DEPTO. DE CS. BIOLÓGICAS Y QUÍMICAS -------------------------------------------------------------------- CURSO : LABORATORIO HISTOLOGIA HUMANA CÓDIGO : DBIO1035

MANUAL DE TRABAJOS PRÁCTICOS

CAPITULO I : HISTOLOGÍA BÁSICA

ESTA GUIA PERTENECE A ...........................................................................................

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PROLOGO

El Manual de Trabajos Prácticos tiene por finalidad complementar el

curso teórico de Histología, con la realización de actividades experimentales que

han sido seleccionadas por los docentes.

Dicho manual constituye un material de apoyo para los alumnos de las

carreras de la Salud de la USS, dado que está complementado con una serie de

ilustraciones que han sido realizadas, adaptadas, modificadas y/o extraídas por

la propia autora, desde distintos textos afines. Estas tienen por objetivo

entregar al alumno imágenes que clarifiquen ciertos aspectos morfológicos de

estructuras, eventos o fenómenos biológicos.

Este manual, dada su extensión se ha subdividido en dos tomos

correspondientes a los dos grandes capítulos que abarca este curso:

I. Tomo : Histología Básica

II. Tomo : Histología de Sistemas

Finalmente, es importante destacar que el uso de este manual es

imprescindible durante el desarrollo del laboratorio y debe ser completado de

acuerdo a la realización de las actividades experimentales.

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BIBLIOGRAFIA 1. CORMACK, D., Histología de Ham. 9 Edit. México 1990 2. LEESON, T., Texto Atlas de Histología, Edit. Mc Graw - Hill México 1992 3. BELIMANN, H., Histología Veterinaria. Zaragoza 1980 4. BACKA W., Atlas Color de Histología Edit.. Interamericana Bs.Aires última edición 5. GARTNER, L y HIATT, J., Texto Atlas de Histología, Edit. Mc Graw - Hill México 2003 6. JUNQUEIRA L.C. y CORNEIRO J., Histología Básica, última Edit.Salvat Editores S.A. - Barcelona España 7. DI FIORE M., Diagnóstico Histológico y Atlas de Histología Normal Edit., El Ateneo. Bs. Aires, última edición 8. FAWCETT D.W. , Tratado de Histología, Edit. Interamericana Bs. Aires, última edición 9. KRSTIC, R. Los tejidos del hombre y los animales, Edit Interamericana Bs. Aires, última

Edición 10. KRSTIC, R. Human microscopic anatomy: an atlas for students of medicine and biology. Berlin .

DIRECCIONES DE UTILIDAD EN INTERNET

www.vh.org/Providers/Textbooks/MicroscopicAnatomy/MicroscopicAnatomy.html http://www-sci.lib.uci.edu/HSG/MedicalAnatomy.html http://www.meddean.luc.edu http://www.meddean.luc.edu/lumen/MedEd/Histo/frames/histo_frames.html www.med.uiuc.edu/histo www.icbl.ufg.br/histologia/incapa.htm http://www.histol.chuvashia.com/atlas-en/content-en.htm www.kumc.edu/instruction/medicine/anatomy/histoweb http://escuela.med.puc.cl

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TRABAJO PRACTICO N°1

TECNICAS HISTOLÓGICAS

INTRODUCCIÓN

La Histología se define literalmente como la ciencia que estudia los

tejidos, históricamente surge como una Anatomía Microscópica y es su principal

objetivo el análisis de cada una de las diversas asociaciones celulares, sus

características, funciones y localización.

Biológicamente un tejido se define como una agrupación de células que son

morfológicamente semejantes, derivan de una misma hoja embrionaria (ecto,

endo o mesoderma) y cumplen una función similar.

Dentro de sus propiedades se encuentran:

La capacidad de crecimiento y/o regeneración

La capacidad de cultivo

La especificidad

De acuerdo con su forma y función todos los tejidos se subdividen en 4

familias:

1. TEJIDO EPITELIAL

2. TEJIDO DE SOSTEN O CON SUSTANCIA INTERCELULAR

3. TEJIDO MUSCULAR

4. TEJIDO NERVIOSO

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Para el estudio de los tejidos se requiere de elaboración de preparaciones

histológicas, las cuales han sido obtenidas a través de un complejo procedimiento

que involucra una serie de etapas consecutivas.

Todas las células, salvo aquellas en que su citoplasma posee como

inclusiones sustancias o partículas coloreadas de origen endógeno (caroteno,

melanina, licopeno) o exógeno (carbón), son incoloras. Por este motivo, para poder

ser estudiadas con el microscopio óptico, ellas deben ser coloreadas o teñidas.

Para esto, se aprovecha la afinidad química de los componentes estructurales de

la célula o los existentes en su citoplasma, con sustancias que poseen un color

característico (colorantes) el que será transmitido a la estructura en estudio,

cuando la reacción química entre ambos se produzca.

Cuando se trata de estudiar células aisladas o disociadas, o bien tejidos

muy delgados, como es el caso de las pleuras, peritoneo, pericardio, meninges y

otras, el proceso de coloración no tiene problemas. El problema se produce

cuando se quiere estudiar órganos o tejidos voluminosos, en donde por la

densidad celular, tanto la coloración como la observación de ellos ofrece gran

dificultad, sobre todo si se piensa, que la observación al microscopio óptico se

basa en que lo observado debe ser transparente para que pueda ser atravesado

por el haz de luz, proveniente de la fuente luminosa.

La única manera de poder estudiar los tejidos formados por una gran masa

de células, es cortarlos de un grosor tal (7 a 10 m), que queden transparentes,

lográndose así una excelente y clara observación.

Como se dijo anteriormente, no sólo basta que el tejido sea delgado, ya

que las células por ser incoloras, no podrán ser puestas en evidencia con claridad

basándose solamente en la diferente refringencia de sus estructuras. Esta

dificultad se elimina, tiñendo las células con sustancias químicas específicas.

Para lograr cortes muy delgados, los que posteriormente serán teñidos, se

debe seguir todo un proceso. Este incluye los siguientes pasos:

1.- Fijación y lavado del tejido

2.- Deshidratación del tejido fijado

3.- Inclusión del tejido ya deshidratado

4.- Pegado de los cortes

5.- Desparafinaje e hidratación de los cortes

6.- Coloración

7.- Montaje definitivo

1. Fijación y lavado del tejido

Al realizar el estudio de una célula o tejido, lo más importante es que sus

estructuras se presenten ojalá sin alteración, es decir que éstas estén y se

conserven lo más próximo a lo real en que ellos estaban en la célula en el

momento de su muerte.

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Normalmente esto es difícil ya que como consecuencia de la muerte

celular, las enzimas de las vacuolas intracitoplasmáticas (lisosomas) se liberan y

esto provoca la autodestrucción o autolisis celular. Considerando este hecho, se

utiliza la fijación del tejido o célula, para esto se usan compuestos químicos

solos o asociados (soluciones o medios fijadores), los que tienen la particularidad

de penetrar rápidamente la membrana plasmática y provocar, ya sea la

coagulación de las proteínas citoplasmáticas o formar compuestos proteicos

complejos que se mantienen en la célula y por lo tanto ella dará una imagen muy

cercana a como estaba en el momento en que se sacó del cuerpo del individuo.

2. Deshidratación del tejido fijado

No debe olvidarse que para poder observar un tejido, él debe cortarse en

trozos tan delgados que dejen pasar la luz y por lo tanto las estructuras a

observar pueden verse por transparencia. La única posibilidad de hacer cortes de

entre 1 a 10 m es utilizando un instrumento llamado micrótomo y la pieza a

cortar debe ser de una dureza tal, que no permita que ésta vibre. Esto se alcanza

embebiendo el tejido en sustancias que le dan una consistencia característica.

Entre estas sustancias se pueden mencionar: los plásticos y la parafina sólida.

Como estas sustancias son muy apolares, y por lo tanto, insolubles en agua, la

única posibilidad de que ellas penetren el tejido es eliminando el agua que éstos

contienen. Dicho objetivo se logra, pasando el trozo de tejido por una batería

ascendente de alcoholes, es decir, desde un alcohol que tenga mucho agua hasta

uno que no contenga nada.

El alcohol (etílico o butílico) es un enérgico deshidratante, saca el agua de

donde ella está presente y como el tejido ya está fijado, el paso por estos

alcoholes no lo altera.

El tejido fijado no debe pasar directamente a alcoholes de 100° porque la

deshidratación sería muy enérgica apareciendo en el tejido espacios, en lugares

donde ellos no existían en la realidad; si esto ocurre se habla de un “artefacto

de técnica”.

Como la sustancia que da mayor consistencia a un tejido (parafina sólida)

es poco soluble, se debe utilizar una sustancia química que intervenga como

eslabón entre el alcohol y la parafina, es decir, que sea muy soluble en ambos

compuestos. Entre estas sustancias podemos mencionar: el xilol, el benceno, el

tolueno. El paso del tejido ya deshidratado, por estos compuestos se llama

“diafanizado”. En este momento el tejido está totalmente deshidratado y

comúnmente se observa que él ha tomado una mayor consistencia, haciéndose

quebradizo.

3. Inclusión del tejido

El tejido ya deshidratado y diafanizado debe ser endurecido para poder

ser cortado a grosores de 1 a 10m. Entre las sustancias utilizadas para

endurecer (incluir) el tejido se pueden mencionar: resinas naturales o sintéticas

y parafina sólida.

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Para esto se sumerge el tejido en este compuesto fundido y se mantiene

en él por varias horas, de modo que se de tiempo suficiente para que él se

introduzca en el tejido, atraviese la membrana celular y forme un todo con la

célula. Se obtiene así un molde que contiene una masa sólida formada por el

tejido y la sustancia endurecedora que lo ha penetrado totalmente.

4. Corte del tejido

En esta etapa se hace uso de un aparato (micrótomo) formado por una

cuchilla fija por la cual pasa el tejido endurecido cada vez que se gira una

manivela. Con cada vuelta de la manivela el tejido se acerca a la cuchilla un

número dado de micrones para así obtener un corte del grosor deseado.

El hecho de trabajar con cortes en dos dimensiones genera dificultades en

el estudio del tejido. Dado que se desconocerán parámetros tales como forma,

tamaño o volumen de la muestra estudiada. Por lo tanto se hace necesaria la

interpretación de los cortes. Esto implica tener que imaginar la estructura

tridimensional de los órganos estudiados bidimensionalmente.

Analice los esquemas que a continuación se presentan.

ESQUEMAS QUE ILUSTRAN DIFERENTES PROBLEMAS

EN LA IDENTIFICACION DE CORTES DE ACUERDO CON

LOS PLANOS DE SECCIONAMIENTO

1.- Diferentes planos de corte de un

huevo

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2.- Diferentes planos de corte de una

naranja.

3.- Diferentes planos de corte de un

cable con hilos aislados

4.- Diferentes planos de corte

de un tubo curvo.

5.- El dibujo de la parte inferior muestra cómo se visualizan en un corte un grupo

de células de dimensiones regulares.

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6.- Diferentes planos de corte

de un tubo recto

5. Pegado de los cortes

Para poder colorear y observar los tejidos ya cortados, éstos deben ser

pegados en portaobjetos muy limpios a través de sustancias adhesivas (solución

acuosa de albúmina) y posteriormente deben ser estirados y secados.

6. Desparafinaje e hidratación de los cortes

A pesar de que los cortes de tejido son muy delgados, no es posible

distinguir las estructuras celulares ya que el tejido y las células están embebidos

en parafina, lo que dificulta cualquier observación. Además, como se mencionó

anteriormente, las células son transparentes, de modo que aunque se elimine la

parafina las estructuras internas no podrán ponerse en evidencia salvo que ellas

sean previamente coloreadas. Basándose en estos hechos se debe continuar

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procesando el tejido ya pegado para eliminar la parafina que lo embebe lo cual se

realiza con xilol y luego se rehidrata el tejido ya que los colorantes que se usan

son solubles en agua. Para realizar esto último se hace uso de una batería de

alcoholes de graduación descendente (desde un alcohol que no contenga agua,

hasta uno que tenga mucha agua y finalmente poder enjuagar la muestra sólo en

agua.

7. Coloración o Tinción

La coloración de los tejidos o células se basa en la propiedad que tienen

algunas soluciones coloreadas (colorantes o tinturas) de asociarse selectivamente

a ciertas estructuras celulares, tiñéndolas. Se las utiliza en histología para que

los detalles estructurales se hagan evidentes, fácilmente visibles y resalten en

medio del resto de las estructuras que permanecen incoloras o que serán teñidas

posteriormente de un color diferente. De este modo, el estudio de un tejido o

células se realiza mediante el análisis cromático de las diferentes estructuras

que conforman la preparación. Por lo tanto, para que un colorante resulte útil en

histología, es indispensable que tiña difusamente y que no tiña con igual

intensidad todas las estructuras celulares.

El colorante deberá fijarse con determinada especificidad sobre

determinados elementos del citoplasma o del núcleo. Las estructuras coloreadas

serán aquellas que tienen la propiedad de absorber de manera selectiva los rayos

luminosos de una determinada longitud de onda y que transmitan por

transparencia o difusión las radiaciones complementarias no absorbidas. En

histología se considera que una estructura se ha teñido cuando el tejido no se

destiñe con un lavado efectuado en el mismo solvente empleado para preparar la

solución de ese colorante. Se admite y se explica este hecho porque en la tinción

el colorante se combina íntimamente con la sustancia coloreable. Esto se debe a

la presencia de agrupaciones moleculares básicas o ácidas de los colorantes

originando sales insolubles.

Ehrlich, divide los colorantes en ácidos, básicos y neutros.

a.- Los colorantes ácidos son sales cuya base es incolora y el ácido es coloreado.

Así por ejemplo, en la eosina o eosinato de sodio, la propiedad colorante es

debida al ácido eosínico y no a la base, sodio, que es incolora.

b.- Los colorantes básicos poseen la base coloreada y el ácido incoloro. Por

ejemplo, el azul de metileno, que es un clorhidrato de azul de metileno, el poder

colorante es debido al compuesto básico: azul de metileno (tetrametiltionina) y

no al ácido clorhídrico que es incoloro.

c.- en los colorantes neutros, tanto el ácido como la base que intervienen son

coloreados. Por ejemplo, el eosinato de azul de metileno.

Los colorantes ácidos tienen una afinidad especial por el citoplasma por lo

que se les llama también “colorantes citoplasmáticos”, ejemplo: eosina, floxina,

eritrocina, etc. y a las estructuras que se tiñen se les llama “estructuras

acidófilas”

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Los colorantes básicos, en cambio, se fijan sobre la cromatina nuclear,

llamándoseles por lo tanto, “colorantes nucleares” y a las estructuras que se

tiñen con estos colorantes se les llama “estructuras basófilas”, como por ejemplo

de estos colorantes se pueden mencionar: la hematoxilina, el azul de metileno, el

azul de toluidina, etc.

Después de la coloración se procede a realizar una deshidratación con una

batería de alcoholes ascendente y un diafanizado con el fin de proceder al

montaje definitivo.

8. Montaje definitivo

Para dejar una preparación permanente y definitiva, se coloca sobre el

tejido ya diafanizado, una gota de bálsamo de Canadá o de Permount (sustancia

adhesiva) y se cubre con un cubreobjeto muy limpio y se deja secar.

OBJETIVOS

1.- Describir una preparación histológica de acuerdo a parámetros definidos.

2.- Identificar diferentes tipos de tinciones histológicas.

3.- Identificar cómo se colorean las estructuras celulares y/o tejidos con

distintas tinciones.

4.- Valorar el uso de las tinciones para el análisis y diagnóstico histológico.

5.- Identificar planos de corte

6.- Interpretar diferentes tipos de corte

* * *

ACTIVIDADES

1. TINCIONES

A. Observe atentamente el set de imágenes que se le entregará.

B. Reconozca en cada uno de ellos la técnica utilizada. Fundamente en base a los

colores observados.

C. Distinga el tipo de corte

D. Identifique el aumento utilizado.

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I.

1. Técnica : …………………………………………………………………….………….……………………………………………………………

Fundamentación ……………………………………………………………….………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………..…………………………….……………………………………………………

2. Corte : …………………………………………………………………….………………………… Aumento ……………..…………

II.

1. Técnica : …………………………………………………………………….………….……………………………………………………………

Fundamentación ……………………………………………………………….………..……………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………..………………….……………….……………………………………………………

2. Corte : …………………………………………………………………….………………………… Aumento ……………..…………

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III.

1. Técnica : …………………………………………………………………….………….……………………………………………………………

Fundamentación ……………………………………………………………….………..……………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………..………………….……………….……………………………………………………

2. Corte : …………………………………………………………………….………………………… Aumento ……………..…………

IV.

1. Técnica : …………………………………………………………………….………….……………………………………………………………

Fundamentación ……………………………………………………………….………..……………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………..………………….……………….……………………………………………………

2. Corte : ……………………………………………………………………………………………… Aumento ……………..…………

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V.

1. Técnica : …………………………………………………………………….………….……………………………………………………………

Fundamentación ……………………………………………………………….………..……………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………..………………….……………….……………………………………………………

2. Corte : ……………………………………………………………………………………………… Aumento ……………..…………

VI.

1. Técnica : …………………………………………………………………………………..…………………………………………………………

Fundamentación ……………………………………………………………………………….……………………………………..………………………

…………………………………………………………………………………..…………………………..……………………………..……………………………

2. Corte : ……………………………………………………………………………..………..…… Aumento ……………..…………

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2. CORTE

A. Realice en plasticina un esquema tridimensional de los siguientes tipos

celulares :

Fibra muscular estriada esquelética

Fibra muscular lisa

Enterocito

Hepatocito

Neurona motora

Neurona ganglionar

NOTA: Para realizar el esquema debe conocer previamente las formas de dichas

células

B. Represente el citoplasma y núcleo en colores diferentes

C. Utilizando un cuchillo, corte en 3 planos diferentes.

D. Dibuje la célula y sus planos de corte

E. Dibuje la imagen bidimensional de los planos de corte obtenidos

1. Fibra muscular estriada esquelética

Esquema tridimensional y planos de cortes Corte bidimensional

1.

2.

3.

2. Fibras muscular lisa

Esquema tridimensional y planos de cortes Corte bidimensional

1.

2.

3.

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3. Enterocito

Esquema tridimensional y planos de cortes Corte bidimensional

1.

2.

3.

4. Hepatocito

Esquema tridimensional y planos de cortes Corte bidimensional

1.

2.

3.

5. Neurona motora

Esquema tridimensional y planos de cortes Corte bidimensional

1.

2.

3.

6. Neurona ganglionar

Esquema tridimensional y planos de cortes Corte bidimensional

1.

2.