Laboratorio 1 Crecimiento Celular

LABORATORIO 1: CRECIMIENTO CELULAR Cdigo: BIOPINGALL01

Vigencia: 30.04.2010

Rev.: 01

Ramo: Laboratorio de Ingeniera de Bioprocesos Carrera: Ingeniera de Alimentos

Facultad Tecnolgica

Departamento de Ciencia y Tecnologa de los Alimentos

Universidad de Santiago de Chile

Editado por los profesores: ngela Contreras, Sergio Aguilera

1. INTRODUCCIN

1.1 Curva de crecimiento

Conocer las caractersticas de crecimiento de un microorganismo es esencial para

desarrollar procesos industriales de manera ptima. Una poblacin de microorganismos,

incluso bajo condiciones ptimas, experimenta variaciones en el tiempo segn un perfil

definido llamado curva de crecimiento. Esta curva de crecimiento es caracterstica para

cada microorganismo y depende de manera importante de las condiciones del en el medio

en el cul este se desarrolle. El crecimiento se define como el aumento ordenado de

todos los componentes de un organismo. En organismos unicelulares conduce a un

aumento en el nmero de clulas ms que un aumento en el tamao celular, lo que deriva

en un crecimiento exponencial del nmero de clulas. Los microorganismos en general no

pueden crecer sin lmite, ya que durante su crecimiento van agotando los nutrientes

disponibles y generando productos txicos nocivos para su desarrollo.

Un cultivo microbiano simple y homogneo tiene un ciclo de crecimiento que se divide en

cuatro fases. En primer lugar, una fase de latencia (o fase lag), una fase de crecimiento

exponencial, una fase de crecimiento estacionario y una fase de muerte.

Tomando como ejemplo un cultivo que est creciendo en un matraz agitado (cultivo

batch), normalmente se observarn estas cuatro fases de crecimiento. En primera

instancia las clulas en fase de latencia (procedentes de un cultivo anterior o pre-inculo)

no crecen enseguida, ya que deben adaptarse al nuevo medio antes de comenzar a

crecer a un ritmo exponencial. Durante esta fase, aunque no ocurra divisin celular, las

clulas pueden estar creciendo en tamao y volumen, sintetizando protenas, enzimas,

ARN, entre otras molculas. En sntesis, aumentando su actividad metablica. La

duracin de esta fase de latencia depende de numerosos factores, como por ejemplo la

edad del inculo, la cantidad de pre-inculo agregado, de la temperatura del medio, de la



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concentracin de nutrientes tanto del cultivo antiguo como del nuevo, de la aireacin del

cultivo y de la concentracin de toxinas que pueden haberse formado en el cultivo

antiguo. Es as como, si los medios de cultivo antiguo y nuevo presentan grandes

diferencias en su composicin, la fase de latencia se har ms extensa.

Una vez que las clulas se encuentran adaptadas, estas comienzan a dividirse

rpidamente, lo que da inicio a la fase de crecimiento exponencial. En esta fase, las

clulas se dividen a una tasa constante y caracterstica de su especie. Es as como se

pueden utilizar algunos parmetros para caracterizar el crecimiento del microorganismo

durante esta fase. Uno de ellos es la velocidad especfica de crecimiento ( con unidades

t-1) y el otro es el tiempo de duplicacin (tD con unidades t). Estos parmetros se puede

relacionar por medio de la expresin =ln2/tD. Como se mencion anteriormente, estos

parmetros son propios de cada especie microbiana, adems dependen del medio en el

cual se est desarrollando el microorganismo.

Conforme se consumen los nutrientes en un biorreactor batch se van acumulando

productos inhibitorios y la velocidad de crecimiento va disminuyendo, hasta llegar a

detenerse (fase estacionaria). En la fase estacionaria las clulas no estn todas en el

mismo estado fisiolgico, algunas todava se estn dividiendo mientras que otras ya han

comenzado a morir, por lo que la poblacin total se mantiene constante. Es importante

destacar que es en esta fase donde se producen los llamados metabolitos secundarios,

como por ejemplo los antibiticos.

A medida que se agota la mayor parte de los nutrientes y la acumulacin de metabolitos

txicos aumenta de forma considerable, el nmero de clulas que mueren sobrepasa al

nmero de clulas que se producen y el cultivo entra en la fase de muerte.



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1.2 Mtodos para el monitoreo del crecimiento de un cultivo

Dada la diversidad de caractersticas que presentan los distintos cultivos de

microorganismos, se han desarrollado una variedad de mtodos fsicos y qumicos para

cuantificar las variaciones en el tiempo que experimenta una poblacin dada de

microorganismos. Algunos de estos mtodos se describen a continuacin.

1.2.1 Mtodos directos

Recuento Celular

El recuento de clulas se efecta en el microscopio, utilizando un portaobjeto graduado

llamado cmara de Neubauer. De esta manera se puede determinar la densidad celular

de una muestra expresndola como el nmero de clulas por volumen del cultivo. La

principal desventaja de este mtodo radica en que no se puede discriminar entre clulas

vivas y muertas (viabilidad celular), siendo necesario utilizar mtodos complementarios

para obtener dicho parmetro. El clculo de la viabilidad celular se basa principalmente en

la capacidad fisiolgica de las clulas para excluir algunos colorantes, impidiendo la

tincin de sus componentes celulares. Uno de los mtodos ms utilizados para el clculo

de viabilidad en levaduras es la tincin con Azul de Metileno.

Cuantificacin de la biomasa microbiana

La biomasa se puede determinar filtrando o centrifugando una muestra de volumen

conocido (peso freso) o desecando esta filtracin a 105 C (peso seco). Otra forma de

cuantificar el desarrollo de una poblacin microbiana, es medir el volumen del pellet o

sedimentos de una centrifugacin. Para ello existen tubos de centrifuga graduados, que

permiten una lectura directa de este valor.



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Turbidimetra

Generalmente los medios de cultivo son lquidos transparentes que dejan atravesar la luz.

Sin embargo, al aumentar el nmero de clulas o biomasa, estos lquidos comienzan a

adquirir turbidez la cual puede cuantificarse por turbidimetra, colorimetra o

espectrofotometra en el rango visible. Se considera que la biomasa sigue el

comportamiento de la Ley de Lambert-Beer, es decir, al graficar la absorbancia v/s la

biomasa sta sigue un patrn lineal dado por Abs = e * l * c, donde A es la absorbancia, e

es la absortividad, l es el espesor y c la concentracin. Por lo general la linealidad se

mantiene hasta un rango de 1 gramo de biomasa seca por litro y se mide

aproximadamente a una longitud de onda de 600nm. Las restricciones para usar este

mtodo son: presencia de slidos en el medio de cultivo, medio de cultivo que absorbe a

la misma longitud de onda que los microorganismos, crecimiento de microorganismos en

biofilms, entre otros.

1.2.2 Mtodos indirectos

Se basan en la capacidad de establecer correlaciones con componentes celulares,

metabolitos producidos por las clulas o reacciones catalizadas por estas. Por ejemplo,

puede estimarse el crecimiento celular determinando cantidad de protenas, cantidad de

DNA, consumo de oxgeno, consumo de nutrientes como glucosa, produccin de cidos u

otros productos.

Mtodo GOD-PAP para monitorear el consumo de glucosa

El mtodo GOD-PAP se basa en determinar la cantidad de glucosa despus de su

oxidacin enzimtica en presencia de glucosa oxidasa. El perxido de hidrgeno formado

reacciona bajo la catlisis de la peroxidasa con fenol y 4-amino-fenazona produciendo un



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complejo rojo-violeta usando la quinoneimina como indicador que absorbe a 500nm. La

reaccin se muestra a continuacin:

Glucosa + O2 + H2O Acido glucnico + H2O2 (Catalizado por glucosa oxidasa)

2H2O2 + 4-aminofenazona + fenol quinoneimina + 4H2O2 (Catalizado por peroxidasa)

Es as como la concentracin de glucosa es proporcional a la produccin de quinoneimina

presente en la reaccin. Para realizar la cuantificacin se debe construir una curva de

calibracin de Abs500nm v/s concentraciones de glucosa conocidas. Un parmetro para

poder caracterizar el consumo de un sustrato es el rendimiento del sustrato, valor que

hace referencia a la cantidad de biomasa producida en relacin a la cantidad de sustrato

consumida ( ).

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo general

Monitorear el crecimiento de un cultivo de levaduras (Saccharomyces cerevisiae) en un

medio de laboratorio por medio del uso de mtodos directos e indirectos.

2.1 Objetivos especficos

Caracterizar la curva de crecimiento de la levadura S. cerevisiae.

Determinar la viabilidad del cultivo durante su crecimiento.

Relacionar el consumo de sustrato con el crecimiento del microorganismo.



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3. ACTIVIDADES

3.1 Construir la curva de crecimiento de la levadura S. cerevisiae en un medio YPD

utilizando espectrofotometra.

3.2 Caracterizar la fase de crecimiento exponencial por medio de los parmetros y tD.

3.3 Utilizar la cmara de Neubauer para realizar el conteo de levaduras y posteriormente

calcular la viabilidad celular.

3.4 Medir el consumo de glucosa por medio del uso del kit GOD-PAP. Determinar el

rendimiento de glucosa.

4. MATERIALES

Cultivo de levadura Saccharomyces cerevisiae, medio de cultivo (YPD), cmara de

Neubauer, solucin de azul de metileno (0,02%), cubetas de espectrofotmetro, tubos

eppendorf, micropipetas, vasos prcipitados, pizetas con agua destilada, alcohol 70%,

papel absorbente, kit GOD-PAP para medicin de glucosa.

5. PROCEDIMIENTOS

Se tendrn dos puntos de la curva de crecimiento por cada grupo de trabajo. Estas

muestras correspondern a medio de cultivo con levaduras en suspensin obtenidas a

diferentes tiempos de cultivo.

5.1 Construccin de la curva de crecimiento por medio de espectrofotometra

1. Homogeneizar la suspensin celular y tomar 1mL en cubetas de espectrofotometra.



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2. Tomar 1mL de medio de cultivo YPD sin levaduras y depositarlo en una cubeta de

espectrofotometra. Esta cubeta se utilizar como blanco.

3. Depositar la cubeta blanco dentro del espectrofotmetro regulado a 600nm. Cuidar

limpiar la cubeta con papel tissue (no utilizar papel absorbente ya que puede rayar la

cubeta, inutilizndola).

4. Medir la absorbancia de las muestras problema. Si el valor de absorbancia sobrepasa

el valor crtico (0,9 - 1,0) deber diluir la muestra. Para ello, siga los pasos desde el punto

1, diluyendo la muestra con medio YPD sin levaduras antes de depositar la muestra en la

cubeta. No olvide corregir el valor de absorbancia obtenido con el factor de dilucin

utilizado.

5. Utilizando los valores de absorbancia de sus compaeros construya la curva de

crecimiento Abs600nm v/s t.

5.2 Recuento celular en cmara de Neubauer y clculo de viabilidad

1. Tomar una muestra de 50L de muestra del cultivo y mezclarlo con 50L de azul de

metileno. Para tiempos avanzados de incubacin, realizar diluciones con medio YPD

antes de mezclar con el colorante. No olvide corregir por el factor de dilucin cuando

realice los clculos.

2. Tomar 10L de esta suspensin y depositarlo en la cmara de Neubauer.

3. Contar en el microscopio, segn las instrucciones entregadas por el profesor, las

clulas azules (muertas) y blancas (viables).



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4. Calcular la concentracin celular por medio de la siguiente frmula

Donde:

C: Concentracin celular [cl/mL]

x: Promedio clulas contadas en la cmara

FD: Factor de dilucin utilizado.

5. Calcular la viabilidad celular por medio de la frmula

6. Confeccionar la curva de crecimiento en C v/s t. Calcule los valores de y tD utilizando

la pendiente de la curva confeccionada en la fase exponencial y por medio del modelo

biolgico

.

5.3 Determinar glucosa residual por el mtodo GOD-PAP

1. Tomar 50L de muestra y mezclarlo en un tubo eppendorf con 1mL de reactivo GOD-

PAP. Se debe tener en consideracin que la linealidad del kit es hasta

concentraciones de glucosa de 700mg/dL. Si considera que su muestra superar este

valor, diluya las veces que considere pertinente. No olvide corregir su valor de

absorbancia por el factor de dilucin utilizado.

2. Tomar 50 mL de agua destilada y mezclarla en un tubo eppendorf con 1mL de reactivo

GOD-PAP. Este tubo se utilizar como blanco de la reaccin.

3. Incubar la muestra y el blanco por 5 min. a 37C.

4. Medir los valores de absorbancia a 500nm de la muestra.



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5. Con los valores de sus compaeros construir la grfica Cglucosa v/s t.

6. Calcular el rendimiento de la glucosa por medio de

Donde:

Yx/s: Rendimiento de glucosa

X: Diferencia de la concentracion celular en un tiempo determinado (Xf - X0).

S: Consumo de glucosa (S0 Sf).

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