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RESUMEN La giardiasis es un padecimiento intestinal provocado por el protozoario
flagelado Giardia duodenalis, tiene distribución mundial y se calculan 2.5
millones de decesos asociados a diarrea y deficiencias nutricionales en niños
de países en vías de desarrollo. Giardia presenta dos estadios en su ciclo de
vida: el quiste, la forma infectante y el trofozoito. La infección se adquiere por
ingesta de agua o comida contaminada o por medio de transmisión directa
fecal-oral. Los síntomas de la giardiasis están caracterizados por episodios
agudos de diarrea, dolor abdominal y flatulencia. Las evacuaciones acuosas
pueden estar intercaladas con periodos de movimientos intestinales normales o
constipación. Si el individuo no es tratado, la sintomatología persiste por meses
y conduce a un problema de mala absorción y disminución de peso por
deficiencia de nutrientes. En niños, las infecciones prolongadas pueden cursar
asintomáticas y provocar retraso en el crecimiento.El tratamiento de giardiasis
se ha efectuado clasicamente con tinidazol, metronidazol, furazolidona y
quinacrina con una eficiencia de menos del 90% y albendazol con una
eficiencia del 10 al 95 %. El albendazol fue introducido en 1982 como un
antihelmintico. El primer reporte exitoso se hizo en 1986. Se han desarrollado
otras drogas para ser utilizadas cuandose presente resistencia del parásito a
los fármacos que se usan al momento. Sin embargo, en nuestro pais las
plantas medicinales juegan un papel importante en la práctica de medicina
tradicional, Euphorbia serpyllifolia se utiliza para reumatismo, afecciones
hepáticas, cólicos renales, dolor estomacal, disentería, gastritis, empacho, bilis,
como purgante, para subir de peso, para el postparto y combinado con las
flores para la vesícula
INTRODUCCION La giardiosis es un padecimiento intestinal con distribución mundial. Se
estima que de 3000 millones de personas que viven en condiciones no
adecuadas en países en vías de desarrollo, el 30% padecen giardiosis, lo que
arroja casi 1000 millones de casos y contribuye a los 2.5 millones de muertes
anuales por enfermedades diarreicas (WHO 1998).
Giardia duodenalis (Giardia intestinalis o G. lamblia) presenta dos
estadios en su ciclo de vida: el quiste, forma infectante y el trofozoito. Los
quistes, resistentes al medio ambiente al ser ingeridos desenquistan --por
efecto del pH ácido del estomago-- a su forma vegetativa, el trofozoito que
se replica en el intestino delgado. Algunos trofozoitos, después de su
exposición a las sales biliares se enquistan y son expulsados en las heces. La
infección se adquiere por ingesta de agua o comida contaminada o por medio
de transmisión directa fecal-oral (Adam 2001).
La giardiosis presenta diversas manifestaciones clínicas. Los individuos
infectados pueden cursar con molestias intestinales ligeras que se resuelven
completamente. También pueden desarrollar síntomas más complejos:
episodios agudos de diarrea, con frecuencia se presenta nausea, dolor
abdominal, flatulencia y disminución de peso; incluso el apetito es normal. Las
evacuaciones pueden estar intercaladas con periodos de movimientos
intestinales normales o constipación. Dichos síntomas pueden prolongarse
hasta siete semanas (Farthing 1993). Los factores que determinan la
variabilidad de los síntomas clínicos no están bien entendidos. La severidad de
la infección puede estar relacionada con factores del individuo como estado de
su sistema inmune, estado nutricional y edad, así como diferencias en
virulencia y patogenicidad de las cepas de Giardia infectantes (Thompson et
al. 1993). Si el individuo no es tratado, la sintomatología persiste por meses y
conduce a un problema de mala absorción y disminución de peso. En niños, las
infecciones pueden cursar asintomáticas y si son prolongadas, provocan
retraso en el crecimiento (Farthing 1993). Los individuos asintomáticos que
sufren esta forma crónica pueden permanecer así por años (Adam 2001).
La mayor incidencia se presenta en niños de uno a 9 años y en adultos
de 25 a 44 años, que corresponden a la población económicamente activa. Las
cifras muestran a aquellos individuos con diagnostico positivo para giardiosis.
Sin embargo muchos casos de giardiosis pueden cursar asintomáticos y tener
un impacto social y epidemiológico más significativo ya que estos individuos
incide en la enfermedad como portadores sanos. Las cifras revelan que, a
pesar de los esfuerzos del Sector Salud por difundir un cambio de hábitos, la
giardiosis ha permanecido por décadas como un padecimiento de alto impacto
en la salud pública en el país.
Tratamiento
En el tratamiento de la giardiosis se han utilizado compuestos como
nitroimidazoles que incluyen metronidazol, tinidazol, ornidazol y secnidazol. Los
efectos adversos de este son; dolor de cabeza, vértigo, nauseas, sabor
metálico, no tan frecuente: pancreatitis, toxicidad en el sistema nervioso
central, neuropatía periférica. Se ha observado que este tipo de compuestos en
ratas y en ratones son agentes carcinogénicos y mutagénicos es por eso que
su uso se ha disminuido para el consumo humano.
Quinacrina. Fueron introducido inicialmente como agentes antimalaricos, en la
segunda guerra mundial, después de la guerra se constituyó un agente
importante contra Giardia lamblia con una eficacia del 90% o más. Sus efectos
adversos son; dolor de cabeza, náuseas, decoloración del pelo y las
membranas mucosas, rara vez psicosis toxica.
Furazolidona. Este tipo de compuestos se han utilizado como agentes
antibacteriales, además se encontró que es un buen agente anti – Giardia,
solamente que su presentación en la cual esta autorizado para el consumo
humano es en suspensión por lo tanto este fármaco solamente esta
diagnosticado para poblaciones pediátricas. Sus efectos secundarios son:
nauseas, vomito, diarrea, orina de color café, es un inhibidor de la enzima
mono amino oxidasa (MAO).
Herbolaria En nuestro país existe una tradición en el uso de las plantas medicinales que
data de la época precolombina. Las evidencias arqueológicas señalan la
relación con las plantas en pinturas, esculturas y cerámicas. El Teotihuacan el
mural de Tepantitla presenta una gran variedad de plantas y remedios de los
que se tenía conocimiento. Por otro lado se representa a Xochipilli, el principe
mexica de las flores sentado en un pedestal que se asemeja a un templo
ornamentado con bajorrelieves de plantas entre las que se puede distinguir a
Psylosybe aztecorum y Turbina corimbosa, Nicotiana tabacum y Heiaia
salicifolia. Finalmente el conocimiento médico guardaba una relación estrecha
con lo sagrado y la religión.
Los conocimientos de nuestros ancestros quedaron registrados por Fray
Bernardino de Sahagún en “Historia de las cosas de la Nueva España
Martín de la Cruz médico indígena quien estudio en el Colegio de Santa Cruz
de Tlatelolco, indico a los dibujantes las formas de las plantas e hizo
anotaciones sobre las enfermedades para las que eran útiles. Juan Badiano
tradujo los manuscritos al latín, el documento se llamó Libellus de Medicinlibus
Indorum herbis o Códice Badiano (Alberti-Manzanares, 2006).
Nuestras poblaciones indígenas actuales, en virtud de su contacto con la
naturaleza han adquirido por tradición amplios conocimientos sobre las
propiedades curativas de las plantas.
Euphorbia serpyllifolia Pers. Chamaesyce serpyllifolia ((Pers.)Small.) Pertenece a la familia Euphorbiaceae, son hierbas anuales rastreras que
alcanzan 25 cm de alto. Poseen tallos delgados a veces rojizos. Las hopjas son
eneralmente pequeñas de 3 a 10 mm de laro por 2 7 mm de ancho. con flores
masculinas o femeninas que se pueden encontrar en la misma planta. Se
desarrolla en suelos con textura franca-arcillosa y lugares soleados. Su
distribución va desde el estado de la Columbia Británica, a Michigan Wisconsin,
Sur de California, Texas y México.
En México las especies de Euphorbia se conocen como hierba de la golondrina
a la que se considera que posee propiedades antisépticas en forma de
cocimiento en tratamiento de heridas o llagas. El látex se emplea para
tratamientos de la piel. La infusión también se consume para tratamientos de
diarrea y controlar hemorreas vaginales. En forma de cataplasma se aplica en
mordeduras de víboras, amigdalitis, erupciones cutáneas (salpullido y ronchas)
y verrugas. Es útil en tratamientos de diarreas y como emético, lactogogo y
catártico (González, et al 2004).
MATERIALES Y METODOS
Derivados del albendazolo extractos de E. serpyllifolia
Evaluación del efecto sobre Citoesqueleto de los trofozoitos.
Trofozoitos.
Concentración inhibitoria 50%
Determinación de Viabilidad con azul de tripan
Microscopía de barrido.
Anticuerpos comerciales anti tubulina y anti actina
Microscopia Confocal
Cultivo de Giardia en medio TYI-S-33 (10% suero bovino) 72 horas.
Determinación de curvas de crecimientoa 24, 48 y 72 h.
/
Diagrama de flujo de la estrategia experimental Se probaron los extractos de E. serpyllifolia o los derivados de albendazol
sobre trofozoitos de G. duodenalis para establecer la IC50. Posteriormente se
trataron los trofozoitos durante 24, 48 y 72 h para establecer los modificaciones
al citoesqueleto a través de microscopia de barrido y microscopia confocal
empleando anticuerpos primarios anti actina y antitubulina seguido de
anticuerpos secundarios unidos a FITC o rodamina.
RESULTADOS Crec imiento ce lu lar . Para establecer el crecimiento celular se sembraron tubos con 1x106 células
por mililitro y por triplicado, se incubaron durante 24, 48 y 72 horas con 10
µg/ml de cada compuesto o el extracto metanolico de E. serpillifolia.
Derivados de Albendazol
Si se compara el crecimiento celular con los derivados de albendazol y los
controles a las 24, 48 y 72 h. Se observa una inhibición en el crecimiento en las
células tratadas con los compuesto estudiados. En el caso del RCB20 dicha
inhibición es considerable en comparación con los controles tanto de vehículo
(DMSO) como células no tratadas a las 72 horas. En el caso del compuesto
JVG9 se observa un inhibición del crecimiento aproximadamente al 50% en
comparación con los controles.
Con el objeto de determinar la inhibición del crecimiento de los compuestos
RCB y JVG a diferentes concentraciones (4, 8 y 12 µg/ml se incubaron
trofozoitos por 72 h a las concentraciones mencionadas. Los datos arrojados
indican que existe una inhibición del crecimiento en los compuestos con una
relación de a mayor concentración mayor inhibición en el crecimiento. En el
caso del compuesto RCB20 con la concentración más baja hay una notable
inhibición del crecimiento celular, en comparación con el vehículo y el control
normal.
En el caso del compuesto JVG9 aunque su efecto fue menor que el del
compuesto RCB hubo una inhibición del crecimiento a una mayor
concentración, En comparación con los controles, en la concentración menor
llega casi a la IC50.
Al aplicar en análisis estadístico unifactorial se observa que existe hay
diferencia significativa entre los grupos tratados con respecto al control y el
vehículo de una probabilidad menor de 0.002, lo que indica que el efecto
encontrado es por el tratamiento y no por el vehículo.
Se hizo una comparación de los compuestos RCB20 y JVG9 con el vehículo.
Se observa la tendencia inhibitoria con los derivados y con el vehículo una
ligera tendencia a la disminución probablemente por que es un compuesto
muy polar.
Con los datos obtenidos se determinó la IC50 de cada compuesto.
La concentración inhibitoria al 50% que se obtuvo de la ecuación es
2.50746X10-1 µMOL para el compuesto JVG9.
La concentración inhibitoria al 50% que se obtuvo de la ecuación de la grafica
es 1.14610X10-1 µMOL para el compuesto RCB20.
Grafica 1. Efecto de los derivados de albendazol sobre el crecimiento de los
trofozoitos de G. duodenalis.
Microscopia electrónica de barrido.
Con el objeto de determinar las modificaciones estructurales
producidas al citoesqueleto de los trofozoitos por los compuestos utilizados se
hizo un análisis de microscopia electrónica de barrido. En trofozoitos de G.
duodenalis en células que no recibieron tratamiento, se pueden observar
intactos la estructura del disco ventral y los flagelos (Figura no mostrada). Las
lcélulas conservan su estructura característica con bordes regulares, presencia
de flagelos y disco suctorio no alterado. El JVG9, que mostró inhibir el
crecimiento en una forma ligeramente menor que el RCB20 indujo un daño
considerable en la estructura general de las células. En la Figura 1 se muestras
imágenes donde los trofozoitos sufrieron un efecto sobre toda la estructura
detectandose perforaciones en el citoplasma y disco vetral (panel A) y
alteraciones en los bordes (panel B). Por otro lado, también en los flagelos en
algunos casos se detectó la retracción o ausencia de ellos (panel C). Un
hallazgo importante fue observar que el compuesto JVG9 in dujo el
enquistamiento en un podentaje bajo en las células (panel D). Los quistes
también se ven deterioradospor este compuesto ya que se ve un
desprendimiento de la pared quística. Por lo tanto el compuesto JVG9 tiene
efecto desestabilizador en toda la estructura celular.
El otro derivado utilizado fue el RCB20 que al comparar las graficas de
crecimiento celular se observa que redujo el crecimiento de forma más eficiente
que el compuesto JVG9. La figura 1 muestra la microscopia electrónica de
barrido, de trofozoitos tratados con este compuesto por 72 h, se observan
daños en el citoplasma, en el disco ventral y en los flagelos y en algunos casos
células redondeadas. Cuando se comparan las imágenes de microscopia
electrónica de barrido, se observa que el vehículo (en comparación de las
células control) solo inhibe el crecimiento de las células por ser un compuesto
muy polar pero no altera ninguna de las estructuras celulares, en comparación
de los compuesto trabajados, el JVG9 y el RCB20, que deterioran la estructura
celular afectando los flagelos y provocando perforaciones en el disco ventral e
irregularidades en la membrana (Fig. 2).
Figura 1. Microscopia electrónica de barrido de trofozoitos tratados con el
compuesto JVG9 por 72 h. Las flechas indican las zonas de daño. La barra
indica la magnificación.
Figura 2. Microscopia electrónica de barrido de trofozoitos tratados con el
compuesto RCB20 por 72 h. Las flechas indican las zonas de daño. La barra
indica la magnificación.
Evaluación biológica del extracto metanolico de Euphorbia serpyllifolia sobre Giardia lamblia
Para la evaluación del extracto metanolico de Euphorbia serpyllifolia
sobre Giardia lamblia se adicionó el extracto a tubos de cultivo del parásito
para observar si el extracto presentaba alguna inhibición sobre el crecimiento
del mis.
El crecimiento del parásito Giardia lamblia en presencia del extracto
metanolico, del vehículo en el que fue disuelto el extracto (DMSO) y una cepa
control a la cual no se le coloco ningún tratamiento. Se observó que el extracto
utilizado presentó una inhibición del crecimiento de las células de Giardia
lamblia, comparado con el crecimiento del control además el vehículo (DMSO)
no afecta el crecimiento del parásito por lo cual podemos asegurar que le
inhibición del crecimiento se debe al extracto metanolico de Euphorbia
serpyllifolia (Grafica 2).
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Grafica 2. Efecto del extracto metanolico sobre el crecimiento de los trofozoitos de G. duodenalis. Determinación de la C.I. 50% del extracto metanolico de Euphorbia
serpyllifolia sobre Giardia lamblia.
Se determinó también la C.I.50% del extracto sobre Giardia lamblia para
lo cual se utilizaron tres concentraciones diferentes del extracto (50, 100 y 200
µg/mL) y se incubaron a 37ºC por 72 horas y se contó el numero de células.
En la grafica 4 se presenta el crecimiento del parásito a diferentes
concentraciones del extracto y comparando con el control (sin tratamiento) se
observa que la C.I.50% se encuentra entre las concentraciones de 100 y 200
µg/mL.
Evaluación del efecto del extracto metanolico de Euphorbia serpyllifolia
sobre los trofozoitos de Giarda lamblia utilizando microscopia electrónica de barrido.
Con el objeto de determinar a nivel de estructura el daño provocado por
los extractos de E. serpyllifolia se realizó microscopía electrónica de barrido de
trofozoitos de Giardia lamblia. En imágenes de trofozoitos no tratados se
pueden observar las células con los bordes enteros y la morfología celular
característica del parásito (Figura no mostrada).
En la Figura 3 se muestra la microscopia de barrido electrónica de barrido
de trofozoitos tratados con extractos de E. serpyllifolia a una concentración de
200 µg/mL. Se observa un daño muy claro ya que el extracto provoca
malformaciones estructurales en el parásito como perforaciones y
desintegración de la célula.
Evaluación del efecto del extracto metanolico de Euphorbia serpyllifolia
sobre los trofozoitos de Giarda lamblia utilizando microscopia confocal Para determinar el posible daño provocado por el extracto de E.
serpyllifolia sobre el citoesqueleto de tubulina se efectuó microscopio confocal
de trofozoitos tratados, fijados, permeabilizados y teñidos con anticuerpo anti
tubulina. La Figura 3 muestra como las células tratadas con el extracto a
comparación del control sufren modificaciones estructurales sobre el
citoesqueleto de tubulina.
Con el objeto de determinar el posible efecto del extracto de E.
serpyllifolia sobre el enquistamiento se indujeron trofozoitos a enquistar y se
administró el extracto a una concetración de 200 µg/mL. Las células se
incubaron a 37°C por 72 h. En la Figura 4, los paneles A y B muestran la
microscopia electrónica barrido de quistes de Giardia lamblia a los cuales no
se les administro el extracto (controles).
Fig 3. Microscopia de trofozoitos de Giardia lamblia tratados con el extracto metanolico de Euphorbia serpyllifolia a una concentración de 200
µg/mL
Fig. 4. Microscopia de barrido de trofozoitos inducidos a enquistamiento
y tratados con el extracto metanólico de Euphorbia serpyllifolia. Panel A :
células control (sin tratar). Panel B: trofozoitos inducidos y tratados a una
concentración de 200 µg/mL.
IMPACTO De acuerdo a los objetivos planteados se alcanzó el 100%. El impacto sobre el
conocimiento de tratamiento de la giardiosis es relevante ya que es necesario
contar con nuevas drogas puesto que en algunos casos hay pacientes que son
multiresistentes a los tratamientos convencionales. Por otro lado, en el caso de
los extractos de Euphorbia serpyllifolia es crítico fundamentar el uso de esta
planta “hierba de la golondrina” como antiparasitario ya que en muchas
poblaciones de nuestro país alejadas de los centros de salud se utiliza para
este fin.
A B