisfactorios en cuanto a la inactivacioacuten del radical y la posibilidad de realizar
caacutelculos sobre este valor El valor de inactivacioacuten del radical hidroxilo se calcula a
traveacutes de la disminucioacuten en la intensidad de las sentildeales al adicionar cada derivado En
cada espectro se aprecia el perfil hiperfino compuesto por cuatro liacuteneas caracteriacutesticas
correspondientes al aacutetomo de nitroacutegeno e hidroacutegeno del spin-aducto formado por
[DMPO-OH] con valores de aN y aH alrededor de 15G lo que concuerda con lo
descrito en la literatura149
para esta reaccioacuten y el espectro simulado que se presenta en
la Figura 515 El cambio experimental tras la adicioacuten de los compuestos se presenta
en color rojo (Figura 516 A-G)
N+
O-
+ OHN
O
OH
Figura 515 Espin aducto generado por la inactivacioacuten del radical OHbull y su espectro
simulado (derecha)
Resultados y discusioacuten
90
Figura 516 A Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto 4-clorometil-78-dihidroxicumarina 1 B Espectro REE de inactivacioacuten del
radical hidroxilo con adicioacuten del compuesto aacutecido cafeico 2
Figura 516 C Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto aacutecido gaacutelico 3 D Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con
adicioacuten del compuesto aacutecido 34-dihidroxi benzoico 4
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
B
Campo Magneacutetico G
compuesto 2
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
C
Campo Magneacutetico G
compuesto 3
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
D
Campo Magneacutetico G
compuesto 4
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
A
Campo Magneacutetico G
compuesto 1
control
Resultados y discusioacuten
91
Figura 516 E Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto hiacutebrido 9 F Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con
adicioacuten del compuesto hiacutebrido 10
Figura 516 G Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto hiacutebrido 11
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
G
Campo Magneacutetico G
compuesto 11
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
E
Campo Mgneacutetico G
compuesto 9
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
F
Campo Magneacutetico G
compuesto 10
control
Resultados y discusioacuten
92
Considerando los patrones espectrales obtenidos para los compuestos 9 10 y 11 se
observoacute que la sentildeal de cuadruplete correspondiente al control (spin-aducto [DMPO-
OH]) desaparecioacute casi por completo lo cual indica la inactivacioacuten del radical
hidroxilo Se observa ademaacutes un triplete con constantes de acoplamiento 1398 G y
1427 G que evidencioacute la reaccioacuten de oxidacioacuten del atrapador DMPO (Figura 517)
ya que de haberse formado el aducto entre la cumarina y el spin trap DMPO se
habriacutea obtenido el correspondiente espectro con un patroacuten de 6 liacuteneas espectrales
(Figura 518)
Figura 517 Espectro REE se destaca en rojo el triplete de integracioacuten 121
formado despueacutes de la reaccioacuten de Fenton no-cataliacutetico (izq) Espectro simulado
utilizando el programa EPR-WINSIM (der)
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
DMPO oxidado
N+
O-
+ OHNO
OH
Campo Magneacutetico G
Resultados y discusioacuten
93
cumarina + OHbull cumarinabull + H2O
cumarinabull + DMPO [cumarina-DMPO]
Figura 518 Espectro simulado para la formacioacuten del spin aducto [cumarina-
DMPO] utilizando el programa EPR-WINSIM
Como se presenta en la Tabla 56 tanto los aacutecidos orgaacutenicos como la cumarina
precursora y sus derivados presentaron reactividad muy semejante En las
condiciones de estudio para todos los compuestos se obtuvo un valor sobre el 90
indicando su poder de inactivacioacuten del radical resultado que superoacute al descrito en la
literatura para el estaacutendar Trolox
Estudios previos realizados en estructuras cumariacutenicas simples semejantes al
precursor 1 de esta investigacioacuten permiten comparar algunos resultados Peacuterez-Cruz y
colaboradores150
indican un 29 de inactivacioacuten para el derivado monohidroxilado de
la cumarina 1 diferencia que puede explicarse por la ausencia del ndashOH en posicioacuten 8
que aumenta su actividad El compuesto con grupos ndashOH en posicioacuten 6 y 7 presentoacute
un apagamiento del 51 Figueroa y colaboradores presentan tambieacuten un estudio en
que las cumarinas monohidroxiladas presentan valores de 23 y 56 de la
inactivacioacuten del radical OH corroborando lo encontrado anteriormente151
Resultados y discusioacuten
94
Tabla 56 Porcentajes de inactivacioacuten del radical hidroxilo (OHmiddot)
Compuesto de inactivacioacuten bullOH
(plusmnSD)
1 923 plusmn 74
2 983 plusmn 27
3 995 plusmn 08
4 927 plusmn 29
9 981 plusmn 18
10 982 plusmn 25
11 980 plusmn 99
Trolox 31plusmn 25a
aRef149 Figueroa R et al Future Med Chem 2013
Los resultados obtenidos con esta teacutecnica indican la reactividad relativa que tienen los
compuestos propuestos frente al radical OH Al considerar que el tiempo de vida del
radical hidroxilo y del spin trap DMPO es del orden de 10-9
s se observa que todos los
compuestos ensayados tuvieron la capacidad de competir con el DMPO en el proceso
de inactivacioacuten del radical evidenciado por la sentildeal de control que disminuyoacute casi en
su totalidad para todos los casos siendo menor en la cumarina precursora 1 y el aacutecido
4 siguiendo ambos compuestos la misma tendencia que se observara en los ensayos
Resultados y discusioacuten
95
anteriores Independientemente que el radical ensayado en este experimento es de una
alta reactividad y escasa selectividad el hecho de que se obtuvieran altos valores de
actividad para los compuestos propuestos indica que eacutestos se presentan como buenos
candidatos como inactivadores de la especie OH
Finalmente se observa que los derivados 9 10 y 11 presentaron un valor de
reactividad superior al de la cumarina precursora obtenieacutendose de esta forma un
aporte a la reactividad en cada nueva estructura propuesta frente al heterociclo de
partida 1 para este ensayo En cuanto a la reactividad relativa de la serie no se
encontroacute una diferencia significativa entre los compuestos ensayados precursores y
derivados mostraron valores cercanos en cuanto al de inactivacioacuten del radical
alrededor del 90
Resultados y discusioacuten
96
544 Estudio de reactividad frente al anioacuten radical superoacutexido O2-
Dentro de las diversas aplicaciones desarrolladas para las teacutecnicas electroquiacutemicas se
encuentran los ensayos de determinacioacuten de la capacidad antioxidante en distintos
medios152
y en muestras como bebidas153
vegetales154
mediciones in situ sobre piel
humana155
por mencionar algunos ejemplos Un reciente review (Pisoschi y
colaboradores 2015) describe las contribuciones realizadas con respecto a la
determinacioacuten de actividad antioxidante empleando exitosamente la voltametriacutea
ciacuteclica voltametriacutea de pulso diferencial voltametriacutea de onda cuadrada amperometriacutea
y potenciometriacutea156
las que ademaacutes se complementan con otras teacutecnicas en este tipo
de estudios157158
En esta parte de la investigacioacuten se determinoacute la reactividad de los compuestos frente
al anioacuten radical superoacutexido cuya generacioacuten electroquiacutemica en la superficie del
electrodo por reduccioacuten de oxiacutegeno disuelto mediante la teacutecnica de voltametriacutea ciacuteclica
ha sido ampliamente estudiada en nuestro grupo de trabajo159160110
y por otros
autores161
Como se esperaba tras la adicioacuten sucesiva de aliacutecuotas de todos los compuestos
estudiados hubo un decaimiento en la corriente de pico anoacutedica (Ipa0) (ejemplo del
resultado para el precursor 1 en la Figura 519) Esto permitioacute calcular el valor del
iacutendice antioxidante 50 (IA50) el cual se define como la concentracioacuten de sustrato
necesaria para obtener una disminucioacuten del 50 en la corriente Ipa0 Esta corriente es
Resultados y discusioacuten
97
directamente proporcional a la concentracioacuten de anioacuten superoacutexido presente por lo
que su disminucioacuten es un indicador de la capacidad del sustrato para inactivar la
especie radical generada in situ
Figura 519 Voltamogramas ciacuteclicos del par redox correspondiente al anioacuten
superoacutexido tras antildeadir aliacutecuotas del compuesto 1 DMF + HFFTBA 02 M 01 Vs
Tras obtener los voltamogramas ciacuteclicos para cada compuesto se procedioacute a
determinar el paraacutemetro adimensional (Ipa0-Ipa
SIpa
0) y se graficoacute con respecto a la
concentracioacuten de sustrato en solucioacuten (Figura 520) obtenieacutendose relaciones de tipo
lineal en que los valores del coeficiente de correlacioacuten r estuvieron entre 099777 y
097267
-10 -08 -06 -04 -02
Ipa0
10A
blanco
0049 mM
0099 mM
0149 mM
0199 mM
0249 mM
0299 mM
E vs Ag|AgCl V
Resultados y discusioacuten
98
007 014 021 02800
03
06
09
r = 099074
IA 50
(Ip
a0-
Ipa
S)
Ip
a0
Concentracioacuten mM
Figura 520 Graacutefica del paraacutemetro adimensional (Ipa0-Ipa
SIpa
0) vs concentracioacuten de
sustrato para el compuesto 1 (Destacado en verde el valor de IA50)
Junto con el valor de concentracioacuten IA50 la pendiente de las rectas entrega tambieacuten
informacioacuten con respecto a la reactividad de los compuestos frente al anioacuten
superoacutexido donde un mayor valor de la pendiente indica que el compuesto posee una
mayor actividad no obstante los autores que desarrollaron el meacutetodo hacen notar que
se utiliza preferentemente el iacutendice IA50 como valor para caracterizar de manera
adecuada la actividad de los compuestos propuestos frente el radical de forma
anaacuteloga al concepto de IC50 (concentracioacuten inhibitoria aplicada en sistemas
bioloacutegicos en relacioacuten a la cantidad de compuesto necesario para inhibir en un 50 el
crecimiento de una poblacioacuten de microorganismos)
Como se observa en los resultados (Tabla 57) la cumarina de partida 1 presenta un
valor mayor de IA50 (0187 mM) en comparacioacuten con los compuestos hiacutebridos 9 10 y
Resultados y discusioacuten
99
11 por lo que la adicioacuten de los fenoles a la estructura cumariacutenica fue un aporte a su
reactividad frente a la especie radical O2-
Tabla 57Valores de IA50 obtenidos para los compuestos estudiados
a Valor de estaacutendar Tolox ref 92
El derivado de aacutecido gaacutelico 10 presentoacute el menor valor de iacutendice antioxidante y por
consiguiente fue el mejor inactivador del anioacuten superoacutexido formado en la superficie
del electrodo puesto que se necesita una menor concentracioacuten de este derivado
(0064 mM) para apagar el 50 radical Junto con esto fue el compuesto que presentoacute
el fenoacutemeno de sinergia dentro de la serie con un valor de concentracioacuten menor
Compuesto IA 50 mM
(plusmnSD)
1 0183 plusmn 0007
2 0125 plusmn 0006
3 0104 plusmn 0004
4 0115 plusmn 0005
9 0141 plusmn 0011
10 0064 plusmn 0004
11 0137 plusmn 0002
Troloxa
197
Resultados y discusioacuten
100
requerida para inactivar el radical con respecto a cada uno de sus precursores (1 y 3)
El segundo mejor inactivador de O2-
fue el compuesto 11 con un valor de IA50 de
0137 mM y finalmente se tiene al derivado 9 con 0141 mM Este comportamiento
puede deberse a fenoacutemenos de difusioacuten de las moleacuteculas en el medio junto con su
reactividad en la superficie del electrodo
En este ensayo frente al radical O2-
al igual que el anterior (inactivacioacuten de la especie
OHbull) se pudo obtener informacioacuten con respecto al comportamiento de los
compuestos en un medio aproacutetico resultados que son de intereacutes ya que se pueden
considerar como una aproximacioacuten quiacutemica de tipo in vitro de los conocidos
fenoacutemenos de estreacutes oxidativo que ocurren en estructuras como las bio-membranas
donde participan especies reactivas oxigenadas161162
Finalmente se puede establecer un orden estimativo para la actividad de los derivados
y la cumarina 10 gt 3 gt 4 gt 2 gt 11 gt 9 gt 1 Todos los compuestos ensayados tuvieron
una reactividad superior al estaacutendar Trolox
Resultados y discusioacuten
101
545 Determinacioacuten de capacidad antioxidante celular (CAC)
Con el objeto de abordar los fenoacutemenos que involucran especies radicalarias
presentes en sistemas vivos se procede a realizar el estudio de la capacidad
antioxidante de los compuestos en un modelo bioloacutegico simple En este experimento
se utiliza la sonda DCFH-DA la cual difunde pasivamente a traveacutes de la membrana
celular al ingresar al citosol se transforma en el compuesto DCFH (no fluorescente)
que emite al entrar en contacto con especies oxidantes del tipo EROs y ERNs En los
experimentos realizados las ceacutelulas fueron estresadas mediante el compuesto ABAP
(generador de radical peroxilo) y se observoacute coacutemo los nuevos derivados en estudio
podiacutean contrarrestar este evento oxidativo al interior de la ceacutelula Los resultados
obtenidos se resumen en la Tabla 58
Los valores experimentales obtenidos en esta etapa indicaron una bio-disponibilidad
baja con una CAC menor al 50 para los nuevos compuestos 9 10 y 11 ademaacutes en
todos los casos se encontroacute un porcentaje menor de CAC de los derivados respecto a
los precursores respectivos 1 2 3 y 4 Para una concentracioacuten de 10 microM de
compuesto se obtuvieron valores muy semejantes (alrededor del 70) para los
precursores ensayados
Resultados y discusioacuten
102
Tabla 58 Valores obtenidos para la capacidad antioxidante celular (CAC)
concentraciones 1 microM y 10 microM de cada compuesto
Compuesto CAC 1 microM CAC 10 microM
1 696plusmn 50 727plusmn 13
2 730plusmn 26 739plusmn 07
3 662plusmn 19 701plusmn 01
4 477plusmn 25 665plusmn 26
9 381plusmn 55 499plusmn 66
10 178plusmn 45 395plusmn 128
11 345plusmn 31 234plusmn 108
En los resultados anteriores llaman la atencioacuten los bajos valores obtenidos en el
ensayo de CAC para los derivados polifenoacutelicos en comparacioacuten con los ensayos
realizados en sistemas no bioloacutegicos en que se obtuvieron buenos resultados en ellos
se pudo apreciar el fenoacutemeno de sinergia (en algunos casos) y un incremento en la
actividad de todos los derivados frente a la cumarina precursora de forma individual
Para explicar este comportamiento y complementar estos resultados se procedioacute a
seleccionar de manera racional los tres derivados obtenidos 9 10 y 11 y se determinoacute
su Hidrofobicidad Relativa en conjunto con el precursor cumariacutenico 1 (el cual
presentoacute valores de CAC alrededor del 70 cercano a lo obtenido en los precursores
Resultados y discusioacuten
103
aacutecidos) ensayo que entrega informacioacuten con respecto a la lipofilia relativa de la serie
(en funcioacuten de tiempos de retencioacuten) pudiendo dar respuesta al fenoacutemeno observado
555 Estudio de hidrofobicidad relativa
En el estudio de nuevos compuestos disentildeados como potenciales faacutermacos una de las
propiedades fisicoquiacutemicas de intereacutes es la lipofilia valor que puede determinarse
mediante distintos meacutetodos electroforesis capilar cromatografiacutea liacutequida de alta
resolucioacuten (HPLC) y determinando el coeficiente de particioacuten aguaoctanol entre
otras Junto con la metodologiacutea empiacuterica se han desarrollado diversas herramientas
computacionales con softwares que permiten calcular el valor para logP y logD
obtenieacutendose buenas correlaciones entre compuestos de una familia de estructuras
semejantes en los que se realizan variaciones a su esqueleto Los valores asiacute
calculados y entregados por el programa se consideran de una confiabilidad
razonable163
En el caso de este estudio se determinoacute la lipofilia relativa para los derivados 9 10 y
11 junto con el precursor 1 mediante HPLC en fase reversa donde se espera obtener
una serie relativa de tiempos de retencioacuten entre los compuestos que deacute cuenta de su
lipofilia Se utilizoacute esta teacutecnica por tratarse de una medicioacuten simple raacutepida y
ampliamente descrita en la literatura para nuevos compuestos en que la fase
estacionaria de la columna C18 simula la fase no polar y la fase moacutevil es la fase
Resultados y discusioacuten
104
acuosa asiacute a traveacutes de la columna se llevan a cabo muacuteltiples equilibrios de particioacuten
entre la fase acuosa y orgaacutenica En la medida en que el compuesto analizado sea maacutes
afiacuten a la fase estacionaria (relacionado con un mayor tiempo de retencioacuten) eacuteste seraacute
maacutes lipofiacutelico y viceversa Los resultados (Tabla 59) muestran que de acuerdo a los
tiempos de retencioacuten obtenidos (5138 5760 4031 y 4695 minutos) el orden
relativo de lipofilia fue el siguiente
Tabla 59 Valores obtenidos para el tiempo de retencioacuten experimental de los
compuestos
Compuesto Tiempo de retencioacuten
(min)
1 5138
9 5760
10 4031
11 4695
La Figura 521 indica el orden de lipofilia relativa encontrada para los derivados y su
precursor cumariacutenico En forma general se observaron valores de tiempo de
retencioacuten cercanos Se aprecioacute que el derivado de aacutecido cafeico 9 fue el compuesto
que encabezoacute la serie lo que se puede explicar debido a la presencia de un doble
enlace en su estructura confirieacutendole mayor apolaridad (por tanto hidrofobicidad) a
Resultados y discusioacuten
105
O
OH
HO O
Cl
O
OH
OH O
OH
OH
O
O
OHO O
O
O
OH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
la moleacutecula El segundo en la serie fue el compuesto clorado 1 en el cual el
sustituyente haloacutegeno es un aporte a la lipofilia del compuesto En el caso de las
estructuras 10 y 11 se encontroacute que el derivado de aacutecido gaacutelico presentoacute el menor
valor relativo debido a la presencia de un grupo ndashOH adicional en el anillo aromaacutetico
que como se esperaba tuvo la mayor tendencia hidrofiacutelica
9 1 11 10
Figura 521 Hidrofobicidad relativa de los derivados y la cumarina precursora
Para complementar este resultado experimental se realizoacute el caacutelculo teoacuterico para el
valor de logD mediante herramienta Marvin Sketch del software libre ChemAxon164
y
se establecioacute su correlacioacuten con el valor experimental obtenido para CAC en
concentracioacuten 10 microM El resultado de esta correlacioacuten se presenta en la Figura 522
Aumento de la lipofilia = aumento en el tiempo de retencioacuten
Resultados y discusioacuten
106
Figura 522 Correlacioacuten entre el valor de logD teoacuterico y CAC experimental a
10 microM de cada compuesto El valor logD se obtuvo a traveacutes de la herramienta Marvin
Sketch del software ChemAxon164
Considerando estos resultados para este modelo experimental propuesto en el ensayo
de CAC se observa que la lipofilia no seriacutea el uacutenico factor relacionado con los bajos
valores de capacidad antioxidante celular (CAC) obtenidos para los compuestos 9 10
y 11 ya que por ejemplo la cumarina 1 presentoacute valores de CAC sobre el 70 y fue
el segundo compuesto de la serie de hidrofobicidad relativa experimental con un
valor cercano de tiempo de retencioacuten al derivado 9 (el cual tuvo valores de CAC bajo
el 50) De igual forma se aprecia la misma tendencia al correlacionar el valor de
CAC con el logD teoacuterico donde el compuesto 1 independientemente de tener una
lipofilia semejante a los derivados polifenoacutelicos (al igual que en la serie de tiempos
de retencioacuten) siacute mostroacute una biodisponibilidad superior a los derivados y muy
-3 -2 -1 0 1 2 3 4
20
40
60
80
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OOH
HO O
Cl
OHO O
O
OOH
OH
OH
OOH
OH O
OH
OH
O
O
logDteor
C
AC
(1
0
32
4
Resultados y discusioacuten
107
semejante a los aacutecidos benzoicos (2 3 y 4) los cuales muestran valores negativos de
logD debido a su menor lipofilia
Por tratarse de un sistema bioloacutegico (ceacutelulas epiteliales) con muacuteltiples variables que
afectan la actividad de los compuestos estudiados se pueden considerar diversos
factores presentes en el medio ensayado que pueden dar respuesta al fenoacutemeno
observado Uno de ellos es la estructura de la membrana celular que contiene diversas
estructuras como por ejemplo el citocromo P (CYP) que es un complejo enzimaacutetico
involucrado en el metabolismo de faacutermacos siacutentesis de biomoleacuteculas y diversas
biotransformaciones de moleacuteculas a nivel celular165
Otro factor presente es la
existencia de enzimas hidroliacuteticas en el citosol celular como es el caso especiacutefico de
las carboxilesterasas (presentes en ceacutelulas epiteliales de intestino hiCE y otros
oacuterganos) las cuales son capaces de escindir diversos grupos funcionales tales como
amidas eacutesteres carbamatos y convertirlos en sus respectivos precursores (alcohol y
aacutecido) 166
Considerando que para este experimento en un modelo bioloacutegico in vitro simple se
emplearon ceacutelulas epiteliales de intestino (EAhy 926 (ATCC CRL-2922)) es posible
que el comportamiento observado se deba a la existencia de diversos fenoacutemenos e
interacciones posibles de los compuestos tanto a nivel de membrana como de
citoplasma Cabe destacar que al comparar las experiencias realizadas en un medio no
bioloacutegico los resultados en este caso se invierten al emplear una metodologiacutea que
involucra un medio bioloacutegico No necesariamente se encuentra un comportamiento
Resultados y discusioacuten
108
anaacutelogo en ambos medios de ensayo debido a la mayor complejidad y variables
asociadas a un sistema que involucra estructuras vivas independientemente de la
simplicidad o lo acotado del mismo
556 Estudios Teoacutericos optimizacioacuten de estructuras y determinacioacuten del Iacutendice
de Fukui
Con el objeto de racionalizar el estudio realizado y poder discriminar entre los
distintos sitios reactivos de los derivados se determinoacute el iacutendice de Fukui fk0
relacionado con un ataque de tipo radicalario Baacutesicamente es el promedio
correspondiente a las reacciones de ataque nucleofiacutelico fk- y electrofiacutelico fk
+(Ecuacioacuten
57) como se describe en el trabajo de Aliaga y Lissi donde se aborda el estudio
teoacuterico y experimental que compara la actividad anti-radicalaria de los polifenoles
rutina y quercetina167
1198911198960 =
119891119896minus+ 119891119896
+
2 Ecuacioacuten 57
Este iacutendice es un descriptor de reactividad local en los aacutetomos de oxiacutegeno que
participan en las reacciones de los grupos catecol presentes Este tipo de anaacutelisis
resulta adecuado para determinar los sitios de reaccioacuten preferentes en moleacuteculas
complejas con diversos centros reactivos168
Los resultados obtenidos indican que en
Resultados y discusioacuten
109
la cumarina precursora 1 el ataque radicalario ocurriraacute primero en el oxiacutegeno en
posicioacuten 7 debido al mayor valor de fk0
(0071) por otra parte no se observaron
cambios significativos en los valores de fk0 al formar parte de los derivados 10 y 11
para los aacutetomos de oxiacutegeno en posicioacuten 7 y 8 (aquellos involucrados en la capacidad
antioxidante de la moleacutecula) Al formar parte del derivado 9 si se observa una
disminucioacuten en su reactividad (fk0
O7 = 00078 y fk0
O8 = 00021) haciendo menos
probables estos dos sitios a un ataque radicalario en la moleacutecula (Tabla 510)
Los valores obtenidos para el iacutendice de Fukui indican que en el derivado 9 el sitio
maacutes probable para un ataque radicalario seraacute el catecol presente en el anillo benceacutenico
(proveniente del aacutecido cafeico) de preferencia en el oxiacutegeno en posicioacuten 4
(fk0
O4 = 00489) A diferencia del derivado de aacutecido cafeico en el caso de los
compuestos 10 y 11 el sitio preferente de reaccioacuten seraacute el anillo cumariacutenico
conservaacutendose el oxiacutegeno en posicioacuten 7 del heterociclo como sitio maacutes reactivo En
las Figuras 523 a 526 se presentan las estructuras optimizadas en 3D para el
precursor 1 y sus derivados polifenoacutelicos 9 10 y 11
Resultados y discusioacuten
110
Tabla 510 Valores de Iacutendice de Fukui fk para los compuestos en estudio
Compuesto Iacutendice de Fukui
fk0
Iacutendice de Fukui
fk-
O7 00771
O7 01373
O8 00391
O8 00757
O7 00078 O7 00072
O8 00021 O8 00036
O3 00389 O3 00779
O4 00489 O4 00890
O7 00719 O7 01276
O8 00365 O8 00716
O3 00025 O3 00050
O4 00025 O4 00049
O5 00002 O5 00004
O7 00739 O7 01316
O8 00378 O8 00742
O3 00004 O3 00008
O4 00003 O4 00005
OHO O
O
OOH
OH
OH
7
8
3
4
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
7
8
3
4
5
OOH
HO O
OH
OH
O
O
7
8
3
4
O
OH
HO O
Cl
7
8
Resultados y discusioacuten
111
OOH
OHO
Cl
Figura 523 Estructura optimizada en 3D para el precursor 1 utilizando DFT
OOH
OH O
OH
OH
O
O
Figura 524 Estructura optimizada en 3D para el derivado 9 utilizando DFT
Resultados y discusioacuten
112
Figura 525 Estructura optimizada en 3D para el derivado 10 utilizando DFT
OHO O
O
OOH
OH
OH
Figura 526 Estructura optimizada en 3D para el derivado 11 utilizando DFT
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
Resultados y discusioacuten
113
6 Discusioacuten General
Respecto del posible mecanismo de reaccioacuten electro-oxidativo se consideran las
siguientes evidencias teoacutericas y experimentales
En primer lugar como se esperaba los experimentos electroquiacutemicos de electro-
oxidacioacuten de los compuestos mostraron las sentildeales correspondientes a los grupos
ndashOH presentes en todas las estructuras Junto con esto los resultados de la graacutefica
Ipa vs vfrac12
indican la existencia de un proceso di-electroacutenico en los precursores y los
derivados (para la primera sentildeal oxidativa) lo que implica que comparten el mismo
mecanismo
Posteriormente se comproboacute la existencia de la especie radicalaria detectada mediante
oxidacioacuten electroquiacutemica seguida por resonancia de espiacuten electroacutenico con los
respectivos resultados de las simulaciones espectrales realizadas
En un siguiente punto se determinaron los valores teoacutericos de reactividad local
encontrados mediante el caacutelculo del iacutendice de Fukui El valor de fkndash
permitioacute
identificar los lugares con mayor reactividad frente a un ataque electrofiacutelico por tanto
las zonas en la moleacutecula puntuales con un alto valor para este iacutendice tenderaacuten a ceder
electrones con mayor facilidad en un proceso oxidativo Las estructuras optimizadas
en 3D indican que las zonas en color celeste (Figuras 523-526) corresponden a
aquellas con mayor densidad electroacutenica y por tanto estaacuten maacutes propensas a ceder
Resultados y discusioacuten
114
electrones en un proceso oxidativo Las zonas color lila representan los sitios con
menor densidad electroacutenica Para el compuesto 1 los ndashOH en el heterociclo presentan
mayor densidad electroacutenica lo que se aprecia de igual forma en los derivados 10 y 11
mientras que la zona del anillo benceacutenico se presenta con una baja densidad
electroacutenica Un fenoacutemeno diferente se aprecia para el derivado 9 donde la mayor
densidad electroacutenica se aprecia en la estructura benceacutenica cuyos grupos ndashOH
presentan el mayor valor de fk-
Este resultado teoacuterico racional complementa lo observado en el experimento descrito
con REE y electro-oxidacioacuten conjunta ya que los valores para las constantes de
acoplamiento hiperfino obtenidas en cada caso tambieacuten sentildealaron en cuaacutel de los dos
catecoles presentes ocurre la formacioacuten de la especie radical y por ende doacutende se
inicia el proceso de oxidacioacuten resultados corroboradas con el estudio teoacuterico
realizado De esta forma para el derivado 9 el proceso oxidativo se inicia en los -OH
ubicados en posicioacuten 3 y 4 que presentaron valores de fkndash
00779 y 00890
respectivamente y cuyas constantes de acoplamiento hiperfino son coherentes con
una interaccioacuten que involucra tres protones aquellos ubicados en las posiciones 2 5 y
6 del anillo benceacutenico El mismo anaacutelisis realizado para las estructuras 10 y 11 indica
que el proceso oxidativo ocurre primero en el anillo de la cumarina en los -OH en
posicioacuten 7 y 8 con valores del descriptor de reactividad local fkndash de 01276 y 00716
respectivamente para el derivado de aacutecido gaacutelico y en el caso del derivado de aacutecido
protocateacutequico con fkndash 01316 y 00742 para los oxiacutegenos en posicioacuten 7 y 8 De igual
forma los valores para las constantes de acoplamiento fueron consistentes con esta
Resultados y discusioacuten
115
informacioacuten experimental evidenciando la interaccioacuten entre dos protones (aquellos en
posicioacuten 5 y 6 del heterociclo cumariacutenico)
Esta diferencia encontrada para el proceso electro-oxidativo entre los derivados se
puede explicar debido a la existencia de un doble enlace conjugado adicional presente
soacutelo en el compuesto 9 derivado del aacutecido cafeico (ausente en 10 y 11) el cual le
confiere mayor deslocalizacioacuten (estabilidad) al radical que se forma como
intermediario en el proceso oxidativo
Los estudios presentes en la literatura sobre la oxidacioacuten de estructuras polifenoacutelicas
en medio aproacutetico presentan evidencias tanto teoacutericas como empiacutericas que ampliacutean la
visioacuten sobre la complejidad y posibilidades mecaniacutesticas en la oxidacioacuten de
estructuras polifenoacutelicas Basadas en modelos de naturaleza bioloacutegica como el
Fotosistema II presente en estructuras vegetales y otros ejemplos se plantea que una
viacutea de oxidacioacuten factible es a traveacutes de un mecanismo de tipo concertado donde se
obtiene el radical fenoxil (ArObull) en un paso directo en que el protoacuten y el electroacuten se
transfieren de manera conjunta (Figura 61 destacado en rojo) planteamiento que
considera factores de tipo energeacutetico a diferencia de los estudios claacutesicos con respecto
a este proceso seguacuten el cual la electro-oxidacioacuten se inicia con la peacuterdida de 1ē (etapa
electroquiacutemica) para formar el catioacuten radical(ArObull+) seguido de la peacuterdida de un
H+(etapa quiacutemica) para formar el radical fenoxil (ArObull) (Figura 62)
En el caso de los compuestos estudiados en esta investigacioacuten los valores de la
pendiente de Tafel encontrados para los compuestos (sobre 88 mVdec) sugieren que
Resultados y discusioacuten
116
el mecanismo de electro-oxidativo que maacutes se ajusta a la evidencia experimental es
por etapas
OH
HO
OH
HO
O
HO
O-
HO
-e- + B
+e- + HB+
+ B-e-
+e-
+e-
-e-
+ HB+
+ B
+HB+
Figura 61 Esquema de reaccioacuten para un mecanismo concertado de electro-
oxidacioacuten fenoacutelica Adaptacioacuten referencia 120
OH
HO - e
+ e
OH
HO
-H+
O
HO
Figura 62 Esquema de reaccioacuten para estructuras fenoacutelicas mecanismo electro-
oxidativo en etapas
Resultados y discusioacuten
117
Con respecto a los ensayos de actividad antioxidante realizados la Tabla 61 permite
comparar y estimar en conjunto los resultados obtenidos a traveacutes de las diferentes
metodologiacuteas empleadas
En forma general los resultados indican que la sustitucioacuten propuesta en esta
investigacioacuten en la cumarina dihidroxilada (utilizada como esqueleto de partida) con
distintas estructuras polifenoacutelicas entregoacute resultados positivos en cuanto al aporte
que los nuevos derivados obtenidos presentaron frente a la inactivacioacuten de especies
radicalarias tales como O2- ROO˙ OH˙ y su capacidad reductora (reflejada en el
ensayo FRAP) Para los ensayos realizados en un modelo no bioloacutegico se obtuvieron
valores de actividad en los derivados que superaron a los obtenidos para el precursor
cumariacutenico de forma individual
Cabe mencionar que en los diferentes ensayos y sus resultados se mencionan los
conceptos de reactividad y actividad de los compuestos En el caso de los ensayos
ORAC-FL y FRAP se habla soacutelo de actividad antioxidante ya que con la informacioacuten
que entregan no se puede determinar cuaacutel de los distintos grupos ndashOH presente en la
moleacutecula es el que reacciona primero Diferente es lo que ocurre en el ensayo frente
al radical hidroxilo en que se establece una competencia entre el atrapador (DMPO) y
el compuesto por inactivar al OHbull debido a que ambos tienen una vida media corta
(10-9
s) por tanto la reaccioacuten entre el antioxidante y el radical es raacutepida y el ndashOH maacutes
reactivo de la moleacutecula es el que inactiva a la especie y se puede mencionar como
reactividad Lo mismo ocurre para el ensayo frente al anioacuten radical superoacutexido en que
tambieacuten se mencionan los resultados como reactividad frente al radical
Resultados y discusioacuten
118
Tabla 61 Cuadro comparativo de los resultados en la determinacioacuten de capacidad
antioxidante para la cumarina y sus derivados
Compuesto ORAC-FL
FRAP
eq Trolox
10 microM
inactivacioacuten
OHmiddot
CAC
1 microM 10 microM
O2-
IA 50 mM
1 091 plusmn 003 1302plusmn 160 923 plusmn 74 696 plusmn 50 727 plusmn 13 0183plusmn0007
2 347 plusmn 010 2727 plusmn 321 983 plusmn 27 730plusmn 26 739plusmn07 0125 plusmn 0006
3 391 plusmn 009 4768 plusmn 215 995 plusmn 08 662plusmn 19 701plusmn01 0104 plusmn 0004
4 069 plusmn 001 868 plusmn 93 927 plusmn 29 477plusmn 25 665plusmn26 0115 plusmn 0005
9 239plusmn0027 2052 plusmn151 981 plusmn 18 381plusmn55 499 plusmn 66 0141plusmn0011
10 174 plusmn 005 28046plusmn188 982 plusmn 25 178plusmn45 395 plusmn128 0064plusmn0004
11 262 plusmn 004 2624 plusmn 236 980 plusmn 99 345plusmn31 234 plusmn 108 0137plusmn0002
Por otra parte en los ensayos ORAC-FL y FRAP se observoacute que los valores de
actividad para los aacutecidos cafeico 2 y gaacutelico 3 fueron superiores a los obtenidos para
sus derivados hiacutebridos 9 y 10 respectivamente En el ensayo frente al anioacuten
superoacutexido se encontroacute que los aacutecidos cafeico 2 y protocateacutequico 4 presentaron
resultados superiores en cuanto a reactividad que sus respectivos derivados hiacutebridos 9
y 11
Resultados y discusioacuten
119
En la literatura se encuentra la caracterizacioacuten de los aacutecidos benzoicos y otros
antioxidantes polifenoacutelicos naturales como moleacuteculas altamente polares lo que en
algunos limita su uso en medios como bio-membranas emulsiones y micelas por lo
que la formacioacuten de sus derivados eacutesteres se utiliza como una estrategia para
aumentar su lipofilia y por lo tanto la biodisponibilidad de estos compuestos en
medios no acuosos169170
investigacioacuten que ha dado origen a la formulacioacuten de los
denominados ldquoantioxidantes lipofiacutelicosrdquo171172
los que han demostrado ser eficientes
como antioxidantes en bio-membranas resultados que se describen en el trabajo
realizado por Tai y colaboradores donde se ensayaron eacutesteres de aacutecido vainilliacutenico
que ademaacutes de presentar buenos valores de iacutendice ORAC-FL inhibieron el proceso
de hemoacutelisis en eritrocitos de mamiacutefero173
Junto con lo anterior estaacute descrita la relacioacuten existente entre la estructura de los
aacutecidos benzoicos y su actividad antioxidante la que es atribuida a diversas
caracteriacutesticas presentes en su esqueleto tales como i) nuacutemero y posicioacuten de grupos ndash
OH en la moleacutecula ii) sustituyentes alcoxilo en posicioacuten orto al ndashOH iii) presencia
de grupos -COOH -COOR -CH=CH-CH2-174
Al apreciar las estructuras de los
derivados propuestos se infiere que las diferencias encontradas en la actividad de los
aacutecidos antes y despueacutes de la unioacuten a la cumarina estaacuten relacionadas con dicha
sustitucioacuten En el caso del aacutecido gaacutelico que presenta un valor de ORAC de 391 frente
a un valor de 174 para su derivado 10 y en el ensayo FRAP se encontroacute un valor de
4768 vs un 3182 para el hiacutebrido se puede sentildealar que no se aprecioacute un aumento de
Resultados y discusioacuten
120
actividad antioxidante para los eacutesteres con respecto al aacutecido del que provienen seguacuten
con lo descrito por algunos autores175176
Junto con lo anterior se forma un eacutester de
aacutecido gaacutelico con un sustituyente voluminoso (la estructura cumariacutenica) pudiendo
disminuir la coplanaridad en el sistema aromaacuteticocarbonilo lo que implica una menor
estabilizacioacuten del radical formado en la reaccioacuten frente a la especie ROObull para el
ensayo ORAC-FL y la capacidad reductora en el ensayo FRAP Otro punto a
considerar es que para este derivado se observa el fenoacutemeno mencionado por Rice-
Evans175
y otros autores con respecto a que un nuacutemero mayor de grupos ndashOH en el
anillo benceacutenico no implica necesariamente un aumento en la actividad antioxidante
de un derivado polifenoacutelico
Para el caso observado en el aacutecido cafeico y su derivado 9 se aprecia el mismo
fenoacutemeno de disminucioacuten de actividad del aacutecido 2 frente al eacutester como lo descrito
para el aacutecido gaacutelico y su derivado en los ensayos ORAC-FL y FRAP con la
diferencia que esta disminucioacuten no es tan draacutestica lo que se atribuye a la presencia del
doble enlace en la estructura que confiere mayor estabilidad por resonancia al radical
formado
El valor de reactividad local del iacutendice de Fukui fk0
-relacionado con los fenoacutemenos
de ataque radicalario- entregoacute informacioacuten con respecto a los sitios de los derivados
donde la actividad anti-radicalaria es maacutes probable Asiacute para el compuesto 9 esta
actividad ocurre en el anillo benceacutenico en primer lugar y posteriormente en la
cumarina Para los derivados 10 y 11 la mayor probabilidad de que se produzca el
Resultados y discusioacuten
121
ataque radicalario es en el heterociclo cumariacutenico y posteriormente en el catecol del
anillo benceacutenico Estos resultados corroboran con los valores experimentales y las
simulaciones realizadas en espectroscopia de resonancia electroacutenica de espiacuten (REE)
donde la actividad antioxidante del compuesto 9 ocurre con mayor probabilidad en el
anillo benceacutenico proveniente de la fraccioacuten del aacutecido cafeico (donde se encuentra el
doble enlace que le confiere mayor estabilidad al radical formado como intermediario
de reaccioacuten) mientras que en los derivados 10 y 11 esta actividad ocurre en el
heterociclo cumariacutenico
Se observa que los resultados de capacidad antioxidante para los derivados
polifenoacutelicos variaron entre un meacutetodo y otro no hubo correlacioacuten entre los valores
obtenidos en la capacidad antioxidante obtenidos en las distintas metodologiacuteas Este
resultado concuerda con lo esperado ya que cada experiencia realizada implica una
especie radicalaria diferente y cada una de ellas posee reactividades distintas (t12 O2-
del orden de los ms t12 OHbull ~ 10-9
s t12 ROObull ~ 10 ms) Para cada ensayo se
obtuvo un distinto orden relativo de reactividad entre los derivados y sus precursores
Se establece la relacioacuten entre el potencial Eonset y los resultados obtenidos en el
ensayo de capacidad antioxidante frente a anioacuten superoacutexido realizado en medio
aproacutetico (Figura 63) Para el ensayo de reactividad frente a O2-
se puede establecer
una correlacioacuten donde una disminucioacuten en el potencial de oxidacioacuten disminuye el
valor de IA50 para 5 de los 7 compuestos estudiados Por tanto a medida que el
Resultados y discusioacuten
122
potencial se hace menos positivo aumenta la reactividad de los compuestos frente al
anioacuten superoacutexido presentaacutendose una relacioacuten entre actividad antioxidante y Eonset
para este ensayo
Figura 63 Correlacioacuten entre el potencial de oxidacioacuten Eonset y los ensayos frente a
anioacuten superoacutexido
Un menor potencial de oxidacioacuten para los grupos ndashOH presentes en los compuestos
implica una mayor facilidad para oxidarse (por ende una mayor densidad de carga
electroacutenica para ceder) y por tanto un incremento en la capacidad antioxidante para
este ensayo
Se puede observar que el compuesto 4 (aacutecido protocateacutequico) posee un valor de IA50
de 0115 mM el cual se encuentra entre los valores encontrados para el aacutecido cafeico
y el aacutecido gaacutelico pero su valor de Eonset es mayor diferenciaacutendose de la tendencia
049 056 063 070 077
006
009
012
015
018
11
3
1
42
9
10
Eonset
vs Ag|AgCl V
IA50
mM
Resultados y discusioacuten
123
encontrada Junto con lo anterior el compuesto 4 presentoacute el menor valor para la
pendiente de Tafel (b = 88 mVdec) de toda la serie lo que sugiere una relacioacuten entre
el mecanismo de oxidacioacuten y la capacidad de reaccionar frente a la especie
radicalaria El compuesto 10 presentoacute el mejor valor para IA50 y tambieacuten se diferencia
de la serie de compuestos con respecto al Eonset (cercano al del compuesto 4) a
diferencia del aacutecido su pendiente de Tafel (b = 134 mVdec) indica la presencia de
dimerizaciones posteriores a la formacioacuten del radical fenoxil (y generacioacuten de
compuestos nuevos que tambieacuten pueden reaccionar con el radical) sugiriendo que
ademaacutes del mecanismo de oxidacioacuten hay otros factores que pueden influir como por
ejemplo la difusioacuten de las especies en el medio empleado
El estudio de los compuestos frente al radical hidroxilo reflejoacute que en las condiciones
experimentales empleadas los resultados fueron semejantes por cuanto los valores de
inactivacioacuten del radical en todos los casos fue sobre el 90 Debido a lo anterior se
descarta realizar la correlacioacuten con el potencial Eonset ya que no encontroacute una
diferencia significativa entre los compuestos
Finalmente al considerar los resultados obtenidos para la capacidad antioxidante
celular en un modelo bioloacutegico simple un punto a tener en cuenta es el hecho de que
esta metodologiacutea en particular adolece en cuanto a que es inespeciacutefica con respecto a
la cantidad de compuesto que ingresa en la ceacutelula ya que por las distintas lipofilias
observadas los compuestos tendraacuten una diferente capacidad de ingreso al medio y no
se puede determinar la relacioacuten existente entre la cantidad que ingresa a la ceacutelula
Resultados y discusioacuten
124
versus la reactividad Debido a lo anteriormente descrito estos resultados muestran
principalmente un reflejo de la capacidad de penetracioacuten que tienen los compuestos
hacia el interior de la ceacutelula
Un modo de abordar temaacuteticas de tipo multi-variable-donde se deben considerar
numerosos factores involucrados en un comportamiento o fenoacutemeno- es el empleo de
modelos teoacuterico-computacionales como QSAR (por su sigla en ingleacutes Quantitative
Structure-Activity Relationships) herramienta que se utiliza en la estimacioacuten de
propiedades bioloacutegicas y fisicoquiacutemicas de intereacutes en diversas moleacuteculas entre ellas
polifenoles177
El factor esteacuterico tiene un papel importante en los estudios realizados en medios
celulares siendo el tamantildeo molecular uno de los factores considerados en ensayos de
permeabilidad en futuros faacutermacos ya que un excesivo tamantildeo (entre otras cosas)
dificulta la solubilidad en medio acuoso asiacute como tambieacuten la difusioacuten pasiva de las
moleacuteculas163
Al observar el peso molecular de los compuestos derivados (entre
34427 gmol y 37031 gmol) se puede considerar que el efecto esteacuterico en este caso
no seriacutea la causa principal para el fenoacutemeno observado en el ensayo celular ya que
estaacute descrito que los compuestos no deberiacutean superar un peso de 500 gmol 163
_que no es el caso de estos derivados-
Los resultados obtenidos para este ensayo realizado en un modelo bioloacutegico simple
sugieren que la actividad de los derivados para reaccionar frente a especies
radicalarias podriacutea estar circunscrita a medios lipofiacutelicos como las membranas
Resultados y discusioacuten
125
bioloacutegicas estudio que se podriacutea profundizar empleando un modelo como el
descrito173
para estudiar procesos oxidativos en membranas de eritrocito
Conclusiones
126
7 Conclusiones
La teacutecnica de electro-oxidacioacuten complementada con espectroscopia de
resonancia de espiacuten electroacutenico (REE) resulta uacutetil para identificar especies
radicalarias como intermediarios de la reaccioacuten en este trabajo
La determinacioacuten del iacutendice de Fukui (fk-) en conjunto con los resultados de
resonancia de espiacuten electroacutenico permitieron discriminar los sitios de las
moleacuteculas donde se inicia el proceso oxidativo En el derivado 9 la oxidacioacuten
ocurre primero en el anillo benceacutenico y en los compuestos 10 y 11 el proceso
oxidativo ocurre primero en el heterociclo cumariacutenico
La inclusioacuten de las estructuras polifenoacutelicas al heterociclo cumariacutenico generoacute
un incremento en su capacidad antioxidante en los ensayos no bioloacutegicos
No se obtuvo correlacioacuten para los resultados de capacidad antioxidante entre
las distintas metodologiacuteas empleadas
Se establecioacute la correlacioacuten entre el valor de potencial de inicio de la reaccioacuten
electroquiacutemica (onset) y los resultados para el ensayo frente al anioacuten
superoacutexido A medida que el potencial se hace menos positivo aumenta la
reactividad de los compuestos lo que indica que la transferencia electroacutenica
estaacute involucrada en la etapa determinante de la velocidad
De acuerdo con los resultados de la teacutecnica CAC y la correlacioacuten tanto con la
hidrofobicidad relativa como con el logDteoacuterico la actividad de los derivados
Conclusiones
127
propuestos estaacute circunscrita a aquellos procesos oxidativos que tienen lugar en
medios lipofiacutelicos como por ejemplo membranas bioloacutegicas
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vi
INDICE
Informe de aprobacioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip i
Agradecimientoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip iii
Iacutendicehelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip vi
Iacutendice de figuras y tablashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip x
Glosariohelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip xvi
Resumenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip xviii
Summaryhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip xx
1 Introduccioacutenhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 1
11 Cumarinashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 1
111 Origen vegetalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 1
112 Rutas de siacutentesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 2
113 Principales aplicacioneshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 4
12 Compuestos polifenoacutelicoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 9
121 Origen vegetalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 9
122 Actividad bioloacutegicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 10
123 Polifenoles como antioxidanteshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 11
13 Compuestos hiacutebridoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 13
vii
131 Cumarinas como estructuras hiacutebridashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 15
2 Hipoacutetesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
3 Objetivoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
31 Objetivos generaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
32 Objetivos especiacuteficoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
4 Materiales y meacutetodoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 23
41 Materialeshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24
411 Reactivos y equipamiento utilizado en siacutentesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24
412 Reactivos y equipamiento utilizados en electroquiacutemicahelliphelliphelliphelliphellip 25
413 Reactivos y equipamiento utilizados en ensayos frente a especies
radicalariashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27
42 Meacutetodoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 28
421 Procedimientos de siacutentesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 28
422 Procedimientos en electroquiacutemicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 37
423 Estudio de generacioacuten de especies radicalarias mediante
espectroscopia de resonancia de espiacuten electroacutenico (REE)helliphelliphelliphelliphellip 38
424 Procedimiento experimental en el estudio de reactividad
frente a especies radicalariashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39
4241 Metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales
de oxiacutegeno (ORAC-FL)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39
4242 Metodologiacutea de capacidad reductora de hierro en plasma
(FRAP)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42
viii
4243 Capacidad de apagamiento del radical hidroxilo (OHmiddot)
mediante la teacutecnica spin traphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 44
4244 Estudio de reactividad frente al anioacuten radical superoacutexido O2bull-helliphelliphellip 45
4245 Estudio de la capacidad antioxidante celular (CAC)helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 47
4246 Estudio de hidrofobicidad relativa helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 48
4247 Estudio teoacuterico caacutelculo del Iacutendice de Fukui fkhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 49
5 Resultados y discusioacuten helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 50
51 Siacutentesis de los compuestoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 50
52 Estudios electroquiacutemicoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 54
53 Estudio de generacioacuten de especies radicalarias mediante espectroscopia
de resonancia de espiacuten electroacutenico (REE)helliphelliphelliphelliphellip 70
54 Resultados y discusioacuten de los estudios de reactividad
frente a especies radicalariashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 74
541 Metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales
oxiacutegeno-fluoresceiacutena (ORAC-FL)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 74
542 Metodologiacutea de capacidad reductora de hierro en plasma
(FRAP )helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 82
543 Determinacioacuten de capacidad de apagamiento del radical OHmiddot
teacutecnica spin trappinghelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 86
544 Estudio de reactividad frente al anioacuten radical superoacutexido O2bull-helliphelliphellip 94
545 Determinacioacuten de capacidad antioxidante celular (CAC)helliphelliphelliphelliphellip 100
546 Estudio de hidrofobicidad relativa helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 102
ix
547 Estudio teoacuterico caacutelculo del Iacutendice de Fukui fkhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 108
6 Discusioacuten generalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 113
7 Conclusiones helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 124
8 Bibliografiacuteahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 126
x
Iacutendice de figuras y tablas
Figuras
Figura 1 Esquema de los compuestos estudiados
Figure 1 Scheme of studied compounds
Figura 11 Estructura de la 2H-1-benzopiran-2-ona (cumarina)
Figura 12 Esquema general de la reaccioacuten de Pechmann
Figura 13 Estructura de la 33rsquo-metilenbis(4-hidroxicumarina) o dicumarol
Figura 14 Estructura de la suksdorfina
Figura 15 Estructura del hiacutebrido cumarina-flavona aislado de su fuente vegetal
Gnidia socotrana
Figura 16 Estructura del antibioacutetico hiacutebrido novobiocina metabolitos secundarios
en la especie Streptomyces
Figura 17 Hiacutebridos chalcona-cumarina con capacidad antioxidante
Figura 41 Aacutecidos empleados en la sustitucioacuten de la 4-clorometil-78-
dihidroxicumarina
Figura 42 Siacutentesis del derivado clorado 1
Figura 43 Siacutentesis del derivado clorado acetilado 5
Figura 44 Siacutentesis del aacutecido cafeico acetilado 6
Figura 45 Siacutentesis del aacutecido gaacutelico acetilado 7
Figura 46 Siacutentesis del aacutecido 34-dihidroxibenzoico acetilado 8
Figura 47 Siacutentesis del intermediario hiacutebrido derivado del aacutecido cafeico
xi
Figura 48 Siacutentesis del compuesto hiacutebrido final 9
Figura 49A Ruta de siacutentesis de los compuestos cumariacutenicos i) H2SO4 1 h bantildeo de
hielo ii) NaOH Ac2O 30 min bantildeo de hielo (aacutecido cafeico 6) H2SO4 Ac2O 30
min (cumarina y aacutecidos benzoicos)
Figura 49B Ruta de siacutentesis de los compuestos cumariacutenicos iii) DBU DMF (seca)
35 h 50 degC iv) NaHCO3 MeOH acetona tdeg amb 3 h N2
Figura 410 A Sonda fluoresceiacutena B 22prime-azobis (2-metilpropionamidina)
dihidrochloridrato (ABAP) C 6-hidroxi-2578-tetrametilcroman-2-aacutecido carboxiacutelico
(Trolox)
Figura 411 Actividad antioxidante ORAC para un compuesto en estudio
Figura 412 Reactivo 246-tris(2-piridil)-s-triazina (TPTZ)
Figura 413 Voltamograma ciacuteclico de la generacioacuten de anioacuten radical superoacutexido
DMF+ HFFTBA 02 M en electrodo de carbono viacutetreo
Figura 51A Voltamogramas de pulso diferencial para los precursores 1 2 3 y 4
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 51B Voltamogramas de pulso diferencial para los derivados 9 10 y 11
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 52A VC para el derivado 9 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 53A VC para el derivado 10 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 54A VC para el derivado 1a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 55 Esquema del proceso electro-oxidativo propuesto para el catecol
Figura 56 Relacioacuten Epa vs logv para el derivado de aacutecido cafeico 9 2 mM en
DMF + HFFTBA 02 M
xii
Figura 57 Graacutefica para la corriente de pico Ipa vs la raiacutez cuadrada de la velocidad de
barrido Ejemplo de correlacioacuten lineal en el aacutecido protocateacutequico 4 2 mM en
DMF + HFFTBA 02 M
Figura 58 Determinacioacuten graacutefica del valor de Eonset VC del precursor 1 01 Vs
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 59 Relacioacuten Eonset vs logv para los compuestos estudiados
Figura 510 Correlacioacuten Ipa v12
vs v12
para el precursor aacutecido protocateacutequico 4
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 511A Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido cafeico 9 estabilizado con Zn2+
en DMF+HFFTBA
(izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color
rojo)
Figura 511B Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido gaacutelico 10 estabilizado con Zn2+
en DMF+HFFTBA
(izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color
rojo)
Figura 511C Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido 11 estabilizado con Zn2+
en DMF+HFFTBA (izq)
Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color rojo)
Figura 512 Curvas para el consumo de la sonda Fluoresceiacutena para un set de
concentraciones del compuesto 11
Figura 513 Graacutefica de aacuterea neta bajo la curva ABC vs concentracioacuten del derivado 11
Figura 514 Esquema para la reaccioacuten entre el complejo de Fe3+
y el compuesto
antioxidante reductor
Figura 515 Espin aducto generado por la inactivacioacuten del radical OHbull y su espectro
simulado (derecha)
xiii
Figura 516A Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto 4-clorometil-78-dihidroxicumarina 1 B Espectro REE de inactivacioacuten
del radical hidroxilo con adicioacuten del compuesto aacutecido cafeico 2
Figura 516C Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto aacutecido gaacutelico 3 D Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con
adicioacuten del compuesto aacutecido 34-dihidroxi benzoico 4
Figura 516E Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto hiacutebrido 9 F Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con
adicioacuten del compuesto hiacutebrido 10
Figura 516G Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto hiacutebrido 11
Figura 517 Espectro REE se destaca en rojo el triplete de integracioacuten 121
formado despueacutes de la reaccioacuten de Fenton no-cataliacutetico (izq) Espectro simulado
utilizando el programa EPR-WINSIM (der)
Figura 518 Espectro simulado para la formacioacuten del spin aducto [cumarina-
DMPO] utilizando el programa EPR-WINSIM
Figura 519 Voltamogramas ciacuteclicos del par redox correspondiente al anioacuten
superoacutexido tras antildeadir aliacutecuotas del compuesto 1 DMF + HFFTBA 02 M 01 Vs
Figura 520 Graacutefica del paraacutemetro adimensional (Ipa0-Ipa
S Ipa
0) vs concentracioacuten
de sustrato para el compuesto 1 (Destacado en verde el valor de IA50)
Figura 521 Hidrofobicidad relativa de los derivados y la cumarina precursora
Figura 522 Correlacioacuten entre el valor de logD teoacuterico y CAC experimental a
10 microM de cada compuesto El valor logD se obtuvo a traveacutes de la herramienta Marvin
Sketch del software ChemAxon164
Figura 523 Estructura optimizada en 3D para el precursor 1 utilizando DFT
Figura 524 Estructura optimizada en 3D para el derivado 9 utilizando DFT
Figura 525 Estructura optimizada en 3D para el derivado 10 utilizando DFT
xiv
Figura 526 Estructura optimizada en 3D para el derivado 11 utilizando DFT
Figura 61 Esquema de reaccioacuten para un mecanismo concertado de electro-
oxidacioacuten fenoacutelica Adaptacioacuten referencia 118
Figura 62 Esquema de reaccioacuten para estructuras fenoacutelicas mecanismo electro-
oxidativo en etapas
Figura 63 Correlacioacuten entre el potencial de oxidacioacuten Eonset y los ensayos frente a
anioacuten superoacutexido
xv
Tablas
Tabla 51 Paraacutemetros experimentales para los compuestos Determinaciones en VC
2 mM DMF + HFFTBA 02 M
Tabla 52 Constantes de acoplamiento hiperfino para los derivados polifenoacutelicos
Valores en Gauss
Tabla 53 Valores experimentales de Iacutendice ORAC para los compuestos estudiados
Tabla 54 Valores calculados para el factor estequiomeacutetrico n
Tabla 55 Valores experimentales obtenidos para los compuestos en estudio ensayo
FRAP en equivalentes de Trolox10 microM de muestra
Tabla 56 Porcentajes de inactivacioacuten del radical hidroxilo (OHmiddot)
Tabla 57 Valores de IA50 obtenidos para los compuestos estudiados
Tabla 58 Valores obtenidos para la capacidad antioxidante celular (CAC)
concentraciones 1 microM y 10 microM de cada compuesto
Tabla 59 Valores obtenidos para el tiempo de retencioacuten experimental de los
compuestos
Tabla 510 Valores de Iacutendice de Fukui fk para los compuestos en estudio
Tabla 61 Cuadro comparativo de los resultados en la determinacioacuten de capacidad
antioxidante para la cumarina y sus derivados
xvi
Glosario de abreviaturas
ABAP 22-azo-bis(2-amidinopropan)diclorhidrato
ADN Aacutecido desoxiribonucleico
ATCC American Type Culture Collection
HFFTBA Hexafluorofosfato de tetrabutil amonio
CAC Capacidad antioxidante celular
CYP450 Citocromo P450
DBU 18-diazabiciclo[540]undec-7-ano
DCFH-DA 2-(6-oxido-3-oxo-3H-xanten-9-il)benzoato disoacutedico (fluoresceiacutena sal
disoacutedica)
DMF NN-dimetilformamida
DMPO 55-dimetil-1-pirroline-N-oacutexido
DMSO Dimetil sulfoacutexido
DPPHbull Radical 22-difenil-1-picrilhidrazil
Epa Potencial de pico anoacutedico
EPR Electron paramagnetic resonance
ERNs Especies reactivas de nitroacutegeno
EROs Especies reactivas de oxiacutegeno
xvii
fk Iacutendice de Fukui
FRAP Ferric reducing antioxidant in plasma
HObull Radical hidroxilo
IA50 Iacutendice antioxidante 50
Ipa Corriente de pico anoacutedica
O2˙- Anioacuten radical superoacutexido
ONOObull Radical peroxinitrito
ORAC-FL Oxygen radical antioxidant capacity-fluorescein
PBS Buffer fosfato salino
REE Resonancia de espiacuten electroacutenico
RObull Radical alcoxilo
ROOmiddot Radical peroxilo
TPTZ 246-tris(2-piridil)-s-triazina
Trolox 6-hidroxi-2578-tetrametilcroman-2-aacutecido carboxiacutelico
VC Voltametriacutea ciacuteclica
VPD Voltametriacutea de pulso diferencial
xviii
RESUMEN
Las cumarinas (2H-1-benzopiran-2-ona) son estructuras quiacutemicas presentes en
especies vegetales ampliamente distribuidas en la naturaleza con una reconocida
actividad bioloacutegica entre las que destacan sus propiedades antioxidantes
En el presente trabajo de Tesis se describe la siacutentesis de derivados polifenoacutelicos La
cumarina dihidroxilada como estructura de partida fue esterificada con distintos
aacutecidos orgaacutenicos polifenoacutelicos (Figura 1) Se estudioacute su electro-oxidacioacuten y se evaluoacute
su actividad antioxidante frente a especies reactivas de oxiacutegeno por medio de diversas
metodologiacuteas in vitro
Figura 1 Esquema de los compuestos estudiados
Se estudioacute el comportamiento anoacutedico de los compuestos mediante voltametriacutea
ciacuteclica (VC) y voltametriacutea de pulso diferencial (VPD) en medio aproacutetico como una
aproximacioacuten a los procesos redox que ocurren en membranas bioloacutegicas
Se determinoacute la presencia de especies radicalarias en el proceso electro-oxidativo a
traveacutes de la teacutecnica de resonancia de espiacuten electroacutenico (REE) Las constantes de
OOH
HO O
Cl
HO
OOH
OH
OH
OH
HO
O
OH
OH
OH
HO
OO
OHHO O
OH
OH
O
O
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
xix
acoplamiento hiperfino junto con caacutelculos teoacutericos (iacutendice de Fukui) permitieron
discriminar distintos sitios reactivos en las nuevas moleacuteculas donde se desarrolla el
proceso oxidativo
Ademaacutes se evaluoacute la capacidad antioxidante de los compuestos a traveacutes de los
ensayos capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno-fluoresceiacutena (ORAC-
FL) capacidad antioxidante reductora de hierro (FRAP) apagamiento del radical
hidroxilo mediante spin trapping inactivacioacuten de anioacuten superoacutexido y capacidad
antioxidante celular (CAC) en un modelo bioloacutegico in vitro simple
Para los ensayos antioxidantes no bioloacutegicos la introduccioacuten de las distintas
estructuras fenoacutelicas en el anillo cumariacutenico permite obtener derivados que presentan
una capacidad antioxidante mejor que el precursor cumariacutenico inicial Se establecioacute
la respectiva correlacioacuten entre el potencial de inicio del proceso electroquiacutemico
(potencial onset) y los resultados encontrados en el ensayo en medio aproacutetico frente a
anioacuten superoacutexido
Considerando el ensayo bioloacutegico de capacidad antioxidante celular eacuteste sugiere que
la actividad antioxidante de los nuevos derivados estaacute circunscrita a medios de
naturaleza lipofiacutelica
xx
SUMMARY
Coumarins (2H-1-benzopyran-2-one) are chemical structures from vegetal sources
widely distributed in vegetable species with recognized biological activities among
which their antioxidant capacity
In this Thesis work the syntheses of coumarin polyphenolic derivatives is described
Coumarin was the starter scaffold and it was sterified with different organic phenolic
acids The electro-oxidation of polyphenolic derivatives is studied and their
antioxidant capacity towards ROS through methodologies in vitro is evaluated
Figure 1 Scheme of studied compounds
The anodic behavior of the compounds by cyclic voltammetry (CV) and differential
pulse voltammetry (VPD) was studied in aprotic medium as an approximation to the
redox processes in biological membranes
The presence of radical species is determined in the electro-oxidation process through
the technique electron spin resonance (ESR)The hyperfine coupling constants and
theoretical calculations (Fukui index values) allow to discriminate between the
OOH
HO O
Cl
HO
OOH
OH
OH
OH
HO
O
OH
OH
OH
HO
OO
OHHO O
OH
OH
O
O
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
xxi
different reactive sites in the new molecules where the oxidative process is taking
place
Moreover antioxidant capacity of derivatives was evaluated through oxygen radical
antioxidant assay-fluorescein (ORAC-FL) ferric reducing ability of plasma (FRAP)
spin trapping superoxide scavenging assays and cellular antioxidant (CAC) in a
simple biological model in vitro
In the non-biological antioxidant assays the addition of various phenolic structures to
the coumarin scaffold yielded derivatives with improved antioxidant capacity related
to initial coumarin We studied the correlations between the starting potential of the
electrochemical process (onset potential) and the antioxidant results obtained in
aprotic media against superoxide anion
In regard to the biological cellular antioxidant capacity assay it suggests that the
antioxidant activity of new derivatives could be limited to lipophilic media
Introduccioacuten
1
1 Introduccioacuten
11 Cumarinas
111 Origen vegetal
Las cumarinas son una familia de compuestos cuya estructura baacutesica corresponde a la
lactona heterociacuteclica 2H-1-benzopiran-2-ona (Figura 11) En el reino vegetal estaacuten
ampliamente distribuidas habieacutendose identificado en la actualidad maacutes de 1800
cumarinas de origen natural1 eacutestas se encuentran principalmente como metabolitos
secundarios en diversas plantas tanto en sus semillas como en hojas y raiacuteces2 Su
biosiacutentesis es descrita por distintos autores como una serie de procesos catalizados
por enzimas presentes en la estructura CYP450 (citocromo P450) en algunos casos
estos compuestos son generados en la ceacutelula vegetal como una viacutea de defensa
(fitoalexinas como la escopoletina) frente a estiacutemulos de estreacutes y la presencia de fito-
patoacutegenos34
O O
3
45
6
7
81
2
Figura 11 Estructura de la 2H-1-benzopiran-2-ona (cumarina)
Introduccioacuten
2
El nombre de estos compuestos se deriva de la palabra ldquocoumarourdquo vocablo
caribentildeo que hace referencia al aacuterbol de Tonka originario de Sudameacuterica de cuya
semilla A Vogel logra aislar el compuesto y publicar su hallazgo en 18205b
A partir
de entonces el intereacutes por su caracterizacioacuten6 la obtencioacuten tanto desde fuentes
naturales7 como por rutas sinteacuteticas de la cumarina y sus derivados ha ido en
aumento encontrando su primera aplicacioacuten en la fabricacioacuten de perfumes En 1868
W H Perkin propuso la siacutentesis de una fragancia vegetal a partir de la sal soacutedica del
orto-hidroxibenzaldehiacutedo y anhiacutedrido aceacutetico obteniendo el mismo producto aislado
de la semilla de Tonka5 8(ac)
Se han estudiado los aspectos taxonoacutemicos en cuanto a la clasificacioacuten de las especies
vegetales que contienen compuestos cumariacutenicos se estima que las principales
familias donde se encuentran estos derivados son Umbelliferae Rutaceae
Leguminosae Compositae Caryopgillaceae Euphorbiaceae Hipocastanaceae
Oleaceae Thymelaeaceae8b
112 Rutas de siacutentesis
Los autores Sethna y Narsinh9 presentaron en 1944 una de las primeras revisiones del
estado del arte con respecto a la siacutentesis de cumarinas En ella se encuentran las
principales metodologiacuteas claacutesicas de obtencioacuten como la siacutentesis de Perkin
Pechmann10
y Pechmann-Duisberg11
(Figura 12) en la que se obtiene la cumarina al
Introduccioacuten
3
condensar un fenol con un β-cetoester en medio aacutecido Diversas publicaciones
plantean modificaciones a esta ruta con catalizadores12 (ab)
libre de solventes13 (ab)
con promotores aacutecidos14
asistida por microondas15
entre otras
Figura 12 Esquema general de la reaccioacuten de Pechmann
Otra metodologiacutea empleada es la de Knoevenagel16
propuesta en 1898 Consiste en
una reaccioacuten de condensacioacuten entre o-hidroxialdehiacutedos con malonato de etilo
acetoacetato de etilo o cianoacetato de etilo en medio baacutesico (piridina o piperidina)
Los autores Bigi y colaboradores17
describen el uso de un catalizador en base a
montmorillonita para la obtencioacuten de cumarinas sustituidas en posicioacuten 3 con un
grupo aacutecido Posteriormente otro grupo de trabajo (Shaabani 2009) llevoacute a cabo esta
condensacioacuten empleando radiacioacuten de microondas lo que les permitioacute obtener buenos
rendimientos en un medio ldquoamigablerdquo con el ambiente18
Se han descrito otras metodologiacuteas sinteacuteticas en las cuales se utilizan las reacciones
claacutesicas de Wittig19 ab
y Reformatsky20
ademaacutes de otras rutas con variantes tanto en
los reactivos como en el medio de reaccioacuten que permiten la obtencioacuten de derivados
OH
+
OEt
O O H2SO4
O O
Introduccioacuten
4
cumariacutenicos como la siacutentesis en presencia de bases fuertes21
reacciones libres de
solventes22
y la obtencioacuten de cumarinas policiacuteclicas utilizando compuestos
organometaacutelicos descrita por Harvey y cols23
113 Principales aplicaciones
Tras ser aisladas desde su fuente vegetal y como resultado de investigaciones
posteriores dirigidas a generar rutas sinteacuteticas viables las cumarinas han sido objeto
de numerosos estudios enfocados en la buacutesqueda de sus aplicaciones Es asiacute como en
la literatura se pueden encontrar las maacutes diversas investigaciones para este tipo de
compuestos provenientes tanto de productos de siacutentesis o como extractos de
vegetales y plantas con reconocidas propiedades en la medicina tradicional esto da
origen al estudio de sus bio-aplicaciones entre las que se destaca su capacidad como
antioxidante
A Actividad bioloacutegica
La primera aplicacioacuten en bio-medicina descrita para las cumarinas fue como
anticoagulante desde que se aislara y caracterizara el dicumarol 33rsquo-metilenbis(4-
hidroxicumarina) (Figura 13) Posteriormente aparece en el mercado su derivado
Introduccioacuten
5
sinteacutetico conocido como Warfarina que hasta la deacutecada pasada era considerado uno
de los faacutermacos anticoagulantes maacutes vendidos en Estados Unidos24 a-c
OOOO
OH HO
Figura 13 Estructura de la 33rsquo-metilenbis(4-hidroxicumarina) o dicumarol
Con posterioridad el uso de las cumarinas se ha diversificado hacia innumerables
blancos terapeacuteuticos En la literatura se describen variados estudios con respecto a sus
propiedades farmacoloacutegicas25ab
Su capacidad como agente antitumoral 26ab
se ha
estudiado en compuestos provenientes tanto de fuentes vegetales como sinteacuteticas
Riveiro ME y cols estudiaron el efecto de la 78-OH-4-metilcumarina en ceacutelulas
humanas afectadas por leucemia evidenciando el potencial que presentoacute este
derivado dihidroxilado27
En otra investigacioacuten realizada por C Ito y colaboradores
aislaron tres derivados cumariacutenicos de la especie vegetal Murraya siamensis cuyos
ensayos frente a ceacutelulas tumorales resultaron promisorios28
Con respecto a las propiedades antiinflamatorias de las cumarinas en la naturaleza se
encuentran especies como la Chamomilla recutita (manzanilla) que contiene un tipo
Introduccioacuten
6
de umbeliferona con tales propiedades En la literatura se encuentran derivados
sinteacuteticos desarrollados en cuya estructura estaacute presente el esqueleto cumariacutenico29
Lin y cols presentan los resultados de su estudio de la capacidad antiinflamatoria de
un conjunto de cumarinas los cuales fueron ademaacutes correlacionados con los
obtenidos para el apagamiento del radical hidroxilo30
HA El-Wahab y cols sintetizaron distintas tiazolo-cumarinas hiacutebridas y estudiaron
una de sus propiedades farmacoloacutegicas como agente antimicrobiano Estos
compuestos posteriormente fueron aplicados como aditivos en recubrimientos de
poliuretano confirieacutendoles tambieacuten esta propiedad microbicida a las superficies en
las que se utilizoacute31
Tambieacuten se han descrito derivados cumariacutenicos con propiedades anti-fuacutengicas 32ab
Un trabajo reciente presenta el estudio de complejos en base a Ni(II) Cu(II) y
Co(II)frente a distintas especies de hongos (Candida A niger Rhizopus)32c
Tambieacuten se han encontrado estructuras cumarina-glucoacutesidos provenientes de especies
vegetales (Hydrangea paniculata) que presentan propiedades hepatoprotectoras33
Otros estudios sentildealan tambieacuten la importancia de las estructuras cumariacutenicas como
compuesto antiviral analgeacutesico anti-tromboacutetico ulcerogeacutenico 25 34-36
inclusive con
potencial para ser usadas en terapias frente al VIH como lo sentildeala la investigacioacuten
sobre especies vegetales que contienen dipiranocumarin - calanolideos como
Introduccioacuten
7
principio activo25a
estudios que tambieacuten se han realizado con derivados de siacutentesis
disentildeados a partir de la estructura de origen vegetal (Lomatium suksdorfii) conocida
como suksdorfina (Figura 14) a partir de la cual se han generado compuestos
anaacutelogos con el objeto de estudiar su modo de accioacuten y obtener sustratos cada vez
maacutes potentes frente a la enfermedad (Yu D y cols 2003)37
O OO
O
O
OO
Figura 14 Estructura de la suksdorfina
B Propiedades antioxidantes
El equilibrio en los organismos vivos es funcioacuten de diversos factores entre ellos cabe
mencionar el balance de las especies que generan estreacutes oxidativo dentro del medio
celular estas especies pueden ser de origen endoacutegeno como las provenientes de la
cadena transportadora de electrones enzimas oxidantes ceacutelulas fagociacuteticas o de
origen exoacutegeno como sustancias reductoras oxidacioacuten de drogas tabaquismo
ultrasonido luz solar etc Entre los compuestos que generan estreacutes conocidos como
Introduccioacuten
8
EROs y ERNs (especies reactivas de oxiacutegenonitroacutegeno) se pueden mencionar el
anioacuten superoacutexido (O2˙-) peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2) radical peroxilo (ROObull) y
alcoxilo (RObull) radical hidroxilo (HObull) oacutexido niacutetrico (NObull) peroxinitrito (ONOObull)
entre otras
Dentro de este contexto en la literatura se ha descrito el potencial que poseen las
cumarinas y sus derivados como compuestos capaces de interaccionar con especies
reactivas de oxiacutegeno y nitroacutegeno lo que da cuenta de su capacidad antioxidante tema
relevante si se considera que parte importante de las patologiacuteas conocidas y
estudiadas en la actualidad a nivel mundial estaacuten iacutentimamente ligadas a cuadros de
estreacutes oxidativo presentes en el organismo 38 39
Payaacute y colaboradores presentaron un trabajo en el cual se estudia la reactividad de un
conjunto de dieciseacuteis cumarinas (naturales y sinteacuteticas) frente al radical hidroxilo
aacutecido hipocloroso y anioacuten superoacutexido encontrando que los derivados di-hidroxilados
poseiacutean mejores propiedades que aquellos mono-hidroxilados o sin sustitucioacuten40
Estos resultados se complementan con una publicacioacuten posterior del mismo grupo en
que se profundiza el estudio anterior sentildealando las propiedades terapeacuteuticas de los
derivados cumariacutenicos34
El derivado conocido como esculetina (67-dihidroxicumarina) fue ensayado frente al
radical DPPH junto con ensayos de estreacutes oxidativo en medios de cultivo celular
Introduccioacuten
9
estos autores sentildealan la importancia de los grupos catecol en su capacidad de atrapar
especies radicales (Kim y cols 2008)41
Otro estudio en el que se ensaya un extracto
vegetal (Cortex Fraxini) relaciona ademaacutes la capacidad antioxidante de las o-
dihidroxi cumarinas con su capacidad reductora42
Zhang y cols presentan un estudio reciente en el cual cumarinas dihidroxiladas en
posicioacuten 7 y 8 entre otros derivados poseen importante bio-actividad in vitro los
compuestos fueron ensayados frente a especies radicales en ceacutelulas tumorales
presentaron ademaacutes actividad como antiinflamatorios y baja toxicidad tanto en
ceacutelulas sanguiacuteneas de vertebrado como de invertebrado Junto con lo anterior se
realizoacute un anaacutelisis de estructura-reactividad correlacionando la capacidad de
apagamiento de radicales con las propiedades antiinflamatorias y antitumorales de los
derivados cumariacutenicos encontradas en esta investigacioacuten43
12 Compuestos polifenoacutelicos
121 Origen vegetal
Los polifenoles al igual que las cumarinas son una amplia familia de compuestos (se
han encontrado maacutes de 8000 de ellos) presentes en estructuras vegetales como
metabolitos secundarios cumpliendo roles tales como protector frente a radiacioacuten
UV reguladores de los ciclos de crecimiento pigmentacioacuten y defensa frente a
Introduccioacuten
10
depredadores Su estructura baacutesica es el anillo benceacutenico con sustituyentes hidroxilo
(-OH) en distintas posiciones Se clasifican en flavonoides aacutecidos fenoacutelicos
(hidroxicinaacutemicos e hidroxibenzoicos) taninos estilbenos Debido a sus interesantes
propiedades y bio-aplicaciones estos fitoquiacutemicos han sido objeto de diversos
estudios investigacioacuten y caracterizacioacuten44-46
Estos compuestos son un constituyente importante de la dieta diaria se encuentran en
forma abundante en diversos frutos como por ejemplo berries manzana mango uva
pera granada y ciacutetricos en bebidas como el vino teacute y cafeacute 47
en vegetales cereales
y semillas Junto con lo anterior se ha descrito la utilizacioacuten de aacutecidos polifenoacutelicos
provenientes de extractos vegetales y aceites esenciales como aditivos en la industria
alimentaria aplicados como preservantes naturales en reemplazo de aquellos de
origen sinteacutetico debido a las propiedades antimicrobianas que exhiben48
122 Actividad bioloacutegica
Estos compuestos se conocen tambieacuten como ldquobiofenolesrdquo (Romeo y Uccella 1996)
haciendo referencia a aquellos provenientes de fuentes naturales Las primeras
publicaciones sobre los polifenoles en general comenzaron en la deacutecada de 1950 con
la investigacioacuten de D Harman y su teoriacutea del envejecimiento y los radicales libres
estudios en los que se planteoacute prolongar la sobrevida en especies roedores enfermos a
traveacutes de la ingesta de biofenoles presentes en su dieta Es asiacute que el nuacutemero de
publicaciones concernientes al tema se incrementoacute de una treintena (entre 1900 y
Introduccioacuten
11
1950) hasta superar las 35000 publicaciones entre los antildeos 2000-2010 lo que da
cuenta del creciente intereacutes en este toacutepico49
La bio-actividad de los compuestos polifenoacutelicos es amplia se encuentran diversos
estudios como el citado anteriormente con respecto a las capacidades antimicrobianas
de los polifenoles y su uso en la industria alimentaria5051
Compuestos como la
curcumina resveratrol quercetina y derivados del aacutecido gaacutelico se enumeran dentro de
las investigaciones realizadas tanto in vitro e in vivo en la prevencioacuten del caacutencer
(Cimino y cols 2012)52
Otras propiedades descritas para estos compuestos son como cardio-protectores anti-
canceriacutegenos antiinflamatorios vaso-relajantes entre otras como lo resume el
artiacuteculo de Xia y cols (2010) En eacutel ademaacutes se presenta una revisioacuten en cuanto a los
meacutetodos de extraccioacuten purificacioacuten y caracterizacioacuten del contenido y tipos de
polifenoles especiacuteficamente en el caso de la uva fruto reconocido por su alto
contenido de fitoquiacutemicos y nutrientes53
123 Polifenoles como antioxidantes
Los polifenoles como micronutrientes presentes en los alimentos y otras estructuras
vegetales han sido un foco de intereacutes ya que sus aplicaciones terapeacuteuticas estaacuten
relacionadas con su reconocida e investigada capacidad antioxidante y quelante de
metales Con respecto a esta uacuteltima cabe mencionar la revisioacuten del estado del arte
Introduccioacuten
12
realizada por Kozlowski y cols con respecto al desbalance de Cu Zn y Fe en el
organismo en ella se indica que la presencia libre y en exceso de estos metales estaacute
directamente relacionada con patologiacuteas neurodegenerativas y caacutencer entre otras ya
que su actividad redox genera especies reactivas capaces de atacar sustratos orgaacutenicos
como la membrana lipiacutedica proteiacutenas y aacutecido desoxiribonucleico (ADN)54
Ribeiro y colaboradores presentan un estudio en el que se determina el contenido
polifenoacutelico de la especie Fistulina hepaacutetica Los extractos se ensayaron frente a
DPPH anioacuten superoacutexido radical hidroxilo y aacutecido hipocloroso Los autores plantean
que considerando los resultados obtenidos esta especie fuacutengica podriacutea tener
aplicacioacuten como suplemento o como antioxidante en la industria alimentaria55
Estudios realizados con aacutecido taacutenico comercial sentildealan que su capacidad como
antioxidante y como quelante de hierro da cuenta del potencial que tiene este aacutecido
ademaacutes como anti-mutageacutenico y anti-carcinogeacutenico Los autores indican posibilidad
de que este aacutecido el cual presenta baja toxicidad contribuye en el apagamiento de
especies reactivas de oxiacutegeno dantildeinas a nivel de ADN (Andrade y cols 2006)56
trabajo que se complementa con una publicacioacuten anterior del mismo grupo donde se
estudioacute el apagamiento del radical OHbull mediante complejos de aacutecido taacutenico-Cu
(Andrade y cols 2005)57
Los aacutecidos hidroxicinaacutemicos e hidroxibenzoicos han sido tambieacuten objeto de estudio
debido a su capacidad antioxidante58-61
Jeong y colaboradores estudiaron el extracto
de la especie vegetal Erigeron annuus el cual contiene aacutecido cafeico en su fraccioacuten
Introduccioacuten
13
butanoacutelica este extracto fue ensayado como agente neuro-protector y antioxidante en
ceacutelulas nerviosas Frente a los resultados obtenidos los autores concluyen que este
extracto podriacutea ser utilizado en terapias frente a patologiacuteas neurodegenerativas como
el Alzheimer62
Otro estudio de capacidad antioxidante realizado a un grupo de
compuestos polifenoacutelicos presentes en el propoacuteleo (aacutecido cafeico aacutecido feruacutelico
ferulato de etilo eacutester fenetiacutelico del aacutecido cafeico) sentildeala que los grupos catecol
presentes en las estructuras ensayadas incrementan la capacidad antioxidante
mientras que en estudios relacionados con bio-membranas se debe tener en cuenta
ademaacutes la hidrofobicidad que presenten los compuestos63
13 Compuestos hiacutebridos
Al considerar que las diversas enfermedades que afectan al ser humano (caacutencer
diabetes enfermedades neurodegenerativas artritis entre otras) involucran diferentes
factores patogeacutenicos se han desarrollado estrategias sinteacuteticas que permiten obtener
nuevos faacutermacos de naturaleza hiacutebrida los cuales incorporan en su estructura
distintos ingredientes activos64
Este disentildeo ldquomulti-blancordquo ha permitido que los
nuevos faacutermacos actuacuteen en distintos blancos terapeacuteuticos este tipo de terapias
implica una disminucioacuten en los problemas asociados a una multi-dosificacioacuten las
interacciones entre distintos medicamentos una disminucioacuten en la resistencia a los
faacutermacos (en el caso de enfermedades de origen microbiano) disminucioacuten en los
efectos adversos derivados de la dosificacioacuten muacuteltiple por mencionar algunos
Introduccioacuten
14
Diversas investigaciones sobre el tema dan cuenta de la relevancia que ha tenido esta
estrategia y el disentildeo racional de nuevos medicamentos65-68
La revisioacuten realizada por
los autores Mehta y Singh (2002) menciona algunos de los esqueletos que han dado
origen a estructuras hiacutebridas entre ellas esteroides antraciclinas β-lactamas
fullerenos carbohidratos-peacuteptidos En esta revisioacuten se indica el uso de este tipo de
compuestos en terapias contra el caacutencer y como neuro-protectores69
En el caso de la malaria una de las enfermedades infecciosas maacutes complejas a nivel
mundial la resistencia del paraacutesito del geacutenero Plasmodium frente a los faacutermacos
empleados (cloroquina principalmente) ha sido un tema de estudio durante antildeos Una
resentildea de este desafiacuteo se presenta en el artiacuteculo de Kouznetsov y Goacutemez-Barrio
(2009) en el que se sentildeala la siacutentesis de derivados de aminoquinolina como las
trioxaquinas70
las cuales se presentan posteriormente en una revisioacuten realizada por
Chauhan y colaboradores en ella se destaca a estos hiacutebridos como candidatos
promisorios para la formulacioacuten de nuevas drogas antimalaacutericas71
Otra patologiacutea en la que se ha utilizado faacutermacos de naturaleza hiacutebrida que en
algunos casos provienen de productos naturales es el caacutencer72
Allen y
colaboradores73
mencionan en una reciente revisioacuten de tecnologiacuteas avanzadas en las
que ademaacutes de utilizar la estrategia de compuestos hiacutebridos con dos estructuras de
propiedades anticanceriacutegenas eacutestos se combinan con nano-estructuras orientadas a
Introduccioacuten
15
blancos especiacuteficos para asiacute disminuir el riesgo de efectos colaterales en el
tratamiento de esta compleja patologiacutea
Este concepto y disentildeo de faacutermacos multi-blanco se ha aplicado ademaacutes en distintas
terapias frente a enfermedades como el Alzheimer74
en vacunas de amplio espectro
frente al coacutelera75
en la siacutentesis de compuestos antiparasitarios76
y de dihidropiridinas
las cuales poseen actividad vasodilatadora77
por mencionar algunos ejemplos
131 Cumarinas como estructuras hiacutebridas
Al considerar el estado del arte con respecto a la amplia y variada actividad bioloacutegica
que presentan los derivados cumariacutenicos se encuentra que otra de las aplicaciones que
se ha estudiado para esta familia de compuestos es su capacidad para formar parte de
estructuras hiacutebridas complejas compuestos orientados a la obtencioacuten faacutermacos multi-
blanco que den respuesta a los interrogantes y desafiacuteos actuales con respecto a
importantes patologiacuteas y sus terapias 78
En la literatura se describen ejemplos de estructuras cumariacutenicas hiacutebridas no soacutelo de
origen sinteacutetico sino que tambieacuten se pueden extraer desde su fuente natural Un
estudio realizado en hojas y ramas de la especie Gnidia socotrana (originaria de
Yemen) da cuenta de la presencia de estructuras flavona-cumarina las que fueron
extraiacutedas purificadas y caracterizadas79
(Figura 15)
Introduccioacuten
16
O
OH
HO O
OH
O
O
OH
Figura 15 Estructura del hiacutebrido cumarina-flavona aislado de su fuente vegetal
Gnidia socotrana
Entre los compuestos antibioacuteticos de origen natural que poseen el esqueleto
cumariacutenico en su estructura se encuentran la novobiocina (Figura 16) clorobiocina y
cumermicina Presentes como metabolitos secundarios en la especie Streptomyces
estos derivados deben su actividad antibioacutetica a que actuacutean inhibiendo la enzima
ADN girasa presente en bacterias impidiendo su replicacioacuten y ademaacutes genera su
muerte celular80
O
HN
OH
O
OH
O
O
MeOO
H2N
HO
Figura 16 Estructura del antibioacutetico hiacutebrido novobiocina metabolitos secundarios
en la especie Streptomyces
Introduccioacuten
17
Se ha descrito tambieacuten la capacidad antitumoral de derivados cumarina-resveratrol a
partir del precursor 7-hidroxicumarina En la publicacioacuten de Belluti y colaboradores
se presentan los ensayos realizados para 10 compuestos los cuales tuvieron como
objeto ceacutelulas tumorales de pulmoacuten humano dos de los hiacutebridos presentaron
resultados promisorios como antitumorales y pro-apoptoacuteticos comportamiento que
los autores concluyen tiene relacioacuten con la posicioacuten de los sustituyentes en la
moleacutecula81
La revisioacuten bibliograacutefica de Longhin y colaboradores describe diversas estructuras
hiacutebridas desarrolladas que cuentan con capacidad antiinflamatoria toacutepico de intereacutes si
se considera que los cuadros inflamatorios estaacuten relacionados a dolencias como el
Alzheimer asma arterioesclerosis artritis reumatoide caacutencer etc En este trabajo se
sentildeala al hiacutebrido cumarina-aacutecido lipoico donde ambas estructuras poseen ademaacutes
reconocida capacidad antioxidante y el aacutecido unido a la cumarina en posicioacuten 3
mediante un espaciador es la estructura que se describe con una actividad superior al
conocido y utilizado faacutermaco indometacina82
Junto con los estudios descritos otra importante aacuterea de investigacioacuten ha sido el
desarrollo de estructuras hiacutebridas con capacidad antioxidante (Koufaki 2006)83
actividad que permite en muchos casos restablecer el equilibrio en organismos vivos
frente al exceso de especies generadoras de estreacutes oxidativo cuadro que como ya se
Introduccioacuten
18
mencionoacute estaacute con frecuencia asociado las patologiacuteas conocidas y estudiadas en la
actualidad
El reciente estudio desarrollado por Matos Olea-Azar y colaboradores presenta la
estructura cumarina-resveratrol y diferentes derivados sinteacuteticos los cuales fueron
estudiados mediante diversas teacutecnicas in vitro como resonancia de espiacuten electroacutenico
(REE) capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno (ORAC-FL) y
voltametriacutea ciacuteclica (VC) En esta investigacioacuten se encontroacute que los compuestos
propuestos poseen una buena capacidad antioxidante84
Una investigacioacuten que da cuenta del potencial que posee esta estrategia es la
desarrollada por Kenchappa y colaboradores quienes sintetizaron derivados
cumariacutenicos unidos a pirazol e indenona posteriormente mediante estudios in vitro e
in vivo obtuvieron resultados de su capacidad antioxidante y ademaacutes como agentes
anti-hipergliceacutemicos en un modelo animal proyectaacutendolos como posibles faacutermacos
frente a la diabetes85
Dentro del mismo esquema Krishan y colaboradores
desarrollaron una serie de cumarinas unidas al benzoimidazol el cual es a su vez una
estructura con muacuteltiple y reconocida actividad bioloacutegica proponen a dos compuestos
de la serie como derivados con una buena capacidad antioxidante y anti-inflamatoria
a nivel de mucosa gaacutestrica86
Introduccioacuten
19
Un tipo de derivado hiacutebrido que ha sido estudiado es la cumarina-chalcona El trabajo
realizado por Xi y Liu presenta la siacutentesis de una serie de compuestos (Figura 17)
los que posteriormente son ensayados por distintas metodologiacuteas de determinacioacuten de
capacidad antioxidante concluyendo que estos hiacutebridos son estructuras promisorias
en los que el grupo catecol presente en el esqueleto cumariacutenico o en la chalcona es
capaz de inhibir distintos procesos oxidativos a nivel de ADN87
O O
OH
O
R1
R2
R3
Figura 17 Hiacutebridos chalcona-cumarina con capacidad antioxidante
Peacuterez-Cruz y colaboradores describen el disentildeo siacutentesis y estudio de la capacidad
antioxidante de derivados cumarina-chalcona los que presentaron buena reactividad
frente a distintas especies radicales y capacidad cito-protectora en un modelo celular
animal88
En los estudios mencionados se evidencia el continuo desarrollo que ha tenido el
disentildeo y siacutentesis de compuestos hiacutebridos como nuevos faacutermacos frente a complejas
Introduccioacuten
20
enfermedades multifactoriales Esta tendencia vigente en la actualidad se extiende a
los maacutes variados nuacutecleos estructurales entre ellos la cumarina Este heterociclo
clasificado por algunos autores como ldquoestructura privilegiadardquo debido a la amplia
gama de compuestos que se originan a partir de eacutel es el punto de partida para
diversas propuestas sinteacuteticas enfocadas a generar un producto que posea muacuteltiples
actividades bioloacutegicas de intereacutes terapeacuteutico
Hipoacutetesis y objetivos
21
2 Hipoacutetesis
Los compuestos hidroxicumariacutenicos exhiben conocidas e interesantes propiedades
antioxidantes
Al sustituir la cumarina con los compuestos aacutecido cafeico aacutecido gaacutelico y aacutecido
protocateacutequico se obtienen derivados de naturaleza hiacutebrida aumentando la actividad
de la cumarina frente a las especies reactivas de oxiacutegeno anioacuten superoacutexido radical
hidroxilo radical peroxilo y su capacidad reductora
3 Objetivos
31 Objetivos generales
- Evaluar el comportamiento electroquiacutemico oxidativo de los derivados
cumariacutenicos previamente sintetizados y caracterizados fiacutesicamente
- Evaluar la capacidad antioxidante de los nuevos compuestos derivados de
cumarina y aacutecidos benzoicos frente a distintas especies radicales mediante
diversas teacutecnicas in vitro
Hipoacutetesis y objetivos
22
32 Objetivos especiacuteficos
Objetivos en siacutentesis
- Sintetizar y caracterizar el compuesto precursor 4-clorometil-78-
dihidroxicumarina y los correspondientes derivados de la sustitucioacuten en posicioacuten-
4 con aacutecido cafeico aacutecido gaacutelico y aacutecido 34-dihidroxibenzoico
Objetivos en electroquiacutemica
- Realizar la caracterizacioacuten anoacutedica en medio aproacutetico (NN-dimetilformamida
DMF) de los compuestos por voltametriacutea ciacuteclica (VC) voltametriacutea de pulso
diferencial (VPD)
Objetivos en la determinacioacuten de capacidad antioxidante
- Estudiar la reactividad de los compuestos frente al anioacuten radical superoacutexido O2-
utilizando como teacutecnica voltametriacutea ciacuteclica
- Determinar la reactividad de los compuestos frente al radical peroxilo (ROObull)
obteniendo su iacutendice ORAC-FL
- Determinar la capacidad reductora de hierro (Fe3+
) de los compuestos a traveacutes de
la teacutecnica FRAP
- Estudiar la reactividad frente al radical OHbull mediante la teacutecnica spin trapping
utilizando espectroscopiacutea de resonancia de espin electroacutenica (REE)
Hipoacutetesis y objetivos
23
- Evaluar la capacidad antioxidante celular de los compuestos
- Establecer la existencia de correlacioacuten entre paraacutemetros fisicoquiacutemicos de los
compuestos y su actividad antioxidante
Materiales y meacutetodos
24
4 Materiales y meacutetodos
41 Materiales
411 Reactivos y equipamiento utilizado en siacutentesis
Reactivos
- Aacutecido 34-dihidroxicinaacutemico Merck
- Aacutecido 34- dihidroxibenzoico Sigma-Aldrich
- Aacutecido 345-trihidroxibenzoico Sigma-Aldrich
- Pirogalol Merck
- 4-cloro acetoacetato de etilo Sigma-Aldrich
- NN-dimetilformamida PA J T Baker
- 18-diazabiciclo[540]undec-7-ano (DBU) Sigma-Aldrich
- Carbonato aacutecido de sodio Merck
- Metanol PA JT Baker
- Acetona PA Merck
- Etanol PA Merck
- Cloroformo PA Merck
- Aacutecido sulfuacuterico 98 Merck
- Aacutecido clorhiacutedrico 37 JTBaker
- Anhiacutedrido aceacutetico Merck
- Hidroacutexido de sodio PA Merck
- Solucioacuten etanoacutelica de FeCl3
Materiales y meacutetodos
25
- Acetona d6 Sigma-Aldrich
- Dimetilsulfoacutexido d6 Sigma-Aldrich
- Cloroformo d6 Sigma-Aldrich
- Nitroacutegeno extra puro 99995 Linde Gas Chile SA
Equipamiento
Todo el material de vidrio utilizado fue clase A
- Balanza analiacutetica Precisa 125 A
- Rotavapor Heidolph VV 2000
- Sonicador Elme Transsonic Digital tipo T480H-2
- Agitador magneacutetico placa calefactora Heidolph MR 3002
- Estufa de secado al vaciacuteo Heraeus
412 Reactivos y equipamiento utilizados en electroquiacutemica
Reactivos
- NN-dimetilformamida (DMF) PA Merck
- Hexafluorofosfato de tetrabutil amonio (HFFTBA) Sigma-Aldrich
- Aacutecido 34-dihidroxicinaacutemico Merck
- Aacutecido 34- dihidroxibenzoico Sigma-Aldrich
- Aacutecido 345-trihidroxibenzoico Sigma-Aldrich
- Nitroacutegeno extra puro 99995 Linde Gas Chile SA
Materiales y meacutetodos
26
- Agua purificada (MilliQ) Millipore Merck
Equipamiento
- Estacioacuten de trabajo electroquiacutemica CH Instruments CHI 760c
- Electrodo de carbono viacutetreo CH Instruments d = 3 mm
- Alambre de platino
- Electrodo de referencia AgAgCl (KCl 3 M) CH Instruments
- Aluacutemina 03 μM y 005 μM Buheler
- Balanza analiacutetica Precisa 40SM-200ordf
413 Reactivos y equipamiento utilizados en ensayos frente a especies
radicalarias
Reactivos
- 2-(6-oacutexido-3-oxo-3H-xanten-9-il)benzoato disoacutedico (fluoresceiacutena sal
disoacutedica) Sigma-Aldrich
- 22-azo-bis(2-amidinopropan)diclorhidrato (ABAP) Sigma-Aldrich
- 246-tris(2-piridil)-s-triazina (TPTZ) Sigma Aldrich
- 6-hidroxi-2578-tetrametilcroman-2-aacutecido carboxiacutelico (Trolox) Sigma-
Aldrich
- Peroacutexido de hidroacutegeno al 30
- NN-dimetilformamida PA Sigma-Aldrich
- 55-dimetil-1-pirroline-N-oacutexido (DMPO)
- Acetato de sodio Merck
Materiales y meacutetodos
27
- Tricloruro de hierro (FeCl3) Sigma Aldrich
- Hidroacutexido de sodio Merck
- Fosfato diaacutecido de potasio Merck
- Etanol grado HPLC Merck
- Aacutecido aceacutetico glacial Merck
- N-octanol Merck
- Cloruro de zinc Merck
Equipamiento
- Balanza Precisa 40SM-200ordf
- Lector de microplacas con detector muacuteltiple Synergytrade HT Bio-Tek
Instruments Inc (Winooski VT USA)
- Espectroacutemetro ECS 106 de banda X (985 GHz) equipado con cavidad
rectangular y 50 KHz de modulacioacuten de campo (Bruker Coventry UK)
- WINSIM Software EPR Spectral Simulation for MS-Windows 9x NT
Version 098 copy PEST Public EPR Simulation Tools NIEHS USA
- Alambre de platino
- Espectrofotoacutemetro UV-Visible Specord S600 Analytik Jena
- Equipo generacioacuten agua ultrapura NanoPure Barnstead
Materiales y meacutetodos
28
42 Meacutetodo
421 Procedimientos de siacutentesis
En un primer paso se obtuvo el precursor 4-clorometil-78-dihidroxicumarina
mediante la siacutentesis de Pechmann posteriormente se realizoacute la esterificacioacuten entre el
compuesto halogenado y diferentes aacutecidos orgaacutenicos comerciales (Figura 41) Los
aacutecidos comerciales utilizados en el proceso de siacutentesis fueron los siguientes
aacutecido 34-dixidroxicinaacutemico aacutecido 345- trihidroxibenzoico
(aacutecido cafeico) (aacutecido gaacutelico)
O
OH
OH
HO
aacutecido 34-dihidroxibenzoico
(aacutecido protocateacutequico)
Figura 41 Aacutecidos empleados en la sustitucioacuten de la 4-clorometil-78-
dihidroxicumarina
OH
OH
O
HO
O
OH
OH
HO
OH
Materiales y meacutetodos
29
Todos los compuestos fueron previamente acetilados para proteger los grupos
hidroxilo presentes en sus estructuras para evitar reacciones entre siacute
A Siacutentesis de la 4-clorometil-78-dihidroxicumarina 1
Se mezclaron en proporciones equimolares el pirogalol (31 mmoles) junto con el 4-
cloroacetoacetato de etilo con agitacioacuten constante en un bantildeo de agua-hielo sobre la
mezcla se antildeadieron lentamente 25 mL de H2SO4 (tambieacuten friacuteo) esta solucioacuten se
tornoacute de color rojizo oscuro Se dejoacute reaccionar 1 h
La mezcla de reaccioacuten se agregoacute lentamente sobre un bantildeo de agua-hielo-etanol con
vigorosa agitacioacuten y se obtuvo el producto como un precipitado fino que fue lavado
con abundante agua (a fin de eliminar restos aacutecidos) y purificado por re-cristalizacioacuten
en una mezcla etanol agua obtenieacutendose un soacutelido marfil brillante 1 La ruta
sinteacutetica se presenta a continuacioacuten
Figura 42 Siacutentesis del derivado clorado 1
O
OH
OH O
Cl
HO
OH
OH
OEt
Cl
O O
+
H2SO4
1 h
1
Materiales y meacutetodos
30
B Procedimientos de acetilacioacuten
a) Acetilacioacuten de 4-clorometil-78-dihidroxi-cumarina 2
Se suspendioacute la cumarina clorada (3 g) en 6 mL anhiacutedrido aceacutetico y se antildeadioacute 1 gota
de aacutecido sulfuacuterico La solucioacuten fue agitada con calentamiento (45 degC) por 30 min y se
observoacute el progreso de la reaccioacuten mediante el test de FeCl3 el que indica la presencia
o ausencia de grupos ndashOH fenoacutelicos en solucioacuten El precipitado obtenido 5 se
recristalizoacute en etanol su ruta sinteacutetica se muestra en la Figura 43
Figura 43 Siacutentesis del derivado clorado acetilado 5
b) Acetilacioacuten del aacutecido 34-dihidroxicinaacutemico 6
Seguacuten lo descrito en la literatura89
se disolvioacute el aacutecido 34-dihidroxicinaacutemico (aacutecido
cafeico) en solucioacuten 1 M de NaOH sobre un bantildeo de hielo se agregoacute anhiacutedrido
O
OH
HO O
Cl
Ac2O H2SO4
45 degC 30 min
O
O
O O
Cl
5
O
O
Materiales y meacutetodos
31
aceacutetico y de inmediato se aprecioacute la aparicioacuten de un precipitado amarillo claro que
con el paso del tiempo se tornoacute de color marfil Se dejoacute en estas condiciones con
agitacioacuten vigorosa por 30 min El producto 6 fue filtrado y lavado prolijamente con
agua posteriormente se recristalizoacute en etanol obtenieacutendose un soacutelido blanco brillante
La reaccioacuten global se presenta en la Figura 44
HO
HO
OH
O
O
O O
NaOH 30 min
AcO
AcO
OH
O
6
Figura 44 Siacutentesis del aacutecido cafeico acetilado 6
c) Acetilacioacuten del aacutecido gaacutelico7
Se mezclaron 3 g de aacutecido con 7 mL de anhiacutedrido aceacutetico se antildeadioacute 1 gota de H2SO4
Se agitoacute durante 30 min a 47 degC Posteriormente la mezcla fue enfriada y filtrada al
vaciacuteo El producto 7 soacutelido de color blanco se recristalizoacute en etanol La reaccioacuten
global se presenta en la Figura 45
Materiales y meacutetodos
32
O
HO
HO
OH
OHO
O O
H2SO4 30 min
O
AcO
AcO
OAc
OH
7
Figura 45 Siacutentesis del aacutecido gaacutelico acetilado 7
d) Acetilacioacuten del aacutecido 34-dihidroxibenzoico 8
Se mezclaron 3 g de aacutecido con 6 mL de anhiacutedrido aceacutetico se antildeadioacute 1 gota de H2SO4
Se agitoacute por 30 min a 50 degC Luego se enfrioacute y filtroacute al vaciacuteo El producto 8 soacutelido de
color blanco fue recristalizado en etanol la reaccioacuten global se muestra en la Figura
46
O
OH
OH
OHO
O O
H2SO4 30 min
O
OAc
OAc
OH
8
Figura 46 Siacutentesis del aacutecido 34-dihidroxibenzoico acetilado 8
Materiales y meacutetodos
33
C Siacutentesis de los derivados hiacutebridos Procedimiento general
En base a una variante del procedimiento descrito (Ono y colaboradores 1978)90
los
derivados hiacutebridos se obtuvieron mediante la esterificacioacuten de la cumarina acetilada
5 y el correspondiente aacutecido tambieacuten previamente acetilado (6 7 8) Se disolvioacute el
aacutecido (32 mmoles) en 10 mL de DMF (seca recieacuten destilada) a temperatura ambiente
y se agregoacute el DBU en proporcioacuten equimolar se dejoacute reaccionar por 30 min en un
matraz provisto de codo de desecacioacuten (relleno con CaCl2) y agitacioacuten constante Se
agregoacute la cumarina (32 mmoles) y se aprecioacute el fin de la reaccioacuten tras 35 h a 50 degC
de temperatura La solucioacuten se llevoacute a tdeg ambiente y se hizo precipitar
cuidadosamente agregando agua destilada el soacutelido (9 10 y 11) fue lavado
prolijamente se filtroacute y secoacute
La Figura 47 muestra como ejemplo la ruta sinteacutetica llevada a cabo en la obtencioacuten
del derivado de aacutecido cafeico
Figura47 Siacutentesis del intermediario hiacutebrido derivado del aacutecido cafeico
O
OAc
OAc O
Cl
OAc
OAc
HO
O
+ DBU
DMF seco
O
OAc
OAc O
OAc
OAc
O
O
Materiales y meacutetodos
34
Posteriormente se procedioacute a desproteger los grupos fenoacutelicos en el soacutelido mediante
el procedimiento de desacetilacioacuten El producto crudo fue suspendido en una mezcla
de metanol (8 mL) acetona (12 mL) y solucioacuten saturada de NaHCO3 (14 mL) se
agitoacute a temperatura ambiente bajo nitroacutegeno por 3 h
Finalizada la reaccioacuten la suspensioacuten se concentroacute al vaciacuteo se antildeadioacute HCl en friacuteo
formaacutendose un precipitado claro que se filtroacute y lavoacute con abundante agua
posteriormente fue secado cuidadosamente El soacutelido se lavoacute prolijamente con CHCl3
a ebullicioacuten y fue secado al vaciacuteo de esta forma se obtuvo el producto hiacutebrido La
Figura 48 muestra la ruta de desproteccioacuten empleada
Figura48 Siacutentesis del compuesto hiacutebrido final 9
O
OAc
AcO O
OAc
OAc
O
O N2 tdeg amb
O
OH
HO O
OH
OH
O
O
9
hidroacutelisis baacutesica
Materiales y meacutetodos
35
En la Figura 49 se presenta un resumen de la ruta sinteacutetica para las cumarinas
hiacutebridas obtenidas
HO
O
OH
OH4
OH
OH
HO
O
OH
3
OH
OH
HO
O
2
O
OH
HO O
Cl1
ii
HO
O
OAc
OAc8
OAc
OAc
HO
O
OAc
7
OAc
OAc
HO
O
6
O
OAc
AcO O
Cl5
Figura 49A Ruta de siacutentesis de los compuestos cumariacutenicos i) H2SO4 1 h bantildeo de
hielo ii) NaOH Ac2O 30 min bantildeo de hielo (aacutecido cafeico 6) H2SO4 Ac2O
30 min (cumarina y aacutecidos benzoicos)
O
OH
HO O
Cl
HO
OH
OH
OEtCl
O O
+
1
i
Materiales y meacutetodos
36
HO
OOAc
OAc
OAc
OAc
HO
O
OAc
7
OAc
OAc
HO
O
6
OOH
HO O
OH
OH
O
O
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
9
10
11
OOAc
AcO O
Cl5
iiiiv
8
Figura 49B Ruta de siacutentesis de los compuestos cumariacutenicos iii) DBU DMF (seca)
35 h 50 degC iv) NaHCO3 MeOH acetona tdeg amb 3 h N2
Materiales y meacutetodos
37
422 Procedimiento experimental en electroquiacutemica
i) Celda electroquiacutemica
La celda de trabajo estuvo compuesta por tres electrodos el de trabajo de carbono
viacutetreo y superficie 0076 cm2 electrodo de referencia AgAgCl (3 M KCl) inmerso en
puente salino (DMF + HFFTBA 02 M) y alambre de platino como contra-electrodo
ii) Condiciones de trabajo
Los experimentos se realizaron utilizando como solvente aproacutetico NN-
dimetilformamida (previamente destilada y guardada con tamiz molecular 3 Aring) las
soluciones de trabajo en una concentracioacuten de 2 mM para todos los compuestos
continuamente fueron purgadas con nitroacutegeno extra puro el electrolito soporte
utilizado fue HFFTBA (hexafluorofosfato de tetrabutil amonio) en una concentracioacuten
dos oacuterdenes de magnitud superior a la de la muestra
iii) Teacutecnicas empleadas
En el desarrollo de este trabajo se utilizoacute voltamperometriacutea ciacuteclica (VC) y
voltamperometriacutea de pulso diferencial (VPD)
Materiales y meacutetodos
38
iv) Caacutelculos
El proceso de deconvolucioacuten de las graacuteficas en VC se llevoacute a cabo utilizando el
software Origin Pro 8 SR2 (Origin Lab Corporation USA) Se aplicoacute la funcioacuten
Gaussiana (Ecuacioacuten 41)
119910 = 1199100 + 119860
119908 radic120587 119890
minus2(119909minus119909119888)2
1199082 Ecuacioacuten 41
423 Estudio de generacioacuten de especies radicalarias mediante espectroscopiacutea de
resonancia de espiacuten electroacutenico
La oxidacioacuten electroquiacutemica de los compuestos se realizoacute utilizando las
mismas condiciones de potencial de voltametriacutea ciacuteclica una celda compuesta de
electrodo de trabajo de alambre de platino el medio empleado fue DMF + HFFTBA
como contra-electrodo se utilizoacute alambre de platino La estabilizacioacuten del radical
generado en la oxidacioacuten electroquiacutemica se logroacute empleando el catioacuten quelante Zn2+
el cual es silente a la teacutecnica espectroscoacutepica y forma complejos con el grupo catecol
Se utilizoacute ZnCl2 en concentracioacuten final 3 mM
Materiales y meacutetodos
39
424 Procedimiento experimental en el estudio de actividad frente a especies
radicalarias
4241 Metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno
(oxygen radical antioxidant capacity-fluorescein ORAC-FL)
Se prepararon soluciones stock en etanol para cada compuesto de ellas se obtuvieron
las soluciones de trabajo diluidas en solucioacuten buffer fosfato (pH 74) Se antildeadieron
las aliacutecuotas respectivas de concentraciones crecientes de cada compuesto en los
pocillos de la placa (concentraciones finales entre 02 microM y 109 microM que permitieron
obtener curvas de decaimiento apropiadamente separadas) posteriormente se
adicionoacute la sonda fluoresceiacutena (Figura 410 A) (solucioacuten preparada en buffer pH 74 y
concentracioacuten final 40 nM) y se pre-incuboacute 15 min a 37 degC Finalmente se adicionoacute la
aliacutecuota correspondiente de solucioacuten de 22prime-azobis(2-metiilpropionamidina)
dihidrochloridrato (ABAP) la solucioacuten fue preparada en buffer pH 74 y
concentracioacuten final 18 mM (Figura 410 B) y se llegoacute a un volumen final de 200 microL
La placa fue introducida en el lector y se midioacute el decaimiento de la sonda
fluorescente cada 1 min con agitacioacuten previa a cada medicioacuten Para cada set de
medidas fue determinado el blanco correspondiente que contiene la sonda
fluorescente y el generador de radicales peroxilo (ROObull) Se empleoacute el compuesto
Trolox como antioxidante estaacutendar de referencia (Figura 410 C) utilizaacutendose un set
Materiales y meacutetodos
40
de concentraciones entre los 3 microM y 20 microM y el procedimiento anteriormente descrito
para determinar el decaimiento de la fluorescencia de la sonda
La capacidad de inhibicioacuten expresada como valor de iacutendice ORAC se cuantificoacute
utilizando el valor integrado de aacuterea bajo la curva (ABC) de fluorescencia (Figura
411 donde F0 es el valor medido a tiempo 0 y F es el valor de fluorescencia al final
de la medicioacuten cuando se aprecioacute que el decaimiento es total) La ABC neta se obtuvo
de restar el valor del blanco al valor de cada compuesto (ver Ecuacioacuten 42)
ABC neta = ABC compuesto ndash ABC blanco Ecuacioacuten 42
ONaO O
ONa
O
A
O
HO
OH
O
C
Figura 410 A Sonda fluoresceiacutena B 22prime-azobis(2-metilpropionamidina)
dihidrochloridrato (ABAP) C 6-hidroxi-2578-tetrametilcroman-2-aacutecido carboxiacutelico
(Trolox)
-Cl H2N+
NH2
N
N+NH2 Cl-
NH2
B
Materiales y Meacutetodos
41
Figura 411 Actividad antioxidante ORAC-FL para un compuesto en estudio
Finalmente este valor de ABC neta para cada concentracioacuten se graficoacute con respecto a la
concentracioacuten obtenieacutendose una relacioacuten lineal en el rango de estudio La pendiente de
la regresioacuten de cada compuesto fue dividida por el valor de la pendiente del estaacutendar
Trolox (obtenido de la mima forma descrita para las muestras) este coeficiente es el
mencionado Iacutendice ORAC
Los datos fueron procesados mediante el software Origin Pro 8 SR2 (Origin Lab
Corporation USA) Las mediciones se realizaron en triplicado
0 1000 2000 3000 400000
02
04
06
08
10
ABCneta
Antioxidante
Blanco
F
F0
Tiempo s
Materiales y Meacutetodos
42
4242 Metodologiacutea de determinacioacuten de poder antioxidante de reduccioacuten de hierro
(FRAP)
Preparacioacuten de soluciones
i) Preparacioacuten solucioacuten tampoacuten acetato
Se disolvieron 155 g de acetato de sodio trihidrato (CH3COONamiddot3H2O) en agua
ultrapura se agregaron 8 mL de CH3COOH glacial con agitacioacuten constante y se aforoacute
a 500 mL El pH fue ajustado a 36 con NaOH concentrado
ii) Preparacioacuten de solucioacuten tampoacuten fosfato pH 74
Se mezclaron 80 mL de solucioacuten 01 M de NaOH con 100 mL de solucioacuten 01 M de
KH2PO4 se agitoacute para homogeneizar
iii) Preparacioacuten solucioacuten HCl 40 mM
En un matraz aforado (50 mL) se mezclaron 167 microL de HCl 12 M (37) con agua
ultrapura y se agitoacute hasta homogeneizar
iv) Preparacioacuten de solucioacuten TPTZ
Se pesaron 797 mg de reactivo TPTZ (Figura 412) y se aforoacute a 25 mL con solucioacuten
HCl 40 mM se agitoacute y conservoacute protegido de la luz
Materiales y Meacutetodos
43
N
N
N
N
NN
Figura 412 Reactivo 246-tris(2-piridil)-s-triazina (TPTZ)
v) Preparacioacuten solucioacuten de FeCl3 (20 mM)
Se pesaron 0054 g de FeCl3middot6H2O se aforoacute a 10 mL con agua ultrapura y se agitoacute
constantemente
vi) Preparacioacuten del reactivo FRAP
Se mezcloacute el tampoacuten acetato con solucioacuten TPTZ y solucioacuten feacuterrica en proporcioacuten
1011 se agitoacute y conservoacute al abrigo de la luz
vii) Preparacioacuten de soluciones en estudio
Se mezclaron aliacutecuotas de solucioacuten stock (en etanol) de cada compuesto con tampoacuten
fosfato luego se agitaron y se obtuvieron soluciones en concentraciones entre 15 microM y
58 microM
Materiales y Meacutetodos
44
Ensayo de capacidad reductora
En un frasco aacutembar se mezclaron 150 microL de solucioacuten de muestra con 450 microL de agua
ultrapura y posteriormente 950 microL de reactivo FRAP La solucioacuten se agitoacute e
inmediatamente se tornoacute de color azul lo que indicoacute la reaccioacuten de oxidacioacuten de Fe2+
a Fe3+
en el complejo formado con el reactivo TPTZ Se midioacute el espectro de
absorbancia en el rango del UV-visible a temperatura ambiente considerando el valor
de λmaacutex = 599 nm Los experimentos se realizaron en triplicado los valores obtenidos
para este ensayo se expresan como equivalentes de Trolox 10 microM de muestra
4243 Capacidad de apagamiento del radical hidroxilo (OHbull) mediante la teacutecnica
spin trap
Se realizoacute el ensayo mediante la metodologiacutea de Fenton no cataliacutetico comparando las
sentildeales en el espectro mediante espectroscopia de resonancia de espiacuten electroacutenico
(REE) del aducto DMPO-OH como blanco frente a las sentildeales obtenidas en las
mismas condiciones tras antildeadir los compuestos en estudio Para la generacioacuten del
radical hidroxilo se utilizoacute peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2) y solucioacuten acuosa de NaOH
metodologiacutea que presenta la ventaja de que en ausencia de iones Fe2+
(como en la
metodologiacutea Fenton) se evitoacute la reaccioacuten de quelacioacuten con los grupos catecol presentes
en las estructuras propuestas91ab
Materiales y Meacutetodos
45
-10 -08 -06 -04
Ipa0
O2 + e
- O
2
-
O2
-O
2 + e
-
10 A
E vs Ag|AgCl V
Se prepararon soluciones stock (20 mM en DMF) de cada compuesto en estudio se
tomaron aliacutecuotas de 100 microL y se agregaron 50 microL de NaOH (25 mM) 50 microL de
solucioacuten de 55-dimetil-1-pirroline-N-oacutexido (DMPO) (30 mM) y finalmente 50 microL de
agua oxigenada (30) se agitoacute cuidadosamente se incuboacute por 5 minutos y se midioacute
su espectro Los resultados se expresaron como el porcentaje de inactivacioacuten del
radical hidroxilo
4244 Estudio de reactividad frente a anioacuten radical superoacutexido O2middot -
Se evaluoacute la reactividad de cada compuesto frente al radical anioacuten superoacutexido el que
fue generado electroquiacutemicamente en la superficie del electrodo a traveacutes de la
reduccioacuten del oxiacutegeno molecular disuelto en el medio (Figura 413)
Figura 413 Voltamograma ciacuteclico de la generacioacuten de anioacuten radical superoacutexido
DMF + HFFTBA 02 M en electrodo de carbono viacutetreo
Materiales y Meacutetodos
46
i) Celda electroquiacutemica
La celda estuvo compuesta de tres electrodos el electrodo de trabajo fue carbono
viacutetreo (aacuterea = 003 cm2) el electrodo auxiliar empleado fue Ag|AgCl (KCl 3 M
inmerso en DMF + HFFTBA 02 M como puente salino) y alambre de platino como
contra-electrodo
ii) Teacutecnica empleada
La generacioacuten del radical se realizoacute mediante voltamperometriacutea ciacuteclica (VC) a
velocidad de barrido de 01 Vs en un rango de potencial entre 0 V (inicial) y -1 V
como potencial de inversioacuten de la direccioacuten de barrido (switching) 92
iii) Experimento
Los experimentos se realizaron utilizando como solvente 10 mL de NN-
dimetilformamida (previamente destilada) el electrolito soporte utilizado fue
HFFTBA (hexafluorofosfato de tetrabutil amonio) en concentracioacuten 02 M las
soluciones fueron saturadas con aire continuamente Una vez estabilizada la corriente
se antildeadieron a la celda aliacutecuotas crecientes de solucioacuten stock de cada compuesto
observaacutendose la disminucioacuten en la corriente de pico anoacutedica Ipa0 Una vez obtenidos
los voltamogramas se determinoacute el paraacutemetro adimensional ((Ipa0-Ipa
S) Ipa
0) el que
expresoacute el consumo de la especie radical este valor se graficoacute con respecto a la
concentracioacuten del sustrato cuya relacioacuten fue una regresioacuten lineal De la graacutefica se
Materiales y Meacutetodos
47
obtuvo el valor de concentracioacuten de antioxidante en que la corriente de pico anoacutedico
disminuye en un 50 (IA50)
4245 Estudio de la capacidad antioxidante celular (CAC)
Para evaluar la actividad antioxidante de los compuestos estudiados en un medio
celular se utilizoacute el meacutetodo descrito en la literatura por Wolfe93
Se emplearon ceacutelulas
EAhy 926 (ATCC CRL-2922) las que fueron sembradas con una densidad de
50000 ceacutelulas por pocillo en microplacas de 96 pocillos con medio de cultivo
RPMI 1640 Despueacutes de 24 h fue removido el medio de cultivo y los pocillos
fueron lavados con buffer fosfato salino (PBS) pH 74 Los pocillos fueron tratados
con 20 μM de la sonda DCFH-DA disuelta en RPMI 1640 libre de suero fetal bobino
Posteriormente se agregaron los compuestos en dos concentraciones diferentes 1 μM y
10 μM Luego de transcurrida 1 h de incubacioacuten a 37 degC los pocillos fueron
lavados con PBS Luego de esto se agregoacute ABAP en una concentracioacuten final de
600 μM y se midioacute la fluorescencia generada por la sonda en el multi-lector de placas
a temperatura constante de 37 degC La emisioacuten a 538 nm fue medida con una excitacioacuten
a 485 nm cada 1 min por 1 hora El ensayo se realizoacute en triplicado El valor de
capacidad antioxidante se calcula determinando el aacuterea bajo la curva para la muestra y
el control experimental utilizando la siguiente ecuacioacuten
CAC = 100 ndash (ABCmuestra ABCcontrol) 100 Ecuacioacuten 43
Materiales y Meacutetodos
48
4246 Estudio de hidrofobicidad relativa de los compuestos
La hidrofobicidad de los compuestos se correlaciona con sus coeficientes de reparto y
distribucioacuten (log P para el reparto octanolagua y log D para la distribucioacuten
octanolsolucioacuten tampoacuten pH 74) los que se determinan utilizando teacutecnicas
espectrofotomeacutetricas yo cromatograacuteficas
Para realizar estas experiencias se determina la solubilidad del analito en octanol
saturado con agua y en la solucioacuten tampoacuten pH 74 saturado con octanol Luego se
obtienen las respectivas curvas de calibracioacuten para la concentracioacuten del compuesto en
estas soluciones en funcioacuten de la absorbancia yo aacuterea bajo la curva Se espera que las
curvas de calibracioacuten obtenidas cumplan con el requisito de una linealidad apropiada
Posteriormente se debe evaluar el reparto midiendo la concentracioacuten analiacutetica en la
fase orgaacutenica y acuosa Para la determinacioacuten del reparto estaacute descrita la siguiente
ecuacioacuten
119897119900119892119875119900119888119905119886119892119906119886 = log ([119904119900119897119906119905119900]119900119888119905119886119899119900119897
[119904119900119897119906119905119900]119886119892119906119886) Ecuacioacuten 44
Mientras que para la determinacioacuten de la distribucioacuten se utiliza la siguiente ecuacioacuten
119897119900119892119875119900119888119905119886119892119906119886(119905119886119898119901oacute119899) = log ([119904119900119897119906119905119900]119900119888119905119886119899119900119897
[119904119900119897119906119905119900]119905119886119898119901oacute119899 119901119867 74) Ecuacioacuten 45
Materiales y Meacutetodos
49
Para este estudio se realizoacute la determinacioacuten de tiempos de retencioacuten como medida de
la hidrofobicidad relativa entre compuestos Se utilizoacute una columna C18 ODS Hypersil
una fase moacutevil compuesta de acetonitrilo solucioacuten H3PO4 (6535 vv) bajo
condiciones isocraacuteticas con flujo 1 mLmin volumen de inyeccioacuten 50 microL
4247 Estudio teoacuterico caacutelculo del Iacutendice de Fukui
La optimizacioacuten de estructuras de los compuestos neutros se realizoacute utilizando el
meacutetodo DFTSP-DFT basado en la Teoriacutea de Funcionales de la Densidad (DFT)94-96
Se utilizoacute el funcional hiacutebrido B3LYP el conjunto de bases empleado fue 6-31G(d)
Los caacutelculos se realizaron mediante el software Gaussianrsquo09 Los descriptores locales
se evaluaron a traveacutes de la aproximacioacuten de orbitales condensados Orbitales
Moleculares Frontera (Mulliken MOs)
Resultados y discusioacuten
50
5 Resultados y discusioacuten
51 Siacutentesis de los compuestos
Se presentan a continuacioacuten los resultados de la caracterizacioacuten fiacutesica y
espectroscoacutepica de los compuestos sintetizados durante este trabajo
4-clorometil-78-dihidroxicumarina (1)
1H RMN (DMSO d6 δ ppm) 493 (s 2H -CH2-) 641 (s 1H =CH- cumarina) 686
(d 1Harom Jorto 85) 717 (d 1Harom Jorto 85) 942 (s1H OH) 1022 (s 1H OH)
13C RMN (DMSO d6 δ ppm) 4187 11047 11129 11267 11585 13282 14358
15017 15181 16046 Rendimiento 47 Punto de fusioacuten 202-204 degC Agujas
color marfil PM 2265gmol Foacutermula molecular C10H7O4Cl
4-clorometil-78-diacetilcumarina (5)
1H RMN (DMSO d6 δ ppm) 235 (s 3H -CH3) 241 (s 3H-CH3) 506 (s 2H -
CH2-) 674 (s 1H =CH- cumarina) 739 (d 1Harom Jorto 878) 783 (d 1Harom Jorto
878)13
C RMN (DMSO d6 δ ppm) 1943 1985 3983 4073 11467 11549
11871 12238 12939 14459 14593 14999 1578716751 Rendimiento 68
Punto de fusioacuten 157-159 degC Soacutelido blanco PM 3105 gmol Foacutermula molecular
C14H11O6Cl
Resultados y discusioacuten
51
Aacutecido-34-diacetoxicinaacutemico (6)
1H RMN (acetona d6 δ ppm) 215 (s 3H -CH3) 216 (s 3H CH3) 638-643 (d 1H
Jtrans 159) 717-720 (d 1Harom Jorto 878) 748-750-756 (s Harom y Htrans) 13
C RMN
(acetona d6 δ ppm)1996 2004 11977 12333 12450 12682 13364 14323
14339 14439 16699 16809 16817 Rendimiento 56 Punto de fusioacuten
158-161 degC Soacutelido blanco PM 264 gmol Foacutermula molecular C13H12O6
Aacutecido-345-triacetilbenzoico (7)
1H RMN (acetona d6 δ ppm) 217 (s 6H -CH3) 219 (s 3H -CH3) 767 (s 2H
Harom) 13
C RMN (acetona d6 δ ppm) (2C -CH3 1865) (2C-C=O 1910) (2Carom
12160) 12790 13857 (2C 14337) 16432 16599 16789 Rendimiento 66
Punto de fusioacuten 158-160 degC Soacutelido blanco PM 296 gmol Foacutermula molecular
C13H12O8
Aacutecido 34-diacetilbenzoico (8)
1H RMN (acetona d6 δ ppm) 217 (s 6H CH3) 724-727 (d 1Harom Jorto 85) 774-
775 (d 1Harom) 781-784 (dd 1Harom) 13
C RMN (acetona d6 δ ppm) 1910 1913
(2C 12329) 12453 12729 12838 16487 16699 16729 Rendimiento 61
Punto de fusioacuten 155-158 degC Soacutelido blanco PM 238 gmol Foacutermula molecular
C11H10O6
Resultados y discusioacuten
52
4-metil-(34-dihidroxicinamoato)-78-dihidroxicumarina (9)
1H RMN (DMSOd6 δppm) 541(s 2H -CH2-) 621(s 1H =CH- cumarina) 642-
648 (d 1H Jtrans= 1591) 682-71 (Harom) 758-763 (d 1H Jtrans = 1591) 91 (s -
OH) 94 (s -OH) 97 (s -OH) 102 (s- OH)13
C RMN (DMSO d6 δppm) 6154
10820 11035 11290 11345 11526 11550 11620 12225 12566 13292
14391 14607 14686 14920 15026 15174 16055 16646ESI-MS mz 371
[M+H]+ 369 [M-H]
- 181 [M+H]
+ 163 [M-H2O+H]
+ 145 [M-H2O+H]
+ 135 [M-
HCOOH+H]+ 179 [M-H]
- 161 [M-H2O-H]
- 135 [M-CO2-H]
-Rendimiento 37
Punto de fusioacuten 246-249 degC Soacutelido amarillo opaco PM 37031 gmol Foacutermula
molecular C19H14O8
4-metil-(345-dixidroxibenzoato)-78-dihidroxicumarina ( 10 )
1H RMN (DMSO d6 δ ppm) 546 (s 2H -CH2-) 619 (s 1H =CH- cumarina) 682-
685 (d 1Harom Jorto 8508) 704 (s 2Harom) 709-712 (d 1Harom Jorto 778)13
C RMN
(DMSO d6 δppm) 6192 10821 10914 11041 11295 11533 11885 13292
13949 14394 (2Carom) 14620 15024 15184 16055 16555 16793ESI-MS mz
361 [M+H]+ 359 [M-H]
- 171 [M+H]
+ 153 [M-H2O+H]
+ 125 [M-CO2H+H]
+ 169
[M-H]- 125 [M-CO2-H]
- Rendimiento 46 Punto de fusioacuten descomposicioacuten sobre
230 degC Soacutelido amarillo opaco PM 36027 gmol Foacutermula molecular C17H12O9
Resultados y discusioacuten
53
4-metil-(34-dihidroxibenzoato)-78-dihidroxicumarina (11)
1H RMN (DMSO d6 δ ppm) 548 (s 2H -CH2-) 619 (s 1H =CH- cumarina) 685
(m 2Harom) 71 (d 1Harom) 74 (d 2Harom) 13
C RMN (DMSO d6 δ ppm) 6142
10774 10988 11242 11481 11551 11626 11957 12218 13240 14343
14520 14972 15096 15127 16001 16490 ESI-MS mz 345 [M+H]+ 343 [M-
H]- 137 [M-H2O+H]
+ 109 [M-HCOOH+H]
+ 153 [M-H]
- 108 [M-CO2-H]
-
Rendimiento 73 Punto de fusioacuten descomposicioacuten sobre 250 degC Soacutelido amarillo
opaco PM 34427 gmol Foacutermula molecular C17H12O8
Resultados y discusioacuten
54
52 Estudios de voltametriacutea ciacuteclica y voltametriacutea de pulso diferencial
El proceso de oxidacioacuten electroquiacutemico de los compuestos fue evaluado mediante
voltamperometriacutea de pulso diferencial VPD Los resultados presentaron soacutelo un pico
de oxidacioacuten para los compuestos 1 2 4 y 9 por otra parte el aacutecido gaacutelico 3 y los
hiacutebridos 10 y 11 mostraron dos o maacutes sentildeales poniendo de manifiesto las complejas
reacciones de oxidacioacuten que presentan los grupos -OH en dichas estructuras (Figura
51 A y B)97
Al analizar las sentildeales tanto para los precursores y sus derivados hiacutebridos se encontroacute
que la uacutenica sentildeal anoacutedica del compuesto 9 corresponderiacutea tanto a la oxidacioacuten del
catecol presente en la cumarina 1 (Epa 083 V) como del aacutecido cafeico 2 (Epa 076 V)
(Figura 52 A) ambos compuestos por separado tuvieron potenciales de pico anoacutedico
cercanos los que se solaparon para una dar una sola sentildeal en el derivado 9 (Epa 082
V)
Figura 51 A
Voltamperogramas de pulso
diferencial para los
precursores 1 2 3 y 4 2 mM
en DMF + HFFTBA 02 M
00 03 06 09 12 15 18 21 24
OO H
O H
H O
OOH
OH
HO
OH
OH
OH
O
HO
OOH
OH O
Cl
A
2A
E vs Ag|AgCl V
1
2
3
4
Resultados y discusioacuten
55
Figura 51 B Voltamperogramas de pulso diferencial para los derivados 9 10 y 11
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
En el caso del hiacutebrido 11 derivado del aacutecido protocateacutequico se observaron dos picos de
oxidacioacuten que corresponderiacutean a la oxidacioacuten del catecol cumariacutenico (Epa 083 V) y el
catecol del aacutecido benzoico (Epa 111 V) A diferencia del caso anterior se encontroacute
que las sentildeales anoacutedicas de ambos precursores estuvieron lo suficientemente distantes
como para solaparse como en el caso anterior Considerando que los resultados se
obtuvieron bajo las mismas condiciones experimentales se podriacutea asumir que la sentildeal
a potencial Epa1 081 V corresponde a la oxidacioacuten en el anillo de la cumarina y la
sentildeal en Epa2 094 V corresponde a la oxidacioacuten del catecol presente en el anillo
benceacutenico Para el compuesto 10 se observoacute un comportamiento semejante al descrito
para 11
00 03 06 09 12 15 18 21 24
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OH O O
O
OO H
O H
O H
OOH
OH O
OH
OH
O
O
B
E vs Ag|AgCl V
9
10
11
2A
Resultados y discusioacuten
56
Los experimentos de voltamperometriacutea ciacuteclica se llevaron a cabo a distinta velocidad
de barrido 005 Vs ndash 3 Vs con el objeto de estudiar su influencia sobre la sentildeal de
oxidacioacuten En forma graacutefica para precursores y derivados se observaron pares redox de
comportamiento irreversible debido al evidente desplazamiento del potencial de pico
Epa con respecto al aumento de la velocidad de barrido El valor de ΔEp (Epa -Epc) se
incrementoacute con el aumento en la velocidad lo que indica una disminucioacuten en la
velocidad de transferencia electroacutenica Para los compuestos 1 2 4 y 9 a la velocidad
de barrido estudiada se observoacute al igual que en VPD la aparicioacuten de una uacutenica sentildeal
de oxidacioacuten para todo el rango de velocidad (la que se desplaza a potenciales maacutes
positivos a medida que aumenta la velocidad de barrido) seguida de una sentildeal de
reduccioacuten en el barrido hacia potenciales negativos Para los compuestos 3 10 y 11 se
apreciaron dos sentildeales de oxidacioacuten seguida de la correspondiente sentildeal en el barrido
de reduccioacuten
Para cada par redox se realizaron estudios por segmentos encontraacutendose para los
compuestos 9 y 10 que el pico I (de oxidacioacuten) estaacute relacionado con el pico II (de
reduccioacuten) y para el compuesto 11 las sentildeales I y Irsquo (de oxidacioacuten) estaacuten relacionadas
con el pico II (de reduccioacuten) Esto es indicio de que en el primer barrido se observa el
proceso de oxidacioacuten de los grupos fenoles en el cual se generan especies factibles de
ser reducidas como derivados de tipo quinoacutenico (Figuras 52 a 54)
Resultados y discusioacuten
57
Figura 52A VC para el derivado 9 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 53A VC para el derivado 10 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
-03 00 03 06 09 12 15
A
II
I
OOH
OH O
OH
OH
O
O
100 A
005 Vs
3 Vs
E vs Ag|AgCl V
03 06 09 12 15
B
II
I
E vs Ag|AgCl V
0 V - 13 V
0 V - 06 V
00 03 06 09 12 15 18
A
II
I
I
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
3 Vs
005 Vs
E vs Ag|AgCl V
00 03 06 09 12
B
II
I
E vs Ag|AgCl V
-02 V - 06 V
-02 V - 11 V
Resultados y discusioacuten
58
Figura 54 A VC para el derivado 11 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
En sistemas fenoacutelicos simples como es el caso del catecol o la hidroquinona se ha
estudiado el proceso redox en distintos medios 98-101
planteaacutendose que la oxidacioacuten en
medio aproacutetico deriva en la formacioacuten de la quinona correspondiente viacutea 2e-2H
+
(Figura 55) En esta investigacioacuten se han estudiado estructuras de mayor complejidad
y considerando que en este proceso de oxidacioacuten se ha descrito la presencia de
especies radicales como intermediarios de reaccioacuten es probable que ocurran procesos
de dimerizacioacuten o ataques nucleofiacutelicos por parte de los radicales dando como
resultado la generacioacuten de compuestos diferentes a la moleacutecula de partida (por
ejemplo de mayor peso molecular) Este tipo de comportamiento se puede analizar en
profundidad realizando barridos de potencial consecutivos en VC a baja velocidad de
00 03 06 09 12 15
I
II
I
A
100 A
OHO O
O
OOH
OH
OH
005 Vs
3 Vs
E vs Ag|AgCl V
00 03 06 09 12 15
II
I
IB
E vs Ag|AgCl V
-01 V - 07 V
-01 V - 14 V
Resultados y discusioacuten
59
barrido (005 Vs o menor para observar maacutes detalladamente la reaccioacuten quiacutemica en la
escala de tiempo del experimento) Si fuese el caso se esperariacutea observar la aparicioacuten
de sentildeales nuevas en el segundo barrido de oxidacioacuten que dariacutean cuenta de la
oxidacioacuten de las nuevas estructuras fenoacutelicas generadas
OH
OH-2e- -2H+
2e- 2H+
O
O
Figura 55 Esquema del proceso electro-oxidativo propuesto para el catecol
Se realizoacute la deconvolucioacuten (mediante la funcioacuten gaussiana) sobre las curvas de
oxidacioacuten para los compuestos con el objeto de determinar los valores de corriente de
pico anoacutedica de forma independiente con esto se obtienen valores de corriente y
potencial (principalmente a alta velocidad de barrido) los cuales son maacutes exactos que
los entregados por defecto por el software electroquiacutemico utilizado Las graacuteficas y
caacutelculos correspondientes a la relacioacuten entre los diferentes paraacutemetros analizados se
realizaron considerando los valores de Ipa y Epa para el primer pico oxidativo debido a
que esta sentildeal entrega informacioacuten con respecto a la energiacutea del primer electroacuten cedido
en el proceso de oxidacioacuten etapa que generalmente es lenta y determinante de la
velocidad de reaccioacuten
Resultados y discusioacuten
60
La expresioacuten indicada en la Ecuacioacuten 51102
da cuenta de la relacioacuten entre el potencial
de pico y el logaritmo de la velocidad de barrido para una reaccioacuten electroquiacutemica
irreversible
119864119901 119894119903119903119890119907 = 11986412 + 119887
2[104 minus log (
119887
119863) minus 2119897119900119892119896119891 + 119897119900119892119907] Ecuacioacuten 51
Por tanto de la graacutefica Ep vs logv se puede obtener el valor de la pendiente de Tafel b
que es igual al doble de la pendiente de la recta obtenida
119864119901 119894119903119903119890119907 = 119862119905119890 + 119887
2(119897119900119892119907) Ecuacioacuten 52
La graacutefica de potencial de pico anoacutedico (Epa) vs logv dio como resultado una relacioacuten
de tipo lineal para todos los compuestos el potencial de oxidacioacuten se desplazoacute hacia
valores maacutes positivos con el aumento de la velocidad de barrido lo que indica el
caraacutecter irreversible del proceso oxidativo en este medio En la Figura 56 se presenta
la graacutefica obtenida para el derivado 9 como ejemplo representativo de los resultados
obtenidos
Resultados y discusioacuten
61
Figura 56 Relacioacuten Epa vs logv para el derivado de aacutecido cafeico 9 2 mM en
DMF + HFFTBA 02 M
Los valores obtenidos para la pendiente de Tafel se resumen en la Tabla 51 Los
compuestos 1 y 3 poseen valores de la pendiente de Tafel cercanos al teoacuterico (118
mVdec)103
para un proceso en que la primera transferencia electroacutenica es la etapa
lenta del proceso (por tanto la etapa determinante de la reaccioacuten de electro-oxidacioacuten)
El compuesto 4 presenta un valor de 88 mVdec lo que sugiere que el electrodo estaacute
contaminado103104
o se produce un mecanismo de oxidacioacuten complejo (que implica
una transicioacuten entre la etapa quiacutemica y la transferencia electroacutenica como determinante
de la velocidad)105
De la misma forma los valores encontrados para los derivados 9
(170 mVdec) 10 (134 mVdec) y 11 (140 mVdec) y para el aacutecido cafeico (212
mVdec) indican que en las condiciones experimentales utilizadas la superficie del
18 21 24 27 30 33 36
090
093
096
099
102
105
OOH
OH O
OH
OH
O
O
r = 098638
m = 008548
Ep
a1 (
V)
logv (mV12
s-12
)
Resultados y discusioacuten
62
electrodo se contamina (pasiva)106
con la generacioacuten de especies polimeacutericas debido a
la formacioacuten del radical fenoxilo (ArObull) el cual puede dimerizar y originar diversos
productos de reaccioacuten los cuales se adhieren a la superficie del electrodo
Para cada compuesto se establecioacute la existencia de una relacioacuten de tipo lineal entre el
logaritmo de la corriente de pico anoacutedico y el logaritmo de la velocidad de barrido
(logIpa vs logv) El valor para la pendiente de estas rectas estuvo entre 044 y 056
(Tabla 51) lo que sugiere que el proceso observado es de tipo difusivo
La corriente de pico anoacutedica se puede expresar en funcioacuten de distintos paraacutemetros
experimentales como se indica en la Ecuacioacuten 53102
119868119901 = 301 times 10minus5 119899 (23 119877 119879
119887 119865)
12
11986312 119862 11990712 Ecuacioacuten 53
Donde n es el nuacutemero de electrones transferidos R es la constante de los gases (Jmol
K) T es la temperatura (K) D es el coeficiente de difusioacuten de la especie electro-activa
(cm2s) F es la constante de Faraday (Cmol) b es la pendiente de la ecuacioacuten de
Tafel107
(η = a + b log i) C es la concentracioacuten de la especie electro-activa (molL) y v
es la velocidad de barrido (mVs) Esta expresioacuten indica que la correlacioacuten entre
Ip y vfrac12
da como resultado una recta que seraacute funcioacuten del nuacutemero de electrones n y la
pendiente de Tafel b valores que estaacuten presentes en la pendiente de esta recta
Resultados y discusioacuten
63
Considerando lo anterior se procedioacute a graficar Ipa vs vfrac12
encontraacutendose para todos los
compuestos (Figura 57) una relacioacuten de tipo lineal con valores de r entre 099988 y
099448 se presenta ademaacutes la regresioacuten para el aacutecido protocateacutequico 4 como muestra
del comportamiento encontrado para todos los compuestos con valores de intercepto
que tienden a cero Al observar la Tabla 51 se aprecia que todas las regresiones
poseen una pendiente semejante lo cual da un indicio con respecto al nuacutemero de
electrones y mecanismo involucrados en la reaccioacuten de oxidacioacuten estudiada
Figura 57 Graacutefica para la corriente de pico Ipa vs la raiacutez cuadrada de la velocidad de
barrido Ejemplo de correlacioacuten lineal en el aacutecido protocateacutequico 4 2 mM en DMF +
HFFTBA 02 M
Tomando en cuenta que los valores de C R T y F (Ecuacioacuten 53) son factores
constantes y que los coeficientes de difusioacuten D seraacuten semejantes y del mismo orden
para aquellos compuestos de estructura similar (precursores por una parte y derivados
por otra) se obtiene que la pendiente de la recta obtenida en esta correlacioacuten es un
0 10 20 30 40 50 600
50
100
150
200
250
Ipa (
A)
V12
(mV12
s-12
)
OOH
OH
HO
m = 40 10-6
r = 099988
Resultados y discusioacuten
64
indicador respecto al nuacutemero de electrones involucrados en la reaccioacuten y al valor de b
(relacionado con el mecanismo de oxidacioacuten estudiado)
En el caso de los compuestos precursores se obtuvieron valores de pendientes entre
36bull10-6
y 41bull10-6
(Tabla 51) este rango cercano indica la transferencia del mismo
nuacutemero de electrones en el proceso oxidativo observado en que para la cumarina
clorada 1 el aacutecido cafeico 2 y el aacutecido protocateacutequico 4 corresponde a la uacutenica sentildeal
de oxidacioacuten observada y en el caso del aacutecido gaacutelico 3 es el proceso correspondiente a
la primera sentildeal del voltamograma En la literatura se describen estudios en medio
aproacutetico para compuestos fenoacutelicos como por ejemplo derivados de la cumarina 78-
dihidroxilada 100ab
el aacutecido cafeico101
y la hidroquinona105
que dan cuenta de una sentildeal
en el proceso oxidativo en medio aproacutetico que involucra 2 electrones esto permite
inferir que las sentildeales observadas experimentalmente corresponden a un proceso di-
electroacutenico
Para los derivados 9 10 y 11 se observa que los valores para la pendiente Ipa vs vfrac12 se
encuentran entre 37bull10-6
y 42bull10-6
como se indica en la Tabla 51 Ademaacutes al
comparar estos resultados con los obtenidos para el caso de los precursores se deduce
que estamos frente a un proceso oxidativo que involucra dos electrones Se observa
tambieacuten que no hay cambios con respecto al mecanismo de reaccioacuten si lo hubiese se
esperariacutea encontrar diferencias del doble o superior en los valores encontrados para la
pendiente de la recta ya que eacutesta contiene el factor b (pendiente de la ecuacioacuten de
Tafel) antes mencionado
Resultados y discusioacuten
65
Posteriormente se calculoacute el valor correspondiente al potencial de inicio del proceso
electroquiacutemico (Eonset)108109
Este valor indica el potencial inicial con que el primer
electroacuten es cedido en el proceso oxidativo que tiene lugar en la superficie del
electrodo Se determina como el valor de potencial de interseccioacuten entre las recta
tangentes a la liacutenea base y la corriente de oxidacioacuten para cada velocidad de barrido
aplicada en forma experimental (005 Vs a 3 Vs en este estudio) (Figura 58) Una
vez obtenido este potencial se procede a graficar con respecto al logaritmo de la
velocidad de barrido como se presenta en la Figura 59 Se considera el valor del
intercepto de cada recta Eionset (por lo tanto a una baja velocidad de barrido) el cual
incluye el error inherente a la medicioacuten y por tanto es maacutes confiable (Tabla 51) Se
observa que estos potenciales variacutean entre 050 V y 079 V para el aacutecido gaacutelico 3 y el
aacutecido protocateacutequico 4 respectivamente potencial que da indicio de la factibilidad de
oxidacioacuten siendo el compuesto con un Eionset menor el que se oxida con mayor
facilidad Estos valores de potencial onset encontrados permitiraacuten establecer una
correlacioacuten entre el potencial de oxidacioacuten determinado de esta forma y los resultados
obtenidos en los ensayos de actividad frente a especies radicales llevados a cabo en
medio aproacutetico (seccioacuten 6)
Resultados y discusioacuten
66
Figura 58 Determinacioacuten graacutefica del valor de Eonset VC del precursor 1 01 Vs
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 59 Relacioacuten Eonset vs logv para los compuestos estudiados
-05 00 05 10 15 20
20 A
Eonset
E vs Ag|AgCl (V)
15 18 21 24 27 30 33 3606
07
08
09
10
11
12
OOH
OH
HO
OOH
OH
HO
OH
OH
OH
O
HO
OHO O
O
OOH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OOH
OH O
OH
OH
O
O
OOH
HO O
Cl
Eon
set
(V)
logv (mV12
s-12
)
Resultados y discusioacuten
67
Tabla 51 Paraacutemetros experimentales para los compuestos Determinaciones en VC
2 mM DMF + HFFTBA 02 M
Compuesto
119837119845119848119840119816119849119834120783
119837119845119848119840119855 (microAmVs
-1)
119837119816119849119834120783 119837119855120783120784
(microAmV12
s-12
)
119837119812119849119834120783
119837119845119848119840119855
(mVdec)
119835 = 120784 119837119812119849119834120783
119837119845119848119840119855
(mVdec)
Eionset
(mV)
056 36bull10-6
61 122 059
053 41bull10
-6 106 212 059
048 36bull10-6
55 110 050
O
OH
OH
HO
052 41bull10-6
44 88 079
047 40bull10-6
85 170 064
049 37bull10-6
67 134 075
044
42bull10-6
70 140 058
Con el objeto de recabar mayor informacioacuten con respecto al mecanismo de reaccioacuten
involucrado en los procesos oxidativos en estudio en base a los resultados obtenidos
OHO O
O
OOH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
O
OH
OH O
OH
OH
O
O
OOH
OH
HO
OH
OH
OH
O
HO
O
OH
HO O
Cl
Resultados y discusioacuten
68
en VC se realizoacute la graacutefica (Ipa v12
) vs v12
para los compuestos precursores 1 2 3 y
4 (escogidos por poseer un grupo catecol y ser estructuras de menor complejidad que
los derivados 9 10 y 11) Estas graacuteficas de las que se presenta el ejemplo del aacutecido
como muestra (Figura 510) presentaron una relacioacuten de tipo lineal en la que la
pendiente negativa obtenida sugiere que la reaccioacuten observada implica un mecanismo
de tipo EC considerando los estudios mencionados para compuestos fenoacutelicos
ampliamente descritos en la literatura100101105109
y el criterio de diagnoacutestico
mencionado por Pletcher y colaboradores111
Figura 510 Correlacioacuten (Ipa v12
) vs v
12 para el precursor aacutecido protocateacutequico 4
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
21 28 35 42 49 5626
28
30
32
34O
OH
OH
HO
r = -099302
V12
(mV12
s-12
)
Ipa
V12 (
A
mV
12s-1
2)
Resultados y discusioacuten
69
Diversos estudios proponen la presencia de mecanismos concertados para los procesos
redox de compuestos de tipo fenoacutelico los cuales implican la presencia de
intermediarios radicalarios y reacciones donde la transferencia de un protoacuten y un
electroacuten ocurren de forma acoplada dentro de un mismo paso Este concepto nace en la
deacutecada de 1990 a partir de los trabajos publicados por Biczoacutek y colaboradores112113
El estudio de este tipo de reacciones principalmente en derivados fenoacutelicos es de
relevancia debido al rol que eacutestos desempentildean en diferentes sistemas bioloacutegicos tanto
por su reconocida capacidad antioxidante como se evidencia en la investigacioacuten
realizada por Nakayama y colaboradores con respecto a derivados polifenoacutelicos y el
mecanismo de reaccioacuten propuesto de tipo PCET (Proton Concerted Electron Transfer)
frente al anioacuten superoacutexido114
o como en el caso de estudio de las reacciones de
transferencia electroacutenica que involucran al aminoaacutecido tirosina115ab
y otros co-factores
que forman parte esencial del proceso fotosinteacutetico que se lleva a cabo en estructuras
vegetales (Fotosistema II)116
En la deacutecada pasada los aportes a la investigacioacuten sobre el tema se tornaron maacutes
profundos y sistemaacuteticos permitiendo el modelamiento teoacuterico y anaacutelisis de este tipo
de mecanismos Debido al intereacutes concerniente a la obtencioacuten de modelos racionales
de sistemas bioloacutegicos los estudios realizados en medio proacutetico son variados como la
serie de derivados fenol-imidazol sintetizados y caracterizados por Markle y
colaboradores117
quienes entre diversos factores analizan el efecto del sustituyente
sobre el enlace O-H Otros autores como Saveacuteant Costentin y colaboradores han
abordado este toacutepico en diferentes publicaciones proponiendo distintos mecanismos
Resultados y discusioacuten
70
dependientes del pH y composicioacuten de la solucioacuten de trabajo (con buffer o sin eacutel)118
En trabajos posteriores plantean un estudio teoacuterico de modelamiento en sistemas de
tipo amino-fenol enfocados en el mencionado Fotosistema II119
y frente al sistema
enzimaacutetico superoacutexido dismutasa120
Rhile y colaboradores describen la siacutentesis
caracterizacioacuten y estudios de oxidacioacuten tanto quiacutemica como electroquiacutemica (en medio
aproacutetico acetonitrilo) de una serie de fenol-aminas junto con un anaacutelisis teoacuterico del
sistema evidenciaacutendose la presencia de especies radicales intermediarias121
junto con
valores entre 16 a 28 para la relacioacuten de efecto isotoacutepico cineacutetico (KI = kHkD) que se
estima como criterio para considerar un mecanismo concertado122
El estado del arte con respecto a los distintos mecanismos electro-oxidativos descritos
para los derivados fenoacutelicos indica que la determinacioacuten de una ruta en particular en
este proceso se puede establecer mediante estudios de naturaleza tanto experimental
como teoacuterica La obtencioacuten de paraacutemetros termodinaacutemicos como la energiacutea libre de
Gibbs el estudio de efecto isotoacutepico y la determinacioacuten de constantes de velocidad en
electroquiacutemica entre otros permiten discriminar entre las diferentes viacuteas en que se
puede llevar a cabo la electro-oxidacioacuten de fenoles
Resultados y discusioacuten
71
53 Estudio de generacioacuten de especies radicalarias mediante espectroscopia de
resonancia de espiacuten electroacutenico (REE)
A fin de evidenciar la existencia de posibles intermediarios radicalarios en el proceso
electro-oxidativo de los fenoles previamente estudiados a traveacutes de las teacutecnicas
electroquiacutemicas se procedioacute a oxidar los derivados 9 10 y 11 y medir in situ su
espectro REE Se utilizoacute la teacutecnica descrita por Le Nest y colaboradores99
en que se
describe el estudio de estructuras flavonoides polifenoacutelicas en eacutel se utiliza la
quelacioacuten con Zn2+
lo que permitioacute la estabilizacioacuten del radical formado y su posterior
estudio En primer lugar desde un punto de vista cualitativo se observoacute para cada
compuesto un evidente cambio de color en las soluciones electrolizadas las que se
tornaron de color amarillo intenso y maacutes oscuro que las soluciones de trabajo
originales lo que sugiere que tras la electroacutelisis se forma un compuesto nuevo
diferente al de partida como se esperaba En la Figura 511A-C se presentan los
espectros obtenidos junto con las respectivas simulaciones realizadas
Resultados y discusioacuten
72
Figura 511A Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido cafeico 9 estabilizado con Zn2+
en DMF + HFFTBA
(izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color
rojo)
Figura 511B Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido gaacutelico 10 estabilizado con Zn2+
en DMF + HFFTBA
(izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color
rojo)
3440 3450 3460 3470 3480 3490
O
OH
HO O
OH
OH
O
OA
Campo Magneacutetico G
3440 3450 3460 3470 3480 3490
OHO O
O
O
OH
OH
OH
OH
B
Campo Magneacutetico G
Resultados y discusioacuten
73
Figura 511C Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido protocateacutequico 11 estabilizado con Zn2+
en DMF +
HFFTBA (izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der
en color rojo)
Concordante con el resultado esperado la sentildeal espectral indica la presencia de una
especie radicalaria como intermediario de la electro-oxidacioacuten de los grupos catecol
presentes en los tres derivados en estudio
En la simulacioacuten realizada para el derivado 9 se observa el acoplamiento hiperfino de
tres aacutetomos de hidroacutegeno con los siguientes valores de constantes 132 G 098 G y
03 G que seriacutea indicio del proceso oxidativo que ocurre en el catecol del anillo
benceacutenico (Tabla 52) ya que estos valores coinciden con una interaccioacuten entre los tres
protones del anillo benceacutenico en posicioacuten 2 5 y 6 En el caso de los compuestos 10
y 11 se encontraron dos constantes de acoplamiento hiperfino lo que indica la
3440 3450 3460 3470 3480 3490
OHO O
O
OOH
OH
OH
C
Campo Magneacutetico G
Resultados y discusioacuten
74
interaccioacuten entre dos protones que seriacutean aquellos en posicioacuten 5 y 6 del anillo
cumariacutenico
Tabla 52 Constantes de acoplamiento hiperfino para los derivados polifenoacutelicos
Valores en Gauss
Compuesto aH1 G aH2 G aH3 G
132 098 030
215 156 -
235 122 -
Estos resultados concuerdan ademaacutes con lo descrito en la literatura con respecto a la
oxidacioacuten de grupos fenoacutelicos lo que permite inferir un posible mecanismo electro-
oxidativo para los derivados en estudio
O
OH
OH O
OH
OH
O
O
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
Resultados y discusioacuten
75
54 Resultados y discusioacuten de los estudios de reactividad frente a especies
radicalarias
En este punto de la investigacioacuten el objeto de estudio fue evaluar el comportamiento
de las nuevas estructuras previamente sintetizadas frente a diferentes especies
radicalarias de amplio intereacutes bioloacutegico radical peroxilo (ROObull) radical hidroxilo
(OHbull) anioacuten radical superoacutexido (O2-) junto con determinar la capacidad reductora de
los compuestos Cada ensayo fue escogido con miras de abordar el tema de la
capacidad antioxidante desde las posibilidades que permiten las experiencias de tipo in
vitro
541 Metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno
(oxygen radical antioxidant capacity-fluorescein ORAC-FL)
El estudio de especies reactivas de oxiacutegeno y nitroacutegeno asociadas a los procesos
oxidativos requiere en algunos casos del uso de compuestos denominados ldquosondasrdquo
En la teacutecnica de fluorescencia es posible implementar este tipo de metodologiacutea debido
a sus caracteriacutesticas de sensibilidad especificidad y simplicidad en la obtencioacuten de
datos convirtieacutendose en una herramienta uacutetil y ampliamente utilizada a la hora de
obtener una buena aproximacioacuten en la determinacioacuten de actividad frente a especies
EROsERNs123
Resultados y discusioacuten
76
En el caso de la metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno
(ORAC) los primeros trabajos que dan cuenta de su uso fueron descritos en la deacutecada
de 1990 a partir de la investigacioacuten de Cao y colaboradores124
En este trabajo los
autores describen la teacutecnica como un meacutetodo simple y confiable para determinar
capacidad antioxidante en serum humano en pequentildeas cantidades de muestra (del
orden de los microL) utilizando como sonda la β-ficoeritrina (proteiacutena aislada del alga roja
unicelular Porphyridium cruenturn) debido a su fluorescencia sensible a los cambios
conformacionales en su estructura en ensayos frente al radical peroxilo125
En el
desarrollo posterior Ou y colaboradores126
proponen una mejora a la teacutecnica
cambiando la sonda proteica por el compuesto fluoresceiacutena debido a su mayor foto-
estabilidad y para evitar interacciones proteiacutena-polifenol (hidrofoacutebicas y puentes de
hidroacutegeno) junto con ello realizaron la validacioacuten del meacutetodo Esta sonda es la
utilizada actualmente para este ensayo el cual es ampliamente utilizado en el estudio
de polifenoles y sus derivados127-128ab
en diferentes alimentos y bebidas129130
muestras bioloacutegicas de distinta iacutendole131
por mencionar algunos ejemplos
Para efectos de esta investigacioacuten se espera obtener un perfil de comportamiento de
cada uno de los compuestos frente al radical peroxilo (ROObull) que permita distinguir el
aporte que significa cada sustitucioacuten realizada al anillo cumarina con diferentes
grupos fenoacutelicos Cabe mencionar que las longitudes de onda maacuteximas (λmaacutex) de
absorbancia en el rango UV-visible para los compuestos ensayados estuvieron en un
rango entre los 203 nm y 329 nm En este estudio se obtuvieron los perfiles cineacuteticos
Resultados y discusioacuten
77
de consumo de la sonda fluoresceiacutena (con valores de 485525 nm para su absorcioacuten y
emisioacuten respectivamente) por induccioacuten de los radicales peroxilo (originados por
efecto de la termoacutelisis del azo-compuesto ABAP a 37 degC) A partir de estos perfiles de
decaimiento de la sonda a distintas concentraciones de compuestos antioxidantes (5 en
total) se obtuvieron curvas adecuadamente separadas como se muestra en la Figura
512 donde se muestran los resultados para el compuesto 11 como ejemplo
representativo del ensayo Posteriormente se determina para cada concentracioacuten el aacuterea
neta bajo la curva la que es graficada con respecto a las concentraciones utilizadas La
Figura 513 presenta relacioacuten lineal entre el aacuterea neta bajo la curva con respecto a la
concentracioacuten del compuesto 11 como ejemplo la que fue determinada para cada
derivado
Figura 512 Curvas para el consumo de la sonda fluoresceiacutena para un set de
concentraciones del compuesto 11
0 2000 4000 6000
02
04
06
08
10
F
F0
Tiempo (s)
control
16 M
12 M
081 M
045 M
020 M
Resultados y discusioacuten
78
Las curvas obtenidas en esta parte del experimento muestran la reaccioacuten de
competencia entre el radical y el antioxidante (el cual protege a la fluoresceiacutena del
proceso de oxidacioacuten) Posterior al procedimiento anteriormente descrito se obtuvo el
iacutendice ORAC para cada compuesto que se resume en la Tabla 54
Figura 513 Graacutefica de aacuterea neta bajo la curva ABC vs concentracioacuten del derivado 11
En este ensayo los compuestos hiacutebridos propuestos superaron en cuanto al valor de
iacutendice ORAC a la cumarina precursora 1 En los tres casos se pudo observar valores
superiores de casi el doble para el compuesto 10 y bordeando un ORAC casi tres veces
mayor en los compuestos 9 y 11 del valor obtenido para su precursor Estos resultados
evidenciaron un incremento en la capacidad antioxidante al que posee la cumarina de
manera independiente debido a la inclusioacuten de los derivados de aacutecidos
hidroxibenzoicos e hidroxicinaacutemico en su estructura (Tabla 53)
0 1 2 3 4 50
1000
2000
3000
4000
r = 099309
AB
C n
eta
Concentracioacuten (mM)
Resultados y discusioacuten
79
Tabla 53 Valores experimentales de iacutendice ORAC-FL para los compuestos
estudiados
Compuesto iacutendice ORAC-FL
(plusmnSD)
1 091 plusmn 010
2 347 plusmn 010
3 391 plusmn 009
4 069 plusmn 001
9 239 plusmn 003
10 174 plusmn 005
11 262 plusmn 004
Trolox 1
Por otra parte los valores del iacutendice ORAC de la serie fueron superiores al estaacutendar
Trolox con excepcioacuten de los compuestos 1 (cumarina de partida) y 4 (aacutecido
protocateacutequico) Para el caso de la cumarina eacutesta tuvo un valor ORAC menor a 1 En
el caso del compuesto 4 la ostensible diferencia (5 veces menor) con su homoacutelogo
aacutecido cafeico 2 deriva de la presencia del doble enlace en esta estructura aunque
ambos aacutecidos poseen igual cantidad de grupos ndashOH y en igual posicioacuten en el anillo
aromaacutetico la insaturacioacuten le confiere maacutes posibilidades de deslocalizacioacuten electroacutenica
debido a la mayor cantidad de estructuras resonantes posibles y por lo tanto mayor
Resultados y discusioacuten
80
estabilidad al formarse la especie radicalaria correspondiente en la reaccioacuten frente el
ABAP Al observar el valor obtenido para el aacutecido gaacutelico 3 se obtuvo un iacutendice
ORAC cercano al del aacutecido cafeico y aunque carece de la insaturacioacuten presente en el
derivado cinaacutemico posee en su defecto un grupo ndashOH adicional en posicioacuten 5 del
anillo aromaacutetico el cual aportoacute adicionalmente a su capacidad antioxidante (lo que no
ocurrioacute en el caso del aacutecido protocateacutequico 4)
Se observa que el aacutecido dihidroxibenzoico 4 que arrojara un valor 069 presenta un
incremento de 37 veces en su valor ORAC-FL al estar incorporado en el heterociclo
cumariacutenico En este caso se presentoacute un fenoacutemeno de sinergia positiva ya que ambos
compuestos cumarina 1 y aacutecido protocateacutequico 4 aumentaron su valor de ORAC-FL
pasando de un valor 091 y 069 de forma individual respectivamente a formar un
derivado que presentoacute un valor de ORAC-FL igual a 262 Al observar los valores
totales en los derivados 9 y 10 obtenidos no correspondieron a la sumatoria de los
iacutendices individuales de sus precursores este resultado indica que estuvo ausente el
fenoacutemeno de sinergia
Para los nuevos compuestos (9 10 y 11) se observoacute un incremento del valor de
ORAC-FL con respecto a la cumarina precursora 1 Por lo tanto la inclusioacuten delas
estructuras fenoacutelicas en el heterociclo cumariacutenico generoacute la obtencioacuten de nuevos
derivados con una mayor capacidad antioxidante en esta metodologiacutea de esta forma se
obtuvo un aporte a la reactividad de la cumarina 1
Resultados y discusioacuten
81
Los resultados obtenidos en este ensayo dan cuenta de la actividad que presentaron los
compuestos tanto precursores como derivados frente a la especie radical ROObull Un
punto importante a considerar es que este experimento ndashindependientemente de ser un
ensayo in vitro- se lleva a cabo en un medio buffer a pH 74 y a una temperatura
controlada de 37 degC lo que permite obtener una primera aproximacioacuten con respecto a
lo que seraacute la actividad de los compuestos en un medio bioloacutegico La sustitucioacuten en el
anillo cumariacutenico generoacute nuevos compuestos que superaron su capacidad antioxidante
sin embargo desde el punto de vista de los precursores aacutecidos (cafeico y gaacutelico) su
actividad se vio mermada tras la sustitucioacuten fenoacutemeno que se discute en la seccioacuten 6
La secuencia de actividad obtenida para los derivados y sus precursores fue 3 gt 2 gt 11
gt 9 gt 10 gt 1 gt 4
Junto con el ensayo anteriormente detallado se procedioacute a determinar la cantidad de
radicales que reaccionan con el compuesto antioxidante relacionando la concentracioacuten
de antioxidante aplicado la estequiometriacutea de la reaccioacuten y la velocidad de generacioacuten
de radicales peroxilo a 37 degC como se expresa en la siguiente ecuacioacuten (Burton y
colaboradores 1981)132
120591 = 119899 [119860119903119874119867]
119877119894 Ecuacioacuten 54
Resultados y discusioacuten
82
donde τ es el tiempo de induccioacuten (tiempo en el que la sonda es protegida de los
radicales peroxilo por el antioxidante) n es el valor asociado a la estequiometriacutea de la
reaccioacuten correspondiente a la cantidad de moleacuteculas de radical ROObull inactivadas por
moleacutecula de compuesto antioxidante [ArOH] es la concentracioacuten de antioxidante y Ri
es la velocidad de generacioacuten de radical peroxilo la cual estaacute directamente relacionada
con la concentracioacuten de ABAP utilizada en el ensayo (18 mM) y se determina seguacuten la
expresioacuten133
Ri = 136 bull 10-6
[ABAP] Ecuacioacuten 55
Dadas las condiciones experimentales empleadas el valor de Ri es 147 microMmin Los
resultados obtenidos del valor de la pendiente (regresioacuten lineal Ecuacioacuten 54) se
resumen en la Tabla 54
Todos los compuestos (precursores y derivados) presentan valores de n superiores a
los esperados donde en el caso extremo se tiene que una moleacutecula de aacutecido gaacutelico
estariacutea consumiendo 14 moleacuteculas de radical peroxilo resultado que es mucho mayor
al esperado Los aparentes altos valores de n como estequiometriacutea de la reaccioacuten
(n = 3 hasta n = 14) sugieren la presencia de reacciones asociadas de mayor
complejidad en las que estariacutea presente el radical alcoxilo (RObull)134
el cual se forma
por descomposicioacuten del radical peroxilo que posee una vida media del orden de los
segundos en comparacioacuten con el radical alcoxilo con una vida media del orden de los
10-6
s (y es maacutes reactivo) lo que explica esta diferencia en la estequiometria
Resultados y discusioacuten
83
Tabla 54 Valores calculados para el factor estequiomeacutetrico n
Compuesto na(plusmnSD) n
1 28 plusmn 03 3
2 39 plusmn 01 4
3 141 plusmn 14 14
4 24 plusmn 01 3
9 58 plusmn 04 6
10 49 plusmn 01 5
11 86 plusmn 01 9
a Valores calculados en triplicado
Este fenoacutemeno se ha encontrado en investigaciones previas realizadas en derivados
cumariacutenicos135
y fue descrito por Lissi y colaboradores el que se puede encontrar
ademaacutes en experimentos en los que se utiliza la sonda rojo de pirogalol (ORAC-
PGR)136137
Resultados y discusioacuten
84
542 Metodologiacutea de capacidad reductora de hierro en plasma (FRAP)
Esta metodologiacutea desarrollada por Benzie y Strain (1996)138
se propuso como una
medida de la capacidad reductora (asociada a una buena capacidad antioxidante)
enfocada a investigar procesos de estreacutes oxidativo en fluidos bioloacutegicos
Posteriormente se ha extendido al estudio de diversas matrices como extractos de
plantas medicinales139
alimentos140
compuestos puros141
por mencionar algunos
ejemplos
En este ensayo se obtuvieron los valores de la capacidad reductora de los compuestos
polifenoacutelicos la que se aprecia cualitativamente a traveacutes de la formacioacuten del complejo
de Fe2+
de color azul (Figura 514) Esta metodologiacutea involucra la reaccioacuten redox
entre el agente reductor (en este caso los derivados cumariacutenicos) y el oxidante (la sal
feacuterrica) es considerada como aproximacioacuten con respecto a la capacidad de mantener el
estatus redox dentro de la ceacutelula
En primer lugar se observoacute un comportamiento semejante al ensayo ORAC-FL en
cuanto a la tendencia que presentaron los compuestos en su capacidad reductora de
hierro lo que indica una baja probabilidad de que en este ensayo ocurriese el
fenoacutemeno de quelacioacuten propio de los catecoles La Tabla 55 presenta los datos
experimentales obtenidos
Resultados y discusioacuten
85
NN
NN
Fe 3+N
N
N
N
N
N
NN
NN
NN
Fe2+N
N
N
N
N
N
NN
Antioxidante
amarilloazul
[Fe(III) (TPTZ)2]3+ [Fe(III) (TPTZ)2]2+
Figura 514 Esquema para la reaccioacuten entre el complejo de Fe3+
y el compuesto
antioxidante reductor
Los compuestos 9 10 y 11 presentaron una mejor capacidad reductora frente a su
precursor cumariacutenico 1 Esto se explica debido a la presencia de un mayor nuacutemero de
grupos -OH presentes en las nuevas estructuras propuestas capaces de transferir
electrones y reducir la sal feacuterrica como se menciona en el trabajo de Pulido y
colaboradores142
quienes estudian una serie de polifenoles mediante esta teacutecnica
sentildealando que ademaacutes del nuacutemero de hidroxilos presentes la presencia de dobles
enlaces conjugados en el esqueleto como parte de las caracteriacutesticas estructurales
responsables de un aumento en la capacidad reductora en polifenoles
Resultados y discusioacuten
86
Tabla 55 Valores experimentales obtenidos para los compuestos en estudio ensayo
FRAP en equivalentes de Trolox10 microM de muestra
En el derivado 11 se presenta una interaccioacuten de tipo sineacutergica con respecto a los
resultados individuales de cada precursor habieacutendose obtenido un valor FRAP de
1302 y 868 equiv Trolox 10 microM de muestra para 1 y 4 respectivamente y para el
derivado final un valor de 2624 equiv Trolox 10 microM de muestra
Del mismo modo que en el ensayo anterior se observa que la sustitucioacuten en el anillo
cumariacutenico con los distintos grupos aacutecidos incrementa su potencial como especie
reductora mientras que en el caso del aacutecido cafeico y gaacutelico se aprecia una
disminucioacuten de 13 y 15 veces respectivamente en su capacidad reductora tras la
esterificacioacuten
Compuesto equiv Trolox 10 microM muestra
(plusmnSD)
1 1302 plusmn 197
2 2727 plusmn 321
3 4768 plusmn 215
4 868 plusmn 93
9 2052 plusmn 186
10 3182 plusmn 681
11 2624 plusmn 335
Resultados y discusioacuten
87
Los resultados obtenidos para esta teacutecnica entregan informacioacuten acerca de la capacidad
reductora relativa para el conjunto de compuestos ensayados capacidad que estaacute
relacionada con su actividad antioxidante Se obtuvo un orden relativo para
precursores y derivados como sigue 3 gt 10 gt 2 gt 11 gt 9 gt 1 gt 4 Con respecto a la
disminucioacuten de actividad para los aacutecidos mencionados sugiere que esta capacidad
ademaacutes del nuacutemero de ndashOH presentes estariacutea relacionada con el sustituyente ndashCOOH
que se transforma en un grupo eacutester (ver seccioacuten 6)
543 Capacidad de inactivacioacuten del radical OHmiddot teacutecnica Spin Trapping
Esta teacutecnica no destructiva permite la deteccioacuten e identificacioacuten de especies
paramagneacuteticas (con electrones desapareados) en distintas matrices El fenoacutemeno de
resonancia de espiacuten electroacutenico fue descubierto y descrito en la deacutecada de 1940 por
Zavoisky143
en sus estudios basados en sales de manganeso en distintos medios Su uso
y aplicaciones se han diversificado a numerosas aacutereas como en la determinacioacuten de
capacidad antioxidante en alimentos144
en el anaacutelisis del proceso oxidativo en
liacutepidos145
en el estudio de enfermedades parasitarias146
El creciente intereacutes de la
teacutecnica en ciencias biomeacutedicas radica en el hecho de que esta espectroscopia permite
discriminar diferentes especies radicales de intereacutes bioloacutegico estrechamente
relacionadas con el estatus redox de la ceacutelula147
cuyo desbalance se traduce en cuadros
de estreacutes oxidativo148
Resultados y discusioacuten
88
En este estudio se determinoacute la capacidad de los compuestos propuestos para inactivar
la especie radicalaria OHmiddot
mediante la teacutecnica spin trapping metodologiacutea basada en
establecer la competencia de reaccioacuten entre los antioxidantes propuestos y el spin trap
DMPO El radical se generoacute a traveacutes de la reaccioacuten de ldquoFenton no cataliacuteticordquo
(Ecuacioacuten 56) metodologiacutea que permite la generacioacuten del radical OHbull en medio
baacutesico en ausencia del ioacuten Fe como catalizador91ab
211986721198742 + 119874119867minus rarr 119874119867∙ + 1198742minus + 21198672119874 Ecuacioacuten 56
En un primer set de experimentos se procedioacute a realizar la experiencia utilizando
DMSO como solvente Se descartoacute esta opcioacuten debido a que resultoacute complejo
observar un patroacuten claro en el blanco y poder asiacute discriminar las nuevas sentildeales
espectrales a partir de la adicioacuten de los compuestos en estudio
En primer lugar se determinoacute el blanco experimental que indica la reaccioacuten de
inactivacioacuten del radical mediante el compuesto spin trap DMPO Posteriormente se
ensayaron los derivados hiacutebridos y sus precursores sinteacuteticos en dos concentraciones
033 mM y 33 mM En el caso de los experimentos realizados a la menor
concentracioacuten se aprecioacute que la disminucioacuten de la sentildeal del blanco fue miacutenima para los
siete compuestos y no se observoacute un cambio significativo en el espectro como para
obtener resultados concluyentes Considerando lo anterior los experimentos se
Resultados y discusioacuten
89
realizaron con concentracioacuten del orden de los 3 mM obtenieacutendose asiacute datos
satisfactorios en cuanto a la inactivacioacuten del radical y la posibilidad de realizar
caacutelculos sobre este valor El valor de inactivacioacuten del radical hidroxilo se calcula a
traveacutes de la disminucioacuten en la intensidad de las sentildeales al adicionar cada derivado En
cada espectro se aprecia el perfil hiperfino compuesto por cuatro liacuteneas caracteriacutesticas
correspondientes al aacutetomo de nitroacutegeno e hidroacutegeno del spin-aducto formado por
[DMPO-OH] con valores de aN y aH alrededor de 15G lo que concuerda con lo
descrito en la literatura149
para esta reaccioacuten y el espectro simulado que se presenta en
la Figura 515 El cambio experimental tras la adicioacuten de los compuestos se presenta
en color rojo (Figura 516 A-G)
N+
O-
+ OHN
O
OH
Figura 515 Espin aducto generado por la inactivacioacuten del radical OHbull y su espectro
simulado (derecha)
Resultados y discusioacuten
90
Figura 516 A Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto 4-clorometil-78-dihidroxicumarina 1 B Espectro REE de inactivacioacuten del
radical hidroxilo con adicioacuten del compuesto aacutecido cafeico 2
Figura 516 C Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto aacutecido gaacutelico 3 D Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con
adicioacuten del compuesto aacutecido 34-dihidroxi benzoico 4
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
B
Campo Magneacutetico G
compuesto 2
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
C
Campo Magneacutetico G
compuesto 3
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
D
Campo Magneacutetico G
compuesto 4
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
A
Campo Magneacutetico G
compuesto 1
control
Resultados y discusioacuten
91
Figura 516 E Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto hiacutebrido 9 F Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con
adicioacuten del compuesto hiacutebrido 10
Figura 516 G Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto hiacutebrido 11
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
G
Campo Magneacutetico G
compuesto 11
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
E
Campo Mgneacutetico G
compuesto 9
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
F
Campo Magneacutetico G
compuesto 10
control
Resultados y discusioacuten
92
Considerando los patrones espectrales obtenidos para los compuestos 9 10 y 11 se
observoacute que la sentildeal de cuadruplete correspondiente al control (spin-aducto [DMPO-
OH]) desaparecioacute casi por completo lo cual indica la inactivacioacuten del radical
hidroxilo Se observa ademaacutes un triplete con constantes de acoplamiento 1398 G y
1427 G que evidencioacute la reaccioacuten de oxidacioacuten del atrapador DMPO (Figura 517)
ya que de haberse formado el aducto entre la cumarina y el spin trap DMPO se
habriacutea obtenido el correspondiente espectro con un patroacuten de 6 liacuteneas espectrales
(Figura 518)
Figura 517 Espectro REE se destaca en rojo el triplete de integracioacuten 121
formado despueacutes de la reaccioacuten de Fenton no-cataliacutetico (izq) Espectro simulado
utilizando el programa EPR-WINSIM (der)
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
DMPO oxidado
N+
O-
+ OHNO
OH
Campo Magneacutetico G
Resultados y discusioacuten
93
cumarina + OHbull cumarinabull + H2O
cumarinabull + DMPO [cumarina-DMPO]
Figura 518 Espectro simulado para la formacioacuten del spin aducto [cumarina-
DMPO] utilizando el programa EPR-WINSIM
Como se presenta en la Tabla 56 tanto los aacutecidos orgaacutenicos como la cumarina
precursora y sus derivados presentaron reactividad muy semejante En las
condiciones de estudio para todos los compuestos se obtuvo un valor sobre el 90
indicando su poder de inactivacioacuten del radical resultado que superoacute al descrito en la
literatura para el estaacutendar Trolox
Estudios previos realizados en estructuras cumariacutenicas simples semejantes al
precursor 1 de esta investigacioacuten permiten comparar algunos resultados Peacuterez-Cruz y
colaboradores150
indican un 29 de inactivacioacuten para el derivado monohidroxilado de
la cumarina 1 diferencia que puede explicarse por la ausencia del ndashOH en posicioacuten 8
que aumenta su actividad El compuesto con grupos ndashOH en posicioacuten 6 y 7 presentoacute
un apagamiento del 51 Figueroa y colaboradores presentan tambieacuten un estudio en
que las cumarinas monohidroxiladas presentan valores de 23 y 56 de la
inactivacioacuten del radical OH corroborando lo encontrado anteriormente151
Resultados y discusioacuten
94
Tabla 56 Porcentajes de inactivacioacuten del radical hidroxilo (OHmiddot)
Compuesto de inactivacioacuten bullOH
(plusmnSD)
1 923 plusmn 74
2 983 plusmn 27
3 995 plusmn 08
4 927 plusmn 29
9 981 plusmn 18
10 982 plusmn 25
11 980 plusmn 99
Trolox 31plusmn 25a
aRef149 Figueroa R et al Future Med Chem 2013
Los resultados obtenidos con esta teacutecnica indican la reactividad relativa que tienen los
compuestos propuestos frente al radical OH Al considerar que el tiempo de vida del
radical hidroxilo y del spin trap DMPO es del orden de 10-9
s se observa que todos los
compuestos ensayados tuvieron la capacidad de competir con el DMPO en el proceso
de inactivacioacuten del radical evidenciado por la sentildeal de control que disminuyoacute casi en
su totalidad para todos los casos siendo menor en la cumarina precursora 1 y el aacutecido
4 siguiendo ambos compuestos la misma tendencia que se observara en los ensayos
Resultados y discusioacuten
95
anteriores Independientemente que el radical ensayado en este experimento es de una
alta reactividad y escasa selectividad el hecho de que se obtuvieran altos valores de
actividad para los compuestos propuestos indica que eacutestos se presentan como buenos
candidatos como inactivadores de la especie OH
Finalmente se observa que los derivados 9 10 y 11 presentaron un valor de
reactividad superior al de la cumarina precursora obtenieacutendose de esta forma un
aporte a la reactividad en cada nueva estructura propuesta frente al heterociclo de
partida 1 para este ensayo En cuanto a la reactividad relativa de la serie no se
encontroacute una diferencia significativa entre los compuestos ensayados precursores y
derivados mostraron valores cercanos en cuanto al de inactivacioacuten del radical
alrededor del 90
Resultados y discusioacuten
96
544 Estudio de reactividad frente al anioacuten radical superoacutexido O2-
Dentro de las diversas aplicaciones desarrolladas para las teacutecnicas electroquiacutemicas se
encuentran los ensayos de determinacioacuten de la capacidad antioxidante en distintos
medios152
y en muestras como bebidas153
vegetales154
mediciones in situ sobre piel
humana155
por mencionar algunos ejemplos Un reciente review (Pisoschi y
colaboradores 2015) describe las contribuciones realizadas con respecto a la
determinacioacuten de actividad antioxidante empleando exitosamente la voltametriacutea
ciacuteclica voltametriacutea de pulso diferencial voltametriacutea de onda cuadrada amperometriacutea
y potenciometriacutea156
las que ademaacutes se complementan con otras teacutecnicas en este tipo
de estudios157158
En esta parte de la investigacioacuten se determinoacute la reactividad de los compuestos frente
al anioacuten radical superoacutexido cuya generacioacuten electroquiacutemica en la superficie del
electrodo por reduccioacuten de oxiacutegeno disuelto mediante la teacutecnica de voltametriacutea ciacuteclica
ha sido ampliamente estudiada en nuestro grupo de trabajo159160110
y por otros
autores161
Como se esperaba tras la adicioacuten sucesiva de aliacutecuotas de todos los compuestos
estudiados hubo un decaimiento en la corriente de pico anoacutedica (Ipa0) (ejemplo del
resultado para el precursor 1 en la Figura 519) Esto permitioacute calcular el valor del
iacutendice antioxidante 50 (IA50) el cual se define como la concentracioacuten de sustrato
necesaria para obtener una disminucioacuten del 50 en la corriente Ipa0 Esta corriente es
Resultados y discusioacuten
97
directamente proporcional a la concentracioacuten de anioacuten superoacutexido presente por lo
que su disminucioacuten es un indicador de la capacidad del sustrato para inactivar la
especie radical generada in situ
Figura 519 Voltamogramas ciacuteclicos del par redox correspondiente al anioacuten
superoacutexido tras antildeadir aliacutecuotas del compuesto 1 DMF + HFFTBA 02 M 01 Vs
Tras obtener los voltamogramas ciacuteclicos para cada compuesto se procedioacute a
determinar el paraacutemetro adimensional (Ipa0-Ipa
SIpa
0) y se graficoacute con respecto a la
concentracioacuten de sustrato en solucioacuten (Figura 520) obtenieacutendose relaciones de tipo
lineal en que los valores del coeficiente de correlacioacuten r estuvieron entre 099777 y
097267
-10 -08 -06 -04 -02
Ipa0
10A
blanco
0049 mM
0099 mM
0149 mM
0199 mM
0249 mM
0299 mM
E vs Ag|AgCl V
Resultados y discusioacuten
98
007 014 021 02800
03
06
09
r = 099074
IA 50
(Ip
a0-
Ipa
S)
Ip
a0
Concentracioacuten mM
Figura 520 Graacutefica del paraacutemetro adimensional (Ipa0-Ipa
SIpa
0) vs concentracioacuten de
sustrato para el compuesto 1 (Destacado en verde el valor de IA50)
Junto con el valor de concentracioacuten IA50 la pendiente de las rectas entrega tambieacuten
informacioacuten con respecto a la reactividad de los compuestos frente al anioacuten
superoacutexido donde un mayor valor de la pendiente indica que el compuesto posee una
mayor actividad no obstante los autores que desarrollaron el meacutetodo hacen notar que
se utiliza preferentemente el iacutendice IA50 como valor para caracterizar de manera
adecuada la actividad de los compuestos propuestos frente el radical de forma
anaacuteloga al concepto de IC50 (concentracioacuten inhibitoria aplicada en sistemas
bioloacutegicos en relacioacuten a la cantidad de compuesto necesario para inhibir en un 50 el
crecimiento de una poblacioacuten de microorganismos)
Como se observa en los resultados (Tabla 57) la cumarina de partida 1 presenta un
valor mayor de IA50 (0187 mM) en comparacioacuten con los compuestos hiacutebridos 9 10 y
Resultados y discusioacuten
99
11 por lo que la adicioacuten de los fenoles a la estructura cumariacutenica fue un aporte a su
reactividad frente a la especie radical O2-
Tabla 57Valores de IA50 obtenidos para los compuestos estudiados
a Valor de estaacutendar Tolox ref 92
El derivado de aacutecido gaacutelico 10 presentoacute el menor valor de iacutendice antioxidante y por
consiguiente fue el mejor inactivador del anioacuten superoacutexido formado en la superficie
del electrodo puesto que se necesita una menor concentracioacuten de este derivado
(0064 mM) para apagar el 50 radical Junto con esto fue el compuesto que presentoacute
el fenoacutemeno de sinergia dentro de la serie con un valor de concentracioacuten menor
Compuesto IA 50 mM
(plusmnSD)
1 0183 plusmn 0007
2 0125 plusmn 0006
3 0104 plusmn 0004
4 0115 plusmn 0005
9 0141 plusmn 0011
10 0064 plusmn 0004
11 0137 plusmn 0002
Troloxa
197
Resultados y discusioacuten
100
requerida para inactivar el radical con respecto a cada uno de sus precursores (1 y 3)
El segundo mejor inactivador de O2-
fue el compuesto 11 con un valor de IA50 de
0137 mM y finalmente se tiene al derivado 9 con 0141 mM Este comportamiento
puede deberse a fenoacutemenos de difusioacuten de las moleacuteculas en el medio junto con su
reactividad en la superficie del electrodo
En este ensayo frente al radical O2-
al igual que el anterior (inactivacioacuten de la especie
OHbull) se pudo obtener informacioacuten con respecto al comportamiento de los
compuestos en un medio aproacutetico resultados que son de intereacutes ya que se pueden
considerar como una aproximacioacuten quiacutemica de tipo in vitro de los conocidos
fenoacutemenos de estreacutes oxidativo que ocurren en estructuras como las bio-membranas
donde participan especies reactivas oxigenadas161162
Finalmente se puede establecer un orden estimativo para la actividad de los derivados
y la cumarina 10 gt 3 gt 4 gt 2 gt 11 gt 9 gt 1 Todos los compuestos ensayados tuvieron
una reactividad superior al estaacutendar Trolox
Resultados y discusioacuten
101
545 Determinacioacuten de capacidad antioxidante celular (CAC)
Con el objeto de abordar los fenoacutemenos que involucran especies radicalarias
presentes en sistemas vivos se procede a realizar el estudio de la capacidad
antioxidante de los compuestos en un modelo bioloacutegico simple En este experimento
se utiliza la sonda DCFH-DA la cual difunde pasivamente a traveacutes de la membrana
celular al ingresar al citosol se transforma en el compuesto DCFH (no fluorescente)
que emite al entrar en contacto con especies oxidantes del tipo EROs y ERNs En los
experimentos realizados las ceacutelulas fueron estresadas mediante el compuesto ABAP
(generador de radical peroxilo) y se observoacute coacutemo los nuevos derivados en estudio
podiacutean contrarrestar este evento oxidativo al interior de la ceacutelula Los resultados
obtenidos se resumen en la Tabla 58
Los valores experimentales obtenidos en esta etapa indicaron una bio-disponibilidad
baja con una CAC menor al 50 para los nuevos compuestos 9 10 y 11 ademaacutes en
todos los casos se encontroacute un porcentaje menor de CAC de los derivados respecto a
los precursores respectivos 1 2 3 y 4 Para una concentracioacuten de 10 microM de
compuesto se obtuvieron valores muy semejantes (alrededor del 70) para los
precursores ensayados
Resultados y discusioacuten
102
Tabla 58 Valores obtenidos para la capacidad antioxidante celular (CAC)
concentraciones 1 microM y 10 microM de cada compuesto
Compuesto CAC 1 microM CAC 10 microM
1 696plusmn 50 727plusmn 13
2 730plusmn 26 739plusmn 07
3 662plusmn 19 701plusmn 01
4 477plusmn 25 665plusmn 26
9 381plusmn 55 499plusmn 66
10 178plusmn 45 395plusmn 128
11 345plusmn 31 234plusmn 108
En los resultados anteriores llaman la atencioacuten los bajos valores obtenidos en el
ensayo de CAC para los derivados polifenoacutelicos en comparacioacuten con los ensayos
realizados en sistemas no bioloacutegicos en que se obtuvieron buenos resultados en ellos
se pudo apreciar el fenoacutemeno de sinergia (en algunos casos) y un incremento en la
actividad de todos los derivados frente a la cumarina precursora de forma individual
Para explicar este comportamiento y complementar estos resultados se procedioacute a
seleccionar de manera racional los tres derivados obtenidos 9 10 y 11 y se determinoacute
su Hidrofobicidad Relativa en conjunto con el precursor cumariacutenico 1 (el cual
presentoacute valores de CAC alrededor del 70 cercano a lo obtenido en los precursores
Resultados y discusioacuten
103
aacutecidos) ensayo que entrega informacioacuten con respecto a la lipofilia relativa de la serie
(en funcioacuten de tiempos de retencioacuten) pudiendo dar respuesta al fenoacutemeno observado
555 Estudio de hidrofobicidad relativa
En el estudio de nuevos compuestos disentildeados como potenciales faacutermacos una de las
propiedades fisicoquiacutemicas de intereacutes es la lipofilia valor que puede determinarse
mediante distintos meacutetodos electroforesis capilar cromatografiacutea liacutequida de alta
resolucioacuten (HPLC) y determinando el coeficiente de particioacuten aguaoctanol entre
otras Junto con la metodologiacutea empiacuterica se han desarrollado diversas herramientas
computacionales con softwares que permiten calcular el valor para logP y logD
obtenieacutendose buenas correlaciones entre compuestos de una familia de estructuras
semejantes en los que se realizan variaciones a su esqueleto Los valores asiacute
calculados y entregados por el programa se consideran de una confiabilidad
razonable163
En el caso de este estudio se determinoacute la lipofilia relativa para los derivados 9 10 y
11 junto con el precursor 1 mediante HPLC en fase reversa donde se espera obtener
una serie relativa de tiempos de retencioacuten entre los compuestos que deacute cuenta de su
lipofilia Se utilizoacute esta teacutecnica por tratarse de una medicioacuten simple raacutepida y
ampliamente descrita en la literatura para nuevos compuestos en que la fase
estacionaria de la columna C18 simula la fase no polar y la fase moacutevil es la fase
Resultados y discusioacuten
104
acuosa asiacute a traveacutes de la columna se llevan a cabo muacuteltiples equilibrios de particioacuten
entre la fase acuosa y orgaacutenica En la medida en que el compuesto analizado sea maacutes
afiacuten a la fase estacionaria (relacionado con un mayor tiempo de retencioacuten) eacuteste seraacute
maacutes lipofiacutelico y viceversa Los resultados (Tabla 59) muestran que de acuerdo a los
tiempos de retencioacuten obtenidos (5138 5760 4031 y 4695 minutos) el orden
relativo de lipofilia fue el siguiente
Tabla 59 Valores obtenidos para el tiempo de retencioacuten experimental de los
compuestos
Compuesto Tiempo de retencioacuten
(min)
1 5138
9 5760
10 4031
11 4695
La Figura 521 indica el orden de lipofilia relativa encontrada para los derivados y su
precursor cumariacutenico En forma general se observaron valores de tiempo de
retencioacuten cercanos Se aprecioacute que el derivado de aacutecido cafeico 9 fue el compuesto
que encabezoacute la serie lo que se puede explicar debido a la presencia de un doble
enlace en su estructura confirieacutendole mayor apolaridad (por tanto hidrofobicidad) a
Resultados y discusioacuten
105
O
OH
HO O
Cl
O
OH
OH O
OH
OH
O
O
OHO O
O
O
OH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
la moleacutecula El segundo en la serie fue el compuesto clorado 1 en el cual el
sustituyente haloacutegeno es un aporte a la lipofilia del compuesto En el caso de las
estructuras 10 y 11 se encontroacute que el derivado de aacutecido gaacutelico presentoacute el menor
valor relativo debido a la presencia de un grupo ndashOH adicional en el anillo aromaacutetico
que como se esperaba tuvo la mayor tendencia hidrofiacutelica
9 1 11 10
Figura 521 Hidrofobicidad relativa de los derivados y la cumarina precursora
Para complementar este resultado experimental se realizoacute el caacutelculo teoacuterico para el
valor de logD mediante herramienta Marvin Sketch del software libre ChemAxon164
y
se establecioacute su correlacioacuten con el valor experimental obtenido para CAC en
concentracioacuten 10 microM El resultado de esta correlacioacuten se presenta en la Figura 522
Aumento de la lipofilia = aumento en el tiempo de retencioacuten
Resultados y discusioacuten
106
Figura 522 Correlacioacuten entre el valor de logD teoacuterico y CAC experimental a
10 microM de cada compuesto El valor logD se obtuvo a traveacutes de la herramienta Marvin
Sketch del software ChemAxon164
Considerando estos resultados para este modelo experimental propuesto en el ensayo
de CAC se observa que la lipofilia no seriacutea el uacutenico factor relacionado con los bajos
valores de capacidad antioxidante celular (CAC) obtenidos para los compuestos 9 10
y 11 ya que por ejemplo la cumarina 1 presentoacute valores de CAC sobre el 70 y fue
el segundo compuesto de la serie de hidrofobicidad relativa experimental con un
valor cercano de tiempo de retencioacuten al derivado 9 (el cual tuvo valores de CAC bajo
el 50) De igual forma se aprecia la misma tendencia al correlacionar el valor de
CAC con el logD teoacuterico donde el compuesto 1 independientemente de tener una
lipofilia semejante a los derivados polifenoacutelicos (al igual que en la serie de tiempos
de retencioacuten) siacute mostroacute una biodisponibilidad superior a los derivados y muy
-3 -2 -1 0 1 2 3 4
20
40
60
80
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OOH
HO O
Cl
OHO O
O
OOH
OH
OH
OOH
OH O
OH
OH
O
O
logDteor
C
AC
(1
0
32
4
Resultados y discusioacuten
107
semejante a los aacutecidos benzoicos (2 3 y 4) los cuales muestran valores negativos de
logD debido a su menor lipofilia
Por tratarse de un sistema bioloacutegico (ceacutelulas epiteliales) con muacuteltiples variables que
afectan la actividad de los compuestos estudiados se pueden considerar diversos
factores presentes en el medio ensayado que pueden dar respuesta al fenoacutemeno
observado Uno de ellos es la estructura de la membrana celular que contiene diversas
estructuras como por ejemplo el citocromo P (CYP) que es un complejo enzimaacutetico
involucrado en el metabolismo de faacutermacos siacutentesis de biomoleacuteculas y diversas
biotransformaciones de moleacuteculas a nivel celular165
Otro factor presente es la
existencia de enzimas hidroliacuteticas en el citosol celular como es el caso especiacutefico de
las carboxilesterasas (presentes en ceacutelulas epiteliales de intestino hiCE y otros
oacuterganos) las cuales son capaces de escindir diversos grupos funcionales tales como
amidas eacutesteres carbamatos y convertirlos en sus respectivos precursores (alcohol y
aacutecido) 166
Considerando que para este experimento en un modelo bioloacutegico in vitro simple se
emplearon ceacutelulas epiteliales de intestino (EAhy 926 (ATCC CRL-2922)) es posible
que el comportamiento observado se deba a la existencia de diversos fenoacutemenos e
interacciones posibles de los compuestos tanto a nivel de membrana como de
citoplasma Cabe destacar que al comparar las experiencias realizadas en un medio no
bioloacutegico los resultados en este caso se invierten al emplear una metodologiacutea que
involucra un medio bioloacutegico No necesariamente se encuentra un comportamiento
Resultados y discusioacuten
108
anaacutelogo en ambos medios de ensayo debido a la mayor complejidad y variables
asociadas a un sistema que involucra estructuras vivas independientemente de la
simplicidad o lo acotado del mismo
556 Estudios Teoacutericos optimizacioacuten de estructuras y determinacioacuten del Iacutendice
de Fukui
Con el objeto de racionalizar el estudio realizado y poder discriminar entre los
distintos sitios reactivos de los derivados se determinoacute el iacutendice de Fukui fk0
relacionado con un ataque de tipo radicalario Baacutesicamente es el promedio
correspondiente a las reacciones de ataque nucleofiacutelico fk- y electrofiacutelico fk
+(Ecuacioacuten
57) como se describe en el trabajo de Aliaga y Lissi donde se aborda el estudio
teoacuterico y experimental que compara la actividad anti-radicalaria de los polifenoles
rutina y quercetina167
1198911198960 =
119891119896minus+ 119891119896
+
2 Ecuacioacuten 57
Este iacutendice es un descriptor de reactividad local en los aacutetomos de oxiacutegeno que
participan en las reacciones de los grupos catecol presentes Este tipo de anaacutelisis
resulta adecuado para determinar los sitios de reaccioacuten preferentes en moleacuteculas
complejas con diversos centros reactivos168
Los resultados obtenidos indican que en
Resultados y discusioacuten
109
la cumarina precursora 1 el ataque radicalario ocurriraacute primero en el oxiacutegeno en
posicioacuten 7 debido al mayor valor de fk0
(0071) por otra parte no se observaron
cambios significativos en los valores de fk0 al formar parte de los derivados 10 y 11
para los aacutetomos de oxiacutegeno en posicioacuten 7 y 8 (aquellos involucrados en la capacidad
antioxidante de la moleacutecula) Al formar parte del derivado 9 si se observa una
disminucioacuten en su reactividad (fk0
O7 = 00078 y fk0
O8 = 00021) haciendo menos
probables estos dos sitios a un ataque radicalario en la moleacutecula (Tabla 510)
Los valores obtenidos para el iacutendice de Fukui indican que en el derivado 9 el sitio
maacutes probable para un ataque radicalario seraacute el catecol presente en el anillo benceacutenico
(proveniente del aacutecido cafeico) de preferencia en el oxiacutegeno en posicioacuten 4
(fk0
O4 = 00489) A diferencia del derivado de aacutecido cafeico en el caso de los
compuestos 10 y 11 el sitio preferente de reaccioacuten seraacute el anillo cumariacutenico
conservaacutendose el oxiacutegeno en posicioacuten 7 del heterociclo como sitio maacutes reactivo En
las Figuras 523 a 526 se presentan las estructuras optimizadas en 3D para el
precursor 1 y sus derivados polifenoacutelicos 9 10 y 11
Resultados y discusioacuten
110
Tabla 510 Valores de Iacutendice de Fukui fk para los compuestos en estudio
Compuesto Iacutendice de Fukui
fk0
Iacutendice de Fukui
fk-
O7 00771
O7 01373
O8 00391
O8 00757
O7 00078 O7 00072
O8 00021 O8 00036
O3 00389 O3 00779
O4 00489 O4 00890
O7 00719 O7 01276
O8 00365 O8 00716
O3 00025 O3 00050
O4 00025 O4 00049
O5 00002 O5 00004
O7 00739 O7 01316
O8 00378 O8 00742
O3 00004 O3 00008
O4 00003 O4 00005
OHO O
O
OOH
OH
OH
7
8
3
4
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
7
8
3
4
5
OOH
HO O
OH
OH
O
O
7
8
3
4
O
OH
HO O
Cl
7
8
Resultados y discusioacuten
111
OOH
OHO
Cl
Figura 523 Estructura optimizada en 3D para el precursor 1 utilizando DFT
OOH
OH O
OH
OH
O
O
Figura 524 Estructura optimizada en 3D para el derivado 9 utilizando DFT
Resultados y discusioacuten
112
Figura 525 Estructura optimizada en 3D para el derivado 10 utilizando DFT
OHO O
O
OOH
OH
OH
Figura 526 Estructura optimizada en 3D para el derivado 11 utilizando DFT
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
Resultados y discusioacuten
113
6 Discusioacuten General
Respecto del posible mecanismo de reaccioacuten electro-oxidativo se consideran las
siguientes evidencias teoacutericas y experimentales
En primer lugar como se esperaba los experimentos electroquiacutemicos de electro-
oxidacioacuten de los compuestos mostraron las sentildeales correspondientes a los grupos
ndashOH presentes en todas las estructuras Junto con esto los resultados de la graacutefica
Ipa vs vfrac12
indican la existencia de un proceso di-electroacutenico en los precursores y los
derivados (para la primera sentildeal oxidativa) lo que implica que comparten el mismo
mecanismo
Posteriormente se comproboacute la existencia de la especie radicalaria detectada mediante
oxidacioacuten electroquiacutemica seguida por resonancia de espiacuten electroacutenico con los
respectivos resultados de las simulaciones espectrales realizadas
En un siguiente punto se determinaron los valores teoacutericos de reactividad local
encontrados mediante el caacutelculo del iacutendice de Fukui El valor de fkndash
permitioacute
identificar los lugares con mayor reactividad frente a un ataque electrofiacutelico por tanto
las zonas en la moleacutecula puntuales con un alto valor para este iacutendice tenderaacuten a ceder
electrones con mayor facilidad en un proceso oxidativo Las estructuras optimizadas
en 3D indican que las zonas en color celeste (Figuras 523-526) corresponden a
aquellas con mayor densidad electroacutenica y por tanto estaacuten maacutes propensas a ceder
Resultados y discusioacuten
114
electrones en un proceso oxidativo Las zonas color lila representan los sitios con
menor densidad electroacutenica Para el compuesto 1 los ndashOH en el heterociclo presentan
mayor densidad electroacutenica lo que se aprecia de igual forma en los derivados 10 y 11
mientras que la zona del anillo benceacutenico se presenta con una baja densidad
electroacutenica Un fenoacutemeno diferente se aprecia para el derivado 9 donde la mayor
densidad electroacutenica se aprecia en la estructura benceacutenica cuyos grupos ndashOH
presentan el mayor valor de fk-
Este resultado teoacuterico racional complementa lo observado en el experimento descrito
con REE y electro-oxidacioacuten conjunta ya que los valores para las constantes de
acoplamiento hiperfino obtenidas en cada caso tambieacuten sentildealaron en cuaacutel de los dos
catecoles presentes ocurre la formacioacuten de la especie radical y por ende doacutende se
inicia el proceso de oxidacioacuten resultados corroboradas con el estudio teoacuterico
realizado De esta forma para el derivado 9 el proceso oxidativo se inicia en los -OH
ubicados en posicioacuten 3 y 4 que presentaron valores de fkndash
00779 y 00890
respectivamente y cuyas constantes de acoplamiento hiperfino son coherentes con
una interaccioacuten que involucra tres protones aquellos ubicados en las posiciones 2 5 y
6 del anillo benceacutenico El mismo anaacutelisis realizado para las estructuras 10 y 11 indica
que el proceso oxidativo ocurre primero en el anillo de la cumarina en los -OH en
posicioacuten 7 y 8 con valores del descriptor de reactividad local fkndash de 01276 y 00716
respectivamente para el derivado de aacutecido gaacutelico y en el caso del derivado de aacutecido
protocateacutequico con fkndash 01316 y 00742 para los oxiacutegenos en posicioacuten 7 y 8 De igual
forma los valores para las constantes de acoplamiento fueron consistentes con esta
Resultados y discusioacuten
115
informacioacuten experimental evidenciando la interaccioacuten entre dos protones (aquellos en
posicioacuten 5 y 6 del heterociclo cumariacutenico)
Esta diferencia encontrada para el proceso electro-oxidativo entre los derivados se
puede explicar debido a la existencia de un doble enlace conjugado adicional presente
soacutelo en el compuesto 9 derivado del aacutecido cafeico (ausente en 10 y 11) el cual le
confiere mayor deslocalizacioacuten (estabilidad) al radical que se forma como
intermediario en el proceso oxidativo
Los estudios presentes en la literatura sobre la oxidacioacuten de estructuras polifenoacutelicas
en medio aproacutetico presentan evidencias tanto teoacutericas como empiacutericas que ampliacutean la
visioacuten sobre la complejidad y posibilidades mecaniacutesticas en la oxidacioacuten de
estructuras polifenoacutelicas Basadas en modelos de naturaleza bioloacutegica como el
Fotosistema II presente en estructuras vegetales y otros ejemplos se plantea que una
viacutea de oxidacioacuten factible es a traveacutes de un mecanismo de tipo concertado donde se
obtiene el radical fenoxil (ArObull) en un paso directo en que el protoacuten y el electroacuten se
transfieren de manera conjunta (Figura 61 destacado en rojo) planteamiento que
considera factores de tipo energeacutetico a diferencia de los estudios claacutesicos con respecto
a este proceso seguacuten el cual la electro-oxidacioacuten se inicia con la peacuterdida de 1ē (etapa
electroquiacutemica) para formar el catioacuten radical(ArObull+) seguido de la peacuterdida de un
H+(etapa quiacutemica) para formar el radical fenoxil (ArObull) (Figura 62)
En el caso de los compuestos estudiados en esta investigacioacuten los valores de la
pendiente de Tafel encontrados para los compuestos (sobre 88 mVdec) sugieren que
Resultados y discusioacuten
116
el mecanismo de electro-oxidativo que maacutes se ajusta a la evidencia experimental es
por etapas
OH
HO
OH
HO
O
HO
O-
HO
-e- + B
+e- + HB+
+ B-e-
+e-
+e-
-e-
+ HB+
+ B
+HB+
Figura 61 Esquema de reaccioacuten para un mecanismo concertado de electro-
oxidacioacuten fenoacutelica Adaptacioacuten referencia 120
OH
HO - e
+ e
OH
HO
-H+
O
HO
Figura 62 Esquema de reaccioacuten para estructuras fenoacutelicas mecanismo electro-
oxidativo en etapas
Resultados y discusioacuten
117
Con respecto a los ensayos de actividad antioxidante realizados la Tabla 61 permite
comparar y estimar en conjunto los resultados obtenidos a traveacutes de las diferentes
metodologiacuteas empleadas
En forma general los resultados indican que la sustitucioacuten propuesta en esta
investigacioacuten en la cumarina dihidroxilada (utilizada como esqueleto de partida) con
distintas estructuras polifenoacutelicas entregoacute resultados positivos en cuanto al aporte
que los nuevos derivados obtenidos presentaron frente a la inactivacioacuten de especies
radicalarias tales como O2- ROO˙ OH˙ y su capacidad reductora (reflejada en el
ensayo FRAP) Para los ensayos realizados en un modelo no bioloacutegico se obtuvieron
valores de actividad en los derivados que superaron a los obtenidos para el precursor
cumariacutenico de forma individual
Cabe mencionar que en los diferentes ensayos y sus resultados se mencionan los
conceptos de reactividad y actividad de los compuestos En el caso de los ensayos
ORAC-FL y FRAP se habla soacutelo de actividad antioxidante ya que con la informacioacuten
que entregan no se puede determinar cuaacutel de los distintos grupos ndashOH presente en la
moleacutecula es el que reacciona primero Diferente es lo que ocurre en el ensayo frente
al radical hidroxilo en que se establece una competencia entre el atrapador (DMPO) y
el compuesto por inactivar al OHbull debido a que ambos tienen una vida media corta
(10-9
s) por tanto la reaccioacuten entre el antioxidante y el radical es raacutepida y el ndashOH maacutes
reactivo de la moleacutecula es el que inactiva a la especie y se puede mencionar como
reactividad Lo mismo ocurre para el ensayo frente al anioacuten radical superoacutexido en que
tambieacuten se mencionan los resultados como reactividad frente al radical
Resultados y discusioacuten
118
Tabla 61 Cuadro comparativo de los resultados en la determinacioacuten de capacidad
antioxidante para la cumarina y sus derivados
Compuesto ORAC-FL
FRAP
eq Trolox
10 microM
inactivacioacuten
OHmiddot
CAC
1 microM 10 microM
O2-
IA 50 mM
1 091 plusmn 003 1302plusmn 160 923 plusmn 74 696 plusmn 50 727 plusmn 13 0183plusmn0007
2 347 plusmn 010 2727 plusmn 321 983 plusmn 27 730plusmn 26 739plusmn07 0125 plusmn 0006
3 391 plusmn 009 4768 plusmn 215 995 plusmn 08 662plusmn 19 701plusmn01 0104 plusmn 0004
4 069 plusmn 001 868 plusmn 93 927 plusmn 29 477plusmn 25 665plusmn26 0115 plusmn 0005
9 239plusmn0027 2052 plusmn151 981 plusmn 18 381plusmn55 499 plusmn 66 0141plusmn0011
10 174 plusmn 005 28046plusmn188 982 plusmn 25 178plusmn45 395 plusmn128 0064plusmn0004
11 262 plusmn 004 2624 plusmn 236 980 plusmn 99 345plusmn31 234 plusmn 108 0137plusmn0002
Por otra parte en los ensayos ORAC-FL y FRAP se observoacute que los valores de
actividad para los aacutecidos cafeico 2 y gaacutelico 3 fueron superiores a los obtenidos para
sus derivados hiacutebridos 9 y 10 respectivamente En el ensayo frente al anioacuten
superoacutexido se encontroacute que los aacutecidos cafeico 2 y protocateacutequico 4 presentaron
resultados superiores en cuanto a reactividad que sus respectivos derivados hiacutebridos 9
y 11
Resultados y discusioacuten
119
En la literatura se encuentra la caracterizacioacuten de los aacutecidos benzoicos y otros
antioxidantes polifenoacutelicos naturales como moleacuteculas altamente polares lo que en
algunos limita su uso en medios como bio-membranas emulsiones y micelas por lo
que la formacioacuten de sus derivados eacutesteres se utiliza como una estrategia para
aumentar su lipofilia y por lo tanto la biodisponibilidad de estos compuestos en
medios no acuosos169170
investigacioacuten que ha dado origen a la formulacioacuten de los
denominados ldquoantioxidantes lipofiacutelicosrdquo171172
los que han demostrado ser eficientes
como antioxidantes en bio-membranas resultados que se describen en el trabajo
realizado por Tai y colaboradores donde se ensayaron eacutesteres de aacutecido vainilliacutenico
que ademaacutes de presentar buenos valores de iacutendice ORAC-FL inhibieron el proceso
de hemoacutelisis en eritrocitos de mamiacutefero173
Junto con lo anterior estaacute descrita la relacioacuten existente entre la estructura de los
aacutecidos benzoicos y su actividad antioxidante la que es atribuida a diversas
caracteriacutesticas presentes en su esqueleto tales como i) nuacutemero y posicioacuten de grupos ndash
OH en la moleacutecula ii) sustituyentes alcoxilo en posicioacuten orto al ndashOH iii) presencia
de grupos -COOH -COOR -CH=CH-CH2-174
Al apreciar las estructuras de los
derivados propuestos se infiere que las diferencias encontradas en la actividad de los
aacutecidos antes y despueacutes de la unioacuten a la cumarina estaacuten relacionadas con dicha
sustitucioacuten En el caso del aacutecido gaacutelico que presenta un valor de ORAC de 391 frente
a un valor de 174 para su derivado 10 y en el ensayo FRAP se encontroacute un valor de
4768 vs un 3182 para el hiacutebrido se puede sentildealar que no se aprecioacute un aumento de
Resultados y discusioacuten
120
actividad antioxidante para los eacutesteres con respecto al aacutecido del que provienen seguacuten
con lo descrito por algunos autores175176
Junto con lo anterior se forma un eacutester de
aacutecido gaacutelico con un sustituyente voluminoso (la estructura cumariacutenica) pudiendo
disminuir la coplanaridad en el sistema aromaacuteticocarbonilo lo que implica una menor
estabilizacioacuten del radical formado en la reaccioacuten frente a la especie ROObull para el
ensayo ORAC-FL y la capacidad reductora en el ensayo FRAP Otro punto a
considerar es que para este derivado se observa el fenoacutemeno mencionado por Rice-
Evans175
y otros autores con respecto a que un nuacutemero mayor de grupos ndashOH en el
anillo benceacutenico no implica necesariamente un aumento en la actividad antioxidante
de un derivado polifenoacutelico
Para el caso observado en el aacutecido cafeico y su derivado 9 se aprecia el mismo
fenoacutemeno de disminucioacuten de actividad del aacutecido 2 frente al eacutester como lo descrito
para el aacutecido gaacutelico y su derivado en los ensayos ORAC-FL y FRAP con la
diferencia que esta disminucioacuten no es tan draacutestica lo que se atribuye a la presencia del
doble enlace en la estructura que confiere mayor estabilidad por resonancia al radical
formado
El valor de reactividad local del iacutendice de Fukui fk0
-relacionado con los fenoacutemenos
de ataque radicalario- entregoacute informacioacuten con respecto a los sitios de los derivados
donde la actividad anti-radicalaria es maacutes probable Asiacute para el compuesto 9 esta
actividad ocurre en el anillo benceacutenico en primer lugar y posteriormente en la
cumarina Para los derivados 10 y 11 la mayor probabilidad de que se produzca el
Resultados y discusioacuten
121
ataque radicalario es en el heterociclo cumariacutenico y posteriormente en el catecol del
anillo benceacutenico Estos resultados corroboran con los valores experimentales y las
simulaciones realizadas en espectroscopia de resonancia electroacutenica de espiacuten (REE)
donde la actividad antioxidante del compuesto 9 ocurre con mayor probabilidad en el
anillo benceacutenico proveniente de la fraccioacuten del aacutecido cafeico (donde se encuentra el
doble enlace que le confiere mayor estabilidad al radical formado como intermediario
de reaccioacuten) mientras que en los derivados 10 y 11 esta actividad ocurre en el
heterociclo cumariacutenico
Se observa que los resultados de capacidad antioxidante para los derivados
polifenoacutelicos variaron entre un meacutetodo y otro no hubo correlacioacuten entre los valores
obtenidos en la capacidad antioxidante obtenidos en las distintas metodologiacuteas Este
resultado concuerda con lo esperado ya que cada experiencia realizada implica una
especie radicalaria diferente y cada una de ellas posee reactividades distintas (t12 O2-
del orden de los ms t12 OHbull ~ 10-9
s t12 ROObull ~ 10 ms) Para cada ensayo se
obtuvo un distinto orden relativo de reactividad entre los derivados y sus precursores
Se establece la relacioacuten entre el potencial Eonset y los resultados obtenidos en el
ensayo de capacidad antioxidante frente a anioacuten superoacutexido realizado en medio
aproacutetico (Figura 63) Para el ensayo de reactividad frente a O2-
se puede establecer
una correlacioacuten donde una disminucioacuten en el potencial de oxidacioacuten disminuye el
valor de IA50 para 5 de los 7 compuestos estudiados Por tanto a medida que el
Resultados y discusioacuten
122
potencial se hace menos positivo aumenta la reactividad de los compuestos frente al
anioacuten superoacutexido presentaacutendose una relacioacuten entre actividad antioxidante y Eonset
para este ensayo
Figura 63 Correlacioacuten entre el potencial de oxidacioacuten Eonset y los ensayos frente a
anioacuten superoacutexido
Un menor potencial de oxidacioacuten para los grupos ndashOH presentes en los compuestos
implica una mayor facilidad para oxidarse (por ende una mayor densidad de carga
electroacutenica para ceder) y por tanto un incremento en la capacidad antioxidante para
este ensayo
Se puede observar que el compuesto 4 (aacutecido protocateacutequico) posee un valor de IA50
de 0115 mM el cual se encuentra entre los valores encontrados para el aacutecido cafeico
y el aacutecido gaacutelico pero su valor de Eonset es mayor diferenciaacutendose de la tendencia
049 056 063 070 077
006
009
012
015
018
11
3
1
42
9
10
Eonset
vs Ag|AgCl V
IA50
mM
Resultados y discusioacuten
123
encontrada Junto con lo anterior el compuesto 4 presentoacute el menor valor para la
pendiente de Tafel (b = 88 mVdec) de toda la serie lo que sugiere una relacioacuten entre
el mecanismo de oxidacioacuten y la capacidad de reaccionar frente a la especie
radicalaria El compuesto 10 presentoacute el mejor valor para IA50 y tambieacuten se diferencia
de la serie de compuestos con respecto al Eonset (cercano al del compuesto 4) a
diferencia del aacutecido su pendiente de Tafel (b = 134 mVdec) indica la presencia de
dimerizaciones posteriores a la formacioacuten del radical fenoxil (y generacioacuten de
compuestos nuevos que tambieacuten pueden reaccionar con el radical) sugiriendo que
ademaacutes del mecanismo de oxidacioacuten hay otros factores que pueden influir como por
ejemplo la difusioacuten de las especies en el medio empleado
El estudio de los compuestos frente al radical hidroxilo reflejoacute que en las condiciones
experimentales empleadas los resultados fueron semejantes por cuanto los valores de
inactivacioacuten del radical en todos los casos fue sobre el 90 Debido a lo anterior se
descarta realizar la correlacioacuten con el potencial Eonset ya que no encontroacute una
diferencia significativa entre los compuestos
Finalmente al considerar los resultados obtenidos para la capacidad antioxidante
celular en un modelo bioloacutegico simple un punto a tener en cuenta es el hecho de que
esta metodologiacutea en particular adolece en cuanto a que es inespeciacutefica con respecto a
la cantidad de compuesto que ingresa en la ceacutelula ya que por las distintas lipofilias
observadas los compuestos tendraacuten una diferente capacidad de ingreso al medio y no
se puede determinar la relacioacuten existente entre la cantidad que ingresa a la ceacutelula
Resultados y discusioacuten
124
versus la reactividad Debido a lo anteriormente descrito estos resultados muestran
principalmente un reflejo de la capacidad de penetracioacuten que tienen los compuestos
hacia el interior de la ceacutelula
Un modo de abordar temaacuteticas de tipo multi-variable-donde se deben considerar
numerosos factores involucrados en un comportamiento o fenoacutemeno- es el empleo de
modelos teoacuterico-computacionales como QSAR (por su sigla en ingleacutes Quantitative
Structure-Activity Relationships) herramienta que se utiliza en la estimacioacuten de
propiedades bioloacutegicas y fisicoquiacutemicas de intereacutes en diversas moleacuteculas entre ellas
polifenoles177
El factor esteacuterico tiene un papel importante en los estudios realizados en medios
celulares siendo el tamantildeo molecular uno de los factores considerados en ensayos de
permeabilidad en futuros faacutermacos ya que un excesivo tamantildeo (entre otras cosas)
dificulta la solubilidad en medio acuoso asiacute como tambieacuten la difusioacuten pasiva de las
moleacuteculas163
Al observar el peso molecular de los compuestos derivados (entre
34427 gmol y 37031 gmol) se puede considerar que el efecto esteacuterico en este caso
no seriacutea la causa principal para el fenoacutemeno observado en el ensayo celular ya que
estaacute descrito que los compuestos no deberiacutean superar un peso de 500 gmol 163
_que no es el caso de estos derivados-
Los resultados obtenidos para este ensayo realizado en un modelo bioloacutegico simple
sugieren que la actividad de los derivados para reaccionar frente a especies
radicalarias podriacutea estar circunscrita a medios lipofiacutelicos como las membranas
Resultados y discusioacuten
125
bioloacutegicas estudio que se podriacutea profundizar empleando un modelo como el
descrito173
para estudiar procesos oxidativos en membranas de eritrocito
Conclusiones
126
7 Conclusiones
La teacutecnica de electro-oxidacioacuten complementada con espectroscopia de
resonancia de espiacuten electroacutenico (REE) resulta uacutetil para identificar especies
radicalarias como intermediarios de la reaccioacuten en este trabajo
La determinacioacuten del iacutendice de Fukui (fk-) en conjunto con los resultados de
resonancia de espiacuten electroacutenico permitieron discriminar los sitios de las
moleacuteculas donde se inicia el proceso oxidativo En el derivado 9 la oxidacioacuten
ocurre primero en el anillo benceacutenico y en los compuestos 10 y 11 el proceso
oxidativo ocurre primero en el heterociclo cumariacutenico
La inclusioacuten de las estructuras polifenoacutelicas al heterociclo cumariacutenico generoacute
un incremento en su capacidad antioxidante en los ensayos no bioloacutegicos
No se obtuvo correlacioacuten para los resultados de capacidad antioxidante entre
las distintas metodologiacuteas empleadas
Se establecioacute la correlacioacuten entre el valor de potencial de inicio de la reaccioacuten
electroquiacutemica (onset) y los resultados para el ensayo frente al anioacuten
superoacutexido A medida que el potencial se hace menos positivo aumenta la
reactividad de los compuestos lo que indica que la transferencia electroacutenica
estaacute involucrada en la etapa determinante de la velocidad
De acuerdo con los resultados de la teacutecnica CAC y la correlacioacuten tanto con la
hidrofobicidad relativa como con el logDteoacuterico la actividad de los derivados
Conclusiones
127
propuestos estaacute circunscrita a aquellos procesos oxidativos que tienen lugar en
medios lipofiacutelicos como por ejemplo membranas bioloacutegicas
Bibliografiacutea
128
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vii
131 Cumarinas como estructuras hiacutebridashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 15
2 Hipoacutetesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
3 Objetivoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
31 Objetivos generaleshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
32 Objetivos especiacuteficoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 21
4 Materiales y meacutetodoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 23
41 Materialeshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24
411 Reactivos y equipamiento utilizado en siacutentesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 24
412 Reactivos y equipamiento utilizados en electroquiacutemicahelliphelliphelliphelliphellip 25
413 Reactivos y equipamiento utilizados en ensayos frente a especies
radicalariashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 27
42 Meacutetodoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 28
421 Procedimientos de siacutentesishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 28
422 Procedimientos en electroquiacutemicahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 37
423 Estudio de generacioacuten de especies radicalarias mediante
espectroscopia de resonancia de espiacuten electroacutenico (REE)helliphelliphelliphelliphellip 38
424 Procedimiento experimental en el estudio de reactividad
frente a especies radicalariashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39
4241 Metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales
de oxiacutegeno (ORAC-FL)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 39
4242 Metodologiacutea de capacidad reductora de hierro en plasma
(FRAP)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 42
viii
4243 Capacidad de apagamiento del radical hidroxilo (OHmiddot)
mediante la teacutecnica spin traphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 44
4244 Estudio de reactividad frente al anioacuten radical superoacutexido O2bull-helliphelliphellip 45
4245 Estudio de la capacidad antioxidante celular (CAC)helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 47
4246 Estudio de hidrofobicidad relativa helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 48
4247 Estudio teoacuterico caacutelculo del Iacutendice de Fukui fkhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 49
5 Resultados y discusioacuten helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 50
51 Siacutentesis de los compuestoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 50
52 Estudios electroquiacutemicoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 54
53 Estudio de generacioacuten de especies radicalarias mediante espectroscopia
de resonancia de espiacuten electroacutenico (REE)helliphelliphelliphelliphellip 70
54 Resultados y discusioacuten de los estudios de reactividad
frente a especies radicalariashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 74
541 Metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales
oxiacutegeno-fluoresceiacutena (ORAC-FL)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 74
542 Metodologiacutea de capacidad reductora de hierro en plasma
(FRAP )helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 82
543 Determinacioacuten de capacidad de apagamiento del radical OHmiddot
teacutecnica spin trappinghelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 86
544 Estudio de reactividad frente al anioacuten radical superoacutexido O2bull-helliphelliphellip 94
545 Determinacioacuten de capacidad antioxidante celular (CAC)helliphelliphelliphelliphellip 100
546 Estudio de hidrofobicidad relativa helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 102
ix
547 Estudio teoacuterico caacutelculo del Iacutendice de Fukui fkhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 108
6 Discusioacuten generalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 113
7 Conclusiones helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 124
8 Bibliografiacuteahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 126
x
Iacutendice de figuras y tablas
Figuras
Figura 1 Esquema de los compuestos estudiados
Figure 1 Scheme of studied compounds
Figura 11 Estructura de la 2H-1-benzopiran-2-ona (cumarina)
Figura 12 Esquema general de la reaccioacuten de Pechmann
Figura 13 Estructura de la 33rsquo-metilenbis(4-hidroxicumarina) o dicumarol
Figura 14 Estructura de la suksdorfina
Figura 15 Estructura del hiacutebrido cumarina-flavona aislado de su fuente vegetal
Gnidia socotrana
Figura 16 Estructura del antibioacutetico hiacutebrido novobiocina metabolitos secundarios
en la especie Streptomyces
Figura 17 Hiacutebridos chalcona-cumarina con capacidad antioxidante
Figura 41 Aacutecidos empleados en la sustitucioacuten de la 4-clorometil-78-
dihidroxicumarina
Figura 42 Siacutentesis del derivado clorado 1
Figura 43 Siacutentesis del derivado clorado acetilado 5
Figura 44 Siacutentesis del aacutecido cafeico acetilado 6
Figura 45 Siacutentesis del aacutecido gaacutelico acetilado 7
Figura 46 Siacutentesis del aacutecido 34-dihidroxibenzoico acetilado 8
Figura 47 Siacutentesis del intermediario hiacutebrido derivado del aacutecido cafeico
xi
Figura 48 Siacutentesis del compuesto hiacutebrido final 9
Figura 49A Ruta de siacutentesis de los compuestos cumariacutenicos i) H2SO4 1 h bantildeo de
hielo ii) NaOH Ac2O 30 min bantildeo de hielo (aacutecido cafeico 6) H2SO4 Ac2O 30
min (cumarina y aacutecidos benzoicos)
Figura 49B Ruta de siacutentesis de los compuestos cumariacutenicos iii) DBU DMF (seca)
35 h 50 degC iv) NaHCO3 MeOH acetona tdeg amb 3 h N2
Figura 410 A Sonda fluoresceiacutena B 22prime-azobis (2-metilpropionamidina)
dihidrochloridrato (ABAP) C 6-hidroxi-2578-tetrametilcroman-2-aacutecido carboxiacutelico
(Trolox)
Figura 411 Actividad antioxidante ORAC para un compuesto en estudio
Figura 412 Reactivo 246-tris(2-piridil)-s-triazina (TPTZ)
Figura 413 Voltamograma ciacuteclico de la generacioacuten de anioacuten radical superoacutexido
DMF+ HFFTBA 02 M en electrodo de carbono viacutetreo
Figura 51A Voltamogramas de pulso diferencial para los precursores 1 2 3 y 4
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 51B Voltamogramas de pulso diferencial para los derivados 9 10 y 11
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 52A VC para el derivado 9 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 53A VC para el derivado 10 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 54A VC para el derivado 1a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 55 Esquema del proceso electro-oxidativo propuesto para el catecol
Figura 56 Relacioacuten Epa vs logv para el derivado de aacutecido cafeico 9 2 mM en
DMF + HFFTBA 02 M
xii
Figura 57 Graacutefica para la corriente de pico Ipa vs la raiacutez cuadrada de la velocidad de
barrido Ejemplo de correlacioacuten lineal en el aacutecido protocateacutequico 4 2 mM en
DMF + HFFTBA 02 M
Figura 58 Determinacioacuten graacutefica del valor de Eonset VC del precursor 1 01 Vs
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 59 Relacioacuten Eonset vs logv para los compuestos estudiados
Figura 510 Correlacioacuten Ipa v12
vs v12
para el precursor aacutecido protocateacutequico 4
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 511A Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido cafeico 9 estabilizado con Zn2+
en DMF+HFFTBA
(izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color
rojo)
Figura 511B Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido gaacutelico 10 estabilizado con Zn2+
en DMF+HFFTBA
(izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color
rojo)
Figura 511C Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido 11 estabilizado con Zn2+
en DMF+HFFTBA (izq)
Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color rojo)
Figura 512 Curvas para el consumo de la sonda Fluoresceiacutena para un set de
concentraciones del compuesto 11
Figura 513 Graacutefica de aacuterea neta bajo la curva ABC vs concentracioacuten del derivado 11
Figura 514 Esquema para la reaccioacuten entre el complejo de Fe3+
y el compuesto
antioxidante reductor
Figura 515 Espin aducto generado por la inactivacioacuten del radical OHbull y su espectro
simulado (derecha)
xiii
Figura 516A Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto 4-clorometil-78-dihidroxicumarina 1 B Espectro REE de inactivacioacuten
del radical hidroxilo con adicioacuten del compuesto aacutecido cafeico 2
Figura 516C Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto aacutecido gaacutelico 3 D Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con
adicioacuten del compuesto aacutecido 34-dihidroxi benzoico 4
Figura 516E Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto hiacutebrido 9 F Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con
adicioacuten del compuesto hiacutebrido 10
Figura 516G Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto hiacutebrido 11
Figura 517 Espectro REE se destaca en rojo el triplete de integracioacuten 121
formado despueacutes de la reaccioacuten de Fenton no-cataliacutetico (izq) Espectro simulado
utilizando el programa EPR-WINSIM (der)
Figura 518 Espectro simulado para la formacioacuten del spin aducto [cumarina-
DMPO] utilizando el programa EPR-WINSIM
Figura 519 Voltamogramas ciacuteclicos del par redox correspondiente al anioacuten
superoacutexido tras antildeadir aliacutecuotas del compuesto 1 DMF + HFFTBA 02 M 01 Vs
Figura 520 Graacutefica del paraacutemetro adimensional (Ipa0-Ipa
S Ipa
0) vs concentracioacuten
de sustrato para el compuesto 1 (Destacado en verde el valor de IA50)
Figura 521 Hidrofobicidad relativa de los derivados y la cumarina precursora
Figura 522 Correlacioacuten entre el valor de logD teoacuterico y CAC experimental a
10 microM de cada compuesto El valor logD se obtuvo a traveacutes de la herramienta Marvin
Sketch del software ChemAxon164
Figura 523 Estructura optimizada en 3D para el precursor 1 utilizando DFT
Figura 524 Estructura optimizada en 3D para el derivado 9 utilizando DFT
Figura 525 Estructura optimizada en 3D para el derivado 10 utilizando DFT
xiv
Figura 526 Estructura optimizada en 3D para el derivado 11 utilizando DFT
Figura 61 Esquema de reaccioacuten para un mecanismo concertado de electro-
oxidacioacuten fenoacutelica Adaptacioacuten referencia 118
Figura 62 Esquema de reaccioacuten para estructuras fenoacutelicas mecanismo electro-
oxidativo en etapas
Figura 63 Correlacioacuten entre el potencial de oxidacioacuten Eonset y los ensayos frente a
anioacuten superoacutexido
xv
Tablas
Tabla 51 Paraacutemetros experimentales para los compuestos Determinaciones en VC
2 mM DMF + HFFTBA 02 M
Tabla 52 Constantes de acoplamiento hiperfino para los derivados polifenoacutelicos
Valores en Gauss
Tabla 53 Valores experimentales de Iacutendice ORAC para los compuestos estudiados
Tabla 54 Valores calculados para el factor estequiomeacutetrico n
Tabla 55 Valores experimentales obtenidos para los compuestos en estudio ensayo
FRAP en equivalentes de Trolox10 microM de muestra
Tabla 56 Porcentajes de inactivacioacuten del radical hidroxilo (OHmiddot)
Tabla 57 Valores de IA50 obtenidos para los compuestos estudiados
Tabla 58 Valores obtenidos para la capacidad antioxidante celular (CAC)
concentraciones 1 microM y 10 microM de cada compuesto
Tabla 59 Valores obtenidos para el tiempo de retencioacuten experimental de los
compuestos
Tabla 510 Valores de Iacutendice de Fukui fk para los compuestos en estudio
Tabla 61 Cuadro comparativo de los resultados en la determinacioacuten de capacidad
antioxidante para la cumarina y sus derivados
xvi
Glosario de abreviaturas
ABAP 22-azo-bis(2-amidinopropan)diclorhidrato
ADN Aacutecido desoxiribonucleico
ATCC American Type Culture Collection
HFFTBA Hexafluorofosfato de tetrabutil amonio
CAC Capacidad antioxidante celular
CYP450 Citocromo P450
DBU 18-diazabiciclo[540]undec-7-ano
DCFH-DA 2-(6-oxido-3-oxo-3H-xanten-9-il)benzoato disoacutedico (fluoresceiacutena sal
disoacutedica)
DMF NN-dimetilformamida
DMPO 55-dimetil-1-pirroline-N-oacutexido
DMSO Dimetil sulfoacutexido
DPPHbull Radical 22-difenil-1-picrilhidrazil
Epa Potencial de pico anoacutedico
EPR Electron paramagnetic resonance
ERNs Especies reactivas de nitroacutegeno
EROs Especies reactivas de oxiacutegeno
xvii
fk Iacutendice de Fukui
FRAP Ferric reducing antioxidant in plasma
HObull Radical hidroxilo
IA50 Iacutendice antioxidante 50
Ipa Corriente de pico anoacutedica
O2˙- Anioacuten radical superoacutexido
ONOObull Radical peroxinitrito
ORAC-FL Oxygen radical antioxidant capacity-fluorescein
PBS Buffer fosfato salino
REE Resonancia de espiacuten electroacutenico
RObull Radical alcoxilo
ROOmiddot Radical peroxilo
TPTZ 246-tris(2-piridil)-s-triazina
Trolox 6-hidroxi-2578-tetrametilcroman-2-aacutecido carboxiacutelico
VC Voltametriacutea ciacuteclica
VPD Voltametriacutea de pulso diferencial
xviii
RESUMEN
Las cumarinas (2H-1-benzopiran-2-ona) son estructuras quiacutemicas presentes en
especies vegetales ampliamente distribuidas en la naturaleza con una reconocida
actividad bioloacutegica entre las que destacan sus propiedades antioxidantes
En el presente trabajo de Tesis se describe la siacutentesis de derivados polifenoacutelicos La
cumarina dihidroxilada como estructura de partida fue esterificada con distintos
aacutecidos orgaacutenicos polifenoacutelicos (Figura 1) Se estudioacute su electro-oxidacioacuten y se evaluoacute
su actividad antioxidante frente a especies reactivas de oxiacutegeno por medio de diversas
metodologiacuteas in vitro
Figura 1 Esquema de los compuestos estudiados
Se estudioacute el comportamiento anoacutedico de los compuestos mediante voltametriacutea
ciacuteclica (VC) y voltametriacutea de pulso diferencial (VPD) en medio aproacutetico como una
aproximacioacuten a los procesos redox que ocurren en membranas bioloacutegicas
Se determinoacute la presencia de especies radicalarias en el proceso electro-oxidativo a
traveacutes de la teacutecnica de resonancia de espiacuten electroacutenico (REE) Las constantes de
OOH
HO O
Cl
HO
OOH
OH
OH
OH
HO
O
OH
OH
OH
HO
OO
OHHO O
OH
OH
O
O
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
xix
acoplamiento hiperfino junto con caacutelculos teoacutericos (iacutendice de Fukui) permitieron
discriminar distintos sitios reactivos en las nuevas moleacuteculas donde se desarrolla el
proceso oxidativo
Ademaacutes se evaluoacute la capacidad antioxidante de los compuestos a traveacutes de los
ensayos capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno-fluoresceiacutena (ORAC-
FL) capacidad antioxidante reductora de hierro (FRAP) apagamiento del radical
hidroxilo mediante spin trapping inactivacioacuten de anioacuten superoacutexido y capacidad
antioxidante celular (CAC) en un modelo bioloacutegico in vitro simple
Para los ensayos antioxidantes no bioloacutegicos la introduccioacuten de las distintas
estructuras fenoacutelicas en el anillo cumariacutenico permite obtener derivados que presentan
una capacidad antioxidante mejor que el precursor cumariacutenico inicial Se establecioacute
la respectiva correlacioacuten entre el potencial de inicio del proceso electroquiacutemico
(potencial onset) y los resultados encontrados en el ensayo en medio aproacutetico frente a
anioacuten superoacutexido
Considerando el ensayo bioloacutegico de capacidad antioxidante celular eacuteste sugiere que
la actividad antioxidante de los nuevos derivados estaacute circunscrita a medios de
naturaleza lipofiacutelica
xx
SUMMARY
Coumarins (2H-1-benzopyran-2-one) are chemical structures from vegetal sources
widely distributed in vegetable species with recognized biological activities among
which their antioxidant capacity
In this Thesis work the syntheses of coumarin polyphenolic derivatives is described
Coumarin was the starter scaffold and it was sterified with different organic phenolic
acids The electro-oxidation of polyphenolic derivatives is studied and their
antioxidant capacity towards ROS through methodologies in vitro is evaluated
Figure 1 Scheme of studied compounds
The anodic behavior of the compounds by cyclic voltammetry (CV) and differential
pulse voltammetry (VPD) was studied in aprotic medium as an approximation to the
redox processes in biological membranes
The presence of radical species is determined in the electro-oxidation process through
the technique electron spin resonance (ESR)The hyperfine coupling constants and
theoretical calculations (Fukui index values) allow to discriminate between the
OOH
HO O
Cl
HO
OOH
OH
OH
OH
HO
O
OH
OH
OH
HO
OO
OHHO O
OH
OH
O
O
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
xxi
different reactive sites in the new molecules where the oxidative process is taking
place
Moreover antioxidant capacity of derivatives was evaluated through oxygen radical
antioxidant assay-fluorescein (ORAC-FL) ferric reducing ability of plasma (FRAP)
spin trapping superoxide scavenging assays and cellular antioxidant (CAC) in a
simple biological model in vitro
In the non-biological antioxidant assays the addition of various phenolic structures to
the coumarin scaffold yielded derivatives with improved antioxidant capacity related
to initial coumarin We studied the correlations between the starting potential of the
electrochemical process (onset potential) and the antioxidant results obtained in
aprotic media against superoxide anion
In regard to the biological cellular antioxidant capacity assay it suggests that the
antioxidant activity of new derivatives could be limited to lipophilic media
Introduccioacuten
1
1 Introduccioacuten
11 Cumarinas
111 Origen vegetal
Las cumarinas son una familia de compuestos cuya estructura baacutesica corresponde a la
lactona heterociacuteclica 2H-1-benzopiran-2-ona (Figura 11) En el reino vegetal estaacuten
ampliamente distribuidas habieacutendose identificado en la actualidad maacutes de 1800
cumarinas de origen natural1 eacutestas se encuentran principalmente como metabolitos
secundarios en diversas plantas tanto en sus semillas como en hojas y raiacuteces2 Su
biosiacutentesis es descrita por distintos autores como una serie de procesos catalizados
por enzimas presentes en la estructura CYP450 (citocromo P450) en algunos casos
estos compuestos son generados en la ceacutelula vegetal como una viacutea de defensa
(fitoalexinas como la escopoletina) frente a estiacutemulos de estreacutes y la presencia de fito-
patoacutegenos34
O O
3
45
6
7
81
2
Figura 11 Estructura de la 2H-1-benzopiran-2-ona (cumarina)
Introduccioacuten
2
El nombre de estos compuestos se deriva de la palabra ldquocoumarourdquo vocablo
caribentildeo que hace referencia al aacuterbol de Tonka originario de Sudameacuterica de cuya
semilla A Vogel logra aislar el compuesto y publicar su hallazgo en 18205b
A partir
de entonces el intereacutes por su caracterizacioacuten6 la obtencioacuten tanto desde fuentes
naturales7 como por rutas sinteacuteticas de la cumarina y sus derivados ha ido en
aumento encontrando su primera aplicacioacuten en la fabricacioacuten de perfumes En 1868
W H Perkin propuso la siacutentesis de una fragancia vegetal a partir de la sal soacutedica del
orto-hidroxibenzaldehiacutedo y anhiacutedrido aceacutetico obteniendo el mismo producto aislado
de la semilla de Tonka5 8(ac)
Se han estudiado los aspectos taxonoacutemicos en cuanto a la clasificacioacuten de las especies
vegetales que contienen compuestos cumariacutenicos se estima que las principales
familias donde se encuentran estos derivados son Umbelliferae Rutaceae
Leguminosae Compositae Caryopgillaceae Euphorbiaceae Hipocastanaceae
Oleaceae Thymelaeaceae8b
112 Rutas de siacutentesis
Los autores Sethna y Narsinh9 presentaron en 1944 una de las primeras revisiones del
estado del arte con respecto a la siacutentesis de cumarinas En ella se encuentran las
principales metodologiacuteas claacutesicas de obtencioacuten como la siacutentesis de Perkin
Pechmann10
y Pechmann-Duisberg11
(Figura 12) en la que se obtiene la cumarina al
Introduccioacuten
3
condensar un fenol con un β-cetoester en medio aacutecido Diversas publicaciones
plantean modificaciones a esta ruta con catalizadores12 (ab)
libre de solventes13 (ab)
con promotores aacutecidos14
asistida por microondas15
entre otras
Figura 12 Esquema general de la reaccioacuten de Pechmann
Otra metodologiacutea empleada es la de Knoevenagel16
propuesta en 1898 Consiste en
una reaccioacuten de condensacioacuten entre o-hidroxialdehiacutedos con malonato de etilo
acetoacetato de etilo o cianoacetato de etilo en medio baacutesico (piridina o piperidina)
Los autores Bigi y colaboradores17
describen el uso de un catalizador en base a
montmorillonita para la obtencioacuten de cumarinas sustituidas en posicioacuten 3 con un
grupo aacutecido Posteriormente otro grupo de trabajo (Shaabani 2009) llevoacute a cabo esta
condensacioacuten empleando radiacioacuten de microondas lo que les permitioacute obtener buenos
rendimientos en un medio ldquoamigablerdquo con el ambiente18
Se han descrito otras metodologiacuteas sinteacuteticas en las cuales se utilizan las reacciones
claacutesicas de Wittig19 ab
y Reformatsky20
ademaacutes de otras rutas con variantes tanto en
los reactivos como en el medio de reaccioacuten que permiten la obtencioacuten de derivados
OH
+
OEt
O O H2SO4
O O
Introduccioacuten
4
cumariacutenicos como la siacutentesis en presencia de bases fuertes21
reacciones libres de
solventes22
y la obtencioacuten de cumarinas policiacuteclicas utilizando compuestos
organometaacutelicos descrita por Harvey y cols23
113 Principales aplicaciones
Tras ser aisladas desde su fuente vegetal y como resultado de investigaciones
posteriores dirigidas a generar rutas sinteacuteticas viables las cumarinas han sido objeto
de numerosos estudios enfocados en la buacutesqueda de sus aplicaciones Es asiacute como en
la literatura se pueden encontrar las maacutes diversas investigaciones para este tipo de
compuestos provenientes tanto de productos de siacutentesis o como extractos de
vegetales y plantas con reconocidas propiedades en la medicina tradicional esto da
origen al estudio de sus bio-aplicaciones entre las que se destaca su capacidad como
antioxidante
A Actividad bioloacutegica
La primera aplicacioacuten en bio-medicina descrita para las cumarinas fue como
anticoagulante desde que se aislara y caracterizara el dicumarol 33rsquo-metilenbis(4-
hidroxicumarina) (Figura 13) Posteriormente aparece en el mercado su derivado
Introduccioacuten
5
sinteacutetico conocido como Warfarina que hasta la deacutecada pasada era considerado uno
de los faacutermacos anticoagulantes maacutes vendidos en Estados Unidos24 a-c
OOOO
OH HO
Figura 13 Estructura de la 33rsquo-metilenbis(4-hidroxicumarina) o dicumarol
Con posterioridad el uso de las cumarinas se ha diversificado hacia innumerables
blancos terapeacuteuticos En la literatura se describen variados estudios con respecto a sus
propiedades farmacoloacutegicas25ab
Su capacidad como agente antitumoral 26ab
se ha
estudiado en compuestos provenientes tanto de fuentes vegetales como sinteacuteticas
Riveiro ME y cols estudiaron el efecto de la 78-OH-4-metilcumarina en ceacutelulas
humanas afectadas por leucemia evidenciando el potencial que presentoacute este
derivado dihidroxilado27
En otra investigacioacuten realizada por C Ito y colaboradores
aislaron tres derivados cumariacutenicos de la especie vegetal Murraya siamensis cuyos
ensayos frente a ceacutelulas tumorales resultaron promisorios28
Con respecto a las propiedades antiinflamatorias de las cumarinas en la naturaleza se
encuentran especies como la Chamomilla recutita (manzanilla) que contiene un tipo
Introduccioacuten
6
de umbeliferona con tales propiedades En la literatura se encuentran derivados
sinteacuteticos desarrollados en cuya estructura estaacute presente el esqueleto cumariacutenico29
Lin y cols presentan los resultados de su estudio de la capacidad antiinflamatoria de
un conjunto de cumarinas los cuales fueron ademaacutes correlacionados con los
obtenidos para el apagamiento del radical hidroxilo30
HA El-Wahab y cols sintetizaron distintas tiazolo-cumarinas hiacutebridas y estudiaron
una de sus propiedades farmacoloacutegicas como agente antimicrobiano Estos
compuestos posteriormente fueron aplicados como aditivos en recubrimientos de
poliuretano confirieacutendoles tambieacuten esta propiedad microbicida a las superficies en
las que se utilizoacute31
Tambieacuten se han descrito derivados cumariacutenicos con propiedades anti-fuacutengicas 32ab
Un trabajo reciente presenta el estudio de complejos en base a Ni(II) Cu(II) y
Co(II)frente a distintas especies de hongos (Candida A niger Rhizopus)32c
Tambieacuten se han encontrado estructuras cumarina-glucoacutesidos provenientes de especies
vegetales (Hydrangea paniculata) que presentan propiedades hepatoprotectoras33
Otros estudios sentildealan tambieacuten la importancia de las estructuras cumariacutenicas como
compuesto antiviral analgeacutesico anti-tromboacutetico ulcerogeacutenico 25 34-36
inclusive con
potencial para ser usadas en terapias frente al VIH como lo sentildeala la investigacioacuten
sobre especies vegetales que contienen dipiranocumarin - calanolideos como
Introduccioacuten
7
principio activo25a
estudios que tambieacuten se han realizado con derivados de siacutentesis
disentildeados a partir de la estructura de origen vegetal (Lomatium suksdorfii) conocida
como suksdorfina (Figura 14) a partir de la cual se han generado compuestos
anaacutelogos con el objeto de estudiar su modo de accioacuten y obtener sustratos cada vez
maacutes potentes frente a la enfermedad (Yu D y cols 2003)37
O OO
O
O
OO
Figura 14 Estructura de la suksdorfina
B Propiedades antioxidantes
El equilibrio en los organismos vivos es funcioacuten de diversos factores entre ellos cabe
mencionar el balance de las especies que generan estreacutes oxidativo dentro del medio
celular estas especies pueden ser de origen endoacutegeno como las provenientes de la
cadena transportadora de electrones enzimas oxidantes ceacutelulas fagociacuteticas o de
origen exoacutegeno como sustancias reductoras oxidacioacuten de drogas tabaquismo
ultrasonido luz solar etc Entre los compuestos que generan estreacutes conocidos como
Introduccioacuten
8
EROs y ERNs (especies reactivas de oxiacutegenonitroacutegeno) se pueden mencionar el
anioacuten superoacutexido (O2˙-) peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2) radical peroxilo (ROObull) y
alcoxilo (RObull) radical hidroxilo (HObull) oacutexido niacutetrico (NObull) peroxinitrito (ONOObull)
entre otras
Dentro de este contexto en la literatura se ha descrito el potencial que poseen las
cumarinas y sus derivados como compuestos capaces de interaccionar con especies
reactivas de oxiacutegeno y nitroacutegeno lo que da cuenta de su capacidad antioxidante tema
relevante si se considera que parte importante de las patologiacuteas conocidas y
estudiadas en la actualidad a nivel mundial estaacuten iacutentimamente ligadas a cuadros de
estreacutes oxidativo presentes en el organismo 38 39
Payaacute y colaboradores presentaron un trabajo en el cual se estudia la reactividad de un
conjunto de dieciseacuteis cumarinas (naturales y sinteacuteticas) frente al radical hidroxilo
aacutecido hipocloroso y anioacuten superoacutexido encontrando que los derivados di-hidroxilados
poseiacutean mejores propiedades que aquellos mono-hidroxilados o sin sustitucioacuten40
Estos resultados se complementan con una publicacioacuten posterior del mismo grupo en
que se profundiza el estudio anterior sentildealando las propiedades terapeacuteuticas de los
derivados cumariacutenicos34
El derivado conocido como esculetina (67-dihidroxicumarina) fue ensayado frente al
radical DPPH junto con ensayos de estreacutes oxidativo en medios de cultivo celular
Introduccioacuten
9
estos autores sentildealan la importancia de los grupos catecol en su capacidad de atrapar
especies radicales (Kim y cols 2008)41
Otro estudio en el que se ensaya un extracto
vegetal (Cortex Fraxini) relaciona ademaacutes la capacidad antioxidante de las o-
dihidroxi cumarinas con su capacidad reductora42
Zhang y cols presentan un estudio reciente en el cual cumarinas dihidroxiladas en
posicioacuten 7 y 8 entre otros derivados poseen importante bio-actividad in vitro los
compuestos fueron ensayados frente a especies radicales en ceacutelulas tumorales
presentaron ademaacutes actividad como antiinflamatorios y baja toxicidad tanto en
ceacutelulas sanguiacuteneas de vertebrado como de invertebrado Junto con lo anterior se
realizoacute un anaacutelisis de estructura-reactividad correlacionando la capacidad de
apagamiento de radicales con las propiedades antiinflamatorias y antitumorales de los
derivados cumariacutenicos encontradas en esta investigacioacuten43
12 Compuestos polifenoacutelicos
121 Origen vegetal
Los polifenoles al igual que las cumarinas son una amplia familia de compuestos (se
han encontrado maacutes de 8000 de ellos) presentes en estructuras vegetales como
metabolitos secundarios cumpliendo roles tales como protector frente a radiacioacuten
UV reguladores de los ciclos de crecimiento pigmentacioacuten y defensa frente a
Introduccioacuten
10
depredadores Su estructura baacutesica es el anillo benceacutenico con sustituyentes hidroxilo
(-OH) en distintas posiciones Se clasifican en flavonoides aacutecidos fenoacutelicos
(hidroxicinaacutemicos e hidroxibenzoicos) taninos estilbenos Debido a sus interesantes
propiedades y bio-aplicaciones estos fitoquiacutemicos han sido objeto de diversos
estudios investigacioacuten y caracterizacioacuten44-46
Estos compuestos son un constituyente importante de la dieta diaria se encuentran en
forma abundante en diversos frutos como por ejemplo berries manzana mango uva
pera granada y ciacutetricos en bebidas como el vino teacute y cafeacute 47
en vegetales cereales
y semillas Junto con lo anterior se ha descrito la utilizacioacuten de aacutecidos polifenoacutelicos
provenientes de extractos vegetales y aceites esenciales como aditivos en la industria
alimentaria aplicados como preservantes naturales en reemplazo de aquellos de
origen sinteacutetico debido a las propiedades antimicrobianas que exhiben48
122 Actividad bioloacutegica
Estos compuestos se conocen tambieacuten como ldquobiofenolesrdquo (Romeo y Uccella 1996)
haciendo referencia a aquellos provenientes de fuentes naturales Las primeras
publicaciones sobre los polifenoles en general comenzaron en la deacutecada de 1950 con
la investigacioacuten de D Harman y su teoriacutea del envejecimiento y los radicales libres
estudios en los que se planteoacute prolongar la sobrevida en especies roedores enfermos a
traveacutes de la ingesta de biofenoles presentes en su dieta Es asiacute que el nuacutemero de
publicaciones concernientes al tema se incrementoacute de una treintena (entre 1900 y
Introduccioacuten
11
1950) hasta superar las 35000 publicaciones entre los antildeos 2000-2010 lo que da
cuenta del creciente intereacutes en este toacutepico49
La bio-actividad de los compuestos polifenoacutelicos es amplia se encuentran diversos
estudios como el citado anteriormente con respecto a las capacidades antimicrobianas
de los polifenoles y su uso en la industria alimentaria5051
Compuestos como la
curcumina resveratrol quercetina y derivados del aacutecido gaacutelico se enumeran dentro de
las investigaciones realizadas tanto in vitro e in vivo en la prevencioacuten del caacutencer
(Cimino y cols 2012)52
Otras propiedades descritas para estos compuestos son como cardio-protectores anti-
canceriacutegenos antiinflamatorios vaso-relajantes entre otras como lo resume el
artiacuteculo de Xia y cols (2010) En eacutel ademaacutes se presenta una revisioacuten en cuanto a los
meacutetodos de extraccioacuten purificacioacuten y caracterizacioacuten del contenido y tipos de
polifenoles especiacuteficamente en el caso de la uva fruto reconocido por su alto
contenido de fitoquiacutemicos y nutrientes53
123 Polifenoles como antioxidantes
Los polifenoles como micronutrientes presentes en los alimentos y otras estructuras
vegetales han sido un foco de intereacutes ya que sus aplicaciones terapeacuteuticas estaacuten
relacionadas con su reconocida e investigada capacidad antioxidante y quelante de
metales Con respecto a esta uacuteltima cabe mencionar la revisioacuten del estado del arte
Introduccioacuten
12
realizada por Kozlowski y cols con respecto al desbalance de Cu Zn y Fe en el
organismo en ella se indica que la presencia libre y en exceso de estos metales estaacute
directamente relacionada con patologiacuteas neurodegenerativas y caacutencer entre otras ya
que su actividad redox genera especies reactivas capaces de atacar sustratos orgaacutenicos
como la membrana lipiacutedica proteiacutenas y aacutecido desoxiribonucleico (ADN)54
Ribeiro y colaboradores presentan un estudio en el que se determina el contenido
polifenoacutelico de la especie Fistulina hepaacutetica Los extractos se ensayaron frente a
DPPH anioacuten superoacutexido radical hidroxilo y aacutecido hipocloroso Los autores plantean
que considerando los resultados obtenidos esta especie fuacutengica podriacutea tener
aplicacioacuten como suplemento o como antioxidante en la industria alimentaria55
Estudios realizados con aacutecido taacutenico comercial sentildealan que su capacidad como
antioxidante y como quelante de hierro da cuenta del potencial que tiene este aacutecido
ademaacutes como anti-mutageacutenico y anti-carcinogeacutenico Los autores indican posibilidad
de que este aacutecido el cual presenta baja toxicidad contribuye en el apagamiento de
especies reactivas de oxiacutegeno dantildeinas a nivel de ADN (Andrade y cols 2006)56
trabajo que se complementa con una publicacioacuten anterior del mismo grupo donde se
estudioacute el apagamiento del radical OHbull mediante complejos de aacutecido taacutenico-Cu
(Andrade y cols 2005)57
Los aacutecidos hidroxicinaacutemicos e hidroxibenzoicos han sido tambieacuten objeto de estudio
debido a su capacidad antioxidante58-61
Jeong y colaboradores estudiaron el extracto
de la especie vegetal Erigeron annuus el cual contiene aacutecido cafeico en su fraccioacuten
Introduccioacuten
13
butanoacutelica este extracto fue ensayado como agente neuro-protector y antioxidante en
ceacutelulas nerviosas Frente a los resultados obtenidos los autores concluyen que este
extracto podriacutea ser utilizado en terapias frente a patologiacuteas neurodegenerativas como
el Alzheimer62
Otro estudio de capacidad antioxidante realizado a un grupo de
compuestos polifenoacutelicos presentes en el propoacuteleo (aacutecido cafeico aacutecido feruacutelico
ferulato de etilo eacutester fenetiacutelico del aacutecido cafeico) sentildeala que los grupos catecol
presentes en las estructuras ensayadas incrementan la capacidad antioxidante
mientras que en estudios relacionados con bio-membranas se debe tener en cuenta
ademaacutes la hidrofobicidad que presenten los compuestos63
13 Compuestos hiacutebridos
Al considerar que las diversas enfermedades que afectan al ser humano (caacutencer
diabetes enfermedades neurodegenerativas artritis entre otras) involucran diferentes
factores patogeacutenicos se han desarrollado estrategias sinteacuteticas que permiten obtener
nuevos faacutermacos de naturaleza hiacutebrida los cuales incorporan en su estructura
distintos ingredientes activos64
Este disentildeo ldquomulti-blancordquo ha permitido que los
nuevos faacutermacos actuacuteen en distintos blancos terapeacuteuticos este tipo de terapias
implica una disminucioacuten en los problemas asociados a una multi-dosificacioacuten las
interacciones entre distintos medicamentos una disminucioacuten en la resistencia a los
faacutermacos (en el caso de enfermedades de origen microbiano) disminucioacuten en los
efectos adversos derivados de la dosificacioacuten muacuteltiple por mencionar algunos
Introduccioacuten
14
Diversas investigaciones sobre el tema dan cuenta de la relevancia que ha tenido esta
estrategia y el disentildeo racional de nuevos medicamentos65-68
La revisioacuten realizada por
los autores Mehta y Singh (2002) menciona algunos de los esqueletos que han dado
origen a estructuras hiacutebridas entre ellas esteroides antraciclinas β-lactamas
fullerenos carbohidratos-peacuteptidos En esta revisioacuten se indica el uso de este tipo de
compuestos en terapias contra el caacutencer y como neuro-protectores69
En el caso de la malaria una de las enfermedades infecciosas maacutes complejas a nivel
mundial la resistencia del paraacutesito del geacutenero Plasmodium frente a los faacutermacos
empleados (cloroquina principalmente) ha sido un tema de estudio durante antildeos Una
resentildea de este desafiacuteo se presenta en el artiacuteculo de Kouznetsov y Goacutemez-Barrio
(2009) en el que se sentildeala la siacutentesis de derivados de aminoquinolina como las
trioxaquinas70
las cuales se presentan posteriormente en una revisioacuten realizada por
Chauhan y colaboradores en ella se destaca a estos hiacutebridos como candidatos
promisorios para la formulacioacuten de nuevas drogas antimalaacutericas71
Otra patologiacutea en la que se ha utilizado faacutermacos de naturaleza hiacutebrida que en
algunos casos provienen de productos naturales es el caacutencer72
Allen y
colaboradores73
mencionan en una reciente revisioacuten de tecnologiacuteas avanzadas en las
que ademaacutes de utilizar la estrategia de compuestos hiacutebridos con dos estructuras de
propiedades anticanceriacutegenas eacutestos se combinan con nano-estructuras orientadas a
Introduccioacuten
15
blancos especiacuteficos para asiacute disminuir el riesgo de efectos colaterales en el
tratamiento de esta compleja patologiacutea
Este concepto y disentildeo de faacutermacos multi-blanco se ha aplicado ademaacutes en distintas
terapias frente a enfermedades como el Alzheimer74
en vacunas de amplio espectro
frente al coacutelera75
en la siacutentesis de compuestos antiparasitarios76
y de dihidropiridinas
las cuales poseen actividad vasodilatadora77
por mencionar algunos ejemplos
131 Cumarinas como estructuras hiacutebridas
Al considerar el estado del arte con respecto a la amplia y variada actividad bioloacutegica
que presentan los derivados cumariacutenicos se encuentra que otra de las aplicaciones que
se ha estudiado para esta familia de compuestos es su capacidad para formar parte de
estructuras hiacutebridas complejas compuestos orientados a la obtencioacuten faacutermacos multi-
blanco que den respuesta a los interrogantes y desafiacuteos actuales con respecto a
importantes patologiacuteas y sus terapias 78
En la literatura se describen ejemplos de estructuras cumariacutenicas hiacutebridas no soacutelo de
origen sinteacutetico sino que tambieacuten se pueden extraer desde su fuente natural Un
estudio realizado en hojas y ramas de la especie Gnidia socotrana (originaria de
Yemen) da cuenta de la presencia de estructuras flavona-cumarina las que fueron
extraiacutedas purificadas y caracterizadas79
(Figura 15)
Introduccioacuten
16
O
OH
HO O
OH
O
O
OH
Figura 15 Estructura del hiacutebrido cumarina-flavona aislado de su fuente vegetal
Gnidia socotrana
Entre los compuestos antibioacuteticos de origen natural que poseen el esqueleto
cumariacutenico en su estructura se encuentran la novobiocina (Figura 16) clorobiocina y
cumermicina Presentes como metabolitos secundarios en la especie Streptomyces
estos derivados deben su actividad antibioacutetica a que actuacutean inhibiendo la enzima
ADN girasa presente en bacterias impidiendo su replicacioacuten y ademaacutes genera su
muerte celular80
O
HN
OH
O
OH
O
O
MeOO
H2N
HO
Figura 16 Estructura del antibioacutetico hiacutebrido novobiocina metabolitos secundarios
en la especie Streptomyces
Introduccioacuten
17
Se ha descrito tambieacuten la capacidad antitumoral de derivados cumarina-resveratrol a
partir del precursor 7-hidroxicumarina En la publicacioacuten de Belluti y colaboradores
se presentan los ensayos realizados para 10 compuestos los cuales tuvieron como
objeto ceacutelulas tumorales de pulmoacuten humano dos de los hiacutebridos presentaron
resultados promisorios como antitumorales y pro-apoptoacuteticos comportamiento que
los autores concluyen tiene relacioacuten con la posicioacuten de los sustituyentes en la
moleacutecula81
La revisioacuten bibliograacutefica de Longhin y colaboradores describe diversas estructuras
hiacutebridas desarrolladas que cuentan con capacidad antiinflamatoria toacutepico de intereacutes si
se considera que los cuadros inflamatorios estaacuten relacionados a dolencias como el
Alzheimer asma arterioesclerosis artritis reumatoide caacutencer etc En este trabajo se
sentildeala al hiacutebrido cumarina-aacutecido lipoico donde ambas estructuras poseen ademaacutes
reconocida capacidad antioxidante y el aacutecido unido a la cumarina en posicioacuten 3
mediante un espaciador es la estructura que se describe con una actividad superior al
conocido y utilizado faacutermaco indometacina82
Junto con los estudios descritos otra importante aacuterea de investigacioacuten ha sido el
desarrollo de estructuras hiacutebridas con capacidad antioxidante (Koufaki 2006)83
actividad que permite en muchos casos restablecer el equilibrio en organismos vivos
frente al exceso de especies generadoras de estreacutes oxidativo cuadro que como ya se
Introduccioacuten
18
mencionoacute estaacute con frecuencia asociado las patologiacuteas conocidas y estudiadas en la
actualidad
El reciente estudio desarrollado por Matos Olea-Azar y colaboradores presenta la
estructura cumarina-resveratrol y diferentes derivados sinteacuteticos los cuales fueron
estudiados mediante diversas teacutecnicas in vitro como resonancia de espiacuten electroacutenico
(REE) capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno (ORAC-FL) y
voltametriacutea ciacuteclica (VC) En esta investigacioacuten se encontroacute que los compuestos
propuestos poseen una buena capacidad antioxidante84
Una investigacioacuten que da cuenta del potencial que posee esta estrategia es la
desarrollada por Kenchappa y colaboradores quienes sintetizaron derivados
cumariacutenicos unidos a pirazol e indenona posteriormente mediante estudios in vitro e
in vivo obtuvieron resultados de su capacidad antioxidante y ademaacutes como agentes
anti-hipergliceacutemicos en un modelo animal proyectaacutendolos como posibles faacutermacos
frente a la diabetes85
Dentro del mismo esquema Krishan y colaboradores
desarrollaron una serie de cumarinas unidas al benzoimidazol el cual es a su vez una
estructura con muacuteltiple y reconocida actividad bioloacutegica proponen a dos compuestos
de la serie como derivados con una buena capacidad antioxidante y anti-inflamatoria
a nivel de mucosa gaacutestrica86
Introduccioacuten
19
Un tipo de derivado hiacutebrido que ha sido estudiado es la cumarina-chalcona El trabajo
realizado por Xi y Liu presenta la siacutentesis de una serie de compuestos (Figura 17)
los que posteriormente son ensayados por distintas metodologiacuteas de determinacioacuten de
capacidad antioxidante concluyendo que estos hiacutebridos son estructuras promisorias
en los que el grupo catecol presente en el esqueleto cumariacutenico o en la chalcona es
capaz de inhibir distintos procesos oxidativos a nivel de ADN87
O O
OH
O
R1
R2
R3
Figura 17 Hiacutebridos chalcona-cumarina con capacidad antioxidante
Peacuterez-Cruz y colaboradores describen el disentildeo siacutentesis y estudio de la capacidad
antioxidante de derivados cumarina-chalcona los que presentaron buena reactividad
frente a distintas especies radicales y capacidad cito-protectora en un modelo celular
animal88
En los estudios mencionados se evidencia el continuo desarrollo que ha tenido el
disentildeo y siacutentesis de compuestos hiacutebridos como nuevos faacutermacos frente a complejas
Introduccioacuten
20
enfermedades multifactoriales Esta tendencia vigente en la actualidad se extiende a
los maacutes variados nuacutecleos estructurales entre ellos la cumarina Este heterociclo
clasificado por algunos autores como ldquoestructura privilegiadardquo debido a la amplia
gama de compuestos que se originan a partir de eacutel es el punto de partida para
diversas propuestas sinteacuteticas enfocadas a generar un producto que posea muacuteltiples
actividades bioloacutegicas de intereacutes terapeacuteutico
Hipoacutetesis y objetivos
21
2 Hipoacutetesis
Los compuestos hidroxicumariacutenicos exhiben conocidas e interesantes propiedades
antioxidantes
Al sustituir la cumarina con los compuestos aacutecido cafeico aacutecido gaacutelico y aacutecido
protocateacutequico se obtienen derivados de naturaleza hiacutebrida aumentando la actividad
de la cumarina frente a las especies reactivas de oxiacutegeno anioacuten superoacutexido radical
hidroxilo radical peroxilo y su capacidad reductora
3 Objetivos
31 Objetivos generales
- Evaluar el comportamiento electroquiacutemico oxidativo de los derivados
cumariacutenicos previamente sintetizados y caracterizados fiacutesicamente
- Evaluar la capacidad antioxidante de los nuevos compuestos derivados de
cumarina y aacutecidos benzoicos frente a distintas especies radicales mediante
diversas teacutecnicas in vitro
Hipoacutetesis y objetivos
22
32 Objetivos especiacuteficos
Objetivos en siacutentesis
- Sintetizar y caracterizar el compuesto precursor 4-clorometil-78-
dihidroxicumarina y los correspondientes derivados de la sustitucioacuten en posicioacuten-
4 con aacutecido cafeico aacutecido gaacutelico y aacutecido 34-dihidroxibenzoico
Objetivos en electroquiacutemica
- Realizar la caracterizacioacuten anoacutedica en medio aproacutetico (NN-dimetilformamida
DMF) de los compuestos por voltametriacutea ciacuteclica (VC) voltametriacutea de pulso
diferencial (VPD)
Objetivos en la determinacioacuten de capacidad antioxidante
- Estudiar la reactividad de los compuestos frente al anioacuten radical superoacutexido O2-
utilizando como teacutecnica voltametriacutea ciacuteclica
- Determinar la reactividad de los compuestos frente al radical peroxilo (ROObull)
obteniendo su iacutendice ORAC-FL
- Determinar la capacidad reductora de hierro (Fe3+
) de los compuestos a traveacutes de
la teacutecnica FRAP
- Estudiar la reactividad frente al radical OHbull mediante la teacutecnica spin trapping
utilizando espectroscopiacutea de resonancia de espin electroacutenica (REE)
Hipoacutetesis y objetivos
23
- Evaluar la capacidad antioxidante celular de los compuestos
- Establecer la existencia de correlacioacuten entre paraacutemetros fisicoquiacutemicos de los
compuestos y su actividad antioxidante
Materiales y meacutetodos
24
4 Materiales y meacutetodos
41 Materiales
411 Reactivos y equipamiento utilizado en siacutentesis
Reactivos
- Aacutecido 34-dihidroxicinaacutemico Merck
- Aacutecido 34- dihidroxibenzoico Sigma-Aldrich
- Aacutecido 345-trihidroxibenzoico Sigma-Aldrich
- Pirogalol Merck
- 4-cloro acetoacetato de etilo Sigma-Aldrich
- NN-dimetilformamida PA J T Baker
- 18-diazabiciclo[540]undec-7-ano (DBU) Sigma-Aldrich
- Carbonato aacutecido de sodio Merck
- Metanol PA JT Baker
- Acetona PA Merck
- Etanol PA Merck
- Cloroformo PA Merck
- Aacutecido sulfuacuterico 98 Merck
- Aacutecido clorhiacutedrico 37 JTBaker
- Anhiacutedrido aceacutetico Merck
- Hidroacutexido de sodio PA Merck
- Solucioacuten etanoacutelica de FeCl3
Materiales y meacutetodos
25
- Acetona d6 Sigma-Aldrich
- Dimetilsulfoacutexido d6 Sigma-Aldrich
- Cloroformo d6 Sigma-Aldrich
- Nitroacutegeno extra puro 99995 Linde Gas Chile SA
Equipamiento
Todo el material de vidrio utilizado fue clase A
- Balanza analiacutetica Precisa 125 A
- Rotavapor Heidolph VV 2000
- Sonicador Elme Transsonic Digital tipo T480H-2
- Agitador magneacutetico placa calefactora Heidolph MR 3002
- Estufa de secado al vaciacuteo Heraeus
412 Reactivos y equipamiento utilizados en electroquiacutemica
Reactivos
- NN-dimetilformamida (DMF) PA Merck
- Hexafluorofosfato de tetrabutil amonio (HFFTBA) Sigma-Aldrich
- Aacutecido 34-dihidroxicinaacutemico Merck
- Aacutecido 34- dihidroxibenzoico Sigma-Aldrich
- Aacutecido 345-trihidroxibenzoico Sigma-Aldrich
- Nitroacutegeno extra puro 99995 Linde Gas Chile SA
Materiales y meacutetodos
26
- Agua purificada (MilliQ) Millipore Merck
Equipamiento
- Estacioacuten de trabajo electroquiacutemica CH Instruments CHI 760c
- Electrodo de carbono viacutetreo CH Instruments d = 3 mm
- Alambre de platino
- Electrodo de referencia AgAgCl (KCl 3 M) CH Instruments
- Aluacutemina 03 μM y 005 μM Buheler
- Balanza analiacutetica Precisa 40SM-200ordf
413 Reactivos y equipamiento utilizados en ensayos frente a especies
radicalarias
Reactivos
- 2-(6-oacutexido-3-oxo-3H-xanten-9-il)benzoato disoacutedico (fluoresceiacutena sal
disoacutedica) Sigma-Aldrich
- 22-azo-bis(2-amidinopropan)diclorhidrato (ABAP) Sigma-Aldrich
- 246-tris(2-piridil)-s-triazina (TPTZ) Sigma Aldrich
- 6-hidroxi-2578-tetrametilcroman-2-aacutecido carboxiacutelico (Trolox) Sigma-
Aldrich
- Peroacutexido de hidroacutegeno al 30
- NN-dimetilformamida PA Sigma-Aldrich
- 55-dimetil-1-pirroline-N-oacutexido (DMPO)
- Acetato de sodio Merck
Materiales y meacutetodos
27
- Tricloruro de hierro (FeCl3) Sigma Aldrich
- Hidroacutexido de sodio Merck
- Fosfato diaacutecido de potasio Merck
- Etanol grado HPLC Merck
- Aacutecido aceacutetico glacial Merck
- N-octanol Merck
- Cloruro de zinc Merck
Equipamiento
- Balanza Precisa 40SM-200ordf
- Lector de microplacas con detector muacuteltiple Synergytrade HT Bio-Tek
Instruments Inc (Winooski VT USA)
- Espectroacutemetro ECS 106 de banda X (985 GHz) equipado con cavidad
rectangular y 50 KHz de modulacioacuten de campo (Bruker Coventry UK)
- WINSIM Software EPR Spectral Simulation for MS-Windows 9x NT
Version 098 copy PEST Public EPR Simulation Tools NIEHS USA
- Alambre de platino
- Espectrofotoacutemetro UV-Visible Specord S600 Analytik Jena
- Equipo generacioacuten agua ultrapura NanoPure Barnstead
Materiales y meacutetodos
28
42 Meacutetodo
421 Procedimientos de siacutentesis
En un primer paso se obtuvo el precursor 4-clorometil-78-dihidroxicumarina
mediante la siacutentesis de Pechmann posteriormente se realizoacute la esterificacioacuten entre el
compuesto halogenado y diferentes aacutecidos orgaacutenicos comerciales (Figura 41) Los
aacutecidos comerciales utilizados en el proceso de siacutentesis fueron los siguientes
aacutecido 34-dixidroxicinaacutemico aacutecido 345- trihidroxibenzoico
(aacutecido cafeico) (aacutecido gaacutelico)
O
OH
OH
HO
aacutecido 34-dihidroxibenzoico
(aacutecido protocateacutequico)
Figura 41 Aacutecidos empleados en la sustitucioacuten de la 4-clorometil-78-
dihidroxicumarina
OH
OH
O
HO
O
OH
OH
HO
OH
Materiales y meacutetodos
29
Todos los compuestos fueron previamente acetilados para proteger los grupos
hidroxilo presentes en sus estructuras para evitar reacciones entre siacute
A Siacutentesis de la 4-clorometil-78-dihidroxicumarina 1
Se mezclaron en proporciones equimolares el pirogalol (31 mmoles) junto con el 4-
cloroacetoacetato de etilo con agitacioacuten constante en un bantildeo de agua-hielo sobre la
mezcla se antildeadieron lentamente 25 mL de H2SO4 (tambieacuten friacuteo) esta solucioacuten se
tornoacute de color rojizo oscuro Se dejoacute reaccionar 1 h
La mezcla de reaccioacuten se agregoacute lentamente sobre un bantildeo de agua-hielo-etanol con
vigorosa agitacioacuten y se obtuvo el producto como un precipitado fino que fue lavado
con abundante agua (a fin de eliminar restos aacutecidos) y purificado por re-cristalizacioacuten
en una mezcla etanol agua obtenieacutendose un soacutelido marfil brillante 1 La ruta
sinteacutetica se presenta a continuacioacuten
Figura 42 Siacutentesis del derivado clorado 1
O
OH
OH O
Cl
HO
OH
OH
OEt
Cl
O O
+
H2SO4
1 h
1
Materiales y meacutetodos
30
B Procedimientos de acetilacioacuten
a) Acetilacioacuten de 4-clorometil-78-dihidroxi-cumarina 2
Se suspendioacute la cumarina clorada (3 g) en 6 mL anhiacutedrido aceacutetico y se antildeadioacute 1 gota
de aacutecido sulfuacuterico La solucioacuten fue agitada con calentamiento (45 degC) por 30 min y se
observoacute el progreso de la reaccioacuten mediante el test de FeCl3 el que indica la presencia
o ausencia de grupos ndashOH fenoacutelicos en solucioacuten El precipitado obtenido 5 se
recristalizoacute en etanol su ruta sinteacutetica se muestra en la Figura 43
Figura 43 Siacutentesis del derivado clorado acetilado 5
b) Acetilacioacuten del aacutecido 34-dihidroxicinaacutemico 6
Seguacuten lo descrito en la literatura89
se disolvioacute el aacutecido 34-dihidroxicinaacutemico (aacutecido
cafeico) en solucioacuten 1 M de NaOH sobre un bantildeo de hielo se agregoacute anhiacutedrido
O
OH
HO O
Cl
Ac2O H2SO4
45 degC 30 min
O
O
O O
Cl
5
O
O
Materiales y meacutetodos
31
aceacutetico y de inmediato se aprecioacute la aparicioacuten de un precipitado amarillo claro que
con el paso del tiempo se tornoacute de color marfil Se dejoacute en estas condiciones con
agitacioacuten vigorosa por 30 min El producto 6 fue filtrado y lavado prolijamente con
agua posteriormente se recristalizoacute en etanol obtenieacutendose un soacutelido blanco brillante
La reaccioacuten global se presenta en la Figura 44
HO
HO
OH
O
O
O O
NaOH 30 min
AcO
AcO
OH
O
6
Figura 44 Siacutentesis del aacutecido cafeico acetilado 6
c) Acetilacioacuten del aacutecido gaacutelico7
Se mezclaron 3 g de aacutecido con 7 mL de anhiacutedrido aceacutetico se antildeadioacute 1 gota de H2SO4
Se agitoacute durante 30 min a 47 degC Posteriormente la mezcla fue enfriada y filtrada al
vaciacuteo El producto 7 soacutelido de color blanco se recristalizoacute en etanol La reaccioacuten
global se presenta en la Figura 45
Materiales y meacutetodos
32
O
HO
HO
OH
OHO
O O
H2SO4 30 min
O
AcO
AcO
OAc
OH
7
Figura 45 Siacutentesis del aacutecido gaacutelico acetilado 7
d) Acetilacioacuten del aacutecido 34-dihidroxibenzoico 8
Se mezclaron 3 g de aacutecido con 6 mL de anhiacutedrido aceacutetico se antildeadioacute 1 gota de H2SO4
Se agitoacute por 30 min a 50 degC Luego se enfrioacute y filtroacute al vaciacuteo El producto 8 soacutelido de
color blanco fue recristalizado en etanol la reaccioacuten global se muestra en la Figura
46
O
OH
OH
OHO
O O
H2SO4 30 min
O
OAc
OAc
OH
8
Figura 46 Siacutentesis del aacutecido 34-dihidroxibenzoico acetilado 8
Materiales y meacutetodos
33
C Siacutentesis de los derivados hiacutebridos Procedimiento general
En base a una variante del procedimiento descrito (Ono y colaboradores 1978)90
los
derivados hiacutebridos se obtuvieron mediante la esterificacioacuten de la cumarina acetilada
5 y el correspondiente aacutecido tambieacuten previamente acetilado (6 7 8) Se disolvioacute el
aacutecido (32 mmoles) en 10 mL de DMF (seca recieacuten destilada) a temperatura ambiente
y se agregoacute el DBU en proporcioacuten equimolar se dejoacute reaccionar por 30 min en un
matraz provisto de codo de desecacioacuten (relleno con CaCl2) y agitacioacuten constante Se
agregoacute la cumarina (32 mmoles) y se aprecioacute el fin de la reaccioacuten tras 35 h a 50 degC
de temperatura La solucioacuten se llevoacute a tdeg ambiente y se hizo precipitar
cuidadosamente agregando agua destilada el soacutelido (9 10 y 11) fue lavado
prolijamente se filtroacute y secoacute
La Figura 47 muestra como ejemplo la ruta sinteacutetica llevada a cabo en la obtencioacuten
del derivado de aacutecido cafeico
Figura47 Siacutentesis del intermediario hiacutebrido derivado del aacutecido cafeico
O
OAc
OAc O
Cl
OAc
OAc
HO
O
+ DBU
DMF seco
O
OAc
OAc O
OAc
OAc
O
O
Materiales y meacutetodos
34
Posteriormente se procedioacute a desproteger los grupos fenoacutelicos en el soacutelido mediante
el procedimiento de desacetilacioacuten El producto crudo fue suspendido en una mezcla
de metanol (8 mL) acetona (12 mL) y solucioacuten saturada de NaHCO3 (14 mL) se
agitoacute a temperatura ambiente bajo nitroacutegeno por 3 h
Finalizada la reaccioacuten la suspensioacuten se concentroacute al vaciacuteo se antildeadioacute HCl en friacuteo
formaacutendose un precipitado claro que se filtroacute y lavoacute con abundante agua
posteriormente fue secado cuidadosamente El soacutelido se lavoacute prolijamente con CHCl3
a ebullicioacuten y fue secado al vaciacuteo de esta forma se obtuvo el producto hiacutebrido La
Figura 48 muestra la ruta de desproteccioacuten empleada
Figura48 Siacutentesis del compuesto hiacutebrido final 9
O
OAc
AcO O
OAc
OAc
O
O N2 tdeg amb
O
OH
HO O
OH
OH
O
O
9
hidroacutelisis baacutesica
Materiales y meacutetodos
35
En la Figura 49 se presenta un resumen de la ruta sinteacutetica para las cumarinas
hiacutebridas obtenidas
HO
O
OH
OH4
OH
OH
HO
O
OH
3
OH
OH
HO
O
2
O
OH
HO O
Cl1
ii
HO
O
OAc
OAc8
OAc
OAc
HO
O
OAc
7
OAc
OAc
HO
O
6
O
OAc
AcO O
Cl5
Figura 49A Ruta de siacutentesis de los compuestos cumariacutenicos i) H2SO4 1 h bantildeo de
hielo ii) NaOH Ac2O 30 min bantildeo de hielo (aacutecido cafeico 6) H2SO4 Ac2O
30 min (cumarina y aacutecidos benzoicos)
O
OH
HO O
Cl
HO
OH
OH
OEtCl
O O
+
1
i
Materiales y meacutetodos
36
HO
OOAc
OAc
OAc
OAc
HO
O
OAc
7
OAc
OAc
HO
O
6
OOH
HO O
OH
OH
O
O
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
9
10
11
OOAc
AcO O
Cl5
iiiiv
8
Figura 49B Ruta de siacutentesis de los compuestos cumariacutenicos iii) DBU DMF (seca)
35 h 50 degC iv) NaHCO3 MeOH acetona tdeg amb 3 h N2
Materiales y meacutetodos
37
422 Procedimiento experimental en electroquiacutemica
i) Celda electroquiacutemica
La celda de trabajo estuvo compuesta por tres electrodos el de trabajo de carbono
viacutetreo y superficie 0076 cm2 electrodo de referencia AgAgCl (3 M KCl) inmerso en
puente salino (DMF + HFFTBA 02 M) y alambre de platino como contra-electrodo
ii) Condiciones de trabajo
Los experimentos se realizaron utilizando como solvente aproacutetico NN-
dimetilformamida (previamente destilada y guardada con tamiz molecular 3 Aring) las
soluciones de trabajo en una concentracioacuten de 2 mM para todos los compuestos
continuamente fueron purgadas con nitroacutegeno extra puro el electrolito soporte
utilizado fue HFFTBA (hexafluorofosfato de tetrabutil amonio) en una concentracioacuten
dos oacuterdenes de magnitud superior a la de la muestra
iii) Teacutecnicas empleadas
En el desarrollo de este trabajo se utilizoacute voltamperometriacutea ciacuteclica (VC) y
voltamperometriacutea de pulso diferencial (VPD)
Materiales y meacutetodos
38
iv) Caacutelculos
El proceso de deconvolucioacuten de las graacuteficas en VC se llevoacute a cabo utilizando el
software Origin Pro 8 SR2 (Origin Lab Corporation USA) Se aplicoacute la funcioacuten
Gaussiana (Ecuacioacuten 41)
119910 = 1199100 + 119860
119908 radic120587 119890
minus2(119909minus119909119888)2
1199082 Ecuacioacuten 41
423 Estudio de generacioacuten de especies radicalarias mediante espectroscopiacutea de
resonancia de espiacuten electroacutenico
La oxidacioacuten electroquiacutemica de los compuestos se realizoacute utilizando las
mismas condiciones de potencial de voltametriacutea ciacuteclica una celda compuesta de
electrodo de trabajo de alambre de platino el medio empleado fue DMF + HFFTBA
como contra-electrodo se utilizoacute alambre de platino La estabilizacioacuten del radical
generado en la oxidacioacuten electroquiacutemica se logroacute empleando el catioacuten quelante Zn2+
el cual es silente a la teacutecnica espectroscoacutepica y forma complejos con el grupo catecol
Se utilizoacute ZnCl2 en concentracioacuten final 3 mM
Materiales y meacutetodos
39
424 Procedimiento experimental en el estudio de actividad frente a especies
radicalarias
4241 Metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno
(oxygen radical antioxidant capacity-fluorescein ORAC-FL)
Se prepararon soluciones stock en etanol para cada compuesto de ellas se obtuvieron
las soluciones de trabajo diluidas en solucioacuten buffer fosfato (pH 74) Se antildeadieron
las aliacutecuotas respectivas de concentraciones crecientes de cada compuesto en los
pocillos de la placa (concentraciones finales entre 02 microM y 109 microM que permitieron
obtener curvas de decaimiento apropiadamente separadas) posteriormente se
adicionoacute la sonda fluoresceiacutena (Figura 410 A) (solucioacuten preparada en buffer pH 74 y
concentracioacuten final 40 nM) y se pre-incuboacute 15 min a 37 degC Finalmente se adicionoacute la
aliacutecuota correspondiente de solucioacuten de 22prime-azobis(2-metiilpropionamidina)
dihidrochloridrato (ABAP) la solucioacuten fue preparada en buffer pH 74 y
concentracioacuten final 18 mM (Figura 410 B) y se llegoacute a un volumen final de 200 microL
La placa fue introducida en el lector y se midioacute el decaimiento de la sonda
fluorescente cada 1 min con agitacioacuten previa a cada medicioacuten Para cada set de
medidas fue determinado el blanco correspondiente que contiene la sonda
fluorescente y el generador de radicales peroxilo (ROObull) Se empleoacute el compuesto
Trolox como antioxidante estaacutendar de referencia (Figura 410 C) utilizaacutendose un set
Materiales y meacutetodos
40
de concentraciones entre los 3 microM y 20 microM y el procedimiento anteriormente descrito
para determinar el decaimiento de la fluorescencia de la sonda
La capacidad de inhibicioacuten expresada como valor de iacutendice ORAC se cuantificoacute
utilizando el valor integrado de aacuterea bajo la curva (ABC) de fluorescencia (Figura
411 donde F0 es el valor medido a tiempo 0 y F es el valor de fluorescencia al final
de la medicioacuten cuando se aprecioacute que el decaimiento es total) La ABC neta se obtuvo
de restar el valor del blanco al valor de cada compuesto (ver Ecuacioacuten 42)
ABC neta = ABC compuesto ndash ABC blanco Ecuacioacuten 42
ONaO O
ONa
O
A
O
HO
OH
O
C
Figura 410 A Sonda fluoresceiacutena B 22prime-azobis(2-metilpropionamidina)
dihidrochloridrato (ABAP) C 6-hidroxi-2578-tetrametilcroman-2-aacutecido carboxiacutelico
(Trolox)
-Cl H2N+
NH2
N
N+NH2 Cl-
NH2
B
Materiales y Meacutetodos
41
Figura 411 Actividad antioxidante ORAC-FL para un compuesto en estudio
Finalmente este valor de ABC neta para cada concentracioacuten se graficoacute con respecto a la
concentracioacuten obtenieacutendose una relacioacuten lineal en el rango de estudio La pendiente de
la regresioacuten de cada compuesto fue dividida por el valor de la pendiente del estaacutendar
Trolox (obtenido de la mima forma descrita para las muestras) este coeficiente es el
mencionado Iacutendice ORAC
Los datos fueron procesados mediante el software Origin Pro 8 SR2 (Origin Lab
Corporation USA) Las mediciones se realizaron en triplicado
0 1000 2000 3000 400000
02
04
06
08
10
ABCneta
Antioxidante
Blanco
F
F0
Tiempo s
Materiales y Meacutetodos
42
4242 Metodologiacutea de determinacioacuten de poder antioxidante de reduccioacuten de hierro
(FRAP)
Preparacioacuten de soluciones
i) Preparacioacuten solucioacuten tampoacuten acetato
Se disolvieron 155 g de acetato de sodio trihidrato (CH3COONamiddot3H2O) en agua
ultrapura se agregaron 8 mL de CH3COOH glacial con agitacioacuten constante y se aforoacute
a 500 mL El pH fue ajustado a 36 con NaOH concentrado
ii) Preparacioacuten de solucioacuten tampoacuten fosfato pH 74
Se mezclaron 80 mL de solucioacuten 01 M de NaOH con 100 mL de solucioacuten 01 M de
KH2PO4 se agitoacute para homogeneizar
iii) Preparacioacuten solucioacuten HCl 40 mM
En un matraz aforado (50 mL) se mezclaron 167 microL de HCl 12 M (37) con agua
ultrapura y se agitoacute hasta homogeneizar
iv) Preparacioacuten de solucioacuten TPTZ
Se pesaron 797 mg de reactivo TPTZ (Figura 412) y se aforoacute a 25 mL con solucioacuten
HCl 40 mM se agitoacute y conservoacute protegido de la luz
Materiales y Meacutetodos
43
N
N
N
N
NN
Figura 412 Reactivo 246-tris(2-piridil)-s-triazina (TPTZ)
v) Preparacioacuten solucioacuten de FeCl3 (20 mM)
Se pesaron 0054 g de FeCl3middot6H2O se aforoacute a 10 mL con agua ultrapura y se agitoacute
constantemente
vi) Preparacioacuten del reactivo FRAP
Se mezcloacute el tampoacuten acetato con solucioacuten TPTZ y solucioacuten feacuterrica en proporcioacuten
1011 se agitoacute y conservoacute al abrigo de la luz
vii) Preparacioacuten de soluciones en estudio
Se mezclaron aliacutecuotas de solucioacuten stock (en etanol) de cada compuesto con tampoacuten
fosfato luego se agitaron y se obtuvieron soluciones en concentraciones entre 15 microM y
58 microM
Materiales y Meacutetodos
44
Ensayo de capacidad reductora
En un frasco aacutembar se mezclaron 150 microL de solucioacuten de muestra con 450 microL de agua
ultrapura y posteriormente 950 microL de reactivo FRAP La solucioacuten se agitoacute e
inmediatamente se tornoacute de color azul lo que indicoacute la reaccioacuten de oxidacioacuten de Fe2+
a Fe3+
en el complejo formado con el reactivo TPTZ Se midioacute el espectro de
absorbancia en el rango del UV-visible a temperatura ambiente considerando el valor
de λmaacutex = 599 nm Los experimentos se realizaron en triplicado los valores obtenidos
para este ensayo se expresan como equivalentes de Trolox 10 microM de muestra
4243 Capacidad de apagamiento del radical hidroxilo (OHbull) mediante la teacutecnica
spin trap
Se realizoacute el ensayo mediante la metodologiacutea de Fenton no cataliacutetico comparando las
sentildeales en el espectro mediante espectroscopia de resonancia de espiacuten electroacutenico
(REE) del aducto DMPO-OH como blanco frente a las sentildeales obtenidas en las
mismas condiciones tras antildeadir los compuestos en estudio Para la generacioacuten del
radical hidroxilo se utilizoacute peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2) y solucioacuten acuosa de NaOH
metodologiacutea que presenta la ventaja de que en ausencia de iones Fe2+
(como en la
metodologiacutea Fenton) se evitoacute la reaccioacuten de quelacioacuten con los grupos catecol presentes
en las estructuras propuestas91ab
Materiales y Meacutetodos
45
-10 -08 -06 -04
Ipa0
O2 + e
- O
2
-
O2
-O
2 + e
-
10 A
E vs Ag|AgCl V
Se prepararon soluciones stock (20 mM en DMF) de cada compuesto en estudio se
tomaron aliacutecuotas de 100 microL y se agregaron 50 microL de NaOH (25 mM) 50 microL de
solucioacuten de 55-dimetil-1-pirroline-N-oacutexido (DMPO) (30 mM) y finalmente 50 microL de
agua oxigenada (30) se agitoacute cuidadosamente se incuboacute por 5 minutos y se midioacute
su espectro Los resultados se expresaron como el porcentaje de inactivacioacuten del
radical hidroxilo
4244 Estudio de reactividad frente a anioacuten radical superoacutexido O2middot -
Se evaluoacute la reactividad de cada compuesto frente al radical anioacuten superoacutexido el que
fue generado electroquiacutemicamente en la superficie del electrodo a traveacutes de la
reduccioacuten del oxiacutegeno molecular disuelto en el medio (Figura 413)
Figura 413 Voltamograma ciacuteclico de la generacioacuten de anioacuten radical superoacutexido
DMF + HFFTBA 02 M en electrodo de carbono viacutetreo
Materiales y Meacutetodos
46
i) Celda electroquiacutemica
La celda estuvo compuesta de tres electrodos el electrodo de trabajo fue carbono
viacutetreo (aacuterea = 003 cm2) el electrodo auxiliar empleado fue Ag|AgCl (KCl 3 M
inmerso en DMF + HFFTBA 02 M como puente salino) y alambre de platino como
contra-electrodo
ii) Teacutecnica empleada
La generacioacuten del radical se realizoacute mediante voltamperometriacutea ciacuteclica (VC) a
velocidad de barrido de 01 Vs en un rango de potencial entre 0 V (inicial) y -1 V
como potencial de inversioacuten de la direccioacuten de barrido (switching) 92
iii) Experimento
Los experimentos se realizaron utilizando como solvente 10 mL de NN-
dimetilformamida (previamente destilada) el electrolito soporte utilizado fue
HFFTBA (hexafluorofosfato de tetrabutil amonio) en concentracioacuten 02 M las
soluciones fueron saturadas con aire continuamente Una vez estabilizada la corriente
se antildeadieron a la celda aliacutecuotas crecientes de solucioacuten stock de cada compuesto
observaacutendose la disminucioacuten en la corriente de pico anoacutedica Ipa0 Una vez obtenidos
los voltamogramas se determinoacute el paraacutemetro adimensional ((Ipa0-Ipa
S) Ipa
0) el que
expresoacute el consumo de la especie radical este valor se graficoacute con respecto a la
concentracioacuten del sustrato cuya relacioacuten fue una regresioacuten lineal De la graacutefica se
Materiales y Meacutetodos
47
obtuvo el valor de concentracioacuten de antioxidante en que la corriente de pico anoacutedico
disminuye en un 50 (IA50)
4245 Estudio de la capacidad antioxidante celular (CAC)
Para evaluar la actividad antioxidante de los compuestos estudiados en un medio
celular se utilizoacute el meacutetodo descrito en la literatura por Wolfe93
Se emplearon ceacutelulas
EAhy 926 (ATCC CRL-2922) las que fueron sembradas con una densidad de
50000 ceacutelulas por pocillo en microplacas de 96 pocillos con medio de cultivo
RPMI 1640 Despueacutes de 24 h fue removido el medio de cultivo y los pocillos
fueron lavados con buffer fosfato salino (PBS) pH 74 Los pocillos fueron tratados
con 20 μM de la sonda DCFH-DA disuelta en RPMI 1640 libre de suero fetal bobino
Posteriormente se agregaron los compuestos en dos concentraciones diferentes 1 μM y
10 μM Luego de transcurrida 1 h de incubacioacuten a 37 degC los pocillos fueron
lavados con PBS Luego de esto se agregoacute ABAP en una concentracioacuten final de
600 μM y se midioacute la fluorescencia generada por la sonda en el multi-lector de placas
a temperatura constante de 37 degC La emisioacuten a 538 nm fue medida con una excitacioacuten
a 485 nm cada 1 min por 1 hora El ensayo se realizoacute en triplicado El valor de
capacidad antioxidante se calcula determinando el aacuterea bajo la curva para la muestra y
el control experimental utilizando la siguiente ecuacioacuten
CAC = 100 ndash (ABCmuestra ABCcontrol) 100 Ecuacioacuten 43
Materiales y Meacutetodos
48
4246 Estudio de hidrofobicidad relativa de los compuestos
La hidrofobicidad de los compuestos se correlaciona con sus coeficientes de reparto y
distribucioacuten (log P para el reparto octanolagua y log D para la distribucioacuten
octanolsolucioacuten tampoacuten pH 74) los que se determinan utilizando teacutecnicas
espectrofotomeacutetricas yo cromatograacuteficas
Para realizar estas experiencias se determina la solubilidad del analito en octanol
saturado con agua y en la solucioacuten tampoacuten pH 74 saturado con octanol Luego se
obtienen las respectivas curvas de calibracioacuten para la concentracioacuten del compuesto en
estas soluciones en funcioacuten de la absorbancia yo aacuterea bajo la curva Se espera que las
curvas de calibracioacuten obtenidas cumplan con el requisito de una linealidad apropiada
Posteriormente se debe evaluar el reparto midiendo la concentracioacuten analiacutetica en la
fase orgaacutenica y acuosa Para la determinacioacuten del reparto estaacute descrita la siguiente
ecuacioacuten
119897119900119892119875119900119888119905119886119892119906119886 = log ([119904119900119897119906119905119900]119900119888119905119886119899119900119897
[119904119900119897119906119905119900]119886119892119906119886) Ecuacioacuten 44
Mientras que para la determinacioacuten de la distribucioacuten se utiliza la siguiente ecuacioacuten
119897119900119892119875119900119888119905119886119892119906119886(119905119886119898119901oacute119899) = log ([119904119900119897119906119905119900]119900119888119905119886119899119900119897
[119904119900119897119906119905119900]119905119886119898119901oacute119899 119901119867 74) Ecuacioacuten 45
Materiales y Meacutetodos
49
Para este estudio se realizoacute la determinacioacuten de tiempos de retencioacuten como medida de
la hidrofobicidad relativa entre compuestos Se utilizoacute una columna C18 ODS Hypersil
una fase moacutevil compuesta de acetonitrilo solucioacuten H3PO4 (6535 vv) bajo
condiciones isocraacuteticas con flujo 1 mLmin volumen de inyeccioacuten 50 microL
4247 Estudio teoacuterico caacutelculo del Iacutendice de Fukui
La optimizacioacuten de estructuras de los compuestos neutros se realizoacute utilizando el
meacutetodo DFTSP-DFT basado en la Teoriacutea de Funcionales de la Densidad (DFT)94-96
Se utilizoacute el funcional hiacutebrido B3LYP el conjunto de bases empleado fue 6-31G(d)
Los caacutelculos se realizaron mediante el software Gaussianrsquo09 Los descriptores locales
se evaluaron a traveacutes de la aproximacioacuten de orbitales condensados Orbitales
Moleculares Frontera (Mulliken MOs)
Resultados y discusioacuten
50
5 Resultados y discusioacuten
51 Siacutentesis de los compuestos
Se presentan a continuacioacuten los resultados de la caracterizacioacuten fiacutesica y
espectroscoacutepica de los compuestos sintetizados durante este trabajo
4-clorometil-78-dihidroxicumarina (1)
1H RMN (DMSO d6 δ ppm) 493 (s 2H -CH2-) 641 (s 1H =CH- cumarina) 686
(d 1Harom Jorto 85) 717 (d 1Harom Jorto 85) 942 (s1H OH) 1022 (s 1H OH)
13C RMN (DMSO d6 δ ppm) 4187 11047 11129 11267 11585 13282 14358
15017 15181 16046 Rendimiento 47 Punto de fusioacuten 202-204 degC Agujas
color marfil PM 2265gmol Foacutermula molecular C10H7O4Cl
4-clorometil-78-diacetilcumarina (5)
1H RMN (DMSO d6 δ ppm) 235 (s 3H -CH3) 241 (s 3H-CH3) 506 (s 2H -
CH2-) 674 (s 1H =CH- cumarina) 739 (d 1Harom Jorto 878) 783 (d 1Harom Jorto
878)13
C RMN (DMSO d6 δ ppm) 1943 1985 3983 4073 11467 11549
11871 12238 12939 14459 14593 14999 1578716751 Rendimiento 68
Punto de fusioacuten 157-159 degC Soacutelido blanco PM 3105 gmol Foacutermula molecular
C14H11O6Cl
Resultados y discusioacuten
51
Aacutecido-34-diacetoxicinaacutemico (6)
1H RMN (acetona d6 δ ppm) 215 (s 3H -CH3) 216 (s 3H CH3) 638-643 (d 1H
Jtrans 159) 717-720 (d 1Harom Jorto 878) 748-750-756 (s Harom y Htrans) 13
C RMN
(acetona d6 δ ppm)1996 2004 11977 12333 12450 12682 13364 14323
14339 14439 16699 16809 16817 Rendimiento 56 Punto de fusioacuten
158-161 degC Soacutelido blanco PM 264 gmol Foacutermula molecular C13H12O6
Aacutecido-345-triacetilbenzoico (7)
1H RMN (acetona d6 δ ppm) 217 (s 6H -CH3) 219 (s 3H -CH3) 767 (s 2H
Harom) 13
C RMN (acetona d6 δ ppm) (2C -CH3 1865) (2C-C=O 1910) (2Carom
12160) 12790 13857 (2C 14337) 16432 16599 16789 Rendimiento 66
Punto de fusioacuten 158-160 degC Soacutelido blanco PM 296 gmol Foacutermula molecular
C13H12O8
Aacutecido 34-diacetilbenzoico (8)
1H RMN (acetona d6 δ ppm) 217 (s 6H CH3) 724-727 (d 1Harom Jorto 85) 774-
775 (d 1Harom) 781-784 (dd 1Harom) 13
C RMN (acetona d6 δ ppm) 1910 1913
(2C 12329) 12453 12729 12838 16487 16699 16729 Rendimiento 61
Punto de fusioacuten 155-158 degC Soacutelido blanco PM 238 gmol Foacutermula molecular
C11H10O6
Resultados y discusioacuten
52
4-metil-(34-dihidroxicinamoato)-78-dihidroxicumarina (9)
1H RMN (DMSOd6 δppm) 541(s 2H -CH2-) 621(s 1H =CH- cumarina) 642-
648 (d 1H Jtrans= 1591) 682-71 (Harom) 758-763 (d 1H Jtrans = 1591) 91 (s -
OH) 94 (s -OH) 97 (s -OH) 102 (s- OH)13
C RMN (DMSO d6 δppm) 6154
10820 11035 11290 11345 11526 11550 11620 12225 12566 13292
14391 14607 14686 14920 15026 15174 16055 16646ESI-MS mz 371
[M+H]+ 369 [M-H]
- 181 [M+H]
+ 163 [M-H2O+H]
+ 145 [M-H2O+H]
+ 135 [M-
HCOOH+H]+ 179 [M-H]
- 161 [M-H2O-H]
- 135 [M-CO2-H]
-Rendimiento 37
Punto de fusioacuten 246-249 degC Soacutelido amarillo opaco PM 37031 gmol Foacutermula
molecular C19H14O8
4-metil-(345-dixidroxibenzoato)-78-dihidroxicumarina ( 10 )
1H RMN (DMSO d6 δ ppm) 546 (s 2H -CH2-) 619 (s 1H =CH- cumarina) 682-
685 (d 1Harom Jorto 8508) 704 (s 2Harom) 709-712 (d 1Harom Jorto 778)13
C RMN
(DMSO d6 δppm) 6192 10821 10914 11041 11295 11533 11885 13292
13949 14394 (2Carom) 14620 15024 15184 16055 16555 16793ESI-MS mz
361 [M+H]+ 359 [M-H]
- 171 [M+H]
+ 153 [M-H2O+H]
+ 125 [M-CO2H+H]
+ 169
[M-H]- 125 [M-CO2-H]
- Rendimiento 46 Punto de fusioacuten descomposicioacuten sobre
230 degC Soacutelido amarillo opaco PM 36027 gmol Foacutermula molecular C17H12O9
Resultados y discusioacuten
53
4-metil-(34-dihidroxibenzoato)-78-dihidroxicumarina (11)
1H RMN (DMSO d6 δ ppm) 548 (s 2H -CH2-) 619 (s 1H =CH- cumarina) 685
(m 2Harom) 71 (d 1Harom) 74 (d 2Harom) 13
C RMN (DMSO d6 δ ppm) 6142
10774 10988 11242 11481 11551 11626 11957 12218 13240 14343
14520 14972 15096 15127 16001 16490 ESI-MS mz 345 [M+H]+ 343 [M-
H]- 137 [M-H2O+H]
+ 109 [M-HCOOH+H]
+ 153 [M-H]
- 108 [M-CO2-H]
-
Rendimiento 73 Punto de fusioacuten descomposicioacuten sobre 250 degC Soacutelido amarillo
opaco PM 34427 gmol Foacutermula molecular C17H12O8
Resultados y discusioacuten
54
52 Estudios de voltametriacutea ciacuteclica y voltametriacutea de pulso diferencial
El proceso de oxidacioacuten electroquiacutemico de los compuestos fue evaluado mediante
voltamperometriacutea de pulso diferencial VPD Los resultados presentaron soacutelo un pico
de oxidacioacuten para los compuestos 1 2 4 y 9 por otra parte el aacutecido gaacutelico 3 y los
hiacutebridos 10 y 11 mostraron dos o maacutes sentildeales poniendo de manifiesto las complejas
reacciones de oxidacioacuten que presentan los grupos -OH en dichas estructuras (Figura
51 A y B)97
Al analizar las sentildeales tanto para los precursores y sus derivados hiacutebridos se encontroacute
que la uacutenica sentildeal anoacutedica del compuesto 9 corresponderiacutea tanto a la oxidacioacuten del
catecol presente en la cumarina 1 (Epa 083 V) como del aacutecido cafeico 2 (Epa 076 V)
(Figura 52 A) ambos compuestos por separado tuvieron potenciales de pico anoacutedico
cercanos los que se solaparon para una dar una sola sentildeal en el derivado 9 (Epa 082
V)
Figura 51 A
Voltamperogramas de pulso
diferencial para los
precursores 1 2 3 y 4 2 mM
en DMF + HFFTBA 02 M
00 03 06 09 12 15 18 21 24
OO H
O H
H O
OOH
OH
HO
OH
OH
OH
O
HO
OOH
OH O
Cl
A
2A
E vs Ag|AgCl V
1
2
3
4
Resultados y discusioacuten
55
Figura 51 B Voltamperogramas de pulso diferencial para los derivados 9 10 y 11
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
En el caso del hiacutebrido 11 derivado del aacutecido protocateacutequico se observaron dos picos de
oxidacioacuten que corresponderiacutean a la oxidacioacuten del catecol cumariacutenico (Epa 083 V) y el
catecol del aacutecido benzoico (Epa 111 V) A diferencia del caso anterior se encontroacute
que las sentildeales anoacutedicas de ambos precursores estuvieron lo suficientemente distantes
como para solaparse como en el caso anterior Considerando que los resultados se
obtuvieron bajo las mismas condiciones experimentales se podriacutea asumir que la sentildeal
a potencial Epa1 081 V corresponde a la oxidacioacuten en el anillo de la cumarina y la
sentildeal en Epa2 094 V corresponde a la oxidacioacuten del catecol presente en el anillo
benceacutenico Para el compuesto 10 se observoacute un comportamiento semejante al descrito
para 11
00 03 06 09 12 15 18 21 24
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OH O O
O
OO H
O H
O H
OOH
OH O
OH
OH
O
O
B
E vs Ag|AgCl V
9
10
11
2A
Resultados y discusioacuten
56
Los experimentos de voltamperometriacutea ciacuteclica se llevaron a cabo a distinta velocidad
de barrido 005 Vs ndash 3 Vs con el objeto de estudiar su influencia sobre la sentildeal de
oxidacioacuten En forma graacutefica para precursores y derivados se observaron pares redox de
comportamiento irreversible debido al evidente desplazamiento del potencial de pico
Epa con respecto al aumento de la velocidad de barrido El valor de ΔEp (Epa -Epc) se
incrementoacute con el aumento en la velocidad lo que indica una disminucioacuten en la
velocidad de transferencia electroacutenica Para los compuestos 1 2 4 y 9 a la velocidad
de barrido estudiada se observoacute al igual que en VPD la aparicioacuten de una uacutenica sentildeal
de oxidacioacuten para todo el rango de velocidad (la que se desplaza a potenciales maacutes
positivos a medida que aumenta la velocidad de barrido) seguida de una sentildeal de
reduccioacuten en el barrido hacia potenciales negativos Para los compuestos 3 10 y 11 se
apreciaron dos sentildeales de oxidacioacuten seguida de la correspondiente sentildeal en el barrido
de reduccioacuten
Para cada par redox se realizaron estudios por segmentos encontraacutendose para los
compuestos 9 y 10 que el pico I (de oxidacioacuten) estaacute relacionado con el pico II (de
reduccioacuten) y para el compuesto 11 las sentildeales I y Irsquo (de oxidacioacuten) estaacuten relacionadas
con el pico II (de reduccioacuten) Esto es indicio de que en el primer barrido se observa el
proceso de oxidacioacuten de los grupos fenoles en el cual se generan especies factibles de
ser reducidas como derivados de tipo quinoacutenico (Figuras 52 a 54)
Resultados y discusioacuten
57
Figura 52A VC para el derivado 9 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 53A VC para el derivado 10 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
-03 00 03 06 09 12 15
A
II
I
OOH
OH O
OH
OH
O
O
100 A
005 Vs
3 Vs
E vs Ag|AgCl V
03 06 09 12 15
B
II
I
E vs Ag|AgCl V
0 V - 13 V
0 V - 06 V
00 03 06 09 12 15 18
A
II
I
I
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
3 Vs
005 Vs
E vs Ag|AgCl V
00 03 06 09 12
B
II
I
E vs Ag|AgCl V
-02 V - 06 V
-02 V - 11 V
Resultados y discusioacuten
58
Figura 54 A VC para el derivado 11 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
En sistemas fenoacutelicos simples como es el caso del catecol o la hidroquinona se ha
estudiado el proceso redox en distintos medios 98-101
planteaacutendose que la oxidacioacuten en
medio aproacutetico deriva en la formacioacuten de la quinona correspondiente viacutea 2e-2H
+
(Figura 55) En esta investigacioacuten se han estudiado estructuras de mayor complejidad
y considerando que en este proceso de oxidacioacuten se ha descrito la presencia de
especies radicales como intermediarios de reaccioacuten es probable que ocurran procesos
de dimerizacioacuten o ataques nucleofiacutelicos por parte de los radicales dando como
resultado la generacioacuten de compuestos diferentes a la moleacutecula de partida (por
ejemplo de mayor peso molecular) Este tipo de comportamiento se puede analizar en
profundidad realizando barridos de potencial consecutivos en VC a baja velocidad de
00 03 06 09 12 15
I
II
I
A
100 A
OHO O
O
OOH
OH
OH
005 Vs
3 Vs
E vs Ag|AgCl V
00 03 06 09 12 15
II
I
IB
E vs Ag|AgCl V
-01 V - 07 V
-01 V - 14 V
Resultados y discusioacuten
59
barrido (005 Vs o menor para observar maacutes detalladamente la reaccioacuten quiacutemica en la
escala de tiempo del experimento) Si fuese el caso se esperariacutea observar la aparicioacuten
de sentildeales nuevas en el segundo barrido de oxidacioacuten que dariacutean cuenta de la
oxidacioacuten de las nuevas estructuras fenoacutelicas generadas
OH
OH-2e- -2H+
2e- 2H+
O
O
Figura 55 Esquema del proceso electro-oxidativo propuesto para el catecol
Se realizoacute la deconvolucioacuten (mediante la funcioacuten gaussiana) sobre las curvas de
oxidacioacuten para los compuestos con el objeto de determinar los valores de corriente de
pico anoacutedica de forma independiente con esto se obtienen valores de corriente y
potencial (principalmente a alta velocidad de barrido) los cuales son maacutes exactos que
los entregados por defecto por el software electroquiacutemico utilizado Las graacuteficas y
caacutelculos correspondientes a la relacioacuten entre los diferentes paraacutemetros analizados se
realizaron considerando los valores de Ipa y Epa para el primer pico oxidativo debido a
que esta sentildeal entrega informacioacuten con respecto a la energiacutea del primer electroacuten cedido
en el proceso de oxidacioacuten etapa que generalmente es lenta y determinante de la
velocidad de reaccioacuten
Resultados y discusioacuten
60
La expresioacuten indicada en la Ecuacioacuten 51102
da cuenta de la relacioacuten entre el potencial
de pico y el logaritmo de la velocidad de barrido para una reaccioacuten electroquiacutemica
irreversible
119864119901 119894119903119903119890119907 = 11986412 + 119887
2[104 minus log (
119887
119863) minus 2119897119900119892119896119891 + 119897119900119892119907] Ecuacioacuten 51
Por tanto de la graacutefica Ep vs logv se puede obtener el valor de la pendiente de Tafel b
que es igual al doble de la pendiente de la recta obtenida
119864119901 119894119903119903119890119907 = 119862119905119890 + 119887
2(119897119900119892119907) Ecuacioacuten 52
La graacutefica de potencial de pico anoacutedico (Epa) vs logv dio como resultado una relacioacuten
de tipo lineal para todos los compuestos el potencial de oxidacioacuten se desplazoacute hacia
valores maacutes positivos con el aumento de la velocidad de barrido lo que indica el
caraacutecter irreversible del proceso oxidativo en este medio En la Figura 56 se presenta
la graacutefica obtenida para el derivado 9 como ejemplo representativo de los resultados
obtenidos
Resultados y discusioacuten
61
Figura 56 Relacioacuten Epa vs logv para el derivado de aacutecido cafeico 9 2 mM en
DMF + HFFTBA 02 M
Los valores obtenidos para la pendiente de Tafel se resumen en la Tabla 51 Los
compuestos 1 y 3 poseen valores de la pendiente de Tafel cercanos al teoacuterico (118
mVdec)103
para un proceso en que la primera transferencia electroacutenica es la etapa
lenta del proceso (por tanto la etapa determinante de la reaccioacuten de electro-oxidacioacuten)
El compuesto 4 presenta un valor de 88 mVdec lo que sugiere que el electrodo estaacute
contaminado103104
o se produce un mecanismo de oxidacioacuten complejo (que implica
una transicioacuten entre la etapa quiacutemica y la transferencia electroacutenica como determinante
de la velocidad)105
De la misma forma los valores encontrados para los derivados 9
(170 mVdec) 10 (134 mVdec) y 11 (140 mVdec) y para el aacutecido cafeico (212
mVdec) indican que en las condiciones experimentales utilizadas la superficie del
18 21 24 27 30 33 36
090
093
096
099
102
105
OOH
OH O
OH
OH
O
O
r = 098638
m = 008548
Ep
a1 (
V)
logv (mV12
s-12
)
Resultados y discusioacuten
62
electrodo se contamina (pasiva)106
con la generacioacuten de especies polimeacutericas debido a
la formacioacuten del radical fenoxilo (ArObull) el cual puede dimerizar y originar diversos
productos de reaccioacuten los cuales se adhieren a la superficie del electrodo
Para cada compuesto se establecioacute la existencia de una relacioacuten de tipo lineal entre el
logaritmo de la corriente de pico anoacutedico y el logaritmo de la velocidad de barrido
(logIpa vs logv) El valor para la pendiente de estas rectas estuvo entre 044 y 056
(Tabla 51) lo que sugiere que el proceso observado es de tipo difusivo
La corriente de pico anoacutedica se puede expresar en funcioacuten de distintos paraacutemetros
experimentales como se indica en la Ecuacioacuten 53102
119868119901 = 301 times 10minus5 119899 (23 119877 119879
119887 119865)
12
11986312 119862 11990712 Ecuacioacuten 53
Donde n es el nuacutemero de electrones transferidos R es la constante de los gases (Jmol
K) T es la temperatura (K) D es el coeficiente de difusioacuten de la especie electro-activa
(cm2s) F es la constante de Faraday (Cmol) b es la pendiente de la ecuacioacuten de
Tafel107
(η = a + b log i) C es la concentracioacuten de la especie electro-activa (molL) y v
es la velocidad de barrido (mVs) Esta expresioacuten indica que la correlacioacuten entre
Ip y vfrac12
da como resultado una recta que seraacute funcioacuten del nuacutemero de electrones n y la
pendiente de Tafel b valores que estaacuten presentes en la pendiente de esta recta
Resultados y discusioacuten
63
Considerando lo anterior se procedioacute a graficar Ipa vs vfrac12
encontraacutendose para todos los
compuestos (Figura 57) una relacioacuten de tipo lineal con valores de r entre 099988 y
099448 se presenta ademaacutes la regresioacuten para el aacutecido protocateacutequico 4 como muestra
del comportamiento encontrado para todos los compuestos con valores de intercepto
que tienden a cero Al observar la Tabla 51 se aprecia que todas las regresiones
poseen una pendiente semejante lo cual da un indicio con respecto al nuacutemero de
electrones y mecanismo involucrados en la reaccioacuten de oxidacioacuten estudiada
Figura 57 Graacutefica para la corriente de pico Ipa vs la raiacutez cuadrada de la velocidad de
barrido Ejemplo de correlacioacuten lineal en el aacutecido protocateacutequico 4 2 mM en DMF +
HFFTBA 02 M
Tomando en cuenta que los valores de C R T y F (Ecuacioacuten 53) son factores
constantes y que los coeficientes de difusioacuten D seraacuten semejantes y del mismo orden
para aquellos compuestos de estructura similar (precursores por una parte y derivados
por otra) se obtiene que la pendiente de la recta obtenida en esta correlacioacuten es un
0 10 20 30 40 50 600
50
100
150
200
250
Ipa (
A)
V12
(mV12
s-12
)
OOH
OH
HO
m = 40 10-6
r = 099988
Resultados y discusioacuten
64
indicador respecto al nuacutemero de electrones involucrados en la reaccioacuten y al valor de b
(relacionado con el mecanismo de oxidacioacuten estudiado)
En el caso de los compuestos precursores se obtuvieron valores de pendientes entre
36bull10-6
y 41bull10-6
(Tabla 51) este rango cercano indica la transferencia del mismo
nuacutemero de electrones en el proceso oxidativo observado en que para la cumarina
clorada 1 el aacutecido cafeico 2 y el aacutecido protocateacutequico 4 corresponde a la uacutenica sentildeal
de oxidacioacuten observada y en el caso del aacutecido gaacutelico 3 es el proceso correspondiente a
la primera sentildeal del voltamograma En la literatura se describen estudios en medio
aproacutetico para compuestos fenoacutelicos como por ejemplo derivados de la cumarina 78-
dihidroxilada 100ab
el aacutecido cafeico101
y la hidroquinona105
que dan cuenta de una sentildeal
en el proceso oxidativo en medio aproacutetico que involucra 2 electrones esto permite
inferir que las sentildeales observadas experimentalmente corresponden a un proceso di-
electroacutenico
Para los derivados 9 10 y 11 se observa que los valores para la pendiente Ipa vs vfrac12 se
encuentran entre 37bull10-6
y 42bull10-6
como se indica en la Tabla 51 Ademaacutes al
comparar estos resultados con los obtenidos para el caso de los precursores se deduce
que estamos frente a un proceso oxidativo que involucra dos electrones Se observa
tambieacuten que no hay cambios con respecto al mecanismo de reaccioacuten si lo hubiese se
esperariacutea encontrar diferencias del doble o superior en los valores encontrados para la
pendiente de la recta ya que eacutesta contiene el factor b (pendiente de la ecuacioacuten de
Tafel) antes mencionado
Resultados y discusioacuten
65
Posteriormente se calculoacute el valor correspondiente al potencial de inicio del proceso
electroquiacutemico (Eonset)108109
Este valor indica el potencial inicial con que el primer
electroacuten es cedido en el proceso oxidativo que tiene lugar en la superficie del
electrodo Se determina como el valor de potencial de interseccioacuten entre las recta
tangentes a la liacutenea base y la corriente de oxidacioacuten para cada velocidad de barrido
aplicada en forma experimental (005 Vs a 3 Vs en este estudio) (Figura 58) Una
vez obtenido este potencial se procede a graficar con respecto al logaritmo de la
velocidad de barrido como se presenta en la Figura 59 Se considera el valor del
intercepto de cada recta Eionset (por lo tanto a una baja velocidad de barrido) el cual
incluye el error inherente a la medicioacuten y por tanto es maacutes confiable (Tabla 51) Se
observa que estos potenciales variacutean entre 050 V y 079 V para el aacutecido gaacutelico 3 y el
aacutecido protocateacutequico 4 respectivamente potencial que da indicio de la factibilidad de
oxidacioacuten siendo el compuesto con un Eionset menor el que se oxida con mayor
facilidad Estos valores de potencial onset encontrados permitiraacuten establecer una
correlacioacuten entre el potencial de oxidacioacuten determinado de esta forma y los resultados
obtenidos en los ensayos de actividad frente a especies radicales llevados a cabo en
medio aproacutetico (seccioacuten 6)
Resultados y discusioacuten
66
Figura 58 Determinacioacuten graacutefica del valor de Eonset VC del precursor 1 01 Vs
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 59 Relacioacuten Eonset vs logv para los compuestos estudiados
-05 00 05 10 15 20
20 A
Eonset
E vs Ag|AgCl (V)
15 18 21 24 27 30 33 3606
07
08
09
10
11
12
OOH
OH
HO
OOH
OH
HO
OH
OH
OH
O
HO
OHO O
O
OOH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OOH
OH O
OH
OH
O
O
OOH
HO O
Cl
Eon
set
(V)
logv (mV12
s-12
)
Resultados y discusioacuten
67
Tabla 51 Paraacutemetros experimentales para los compuestos Determinaciones en VC
2 mM DMF + HFFTBA 02 M
Compuesto
119837119845119848119840119816119849119834120783
119837119845119848119840119855 (microAmVs
-1)
119837119816119849119834120783 119837119855120783120784
(microAmV12
s-12
)
119837119812119849119834120783
119837119845119848119840119855
(mVdec)
119835 = 120784 119837119812119849119834120783
119837119845119848119840119855
(mVdec)
Eionset
(mV)
056 36bull10-6
61 122 059
053 41bull10
-6 106 212 059
048 36bull10-6
55 110 050
O
OH
OH
HO
052 41bull10-6
44 88 079
047 40bull10-6
85 170 064
049 37bull10-6
67 134 075
044
42bull10-6
70 140 058
Con el objeto de recabar mayor informacioacuten con respecto al mecanismo de reaccioacuten
involucrado en los procesos oxidativos en estudio en base a los resultados obtenidos
OHO O
O
OOH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
O
OH
OH O
OH
OH
O
O
OOH
OH
HO
OH
OH
OH
O
HO
O
OH
HO O
Cl
Resultados y discusioacuten
68
en VC se realizoacute la graacutefica (Ipa v12
) vs v12
para los compuestos precursores 1 2 3 y
4 (escogidos por poseer un grupo catecol y ser estructuras de menor complejidad que
los derivados 9 10 y 11) Estas graacuteficas de las que se presenta el ejemplo del aacutecido
como muestra (Figura 510) presentaron una relacioacuten de tipo lineal en la que la
pendiente negativa obtenida sugiere que la reaccioacuten observada implica un mecanismo
de tipo EC considerando los estudios mencionados para compuestos fenoacutelicos
ampliamente descritos en la literatura100101105109
y el criterio de diagnoacutestico
mencionado por Pletcher y colaboradores111
Figura 510 Correlacioacuten (Ipa v12
) vs v
12 para el precursor aacutecido protocateacutequico 4
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
21 28 35 42 49 5626
28
30
32
34O
OH
OH
HO
r = -099302
V12
(mV12
s-12
)
Ipa
V12 (
A
mV
12s-1
2)
Resultados y discusioacuten
69
Diversos estudios proponen la presencia de mecanismos concertados para los procesos
redox de compuestos de tipo fenoacutelico los cuales implican la presencia de
intermediarios radicalarios y reacciones donde la transferencia de un protoacuten y un
electroacuten ocurren de forma acoplada dentro de un mismo paso Este concepto nace en la
deacutecada de 1990 a partir de los trabajos publicados por Biczoacutek y colaboradores112113
El estudio de este tipo de reacciones principalmente en derivados fenoacutelicos es de
relevancia debido al rol que eacutestos desempentildean en diferentes sistemas bioloacutegicos tanto
por su reconocida capacidad antioxidante como se evidencia en la investigacioacuten
realizada por Nakayama y colaboradores con respecto a derivados polifenoacutelicos y el
mecanismo de reaccioacuten propuesto de tipo PCET (Proton Concerted Electron Transfer)
frente al anioacuten superoacutexido114
o como en el caso de estudio de las reacciones de
transferencia electroacutenica que involucran al aminoaacutecido tirosina115ab
y otros co-factores
que forman parte esencial del proceso fotosinteacutetico que se lleva a cabo en estructuras
vegetales (Fotosistema II)116
En la deacutecada pasada los aportes a la investigacioacuten sobre el tema se tornaron maacutes
profundos y sistemaacuteticos permitiendo el modelamiento teoacuterico y anaacutelisis de este tipo
de mecanismos Debido al intereacutes concerniente a la obtencioacuten de modelos racionales
de sistemas bioloacutegicos los estudios realizados en medio proacutetico son variados como la
serie de derivados fenol-imidazol sintetizados y caracterizados por Markle y
colaboradores117
quienes entre diversos factores analizan el efecto del sustituyente
sobre el enlace O-H Otros autores como Saveacuteant Costentin y colaboradores han
abordado este toacutepico en diferentes publicaciones proponiendo distintos mecanismos
Resultados y discusioacuten
70
dependientes del pH y composicioacuten de la solucioacuten de trabajo (con buffer o sin eacutel)118
En trabajos posteriores plantean un estudio teoacuterico de modelamiento en sistemas de
tipo amino-fenol enfocados en el mencionado Fotosistema II119
y frente al sistema
enzimaacutetico superoacutexido dismutasa120
Rhile y colaboradores describen la siacutentesis
caracterizacioacuten y estudios de oxidacioacuten tanto quiacutemica como electroquiacutemica (en medio
aproacutetico acetonitrilo) de una serie de fenol-aminas junto con un anaacutelisis teoacuterico del
sistema evidenciaacutendose la presencia de especies radicales intermediarias121
junto con
valores entre 16 a 28 para la relacioacuten de efecto isotoacutepico cineacutetico (KI = kHkD) que se
estima como criterio para considerar un mecanismo concertado122
El estado del arte con respecto a los distintos mecanismos electro-oxidativos descritos
para los derivados fenoacutelicos indica que la determinacioacuten de una ruta en particular en
este proceso se puede establecer mediante estudios de naturaleza tanto experimental
como teoacuterica La obtencioacuten de paraacutemetros termodinaacutemicos como la energiacutea libre de
Gibbs el estudio de efecto isotoacutepico y la determinacioacuten de constantes de velocidad en
electroquiacutemica entre otros permiten discriminar entre las diferentes viacuteas en que se
puede llevar a cabo la electro-oxidacioacuten de fenoles
Resultados y discusioacuten
71
53 Estudio de generacioacuten de especies radicalarias mediante espectroscopia de
resonancia de espiacuten electroacutenico (REE)
A fin de evidenciar la existencia de posibles intermediarios radicalarios en el proceso
electro-oxidativo de los fenoles previamente estudiados a traveacutes de las teacutecnicas
electroquiacutemicas se procedioacute a oxidar los derivados 9 10 y 11 y medir in situ su
espectro REE Se utilizoacute la teacutecnica descrita por Le Nest y colaboradores99
en que se
describe el estudio de estructuras flavonoides polifenoacutelicas en eacutel se utiliza la
quelacioacuten con Zn2+
lo que permitioacute la estabilizacioacuten del radical formado y su posterior
estudio En primer lugar desde un punto de vista cualitativo se observoacute para cada
compuesto un evidente cambio de color en las soluciones electrolizadas las que se
tornaron de color amarillo intenso y maacutes oscuro que las soluciones de trabajo
originales lo que sugiere que tras la electroacutelisis se forma un compuesto nuevo
diferente al de partida como se esperaba En la Figura 511A-C se presentan los
espectros obtenidos junto con las respectivas simulaciones realizadas
Resultados y discusioacuten
72
Figura 511A Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido cafeico 9 estabilizado con Zn2+
en DMF + HFFTBA
(izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color
rojo)
Figura 511B Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido gaacutelico 10 estabilizado con Zn2+
en DMF + HFFTBA
(izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color
rojo)
3440 3450 3460 3470 3480 3490
O
OH
HO O
OH
OH
O
OA
Campo Magneacutetico G
3440 3450 3460 3470 3480 3490
OHO O
O
O
OH
OH
OH
OH
B
Campo Magneacutetico G
Resultados y discusioacuten
73
Figura 511C Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido protocateacutequico 11 estabilizado con Zn2+
en DMF +
HFFTBA (izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der
en color rojo)
Concordante con el resultado esperado la sentildeal espectral indica la presencia de una
especie radicalaria como intermediario de la electro-oxidacioacuten de los grupos catecol
presentes en los tres derivados en estudio
En la simulacioacuten realizada para el derivado 9 se observa el acoplamiento hiperfino de
tres aacutetomos de hidroacutegeno con los siguientes valores de constantes 132 G 098 G y
03 G que seriacutea indicio del proceso oxidativo que ocurre en el catecol del anillo
benceacutenico (Tabla 52) ya que estos valores coinciden con una interaccioacuten entre los tres
protones del anillo benceacutenico en posicioacuten 2 5 y 6 En el caso de los compuestos 10
y 11 se encontraron dos constantes de acoplamiento hiperfino lo que indica la
3440 3450 3460 3470 3480 3490
OHO O
O
OOH
OH
OH
C
Campo Magneacutetico G
Resultados y discusioacuten
74
interaccioacuten entre dos protones que seriacutean aquellos en posicioacuten 5 y 6 del anillo
cumariacutenico
Tabla 52 Constantes de acoplamiento hiperfino para los derivados polifenoacutelicos
Valores en Gauss
Compuesto aH1 G aH2 G aH3 G
132 098 030
215 156 -
235 122 -
Estos resultados concuerdan ademaacutes con lo descrito en la literatura con respecto a la
oxidacioacuten de grupos fenoacutelicos lo que permite inferir un posible mecanismo electro-
oxidativo para los derivados en estudio
O
OH
OH O
OH
OH
O
O
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
Resultados y discusioacuten
75
54 Resultados y discusioacuten de los estudios de reactividad frente a especies
radicalarias
En este punto de la investigacioacuten el objeto de estudio fue evaluar el comportamiento
de las nuevas estructuras previamente sintetizadas frente a diferentes especies
radicalarias de amplio intereacutes bioloacutegico radical peroxilo (ROObull) radical hidroxilo
(OHbull) anioacuten radical superoacutexido (O2-) junto con determinar la capacidad reductora de
los compuestos Cada ensayo fue escogido con miras de abordar el tema de la
capacidad antioxidante desde las posibilidades que permiten las experiencias de tipo in
vitro
541 Metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno
(oxygen radical antioxidant capacity-fluorescein ORAC-FL)
El estudio de especies reactivas de oxiacutegeno y nitroacutegeno asociadas a los procesos
oxidativos requiere en algunos casos del uso de compuestos denominados ldquosondasrdquo
En la teacutecnica de fluorescencia es posible implementar este tipo de metodologiacutea debido
a sus caracteriacutesticas de sensibilidad especificidad y simplicidad en la obtencioacuten de
datos convirtieacutendose en una herramienta uacutetil y ampliamente utilizada a la hora de
obtener una buena aproximacioacuten en la determinacioacuten de actividad frente a especies
EROsERNs123
Resultados y discusioacuten
76
En el caso de la metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno
(ORAC) los primeros trabajos que dan cuenta de su uso fueron descritos en la deacutecada
de 1990 a partir de la investigacioacuten de Cao y colaboradores124
En este trabajo los
autores describen la teacutecnica como un meacutetodo simple y confiable para determinar
capacidad antioxidante en serum humano en pequentildeas cantidades de muestra (del
orden de los microL) utilizando como sonda la β-ficoeritrina (proteiacutena aislada del alga roja
unicelular Porphyridium cruenturn) debido a su fluorescencia sensible a los cambios
conformacionales en su estructura en ensayos frente al radical peroxilo125
En el
desarrollo posterior Ou y colaboradores126
proponen una mejora a la teacutecnica
cambiando la sonda proteica por el compuesto fluoresceiacutena debido a su mayor foto-
estabilidad y para evitar interacciones proteiacutena-polifenol (hidrofoacutebicas y puentes de
hidroacutegeno) junto con ello realizaron la validacioacuten del meacutetodo Esta sonda es la
utilizada actualmente para este ensayo el cual es ampliamente utilizado en el estudio
de polifenoles y sus derivados127-128ab
en diferentes alimentos y bebidas129130
muestras bioloacutegicas de distinta iacutendole131
por mencionar algunos ejemplos
Para efectos de esta investigacioacuten se espera obtener un perfil de comportamiento de
cada uno de los compuestos frente al radical peroxilo (ROObull) que permita distinguir el
aporte que significa cada sustitucioacuten realizada al anillo cumarina con diferentes
grupos fenoacutelicos Cabe mencionar que las longitudes de onda maacuteximas (λmaacutex) de
absorbancia en el rango UV-visible para los compuestos ensayados estuvieron en un
rango entre los 203 nm y 329 nm En este estudio se obtuvieron los perfiles cineacuteticos
Resultados y discusioacuten
77
de consumo de la sonda fluoresceiacutena (con valores de 485525 nm para su absorcioacuten y
emisioacuten respectivamente) por induccioacuten de los radicales peroxilo (originados por
efecto de la termoacutelisis del azo-compuesto ABAP a 37 degC) A partir de estos perfiles de
decaimiento de la sonda a distintas concentraciones de compuestos antioxidantes (5 en
total) se obtuvieron curvas adecuadamente separadas como se muestra en la Figura
512 donde se muestran los resultados para el compuesto 11 como ejemplo
representativo del ensayo Posteriormente se determina para cada concentracioacuten el aacuterea
neta bajo la curva la que es graficada con respecto a las concentraciones utilizadas La
Figura 513 presenta relacioacuten lineal entre el aacuterea neta bajo la curva con respecto a la
concentracioacuten del compuesto 11 como ejemplo la que fue determinada para cada
derivado
Figura 512 Curvas para el consumo de la sonda fluoresceiacutena para un set de
concentraciones del compuesto 11
0 2000 4000 6000
02
04
06
08
10
F
F0
Tiempo (s)
control
16 M
12 M
081 M
045 M
020 M
Resultados y discusioacuten
78
Las curvas obtenidas en esta parte del experimento muestran la reaccioacuten de
competencia entre el radical y el antioxidante (el cual protege a la fluoresceiacutena del
proceso de oxidacioacuten) Posterior al procedimiento anteriormente descrito se obtuvo el
iacutendice ORAC para cada compuesto que se resume en la Tabla 54
Figura 513 Graacutefica de aacuterea neta bajo la curva ABC vs concentracioacuten del derivado 11
En este ensayo los compuestos hiacutebridos propuestos superaron en cuanto al valor de
iacutendice ORAC a la cumarina precursora 1 En los tres casos se pudo observar valores
superiores de casi el doble para el compuesto 10 y bordeando un ORAC casi tres veces
mayor en los compuestos 9 y 11 del valor obtenido para su precursor Estos resultados
evidenciaron un incremento en la capacidad antioxidante al que posee la cumarina de
manera independiente debido a la inclusioacuten de los derivados de aacutecidos
hidroxibenzoicos e hidroxicinaacutemico en su estructura (Tabla 53)
0 1 2 3 4 50
1000
2000
3000
4000
r = 099309
AB
C n
eta
Concentracioacuten (mM)
Resultados y discusioacuten
79
Tabla 53 Valores experimentales de iacutendice ORAC-FL para los compuestos
estudiados
Compuesto iacutendice ORAC-FL
(plusmnSD)
1 091 plusmn 010
2 347 plusmn 010
3 391 plusmn 009
4 069 plusmn 001
9 239 plusmn 003
10 174 plusmn 005
11 262 plusmn 004
Trolox 1
Por otra parte los valores del iacutendice ORAC de la serie fueron superiores al estaacutendar
Trolox con excepcioacuten de los compuestos 1 (cumarina de partida) y 4 (aacutecido
protocateacutequico) Para el caso de la cumarina eacutesta tuvo un valor ORAC menor a 1 En
el caso del compuesto 4 la ostensible diferencia (5 veces menor) con su homoacutelogo
aacutecido cafeico 2 deriva de la presencia del doble enlace en esta estructura aunque
ambos aacutecidos poseen igual cantidad de grupos ndashOH y en igual posicioacuten en el anillo
aromaacutetico la insaturacioacuten le confiere maacutes posibilidades de deslocalizacioacuten electroacutenica
debido a la mayor cantidad de estructuras resonantes posibles y por lo tanto mayor
Resultados y discusioacuten
80
estabilidad al formarse la especie radicalaria correspondiente en la reaccioacuten frente el
ABAP Al observar el valor obtenido para el aacutecido gaacutelico 3 se obtuvo un iacutendice
ORAC cercano al del aacutecido cafeico y aunque carece de la insaturacioacuten presente en el
derivado cinaacutemico posee en su defecto un grupo ndashOH adicional en posicioacuten 5 del
anillo aromaacutetico el cual aportoacute adicionalmente a su capacidad antioxidante (lo que no
ocurrioacute en el caso del aacutecido protocateacutequico 4)
Se observa que el aacutecido dihidroxibenzoico 4 que arrojara un valor 069 presenta un
incremento de 37 veces en su valor ORAC-FL al estar incorporado en el heterociclo
cumariacutenico En este caso se presentoacute un fenoacutemeno de sinergia positiva ya que ambos
compuestos cumarina 1 y aacutecido protocateacutequico 4 aumentaron su valor de ORAC-FL
pasando de un valor 091 y 069 de forma individual respectivamente a formar un
derivado que presentoacute un valor de ORAC-FL igual a 262 Al observar los valores
totales en los derivados 9 y 10 obtenidos no correspondieron a la sumatoria de los
iacutendices individuales de sus precursores este resultado indica que estuvo ausente el
fenoacutemeno de sinergia
Para los nuevos compuestos (9 10 y 11) se observoacute un incremento del valor de
ORAC-FL con respecto a la cumarina precursora 1 Por lo tanto la inclusioacuten delas
estructuras fenoacutelicas en el heterociclo cumariacutenico generoacute la obtencioacuten de nuevos
derivados con una mayor capacidad antioxidante en esta metodologiacutea de esta forma se
obtuvo un aporte a la reactividad de la cumarina 1
Resultados y discusioacuten
81
Los resultados obtenidos en este ensayo dan cuenta de la actividad que presentaron los
compuestos tanto precursores como derivados frente a la especie radical ROObull Un
punto importante a considerar es que este experimento ndashindependientemente de ser un
ensayo in vitro- se lleva a cabo en un medio buffer a pH 74 y a una temperatura
controlada de 37 degC lo que permite obtener una primera aproximacioacuten con respecto a
lo que seraacute la actividad de los compuestos en un medio bioloacutegico La sustitucioacuten en el
anillo cumariacutenico generoacute nuevos compuestos que superaron su capacidad antioxidante
sin embargo desde el punto de vista de los precursores aacutecidos (cafeico y gaacutelico) su
actividad se vio mermada tras la sustitucioacuten fenoacutemeno que se discute en la seccioacuten 6
La secuencia de actividad obtenida para los derivados y sus precursores fue 3 gt 2 gt 11
gt 9 gt 10 gt 1 gt 4
Junto con el ensayo anteriormente detallado se procedioacute a determinar la cantidad de
radicales que reaccionan con el compuesto antioxidante relacionando la concentracioacuten
de antioxidante aplicado la estequiometriacutea de la reaccioacuten y la velocidad de generacioacuten
de radicales peroxilo a 37 degC como se expresa en la siguiente ecuacioacuten (Burton y
colaboradores 1981)132
120591 = 119899 [119860119903119874119867]
119877119894 Ecuacioacuten 54
Resultados y discusioacuten
82
donde τ es el tiempo de induccioacuten (tiempo en el que la sonda es protegida de los
radicales peroxilo por el antioxidante) n es el valor asociado a la estequiometriacutea de la
reaccioacuten correspondiente a la cantidad de moleacuteculas de radical ROObull inactivadas por
moleacutecula de compuesto antioxidante [ArOH] es la concentracioacuten de antioxidante y Ri
es la velocidad de generacioacuten de radical peroxilo la cual estaacute directamente relacionada
con la concentracioacuten de ABAP utilizada en el ensayo (18 mM) y se determina seguacuten la
expresioacuten133
Ri = 136 bull 10-6
[ABAP] Ecuacioacuten 55
Dadas las condiciones experimentales empleadas el valor de Ri es 147 microMmin Los
resultados obtenidos del valor de la pendiente (regresioacuten lineal Ecuacioacuten 54) se
resumen en la Tabla 54
Todos los compuestos (precursores y derivados) presentan valores de n superiores a
los esperados donde en el caso extremo se tiene que una moleacutecula de aacutecido gaacutelico
estariacutea consumiendo 14 moleacuteculas de radical peroxilo resultado que es mucho mayor
al esperado Los aparentes altos valores de n como estequiometriacutea de la reaccioacuten
(n = 3 hasta n = 14) sugieren la presencia de reacciones asociadas de mayor
complejidad en las que estariacutea presente el radical alcoxilo (RObull)134
el cual se forma
por descomposicioacuten del radical peroxilo que posee una vida media del orden de los
segundos en comparacioacuten con el radical alcoxilo con una vida media del orden de los
10-6
s (y es maacutes reactivo) lo que explica esta diferencia en la estequiometria
Resultados y discusioacuten
83
Tabla 54 Valores calculados para el factor estequiomeacutetrico n
Compuesto na(plusmnSD) n
1 28 plusmn 03 3
2 39 plusmn 01 4
3 141 plusmn 14 14
4 24 plusmn 01 3
9 58 plusmn 04 6
10 49 plusmn 01 5
11 86 plusmn 01 9
a Valores calculados en triplicado
Este fenoacutemeno se ha encontrado en investigaciones previas realizadas en derivados
cumariacutenicos135
y fue descrito por Lissi y colaboradores el que se puede encontrar
ademaacutes en experimentos en los que se utiliza la sonda rojo de pirogalol (ORAC-
PGR)136137
Resultados y discusioacuten
84
542 Metodologiacutea de capacidad reductora de hierro en plasma (FRAP)
Esta metodologiacutea desarrollada por Benzie y Strain (1996)138
se propuso como una
medida de la capacidad reductora (asociada a una buena capacidad antioxidante)
enfocada a investigar procesos de estreacutes oxidativo en fluidos bioloacutegicos
Posteriormente se ha extendido al estudio de diversas matrices como extractos de
plantas medicinales139
alimentos140
compuestos puros141
por mencionar algunos
ejemplos
En este ensayo se obtuvieron los valores de la capacidad reductora de los compuestos
polifenoacutelicos la que se aprecia cualitativamente a traveacutes de la formacioacuten del complejo
de Fe2+
de color azul (Figura 514) Esta metodologiacutea involucra la reaccioacuten redox
entre el agente reductor (en este caso los derivados cumariacutenicos) y el oxidante (la sal
feacuterrica) es considerada como aproximacioacuten con respecto a la capacidad de mantener el
estatus redox dentro de la ceacutelula
En primer lugar se observoacute un comportamiento semejante al ensayo ORAC-FL en
cuanto a la tendencia que presentaron los compuestos en su capacidad reductora de
hierro lo que indica una baja probabilidad de que en este ensayo ocurriese el
fenoacutemeno de quelacioacuten propio de los catecoles La Tabla 55 presenta los datos
experimentales obtenidos
Resultados y discusioacuten
85
NN
NN
Fe 3+N
N
N
N
N
N
NN
NN
NN
Fe2+N
N
N
N
N
N
NN
Antioxidante
amarilloazul
[Fe(III) (TPTZ)2]3+ [Fe(III) (TPTZ)2]2+
Figura 514 Esquema para la reaccioacuten entre el complejo de Fe3+
y el compuesto
antioxidante reductor
Los compuestos 9 10 y 11 presentaron una mejor capacidad reductora frente a su
precursor cumariacutenico 1 Esto se explica debido a la presencia de un mayor nuacutemero de
grupos -OH presentes en las nuevas estructuras propuestas capaces de transferir
electrones y reducir la sal feacuterrica como se menciona en el trabajo de Pulido y
colaboradores142
quienes estudian una serie de polifenoles mediante esta teacutecnica
sentildealando que ademaacutes del nuacutemero de hidroxilos presentes la presencia de dobles
enlaces conjugados en el esqueleto como parte de las caracteriacutesticas estructurales
responsables de un aumento en la capacidad reductora en polifenoles
Resultados y discusioacuten
86
Tabla 55 Valores experimentales obtenidos para los compuestos en estudio ensayo
FRAP en equivalentes de Trolox10 microM de muestra
En el derivado 11 se presenta una interaccioacuten de tipo sineacutergica con respecto a los
resultados individuales de cada precursor habieacutendose obtenido un valor FRAP de
1302 y 868 equiv Trolox 10 microM de muestra para 1 y 4 respectivamente y para el
derivado final un valor de 2624 equiv Trolox 10 microM de muestra
Del mismo modo que en el ensayo anterior se observa que la sustitucioacuten en el anillo
cumariacutenico con los distintos grupos aacutecidos incrementa su potencial como especie
reductora mientras que en el caso del aacutecido cafeico y gaacutelico se aprecia una
disminucioacuten de 13 y 15 veces respectivamente en su capacidad reductora tras la
esterificacioacuten
Compuesto equiv Trolox 10 microM muestra
(plusmnSD)
1 1302 plusmn 197
2 2727 plusmn 321
3 4768 plusmn 215
4 868 plusmn 93
9 2052 plusmn 186
10 3182 plusmn 681
11 2624 plusmn 335
Resultados y discusioacuten
87
Los resultados obtenidos para esta teacutecnica entregan informacioacuten acerca de la capacidad
reductora relativa para el conjunto de compuestos ensayados capacidad que estaacute
relacionada con su actividad antioxidante Se obtuvo un orden relativo para
precursores y derivados como sigue 3 gt 10 gt 2 gt 11 gt 9 gt 1 gt 4 Con respecto a la
disminucioacuten de actividad para los aacutecidos mencionados sugiere que esta capacidad
ademaacutes del nuacutemero de ndashOH presentes estariacutea relacionada con el sustituyente ndashCOOH
que se transforma en un grupo eacutester (ver seccioacuten 6)
543 Capacidad de inactivacioacuten del radical OHmiddot teacutecnica Spin Trapping
Esta teacutecnica no destructiva permite la deteccioacuten e identificacioacuten de especies
paramagneacuteticas (con electrones desapareados) en distintas matrices El fenoacutemeno de
resonancia de espiacuten electroacutenico fue descubierto y descrito en la deacutecada de 1940 por
Zavoisky143
en sus estudios basados en sales de manganeso en distintos medios Su uso
y aplicaciones se han diversificado a numerosas aacutereas como en la determinacioacuten de
capacidad antioxidante en alimentos144
en el anaacutelisis del proceso oxidativo en
liacutepidos145
en el estudio de enfermedades parasitarias146
El creciente intereacutes de la
teacutecnica en ciencias biomeacutedicas radica en el hecho de que esta espectroscopia permite
discriminar diferentes especies radicales de intereacutes bioloacutegico estrechamente
relacionadas con el estatus redox de la ceacutelula147
cuyo desbalance se traduce en cuadros
de estreacutes oxidativo148
Resultados y discusioacuten
88
En este estudio se determinoacute la capacidad de los compuestos propuestos para inactivar
la especie radicalaria OHmiddot
mediante la teacutecnica spin trapping metodologiacutea basada en
establecer la competencia de reaccioacuten entre los antioxidantes propuestos y el spin trap
DMPO El radical se generoacute a traveacutes de la reaccioacuten de ldquoFenton no cataliacuteticordquo
(Ecuacioacuten 56) metodologiacutea que permite la generacioacuten del radical OHbull en medio
baacutesico en ausencia del ioacuten Fe como catalizador91ab
211986721198742 + 119874119867minus rarr 119874119867∙ + 1198742minus + 21198672119874 Ecuacioacuten 56
En un primer set de experimentos se procedioacute a realizar la experiencia utilizando
DMSO como solvente Se descartoacute esta opcioacuten debido a que resultoacute complejo
observar un patroacuten claro en el blanco y poder asiacute discriminar las nuevas sentildeales
espectrales a partir de la adicioacuten de los compuestos en estudio
En primer lugar se determinoacute el blanco experimental que indica la reaccioacuten de
inactivacioacuten del radical mediante el compuesto spin trap DMPO Posteriormente se
ensayaron los derivados hiacutebridos y sus precursores sinteacuteticos en dos concentraciones
033 mM y 33 mM En el caso de los experimentos realizados a la menor
concentracioacuten se aprecioacute que la disminucioacuten de la sentildeal del blanco fue miacutenima para los
siete compuestos y no se observoacute un cambio significativo en el espectro como para
obtener resultados concluyentes Considerando lo anterior los experimentos se
Resultados y discusioacuten
89
realizaron con concentracioacuten del orden de los 3 mM obtenieacutendose asiacute datos
satisfactorios en cuanto a la inactivacioacuten del radical y la posibilidad de realizar
caacutelculos sobre este valor El valor de inactivacioacuten del radical hidroxilo se calcula a
traveacutes de la disminucioacuten en la intensidad de las sentildeales al adicionar cada derivado En
cada espectro se aprecia el perfil hiperfino compuesto por cuatro liacuteneas caracteriacutesticas
correspondientes al aacutetomo de nitroacutegeno e hidroacutegeno del spin-aducto formado por
[DMPO-OH] con valores de aN y aH alrededor de 15G lo que concuerda con lo
descrito en la literatura149
para esta reaccioacuten y el espectro simulado que se presenta en
la Figura 515 El cambio experimental tras la adicioacuten de los compuestos se presenta
en color rojo (Figura 516 A-G)
N+
O-
+ OHN
O
OH
Figura 515 Espin aducto generado por la inactivacioacuten del radical OHbull y su espectro
simulado (derecha)
Resultados y discusioacuten
90
Figura 516 A Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto 4-clorometil-78-dihidroxicumarina 1 B Espectro REE de inactivacioacuten del
radical hidroxilo con adicioacuten del compuesto aacutecido cafeico 2
Figura 516 C Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto aacutecido gaacutelico 3 D Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con
adicioacuten del compuesto aacutecido 34-dihidroxi benzoico 4
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
B
Campo Magneacutetico G
compuesto 2
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
C
Campo Magneacutetico G
compuesto 3
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
D
Campo Magneacutetico G
compuesto 4
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
A
Campo Magneacutetico G
compuesto 1
control
Resultados y discusioacuten
91
Figura 516 E Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto hiacutebrido 9 F Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con
adicioacuten del compuesto hiacutebrido 10
Figura 516 G Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto hiacutebrido 11
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
G
Campo Magneacutetico G
compuesto 11
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
E
Campo Mgneacutetico G
compuesto 9
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
F
Campo Magneacutetico G
compuesto 10
control
Resultados y discusioacuten
92
Considerando los patrones espectrales obtenidos para los compuestos 9 10 y 11 se
observoacute que la sentildeal de cuadruplete correspondiente al control (spin-aducto [DMPO-
OH]) desaparecioacute casi por completo lo cual indica la inactivacioacuten del radical
hidroxilo Se observa ademaacutes un triplete con constantes de acoplamiento 1398 G y
1427 G que evidencioacute la reaccioacuten de oxidacioacuten del atrapador DMPO (Figura 517)
ya que de haberse formado el aducto entre la cumarina y el spin trap DMPO se
habriacutea obtenido el correspondiente espectro con un patroacuten de 6 liacuteneas espectrales
(Figura 518)
Figura 517 Espectro REE se destaca en rojo el triplete de integracioacuten 121
formado despueacutes de la reaccioacuten de Fenton no-cataliacutetico (izq) Espectro simulado
utilizando el programa EPR-WINSIM (der)
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
DMPO oxidado
N+
O-
+ OHNO
OH
Campo Magneacutetico G
Resultados y discusioacuten
93
cumarina + OHbull cumarinabull + H2O
cumarinabull + DMPO [cumarina-DMPO]
Figura 518 Espectro simulado para la formacioacuten del spin aducto [cumarina-
DMPO] utilizando el programa EPR-WINSIM
Como se presenta en la Tabla 56 tanto los aacutecidos orgaacutenicos como la cumarina
precursora y sus derivados presentaron reactividad muy semejante En las
condiciones de estudio para todos los compuestos se obtuvo un valor sobre el 90
indicando su poder de inactivacioacuten del radical resultado que superoacute al descrito en la
literatura para el estaacutendar Trolox
Estudios previos realizados en estructuras cumariacutenicas simples semejantes al
precursor 1 de esta investigacioacuten permiten comparar algunos resultados Peacuterez-Cruz y
colaboradores150
indican un 29 de inactivacioacuten para el derivado monohidroxilado de
la cumarina 1 diferencia que puede explicarse por la ausencia del ndashOH en posicioacuten 8
que aumenta su actividad El compuesto con grupos ndashOH en posicioacuten 6 y 7 presentoacute
un apagamiento del 51 Figueroa y colaboradores presentan tambieacuten un estudio en
que las cumarinas monohidroxiladas presentan valores de 23 y 56 de la
inactivacioacuten del radical OH corroborando lo encontrado anteriormente151
Resultados y discusioacuten
94
Tabla 56 Porcentajes de inactivacioacuten del radical hidroxilo (OHmiddot)
Compuesto de inactivacioacuten bullOH
(plusmnSD)
1 923 plusmn 74
2 983 plusmn 27
3 995 plusmn 08
4 927 plusmn 29
9 981 plusmn 18
10 982 plusmn 25
11 980 plusmn 99
Trolox 31plusmn 25a
aRef149 Figueroa R et al Future Med Chem 2013
Los resultados obtenidos con esta teacutecnica indican la reactividad relativa que tienen los
compuestos propuestos frente al radical OH Al considerar que el tiempo de vida del
radical hidroxilo y del spin trap DMPO es del orden de 10-9
s se observa que todos los
compuestos ensayados tuvieron la capacidad de competir con el DMPO en el proceso
de inactivacioacuten del radical evidenciado por la sentildeal de control que disminuyoacute casi en
su totalidad para todos los casos siendo menor en la cumarina precursora 1 y el aacutecido
4 siguiendo ambos compuestos la misma tendencia que se observara en los ensayos
Resultados y discusioacuten
95
anteriores Independientemente que el radical ensayado en este experimento es de una
alta reactividad y escasa selectividad el hecho de que se obtuvieran altos valores de
actividad para los compuestos propuestos indica que eacutestos se presentan como buenos
candidatos como inactivadores de la especie OH
Finalmente se observa que los derivados 9 10 y 11 presentaron un valor de
reactividad superior al de la cumarina precursora obtenieacutendose de esta forma un
aporte a la reactividad en cada nueva estructura propuesta frente al heterociclo de
partida 1 para este ensayo En cuanto a la reactividad relativa de la serie no se
encontroacute una diferencia significativa entre los compuestos ensayados precursores y
derivados mostraron valores cercanos en cuanto al de inactivacioacuten del radical
alrededor del 90
Resultados y discusioacuten
96
544 Estudio de reactividad frente al anioacuten radical superoacutexido O2-
Dentro de las diversas aplicaciones desarrolladas para las teacutecnicas electroquiacutemicas se
encuentran los ensayos de determinacioacuten de la capacidad antioxidante en distintos
medios152
y en muestras como bebidas153
vegetales154
mediciones in situ sobre piel
humana155
por mencionar algunos ejemplos Un reciente review (Pisoschi y
colaboradores 2015) describe las contribuciones realizadas con respecto a la
determinacioacuten de actividad antioxidante empleando exitosamente la voltametriacutea
ciacuteclica voltametriacutea de pulso diferencial voltametriacutea de onda cuadrada amperometriacutea
y potenciometriacutea156
las que ademaacutes se complementan con otras teacutecnicas en este tipo
de estudios157158
En esta parte de la investigacioacuten se determinoacute la reactividad de los compuestos frente
al anioacuten radical superoacutexido cuya generacioacuten electroquiacutemica en la superficie del
electrodo por reduccioacuten de oxiacutegeno disuelto mediante la teacutecnica de voltametriacutea ciacuteclica
ha sido ampliamente estudiada en nuestro grupo de trabajo159160110
y por otros
autores161
Como se esperaba tras la adicioacuten sucesiva de aliacutecuotas de todos los compuestos
estudiados hubo un decaimiento en la corriente de pico anoacutedica (Ipa0) (ejemplo del
resultado para el precursor 1 en la Figura 519) Esto permitioacute calcular el valor del
iacutendice antioxidante 50 (IA50) el cual se define como la concentracioacuten de sustrato
necesaria para obtener una disminucioacuten del 50 en la corriente Ipa0 Esta corriente es
Resultados y discusioacuten
97
directamente proporcional a la concentracioacuten de anioacuten superoacutexido presente por lo
que su disminucioacuten es un indicador de la capacidad del sustrato para inactivar la
especie radical generada in situ
Figura 519 Voltamogramas ciacuteclicos del par redox correspondiente al anioacuten
superoacutexido tras antildeadir aliacutecuotas del compuesto 1 DMF + HFFTBA 02 M 01 Vs
Tras obtener los voltamogramas ciacuteclicos para cada compuesto se procedioacute a
determinar el paraacutemetro adimensional (Ipa0-Ipa
SIpa
0) y se graficoacute con respecto a la
concentracioacuten de sustrato en solucioacuten (Figura 520) obtenieacutendose relaciones de tipo
lineal en que los valores del coeficiente de correlacioacuten r estuvieron entre 099777 y
097267
-10 -08 -06 -04 -02
Ipa0
10A
blanco
0049 mM
0099 mM
0149 mM
0199 mM
0249 mM
0299 mM
E vs Ag|AgCl V
Resultados y discusioacuten
98
007 014 021 02800
03
06
09
r = 099074
IA 50
(Ip
a0-
Ipa
S)
Ip
a0
Concentracioacuten mM
Figura 520 Graacutefica del paraacutemetro adimensional (Ipa0-Ipa
SIpa
0) vs concentracioacuten de
sustrato para el compuesto 1 (Destacado en verde el valor de IA50)
Junto con el valor de concentracioacuten IA50 la pendiente de las rectas entrega tambieacuten
informacioacuten con respecto a la reactividad de los compuestos frente al anioacuten
superoacutexido donde un mayor valor de la pendiente indica que el compuesto posee una
mayor actividad no obstante los autores que desarrollaron el meacutetodo hacen notar que
se utiliza preferentemente el iacutendice IA50 como valor para caracterizar de manera
adecuada la actividad de los compuestos propuestos frente el radical de forma
anaacuteloga al concepto de IC50 (concentracioacuten inhibitoria aplicada en sistemas
bioloacutegicos en relacioacuten a la cantidad de compuesto necesario para inhibir en un 50 el
crecimiento de una poblacioacuten de microorganismos)
Como se observa en los resultados (Tabla 57) la cumarina de partida 1 presenta un
valor mayor de IA50 (0187 mM) en comparacioacuten con los compuestos hiacutebridos 9 10 y
Resultados y discusioacuten
99
11 por lo que la adicioacuten de los fenoles a la estructura cumariacutenica fue un aporte a su
reactividad frente a la especie radical O2-
Tabla 57Valores de IA50 obtenidos para los compuestos estudiados
a Valor de estaacutendar Tolox ref 92
El derivado de aacutecido gaacutelico 10 presentoacute el menor valor de iacutendice antioxidante y por
consiguiente fue el mejor inactivador del anioacuten superoacutexido formado en la superficie
del electrodo puesto que se necesita una menor concentracioacuten de este derivado
(0064 mM) para apagar el 50 radical Junto con esto fue el compuesto que presentoacute
el fenoacutemeno de sinergia dentro de la serie con un valor de concentracioacuten menor
Compuesto IA 50 mM
(plusmnSD)
1 0183 plusmn 0007
2 0125 plusmn 0006
3 0104 plusmn 0004
4 0115 plusmn 0005
9 0141 plusmn 0011
10 0064 plusmn 0004
11 0137 plusmn 0002
Troloxa
197
Resultados y discusioacuten
100
requerida para inactivar el radical con respecto a cada uno de sus precursores (1 y 3)
El segundo mejor inactivador de O2-
fue el compuesto 11 con un valor de IA50 de
0137 mM y finalmente se tiene al derivado 9 con 0141 mM Este comportamiento
puede deberse a fenoacutemenos de difusioacuten de las moleacuteculas en el medio junto con su
reactividad en la superficie del electrodo
En este ensayo frente al radical O2-
al igual que el anterior (inactivacioacuten de la especie
OHbull) se pudo obtener informacioacuten con respecto al comportamiento de los
compuestos en un medio aproacutetico resultados que son de intereacutes ya que se pueden
considerar como una aproximacioacuten quiacutemica de tipo in vitro de los conocidos
fenoacutemenos de estreacutes oxidativo que ocurren en estructuras como las bio-membranas
donde participan especies reactivas oxigenadas161162
Finalmente se puede establecer un orden estimativo para la actividad de los derivados
y la cumarina 10 gt 3 gt 4 gt 2 gt 11 gt 9 gt 1 Todos los compuestos ensayados tuvieron
una reactividad superior al estaacutendar Trolox
Resultados y discusioacuten
101
545 Determinacioacuten de capacidad antioxidante celular (CAC)
Con el objeto de abordar los fenoacutemenos que involucran especies radicalarias
presentes en sistemas vivos se procede a realizar el estudio de la capacidad
antioxidante de los compuestos en un modelo bioloacutegico simple En este experimento
se utiliza la sonda DCFH-DA la cual difunde pasivamente a traveacutes de la membrana
celular al ingresar al citosol se transforma en el compuesto DCFH (no fluorescente)
que emite al entrar en contacto con especies oxidantes del tipo EROs y ERNs En los
experimentos realizados las ceacutelulas fueron estresadas mediante el compuesto ABAP
(generador de radical peroxilo) y se observoacute coacutemo los nuevos derivados en estudio
podiacutean contrarrestar este evento oxidativo al interior de la ceacutelula Los resultados
obtenidos se resumen en la Tabla 58
Los valores experimentales obtenidos en esta etapa indicaron una bio-disponibilidad
baja con una CAC menor al 50 para los nuevos compuestos 9 10 y 11 ademaacutes en
todos los casos se encontroacute un porcentaje menor de CAC de los derivados respecto a
los precursores respectivos 1 2 3 y 4 Para una concentracioacuten de 10 microM de
compuesto se obtuvieron valores muy semejantes (alrededor del 70) para los
precursores ensayados
Resultados y discusioacuten
102
Tabla 58 Valores obtenidos para la capacidad antioxidante celular (CAC)
concentraciones 1 microM y 10 microM de cada compuesto
Compuesto CAC 1 microM CAC 10 microM
1 696plusmn 50 727plusmn 13
2 730plusmn 26 739plusmn 07
3 662plusmn 19 701plusmn 01
4 477plusmn 25 665plusmn 26
9 381plusmn 55 499plusmn 66
10 178plusmn 45 395plusmn 128
11 345plusmn 31 234plusmn 108
En los resultados anteriores llaman la atencioacuten los bajos valores obtenidos en el
ensayo de CAC para los derivados polifenoacutelicos en comparacioacuten con los ensayos
realizados en sistemas no bioloacutegicos en que se obtuvieron buenos resultados en ellos
se pudo apreciar el fenoacutemeno de sinergia (en algunos casos) y un incremento en la
actividad de todos los derivados frente a la cumarina precursora de forma individual
Para explicar este comportamiento y complementar estos resultados se procedioacute a
seleccionar de manera racional los tres derivados obtenidos 9 10 y 11 y se determinoacute
su Hidrofobicidad Relativa en conjunto con el precursor cumariacutenico 1 (el cual
presentoacute valores de CAC alrededor del 70 cercano a lo obtenido en los precursores
Resultados y discusioacuten
103
aacutecidos) ensayo que entrega informacioacuten con respecto a la lipofilia relativa de la serie
(en funcioacuten de tiempos de retencioacuten) pudiendo dar respuesta al fenoacutemeno observado
555 Estudio de hidrofobicidad relativa
En el estudio de nuevos compuestos disentildeados como potenciales faacutermacos una de las
propiedades fisicoquiacutemicas de intereacutes es la lipofilia valor que puede determinarse
mediante distintos meacutetodos electroforesis capilar cromatografiacutea liacutequida de alta
resolucioacuten (HPLC) y determinando el coeficiente de particioacuten aguaoctanol entre
otras Junto con la metodologiacutea empiacuterica se han desarrollado diversas herramientas
computacionales con softwares que permiten calcular el valor para logP y logD
obtenieacutendose buenas correlaciones entre compuestos de una familia de estructuras
semejantes en los que se realizan variaciones a su esqueleto Los valores asiacute
calculados y entregados por el programa se consideran de una confiabilidad
razonable163
En el caso de este estudio se determinoacute la lipofilia relativa para los derivados 9 10 y
11 junto con el precursor 1 mediante HPLC en fase reversa donde se espera obtener
una serie relativa de tiempos de retencioacuten entre los compuestos que deacute cuenta de su
lipofilia Se utilizoacute esta teacutecnica por tratarse de una medicioacuten simple raacutepida y
ampliamente descrita en la literatura para nuevos compuestos en que la fase
estacionaria de la columna C18 simula la fase no polar y la fase moacutevil es la fase
Resultados y discusioacuten
104
acuosa asiacute a traveacutes de la columna se llevan a cabo muacuteltiples equilibrios de particioacuten
entre la fase acuosa y orgaacutenica En la medida en que el compuesto analizado sea maacutes
afiacuten a la fase estacionaria (relacionado con un mayor tiempo de retencioacuten) eacuteste seraacute
maacutes lipofiacutelico y viceversa Los resultados (Tabla 59) muestran que de acuerdo a los
tiempos de retencioacuten obtenidos (5138 5760 4031 y 4695 minutos) el orden
relativo de lipofilia fue el siguiente
Tabla 59 Valores obtenidos para el tiempo de retencioacuten experimental de los
compuestos
Compuesto Tiempo de retencioacuten
(min)
1 5138
9 5760
10 4031
11 4695
La Figura 521 indica el orden de lipofilia relativa encontrada para los derivados y su
precursor cumariacutenico En forma general se observaron valores de tiempo de
retencioacuten cercanos Se aprecioacute que el derivado de aacutecido cafeico 9 fue el compuesto
que encabezoacute la serie lo que se puede explicar debido a la presencia de un doble
enlace en su estructura confirieacutendole mayor apolaridad (por tanto hidrofobicidad) a
Resultados y discusioacuten
105
O
OH
HO O
Cl
O
OH
OH O
OH
OH
O
O
OHO O
O
O
OH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
la moleacutecula El segundo en la serie fue el compuesto clorado 1 en el cual el
sustituyente haloacutegeno es un aporte a la lipofilia del compuesto En el caso de las
estructuras 10 y 11 se encontroacute que el derivado de aacutecido gaacutelico presentoacute el menor
valor relativo debido a la presencia de un grupo ndashOH adicional en el anillo aromaacutetico
que como se esperaba tuvo la mayor tendencia hidrofiacutelica
9 1 11 10
Figura 521 Hidrofobicidad relativa de los derivados y la cumarina precursora
Para complementar este resultado experimental se realizoacute el caacutelculo teoacuterico para el
valor de logD mediante herramienta Marvin Sketch del software libre ChemAxon164
y
se establecioacute su correlacioacuten con el valor experimental obtenido para CAC en
concentracioacuten 10 microM El resultado de esta correlacioacuten se presenta en la Figura 522
Aumento de la lipofilia = aumento en el tiempo de retencioacuten
Resultados y discusioacuten
106
Figura 522 Correlacioacuten entre el valor de logD teoacuterico y CAC experimental a
10 microM de cada compuesto El valor logD se obtuvo a traveacutes de la herramienta Marvin
Sketch del software ChemAxon164
Considerando estos resultados para este modelo experimental propuesto en el ensayo
de CAC se observa que la lipofilia no seriacutea el uacutenico factor relacionado con los bajos
valores de capacidad antioxidante celular (CAC) obtenidos para los compuestos 9 10
y 11 ya que por ejemplo la cumarina 1 presentoacute valores de CAC sobre el 70 y fue
el segundo compuesto de la serie de hidrofobicidad relativa experimental con un
valor cercano de tiempo de retencioacuten al derivado 9 (el cual tuvo valores de CAC bajo
el 50) De igual forma se aprecia la misma tendencia al correlacionar el valor de
CAC con el logD teoacuterico donde el compuesto 1 independientemente de tener una
lipofilia semejante a los derivados polifenoacutelicos (al igual que en la serie de tiempos
de retencioacuten) siacute mostroacute una biodisponibilidad superior a los derivados y muy
-3 -2 -1 0 1 2 3 4
20
40
60
80
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OOH
HO O
Cl
OHO O
O
OOH
OH
OH
OOH
OH O
OH
OH
O
O
logDteor
C
AC
(1
0
32
4
Resultados y discusioacuten
107
semejante a los aacutecidos benzoicos (2 3 y 4) los cuales muestran valores negativos de
logD debido a su menor lipofilia
Por tratarse de un sistema bioloacutegico (ceacutelulas epiteliales) con muacuteltiples variables que
afectan la actividad de los compuestos estudiados se pueden considerar diversos
factores presentes en el medio ensayado que pueden dar respuesta al fenoacutemeno
observado Uno de ellos es la estructura de la membrana celular que contiene diversas
estructuras como por ejemplo el citocromo P (CYP) que es un complejo enzimaacutetico
involucrado en el metabolismo de faacutermacos siacutentesis de biomoleacuteculas y diversas
biotransformaciones de moleacuteculas a nivel celular165
Otro factor presente es la
existencia de enzimas hidroliacuteticas en el citosol celular como es el caso especiacutefico de
las carboxilesterasas (presentes en ceacutelulas epiteliales de intestino hiCE y otros
oacuterganos) las cuales son capaces de escindir diversos grupos funcionales tales como
amidas eacutesteres carbamatos y convertirlos en sus respectivos precursores (alcohol y
aacutecido) 166
Considerando que para este experimento en un modelo bioloacutegico in vitro simple se
emplearon ceacutelulas epiteliales de intestino (EAhy 926 (ATCC CRL-2922)) es posible
que el comportamiento observado se deba a la existencia de diversos fenoacutemenos e
interacciones posibles de los compuestos tanto a nivel de membrana como de
citoplasma Cabe destacar que al comparar las experiencias realizadas en un medio no
bioloacutegico los resultados en este caso se invierten al emplear una metodologiacutea que
involucra un medio bioloacutegico No necesariamente se encuentra un comportamiento
Resultados y discusioacuten
108
anaacutelogo en ambos medios de ensayo debido a la mayor complejidad y variables
asociadas a un sistema que involucra estructuras vivas independientemente de la
simplicidad o lo acotado del mismo
556 Estudios Teoacutericos optimizacioacuten de estructuras y determinacioacuten del Iacutendice
de Fukui
Con el objeto de racionalizar el estudio realizado y poder discriminar entre los
distintos sitios reactivos de los derivados se determinoacute el iacutendice de Fukui fk0
relacionado con un ataque de tipo radicalario Baacutesicamente es el promedio
correspondiente a las reacciones de ataque nucleofiacutelico fk- y electrofiacutelico fk
+(Ecuacioacuten
57) como se describe en el trabajo de Aliaga y Lissi donde se aborda el estudio
teoacuterico y experimental que compara la actividad anti-radicalaria de los polifenoles
rutina y quercetina167
1198911198960 =
119891119896minus+ 119891119896
+
2 Ecuacioacuten 57
Este iacutendice es un descriptor de reactividad local en los aacutetomos de oxiacutegeno que
participan en las reacciones de los grupos catecol presentes Este tipo de anaacutelisis
resulta adecuado para determinar los sitios de reaccioacuten preferentes en moleacuteculas
complejas con diversos centros reactivos168
Los resultados obtenidos indican que en
Resultados y discusioacuten
109
la cumarina precursora 1 el ataque radicalario ocurriraacute primero en el oxiacutegeno en
posicioacuten 7 debido al mayor valor de fk0
(0071) por otra parte no se observaron
cambios significativos en los valores de fk0 al formar parte de los derivados 10 y 11
para los aacutetomos de oxiacutegeno en posicioacuten 7 y 8 (aquellos involucrados en la capacidad
antioxidante de la moleacutecula) Al formar parte del derivado 9 si se observa una
disminucioacuten en su reactividad (fk0
O7 = 00078 y fk0
O8 = 00021) haciendo menos
probables estos dos sitios a un ataque radicalario en la moleacutecula (Tabla 510)
Los valores obtenidos para el iacutendice de Fukui indican que en el derivado 9 el sitio
maacutes probable para un ataque radicalario seraacute el catecol presente en el anillo benceacutenico
(proveniente del aacutecido cafeico) de preferencia en el oxiacutegeno en posicioacuten 4
(fk0
O4 = 00489) A diferencia del derivado de aacutecido cafeico en el caso de los
compuestos 10 y 11 el sitio preferente de reaccioacuten seraacute el anillo cumariacutenico
conservaacutendose el oxiacutegeno en posicioacuten 7 del heterociclo como sitio maacutes reactivo En
las Figuras 523 a 526 se presentan las estructuras optimizadas en 3D para el
precursor 1 y sus derivados polifenoacutelicos 9 10 y 11
Resultados y discusioacuten
110
Tabla 510 Valores de Iacutendice de Fukui fk para los compuestos en estudio
Compuesto Iacutendice de Fukui
fk0
Iacutendice de Fukui
fk-
O7 00771
O7 01373
O8 00391
O8 00757
O7 00078 O7 00072
O8 00021 O8 00036
O3 00389 O3 00779
O4 00489 O4 00890
O7 00719 O7 01276
O8 00365 O8 00716
O3 00025 O3 00050
O4 00025 O4 00049
O5 00002 O5 00004
O7 00739 O7 01316
O8 00378 O8 00742
O3 00004 O3 00008
O4 00003 O4 00005
OHO O
O
OOH
OH
OH
7
8
3
4
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
7
8
3
4
5
OOH
HO O
OH
OH
O
O
7
8
3
4
O
OH
HO O
Cl
7
8
Resultados y discusioacuten
111
OOH
OHO
Cl
Figura 523 Estructura optimizada en 3D para el precursor 1 utilizando DFT
OOH
OH O
OH
OH
O
O
Figura 524 Estructura optimizada en 3D para el derivado 9 utilizando DFT
Resultados y discusioacuten
112
Figura 525 Estructura optimizada en 3D para el derivado 10 utilizando DFT
OHO O
O
OOH
OH
OH
Figura 526 Estructura optimizada en 3D para el derivado 11 utilizando DFT
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
Resultados y discusioacuten
113
6 Discusioacuten General
Respecto del posible mecanismo de reaccioacuten electro-oxidativo se consideran las
siguientes evidencias teoacutericas y experimentales
En primer lugar como se esperaba los experimentos electroquiacutemicos de electro-
oxidacioacuten de los compuestos mostraron las sentildeales correspondientes a los grupos
ndashOH presentes en todas las estructuras Junto con esto los resultados de la graacutefica
Ipa vs vfrac12
indican la existencia de un proceso di-electroacutenico en los precursores y los
derivados (para la primera sentildeal oxidativa) lo que implica que comparten el mismo
mecanismo
Posteriormente se comproboacute la existencia de la especie radicalaria detectada mediante
oxidacioacuten electroquiacutemica seguida por resonancia de espiacuten electroacutenico con los
respectivos resultados de las simulaciones espectrales realizadas
En un siguiente punto se determinaron los valores teoacutericos de reactividad local
encontrados mediante el caacutelculo del iacutendice de Fukui El valor de fkndash
permitioacute
identificar los lugares con mayor reactividad frente a un ataque electrofiacutelico por tanto
las zonas en la moleacutecula puntuales con un alto valor para este iacutendice tenderaacuten a ceder
electrones con mayor facilidad en un proceso oxidativo Las estructuras optimizadas
en 3D indican que las zonas en color celeste (Figuras 523-526) corresponden a
aquellas con mayor densidad electroacutenica y por tanto estaacuten maacutes propensas a ceder
Resultados y discusioacuten
114
electrones en un proceso oxidativo Las zonas color lila representan los sitios con
menor densidad electroacutenica Para el compuesto 1 los ndashOH en el heterociclo presentan
mayor densidad electroacutenica lo que se aprecia de igual forma en los derivados 10 y 11
mientras que la zona del anillo benceacutenico se presenta con una baja densidad
electroacutenica Un fenoacutemeno diferente se aprecia para el derivado 9 donde la mayor
densidad electroacutenica se aprecia en la estructura benceacutenica cuyos grupos ndashOH
presentan el mayor valor de fk-
Este resultado teoacuterico racional complementa lo observado en el experimento descrito
con REE y electro-oxidacioacuten conjunta ya que los valores para las constantes de
acoplamiento hiperfino obtenidas en cada caso tambieacuten sentildealaron en cuaacutel de los dos
catecoles presentes ocurre la formacioacuten de la especie radical y por ende doacutende se
inicia el proceso de oxidacioacuten resultados corroboradas con el estudio teoacuterico
realizado De esta forma para el derivado 9 el proceso oxidativo se inicia en los -OH
ubicados en posicioacuten 3 y 4 que presentaron valores de fkndash
00779 y 00890
respectivamente y cuyas constantes de acoplamiento hiperfino son coherentes con
una interaccioacuten que involucra tres protones aquellos ubicados en las posiciones 2 5 y
6 del anillo benceacutenico El mismo anaacutelisis realizado para las estructuras 10 y 11 indica
que el proceso oxidativo ocurre primero en el anillo de la cumarina en los -OH en
posicioacuten 7 y 8 con valores del descriptor de reactividad local fkndash de 01276 y 00716
respectivamente para el derivado de aacutecido gaacutelico y en el caso del derivado de aacutecido
protocateacutequico con fkndash 01316 y 00742 para los oxiacutegenos en posicioacuten 7 y 8 De igual
forma los valores para las constantes de acoplamiento fueron consistentes con esta
Resultados y discusioacuten
115
informacioacuten experimental evidenciando la interaccioacuten entre dos protones (aquellos en
posicioacuten 5 y 6 del heterociclo cumariacutenico)
Esta diferencia encontrada para el proceso electro-oxidativo entre los derivados se
puede explicar debido a la existencia de un doble enlace conjugado adicional presente
soacutelo en el compuesto 9 derivado del aacutecido cafeico (ausente en 10 y 11) el cual le
confiere mayor deslocalizacioacuten (estabilidad) al radical que se forma como
intermediario en el proceso oxidativo
Los estudios presentes en la literatura sobre la oxidacioacuten de estructuras polifenoacutelicas
en medio aproacutetico presentan evidencias tanto teoacutericas como empiacutericas que ampliacutean la
visioacuten sobre la complejidad y posibilidades mecaniacutesticas en la oxidacioacuten de
estructuras polifenoacutelicas Basadas en modelos de naturaleza bioloacutegica como el
Fotosistema II presente en estructuras vegetales y otros ejemplos se plantea que una
viacutea de oxidacioacuten factible es a traveacutes de un mecanismo de tipo concertado donde se
obtiene el radical fenoxil (ArObull) en un paso directo en que el protoacuten y el electroacuten se
transfieren de manera conjunta (Figura 61 destacado en rojo) planteamiento que
considera factores de tipo energeacutetico a diferencia de los estudios claacutesicos con respecto
a este proceso seguacuten el cual la electro-oxidacioacuten se inicia con la peacuterdida de 1ē (etapa
electroquiacutemica) para formar el catioacuten radical(ArObull+) seguido de la peacuterdida de un
H+(etapa quiacutemica) para formar el radical fenoxil (ArObull) (Figura 62)
En el caso de los compuestos estudiados en esta investigacioacuten los valores de la
pendiente de Tafel encontrados para los compuestos (sobre 88 mVdec) sugieren que
Resultados y discusioacuten
116
el mecanismo de electro-oxidativo que maacutes se ajusta a la evidencia experimental es
por etapas
OH
HO
OH
HO
O
HO
O-
HO
-e- + B
+e- + HB+
+ B-e-
+e-
+e-
-e-
+ HB+
+ B
+HB+
Figura 61 Esquema de reaccioacuten para un mecanismo concertado de electro-
oxidacioacuten fenoacutelica Adaptacioacuten referencia 120
OH
HO - e
+ e
OH
HO
-H+
O
HO
Figura 62 Esquema de reaccioacuten para estructuras fenoacutelicas mecanismo electro-
oxidativo en etapas
Resultados y discusioacuten
117
Con respecto a los ensayos de actividad antioxidante realizados la Tabla 61 permite
comparar y estimar en conjunto los resultados obtenidos a traveacutes de las diferentes
metodologiacuteas empleadas
En forma general los resultados indican que la sustitucioacuten propuesta en esta
investigacioacuten en la cumarina dihidroxilada (utilizada como esqueleto de partida) con
distintas estructuras polifenoacutelicas entregoacute resultados positivos en cuanto al aporte
que los nuevos derivados obtenidos presentaron frente a la inactivacioacuten de especies
radicalarias tales como O2- ROO˙ OH˙ y su capacidad reductora (reflejada en el
ensayo FRAP) Para los ensayos realizados en un modelo no bioloacutegico se obtuvieron
valores de actividad en los derivados que superaron a los obtenidos para el precursor
cumariacutenico de forma individual
Cabe mencionar que en los diferentes ensayos y sus resultados se mencionan los
conceptos de reactividad y actividad de los compuestos En el caso de los ensayos
ORAC-FL y FRAP se habla soacutelo de actividad antioxidante ya que con la informacioacuten
que entregan no se puede determinar cuaacutel de los distintos grupos ndashOH presente en la
moleacutecula es el que reacciona primero Diferente es lo que ocurre en el ensayo frente
al radical hidroxilo en que se establece una competencia entre el atrapador (DMPO) y
el compuesto por inactivar al OHbull debido a que ambos tienen una vida media corta
(10-9
s) por tanto la reaccioacuten entre el antioxidante y el radical es raacutepida y el ndashOH maacutes
reactivo de la moleacutecula es el que inactiva a la especie y se puede mencionar como
reactividad Lo mismo ocurre para el ensayo frente al anioacuten radical superoacutexido en que
tambieacuten se mencionan los resultados como reactividad frente al radical
Resultados y discusioacuten
118
Tabla 61 Cuadro comparativo de los resultados en la determinacioacuten de capacidad
antioxidante para la cumarina y sus derivados
Compuesto ORAC-FL
FRAP
eq Trolox
10 microM
inactivacioacuten
OHmiddot
CAC
1 microM 10 microM
O2-
IA 50 mM
1 091 plusmn 003 1302plusmn 160 923 plusmn 74 696 plusmn 50 727 plusmn 13 0183plusmn0007
2 347 plusmn 010 2727 plusmn 321 983 plusmn 27 730plusmn 26 739plusmn07 0125 plusmn 0006
3 391 plusmn 009 4768 plusmn 215 995 plusmn 08 662plusmn 19 701plusmn01 0104 plusmn 0004
4 069 plusmn 001 868 plusmn 93 927 plusmn 29 477plusmn 25 665plusmn26 0115 plusmn 0005
9 239plusmn0027 2052 plusmn151 981 plusmn 18 381plusmn55 499 plusmn 66 0141plusmn0011
10 174 plusmn 005 28046plusmn188 982 plusmn 25 178plusmn45 395 plusmn128 0064plusmn0004
11 262 plusmn 004 2624 plusmn 236 980 plusmn 99 345plusmn31 234 plusmn 108 0137plusmn0002
Por otra parte en los ensayos ORAC-FL y FRAP se observoacute que los valores de
actividad para los aacutecidos cafeico 2 y gaacutelico 3 fueron superiores a los obtenidos para
sus derivados hiacutebridos 9 y 10 respectivamente En el ensayo frente al anioacuten
superoacutexido se encontroacute que los aacutecidos cafeico 2 y protocateacutequico 4 presentaron
resultados superiores en cuanto a reactividad que sus respectivos derivados hiacutebridos 9
y 11
Resultados y discusioacuten
119
En la literatura se encuentra la caracterizacioacuten de los aacutecidos benzoicos y otros
antioxidantes polifenoacutelicos naturales como moleacuteculas altamente polares lo que en
algunos limita su uso en medios como bio-membranas emulsiones y micelas por lo
que la formacioacuten de sus derivados eacutesteres se utiliza como una estrategia para
aumentar su lipofilia y por lo tanto la biodisponibilidad de estos compuestos en
medios no acuosos169170
investigacioacuten que ha dado origen a la formulacioacuten de los
denominados ldquoantioxidantes lipofiacutelicosrdquo171172
los que han demostrado ser eficientes
como antioxidantes en bio-membranas resultados que se describen en el trabajo
realizado por Tai y colaboradores donde se ensayaron eacutesteres de aacutecido vainilliacutenico
que ademaacutes de presentar buenos valores de iacutendice ORAC-FL inhibieron el proceso
de hemoacutelisis en eritrocitos de mamiacutefero173
Junto con lo anterior estaacute descrita la relacioacuten existente entre la estructura de los
aacutecidos benzoicos y su actividad antioxidante la que es atribuida a diversas
caracteriacutesticas presentes en su esqueleto tales como i) nuacutemero y posicioacuten de grupos ndash
OH en la moleacutecula ii) sustituyentes alcoxilo en posicioacuten orto al ndashOH iii) presencia
de grupos -COOH -COOR -CH=CH-CH2-174
Al apreciar las estructuras de los
derivados propuestos se infiere que las diferencias encontradas en la actividad de los
aacutecidos antes y despueacutes de la unioacuten a la cumarina estaacuten relacionadas con dicha
sustitucioacuten En el caso del aacutecido gaacutelico que presenta un valor de ORAC de 391 frente
a un valor de 174 para su derivado 10 y en el ensayo FRAP se encontroacute un valor de
4768 vs un 3182 para el hiacutebrido se puede sentildealar que no se aprecioacute un aumento de
Resultados y discusioacuten
120
actividad antioxidante para los eacutesteres con respecto al aacutecido del que provienen seguacuten
con lo descrito por algunos autores175176
Junto con lo anterior se forma un eacutester de
aacutecido gaacutelico con un sustituyente voluminoso (la estructura cumariacutenica) pudiendo
disminuir la coplanaridad en el sistema aromaacuteticocarbonilo lo que implica una menor
estabilizacioacuten del radical formado en la reaccioacuten frente a la especie ROObull para el
ensayo ORAC-FL y la capacidad reductora en el ensayo FRAP Otro punto a
considerar es que para este derivado se observa el fenoacutemeno mencionado por Rice-
Evans175
y otros autores con respecto a que un nuacutemero mayor de grupos ndashOH en el
anillo benceacutenico no implica necesariamente un aumento en la actividad antioxidante
de un derivado polifenoacutelico
Para el caso observado en el aacutecido cafeico y su derivado 9 se aprecia el mismo
fenoacutemeno de disminucioacuten de actividad del aacutecido 2 frente al eacutester como lo descrito
para el aacutecido gaacutelico y su derivado en los ensayos ORAC-FL y FRAP con la
diferencia que esta disminucioacuten no es tan draacutestica lo que se atribuye a la presencia del
doble enlace en la estructura que confiere mayor estabilidad por resonancia al radical
formado
El valor de reactividad local del iacutendice de Fukui fk0
-relacionado con los fenoacutemenos
de ataque radicalario- entregoacute informacioacuten con respecto a los sitios de los derivados
donde la actividad anti-radicalaria es maacutes probable Asiacute para el compuesto 9 esta
actividad ocurre en el anillo benceacutenico en primer lugar y posteriormente en la
cumarina Para los derivados 10 y 11 la mayor probabilidad de que se produzca el
Resultados y discusioacuten
121
ataque radicalario es en el heterociclo cumariacutenico y posteriormente en el catecol del
anillo benceacutenico Estos resultados corroboran con los valores experimentales y las
simulaciones realizadas en espectroscopia de resonancia electroacutenica de espiacuten (REE)
donde la actividad antioxidante del compuesto 9 ocurre con mayor probabilidad en el
anillo benceacutenico proveniente de la fraccioacuten del aacutecido cafeico (donde se encuentra el
doble enlace que le confiere mayor estabilidad al radical formado como intermediario
de reaccioacuten) mientras que en los derivados 10 y 11 esta actividad ocurre en el
heterociclo cumariacutenico
Se observa que los resultados de capacidad antioxidante para los derivados
polifenoacutelicos variaron entre un meacutetodo y otro no hubo correlacioacuten entre los valores
obtenidos en la capacidad antioxidante obtenidos en las distintas metodologiacuteas Este
resultado concuerda con lo esperado ya que cada experiencia realizada implica una
especie radicalaria diferente y cada una de ellas posee reactividades distintas (t12 O2-
del orden de los ms t12 OHbull ~ 10-9
s t12 ROObull ~ 10 ms) Para cada ensayo se
obtuvo un distinto orden relativo de reactividad entre los derivados y sus precursores
Se establece la relacioacuten entre el potencial Eonset y los resultados obtenidos en el
ensayo de capacidad antioxidante frente a anioacuten superoacutexido realizado en medio
aproacutetico (Figura 63) Para el ensayo de reactividad frente a O2-
se puede establecer
una correlacioacuten donde una disminucioacuten en el potencial de oxidacioacuten disminuye el
valor de IA50 para 5 de los 7 compuestos estudiados Por tanto a medida que el
Resultados y discusioacuten
122
potencial se hace menos positivo aumenta la reactividad de los compuestos frente al
anioacuten superoacutexido presentaacutendose una relacioacuten entre actividad antioxidante y Eonset
para este ensayo
Figura 63 Correlacioacuten entre el potencial de oxidacioacuten Eonset y los ensayos frente a
anioacuten superoacutexido
Un menor potencial de oxidacioacuten para los grupos ndashOH presentes en los compuestos
implica una mayor facilidad para oxidarse (por ende una mayor densidad de carga
electroacutenica para ceder) y por tanto un incremento en la capacidad antioxidante para
este ensayo
Se puede observar que el compuesto 4 (aacutecido protocateacutequico) posee un valor de IA50
de 0115 mM el cual se encuentra entre los valores encontrados para el aacutecido cafeico
y el aacutecido gaacutelico pero su valor de Eonset es mayor diferenciaacutendose de la tendencia
049 056 063 070 077
006
009
012
015
018
11
3
1
42
9
10
Eonset
vs Ag|AgCl V
IA50
mM
Resultados y discusioacuten
123
encontrada Junto con lo anterior el compuesto 4 presentoacute el menor valor para la
pendiente de Tafel (b = 88 mVdec) de toda la serie lo que sugiere una relacioacuten entre
el mecanismo de oxidacioacuten y la capacidad de reaccionar frente a la especie
radicalaria El compuesto 10 presentoacute el mejor valor para IA50 y tambieacuten se diferencia
de la serie de compuestos con respecto al Eonset (cercano al del compuesto 4) a
diferencia del aacutecido su pendiente de Tafel (b = 134 mVdec) indica la presencia de
dimerizaciones posteriores a la formacioacuten del radical fenoxil (y generacioacuten de
compuestos nuevos que tambieacuten pueden reaccionar con el radical) sugiriendo que
ademaacutes del mecanismo de oxidacioacuten hay otros factores que pueden influir como por
ejemplo la difusioacuten de las especies en el medio empleado
El estudio de los compuestos frente al radical hidroxilo reflejoacute que en las condiciones
experimentales empleadas los resultados fueron semejantes por cuanto los valores de
inactivacioacuten del radical en todos los casos fue sobre el 90 Debido a lo anterior se
descarta realizar la correlacioacuten con el potencial Eonset ya que no encontroacute una
diferencia significativa entre los compuestos
Finalmente al considerar los resultados obtenidos para la capacidad antioxidante
celular en un modelo bioloacutegico simple un punto a tener en cuenta es el hecho de que
esta metodologiacutea en particular adolece en cuanto a que es inespeciacutefica con respecto a
la cantidad de compuesto que ingresa en la ceacutelula ya que por las distintas lipofilias
observadas los compuestos tendraacuten una diferente capacidad de ingreso al medio y no
se puede determinar la relacioacuten existente entre la cantidad que ingresa a la ceacutelula
Resultados y discusioacuten
124
versus la reactividad Debido a lo anteriormente descrito estos resultados muestran
principalmente un reflejo de la capacidad de penetracioacuten que tienen los compuestos
hacia el interior de la ceacutelula
Un modo de abordar temaacuteticas de tipo multi-variable-donde se deben considerar
numerosos factores involucrados en un comportamiento o fenoacutemeno- es el empleo de
modelos teoacuterico-computacionales como QSAR (por su sigla en ingleacutes Quantitative
Structure-Activity Relationships) herramienta que se utiliza en la estimacioacuten de
propiedades bioloacutegicas y fisicoquiacutemicas de intereacutes en diversas moleacuteculas entre ellas
polifenoles177
El factor esteacuterico tiene un papel importante en los estudios realizados en medios
celulares siendo el tamantildeo molecular uno de los factores considerados en ensayos de
permeabilidad en futuros faacutermacos ya que un excesivo tamantildeo (entre otras cosas)
dificulta la solubilidad en medio acuoso asiacute como tambieacuten la difusioacuten pasiva de las
moleacuteculas163
Al observar el peso molecular de los compuestos derivados (entre
34427 gmol y 37031 gmol) se puede considerar que el efecto esteacuterico en este caso
no seriacutea la causa principal para el fenoacutemeno observado en el ensayo celular ya que
estaacute descrito que los compuestos no deberiacutean superar un peso de 500 gmol 163
_que no es el caso de estos derivados-
Los resultados obtenidos para este ensayo realizado en un modelo bioloacutegico simple
sugieren que la actividad de los derivados para reaccionar frente a especies
radicalarias podriacutea estar circunscrita a medios lipofiacutelicos como las membranas
Resultados y discusioacuten
125
bioloacutegicas estudio que se podriacutea profundizar empleando un modelo como el
descrito173
para estudiar procesos oxidativos en membranas de eritrocito
Conclusiones
126
7 Conclusiones
La teacutecnica de electro-oxidacioacuten complementada con espectroscopia de
resonancia de espiacuten electroacutenico (REE) resulta uacutetil para identificar especies
radicalarias como intermediarios de la reaccioacuten en este trabajo
La determinacioacuten del iacutendice de Fukui (fk-) en conjunto con los resultados de
resonancia de espiacuten electroacutenico permitieron discriminar los sitios de las
moleacuteculas donde se inicia el proceso oxidativo En el derivado 9 la oxidacioacuten
ocurre primero en el anillo benceacutenico y en los compuestos 10 y 11 el proceso
oxidativo ocurre primero en el heterociclo cumariacutenico
La inclusioacuten de las estructuras polifenoacutelicas al heterociclo cumariacutenico generoacute
un incremento en su capacidad antioxidante en los ensayos no bioloacutegicos
No se obtuvo correlacioacuten para los resultados de capacidad antioxidante entre
las distintas metodologiacuteas empleadas
Se establecioacute la correlacioacuten entre el valor de potencial de inicio de la reaccioacuten
electroquiacutemica (onset) y los resultados para el ensayo frente al anioacuten
superoacutexido A medida que el potencial se hace menos positivo aumenta la
reactividad de los compuestos lo que indica que la transferencia electroacutenica
estaacute involucrada en la etapa determinante de la velocidad
De acuerdo con los resultados de la teacutecnica CAC y la correlacioacuten tanto con la
hidrofobicidad relativa como con el logDteoacuterico la actividad de los derivados
Conclusiones
127
propuestos estaacute circunscrita a aquellos procesos oxidativos que tienen lugar en
medios lipofiacutelicos como por ejemplo membranas bioloacutegicas
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viii
4243 Capacidad de apagamiento del radical hidroxilo (OHmiddot)
mediante la teacutecnica spin traphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 44
4244 Estudio de reactividad frente al anioacuten radical superoacutexido O2bull-helliphelliphellip 45
4245 Estudio de la capacidad antioxidante celular (CAC)helliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 47
4246 Estudio de hidrofobicidad relativa helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 48
4247 Estudio teoacuterico caacutelculo del Iacutendice de Fukui fkhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 49
5 Resultados y discusioacuten helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 50
51 Siacutentesis de los compuestoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 50
52 Estudios electroquiacutemicoshelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 54
53 Estudio de generacioacuten de especies radicalarias mediante espectroscopia
de resonancia de espiacuten electroacutenico (REE)helliphelliphelliphelliphellip 70
54 Resultados y discusioacuten de los estudios de reactividad
frente a especies radicalariashelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 74
541 Metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales
oxiacutegeno-fluoresceiacutena (ORAC-FL)helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 74
542 Metodologiacutea de capacidad reductora de hierro en plasma
(FRAP )helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 82
543 Determinacioacuten de capacidad de apagamiento del radical OHmiddot
teacutecnica spin trappinghelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 86
544 Estudio de reactividad frente al anioacuten radical superoacutexido O2bull-helliphelliphellip 94
545 Determinacioacuten de capacidad antioxidante celular (CAC)helliphelliphelliphelliphellip 100
546 Estudio de hidrofobicidad relativa helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 102
ix
547 Estudio teoacuterico caacutelculo del Iacutendice de Fukui fkhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 108
6 Discusioacuten generalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 113
7 Conclusiones helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 124
8 Bibliografiacuteahelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 126
x
Iacutendice de figuras y tablas
Figuras
Figura 1 Esquema de los compuestos estudiados
Figure 1 Scheme of studied compounds
Figura 11 Estructura de la 2H-1-benzopiran-2-ona (cumarina)
Figura 12 Esquema general de la reaccioacuten de Pechmann
Figura 13 Estructura de la 33rsquo-metilenbis(4-hidroxicumarina) o dicumarol
Figura 14 Estructura de la suksdorfina
Figura 15 Estructura del hiacutebrido cumarina-flavona aislado de su fuente vegetal
Gnidia socotrana
Figura 16 Estructura del antibioacutetico hiacutebrido novobiocina metabolitos secundarios
en la especie Streptomyces
Figura 17 Hiacutebridos chalcona-cumarina con capacidad antioxidante
Figura 41 Aacutecidos empleados en la sustitucioacuten de la 4-clorometil-78-
dihidroxicumarina
Figura 42 Siacutentesis del derivado clorado 1
Figura 43 Siacutentesis del derivado clorado acetilado 5
Figura 44 Siacutentesis del aacutecido cafeico acetilado 6
Figura 45 Siacutentesis del aacutecido gaacutelico acetilado 7
Figura 46 Siacutentesis del aacutecido 34-dihidroxibenzoico acetilado 8
Figura 47 Siacutentesis del intermediario hiacutebrido derivado del aacutecido cafeico
xi
Figura 48 Siacutentesis del compuesto hiacutebrido final 9
Figura 49A Ruta de siacutentesis de los compuestos cumariacutenicos i) H2SO4 1 h bantildeo de
hielo ii) NaOH Ac2O 30 min bantildeo de hielo (aacutecido cafeico 6) H2SO4 Ac2O 30
min (cumarina y aacutecidos benzoicos)
Figura 49B Ruta de siacutentesis de los compuestos cumariacutenicos iii) DBU DMF (seca)
35 h 50 degC iv) NaHCO3 MeOH acetona tdeg amb 3 h N2
Figura 410 A Sonda fluoresceiacutena B 22prime-azobis (2-metilpropionamidina)
dihidrochloridrato (ABAP) C 6-hidroxi-2578-tetrametilcroman-2-aacutecido carboxiacutelico
(Trolox)
Figura 411 Actividad antioxidante ORAC para un compuesto en estudio
Figura 412 Reactivo 246-tris(2-piridil)-s-triazina (TPTZ)
Figura 413 Voltamograma ciacuteclico de la generacioacuten de anioacuten radical superoacutexido
DMF+ HFFTBA 02 M en electrodo de carbono viacutetreo
Figura 51A Voltamogramas de pulso diferencial para los precursores 1 2 3 y 4
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 51B Voltamogramas de pulso diferencial para los derivados 9 10 y 11
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 52A VC para el derivado 9 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 53A VC para el derivado 10 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 54A VC para el derivado 1a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 55 Esquema del proceso electro-oxidativo propuesto para el catecol
Figura 56 Relacioacuten Epa vs logv para el derivado de aacutecido cafeico 9 2 mM en
DMF + HFFTBA 02 M
xii
Figura 57 Graacutefica para la corriente de pico Ipa vs la raiacutez cuadrada de la velocidad de
barrido Ejemplo de correlacioacuten lineal en el aacutecido protocateacutequico 4 2 mM en
DMF + HFFTBA 02 M
Figura 58 Determinacioacuten graacutefica del valor de Eonset VC del precursor 1 01 Vs
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 59 Relacioacuten Eonset vs logv para los compuestos estudiados
Figura 510 Correlacioacuten Ipa v12
vs v12
para el precursor aacutecido protocateacutequico 4
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 511A Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido cafeico 9 estabilizado con Zn2+
en DMF+HFFTBA
(izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color
rojo)
Figura 511B Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido gaacutelico 10 estabilizado con Zn2+
en DMF+HFFTBA
(izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color
rojo)
Figura 511C Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido 11 estabilizado con Zn2+
en DMF+HFFTBA (izq)
Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color rojo)
Figura 512 Curvas para el consumo de la sonda Fluoresceiacutena para un set de
concentraciones del compuesto 11
Figura 513 Graacutefica de aacuterea neta bajo la curva ABC vs concentracioacuten del derivado 11
Figura 514 Esquema para la reaccioacuten entre el complejo de Fe3+
y el compuesto
antioxidante reductor
Figura 515 Espin aducto generado por la inactivacioacuten del radical OHbull y su espectro
simulado (derecha)
xiii
Figura 516A Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto 4-clorometil-78-dihidroxicumarina 1 B Espectro REE de inactivacioacuten
del radical hidroxilo con adicioacuten del compuesto aacutecido cafeico 2
Figura 516C Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto aacutecido gaacutelico 3 D Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con
adicioacuten del compuesto aacutecido 34-dihidroxi benzoico 4
Figura 516E Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto hiacutebrido 9 F Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con
adicioacuten del compuesto hiacutebrido 10
Figura 516G Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto hiacutebrido 11
Figura 517 Espectro REE se destaca en rojo el triplete de integracioacuten 121
formado despueacutes de la reaccioacuten de Fenton no-cataliacutetico (izq) Espectro simulado
utilizando el programa EPR-WINSIM (der)
Figura 518 Espectro simulado para la formacioacuten del spin aducto [cumarina-
DMPO] utilizando el programa EPR-WINSIM
Figura 519 Voltamogramas ciacuteclicos del par redox correspondiente al anioacuten
superoacutexido tras antildeadir aliacutecuotas del compuesto 1 DMF + HFFTBA 02 M 01 Vs
Figura 520 Graacutefica del paraacutemetro adimensional (Ipa0-Ipa
S Ipa
0) vs concentracioacuten
de sustrato para el compuesto 1 (Destacado en verde el valor de IA50)
Figura 521 Hidrofobicidad relativa de los derivados y la cumarina precursora
Figura 522 Correlacioacuten entre el valor de logD teoacuterico y CAC experimental a
10 microM de cada compuesto El valor logD se obtuvo a traveacutes de la herramienta Marvin
Sketch del software ChemAxon164
Figura 523 Estructura optimizada en 3D para el precursor 1 utilizando DFT
Figura 524 Estructura optimizada en 3D para el derivado 9 utilizando DFT
Figura 525 Estructura optimizada en 3D para el derivado 10 utilizando DFT
xiv
Figura 526 Estructura optimizada en 3D para el derivado 11 utilizando DFT
Figura 61 Esquema de reaccioacuten para un mecanismo concertado de electro-
oxidacioacuten fenoacutelica Adaptacioacuten referencia 118
Figura 62 Esquema de reaccioacuten para estructuras fenoacutelicas mecanismo electro-
oxidativo en etapas
Figura 63 Correlacioacuten entre el potencial de oxidacioacuten Eonset y los ensayos frente a
anioacuten superoacutexido
xv
Tablas
Tabla 51 Paraacutemetros experimentales para los compuestos Determinaciones en VC
2 mM DMF + HFFTBA 02 M
Tabla 52 Constantes de acoplamiento hiperfino para los derivados polifenoacutelicos
Valores en Gauss
Tabla 53 Valores experimentales de Iacutendice ORAC para los compuestos estudiados
Tabla 54 Valores calculados para el factor estequiomeacutetrico n
Tabla 55 Valores experimentales obtenidos para los compuestos en estudio ensayo
FRAP en equivalentes de Trolox10 microM de muestra
Tabla 56 Porcentajes de inactivacioacuten del radical hidroxilo (OHmiddot)
Tabla 57 Valores de IA50 obtenidos para los compuestos estudiados
Tabla 58 Valores obtenidos para la capacidad antioxidante celular (CAC)
concentraciones 1 microM y 10 microM de cada compuesto
Tabla 59 Valores obtenidos para el tiempo de retencioacuten experimental de los
compuestos
Tabla 510 Valores de Iacutendice de Fukui fk para los compuestos en estudio
Tabla 61 Cuadro comparativo de los resultados en la determinacioacuten de capacidad
antioxidante para la cumarina y sus derivados
xvi
Glosario de abreviaturas
ABAP 22-azo-bis(2-amidinopropan)diclorhidrato
ADN Aacutecido desoxiribonucleico
ATCC American Type Culture Collection
HFFTBA Hexafluorofosfato de tetrabutil amonio
CAC Capacidad antioxidante celular
CYP450 Citocromo P450
DBU 18-diazabiciclo[540]undec-7-ano
DCFH-DA 2-(6-oxido-3-oxo-3H-xanten-9-il)benzoato disoacutedico (fluoresceiacutena sal
disoacutedica)
DMF NN-dimetilformamida
DMPO 55-dimetil-1-pirroline-N-oacutexido
DMSO Dimetil sulfoacutexido
DPPHbull Radical 22-difenil-1-picrilhidrazil
Epa Potencial de pico anoacutedico
EPR Electron paramagnetic resonance
ERNs Especies reactivas de nitroacutegeno
EROs Especies reactivas de oxiacutegeno
xvii
fk Iacutendice de Fukui
FRAP Ferric reducing antioxidant in plasma
HObull Radical hidroxilo
IA50 Iacutendice antioxidante 50
Ipa Corriente de pico anoacutedica
O2˙- Anioacuten radical superoacutexido
ONOObull Radical peroxinitrito
ORAC-FL Oxygen radical antioxidant capacity-fluorescein
PBS Buffer fosfato salino
REE Resonancia de espiacuten electroacutenico
RObull Radical alcoxilo
ROOmiddot Radical peroxilo
TPTZ 246-tris(2-piridil)-s-triazina
Trolox 6-hidroxi-2578-tetrametilcroman-2-aacutecido carboxiacutelico
VC Voltametriacutea ciacuteclica
VPD Voltametriacutea de pulso diferencial
xviii
RESUMEN
Las cumarinas (2H-1-benzopiran-2-ona) son estructuras quiacutemicas presentes en
especies vegetales ampliamente distribuidas en la naturaleza con una reconocida
actividad bioloacutegica entre las que destacan sus propiedades antioxidantes
En el presente trabajo de Tesis se describe la siacutentesis de derivados polifenoacutelicos La
cumarina dihidroxilada como estructura de partida fue esterificada con distintos
aacutecidos orgaacutenicos polifenoacutelicos (Figura 1) Se estudioacute su electro-oxidacioacuten y se evaluoacute
su actividad antioxidante frente a especies reactivas de oxiacutegeno por medio de diversas
metodologiacuteas in vitro
Figura 1 Esquema de los compuestos estudiados
Se estudioacute el comportamiento anoacutedico de los compuestos mediante voltametriacutea
ciacuteclica (VC) y voltametriacutea de pulso diferencial (VPD) en medio aproacutetico como una
aproximacioacuten a los procesos redox que ocurren en membranas bioloacutegicas
Se determinoacute la presencia de especies radicalarias en el proceso electro-oxidativo a
traveacutes de la teacutecnica de resonancia de espiacuten electroacutenico (REE) Las constantes de
OOH
HO O
Cl
HO
OOH
OH
OH
OH
HO
O
OH
OH
OH
HO
OO
OHHO O
OH
OH
O
O
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
xix
acoplamiento hiperfino junto con caacutelculos teoacutericos (iacutendice de Fukui) permitieron
discriminar distintos sitios reactivos en las nuevas moleacuteculas donde se desarrolla el
proceso oxidativo
Ademaacutes se evaluoacute la capacidad antioxidante de los compuestos a traveacutes de los
ensayos capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno-fluoresceiacutena (ORAC-
FL) capacidad antioxidante reductora de hierro (FRAP) apagamiento del radical
hidroxilo mediante spin trapping inactivacioacuten de anioacuten superoacutexido y capacidad
antioxidante celular (CAC) en un modelo bioloacutegico in vitro simple
Para los ensayos antioxidantes no bioloacutegicos la introduccioacuten de las distintas
estructuras fenoacutelicas en el anillo cumariacutenico permite obtener derivados que presentan
una capacidad antioxidante mejor que el precursor cumariacutenico inicial Se establecioacute
la respectiva correlacioacuten entre el potencial de inicio del proceso electroquiacutemico
(potencial onset) y los resultados encontrados en el ensayo en medio aproacutetico frente a
anioacuten superoacutexido
Considerando el ensayo bioloacutegico de capacidad antioxidante celular eacuteste sugiere que
la actividad antioxidante de los nuevos derivados estaacute circunscrita a medios de
naturaleza lipofiacutelica
xx
SUMMARY
Coumarins (2H-1-benzopyran-2-one) are chemical structures from vegetal sources
widely distributed in vegetable species with recognized biological activities among
which their antioxidant capacity
In this Thesis work the syntheses of coumarin polyphenolic derivatives is described
Coumarin was the starter scaffold and it was sterified with different organic phenolic
acids The electro-oxidation of polyphenolic derivatives is studied and their
antioxidant capacity towards ROS through methodologies in vitro is evaluated
Figure 1 Scheme of studied compounds
The anodic behavior of the compounds by cyclic voltammetry (CV) and differential
pulse voltammetry (VPD) was studied in aprotic medium as an approximation to the
redox processes in biological membranes
The presence of radical species is determined in the electro-oxidation process through
the technique electron spin resonance (ESR)The hyperfine coupling constants and
theoretical calculations (Fukui index values) allow to discriminate between the
OOH
HO O
Cl
HO
OOH
OH
OH
OH
HO
O
OH
OH
OH
HO
OO
OHHO O
OH
OH
O
O
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
xxi
different reactive sites in the new molecules where the oxidative process is taking
place
Moreover antioxidant capacity of derivatives was evaluated through oxygen radical
antioxidant assay-fluorescein (ORAC-FL) ferric reducing ability of plasma (FRAP)
spin trapping superoxide scavenging assays and cellular antioxidant (CAC) in a
simple biological model in vitro
In the non-biological antioxidant assays the addition of various phenolic structures to
the coumarin scaffold yielded derivatives with improved antioxidant capacity related
to initial coumarin We studied the correlations between the starting potential of the
electrochemical process (onset potential) and the antioxidant results obtained in
aprotic media against superoxide anion
In regard to the biological cellular antioxidant capacity assay it suggests that the
antioxidant activity of new derivatives could be limited to lipophilic media
Introduccioacuten
1
1 Introduccioacuten
11 Cumarinas
111 Origen vegetal
Las cumarinas son una familia de compuestos cuya estructura baacutesica corresponde a la
lactona heterociacuteclica 2H-1-benzopiran-2-ona (Figura 11) En el reino vegetal estaacuten
ampliamente distribuidas habieacutendose identificado en la actualidad maacutes de 1800
cumarinas de origen natural1 eacutestas se encuentran principalmente como metabolitos
secundarios en diversas plantas tanto en sus semillas como en hojas y raiacuteces2 Su
biosiacutentesis es descrita por distintos autores como una serie de procesos catalizados
por enzimas presentes en la estructura CYP450 (citocromo P450) en algunos casos
estos compuestos son generados en la ceacutelula vegetal como una viacutea de defensa
(fitoalexinas como la escopoletina) frente a estiacutemulos de estreacutes y la presencia de fito-
patoacutegenos34
O O
3
45
6
7
81
2
Figura 11 Estructura de la 2H-1-benzopiran-2-ona (cumarina)
Introduccioacuten
2
El nombre de estos compuestos se deriva de la palabra ldquocoumarourdquo vocablo
caribentildeo que hace referencia al aacuterbol de Tonka originario de Sudameacuterica de cuya
semilla A Vogel logra aislar el compuesto y publicar su hallazgo en 18205b
A partir
de entonces el intereacutes por su caracterizacioacuten6 la obtencioacuten tanto desde fuentes
naturales7 como por rutas sinteacuteticas de la cumarina y sus derivados ha ido en
aumento encontrando su primera aplicacioacuten en la fabricacioacuten de perfumes En 1868
W H Perkin propuso la siacutentesis de una fragancia vegetal a partir de la sal soacutedica del
orto-hidroxibenzaldehiacutedo y anhiacutedrido aceacutetico obteniendo el mismo producto aislado
de la semilla de Tonka5 8(ac)
Se han estudiado los aspectos taxonoacutemicos en cuanto a la clasificacioacuten de las especies
vegetales que contienen compuestos cumariacutenicos se estima que las principales
familias donde se encuentran estos derivados son Umbelliferae Rutaceae
Leguminosae Compositae Caryopgillaceae Euphorbiaceae Hipocastanaceae
Oleaceae Thymelaeaceae8b
112 Rutas de siacutentesis
Los autores Sethna y Narsinh9 presentaron en 1944 una de las primeras revisiones del
estado del arte con respecto a la siacutentesis de cumarinas En ella se encuentran las
principales metodologiacuteas claacutesicas de obtencioacuten como la siacutentesis de Perkin
Pechmann10
y Pechmann-Duisberg11
(Figura 12) en la que se obtiene la cumarina al
Introduccioacuten
3
condensar un fenol con un β-cetoester en medio aacutecido Diversas publicaciones
plantean modificaciones a esta ruta con catalizadores12 (ab)
libre de solventes13 (ab)
con promotores aacutecidos14
asistida por microondas15
entre otras
Figura 12 Esquema general de la reaccioacuten de Pechmann
Otra metodologiacutea empleada es la de Knoevenagel16
propuesta en 1898 Consiste en
una reaccioacuten de condensacioacuten entre o-hidroxialdehiacutedos con malonato de etilo
acetoacetato de etilo o cianoacetato de etilo en medio baacutesico (piridina o piperidina)
Los autores Bigi y colaboradores17
describen el uso de un catalizador en base a
montmorillonita para la obtencioacuten de cumarinas sustituidas en posicioacuten 3 con un
grupo aacutecido Posteriormente otro grupo de trabajo (Shaabani 2009) llevoacute a cabo esta
condensacioacuten empleando radiacioacuten de microondas lo que les permitioacute obtener buenos
rendimientos en un medio ldquoamigablerdquo con el ambiente18
Se han descrito otras metodologiacuteas sinteacuteticas en las cuales se utilizan las reacciones
claacutesicas de Wittig19 ab
y Reformatsky20
ademaacutes de otras rutas con variantes tanto en
los reactivos como en el medio de reaccioacuten que permiten la obtencioacuten de derivados
OH
+
OEt
O O H2SO4
O O
Introduccioacuten
4
cumariacutenicos como la siacutentesis en presencia de bases fuertes21
reacciones libres de
solventes22
y la obtencioacuten de cumarinas policiacuteclicas utilizando compuestos
organometaacutelicos descrita por Harvey y cols23
113 Principales aplicaciones
Tras ser aisladas desde su fuente vegetal y como resultado de investigaciones
posteriores dirigidas a generar rutas sinteacuteticas viables las cumarinas han sido objeto
de numerosos estudios enfocados en la buacutesqueda de sus aplicaciones Es asiacute como en
la literatura se pueden encontrar las maacutes diversas investigaciones para este tipo de
compuestos provenientes tanto de productos de siacutentesis o como extractos de
vegetales y plantas con reconocidas propiedades en la medicina tradicional esto da
origen al estudio de sus bio-aplicaciones entre las que se destaca su capacidad como
antioxidante
A Actividad bioloacutegica
La primera aplicacioacuten en bio-medicina descrita para las cumarinas fue como
anticoagulante desde que se aislara y caracterizara el dicumarol 33rsquo-metilenbis(4-
hidroxicumarina) (Figura 13) Posteriormente aparece en el mercado su derivado
Introduccioacuten
5
sinteacutetico conocido como Warfarina que hasta la deacutecada pasada era considerado uno
de los faacutermacos anticoagulantes maacutes vendidos en Estados Unidos24 a-c
OOOO
OH HO
Figura 13 Estructura de la 33rsquo-metilenbis(4-hidroxicumarina) o dicumarol
Con posterioridad el uso de las cumarinas se ha diversificado hacia innumerables
blancos terapeacuteuticos En la literatura se describen variados estudios con respecto a sus
propiedades farmacoloacutegicas25ab
Su capacidad como agente antitumoral 26ab
se ha
estudiado en compuestos provenientes tanto de fuentes vegetales como sinteacuteticas
Riveiro ME y cols estudiaron el efecto de la 78-OH-4-metilcumarina en ceacutelulas
humanas afectadas por leucemia evidenciando el potencial que presentoacute este
derivado dihidroxilado27
En otra investigacioacuten realizada por C Ito y colaboradores
aislaron tres derivados cumariacutenicos de la especie vegetal Murraya siamensis cuyos
ensayos frente a ceacutelulas tumorales resultaron promisorios28
Con respecto a las propiedades antiinflamatorias de las cumarinas en la naturaleza se
encuentran especies como la Chamomilla recutita (manzanilla) que contiene un tipo
Introduccioacuten
6
de umbeliferona con tales propiedades En la literatura se encuentran derivados
sinteacuteticos desarrollados en cuya estructura estaacute presente el esqueleto cumariacutenico29
Lin y cols presentan los resultados de su estudio de la capacidad antiinflamatoria de
un conjunto de cumarinas los cuales fueron ademaacutes correlacionados con los
obtenidos para el apagamiento del radical hidroxilo30
HA El-Wahab y cols sintetizaron distintas tiazolo-cumarinas hiacutebridas y estudiaron
una de sus propiedades farmacoloacutegicas como agente antimicrobiano Estos
compuestos posteriormente fueron aplicados como aditivos en recubrimientos de
poliuretano confirieacutendoles tambieacuten esta propiedad microbicida a las superficies en
las que se utilizoacute31
Tambieacuten se han descrito derivados cumariacutenicos con propiedades anti-fuacutengicas 32ab
Un trabajo reciente presenta el estudio de complejos en base a Ni(II) Cu(II) y
Co(II)frente a distintas especies de hongos (Candida A niger Rhizopus)32c
Tambieacuten se han encontrado estructuras cumarina-glucoacutesidos provenientes de especies
vegetales (Hydrangea paniculata) que presentan propiedades hepatoprotectoras33
Otros estudios sentildealan tambieacuten la importancia de las estructuras cumariacutenicas como
compuesto antiviral analgeacutesico anti-tromboacutetico ulcerogeacutenico 25 34-36
inclusive con
potencial para ser usadas en terapias frente al VIH como lo sentildeala la investigacioacuten
sobre especies vegetales que contienen dipiranocumarin - calanolideos como
Introduccioacuten
7
principio activo25a
estudios que tambieacuten se han realizado con derivados de siacutentesis
disentildeados a partir de la estructura de origen vegetal (Lomatium suksdorfii) conocida
como suksdorfina (Figura 14) a partir de la cual se han generado compuestos
anaacutelogos con el objeto de estudiar su modo de accioacuten y obtener sustratos cada vez
maacutes potentes frente a la enfermedad (Yu D y cols 2003)37
O OO
O
O
OO
Figura 14 Estructura de la suksdorfina
B Propiedades antioxidantes
El equilibrio en los organismos vivos es funcioacuten de diversos factores entre ellos cabe
mencionar el balance de las especies que generan estreacutes oxidativo dentro del medio
celular estas especies pueden ser de origen endoacutegeno como las provenientes de la
cadena transportadora de electrones enzimas oxidantes ceacutelulas fagociacuteticas o de
origen exoacutegeno como sustancias reductoras oxidacioacuten de drogas tabaquismo
ultrasonido luz solar etc Entre los compuestos que generan estreacutes conocidos como
Introduccioacuten
8
EROs y ERNs (especies reactivas de oxiacutegenonitroacutegeno) se pueden mencionar el
anioacuten superoacutexido (O2˙-) peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2) radical peroxilo (ROObull) y
alcoxilo (RObull) radical hidroxilo (HObull) oacutexido niacutetrico (NObull) peroxinitrito (ONOObull)
entre otras
Dentro de este contexto en la literatura se ha descrito el potencial que poseen las
cumarinas y sus derivados como compuestos capaces de interaccionar con especies
reactivas de oxiacutegeno y nitroacutegeno lo que da cuenta de su capacidad antioxidante tema
relevante si se considera que parte importante de las patologiacuteas conocidas y
estudiadas en la actualidad a nivel mundial estaacuten iacutentimamente ligadas a cuadros de
estreacutes oxidativo presentes en el organismo 38 39
Payaacute y colaboradores presentaron un trabajo en el cual se estudia la reactividad de un
conjunto de dieciseacuteis cumarinas (naturales y sinteacuteticas) frente al radical hidroxilo
aacutecido hipocloroso y anioacuten superoacutexido encontrando que los derivados di-hidroxilados
poseiacutean mejores propiedades que aquellos mono-hidroxilados o sin sustitucioacuten40
Estos resultados se complementan con una publicacioacuten posterior del mismo grupo en
que se profundiza el estudio anterior sentildealando las propiedades terapeacuteuticas de los
derivados cumariacutenicos34
El derivado conocido como esculetina (67-dihidroxicumarina) fue ensayado frente al
radical DPPH junto con ensayos de estreacutes oxidativo en medios de cultivo celular
Introduccioacuten
9
estos autores sentildealan la importancia de los grupos catecol en su capacidad de atrapar
especies radicales (Kim y cols 2008)41
Otro estudio en el que se ensaya un extracto
vegetal (Cortex Fraxini) relaciona ademaacutes la capacidad antioxidante de las o-
dihidroxi cumarinas con su capacidad reductora42
Zhang y cols presentan un estudio reciente en el cual cumarinas dihidroxiladas en
posicioacuten 7 y 8 entre otros derivados poseen importante bio-actividad in vitro los
compuestos fueron ensayados frente a especies radicales en ceacutelulas tumorales
presentaron ademaacutes actividad como antiinflamatorios y baja toxicidad tanto en
ceacutelulas sanguiacuteneas de vertebrado como de invertebrado Junto con lo anterior se
realizoacute un anaacutelisis de estructura-reactividad correlacionando la capacidad de
apagamiento de radicales con las propiedades antiinflamatorias y antitumorales de los
derivados cumariacutenicos encontradas en esta investigacioacuten43
12 Compuestos polifenoacutelicos
121 Origen vegetal
Los polifenoles al igual que las cumarinas son una amplia familia de compuestos (se
han encontrado maacutes de 8000 de ellos) presentes en estructuras vegetales como
metabolitos secundarios cumpliendo roles tales como protector frente a radiacioacuten
UV reguladores de los ciclos de crecimiento pigmentacioacuten y defensa frente a
Introduccioacuten
10
depredadores Su estructura baacutesica es el anillo benceacutenico con sustituyentes hidroxilo
(-OH) en distintas posiciones Se clasifican en flavonoides aacutecidos fenoacutelicos
(hidroxicinaacutemicos e hidroxibenzoicos) taninos estilbenos Debido a sus interesantes
propiedades y bio-aplicaciones estos fitoquiacutemicos han sido objeto de diversos
estudios investigacioacuten y caracterizacioacuten44-46
Estos compuestos son un constituyente importante de la dieta diaria se encuentran en
forma abundante en diversos frutos como por ejemplo berries manzana mango uva
pera granada y ciacutetricos en bebidas como el vino teacute y cafeacute 47
en vegetales cereales
y semillas Junto con lo anterior se ha descrito la utilizacioacuten de aacutecidos polifenoacutelicos
provenientes de extractos vegetales y aceites esenciales como aditivos en la industria
alimentaria aplicados como preservantes naturales en reemplazo de aquellos de
origen sinteacutetico debido a las propiedades antimicrobianas que exhiben48
122 Actividad bioloacutegica
Estos compuestos se conocen tambieacuten como ldquobiofenolesrdquo (Romeo y Uccella 1996)
haciendo referencia a aquellos provenientes de fuentes naturales Las primeras
publicaciones sobre los polifenoles en general comenzaron en la deacutecada de 1950 con
la investigacioacuten de D Harman y su teoriacutea del envejecimiento y los radicales libres
estudios en los que se planteoacute prolongar la sobrevida en especies roedores enfermos a
traveacutes de la ingesta de biofenoles presentes en su dieta Es asiacute que el nuacutemero de
publicaciones concernientes al tema se incrementoacute de una treintena (entre 1900 y
Introduccioacuten
11
1950) hasta superar las 35000 publicaciones entre los antildeos 2000-2010 lo que da
cuenta del creciente intereacutes en este toacutepico49
La bio-actividad de los compuestos polifenoacutelicos es amplia se encuentran diversos
estudios como el citado anteriormente con respecto a las capacidades antimicrobianas
de los polifenoles y su uso en la industria alimentaria5051
Compuestos como la
curcumina resveratrol quercetina y derivados del aacutecido gaacutelico se enumeran dentro de
las investigaciones realizadas tanto in vitro e in vivo en la prevencioacuten del caacutencer
(Cimino y cols 2012)52
Otras propiedades descritas para estos compuestos son como cardio-protectores anti-
canceriacutegenos antiinflamatorios vaso-relajantes entre otras como lo resume el
artiacuteculo de Xia y cols (2010) En eacutel ademaacutes se presenta una revisioacuten en cuanto a los
meacutetodos de extraccioacuten purificacioacuten y caracterizacioacuten del contenido y tipos de
polifenoles especiacuteficamente en el caso de la uva fruto reconocido por su alto
contenido de fitoquiacutemicos y nutrientes53
123 Polifenoles como antioxidantes
Los polifenoles como micronutrientes presentes en los alimentos y otras estructuras
vegetales han sido un foco de intereacutes ya que sus aplicaciones terapeacuteuticas estaacuten
relacionadas con su reconocida e investigada capacidad antioxidante y quelante de
metales Con respecto a esta uacuteltima cabe mencionar la revisioacuten del estado del arte
Introduccioacuten
12
realizada por Kozlowski y cols con respecto al desbalance de Cu Zn y Fe en el
organismo en ella se indica que la presencia libre y en exceso de estos metales estaacute
directamente relacionada con patologiacuteas neurodegenerativas y caacutencer entre otras ya
que su actividad redox genera especies reactivas capaces de atacar sustratos orgaacutenicos
como la membrana lipiacutedica proteiacutenas y aacutecido desoxiribonucleico (ADN)54
Ribeiro y colaboradores presentan un estudio en el que se determina el contenido
polifenoacutelico de la especie Fistulina hepaacutetica Los extractos se ensayaron frente a
DPPH anioacuten superoacutexido radical hidroxilo y aacutecido hipocloroso Los autores plantean
que considerando los resultados obtenidos esta especie fuacutengica podriacutea tener
aplicacioacuten como suplemento o como antioxidante en la industria alimentaria55
Estudios realizados con aacutecido taacutenico comercial sentildealan que su capacidad como
antioxidante y como quelante de hierro da cuenta del potencial que tiene este aacutecido
ademaacutes como anti-mutageacutenico y anti-carcinogeacutenico Los autores indican posibilidad
de que este aacutecido el cual presenta baja toxicidad contribuye en el apagamiento de
especies reactivas de oxiacutegeno dantildeinas a nivel de ADN (Andrade y cols 2006)56
trabajo que se complementa con una publicacioacuten anterior del mismo grupo donde se
estudioacute el apagamiento del radical OHbull mediante complejos de aacutecido taacutenico-Cu
(Andrade y cols 2005)57
Los aacutecidos hidroxicinaacutemicos e hidroxibenzoicos han sido tambieacuten objeto de estudio
debido a su capacidad antioxidante58-61
Jeong y colaboradores estudiaron el extracto
de la especie vegetal Erigeron annuus el cual contiene aacutecido cafeico en su fraccioacuten
Introduccioacuten
13
butanoacutelica este extracto fue ensayado como agente neuro-protector y antioxidante en
ceacutelulas nerviosas Frente a los resultados obtenidos los autores concluyen que este
extracto podriacutea ser utilizado en terapias frente a patologiacuteas neurodegenerativas como
el Alzheimer62
Otro estudio de capacidad antioxidante realizado a un grupo de
compuestos polifenoacutelicos presentes en el propoacuteleo (aacutecido cafeico aacutecido feruacutelico
ferulato de etilo eacutester fenetiacutelico del aacutecido cafeico) sentildeala que los grupos catecol
presentes en las estructuras ensayadas incrementan la capacidad antioxidante
mientras que en estudios relacionados con bio-membranas se debe tener en cuenta
ademaacutes la hidrofobicidad que presenten los compuestos63
13 Compuestos hiacutebridos
Al considerar que las diversas enfermedades que afectan al ser humano (caacutencer
diabetes enfermedades neurodegenerativas artritis entre otras) involucran diferentes
factores patogeacutenicos se han desarrollado estrategias sinteacuteticas que permiten obtener
nuevos faacutermacos de naturaleza hiacutebrida los cuales incorporan en su estructura
distintos ingredientes activos64
Este disentildeo ldquomulti-blancordquo ha permitido que los
nuevos faacutermacos actuacuteen en distintos blancos terapeacuteuticos este tipo de terapias
implica una disminucioacuten en los problemas asociados a una multi-dosificacioacuten las
interacciones entre distintos medicamentos una disminucioacuten en la resistencia a los
faacutermacos (en el caso de enfermedades de origen microbiano) disminucioacuten en los
efectos adversos derivados de la dosificacioacuten muacuteltiple por mencionar algunos
Introduccioacuten
14
Diversas investigaciones sobre el tema dan cuenta de la relevancia que ha tenido esta
estrategia y el disentildeo racional de nuevos medicamentos65-68
La revisioacuten realizada por
los autores Mehta y Singh (2002) menciona algunos de los esqueletos que han dado
origen a estructuras hiacutebridas entre ellas esteroides antraciclinas β-lactamas
fullerenos carbohidratos-peacuteptidos En esta revisioacuten se indica el uso de este tipo de
compuestos en terapias contra el caacutencer y como neuro-protectores69
En el caso de la malaria una de las enfermedades infecciosas maacutes complejas a nivel
mundial la resistencia del paraacutesito del geacutenero Plasmodium frente a los faacutermacos
empleados (cloroquina principalmente) ha sido un tema de estudio durante antildeos Una
resentildea de este desafiacuteo se presenta en el artiacuteculo de Kouznetsov y Goacutemez-Barrio
(2009) en el que se sentildeala la siacutentesis de derivados de aminoquinolina como las
trioxaquinas70
las cuales se presentan posteriormente en una revisioacuten realizada por
Chauhan y colaboradores en ella se destaca a estos hiacutebridos como candidatos
promisorios para la formulacioacuten de nuevas drogas antimalaacutericas71
Otra patologiacutea en la que se ha utilizado faacutermacos de naturaleza hiacutebrida que en
algunos casos provienen de productos naturales es el caacutencer72
Allen y
colaboradores73
mencionan en una reciente revisioacuten de tecnologiacuteas avanzadas en las
que ademaacutes de utilizar la estrategia de compuestos hiacutebridos con dos estructuras de
propiedades anticanceriacutegenas eacutestos se combinan con nano-estructuras orientadas a
Introduccioacuten
15
blancos especiacuteficos para asiacute disminuir el riesgo de efectos colaterales en el
tratamiento de esta compleja patologiacutea
Este concepto y disentildeo de faacutermacos multi-blanco se ha aplicado ademaacutes en distintas
terapias frente a enfermedades como el Alzheimer74
en vacunas de amplio espectro
frente al coacutelera75
en la siacutentesis de compuestos antiparasitarios76
y de dihidropiridinas
las cuales poseen actividad vasodilatadora77
por mencionar algunos ejemplos
131 Cumarinas como estructuras hiacutebridas
Al considerar el estado del arte con respecto a la amplia y variada actividad bioloacutegica
que presentan los derivados cumariacutenicos se encuentra que otra de las aplicaciones que
se ha estudiado para esta familia de compuestos es su capacidad para formar parte de
estructuras hiacutebridas complejas compuestos orientados a la obtencioacuten faacutermacos multi-
blanco que den respuesta a los interrogantes y desafiacuteos actuales con respecto a
importantes patologiacuteas y sus terapias 78
En la literatura se describen ejemplos de estructuras cumariacutenicas hiacutebridas no soacutelo de
origen sinteacutetico sino que tambieacuten se pueden extraer desde su fuente natural Un
estudio realizado en hojas y ramas de la especie Gnidia socotrana (originaria de
Yemen) da cuenta de la presencia de estructuras flavona-cumarina las que fueron
extraiacutedas purificadas y caracterizadas79
(Figura 15)
Introduccioacuten
16
O
OH
HO O
OH
O
O
OH
Figura 15 Estructura del hiacutebrido cumarina-flavona aislado de su fuente vegetal
Gnidia socotrana
Entre los compuestos antibioacuteticos de origen natural que poseen el esqueleto
cumariacutenico en su estructura se encuentran la novobiocina (Figura 16) clorobiocina y
cumermicina Presentes como metabolitos secundarios en la especie Streptomyces
estos derivados deben su actividad antibioacutetica a que actuacutean inhibiendo la enzima
ADN girasa presente en bacterias impidiendo su replicacioacuten y ademaacutes genera su
muerte celular80
O
HN
OH
O
OH
O
O
MeOO
H2N
HO
Figura 16 Estructura del antibioacutetico hiacutebrido novobiocina metabolitos secundarios
en la especie Streptomyces
Introduccioacuten
17
Se ha descrito tambieacuten la capacidad antitumoral de derivados cumarina-resveratrol a
partir del precursor 7-hidroxicumarina En la publicacioacuten de Belluti y colaboradores
se presentan los ensayos realizados para 10 compuestos los cuales tuvieron como
objeto ceacutelulas tumorales de pulmoacuten humano dos de los hiacutebridos presentaron
resultados promisorios como antitumorales y pro-apoptoacuteticos comportamiento que
los autores concluyen tiene relacioacuten con la posicioacuten de los sustituyentes en la
moleacutecula81
La revisioacuten bibliograacutefica de Longhin y colaboradores describe diversas estructuras
hiacutebridas desarrolladas que cuentan con capacidad antiinflamatoria toacutepico de intereacutes si
se considera que los cuadros inflamatorios estaacuten relacionados a dolencias como el
Alzheimer asma arterioesclerosis artritis reumatoide caacutencer etc En este trabajo se
sentildeala al hiacutebrido cumarina-aacutecido lipoico donde ambas estructuras poseen ademaacutes
reconocida capacidad antioxidante y el aacutecido unido a la cumarina en posicioacuten 3
mediante un espaciador es la estructura que se describe con una actividad superior al
conocido y utilizado faacutermaco indometacina82
Junto con los estudios descritos otra importante aacuterea de investigacioacuten ha sido el
desarrollo de estructuras hiacutebridas con capacidad antioxidante (Koufaki 2006)83
actividad que permite en muchos casos restablecer el equilibrio en organismos vivos
frente al exceso de especies generadoras de estreacutes oxidativo cuadro que como ya se
Introduccioacuten
18
mencionoacute estaacute con frecuencia asociado las patologiacuteas conocidas y estudiadas en la
actualidad
El reciente estudio desarrollado por Matos Olea-Azar y colaboradores presenta la
estructura cumarina-resveratrol y diferentes derivados sinteacuteticos los cuales fueron
estudiados mediante diversas teacutecnicas in vitro como resonancia de espiacuten electroacutenico
(REE) capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno (ORAC-FL) y
voltametriacutea ciacuteclica (VC) En esta investigacioacuten se encontroacute que los compuestos
propuestos poseen una buena capacidad antioxidante84
Una investigacioacuten que da cuenta del potencial que posee esta estrategia es la
desarrollada por Kenchappa y colaboradores quienes sintetizaron derivados
cumariacutenicos unidos a pirazol e indenona posteriormente mediante estudios in vitro e
in vivo obtuvieron resultados de su capacidad antioxidante y ademaacutes como agentes
anti-hipergliceacutemicos en un modelo animal proyectaacutendolos como posibles faacutermacos
frente a la diabetes85
Dentro del mismo esquema Krishan y colaboradores
desarrollaron una serie de cumarinas unidas al benzoimidazol el cual es a su vez una
estructura con muacuteltiple y reconocida actividad bioloacutegica proponen a dos compuestos
de la serie como derivados con una buena capacidad antioxidante y anti-inflamatoria
a nivel de mucosa gaacutestrica86
Introduccioacuten
19
Un tipo de derivado hiacutebrido que ha sido estudiado es la cumarina-chalcona El trabajo
realizado por Xi y Liu presenta la siacutentesis de una serie de compuestos (Figura 17)
los que posteriormente son ensayados por distintas metodologiacuteas de determinacioacuten de
capacidad antioxidante concluyendo que estos hiacutebridos son estructuras promisorias
en los que el grupo catecol presente en el esqueleto cumariacutenico o en la chalcona es
capaz de inhibir distintos procesos oxidativos a nivel de ADN87
O O
OH
O
R1
R2
R3
Figura 17 Hiacutebridos chalcona-cumarina con capacidad antioxidante
Peacuterez-Cruz y colaboradores describen el disentildeo siacutentesis y estudio de la capacidad
antioxidante de derivados cumarina-chalcona los que presentaron buena reactividad
frente a distintas especies radicales y capacidad cito-protectora en un modelo celular
animal88
En los estudios mencionados se evidencia el continuo desarrollo que ha tenido el
disentildeo y siacutentesis de compuestos hiacutebridos como nuevos faacutermacos frente a complejas
Introduccioacuten
20
enfermedades multifactoriales Esta tendencia vigente en la actualidad se extiende a
los maacutes variados nuacutecleos estructurales entre ellos la cumarina Este heterociclo
clasificado por algunos autores como ldquoestructura privilegiadardquo debido a la amplia
gama de compuestos que se originan a partir de eacutel es el punto de partida para
diversas propuestas sinteacuteticas enfocadas a generar un producto que posea muacuteltiples
actividades bioloacutegicas de intereacutes terapeacuteutico
Hipoacutetesis y objetivos
21
2 Hipoacutetesis
Los compuestos hidroxicumariacutenicos exhiben conocidas e interesantes propiedades
antioxidantes
Al sustituir la cumarina con los compuestos aacutecido cafeico aacutecido gaacutelico y aacutecido
protocateacutequico se obtienen derivados de naturaleza hiacutebrida aumentando la actividad
de la cumarina frente a las especies reactivas de oxiacutegeno anioacuten superoacutexido radical
hidroxilo radical peroxilo y su capacidad reductora
3 Objetivos
31 Objetivos generales
- Evaluar el comportamiento electroquiacutemico oxidativo de los derivados
cumariacutenicos previamente sintetizados y caracterizados fiacutesicamente
- Evaluar la capacidad antioxidante de los nuevos compuestos derivados de
cumarina y aacutecidos benzoicos frente a distintas especies radicales mediante
diversas teacutecnicas in vitro
Hipoacutetesis y objetivos
22
32 Objetivos especiacuteficos
Objetivos en siacutentesis
- Sintetizar y caracterizar el compuesto precursor 4-clorometil-78-
dihidroxicumarina y los correspondientes derivados de la sustitucioacuten en posicioacuten-
4 con aacutecido cafeico aacutecido gaacutelico y aacutecido 34-dihidroxibenzoico
Objetivos en electroquiacutemica
- Realizar la caracterizacioacuten anoacutedica en medio aproacutetico (NN-dimetilformamida
DMF) de los compuestos por voltametriacutea ciacuteclica (VC) voltametriacutea de pulso
diferencial (VPD)
Objetivos en la determinacioacuten de capacidad antioxidante
- Estudiar la reactividad de los compuestos frente al anioacuten radical superoacutexido O2-
utilizando como teacutecnica voltametriacutea ciacuteclica
- Determinar la reactividad de los compuestos frente al radical peroxilo (ROObull)
obteniendo su iacutendice ORAC-FL
- Determinar la capacidad reductora de hierro (Fe3+
) de los compuestos a traveacutes de
la teacutecnica FRAP
- Estudiar la reactividad frente al radical OHbull mediante la teacutecnica spin trapping
utilizando espectroscopiacutea de resonancia de espin electroacutenica (REE)
Hipoacutetesis y objetivos
23
- Evaluar la capacidad antioxidante celular de los compuestos
- Establecer la existencia de correlacioacuten entre paraacutemetros fisicoquiacutemicos de los
compuestos y su actividad antioxidante
Materiales y meacutetodos
24
4 Materiales y meacutetodos
41 Materiales
411 Reactivos y equipamiento utilizado en siacutentesis
Reactivos
- Aacutecido 34-dihidroxicinaacutemico Merck
- Aacutecido 34- dihidroxibenzoico Sigma-Aldrich
- Aacutecido 345-trihidroxibenzoico Sigma-Aldrich
- Pirogalol Merck
- 4-cloro acetoacetato de etilo Sigma-Aldrich
- NN-dimetilformamida PA J T Baker
- 18-diazabiciclo[540]undec-7-ano (DBU) Sigma-Aldrich
- Carbonato aacutecido de sodio Merck
- Metanol PA JT Baker
- Acetona PA Merck
- Etanol PA Merck
- Cloroformo PA Merck
- Aacutecido sulfuacuterico 98 Merck
- Aacutecido clorhiacutedrico 37 JTBaker
- Anhiacutedrido aceacutetico Merck
- Hidroacutexido de sodio PA Merck
- Solucioacuten etanoacutelica de FeCl3
Materiales y meacutetodos
25
- Acetona d6 Sigma-Aldrich
- Dimetilsulfoacutexido d6 Sigma-Aldrich
- Cloroformo d6 Sigma-Aldrich
- Nitroacutegeno extra puro 99995 Linde Gas Chile SA
Equipamiento
Todo el material de vidrio utilizado fue clase A
- Balanza analiacutetica Precisa 125 A
- Rotavapor Heidolph VV 2000
- Sonicador Elme Transsonic Digital tipo T480H-2
- Agitador magneacutetico placa calefactora Heidolph MR 3002
- Estufa de secado al vaciacuteo Heraeus
412 Reactivos y equipamiento utilizados en electroquiacutemica
Reactivos
- NN-dimetilformamida (DMF) PA Merck
- Hexafluorofosfato de tetrabutil amonio (HFFTBA) Sigma-Aldrich
- Aacutecido 34-dihidroxicinaacutemico Merck
- Aacutecido 34- dihidroxibenzoico Sigma-Aldrich
- Aacutecido 345-trihidroxibenzoico Sigma-Aldrich
- Nitroacutegeno extra puro 99995 Linde Gas Chile SA
Materiales y meacutetodos
26
- Agua purificada (MilliQ) Millipore Merck
Equipamiento
- Estacioacuten de trabajo electroquiacutemica CH Instruments CHI 760c
- Electrodo de carbono viacutetreo CH Instruments d = 3 mm
- Alambre de platino
- Electrodo de referencia AgAgCl (KCl 3 M) CH Instruments
- Aluacutemina 03 μM y 005 μM Buheler
- Balanza analiacutetica Precisa 40SM-200ordf
413 Reactivos y equipamiento utilizados en ensayos frente a especies
radicalarias
Reactivos
- 2-(6-oacutexido-3-oxo-3H-xanten-9-il)benzoato disoacutedico (fluoresceiacutena sal
disoacutedica) Sigma-Aldrich
- 22-azo-bis(2-amidinopropan)diclorhidrato (ABAP) Sigma-Aldrich
- 246-tris(2-piridil)-s-triazina (TPTZ) Sigma Aldrich
- 6-hidroxi-2578-tetrametilcroman-2-aacutecido carboxiacutelico (Trolox) Sigma-
Aldrich
- Peroacutexido de hidroacutegeno al 30
- NN-dimetilformamida PA Sigma-Aldrich
- 55-dimetil-1-pirroline-N-oacutexido (DMPO)
- Acetato de sodio Merck
Materiales y meacutetodos
27
- Tricloruro de hierro (FeCl3) Sigma Aldrich
- Hidroacutexido de sodio Merck
- Fosfato diaacutecido de potasio Merck
- Etanol grado HPLC Merck
- Aacutecido aceacutetico glacial Merck
- N-octanol Merck
- Cloruro de zinc Merck
Equipamiento
- Balanza Precisa 40SM-200ordf
- Lector de microplacas con detector muacuteltiple Synergytrade HT Bio-Tek
Instruments Inc (Winooski VT USA)
- Espectroacutemetro ECS 106 de banda X (985 GHz) equipado con cavidad
rectangular y 50 KHz de modulacioacuten de campo (Bruker Coventry UK)
- WINSIM Software EPR Spectral Simulation for MS-Windows 9x NT
Version 098 copy PEST Public EPR Simulation Tools NIEHS USA
- Alambre de platino
- Espectrofotoacutemetro UV-Visible Specord S600 Analytik Jena
- Equipo generacioacuten agua ultrapura NanoPure Barnstead
Materiales y meacutetodos
28
42 Meacutetodo
421 Procedimientos de siacutentesis
En un primer paso se obtuvo el precursor 4-clorometil-78-dihidroxicumarina
mediante la siacutentesis de Pechmann posteriormente se realizoacute la esterificacioacuten entre el
compuesto halogenado y diferentes aacutecidos orgaacutenicos comerciales (Figura 41) Los
aacutecidos comerciales utilizados en el proceso de siacutentesis fueron los siguientes
aacutecido 34-dixidroxicinaacutemico aacutecido 345- trihidroxibenzoico
(aacutecido cafeico) (aacutecido gaacutelico)
O
OH
OH
HO
aacutecido 34-dihidroxibenzoico
(aacutecido protocateacutequico)
Figura 41 Aacutecidos empleados en la sustitucioacuten de la 4-clorometil-78-
dihidroxicumarina
OH
OH
O
HO
O
OH
OH
HO
OH
Materiales y meacutetodos
29
Todos los compuestos fueron previamente acetilados para proteger los grupos
hidroxilo presentes en sus estructuras para evitar reacciones entre siacute
A Siacutentesis de la 4-clorometil-78-dihidroxicumarina 1
Se mezclaron en proporciones equimolares el pirogalol (31 mmoles) junto con el 4-
cloroacetoacetato de etilo con agitacioacuten constante en un bantildeo de agua-hielo sobre la
mezcla se antildeadieron lentamente 25 mL de H2SO4 (tambieacuten friacuteo) esta solucioacuten se
tornoacute de color rojizo oscuro Se dejoacute reaccionar 1 h
La mezcla de reaccioacuten se agregoacute lentamente sobre un bantildeo de agua-hielo-etanol con
vigorosa agitacioacuten y se obtuvo el producto como un precipitado fino que fue lavado
con abundante agua (a fin de eliminar restos aacutecidos) y purificado por re-cristalizacioacuten
en una mezcla etanol agua obtenieacutendose un soacutelido marfil brillante 1 La ruta
sinteacutetica se presenta a continuacioacuten
Figura 42 Siacutentesis del derivado clorado 1
O
OH
OH O
Cl
HO
OH
OH
OEt
Cl
O O
+
H2SO4
1 h
1
Materiales y meacutetodos
30
B Procedimientos de acetilacioacuten
a) Acetilacioacuten de 4-clorometil-78-dihidroxi-cumarina 2
Se suspendioacute la cumarina clorada (3 g) en 6 mL anhiacutedrido aceacutetico y se antildeadioacute 1 gota
de aacutecido sulfuacuterico La solucioacuten fue agitada con calentamiento (45 degC) por 30 min y se
observoacute el progreso de la reaccioacuten mediante el test de FeCl3 el que indica la presencia
o ausencia de grupos ndashOH fenoacutelicos en solucioacuten El precipitado obtenido 5 se
recristalizoacute en etanol su ruta sinteacutetica se muestra en la Figura 43
Figura 43 Siacutentesis del derivado clorado acetilado 5
b) Acetilacioacuten del aacutecido 34-dihidroxicinaacutemico 6
Seguacuten lo descrito en la literatura89
se disolvioacute el aacutecido 34-dihidroxicinaacutemico (aacutecido
cafeico) en solucioacuten 1 M de NaOH sobre un bantildeo de hielo se agregoacute anhiacutedrido
O
OH
HO O
Cl
Ac2O H2SO4
45 degC 30 min
O
O
O O
Cl
5
O
O
Materiales y meacutetodos
31
aceacutetico y de inmediato se aprecioacute la aparicioacuten de un precipitado amarillo claro que
con el paso del tiempo se tornoacute de color marfil Se dejoacute en estas condiciones con
agitacioacuten vigorosa por 30 min El producto 6 fue filtrado y lavado prolijamente con
agua posteriormente se recristalizoacute en etanol obtenieacutendose un soacutelido blanco brillante
La reaccioacuten global se presenta en la Figura 44
HO
HO
OH
O
O
O O
NaOH 30 min
AcO
AcO
OH
O
6
Figura 44 Siacutentesis del aacutecido cafeico acetilado 6
c) Acetilacioacuten del aacutecido gaacutelico7
Se mezclaron 3 g de aacutecido con 7 mL de anhiacutedrido aceacutetico se antildeadioacute 1 gota de H2SO4
Se agitoacute durante 30 min a 47 degC Posteriormente la mezcla fue enfriada y filtrada al
vaciacuteo El producto 7 soacutelido de color blanco se recristalizoacute en etanol La reaccioacuten
global se presenta en la Figura 45
Materiales y meacutetodos
32
O
HO
HO
OH
OHO
O O
H2SO4 30 min
O
AcO
AcO
OAc
OH
7
Figura 45 Siacutentesis del aacutecido gaacutelico acetilado 7
d) Acetilacioacuten del aacutecido 34-dihidroxibenzoico 8
Se mezclaron 3 g de aacutecido con 6 mL de anhiacutedrido aceacutetico se antildeadioacute 1 gota de H2SO4
Se agitoacute por 30 min a 50 degC Luego se enfrioacute y filtroacute al vaciacuteo El producto 8 soacutelido de
color blanco fue recristalizado en etanol la reaccioacuten global se muestra en la Figura
46
O
OH
OH
OHO
O O
H2SO4 30 min
O
OAc
OAc
OH
8
Figura 46 Siacutentesis del aacutecido 34-dihidroxibenzoico acetilado 8
Materiales y meacutetodos
33
C Siacutentesis de los derivados hiacutebridos Procedimiento general
En base a una variante del procedimiento descrito (Ono y colaboradores 1978)90
los
derivados hiacutebridos se obtuvieron mediante la esterificacioacuten de la cumarina acetilada
5 y el correspondiente aacutecido tambieacuten previamente acetilado (6 7 8) Se disolvioacute el
aacutecido (32 mmoles) en 10 mL de DMF (seca recieacuten destilada) a temperatura ambiente
y se agregoacute el DBU en proporcioacuten equimolar se dejoacute reaccionar por 30 min en un
matraz provisto de codo de desecacioacuten (relleno con CaCl2) y agitacioacuten constante Se
agregoacute la cumarina (32 mmoles) y se aprecioacute el fin de la reaccioacuten tras 35 h a 50 degC
de temperatura La solucioacuten se llevoacute a tdeg ambiente y se hizo precipitar
cuidadosamente agregando agua destilada el soacutelido (9 10 y 11) fue lavado
prolijamente se filtroacute y secoacute
La Figura 47 muestra como ejemplo la ruta sinteacutetica llevada a cabo en la obtencioacuten
del derivado de aacutecido cafeico
Figura47 Siacutentesis del intermediario hiacutebrido derivado del aacutecido cafeico
O
OAc
OAc O
Cl
OAc
OAc
HO
O
+ DBU
DMF seco
O
OAc
OAc O
OAc
OAc
O
O
Materiales y meacutetodos
34
Posteriormente se procedioacute a desproteger los grupos fenoacutelicos en el soacutelido mediante
el procedimiento de desacetilacioacuten El producto crudo fue suspendido en una mezcla
de metanol (8 mL) acetona (12 mL) y solucioacuten saturada de NaHCO3 (14 mL) se
agitoacute a temperatura ambiente bajo nitroacutegeno por 3 h
Finalizada la reaccioacuten la suspensioacuten se concentroacute al vaciacuteo se antildeadioacute HCl en friacuteo
formaacutendose un precipitado claro que se filtroacute y lavoacute con abundante agua
posteriormente fue secado cuidadosamente El soacutelido se lavoacute prolijamente con CHCl3
a ebullicioacuten y fue secado al vaciacuteo de esta forma se obtuvo el producto hiacutebrido La
Figura 48 muestra la ruta de desproteccioacuten empleada
Figura48 Siacutentesis del compuesto hiacutebrido final 9
O
OAc
AcO O
OAc
OAc
O
O N2 tdeg amb
O
OH
HO O
OH
OH
O
O
9
hidroacutelisis baacutesica
Materiales y meacutetodos
35
En la Figura 49 se presenta un resumen de la ruta sinteacutetica para las cumarinas
hiacutebridas obtenidas
HO
O
OH
OH4
OH
OH
HO
O
OH
3
OH
OH
HO
O
2
O
OH
HO O
Cl1
ii
HO
O
OAc
OAc8
OAc
OAc
HO
O
OAc
7
OAc
OAc
HO
O
6
O
OAc
AcO O
Cl5
Figura 49A Ruta de siacutentesis de los compuestos cumariacutenicos i) H2SO4 1 h bantildeo de
hielo ii) NaOH Ac2O 30 min bantildeo de hielo (aacutecido cafeico 6) H2SO4 Ac2O
30 min (cumarina y aacutecidos benzoicos)
O
OH
HO O
Cl
HO
OH
OH
OEtCl
O O
+
1
i
Materiales y meacutetodos
36
HO
OOAc
OAc
OAc
OAc
HO
O
OAc
7
OAc
OAc
HO
O
6
OOH
HO O
OH
OH
O
O
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
9
10
11
OOAc
AcO O
Cl5
iiiiv
8
Figura 49B Ruta de siacutentesis de los compuestos cumariacutenicos iii) DBU DMF (seca)
35 h 50 degC iv) NaHCO3 MeOH acetona tdeg amb 3 h N2
Materiales y meacutetodos
37
422 Procedimiento experimental en electroquiacutemica
i) Celda electroquiacutemica
La celda de trabajo estuvo compuesta por tres electrodos el de trabajo de carbono
viacutetreo y superficie 0076 cm2 electrodo de referencia AgAgCl (3 M KCl) inmerso en
puente salino (DMF + HFFTBA 02 M) y alambre de platino como contra-electrodo
ii) Condiciones de trabajo
Los experimentos se realizaron utilizando como solvente aproacutetico NN-
dimetilformamida (previamente destilada y guardada con tamiz molecular 3 Aring) las
soluciones de trabajo en una concentracioacuten de 2 mM para todos los compuestos
continuamente fueron purgadas con nitroacutegeno extra puro el electrolito soporte
utilizado fue HFFTBA (hexafluorofosfato de tetrabutil amonio) en una concentracioacuten
dos oacuterdenes de magnitud superior a la de la muestra
iii) Teacutecnicas empleadas
En el desarrollo de este trabajo se utilizoacute voltamperometriacutea ciacuteclica (VC) y
voltamperometriacutea de pulso diferencial (VPD)
Materiales y meacutetodos
38
iv) Caacutelculos
El proceso de deconvolucioacuten de las graacuteficas en VC se llevoacute a cabo utilizando el
software Origin Pro 8 SR2 (Origin Lab Corporation USA) Se aplicoacute la funcioacuten
Gaussiana (Ecuacioacuten 41)
119910 = 1199100 + 119860
119908 radic120587 119890
minus2(119909minus119909119888)2
1199082 Ecuacioacuten 41
423 Estudio de generacioacuten de especies radicalarias mediante espectroscopiacutea de
resonancia de espiacuten electroacutenico
La oxidacioacuten electroquiacutemica de los compuestos se realizoacute utilizando las
mismas condiciones de potencial de voltametriacutea ciacuteclica una celda compuesta de
electrodo de trabajo de alambre de platino el medio empleado fue DMF + HFFTBA
como contra-electrodo se utilizoacute alambre de platino La estabilizacioacuten del radical
generado en la oxidacioacuten electroquiacutemica se logroacute empleando el catioacuten quelante Zn2+
el cual es silente a la teacutecnica espectroscoacutepica y forma complejos con el grupo catecol
Se utilizoacute ZnCl2 en concentracioacuten final 3 mM
Materiales y meacutetodos
39
424 Procedimiento experimental en el estudio de actividad frente a especies
radicalarias
4241 Metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno
(oxygen radical antioxidant capacity-fluorescein ORAC-FL)
Se prepararon soluciones stock en etanol para cada compuesto de ellas se obtuvieron
las soluciones de trabajo diluidas en solucioacuten buffer fosfato (pH 74) Se antildeadieron
las aliacutecuotas respectivas de concentraciones crecientes de cada compuesto en los
pocillos de la placa (concentraciones finales entre 02 microM y 109 microM que permitieron
obtener curvas de decaimiento apropiadamente separadas) posteriormente se
adicionoacute la sonda fluoresceiacutena (Figura 410 A) (solucioacuten preparada en buffer pH 74 y
concentracioacuten final 40 nM) y se pre-incuboacute 15 min a 37 degC Finalmente se adicionoacute la
aliacutecuota correspondiente de solucioacuten de 22prime-azobis(2-metiilpropionamidina)
dihidrochloridrato (ABAP) la solucioacuten fue preparada en buffer pH 74 y
concentracioacuten final 18 mM (Figura 410 B) y se llegoacute a un volumen final de 200 microL
La placa fue introducida en el lector y se midioacute el decaimiento de la sonda
fluorescente cada 1 min con agitacioacuten previa a cada medicioacuten Para cada set de
medidas fue determinado el blanco correspondiente que contiene la sonda
fluorescente y el generador de radicales peroxilo (ROObull) Se empleoacute el compuesto
Trolox como antioxidante estaacutendar de referencia (Figura 410 C) utilizaacutendose un set
Materiales y meacutetodos
40
de concentraciones entre los 3 microM y 20 microM y el procedimiento anteriormente descrito
para determinar el decaimiento de la fluorescencia de la sonda
La capacidad de inhibicioacuten expresada como valor de iacutendice ORAC se cuantificoacute
utilizando el valor integrado de aacuterea bajo la curva (ABC) de fluorescencia (Figura
411 donde F0 es el valor medido a tiempo 0 y F es el valor de fluorescencia al final
de la medicioacuten cuando se aprecioacute que el decaimiento es total) La ABC neta se obtuvo
de restar el valor del blanco al valor de cada compuesto (ver Ecuacioacuten 42)
ABC neta = ABC compuesto ndash ABC blanco Ecuacioacuten 42
ONaO O
ONa
O
A
O
HO
OH
O
C
Figura 410 A Sonda fluoresceiacutena B 22prime-azobis(2-metilpropionamidina)
dihidrochloridrato (ABAP) C 6-hidroxi-2578-tetrametilcroman-2-aacutecido carboxiacutelico
(Trolox)
-Cl H2N+
NH2
N
N+NH2 Cl-
NH2
B
Materiales y Meacutetodos
41
Figura 411 Actividad antioxidante ORAC-FL para un compuesto en estudio
Finalmente este valor de ABC neta para cada concentracioacuten se graficoacute con respecto a la
concentracioacuten obtenieacutendose una relacioacuten lineal en el rango de estudio La pendiente de
la regresioacuten de cada compuesto fue dividida por el valor de la pendiente del estaacutendar
Trolox (obtenido de la mima forma descrita para las muestras) este coeficiente es el
mencionado Iacutendice ORAC
Los datos fueron procesados mediante el software Origin Pro 8 SR2 (Origin Lab
Corporation USA) Las mediciones se realizaron en triplicado
0 1000 2000 3000 400000
02
04
06
08
10
ABCneta
Antioxidante
Blanco
F
F0
Tiempo s
Materiales y Meacutetodos
42
4242 Metodologiacutea de determinacioacuten de poder antioxidante de reduccioacuten de hierro
(FRAP)
Preparacioacuten de soluciones
i) Preparacioacuten solucioacuten tampoacuten acetato
Se disolvieron 155 g de acetato de sodio trihidrato (CH3COONamiddot3H2O) en agua
ultrapura se agregaron 8 mL de CH3COOH glacial con agitacioacuten constante y se aforoacute
a 500 mL El pH fue ajustado a 36 con NaOH concentrado
ii) Preparacioacuten de solucioacuten tampoacuten fosfato pH 74
Se mezclaron 80 mL de solucioacuten 01 M de NaOH con 100 mL de solucioacuten 01 M de
KH2PO4 se agitoacute para homogeneizar
iii) Preparacioacuten solucioacuten HCl 40 mM
En un matraz aforado (50 mL) se mezclaron 167 microL de HCl 12 M (37) con agua
ultrapura y se agitoacute hasta homogeneizar
iv) Preparacioacuten de solucioacuten TPTZ
Se pesaron 797 mg de reactivo TPTZ (Figura 412) y se aforoacute a 25 mL con solucioacuten
HCl 40 mM se agitoacute y conservoacute protegido de la luz
Materiales y Meacutetodos
43
N
N
N
N
NN
Figura 412 Reactivo 246-tris(2-piridil)-s-triazina (TPTZ)
v) Preparacioacuten solucioacuten de FeCl3 (20 mM)
Se pesaron 0054 g de FeCl3middot6H2O se aforoacute a 10 mL con agua ultrapura y se agitoacute
constantemente
vi) Preparacioacuten del reactivo FRAP
Se mezcloacute el tampoacuten acetato con solucioacuten TPTZ y solucioacuten feacuterrica en proporcioacuten
1011 se agitoacute y conservoacute al abrigo de la luz
vii) Preparacioacuten de soluciones en estudio
Se mezclaron aliacutecuotas de solucioacuten stock (en etanol) de cada compuesto con tampoacuten
fosfato luego se agitaron y se obtuvieron soluciones en concentraciones entre 15 microM y
58 microM
Materiales y Meacutetodos
44
Ensayo de capacidad reductora
En un frasco aacutembar se mezclaron 150 microL de solucioacuten de muestra con 450 microL de agua
ultrapura y posteriormente 950 microL de reactivo FRAP La solucioacuten se agitoacute e
inmediatamente se tornoacute de color azul lo que indicoacute la reaccioacuten de oxidacioacuten de Fe2+
a Fe3+
en el complejo formado con el reactivo TPTZ Se midioacute el espectro de
absorbancia en el rango del UV-visible a temperatura ambiente considerando el valor
de λmaacutex = 599 nm Los experimentos se realizaron en triplicado los valores obtenidos
para este ensayo se expresan como equivalentes de Trolox 10 microM de muestra
4243 Capacidad de apagamiento del radical hidroxilo (OHbull) mediante la teacutecnica
spin trap
Se realizoacute el ensayo mediante la metodologiacutea de Fenton no cataliacutetico comparando las
sentildeales en el espectro mediante espectroscopia de resonancia de espiacuten electroacutenico
(REE) del aducto DMPO-OH como blanco frente a las sentildeales obtenidas en las
mismas condiciones tras antildeadir los compuestos en estudio Para la generacioacuten del
radical hidroxilo se utilizoacute peroacutexido de hidroacutegeno (H2O2) y solucioacuten acuosa de NaOH
metodologiacutea que presenta la ventaja de que en ausencia de iones Fe2+
(como en la
metodologiacutea Fenton) se evitoacute la reaccioacuten de quelacioacuten con los grupos catecol presentes
en las estructuras propuestas91ab
Materiales y Meacutetodos
45
-10 -08 -06 -04
Ipa0
O2 + e
- O
2
-
O2
-O
2 + e
-
10 A
E vs Ag|AgCl V
Se prepararon soluciones stock (20 mM en DMF) de cada compuesto en estudio se
tomaron aliacutecuotas de 100 microL y se agregaron 50 microL de NaOH (25 mM) 50 microL de
solucioacuten de 55-dimetil-1-pirroline-N-oacutexido (DMPO) (30 mM) y finalmente 50 microL de
agua oxigenada (30) se agitoacute cuidadosamente se incuboacute por 5 minutos y se midioacute
su espectro Los resultados se expresaron como el porcentaje de inactivacioacuten del
radical hidroxilo
4244 Estudio de reactividad frente a anioacuten radical superoacutexido O2middot -
Se evaluoacute la reactividad de cada compuesto frente al radical anioacuten superoacutexido el que
fue generado electroquiacutemicamente en la superficie del electrodo a traveacutes de la
reduccioacuten del oxiacutegeno molecular disuelto en el medio (Figura 413)
Figura 413 Voltamograma ciacuteclico de la generacioacuten de anioacuten radical superoacutexido
DMF + HFFTBA 02 M en electrodo de carbono viacutetreo
Materiales y Meacutetodos
46
i) Celda electroquiacutemica
La celda estuvo compuesta de tres electrodos el electrodo de trabajo fue carbono
viacutetreo (aacuterea = 003 cm2) el electrodo auxiliar empleado fue Ag|AgCl (KCl 3 M
inmerso en DMF + HFFTBA 02 M como puente salino) y alambre de platino como
contra-electrodo
ii) Teacutecnica empleada
La generacioacuten del radical se realizoacute mediante voltamperometriacutea ciacuteclica (VC) a
velocidad de barrido de 01 Vs en un rango de potencial entre 0 V (inicial) y -1 V
como potencial de inversioacuten de la direccioacuten de barrido (switching) 92
iii) Experimento
Los experimentos se realizaron utilizando como solvente 10 mL de NN-
dimetilformamida (previamente destilada) el electrolito soporte utilizado fue
HFFTBA (hexafluorofosfato de tetrabutil amonio) en concentracioacuten 02 M las
soluciones fueron saturadas con aire continuamente Una vez estabilizada la corriente
se antildeadieron a la celda aliacutecuotas crecientes de solucioacuten stock de cada compuesto
observaacutendose la disminucioacuten en la corriente de pico anoacutedica Ipa0 Una vez obtenidos
los voltamogramas se determinoacute el paraacutemetro adimensional ((Ipa0-Ipa
S) Ipa
0) el que
expresoacute el consumo de la especie radical este valor se graficoacute con respecto a la
concentracioacuten del sustrato cuya relacioacuten fue una regresioacuten lineal De la graacutefica se
Materiales y Meacutetodos
47
obtuvo el valor de concentracioacuten de antioxidante en que la corriente de pico anoacutedico
disminuye en un 50 (IA50)
4245 Estudio de la capacidad antioxidante celular (CAC)
Para evaluar la actividad antioxidante de los compuestos estudiados en un medio
celular se utilizoacute el meacutetodo descrito en la literatura por Wolfe93
Se emplearon ceacutelulas
EAhy 926 (ATCC CRL-2922) las que fueron sembradas con una densidad de
50000 ceacutelulas por pocillo en microplacas de 96 pocillos con medio de cultivo
RPMI 1640 Despueacutes de 24 h fue removido el medio de cultivo y los pocillos
fueron lavados con buffer fosfato salino (PBS) pH 74 Los pocillos fueron tratados
con 20 μM de la sonda DCFH-DA disuelta en RPMI 1640 libre de suero fetal bobino
Posteriormente se agregaron los compuestos en dos concentraciones diferentes 1 μM y
10 μM Luego de transcurrida 1 h de incubacioacuten a 37 degC los pocillos fueron
lavados con PBS Luego de esto se agregoacute ABAP en una concentracioacuten final de
600 μM y se midioacute la fluorescencia generada por la sonda en el multi-lector de placas
a temperatura constante de 37 degC La emisioacuten a 538 nm fue medida con una excitacioacuten
a 485 nm cada 1 min por 1 hora El ensayo se realizoacute en triplicado El valor de
capacidad antioxidante se calcula determinando el aacuterea bajo la curva para la muestra y
el control experimental utilizando la siguiente ecuacioacuten
CAC = 100 ndash (ABCmuestra ABCcontrol) 100 Ecuacioacuten 43
Materiales y Meacutetodos
48
4246 Estudio de hidrofobicidad relativa de los compuestos
La hidrofobicidad de los compuestos se correlaciona con sus coeficientes de reparto y
distribucioacuten (log P para el reparto octanolagua y log D para la distribucioacuten
octanolsolucioacuten tampoacuten pH 74) los que se determinan utilizando teacutecnicas
espectrofotomeacutetricas yo cromatograacuteficas
Para realizar estas experiencias se determina la solubilidad del analito en octanol
saturado con agua y en la solucioacuten tampoacuten pH 74 saturado con octanol Luego se
obtienen las respectivas curvas de calibracioacuten para la concentracioacuten del compuesto en
estas soluciones en funcioacuten de la absorbancia yo aacuterea bajo la curva Se espera que las
curvas de calibracioacuten obtenidas cumplan con el requisito de una linealidad apropiada
Posteriormente se debe evaluar el reparto midiendo la concentracioacuten analiacutetica en la
fase orgaacutenica y acuosa Para la determinacioacuten del reparto estaacute descrita la siguiente
ecuacioacuten
119897119900119892119875119900119888119905119886119892119906119886 = log ([119904119900119897119906119905119900]119900119888119905119886119899119900119897
[119904119900119897119906119905119900]119886119892119906119886) Ecuacioacuten 44
Mientras que para la determinacioacuten de la distribucioacuten se utiliza la siguiente ecuacioacuten
119897119900119892119875119900119888119905119886119892119906119886(119905119886119898119901oacute119899) = log ([119904119900119897119906119905119900]119900119888119905119886119899119900119897
[119904119900119897119906119905119900]119905119886119898119901oacute119899 119901119867 74) Ecuacioacuten 45
Materiales y Meacutetodos
49
Para este estudio se realizoacute la determinacioacuten de tiempos de retencioacuten como medida de
la hidrofobicidad relativa entre compuestos Se utilizoacute una columna C18 ODS Hypersil
una fase moacutevil compuesta de acetonitrilo solucioacuten H3PO4 (6535 vv) bajo
condiciones isocraacuteticas con flujo 1 mLmin volumen de inyeccioacuten 50 microL
4247 Estudio teoacuterico caacutelculo del Iacutendice de Fukui
La optimizacioacuten de estructuras de los compuestos neutros se realizoacute utilizando el
meacutetodo DFTSP-DFT basado en la Teoriacutea de Funcionales de la Densidad (DFT)94-96
Se utilizoacute el funcional hiacutebrido B3LYP el conjunto de bases empleado fue 6-31G(d)
Los caacutelculos se realizaron mediante el software Gaussianrsquo09 Los descriptores locales
se evaluaron a traveacutes de la aproximacioacuten de orbitales condensados Orbitales
Moleculares Frontera (Mulliken MOs)
Resultados y discusioacuten
50
5 Resultados y discusioacuten
51 Siacutentesis de los compuestos
Se presentan a continuacioacuten los resultados de la caracterizacioacuten fiacutesica y
espectroscoacutepica de los compuestos sintetizados durante este trabajo
4-clorometil-78-dihidroxicumarina (1)
1H RMN (DMSO d6 δ ppm) 493 (s 2H -CH2-) 641 (s 1H =CH- cumarina) 686
(d 1Harom Jorto 85) 717 (d 1Harom Jorto 85) 942 (s1H OH) 1022 (s 1H OH)
13C RMN (DMSO d6 δ ppm) 4187 11047 11129 11267 11585 13282 14358
15017 15181 16046 Rendimiento 47 Punto de fusioacuten 202-204 degC Agujas
color marfil PM 2265gmol Foacutermula molecular C10H7O4Cl
4-clorometil-78-diacetilcumarina (5)
1H RMN (DMSO d6 δ ppm) 235 (s 3H -CH3) 241 (s 3H-CH3) 506 (s 2H -
CH2-) 674 (s 1H =CH- cumarina) 739 (d 1Harom Jorto 878) 783 (d 1Harom Jorto
878)13
C RMN (DMSO d6 δ ppm) 1943 1985 3983 4073 11467 11549
11871 12238 12939 14459 14593 14999 1578716751 Rendimiento 68
Punto de fusioacuten 157-159 degC Soacutelido blanco PM 3105 gmol Foacutermula molecular
C14H11O6Cl
Resultados y discusioacuten
51
Aacutecido-34-diacetoxicinaacutemico (6)
1H RMN (acetona d6 δ ppm) 215 (s 3H -CH3) 216 (s 3H CH3) 638-643 (d 1H
Jtrans 159) 717-720 (d 1Harom Jorto 878) 748-750-756 (s Harom y Htrans) 13
C RMN
(acetona d6 δ ppm)1996 2004 11977 12333 12450 12682 13364 14323
14339 14439 16699 16809 16817 Rendimiento 56 Punto de fusioacuten
158-161 degC Soacutelido blanco PM 264 gmol Foacutermula molecular C13H12O6
Aacutecido-345-triacetilbenzoico (7)
1H RMN (acetona d6 δ ppm) 217 (s 6H -CH3) 219 (s 3H -CH3) 767 (s 2H
Harom) 13
C RMN (acetona d6 δ ppm) (2C -CH3 1865) (2C-C=O 1910) (2Carom
12160) 12790 13857 (2C 14337) 16432 16599 16789 Rendimiento 66
Punto de fusioacuten 158-160 degC Soacutelido blanco PM 296 gmol Foacutermula molecular
C13H12O8
Aacutecido 34-diacetilbenzoico (8)
1H RMN (acetona d6 δ ppm) 217 (s 6H CH3) 724-727 (d 1Harom Jorto 85) 774-
775 (d 1Harom) 781-784 (dd 1Harom) 13
C RMN (acetona d6 δ ppm) 1910 1913
(2C 12329) 12453 12729 12838 16487 16699 16729 Rendimiento 61
Punto de fusioacuten 155-158 degC Soacutelido blanco PM 238 gmol Foacutermula molecular
C11H10O6
Resultados y discusioacuten
52
4-metil-(34-dihidroxicinamoato)-78-dihidroxicumarina (9)
1H RMN (DMSOd6 δppm) 541(s 2H -CH2-) 621(s 1H =CH- cumarina) 642-
648 (d 1H Jtrans= 1591) 682-71 (Harom) 758-763 (d 1H Jtrans = 1591) 91 (s -
OH) 94 (s -OH) 97 (s -OH) 102 (s- OH)13
C RMN (DMSO d6 δppm) 6154
10820 11035 11290 11345 11526 11550 11620 12225 12566 13292
14391 14607 14686 14920 15026 15174 16055 16646ESI-MS mz 371
[M+H]+ 369 [M-H]
- 181 [M+H]
+ 163 [M-H2O+H]
+ 145 [M-H2O+H]
+ 135 [M-
HCOOH+H]+ 179 [M-H]
- 161 [M-H2O-H]
- 135 [M-CO2-H]
-Rendimiento 37
Punto de fusioacuten 246-249 degC Soacutelido amarillo opaco PM 37031 gmol Foacutermula
molecular C19H14O8
4-metil-(345-dixidroxibenzoato)-78-dihidroxicumarina ( 10 )
1H RMN (DMSO d6 δ ppm) 546 (s 2H -CH2-) 619 (s 1H =CH- cumarina) 682-
685 (d 1Harom Jorto 8508) 704 (s 2Harom) 709-712 (d 1Harom Jorto 778)13
C RMN
(DMSO d6 δppm) 6192 10821 10914 11041 11295 11533 11885 13292
13949 14394 (2Carom) 14620 15024 15184 16055 16555 16793ESI-MS mz
361 [M+H]+ 359 [M-H]
- 171 [M+H]
+ 153 [M-H2O+H]
+ 125 [M-CO2H+H]
+ 169
[M-H]- 125 [M-CO2-H]
- Rendimiento 46 Punto de fusioacuten descomposicioacuten sobre
230 degC Soacutelido amarillo opaco PM 36027 gmol Foacutermula molecular C17H12O9
Resultados y discusioacuten
53
4-metil-(34-dihidroxibenzoato)-78-dihidroxicumarina (11)
1H RMN (DMSO d6 δ ppm) 548 (s 2H -CH2-) 619 (s 1H =CH- cumarina) 685
(m 2Harom) 71 (d 1Harom) 74 (d 2Harom) 13
C RMN (DMSO d6 δ ppm) 6142
10774 10988 11242 11481 11551 11626 11957 12218 13240 14343
14520 14972 15096 15127 16001 16490 ESI-MS mz 345 [M+H]+ 343 [M-
H]- 137 [M-H2O+H]
+ 109 [M-HCOOH+H]
+ 153 [M-H]
- 108 [M-CO2-H]
-
Rendimiento 73 Punto de fusioacuten descomposicioacuten sobre 250 degC Soacutelido amarillo
opaco PM 34427 gmol Foacutermula molecular C17H12O8
Resultados y discusioacuten
54
52 Estudios de voltametriacutea ciacuteclica y voltametriacutea de pulso diferencial
El proceso de oxidacioacuten electroquiacutemico de los compuestos fue evaluado mediante
voltamperometriacutea de pulso diferencial VPD Los resultados presentaron soacutelo un pico
de oxidacioacuten para los compuestos 1 2 4 y 9 por otra parte el aacutecido gaacutelico 3 y los
hiacutebridos 10 y 11 mostraron dos o maacutes sentildeales poniendo de manifiesto las complejas
reacciones de oxidacioacuten que presentan los grupos -OH en dichas estructuras (Figura
51 A y B)97
Al analizar las sentildeales tanto para los precursores y sus derivados hiacutebridos se encontroacute
que la uacutenica sentildeal anoacutedica del compuesto 9 corresponderiacutea tanto a la oxidacioacuten del
catecol presente en la cumarina 1 (Epa 083 V) como del aacutecido cafeico 2 (Epa 076 V)
(Figura 52 A) ambos compuestos por separado tuvieron potenciales de pico anoacutedico
cercanos los que se solaparon para una dar una sola sentildeal en el derivado 9 (Epa 082
V)
Figura 51 A
Voltamperogramas de pulso
diferencial para los
precursores 1 2 3 y 4 2 mM
en DMF + HFFTBA 02 M
00 03 06 09 12 15 18 21 24
OO H
O H
H O
OOH
OH
HO
OH
OH
OH
O
HO
OOH
OH O
Cl
A
2A
E vs Ag|AgCl V
1
2
3
4
Resultados y discusioacuten
55
Figura 51 B Voltamperogramas de pulso diferencial para los derivados 9 10 y 11
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
En el caso del hiacutebrido 11 derivado del aacutecido protocateacutequico se observaron dos picos de
oxidacioacuten que corresponderiacutean a la oxidacioacuten del catecol cumariacutenico (Epa 083 V) y el
catecol del aacutecido benzoico (Epa 111 V) A diferencia del caso anterior se encontroacute
que las sentildeales anoacutedicas de ambos precursores estuvieron lo suficientemente distantes
como para solaparse como en el caso anterior Considerando que los resultados se
obtuvieron bajo las mismas condiciones experimentales se podriacutea asumir que la sentildeal
a potencial Epa1 081 V corresponde a la oxidacioacuten en el anillo de la cumarina y la
sentildeal en Epa2 094 V corresponde a la oxidacioacuten del catecol presente en el anillo
benceacutenico Para el compuesto 10 se observoacute un comportamiento semejante al descrito
para 11
00 03 06 09 12 15 18 21 24
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OH O O
O
OO H
O H
O H
OOH
OH O
OH
OH
O
O
B
E vs Ag|AgCl V
9
10
11
2A
Resultados y discusioacuten
56
Los experimentos de voltamperometriacutea ciacuteclica se llevaron a cabo a distinta velocidad
de barrido 005 Vs ndash 3 Vs con el objeto de estudiar su influencia sobre la sentildeal de
oxidacioacuten En forma graacutefica para precursores y derivados se observaron pares redox de
comportamiento irreversible debido al evidente desplazamiento del potencial de pico
Epa con respecto al aumento de la velocidad de barrido El valor de ΔEp (Epa -Epc) se
incrementoacute con el aumento en la velocidad lo que indica una disminucioacuten en la
velocidad de transferencia electroacutenica Para los compuestos 1 2 4 y 9 a la velocidad
de barrido estudiada se observoacute al igual que en VPD la aparicioacuten de una uacutenica sentildeal
de oxidacioacuten para todo el rango de velocidad (la que se desplaza a potenciales maacutes
positivos a medida que aumenta la velocidad de barrido) seguida de una sentildeal de
reduccioacuten en el barrido hacia potenciales negativos Para los compuestos 3 10 y 11 se
apreciaron dos sentildeales de oxidacioacuten seguida de la correspondiente sentildeal en el barrido
de reduccioacuten
Para cada par redox se realizaron estudios por segmentos encontraacutendose para los
compuestos 9 y 10 que el pico I (de oxidacioacuten) estaacute relacionado con el pico II (de
reduccioacuten) y para el compuesto 11 las sentildeales I y Irsquo (de oxidacioacuten) estaacuten relacionadas
con el pico II (de reduccioacuten) Esto es indicio de que en el primer barrido se observa el
proceso de oxidacioacuten de los grupos fenoles en el cual se generan especies factibles de
ser reducidas como derivados de tipo quinoacutenico (Figuras 52 a 54)
Resultados y discusioacuten
57
Figura 52A VC para el derivado 9 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 53A VC para el derivado 10 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
-03 00 03 06 09 12 15
A
II
I
OOH
OH O
OH
OH
O
O
100 A
005 Vs
3 Vs
E vs Ag|AgCl V
03 06 09 12 15
B
II
I
E vs Ag|AgCl V
0 V - 13 V
0 V - 06 V
00 03 06 09 12 15 18
A
II
I
I
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
3 Vs
005 Vs
E vs Ag|AgCl V
00 03 06 09 12
B
II
I
E vs Ag|AgCl V
-02 V - 06 V
-02 V - 11 V
Resultados y discusioacuten
58
Figura 54 A VC para el derivado 11 a distintas velocidades de barrido 005 Vs - 3
Vs B VC por segmentos a 01 Vs 2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
En sistemas fenoacutelicos simples como es el caso del catecol o la hidroquinona se ha
estudiado el proceso redox en distintos medios 98-101
planteaacutendose que la oxidacioacuten en
medio aproacutetico deriva en la formacioacuten de la quinona correspondiente viacutea 2e-2H
+
(Figura 55) En esta investigacioacuten se han estudiado estructuras de mayor complejidad
y considerando que en este proceso de oxidacioacuten se ha descrito la presencia de
especies radicales como intermediarios de reaccioacuten es probable que ocurran procesos
de dimerizacioacuten o ataques nucleofiacutelicos por parte de los radicales dando como
resultado la generacioacuten de compuestos diferentes a la moleacutecula de partida (por
ejemplo de mayor peso molecular) Este tipo de comportamiento se puede analizar en
profundidad realizando barridos de potencial consecutivos en VC a baja velocidad de
00 03 06 09 12 15
I
II
I
A
100 A
OHO O
O
OOH
OH
OH
005 Vs
3 Vs
E vs Ag|AgCl V
00 03 06 09 12 15
II
I
IB
E vs Ag|AgCl V
-01 V - 07 V
-01 V - 14 V
Resultados y discusioacuten
59
barrido (005 Vs o menor para observar maacutes detalladamente la reaccioacuten quiacutemica en la
escala de tiempo del experimento) Si fuese el caso se esperariacutea observar la aparicioacuten
de sentildeales nuevas en el segundo barrido de oxidacioacuten que dariacutean cuenta de la
oxidacioacuten de las nuevas estructuras fenoacutelicas generadas
OH
OH-2e- -2H+
2e- 2H+
O
O
Figura 55 Esquema del proceso electro-oxidativo propuesto para el catecol
Se realizoacute la deconvolucioacuten (mediante la funcioacuten gaussiana) sobre las curvas de
oxidacioacuten para los compuestos con el objeto de determinar los valores de corriente de
pico anoacutedica de forma independiente con esto se obtienen valores de corriente y
potencial (principalmente a alta velocidad de barrido) los cuales son maacutes exactos que
los entregados por defecto por el software electroquiacutemico utilizado Las graacuteficas y
caacutelculos correspondientes a la relacioacuten entre los diferentes paraacutemetros analizados se
realizaron considerando los valores de Ipa y Epa para el primer pico oxidativo debido a
que esta sentildeal entrega informacioacuten con respecto a la energiacutea del primer electroacuten cedido
en el proceso de oxidacioacuten etapa que generalmente es lenta y determinante de la
velocidad de reaccioacuten
Resultados y discusioacuten
60
La expresioacuten indicada en la Ecuacioacuten 51102
da cuenta de la relacioacuten entre el potencial
de pico y el logaritmo de la velocidad de barrido para una reaccioacuten electroquiacutemica
irreversible
119864119901 119894119903119903119890119907 = 11986412 + 119887
2[104 minus log (
119887
119863) minus 2119897119900119892119896119891 + 119897119900119892119907] Ecuacioacuten 51
Por tanto de la graacutefica Ep vs logv se puede obtener el valor de la pendiente de Tafel b
que es igual al doble de la pendiente de la recta obtenida
119864119901 119894119903119903119890119907 = 119862119905119890 + 119887
2(119897119900119892119907) Ecuacioacuten 52
La graacutefica de potencial de pico anoacutedico (Epa) vs logv dio como resultado una relacioacuten
de tipo lineal para todos los compuestos el potencial de oxidacioacuten se desplazoacute hacia
valores maacutes positivos con el aumento de la velocidad de barrido lo que indica el
caraacutecter irreversible del proceso oxidativo en este medio En la Figura 56 se presenta
la graacutefica obtenida para el derivado 9 como ejemplo representativo de los resultados
obtenidos
Resultados y discusioacuten
61
Figura 56 Relacioacuten Epa vs logv para el derivado de aacutecido cafeico 9 2 mM en
DMF + HFFTBA 02 M
Los valores obtenidos para la pendiente de Tafel se resumen en la Tabla 51 Los
compuestos 1 y 3 poseen valores de la pendiente de Tafel cercanos al teoacuterico (118
mVdec)103
para un proceso en que la primera transferencia electroacutenica es la etapa
lenta del proceso (por tanto la etapa determinante de la reaccioacuten de electro-oxidacioacuten)
El compuesto 4 presenta un valor de 88 mVdec lo que sugiere que el electrodo estaacute
contaminado103104
o se produce un mecanismo de oxidacioacuten complejo (que implica
una transicioacuten entre la etapa quiacutemica y la transferencia electroacutenica como determinante
de la velocidad)105
De la misma forma los valores encontrados para los derivados 9
(170 mVdec) 10 (134 mVdec) y 11 (140 mVdec) y para el aacutecido cafeico (212
mVdec) indican que en las condiciones experimentales utilizadas la superficie del
18 21 24 27 30 33 36
090
093
096
099
102
105
OOH
OH O
OH
OH
O
O
r = 098638
m = 008548
Ep
a1 (
V)
logv (mV12
s-12
)
Resultados y discusioacuten
62
electrodo se contamina (pasiva)106
con la generacioacuten de especies polimeacutericas debido a
la formacioacuten del radical fenoxilo (ArObull) el cual puede dimerizar y originar diversos
productos de reaccioacuten los cuales se adhieren a la superficie del electrodo
Para cada compuesto se establecioacute la existencia de una relacioacuten de tipo lineal entre el
logaritmo de la corriente de pico anoacutedico y el logaritmo de la velocidad de barrido
(logIpa vs logv) El valor para la pendiente de estas rectas estuvo entre 044 y 056
(Tabla 51) lo que sugiere que el proceso observado es de tipo difusivo
La corriente de pico anoacutedica se puede expresar en funcioacuten de distintos paraacutemetros
experimentales como se indica en la Ecuacioacuten 53102
119868119901 = 301 times 10minus5 119899 (23 119877 119879
119887 119865)
12
11986312 119862 11990712 Ecuacioacuten 53
Donde n es el nuacutemero de electrones transferidos R es la constante de los gases (Jmol
K) T es la temperatura (K) D es el coeficiente de difusioacuten de la especie electro-activa
(cm2s) F es la constante de Faraday (Cmol) b es la pendiente de la ecuacioacuten de
Tafel107
(η = a + b log i) C es la concentracioacuten de la especie electro-activa (molL) y v
es la velocidad de barrido (mVs) Esta expresioacuten indica que la correlacioacuten entre
Ip y vfrac12
da como resultado una recta que seraacute funcioacuten del nuacutemero de electrones n y la
pendiente de Tafel b valores que estaacuten presentes en la pendiente de esta recta
Resultados y discusioacuten
63
Considerando lo anterior se procedioacute a graficar Ipa vs vfrac12
encontraacutendose para todos los
compuestos (Figura 57) una relacioacuten de tipo lineal con valores de r entre 099988 y
099448 se presenta ademaacutes la regresioacuten para el aacutecido protocateacutequico 4 como muestra
del comportamiento encontrado para todos los compuestos con valores de intercepto
que tienden a cero Al observar la Tabla 51 se aprecia que todas las regresiones
poseen una pendiente semejante lo cual da un indicio con respecto al nuacutemero de
electrones y mecanismo involucrados en la reaccioacuten de oxidacioacuten estudiada
Figura 57 Graacutefica para la corriente de pico Ipa vs la raiacutez cuadrada de la velocidad de
barrido Ejemplo de correlacioacuten lineal en el aacutecido protocateacutequico 4 2 mM en DMF +
HFFTBA 02 M
Tomando en cuenta que los valores de C R T y F (Ecuacioacuten 53) son factores
constantes y que los coeficientes de difusioacuten D seraacuten semejantes y del mismo orden
para aquellos compuestos de estructura similar (precursores por una parte y derivados
por otra) se obtiene que la pendiente de la recta obtenida en esta correlacioacuten es un
0 10 20 30 40 50 600
50
100
150
200
250
Ipa (
A)
V12
(mV12
s-12
)
OOH
OH
HO
m = 40 10-6
r = 099988
Resultados y discusioacuten
64
indicador respecto al nuacutemero de electrones involucrados en la reaccioacuten y al valor de b
(relacionado con el mecanismo de oxidacioacuten estudiado)
En el caso de los compuestos precursores se obtuvieron valores de pendientes entre
36bull10-6
y 41bull10-6
(Tabla 51) este rango cercano indica la transferencia del mismo
nuacutemero de electrones en el proceso oxidativo observado en que para la cumarina
clorada 1 el aacutecido cafeico 2 y el aacutecido protocateacutequico 4 corresponde a la uacutenica sentildeal
de oxidacioacuten observada y en el caso del aacutecido gaacutelico 3 es el proceso correspondiente a
la primera sentildeal del voltamograma En la literatura se describen estudios en medio
aproacutetico para compuestos fenoacutelicos como por ejemplo derivados de la cumarina 78-
dihidroxilada 100ab
el aacutecido cafeico101
y la hidroquinona105
que dan cuenta de una sentildeal
en el proceso oxidativo en medio aproacutetico que involucra 2 electrones esto permite
inferir que las sentildeales observadas experimentalmente corresponden a un proceso di-
electroacutenico
Para los derivados 9 10 y 11 se observa que los valores para la pendiente Ipa vs vfrac12 se
encuentran entre 37bull10-6
y 42bull10-6
como se indica en la Tabla 51 Ademaacutes al
comparar estos resultados con los obtenidos para el caso de los precursores se deduce
que estamos frente a un proceso oxidativo que involucra dos electrones Se observa
tambieacuten que no hay cambios con respecto al mecanismo de reaccioacuten si lo hubiese se
esperariacutea encontrar diferencias del doble o superior en los valores encontrados para la
pendiente de la recta ya que eacutesta contiene el factor b (pendiente de la ecuacioacuten de
Tafel) antes mencionado
Resultados y discusioacuten
65
Posteriormente se calculoacute el valor correspondiente al potencial de inicio del proceso
electroquiacutemico (Eonset)108109
Este valor indica el potencial inicial con que el primer
electroacuten es cedido en el proceso oxidativo que tiene lugar en la superficie del
electrodo Se determina como el valor de potencial de interseccioacuten entre las recta
tangentes a la liacutenea base y la corriente de oxidacioacuten para cada velocidad de barrido
aplicada en forma experimental (005 Vs a 3 Vs en este estudio) (Figura 58) Una
vez obtenido este potencial se procede a graficar con respecto al logaritmo de la
velocidad de barrido como se presenta en la Figura 59 Se considera el valor del
intercepto de cada recta Eionset (por lo tanto a una baja velocidad de barrido) el cual
incluye el error inherente a la medicioacuten y por tanto es maacutes confiable (Tabla 51) Se
observa que estos potenciales variacutean entre 050 V y 079 V para el aacutecido gaacutelico 3 y el
aacutecido protocateacutequico 4 respectivamente potencial que da indicio de la factibilidad de
oxidacioacuten siendo el compuesto con un Eionset menor el que se oxida con mayor
facilidad Estos valores de potencial onset encontrados permitiraacuten establecer una
correlacioacuten entre el potencial de oxidacioacuten determinado de esta forma y los resultados
obtenidos en los ensayos de actividad frente a especies radicales llevados a cabo en
medio aproacutetico (seccioacuten 6)
Resultados y discusioacuten
66
Figura 58 Determinacioacuten graacutefica del valor de Eonset VC del precursor 1 01 Vs
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
Figura 59 Relacioacuten Eonset vs logv para los compuestos estudiados
-05 00 05 10 15 20
20 A
Eonset
E vs Ag|AgCl (V)
15 18 21 24 27 30 33 3606
07
08
09
10
11
12
OOH
OH
HO
OOH
OH
HO
OH
OH
OH
O
HO
OHO O
O
OOH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OOH
OH O
OH
OH
O
O
OOH
HO O
Cl
Eon
set
(V)
logv (mV12
s-12
)
Resultados y discusioacuten
67
Tabla 51 Paraacutemetros experimentales para los compuestos Determinaciones en VC
2 mM DMF + HFFTBA 02 M
Compuesto
119837119845119848119840119816119849119834120783
119837119845119848119840119855 (microAmVs
-1)
119837119816119849119834120783 119837119855120783120784
(microAmV12
s-12
)
119837119812119849119834120783
119837119845119848119840119855
(mVdec)
119835 = 120784 119837119812119849119834120783
119837119845119848119840119855
(mVdec)
Eionset
(mV)
056 36bull10-6
61 122 059
053 41bull10
-6 106 212 059
048 36bull10-6
55 110 050
O
OH
OH
HO
052 41bull10-6
44 88 079
047 40bull10-6
85 170 064
049 37bull10-6
67 134 075
044
42bull10-6
70 140 058
Con el objeto de recabar mayor informacioacuten con respecto al mecanismo de reaccioacuten
involucrado en los procesos oxidativos en estudio en base a los resultados obtenidos
OHO O
O
OOH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
O
OH
OH O
OH
OH
O
O
OOH
OH
HO
OH
OH
OH
O
HO
O
OH
HO O
Cl
Resultados y discusioacuten
68
en VC se realizoacute la graacutefica (Ipa v12
) vs v12
para los compuestos precursores 1 2 3 y
4 (escogidos por poseer un grupo catecol y ser estructuras de menor complejidad que
los derivados 9 10 y 11) Estas graacuteficas de las que se presenta el ejemplo del aacutecido
como muestra (Figura 510) presentaron una relacioacuten de tipo lineal en la que la
pendiente negativa obtenida sugiere que la reaccioacuten observada implica un mecanismo
de tipo EC considerando los estudios mencionados para compuestos fenoacutelicos
ampliamente descritos en la literatura100101105109
y el criterio de diagnoacutestico
mencionado por Pletcher y colaboradores111
Figura 510 Correlacioacuten (Ipa v12
) vs v
12 para el precursor aacutecido protocateacutequico 4
2 mM en DMF + HFFTBA 02 M
21 28 35 42 49 5626
28
30
32
34O
OH
OH
HO
r = -099302
V12
(mV12
s-12
)
Ipa
V12 (
A
mV
12s-1
2)
Resultados y discusioacuten
69
Diversos estudios proponen la presencia de mecanismos concertados para los procesos
redox de compuestos de tipo fenoacutelico los cuales implican la presencia de
intermediarios radicalarios y reacciones donde la transferencia de un protoacuten y un
electroacuten ocurren de forma acoplada dentro de un mismo paso Este concepto nace en la
deacutecada de 1990 a partir de los trabajos publicados por Biczoacutek y colaboradores112113
El estudio de este tipo de reacciones principalmente en derivados fenoacutelicos es de
relevancia debido al rol que eacutestos desempentildean en diferentes sistemas bioloacutegicos tanto
por su reconocida capacidad antioxidante como se evidencia en la investigacioacuten
realizada por Nakayama y colaboradores con respecto a derivados polifenoacutelicos y el
mecanismo de reaccioacuten propuesto de tipo PCET (Proton Concerted Electron Transfer)
frente al anioacuten superoacutexido114
o como en el caso de estudio de las reacciones de
transferencia electroacutenica que involucran al aminoaacutecido tirosina115ab
y otros co-factores
que forman parte esencial del proceso fotosinteacutetico que se lleva a cabo en estructuras
vegetales (Fotosistema II)116
En la deacutecada pasada los aportes a la investigacioacuten sobre el tema se tornaron maacutes
profundos y sistemaacuteticos permitiendo el modelamiento teoacuterico y anaacutelisis de este tipo
de mecanismos Debido al intereacutes concerniente a la obtencioacuten de modelos racionales
de sistemas bioloacutegicos los estudios realizados en medio proacutetico son variados como la
serie de derivados fenol-imidazol sintetizados y caracterizados por Markle y
colaboradores117
quienes entre diversos factores analizan el efecto del sustituyente
sobre el enlace O-H Otros autores como Saveacuteant Costentin y colaboradores han
abordado este toacutepico en diferentes publicaciones proponiendo distintos mecanismos
Resultados y discusioacuten
70
dependientes del pH y composicioacuten de la solucioacuten de trabajo (con buffer o sin eacutel)118
En trabajos posteriores plantean un estudio teoacuterico de modelamiento en sistemas de
tipo amino-fenol enfocados en el mencionado Fotosistema II119
y frente al sistema
enzimaacutetico superoacutexido dismutasa120
Rhile y colaboradores describen la siacutentesis
caracterizacioacuten y estudios de oxidacioacuten tanto quiacutemica como electroquiacutemica (en medio
aproacutetico acetonitrilo) de una serie de fenol-aminas junto con un anaacutelisis teoacuterico del
sistema evidenciaacutendose la presencia de especies radicales intermediarias121
junto con
valores entre 16 a 28 para la relacioacuten de efecto isotoacutepico cineacutetico (KI = kHkD) que se
estima como criterio para considerar un mecanismo concertado122
El estado del arte con respecto a los distintos mecanismos electro-oxidativos descritos
para los derivados fenoacutelicos indica que la determinacioacuten de una ruta en particular en
este proceso se puede establecer mediante estudios de naturaleza tanto experimental
como teoacuterica La obtencioacuten de paraacutemetros termodinaacutemicos como la energiacutea libre de
Gibbs el estudio de efecto isotoacutepico y la determinacioacuten de constantes de velocidad en
electroquiacutemica entre otros permiten discriminar entre las diferentes viacuteas en que se
puede llevar a cabo la electro-oxidacioacuten de fenoles
Resultados y discusioacuten
71
53 Estudio de generacioacuten de especies radicalarias mediante espectroscopia de
resonancia de espiacuten electroacutenico (REE)
A fin de evidenciar la existencia de posibles intermediarios radicalarios en el proceso
electro-oxidativo de los fenoles previamente estudiados a traveacutes de las teacutecnicas
electroquiacutemicas se procedioacute a oxidar los derivados 9 10 y 11 y medir in situ su
espectro REE Se utilizoacute la teacutecnica descrita por Le Nest y colaboradores99
en que se
describe el estudio de estructuras flavonoides polifenoacutelicas en eacutel se utiliza la
quelacioacuten con Zn2+
lo que permitioacute la estabilizacioacuten del radical formado y su posterior
estudio En primer lugar desde un punto de vista cualitativo se observoacute para cada
compuesto un evidente cambio de color en las soluciones electrolizadas las que se
tornaron de color amarillo intenso y maacutes oscuro que las soluciones de trabajo
originales lo que sugiere que tras la electroacutelisis se forma un compuesto nuevo
diferente al de partida como se esperaba En la Figura 511A-C se presentan los
espectros obtenidos junto con las respectivas simulaciones realizadas
Resultados y discusioacuten
72
Figura 511A Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido cafeico 9 estabilizado con Zn2+
en DMF + HFFTBA
(izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color
rojo)
Figura 511B Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido gaacutelico 10 estabilizado con Zn2+
en DMF + HFFTBA
(izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der en color
rojo)
3440 3450 3460 3470 3480 3490
O
OH
HO O
OH
OH
O
OA
Campo Magneacutetico G
3440 3450 3460 3470 3480 3490
OHO O
O
O
OH
OH
OH
OH
B
Campo Magneacutetico G
Resultados y discusioacuten
73
Figura 511C Espectro REE de la especie radicalaria generada en la electro-
oxidacioacuten del derivado de aacutecido protocateacutequico 11 estabilizado con Zn2+
en DMF +
HFFTBA (izq) Espectro simulado utilizando el programa EPR-WINSIM 2002 (der
en color rojo)
Concordante con el resultado esperado la sentildeal espectral indica la presencia de una
especie radicalaria como intermediario de la electro-oxidacioacuten de los grupos catecol
presentes en los tres derivados en estudio
En la simulacioacuten realizada para el derivado 9 se observa el acoplamiento hiperfino de
tres aacutetomos de hidroacutegeno con los siguientes valores de constantes 132 G 098 G y
03 G que seriacutea indicio del proceso oxidativo que ocurre en el catecol del anillo
benceacutenico (Tabla 52) ya que estos valores coinciden con una interaccioacuten entre los tres
protones del anillo benceacutenico en posicioacuten 2 5 y 6 En el caso de los compuestos 10
y 11 se encontraron dos constantes de acoplamiento hiperfino lo que indica la
3440 3450 3460 3470 3480 3490
OHO O
O
OOH
OH
OH
C
Campo Magneacutetico G
Resultados y discusioacuten
74
interaccioacuten entre dos protones que seriacutean aquellos en posicioacuten 5 y 6 del anillo
cumariacutenico
Tabla 52 Constantes de acoplamiento hiperfino para los derivados polifenoacutelicos
Valores en Gauss
Compuesto aH1 G aH2 G aH3 G
132 098 030
215 156 -
235 122 -
Estos resultados concuerdan ademaacutes con lo descrito en la literatura con respecto a la
oxidacioacuten de grupos fenoacutelicos lo que permite inferir un posible mecanismo electro-
oxidativo para los derivados en estudio
O
OH
OH O
OH
OH
O
O
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
Resultados y discusioacuten
75
54 Resultados y discusioacuten de los estudios de reactividad frente a especies
radicalarias
En este punto de la investigacioacuten el objeto de estudio fue evaluar el comportamiento
de las nuevas estructuras previamente sintetizadas frente a diferentes especies
radicalarias de amplio intereacutes bioloacutegico radical peroxilo (ROObull) radical hidroxilo
(OHbull) anioacuten radical superoacutexido (O2-) junto con determinar la capacidad reductora de
los compuestos Cada ensayo fue escogido con miras de abordar el tema de la
capacidad antioxidante desde las posibilidades que permiten las experiencias de tipo in
vitro
541 Metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno
(oxygen radical antioxidant capacity-fluorescein ORAC-FL)
El estudio de especies reactivas de oxiacutegeno y nitroacutegeno asociadas a los procesos
oxidativos requiere en algunos casos del uso de compuestos denominados ldquosondasrdquo
En la teacutecnica de fluorescencia es posible implementar este tipo de metodologiacutea debido
a sus caracteriacutesticas de sensibilidad especificidad y simplicidad en la obtencioacuten de
datos convirtieacutendose en una herramienta uacutetil y ampliamente utilizada a la hora de
obtener una buena aproximacioacuten en la determinacioacuten de actividad frente a especies
EROsERNs123
Resultados y discusioacuten
76
En el caso de la metodologiacutea de capacidad antioxidante frente a radicales de oxiacutegeno
(ORAC) los primeros trabajos que dan cuenta de su uso fueron descritos en la deacutecada
de 1990 a partir de la investigacioacuten de Cao y colaboradores124
En este trabajo los
autores describen la teacutecnica como un meacutetodo simple y confiable para determinar
capacidad antioxidante en serum humano en pequentildeas cantidades de muestra (del
orden de los microL) utilizando como sonda la β-ficoeritrina (proteiacutena aislada del alga roja
unicelular Porphyridium cruenturn) debido a su fluorescencia sensible a los cambios
conformacionales en su estructura en ensayos frente al radical peroxilo125
En el
desarrollo posterior Ou y colaboradores126
proponen una mejora a la teacutecnica
cambiando la sonda proteica por el compuesto fluoresceiacutena debido a su mayor foto-
estabilidad y para evitar interacciones proteiacutena-polifenol (hidrofoacutebicas y puentes de
hidroacutegeno) junto con ello realizaron la validacioacuten del meacutetodo Esta sonda es la
utilizada actualmente para este ensayo el cual es ampliamente utilizado en el estudio
de polifenoles y sus derivados127-128ab
en diferentes alimentos y bebidas129130
muestras bioloacutegicas de distinta iacutendole131
por mencionar algunos ejemplos
Para efectos de esta investigacioacuten se espera obtener un perfil de comportamiento de
cada uno de los compuestos frente al radical peroxilo (ROObull) que permita distinguir el
aporte que significa cada sustitucioacuten realizada al anillo cumarina con diferentes
grupos fenoacutelicos Cabe mencionar que las longitudes de onda maacuteximas (λmaacutex) de
absorbancia en el rango UV-visible para los compuestos ensayados estuvieron en un
rango entre los 203 nm y 329 nm En este estudio se obtuvieron los perfiles cineacuteticos
Resultados y discusioacuten
77
de consumo de la sonda fluoresceiacutena (con valores de 485525 nm para su absorcioacuten y
emisioacuten respectivamente) por induccioacuten de los radicales peroxilo (originados por
efecto de la termoacutelisis del azo-compuesto ABAP a 37 degC) A partir de estos perfiles de
decaimiento de la sonda a distintas concentraciones de compuestos antioxidantes (5 en
total) se obtuvieron curvas adecuadamente separadas como se muestra en la Figura
512 donde se muestran los resultados para el compuesto 11 como ejemplo
representativo del ensayo Posteriormente se determina para cada concentracioacuten el aacuterea
neta bajo la curva la que es graficada con respecto a las concentraciones utilizadas La
Figura 513 presenta relacioacuten lineal entre el aacuterea neta bajo la curva con respecto a la
concentracioacuten del compuesto 11 como ejemplo la que fue determinada para cada
derivado
Figura 512 Curvas para el consumo de la sonda fluoresceiacutena para un set de
concentraciones del compuesto 11
0 2000 4000 6000
02
04
06
08
10
F
F0
Tiempo (s)
control
16 M
12 M
081 M
045 M
020 M
Resultados y discusioacuten
78
Las curvas obtenidas en esta parte del experimento muestran la reaccioacuten de
competencia entre el radical y el antioxidante (el cual protege a la fluoresceiacutena del
proceso de oxidacioacuten) Posterior al procedimiento anteriormente descrito se obtuvo el
iacutendice ORAC para cada compuesto que se resume en la Tabla 54
Figura 513 Graacutefica de aacuterea neta bajo la curva ABC vs concentracioacuten del derivado 11
En este ensayo los compuestos hiacutebridos propuestos superaron en cuanto al valor de
iacutendice ORAC a la cumarina precursora 1 En los tres casos se pudo observar valores
superiores de casi el doble para el compuesto 10 y bordeando un ORAC casi tres veces
mayor en los compuestos 9 y 11 del valor obtenido para su precursor Estos resultados
evidenciaron un incremento en la capacidad antioxidante al que posee la cumarina de
manera independiente debido a la inclusioacuten de los derivados de aacutecidos
hidroxibenzoicos e hidroxicinaacutemico en su estructura (Tabla 53)
0 1 2 3 4 50
1000
2000
3000
4000
r = 099309
AB
C n
eta
Concentracioacuten (mM)
Resultados y discusioacuten
79
Tabla 53 Valores experimentales de iacutendice ORAC-FL para los compuestos
estudiados
Compuesto iacutendice ORAC-FL
(plusmnSD)
1 091 plusmn 010
2 347 plusmn 010
3 391 plusmn 009
4 069 plusmn 001
9 239 plusmn 003
10 174 plusmn 005
11 262 plusmn 004
Trolox 1
Por otra parte los valores del iacutendice ORAC de la serie fueron superiores al estaacutendar
Trolox con excepcioacuten de los compuestos 1 (cumarina de partida) y 4 (aacutecido
protocateacutequico) Para el caso de la cumarina eacutesta tuvo un valor ORAC menor a 1 En
el caso del compuesto 4 la ostensible diferencia (5 veces menor) con su homoacutelogo
aacutecido cafeico 2 deriva de la presencia del doble enlace en esta estructura aunque
ambos aacutecidos poseen igual cantidad de grupos ndashOH y en igual posicioacuten en el anillo
aromaacutetico la insaturacioacuten le confiere maacutes posibilidades de deslocalizacioacuten electroacutenica
debido a la mayor cantidad de estructuras resonantes posibles y por lo tanto mayor
Resultados y discusioacuten
80
estabilidad al formarse la especie radicalaria correspondiente en la reaccioacuten frente el
ABAP Al observar el valor obtenido para el aacutecido gaacutelico 3 se obtuvo un iacutendice
ORAC cercano al del aacutecido cafeico y aunque carece de la insaturacioacuten presente en el
derivado cinaacutemico posee en su defecto un grupo ndashOH adicional en posicioacuten 5 del
anillo aromaacutetico el cual aportoacute adicionalmente a su capacidad antioxidante (lo que no
ocurrioacute en el caso del aacutecido protocateacutequico 4)
Se observa que el aacutecido dihidroxibenzoico 4 que arrojara un valor 069 presenta un
incremento de 37 veces en su valor ORAC-FL al estar incorporado en el heterociclo
cumariacutenico En este caso se presentoacute un fenoacutemeno de sinergia positiva ya que ambos
compuestos cumarina 1 y aacutecido protocateacutequico 4 aumentaron su valor de ORAC-FL
pasando de un valor 091 y 069 de forma individual respectivamente a formar un
derivado que presentoacute un valor de ORAC-FL igual a 262 Al observar los valores
totales en los derivados 9 y 10 obtenidos no correspondieron a la sumatoria de los
iacutendices individuales de sus precursores este resultado indica que estuvo ausente el
fenoacutemeno de sinergia
Para los nuevos compuestos (9 10 y 11) se observoacute un incremento del valor de
ORAC-FL con respecto a la cumarina precursora 1 Por lo tanto la inclusioacuten delas
estructuras fenoacutelicas en el heterociclo cumariacutenico generoacute la obtencioacuten de nuevos
derivados con una mayor capacidad antioxidante en esta metodologiacutea de esta forma se
obtuvo un aporte a la reactividad de la cumarina 1
Resultados y discusioacuten
81
Los resultados obtenidos en este ensayo dan cuenta de la actividad que presentaron los
compuestos tanto precursores como derivados frente a la especie radical ROObull Un
punto importante a considerar es que este experimento ndashindependientemente de ser un
ensayo in vitro- se lleva a cabo en un medio buffer a pH 74 y a una temperatura
controlada de 37 degC lo que permite obtener una primera aproximacioacuten con respecto a
lo que seraacute la actividad de los compuestos en un medio bioloacutegico La sustitucioacuten en el
anillo cumariacutenico generoacute nuevos compuestos que superaron su capacidad antioxidante
sin embargo desde el punto de vista de los precursores aacutecidos (cafeico y gaacutelico) su
actividad se vio mermada tras la sustitucioacuten fenoacutemeno que se discute en la seccioacuten 6
La secuencia de actividad obtenida para los derivados y sus precursores fue 3 gt 2 gt 11
gt 9 gt 10 gt 1 gt 4
Junto con el ensayo anteriormente detallado se procedioacute a determinar la cantidad de
radicales que reaccionan con el compuesto antioxidante relacionando la concentracioacuten
de antioxidante aplicado la estequiometriacutea de la reaccioacuten y la velocidad de generacioacuten
de radicales peroxilo a 37 degC como se expresa en la siguiente ecuacioacuten (Burton y
colaboradores 1981)132
120591 = 119899 [119860119903119874119867]
119877119894 Ecuacioacuten 54
Resultados y discusioacuten
82
donde τ es el tiempo de induccioacuten (tiempo en el que la sonda es protegida de los
radicales peroxilo por el antioxidante) n es el valor asociado a la estequiometriacutea de la
reaccioacuten correspondiente a la cantidad de moleacuteculas de radical ROObull inactivadas por
moleacutecula de compuesto antioxidante [ArOH] es la concentracioacuten de antioxidante y Ri
es la velocidad de generacioacuten de radical peroxilo la cual estaacute directamente relacionada
con la concentracioacuten de ABAP utilizada en el ensayo (18 mM) y se determina seguacuten la
expresioacuten133
Ri = 136 bull 10-6
[ABAP] Ecuacioacuten 55
Dadas las condiciones experimentales empleadas el valor de Ri es 147 microMmin Los
resultados obtenidos del valor de la pendiente (regresioacuten lineal Ecuacioacuten 54) se
resumen en la Tabla 54
Todos los compuestos (precursores y derivados) presentan valores de n superiores a
los esperados donde en el caso extremo se tiene que una moleacutecula de aacutecido gaacutelico
estariacutea consumiendo 14 moleacuteculas de radical peroxilo resultado que es mucho mayor
al esperado Los aparentes altos valores de n como estequiometriacutea de la reaccioacuten
(n = 3 hasta n = 14) sugieren la presencia de reacciones asociadas de mayor
complejidad en las que estariacutea presente el radical alcoxilo (RObull)134
el cual se forma
por descomposicioacuten del radical peroxilo que posee una vida media del orden de los
segundos en comparacioacuten con el radical alcoxilo con una vida media del orden de los
10-6
s (y es maacutes reactivo) lo que explica esta diferencia en la estequiometria
Resultados y discusioacuten
83
Tabla 54 Valores calculados para el factor estequiomeacutetrico n
Compuesto na(plusmnSD) n
1 28 plusmn 03 3
2 39 plusmn 01 4
3 141 plusmn 14 14
4 24 plusmn 01 3
9 58 plusmn 04 6
10 49 plusmn 01 5
11 86 plusmn 01 9
a Valores calculados en triplicado
Este fenoacutemeno se ha encontrado en investigaciones previas realizadas en derivados
cumariacutenicos135
y fue descrito por Lissi y colaboradores el que se puede encontrar
ademaacutes en experimentos en los que se utiliza la sonda rojo de pirogalol (ORAC-
PGR)136137
Resultados y discusioacuten
84
542 Metodologiacutea de capacidad reductora de hierro en plasma (FRAP)
Esta metodologiacutea desarrollada por Benzie y Strain (1996)138
se propuso como una
medida de la capacidad reductora (asociada a una buena capacidad antioxidante)
enfocada a investigar procesos de estreacutes oxidativo en fluidos bioloacutegicos
Posteriormente se ha extendido al estudio de diversas matrices como extractos de
plantas medicinales139
alimentos140
compuestos puros141
por mencionar algunos
ejemplos
En este ensayo se obtuvieron los valores de la capacidad reductora de los compuestos
polifenoacutelicos la que se aprecia cualitativamente a traveacutes de la formacioacuten del complejo
de Fe2+
de color azul (Figura 514) Esta metodologiacutea involucra la reaccioacuten redox
entre el agente reductor (en este caso los derivados cumariacutenicos) y el oxidante (la sal
feacuterrica) es considerada como aproximacioacuten con respecto a la capacidad de mantener el
estatus redox dentro de la ceacutelula
En primer lugar se observoacute un comportamiento semejante al ensayo ORAC-FL en
cuanto a la tendencia que presentaron los compuestos en su capacidad reductora de
hierro lo que indica una baja probabilidad de que en este ensayo ocurriese el
fenoacutemeno de quelacioacuten propio de los catecoles La Tabla 55 presenta los datos
experimentales obtenidos
Resultados y discusioacuten
85
NN
NN
Fe 3+N
N
N
N
N
N
NN
NN
NN
Fe2+N
N
N
N
N
N
NN
Antioxidante
amarilloazul
[Fe(III) (TPTZ)2]3+ [Fe(III) (TPTZ)2]2+
Figura 514 Esquema para la reaccioacuten entre el complejo de Fe3+
y el compuesto
antioxidante reductor
Los compuestos 9 10 y 11 presentaron una mejor capacidad reductora frente a su
precursor cumariacutenico 1 Esto se explica debido a la presencia de un mayor nuacutemero de
grupos -OH presentes en las nuevas estructuras propuestas capaces de transferir
electrones y reducir la sal feacuterrica como se menciona en el trabajo de Pulido y
colaboradores142
quienes estudian una serie de polifenoles mediante esta teacutecnica
sentildealando que ademaacutes del nuacutemero de hidroxilos presentes la presencia de dobles
enlaces conjugados en el esqueleto como parte de las caracteriacutesticas estructurales
responsables de un aumento en la capacidad reductora en polifenoles
Resultados y discusioacuten
86
Tabla 55 Valores experimentales obtenidos para los compuestos en estudio ensayo
FRAP en equivalentes de Trolox10 microM de muestra
En el derivado 11 se presenta una interaccioacuten de tipo sineacutergica con respecto a los
resultados individuales de cada precursor habieacutendose obtenido un valor FRAP de
1302 y 868 equiv Trolox 10 microM de muestra para 1 y 4 respectivamente y para el
derivado final un valor de 2624 equiv Trolox 10 microM de muestra
Del mismo modo que en el ensayo anterior se observa que la sustitucioacuten en el anillo
cumariacutenico con los distintos grupos aacutecidos incrementa su potencial como especie
reductora mientras que en el caso del aacutecido cafeico y gaacutelico se aprecia una
disminucioacuten de 13 y 15 veces respectivamente en su capacidad reductora tras la
esterificacioacuten
Compuesto equiv Trolox 10 microM muestra
(plusmnSD)
1 1302 plusmn 197
2 2727 plusmn 321
3 4768 plusmn 215
4 868 plusmn 93
9 2052 plusmn 186
10 3182 plusmn 681
11 2624 plusmn 335
Resultados y discusioacuten
87
Los resultados obtenidos para esta teacutecnica entregan informacioacuten acerca de la capacidad
reductora relativa para el conjunto de compuestos ensayados capacidad que estaacute
relacionada con su actividad antioxidante Se obtuvo un orden relativo para
precursores y derivados como sigue 3 gt 10 gt 2 gt 11 gt 9 gt 1 gt 4 Con respecto a la
disminucioacuten de actividad para los aacutecidos mencionados sugiere que esta capacidad
ademaacutes del nuacutemero de ndashOH presentes estariacutea relacionada con el sustituyente ndashCOOH
que se transforma en un grupo eacutester (ver seccioacuten 6)
543 Capacidad de inactivacioacuten del radical OHmiddot teacutecnica Spin Trapping
Esta teacutecnica no destructiva permite la deteccioacuten e identificacioacuten de especies
paramagneacuteticas (con electrones desapareados) en distintas matrices El fenoacutemeno de
resonancia de espiacuten electroacutenico fue descubierto y descrito en la deacutecada de 1940 por
Zavoisky143
en sus estudios basados en sales de manganeso en distintos medios Su uso
y aplicaciones se han diversificado a numerosas aacutereas como en la determinacioacuten de
capacidad antioxidante en alimentos144
en el anaacutelisis del proceso oxidativo en
liacutepidos145
en el estudio de enfermedades parasitarias146
El creciente intereacutes de la
teacutecnica en ciencias biomeacutedicas radica en el hecho de que esta espectroscopia permite
discriminar diferentes especies radicales de intereacutes bioloacutegico estrechamente
relacionadas con el estatus redox de la ceacutelula147
cuyo desbalance se traduce en cuadros
de estreacutes oxidativo148
Resultados y discusioacuten
88
En este estudio se determinoacute la capacidad de los compuestos propuestos para inactivar
la especie radicalaria OHmiddot
mediante la teacutecnica spin trapping metodologiacutea basada en
establecer la competencia de reaccioacuten entre los antioxidantes propuestos y el spin trap
DMPO El radical se generoacute a traveacutes de la reaccioacuten de ldquoFenton no cataliacuteticordquo
(Ecuacioacuten 56) metodologiacutea que permite la generacioacuten del radical OHbull en medio
baacutesico en ausencia del ioacuten Fe como catalizador91ab
211986721198742 + 119874119867minus rarr 119874119867∙ + 1198742minus + 21198672119874 Ecuacioacuten 56
En un primer set de experimentos se procedioacute a realizar la experiencia utilizando
DMSO como solvente Se descartoacute esta opcioacuten debido a que resultoacute complejo
observar un patroacuten claro en el blanco y poder asiacute discriminar las nuevas sentildeales
espectrales a partir de la adicioacuten de los compuestos en estudio
En primer lugar se determinoacute el blanco experimental que indica la reaccioacuten de
inactivacioacuten del radical mediante el compuesto spin trap DMPO Posteriormente se
ensayaron los derivados hiacutebridos y sus precursores sinteacuteticos en dos concentraciones
033 mM y 33 mM En el caso de los experimentos realizados a la menor
concentracioacuten se aprecioacute que la disminucioacuten de la sentildeal del blanco fue miacutenima para los
siete compuestos y no se observoacute un cambio significativo en el espectro como para
obtener resultados concluyentes Considerando lo anterior los experimentos se
Resultados y discusioacuten
89
realizaron con concentracioacuten del orden de los 3 mM obtenieacutendose asiacute datos
satisfactorios en cuanto a la inactivacioacuten del radical y la posibilidad de realizar
caacutelculos sobre este valor El valor de inactivacioacuten del radical hidroxilo se calcula a
traveacutes de la disminucioacuten en la intensidad de las sentildeales al adicionar cada derivado En
cada espectro se aprecia el perfil hiperfino compuesto por cuatro liacuteneas caracteriacutesticas
correspondientes al aacutetomo de nitroacutegeno e hidroacutegeno del spin-aducto formado por
[DMPO-OH] con valores de aN y aH alrededor de 15G lo que concuerda con lo
descrito en la literatura149
para esta reaccioacuten y el espectro simulado que se presenta en
la Figura 515 El cambio experimental tras la adicioacuten de los compuestos se presenta
en color rojo (Figura 516 A-G)
N+
O-
+ OHN
O
OH
Figura 515 Espin aducto generado por la inactivacioacuten del radical OHbull y su espectro
simulado (derecha)
Resultados y discusioacuten
90
Figura 516 A Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto 4-clorometil-78-dihidroxicumarina 1 B Espectro REE de inactivacioacuten del
radical hidroxilo con adicioacuten del compuesto aacutecido cafeico 2
Figura 516 C Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto aacutecido gaacutelico 3 D Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con
adicioacuten del compuesto aacutecido 34-dihidroxi benzoico 4
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
B
Campo Magneacutetico G
compuesto 2
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
C
Campo Magneacutetico G
compuesto 3
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
D
Campo Magneacutetico G
compuesto 4
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
A
Campo Magneacutetico G
compuesto 1
control
Resultados y discusioacuten
91
Figura 516 E Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto hiacutebrido 9 F Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con
adicioacuten del compuesto hiacutebrido 10
Figura 516 G Espectro REE de inactivacioacuten del radical hidroxilo con adicioacuten del
compuesto hiacutebrido 11
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
G
Campo Magneacutetico G
compuesto 11
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
E
Campo Mgneacutetico G
compuesto 9
control
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
F
Campo Magneacutetico G
compuesto 10
control
Resultados y discusioacuten
92
Considerando los patrones espectrales obtenidos para los compuestos 9 10 y 11 se
observoacute que la sentildeal de cuadruplete correspondiente al control (spin-aducto [DMPO-
OH]) desaparecioacute casi por completo lo cual indica la inactivacioacuten del radical
hidroxilo Se observa ademaacutes un triplete con constantes de acoplamiento 1398 G y
1427 G que evidencioacute la reaccioacuten de oxidacioacuten del atrapador DMPO (Figura 517)
ya que de haberse formado el aducto entre la cumarina y el spin trap DMPO se
habriacutea obtenido el correspondiente espectro con un patroacuten de 6 liacuteneas espectrales
(Figura 518)
Figura 517 Espectro REE se destaca en rojo el triplete de integracioacuten 121
formado despueacutes de la reaccioacuten de Fenton no-cataliacutetico (izq) Espectro simulado
utilizando el programa EPR-WINSIM (der)
3420 3440 3460 3480 3500 3520 3540
DMPO oxidado
N+
O-
+ OHNO
OH
Campo Magneacutetico G
Resultados y discusioacuten
93
cumarina + OHbull cumarinabull + H2O
cumarinabull + DMPO [cumarina-DMPO]
Figura 518 Espectro simulado para la formacioacuten del spin aducto [cumarina-
DMPO] utilizando el programa EPR-WINSIM
Como se presenta en la Tabla 56 tanto los aacutecidos orgaacutenicos como la cumarina
precursora y sus derivados presentaron reactividad muy semejante En las
condiciones de estudio para todos los compuestos se obtuvo un valor sobre el 90
indicando su poder de inactivacioacuten del radical resultado que superoacute al descrito en la
literatura para el estaacutendar Trolox
Estudios previos realizados en estructuras cumariacutenicas simples semejantes al
precursor 1 de esta investigacioacuten permiten comparar algunos resultados Peacuterez-Cruz y
colaboradores150
indican un 29 de inactivacioacuten para el derivado monohidroxilado de
la cumarina 1 diferencia que puede explicarse por la ausencia del ndashOH en posicioacuten 8
que aumenta su actividad El compuesto con grupos ndashOH en posicioacuten 6 y 7 presentoacute
un apagamiento del 51 Figueroa y colaboradores presentan tambieacuten un estudio en
que las cumarinas monohidroxiladas presentan valores de 23 y 56 de la
inactivacioacuten del radical OH corroborando lo encontrado anteriormente151
Resultados y discusioacuten
94
Tabla 56 Porcentajes de inactivacioacuten del radical hidroxilo (OHmiddot)
Compuesto de inactivacioacuten bullOH
(plusmnSD)
1 923 plusmn 74
2 983 plusmn 27
3 995 plusmn 08
4 927 plusmn 29
9 981 plusmn 18
10 982 plusmn 25
11 980 plusmn 99
Trolox 31plusmn 25a
aRef149 Figueroa R et al Future Med Chem 2013
Los resultados obtenidos con esta teacutecnica indican la reactividad relativa que tienen los
compuestos propuestos frente al radical OH Al considerar que el tiempo de vida del
radical hidroxilo y del spin trap DMPO es del orden de 10-9
s se observa que todos los
compuestos ensayados tuvieron la capacidad de competir con el DMPO en el proceso
de inactivacioacuten del radical evidenciado por la sentildeal de control que disminuyoacute casi en
su totalidad para todos los casos siendo menor en la cumarina precursora 1 y el aacutecido
4 siguiendo ambos compuestos la misma tendencia que se observara en los ensayos
Resultados y discusioacuten
95
anteriores Independientemente que el radical ensayado en este experimento es de una
alta reactividad y escasa selectividad el hecho de que se obtuvieran altos valores de
actividad para los compuestos propuestos indica que eacutestos se presentan como buenos
candidatos como inactivadores de la especie OH
Finalmente se observa que los derivados 9 10 y 11 presentaron un valor de
reactividad superior al de la cumarina precursora obtenieacutendose de esta forma un
aporte a la reactividad en cada nueva estructura propuesta frente al heterociclo de
partida 1 para este ensayo En cuanto a la reactividad relativa de la serie no se
encontroacute una diferencia significativa entre los compuestos ensayados precursores y
derivados mostraron valores cercanos en cuanto al de inactivacioacuten del radical
alrededor del 90
Resultados y discusioacuten
96
544 Estudio de reactividad frente al anioacuten radical superoacutexido O2-
Dentro de las diversas aplicaciones desarrolladas para las teacutecnicas electroquiacutemicas se
encuentran los ensayos de determinacioacuten de la capacidad antioxidante en distintos
medios152
y en muestras como bebidas153
vegetales154
mediciones in situ sobre piel
humana155
por mencionar algunos ejemplos Un reciente review (Pisoschi y
colaboradores 2015) describe las contribuciones realizadas con respecto a la
determinacioacuten de actividad antioxidante empleando exitosamente la voltametriacutea
ciacuteclica voltametriacutea de pulso diferencial voltametriacutea de onda cuadrada amperometriacutea
y potenciometriacutea156
las que ademaacutes se complementan con otras teacutecnicas en este tipo
de estudios157158
En esta parte de la investigacioacuten se determinoacute la reactividad de los compuestos frente
al anioacuten radical superoacutexido cuya generacioacuten electroquiacutemica en la superficie del
electrodo por reduccioacuten de oxiacutegeno disuelto mediante la teacutecnica de voltametriacutea ciacuteclica
ha sido ampliamente estudiada en nuestro grupo de trabajo159160110
y por otros
autores161
Como se esperaba tras la adicioacuten sucesiva de aliacutecuotas de todos los compuestos
estudiados hubo un decaimiento en la corriente de pico anoacutedica (Ipa0) (ejemplo del
resultado para el precursor 1 en la Figura 519) Esto permitioacute calcular el valor del
iacutendice antioxidante 50 (IA50) el cual se define como la concentracioacuten de sustrato
necesaria para obtener una disminucioacuten del 50 en la corriente Ipa0 Esta corriente es
Resultados y discusioacuten
97
directamente proporcional a la concentracioacuten de anioacuten superoacutexido presente por lo
que su disminucioacuten es un indicador de la capacidad del sustrato para inactivar la
especie radical generada in situ
Figura 519 Voltamogramas ciacuteclicos del par redox correspondiente al anioacuten
superoacutexido tras antildeadir aliacutecuotas del compuesto 1 DMF + HFFTBA 02 M 01 Vs
Tras obtener los voltamogramas ciacuteclicos para cada compuesto se procedioacute a
determinar el paraacutemetro adimensional (Ipa0-Ipa
SIpa
0) y se graficoacute con respecto a la
concentracioacuten de sustrato en solucioacuten (Figura 520) obtenieacutendose relaciones de tipo
lineal en que los valores del coeficiente de correlacioacuten r estuvieron entre 099777 y
097267
-10 -08 -06 -04 -02
Ipa0
10A
blanco
0049 mM
0099 mM
0149 mM
0199 mM
0249 mM
0299 mM
E vs Ag|AgCl V
Resultados y discusioacuten
98
007 014 021 02800
03
06
09
r = 099074
IA 50
(Ip
a0-
Ipa
S)
Ip
a0
Concentracioacuten mM
Figura 520 Graacutefica del paraacutemetro adimensional (Ipa0-Ipa
SIpa
0) vs concentracioacuten de
sustrato para el compuesto 1 (Destacado en verde el valor de IA50)
Junto con el valor de concentracioacuten IA50 la pendiente de las rectas entrega tambieacuten
informacioacuten con respecto a la reactividad de los compuestos frente al anioacuten
superoacutexido donde un mayor valor de la pendiente indica que el compuesto posee una
mayor actividad no obstante los autores que desarrollaron el meacutetodo hacen notar que
se utiliza preferentemente el iacutendice IA50 como valor para caracterizar de manera
adecuada la actividad de los compuestos propuestos frente el radical de forma
anaacuteloga al concepto de IC50 (concentracioacuten inhibitoria aplicada en sistemas
bioloacutegicos en relacioacuten a la cantidad de compuesto necesario para inhibir en un 50 el
crecimiento de una poblacioacuten de microorganismos)
Como se observa en los resultados (Tabla 57) la cumarina de partida 1 presenta un
valor mayor de IA50 (0187 mM) en comparacioacuten con los compuestos hiacutebridos 9 10 y
Resultados y discusioacuten
99
11 por lo que la adicioacuten de los fenoles a la estructura cumariacutenica fue un aporte a su
reactividad frente a la especie radical O2-
Tabla 57Valores de IA50 obtenidos para los compuestos estudiados
a Valor de estaacutendar Tolox ref 92
El derivado de aacutecido gaacutelico 10 presentoacute el menor valor de iacutendice antioxidante y por
consiguiente fue el mejor inactivador del anioacuten superoacutexido formado en la superficie
del electrodo puesto que se necesita una menor concentracioacuten de este derivado
(0064 mM) para apagar el 50 radical Junto con esto fue el compuesto que presentoacute
el fenoacutemeno de sinergia dentro de la serie con un valor de concentracioacuten menor
Compuesto IA 50 mM
(plusmnSD)
1 0183 plusmn 0007
2 0125 plusmn 0006
3 0104 plusmn 0004
4 0115 plusmn 0005
9 0141 plusmn 0011
10 0064 plusmn 0004
11 0137 plusmn 0002
Troloxa
197
Resultados y discusioacuten
100
requerida para inactivar el radical con respecto a cada uno de sus precursores (1 y 3)
El segundo mejor inactivador de O2-
fue el compuesto 11 con un valor de IA50 de
0137 mM y finalmente se tiene al derivado 9 con 0141 mM Este comportamiento
puede deberse a fenoacutemenos de difusioacuten de las moleacuteculas en el medio junto con su
reactividad en la superficie del electrodo
En este ensayo frente al radical O2-
al igual que el anterior (inactivacioacuten de la especie
OHbull) se pudo obtener informacioacuten con respecto al comportamiento de los
compuestos en un medio aproacutetico resultados que son de intereacutes ya que se pueden
considerar como una aproximacioacuten quiacutemica de tipo in vitro de los conocidos
fenoacutemenos de estreacutes oxidativo que ocurren en estructuras como las bio-membranas
donde participan especies reactivas oxigenadas161162
Finalmente se puede establecer un orden estimativo para la actividad de los derivados
y la cumarina 10 gt 3 gt 4 gt 2 gt 11 gt 9 gt 1 Todos los compuestos ensayados tuvieron
una reactividad superior al estaacutendar Trolox
Resultados y discusioacuten
101
545 Determinacioacuten de capacidad antioxidante celular (CAC)
Con el objeto de abordar los fenoacutemenos que involucran especies radicalarias
presentes en sistemas vivos se procede a realizar el estudio de la capacidad
antioxidante de los compuestos en un modelo bioloacutegico simple En este experimento
se utiliza la sonda DCFH-DA la cual difunde pasivamente a traveacutes de la membrana
celular al ingresar al citosol se transforma en el compuesto DCFH (no fluorescente)
que emite al entrar en contacto con especies oxidantes del tipo EROs y ERNs En los
experimentos realizados las ceacutelulas fueron estresadas mediante el compuesto ABAP
(generador de radical peroxilo) y se observoacute coacutemo los nuevos derivados en estudio
podiacutean contrarrestar este evento oxidativo al interior de la ceacutelula Los resultados
obtenidos se resumen en la Tabla 58
Los valores experimentales obtenidos en esta etapa indicaron una bio-disponibilidad
baja con una CAC menor al 50 para los nuevos compuestos 9 10 y 11 ademaacutes en
todos los casos se encontroacute un porcentaje menor de CAC de los derivados respecto a
los precursores respectivos 1 2 3 y 4 Para una concentracioacuten de 10 microM de
compuesto se obtuvieron valores muy semejantes (alrededor del 70) para los
precursores ensayados
Resultados y discusioacuten
102
Tabla 58 Valores obtenidos para la capacidad antioxidante celular (CAC)
concentraciones 1 microM y 10 microM de cada compuesto
Compuesto CAC 1 microM CAC 10 microM
1 696plusmn 50 727plusmn 13
2 730plusmn 26 739plusmn 07
3 662plusmn 19 701plusmn 01
4 477plusmn 25 665plusmn 26
9 381plusmn 55 499plusmn 66
10 178plusmn 45 395plusmn 128
11 345plusmn 31 234plusmn 108
En los resultados anteriores llaman la atencioacuten los bajos valores obtenidos en el
ensayo de CAC para los derivados polifenoacutelicos en comparacioacuten con los ensayos
realizados en sistemas no bioloacutegicos en que se obtuvieron buenos resultados en ellos
se pudo apreciar el fenoacutemeno de sinergia (en algunos casos) y un incremento en la
actividad de todos los derivados frente a la cumarina precursora de forma individual
Para explicar este comportamiento y complementar estos resultados se procedioacute a
seleccionar de manera racional los tres derivados obtenidos 9 10 y 11 y se determinoacute
su Hidrofobicidad Relativa en conjunto con el precursor cumariacutenico 1 (el cual
presentoacute valores de CAC alrededor del 70 cercano a lo obtenido en los precursores
Resultados y discusioacuten
103
aacutecidos) ensayo que entrega informacioacuten con respecto a la lipofilia relativa de la serie
(en funcioacuten de tiempos de retencioacuten) pudiendo dar respuesta al fenoacutemeno observado
555 Estudio de hidrofobicidad relativa
En el estudio de nuevos compuestos disentildeados como potenciales faacutermacos una de las
propiedades fisicoquiacutemicas de intereacutes es la lipofilia valor que puede determinarse
mediante distintos meacutetodos electroforesis capilar cromatografiacutea liacutequida de alta
resolucioacuten (HPLC) y determinando el coeficiente de particioacuten aguaoctanol entre
otras Junto con la metodologiacutea empiacuterica se han desarrollado diversas herramientas
computacionales con softwares que permiten calcular el valor para logP y logD
obtenieacutendose buenas correlaciones entre compuestos de una familia de estructuras
semejantes en los que se realizan variaciones a su esqueleto Los valores asiacute
calculados y entregados por el programa se consideran de una confiabilidad
razonable163
En el caso de este estudio se determinoacute la lipofilia relativa para los derivados 9 10 y
11 junto con el precursor 1 mediante HPLC en fase reversa donde se espera obtener
una serie relativa de tiempos de retencioacuten entre los compuestos que deacute cuenta de su
lipofilia Se utilizoacute esta teacutecnica por tratarse de una medicioacuten simple raacutepida y
ampliamente descrita en la literatura para nuevos compuestos en que la fase
estacionaria de la columna C18 simula la fase no polar y la fase moacutevil es la fase
Resultados y discusioacuten
104
acuosa asiacute a traveacutes de la columna se llevan a cabo muacuteltiples equilibrios de particioacuten
entre la fase acuosa y orgaacutenica En la medida en que el compuesto analizado sea maacutes
afiacuten a la fase estacionaria (relacionado con un mayor tiempo de retencioacuten) eacuteste seraacute
maacutes lipofiacutelico y viceversa Los resultados (Tabla 59) muestran que de acuerdo a los
tiempos de retencioacuten obtenidos (5138 5760 4031 y 4695 minutos) el orden
relativo de lipofilia fue el siguiente
Tabla 59 Valores obtenidos para el tiempo de retencioacuten experimental de los
compuestos
Compuesto Tiempo de retencioacuten
(min)
1 5138
9 5760
10 4031
11 4695
La Figura 521 indica el orden de lipofilia relativa encontrada para los derivados y su
precursor cumariacutenico En forma general se observaron valores de tiempo de
retencioacuten cercanos Se aprecioacute que el derivado de aacutecido cafeico 9 fue el compuesto
que encabezoacute la serie lo que se puede explicar debido a la presencia de un doble
enlace en su estructura confirieacutendole mayor apolaridad (por tanto hidrofobicidad) a
Resultados y discusioacuten
105
O
OH
HO O
Cl
O
OH
OH O
OH
OH
O
O
OHO O
O
O
OH
OH
OH
OH
OHO O
O
OOH
OH
OH
la moleacutecula El segundo en la serie fue el compuesto clorado 1 en el cual el
sustituyente haloacutegeno es un aporte a la lipofilia del compuesto En el caso de las
estructuras 10 y 11 se encontroacute que el derivado de aacutecido gaacutelico presentoacute el menor
valor relativo debido a la presencia de un grupo ndashOH adicional en el anillo aromaacutetico
que como se esperaba tuvo la mayor tendencia hidrofiacutelica
9 1 11 10
Figura 521 Hidrofobicidad relativa de los derivados y la cumarina precursora
Para complementar este resultado experimental se realizoacute el caacutelculo teoacuterico para el
valor de logD mediante herramienta Marvin Sketch del software libre ChemAxon164
y
se establecioacute su correlacioacuten con el valor experimental obtenido para CAC en
concentracioacuten 10 microM El resultado de esta correlacioacuten se presenta en la Figura 522
Aumento de la lipofilia = aumento en el tiempo de retencioacuten
Resultados y discusioacuten
106
Figura 522 Correlacioacuten entre el valor de logD teoacuterico y CAC experimental a
10 microM de cada compuesto El valor logD se obtuvo a traveacutes de la herramienta Marvin
Sketch del software ChemAxon164
Considerando estos resultados para este modelo experimental propuesto en el ensayo
de CAC se observa que la lipofilia no seriacutea el uacutenico factor relacionado con los bajos
valores de capacidad antioxidante celular (CAC) obtenidos para los compuestos 9 10
y 11 ya que por ejemplo la cumarina 1 presentoacute valores de CAC sobre el 70 y fue
el segundo compuesto de la serie de hidrofobicidad relativa experimental con un
valor cercano de tiempo de retencioacuten al derivado 9 (el cual tuvo valores de CAC bajo
el 50) De igual forma se aprecia la misma tendencia al correlacionar el valor de
CAC con el logD teoacuterico donde el compuesto 1 independientemente de tener una
lipofilia semejante a los derivados polifenoacutelicos (al igual que en la serie de tiempos
de retencioacuten) siacute mostroacute una biodisponibilidad superior a los derivados y muy
-3 -2 -1 0 1 2 3 4
20
40
60
80
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
OOH
HO O
Cl
OHO O
O
OOH
OH
OH
OOH
OH O
OH
OH
O
O
logDteor
C
AC
(1
0
32
4
Resultados y discusioacuten
107
semejante a los aacutecidos benzoicos (2 3 y 4) los cuales muestran valores negativos de
logD debido a su menor lipofilia
Por tratarse de un sistema bioloacutegico (ceacutelulas epiteliales) con muacuteltiples variables que
afectan la actividad de los compuestos estudiados se pueden considerar diversos
factores presentes en el medio ensayado que pueden dar respuesta al fenoacutemeno
observado Uno de ellos es la estructura de la membrana celular que contiene diversas
estructuras como por ejemplo el citocromo P (CYP) que es un complejo enzimaacutetico
involucrado en el metabolismo de faacutermacos siacutentesis de biomoleacuteculas y diversas
biotransformaciones de moleacuteculas a nivel celular165
Otro factor presente es la
existencia de enzimas hidroliacuteticas en el citosol celular como es el caso especiacutefico de
las carboxilesterasas (presentes en ceacutelulas epiteliales de intestino hiCE y otros
oacuterganos) las cuales son capaces de escindir diversos grupos funcionales tales como
amidas eacutesteres carbamatos y convertirlos en sus respectivos precursores (alcohol y
aacutecido) 166
Considerando que para este experimento en un modelo bioloacutegico in vitro simple se
emplearon ceacutelulas epiteliales de intestino (EAhy 926 (ATCC CRL-2922)) es posible
que el comportamiento observado se deba a la existencia de diversos fenoacutemenos e
interacciones posibles de los compuestos tanto a nivel de membrana como de
citoplasma Cabe destacar que al comparar las experiencias realizadas en un medio no
bioloacutegico los resultados en este caso se invierten al emplear una metodologiacutea que
involucra un medio bioloacutegico No necesariamente se encuentra un comportamiento
Resultados y discusioacuten
108
anaacutelogo en ambos medios de ensayo debido a la mayor complejidad y variables
asociadas a un sistema que involucra estructuras vivas independientemente de la
simplicidad o lo acotado del mismo
556 Estudios Teoacutericos optimizacioacuten de estructuras y determinacioacuten del Iacutendice
de Fukui
Con el objeto de racionalizar el estudio realizado y poder discriminar entre los
distintos sitios reactivos de los derivados se determinoacute el iacutendice de Fukui fk0
relacionado con un ataque de tipo radicalario Baacutesicamente es el promedio
correspondiente a las reacciones de ataque nucleofiacutelico fk- y electrofiacutelico fk
+(Ecuacioacuten
57) como se describe en el trabajo de Aliaga y Lissi donde se aborda el estudio
teoacuterico y experimental que compara la actividad anti-radicalaria de los polifenoles
rutina y quercetina167
1198911198960 =
119891119896minus+ 119891119896
+
2 Ecuacioacuten 57
Este iacutendice es un descriptor de reactividad local en los aacutetomos de oxiacutegeno que
participan en las reacciones de los grupos catecol presentes Este tipo de anaacutelisis
resulta adecuado para determinar los sitios de reaccioacuten preferentes en moleacuteculas
complejas con diversos centros reactivos168
Los resultados obtenidos indican que en
Resultados y discusioacuten
109
la cumarina precursora 1 el ataque radicalario ocurriraacute primero en el oxiacutegeno en
posicioacuten 7 debido al mayor valor de fk0
(0071) por otra parte no se observaron
cambios significativos en los valores de fk0 al formar parte de los derivados 10 y 11
para los aacutetomos de oxiacutegeno en posicioacuten 7 y 8 (aquellos involucrados en la capacidad
antioxidante de la moleacutecula) Al formar parte del derivado 9 si se observa una
disminucioacuten en su reactividad (fk0
O7 = 00078 y fk0
O8 = 00021) haciendo menos
probables estos dos sitios a un ataque radicalario en la moleacutecula (Tabla 510)
Los valores obtenidos para el iacutendice de Fukui indican que en el derivado 9 el sitio
maacutes probable para un ataque radicalario seraacute el catecol presente en el anillo benceacutenico
(proveniente del aacutecido cafeico) de preferencia en el oxiacutegeno en posicioacuten 4
(fk0
O4 = 00489) A diferencia del derivado de aacutecido cafeico en el caso de los
compuestos 10 y 11 el sitio preferente de reaccioacuten seraacute el anillo cumariacutenico
conservaacutendose el oxiacutegeno en posicioacuten 7 del heterociclo como sitio maacutes reactivo En
las Figuras 523 a 526 se presentan las estructuras optimizadas en 3D para el
precursor 1 y sus derivados polifenoacutelicos 9 10 y 11
Resultados y discusioacuten
110
Tabla 510 Valores de Iacutendice de Fukui fk para los compuestos en estudio
Compuesto Iacutendice de Fukui
fk0
Iacutendice de Fukui
fk-
O7 00771
O7 01373
O8 00391
O8 00757
O7 00078 O7 00072
O8 00021 O8 00036
O3 00389 O3 00779
O4 00489 O4 00890
O7 00719 O7 01276
O8 00365 O8 00716
O3 00025 O3 00050
O4 00025 O4 00049
O5 00002 O5 00004
O7 00739 O7 01316
O8 00378 O8 00742
O3 00004 O3 00008
O4 00003 O4 00005
OHO O
O
OOH
OH
OH
7
8
3
4
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
7
8
3
4
5
OOH
HO O
OH
OH
O
O
7
8
3
4
O
OH
HO O
Cl
7
8
Resultados y discusioacuten
111
OOH
OHO
Cl
Figura 523 Estructura optimizada en 3D para el precursor 1 utilizando DFT
OOH
OH O
OH
OH
O
O
Figura 524 Estructura optimizada en 3D para el derivado 9 utilizando DFT
Resultados y discusioacuten
112
Figura 525 Estructura optimizada en 3D para el derivado 10 utilizando DFT
OHO O
O
OOH
OH
OH
Figura 526 Estructura optimizada en 3D para el derivado 11 utilizando DFT
OHO O
O
OOH
OH
OH
OH
Resultados y discusioacuten
113
6 Discusioacuten General
Respecto del posible mecanismo de reaccioacuten electro-oxidativo se consideran las
siguientes evidencias teoacutericas y experimentales
En primer lugar como se esperaba los experimentos electroquiacutemicos de electro-
oxidacioacuten de los compuestos mostraron las sentildeales correspondientes a los grupos
ndashOH presentes en todas las estructuras Junto con esto los resultados de la graacutefica
Ipa vs vfrac12
indican la existencia de un proceso di-electroacutenico en los precursores y los
derivados (para la primera sentildeal oxidativa) lo que implica que comparten el mismo
mecanismo
Posteriormente se comproboacute la existencia de la especie radicalaria detectada mediante
oxidacioacuten electroquiacutemica seguida por resonancia de espiacuten electroacutenico con los
respectivos resultados de las simulaciones espectrales realizadas
En un siguiente punto se determinaron los valores teoacutericos de reactividad local
encontrados mediante el caacutelculo del iacutendice de Fukui El valor de fkndash
permitioacute
identificar los lugares con mayor reactividad frente a un ataque electrofiacutelico por tanto
las zonas en la moleacutecula puntuales con un alto valor para este iacutendice tenderaacuten a ceder
electrones con mayor facilidad en un proceso oxidativo Las estructuras optimizadas
en 3D indican que las zonas en color celeste (Figuras 523-526) corresponden a
aquellas con mayor densidad electroacutenica y por tanto estaacuten maacutes propensas a ceder
Resultados y discusioacuten
114
electrones en un proceso oxidativo Las zonas color lila representan los sitios con
menor densidad electroacutenica Para el compuesto 1 los ndashOH en el heterociclo presentan
mayor densidad electroacutenica lo que se aprecia de igual forma en los derivados 10 y 11
mientras que la zona del anillo benceacutenico se presenta con una baja densidad
electroacutenica Un fenoacutemeno diferente se aprecia para el derivado 9 donde la mayor
densidad electroacutenica se aprecia en la estructura benceacutenica cuyos grupos ndashOH
presentan el mayor valor de fk-
Este resultado teoacuterico racional complementa lo observado en el experimento descrito
con REE y electro-oxidacioacuten conjunta ya que los valores para las constantes de
acoplamiento hiperfino obtenidas en cada caso tambieacuten sentildealaron en cuaacutel de los dos
catecoles presentes ocurre la formacioacuten de la especie radical y por ende doacutende se
inicia el proceso de oxidacioacuten resultados corroboradas con el estudio teoacuterico
realizado De esta forma para el derivado 9 el proceso oxidativo se inicia en los -OH
ubicados en posicioacuten 3 y 4 que presentaron valores de fkndash
00779 y 00890
respectivamente y cuyas constantes de acoplamiento hiperfino son coherentes con
una interaccioacuten que involucra tres protones aquellos ubicados en las posiciones 2 5 y
6 del anillo benceacutenico El mismo anaacutelisis realizado para las estructuras 10 y 11 indica
que el proceso oxidativo ocurre primero en el anillo de la cumarina en los -OH en
posicioacuten 7 y 8 con valores del descriptor de reactividad local fkndash de 01276 y 00716
respectivamente para el derivado de aacutecido gaacutelico y en el caso del derivado de aacutecido
protocateacutequico con fkndash 01316 y 00742 para los oxiacutegenos en posicioacuten 7 y 8 De igual
forma los valores para las constantes de acoplamiento fueron consistentes con esta
Resultados y discusioacuten
115
informacioacuten experimental evidenciando la interaccioacuten entre dos protones (aquellos en
posicioacuten 5 y 6 del heterociclo cumariacutenico)
Esta diferencia encontrada para el proceso electro-oxidativo entre los derivados se
puede explicar debido a la existencia de un doble enlace conjugado adicional presente
soacutelo en el compuesto 9 derivado del aacutecido cafeico (ausente en 10 y 11) el cual le
confiere mayor deslocalizacioacuten (estabilidad) al radical que se forma como
intermediario en el proceso oxidativo
Los estudios presentes en la literatura sobre la oxidacioacuten de estructuras polifenoacutelicas
en medio aproacutetico presentan evidencias tanto teoacutericas como empiacutericas que ampliacutean la
visioacuten sobre la complejidad y posibilidades mecaniacutesticas en la oxidacioacuten de
estructuras polifenoacutelicas Basadas en modelos de naturaleza bioloacutegica como el
Fotosistema II presente en estructuras vegetales y otros ejemplos se plantea que una
viacutea de oxidacioacuten factible es a traveacutes de un mecanismo de tipo concertado donde se
obtiene el radical fenoxil (ArObull) en un paso directo en que el protoacuten y el electroacuten se
transfieren de manera conjunta (Figura 61 destacado en rojo) planteamiento que
considera factores de tipo energeacutetico a diferencia de los estudios claacutesicos con respecto
a este proceso seguacuten el cual la electro-oxidacioacuten se inicia con la peacuterdida de 1ē (etapa
electroquiacutemica) para formar el catioacuten radical(ArObull+) seguido de la peacuterdida de un
H+(etapa quiacutemica) para formar el radical fenoxil (ArObull) (Figura 62)
En el caso de los compuestos estudiados en esta investigacioacuten los valores de la
pendiente de Tafel encontrados para los compuestos (sobre 88 mVdec) sugieren que
Resultados y discusioacuten
116
el mecanismo de electro-oxidativo que maacutes se ajusta a la evidencia experimental es
por etapas
OH
HO
OH
HO
O
HO
O-
HO
-e- + B
+e- + HB+
+ B-e-
+e-
+e-
-e-
+ HB+
+ B
+HB+
Figura 61 Esquema de reaccioacuten para un mecanismo concertado de electro-
oxidacioacuten fenoacutelica Adaptacioacuten referencia 120
OH
HO - e
+ e
OH
HO
-H+
O
HO
Figura 62 Esquema de reaccioacuten para estructuras fenoacutelicas mecanismo electro-
oxidativo en etapas
Resultados y discusioacuten
117
Con respecto a los ensayos de actividad antioxidante realizados la Tabla 61 permite
comparar y estimar en conjunto los resultados obtenidos a traveacutes de las diferentes
metodologiacuteas empleadas
En forma general los resultados indican que la sustitucioacuten propuesta en esta
investigacioacuten en la cumarina dihidroxilada (utilizada como esqueleto de partida) con
distintas estructuras polifenoacutelicas entregoacute resultados positivos en cuanto al aporte
que los nuevos derivados obtenidos presentaron frente a la inactivacioacuten de especies
radicalarias tales como O2- ROO˙ OH˙ y su capacidad reductora (reflejada en el
ensayo FRAP) Para los ensayos realizados en un modelo no bioloacutegico se obtuvieron
valores de actividad en los derivados que superaron a los obtenidos para el precursor
cumariacutenico de forma individual
Cabe mencionar que en los diferentes ensayos y sus resultados se mencionan los
conceptos de reactividad y actividad de los compuestos En el caso de los ensayos
ORAC-FL y FRAP se habla soacutelo de actividad antioxidante ya que con la informacioacuten
que entregan no se puede determinar cuaacutel de los distintos grupos ndashOH presente en la
moleacutecula es el que reacciona primero Diferente es lo que ocurre en el ensayo frente
al radical hidroxilo en que se establece una competencia entre el atrapador (DMPO) y
el compuesto por inactivar al OHbull debido a que ambos tienen una vida media corta
(10-9
s) por tanto la reaccioacuten entre el antioxidante y el radical es raacutepida y el ndashOH maacutes
reactivo de la moleacutecula es el que inactiva a la especie y se puede mencionar como
reactividad Lo mismo ocurre para el ensayo frente al anioacuten radical superoacutexido en que
tambieacuten se mencionan los resultados como reactividad frente al radical
Resultados y discusioacuten
118
Tabla 61 Cuadro comparativo de los resultados en la determinacioacuten de capacidad
antioxidante para la cumarina y sus derivados
Compuesto ORAC-FL
FRAP
eq Trolox
10 microM
inactivacioacuten
OHmiddot
CAC
1 microM 10 microM
O2-
IA 50 mM
1 091 plusmn 003 1302plusmn 160 923 plusmn 74 696 plusmn 50 727 plusmn 13 0183plusmn0007
2 347 plusmn 010 2727 plusmn 321 983 plusmn 27 730plusmn 26 739plusmn07 0125 plusmn 0006
3 391 plusmn 009 4768 plusmn 215 995 plusmn 08 662plusmn 19 701plusmn01 0104 plusmn 0004
4 069 plusmn 001 868 plusmn 93 927 plusmn 29 477plusmn 25 665plusmn26 0115 plusmn 0005
9 239plusmn0027 2052 plusmn151 981 plusmn 18 381plusmn55 499 plusmn 66 0141plusmn0011
10 174 plusmn 005 28046plusmn188 982 plusmn 25 178plusmn45 395 plusmn128 0064plusmn0004
11 262 plusmn 004 2624 plusmn 236 980 plusmn 99 345plusmn31 234 plusmn 108 0137plusmn0002
Por otra parte en los ensayos ORAC-FL y FRAP se observoacute que los valores de
actividad para los aacutecidos cafeico 2 y gaacutelico 3 fueron superiores a los obtenidos para
sus derivados hiacutebridos 9 y 10 respectivamente En el ensayo frente al anioacuten
superoacutexido se encontroacute que los aacutecidos cafeico 2 y protocateacutequico 4 presentaron
resultados superiores en cuanto a reactividad que sus respectivos derivados hiacutebridos 9
y 11
Resultados y discusioacuten
119
En la literatura se encuentra la caracterizacioacuten de los aacutecidos benzoicos y otros
antioxidantes polifenoacutelicos naturales como moleacuteculas altamente polares lo que en
algunos limita su uso en medios como bio-membranas emulsiones y micelas por lo
que la formacioacuten de sus derivados eacutesteres se utiliza como una estrategia para
aumentar su lipofilia y por lo tanto la biodisponibilidad de estos compuestos en
medios no acuosos169170
investigacioacuten que ha dado origen a la formulacioacuten de los
denominados ldquoantioxidantes lipofiacutelicosrdquo171172
los que han demostrado ser eficientes
como antioxidantes en bio-membranas resultados que se describen en el trabajo
realizado por Tai y colaboradores donde se ensayaron eacutesteres de aacutecido vainilliacutenico
que ademaacutes de presentar buenos valores de iacutendice ORAC-FL inhibieron el proceso
de hemoacutelisis en eritrocitos de mamiacutefero173
Junto con lo anterior estaacute descrita la relacioacuten existente entre la estructura de los
aacutecidos benzoicos y su actividad antioxidante la que es atribuida a diversas
caracteriacutesticas presentes en su esqueleto tales como i) nuacutemero y posicioacuten de grupos ndash
OH en la moleacutecula ii) sustituyentes alcoxilo en posicioacuten orto al ndashOH iii) presencia
de grupos -COOH -COOR -CH=CH-CH2-174
Al apreciar las estructuras de los
derivados propuestos se infiere que las diferencias encontradas en la actividad de los
aacutecidos antes y despueacutes de la unioacuten a la cumarina estaacuten relacionadas con dicha
sustitucioacuten En el caso del aacutecido gaacutelico que presenta un valor de ORAC de 391 frente
a un valor de 174 para su derivado 10 y en el ensayo FRAP se encontroacute un valor de
4768 vs un 3182 para el hiacutebrido se puede sentildealar que no se aprecioacute un aumento de
Resultados y discusioacuten
120
actividad antioxidante para los eacutesteres con respecto al aacutecido del que provienen seguacuten
con lo descrito por algunos autores175176
Junto con lo anterior se forma un eacutester de
aacutecido gaacutelico con un sustituyente voluminoso (la estructura cumariacutenica) pudiendo
disminuir la coplanaridad en el sistema aromaacuteticocarbonilo lo que implica una menor
estabilizacioacuten del radical formado en la reaccioacuten frente a la especie ROObull para el
ensayo ORAC-FL y la capacidad reductora en el ensayo FRAP Otro punto a
considerar es que para este derivado se observa el fenoacutemeno mencionado por Rice-
Evans175
y otros autores con respecto a que un nuacutemero mayor de grupos ndashOH en el
anillo benceacutenico no implica necesariamente un aumento en la actividad antioxidante
de un derivado polifenoacutelico
Para el caso observado en el aacutecido cafeico y su derivado 9 se aprecia el mismo
fenoacutemeno de disminucioacuten de actividad del aacutecido 2 frente al eacutester como lo descrito
para el aacutecido gaacutelico y su derivado en los ensayos ORAC-FL y FRAP con la
diferencia que esta disminucioacuten no es tan draacutestica lo que se atribuye a la presencia del
doble enlace en la estructura que confiere mayor estabilidad por resonancia al radical
formado
El valor de reactividad local del iacutendice de Fukui fk0
-relacionado con los fenoacutemenos
de ataque radicalario- entregoacute informacioacuten con respecto a los sitios de los derivados
donde la actividad anti-radicalaria es maacutes probable Asiacute para el compuesto 9 esta
actividad ocurre en el anillo benceacutenico en primer lugar y posteriormente en la
cumarina Para los derivados 10 y 11 la mayor probabilidad de que se produzca el
Resultados y discusioacuten
121
ataque radicalario es en el heterociclo cumariacutenico y posteriormente en el catecol del
anillo benceacutenico Estos resultados corroboran con los valores experimentales y las
simulaciones realizadas en espectroscopia de resonancia electroacutenica de espiacuten (REE)
donde la actividad antioxidante del compuesto 9 ocurre con mayor probabilidad en el
anillo benceacutenico proveniente de la fraccioacuten del aacutecido cafeico (donde se encuentra el
doble enlace que le confiere mayor estabilidad al radical formado como intermediario
de reaccioacuten) mientras que en los derivados 10 y 11 esta actividad ocurre en el
heterociclo cumariacutenico
Se observa que los resultados de capacidad antioxidante para los derivados
polifenoacutelicos variaron entre un meacutetodo y otro no hubo correlacioacuten entre los valores
obtenidos en la capacidad antioxidante obtenidos en las distintas metodologiacuteas Este
resultado concuerda con lo esperado ya que cada experiencia realizada implica una
especie radicalaria diferente y cada una de ellas posee reactividades distintas (t12 O2-
del orden de los ms t12 OHbull ~ 10-9
s t12 ROObull ~ 10 ms) Para cada ensayo se
obtuvo un distinto orden relativo de reactividad entre los derivados y sus precursores
Se establece la relacioacuten entre el potencial Eonset y los resultados obtenidos en el
ensayo de capacidad antioxidante frente a anioacuten superoacutexido realizado en medio
aproacutetico (Figura 63) Para el ensayo de reactividad frente a O2-
se puede establecer
una correlacioacuten donde una disminucioacuten en el potencial de oxidacioacuten disminuye el
valor de IA50 para 5 de los 7 compuestos estudiados Por tanto a medida que el
Resultados y discusioacuten
122
potencial se hace menos positivo aumenta la reactividad de los compuestos frente al
anioacuten superoacutexido presentaacutendose una relacioacuten entre actividad antioxidante y Eonset
para este ensayo
Figura 63 Correlacioacuten entre el potencial de oxidacioacuten Eonset y los ensayos frente a
anioacuten superoacutexido
Un menor potencial de oxidacioacuten para los grupos ndashOH presentes en los compuestos
implica una mayor facilidad para oxidarse (por ende una mayor densidad de carga
electroacutenica para ceder) y por tanto un incremento en la capacidad antioxidante para
este ensayo
Se puede observar que el compuesto 4 (aacutecido protocateacutequico) posee un valor de IA50
de 0115 mM el cual se encuentra entre los valores encontrados para el aacutecido cafeico
y el aacutecido gaacutelico pero su valor de Eonset es mayor diferenciaacutendose de la tendencia
049 056 063 070 077
006
009
012
015
018
11
3
1
42
9
10
Eonset
vs Ag|AgCl V
IA50
mM
Resultados y discusioacuten
123
encontrada Junto con lo anterior el compuesto 4 presentoacute el menor valor para la
pendiente de Tafel (b = 88 mVdec) de toda la serie lo que sugiere una relacioacuten entre
el mecanismo de oxidacioacuten y la capacidad de reaccionar frente a la especie
radicalaria El compuesto 10 presentoacute el mejor valor para IA50 y tambieacuten se diferencia
de la serie de compuestos con respecto al Eonset (cercano al del compuesto 4) a
diferencia del aacutecido su pendiente de Tafel (b = 134 mVdec) indica la presencia de
dimerizaciones posteriores a la formacioacuten del radical fenoxil (y generacioacuten de
compuestos nuevos que tambieacuten pueden reaccionar con el radical) sugiriendo que
ademaacutes del mecanismo de oxidacioacuten hay otros factores que pueden influir como por
ejemplo la difusioacuten de las especies en el medio empleado
El estudio de los compuestos frente al radical hidroxilo reflejoacute que en las condiciones
experimentales empleadas los resultados fueron semejantes por cuanto los valores de
inactivacioacuten del radical en todos los casos fue sobre el 90 Debido a lo anterior se
descarta realizar la correlacioacuten con el potencial Eonset ya que no encontroacute una
diferencia significativa entre los compuestos
Finalmente al considerar los resultados obtenidos para la capacidad antioxidante
celular en un modelo bioloacutegico simple un punto a tener en cuenta es el hecho de que
esta metodologiacutea en particular adolece en cuanto a que es inespeciacutefica con respecto a
la cantidad de compuesto que ingresa en la ceacutelula ya que por las distintas lipofilias
observadas los compuestos tendraacuten una diferente capacidad de ingreso al medio y no
se puede determinar la relacioacuten existente entre la cantidad que ingresa a la ceacutelula
Resultados y discusioacuten
124
versus la reactividad Debido a lo anteriormente descrito estos resultados muestran
principalmente un reflejo de la capacidad de penetracioacuten que tienen los compuestos
hacia el interior de la ceacutelula
Un modo de abordar temaacuteticas de tipo multi-variable-donde se deben considerar
numerosos factores involucrados en un comportamiento o fenoacutemeno- es el empleo de
modelos teoacuterico-computacionales como QSAR (por su sigla en ingleacutes Quantitative
Structure-Activity Relationships) herramienta que se utiliza en la estimacioacuten de
propiedades bioloacutegicas y fisicoquiacutemicas de intereacutes en diversas moleacuteculas entre ellas
polifenoles177
El factor esteacuterico tiene un papel importante en los estudios realizados en medios
celulares siendo el tamantildeo molecular uno de los factores considerados en ensayos de
permeabilidad en futuros faacutermacos ya que un excesivo tamantildeo (entre otras cosas)
dificulta la solubilidad en medio acuoso asiacute como tambieacuten la difusioacuten pasiva de las
moleacuteculas163
Al observar el peso molecular de los compuestos derivados (entre
34427 gmol y 37031 gmol) se puede considerar que el efecto esteacuterico en este caso
no seriacutea la causa principal para el fenoacutemeno observado en el ensayo celular ya que
estaacute descrito que los compuestos no deberiacutean superar un peso de 500 gmol 163
_que no es el caso de estos derivados-
Los resultados obtenidos para este ensayo realizado en un modelo bioloacutegico simple
sugieren que la actividad de los derivados para reaccionar frente a especies
radicalarias podriacutea estar circunscrita a medios lipofiacutelicos como las membranas
Resultados y discusioacuten
125
bioloacutegicas estudio que se podriacutea profundizar empleando un modelo como el
descrito173
para estudiar procesos oxidativos en membranas de eritrocito
Conclusiones
126
7 Conclusiones
La teacutecnica de electro-oxidacioacuten complementada con espectroscopia de
resonancia de espiacuten electroacutenico (REE) resulta uacutetil para identificar especies
radicalarias como intermediarios de la reaccioacuten en este trabajo
La determinacioacuten del iacutendice de Fukui (fk-) en conjunto con los resultados de
resonancia de espiacuten electroacutenico permitieron discriminar los sitios de las
moleacuteculas donde se inicia el proceso oxidativo En el derivado 9 la oxidacioacuten
ocurre primero en el anillo benceacutenico y en los compuestos 10 y 11 el proceso
oxidativo ocurre primero en el heterociclo cumariacutenico
La inclusioacuten de las estructuras polifenoacutelicas al heterociclo cumariacutenico generoacute
un incremento en su capacidad antioxidante en los ensayos no bioloacutegicos
No se obtuvo correlacioacuten para los resultados de capacidad antioxidante entre
las distintas metodologiacuteas empleadas
Se establecioacute la correlacioacuten entre el valor de potencial de inicio de la reaccioacuten
electroquiacutemica (onset) y los resultados para el ensayo frente al anioacuten
superoacutexido A medida que el potencial se hace menos positivo aumenta la
reactividad de los compuestos lo que indica que la transferencia electroacutenica
estaacute involucrada en la etapa determinante de la velocidad
De acuerdo con los resultados de la teacutecnica CAC y la correlacioacuten tanto con la
hidrofobicidad relativa como con el logDteoacuterico la actividad de los derivados
Conclusiones
127
propuestos estaacute circunscrita a aquellos procesos oxidativos que tienen lugar en
medios lipofiacutelicos como por ejemplo membranas bioloacutegicas
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