Las bacterias y la temperatura

Cmo afecta la temperatura a las bacterias?Las bacterias prefieren las temperaturas moderadas, pero algunas son capaces de adaptarse al fro y sobrevivir dentro de los refrigeradores y freezers, mientras que otras hasta necesitan cierta intensidad de calor para poder multiplicarse. Pero lo ms usual es que el calor las destruya, el fro las inhiba y la temperatura media favorezca su desarrollo. Entonces, para evitar la proliferacin de bacterias la opcin es cadena de calor o cadena de fro.Cmo se clasifican las bacterias en relacin a la temperatura?Las bacterias se dividen en cuatro grupos:1. Termfilas: las bacterias viven y se multiplican entre 40C y 90C, cuya temperatura ptima es de 55 75C. Este tipo de bacteria es uno de los problemas a resolver por la industria conservera, que utiliza las altas temperaturas para el procesamiento de los alimentos.2. Mesfilas: las bacterias crecen entre 5 y 47C, cuya temperatura ptima es de 30 45C. Como estas bacterias causan enfermedades son capaces de desarrollarse a la temperatura corporal.3. Psicrfilas: las bacterias se desarrollan entre 5 y 20C, cuya temperatura ptima es de 12 15C. Las bajas temperaturas son las ms favorables para este tipo de bacterias.4. Psicrotrofas: las bacterias crecen entre 5 y 35C, cuya temperatura ptima es de 25 30C. Estas bacterias son capaces de multiplicarse a bajas temperaturas, pero no es su temperatura ideal de desarrollo.La formacin de familias o comunidades?La formacin de familias o comunidades caracteriza a los seres humanos y a las bacterias. Tanto las bacterias como las personas viven en comunidad y casi nunca estn solas.Otras personas y otras bacterias pueden ayudar a vivir mejor?Entre las bacterias, muchas de ellas contribuyen a los procesos tecnolgicos para la fabricacin del yogur o los embutidos secos. Tambin hay bacterias que intervienen en la degradacin de nuestros desperdicios y ayudan a disminuir la contaminacin ambiental. Muchas veces el esfuerzo "conjunto" de los seres humanos y de las bacterias ha brindado grandes soluciones a problemas sanitarios

PSEUDOMONAS AERUGINOSAGloria Sobern

Instituto de Biotecnologa, Universidad Nacional Autnoma de MxicoIntroduccinPseudomonas aeruginosa es una bacteria gram-negativa perteneciente a la rama de las proteobacterias, misma a la que pertenecen las enterobacterias(Fig. 1)(54,84).Dentro del gneroPseudomonasse encuentran tambin algunas otras especies comoP. fluorescens,P. putida,P. syringaeyP. alcaligenes.P. aeruginosase encuentra ampliamente distribuida en la naturaleza(11,31),se puede aislar de muestras de suelo, aguas pristinas y contaminadas, asi como de plantas y animales. Todas las cepas son potencialmente patgenas para el hombre y algunas pueden infectar tambin a plantas comoArabidopsis thaliana(62),y a invertebrados comoCaenorhabditis elegans(73).Esta bacteria es capaz de utilizar una enorme variedad de compuestos orgnicos como sustrato para crecer, capacidad que le permite colonizar nichos en los que son escasos los nutrimentos que otros organismos pueden asimilar. Se ha reportado el aislamiento deP. aeruginosade ambientes tan inhspitos como son el combustible de avin, soluciones de clorhexidina y el jabn(31).Para empezar este captulo es interesante mencionar queP. aeruginosatiene importancia para el hombre tanto porque le representa problemas, como porque puede ser til en el tratamiento de la contaminacin ambiental(Fig. 2).Contrariamente a lo que parece, todos nosotros estamos en contacto diariamente conPseudomonas aeruginosa, ya que se encuentra en bajas cantidades en nuestros alimentos y en algunos artculos de limpieza(31).De hecho, se obtienen aislamientos de esta bacteria a partir de entre el 2 y el 8% de las heces de personas sanas(31),lo que nos muestra que nuestro contacto con esta bacteria es cotidiano y slo representa una amenaza para nuestra salud en condiciones especiales, como veremos a continuacin.P. aeruginosarepresenta un problema importante de salud en centros hospitalarios, especialmente cuando se trata de pacientes con cancer(1)o quemados(41).Una vez que se establece la infeccin,P. aeruginosaproduce una serie de compuestos txicos que causan no slo dao tisular extenso, sino adicionalmente interfieren con el funcionamiento del sistema inmune(18,46).Entre las protenas que intervienen en la infeccin deP. aeruginosaencontramos toxinas, como las exotoxinas A y S, as como enzimas hidrolticas que degradan las membranas y el tejido conjuntivo de diversos rganos(18,46).Esta situacin se ve agravada por la dificultad para tratar las infecciones porP. aeruginosa, ya que esta bacteria presenta una muy alta resistencia natural a distintos antibiticos y a desinfectantes(30,72).Existe un grupo poblacional especialmente vulnerable a las infecciones conP. aeruginosaformado por los enfermos de fibrosis qustica(26,27,59).P. aeruginosacoloniza muy eficientemente el tracto respiratorio de estos pacientes, y a medida que progresa la infeccin se seleccionan derivados mucoides de la bacteria que producen grandes cantidades del exopolisacrido alginato(Fig. 3).Una vez que se establece una infeccin por cepas mucoides deP. aeruginosaen los pulmones de pacientes con fibrosis qustica, estos estn en la etapa terminal de la enfermedad. Esto se debe a que estas cepas no pueden ser eliminadas por el sistema inmune y, hasta el momento, no existe un tratamiento efectivo contra cepas mucoides.Por otra parte, en ambientes acuosos esta bacteria se adhiere a superficies, produciendo una especie de agregado llamado biopelcula(12)(Fig. 4).La formacin de estos cmulos de bacterias y material extracelular representa un problema de salud pues contamina dispositivos que se implantan dentro del cuerpo, como por ejemplo dispositivos intrauterinos, catteres(48)o vlvulas cardiacas. Las biopelculas tambin representan un problema en el proceso de produccin de diversas industrias pues provocan taponamiento y corrosin de conexiones y filtros.Asimismo,P. aeruginosapresenta problemas en la industria alimentaria ya que puede descomponer los alimentos que se mantienen en refrigeracin al mantener un metabolismo basal en estas condiciones y producir enzimas hidrolticas(69).Sin embargo, a la vez queP. aeruginosacausa al hombre distintos problemas, esta bacteria tiene diversas aplicaciones biotecnolgicas, sobre todo en el rea ambiental. As se sabe que es uno de los pocos organismos capaces de degradar alcanos de cadena ramificada(65);que produce biosurfactantes que son tiles para la limpieza de suelos contaminados con hidrocarburos(42)o con metales pesados(45);y que produce enzimas, como la lipasa, con distintas aplicaciones potenciales(69).Desde un enfoque bsicoP. aeruginosarepresenta un modelo de gran inters que, como veremos ms adelante, ha sido estudiada desde mltiples enfoques. De hechoP. aeruginosaes una de las bacterias ms estudiadas a nivel molecular y su genoma ha sido totalmente secuenciado recientemente(72,www.pseudomonas.com).En este captulo revisaremos brevemente distintos aspectos de la biologa de esta bacteria que tiene tantas y tan diversas relaciones con el hombre.Dentro de esta introduccin es importante mencionar queP. aeruginosasobresale entre las bacterias por su extraordinaria capacidad de adaptacin, ya que, como mencion anteriormente, vive en ambientes muy diversos. Muchos autores incluso la han considerado como un organismo ubicuo(11,31,72,www.pseudomonas.com)aunque no se ha documentado su presencia en ambientes extremos. Por otra parte, es el nico caso conocido de una bacteria ambiental en la que todos los aislamientos son potencialmente patgenos para el hombre(11,31,72,www.pseudomonas.com).Es tambin una caracterstica particular de esta bacteria el arreglo de los genes que intervienen en la virulencia de la bacteria, ya que no estn codificados en las llamadas "islas de patognesis" como en las dems bacterias patgenas(29),sino se encuentran interdispersas en su cromosoma(72,www.pseudomonas.com).La colonizacin de distintos ambientes porP. aeruginosay la patogenia de los aislamientos ambientales nos plantean interrogantes evolutivas muy importantes que hacen fascinante el estudio deP. aeruginosa. Entre otras podemos hacernos las siguientes preguntas: qu ventaja selectiva le da la produccin de los factores de virulencia aP. aeruginosaviviendo en el medio ambiente? cmo puedeP. aeruginosaadaptarse a ambientes tan diversos?, y por qu es distinto el arreglo gentico de los genes que intervienen en la virulencia de la bacteria al de otras bacterias patgenas? El estudio de esta bacteria nos permitir, pues, contestar problemas fundamentales acerca de la manera en la que se adapta a mltiples condiciones ambientales.Estructura del GenomaRecientemente se concluy la secuencia completa del genoma de la cepa PAO1, que es la cepa tipo deP. aeruginosay que fue aislada de un paciente con otitis media. Esta secuencia ya se encuentra disponible en el internet(www.pseudomonas.com)y su anlisis fue recientemente publicado(72).El tamao aproximado del nico cromosoma circular(www.pseudomonas.com)que forma el genoma de esta bacteria es de cerca de 6.3 millones de pares de bases, con mucho el de mayor tamao de los genomas de bacterias secuenciados hasta ahora(Tabla 1).Esta cepa, al igual que muchos otros aislamientos deP. aeruginosa, no contiene plsmidos.Ms de la mitad de los genes deP. aeruginosaPAO1 presentan una homologa cercana y un arreglo transcripcional en operones similar a los deEscherichia coli(71,72).Tambin es aparente queP. aeruginosapresenta homologa en la secuencia y en la organizacin gentica con bacterias ambientales, incluso con bacterias gram-positivas(71,72).El 32% de los genes predichos a partir de la secuencia del genoma de esta bacteria no tienen homologa con las secuencias depositadas en los bancos de datos, lo que sugiere que se trata de genes que codifican para actividades enzimticas novedosas(71,72).Del anlisis del genoma de esta bacteria es notorio la gran abundancia de genes que parecen codificar para bombas que sacan compuestos de la clula(71,72).La abundancia de estos transportadores pudiera estar relacionada con su alta resistencia a distintos compuestos txicos(49,88)y, en ltima instancia, con su extraordinaria versatilidad.El proyecto de secuenciacin del genoma de la cepa PAO1 fue realizado por la fundacin para la Fibrosis Qustica, la universidad de Washington, y la compana PathoGenesis. El inters de estas organizaciones es fundamentalemnete clnico, ya que su objetivo principal es encontrar nuevos frmacos y otras herramientas para combatir las infecciones porP. aeruginosa.Variabilidad GenticaContrariamente a lo que ocurre con otras bacterias patgenas, no existen clonas deP. aeruginosaasociadas con el desarrollo de una enfermedad, por lo que la frecuencia de las distintas clonas es la misma entre los aislamientos ambientales y clnicos(63).Esto es, en una determinada regin geogrfica se encuentra que la frecuencia con la que se aisla una cepa es la misma si se muestrean hospitales, pacientes con distinto tipo de infecciones o se toman muestras ambientales(63).Sin embargo existe una gran variabilidad gentica entre distintos aislamientos de esta bacteria an aisladas en la misma regin. Esta variabilidad tiene caractersticas muy particulares(37,77),como a continuacin veremos. El tamao del genoma de distintas cepas deP. aeruginosavara entre 5 y 7 millones de pares de bases, y comprende un mosaico de genes especficos de la especie que va del 70 al 90% de la secuencia de DNA de una cepa. Esta proporcin vara de acuerdo con la cantidad de informacin accesoria que cada cepa tiene, pero el orden de los genes propios de la especie est conservado entre todos los aislamientos. Estos bloques de DNA se interrumpen por secuencias especficas de cada cepa que pueden ser de entre 1 a 200 kb. La secuencia de los genes comunes est altamente conservada entre los distintos aislamientos de esta bacteria, a excepcin del genpilAque codifica para la fimbria tipo IV y que presenta un gran polimorfismo. De hecho la variabilidad de las secuencias especficas deP. aeruginosaes 10 veces menor que la que presentan distintas cepas deE. colioSalmonella, lo que sugiere una alta tasa de recombinacin entre la poblacin de esta bacteria. La alta frecuencia de recombinacin entre las distintas clonas, comparada con la relativamente menor tasa de mutacin espontnea, mantiene una informacin gentica comn a toda la especie. De este modo,P. aeruginosatiene una parte de su genoma altamente conservada y una proporcin menor, pero significativa, que es distinta en cada clona de esta bacteria. La alta conservacin entre cepas de la mayor parte del genoma deP. aeruginosa, aunada a la presencia de genes clona especfico, podra explicar la capacidad de esta bacteria de colonizar tan diversos nichos y de utilizar como sustrato una gran variedad de compuesto. En un determinado nicho ecolgico toda la poblacin bacteriana puede explotar toda la informacin gentica propia de la especie y, al mismo tiempo, cada clona contiene secuencias propias que son blanco de una acelerada evolucin gentica.PlsmidosUna de las caractersticas de las bacterias del gneroPseudomonases su gran capacidad para catabolizar distintos hidrocarburos aromticos y alifticos. Esta caracterstica generalmente est codificada en plsmidos, llamados catablicos(22),que casi siempre se encuentran en cepas deP. putiday rara vez enP. aeruginosa. En el caso de esta ltima bacteria su enorme versatilidad metablica parece deberse al gran nmero de genes cromosomales que codifican para enzimas con actividades novedosas(72).Los plsmidos que se presentan enP. aeruginosacodifican para resistencias a antibiticos(28)o a metales(8,67),y su extensa distribucin representa un problema clnico.Es interesante mencionar que si bien son frecuentes los plsmidos que confieren resistencia a antibiticos y metales pesados entre los aislamientos deP. aeruginosa, no lo son tanto como para considerar que estos elementos genticos formen parte de su genoma. Por otra parte, no existen datos que sugieran que los plsmidos tengan un papel en la alta tasa de recombinacin que presenta esta bacteria.Algunos plsmidos originalmente aislados de cepas deP. aeruginosafueron importantes para la construccin del mapa gentico de esta bacteria(34,35).Adems, ya que estos plsmidos pueden replicarse en distintos fondos genticos, han sido utilizados en el estudio gentico de distintas bacterias gram-negativas, diferentes a las enterobacterias(33,61).Tambin tienen importancia dentro de la ingeniera gentica pues a partir de ellos se han construido mltiples vectores de clonacin capaces de replicarse en diversas bacterias gram-negativas(61,79).Resistencia Natural a AntibiticosLa membrana externa de las bacterias gram-negativas es una membrana semipermeable que permite la difusin de solutos hidroflicos pequeos y tiene muy baja permeabilidad para los compuestos hidrofbicos(87).La permeabilidad de la membrana externa depende principalmente de las porinas, que son proteinas formadoras de poros con una baja especificidad(86),y de los sistemas de transporte especficos(78)(Fig. 5).La baja permeabilidad de las porinas de la membrana externa deP. aeruginosatiene un papel importante en el alto nivel de resistencia natural a los antibiticos de esta bacteria(30).Sin embargo, es claro que enP. aeruginosa, tanto la resistencia a antibiticos intrnseca como la adquirida, dependen principalmente de la presencia de un gran nmero de transportadores que secretan estos compuestos al exterior de la clula. El mayor nmero de estos transportadores se agrupan en dos familias, segun su parecido estructural, una de ellas est formada por los sistemas llamados eflux(49,88),y la otra se denomina MFS, por sus siglas en ingls (major facilitator superfamily)(72).Es notorio la gran abundancia de estos dos tipos de transportadores en el genoma de la cepa PAO1 comparado con el nmero encontrado en otras bacterias comoE. coli(72,www.pseudomonas.com).Los sistemas eflux estn formados por tres proteinas, un intercambiador droga-protn, presente en la membrana interna, una proteina de membrana externa que parece formar un canal y una proteina periplsmica que une a las dos proteinas membranales(Animacin 1)(88).El sistema eflux que ms contribuye a la resistencia intrnseca de P. aeruginosa es el sistema AcrAB/MexAB que es capaz de transportar una amplia variedad de antibiticos como: quinolonas, macrolidos, cloranfenicol, tetraciclina, trimetroprima y -lactmicos(60).Adems de los antibiticos, el sistema AcrAB/MexAB tambin puede translocar soventes orgnicos(60)."Sistema Sensor de Quorum"Pseudomonas aeruginosa, al igual que otras bacterias cuenta con mltiples sistemas regulatorios que le permiten modificar la expresin de distintos genes en respuesta de cambios en el medio ambiente. Es ms, se trata de la bacteria en la que se ha encontrado la mayor proporcin de genes que codifican para protenas que son potencialmente reguladores transcripcionales(72).Uno de estos sistemas regulatorios, que tambin est presente en muchas otras bacterias, responde no directamente a las condiciones medio ambientales, sino fundamentalmente a cambios en una poblacin bacteriana, ya que promueve el cambio en la expresin gentica en funcin de la densidad celular. Este sistema regulatorio detecta cundo se ha llegado a una masa crtica de bacterias por lo que se le ha denominado "sensor de quorum"(24,25,64).El mecanismo mediante el cual se regula la expresin gentica en altas densidades celulares se basa en la produccin baja y constante por cada clula de un compuesto difusible llamado autoinductor(Fig. 6 y7).Cuando el nmero de clulas llega a cierto umbral en el que la concentracin del autoinductor es suficientemente elevada, este compuesto interacciona y activa a cierto activador transcripcional que, a su vez, cambia el patrn de expresin gnica(Fig. 6 y7)(24,25,64).En un gran nmero de bacterias gram-negativas los autoinductores son derivados acilados de la lactonas de homoserina.P. aeruginosacontiene ms de un sistema "sensor de quorum"(24,25),dos de estos sistemas denominados Las y Rhl, han sido muy bien caracterizados a nivel molecular y sern los que revisar en este captulo. Sin embargo, recientemente fue reportado mediante el anlisis de la secuencia del genoma de la cepa PAO1 un tercer regulador transcripcional de la familia de los activadores de la respuesta sensora de quorum llamado QscR, que a diferencia de los otros dos sistemas mencionados, tiene un papel negativo en la regulacin de la respuesta sensora de quorum(10).Pseudomonas aeruginosa, al igual que otras bacterias cuenta con mltiples sistemas regulatorios que le permiten modificar la expresin de distintos genes en respuesta de cambios en el medio ambiente. Es ms, se trata de la bacteria con la mayor proporcin de genes que codifican para protenas que son potencialmente reguladores transcripcionales(72).Uno de estos sistemas regulatorios, que tambin est presente en muchas otras bacterias, responde no directamente a las condiciones medio ambientales, sino fundamentalmente a cambios en una poblacin bacteriana, ya que promueve el cambio en la expresin gentica en funcin de la densidad celular. Este sistema regulatorio detecta cundo se ha llegado a una masa crtica de bacterias por lo que se le ha denominado "sensor de quorum"(24,25,64).El mecanismo mediante el cul se regula la expresin gentica en altas densidades celulares se basa en la produccin baja y constante por cada clula de un compuesto difusible llamado autoinductor(Fig. 6 y7).Cuando el nmero de clulas llega a cierto umbral en el que la concentracin del autoinduuctor es suficientemente elevada, este compuesto interacciona y activa a cierto activador transcripcional que, a su vez, cambia el patrn de expresin gnica(Fig. 6 y7)(24,25,64).En un gran nmero de bacterias gram-negativas los autoinductores son derivados acilados de la lactonas de homoserina.P. aeruginosaes la nica bacteria gram-negativa reportada a la fecha que contiene ms de un sistema "sensor de quorum"(24,25).Dos de estos sistemas denominados Las y Rhl, han sido muy bien caracterizados a nivel molecular y sern los que revisar en este captulo. Sin embargo, recientemente detectamos mediante el anlisis de la secuencia del genoma de la cepa PAO1 un tercer regulador transcripcional de la familia de los activadores de la respuesta sensora de quorum. Denominamos PhzR a este tercer regulador por estar ligado a los genesphzencargados de la sntesis de piocianina.Se sabe que los sistemas Las y Rhl participan de una manera central en la expresin de los genes que tienen que ver con la virulencia deP. aeruginosa, a los que me refer en la introduccin de este captulo. Se sabe, tambin, que estos dos sistemas reguladores interaccionan entre si de una manera muy compleja para promover la expresin de los genes involucrados en la patognesis deP. aeruginosa(38,56,57,58)(Animacin 2).El sistema "sensor de quorum" basado en el activador transcripcional LasR promueve la transcripcin de distintas proteasas involucradas en la virulencia de esta bacteria como son las elastasas A y B y la proteasa alcalina, asi como la exotoxina S(51,52)(Animacin 2).El autoinductor con el que interacciona LasR es elN-(3-oxododecanoil)-homoserina lactona, o PAI1, que se sintetiza por la reaccin catalizada por la enzima sintetasa de autoinductor LasI(51,52).Este sistema "sensor de quorum" slo depende de la densidad celuar y no de la composicin del medio de cultivo, por lo que se supone que se expresa siempre que se alcanza una elevada densidad deP. aeruginosa,como sera el caso de cualquier tipo de infeccin.La proteina RhlR promueve la transcripcin de los genesrhlAB(Animacin 2)que codifican para una de las enzimas que producen el biosurfactante ramnolpido(2,51,52).Se ha reportado que otros metabolitos que tambin participan en la virulencia de la bacteria(Animacin 2),como la piocianina(3,13),estn tambin bajo el control del sistema Rhl(2,52)El autoinductor con el que interacciona RhlR es elN-(butanoil)-homoserina lactona, o PAI2 que es producido por la autoinductor sintetasa RhlI. La transcripcin del genrhlRdepende de la activacin por LasR-PAI1, por lo que los dos sistemas "sensor de quorum" forman una cascada regulatoria encabezada por LasR(Animacin 2)(38,56,57,58).El sistema Rhl, a diferencia del sistema Las, slo se expresa en condiciones de limitacin de ciertos nutrimentos, como el fosfato o el nitrgeno, de modo que en un medio rico, an en altas densidades celulares, no se expresan los factores regulados por RhlR(56).An no se conocen los sistemas reguladores que determinan la expresin diferencial del sistema Rhl dependiendo de la disponibilidad de nutrimentos.Virulencia en Plantas e InvertebradosEn un muestreo de cepas deP. aeruginosase determin que el aislamiento clnico PA14 era capaz de infectar a la plantaArabidopsis thaliana, y que utilizaba factores de virulencia comunes para infectar a esta planta y al ratn, que fue el modelo animal usado(61).Asimismo, posteriormente se demostr que la cepa PA14 era capaz de infectar al gusanoCaenorhabditis eleganscausandole una muerte rpida (4 a 24 hrs) en un medio con alta sal, o una muerte lenta (2 a 3 das) en un medio con baja sal (73). Se analiz un grupo de mutantes de la cepa PA14 que ya no eran capaces de matar aC. elegansmediante la infeccin rpida y se encontr que algunas mutantes, como las afectadas en el genmexA(involucrado en los sistemas eflux) y en dos genes sin homlogos conocidos, tenan adems una reduccin significativa en su virulencia en ratones(73).Por otra parte, una mutante en el genphzBque codifica para una enzima en la va de produccin de la piocianina, presenta slo una reduccin del 18% en su virulencia al ratn. Mientras que la mutante en el genhrpM, que codifica para un factor de virulencia en plantas, no disminuye la capacidad de infeccin a estos roedores. En cuanto a los factores involucrados en la infeccin lenta, se han identificado mutantes en diversos reguladores transcripcionales comogacS,lasRymtrR(que regula la expresin del sistema eflux AcrAB/MexAB), que muestran una reduccin en su virulencia en ratones del 50%(73).Estos resultados muestran que algunas cepas deP. aeruginosatiene la capacidad de infectar huespedes tan diversos como son plantas, animales invertebrados y mamferos, y que algunos factores de virulencia participan en todas estas interacciones patognicas, mientras que otros factores slo participan en alguna de ellas. Ya que todas las cepas deP. aeruginosason patgenas para ratones, mientras que slo un grupo de ellas pueden infectarA. thalianay aC. elegans, se puede concluir que dentro de la informacin especie especfica se encuentra codificada la capacidad de causar enfermedad en mamferos y que el resto de interacciones patognicas se debe a informacin slo presente en ciertas clonas.La cepa PA14 resulta un modelo muy interesante en el estudio de la interaccin patognica ya que se ha demostrado que este aislamiento tambin es capaz de infectar a la moscaDrosophila melanogaster, al gusanoGalleria mellonellay al hongoDictyostelium discoideum. Se ha reportado que una mutante en el genlasRde la cepa PA14 tiene una virulencia disminuida en todos los modelos antes mencionados, as como en ratn y en plantas. Esto muestra que la respuesta sensora de quorum juega un papel central en la patogenia deP. aeruginosa.Varios de los modelos eucariotes con los que la cepa PA14 presenta una interaccin patognica presentan un sistema gentico bien definido y en algunos casos, comoC. elegansyD. melanogasterse cuenta ya con la secuencia completa de sus genomas, o parcial en el caso deA.. thaliana. Esto permitir que en un futuro cercano se conozcan los elementos del husped que estn involucrados en la infeccin porP. aeruginosa.Produccin de AlginatoLa inmensa mayora de los aislamientos clnicos o ambientales deP. aeruginosason cepas no mucoides, ya que producen cantidades muy pequeas del exopolisacrido llamado alginato(11).Sin embargo, como mencion antes, en los pulmones de los enfermos de fibrosis qustica se seleccionan muy frecuentemente cepas mucoides, que son el factor principal de morbilidad y mortalidad en estos pacientes(26,27,59).Esta situacin ha promovido el estudio de la produccin de alginato porP. aeruginosa.El alginato es un copolmero lineal con enlaces -1,4 de D-manuronato y su epmero C-5, L-guluronato(Fig. 8).La va de su biosntesis ha sido completamente dilucidada desde hace varios aos(Animacin 3)(44).Asimismo se conocen con gran detalle los mecanismos regulatorios que intervienen en el control de la expresin de este polisacrido(44).Se ha determinado que la causa ms frecuente de la conversin a mucoida de las cepas deP. aeruginosaen los pulmones de los pacientes con fibrosis qustica es la mutacin en el gen que codifica para la proteina MucA, que es un factor anti-sigma(17,33,43,66,84).Veamos lo que esto significa. En bacterias la RNA polimerasa est constituida por varias subunidades, y una de ellas, la subunidad sigma, determina qu genes van a ser transcritos por la enzima. De este modo, los genes del metabolismo general de la bacteria tienen una secuencia caracterstica que los hace ser reconocidos por la RNA polimerasa conteniendo el factor sigma D. Otros genes, como aquellos que se expresan en estrs calrico o en la fase estacionaria de crecimiento son transcrito por la RNA polimerasa con otros factores sigma, llamados alternativos. Los genes que codifican para las enzimas biosintticas de alginato enP. aeruginosason transcritos por la RNA polimerasa asociada con el factor sigma AlgU, o sigma E. En las cepas silvestres deP. aeruginosael factor anti-sigma MucA inactiva al factor sigma AlgU(Fig. 9).En los pulmones de los enfermos de fibrosis qustica se seleccionan mutantesmucAque inactivan a este factor anti-sigma y, por tanto, tienen una alta actividad de AlgU que promueve una alta transcripcin de los genes biosintticos para alginato.Es interesante mencionar que los aislamientos mucoides de enfermos de fibrosis qustica producen muy bajos niveles de proteasas y otros factores de virulencia regulados por el sistema sensor de quorum Las(46),pero producen niveles normales o elevados de ramnolpidos, que se regula por el sistema sensor de quorum Rhl(50).Hasta el momento no se conocen los mecanismos regulatorios que causan este fenmeno.Formacin de BiopelculasCuandoP. aeruginosase adhiere a una superficie, las clulas se diferencian para formar microcolonias cubiertas por una matriz extracelular que eventualmente llegan a constituir una pelcula(12).Las biopelculas tienen una estructura muy compleja, en la que se pueden distinguir canales por los que se intercambian oxgeno y otros sustratos con la fase acuosa(Fig. 3).La matriz extracelular est constituida en parte por alginato(15),pero ste no constituye el material ms abundante. Las bacterias que forman la biopelcula tienen un metabolismo distinto a las celulas que crecen en medios lquidos (llamadas planctnicas), uno de las diferencias ms aparentes es su disminuida sensibilidad a antibiticos y otros agentes txicos(12,48).Se considera que la mayor proporcin de las clulas deP. aeruginosaque viven en el medio ambiente se encuentran formando biopelculas(12).Asimismo, el anlisis microscpico de los pulmones de pacientes con fibrosis qustica muestra queP. aeruginosatambin se encuentra dentro de este tipo de estructuras(38).Recientemente se demostr que el sistema Las "sensor de quorum" tiene un papel central en la formacin de biopelculas, ya que mutantes en el genlasIno producen estas esctructuras, salvo en el caso en el que se adiciona el autoinductor PAI1(16).MotilidadP. aeruginosatiene dos formas de desplazarse, en medios lquidos se desplaza "nadando" mediante un nico flagelo polar(40),mientras que sobre las superficies se mueve, independientemente de la presencia del flagelo, por un mecanismo llamado "twitching" que depende de las fimbrias o pili tipo IV(33),estos dos tipos de desplazamiento estn involucrados en la formacin de biopelculas(76).Por otra parte el anlisis de la secuencia de la cepa PAO1, predice queP. aeruginosa, codifica para un total de cuatro sistemas de quimotaxis y motilidad(72),dos de los que no han sido analizados funcionalmente an.Los genes deP. aeruginosaque codifican para el flagelo y los que regulan su movimiento y que, por tanto, estn involucrados en la quimiotaxis de la bacteria, tienen gran homologa con los deE. coliy otras bacterias gram-negativas. Es interesante, sin embargo, que enP. aeruginosayP. putidaexiste un gen llamadomotR(7)ofleN(14),sin otros homlogos conocidos, que enP. aeruginosaregula el nmero de flagelos(Fig. 10 y11)y la velocidad de nado. Esto es, mutantes en el genmotRtienen mltiples flagelos y se desplazan a mucho mayor velocidad que la cepa silvestre. Al seleccionar mutantes afectadas en la formacin de biopelculas se obtuvieron, entre otras, algunas que tenan inactivado el genmotR(datos no publicados).El desplazamiento tipo "twitching" es caracterstico deP. aeruginosay depende de las fimbrias tipo IV(29),que determinan la adhesin e infeccin de la bacteria a las clulas epiteliales del husped(81).Se han descrito ms de 35 genes involucrados en la biognesis, regulacin y funcionamiento de la fimbria tipo IV deP. aeruginosa(81).Muchos de estos genes tienen homologa con genes involucrados en la secrecin de protenas y la incorporacin de ADN a la clula en distintas bacterias.En interesante mencionar que el activador transcripcional AlgR, que activa los genes para la biosntesis de alginato, tiene un papel central en la expresin de la fimbria tipo IV(80).Asimismo, se encontr que la proteina regulatoria ChpA determina el movimiento twitching, la produccin de alginato y tambin diversos factores regulados por el sistema "sensora de quorum".Esta protena ChpA es un regulador transcripcional que modula la expresin de un sistema multifactorial de transduccin de seales, anlogo, pero ms complejo, que el que regula la quimotaxis en otras bacterias al controlar la rotacin del flagelo(81).Se desconoce el significado fisiolgico de la interaccin regulatoria entre la produccin de alginato, el movimiento twitching, y la respuesta "sensora de quorum".Secrecin de protenasPracticamente todas las bacterias gram-negativas secretan protenas al medio extracelular. Estas exoprotenas tienen que atravesar la envoltura celular compuesta por dos membranas, la membrana plasmtica y la membrana externa. Se han reportado cuatro vas de secrecin de protenas en bacterias gram-negativas, y tres de ellas estn presentes enP. aeruginosa(72,75).En la secrecin tipo I las exoproteinas pasan directamente al medio extracelular sin pasar por el espacio periplsmico. En la translocacin por esta va no participa el pptido seal, sino depende de la presencia de ciertas firmas de amino cidos en la regin carboxilo de las protenas, as como del concurso de algunas protenas accesorias especficas para la translocacin del polipptido a secretar. Los casos mejor estudiados de este tipo de secrecin lo constituyen las proteasas deErwinia chrysanthemiy la -hemolisina deE. coli. EnP. aeruginosala proteasa alcalina codificada por el gen aprA se secreta por esta va; participan en su secrecin las proteinas AprD, AprE, y AprF(75).La va de secrecin tipo II, tambin llamada va de secrecin general, es la responsable de la secrecin de la mayora de las proteinas extracelulares en bacterias gram-negativas, aunqueE. coliySalmonellano la presentan. En esta ruta, la secrecin a travs de la membrana interna depende del sistema Sec, presente en bacterias gram positivas y gram negativas, y del pptido seal en el extremo amino de las protenas que se translocan. Una vez en el espacio periplsmico, las protenas se translocan por un conjunto de 12 a 14 protenas, que enP. aeruginosase denominan Xcp(75)(Animacin 4).Las protenas que se transportan por el sistema Xcp enP. aeruginosason, entre otras, la elastasa, la lipasa, la exotoxina A, las fosfolipasas y la fosfatasa alcalina. Como mencion antes, la transcripcin de los genes que codifican para varias de las protenas que se secretan por esta va est regulada por el sistema "sensor de quorum" que adicionalmente regula a los genesxcp(9).El sistema de secrecin tipo III transloca las proteinas directamente de la bacteria a la clula eucariote, por lo que se encuentra presente en bacterias patgenas de plantas o animales. EnP. aeruginosavarias exotoxinas se translocan a las clulas eucariotes mediante este sistema tipo III(21).Entre estas toxinas se encuentran las exotoxinas S y T que bloquean la transduccin de seales de la clula infectada mediante su actividad de ADP-ribosil-transferasa, as como la exotoxina Y, descrita recientemente, que eleva el Amp cclico, pues tiene actividad de adenilato ciclasa. Las protenas que intervienen en el tipo de secrecin III tienen homologa estructural con proteinas que intervienen en el ensamble del flagelo(21).Produccin de BiosurfactanteUn surfactante es un compuesto tenso-activo, esto es, que tiene propiedades detergentes. El hombre usa una enorme cantidad de surfactantes sintetizados qumicamente en los diversos productos de limpieza que consumimos. Muchsimos seres vivos producen surfactantes para distintos fines, y a estos compuestos se le llama biosurfactantes(23).Los biosurfactantes son importantes, por ejemplo, en nuestros pulmones en donde se produce un surfactante que es fundamental en el intercambio de gases. La bacteriaSerratia liquefasciensproduce un surfactante que le permite a las clulas desplazarse en una superficie(20),mientras que el autoinductor deBacillus subtilises un biosurfactante llamado surfactina(21).La naturaleza qumica de los biosurfactantes es muy variada, hay pptidos polisacridos y glicolpidos, entre otros. Los biosurfactantes tienen un gran potencial biotecnolgico ya que son tan efectivos o ms que los sintetizados qumicamente, pero son totalmente biodegradables y no son txicos(23).P. aeruginosaproduce el biosurfactante ramnolpido como parte de la respuesta dependiente del sensor de quorum RhlR(52).En las condiciones de laboratorio esta bacteria produce dos formas de este glicolpido, una contiene una molcula de ramnosa y la otra tiene dos(Figura 16).No es claro el papel que los ramnolpidos tienen paraP. aeruginosa, se ha postulado, por ejemplo, queP. aeruginosausa estos biosurfactantes para solubilizar sustratos hidrofbicos como el hexadecano(52),sin embargo muchos aislamientos no usan hexadecano como fuente de carbono y todas las cepas producen ramnolpidos. Otras posibilidades seran que estos biosurfactantes participaran en motilidad celular, en la resistencia natural de la bacteria a metales, o como seales de deprivacin de nutrimentos dentro de la respuesta sensora de quorum.Las aplicaciones biotecnolgicas de los ramnolpidos son mltiples(42),pero su principal utilidad es la limpieza de suelos contaminados con hidrocarburos(42)o con metales pesados(45)(Fig. 12 y13).Recientemente se report que los ramnolpidos pueden matar en bajas concentraciones a hongos zoospricos(Animacin 5 yFig. 14,15 y16)(70),que son importantes patgenos de plantas comerciales, de modo que tambin tienen un potencial en el control biolgico de estas plagas.Dentro de mi laboratorio del Instituto de Biotecnologa de la UNAM, hemos reportado la descripcin de la va metablica que interviene en la sntesis de los ramnolpidos(42)(Animacin 6).Conocer esta va nos ha permitido establecer una estrategia para producir ramnolpidos en cepas recombinantes deE. coli(Animacin 7).La ventaja de producir ramnolpidos en esta enterobacteria es que la produccin de metabolitos porP. aeruginosaa nivel industrial est restingida por tratarse de un patgeno oportunista.Produccin de PolihidroxialcanoatosP. aeruginosaalmacena como reserva de carbono, en condiciones de limitacin de nitrgeno, polihidroxialcanoatos (PHA) de 10 a 14 carbonos y, una vez que la bacteria se encuentra en un medio propicio, se degradan mediante la -oxidacin(75).En el laboratorio a mi cargo encontramos que gran parte de los PHA se sintetizan mediante una ramificacin de la va general de la biosntesis de cidos grasos, a nivel de la enzima -cetoacil reductasa (FabG). Tanto los monmeros de PHA como la parte lipdica de los ramnolpidos son sintentizados en su mayor parte por la va general de sntesis de cidos grasos, sin embargo a partir de la reduccin del intermediario cetoacilo-ACP, existe una enzima (RhlG, Animacin 6)que es especfica para la sntesis de PHA y ramnolpidos(4).De este modo, las mutantes en el genrhlGproducen niveles muy bajos de PHA(Fig. 17 y18)y no producen ramnolpidos(4).Los PHA tienen una amplia aplicacin biotecnolgica ya que a partir de ellos se pueden producir plsticos biodegradables.Degradacin de Alcanos de Cadena RamificadaAlgunos hidrocarburos se acumulan en el medio ambiente debido a su baja biodegradabilidad. Este es el caso de los alcanos y alquenos de cadena ramificada, especialmente aquellos con terminaciones en tres metilos o con carbonos cuaternarios(65).Se han reportado cepas deP. aeruginosaque tienen la capacidad de degradar este tipo de compuestos y que, por tanto, son tiles en la limpieza de sitios contaminados con estos compuestos(65).El surfactante de ms amplio uso en pases subdesarrollados es el alquilbenceno sulfonato de cadena ramificada (ABSr), este detergente representa un problema de contaminacin muy serio, ya que se acumula en ros y lagos debido a la baja tasa de degradacin de su cadena lateral. En el laboratorio a mi cargo aislamos de una planta de tratamiento de aguas domesticas e industriales una cepa deP. aeruginosa(W51D) capaz de degradar el ABSr(68).La cepa tipo PAO1 no es capaz de degradar el detergente, sin embargo s degrada el alqueno ramificado citronelol(6)(Fig. 19),que ha sido usado como modelo para estudiar la va de degradacin de hidrocarburos ramificados.La va de degradacin del ABSr en la cepa W51D muestra que este detergente se degrada en parte por la ruta de degradacin del citronelol, que est presente en distintas cepas deP. aeruginosa, pero que la mayor parte del surfactante se degrada por una nueva va catablica(5).En esta nueva va el primer paso es la desulfonacin del surfactante, y posteriormente se degrada completamente la cadena lateral hasta cido benzoico, para finalmente romper el anillo aromtico y ser degradado por el ciclo de los cidos tricarboxlicos(Animacin 8).El grupo de investigacin coordinado por el Maestro Oscar Monroy de la Universidad Metropolitana ha demostrado la utilidad de la cepa W51D en el tratamiento de aguas residuales con un alto contenido de surfactantes del tipo de los alquil bencenos lineales. Como se trata de un tratamiento anerobio, las bacterias no sobreviven ms que en los primeros reactores, evitandose as los problemas de liberar al medio ambiente grandes cantidades de un patgeno potencial.Algunas Consideraciones EvolutivasComo hemos visto,P. aeruginosatiene una extraordinaria capacidad para adaptarse a diversos ambientes y tiene, adems, la particularidad de no presentar una poblacin clonal. Esto es, la poblacin de estas bacterias comparte una gran parte de su genoma a travs de mecanismos de recombinacin. Estas caractersticas plantean una serie de interrogantes acerca de la manera en que esta bacteria ha evolucionado.Uno puede cuestionarse cmo se seleccionan los elementos que participan en la patogenia deP. aeruginosa. Surgen algunas preguntas como: Cmo pueden seleccionarse en el medio ambiente las protenas que son especficas para la infeccin de clulas eucariotes? Tal es el caso del sistema de secrecin de protenas tipo III, las exotoxinas A, T, Y y S y las elastasas. Cul es la presin de seleccin que determina que todas las cepas deP. aeruginosapresenten un sistema regulatorio tan complejo como el sensor de quorum, encargado fundamentalmente de regular la expresin de los elementos involucrados en la virulencia de la bacteria? Acaso la respuesta sensora de quorum representa alguna ventaja selectiva paraP. aeruginosaviviendo en el medio ambiente?Para ejemplificar esta problemtica mencionar el caso de la cepa IGB83 deP. aeruginosa, que aislamos a partir de un coco recolectado en la selva chiapaneca(55).Esta cepa presenta una elevadsima produccin de enzimas hidrolticas y otros factores de virulencia como son los ramnolpidos y la piocianina, regulados por la respuesta sensora de quorum. Es ms, la virulencia de la cepa IGB83, a pesar de ser un aislamiento ambiental, es mucho mayor que la de algunos aislamientos clnicos, como la cepa tipo PAO1.Por otra parte, es tambin difcil entender cmo pueden conservarse las secuencias especie especficas mediante la recombinacin entre cepas aisladas de sitios distantes geograficamente y de ambientes con caractersticas totalmente distintas. Si se analiza, por ejemplo, la secuencia de algunas regiones del genoma de las cepas IGB83 y PAO1 que no codifican para genes esenciales, como el gen que codifica para la lipasa LipA y su regin regulatoria, encontramos que tienen un 99% de identidad, an en la regin no codificante. Asimismo, si comparamos la secuencia del genmotR,rhlGo de los genesrhl, que partcipan en la produccin de ramnolpidos, entre las cepas PAO1, el aislamiento ambiental PG201 y la cepa IGB83, encontramos que en todos los casos las secuencias presentan ms de un 90% de identidad.Es tambin importante entender cules son los mecanismos que determinan los lmites para la recombinacin gentica enP. aeruginosay cules son los mecanismos moleculares que intervienen en el proceso de recombinacin. Preguntarnos, por ejemplo: Cmo se reconocen entre s las cepas deP. aeruginosa? Existe un proceso de recombinacin con bacterias cercanamente relacionadas comoP. fluorescensoP. putida?La informacin especfica de cada clona pareciera no tener un papel importante en la evolucin de esta bacteria, sino ms bien tratarse de informacin accesoria con una importancia coyuntural en determinado nicho ecolgico. Esta conclusin puede obtenerse, precisamente, a partir de la falta de conservacin de estas secuencias entre los aislamientos deP. aeruginosa, as como de su falta de coevolucin con genes esenciales de la bacteria como aquellos que codifican para el RNA ribosomal. El papel de la informacin especfica de cada clona pareciera ser anlogo al que juegan los plsmidos en otras bacterias.P. aeruginosaes pues, una bacteria que coloniza exitosamente una enorme diversidad de nichos, y que mantiene una poblacin con una secuencia genmica comn mediante la recombinacin. Estas caracteristicas poblacionales nos llevan a cuestionar el papel que tienen algunos principios de la teora de la evolucin darwiniana sobre la evolucin de esta bacteria. Cmo podemos explicar el cambio evolutivo de esta bacteria mediante el criterio de seleccin del ms apto, si la recombinacin gentica no permite definir a una clona o individuo?Se puede hablar de deriva gnica en una poblacin en la que no hay barreras geogrficas? Esto es, si los cambios evolutivos se dan cuando, por medio de la seleccin natural, se selecciona al individuo que tiene una mayor capacidad reproductiva en un determinado nicho ecolgico cmo se fijara un cambio gentico, si la informacin se comparte por toda la poblacin?Sin duda el estudio de la gentica molecular deP. aeruginosanos permitir en el futuro cercano contestar algunas de estas preguntas y formular otras, como parte del maravilloso e interminable quehacer cientfico, de modo que vaya creciendo nuestro entendimiento de este, sin duda extraodinario y temido organismo.