La reacción de PCR y sus aplicaciones. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
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La reacción de PCR y sus aplicaciones
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Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
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nº ciclos
DN
A p
rod
ucto
pri
mers
PCR: cinética
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RT
92ºC
55ºC
72ºC 92ºC 92ºC
55ºC 55ºC
72ºC 72ºC
Desnaturalización:
Lo mas corto posible
Evita inactivación
enzima
Anillamiento:Lo mas cerca
posible de las Tm de los primers
Extensión:Lo mas extenso
posible para asegurar
fragmentos completos
PCR: diseñando ciclos
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nº ciclos
DN
A p
rod
ucto
pri
mers
En
zym
e a
cti
vit
y
PCR: cinética
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DNA polimerasas termoestables
• Procesividad: 5’-3’ actividad de síntesis• Fidelidad: 3’-5’ exonucleasa• Adición de As
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5’ 3’3’ 5’
5’ 3’3’ 5’
Tiempo de extensión:Taq polimerasa: 2 Kb/minPfu polimerasa: 0.5 Kb/ minPwo polimerasa: 1 Kb/min
Procesividad
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5’ 3’3’ 5’
5’ 3’3’ 5’
5’ 3’3’ 5’
Polimerasa 3’-5’ exo Tasa de error % productos con mutación
Taq polimerasa NO 8.0x10-6 16.0
Pfu polimerasa SI 1.3x10-6 2.6
Pwo polimerasa SI 0.4x10-6 0.7
Fidelidad en la PCR
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-A3’
5’3’A- 5’
Adición de As:Taq polimerasa: SIPfu polimerasa: NOPwo polimerasa: NO
-A3’
-T3’ 3’T- -T A
AT
Adición de As
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Optimización de PCR• Parametros del ciclo
– Minimo numero de ciclos– Las tres reglas
• Diseño de oligos– Tm’s 55-80ºC– No concentrar GC en el extremo 3’
• Concentración de Mg2+ (0.5-3 mM)– Demasiado da inespecificidad– Poco da poca producción
• Coadyuvantes– BSA: estabiliza la polimerasa y secuestra inhibidores no
especificos– Formamida: Baja la temperatura de desnaturalización (moldes
ricos en GC)– DMSO: Ayuda la elongación en moldes ricos en GC
• Mezcla de polimerasas• Hot start
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• Obtener genes– PCR degenerada– PCR reversa
• Modificar genes– Introducir sitios de restricción– Mutagénesis dirigida– Mutagénesis al azar
Algunas aplicaciones
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ADRGT YKILP
5’ACNGCYTGNTGRCGN3’ 5’NTTNCAYGARTCYTT3’
PCR degenerada
• PCR en condiciones poco estrictas– Temperatura– Mg++
– Concentracion de oligos• Diseño de los primers:
– Tamaño minimo (21 mer)– Evitar aminoacidos con mas de un tipo
de codon– No mas de tres G o C seguidas en los
ultimos tres nucleotidos• PCR con primers en solitario
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PCR reversa
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Touch-down PCR
Nested touch-down PCR
PCR reversa
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X bp Y bp
X bp Y bp
Fragmento A: Z pb
Fragmento B: Z -(X+Y)pb
Nested PCR
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Touch-down PCR
94ºC
60-65ºC
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RE1
RE2
RE1RE2 RE1 RE2
RE1 RE2
Introduciendo sitios de restricción
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RE1 RE2
RE1 RE2
RE1 RE2
RE1 RE2
RE1 RE2
RE1 RE2
RE1 RE2
RE1 RE2RE1 RE2
RE1 RE2
RE1 RE2
• PCR en condiciones de baja fidelidad
– Desbalance de nucleotidos– Mn ++ en vez de Mg++
– Polimerasas mutantes
Mutagénesis al azar localizada
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RE1
RE2MUT1
MUT2
RE1 RE2
RE1+MUT1 RE2+MUT2
RE2RE1
Mutagénesis sitio-específica