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La partición núcleo‐citoplásmica de IYO como
interruptor binario de la diferenciación
Ramon Contreras de Luna
Universidad Autónoma de Madrid
Programa de Doctorado en Biociencias Moleculares
Madrid, 2018
La partición núcleo‐citoplásmica de IYO como
interruptor binario de la diferenciación
Memoria presentada por Ramon Contreras de Luna
para optar al grado de Doctor en Biología
Universidad Autónoma de Madrid Departamento de Biología
Facultad de Ciencias
Dr. Enrique Rojo de la Viesca Dra. Maite Sanmartín Artiñano
DIRECTOR DIRECTORA
Dra. Isabel Correas Hornero
TUTORA
Ramon Contreras de Luna
DOCTORANDO
Este trabajo ha sido realizado en el Departamento de Genética Molecular de Plantas del Centro Nacional de Biotecnología-CSIC y ha
sido financiado mediante la ayuda Predoctoral de Formación de Personal Investigador, del Ministerio de Economía y Competitividad, de referencia BES-2013-062850 asociada al proyecto de investigación
BIO2012-39968-C03-01.
Agradecimientos
A mi familia.
A todas aquellas personas que me pidieron consejo y opinión, porque ellas son
las que realmente me hicieron darme cuenta de que estaba aprendiendo algo.
Índice
Agradecimientos ................................................................................................................... 6
Abreviaturas ........................................................................................................................ 12
Resumen .............................................................................................................................. 14
Summary ............................................................................................................................. 15
1. Introducción ........................................................................................... 17
1.1 La diferenciación celular ...................................................................... 19
1.2 Importancia de la regulación transcripcional en la diferenciación ........ 21
1.3. IYO y su papel en la diferenciación ..................................................... 25
1.4 Transporte a través del poro nuclear .................................................... 27
1.5. Ensamblaje e importe de la Pol II al núcleo ......................................... 29
1.6 Funciones celulares de las proteínas RPAP (RNA Polymerase Associated
Proteins) ..................................................................................................... 31
2. Objetivos ................................................................................................ 37
3. Material y Métodos ................................................................................. 41
3.1 Material biológico ................................................................................. 43
3.1.1 Material vegetal y condiciones de crecimiento ......................................................... 43
3.1.2 Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento utilizadas ...................................... 44
3.1.3 Números de accesión y clones de los genes empleados ............................................ 44
3.2 Preparación y análisis de ácidos nucleicos ........................................... 44
3.2.1 Aislamiento de ARN total ........................................................................................... 44
3.2.2 Aislamiento de ADN plasmídico ................................................................................. 45
3.2.3 Aislamiento de ADN genómico................................................................................... 45
3.2.4 Técnicas electroforéticas y aislamiento de fragmentos de ADN en geles de agarosa45
3.2.5 Genotipado de líneas mutantes ................................................................................. 45
3.2.6 Chip-seq ...................................................................................................................... 46
3.2.7 Análisis de citometría de flujo .................................................................................... 47
3.3 Clonaje de las construcciones .............................................................. 48
3.3.1 Generación de las construcciones .............................................................................. 48
3.3.2 Generación de mutantes por sustitución y deleción ................................................. 48
3.3.3 Transformación de Escherichia coli y Agrobacterium tumefaciens ........................... 49
3.3.4 Transformación de plantas de Arabidopsis thaliana .................................................. 49
3.3.5 Expresión transitoria en N. benthamiana .................................................................. 49
3.4 Técnicas para el análisis de proteínas .................................................. 50
3.4.1 Transferencia e inmunodetección de proteínas ........................................................ 50
3.4.2 Análisis de localización subcelular por microscopía................................................... 50
3.4.3 Ensayos de interacción proteína-proteína ................................................................. 51
3.4.4 Tratamiento con Leptomicina .................................................................................... 51
3.5 Técnicas de microscopia óptica ............................................................ 51
3.5.1 Análisis con hidrato de cloral ..................................................................................... 51
3.6 Aplicaciones bioinformáticas ................................................................ 52
4. Resultados .............................................................................................. 59
4.1 Identificación y caracterización de los dominios determinantes de la
localización subcelular de IYO ................................................................... 61
4.1.1 Identificación de las posibles señales de tránsito núcleo/citoplasma y estudio de su
funcionalidad mediante mutagénesis dirigida .................................................................... 61
4.1.2 Análisis de construcciones truncadas para identificar dominios implicados en la
distribución núcleo/citoplásmica de IYO ............................................................................. 63
4.2 Análisis del efecto de las alteraciones en la localización subcelular sobre
la actividad de IYO ..................................................................................... 66
4.2.1 Generación de líneas transgénicas de sobreexpresión estables ................................ 66
4.2.2 Estudios de complementación del mutante nulo iyo-3 ............................................. 66
4.2.3 Localización y efecto de la sobreexpresión de las construcciones ............................ 67
4.3 Caracterización molecular de IYO: identificación de interactores .......... 77
4.3.1 Interacción de IYO con el complejo de la Pol II .......................................................... 78
4.3.2 Interacción entre IYO y el complejo Mediator ........................................................... 79
4.3.3 Interacción de IYO con factores canónicos de transporte núcleo/citoplásmico ....... 80
4.3.4 Interacción de IYO con factores no canónicos de importe nuclear ........................... 82
4.3.5 RIMA forma un complejo con IYO e interacciona con las proteínas GPN .................. 88
4.4 Análisis de la función de IYO y RIMA en la regulación de la transcripción
mediada por la Pol II .................................................................................. 90
4.4.1 Inmunopurificación de cromatina con anticuerpos frente a HA y secuenciación
masiva en extractos de plantas que expresan IYO-HA o RIMA-HA ..................................... 90
4.4.2 Identificación de regiones de la cromatina a las que se une IYO-HA o RIMA-HA. ..... 91
4.4.3 Expresión de los genes diana del complejo IYO/RIMA............................................... 93
5. Discusión ............................................................................................... 97
5.1 Factores determinantes y mecanismo de transporte de IYO al núcleo .. 99
5.2 La modificación de la localización de IYO provoca cambios en el
desarrollo en Arabidopsis ......................................................................... 103
5.3 Regulación de programas de desarrollo mediado por IYO ................... 105
6. Conclusiones ........................................................................................ 111
8. Bibliografía ............................................................................................. 121
12
Abreviaturas
Aa: Aminoácido
ADN-T: ADN de transferencia
ARM: Dominio Armadillo
BiFC: Ensayo de complementación bimolecular de fluorescencia
CDK: Quinasa dependiente de ciclina
ChIP-seq: Inmunoprecipitación de cromatina seguida de secuenciación masiva
Col-0: Columbia 0
CRM1: Gen Chromosomal Maintenance 1
CTD: Dominio carboxilo terminal de la subunidad RPB1 de la Pol II
cYFP: Fracción C-terminal de la proteína YFP
GFP: Proteína fluorescente verde
He: Heterocigota
Ho: Homocigota
IMPA: Importina de tipo A
IYO: MINIYO
IWR1: Interacting with RNA polymerase II protein 1
LB: Luria-Bertani
LMB: Leptomicina
MBP: Maltose Binding Protein
MS: Murashige y Skoog
NASC: Nottingham Arabidopsis Stock Center
NES: Secuencia de exporte nuclear
NLS: Señal de localización nuclear
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nYFP: Fracción N-terminal de la proteína YFP
OD: Densidad óptica
IP: Ioduro de propidio
PMSF: Fluoruro de fenilmetilsulfonilo
Pol II: ARN polimerasa II
QQT: Quatre quart
RAN: Ras-related Nuclear protein
rARN: ARN ribosomal
RBA50: RNA polymerase II (B) Associated protein,
RIMA: RPAP2 IYO Mate
RPAP: Proteínas asociadas a la ARN polimerasa
RPB: Subunidades de la ARN polimerasa
RTR1: Regulator of transcription 1
SDS-PAGE: Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico
snARN: ARN nuclear de pequeño tamaño
TAIR: The Arabidopsis Information Resource
YFP: Proteína fluorescente amarilla
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Resumen
La diferenciación celular es un evento fundamental en el desarrollo de todos
los organismos pluricelulares. Sin embargo, se desconocen los mecanismos
moleculares que subyacen a la activación de este proceso vital para el
desarrollo. MINIYO (IYO) y su ortólogo en animales, RPAP1, son
fundamentales para la activación de la diferenciación celular y estudios
previos del laboratorio sugieren que la entrada de IYO en el núcleo es la que
desencadena este proceso. Por tanto, es esencial identificar que dominios
determinan la localización subcelular de IYO para elucidar si, efectivamente, la
migración de IYO al núcleo funciona como interruptor de la diferenciación en
plantas. Los resultados de esta tesis demuestran que IYO contiene dos señales
de localización nuclear, NLSA y NLSB, que dirigen su entrada al núcleo y son
necesarias para su interacción con la GTPasa RAN1 y la importina IMP4.
Además, el estudio de construcciones afectadas en la distribución nucleo-
citoplásmica muestra una correlación positiva entre los niveles nucleares y la
activación de la diferenciación. Así, la sobreexpresión del N-terminal de IYO,
que muestra un aumento en los niveles nucleares, provoca la diferenciación
prematura de los meristemos, mientras que la sobreexpresión de la región C-
terminal, que no entra en el núcleo, causa un retraso en la diferenciación
celular de las plantas semejante al observado en el mutante hipomórfico iyo-1.
IYO interacciona con las subunidades RPB2, RPB3, RPB10 y RPB11 de la ARN
polimerasa II (Pol II) y con las proteínas RIMA, GPN1 y GPN2. Un complejo
similar ha sido descrito en animales, donde los ortólogos de GPN1 y GPN2
participan en el importe del complejo al núcleo. En el núcleo, IYO interacciona
con MED19, del complejo Mediator, y con RIMA, una fosfatasa de la Pol II, lo
que sugiere que IYO activa la diferenciación a través de su interacción con
reguladores globales de la transcripción dependiente de Pol II. Respaldando
esta hipótesis, en experimentos de secuenciación masiva de cromatina
inmunoprecitada, hemos obtenido evidencias de que IYO y RIMA se unen a un
grupo de genes diana relacionados con la diferenciación. Además, IYO y RIMA
se distribuyen a lo largo del cuerpo de los genes diana, sugiriendo que ambas
proteínas acompañan a la Pol II durante su transcripción. Los resultados de
esta tesis apoyan el modelo de que la migración de IYO al núcleo induce la
reprogramación transcripcional a gran escala para iniciar la diferenciación de
las células madre.
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Summary
Cell differentiation is an essential step in the development of all multicellular
organisms. However, the molecular mechanisms that underlie the activation of
cell differentiation remain unknown. MINIYO (IYO) and its orthologue in
animals, RPAP1, are key players in the activation of cell differentiation.
Previous work in our laboratory suggests that translocation of IYO into the
nucleus functions as a molecular switch for triggering cell differentiation.
Thus, the identification of the domains that regulate IYO subcellular
localization is essential to elucidate if, indeed, nuclear migration of IYO
triggers cell differentiation. Our results demonstrate that IYO contains two
nuclear localization signals, NLSA y NLSB, which mediate the interaction with
the canonical nuclear transport machinery GTPase RAN1 y IMPA4. Moreover,
the analysis of constructs showing different nuclear/cytosolic partitioning
reveals a positive correlation between the levels of nuclear accumulation y the
rate of cell differentiation. For instance, the overexpression of the N-terminal
region of IYO, which shows increased nuclear accumulation, produces
premature differentiation of the meristems, whereas the overexpression of the
cytoplasmic C-terminal region causes a delay in the cell differentiation, similar
to the hypomorphic mutant iyo-1. IYO interacts with the RPB2, RPB3, RPB10
y RPB11 subunits of RNA polymerase II (Pol II) and with RIMA, GPN1 and
GPN2. A similar complex has been described in animals, where GPN1 and
GPN2 participate in nuclear import of the complex. Within the nucleus, IYO
interacts with MED19, a component of the Mediator complex, and RIMA, a Pol
II phosphatase, suggesting that IYO activates differentiation through
interaction with global regulators of Pol II-dependent transcription. Supporting
this hypothesis, in chromatin immunoprecipitation experiments followed by
deep sequencing, we have obtained evidence that IYO y RIMA bind a cohort of
genes related with cell differentiation. Moreover, IYO y RIMA bind their targets
along their gene bodies, indicating that they accompany Pol II during
transcription. Altogether, our findings support the model that the migration of
IYO into the nucleus induces large-scale transcriptional reprogramming to
initiate stem cell differentiation.
1. Introducción
“Somos enanos a hombros de gigantes”
atribuido Bernard de Chartres ca. 1130.
Introducción
19
1. Introducción
1.1 La diferenciación celular
La diferenciación celular es un proceso mediante el cual las células se
especializan, adquiriendo nuevas capacidades y características necesarias
para su función en el tejido del que formen parte. En el inicio de este proceso,
la progenie de las células madre tiene que decidir entre dos posibles destinos
celulares, mantener la pluripotencia para preservar la población de células
madre o iniciar el proceso de diferenciación para adquirir nuevas funciones
especializadas. Esta decisión es crucial en el desarrollo del organismo y, por
tanto, está sometida a un estricto control genético, (Iyer-Pascuzzi and Benfey,
2009). Se conocen muchos de los genes que participan en determinar la
identidad celular y la formación de órganos específicos en sistemas modelo de
animales y plantas, como pueden ser los que especifican la generación de los
ojos en Drosophila y del sistema nervioso en Caenorhabditis elegans (Chalfie
and Au, 1989, Bonini et al., 1993), o la formación de los órganos florales en
Arabidopsis (Schwarz-Sommer et al., 1990, van den Berg et al., 1997). Sin
embargo, se desconocen los mecanismos moleculares que subyacen a la
decisión inicial entre mantener la pluripotencia o activar la diferenciación
(Benfey, 2016).
Gran parte de la información sobre el mantenimiento de la pluripotencia y la
entrada en diferenciación proviene de estudios en animales, en muchos casos
usando sistemas celulares. Sin embargo, tanto en plantas como en animales,
las células madre están organizadas en nichos que juegan un papel
fundamental en la regulación del destino celular de la progenie. Así, el
mantenimiento de la pluripotencia depende de señales de corto alcance que
provienen de células de un centro organizador (Scheres, 2007a), por lo que es
fundamental estudiar las células madre en el contexto del organismo. En este
sentido, las plantas son un sistema modelo especialmente poderoso para el
estudio del mantenimiento y la diferenciación de las células madre a nivel de
organismo completo, ya que la inmovilidad celular y la organización en nichos
determinados facilita el seguimiento de la progresión de la progenie de las
células madre, pudiéndose detectar cambios en el ritmo de renovación y
diferenciación de las mismas (Sanmartin et al., 2012). En las plantas, los
nichos de células madre se localizan principalmente en meristemos apicales
Introducción
20
presentes en los tallos y las raíces, así como en otros meristemos presentes en
órganos y tejidos de la planta adulta, como son el periciclo del polo xilemático
y el cambium.
Fig. 1.1. Representación del meristemo apical de la raíz de Arabidopsis
thaliana. Izquierda: Sección longitudinal del ápice de la raíz hasta la zona de
elongación. Derecha: ampliación de la zona meristemática con los tipos celulares que
se encuentran en el meristemo apical de la raíz.
El meristemo apical de raíz es un modelo experimental ampliamente utilizado
para el estudio de la diferenciación en plantas (Benfey, 2016). Este meristemo
contiene un grupo de células madre en el ápice que, a través de una serie de
divisiones estereotípicas, forma capas celulares concéntricas que darán lugar
a los distintos tejidos de la raíz adulta. Se pueden reconocer distintas regiones
en el meristemo de raíz: el centro quiescente, las células iniciales y los tejidos
derivados de ellas (Scheres, 2007b, Heidstra and Sabatini, 2014). El centro
quiescente está formado por células madre que apenas se dividen y que
funcionan como centro organizador para mantener la pluripotencia de las
células iniciales circundantes (Fig. 1.1). Las células iniciales y las células
meristematicas derivadas de ellas, son células pluripotentes con un mayor
índice de proliferación celular que generan las capas celulares de la raíz,
permitiendo el crecimiento en longitud (Benfey and Scheres, 2000, Santuari et
al., 2016).
Introducción
21
1.2 Importancia de la regulación transcripcional en la
diferenciación
La diferenciación celular requiere cambios drásticos en la transcripción que
suponen por un lado, la activación de genes relacionados con la identidad
celular y, por otro, la represión de los programas de pluripotencia (Sablowski,
2011, Young, 2011). La Pol II es la que se ocupa de la transcripción de todos
los genes codificantes de proteínas (Henry et al., 1998, Cramer et al., 2008,
Forget et al., 2013). Por tanto, la regulación de la transcripción mediada por
Pol II debe tener un papel central en la transición entre proliferación y
diferenciación (Meyerowitz, 2002, Gaillochet and Lohmann, 2015).
Los estudios pioneros sobre la transcripción por Pol II se realizaron
principalmente en levaduras, donde se demostró que el paso limitante para la
expresión de la mayoría de los genes era la formación del complejo de
iniciación y que la elongación transcripcional procedía de forma constitutiva
sin una regulación importante. Sin embargo, resultados más recientes en
sistemas animales han mostrado que la elongación y la terminación
transcripcionales son también pasos altamente regulados que afectan
significativamente al grado de transcripción de los genes en metazoos. En
especial, la transición desde la iniciación a la elongación productiva de los
transcritos es fundamental en el control de la transcripción durante la
diferenciación celular (Core and Lis, 2008). Así, se ha demostrado que en
células madre de humanos, la Pol II se asocia al promotor de la mayoría de los
genes, pero en alrededor del 30% de ellos, entre los cuales se encuentran
muchos de los genes implicados en desarrollo, no se producen niveles
significativos de transcritos porque el paso de la Pol II a elongación productiva
está impedido (Guenther et al., 2007). En plantas, también se han descritos
varios factores reguladores de la elongación transcripcional y la
caracterización de mutantes en dichos factores de elongación ha desvelado el
papel fundamental de estas proteínas en el desarrollo (Van Lijsebettens and
Grasser, 2014). Entre los factores de elongación implicados en desarrollo en
plantas, está la proteína MINIYO (IYO), que es un interactor de la Pol II
necesario y limitante para iniciar la diferenciación celular (Sanmartín et al.,
2011). La mutación de IYO reduce los niveles globales de Pol II en elongación
productiva en órganos en desarrollo (Sanmartín et al., 2011), mientras que la
sobrexpresión confiere mayor resistencia al inhibidor de elongación
Introducción
22
transcripcional 6-azauracilo (Sanmartin et al., 2011), sugiriendo que IYO
promueve la elongación transcripcional. En concordancia con esto, en los
mutantes de IYO aumentan los niveles de ubiquitinación de RPB1, una señal
molecular inequívoca de que la elongación transcripcional está afectada.
Además, IYO interacciona física y genéticamente con componentes del
complejo Elongator para activar la diferenciación, indicando que la regulación
de esta fase de la transcripción también es esencial para activar programas de
diferenciación y desarrollo en la progenie de las células madre de plantas.
Durante las distintas etapas de la reacción de transcripción, la Pol II sufre una
serie de modificaciones post-traduccionales en las repeticiones de
heptapéptidos del extremo carboxilo terminal (CTD) de la subunidad mayor
RPB1. Estas modificaciones son esenciales para regular la actividad
transcripcional de la Pol II y para el reclutamiento de los distintos complejos
que participan en esta reacción, como son los complejos de procesamiento y
terminación del ARN mensajero (mARN) (Jeronimo et al., 2004, Cloutier and
Coulombe, 2010, Minaker et al., 2013, Boulon et al., 2010). En el complejo de
pre-iniciación, la Pol II está hipofosforilada. Para escapar del promotor e
iniciar la transcripción, la Pol II se fosforila en la posición serina 5 (Ser5) de
los heptapéptidos. Seguidamente la Pol II sufre una defosforilación parcial de
las serinas en posición 5 y una fosforilación de las serinas en posición 2 que
marca la entrada en elongación productiva. Se ha propuesto que la proteína
Rtr1 de levaduras y su ortólogo en animales RPAP2 catalizan la defosforilación
en serina 5 que precede a la entrada en elongación productiva, y serían
necesarias para esta transición. Así, la inactivación de Rtr1 lleva a un
aumento de Pol II con el CTD fosforilado en serina 5, a una bajada de los
niveles de transcripción y a errores en la terminación transcripcional (Gibney
et al., 2008, Mosley et al., 2009). El homólogo de Rtr1 en Arabidopsis es la
proteína RIMA, que interacciona con IYO. RIMA tiene conservados un dedo de
zinc que es esencial para la actividad fosfatasa de la proteína (Xiang et al.,
2012, Irani et al., 2016, Hunter et al., 2016, Munoz et al., 2017), por lo que
IYO podría, a través de su interacción con RIMA, regular el fosfoestado de la
Pol II y la transición a elongación productiva. De hecho, se ha observado que
el silenciamiento de RPAP1 en células de ratón impide la interacción de
RPAP2/RIMA/Rtr1 con la Pol II y resulta en un aumento de la Pol II fosforilada
Introducción
23
en Ser5 presente en los promotores de genes importantes para los procesos de
diferenciación (Lynch et al., 2018).
La reducción de la expresión de RPAP1 en células de ratón también conlleva
que se reduzca la asociación de numerosas subunidades del complejo
Mediator con la Pol II (Lynch et al., 2018). Mediator es un complejo
multiproteico esencial para la transcripción, al actuar como un puente
molecular entre la Pol II, el ADN y los factores específicos de la transcripción
(Boube et al., 2014, Plaschka et al., 2015, Buendía-Monreal and Gillmor,
2016). El complejo Mediator está conservado en eucariotas, aunque la
homología de secuencia en las distintas subunidades es menor del 20% entre
especies de distintos reinos. El número de subunidades varía de levaduras a
humanos y plantas, y en éstas últimas consta de 34 subunidades (Samanta
and Thakur, 2015). Las subunidades se organizan en cuatro módulos: la
cabeza, el central, la cola y el módulo quinasa (Fig. 1.2). En plantas, el módulo
de la cabeza está formada por las subunidades MED6, MED8, MED11,
MED17, MED18, MED20 y MED22, mientras que el módulo central lo
componen MED1, MED4, MED5, MED7, MED9, MED10, MED19, MED21 y
MED31 (Buendía-Monreal and Gillmor, 2016). El complejo Mediator cambia
su conformación cuando interacciona con el complejo de la Pol II. En primer
lugar interacciona a través del módulo de la cabeza y, tras el cambio
conformacional, el módulo central interacciona con la Pol II de forma que
orienta a la polimerasa facilitando la interacción con otros factores de
transcripción (Chadick and Asturias, 2005). Además, el complejo Mediator
tiene una gran plasticidad que le permite moverse alrededor de la Pol II y
cambiar de conformación en respuesta al contacto con factores de
transcripción específicos (Boube et al., 2014). Cuando esto ocurre, más de 20
subunidades del complejo Mediator interaccionan estrechamente con la Pol II
(Asturias et al., 1999). Además, se ha descrito que la presencia de la
subunidad RPB1 de la Pol II es necesaria para que se lleve a cabo la
interacción (Myers et al., 1998). Por otra parte, la interacción parece iniciarse
en la región posterior de la Pol II, concretamente a través del conjunto formado
por RPB3/RPB11, dado que la mutación en el lazo de zinc (zinc loop) de la
Rpb3 de levaduras impide la interacción entre ambos complejos (Davis et al.,
2002, Plaschka et al., 2015).
Introducción
24
Fig. 1.2. Modelo de interacción entre el complejo Mediator y la Pol II. El complejo
Mediator envuelve a la Pol II unida al ADN y regula los factores de transcripción que
interactúan con la Pol II mediante su propia reestructuración. Las 12 subunidades de
la Pol II aparecen numeradas. En color naranja aparecen las subunidades del módulo
central y se señala la subunidad MED19. Basado en Plaschka et al., 2015 y Buendía-
Monreal y Gillmor, 2016.
Dentro del complejo Mediator, la subunidad MED19 es un elemento central
del complejo que interviene directamente en el ensamblaje del complejo
Mediator, en la unión a factores de transcripción, al ADN y a la quinasa CDK8,
que inhibiría la transcripción cuando el complejo ya se ha unido al ADN
(Buendía-Monreal and Gillmor, 2016). Se ha propuesto que MED19 podría
tener un papel destacado en la regulación de la conformación del complejo y
de su actividad en relación con la Pol II (Ding et al., 2009, Boube et al., 2014,
Samanta and Thakur, 2015, Buendía-Monreal and Gillmor, 2016). Además, se
ha descrito el papel de otras subunidades del complejo en diferentes procesos,
como la respuesta a auxinas, la proliferación celular, la floración o en los
procesos de transición de embrión a plántula, lo que sugiere que Mediator es
un importante regulador del desarrollo en plantas y de los procesos de
transición entre los diferentes estadios de desarrollo (Buendía-Monreal and
Gillmor, 2016). Sin embargo, los mecanismos moleculares mediante los cuales
interaccionan los dos complejos están poco estudiados (Buendía-Monreal and
Gillmor, 2016). El complejo Mediator parece interaccionar con la Pol II a través
de RPB3, una subunidad que también interacciona con IYO en el núcleo
(Sanmartín et al., 2011). Teniendo en cuenta su papel en el control
transcripcional, IYO y/o RIMA podrían intervenir en el reclutamiento o en la
activación de Mediator para regular la actividad de la Pol II y reprogramar
transcripcionalmente a la célula para iniciar la diferenciación.
Introducción
25
1.3. IYO y su papel en la diferenciación
La función de IYO en la diferenciación celular se elucidó gracias a la
caracterización del mutante iyo-1 de Arabidospis, que tiene una mutación
puntual que provoca un cambio de aminoácido de glicina (G) a ácido glutámico
(E) en la posición 963 (Sanmartin et al., 2011). Esta mutación se encuentra en
un posible dominio RGG altamente conservado en plantas siendo estos
motivos importantes en procesos que facilitan interacciones entre el ADN, el
ARN y las proteínas (Thandapani et al., 2013). Esta mutación provoca, a nivel
fenotípico, un retraso en la generación de las hojas ligado a una expansión del
tamaño del meristemo apical del tallo y a la formación de meristemos
ectópicos y de tallos fasciados y, a nivel transcripcional, un aumento en la
expresión de genes relacionados con células indiferenciadas y una
disminución en la expresión de genes relacionados con el proceso de
diferenciación (Sanmartin et al., 2011).
Además de la mutación hipomórfica iyo-1, se han descrito dos alelos nulos
resultantes de la inserción de T-ADN en exones, iyo-2 (SALK_099872) e iyo-3
(SAIL_692-G12). Mientras plantas heterocigotas IYO/iyo-2 o IYO/iyo-3
presentan un fenotipo indistinguible a las plantas silvestres, no es posible
recuperar plantas homocigotas, debido a que provocan letalidad embrionaria.
Esto puede deberse a que en estas plantas la formación del endospermo, que
permite el crecimiento de la semilla y la progresión del embrión, está
bloqueado. El cruce entre iyo-1 y cualquiera de los dos alelos nulos resulta en
graves defectos en la diferenciación, mayores a los observados en el mutante
homocigoto iyo-1. Así, las semillas de los trans-heterocigotos iyo-1/iyo-3 o iyo-
1/iyo-2 son capaces de germinar, pero se desarrollan en una estructura
vegetativa similar a un callo que puede mantenerse en condiciones in vitro, y
que presenta alguna hoja en su superficie, aunque no llega a formar órganos
reproductores.
IYO se expresa a altos niveles en embriones, en meristemos y en primordios,
mientras que su expresión en tejidos maduros es muy baja. Además, la
localización subcelular de IYO varía según el grado de diferenciación de las
células. Así, IYO se localiza en el citoplasma de las células madre del
meristemo, mientras que se acumula en el núcleo de las células en la periferia
del meristemo que van a iniciar la diferenciación. Además, la sobreexpresión
de IYO causa la diferenciación prematura de las células madre en los
Introducción
26
meristemos, sugiriendo que IYO no sólo es un factor necesario, sino que
también es limitante para inducir la diferenciación celular en Arabidopsis. Por
ello, el aumento de los niveles nucleares de IYO, que coincide con la entrada
en diferenciación celular, podría ser responsable de iniciar este proceso. Sin
embargo, hasta la realización de esta tesis no se conocían los mecanismos
moleculares que participan en la migración de IYO al núcleo (Sanmartin et al.,
2011) por lo que esta hipótesis no había sido aún demostrada.
IYO es una proteína de 1495 aminoácidos, mientras que RPAP1, su homólogo
en humanos, tiene 1393 aminoácidos y RBA50, su homólogo en levaduras,
tiene 439 aminoácidos. IYO no contiene dominios de función conocida que den
indicios de su posible actividad molecular (Sanmartin et al., 2011). La mayor
conservación de secuencia con homólogos de otras especies y reinos se
encuentra en la región N-terminal de IYO, concretamente en los primeros 700
aminoácidos, donde se localizan los dominios RPAP1, que caracterizan a la
proteína (Fig. 1.3). Aunque la actividad molecular de estos dominios RPAP1 no
está caracterizada, se han relacionado con el correcto funcionamiento de la Pol
II (Jeronimo et al., 2004). El dominio RPAP1 N-terminal en IYO comprende los
aminoácidos en la posición 210 a 253 y el dominio RPAP1 C-terminal incluye
desde el aminoácido 318 al 396 (Jeronimo et al., 2004, Sanmartin et al.,
2011).
Fig. 1.3. Homólogos de IYO con sus dominios funcionales comunes.
Representación esquemática de las cadenas polipeptídicas de ScRBA50, homólogo de IYO en Saccharomyces cerevisiae, HsRPAP1, homólogo de IYO en Homo sapiens y
AtIYO, proteína en Arabidopsis thaliana. Todas ellas con los dominios RPAP (azul) que
caracterizan a la proteína y los dominios armadillo (verde), comunes a los tres
homólogos, y el dominio RGG (amarillo), presente y característico de plantas.
Cuando se lleva a cabo una mutación de estos dominios en levaduras se
producen cambios globales en la expresión génica similares a los causados por
la ausencia de la Rpb11 (Jeronimo et al., 2004). Además de estos dominios,
IYO y sus homólogos presentan varias repeticiones en tándem del motivo
armadillo (ARM), de 40 aminoácidos, que formarían una estructura
Introducción
27
tridimensional de α-hélices, conservada en eucariotas (Jeronimo et al., 2004).
En IYO, las repeticiones de los motivos ARM se encuentran entre los
aminoácidos 43-465, 545-750, 800-895 y 1009-1060. Los dominios ARM
intervienen en interacción proteína-proteína y las proteínas que los contienen
pueden tener un gran número de interactores y funciones muy diversas en la
célula. Estos motivos se han relacionado con el reconocimiento de señales de
entrada al núcleo y la interacción con microtúbulos y con factores de
intercambio como GTPasas (Coates, 2003).
1.4 Transporte a través del poro nuclear
El transporte de grandes complejos a través de la envoltura nuclear, como la
Pol II, requiere de un mecanismo de transporte activo, lo que permite un
control estricto del importe y, por consiguiente, de la actividad nuclear de los
complejos. Moléculas de pequeño tamaño pueden atravesar el poro nuclear
por difusión pero los elementos mayores de 9 nm (o alrededor de 50 KDa)
necesitan un transporte facilitado, generalmente acompañado de gasto de
energía (Görlich and Kutay, 1999). En el caso de las grandes moléculas, la
entrada depende de la presencia de señales específicas para el transporte. Así,
se conocen varias señales que marcan los sustratos para su transporte, entre
las cuales uno de las más conocidas es el transporte mediante señales de
localización nuclear (NLS) (Dingwall and Laskey, 1991, Köhler et al., 1999).
Las señales NLS clásicas pueden ser tanto monopartitas como bipartitas. Las
NLS monopartitas están formadas por una secuencia de aminoácidos básicos
que fueron descritas gracias a los estudios realizados con el antigen largo T del
virus SV40 (126PKKKRRV132) (Lange et al., 2007b). Del estudio de diferentes
dominios NLS se ha derivado la secuencia consenso K(K/R)X(K/R), en el que
solo son necesarias la lisina (K) en posición P1 y dos aminoácidos básicos en
posición P2 y P4 para la funcionalidad del NLS. Por otra parte, el modelo de
NLS bipartita es el presente en la nucleoplasmina
(155KRPAATKKAGQAKKKK170) que incluye dos regiones ricas en lisinas y
aminoácidos básicos separadas por 10 a 12 aminoácidos (Conti and Kuriyan,
2000, Hodel et al., 2001, Lange et al., 2007). Existe un tercer tipo de NLS, no
clásico, que se encuentra solo en proteínas de levaduras y plantas como
Matα2, un represor de la transcripción, cuya secuencia consenso KIPIK es
también rica en lisinas (Hicks et al., 1995).
Introducción
28
Se ha descrito que la entrada al núcleo mediada por señales de tipo NLS
ocurre en un proceso en dos pasos (Fig. 1.4). En primer lugar tiene lugar la
unión entre la proteína cargo que debe entrar al núcleo y el sistema de
transporte, y en segundo lugar, la translocación del complejo a través del poro
nuclear (Newmeyer et al., 1986). Las proteínas con NLS interaccionan
mediante este dominio con las importinas α en el citoplasma, que a su vez se
anclan a las importinas β, que son las encargadas de facilitar el transporte a
través del poro nuclear (Smith et al., 1997, Macara, 2001). Una vez el
heterotrímero se encuentra en el interior del núcleo, las proteínas Ran unidas
a GTP (Ran-GTP) se encargan de disociar el complejo y liberar el cargo
(Quimby, 2003, Lee et al., 2005).
Fig. 1.4. Modelo de entrada de proteínas con dominio NLS al núcleo. 1) La
proteína con el dominio NLS interacciona con la importina α y ésta con la importina β, y el conjunto pasa a través del poro nuclear, mediante la interacción de la importina β
con las proteínas del poro. 2) Una vez en el núcleo, Ran-GTP interacciona con el
conjunto. 3) Ran-GTP promueve cambios conformacionales en las importinas que
llevan a la liberación del cargo y permite el retorno de las importinas al citoplasma
(Macara, 2001).
Las importinas α están presentes en todos los eucariotas y se caracterizan por
la presencia de dos dominios de unión a señales NLS en la región central de la
proteína (Adam and Geracet, 1991, Görlich et al., 1995, Conti et al., 1998).
Análisis computacionales sugieren que la tasa de importe depende de la
afinidad de la importina por la señal NLS del cargo y de la concentración de la
importina (Dingwall and Laskey, 1991, Riddick and Macara, 2005). En
Arabidopsis, las importinas α se agrupan en una familia multigénica que
cuenta con 9 miembros con una alta identidad de secuencia entre ellos
Introducción
29
(Köhler et al., 1999, Bhattacharjee et al., 2008). Aunque muchas importinas α
se expresan ubicuamente, otras presentan especificidad de tejidos. Del mismo
modo, algunas han mostrado especificidad por determinados sustratos,
mientras que hay sustratos a los que se unen diferentes importinas α (Köhler
et al., 1999, Koehler et al., 2002). Además, en Arabidopsis existen 17
importinas β que presentan especificidad de expresión en tejidos, mientras
que en animales existe una única isoforma. Las importinas β pueden unirse a
diferentes importinas α o directamente al cargo, para transportarlas a través
del poro nuclear (Bollman et al., 2003, Merkle, 2011).
Las proteínas Ran han sido implicadas en numerosos procesos, tales como la
regulación de la progresión celular, la síntesis de ADN y la estructura nuclear
(Murphy et al., 1997). Sin embargo, su papel más estudiado es en el importe y
el exporte de proteínas del núcleo (Melchior et al., 1993, Ach and Gruissem,
1994, Haizel et al., 1997, Meier, 2006). Las proteínas Ran son pequeñas
GTPasas de la superfamilia Ras que se caracterizan por los cambios en su
estructura dependiendo de su unión a GDP o GTP, lo que permite su actividad
diferencial. En el citoplasma, los cofactores RanGAP (Ran GTPase Activating
Protein) y RanBP (Ran Binding Proteins) estimulan la actividad GTPasa de Ran,
convirtiendo Ran-GTP en Ran-GDP (Kau et al., 2004a). En el núcleo, el factor
RCC1 (Regulator of Chromosome Condensation 1) estimula el intercambio de
GDP por GTP para generar Ran-GTP (Merkle, 2001, Gasiorowski and Dean,
2003). La presencia en el núcleo de los factores intercambiadores de guanina y
en el citosol de los factores activadores de la GTPasa son los responsables de
que la forma Ran-GDP sea mayoritaria en el citoplasma mientras que en el
núcleo se acumula la forma Ran-GTP. El gradiente Ran-GDP/Ran-GTP entre
el citosol y el núcleo es esencial para asegurar el correcto importe y exporte de
proteínas (Bischoff and Ponstingl, 1991, Kau et al., 2004b). En el núcleo, Ran-
GTP estimula la disociación del complejo de importe y libera el cargo. Además,
Ran-GTP forma un complejo con las exportinas y con el cargo que contiene
señales de exporte para su transporte al citosol. En el citosol la conversión a
Ran-GDP disocia el complejo y libera el cargo exportado (Quimby, 2003, Lee et
al., 2005).
1.5. Ensamblaje e importe de la Pol II al núcleo
La Pol II es un complejo de gran tamaño formado por 12 subunidades, RPB1 a
RPB12, altamente conservadas en eucariotas (Werner and Grohmann, 2011).
Introducción
30
En experimentos in vitro la Pol II activa no ha podido ser reconstituida,
indicando que el complejo necesita de varias proteínas accesorias para su
correcto ensamblaje y función (Niesser et al., 2015). Por otra parte, ninguna de
las subunidades de la Pol II cuenta con NLSs, a pesar de ser un complejo que
con función nuclear (Staresincic et al., 2011). En levaduras y animales la
entrada al núcleo de la Pol II está mediada por la proteína IWR1 conservada
evolutivamente. Esta proteína cuenta con una NLS (Czeko et al., 2011), por lo
que es capaz de interaccionar con la maquinaria de transporte nuclear y co-
transportar al complejo de la Pol II al núcleo. Aunque experimentos llevados a
cabo en levaduras muestran que la entrada de diversas subunidades de la Pol
II puede llevarse a cabo por otras vías secundarias, la pérdida de la proteína
IWR1 provoca defectos en el crecimiento (Hodges et al., 2005, Hu et al., 2007,
Gomez-Navarro and Estruch, 2015), que pueden recuperarse parcialmente
cuando se añade una señal de localización nuclear a RPB3 (Minaker et al.,
2013).
Fig.1.5. Representación esquemática de la Pol II completamente ensamblada.
Subunidades de la Pol II nombradas de la 1 a la 12. Las subunidades RPB2, RPB3,
RPB10, RPB11 y RPB12, forman un complejo de pre-ensamblaje, antes de unirse a la
RPB1 y al resto de subunidades. Basado en el esquema de Wild y Cramer, 2012.
Los estudios en animales y levaduras han revelado que las subunidades de
pequeño tamaño, RPB3 a RPB12, son capaces de entrar al núcleo por
difusión, mientras que las de mayor tamaño, RPB1 y RPB2, que forman el
centro catalítico de la enzima, necesitan que el complejo se ensamble al
completo en el citoplasma para posteriormente entrar en el núcleo (Wild y
Cramer, 2012). Además, la depleción de cualquier otra subunidad conlleva la
acumulación de RPB1 en el citoplasma (Wild and Cramer, 2012, Minaker et
Introducción
31
al., 2013, Gomez-Navarro and Estruch, 2015). Los estudios de purificación y
cristalización de las subunidades de la Pol II mostraron que RPB3, la tercera
subunidad en tamaño, se une a las subunidades RPB10, RPB11 y RPB12 para
formar un complejo de pre-ensamblaje (Fig. 1.5) (Ream et al., 2009). Este sub-
complejo se une a las subunidades RPB2/RPB9 y posteriormente se ensambla
con RPB1, a la que se unen las subunidades RPB4 a RPB8, permitiendo así la
entrada del conjunto en el núcleo, presumiblemente a través de la unión con
IWR1 (Wild and Cramer, 2012, Gomez-Navarro and Estruch, 2015). En
Arabidopsis, el homólogo de IWR1, DMS4/RDM4 se ha relacionado con la
actividad de las ARN polimerasas IV y V, exclusivas de plantas. Estas
polimerasas se consideran estrechamente emparentadas evolutivamente con
la Pol II y su función parece estar específicamente relacionada con el
silenciamiento génico por metilación (He et al., 2009, Ream et al., 2009,
Kanno et al., 2010, Wang and Ma, 2015).
1.6 Funciones celulares de las proteínas RPAP (RNA Polymerase
Associated Proteins)
En ensayos de purificación de la Pol II soluble en células de mamífero, se han
identificado cuatro proteínas mayoritarias asociadas al complejo,
denominadas RNA Polymerase Associated Proteins (RPAP) (Jeronimo et al.,
2007). Estas proteínas RPAP (Tabla 1.1) incluyen a RPAP1, que es el ortólogo
en animales de MINIYO. Las proteínas RPAP se encuentran conservadas en
levaduras, plantas y animales y se ha descrito que alteraciones en ellas
causan defectos en la acumulación o en la actividad enzimática de la Pol II en
el núcleo (Jeronimo et al., 2004, Sanmartin et al., 2011, Staresincic et al.,
2011, Munoz et al., 2017). Las proteínas RPAP han sido propuestas como
necesarias para el correcto ensamblaje de la Pol II en el citoplasma y para su
importe a núcleo. Tanto en animales como en levaduras, se especula que
RPAP1, el homólogo de IYO, no sólo se uniría en el citoplasma a la Pol II sino
que además viajarían juntos al núcleo (Wild and Cramer, 2012, Gomez-
Navarro and Estruch, 2015). Estudios de complementación bimolecular de la
fluorescencia muestran que los complejos entre IYO y RPB3/RPB10 se
acumulan en el núcleo (Sanmartin et al., 2011) y es posible que se co-
transporten desde el citosol en forma de complejo.
Introducción
32
Tabla 1.1. Homólogos en Homo sapiens, Arabidopsis thaliana y Saccharomyces
cerevisiae de las proteínas RPAP.
H. sapiens A. thaliana S. cerevisiae
RPAP1 MINIYO RBA50/YDR527W
RPAP2 RIMA Rtr1/YER139C
RPAP3 - RPAP3/Tah1/YCR060W
RPAP4/GPN1 GPN1/QQT2 Gpn1/Npa3/YJR072C
GPN2 GPN2/QQT1 Gpn2/YOR262W
GPN3 GPN3 Gpn3/Parcs/YLR243W
RPAP4/GPN1 forma parte de una pequeña familia de GTPasas, las GPNs,
compuesta por tres miembros conservados evolutivamente en eucariotas, que
se encuentran relacionadas estructuralmente con las proteínas Ran-GTPasas.
Estudios de deleción y mutación en estas proteínas GPNs han permitido
elucidar su papel en el ensamblaje y la entrada de las Pol II, IV y V al núcleo
(Niesser et al., 2015, Li et al., 2018). Las GPN muestran una localización
principalmente citoplasmática, pero se ha comprobado que se encuentran en
constante movimiento entre el citoplasma y el núcleo (Forget et al., 2010,
Reyes-Pardo et al., 2012). Además, se ha descrito la interacción entre GPN y
las proteínas del poro nuclear (Fagotto et al., 1998). Aunque en levaduras no
se ha observado interacción entre las proteínas GPN y las importinas, en
humanos sí se ha observado esta interacción, sugiriendo su participación en
diferentes medios de transporte al núcleo (Staresincic et al., 2011). La familia
de las GPN se caracteriza por la presencia de un dominio conservado
compuesto por los aminoácidos glicina-prolina-asparagina (GPN). Los estudios
de cristalización de su homólogo en arqueas sugieren que el motivo GPN
podría estar relacionado con la hidrólisis de GTP (Gras et al., 2007). Por otra
parte, el mecanismo de unión a GTP de todas las proteínas de tipo GTPasa se
ha relacionado con dominios tipo G (Fig. 1.7). Tanto GPN1 de Arabidopsis,
como sus homólogos en levaduras y humanos, presentan 5 dominios G
altamente conservados denominados G1 a G5 (Bourne et al., 1991, Niesser et
Introducción
33
al., 2015). Estos dominios GPN y G son fundamentales para la función de las
GPNs y se ha descrito que mutaciones en ellos provocan la acumulación
citoplasmática de Rpb1 tanto en humanos como en levaduras (Forget et al.,
2010, Carre and Shiekhattar, 2011).
Fig. 1.7: Representación de GPN1. A) Modelo de GPN1 unido a GDP mostrando el
bolsillo de interacción con otras proteínas cerrado. B) GPN1-GTP, el intercambio de
GDP a GTP produce un cambio conformacional en la proteína y permite la unión de interactores. C) Comparación de la homología de secuencia de aminoácidos entre los homólogos de GPN1 en levaduras (Saccharomyces cerevisiae), animales (Homo sapiens)
y plantas (Arabidopsis thaliana).
Experimentos in vivo mediante la sustitución de aminoácidos de estos
dominios han demostrado que el dominio GPN es fundamental para la
hidrólisis de GTP y que, cuando no se lleva a cabo este proceso, la Pol II se
acumula en el citoplasma (Forget et al., 2010). De hecho, la interacción Pol
II/GPN-GTP es más fuerte y duradera cuando GPN no es capaz de hidrolizar el
GTP (Staresincic et al., 2011). Del mismo modo se ha demostrado que los
dominios G1 a G5 son esenciales para la retención del GTP y permitir su
hidrólisis. La deleción o mutación puntual en tan sólo uno de ellos provoca
que no se reponga el GTP, derivando en la acumulación citoplasmática de Pol
II y en errores fatales de la diferenciación (Forget et al., 2010, Niesser et al.,
2015).
A nivel funcional, la deleción de cualquiera de los tres miembros de la familia
de las GPN en la levadura Saccharomyces cerevisiae es letal (Giaever et al.,
2002). En plantas, la pérdida de función tanto de GPN1, también denominada
Introducción
34
QQT2, como de GPN2/QQT1 provoca alteraciones en la división celular y
letalidad embrionaria (Lahmy et al., 2007). En células pulmonares de
humanos, la supresión de GPN3 lleva a una inhibición completa de la
proliferación celular (Calera et al., 2011). La letalidad de las mutaciones de
cada una de las GPN sugiere una función fundamental y no redundante de las
distintas isoformas. Además, en células de mamífero se ha observado que
GPN1 y GPN3 podrían estar formando un heterómero que llevaría a cabo la
hidrólisis del GTP de forma conjunta (Mendez-Hernandez et al., 2014). A su
vez, ambas interaccionan con GPN2 y parecen estar implicadas en el
transporte de la Pol II, tanto en levaduras, como en humanos y plantas
(Lahmy et al., 2007, Calera et al., 2011, Minaker et al., 2013). De hecho, se ha
descrito la interacción directa entre GPN1 y GPN3 de humanos con las
subunidades de la Pol II, Rpb4, Rpb7 y el dominio C-terminal de la Rpb1
(Carre and Shiekhattar, 2011). Además, la deleción o mutación de estas GPNs
lleva a la acumulación citoplasmática de Rpb1 o Rpb3 en humanos. Las
mutaciones defectivas de GPN2 y GPN3 en levaduras no han podido ser
rescatadas por la adición de un dominio NLS a RPB3, a diferencia de lo que
ocurre con las mutaciones en IWR, lo que sugiere que su papel principal tiene
lugar antes de la interacción con la envoltura nuclear (Minaker et al., 2013).
Estudios de inmunoprecipitación de GPN1 de plantas han demostrado su
interacción con subunidades de la Pol II y con otros homólogos de las RPAP (Li
et al., 2018). Además, se ha comprobado que las proteínas GPN intervienen en
el ensamblaje de los microtúbulos, la formación del huso acromático durante
la división celular y en el posicionamiento del plano de división durante la
mitosis (Lahmy et al., 2007). También se ha observado su relación con
proteínas de complejos de plegado de proteínas, como chaperonas y prefoldin-
like complex, y con la maquinaria de reparación de ADN (Nitta et al., 2000,
Lahmy et al., 2007, Boulon et al., 2010).
Las proteínas de la familia de las GTPasas cuentan con un diseño estructural
común y comparten un mecanismo molecular de acción. Estas proteínas
funcionan como un interruptor molecular que puede variar su afinidad por
otras macromoléculas, activándose mediante la unión a GTP y desactivándose
con su hidrólisis (Bourne et al., 1991). La cristalización de GPN1 en levaduras
confirmó que se lleva a cabo un cambio conformacional dependiendo de su
unión a GTP o a GDP. Mientras la proteína se encuentra unida a GDP
Introducción
35
permanece en su forma cerrada, inactiva, y al unirse a GTP adopta su
conformación abierta, o activa (Fig. 1.6A-B). Se ha propuesto que la
interacción con péptidos de las subunidades catalíticas de la Pol II provocaría
que GPN perdiera afinidad por el GDP, permitiendo la sustitución por GTP. La
hidrólisis del GTP sería un paso fundamental para el correcto ensamblado del
complejo Pol II y su posterior entrada al núcleo. Una vez allí, GPN-GDP se
separaría de la Pol II y volvería al citoplasma (Boulon et al., 2010, Carre and
Shiekhattar, 2011, Reyes-Pardo et al., 2012, Niesser et al., 2015).
Se ha propuesto que la proteína RPAP2 también participaría junto con las
proteínas GPN en el ensamblaje de la Pol II en el citoplasma y su transporte al
núcleo (Jeronimo et al., 2007, Gibney et al., 2008). Así, la Pol II entraría al
núcleo unida a la RPAP2 y ésta volvería al citoplasma asociada con RPAP4
(Braunwarth et al., 2003, Carre and Shiekhattar, 2011, Egloff et al., 2012,
Minaker et al., 2013, Forget et al., 2013, Niesser et al., 2015). De hecho, el
tránsito entre el núcleo y el citoplasma del homólogo de RPAP2/RIMA en
levaduras, Rtr1, ha sido propuesto como un paso fundamental en el
transporte de la Pol II al núcleo (Forget et al., 2013). El gen homólogo de
RPAP2 en Arabidopsis, RIMA, se expresa en los meristemos, donde tiene una
localización celular principalmente citoplasmática, aunque cuando se incuba
con inhibidores del exporte nuclear, como la leptomicina B se puede observar
en el núcleo (Munoz et al., 2017). En plantas, la pérdida de función de RIMA
provoca retrasos en la diferenciación, causando fenotipos similares a los
ocasionados por la mutación de IYO, iyo-1. Además, en las plantas defectivas
para ambos genes, la diferenciación aparece completamente bloqueada (Muñoz
et al., 2017). Esta interacción funcional entre IYO y RIMA ha sido comprobada
físicamente mediante ensayos de complementación bimolecular de
fluorescencia (BiFC), demostrando que ambas proteínas interaccionan y se
acumulan en el núcleo. Además, la mutación rima-2 reduce los niveles
nucleares de IYO en células de la raíz de Arabidopsis, demostrando que RIMA
es un interactor necesario para el transporte al núcleo de IYO (Munoz et al.,
2017). Estos datos son consistentes con la función conocida de sus homólogos
como parte fundamental en el transporte de Pol II al núcleo.
2. Objetivos
“Hay preguntas ingenuas, preguntas tediosas, preguntas mal formuladas, preguntas
planteadas con una inadecuada autocrítica. Pero toda pregunta es un deseo por
entender el mundo. No hay preguntas estúpidas”.
El mundo y sus demonios, Carl Sagan, 1995.
Objetivos
39
2. Objetivos
IYO es un factor necesario y limitante para iniciar la diferenciación celular en
Arabidopsis. Además, la entrada de IYO en el núcleo coincide con la activación
de la diferenciación en todos los nichos de células madre de la planta. Sin
embargo, los mecanismos moleculares que regulan la distribución subcelular
de IYO son desconocidos, al igual que la función de IYO en el núcleo. Por
tanto, en la presente tesis se ha planteado como objetivo general identificar los
factores moleculares que determinan la localización subcelular de IYO. Para
ello, mediante programas informáticos se predecirán los posibles dominios
determinantes de su transporte al núcleo para posteriormente caracterizarlos
mediante mutagénesis dirigida. Además, se complementará este estudio con la
caracterización de versiones truncadas de la proteína IYO.
Puesto que está presente tanto en el citoplasma como en el núcleo, IYO podría
ejercer funciones en cualquiera de estos dos compartimentos. Para determinar
cómo la localización subcelular afecta a la actividad de IYO se emplearán las
construcciones antes generadas para sobreexpresarlas en Arabidopsis con el
objetivo de caracterizar los efectos que la sobreexpresión en los distintos
compartimentos ejerce sobre los procesos de diferenciación y desarrollo de la
planta.
Finalmente, dado que IYO interacciona con la Pol II, se ha propuesto que IYO
es capaz de regular la actividad de la Pol II a nivel de la elongación
transcripcional para controlar el inicio de la diferenciación. Para identificar las
rutas moleculares en las que intervienen, en este trabajo pretendemos
identificar los interactores de IYO y sus posibles dianas transcripcionales,
para elucidar su papel en el inicio de la diferenciación.
3. Materiales y
Métodos
“Amb ses eines se fan ses feines/ Con las herramientas se hacen los trabajos”
Dicho tradicional mallorquín.
Materiales y métodos
43
3. Materiales y métodos
3.1 Material biológico
3.1.1 Material vegetal y condiciones de crecimiento
Este estudio se ha realizado utilizando las plantas modelo Arabidopsis
thaliana (L. Heynh), ecotipo Columbia-0 (Col-0) y Nicotiana benthamiana. Para
la inmunoprecipitación de cromatina seguida de secuenciación masiva (ChIP-
seq) se utilizaron las líneas pRIMA:RIMA-HA y pIYO:IYO-HA descritas
previamente (Sanmartín et al., 2011; Muñoz et al., 2017).
Para el crecimiento de las plantas en condiciones in vitro, las semillas de
Arabidopsis fueron esterilizadas en superficie durante 10 minutos en lejía
comercial al 70% con 0,1% de Tween-20 (SIGMA) y 5 lavados con agua estéril,
y estratificadas a 4ºC durante 48 h. Posteriormente fueron germinadas en
medio estéril Murashige-Skoog (Duchefa; MS: 4,7 g/l disuelto en agua pH 5,7)
suplementado con 1% de sacarosa y 8 g/l de agar específico para plantas bajo
condiciones de fotoperiodo de día largo (16 h luz/8 h oscuridad) en cámaras
climáticas a 21ºC y 60% de humedad relativa.
El crecimiento en tierra de plantas de Arabidopsis se llevó a cabo mediante el
cultivo de las plantas en una mezcla de tierra/vermiculita (3:1) en régimen de
fotoperiodo de día largo a 21°C, 60% de humedad relativa en cámara
climática. Las plantas de Nicotiana benthamiana (N. benthamiana) fueron
crecidas en sustrato de tierra 100%, en régimen de fotoperiodo de día largo, y
a 22°C día/19°C noche en el invernadero.
Los cruces genéticos de plantas de Arabidopsis se llevaron cabo mediante la
emasculación de las flores femeninas de uno de los genotipos antes del
desarrollo del polen y fueron fertilizadas con las anteras del otro genotipo de
interés (Weigel and Glazebrook, 2006).
El alelo mutante iyo-3 (SAIL_692-G12) en fondo genético Col-0 fue adquirido a
través del Nottingham Arabidopsis Stock Center (NASC). Este alelo nulo que
porta una inserción de ADN-T en la posición 1922, dentro del quinto exón del
gen IYO, se ha caracterizado anteriormente (Sanmartin et al., 2011).
Materiales y métodos
44
3.1.2 Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento utilizadas
La cepa de Escherichia coli DH5α fue utilizada para la transformación,
amplificación y propagación de los plásmidos de interés. Para su crecimiento
se empleó medio Luria-Bertani (LB: triptona 10 g/l, extracto de levadura 5 g/l
y NaCl 5 g/l, pH 7,4) suplementado con 15 g/l de agar para los cultivos en
medio sólido, a 37°C durante 24 horas.
La cepa de Agrobacterium tumefaciens GV3101(Van Larebeke et al., 1974) fue
utilizada para la expresión transitoria de proteínas en hojas de N.
benthamiana y para la generación de líneas transgénicas estables de
Arabidopsis. Para su crecimiento, se empleó medio Yeast Extract Broth (YEB:
bacto-peptona 10 g/l, extracto de levadura 10 g/l y NaCl 5 g/l, pH 7),
suplementado con 15 g/l de agar para los cultivos en medio sólido. Los
cultivos se crecieron a 28°C durante 24 horas para los cultivos líquidos y
durante 48 horas para los sólidos. En todos los casos, los cultivos líquidos se
crecieron en agitación a 200 rpm.
3.1.3 Números de accesión y clones de los genes empleados
Los códigos de los genes estudiados en esta tesis son: IYO AT4G38440, RIMA
AT5G26760, GPN1 AT4G21800, GPN2 AT5G22370, GPN3 AT4G12790, IMPA3
AT4G02150, IMPA4 AT1G09270, IMPA6 AT1G02690, RPB3 AT2G15400,
RPB10 AT1G11475, RAN1 AT5G20020 y MED19 AT5G12230. Las secuencias
utilizadas se obtuvieron de la base de datos The Arabidopsis Information
Resource (TAIR).
3.2 Preparación y análisis de ácidos nucleicos
3.2.1 Aislamiento de ARN total
El aislamiento de ARN total a partir de plántulas de 7 días de Arabidopsis se
realizó con TRIzol® Reagent (Thermo Fisher Scientific) siguiendo las
instrucciones del fabricante.
Materiales y métodos
45
3.2.2 Aislamiento de ADN plasmídico
Para el aislamiento a pequeña escala de plásmidos de E. coli y A. tumefaciens,
se utilizó el kit comercial Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System
de Promega según las instrucciones del fabricante.
3.2.3 Aislamiento de ADN genómico
La preparación de ADN genómico de Arabidopsis se llevó a cabo a partir de
hojas adultas (Doyle, 1990). Las muestras se homogeneizaron en 300 µl de
tampón de extracción (200 mM de Tris-HCl pH 8, 250 mM de NaCl, 25 mM
EDTA y 0,5% de SDS). Tras 10 minutos de centrifugación a 14000 g, se
recuperó el sobrenadante y se añadió el mismo volumen de isopropanol y se
volvió a centrifugar 10 minutos a 14000 g. Tras un lavado con etanol al 70%
se dejó secar el precipitado y se resuspendió en 50 µl de tampón TE (1 mM de
EDTA, 10 mM de Tris-HCl pH 8).
3.2.4 Técnicas electroforéticas y aislamiento de fragmentos de ADN en geles de
agarosa
La electroforesis de ADN se llevó a cabo en geles horizontales de agarosa en
tampón 1X TBE (100mM Tris-HCl, 100mM ácido bórico, 2 mM EDTA),
ajustando en cada caso el porcentaje de agarosa adecuado al tamaño del
fragmento a analizar. La visualización de los ácidos nucleicos se llevó a cabo
incorporando bromuro de etidio en el gel e iluminando con luz ultravioleta
(Sambrook et al., 1989). Para el aislamiento y purificación de fragmentos de
ADN se utilizó el kit comercial QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) según las
instrucciones del fabricante.
3.2.5 Genotipado de líneas mutantes
La identificación de líneas que portasen la inserción de T-ADN del mutante
iyo-3 se llevó a cabo mediante PCR con cebadores en el cuerpo del gen y
específicos de la inserción. Para las líneas de sobreexpresión se empleó ADN
genómico con cebadores específicos para cada construcción (Tabla 2.1).
Materiales y métodos
46
3.2.6 Chip-seq
La inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) fue llevada a cabo siguiendo el
protocolo previamente descrito (Gendrel et al., 2002) con pequeñas
modificaciones. Para fijar covalentemente el ADN a las proteínas, 2 g de
plántulas crecidas 8 días en placas verticales se infiltraron en tampón de
extracción (EB1: 0,4 M de sacarosa, 10 mM de Tris-HCl pH 8, 10 mM de
MgCl2) con formaldehido al 1% aplicando vacío durante 20 min. Para detener
la reacción se añadió glicina a una concentración final de 0.125 M, aplicando
vacío durante 5 minutos. A continuación, se lavó el tejido y tras su ultra-
congelación se procedió a homogeneizar el tejido que se resuspendió en
tampón de extracción EB1 con 5 mM de β-mercaptoetanol, 0,4 mM de PMSF y
1X inhibidores de proteasas (Thermo Scientific™) 1x y se filtró a través de
papel Miracloth (Calbiochem). Los restos celulares se eliminaron mediante
centrifugación en frío a 2000 g durante 20 min. Posteriormente el precipitado
se resuspendió con un pincel en tampón de extracción 2 (EB2: 0,25 M de
sacarosa, 10 mM de Tris-HCl pH 8,0, 10 mM de MgCl2, 1% Tritón X-100, 5
mM de β-mercaptoetanol, 0,1 mM de PMSF y 1X inhibidores de proteasas) y se
volvió a centrifugar 10 min a 2000 g a 4ºC. El precipitado se resuspendió en
600 µl de tampón de extracción 3 (EB3: 1,7 M de sacarosa, 10 mM de Tris-HCl
pH 8, 5 mM de β-mercaptoetanol, 2 mM de MgCl2, 0,15% Tritón X-100, 0,1
mM de PMSF y 1X inhibidores de proteasas). La suspensión se pipeteó con
cuidado sobre 500 µl de tampón EB3 y se centrifugó en frío durante 1 hora a
14000 g.
A continuación, se resuspendió el precipitado en 250 µl de tampón de lisis de
núcleos (50 mM de Tris-HCl pH 8, 10 mM de EDTA, 1% de SDS y 1X
inhibidores de proteasas). Para obtener fragmentos de ADN de entre 200 y 800
pares de base, se sonicaron las muestras durante 15 ciclos de 30 s encendido
y 30 s apagado (Sonicador Bioruptor®). Para eliminar las impurezas se
centrifugó 5 min a 14000 g a 4ºC y se recuperó el sobrenadante. Tras
confirmar la eficacia de la sonicación mediante electroforesis en gel de agarosa
se igualaron las concentraciones de las muestras en tampón de lisis de
núcleos hasta un volumen final de 300 µl. Se añadieron 2,7 ml tampón de
dilución (1.1% Triton X-100, 1,2 mM de EDTA, 16,7 mM de Tris-HCl pH 8,
167 mM de NaCl y 1X inhibidores de proteasas) y se separaron 100 µl como
Materiales y métodos
47
cromatina inicial (Input). Se añadió el anticuerpo adecuado y ambos se
incubaron durante toda la noche a 4ºC en agitación.
Posteriormente, se equilibraron 20 µl de Dynabeads™ protein G (Thermo-
Fisher) por muestra según las especificaciones del fabricante durante 1 hora
en hielo y se incubaron con las muestras a 4ºC en movimiento durante 2
horas. A continuación, se recuperaron los Dynadeads gracias a un soporte
magnético y se lavaron 2 veces con tampón de lavado de baja concentración de
sales (150 mM de NaCl, 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM de EDTA y 20 mM
de Tris-HCl pH 8), 2 veces con tampón de alta concentración de sales (500 mM
de NaCl, 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM de EDTA y 20 mM de Tris-HCl pH
8) y 3 veces con TE (1 mM de EDTA, 10 mM de Tris-HCl pH 8). Para eluir el
DNA, se incubaron los Dynadeads con 125 µl de tampón de elución (1% SDS,
0,1M de NaHCO3) durante 15 minutos a 65ºC dos veces. El DNA de los
extractos eluídos y los input se “descroslinquearon” con 28 µl de buffer que
contiene 2 M de NaCl, 0,1 M de EDTA, 0,4 M Tris-HCl pH 6,5 y 0,025 mg de
proteinasa K mediante incubación a 65ºC en agitación durante la noche. A
continuación, a se lleva el volumen de las muestras a 400 µl y se añade 1
volumen de fenol: cloroformo: alcohol isoamil (25:24:1) y se centrifuga a 16000
g durante 10 min en frio. Seguidamente, se recoge la fase superior y se
precipita el DNA con 0,2 M NaCl, glicógeno (1 mg/ml) y etanol a -20ºC. Tras
centrifugar durante 15 minutos a 14000 g en frio, se lavó el precipitado con
etanol al 75%, se centrifugó 15 minutos a 14000 g en frio y se resuspendió en
agua estéril para su posterior secuenciación.
3.2.7 Análisis de citometría de flujo
Para determinar el contenido de ADN, se emplearon las hojas primarias de
plantas de 18 ó 20 días crecidas en tierra. El material vegetal (40 mg) fue
homogeneizado con cuchillas en tampón Galbraith (45 mM de MgCl2, 30 mM
de citrato de sodio, 20 mM de MOPS y 0.1% de Tritón X-100; (Galbraith et al.,
1983) y filtrado con un filtro de Nylon de 30 µm para eliminar los restos de
tejido. El ADN fue teñido con ioduro de propidio (1 mg/ml) a 37°C en
oscuridad durante 20 minutos antes de realizar las mediciones de contenido
de ADN nuclear en un citómetro Coulter Cytomics FC500.
Materiales y métodos
48
3.3 Clonaje de las construcciones
3.3.1 Generación de las construcciones
Para la amplificación mediante PCR y el clonaje de las regiones de interés, se
diseñaron cebadores específicos para amplificar la secuencia codificante de los
distintos genes o fragmentos de interés basándonos en la información de la
base de datos TAIR. Estos cebadores se diseñaron de acuerdo con el sistema
GATEWAY® Cloning Technology (Thermo Fisher Scientific) para la fusión de los
genes de interés en fase de lectura con epítopos antigénicos o genes reporteros
en posición amino (N-) o carboxilo (C-) terminal mediante recombinación
homóloga (Tabla 2.1). Para la amplificación de las secuencias codificantes se
utilizó la polimerasa Phusion® High-Fidelity (Thermo Fisher Scientific) según
las instrucciones del fabricante. Los productos de PCR fueron clonados en el
vector pDONR207 (Invitrogen) usando el kit Gateway BP II (Invitrogen). En
todos los casos, la inserción correcta del gen, la fase de lectura y la ausencia
de mutaciones se comprobaron por digestión enzimática y secuenciación
usando los cebadores de la Tabla 2.1.
Mediante el sistema de recombinación LR Gateway™ Clonase (Invitrogen), las
diferentes construcciones fueron transferidas del vector pDONR207 a los
vectores binarios de destino Gateway, pGWB5 y pGWB6 (Nakagawa et al.,
2007), pPZP-221 (cedido amablemente por la Dra. S. Prat) y los cuatro
plásmidos pBiFC (cedidos por el Dr. F. Parcy), para su expresión en planta.
Las características de los plásmidos se detallan en la Tabla 2.2. Los clones
fueron seleccionados por resistencia al antibiótico kanamicina para los
plásmidos pGWB5 y pGWB6 y espectinomicina para los plásmidos pBiFC y
pPZP-221.
3.3.2 Generación de mutantes por sustitución y deleción
Para la generación de las construcciones GPN1mGPN1N1GPN108AAA y
GPN1GSGK51AAAA, denominadas GPN1mGPN y GPN1mG1, y mutadas en los dominios
GPN y G1 de la proteína GPN1 respectivamente, se llevó a cabo una
mutagénesis dirigida siguiendo las especificaciones del kit Q5 Site-directed
Mutagenesis (New England Biolabs) utilizando los cebadores sugeridos por la
aplicación online NEBaseChanger (Tabla 2.1) a partir de la construcción
pDONR207-GPN1.
Materiales y métodos
49
Para generar las construcciones de IYO con deleciones en las secuencias de
interés (NES, NLSA, NLSB1 y NLSB2) se llevó a cabo una amplificación de la
secuencia codificante completa del AtIYO clonada en el vector pDONR207 con
cebadores específicos (Tabla 2.1). A continuación, se realizó una ligación con
el kit T4 DNA ligase (Thermo Fisher Scientific). Para la generación de la
construcción que contiene las dos deleciones NLSA y NLSB1, se llevó a cabo
una amplificación partiendo de la construcción con la deleción NLSA con los
cebadores específicos utilizados para generar la construcción con la deleción
en NLSB1.
3.3.3 Transformación de Escherichia coli y Agrobacterium tumefaciens
Se generaron células termocompetentes de E. coli según el protocolo de
Untergasser (2006). Para la transformación con las construcciones de interés
se usaron 100-200 ng de ADN plasmídico y el protocolo de choque térmico
descrito previamente (Sambrook et al., 1989). El crecimiento y selección de
transformantes se llevó a cabo en medio LB suplementado con los antibióticos
específicos de cada plásmido. Para la transformación de A. tumefaciens, se
generaron células termocompetentes (Hofgen and Willmitzer, 1988), que
fueron posteriormente transformadas con los plásmidos de interés (Holsters et
al., 1978). Para la selección de las colonias transformadas se emplearon de
forma conjunta rifampicina para seleccionar las agrobacterias y el antibiótico
específico del plásmido en cada caso.
3.3.4 Transformación de plantas de Arabidopsis thaliana
Se generaron líneas transgénicas estables de Arabidopsis de las diferentes
construcciones de interés mediante el método de inmersión floral mediado por
A. tumefaciens (Clough and Bent, 1998). Las semillas fueron seleccionadas en
antibióticos específicos para la inserción, dependiendo del plásmido en que
estuvieran clonadas las construcciones.
3.3.5 Expresión transitoria en N. benthamiana
Los cultivos de Agrobacterium transformados con las construcciones de interés
y la cepa que expresa el supresor del silenciamiento p19 (Voinnet et al., 2003)
se crecieron durante 16h y se resuspendieron en 1/3 de volumen inicial de
solución de agroinfiltración (10 mM de MES pH 5,6; 10 mM MgCl2 y 150 µM de
acetosiringona). Las células se incubaron a temperatura ambiente durante 2-3
Materiales y métodos
50
h en oscuridad para la posterior infiltración en hojas de N. benthamiana de 3
semanas de edad (Li, 2011) de una dilución en solución de agroinfiltración a
una densidad óptica de 0,15 U por cada construcción. Dos o tres días tras la
infiltración fueron analizadas por microscopía o bien almacenadas en
nitrógeno líquido y conservadas a -80ºC para su análisis posterior por western
blot.
3.4 Técnicas para el análisis de proteínas
3.4.1 Transferencia e inmunodetección de proteínas
Para las extracciones de N. benthamiana se utilizaron dos discos de hojas
agroinfiltradas homogeneizados en 100 µl de tampón de extracción (31,5%
glicerol, 31,5% de SDS 20%, 31,5% Tris-HCl 0,5M pH 6,8 y 7,5% de β-
mercaptoetanol). Para el análisis de proteínas de las construcciones en
Arabidopsis se emplearon los extractos de proteínas de diez plántulas de 7
días. Los extractos fueron cargados en geles SDS-PAGE y transferidos a
membranas de nitrocelulosa Hybond® ECL™ (Amersham Biosciences). Para la
inmunodetección de las proteínas de interés se utilizaron diferentes tipos de
anticuerpos de acuerdo con las instrucciones de cada fabricante. Se empleó
un anticuerpo monoclonal frente a GFP (Roche) que se detectó con
anticuerpos de cabra frente a IgG de ratón conjugados a la peroxidasa de
rábano (NA931V, Amersham Biosciences). De forma alternativa se utilizó el
anticuerpo anti-GFP directamente conjugado a la peroxidasa de rábano
(Sigma) o un anticuerpo policlonal de conejo que reconoce los extremos N-
terminal y C-terminal de la proteína GFP (Living Colors®, Clontech), que se
detectó con anticuerpos de cabra frente a IgG de conejo conjugados a la
peroxidasa de rábano ( NA934V, Amesham Biosciences). Para el revelado de
las proteínas de estudio en las membranas se utilizó el sistema ECL™ Western
Blotting Detection Reagent (Amersham Biosciences).
3.4.2 Análisis de localización subcelular por microscopía
Los ensayos de localización, colocalización y complementación bimolecular de
fluorescencia (BiFC) se llevaron a cabo mediante expresión transitoria de las
construcciones en hojas de 3 semanas de N. benthamiana. El tejido fue
visualizado tres días post-agroinfiltración usando el microscopio confocal SP5
Materiales y métodos
51
(Leica Microsystems). Para la visualización de GFP y YFP las muestras fueron
excitadas con un láser de Argón a 488 nm y la luz emitida fue capturada a
496-538 nm. Para la visualización de RFP las muestras fueron excitadas a 594
nm y la luz emitida fue capturada a 570-630 nm. Las muestras con dos
fluoróforos fueron capturadas mediante escaneo secuencial, en cortes de 1,8
µm, a una resolución de 1024 x 1024 pixeles.
Para el análisis de meristemos de raíces, se analizaron plántulas de
Arabidopsis de 7 de edad montadas en una solución de 10 µg/ml ioduro de
propidio (IP). La detección de GFP se llevó a cabo de la manera descrita
anteriormente. Para la visualización de la tinción de IP, las muestras fueron
excitadas a 561 nm y la luz emitida fue capturada a 590-630 nm.
3.4.3 Ensayos de interacción proteína-proteína
Para caracterizar la interacción entre proteínas se emplearon ensayos de
complementación bimolecular de fluorescencia (BiFC) en hojas de N.
benthamiana que expresaban de forma transitoria las construcciones tras ser
transformadas con Agrobacterium. Para ello se clonaron las construcciones de
interés en los plásmidos pBiFC1, pBiFC2, pBiFC3 y pBiFC4 descritos en la
Tabla 2.2. Mediante las combinaciones adecuadas de los plásmidos se
probaron las interacciones entre las proteínas en estudio.
3.4.4 Tratamiento con Leptomicina
Para los tratamientos con Leptomicina B (LMB), un inhibidor específico de un
receptor del poro nuclear (Chromosomal Maintenance 1/ Exportina 1;
CRM1/XPO1) para proteínas con señales de exporte nuclear (Haasen et al.,
1999, Kudo et al., 1998), las hojas de N. benthamiana agroinfiltradas se
infiltraron con LMB a 0,9 µM disuelta en medio de agroinfiltración y se
visualizaron al microscopio confocal tras 1 hora de incubación.
3.5 Técnicas de microscopia óptica
3.5.1 Análisis con hidrato de cloral
Las raíces de Arabidopsis thaliana se trataron en una solución de hidrato de
cloral (8:2:1; hidrato de cloral:agua:glicerol) para clarificarlas durante 10
minutos antes de observarse al microscopio óptico.
Materiales y métodos
52
3.6 Aplicaciones bioinformáticas
TAIR (The Arabidopsis Information Recourse, www.arabidopsis.com): esta base
de datos se utilizó para obtener las secuencias de los genes de Arabidopsis
empleados en esta tesis.
NCBI (National Center for Biotechnology Information, www.ncbi.nlm.nih.gov/):
la base de datos se empleó para obtener las secuencias de los genes de
animales y levaduras con los que se han establecido homologías con nuestros
genes de interés. Mediante la aplicación BLAST se llevaron a cabo el
alineamiento y la comprobación de homología entre diversos genes y proteínas
durante este trabajo.
Oligocalc (http://biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html):
herramienta utilizada para diseñar los cebadores necesarios y con la que se
comprobó su idoneidad.
NEBaseChanger (http://nebasechanger.neb.com/): herramienta empleada
para la generación de los cebadores para la mutagénesis dirigida.
cNLSmapper (http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi):
herramienta empleada para la identificación de las posibles secuencias NLS.
NetNES 1.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNES/): herramienta utilizada
para determinar los posibles dominios NES.
DNASTAR® LASERGENE v. 8.0: paquete informático con el que se trataron las
secuencias génicas y se generaron las construcciones in silico.
ImageJ: Las imágenes fueron tratadas con este paquete informático para
montar los diferentes canales de las secciones de las imágenes de microscopía
(Schindelin et al., 2012).
Kaluza Analysis Software: Programa informático para el análisis estadístico de
los datos de citometría.
Galaxy (https://usegalaxy.org): programa accesibles online para el análisis de
secuencias.
Bowtie2 (http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml): programa
accesibles online para el alineamiento de las secuencias.
Materiales y métodos
53
MACS2 callpeak: programa informático para buscar zonas del genoma
enriquecidas en lecturas del ADN inmunoprecipitado respecto a las de su
correspondiente ADN input.
Materiales y métodos
54
Tabla 3.1: Cebadores empleados durante este trabajo
Cebador Descripción Secuencia 5' -> 3'
IYOATG Amplificar gen IYO y los fragmentos N-terminales
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGATGGAGCAAAGTAGCGGGAGAG
IYO430 Up Amplificar fragmento de IYO con los primeros 430 aa
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGtAAGGTTCCGGTCCAAGGGCAT
IYO500 Up Amplificar fragmento de IYO con los primeros 500 aa
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTACCACGGAGGAAGCCAAGATC
IYO959 Up Amplificar fragmento de IYO con los primeros 959 aa
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATTTATGTAGCTCAATTGATTGCACGATG
IYO978 Up Amplificar fragmento de IYO
con los primeros 978 aa
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTACCC
ACCACCGCTAGCTCCCC
IYO500Dw Amplificar fragmento de IYO desde el aa 500
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGATGGATCTTGGCTTCCTCCGTGG
IYO959Dw Amplificar fragmento de IYO desde el aa 959
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGATGATCGTGCAATCAATTGAGCTACATAAA
IYO978Dw Amplificar fragmento de IYO desde el aa 978
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGATGTTTTGGTCAACCAGAGTTCTG
IYOnostop Amplificar gen IYO y los fragmentos C-terminales hasta el final del gen
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTACCTTCTTCCACAGAGAGCGGCT
mutGPN-AAA For
Mutación por cambio de aminoácido del dominio GPN del gen GPN1
AGCGGGTGGAATTCTCACTTCAC
mutGPN-AAA Rev
Mutación por cambio de aminoácido del dominio GPN del gen GPN1
GCTGCCAGATTATACTGCTTCATAAC
mutG1-AAAA For
Mutación por cambio de aminoácido del dominio G1 del gen GPN1
GCGGCGAGCTTTCTTCATCGCTTG
mutG1-AAAA Rev
Mutación por cambio de aminoácido del dominio G1 del gen GPN1
TGCTGCTGCCATTCCAACAACGAT
NLS mono DEL 74
deleción del dominio NLS A de IYO
TCTGTCCAGGGGGTTTCCATCACC
NLS mono DEL 68
deleción del dominio NLS A de IYO
CAATTTTGCCTCACCTCGTTTCTT
NES DEL 68
deleción del dominio NES de IYO
GATGACAACCATGCCTCTGTTGTT
NES DEL 73
deleción del dominio NES de IYO
GACAAGCTCAGGTTCCGGTCCAAG
NLS bipart1 DEL 59
deleción del dominio NLS B1 de IYO
GAGGGGATGATGTTAGATCTC
NLS bipart1 DEL 62
deleción del dominio NLS B1 de IYO
TGATAAATCCCTGACAAGAGTCTT
NLS bipart2 DEL 77
deleción del dominio NLS B2 de IYO
GGGTCTGCGAACGCCATGGAAGAA
NLS bipart2 DEL 64
deleción del dominio NLS B2 de IYO
ATACCGCAGGAGATCTAACATCAT
GPN1 F Amplificar gen GPN1 GGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCATGGATCCTATGGAGTCGTC
Materiales y métodos
55
Cebador Descripción Secuencia 5' -> 3'
GPN1 R con stop
Amplificar gen GPN1 GGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCATAGGTAGTAATGCTTCG
GPN2 GW For
Amplificar gen GPN2 GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGATGGTGTTTGGACAAGTAGTAATAGG
GPN2 GW Rev stop
Amplificar gen GPN2 con su codón de parada
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGG GTATCAGTCTTGTATTTCCTCATCTTCCATG
GPN2 GW Rev nostop
Amplificar gen GPN2 sin su codón de parada
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAGTCTTGTATTTCCTCATCTTCCATGTAC
GPN3 GW For
Amplificar gen GPN3 GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGATGGGTTACGCCCAGCTAGTTATTGG
GPN3 GW Rev stop
Amplificar gen GPN3 con su codón de parada
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATTA TAG GTC AGG ACC ATC GTC ACT AA
GPN3 GW Rev nostop
Amplificar gen GPN3 sin su codón de parada
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATAG GTC AGG ACC ATC GTC ACT AAA ATC
MINITU-ORF-F
Amplificar gen RIMA GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGATGGCAAAGGATAATGAAGCA
MINITU-ORF-R
Amplificar gen RIMA con su codón de parada
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTACTACGCCCCGCTTCGGGTAGC
RAN F Amplificar gen RAN1 GGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCATGGCTCTACCTAACCAGCA
RAN R Amplificar gen RAN1 GGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTACTCAAAGATATCATCAT
ImpA3 GW For
Amplificar gen IMPA3 GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGATGTCTCTCAGACCTAGCGCGAAGAC
ImpA3 GW Rev nostop
Amplificar gen IMPA3 sin su codón de parada
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAAAT AAA GTT GAA TTG ACC AGG AGG AAC
ImpA4 GW For
Amplificar gen IMPA4 GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGATGTCGCTGAGGCCGAGCACACGCGC
ImpA4 GW Rev nostop
Amplificar gen IMPA4 sin su codón de parada
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAGGC AAA TTT GAA TCC ACC AAC GGG AG
ImpA6 GW For
Amplificar gen IMPA6 GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGATGTCTTACAAACCAAGCGCGAAGAC
ImpA6 GW Rev nostop
Amplificar gen IMPA6 sin su
codón de parada GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAACC AAA GTT GAA TCC ACC CGT AGG AG
Med19 GW F
Amplificar gen MED19 GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGTATGGAGCCTGAACGTTTAAA
Med19 GW R
Amplificar gen MED19 GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGGCCAGCAACCCTTATTGCAC
pDONR 5
Secuenciar clones en el plásmido pDONR207 desde el extremo 5' CGCGTTAACGCTAGCATGGATCTCG
pDONR 3
Secuenciar clones en el plásmido pDONR207 desde el extremo 3' GTAACATCAGAGATTTTGAGACA
GFP 5' Rev
Secuenciar clones en los plásmidos pGWB5 o pGWB6 desde el extremo 5' GCCGGTGGTGCAGATGAACT
GFP 3' Fw
Secuenciar clones en los plásmidos pGWB5 o pGWB6 desde el extremo 3' TGCTGCCCGACAACCACTACC
Materiales y métodos
56
Cebador Descripción Secuencia 5' -> 3'
TA1
Genotipar IYO y sus versiones
truncadas desde la base 1 GAGTTTTCCGTTTTGCTGAG
TA2 Genotipar IYO y sus versiones truncadas desde la base 422
CTATGTTGCTTCAGCCGATG
TA3 Genotipar IYO y sus versiones truncadas hasta la base 500 AACTCTCTCTGGTCTGATGC
TA4
Genotipar iyo-3, IYO y sus versiones truncadas desde la base 1314 GCTCTTGATGACAACCATG
TA5 Genotipar IYO y sus versiones truncadas hasta la base 1385 GAACAGGTCAGTAGACACTG
TA6
Genotipar iyo-3, IYO y sus versiones truncadas desde la base 2103 CTGTGGTTGAGTTGTCCATC
TA7
Genotipar iyo-3, IYO y sus versiones truncadas hasta la base 2173 ACACAGAAGTAAACTCGCTG
TA8 Genotipar IYO y sus versiones truncadas desde la base 3271 CAGACATAGATGGTTACAGC
TA9
Genotipar iyo-3, IYO y sus versiones truncadas hasta la base 3352 CGTCCTCATGAATAGTCTCC
TA10 Genotipar IYO y sus versiones truncadas desde la base 4133 CAACCAAGCCAAGGATAAAG
TA11 Genotipar IYO y sus versiones truncadas hasta la base 4239 CAGGAGATCTAACATCATCC
TA12
Genotipar IYO y sus versiones
truncadas hasta el final del gen AGAACAGAAGAAGAACATCG
LB3garlic
Genotipar inserción de T-ADN en IYO (alelo iyo-3) TAGCATCTGAATTTCATAACCAATCTCGATACAC
Materiales y métodos
57
Tabla 3.2: Lista de los vectores empleados en este trabajo
Plásmido Características
pDONR207 Vector de entrada del sistema Gateway para las subsiguientes
clonaciones en vectores de expresión/destino
pGWB5 Vector destino del sistema Gateway, promotor constitutivo 35S,
proteína verde fluorescente (GFP) en el extremo C-terminal de la proteína de interés
pGWB6 Vector destino del sistema Gateway, promotor 35S, con la proteína
verde fluorescente (GFP) en el extremo N-terminal de la proteína de interés
pGWB15 Vector destino del sistema Gateway, promotor 35S, con la etiqueta
antigénica HA en el extremo N-terminal de la proteína de interés
pPZP-221 Vector destino del sistema Gateway, promotor 35S, con la proteína
roja fluorescente (Cherry) en el extremo C-terminal de la proteína de
interés
pBIFC1 Vector destino del sistema Gateway, promotor 35S, que permiten la
fusión del fragmento N-terminal de YFP en fase con el extremo
carboxilo terminal de la proteína de interés
pBiFC2 Vector destino del sistema Gateway, promotor 35S, permite la fusión
del fragmento N-terminal de YFP en fase con el extremo amino
terminal de la proteína de interés
pBiFC3 Vector destino del sistema Gateway, promotor 35S, para la expresión
de la fusión del fragmento C-terminal de YFP en fase con el extremo
N-terminal de la proteína de interés
pBiFC4 Vector destino del sistema Gateway, promotor 35S, permite la fusión
del fragmento C-terminal de YFP en fase en el extremo C-terminal de
la proteína de interés
pGWB13 Vector destino del sistema Gateway, sin promotor y 3xHA en el
extremo C-terminal de la proteína de interés
4. Resultados
“Audentis fortuna iuvat/A los que se atreven sonríe la fortuna”
Eneida, X, 284, Virgilio s. I a. C.
Resultados
61
4. Resultados
Resultados previos a esta tesis sugieren que la migración de la proteína IYO
desde el citosol al núcleo funcionaría como un interruptor molecular para
activar la diferenciación celular en Arabidopsis (Sanmartin et al., 2011). Los
determinantes de la localización subcelular de IYO y la naturaleza de su
actividad molecular en el núcleo son dos aspectos no resueltos de este modelo
que constituyen el tema central de estudio de esta tesis.
4.1 Identificación y caracterización de los dominios determinantes
de la localización subcelular de IYO
4.1.1 Identificación de las posibles señales de tránsito núcleo/citoplasma y
estudio de su funcionalidad mediante mutagénesis dirigida
El análisis de la secuencia polipeptídica de IYO con programas de predicción
reveló tres dominios potencialmente relevantes para el tráfico de la proteína
entre el núcleo y el citoplasma: dos posibles señales de localización nuclear
(NLS) y una posible señal de exporte nuclear (NES). Una de las NLS predichas,
que denominamos NLSA, es monopartita y se corresponde con la secuencia
KKRKH entre las posiciones 254-259 de la proteína IYO (Fig. 4.1A). La
segunda NLS predicha, NLSB, es bipartita y se localiza entre las posiciones
1401 y 1417 de la proteína IYO. NLSB tiene dos dominios básicos, RKRHR
(NLSB1) y KK (NLSB2), separados por una secuencia espaciadora de 10
aminoácidos. El NES predicho se corresponde con la secuencia LALRMAL
entre los aminoácidos 432 a 439 de la proteína IYO (Fig. 4.1A). Para
determinar la posible funcionalidad de los motivos predichos, se generaron
construcciones de la proteína IYO silvestre y de versiones con deleciones en
las NLSs o en la NES, fusionadas en el extremo carboxilo-terminal a la
proteína verde fluorescente (GFP) bajo el control del promotor constitutivo 35S
(Fig. 4.1A).
Resultados
62
Fig. 4.1 Caracterización de los posibles dominios de IYO implicados en su
transporte a través de la membrana nuclear. A) Representación esquemática de la
proteína IYO destacando los NLS predichos (NLSA: 254-259 aa y NLSB: 1400-1417 aa), el NES predicho (432 a 439 aa) y el dominio RGG (959-961 aa). Se indica en rojo
la secuencia de aminoácidos delecionados de dichos dominios. B) Localización
subcelular de las construcciones IYO, IYOΔNLSA, IYOΔNLSB1, IYOΔNLSB2, IYOΔNLSAB1 e IYOΔNES
fusionadas a GFP a los 3 días tras la agroinfiltración en Nicotiana benthamiana. Las
imágenes se corresponden a un plano confocal. La señal de GFP se muestra en verde y la de los cloroplastos en rojo. Las flechas destacan la posición de los núcleos en las
células transformadas con IYOΔNLSA e IYOΔNLSAB1. En los recuadros se muestra un
detalle ampliado de los núcleos. Barras de escala: 20 µm. C) Análisis por western blot de la expresión de las proteínas en los ensayos mostrados en el panel B.
Estas construcciones se expresaron de manera transitoria en hojas de
Nicotiana benthamiana y se analizó la localización subcelular por microscopía
Resultados
63
confocal. La proteína silvestre (IYO-GFP) se acumula en el núcleo. Asimismo,
se observó que las versiones de IYO con deleciones en los dominios NLSB o
NES (IYOΔNLSB1-GFP, IYOΔNLSB2-GFP e IYOΔNES-GFP) presentaban una
localización exclusivamente nuclear, similar a la de la proteína silvestre. Por el
contrario, la proteína que carecía del dominio NLSA (IYOΔNLSA-GFP) presentaba
una localización principalmente citosólica, si bien se observaba también cierta
acumulación en el núcleo (Fig. 4.1B). La versión de IYO con las dos NLSs
mutadas (IYOΔNLSAB1-GFP) presentaba una localización exclusivamente
citosólica (Fig. 4.1B). De hecho, no se observa acumulación de IYOΔNLSAB1-GFP
en el núcleo ni siquiera inhibiendo el exporte nuclear con leptomicina B (ver
más adelante; Fig. 4.18), confirmando que no se produce importe detectable
de esta fusión. Estos resultados indican que los dos NLS predichos (NLSA y
NLSB) dirigen el importe de IYO al núcleo, si bien el NLSA tiene la función
principal en la acumulación nuclear de IYO.
4.1.2 Análisis de construcciones truncadas para identificar dominios implicados
en la distribución núcleo/citoplásmica de IYO
Paralelamente al análisis por mutagénesis dirigida de los dominios predichos
por métodos informáticos, se generaron versiones truncadas de la proteína
IYO fusionadas a GFP para identificar de forma no dirigida las regiones
responsables de su localización subcelular. Para diseñar las diferentes
versiones truncadas de IYO se tuvieron en cuenta posibles dominios
funcionales de IYO. Estos incluían las señales de importe y exporte nuclear
descritas en el apartado anterior, así como los dominios RPAP1_N/pfam 08621
y RPAP1_C/pfam 08620 localizados en los primeros 500 aminoácidos de la
proteína IYO y diversos dominios ARM que se encuentran entre los
aminoácidos 500 y 1000 y que están conservados en los homólogos de IYO en
hongos y animales (Fig. 4.2A) (Jaime et al., 2012, Jeronimo et al., 2004).
Además, se analizó la función del motivo RGG localizado entre los aminoácidos
976-978 de IYO, que está altamente conservado en plantas y que está mutado
en el mutante hipomórfico iyo-1. Los fenotipos de este mutante indican que el
motivo RGG es importante para la actividad pro-diferenciación de IYO
(Sanmartín et al. 2011) y, por tanto, podría estar implicado en su localización
nuclear. Con el fin de caracterizar la relevancia de las regiones en la
Resultados
64
determinación de la localización subcelular de IYO, se generaron las siguientes
versiones truncadas: las construcciones IYOATG430, IYOATG500, IYOATG959 e
IYOATG978, que comprenden la secuencia polipeptídica de IYO desde el codón
ATG iniciador hasta los aminoácidos 430, 500, 959 y 978 respectivamente, así
como las construcciones complementarias IYO500Rev, IYO959Rev e IYO978Rev, que
comprenden las secuencias de aminoácidos desde las posiciones 500, 959 ó
978, hasta el codón anterior al de parada, respectivamente. Dichas versiones
truncadas se clonaron como fusiones traduccionales al extremo amino (N-)-
terminal de la proteína GFP bajo el control del promotor constitutivo 35S.
Las construcciones se expresaron de manera transitoria en hojas de N.
benthamiana y se analizó la localización subcelular de las diferentes versiones
truncadas de IYO mediante microscopía confocal (Fig. 4.2B). Se observó que
las construcciones que contienen el dominio NLSA (IYOATG430-GFP, IYOATG500-
GFP, IYOATG959-GFP e IYOATG978-GFP) presentaban una localización
exclusivamente nuclear. La distribución nuclear de IYOATG430 e IYOATG500 no era
homogénea, pudiéndose observar estructuras subnucleares en las que la
fluorescencia era más intensa que en el resto del nucleoplasma (Fig. 4.2B). Se
han descrito numerosas subcompartimentos nucleares (“cuerpos nucleares”)
que, en general, tienen una función en transcripción, procesamiento y
compartimentalización de ARNs (Lamond and Spector, 2003). La construcción
IYOATG978-GFP presentaba una distribución de la fluorescencia en el
nucleoplasma homogénea, similar a la que se observa con la proteína
completa, sugiriendo que la región entre los aminoácidos 500 y 978 es
importante para una distribución uniforme de IYO en el nucleoplasma. Todas
estas construcciones estaban excluidas del nucléolo, lo cual implica que IYO
no estaría implicado en la transcripción de los ARNs ribosomales por la ARN
polimerasa I (Russell and Zomerdijk, 2006). Las versiones truncadas del
extremo C-terminal (IYO500Rev-GFP e IYO978Rev-GFP), que no poseen el dominio
NLSA, presentaron una localización principalmente citoplasmática, si bien se
observaba cierta acumulación nuclear de las proteínas (Fig. 4.2B). El análisis
por western blot de la expresión de las distintas construcciones mostró que se
acumulaban proteínas de los tamaños previstos para las fusiones (Fig. 4.2C),
demostrando que los patrones de fluorescencia observados reflejaban la
distribución de cada versión truncada.
Resultados
65
Fig. 4.2: Caracterización de las versiones truncadas de IYO. A) Esquema de las
versiones truncadas con los dominios ARM (verde) y RPAP1 (azul) y
presencia/ausencia (+/-) de posibles dominios implicados en el transporte de IYO al núcleo. B) Localización subcelular de las proteínas fusionadas a GFP (en verde). Microscopia confocal en hojas de N. benthamiana a los 3 días postinfiltración. Las
flechas blancas marcan los núcleos ampliados. En rojo se muestran los cloroplastos.
Barra de escala: 20 µm. C) Análisis por western blot de la expresión de las proteínas en los ensayos mostrados en el panel B.
Resultados
66
4.2 Análisis del efecto de las alteraciones en la localización
subcelular sobre la actividad de IYO
4.2.1 Generación de líneas transgénicas de sobreexpresión estables
La migración de IYO al núcleo coincide con la entrada en diferenciación
celular, sugiriendo una relación causal entre ambos eventos (Sanmartín et al.,
2011). Sin embargo, se desconoce cuál es la actividad molecular de IYO y en
qué compartimento subcelular realiza sus funciones. Para analizar la relación
entre localización y actividad, se generaron líneas transgénicas estables de
Arabidopsis thaliana de las siguientes construcciones: 35S::IYO-GFP,
35S::IYOATG959-GFP, 35S::IYOATG978-GFP, 35S::IYO959Rev-GFP, 35S::IYO978Rev-GFP y
35S::IYOΔNLSAB1-GFP. Se caracterizaron 12 líneas transgénicas independientes
en fondo Col-0 de cada una de las diferentes construcciones que presentaban
una segregación 3:1 (plantas resistentes: plantas sensibles en medio de
selección) en la T2, sugiriendo que se trataba de líneas con una única
inserción del transgén.
4.2.2 Estudios de complementación del mutante nulo iyo-3
Para analizar su actividad in vivo, se estudió si las construcciones eran
capaces de complementar el fenotipo de letalidad embrionaria del mutante
nulo iyo-3. La presencia tanto del transgén como de la inserción de ADN-T se
comprobó por PCR y mediante visualización en el microscopio confocal. Se
cruzaron plantas heterocigotas iyo-3 con dos líneas transgénicas
independientes de 35S::IYO-GFP, 35S::IYOATG959-GFP, 35S::IYOATG978-GFP,
35S::IYO978Rev-GFP y con una línea de la construcción 35S::IYOΔNLSAB1-GFP. En
la F2 se obtuvieron plantas homocigotas para el transgen y heterocigotas para
la mutación iyo-3, pero no se obtuvieron plantas homocigotas para iyo-3. El
análisis de la segregación de los alelos silvestre e iyo-3 en la progenie de las
plantas homocigotas para el transgén y heterocigotas para iyo-3 dio los
resultados que se muestran en la Tabla 4.1. Se analizaron entre 40-54 plantas
de cada progenie y en ningún caso se obtuvieron plantas homocigotas para
iyo-3, lo que indica que ninguna de las construcciones es capaz de
complementar la letalidad embrionaria de la mutación. Por el contrario, una
construcción pIYO::IYO-GFP si complementa la mutación (Sanmartín et al.,
2011), lo cual sugiere que el promotor 35S no es adecuado para rescatar los
Resultados
67
defectos tempranos del desarrollo que tiene el mutante iyo-3 (Sanmartín et al,
2011), probablemente debido a los bajos niveles de expresión que tiene en esos
estadios de la embriogénesis (Sunilkumar et al., 2002, Muñoz et al., 2017). Por
el contrario, el promotor 35S dirige una expresión fuerte y constitutiva en los
tejidos de la planta adulta, por lo que se puede analizar el efecto de la
sobreexpresión de las distintas construcciones sobre el desarrollo de la planta.
Tabla 4.1: Estudio de complementación de la mutación iyo-3 por las líneas
transgénicas homocigotas. Se indica el número de plantas de cada genotipo y el
porcentaje del total de plantas analizadas de la descendencia de plantas homocigotas
(+/+) para el transgén bajo el promotor 35S y heterocigotas para la mutación iyo-3. En
la última columna se indica la proporción esperada en el caso de que el transgén
complementase la letalidad de los mutantes iyo-3/iyo-3.
IYO-GFP +/+
IYOATG959-GFP L1 +/+
IYOATG978-GFP L3 +/+
IYO978Rev-GFP L1 +/+
IYOΔNLSAB1-GFP L2 +/+
Segregación esperada
iyo-3/iyo-3 0 (0 %) 0 (0 %) 0 (0 %) 0 (0%) 0 (0%) 25%
iyo-3/IYO 32 (65%) 31 (62%) 33 (67%) 34 (68%) 32 (68%) 50%
IYO/IYO 17 (35%) 19 (38%) 16 (33%) 16 (32%) 15 (32%) 25%
4.2.3 Localización y efecto de la sobreexpresión de las construcciones
Para caracterizar las líneas de sobreexpresión, se analizó en primer lugar la
localización subcelular de las proteínas transgénicas en células de la raíz y los
niveles de acumulación en extractos totales de proteínas de plántulas de 7
días. A nivel fenotípico, se analizó el efecto de la sobreexpresión sobre el
desarrollo y los niveles de endoreduplicación en la planta.
4.2.3.1 Sobreexpresión de IYO-GFP
En las líneas 35S::IYO-GFP se observan altos niveles de fluorescencia en la
caliptra, en la zona de elongación y de diferenciación y en la raíz madura,
mientras que la fluorescencia en células meristemáticas es baja e indetectable
en las células del centro quiescente (Fig. 4.3A-B). A nivel subcelular, IYO-GFP
se localiza en el citoplasma de las células meristemáticas, mientras que se
acumula en el núcleo de las células diferenciadas de la cofia y de las células
en diferenciación y diferenciadas en la parte distal de la raíz (Fig. 4.3A-B y
Sanmartín et al., 2011).
Resultados
68
La sobreexpresión de IYO-GFP provoca claras alteraciones del desarrollo en la
parte aérea. El desarrollo foliar es normal, pero los tallos presentan internodos
más cortos lo que resulta en una compactación de las inflorescencias (Fig.
4.4B). Además, ocasionalmente se observan meristemos de inflorescencia de
crecimiento determinado, que acaban en una silicua, sugiriendo que la
sobreexpresión de IYO-GFP activa prematuramente la diferenciación de las
células meristemáticas. Para comprobar el efecto de la construcción sobre el
desarrollo radicular, se analizó el crecimiento y la estructura de los
meristemos radiculares en plantas crecidas en condiciones in vitro. Para
determinar si estas alteraciones en el crecimiento estaban asociadas a
cambios en los meristemos, se clarificaron raíces de las distintas líneas y se
visualizó la organización celular de los meristemos de 21 días por microscopía
Nomarski. Este análisis evidenció que la sobreexpresión de IYO-GFP causa la
diferenciación prematura del meristemo de raíz (Fig. 4.4A).
4.2.3.2 Sobreexpresión de IYOATG978-GFP
Los niveles de expresión de 35S::IYOATG978-GFP en los distintos tejidos de la
raíz son similares a los de 35S::IYO-GFP. Sin embargo, se observan cambios
muy significativos en el patrón de distribución subcelular, ya que IYOATG978-
GFP se localiza en el núcleo de células meristemáticas en las que IYO-GFP es
citosólico. Concretamente, observamos localización nuclear de IYOATG978-GFP
en las células iniciales que rodean al centro quiescente, así como en todas las
células meristemáticas de la epidermis y la estela (Fig. 4.3A-B). En las células
meristemáticas del córtex y la endodermis la expresión es muy baja, pero en
algunas es posible distinguir la fluorescencia en el núcleo, indicando que
también en estos tejidos la distribución está alterada con respecto a IYO-GFP.
En las células diferenciadas de la raíz (caliptra y raíz madura), IYOATG978-GFP,
al igual que IYO-GFP, se localiza en el núcleo. La localización nuclear ectópica
de IYOATG978-GFP en células meristemáticas se corresponde con un incremento
en el ritmo de diferenciación de los meristemos. Así, en las líneas que
sobreexpresan altos niveles de IYOATG978-GFP (L1, L2, L4) no se obtiene
descendencia de plantas homocigotas ya que el meristemo apical del tallo se
diferencia totalmente después de producir 3 ó 4 hojas y no genera tallos
florales (Fig. 4.4A). En plantas heterocigotas o en líneas que expresan menores
niveles del transgén, el desarrollo era más parecido al de plantas silvestres
(Fig. 4.4B).
Resultados
69
Fig. 4.3. Caracterización de las líneas 35S::IYOATG978-GFP de Arabidopsis
thaliana. A-B) Localización subcelular de la proteína de fusión IYOATG978-GFP en el meristemo de la raíz (A) y en la raíz diferenciada (B). En el panel superior: Tinción con
ioduro de propidio (IP; rojo) y expresión de GFP (verde) combinadas; panel inferior:
fluorescencia de GFP. Barra de escala: 20 µm. C) Análisis por western blot de la
expresión de las proteínas fusionadas a GFP en plántulas de 7 días de las líneas indicadas.
Resultados
70
Fig. 4.4. Efecto de la sobreexpresión de IYOATG978-GFP en el meristemo de la raíz
y en plantas adultas. Fenotipos de plantas transgénicas sobreexpresoras de IYO-GFP
o IYOATG978-GFP comparadas con plantas silvestres crecidas en paralelo. A) Desarrollo
del meristemo aéreo y radícular en las líneas indicadas a los 20 días de crecimiento en
placa. Barra de escala: 5 mm (parte aérea) y 20 µm (raíces). B) Plantas adultas de las líneas indicadas a las 4 semanas de crecimiento en tierra bajo condiciones de
fotoperiodo largo, 21ºC y 60% de humedad relativa. He: plantas heterocigotas para el transgen. Ho: plantas homocigotas para el transgen.
El estudio del meristemo de raíz en raíces clarificadas a los 20 días evidenció
que la sobreexpresión de IYOATG978-GFP causa la diferenciación prematura, de
forma similar a lo observado para la sobreexpresión de IYO-GFP (Fig. 4.4A).
Estos resultados apoyan la hipótesis de que la localización nuclear de IYO es
esencial para activar la diferenciación, e indican que los niveles de IYO en el
núcleo son limitantes para iniciar este proceso.
De forma paralela se generaron plantas transgénicas de la construcción
IYOATG959-GFP, que debido a que presentan una localización subcelular
idéntica a la de IYOATG978-GFP, se presentan en el Anexo I.
Resultados
71
4.2.3.3 Sobreexpresión de IYO978Rev-GFP e IYOΔNLSAB1-GFP
En las líneas 35S::IYO978Rev-GFP y 35S::IYOΔNLSAB1-GFP, la fluorescencia es
exclusivamente citosólica y se detecta dentro del ápice de la raíz en las células
iniciales del meristemo y en células de la cofia y de la epidermis (Fig. 4.5A-B y
Fig. 4.7A-B). También se detecta en el citoplasma en células maduras de la
raíz, aunque con unos niveles de expresión muy bajos. A nivel fenotípico, la
sobreexpresión de estas construcciones provoca efectos claros en el desarrollo
de la parte aérea de la planta, incluyendo la pérdida de la dominancia apical,
la duplicación de los meristemos apicales de tallo y el consiguiente desarrollo
de tallos fasciados, así como la compactación de las inflorescencias (Fig. 4.6B
y Fig. 4.8B). La duplicación de los meristemos apicales y la fasciación del tallo
se observan también en el mutante hipomorfico iyo-1 (Sanmartin et al., 2011),
lo que sugiere que la sobreexpresión de 35S::IYO978Rev-GFP o 35S::IYOΔNLSAB1-
GFP interfiere con la función del gen endógeno IYO y provoca defectos en la
entrada en diferenciación en el meristemo y la consiguiente formación de
meristemos ectópicos (Fig. 4.6B y Fig. 4.8B). En el meristemo radicular de las
raíces clarificadas de estas líneas no se observaron diferencias con respecto a
las plantas silvestres (Fig. 4.6A y Fig. 4.8A), lo que apoya la hipótesis de que
sólo la sobreexpresión de versiones nucleares de IYO induce una
diferenciación prematura.
De forma paralela se generaron plantas transgénicas de la construcción
IYO959REV-GFP, que debido a que muestran una localización subcelular
idéntica a la de las líneas 35S::IYO978REV-GFP se presentan en el Anexo I.
Resultados
72
Fig. 4.5. Caracterización de las líneas 35S::IYO978Rev-GFP de Arabidopsis
thaliana. A-B) Localización subcelular de la proteína IYO978Rev-GFP en el meristemo
de la raíz (A) y en la raíz diferenciada (B). En el panel superior: combinación de la tinción IP (rojo) y la expresión de GFP (verde); panel inferior: fluorescencia de GFP.
Barra de escala: 20 µm. C) Análisis por western blot de la expresión de las proteínas fusionadas a GFP en plántulas de 7 días de las líneas indicadas.
Resultados
73
Fig. 4.6. Efecto de la sobreexpresión de IYO978Rev-GFP en el meristemo de la raíz
y en plantas adultas. Fenotipos de plantas transgénicas sobreexpresoras de IYO-GFP o IYO978Rev-GFP comparadas con plantas silvestres crecidas en paralelo. A) Desarrollo
del meristemo aéreo y radícular en las líneas indicadas a los 20 días de crecimiento en
placa. Barra de escala: 5 mm (parte aérea) y 20 µm (raíces). B) Plantas adultas de las
líneas indicadas a las 4 semanas de crecimiento en tierra bajo condiciones de
fotoperiodo largo, 21ºC y 60% de humedad relativa. He: plantas heterocigotas para el transgen. Ho: plantas homocigotas para el transgén.
Resultados
74
Fig. 4.7. Caracterización de las líneas 35S::IYOΔNLSAB1-GFP de Arabidopsis
thaliana. A-B) Localización subcelular de la proteína IYOΔNLSAB1-GFP en el meristemo
de la raíz (A) y en la raíz diferenciada (B). Panel superior: tinción IP (rojo) y expresión GFP (verde) y en el panel inferior sólo GFP. Barra de escala: 20 µm. C) Análisis por
western blot de la expresión de las proteínas fusionadas a GFP en plántulas de 7 días
de las líneas indicadas.
Resultados
75
Fig. 4.8. Efecto de la sobreexpresión de IYOΔNLSAB1-GFP en el meristemo de la raíz
y en plantas adultas. Fenotipos de plantas transgénicas sobreexpresoras de IYO-GFP
o IYOΔNLSAB1-GFP comparadas con plantas silvestres crecidas en paralelo. A) Desarrollo del meristemo aéreo y radícular en las líneas indicadas a los 20 días de crecimiento en
placa. Barra de escala: 5 mm (parte aérea) y 20 µm (raíces). B) Plantas adultas de las
líneas indicadas a las 4 semanas de crecimiento en tierra bajo condiciones de
fotoperiodo largo, 21ºC y 60% de humedad relativa. He: plantas heterocigotas para el transgen. Ho: plantas homocigotas para el transgén.
4.2.3.4 Análisis del nivel de endoreduplicación en las líneas sobreexpresoras
La diferenciación en plantas conlleva, en muchos casos, la entrada en
endoreduplicación (Joubes and Chevalier, 2000, Sugimoto-Shirasu and
Roberts, 2003). Por tanto, el análisis del nivel de ploidía en las líneas de
sobreexpresión caracterizadas nos podría aportar evidencias adicionales sobre
posibles cambios en la entrada en diferenciación. Sería de esperar que una
aceleración de la diferenciación estuviera asociada a un aumento de los
niveles de ploidía, mientras que un retraso en la diferenciación tendría el
efecto contrario. Para determinar si había cambios en niveles de
endoreduplicación, se analizó mediante citometría el nivel de ploidía celular en
Resultados
76
hojas primarias de plantas de 18 días de las líneas 35S::IYO-GFP,
35S::IYOATG978-GFP (L1, heterocigota), 35S::IYO978Rev-GFP (L1, homocigota) e
35S::IYOΔNLSAB1-GFP (L2, homocigota) y se comparó al de plantas silvestres.
Las plantas 35S::IYO-GFP mostraron una distribución de ploidía similar al de
las plantas silvestres, pero en las plantas 35S::IYOATG978-GFP había un
aumento del porcentaje de células con altos niveles de ploidía (contenido de
ADN 16C y 32C), mientras que disminuía la proporción de células con un
contenido 2C y que por tanto, no habían entrado en endoreduplicación (Fig.
4.9). Por el contrario, las plantas de las líneas 35S::IYO978REV-GFP y
35S::IYOΔNLSAB1-GFP presentaron un mayor porcentaje de células 2C y una
menor proporción de células 16C y 32C (Fig. 4.9). Estos resultados indican
que en las plantas 35S::IYOATG978-GFP hay un mayor grado de
endoreduplicación, lo cual es consistente con una entrada prematura en
diferenciación, mientras que en las líneas 35S::IYO978REV-GFP y 35S::IYOΔNLSAB1-
GFP, hay un menor grado de endoreduplicación asociado a un retraso en la
diferenciación. Por tanto, al igual que en raíces, la expresión de versiones
nucleares de IYO aceleraría la diferenciación, mientras que la sobreexpresión
de versiones citosólicas retrasaría la diferenciación.
Fig. 4.9: Análisis mediante citometría de flujo del contenido de ADN nuclear de
plantas silvestres (Col-0), sobreexpresoras de la proteína completa IYO (35S::IYO-
GFP), sus versiones truncadas (35S::IYOATG978-GFP y 35S::IYO978Rev-GFP) y delecionada (35S::IYOΔNLSAB1-GFP). Contenido de ADN en el primer par de hojas en
plantas de las distintas líneas a los 18 días de edad. Cada segmento de la barra con
distinto color representa el porcentaje del tamaño nuclear asociado a cada ploidía
respecto del total de células analizadas. Las barras indican la desviación estándar y
los asteriscos las poblaciones significativamente diferentes a la misma población de
las plantas silvestres, realizado con el test estadístico T-student. Las gráficas representan la media de 3 experimentos independientes.
Resultados
77
4.3 Caracterización molecular de IYO: identificación de
interactores
No se conoce cual es la actividad molecular de IYO ni cuáles son los
componentes celulares que participan en su entrada al núcleo. Para esclarecer
estas cuestiones, iniciamos una búsqueda de proteínas que interaccionan con
IYO, mediante una estrategia de immunopurificación seguida de la
identificación de las proteínas coinmunopurificadas por espectrometría de
masas. Se realizaron tres inmunopurificaciones independientes con
anticuerpos frente a GFP usando extractos de plantas 35S::IYO-GFP, así como
de plantas que expresaban una construcción 35S::GFP como control negativo.
Mediante espectrometría cuantitativa sin marcaje (label-free) se determinó la
cantidad de las proteínas inmunopurificadas en los tres extractos de plantas
35S::IYO-GFP y en los tres controles negativos. En la Tabla 4.2 se muestran
las proteínas identificadas que estaban significativamente enriquecidas en la
inmunoprecipitación de plantas 35S::IYO-GFP. Entre las proteínas
identificadas se encontró la proteína cebo (IYO-GFP), así como las
subunidades RPB2 y RPD2 de las ARN polimerasas II y IV, respectivamente, y
las subunidades RPB3, RPB10 RPB11, que son comunes a las ARN
polimerasas II, IV y V (Tabla 4.2).
Tabla 4.2: Proteínas identificadas por inmunoprecipitación de IYO-GFP. Las
proteínas recuperadas con IYO-GFP muestras un enriquecimiento en el ensayo, el
ratio IYO vs WT muestra el número de veces que se ha recuperado en el ensayo con
IYO-GFP frente a las plantas control. El p-value ANOVA revela la probabilidad de las
diferencias encontradas.
Péptidos únicos
promedio IYO
promedio WT
RATIO IYO vs WT
p-value ANOVA
Descripción de la proteína
115 1,67E+08 12009 13873 2,95E-08 IYO
53 3576733 48386 74 3,95E-06 NRPB2 RNA Pol II
11 5126733 13427 382 4,44E-04 NRPB3/NRPD3/NRPE3A RNA Pol II, IV y V
11 116998 170 688 6,93E-16 NRPD2/NRPE2 RNA Pol IV y V
8 4116500 1836950 2 1,49E-03 MED19a
7 3881833 6506 597 1,60E-16 NRPB11/NRPD11/NRPE11 RNA Pol II, IV y V
6 312190 63531 5 4,16E-07 RAS-RELATED NUCLEAR PROTEIN 1/RAN1
1 193563 170 1139 4,52E-01 NRPE3B RNA Pol V, trace amounts in Pol II y Pol IV
2 690740 39006 18 1,08E-03 NRPB10/NRPD10/NRPE10 RNA Pol II, IV y V
1 1170 170 6,9 4,52E-01 IMP4
1 1321 330 4 3,99E-13 MED14
Resultados
78
Estas subunidades, junto con RPB12 y RPB9, se han propuesto que forman
un subcomplejo durante el ensamblaje de la Pol II (Leam et al., 2009), por lo
que es posible que IYO interaccione preferentemente con este subcomplejo de
la Pol II. Además, se identificaron proteínas que podrían estar implicadas en el
transporte de IYO al núcleo (RAN e IMP4) y subunidades del complejo
regulador de la transcripción Mediator (MED19 y MED14).
4.3.1 Interacción de IYO con el complejo de la Pol II
Se habían obtenido evidencias previas de la interacción de IYO con
subunidades de la Pol II (Sanmartin et al., 2011). En ensayos de pull-down se
había detectado la interacción entre la proteína IYO fusionada a MBP (Maltose
Binding Protein) y la subunidad RPB3 traducida in vitro. Además, se constató
la interacción de IYO con RPB3 y RPB10 en ensayos de complementación
bimolecular de fluorescencia (BiFC). Estos resultados apoyan la conclusión de
que las subunidades de la Pol II identificadas en la inmunopurificación de
IYO-GFP son interactores bona fide de IYO. Para analizar en qué
compartimento celular se produce esta interacción, realizamos ensayos de
BiFC entre RPB10 y versiones nucleares y citosólicas de IYO (Fig. 4.10). En los
ensayos con la proteína IYO completa, la fluorescencia reconstituida se detectó
en el núcleo, tal como ya se había descrito con anterioridad (Sanmartín et al.,
2011).
Fig. 4.10. Interacción de IYO con el complejo de la Pol II. Localización subcelular
de la subunidad de la Pol II RPB10 (izquierda) y ensayo de BiFC entre C-RPB10 y N-
IYO (centro) o N-IYOΔNLSAB1 (derecha). N-: fragmento N-terminal de la proteína
fluorescente YFP. C-: fragmento C-terminal de la proteína fluorescente YFP. En verde
se muestra la señal fluorescente de la GFP/YFP y en rojo la de los cloroplastos. Las
ampliaciones muestras detalles de los núcleos. Barra de escala: 20 µm.
Resultados
79
En ensayos con la proteína IYOΔNLSAB1, también se observó reconstitución de la
fluorescencia, pero en este caso se detectó en el citosol (Fig. 4.10). Estos
resultados sugieren que IYO interaccionaría con RPB10 en el citosol formando
un complejo que requeriría las señales NLS de IYO para su transporte al
núcleo. Alternativamente, es posible que la sobreexpresión de la construcción
IYOΔNLSAB1-GFP retenga artificialmente a RPB10 en el citosol.
4.3.2 Interacción entre IYO y el complejo Mediator
La copurificación con MED19 y MED14 apoya la hipótesis de que IYO se
asocia con el complejo Mediator in vivo. En este sentido, estudios en células de
mamíferos han revelado una posible relación entre el ortólogo de IYO, RPAP1,
y el complejo Mediator en la regulación de los superenhancers (Lynch et al.,
2018). Para confirmar la interacción con el complejo Mediator se llevaron a
cabo experimentos de complementación bimolecular de fluorescencia entre
IYO y MED19. En estos experimentos se observó la reconstitución de la YFP
cuando se co-infiltraron las construcciones cYFP-MED19 ó MED19-cYFP con
nYFP-IYO (Fig. 4.11), lo cual apoya la hipótesis de que IYO interactúa con el
complejo Mediator.
Fig. 4.11. Localización celular de MED19 y su interacción por BiFC con IYO.
Localización subcelular de MED19 fusionado a GFP (izquierda) y ensayo de BiFC entre
C-MED19 y N-IYO (centro) o N-IYOΔNLSAB1 (derecha). N-: fragmento N-terminal de la proteína fluorescente YFP. C-: fragmento C-terminal de la proteína fluorescente YFP.
En verde se muestra la señal fluorescente de la GFP/YFP y en rojo la de los
cloroplastos. Barra de escala: 20 µm.
La YFP reconstituida se acumula en el núcleo, detectándose una mayor
fluorescencia en estructuras subnucleares, que también se observan cuando
Resultados
80
se expresa la proteína MED19 fusionada a GFP (Fig. 4.11) y son similares a las
observadas con las construcciones IYOATG430-GFP e IYOATG500-GFP (Fig. 4.2B).
Por otro lado, no se observó reconstitución de la fluorescencia en ensayos de
BiFC entre MED19 e IYOΔNLSAB1. Estos resultados sugieren que IYO
interacciona con el complejo Mediator en el núcleo y preferentemente en
dominios subnucleares donde MED19 es más abundante.
4.3.3 Interacción de IYO con factores canónicos de transporte
núcleo/citoplásmico
Dentro de los posibles interactores de IYO identificados en el estudio
proteómico, se encontraron dos factores que forman parte de las rutas
canónicas de importe y exporte nuclear, la GTPasa RAN y la importina de tipo
alfa IMP4. Las GTPasas de la familía RAN son esenciales para el importe y el
exporte de proteínas nucleares al establecer la direccionalidad del transporte a
través del poro nuclear (Newmeyer et al., 1986). Por otro lado, las importinas
de tipo alfa funcionan como receptores de las señales NLS y, junto a las
importinas tipo beta, median el importe al núcleo de proteínas que contengan
estas señales (Lange et al., 2007a). En Arabidopsis, hay 4 miembros de la
familia RAN. RAN1, RAN2 y RAN3 comparten más de un 96% de identidad
entre ellas a nivel de secuencia, mientras que RAN4 es más divergente, con
una identidad menor del 73% respecto a las otras 3 RANs. En los
experimentos de coinmunopurificación se identificaron péptidos que
corresponderían a las proteínas RAN1, RAN2 o RAN3. Debido a la gran
identidad de secuencia entre estas tres proteínas, decidimos seleccionar una
de ellas (RAN1) como representativa de todo el clado. Por otro lado, en el
genoma de Arabidopsis hay 9 importinas de tipo alfa que presentan una
mayor divergencia en secuencia que las GTPasas RAN. Entre estas importinas,
hay tres de ellas (IMP3, IMP4 e IMP6) que tienen un patrón de expresión en el
meristemo de la raíz similar al de IYO (Brady et al., 2007), por lo que se
seleccionaron para su estudio.
RAN1, IMPA3, IMPA4 e IMPA6 fusionadas a GFP presentaron una localización
nuclear y citoplasmática (Fig. 4.12A), lo cual es acorde a su función en ciclos
de transporte entre estos dos compartimentos. Para estudiar la interacción de
IYO con estas proteínas se analizó la interacción in planta mediante BiFC. Se
Resultados
81
analizaron todas las combinaciones posibles de expresión de las proteínas
fusionadas al fragmento N- o C-terminal de la YFP. En el caso de RAN1, sólo
se observó reconstitución de la YFP en la coinfiltración de nYFP-IYO y RAN1-
cYFP, localizándose la fluorescencia en el núcleo (Fig. 4.12B). En los ensayos
BiFC entre IYO y las diversas importinas de interés, únicamente se detectó
interacción en la coinfiltración de nYFP-IYO e IMPA4-cYFP, acumulándose de
nuevo la fluorescencia en el núcleo (Fig. 4.12B).
Fig. 4.12. Interacción de IYO con proteínas implicadas con la maquinaria de
transporte al núcleo. A) Localización subcelular de las proteínas RAN1-GFP, IMPA3-
GFP, IMPA4-GFP e IMPA6-GFP. B) Ensayos de BiFC entre N-IYO y RAN1-C, IMPA3-C,
IMPA4-C ó IMPA6-C. N-: fragmento N-terminal de la proteína fluorescente YFP. C-:
fragmento C-terminal de la proteína fluorescente YFP. En verde se muestra la señal fluorescente de la GFP/YFP y en rojo la de los cloroplastos. Barra de escala: 20 µm.
Estos resultados apoyan que tanto RAN1 como la importina IMP4 se asocian
con IYO, probablemente para su regular su partición nucleo/citoplásmica. Así,
IMP4 funcionaría como receptor de la señal NLS de IYO y, por tanto, la
interacción debería ser dependiente de ese dominio. Efectivamente, la
eliminación de los dominios NLSA y NLSB impide la interacción de nYFP-
IYOΔNLSAB1 con IMP4 (Fig. 4.13), lo que apoya que la IMP4 funciona como un
receptor de importe a núcleo de IYO que reconocería las señales NLSA y NLSB.
Además, IYO parece interactuar específicamente con RAN1 en el núcleo, donde
RAN1 está presente en su forma activa unida a GTP y no en el citosol, donde
RAN1 está en su forma inactiva unida a GDP. En el núcleo, Ran-GTP forma un
complejo trimérico con exportinas y proteínas con señales NES para su
Resultados
82
exporte del núcleo. Por tanto, es probable que RAN1 interactúe con IYO en el
núcleo para mediar su exporte al citosol.
Fig. 4.13. IYOΔNLSAB1 no interacciona con proteínas implicadas con la maquinaria
de transporte al núcleo. Ensayos de BiFC entre N-IYO ΔNLSAB1 y RAN1-C y IMPA4-C.
N-: fragmento N-terminal de la proteína fluorescente YFP. C-: fragmento C-terminal de
la proteína fluorescente YFP. En rojo se muestra la señal de los cloroplastos. Barra de escala: 20 µm.
4.3.4 Interacción de IYO con factores no canónicos de importe nuclear
Se han obtenido evidencias de que el complejo de la Pol II se ensambla en el
citosol y de que existen una serie de factores no canónicos de importe nuclear
que son necesarios para la acumulación de la Pol II en el núcleo (Wild y
Cramer, 2012). Entre ellos, está la familia de las proteínas GPN que interviene
en el importe al núcleo de la Pol II en levaduras y animales (Forget et al.,
2010, Carre and Shiekhattar, 2011). La posible interacción de IYO con GPN2
detectada en los ensayos de inmunopurificación indicaría que IYO podría
utilizar estos factores para su importe al núcleo. Datos anteriores en otros
organismos ya indicaban una posible relación funcional entre homólogos de
IYO y proteínas de la familia GPN. Así, en levaduras, la supresión de RBA50, el
homólogo de IYO, causa alteraciones transcripcionales semejantes a las que
ocurren cuando se silencia NPA3/GPN1 o YLR243W/GPN3 (Jeronimo et al.,
2007). Además, en ensayos de purificación por afinidad en tándem (TAP-TAG)
de las proteínas RPAP1 y XAB1/GPN1 en células humanas, se observó la
copurificación de ambas proteínas, sugiriendo que están asociadas in vivo
(Jeronimo et al., 2007).
Resultados
83
Basándonos en estas evidencias, decidimos estudiar en mayor profundidad la
posible relación funcional de IYO con los tres miembros de la familia GPN en
Arabidopsis, GPN1, GPN2 y GPN3. Para estudiar la localización subcelular de
las proteínas GPN, se expresaron transitoriamente como fusiones a GFP en
Nicotiana benthamiana. La proteína de fusión GPN1-GFP presentó una
localización predominantemente citoplasmática, mientras que GPN2-GFP se
repartía más homogéneamente entre núcleo y citoplasma, y la localización de
GPN3-GFP era eminentemente nuclear (Fig. 4.14A). La localización dual de
GPN1 y GPN2 es acorde a su posible papel en el transporte entre el citosol y el
núcleo.
Fig. 4.14. Localización subcelular de las proteínas de la familia GPN y su interacción con IYO. A) Localización subcelular de las proteínas GPN1-GFP, GPN2-
GFP y GPN3-GFP. B) Ensayos de BiFC entre N-IYO y C-GPN1, C-GPN2 y C-GPN3
respectivamente. N-: fragmento N-terminal de la proteína fluorescente YFP. C-:
fragmento C-terminal de la proteína fluorescente YFP. En verde se muestra la señal
fluorescente de la GFP/YFP y en rojo la de los cloroplastos. Las flechas marcan los núcleos. Barra de escala: 20 µm.
Para confirmar una posible asociación de IYO con las proteínas GPN
analizamos la interacción mediante ensayos de BiFC. No se detectó interacción
entre IYO y GPN3 en ninguna de las combinaciones posibles del ensayo de
BiFC. Con GPN2, se detectó una señal débil de YFP reconstituida en la
combinación nYFP-IYO con cYFP-GPN2, acumulándose la fluorescencia en el
Resultados
84
núcleo. Con GPN1 se detectaron altos niveles de YFP reconstituida cuando se
coinfiltraron nYFP-IYO y GPN1-cYFP, localizándose también la fluorescencia
en el núcleo (Fig. 4.14B). Estos resultados confirman la interacción detectada
de IYO con GPN2 e indican que también interacciona con GPN1.
Para estudiar los dominios que intervienen en la unión a las proteínas GPN, se
analizó la interacción de las versiones truncadas de IYO con GPN1 mediante
ensayos de BiFC. Estos análisis mostraron que la construcción nYFP-IYOATG978
interacciona con GPN1, mientras que su complementaria, IYO978Rev, no
interacciona (Fig. 4.15), sugiriendo que el dominio de unión a las GPNs se
localiza en la parte N-terminal de la proteína. Efectivamente, la interacción
con GPN1 se mantiene en las construcciones IYOATG500 e IYOATG430, delimitando
el dominio de unión a los primeros 430 aminoácidos de la proteína IYO, que es
la región más conservada entre los ortólogos de IYO y que contiene el dominio
RPAP1. La YFP reconstituida se localizó en todos los casos en el núcleo, si bien
con las construcciones IYOATG430 e IYOATG500 la fluorescencia no era homogénea
en el nucleoplasma, sino que se podían observar regiones subnucleares con
una mayor concentración de fluorescencia (Fig. 4.15A), un patrón de
localización similar al de las fusiones a GFP de estas construcciones
truncadas (Fig. 4.2B). Además, GPN1 también interactúa con IYONLSAB1, y el
complejo se localiza en el citosol, lo cual apoya que GPN1 se asocia con IYO en
este compartimento para su transporte al núcleo y que este importe requiere
las señales NLS de IYO y, por tanto, probablemente es dependiente de la IMP4.
Resultados
85
Fig. 4.15. Determinacion de la región interactora entre IYO y GPN1. Ensayos de
BiFC entre C-GPN1 y N-IYO, N-IYOATG430, N-IYOATG500, N-IYOATG978, N-IYO978Rev, y N-
IYONLSAB1. N-: fragmento N-terminal de la proteína fluorescente YFP. C-: fragmento C-
terminal de la proteína fluorescente YFP. En verde se muestra la señal fluorescente de
la GFP/YFP y en rojo la de los cloroplastos. Barra de escala: 20 µm.
Además de las versiones truncadas de IYO, testamos posibles dominios de la
proteína GPN1 responsables de su interacción con IYO. Algunos dominios
funcionales de los ortólogos de GPN1 han sido caracterizadas en otros
organismos (Forget et al., 2010, Carre and Shiekhattar, 2011), por lo que
generamos construcciones de GPN1 con sustituciones de alanina en los
motivos GPN (GPN1mGPN) y G1 de unión a GTP (GPN1mG1; Fig. 4.16A), que se
han descrito como necesarios para la actividad GPN1 (Forget et al., 2010).
En células humanas GPN1mGPN y GPN1mG1 se localizan, respectivamente, en el
citosol y en el núcleo y su expresión exógena inhibe de forma dominante el
importe de la subunidad RPB1 de la Pol II al núcleo (Forget et al., 2010; Carre
y Shiekhattar, 2011). Curiosamente, los ensayos de expresión transitoria de
estas construcciones mutadas en Nicotiana revelaron que GPN1mGPN es
mayoritariamente nuclear, mientras que GPN1mG1 permanece de forma
mayoritaria en el citoplasma (Fig. 4.16B), lo cual indica que la mutación de
estos motivos afecta la localización de la proteína de manera opuesta a lo
observado en animales.
Resultados
86
Fig. 4.16. Importancia de los dominios GPN y G1 en la interacción con IYO y con
RIMA. A) Esquema de los dominios de GPN1. Se han resaltado los dominios que se
han sustituido por secuencias de alaninas. B) Localización subcelular de GPN1 y las proteínas con sustituciones de aminoácidos en los dominios GPN y G1. C) Ensayos de
BiFC de GPN1, GPN1mGPN y GPN1mG1 con IYO. N-: fragmento N-terminal de la proteína
fluorescente YFP. C-: fragmento C-terminal de la proteína fluorescente YFP. En verde
se muestra la señal fluorescente de la GFP/YFP y en rojo la de los cloroplastos. Barra de escala: 20 µm.
En los ensayos por BiFC, se observó que la construcción nuclear GPN1mGPN
mantiene la interacción con IYO y el complejo se localiza en el núcleo. Por el
contrario, no se observó interacción BiFC entre IYO y la construcción
GPN1mG1 (Fig. 4.16C). Estos resultados indican que la presencia del dominio
G1 de unión a GTP es esencial para la interacción entre GPN1 e IYO.
Dado que GPN1-GFP se acumula mayoritariamente en el citosol mientras que
el complejo BiFC entre IYO y GPN1 se localiza en el núcleo y el formado entre
IYONLSAB1 y GPN1 se localiza en el citosol, se puede inferir que GPN1
interacciona con IYO en el citosol y que el complejo se importa al núcleo de
forma dependiente del NLS de IYO. Sin embargo, la reconstitución de la YFP
en los experimentos de BiFC es irreversible, estabilizando artificialmente los
Resultados
87
complejos formados, lo cual implica que los compartimentos donde se
acumulan finalmente un complejos BiFC pueden no coincidir con el
compartimento donde se formaría y localizaría el complejo endógeno. Para
estudiar la localización de IYO y GPN en el marco de una interacción
reversible, se llevaron a cabo experimentos de coexpresión con las proteínas
fusionadas a distintos fluoróforos. En estos experimentos se observó que la
sobreexpresión de IYO-RFP aumenta levemente la cantidad de GFP-GPN1
presente en el núcleo, mientras que la sobreexpresión de IYOΔNLSAB1-RFP tiene
como resultado la retención de GFP-GPN1 en el citosol (Fig. 4.17).
Fig. 4.17: La interacción transitoria de IYO modifica la localización de GPN1. Control: Localización de GFP-GPN1, IYO-RFP o IYOΔNLSAB1-RFP solas. Coinfiltración:
Localización de las proteínas coexpresadas GFP-GPN1/IYO-RFP o GFP-GPN1/ IYOΔNLSAB1-RFP en ausencia de leptomicina en hojas de N. benthamiana a los 3 días
tras la infiltración Proyección máxima de GFP-GPN1 en el canal verde, en el canal rojo
IYO-RFP o IYOΔNLSAB1-RFP y la superposición de las dos imágenes anteriores. Barra de
escala: 20 µm.
La retención en el citosol de GFP-GPN1 por IYONLSAB1 es más evidente al inhibir
el exporte nuclear con leptomicina B (Fig. 4.18). Al tratar con leptomicina B,
GFP-GPN1 se localiza exclusivamente en el núcleo tanto cuando se expresa
por sí sola, como cuando se coexpresa con IYO-RFP (Fig. 4.18). Por el
contrario, si se coexpresa con IYOΔNLSAB1-RFP, GFP-GPN1 es mayoritariamente
Resultados
88
citosólica en presencia de leptomicina B (Fig. 4.18). Estos resultados apoyan
los datos de BiFC, confirmando que IYO y GPN1 interaccionan en el
citoplasma y que la entrada del complejo al núcleo depende de las señales de
localización nuclear de IYO. También sugieren que la sobreexpresión de la
versión citosólica de IYO retiene a GPN1 en el citosol.
Fig. 4.18: Efecto de la leptomicina B en la localización de GPN1. Control: Localización de GFP-GPN1, IYO-RFP o IYOΔNLSAB1-RFP solas. Coinfiltración: localización
de las proteínas coexpresadas GFP-GPN1/IYO-RFP o GFP-GPN1/ IYOΔNLSAB1-RFP en tras el tratamiento con leptomicina; en hojas de N. benthamiana a los 3 días tras la
infiltración Proyección máxima de GFP-GPN1 en el canal verde, en el canal rojo IYO-
RFP o IYOΔNLSAB1-RFP y la superposición de las dos imágenes anteriores. Barra de
escala: 20 µm.
4.3.5 RIMA forma un complejo con IYO e interacciona con las proteínas GPN
La interacción de IYO con la Pol II y con las proteínas GPN está conservada en
otros animales. Así, se ha descrito que RPAP1, el ortólogo de IYO en animales,
forma un complejo con RPB3, RPB10, RPB11, GPN1 y GPN2. Este complejo
contiene además otras dos proteínas: GDOWN1, una subunidad
subestequiométrica de la Pol II y RPAP2, una fosfatasa de la Pol II. En el
genoma de Arabidopsis no hay homólogos de GDOWN1, pero si existe un
homólogo de RPAP2 que denominamos RPAP2 IYO MATE (RIMA). Estudios en
Resultados
89
nuestro grupo han demostrado que IYO interacciona física y funcionalmente
con RIMA para activar la diferenciación celular en Arabidopsis (Muñoz et al.,
2017). Además, IYO y RIMA promueven recíprocamente su importe al núcleo
(Fig. 4.19A y Muñoz et al., 2017), sugiriendo que entran en el núcleo formando
un complejo. Es posible por tanto que las proteínas GPN también tuvieran un
papel en la localización de RIMA, por lo que estudiamos la posible interacción
entre RIMA y GPN1 como representante de las proteínas GPN. En ensayos de
BiFC se observó la interacción entre RIMA y GPN1 (Fig. 4.19B). Esta
interacción se mantiene con el mutante GPN1mGPN, pero no con GPN1mG1, como
en el caso de IYO (Fig. 4.16). La fluorescencia de la YFP reconstituida al
coinfiltrar nYFP-RIMA y cYFP-GPN1 se localiza en el citoplasma, sugiriendo
que, al igual que con IYO, GPN1 interacciona con RIMA en el citosol. Esta
localización coincide con la de las respectivas proteínas. En cambio, la
localización citosólica del complejo BiFC entre nYFP-RIMA y cYFP-GPN1mGPN no
coincide con la de la proteína GPN1mGPN, que es nuclear, indicando que RIMA
retiene de manera dominante a GPN1mGPN en el citosol.
Fig. 4.19. Interacción entre RIMA e IYO, GPN1 y sus versiones mutadas. A)
Localización celular de RIMA-GFP e interacción de la proteína con IYO y la versión
delecionada IYONLSAB1. B) Ensayos de BiFC de GPN1, GPN1mGPN y GPN1mG1 con RIMA.
N-: fragmento N-terminal de la proteína fluorescente YFP. C-: fragmento C-terminal de
la proteína fluorescente YFP. En verde se muestra la señal fluorescente de la GFP/YFP y en rojo la de los cloroplastos. Barra de escala: 20 µm.
Resultados
90
En conjunto, estos resultados sugieren que IYO y RIMA podrían entrar al
núcleo de forma dependiente de GPNs como parte de un complejo
macromolecular que podría incluir también a subunidades de la Pol II.
4.4 Análisis de la función de IYO y RIMA en la regulación de la
transcripción mediada por la Pol II
4.4.1 Inmunopurificación de cromatina con anticuerpos frente a HA y
secuenciación masiva en extractos de plantas que expresan IYO-HA o RIMA-HA
La coincidencia entre la acumulación nuclear de IYO y el inicio de la
diferenciación celular apunta a que la actividad pro-diferenciación de IYO
ocurre en el núcleo. Teniendo en cuenta su interacción con Pol II, IYO podría
actuar como un regulador directo de la transcripción mediada por Pol II,
posiblemente a través de la actividad fosfatasa de RIMA. Para determinar si
IYO y RIMA participan directamente en la transcripción e identificar sus
posibles dianas, realizamos experimentos de inmunoprecipitación de
cromatina y secuenciación masiva (ChIP-seq). Se utilizaron plántulas de 8 días
que expresaban versiones de las proteínas etiquetadas con HA bajo el control
de los promotores endógenos (pRIMA:RIMA-HA y pIYO:IYO-HA; Fig.4.20).
Fig. 4.20. Inmunoprecipitación de cromatina asociada a IYO-HA y RIMA-HA. Análisis por western blot de los extractos de cromatina iniciales (input), la fracción no
unida a la matriz anti-HA/proteína G (FT) y la fracción unida a la matriz anti-HA/proteína G y eluida (elut). Las fracciones input y elut de cada experimento se
usaron para la preparación de las librerías que se secuenciaron.
Resultados
91
En total se secuenciaron 8 librerías (4 de ADN input y 4 de ADB¿N
inmunoprecipitado) y se obtuvieron entre 22-49 millones de lecturas
desparejadas de 50 nucleótidos por librería (Tabla 4.3). El análisis de las
secuencias se hizo con los programas accesibles online en el servido Galaxy
(https://usegalaxy.org).
Tabla 4.3. Datos de secuenciación de los experimentos de ChIP-seq. Número de
secuencias de 50 bp (en millones de lecturas) y % de secuencias alineadas una sola
vez (1X), más de una vez (>1X) o no-alineadas (0X) con el genoma de referencia
TAIR10.
Muestra Nº de secuencias 1x (%) >1x (%) 0x (%)
IYO-HA Exp1 ChIP 38,73 Mlecturas 24,73 10,47 64,81
IYO-HA Exp1 Input 22,74 Mlecturas 47,59 20,85 31,56
RIMA-HA Exp1 ChIP 37,55 Mlecturas 37,15 16,40 46,82
RIMA-HA Exp1 Input 31,42 Mlecturas 63,95 32,80 3,25
IYO-HA Exp2 ChIP 39,38 Mlecturas 46,78 14,83 38,39
IYO-HA Exp2 Input 38,86 Mlecturas 65,97 30,50 3,53
RIMA-HA Exp2 ChIP 48,96 Mlecturas 49,03 15,35 35,62
RIMA-HA Exp2 Input 33,98 Mlecturas 64,69 32,68 2,63
El alineamiento de las secuencias se llevó a cabo con el programa Bowtie2
frente al genoma de referencia TAIR10. Entre un 24 y un 66% de lecturas por
librería alinearon una sola vez contra el genoma de referencia, siendo éstas
lecturas las que se usaron para los análisis ulteriores. Del análisis de los
datos de la Tabla 4.3 se desprende que el experimento 1 de IYO-HA tuvo un
menor número de secuencias bien alineadas, lo que se refleja en un menor
número de potenciales dianas identificadas.
4.4.2 Identificación de regiones de la cromatina a las que se une IYO-HA o
RIMA-HA.
Utilizamos el programa MACS2 callpeak para buscar zonas del genoma
enriquecidas en lecturas del ADN inmunoprecipitado respecto a las de su
correspondiente ADN input. Se identificaron entre 1923 y 2346 picos
enriquecidos en los ChIP de IYO-HA y RIMA-HA. Más de un 68% de estos picos
se localizaban en genes codificantes de proteínas (Fig. 4.21A-B), lo cual es
Resultados
92
consistente con un papel directo de IYO y RIMA en la transcripción de mARNs
mediada por la Pol II. Además, se constató que la mayoría de los demás picos
se localizaban en ARN de transferencia (ARNt) y de hecho, IYO y RIMA se
asociaban a prácticamente la totalidad de los ARNt de Arabidopsis (Fig.
4.21C). Estos resultados sugirieren que ambas proteínas también regulan la
actividad transcripcional de la ARN polimerasa III.
El análisis de la distribución promedio de lecturas sobre todos los genes
codificantes de Arabidopsis muestra un enriquecimiento en el cuerpo del gen,
desde la zona del promotor proximal hasta el sitio de termianción d ela
transcripción (Fig. 4.21A-B), lo que indica que tanto IYO como RIMA
acompañan a la Pol II durante la transcripción completa del mARN. La
intersección de los conjuntos de genes codificantes a los que se unen IYO y
RIMA muestra un altísimo grado de solapamiento (Fig. 4.21D). Un total de
1247 genes aparecen significativamente enriquecidos (FDR<0.05) en los cuatro
experimentos de inmunoprecipitación. Además, el reanálisis manual mostró
que no existían genes específicamente unidos por una de las proteínas y por
tanto concluimos que IYO y RIMA se unen en forma de complejo a las ARN
polimerasa II y III y las acompañan durante la transcripción de un conjunto de
genes determinado.
Resultados
93
Fig. 4.21. IYO y RIMA se unen a genes codificantes de proteínas y de ARN de
transferencia (ARNt). A) Ejemplos de la distribución de lecturas en tres genes diana. Se muestran los 8 carriles con los 2 experimentos de ChIP/input secuenciados para
cada construcción. A la derecha se indica la muestra a que corresponde cada carril. IYO: IYO-HA; RIMA: RIMA-HA. ChIP: DNA inmunoprecipitado; input: DNA total. B) El
gráfico muestra la distribución de la media de la ratio de lecturas ChIP/input en el experimento 1 RIMA-HA para todos los genes codificantes de proteínas de Arabidopsis.
En el eje de las abscisas se representa la distancia desde el inicio de la transcripción
en nucleótidos. La ratio en la posición -500 se tomó arbitrariamente como valor 1 y el resto de las ratios en las demás posiciones se calculó respecto a esta. C) Ejemplo de la
distribución de lecturas en seis genes codificantes de ARNt presentes en un clúster del
cromosoma 1. D) Análisis de solapamiento de los genes codificantes enriquecidos en
los dos experimentos de ChIP-seq de IYO-HA (dianas de IYO) con respecto a los
enriquecidos en los dos experimentos de RIMA-HA (dianas de RIMA).
4.4.3 Expresión de los genes diana del complejo IYO/RIMA.
Para obtener información sobre el conjunto de los genes diana del complejo
IYO/RIMA, estudiamos su expresión en experimentos de micromatrices con
muestras de los respectivos mutantes. Así, analizamos su expresión en
hibridaciones que comparaban el transcriptoma de raíces de los mutantes
hipomórficos iyo-1 y rima-2 con el de raíces de plantas silvestres. Este análisis
reveló que la mayoría de las dianas de IYO/RIMA tenía una menor expresión
en los mutantes con respecto a las plantas silvestres (Fig. 4.22 y 4.23), lo que
sugiere que IYO y RIMA funcionan preferentemente como activadores
transcripcionales de sus dianas.
Resultados
94
Fig. 4.22. Expresión diferencial de las dianas de IYO/RIMA en raíces de plantas
silvestres frente a raíces de los mutantes iyo-1 y rima-2. Los paneles muestran la
expresión de las 1247 dianas de IYO/RIMA que tienen expresión significativamente diferencial (FDR<0.05) entre raíces silvestres (Wt) y raíces del mutante iyo-1 (panel de
la izquierda) o entre raíces silvestres (Wt) y raíces del mutante rima-2 (panel de la
derecha). En rojo se destacan las dianas que se expresan significativamente más en
los mutantes que en el Wt y en verde las que se expresan significativamente más en el
Wt que en los mutantes.
Posteriormente estudiamos la expresión diferencial de las dianas de IYO/RIMA
en la zona de la diferenciación de la raíz y en la zona meristemática, utilizando
datos transcriptómicos de poblaciones celulares de estas dos regiones
purificadas mediante citometría de flujo (Wendrich et al., 2017). Como se
muestra en la Fig. 4.23, los genes diana de IYO y RIMA se inducen
mayoritariamente en la zona de diferenciación de la raíz. Por el contrario,
entre los genes a los que no se une IYO/RIMA hay una mayoría de genes que
se expresan preferentemente en las células meristemáticas. Estos resultados
indican que el complejo IYO/RIMA activa la expresión de un programa
transcripcional de desarrollo para disparar la diferenciación. Además,
constatamos que las dianas de IYO/RIMA son genes activables (alto grado de
“responsiveness” tal como se define en Aceituno et al., 2008), mientras que los
genes no unidos por IYO/RIMA son genes constitutivos (Fig. 4.23).
Resultados
95
Fig. 4.23. Análisis de la expresión de las dianas de IYO/RIMA. Las dos columnas de la izquierda muestran un gráfico “heatplot” de la ratio de la señal ChIP frente al
input en los experimentos ChIP-seq de IYO-HA (IYO ChIP/input) y RIMA-HA (RIMA
ChIP/input) para los genes codificantes del genoma de Arabidopsis. En las 5 columnas
de la derecha se muestra los gráficos “heatplot” del conjunto de dianas de IYO/RIMA
(columnas superiores) y del conjunto de genes del genoma con menor señal de ChIP IYO-HA (columnas inferiores). Se muestra la ratio de señal ChIP versus input en los
experimentos ChIP-seq de IYO-HA (IYO ChIP/input) y RIMA-HA (RIMA ChIP/input), la
ratio de expresión en la zona de diferenciación de la raíz (DZ) versus el meristemo de
la raíz (log2 DZ/meristem; Wendrich et al., 2017), la ratio de expresión en la raíz de plantas silvestres versus plantas iyo-1 (log2 Wt/iyo-1; Muñoz et al, 2017), y el grado de
“gene responsiveness” de los genes (Aceituno et al., 2008).
Resultados
96
Por último, realizamos un análisis de sobrerrepresentación de términos de
Ontología Génica (GO) en el conjunto de 1247 genes diana de IYO y RIMA. El
análisis en el servidor Panther mostró que dentro de la categoría Función
Biológica están significativamente enriquecidos términos relacionados con la
señalización de hormonas y luz y con el desarrollo entre los genes diana de
IYO/RIMA (Tabla 4.4), lo cual es consistente con que IYO y RIMA activan
genes que permiten a las células diferenciarse, responder a estímulos y
realizar funciones especializadas.
Tabla 4.4. Análisis de sobrerrepresentación de términos de Ontología Génica (GO)
dentro de la categoría “Función Biológica” en el servidor Panther. Las funciones
biológicas respuesta a hormonas, a estímulos de luz y fotosíntesis, son las funciones que cuentan con un valor de significancia (p-value) mayor. Se calcula dividiendo las
veces que se han encontrado genes relacionados con esa función en el
enriquecimiento de IYO (In set) por la media esperada para un gen cualquiera
(Expected).
5. Discusión
"Las ideas no duran mucho. Hay que hacer algo con ellas."
Charlas en un café de Madrid, Santiago Ramón y Cajal, s. XX
Discusión
99
5. Discusión
5.1 Mecanismos de transporte de IYO al núcleo
Datos previos del laboratorio sugerían que la migración de IYO al núcleo actúa
como un interruptor molecular para activar la diferenciación de las células
meristemáticas (Sanmartín et al., 2011). Sin embargo, hasta ahora se
desconocían los dominios responsables de este transporte y el posible
mecanismo de entrada de IYO al núcleo. El sistema de transporte de proteínas
de gran tamaño a través del núcleo, como es el caso de IYO o del complejo de
la Pol II, requiere de proteínas facilitadoras que reconozcan e interaccionen
con el cargo en el citoplasma, y posteriormente se unan a las nucleoporinas
del poro nuclear para finalmente liberar dicho cargo en el espacio nuclear. De
los distintos mecanismos presentes en eucariotas, el compuesto por la GTPasa
RAN y las importinas es uno de los mejor estudiados (Newmeyer et al., 1986,
Merkle, 2001, Lee et al., 2005). En este modelo, la unión del cargo en el
citoplasma con la importina α se produce a través de los dominios NLS (Lange
et al., 2007a). A este complejo se unirá una importina β, que mediará,
mediante su interacción con las nucleoporinas, la entrada a través del poro
nuclear. Una vez en el núcleo, el conjunto se une a la proteína RAN unida a
GTP (RAN-GTP) o a otra proteína de la familia de las GTPasas, como las
proteínas GPNs, favoreciendo la separación del cargo del complejo de
transporte. Las importinas y RAN-GTP serán transportadas al citoplasma,
donde la desfosforilación de RAN separará ambas proteínas, permitiendo que
la importina recoja nuevo cargo, mientras la entrada de RAN-GDP al núcleo y
su posterior fosforilación reiniciará el ciclo (Görlich et al., 1996, Görlich y
Kutay, 1999, Meier, 2006, Terry et al., 2007).
La caracterización de los dominios identificados en la secuencia de
aminoácidos de IYO ha puesto de manifiesto el papel determinante que el
dominio NLSA juega en el transporte de IYO al núcleo. Este dominio,
localizado en la región N-terminal de IYO, la cual presenta la mayor identidad
de secuencia con sus homólogos RPAP1 de humanos y RBA50 de levaduras,
cumple los requisitos de un dominio NLS clásico, ya que está formado por una
lisina en la posición 1 y un residuo básico en las posiciones 2 y 4 (Conti y
Kuriyan, 2000, Hodel et al., 2001). Nuestros resultados indican que este
dominio es necesario para la entrada de IYO en el núcleo ya que su deleción
Discusión
100
provoca una disminución muy significativa de los niveles nucleares de IYO.
Además, la expresión transitoria de las versiones truncadas que comprenden
la región N-terminal de IYO presentan una localización nuclear, mientras que
las versiones C-terminal de la proteína se localizan principalmente en el citosol
de las células de la epidermis de Nicotiana benthamiana. La eliminación del
segundo dominio NLS identificado en la región C-terminal de IYO, compuesto
por los subdominios NLSB1 y NLSB2 no afecta de manera significativa a la
localización de IYO, ya que las construcciones mutadas en estos dominios son
esencialmente nucleares en Nicotiana. Sin embargo, este segundo NLS sí que
promueve la entrada de IYO al núcleo, siendo esto evidente cuando se
combinan las mutaciones en los dominios NLSA y NLSB1, que provoca que la
proteína se localice totalmente en el citosol. El papel principal del dominio
NLSA en el importe de IYO al núcleo es aún más claro en las líneas
transgénicas estables de Arabidopsis, ya que la eliminación de los 5
aminoácidos que forman el NLSA o la ausencia de la región entera, provoca la
localización de la proteína exclusivamente en el citosol. Las diferencias
encontradas entre la expresión transitoria en Nicotiana y la estable en
Arabidopsis pueden deberse a los niveles de expresión de las proteínas en los
distintos sistemas.
Para esclarecer el mecanismo molecular que facilita la entrada de IYO al
núcleo, se profundizó en la interacción física entre IYO y proteínas
directamente relacionadas con el transporte entre el citoplasma y el núcleo
identificadas por espectrometría de masas. De las importinas α que se
coexpresan con IYO, IMPA3, IMPA4 e IMPA6 (Brady et al., 2007), sólo se
observó interacción con la importina IMP4 siendo ésta dependiente de los
dominios NLS. De hecho, la proteína delecionada en ambos dominios NLS
(IYOΔNLSAB1) no interacciona con la IMPA4 ni en el citoplasma ni en el núcleo.
Además, los ensayos de complementación bimolecular de fluorescencia
revelaron que IYO interacciona con RAN1, un miembro de la superfamilia de
las RAN GTPasas, componentes conocidos del transporte a través de la
membrana nuclear. Por otra parte, la ausencia de interacción por BiFC entre
RAN1 o IMP4 y la versión IYOΔNLSAB1 indica que el mecanismo de entrada de
IYO al núcleo sería a través de este sistema de transporte canónico y
mayoritario en eucariotas (Dingwall and Laskey, 1991, Köhler et al., 1999),
mediado por el dominio NLSA presente en la región N-terminal de la proteína.
Discusión
101
Además de estos interactores, IYO es capaz de interaccionar con las GPNs,
una familia de proteínas relacionada con las RAN GTPasas. Las proteínas GPN
son factores no canónicos de importe nuclear que participan en el transporte
de Pol II al núcleo en humanos y levaduras (Carre y Shiekhattar, 2011, Forget
et al., 2013, Staresincic et al., 2011a, Forget et al., 2010). La familia de las
GPNs está altamente conservadas a lo largo de la evolución (Leipe et al., 2002)
y forma parte de un macrocomplejo citoplasmático de ensamblaje de la Pol II,
en el que también está presente el ortólogo de IYO, RPAP1 (Wild y Cramer,
2012). Nuestros resultados demuestran que IYO interacciona con GPN1 y
GPN2 en el núcleo. La interacción con GPN1 es a través de los primeros 430
aminoácidos de la secuencia de IYO, ya que todas las versiones truncadas que
contienen esta región son capaces de unirse a GPN1 en los ensayos de BiFC
(IYO, IYOATG430, IYOATG500, IYOATG959 e IYOATG978) mientras que las versiones C-
terminal no interaccionan. Además, esta interacción es independiente de la
presencia del dominio NLSA, ya que la versión delecionada IYONLSAB1 es capaz
de interaccionar con GPN1, aunque en este caso el complejo BiFC se localiza
en el citoplasma. Por otra parte, parece que la interacción tampoco depende de
los dominios ARM, pues la versión IYOATG430 es capaz de interaccionar con
GPN1, sugiriendo que existen otros dominios determinantes de la interacción
todavía no descritos en IYO.
En levaduras se ha descrito que GPN1 varia su conformación dependiendo de
su unión con GTP o GDP. La unión de GPN1 al GTP provocaría un cambio
conformacional en la proteína que permitiría su unión a otros elementos del
complejo de la Pol II, promoviendo el correcto ensamblaje del complejo (Niesser
et al., 2015). El dominio GPN de las proteínas GPNs, altamente conservado en
diferentes organismos, es el encargado de la hidrolisis de GTP, necesaria para
que estas proteínas realicen su función (Gras et al., 2007). Así, la mutación de
este dominio GPN conlleva la acumulación de Pol II en el citoplasma en
humanos (Forget et al., 2010). Por otra parte, según estudios realizados en
levaduras y animales, existen otros 5 dominios altamente conservados,
denominados G1 a G5, que permiten la retención de GTP en su bolsillo de
unión, y se ha demostrado que el dominio G1 es esencial para la interacción
entre GPN1 y la Pol II (Murphy et al., 1997, Carre y Shiekhattar, 2011).
Nuestros resultados indican que en plantas estos dominios también son
importantes en la localización de la proteína GPN1 ya que las versiones
Discusión
102
mutadas en el dominio G1, GPN1mG1, o en el dominio GPN, GPN1mGPN,
muestran diferencias en la localización con respecto a la de la proteína
silvestre. La mutación del dominio G1 de GPN1 provoca la acumulación de
ésta en el citoplasma, mientras que la mutación del dominio GPN resulta en
una mayor acumulación nuclear de la proteína. El dominio G1 permite la
activación de la proteína por GTP y, cuando se muta este dominio, no se
observa interacción por BiFC con ninguna construcción de IYO. Por otra parte,
la sustitución del dominio GPN, encargado de la fosforilación del GTP, no
altera esta interacción. Estos resultados sugieren que la actividad del dominio
G1 es necesaria para la interacción entre GPN1 e IYO, de forma similar a lo
descrito en su relación con la Pol II (Niesser et al., 2015). Por otra parte,
GPN1mGPN, la forma constitutivamente activa y mayoritariamente nuclear de la
proteína, interacciona con IYO y la retención de GPN1 en el citoplasma por
IYOΔNLSAB1, sugieren que IYO interviene en la entrada de la forma activa GPN1-
GTP. Resultados previos del laboratorio (Muñoz et al., 2017) muestran que
RIMA es necesaria para que IYO se acumule en el núcleo. Además, IYO se une
a la Pol II a través de las subunidades RPB3 y RPB10 y a otras proteínas
asociadas a ella, como RIMA y la forma activa de las GPN, GPN-GTP. Todos
estos datos nos permiten plantear un modelo de la función de IYO en la
entrada de este complejo multiproteico al núcleo en el que GPN1 debe estar
activo, y junto con RIMA deben interaccionar con IYO para que el complejo
entre al núcleo (Fig. 5.1).
Los estudios de inmunoprecipitación llevados a cabo indican que IYO podría
estar interaccionando físicamente con proteínas relacionadas con diversos
procesos involucrados en la transcripción. IYO se une a la Pol II a través de las
subunidades RPB3 y RPB10 y a otras proteínas asociadas a ella, entre las que
se encuentra RIMA, que se ha propuesto que realiza una función como
fosfatasa del dominio CTD de la subunidad RPB1 de la Pol II (Mosley et al.,
2009, Munoz et al., 2017). La translocación de este subcomplejo asociado tras
la activación del transporte de IYO al núcleo podría tener un papel importante
en la regulación de la actividad transcripcional de genes de diferenciación que
dependen de IYO para su expresión. Además, la interacción genética
encontrada con componentes del complejo Elongator sugiere un papel en la
regulación de la elongación productiva de la transcripción (Sanmartín et al.,
2011, Muñoz et al., 2017). Por otro lado, la interacción con las subunidades
Discusión
103
MED19 y MED14 del complejo Mediator, fortalece la hipótesis de que IYO es
un regulador global de la transcripción. A pesar de que se conoce poco la
función molecular de MED19 se ha visto que forma parte de la región de la
cabeza del complejo Mediator, que es la primera que interacciona con la Pol II
(Buendía-Monreal y Gillmor, 2016, Zhu et al., 2013). IYO interacciona con
RPB3 y RPB10 (Sanmartin et al., 2011), que forman parte del complejo de
preensamblaje RPB3-RPB10-RPB11-RPB12 de la Pol II (Davis et al., 2002), lo
que sugiere que la interacción entre Mediator y Pol II podría llevarse a cabo a
través de este subcomplejo. Además, en animales, se ha confirmado que el
homólogo de IYO, RPAP1, interviene en la unión entre la Pol II y el complejo
Mediator (Lynch et al., 2018). El hecho de que MED19 e IYO interaccionen en
regiones concretas del núcleo (este trabajo; Lynch et al., 2018), donde se ha
propuesto que se produce la transcripción de manera activa, sugiere que éste
podría ser uno de los mecanismos a través de los cuales IYO regulase la
actividad de la Pol II sobre determinados genes diana.
5.2 La modificación de la localización de IYO provoca cambios en
el desarrollo en Arabidopsis
La sobreexpresión de IYO fusionado al epítopo HA (IYO-HA) en Arabidopsis
causa la diferenciación prematura de los meristemos apicales del tallo y de la
raíz (Sanmartín et al., 2011). Las líneas generadas que sobreexpresan la
región N-terminal de IYO fusionada a GFP (35S::IYOATG978-GFP) muestran
fenotipos similares a los encontrados en la sobreexpresión de IYO-HA,
sugiriendo que esta región es suficiente para activar la diferenciación celular y
reproduce los efectos de la proteína completa. Así, las plantas 35S::IYOATG978-
GFP presentan una diferenciación temprana de los meristemos de la raíz y del
tallo y un acortamiento de tallos florales. Es de destacar que las líneas que
sobreexpresan la proteína IYO completa fusionada a GFP (35S::IYO-GFP) tiene
efectos más leves y solamente provocan la terminación prematura del
meristemo de la raíz, lo cual es consistente con una menor acumulación
nuclear en ciertos tipos celulares con respecto a las líneas que expresan las
versiones N-terminal de IYO (35S::IYOATG978-GFP e IYOATG959-GFP). Así, IYO-GFP
se acumula en el citoplasma de las células de la estela y en las células
iniciales que rodean al centro quiescente, mientras que IYOATG978-GFP e
IYOATG959-GFP muestran una localización nuclear en esas células. Esta
Discusión
104
diferencia sugiere que la región C-terminal de IYO tiene una función en la
regulación de la localización de IYO y probablemente contiene señales de
exporte nuclear. Las líneas sobreexpresoras de las construcciones que no
entran al núcleo, 35S::IYO978Rev-GFP o 35S::IYOΔNLSAB1-GFP, presentan pérdida
de dominancia apical y tallos fasciados y acortados, fenotipos observados en el
mutante iyo-1, que podrían ser debidos a problemas en la transición a la
diferenciación de las células meristemáticas (Sanmartín et al., 2011) y
confirmarían la necesidad del transporte de IYO al núcleo para iniciar este
proceso. La similitud fenotípica con el mutante iyo-1 indica que la
sobreexpresión de estas construcciones interfiere de forma dominante con la
función de IYO. La región C-terminal de IYO contiene dominios ARM que
pueden ser importantes para la interacción con otras proteínas. El efecto
dominante negativo de la sobrexpresión de IYOΔNLSAB1-GFP e IYO978Rev-GFP
puede ser debida a que secuestran interactores que son necesarios para la
función de IYO.
Los estudios de complementación mostraron que ninguna de las versiones de
IYO bajo el promotor 35S (IYO-GFP, IYOATG959-GFP, IYOATG978-GFP, IYO959Rev-
GFP, IYO978Rev-GFP o IYOΔNLSAB1-GFP) es capaz de recuperar el fenotipo
deletéreo de la mutación iyo-3, mientras que sí se consigue expresando la
proteína IYO-GFP bajo su propio promotor (Sanmartín et al., 2011) lo que
sugiere que el promotor 35S no es funcional durante el desarrollo embrionario,
como se ha publicado (Sunilkumar et al., 2002), y corrobora la función
esencial de IYO durante los estadios tempranos del desarrollo embrionario.
Por otro lado, de las líneas caracterizadas en este trabajo, 35S::IYO-GFP,
35S::IYOATG959-GFP, 35S::IYOATG978-GFP y 35S::IYOΔNLSAB1-GFP presentan niveles
de expresión similares, mientras las líneas 35S::IYO959Rev-GFP y 35S::IYO978Rev-
GFP mostraban una expresión muy baja, casi inapreciable al microscopio,
sugiriendo que la región N-terminal es importante en la estabilidad de la
proteína.
Para corroborar que la sobreexpresión de IYO provoca la activación prematura
de la diferenciación se estudió el nivel de endoreduplicación de las distintas
líneas transgénicas generadas. Los ensayos de citometría mostraron que las
plantas 35S::IYOATG978-GFP presentan un mayor contenido de células con alto
contenido en ADN, 32C, y menor número de células 2C que las plantas
silvestres, lo que indica una entrada prematura en endoreduplicación y
Discusión
105
concordaría con una aceleración de la diferenciación. La sobreexpresión de la
proteína completa IYO-GFP no provoca diferencias significativas en el nivel de
endoreduplicación con respecto a las plantas silvestres, lo cual es consistente
con la menor acumulación nuclear de esta construcción y la ausencia de
fenotipo de diferenciación prematura en el meristemo apical de tallo. Por otro
lado, las líneas con localización citoplasmática sí mostraban diferencias
significativas en los niveles de ploidía con respecto al tipo silvestre, pero en
este caso presentaban una cantidad significativamente mayor de células 2C, y
un número menor de células 16C, que sugiere que estas plantas presentaban
una diferenciación menor, que se corrobora con los fenotipos observados en
las plantas adultas. El efecto de IYO sobre la endoreduplicación podría ser
indirecto, como una de las consecuencias de la alteración en la entrada en
diferenciación, pero también podría ser directo, a través de la regulación de
factores que controlan la entrada en el endociclo. Así, se ha reportado que
RPAP1 interacciona con APC1 (Jerónimo et al., 2007), una subunidad del
complejo APC/C, que es un regulador maestro de la entrada en
endoreduplicación al degradar las ciclinas mitóticas ((Edgar et al., 2014).
Además, entre las dianas transcripcionales de IYO están OBP4, SIAMESE y
SIAMESE RELATED 1, que promueven la endoreduplicación (Xu et al., 2016)
(Churchman et al., 2006, Kasili et al., 2010).
5.3 Regulación de programas de desarrollo mediado por IYO
Nuestra hipótesis sobre la actividad molecular de IYO era que, en el núcleo,
IYO interaccionaría con la Pol II para inducir la expresión de genes necesarios
para la diferenciación celular. Los experimentos de ChIP-seq efectivamente
indican que IYO, junto con RIMA, participan en la transcripción de más de
1000 genes codificantes de proteínas en plántulas de Arabidopsis. Pero, ¿están
esas dianas de IYO y RIMA relacionadas con la diferenciación? Esta pregunta
no se puede responder actualmente, ya que se desconoce qué compendio de
genes son los que permiten definen el estado diferenciado y lo distinguen del
estado pluripotente, no solo en plantas, sino en cualquier organismo
eucariota. Una de las características que permite diferenciar estos dos
estados, al menos en plantas, es que las células meristemáticas proliferan,
mientras que las diferenciadas han salido del ciclo mitótico y, en muchos
casos, han entrado en endoreduplicación (Edgar et al., 2014). Es notable que
Discusión
106
de un conjunto de 82 genes descritos como específicos de transición G2/M
(Menges et al., 2005), ninguno es diana de IYO y RIMA, lo cual estaría en
concordancia con que IYO y RIMA no regulan genes de proliferación celular
asociados a la pluripotencia. Además, entre las dianas de IYO y RIMA están el
factor transcripcional OBP4, que bloquea el ciclo mitótico y promueve la
endoreduplicación (Xu et al., 2016) y SIAMESE y SIAMESE-RELATED 1, que
son inhibidores de CDKs que también activan el endociclo (Churchman et al.,
2006, Kasili et al., 2010). Asimismo, los genes de expresión constitutiva con
bajo grado de “responsiveness”, que serían genes comunes a todos los tipos
celulares, tampoco son diana de IYO y RIMA. Por el contrario, los genes diana
de IYO y RIMA tienen un grado de “responsiveness” muy por encima de la
media del genoma, lo que indica que son genes que se activan en condiciones
y tipos celulares específicos. Además, el estudio de enriquecimiento de
términos de ontología génica mostró que están sobrerrepresentados los
términos relacionados con respuesta a luz y a hormonas, seguramente las dos
clases de estímulos más importantes para el desarrollo de las plantas. Dentro
de los genes de respuesta a luz, también están sobrerrepresentados
específicamente los relacionados con fotosíntesis, como son los que codifican
las proteínas LHCB (Light harvesting chlorophyll-a/b binding proteins). De
hecho, 12 miembros de la familia LHCB de Arabidopsis, que consta de 15
genes, son diana de IYO/RIMA. En el meristemo apical del tallo, las células
madre de la zona central contienen proplástidos inmaduros que apenas
contienen proteínas fotosintéticas ni membranas tilacoidales (Jarvis and
López-Juez, 2013). La maduración de los proplástidos para formar
cloroplastos comienza en las células de la periferia del meristemo,
coincidiendo con el inicio de la diferenciación celular, y continúa durante el
desarrollo de los primordios foliares. Los genes relacionados con la fotosíntesis
se pueden considerar por tanto como marcadores de diferenciación en los
meristemos y se incluirían entre las dianas de IYO y RIMA relacionados con
este proceso. De hecho, entre los genes que más se inducen en tomate durante
la maduración de los cloroplastos en células en diferenciación están los LHCB
(Dalal and Arora, 2018). Además de los genes relacionados con fotosíntesis,
las dianas de IYO y RIMA incluyen a los fotoreceptores PHYA, PHOT1, CRY1 y
CRY2 y los genes relacionados con señalización por luz HFR1, GLK2, PKS1,
PKS2, PKS4, PIF1 y PIF5. De igual manera IYO y RIMA se une a muchos genes
relacionados con síntesis y señalización de hormonas. Con respecto a las
Discusión
107
auxinas, se unen a los genes de síntesis YUC5, YUC8, YUC9, CYP79B2,
CYP79B3, CYP70A2, SUR1 y SUR2, de transporte polar PIN3 PIN4, PIN7, AUX1,
ABCB19 y ABCG4 y de señalización IAA1, IAA2, IAA3/SHY2, IAA4, IAA7,
IAA16 e IAA29. Además, dentro de la familia de genes SAUR (Small Auxin
Upregulated), que en Arabidopsis cuenta con 89 genes, IYO y RIMA se unen a
20 de ellos, y específicamente a 15 de los 32 liSAURs (SAURS relacionados con
luz) presentes en el genoma de Arabidopsis, lo cual es una
sobrerrepresentación muy significativa. IYO y RIMA también se unen a genes
importantes de otras rutas hormonales, como GAI y RGA de la ruta de las
giberelinas, ABI1, PYL4 y PYL5 de la del ácido abscísico, JAZ1, JAZ9 y
MYC2/JAI1 de la del ácido jasmónico, BRI1, DET2 y CPD de la de los
brasinoesteroides y D14 y KAI2 de la de las estrigolactonas/karrikinas. La
unión a estos genes maestros de las rutas de luz y hormonas indica que IYO y
RIMA podrían activar los mecanismos para responder a estas señales como
parte del programa de diferenciación celular. Según este modelo, las células
madre podrían ser parcial o totalmente insensibles a estos estímulos y solo al
diferenciarse adquirirían las capacidades de respuesta adecuadas a sus
funciones especializadas. Sin embargo, en el caso de las auxinas, que pueden
ser consideradas como las hormonas más importantes en el desarrollo y la
organogénesis de las plantas, IYO y RIMA parecen regular preferentemente la
síntesis y el transporte, así como a reguladores negativos de la señalización
(genes IAA). No están entre las dianas de IYO y RIMA ni los receptores de
auxina ni los factores de transcripción de la familia ARF, principales
encargados de la transducción de la señal de auxinas al núcleo, por lo que se
puede inferir que IYO y RIMA no serían necesarios para la percepción de
auxinas, sino para su modulación y para el establecimiento de los gradientes
de este morfógeno. Esta conclusión es acorde con las evidencias de que la
señalización máxima de auxinas en la raíz es en el meristemo y, dentro de
este, en las células del centro quiescente y en las células iniciales que lo
rodean.
Si bien, como ya se ha indicado, los programas transcripcionales que
distinguen el estado pluripotente del de células que han empezado a
diferenciarse no se conocen, si existen estudios transcriptómicos comparativos
de poblaciones de células aisladas de distintas zonas del ápice de la raíz que
están enriquecidas en células meristemáticas o en células en diferenciación.
Discusión
108
En un estudio pionero, se micro-diseccionaron las puntas de dos raíces en 12
secciones perpendiculares al eje de crecimiento, alcanzando desde el
meristemo en el ápice hasta la zona de diferenciación de la raíz (Brady et al.,
2007). Al analizar la expresión de las dianas de IYO y RIMA comprobamos que
había un enriquecimiento muy significativo de genes que se inducían en la
zona de diferenciación con respecto al total del genoma. Estos resultados se
corroboraron con el estudio de células meristemáticas y en diferenciación
aisladas mediante citometría de flujo (Wendrich et al., 2017), donde se
comprueba que IYO y RIMA se unen a genes inducidos en las células que
están diferenciándose y no se unen a los genes más expresados en las células
meristemáticas (Figura 4.23). Estos resultados constituyen evidencias sólidas
de que IYO y RIMA son responsables de activar la reprogramación
transcripcional de las células que entran en diferenciación y que esta actividad
es la que subyace a la función de IYO y RIMA para iniciar este proceso. Por
tanto, la identificación de las dianas de IYO y RIMA podría ayudar a definir
qué grupo de genes son los que provocan la transición desde un estado
pluripotente al de diferenciación activa. En un estudio transcriptómico
comparativo se han obtenido evidencias de que hay conservación en la clase
de genes regulados por IYO y por RPAP1 (Lynch et al., 2018), por lo que quizás
sea posible identificar un núcleo de genes necesarios para esta transición
conservado entre plantas y animales.
Con todos estos datos proponemos un modelo de la importancia del transporte
de IYO al núcleo para la diferenciación (Fig. 5,1). En el citoplasma el
ensamblaje entre IYO y las proteínas del complejo formado por la Pol II, RIMA
y las GPNs es necesario para su entrada al núcleo, mediante un sistema de
transporte mediado por la IMPA4 y RAN. En el núcleo IYO y RIMA se unen a
un grupo de genes concretos relacionados con procesos de diferenciación y
especialización y activan su transcripción mediada por Pol II y por el complejo
Mediator.
Discusión
109
Fig. 5.1. Modelo de la interacción de IYO con los otros componentes del complejo y la entrada del complejo al núcleo. Posible actuación de IYO dentro
del núcleo para promover la diferenciación. Arriba: En el citoplasma de la célula
interaccionan los diferentes componentes de la Pol II (subunidades marcadas de la 1 a
la 12) y los otros componentes del complejo: RIMA, GPN1, GPN2 y GPN3 e IYO. Una
vez formado todo este complejo IYO se une a la importina IMPA4 que permitirá la
entrada del complejo a través del poro nuclear hacia el núcleo. Abajo: dentro del núcleo, RAN1 interacciona con el complejo para retirar las importinas. En este punto
también es posible que se retiren las proteínas GPNs. A continuación, el complejo de
la Pol II junto con RIMA e IYO interacciona con el ADN y el complejo Mediator para
iniciar la transcripción de los genes diana de IYO y RIMA.
6. Conclusiones
“Somos un punto azul pálido”
Carl Sagan, 1994.
Conclusiones
113
6. Conclusiones
1. Las señales de localización nuclear NLSA y B de IYO son funcionales y
dirigen la entrada de IYO al núcleo mediada por el sistema de
transporte que implica a RAN y a la importina IMPA4.
2. El análisis de la localización celular y del fenotipo de las diferentes
versiones de IYO muestra que la región N-terminal de IYO se localiza en
el núcleo y su sobreexpresión causa la diferenciación prematura de
tejidos mientras la región C-terminal de IYO se localiza exclusivamente
en el citoplasma celular y su sobreexpresión produce un retraso en
diferenciación.
3. La entrada de IYO al núcleo es crítica para iniciar el proceso de
diferenciación celular en plantas.
4. IYO interacciona con subunidades de la Pol II y con proteínas RPAP
relacionadas con el transporte del complejo al núcleo, como son
RIMA/RPAP2, GPN1/RPAP4 y GPN2.
5. IYO interacciona con reguladores globales de la transcripción mediada
por Pol II como la fosfatasa RIMA y las subunidades del complejo
mediator MED19 y MED14.
6. La localización celular de los complejos de IYO con RIMA, GPN1 y GPN2
es dependiente de los dominios NLS de IYO.
7. El dominio G1 de GPN1 es necesario para la interacción con IYO.
8. IYO y RIMA se unen al cuerpo de un grupo común de genes y
preferentemente activan su transcripción.
9. Las dianas transcripcionales directas de IYO y RIMA tienen funciones
biológicas relacionadas con la respuesta a estímulos y la diferenciación.
7. Anexo
"Un diseñador sabe que ha alcanzado la perfección no cuando ya no tiene
nada más que añadir, sino cuando ya no le queda nada más que quitar"
Antoine de Saint-Exupery s. XX.
Anexo
117
7. Anexo
Además de las líneas estables transgénicas de las versiones truncadas
IYOATG978 e IYO978Rev en Arabidopsis que se muestran en Resultados, se
generaron las líneas estables de las construcciones IYOATG959 e IYO959Rev.
Debido a la similitud de fenotipo entre las líneas sobreexpresoras de IYOATG978
e IYOATG959 y entre las líneas de IYO978Rev e IYO959Rev se optó por caracterizar en
mayor profundidad las líneas transgénicas que portan las versiones IYOATG978 e
IYO978Rev. A continuación se presentan los resultados de la localización celular
de las versiones IYOATG959 e IYO959Rev, así como el fenotipo de las plantas
adultas. En la figura Anexo I se puede observar que IYOATG959-GFP presenta
una localización celular en los meristemos de la raíz similar a IYOATG978-GFP.
La fluorescencia se localiza en la zona de la estela, la caliptra y la epidermis,
mientras que en el centro quiescente no se detecta fluorescencia. El fenotipo
de las plantas adultas de estas líneas concuerda con una diferenciación
prematura de los tejidos, ya que se observa una terminación temprana de los
meristemos desarrollándose sólo plántulas de cuatro hojas en las líneas de
mayor expresión y un acortamiento del tallo floral (Fig. Anexo III).
Por otro lado, las líneas que sobreexpresan IYO959Rev-GFP presentan una
localización citoplasmática en las células iniciales del meristemo, de la cofia y
de la epidermis de la raíz diferenciada, aunque ésta es apenas perceptible en
comparación con otras líneas que portan construcciones que también se
localizan en el citoplasma (Fig. Anexo II; Fig. 4.5 y Fig. 4.7). A pesar de ello
estas plantas presentan afectado los procesos de diferenciación ya que, al
igual que las plantas que sobreexpresan otras versiones citoplasmáticas de
IYO, las líneas generadas de IYO959Rev-GFP presentan perdida de dominancia
apical, tallos fasciados y compactación de las inflorescencias (Fig. Anexo IV).
Anexo
118
Anexo I: Caracterización de la expresión de las líneas IYOATG959-GFP de
Arabidopsis thaliana a los 7 días de edad. A-B) Localización subcelular de la
proteína de fusión IYOATG959-GFP en el meristemo distal (A) y en la zona diferenciada
(B) de la raíz. Panel superior: Tinción IP (rojo) y expresión de GFP (verde) combinadas;
panel inferior: fluorescencia de GFP. Barra de escala: 20 µm. C) Western blot de las
líneas estudiadas comparadas con Col-0 y la línea de sobreexpresión de IYO-GFP. Análisis realizados en las cuatro líneas de sobreexpresión independientes seleccionadas.
Anexo
119
Anexo II: Caracterización de la expresión de las líneas IYO959Rev-GFP en
Arabidopsis thaliana. A-B) Localización subcelular de la proteína IYO959Rev-GFP en el
meristemo distal de la raíz (A) y en la zona diferenciada (B) a los 7 días de edad. Panel superior: Tinción IP (rojo) y expresión de GFP (verde) combinadas; panel inferior:
fluorescencia de GFP. C) Western-blot de las líneas estudiadas comparadas con Col-0 y con la sobreexpresión de IYO-GFP. Barra de escala 20 µm.
Anexo
120
Anexo III: Fenotipos de plantas adultas de las líneas transgénicas IYOATG959-GFP.
Fenotipos de plantas transgénicas sobreexpresoras de la versión truncada IYOATG959-
GFP comparadas con plantas silvestres Col-0 y la sobreexpresión de IYO completa
crecidas durante 4 semanas en tierra, bajo condiciones de fotoperiodo largo, 21ºC y 60% de humedad relativa. (He): líneas heterocigotas. (Ho): líneas homocigotas.
Anexo IV: Fenotipos de las líneas transgénicas IYO959Rev-GFP en plantas adultas.
Comparación de las plantas sobreexpresoras de la versión truncada IYO959Rev-GFP
frente a plantas silvestre Col-0 y de la sobreexpresión de IYO completa crecidas
durante 4 semanas en tierra, bajo condiciones de fotoperiodo largo, 21ºC y 60% de humedad relativa. (He): líneas heterocigotas. (Ho): líneas homocigotas.
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"La ciencia se construye a partir de aproximaciones que
gradualmente se acercan a la verdad."
Anochecer. Isaac Asimov, 1990.
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