La Fertilización Abstracta Es Uno Del Más Específico y Cuidadosamente Reguló Las Interacciones...

8/19/2019 La Fertilización Abstracta Es Uno Del Más Específico y Cuidadosamente Reguló Las Interacciones Del Célula

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La Fertilización abstracta es uno del más específco y cuidadosamente regulólas interacciones del célula-célula en el cuerpo animal y se determina a unamagnitud grande por la compatibilidad entre los ligand y moléculas delreceptor en la superfcie de cada gameto. En el pellucida de la zona (Z!" laacti#idad de receptor de esperma es asociada con el glycoproteins Z$ (el

receptor primario para la esperma acrosome-intacta! y Z% (el receptorsecundario para la esperma acrosome-reaccionada! pero se defnen bien susproteínas obligatorias complementarias en la esperma. &osotros repasamos lae#idencia para el proacrosin como un Z secundario la proteína obligatoria enesta comunicación. roacrosin'acrosin liga el non-enzymically al glycoproteinsde Z. Ligar es una interacción iónica uerte entre el polysulp)ate se agrupa enel glycoproteins de Z (probablemente en sus mitades del )idrato de carbono!y residuos básicos en la superfcie de proacrosin. El stereoc)emistry de losreactantes es crucial y determina a una magnitud grande la afnidad de ligar. Elmutagenesis sitio-dirigido y un análisis $*-estructural de +abalí y acrosin delcarnero )an identifcado % racimos de residuos básicos potencialmentein#olucrado ligando. ,n anticancer del polysulp)onated narcotizan" suramin" se)a mostrado ligar uertemente al proacrosin'acrosin e in)ibir esperma-)ue#oue liga en el #itro. En el modelo del ratón" %/0-Z% y $ 1-suramin ligan 2/3efcazmente al acrosin 4nulo4 la esperma ue para sal#a+e-teclear la esperma.&i Z% ni suramin ligan al acrosome la esperma intacta y pueden" porconsiguiente" sólo e+erza sus eectos después de la e5posición de los#ol6menes del acrosomal. En con+unto" esta combinación de datos biouímicos"genéticos y uncionales apoya la )ipótesis ue el proacrosin es una proteína delmultiunctional con un papel signifcante reteniendo la esperma acrosome-reaccionada muc)o tiempo en la superfcie de Z bastante para permitir a la

penetración de Z empezar. 7 %88% 9iencia de Else#ier 0rlanda :.;..


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ue ocurre entre los gametos )omólogos. *entro de este guión" los comple+osdel ligand-receptor presentan ob#iamente en la superfcie de esperma y )ue#o

+uegue un papel importante. 9omo resultado de una cantidad grande dein#estigación acumulado en la biología celular de ertilización en las especiesdierentes (para la re#isión >anagimac)i #en" ??@!" pueden #erse las

interacciones del esperma-)ue#o mamíero como una serie de pasossecuenciales. En el paradigma del ratón (Aassarman" ???!" un spermatozoonacrosome-intacto ue llega en la superfcie del Z reconoce y liga a un receptorprimario asociado con la mitad del )idrato de carbono B-unida de glycoproteinZ$ (Fig. !. Esta encuadernación es de afnidad sufciente retener elspermatozoon del motile en la superfcie del Z mientras permitiendoarracimarse de al mismo tiempo receptor-ligand comple+os ue inducene5ocytosis de la #esícula del acrosomal. El #entana+e e5tenso y pérdida de lagorra del acrosomal e5ponen la matriz del acrosomal y en el uturo lamembrana del acrosomal interna. En esta ase un segundo paso obligatoriotiene lugar entre el receptor secundario en el Z (el glycoprotein Z%! y unaproteína obligatoria dentro de la matriz del acrosomal y'o en la membrana delacrosomal interna. Ligar" sin embargo" no deben ser tan tenaces ue impide ala cabeza de esperma penetrar a tra#és del Z. En parte como resultado deuerzas del empu+ón generadas por el Cagellum del motile y en parte debido aun no identifcado 4el lyticliDe4 la acción" la cabeza de esperma penetra a tra#ésde los Z y accesos los peri#itilline espacian (edord" ??!. ;uí un tercerpaso obligatorio sucede ue posiblemente in#olucra integrin o receptores de9*? en el oolema (el al de et de Golinero." %888!. ;unue este cuadro parecebastante claro" la naturaleza del primero" las proteínas obligatorias secundariasy terciarias en los espermatozoos son muy contenciosas. ,na #ariedad anc)a

de candidatos se )a descrito (Gesa !" muc)os de ellos en el

el sistema del ratón e5clusi#amente. Hstos son sufcientemente dispares en suspropiedades plantear las preguntas importantes sobre cómo ellos se integranentre si con" incluso permitir la redundancia dentro del sistema como sugeridopor el reciente gen 4el DnocDout4 los e5perimentos. Los méritos relati#os deestos Z dierentes se )an discutido las proteínas obligatorias en #ariasre#isiones (GcLesDey" ??"I Aassarman" ???!. En esta comunicación uenosotros enocaremos en la e#idencia en el a#or de una proteína esperma-específca los proacrosin'acrosin llamados como una encuadernaciónsecundaria o molécula del ligand por retener la esperma acrosome-reaccionada

en la superfcie de la zona. ;unue el acrosin se )a considerado muc)o tiempocomo un lysin de la zona" la e#idencia para esto es menos con#incente uepre#iamente supuso (edord" ??! y debe considerarse a)ora como unaproteína del multiunctional. %. la e#idencia para el proacrosin'acrosin deesperma como una proteína Z-obligatoria Los e5perimentos iniciales paradescubrir Z las proteínas obligatorias en los espermatozoos eran basado en elprincipio de usar Z% y receptores de Z$ como las sondas identifcar sus


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proteínas obligatorias respecti#as en los e5tractos de espermatozoos. ara estepropósito" las proteínas detergente-solubles de la esperma del +abalí estabanseparadas por el :*:-JK0&;" desplegaron en un borrón Bccidental eincubaron con %/0-labelled cerdo el glycoproteins de Z. Estos e5perimentos"usando Zs del ollicular u o#uló los )ue#os" captación de orma consistente

re#elada por una proteína de esperma de Gr /$ D*a ue eran

el immunologically identifcado y biouímicamente como el proacrosin" loszymogen orman del acrosin de protease de serine (ones y roncea" ?MI

ones" ??"I ,rc) y atel" ??!. ;lguna encuadernación también se obser#ó aun grupo de proteínas de Gr ba+as en el plasma seminal" después identifcócomo una amilia de glycoproteins del #esiclederi#ed seminal conocido como elad)esins de esperma (el


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in#olucra el ucose y no es un lectin-como la interacción. En el cerdo" todas lastres clases de glycoproteins de Z son los sulp)ated en sus mitades del )idratode carbono (el &aDano et al." ??8! y todo el tres lazo al proacrosin. :inembargo" no se reuieren )idratos de carbono por el se por ligar e5cepto en lamedida en ue cuando ellos mantienen un armazón polimerico repetidor la

presentación de grupos del sulp)ate en la alineación del stereoc)emicalcorrecta. L. 1oQes" R. ones ' el eriódico de Reproducti e 0nmunología

;sí" algunos polímeros del sulp)ated (por e+emplo el ucoidan" sulp)ate delde5tran /88 S" el galactan" el poly#inylsulp)ate! es competidores uertes deZ-proacrosin ue liga considerando ue otros (por e+emplo el sulp)ates delc)ondroitin" )eparin! es los competidores muy débiles. /. ligando de grupos delsulp)ate reuiere la presentación correcta de residuos básicos positi#amentecobrados en la superfcie del proacrosin. La modifcación uímica de arginines"

lysines e )istidines con el p)enylglyo5al" diet)ylpyrocarbonate o el an)ídridodel citraconic abole la encuadernación completamente (el ansen et al." ??/!.Estos reacti#os" sin embargo" no son sitio-específcos" pero e5presandorecombinants de la tac)adura de proacrosin del +abalí en las bacterias él )asido posible identifcar un ragmento obligatorio mínimo representado por losresiduos @M a %M% (Fig. %!. :itio-dirigió mutagenesis de aminoácidosseleccionados dentro de este ragmento )a identifcado algunos de los residuoscríticos in#olucrados" como )istidine @MTarginine /8" / +unto con arginine%/8" lysine %/% y arginine %/$ (el ansen et al." ??!. :ignifcati#amente"sustituyendo un racimo de lysines (M$" M/"M2"MM! adyacente a )istidine @Mning6n eecto lle#a puesto ligando de Zs. Goreno y arros (%888! encuentreue un peptide sintético ue representa los residuos /? a M2 glycoprotein deZ in)ibidos ue ligan al proacrosin del +abalí" apuntando a un papel paraarginines 22T2MT)istidine 2?. En el acrosin del cone+o" Ric)ardson y B4Rand(??2! también dedu+o del mutagenesis estudia ue )istidine @M eraimportante para la encuadernación de Z. Los residuos anteriores" sin embargo"son improbables ser los 6nicos in#olucrados en polysulp)ate ue liga como elstoic)iometry de proacrosin-Z glycoprotein ligar no es conocido. 2. eldescubrimiento ue el suramin" un anticancer del sulp)onated narcotizan" esun competidor muy efcaz de proacrosin-Z ligar )a proporcionado las #isionesen los reuisitos del stereoc)emical de los grupos reaccionando (ones el al del

et." ??2!. ,&; propiedad signifcante de suramin es ue no penetra lasmembranas celulares y por consiguiente no liga a los espermatozoosacrosome-intactos. *esde ue es muy efcaz bloueando la ertilización en el#itro" parece probable ue ue act6a después de la acrosome-reacción ue )atenido lugar cuando los #ol6menes del acrosomal son e5puestos. &o tiene eleecto claro en la motilidad de esperma" ni induce la reacción del acrosome.:uramin es a)ora de interés considerable como una )erramienta por disecarlas interacciones del esperma-)ue#o mamíero. :us méritos principales sonN (i!


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es un compuesto de peso molecular peue=o (Gr @%8! con una composiciónuímica bien-defnidaI (el ii! tiene una estructura simétrica (Fig. $!" unapropiedad ue parece relacionado a su )abilidad de cruz-unirse las proteínasI(el iii! el sulp)onate se agrupa en el nap)t)alene terminal cerue lasestructuras son necesarias para la encuadernación de afnidad altaI y (el i#! un

n6mero grande de análogo se )a sintetizado (el entsc) et al." ?M!permitiendo in#estigar los rasgos estructurales dierentes. 9omo resultado deproteger / de estos análogo en el Z-proacrosin (el +abalí! ligando

ensaye" ue encontrado ue el compuesto del padre presentó el arreglo óptimo(ones el al del et." ??2!. la Reducción en el n6mero de sulp)onate terminal seagrupa o uita de cualuiera de los anillos aromáticos interiores causó unapérdida de acti#idad competiti#a. El struc-ture tridimensional de suramin eseso de un cuc)arón poco proundo o taza (el ;d)iDeso#alu et al." ?!

sugiriendo ue es la distancia entre los anillos de nap)t)alene de sulp)onatedterminales ue son el rasgo importante por ligar a" y cruz-uniéndose" lasproteínas. En el ni#el celular" el suramin está muy efcaz in)ibiendo laertilización en el #itro (ones el al del et." ??2!. M. 0mmunodetection deproacrosin'acrosin en la membrana del acrosomal interna y en los remanentesde la matriz del acrosomal ue sigue la reacción del acrosome se )ademostrado en el cone+o" marmota y cuy (el arros et al." ??%!. sobre todo" Enel cone+o podrían descubrirse los acrosin en %/3 de esperma recuperados delespacio del peri#itelline (el Ualdi#ia et al." ???!" incitando la especulación ueéstos pueden ser la esperma ue puede ligar a y ertilizar los )ue#os zona-intactos rescos (el Susan et al." ?@!. roacrosin se conoce bien para ser unin)erentemente 4pega+oso4 la molécula como él uiere

Fig. . ropuso a modelo de sucesión de e#entos durante esperma-)ue#o ueliga en los mamíeros. ,na esperma capacitada penetra a tra#és del oop)orusdel c6mulo y llega en la superfcie del pellucida de la zona (paso !. Laesperma acrosome-intacta liga a los receptores primarios (el glycoprotein Z$Nlos pasos % y $! siguió por la inducción de la acrosome-reacción (paso @!. Estoe5pone la matriz del acrosomal y en el uturo la membrana del acrosomalinterna. Ligando (paso /! se mantiene #ía un receptor de Z secundario (elglycoprotein Z%!. La esperma del motile empieza a penetrar a tra#és del Z y

en el uturo los accesos los peri#itelline espacian dónde liga a un receptorterciario (el integrin'9*?! en el oolemma (se reprodu+o de ones el al del et."??2!. Fig. %. la distribución Lineal de elemento esencial y los aminoácidosagrios en la sucesión primaria de proacrosin del +abalí. (:e reprodu+o del ansenet al." ??/!. Fig. @. la estructura de cristal


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ligue en general a las superfcies de #aso" liposomes y membranas celularesué induce la acti#ación del contacto (el arris) et al." ?MI Lo el Leggio et al."??@!. no está claro ué propiedad es responsable para esta tenacidad claracomo las parcelas del )ydropat)y no re#ele ning6n dominio del peptide)idróobo pronunciado (el aba et al." ??I El Slemm et al." ??8!. )ay

indicaciones uertes &o obstante" ue el proacrosin'acrosin tiene el potencialpara actuar como un 4el puente4 entre las células. $. los rasgos estructurales deproacrosin de esperma *ados la importancia de stereocompatibility entre elproacrosin de esperma ' el acrosin y el polysulp)ate se agrupa en elglycoproteins de Z por ligar" un análisis del crystallograp)ic de acrosin del

+abalí ue emprendido para determinar la orientación de la superfcie de losresiduos importantes arriba e5presado. *e %8 mg de proteína nati#aa#orablemente purifcada" se obtu#ieron cristales ue el diVracted a %. ,& yde estos datos las estructuras tridimensionales ueron obtenidas por el análisisdel reemplazo molecular (el


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del microscopio ligero. Fue encontrado ue O%/0PZ% límite al permeabilizedpero no a esperma acrosome-intacta ue está de acuerdo con lasobser#aciones por el leil et al. (?!. cuándo el permeabilized (T'T! y (W 'W!la esperma ue comparada" )ubo una 2/3 disminución en el n6mero de granoscolores de plata asociado con la cabeza de esperma acrosin-defciente. ,na

fgura similar se obtu#o para la captación de O$ 1Psuramin. Esto proporciona lae#idencia más uerte )asta a)ora ese proacrosin'acrosin es la molécula deligand de esperma mayor para el receptor de Z secundario" Z%. La cantidadpeue=a de ligar de O%/0PZ% al acrosin (W 'W! la esperma puede ser debida ados otros proteases del serine ue los componentes mayores del acrosome delratón son (el pariente a otras especies" la esperma del ratón es muy defcienteen el proacrosin!. El )ec)o ue Z% ue liga al acrosin (W 'W! la esperma estámuy reducida pero no abolió concurre con el )allazgo ue el acrosin (W 'W! laesperma es capaz de ertilizar los )ue#os" aunue con la efcacia reducida (elaba et al." ??@I El ;d)am et al." ??M!. &o obstante" la )abilidad deO%/0PZ% y O$ sondas de 1Psuramin para dierenciar entre el acrosin (T'T! y(W 'W! la esperma puede atribuirse a su afnidad por el proacrosin'acrosin. /. las9onclusiones )ay por consiguiente" ;ctualmente" razones buenas para creerue el proacrosin ' el acrosin tiene un papel como una molécula obligatoriasecundaria. Es efcazmente el targeted a su sitio de acción el descargosiguiente de la #esícula del acrosomal y de está presente en el momentoapropiado y pone para actuar recíprocamente con la superfcie de la zona.*ado los constre=imientos ísicos agregados ue las células del c6mulocircundantes lle#arán puesto los mo#imientos de esperma" la ormación deataduras iónicas entre el proacrosin'acrosin y glycoproteins de Z (en el ratón"específcamente Z%! sería de tenacidad sufciente impedir a la esperma

destacar. Esto permitiría tiempo la cabeza de esperma para comenzar lapenetración de la zona. La )abilidad del suramin de droga de ligar uertementeal proacrosin ' el acrosin e in)ibe esperma-zona ligando sugiere ue losmimetics seguros del compuesto tengan el potencial como agentes delantiertility si soltó cerca del sitio de ertilización" por e+emplo de 0,*s largo-suplente. ?8 L. 1oQes" R. ones ' el eriódico de Reproducti e 0nmunología /$(%88%! -?% Reconocimientos &osotros agradecemos el :R9 el apoyofnanciero. &osotros también agradecemos a o)n 9oadQell (0! para la ayudacon el modelado molecular y los numerosos colegas en el laboratorio y en otraparte uién )a contribuido a estos estudios durante #arios a=os.

%. ;R910UB

;crosin (9EE $.@.%.8! es proteinase del serine localizado en el acrosome deesperma y consideró +ugar un papel esencial en la ertilización. En contrastecon el mamíero" )ay sólo datos limitados acerca del acrosin del a#ian"principalmente enocado en la caracterización de enzima madura. En el estudio


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presente" el acrosin se aisló de espermatozoos del pa#o ue usan la fltraciónde gel en la presencia de @ urea de G al p1 agrio. &-término ue losseuencing de Edman permitieron a la identifcación de los primeros %2aminoácidos del &-términoN UUKK


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inmunológicas" de desarrollo" reproductores y neutras (el Xuesada et al." %88!.la Reproducción es uno de los procesos más disímil entre los pá+aros ymamíeros. :e encuentran dierencias m6ltiples en gen del proteasein#olucrado la ecundación y embrión saliendo del cascarón. Los


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nucleotide del c*&; duplicado también se inorma. :e describen característicasde )ysicoc)emical de acrosin del pa#o. Bcurriendo el in)ibidor del plasmaseminal naturalmente pueden controlar la acti#idad del acrosin potencialmenteba+o las condiciones fsiológicas. %. los materiales y métodos %.. los ;nimalesy probando el :emen era rutinariamente reunido por el masa+e abdominal (las

Gadrigueras y Xuinns" ?$M! de los pa#os (el gallopa#o de Geleagris! de ERBKrande-2 la línea (los a#os ,nidos británicos Limitaron" 9)ester" 0nglaterra!"durante la estación reproductor. :e mantu#ieron


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en el sistema de 1L9. El lyop)ilized racciona de acrosin se disol#ió en 8.3ácido del triCuoroacetic (


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incubaron a $M [9 para / min con el trypsin bo#ino en 8. G osato pulidor(p1 M.@! y entonces transfrió en una solución ue contiene un substrate delc)romogenic (el acetyl*L-p)enylalanine -W - el ester del nap)t)yl! para eltrypsin. :e guardaron las geles manc)adas en %3 ácido acético. Las zonas ueposeen la acti#idad in)ibitoria contra las enzimas escogidas aparecen como las

#endas del unstained en un ondo coloreado.

/. %.2. la determinación de sucesión del &-término de acrosin Los ragmentosconcentrados de acrosin después de ue se disol#ieron R9 en 1L9 grad6e elagua (:igma!. las Guestras eran )er#ido y su+etaron al :*:-JK0&; del tris-tricine (:c)agger y #on agoQ" ?M! y electroblotted )acia una membrana deU*F ue usa 8 mm $-(cyclo)e5ylamino!--propanesulonoic ácido-&aB1 (p1.8! conteniendo 83 metanol. La membrana se manc)ó en 8.3 9oomassieR-%/8 ;zul 0nteligente en @83 metanol y 3 ácido acético y destained en /83metanol.

El &-término proteína sucesión análisis se realizó a io9entrum :.;.. (9raco#ia"olonia!. El secuencialmente se identifcaron deri#ado del p)enylt)io)ydantoinaislados de aminoácidos usando el rocise @? (iosystems ;plicado" 9iudad;dopti#a" 9;" EE.,,.! el sistema de análisis de sucesión automático" seg6n elprotocolo normal del abricante. :e realizaron las comparaciones de la sucesiónusando la base de datos :A0::rot ()ttpN''QQQ.ncbi.nlm.ni).go#'blast!. %.M.*uplicando y seuencing de proacrosin Los testículos del pa#o rescos estabancortados en los pedazos peue=os e inmediatamente )elado en el nitrógenolíuido. El te+ido era el grinded en el nitrógeno líuido a un pol#o fno con unmortero y el ma+adero siguió por &ucleo:pin íltrese la )omogeneización(Gac)erey-&agel" ;lemania!. ;R&


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realizó y adaptador-oligo-d


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?. aumentando entonces a %/8 U para el pró5imo ) y a /88 U para $8 min.ara la calibración de la pi el 0EF marcador euipo (io-Rad! se usó. 0soelectricapuntan de acrosin se estimó con el uso del SodaD * programa (la EastmanSodaD 9ompa=ía" &ue#o 1a#en" 9


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acti#idad del amidase más alta se encontró a 8 min de incubación y laacti#idad al punto de tiempo era superior apro5imadamente % #eces ue enmomento 8. se muestran Los cambios de perfles del electrop)oretic deacti#idad del gelatinolytic al mismo tiempo inFig .


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de Edman de la proteína principal de F00 nos permitieron identifcar los primeros%2 aminoácidos del &-términoN UUKK


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aminoácidos del &-término de una cadena pesada de acrosin y entoncesusamos esta inormación para construir los cebadores y obtener c*&; deproacrosin del a#ian para el primero

%. tiempo. El pa#o esperma proacrosin-acrosin sistema ue identifcado y seobtu#ieron características del p)ysicoc)emical de acrosin. El #alor alto deasociación de euilibrio constante para el plasma del acrosin'seminal el Sazalin)ibidor comple+o era determinado ué indica ese acrosin del pa#o puedenin)ibirse efcazmente por un in)ibidor del plasma seminal naturalmenteocurriendo como descrito por el :WoQiWsDa et al. (%88!. el e5tracto de acrosinde los espermatozoos del pa#o parecía ser más diícil comparado con losprocedimientos normales para la esperma mamíero. La urea y sonication erannecesarios e5traer el acrosin de los espermatozoos del pa#o (el Ric)ardson etal." ?!. ,& e5tracto diícil de acrosin de los espermatozoos del pa#o reCe+ala fsiología de esperma de pa#o probablemente e indica ese acrosin se atauertemente a los espermatozoos ue ya se indicaron por el Ric)ardson et al.

(?!. el e5tracto de espermatozoos del pa#o con @ la urea de G nos permitióobtener ni#eles altos de acti#idad del amidase (/888 ,'l!. el Ric)ardson et al.(?! sugirió ue este método de e5tracto producía el acrosin en suormulario acti#o pero no como un zymogen. or consiguiente" estos autoresconcluyeron ue ese acrosin está presente en la esperma del pa#o en elormulario acti#o. :in embargo" contrariamente a su traba+o nosotros pudimosacti#ar el sistema del proteolytic de e5tractos de esperma de pa#o y demostrarla presencia de #endas ue corresponden al proacrosin (@ D*a! y elintermedio orma de acrosin ($$ D*a!W - el acrosin ($8 D*a! y productos de laa#ería deW - el acrosin (% D*a!. En la conclusión" nuestros resultados sugieren

uertemente ue el sistema del proacrosin-acrosin e5iste en los espermatozoosdel pa#o y este sistema se parece la acti#ación del proacrosin mamíero (elaba et al." ??aI El casta=o y 1artree" ?M"I El Eberspc)er et al." ??IGeizel y GuDer+i" ?M/"I Geizel y GuDer+i" ?M2"I olaDosDi y arris)" ?MM!. Estaconclusión se apoya por el análisis de sucesión de c*&; (#ea deba+o!. &uestroestudio demostró eso además del proteinase de serine de acrosin otra enzimaestá presente. &uestro estudio también demostrado eso de otra manera ue elproteinase de serine de acrosin está presente en el e5tracto de esperma depa#o. Este proteinase se representó por una #enda con una masa molecular de@ D*a (similar al proacrosin!. &osotros no pudimos acti#ar ese proteinase conel procedimiento ue era efcaz para el acrosin de ragmento 00. Esto sugiere

ue este protease represente una enzima dierente ue el proteinase de serinede acrosin de espermatozoos del pa#o. Uarios proteinases de serine deacrosomal de otra manera ue el acrosin están presentes en la #arios espermamamíero (el 1onda et al." %88%!. ;lgunos de ellos se )an aislado y

$. caracterizado" comoN el protease de esperma bo#ino" proteases de serinede testicular" protease de esperma 9u y >i" %88!. El papel


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biológico de estas enzimas no se )a identifcado toda#ía. Los estudios uturosdeben enocar en la identifcación del proteinase del serine antedic)o dele5tracto de esperma de pa#o y el establecimiento de su relación al acrosin.

@. En nuestro estudio los ragmentos de fltración de gel después de ue laacti#ación no mostró un aumento en la acti#idad del amidase aunue lacon#ersión para madurar ormulario de acrosin ue obser#ada (Fig. @!. Estosresultados sugieren ue cualuier proacrosin del pa#o se #ol#iera inacti#o al p1agrio o la mayoría de la acti#ación del proacrosin ocurrió durante el e5tracto ypreparación del e5tracto para gelifcarse la fltración. ara este métodos deaislamiento de razón solicitados el acrosin mamíero no podría usarse para elproacrosin del pa#o. :in embargo" gelif6ese la fltración al p1 agrio parecíaun método efcaz para ser para el aislamiento deW - el acrosin del e5tracto deesperma de pa#o. El p1 agrio también limitó la generación de ormulariosm6ltiples de una enzima. El procedimiento de aislamiento de uno-paso eraefcaz y produ+o la preparación del acrosin como una una #enda de la proteína

durante el electrop)oresis del :*:-JK0&;. La sucesión de acrosin del pa#o era)omóloga a sucesiones de c*&; de a#ian atribuidas a la proteína delproacrosin (el asentimiento no. ;X$???I ;X$????I ;X@888!. la0normación acerca de la característica de proteína de proacrosin de a#ian noestá disponible ué límites el análisis comparati#o de nuestros resultados. :inembargo" los acrosin del pa#o re#elaron una identidad alta al acrosin mamíero.Estas identidades incluyen sucesiones a#orablemente conser#adas ue rodeanla región del sitio acti#a" substrate el sitio obligatorio y la situación decysteines. Esto permite el análisis de la sucesión de acrosin de pa#o en base ala estructura de acrosins mamíero como descrito por el aba et al. (??a!. es

probable ue el acrosin del pa#o" similar al acrosin mamíero" está compuestode luz y las cadenas pesadas. El &-término los seuencing de Edman de acrosindel pa#o mostraron una similitud alta a la cadena pesada de acrosin mamíero(Fig. 2! y con tal de ue la e#idencia directa para la presencia de la cadenapesada en el acrosin del pa#o. El análisis de la pa#o acrosin c*&; sucesiónindica eso delante de la sucesión de &terminal obtenida de la cadena pesada)ay % aminoácidos adicionales con un modelo notablemente similar de)omología de la sucesión al acrosin mamíero alrededor del residuo delcysteine 9ys-Kly-Leu-;rg y ;rg %(Fig 2!. Esto sugiere ue el acrosin delpa#o - similar al acrosin mamíero - es una molécula de la dos-cadena ueconsiste en las cadenas ligeras y pesadas (los residuos -% y %%-$%M"

respecti#amente!. puede asumirse ue la cadena ligera se sintetiza como unae5tensión del &-término del acrosin maduro y está separado de la cadenapesada durante la acti#ación del zymogen. Es probable ue la cadena ligerasigue siendo co#alently atado a la cadena pesada por dos ataduras deldisulfde. La situación de cysteines ue orma el disulfde une entre la luz y lascadenas pesadas son )omólogas al acrosin mamíero y sugieren ue doscysteines en la cadena ligera a los residuos / y ormulario el disulfde del


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interc)ain une con dos cysteines en la cadena pesada - probablemente losresiduos %M y $/. En la cadena pesada de acrosin pueden identifcarse #ariosresiduos característicos. La sucesión del &-términoN UUKK" es indicati#o de unproteinase del serine acti#ados (el aba et al." ??a!. El proteolytic ue elsitio acti#o segmenta ue se localizan :uyo" ;sp y :er en esta cadena a

posiciones 22" / y %/" respecti#amente. El residuo de ;sp ue act6a comoun sitio del reconocimiento para el )ydrolysis de ataduras del peptide uecontienen ;rg o Lys (el aba et al." ??a!" está presente a residuo %8?. :eorman cuatro ataduras de disulfde de interc)ain probablemente dentro de lacadena pesada entre los residuos del cysteine apropiados (entre los residuos/ y 2M" @? y %%" @ y %88" y % y %@!. 9ys $8 está probablementeale+ado durante la maduración del acrosin. Resumiendo" sucesionesa#orablemente conser#adas ue rodean la región del sitio acti#a" el substrateel sitio obligatorio y la situación de cysteines están presentes en la cadenapesada de acrosin del pa#o. El mecanismo de la maduración de zymogen delacrosin" el proacrosin del +abalí particular" se )a descrito bien para losmamíeros (el aba et al." ??a!. el proacrosin del abalí se con#ierte paramadurar el acrosin por la )endidura de la atadura de ;rg%$-Ual%@ después delle#antamiento del segmento de @-residuo de 9-término" mientras produciendola ormación de las cadenas ligeras y pesadas. Esta molécula de la dos-cadenase con#ierte entonces a la enzima madura por el le#antamiento del 9-término - y segmentos del @$-residuo. :e localizan los sitios de la )endidura en elsegmento del 9-término al residuo Lys$2/ - ;rg$22 y ;rg$$-:er$@. Estas)endiduras podrían catalizarse por

/. el acrosin y'o trypsin. :ólo )endidura al residuo ;rg$%%-ro$%$" la 6ltima

ase de acti#ación" puede lle#arse a cabo por el acrosin" desde ue el trypsines incapaz de raccionamiento ue este peptide unen. ,n grado alto desimilitudes de la sucesión entre el pa#o y el proacrosin del mamíero nospermite predecir ambos & - y sitios de )endidura de 9-término de proacrosindel pa#o durante el proceso de la maduración. El &-término

2. la )endidura se localiza entre ;rg% y Ual%% cuando nosotrosdescribimos antes. Esta )endidura generaría una cadena de luz de %-residuo ymás tiempo la cadena pesada.


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proacrosin acti#ación senda. 0normación presentada sobre indicó una similitudllamati#a entre la estructura general de pa#o y sistemas de proacrosin-acrosinde mamíero. 1ay dierencias pronunciadas en la biología de la reproducciónentre los a#ian y mamíeros y es e5tra=o ue estas dierencias no se reCe+enen la estructura y acti#ación del sistema del proacrosin. :in embargo" la

similitud entre el pa#o y el acrosins del mamíero está de acuerdo con lasugerencia por el erlín et al. (%88! ue la e#olución molecular de genes delgameto-reconocimiento entre los pá+aros y los mamíeros no sondramáticamente dierentes. 9omo el acrosin del pa#o anterior" maduroestablecido %@2 aminoácidos deben contener en dos cadenas" el %-residuo lacadena ligera y %%/-residuo la cadena pesada. Los isoelectric apuntan y lamasa molecular de acrosin del pa#o calculó de la sucesión era 2.@ y %2.?@?/D*a" respecti#amente. El punto del isoelectric estimó a tra#és de isoelectricue enoca (2.@! estaba de acuerdo con el #alor de la pi calculado. La masamolecular de acrosin medida por el spectrometry de masa ($8"M@ D*a! erasuperior $.?%@ D*a ue la masa molecular calculó de la sucesión. Estadierencia los resultados probables del glycoprotein estructuran de acrosin uese encontró en este estudio y también se )a demostrado por el Ric)ardson etal. (?! para el acrosin del pa#o. El análisis de sucesión del c*&; indicó eseacrosin del pa#o contiene un & potenciales - y un sitios de B-glycosylationpotenciales. Los estudios e5tensos son necesarios caracterizar la naturaleza delglycoprotein de acrosin del pa#o con respecto a la estructura de la cadena del)idrato de carbono y su cone5ión a la cadena de la proteína de la molécula delacrosin.

M. ,n rasgo característico de proacrosin mamíero es la presencia del

segmento proline-rico localizada a la porción del 9-término (el aba et al."??aI El aba et al." ??b!. Las unciones de proline repiten no se )adefnido bien. El aba et al. (??a! sugirió ue la presencia del segmentoproline-rico a la porción del 9-término de proacrosin puede relacionarse a ungrado alto de )ydration necesario para una concentración alta de proacrosin(.2 mm! en el acrosome del +abalí. El segmento proline-rico está apagado)endido durante la con#ersión de proacrosin madurar ormulario de acrosin. Esinteresante ue ese proacrosin del pa#o no contiene el segmento proline-rico.Las roacrosin c*&; sucesiones de otras especies del a#ian tampoco contienenel proline repite a la porción del 9-término (el asentimiento no. ;X$???I;X$????I ;X@888!. 9omo Raterman y :pringer (%88! sugirió" e5on pueden

su+etarse / códigos para la región proline-rica a un régimen de la seleccióndierente ue el resto de la proteína. Es posible ue esta región estée#olucionando rápidamente mientras se conser#an la región del sitio acti#a y lasituación de cysteines. ,na alta del segmento proline-rico localizada a laporción del 9-término de acrosin del a#ian parece ser distinta para el acrosindel a#ian. La importancia de este enómeno es en la actualidad incierta.


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ba+o ue se identifcó como un Sazal el in)ibidor amiliar (el :WoQiWsDa et al."%88!. El mecanismo de la Sazal in)ibitor'enzyme interacción se describe bieny es el termed un 4normal4 el mecanismo (LasDoQsDi y Sato" ?8!. El comple+odel in)ibitor'proteinase podría disociar a la enzima e in)ibidor en uno de dosormulariosN la #irgen y modifcó (un peptide )endido une!. como resultado del

peptide )endido una" el ormulario modifcado de in)ibidor difere delormulario de la #irgen en la masa molecular más alta (por *a!" cargo másnegati#o al p1 alto y la reacción más lenta con el proteinase (LasDoQsDi y Sato"?8"I El :WoQiWsDa et al." %88!. La presencia de in)ibidor en el pa#o elplasma seminal en dos ormularios" #irgen y modifcó (un peptide )endidoune!" es una se=al de su papel regulando los procesos del proteolytic en el#i#o. En este estudio nosotros demostramos para la primera #ez la presenciade un in)ibidor de Sazal en el e5tracto de esperma de pa#o. Es desconocido sieste in)ibidor puede atarse a los espermatozoos aparezca o localizó en laesperma. Kelif6ese la fltración al p1 agrio nos permitió disociar elin)ibitor'proteinase de Sazal comple+o e identifcar dos ormularios de in)ibidorde Sazal en el e5tracto de esperma. La presencia de dos ormularios dein)ibidor de Sazal en el e5tracto de esperma es una se=al de su papel acti#o enel mando de procesos del proteolytic en los espermatozoos. :eg6n LasDoQsDi ySato (?8!" los #alores sumamente altos de Sa ue #a entre 8M y 8$ GWindican ue el in)ibidor del proteinase puede in)ibir el proteinase designadoefcazmente. La asociación constante (Sa! determinado para la Sazalin)ibitor'acrosin interacción M.2Y8M GW era. Este #alor era dentro del alto de#alores de Sa ue sugieren ue un in)ibidor de Sazal puede in)ibir el acrosinefcazmente en el #i#o. Este resultado sugiere uertemente ue la unciónfsiológica del Sazal el in)ibidor amiliar de semen del pa#o es el inacti#ation de

acrosin soltado del muerto o da=ó y'o controla de acti#ación del sistema delproacrosin-acrosin. En la conclusión" nosotros )emos demostrado ue elsistema del proacrosin'acrosin e5iste en los espermatozoos del pa#o y estesistema se parece la acti#ación del proacrosin mamíero. ,n rasgocaracterístico de proacrosin del pa#o está una alta de un segmento proline-rico en la porción del 9-término. El acrosin del pa#o maduro es una molécula dela dos-cadena ue consiste en las cadenas ligeras y pesadas y ue encontradopara ser el glycoprotein. La constante de la asociación determinada para laSazal in)ibitor'acrosin interacción era M.2 Y 8M GW ue sugieren ue laacti#idad del acrosin puede controlarse por un plasma seminal el in)ibidor de

Sazal ba+o las condiciones fsiológicas.

$. ;R910UB

La ertilización mamíero es un proceso comple+o ue in#olucra reconocimientodel gameto" penetración" y usión. Estudios biouímicos ue identifcaron elpapel de componentes del acrosome sobre todo durante la interacción de los


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esperma-ó#ulos el pellucida de la zona (Z! con tal de ue los adelantosmayores en la esperma la biología celular. ;crosin (un protease del serinetípicos! las unciones durante la ertilización de #arias maneras signifcantesue incluyenN un! la acti#ación de componentes del acrosome" b! el ligandosecundario con el Z" y c! el )ydrolysis del Z. :in embargo" estudios ue usan

el DnocDout (SB! los ratones acrosin-defcientes lanzaron la duda en el papeltradicional de acrosin en la ertilización. El SB los ratones acrosin-defcientese5)iben la ecundidad normal sal#o la ertilización tardada. ; pesar de la dudalanzada en el papel tradicional de acrosin por el SB ue el ratón acrosin-defciente estudia" el acrosin sigue siendo toda#ía un protease mayorin#olucrado en los procesos m6ltiples de ertilización. En esta re#isión" nosotrose#aluamos el perfl uncional de acrosin y bre#emente resumimos los recientesresultados en proteases in#olucrado en la ertilización. &osotros proponemosun esuema refnado para el papel uncional de acrosin en la ertilización.&osotros damos énasis al papel de acrosin particularmente en el e5ocytosisdel acrosome y acti#ación de otros componentes del acrosome basadas en latecnología a#anzada como el análisis de la Radiograía estructural.

. introducción ue la ertilización Gamíero in#olucra ue las interacciones delos esperma-ó#ulos y reacciones de ertilización los dos de ue contribuyen conue al sync)ronicity de ertilización los e#entos biouímicos y moleculares dela esperma y ó#ulos ocurren en una moda organizada. El estudio de estosprocesos )a elucidado los mecanismos in#olucrados en el reconocimiento delos esperma-ó#ulos" el desarrollo de terapias de inertilidad" y estrategias parael anticoncepcionismo non-)ormonal en los )umanos. :in embargo" muc)osmecanismos moleculares in#olucrados en la ertilización permanecen un-

resueltos" sobre todo en el área de interacciones de los esperma-ó#ulos. En lamayoría de los mamíeros del placental" la ertilización es un procesoa#orablemente oruestado ue in#olucra #arios e#entos ue incluyenN un! lapenetración de esperma del c6mulo la capa celular" b! esperma ue liga alpellucida de la zona (Z!" c! la reacción del acrosome" d! el Z saliendo delcascarón" y d! la usión de esperma con el oocyte la membrana celular (Fig. !.El acrosome (Kr. el aDros ` e5tremo o ladea" soma ` el cuerpo! es un Kolgi-deri#ó

%. organelle ue guarda las enzimas necesario para la penetración de espermay se localiza al fn anterior del spermatozoon entre la membrana celular y el

n6cleo compacto. El acrosome guarda las enzimas necesario para lapenetración de esperma. La esperma sure una reacción del acrosome comoresultado de esperma-Z ligando la matriz del acrosome con ue no sólo perotambién se acti#a soltado. ;lgunos proteases distinti#os se )an identifcadocomo los candidatos probables en este proceso. ;crosin es uno de estosproteases distinti#os ue +uegan los papeles m6ltiples en la ertilización y sonun componente muy conocido de la matriz del acrosome (el ;d)am et al."??I


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la acti#idad" el acrosin se guarda en su ormulario del zymogen inacti#o (llamóel proacrosin! y se secreta como un protease del serine después esperma-Zligando. ;crosin +uega los papeles importantes en #arios procesos ue incluyenNun! la dispersión de matriz de acrosome" b! esperma-Z ligando" c! la reaccióndel acrosome" d! la encuadernación secundaria" y e! la penetración de Z. En

esta re#isión" nosotros discutimos los rasgos biouímicos de acrosin y suparticipación en las interacciones de los esperma-ó#ulos. &osotros resaltamoscómo los #arios estudios en el acrosin )an e5tendido nuestro conocimiento deertilización en las 6ltimas décadas. %. ;crosin en la reacción del acrosome ydispersión de matriz de acrosome *urante la reacción del acrosome" superfcieue remodela los e#entos ocurre en la esperma la membrana celular. ;demás"se acti#an los componentes del acrosome y soltaron de la #esícula delacrosome en el orden al )ydrolyze y penetra las #estiduras ue rodean eloocyte. En esto considere" el acrosin participa en el proceso de e5ocytosis delacrosome. En los )umanos" en el #i#o esperma-Z los restos obligatoriosrelati#amente normal después del tratamiento con el anticuerpo de anti-acrosin'proacrosin de monoclonal (;cr9/F8! aunue ;cr9/F8 bloueaproacrosin ue causa un deecto en la encuadernación del proacrosin-Z. &oobstante" una reacción del acrosome ocurre a pesar del tratamiento de;cr9/F8 (el Ueaute et al." %88!. la localización de :ubcellular estudia deproacrosin re#eló a ese socios del proacrosin con otros componentes de lamatriz del acrosome (1ardy el al del et." ??!. Esto puede indicar eso acti#adoel acrosin participa en el e5ocytosis del acrosome #ía su proteolytic del serineuncione soltando una #ariedad de componentes de matriz de acrosome. Esdecir" los #arios componentes de matriz de acrosome pueden ser#ir como elsubstrates de acrosin acti#ado y entonces pueden surir el descargo de la

matriz. ;demás" ;cr masculinoW 'W los ratones con una mutación disociadora enel acrosin demuestran un descargo tardado de #arias proteínas del acrosome(por e+emplo" sp/2" G98! comparó a ratones del tipo sal#a+es ue usan losacercamientos del immunocytoc)emical (el >amagata et al." ??!. Estosestudios sugieren ue el acrosin acelere la dispersión de la matriz delacrosomal. ;llí está compeliendo la e#idencia para implicar el proacrosinineuí#ocamente ' el acrosin en la reacción del acrosome y e5ocytosis delacrosome. La acti#idad del proteolytic de resultados del acrosin en laacti#ación y aceleró descargo de otros componentes del acrosome. *esde uelos proteases del acrosome se guardan como el proenzymes" la probabilidad

ue los acrosin pueden pegarse y pueden acti#ar otro proteases del acrosomese pone clara. En la ausencia de acti#idad de proteolytic de acrosin de acrosin"la reacción del acrosome puede tardarse y del esperma-Z ligando puedenaectarse (el ;d)am et al." ??M!. or consiguiente" la #aloración de acti#idadde proteolytic de acrosin por el spectrocolorimetry puede ser una manerabuena de medir la reacción del acrosome (el Liu et al." %88!.


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$. #arios preguntas toda#ía permanecen acerca del papel de acrosin ueincluyeN ^un! lo ue es los substrates específcos de acrosinW ^b! los proteomicsde esperma pueden dar algunas pistas acerca del substrates específcoW ^c! loue es el acti#ador de acrosinW ^d! la acti#ación Es de energía del acrosinrelacionadaW ^d! lo ue es la uente de la energíaW $. ;crosin en el esperma-Z

la interacciónN el reconocimiento" respondiendo cascada y penetración El Z esuna matriz del e5tracellular densa de flamentos del glycoprotein cruz-unidosue orman una #estidura proteccionista ue rodea los oocyte y mentiras ba+oel oop)orus del c6mulo (rimaDoV y Gyles" %88%!. El Z debe penetrarse por elprior de esperma a la usión de la membrana celular (Fig. !. &o obstante" losmecanismos moleculares ue median y los actores en ue participan elesperma-Z la interacción permanece polémica. Esperma-Z ligando reuiereun selectin-como la interacción en los )umanos con ue la esperma yglycoproteins de Z +uegan un papel giratorio en esta interacción (el Giranda etal." ??M!. En la mayoría de los mamíeros" el Z consiste en tres termed delglycoproteins Z" Z%" y Z$ todos de los cuales se degeneran ydescomponen durante el embryogenesis. El crosslinDs de Z Z% y Z$ (Z@

+uega el mismo papel en los )umanos!. Z% media esperma-Z ligandoactuando como un receptor secundario (el Lin et al." %88!. Z$ +uega un papelen el reconocimiento de esperma (el 1oQes et al." %88! (Gesa !. $..roacrosin es el ligand potencial de Z$ para el esperma-ó#ulos reconocimientoEsperma-ó#ulos reconocimiento ocurre por un mecanismo del ligand-receptorpor ue la esperma ata y liga al Z. or consiguiente" puede postularse ue uelos receptores de Z e5isten y ligan el ligand en la esperma aparezca.;ctualmente" Z$ el más probablemente es candidato para el receptor de Z(el 1an et al." %88I imenez-Go#illa y *ean" %8"I Aassarman y Litsc)er"

%88!. Z$ liga o act6a recíprocamente con una gama amplia de proteínas desuperfcie de esperma durante el proceso de reconocimiento de los esperma-ó#ulos ue une el Z y la esperma por eso. En esto considere" se encontraronlos glycoproteins de Z para ligar al proacrosin bacteria-e5presado en #itro ueindica un posible papel de proacrosin como el ligand para Z$ (el al de et deEstadio." %888!. $.%. ;crosin liga a Z% La interacción entre elproacrosin'acrosin y Z% en los ratones ocurre a tra#és de un mecanismo llamóencuadernación secundaria ue in#olucra interacciones iónicas uertes de losgrupos del sulp)ate en Z% con el proacrosin'acrosin (el 1oQes et al." %88!. Enesto considere" Z% demuestra la )abilidad obligatoria ba+a al acrosin la

esperma _nula_ en un modelo del ratón (1oQes y ones" %88%!. :in embargo" elrecombinants )umano Z;" Z y Z9 (el )omologs a Z%" Z y Z$!demuestre una )abilidad obligatoria alta al proacrosin y acti#ó el acrosin (el alde et de Estadio." %88/a" %88/b!. Estos resultados indican ese acrosin ue ligaal #arios glycoproteins de Z +uega un papel importante en la penetración deZ. $.$. ;crosin y el proteolysis de Z Los acrosome deben soltar sus#ol6menes para acilitar la ertilización. ;crosin se )a caracterizado muc)otiempo como una enzima del )ydrolytic ue participa en la digestión y


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penetración del pellucida de la zona durante la ertilización. En la #istatradicional del sistema del proacrosin'acrosin" el acrosin acti#ado digiere ylyses el Z ue ayuda la esperma por eso para penetrar el Z. Esta #istatradicional se desarrolló en la ertilización del +abalí estudia (9rosby y arros"???"I El *unbar et al." ?/!. :in embargo" si el acrosin act6a en cierto modo

en los )umanos ue eso es consistente con la #ista tradicional sigue siendo elun#erifed. ;demás" los substrates de Z específcos ue se digieren de lysedpor el acrosin acti#ado permanecen irresolutos. &o se elucidan los mecanismossubyacentes in#olucrados en la interacción entre el acrosin y el Z totalmentea pesar de la #ista tradicional antedic)a. La estructura cristalina de un a#ian el)omolog de Z$ mantiene la e#idencia el papel de Z$ como un receptor ueparticipa en los esperma-ó#ulos iniciales ue ligan (el 1an et al." %88I ElGonné et al." %88!. :in embargo" la estructura cristalina de acrosin no )a sidodeterminada. or consiguiente" un análisis estructural-uncional se e5ige nosólo determinar el dominio obligatorio de acrosin pero también el substrates deZ específco ue los blancos del acrosin durante esperma-Z ligando. ;demás"#arios otras preguntas acerca del cronometrar de acti#ación del proacrosin" elmecanismo de Z substrate reconocimiento" y la regulación de la proporción de)endidura de substrate permanece sin contestar. *esde ue el pi#otally desistema de proacrosin'acrosin participa de una manera giratoria en la reaccióndel acrosome y el esperma-Z la interacción" uno podría concluir esaertilización depende en la presencia de proacrosin'acrosin. :in embargo"muc)os e5perimentos )an indicado esa ertilización no es completamentedependiente en la presencia de proacrosin ' el acrosin. @. e5plorando el papelde acrosin durante la ertilización por un ensaye del DnocDout La idea acerca desi la penetración de esperma del Z ocurre #ía un e#ento del lytic se )a

llamado en la pregunta (edord" ??!. En esto considere" la esperma puedepenetrar el Z #ía un proceso mecánico en lugar de un e#ento del lytic uein#olucra el e5ocytosis del acrosome y )ydrolysis del acrosin del Z. Estodesaía la #ista tradicional de ertilización ob#iamente. El

@. el proceso mecánico se apoya más allá por los resultados ue otrasproteínas (el e+." Kal


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aba et al." ??@!. Estos resultados en el SB el ratón acrosin-defciente lallamada e+emplar en la pregunta el papel esencial de acrosin en la ertilización.*e otra perspecti#a" el SB el modelo del ratón acrosin-defciente también da lacreencia ue otras proteínas (o proteases! puede compensar para la pérdida deunción del acrosin ue sugiere ue la redundancia uncional e5iste en el

proceso de ertilización. ;sí" se )an producido ratones de SB dobles y triplesue in#olucran acrosin y otro proteases del serine (Gesa !. Los ratones de SBdobles ue in#olucran acrosin y


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como pre#iamente pensamiento. Es posible ue la acti#ación temprana deacrosin sea indicati#a de un prior del papel a la penetración de Z. ($! laimportancia de la acti#idad enzimática de acrosin se )a ba+o-apreciado. Laparticipación de ;crosin en la ertilización puede in#olucrar el proceso de otrasproteínas del acrosome o esperma las proteínas de la membrana celulares

durante el e5ocytosis del acrosome en lugar de directamente el )ydrolyzing elZ. En esto considere" la elucidación de todo el substrates de acrosin no sólo enel Z pero también dentro del acrosome debe descirarse. (@! otro e#entoimportante en la ertilización in#olucra la usión de membrana de gameto (Fig.!. La usión de la esperma la membrana celular con los ó#ulos la membranacelular reuiere 0Z,GB (Gesa ! y otro proteases ue posiblemente se acti#apor el acrosin. ; pesar de los adelantos en esperma-Z interacciónpa#imentada por los estudios biouímicos" el esuema uncional completo deacrosin y esperma-Z la interacción sigue siendo conundiendo. :in embargo"molecular y los estudios de manipulación de gen pueden lle#ar a unaresolución del papel e5acto de acrosin en la esperma - la interacción de Z. ElconCicto de interés Los autores declaran ning6n conCicto de interés.Reconocimientos ue &osotros nos endeudamos a todos los miembros delLaboratorio de Esperma en la ,ni#ersidad de Z)e+iang para su ayudainspirando. La apreciación de los autores también #a a Ronald *udeD (El rody:c)ool de Gedicina en la ,ni#ersidad de 9arolina Briental" &9" EE.,,.!" uiéncon tal de ue el sólido y la contribución constructi#a a este manuscrito. Esteproyecto se apoyó en parte por la Fundación de la 9iencia &atural &acional de9)ina (&os. @%M2/ y $8M%?!.

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Resuma El alcance del estudio presente era e#aluar la presencia y acti#aciónde proacrosin'acrosin como una )erramienta determinar el estado delacrosomal de resco y espermatozoos de perro de rozen't)aQed. El anticuerpode Gonoclonal 9/F" dirigido contra el acrosin )umano" cruz-reaccionó con losespermatozoos del perro y etiuetó el acrosome de ambos resco yespermatozoos de perro de rozen't)aQed. Los espermatozoos deFrozen't)aQed tenían una proporción menor de espermatozoos etiuetadosue los espermatozoos rescos ( 8.8/!. 9uando se etiuetaron losespermatozoos #i#os con in)ibidor de trypsin de so+a con+ugado con ;le5a @(:


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ser un indicador bueno de integridad del acrosomal de espermatozoos delrozen't)aQed. 7 %88/ Else#ier .U. todos los derec)os reser#ados.

. la introducción los espermatozoos Gamíero son 6nicos entre las células

secretorias en el sentido ue su solo propósito es ertilizar el oocyte. :ila ertilización no ocurre entonces ue los espermatozoos secomprometen para morirse. En el mismo conte5to" los spermatozoontenían las características celulares ideales para este propósito" mientrasposeyendo un organelle específco para realizar cosas así con é5itounciona (el arros et al." ??2I Ramal)o-:antos el al del et." %88%!. Elacrosome es una #esícula secretoria ue cubre sobre dos-tercero de lasuperfcie nuclear. El acrosome contiene #arios enzimas ue se cree ueayuda los espermatozoos cruzan el pellucida de zona de )ue#o (el


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ni#eles de proacrosin y acti#idad del acrosin con el potencial ertilizandode espermatozoos )umanos (el :)imizu et al." ??M!. además" elproacrosin'acrosin se suelta secuencialmente del acrosome ba+ocapacitar las condiciones. ;sí" la localización de proacrosin'acrosin en elacrosome es un indicador de la reacción del acrosome y'o de integridad

de la membrana en #arias especies. 1elando promue#e #arios cambiosrelacionados al capacitation y senescence de esperma ue puedenmodifcar la unción de esperma (ena y Linde-Forsberg" %888"I El enaet al." %88$!. además" )elar es un proceso ue puede da=arpotencialmente en serio el plasma de esperma y'o membranas delacrosomal (el al de et de urguesa." %88I El &is)izono et al." %88@I ElRasul et al." %88!. or consiguiente" el ob+eti#o del estudio presente erae#aluar si el da=o de la membrana indu+o por el reezing't)aQing puedeinducir la acti#ación del proacrosin en los espermatozoos del perro. 9..9ortés el al del et. ' La Reproducción animal 9iencia ?$ (%882! 2/-M/2M %. los Gateriales y métodos %.. los Reacti#os

semen del perro prueban la 9ongelación se realizó como sigueN elragmento esperma-rico de cada uno eyacula estaba e5tendido en unayema del


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a W?2W 9'min. *es)elando se realizó como descrito por el arris) et al.(?! con las modifcaciones ligerasN pa+as se sacaron de nitrógenolíuido y pusieron en un ba=o de agua a las 28W el 9 para s. Entonces"8.%/ ml de semen des)elado el layered era el /88


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:; para ) a la temperatura del cuarto. :e re#elaron las #endas de laproteína usando el Beste :e=alado E5celente el ico c)emiluminescentsubstrate (;gu+eree" RocDord" 0L!. %.2. la acti#idad de ;crosin laacti#idad de ;crosin el spectrop)otometrically moderado estaba en las%/W el 9 siguiendo el )ydrolysis de &-benzoyl-larginine-etilo-ester (;EE!

y por la suma de /8 o 88l de la solución de la enzima" a %/$ nm. Losensaye se realizaron en $ #ol6menes del ml" mientras usando unamezcla del substrate de /8 mm


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anti-proacrosin'acrosin de monoclonal 9/F (,& y *!" :


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rozen't)aQed. Las cartas dierentes indican las dierencias signifcantes" 8.8/" & ` $. 9.. 9ortés el al del et. ' La Reproducción animal 9iencia?$ (%882! 2/-M/ M Fig. @. el *escubrimiento de proacrosin y acrosinen resco y en las muestras del rozen't)aQed. roacrosin está presenteen ambos resco (senda ! y espermatozoos del rozen't)aQed (senda

%!. ;la-acrosin se descubrió como una #enda de $2 D*a y beta-acrosincomo una #enda de %M D*a sólo presente en los espermatozoos delrozen't)aQed (senda %!. la acti#idad del acrosin aumentó el tres-pliegueapro5imadamente en las muestras rescas" pero el mismo procedimientoue usa las muestras del rozen't)aQed no indicó un aumentosignifcante en la acti#idad del acrosin (Fig. $!. Estos resultados implicanue todo el acrosin en los espermatozoos del rozen't)aQed ya ueacti#ado" como opuesto a los espermatozoos rescos era casi todosacrosin era como el proacrosin. :i el #olumen total de acrosin como laacti#idad de la enzima alcanzada después en la acti#ación del #itro esconsiderado (es decir 883!" era determinado ue 2M3 de la acti#idadobser#ada eran como el proacrosin" y $$3 como el acrosin acti#o en losespermatozoos rescos. Los espermatozoos de Frozen't)aQed" sinembargo" mostraron sólo un 83 aumento en la acti#idad del acrosindespués en la acti#ación del #itro. ;sí" sólo 83 de la acti#idadenzimática obser#ada eran como los proacrosin y ?83 era como elacrosin. Los borrones occidentales mostraron ue el anticuerpo 9/Freconoció una #enda de @8 y $2 D*a en los espermatozoos rescos"mientras correspondiendo al proacrosin y ala-acrosin" respecti#amente(Fig. @" senda !. En los espermatozoos del rozen't)aQed" sin embargo"el anticuerpo 9/F reconoció el proacrosin" ala-acrosin y una #enda de

%M D*a ue corresponden a beta-acrosin (Fig. @" senda %!. Estosresultados sugieren uertemente ue el proacrosin se acti#ara en el ala -y beta-acrosin en los espermatozoos del rozen't)aQed. @. discusión uese )a inormado ue )elando y'o des)elando de espermatozoosmamíero inducen capacitation-como los cambios como la acti#ación dela enzima" ruptura de membrana de plasma" y un aumento en laconcentración de calcio de intracellular (ra#o el al del et." %88/I Gáslleno y A)itting)am" ??M"I El :c)embri et al." %88%!. El )allazgo mayorera ue )abía la acti#ación y descargo de proacrosin'acrosin en losespermatozoos del rozen't)aQed sin la pérdida de proteínas de

membrana de plasma como Kalunes et al." ??%I El Ualdi#ia et al."


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??@I Ramal)o-:antos el al del et." %888I Goreno el al del et." ??!.Este anticuerpo etiueta el acrosome de ambos resco y espermatozoosde perro de rozen't)aQed. Esta etiueta parece ser específca poruening6n signo ue descubierto cuando sólo el anticuerpo secundario ueusado. ;demás" en los ensaye del borrón Bccidentales el anticuerpo

reconoció proacrosin y ambos sus ormularios acti#ados (el ala - y beta-acrosin!. Es más" este anticuerpo reconoce el polysulp)ate el dominioobligatorio de acrosin ue es muy conser#ado entre las especiesdierentes. or consiguiente" aunue este anticuerpo se construyó contrael acrosin )umano" el anticuerpo 9/F cruz-reacciona con el acrosin delperro y puede usarse como un recurso fable para estudiar el acrosomaluncione en los espermatozoos del perro. 1elando y des)elando losimpactos probables la membrana del acrosomal a la magnitud ue másproacrosin'acrosin está disponible actuar recíprocamente con losanticuerpos. En este conte5to" anticuerpos al acrosin )umano tambiénigualmente el proacrosin de la manc)a y ala-acrosin ué puedeintensifcar el signo y puede sobrestimar la cantidad de moléculas delacrosin ue están presente en el acrosome de los espermatozoos. Lacantidad de acrosin en el acrosome no se estimó por la intensidad deCuorescenciaI sin embargo" nosotros cuantifcamos el porcenta+e deespermatozoos etiuetados no importa cómo intenso" y de esta maneranosotros superamos este problema. *espués del ;R" el proacrosin secon#ierte a ala-acrosin ue permanece limitado al acrosome. ;la-acrosin se con#ierte entonces automó#il-catalizadoramente en beta-acrosin eso se suelta al entorno del e5tracellular (el aba et al." ??I El1ermans et al." %88$I 1oQes y ones" %88%!. En #i#o ue procesa y la

acti#ación de proacrosin ocurre gradualmente e incluso después de @-2 )de incubación" es posible descubrir una proporción peue=a deproacrosin'acrosin en el acrosome de )umano y los espermatozoosbo#inos (el arros et al." ??%I Sim el al del et." %88!. or consiguiente"la proporción de espermatozoos el proacrosin'acrosin carente y'o lamagnitud de acti#ación del proacrosin son un indicador e5acto del ;R. Laproporción de espermatozoos del perro con el acrosomal da=a y lapérdida del acrosin era signifcati#amente mayor en el rozen't)aQedue en los espermatozoos rescos en el estudio presente. Estosresultados sugieren ue el acrosin" probablemente en el ormulario de

beta-acrosin" está perdido del acrosome durante o después decualuiera )elando y'o des)elando. :i éste es el caso" se especula ue lapérdida de proacrosin'acrosin del acrosome puede ser un resultado de laacti#ación de proacrosin en el acrosin. Esta )ipótesis era in#eterada porborrón Bccidental ue mostró ese espermatozoos del perro rescos tienedos #endas de @8 proteína del D*a ue corresponde al proacrosin y una#enda débil ue corresponden a ala-acrosin ue puede )aber resultadode alguna acti#ación durante el e5tracto o por acti#ación del proacrosin


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inducida por la reacción del acrosome. La mayoría del acrosin descubrióen los espermatozoos del rozen't)aQed" sin embargo" correspondidos alalp)aand beta-acrosin. ^9ómo los proacrosin se acti#an en losespermatozoos de perro de rozen't)aQedW Los estudios anteriores )anmostrado los espermatozoos bo#inos a ese rozen't)aQed aumenta más

calcio ue la esperma resca prueba" más probable debido a alteracionesde membrana de plasma inducidas durante el procedimiento delcryopreser#ation (el 9ollin et al." %888!. :in embargo" la acti#ación delproacrosin no depende de las concentraciones fsiológicas de 9a%T"Gg%T o Zn%T" toda#ía uertemente conía en el p1 del intra-acrosomal(Geizel y *eamer" ?M"I El casta=o y 1artree" ?M"I El casta=o y1arrison" ?M!. ;sí" es posible ue el da=o de membrana de plasma" enlos espermatozoos de perro de rozen't)aQed" permita un aumento en elp1 del intracellular ue a su #ez promue#e la acti#ación del proacrosin yen el uturo el descargo de beta-acrosin del acrosome. Esto e5plicaría laacti#idad del acrosin mayor y la proporción menor 9.. 9ortés el al del et.' La Reproducción animal 9iencia ?$ (%882! 2/-M/ M$ de etiueta delanti-acrosin encontraron en los espermatozoos del rozen't)aQedcomparado con los espermatozoos rescos. El Kal< media la ertilizaciónen los ratones ligando al ligands del oligosacc)aride B-unido específcoen el glycoprotein de c)aueta de )ue#o Z$ (el al de et de Golinero."%88%!. ;ntes de ligar al )ue#o" esperma Kal< es enmascarado por elcobertizo del glycosides epididymal-deri#ado de la superfcie de espermadurante el capacitation. *espués de ligar el )ue#o" los oligosacc)aridesdel esperma-límite en Z$ inducen la reacción del acrosome por laagregación del receptor" mientras in#olucrando Kal< probablemente (el

al de et de Golinero." %88%I Aassarman" ???"I El Aassarman et al."%88!. los estudios ;nteriores )an mostrado ue el anticuerpo contra elratón Kal< reconoce esta enzima en el acrosome de ratón" ganado"cerdo" cone+o" rata" y espermatozoos del cuy (Larson y Golinero" ??M!.además" ning6n signo ue descubierto cuando sólo se incubaron lasmuestras con el anticuerpo secundario o con el suero pre-inmune. ;sí" esmuy probable ue el signo obser#ó en espermatozoos del perro ueusan este anticuerpo es específco a Kal< (el al de et de Golinero." %88%IAassarman" ???"I El Aassarman et al." %88!. se )a mostrado ue lamanc)a de Kal< está perdida durante la reacción del acrosome. :e

supone ue si los espermatozoos de perro de rozen't)aQed )ubieranperdido su acrosome" una disminución en la proporción de Kal<etiuetada los espermatozoos ocurrirían. :in embargo" en el estudiopresente la proporción de espermatozoos rescos etiuetada con Kal< essimilar a los espermatozoos del rozen't)aQed. La e5plicación másprobable para estos resultados en el estudio presente es eso a pesar delacrosome racture" sólo una porción peue=a del acrosome está perdidadurante este proceso" así el immunoCuorescence no alcanza este ni#el


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de resolución. Es" sin embargo" posible ue a pesar de la usión de lamembrana y acti#ación de protease de acrosome" una porción de lamembrana del plasma del acrosome permanece toda#ía después de ueel ;R está acabado. En este guión" Kal< podría permanecer en losespermatozoos acrosome-reaccionados y podría )abría" por

consiguiente" no sea un marcador fable de da=o del acrosome o lareacción del acrosome. :eme+antemente" Larson y Golinero (%888!mostró ese Kal< no es un marcador fable de )abilidad de ertilización enlos toros. or consiguiente" los resultados del estudio presente indicanue la magnitud de la acti#ación del proacrosin y'o el porcenta+e deespermatozoos etiuetó con un anticuerpo del acrosin puede ser unmétodo efcaz para e#aluar el acrosomal da=e de espermatozoos deperro de rozen't)aQ. ;demás" la e#idencia sugiere ue las racturaspeue=as en la membrana del plasma y'o en la membrana delacrosomal e5terior la acti#ación del proacrosin puede inducir. Losreconocimientos arten de este traba+o se apoyó por una concesión del9oncilio de la 0n#estigación c)ileno (FB&*E9>

/ ;R910UB

RE:,G; La interacción entre la esperma acrosome-reaccionada y no seentienden toda#ía totalmente las proteínas de pellucida de zona. :e )anpropuesto :erine protease acrosin y sus proacrosin del zymogen al ll delulf esta unción debido a su capacidad de ligar el glycoproteins depellucida de zona. :in embargo" el mecanismo molecular ue estádeba+o de esta interacción )a sido meramente especulati#o. ;uínosotros mostramos ese ucoidan (un polisacárido del sulated! ysolubilized zona pellucida glycoproteins" pero no el in)ibidor de trypsinde so+a" puede destacar espermatozoos limitados ue sugieren ue loslazos de esperma #i#os al pellucida de la zona de una manera del non-enzymatical. 0nteresantemente" digestión del proteolytic apacible con elacrosin o el trypsin no modifca la estructura del pellucida de la zona"sino resultados en menos espermatozoos ue ligan a la zona. Estosresultados están de acuerdo con un modelo dónde el sitio acti#o decompendios del acrosin los pellucida de la zona y lazos a tra#és del

dominio polysulate-obligatorio a tra#és de una estructura de la zonatridimensional en lugar de un solo ligand. Las palabras de la lla#eN Laertilización" el acrosin" el acrosome" el pellucida de la zona" la esperma". El autor correspondienteN *r. Ricardo *. Goreno" *epartamento deFisiología" Facultad de 9iencias iológicas" cia de ontif ,ni#ersidad9atólica de 9)ile. ;lameda $@8" :antiago" 9)ile.


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Recei#edN El ? de agosto de %88. En el ormulario re#isadoN El 8 deenero de %8. ;ceptadoN El de enero de %8. 0&


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B4Rand" ??2!. además" un peptide ácidos -aminados" mientrasconteniendo esos residuos básicos" puede in)ibir la acti#ación deproacrosin inducida por ucoidan o solubilized zona pellucidaglycoproteins (ZK! (el 9rosby et al." ??I El ansen et al." ??IGoreno y arros" %888"I Ric)ardson y B4Rand" ??2!. El papel del

segundo :* en esperma-zona pellucida ue liga durante laertilización permanece ser determinado. Los ob+eti#os de este traba+oeran determinar si los cation de modif de proteolytic del pellucida de lazona por el acrosin pueden modifcar la encuadernación y'o penetraciónde espermatozoos" y para e#aluar en más detalle la contribución del:* en el pasa+e de esperma a tra#és del pellucida de la zona. LosG; Reacti#os de los GH


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alícuota cuidadosamente en %/ ml de G sacarosa" /8mG benzamidine"8.8%3 azide de sodio" y se centriugó para $8 min a /88 rpm en un 0E91&: el centríugo clínico a la temperatura del cuarto. El acrosin del +abalí se e5tra+o en una solución ácida ue contiene mm 19l" 83 glycerol"8.8%3 azide de sodio y /8 benzamidine del mm a p1 $.8" y salió toda la

noc)e a las @[W9. Esta suspensión se centriugó entonces a las %M"888gpara $8 min en un :or#all R9%- e+emplares centriugan y lossupernatant guardaron a las -%8[W9. rior al e5perimento" un %88alícuota del ml de proacrosin del +abalí )elado estaba el dialyzed denoc)e contra %L de mG 19l en p1 $.8. el ;crosin acti#idad ensaye laacti#idad de ;crosin estaba el spectrop)otometrically moderado en las%/[W9 siguiendo el )ydrolysis de &-benzoyl-L-arginineet)yl-ester (;EE!"después de la suma de o /8 o 88 ml de la solución de la enzima(Goreno el al del et." ???I Goreno el al del et." ??!. Los ensaye serealizaron en $ml #ol6menes" mientras usando una mezcla del substratede /8 mm


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ZK (/mg'ml! o in)ibidor de trypsin de so+a (:


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embargo" )ue#os tratados para 8 min con ./ o $ , de acrosinmostraron la más ba+o proporción de ertilización y n6mero deespermatozoos limitados a un cantly del signif como comparado con losmandos (1igo $;" " p"La *0:9,:0& *esde las obser#aciones seminales ue el ed del purif

Z% no in)ibe la encuadernación de esperma acrosome-intacta al ratónincita en el #itro" y sólo liga a la esperma acrosome-reaccionada" esteglycoprotein era uertemente implícito como el receptor secundario parala esperma (el leil et al." ?I El leil et al." ?!. no está toda#íaclaro ué az6cares están en#ueltos en esta interacción" pero en losestudios del #itro )a sugerido ue es el specif estereoónico c" con laparticipación de residuos de az6car de polysulp)ated (ones" ??"I Lo elLeggio et al." ??@!. ,no un término esW -"$ galactose (leil yAassarman" ?! y el otro es un &-acetylglucosamine terminal propusoligarW -"@ transerase del galactosyl" un receptor de esperma putati#o(Golinero y 1ac)ea" ??8I El al de et de molinero." %88%!. ;demás" la

ertilidad continuada de ratones mutante ue o altan la enzima ueagrega el términoW -"$ galactose (el


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suelta localmente para desenmascarar los nue#os sitios obligatoriossecundarios en un estéreo-specif la orientación de c" permitiendo laacti#ación de un nue#o +uego de proteases del acrosomal y el adelantoe5tenso de la esperma. Esta )ipótesis pone la acti#idad de protease deacrosomal como un elemento importante para e5poner los sitios

obligatorios secundarios. El )ec)o ue después del tratamiento con elacrosin nosotros obser#amos un n6mero aumentado de límite deesperma a la zona" pero una disminución en la proporción deertilización" sugiere ue los sitios obligatorios recientementedesenmascarados no están en la orientación apropiada permitir lapenetración de esperma completada. ^or ué la e5posición de nue#ossitios obligatorios disminuye la proporción de ertilizaciónW ,na posiblee5plicación es ue un aumento en el n6mero de límitelos espermatozoos a la zona lle#arán a una asociación de cient de inehentre ellos. Los estudios del ultrastructural más tempranos )an sugeridoue para penetrar el oocyte" los spermatozoon deban asociar en una

moda oblicua a tra#és del dorsal'#entral y el margen anterior. *e )ec)o"en la ertilización del #itro con las concentraciones de esperma altas(@"888 sperms'ml! lle#a a ambos una disminución en el n6mero deesperma limitada a la zona y una más ba+o proporción de ertilización (el

edlicDi et al." ?!. los estudios de ,ltrastructural )an mostrado eso aesta concentración" los espermatozoos eran asociados en unperpendicular y no la moda oblicua. ,na e5plicación alternati#a es ueese protease-tratamiento e5pone los nue#os sitios obligatorios en lospellucida de la zona y aumentos la interacción con la esperma. Losespermatozoos se entramparán en la zona debido al aumento en el

n6mero de ligar los sitios en la zona en este modelo. Esta idea reuerza auna modelo anterior en ue la interacción de espermatozoos acrosome-reaccionados debe ser muy bien bastante para apoyar suencuadernación a la zona" pero debe debilitar para permitir elmo#imiento de la esperma a tra#és de la zona. En este modelo" elproacrosin ' el acrosin se pre#io como la proteína zona-obligatoriaprincipal en el acrosome. roacrosin ue liga a la zona induce suacti#ación en acrosin ue ya no act6a recíprocamente con la zona y sesuelta al entorno del e5tracellular (el arros et al." ??%I Goreno el al delet." ???I


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de residuos básicos positi#amente cobrados de la superfcie delproacrosin'acrosin. &osotros )emos mostrado ese polysulates delmodelo pre#iamente como el ucoidan pre#enga acti#ación de proacrosinen el acrosin" un proceso ue se medió por un containin de peptide de-residuos! un racimo de tres aminoácidos básicos (residuos /?-M2!

(Goreno y arros" %888"I Goreno el al del et." %88%!. En este estudionosotros mostramos para el rst del f cronometra ue el ucoidan ysolubilized zona pellucida glycoproteins destacan la esperma limitada delpellucida de la zona" mientras sugiriendo ue el :* está de )ec)oen#uelto en la encuadernación de espermatozoos acrosome-reaccionados a la zona. 0nteresantemente" :

La Fertilización Abstracta Es Uno Del Más Específico y Cuidadosamente Reguló Las Interacciones...

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