PODEMOS SEPARAR UNA MEZCLA DE AMINOACIDOS POR CROMATOGRAFIA DE REPARTO?

Objetivo: Se llevar a cabo la separacin de mezclas de aminocidos mediante cromatografa en papel. Se revelar la

presencia de los mismos en el papel mediante reaccin con ninhidrina y se identificarn en la cromatografa por

comparacin con la posicin de los correspondientes patrones preparados al efecto.

La cromatografa es un mtodo fsico para separar e identificar compuestos. Se basa en que cualquier sustancia, al serdisuelta en dos disolventes distintos no miscibles, se reparte entre ambos con arreglo a su solubilidad. La relacin entrelas solubilidades de dicha sustancia en cada uno de los disolventes se denomina Coeficiente de Reparto.Si uno de los disolventes se mantiene fijo (Fase Estacionaria) se puede hacer desplazar el otro disolvente (Fase Mvil)sobre el primero. Las sustancias a cromatografiarse vern sometidas a una distribucin entre las fases estacionaria ymvil de modo que las ms solubles en la fase mvil avanzarn ms que las que sean retenidas por la fase estacionaria.

De acuerdo con el mecanismo que produce la separacin, se puede hablar de distintos tipos de cromatografa:

Uno de ellos es la cromatografa en papel que se utiliza para la separacin de cantidades mnimas de soluto y tambincomo un criterio de pureza. Se basa en la diferente velocidad con que se mueve cada uno de los solutos a travs de unafase estacionaria que es el agua retenida sobre un soporte slido e inerte (celulosa), arrastrado por un disolvente enmovimiento. Una vez realizada la cromatografa, la posicin de los componentes se determina mediante una tcnicaque permita visualizarlos. Es comn revelar la cromatografa mediante reacciones que originen productos coloreados,como la ninhidrina.

La ninhidrina que reacciona con aminocidos que tengan el grupo amino libre, dando lugar a la formacin de amonacoy anhdrido carbnico, con reduccin del reactivo (la ninhidrina) a hidrindantina. La hidrindantina reacciona a su vez conamonaco y otra molcula de ninhidrina para dar un compuesto de adicin doble que presenta una coloracin azul-prpura, con la excepcin de la prolina que da una coloracin amarillenta, debido a que su grupo amino est sustituido.

Los objetivos principales de esta prctica fueron llevar a cabo la separacin de aminocidos por medio de lascromatoplacas utilizadas siendo as la fase mvil el eluyente que fue una mezcla de solventes y la fase mvil, elaminocido utilizado en cada placa. Se utilizaron para esto 11 aminocidos y una protena que fue la casena paracompararlos con ella sin embargo no se observ un factor de rendimiento igual al de la casena, no por que no tuvieraesta ninguno de los aminocidos que se utilizaron sino que para que se pudieran comparar sus aminocidos e hubieratenido que hidrolizar primero esta protena para comparar sus residuos con los aminocidos utilizado

Los aminocidos suben sobre el papel cromatogrfico de manera distinta, esto se debe a su composicin qumicaestructural.Si se emplea un solvente polar, aquellos aminocidos polares-con o sin carga- tendrn una interaccin mayor que losotros aminocidos, en cambio, si se usa un solvente apolar, los apolares recorrern una distancia mayor, en amboscasos, los neutros recorrer una distancia intermedia, debido a su naturaleza neutra.

Despus de realizar una cromatografa, en ocasiones, se necesita un revelador que nos indique la posicin final a lacual llegaron los analitos, un ejemplo de revelador para aminocidos, es la Ninhidrina, ya que reacciona con el grupoamino de los A.A. dando una coloracin azul-prpura, a excepcin de la prolina, ya que esta tiene su radical NH3sustituido, por lo que toma una coloracin amarilla

AMINOCIDOSSon compuestos orgnicos formados por Carbono, Nitrgeno, Oxgeno e Hidrgeno; (algunos poseen Azufre).Los aminocidos reciben este nombre porque presentan los grupos funcionales Amino (NH3+) y carboxilo(COO-); algunos autores los definen como derivados aminados de cidos carboxlicos.

CROMATOGRAFIA:La cromatografa es un mtodo fsico de separacin para la caracterizacin de mezclas complejas, la cual tieneaplicacin en todas las ramas de la ciencia. Es un conjunto de tcnicas basadas en el principio de retencinselectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar ydeterminar las cantidades de dichos componentes. Diferencias sutiles en el coeficiente de particin de loscompuestos da como resultado una retencin diferencial sobre la fase estacionaria y por tanto una separacinefectiva en funcin de los tiempos de retencin de cada componente de la mezcla.La cromatografa puede cumplir dos funciones bsicas que no se excluyen mutuamente:

Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos ms puros y que puedan ser usados posteriormente(etapa final de muchas sntesis).Medir la proporcin de los componentes de la mezcla (finalidad analtica). En este caso, las cantidades dematerial empleadas son pequeas.

LEUCINALa leucina interacta con los aminocidos isoleucina y valina para promover la cicatrizacin del tejido muscular, la piel y los huesos y serecomienda para quienes se recuperan de la ciruga. Este aminocido reduce los niveles de azcar en la sangre y ayuda a aumentar laproduccin de la hormona del crecimiento.

LISINAFunciones de este aminocido son garantizar la absorcin adecuada de calcio y mantiene un equilibrio adecuado de nitrgeno en losadultos. Adems, la lisina ayuda a formar colgeno que constituye el cartlago y tejido conectivo. La Lisina tambin ayuda a la produccinde anticuerpos que tienen la capacidad para luchar contra el herpes labial y los brotes de herpes y reduce los niveles elevados detriglicridos en suero.

PROLINAFunciones de este aminocido son mejorar la textura de la piel, ayudando a la produccin de colgeno y reducir la prdida de colgeno atravs del proceso de envejecimiento. Adems, la Prolina ayuda en la cicatrizacin del cartlago y el fortalecimiento de las articulaciones,los tendones y los msculos del corazn. La Prolina trabaja con la vitamina C para ayudar a mantener sanos los tejidos conectivos.

LA NINHIDRINALa ninhidrina es un poderoso agente reactivo comn para visualizar (Castro, J. 1990) las bandasde separacin de aminocidos por cromatografa o electroforesis, tambin es utilizada confines cuantitativos para la determinacin de aminocidos Reacciona con todos los aminocidosalfa cuyo pH se encuentra entre 4 y 8, dando una coloracin que vara de azul a violeta intenso.Este producto colorido (llamado prpura de Ruhemann) se estabiliza por resonancia, lacoloracin producida por la ninhidrina es independiente de la coloracin original delaminocido.

Butanol

Frmula: CH3(CH2)3OH M.=74,12 CAS [71-36-3] Nmero CE (EINECS): 200-751-6 Nmero de ndice CE: 603-004-00-6 INDICACIONES DE PELIGRO: Nocivo FRASES R: 10-22-37/38-41-67 Inflamable. Nocivo por ingestin. Irrita las vas respiratorias y la piel. Riesgo de lesiones oculares graves. La inhalacin de vapores puede provocar somnolencia y vrtigo. FRASES S: 7/9-13-26-37/39-46 Mantngase el recipiente bien cerrado y en lugar bien ventilado. Mantngase lejos de alimentos, bebidas y piensos. En caso de contacto con los ojos, lvense inmediata y abundantemente con agua y acdase a un mdico. sense guantes adecuados y proteccin para los ojos-la cara. En caso de ingestin, acuda inmediatamente al mdico y mustrele la etiqueta o el envase. NMERO DE NDICE CE: 603-004-00-6

Ninhidrina

Frmula: C9H6O4 M.=178,15 CAS [485-47-2] Nmero CE (EINECS): 207-618-1 INDICACIONES DE PELIGRO: Nocivo FRASES R: 22-36/37/38 Nocivo por ingestin. Irrita los ojos, la piel y las vas respiratorias. ALMACENAMIENTO: Recipientes bien cerrados. Ambiente seco. Temperatura ambiente No se descartan otras caractersticas peligrosas. Observar las precauciones habituales en el

manejo de productos qumicos.

Material:-Cmara cromatografa-Papel para cromatografa (16cm de largo X 18cm de ancho)-Estufa 90C-Capilares

Reactivos:-Aminocidos en solucin 0.05 M-Solvente: n-Butanol: cido actico glacial: Agua (4:1:5)-Revelador: Solucin de Ninhidrina-Hidrxido de Amonio concentrado

Hidrxido de amonio

Frmula: NH4OH Masa molecular: 35.1 N CAS 1336-21-6 N RTECS BQ9625000 N ICSC 0215 N NU 2672 N CE 007-001-01-2 ESTADO FISICO; ASPECTO: Disolucin incolora, muy voltil, de olor acre. PELIGROS QUIMICOS: Reacciona con muchos metales y sus sales dando lugar a la formacin de compuestos explosivos. Ataca a muchos metales formando gas inflamable de hidrgeno. La disolucin en agua es una base fuerte y reacciona violentamente con cidos. LIMITES DE EXPOSICION: TLV no establecido. MAK no establecido. VIAS DE EXPOSICION: La sustancia se puede absorber por inhalacin del vapor o aerosol y por ingestin. RIESGO DE INHALACION: Por evaporacin de esta sustancia a 20C se puede alcanzar muy rpidamente una concentracin nociva en el aire. EFECTOS DE EXPOSICION DE CORTA DURACION: La sustancia es corrosiva para los ojos, la piel y el tracto respiratorio. Corrosiva por ingestin. La inhalacin de altas concentraciones del vapor puede originar edema laringeal, inflamacin del tracto respiratorio y neumona. Los efectos pueden aparecer de forma no inmediata. EFECTOS DE EXPOSICION PROLONGADA O REPETIDA: Los pulmones pueden resultar afectados

por la exposicin prolongada o repetida al vapor o aerosol.

DISCUSIN:

Consultando el libro Laboratory Experiments for Introduction to General, Organic and Biochemistry de Frederick Bettelheim, se encontr la siguiente tabla para los valores de Rf para cada aminocido utilizando como solvente una mezcla de butanol/acido actico/agua en proporcin 12/3/5. Aunque el eluyente no sea en la misma proporcin que en la prctica, la fase estacionaria y la mvil son la misma, as que se pueden esperar resultados parecidos, al menos en cuanto al orden de menor a mayor factor de retencin

Amino acid Rf value Amino

acid

Rf value

alanine 0.38 leucine 0.73

arginine 0.20 lysine 0.14

asparagine 0.5 methionin

e

0.55

aspartic acid 0.24 phenylala

nine

0.68

cysteine 0.4 proline

not a true

amino

acid -

shows up

as yellow

0.43

glutamine 0.13 serine 0.27

glutamic acid 0.30 threonine 0.35

glycine 0.26 tryptopha

n

0.66

histidine 0.11 tyrosine 0.45

isoleucine 0.72 valine 0.61

Aminocido Valor promedio Rf en la

prctica Valores Rf reportados en proporcin 12/3/5

Leucina 0.589 0.738

Prolina 0.389 0.43

Lisina 0.291 0.14

Mediciones:

Aminocido Distancia recorrida por el compuesto (x)

Distancia recorrida por el eluyente (y)

Factor de retencin Rf=x/y

Color

Leucina

3.7cm 7cm 0.529 Morado

Prolina

2cm 6cm 0.333 Amarillo

Lisina

2cm 7.4cm 0.27 Morado

Mezcla. Sustancia 1

2.3cm 7.4cm 0.311 Morado

Mezcla. Sustancia 2

3.3cm 7.4cm 0.446 Amarillo

Mezcla. Sustancia 3

4.8cm 7.4cm 0.649 Morado

Rf (Leucina)= 3.7cm/7cm=0.529Rf (Prolina) =2cm/6cm=0.333Rf (Lisina) =2cm/7.4cm=0.27

Rf (Sustancia 1) =2.3cm/7.4cm=0.311Rf (Sustancia 2) =3.3cm/7.4cm=0.446Rf (Sustancia 3) =4.8cm/7.4cm=0.649

( ) + ( 3)

2 =

0.529 + 0.649

2=0.589

( ) + ( 2)

2 =

0.333 + 0.446

2=0.389

( ) + ( 1)

2 =

0.27 + 0.311

2=0.291

Observaciones:Se concluye que la sustancia 2 en la mezcla corresponde a la prolinaporque ambas presentan la coloracin amarilla ante el revelador deaminocidos. La sustancia 1 en la mezcla es ms probable que se tratede la lisina, y la sustancia 3 que se trate de la leucina, porque existemayor relacin entre los valores.Hubo algunos errores que provocaron la diferencia en los factores deretencin entre los primeros 3 aminocidos y los que formaban lamezcla, principalmente que hubo movimiento no intencional del frascodonde se estaba llevando a cabo la separacin de solutos porcromatografa.Promedio de los valores obtenidos de Rf por cada aminocido

1 Paso: Sobre una placa de papel cromatogrfico de 20 x 20 cm se trazo con un lpiz una recta paralela

a uno de los bordes y a una distancia de ste de 2 cm. Sobre esta lnea se pone 4 puntos

equidistantes entre s y sobre los bordes (3.5, 7.5, 11.5, y 15.5).

NOTA: No hay que tocar la parte del papel cromatografico de la placa con las manos, ya que la contaminaremos con

aminocidos procedentes de nuestras manos. No utilizar nunca bolgrafo ni rotulador. No horadar la placa cuando la marqus.

2 Paso: Agregamos aproximadamente 20ml de el solvente (n-Butanol: Acido actico glacial: Agua) en la

cmara y tapamos para saturar.

3 Paso: En cada punto (identificamos con el nombre de cada uno de los aminocidos) se aplicaron tres

gotas de la solucin de aminocidos y solucin problema (un aminocido en cada punto y en el

ltimo la solucin problema). Se utiliza un capilar para aplicar la muestra gota a gota (hacerlo con

mucho cuidado). Procurando secar en cada aplicacin.

4 Paso: Pasamos el papel cromatogrfico sobre el bocal de la botella de hidrxido de amonio

concentrado para neutralizar (una vez secadas las muestras)

5 Paso: Se aadi al tanque cromatogrfico eluyente hasta una altura aproximada de 1 cm y sin que

ste alcance la zona de aplicacin de las muestras. Se mete la placa en el tanque, se tapa y se

deja desarrollar la cromatografa hasta que el

elulyente alcance el borde superior, sin llegar a sobrepasarlo (45min aproximadamente).

NOTA: Se opera en la campana extractora de gases, ya que el eluyente es txico y no mover la cmara.

6 Paso: Terminada la cromatografa se saca la placa, se marca la distancia recorrida por el eluyente, se

seca dentro de la campana de gases con la ayuda de un secador de aire y se roca con un

pulverizador que contiene la solucin reveladora (en la campana de gases). La placa se secar

hacindole llegar aire caliente con el secador.

NOTA: Esta operacin debe de hacerse en la campana extractora de gases.

7 Paso: Se indican los valores de distancia recorrida por cada uno de los aminocidos en una tabla y se

calculan los correspondientes valores de Rf. Se indica la composicin de la solucin problema,

justificando la conclusin a la que se ha llegado.

En qu orden migran los aminocidos de diferentes grupos?

En una cromatografa, migran primeramente aquellos aminocidos apolares, ya que los

solventes comnmente usados son menos polares que el agua, lo que hace que los

aminocidos polares (con o sin carga) sean retenidos en la fase estacionaria

Es a ninhidrina es un revelador selectivo, porque?

S, porque reacciona con el grupo amino o amoniaco de un compuesto, dando una tonalidad

entre azul y purpura, llamado purpura de Ruhemann

Cmo se calcula el Rf?

=

CUESTIONARIO:

cido actico

Acido etanoico Frmula: CH3COOH Masa molecular: 60.1 N CAS 64-19-7 N RTECS AF1340000 N ICSC 0363 N NU 2789 N CE 607-002-00-6(>90%) ESTADO FISICO; ASPECTO: Lquido incoloro, con olor acre. PELIGROS QUIMICOS: La sustancia es moderadamente cida. Reacciona violentamente con oxidantes tales como trixido de cromo y permanganato potsico. Reacciona violentamente con bases fuertes. Ataca muchos metales formando gas combustible (Hidrgeno). LIMITES DE EXPOSICION: TLV: 10 ppm; 25 mg/m3 (como TWA); 15 ppm; 37 mg/m3 (como STEL) (ACGIH 1990-1991) VIAS DE EXPOSICION: La sustancia se puede absorber por inhalacin del vapor y por ingestin. RIESGO DE INHALACION: En la evaporacin de esta sustancia a 20C se puede alcanzar bastante rpidamente una concentracin nociva en el aire. EFECTOS DE EXPOSICION DE CORTA DURACION: Corrosivo. La sustancia es muy corrosiva para los ojos, la piel y el tracto respiratorio. La inhalacin del vapor puede originar edema pulmonar (vanse Notas). Corrosivo por ingestin. EFECTOS DE EXPOSICION PROLONGADA O REPETIDA: El contacto prolongado o repetido con la piel puede producir dermatitis.

Observamos que aunque los valores no son los mismos, el orden de menor a mayor son iguales. Hubo errores cometidos en la prctica, como el movimiento no intencional del frasco donde se llevaba a cabo la cromatografa, por lo que los resultados difieren de los reales.

Conclusin

Si es posible, porque gracias a los diferentes factores de reparto que tiene cada aminocido ante el eluyente es que muestran diferentes velocidades de desplazamiento ante la fase mvil. Por estas diferentes velocidades es que el desplazamiento final es diferente en cada caso y entonces quedan separados cada uno de los aminocidos.

Esta es nuestra cromatografa de reparto en papel