Levaduras nativas para Enología de Mínima Intervención ... · La siguiente etapa de nuestro...

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Organizan:

Programa detallado y resúmenes

Programa

MIERCOLES 19 DE NOVIEMBRE -Anfiteatro Estación Experimental INIA-Las Brujas, Ruta 48

Km. 10. Rincón del Colorado, Canelones

8:30. Registro de participantes

9:00. Bienvenida y presentación de jornadas. Ing. Agr. (MSc) Edgardo Disegna (Viticultura,

Estación Experimental INIA-Las Brujas) y Dr. Eduardo Dellacassa (Laboratorio de

Biotecnología de Aromas, Facultad de Química-UdelaR)

9:30. Genoma Tannat: polifenoles durante el desarrollo del grano de uva. MSc Cecilia Da

Silva y Dra. Carina Gaggero (Departamento Biología Molecular, IIBCE)…………………………pag. 1

9:50. El manejo del viñedo y su efecto en la sanidad de la uva. Lic. Virginia Ferrari

(Viticultura, Estación Experimental INIA-Las Brujas........……………………………………………….pag. 2

10:10. El balance del Tannat en el sur de Uruguay. Ing. Agr. Andres Coniberti (Viticultura,

Estación Experimental INIA-Las Brujas).………………………………………………………………………..pag. 3

10:35. Descanso para el café

11:05. Evaluación y selección de clones de Tannat. Ing. Agr. (MSc) Edgardo Disegna

(Viticultura, Estación Experimental INIA-Las Brujas)…….....………………………………………….pag. 4

11:40. Principios y práctica de la poda reducida. Dr. Alan Lakso y Dr. Terry Bates

(Horticultural Section, Plant Science, Cornell University, USA)…………………………………….pag. 6

12:30. Lunch y Degustación de vinos de Wines of Uruguay. Vinos Blancos

JUEVES 20 DE NOVIEMBRE -Salón Píriz McColl- Facultad de Química, Gral. Flores

2124 en el edificio del Instituto de Química.

14:00. Presentación de la jornada de Enología. Dr. Francisco Carrau (Sección Enología,

Facultad de Química-UdelaR)

14:20. Aplicaciones de un método rápido para la determinación de madurez aromática.

Dr. Eduardo Boido (Sección Enología, Facultad de Química-UdelaR)………………….……..pag. 7

14:40. ¿Saccharomyces o no-Saccharomyces? Biodiversidad para incrementar complejidad.

Dr. Francisco Carrau (Sección Enología, Facultad de Química-UdelaR)………….…………..pag. 8

15:00. Levaduras comerciales y demanda de nitrógeno. Dra. Laura Fariña (Sección Enología,

Facultad de Química-UdelaR)…………………………………………………………………………………….pag. 9

15:20. Control y huella microbiológica en los vinos. Dr. Albert Mas (Facultad de Enología,

Universidad Rovira i Virgili, Tarragona España)………………………….………………………………pag. 10

16:00. Descanso para el café

16:20. ¿Podemos evitar la pérdida de color con levaduras? Dra. Karina Medina (Sección

Enología, Facultad de Química-UdelaR)…………………………………………………………….………pag. 12

16:40. Aplicación de levadura Hanseniaspora vineae para vinificación en blanco y tinto.

MSc Valentina Martin (Sección Enología, Facultad de Química-UdelaR y Universidad Rovira i

Virgili, Tarragona)………………………………………………………………………………………………………pag. 13

17:00. Aquibrett: método simple para detectar Brettanomyces en bodega. MSc. Gabriel

Perez (Sección Enología, Facultad de Química-UdelaR)…………………………………….………pag. 14

17:20. "Novedades en la caracterización y trazabilidad de los taninos enológicos" y "Tioles

varietales provenientes de los taninos de la uva. Nuevas opciones enológicas"

Dr. Giorgio Nicolini y Dr. Roberto Larcher (Centro Trasferimento Tecnologico. Fondazione

Edmund Mach di Institute San Michele all'Adige San Michele all Adige, Italia……….pag 16- 17

18.00. Cierre del evento con degustación vinos WOU.

Jornadas de difusión de resultados y propuestas de líneas futuras de investigación vitivinícola.

19 y 20 de noviembre de 2014

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Genoma Tannat: polifenoles durante el desarrollo del grano de uva.

MSc Cecilia Da Silva y Dra. Carina Gaggero

Departamento Biología Molecular, IIBCE

Hoy en día Tannat (Vitis vinifera cv. Tannat) es la variedad de uva vinífera más plantada en

Uruguay, constituyendo los viñedos más extensos del mundo. Posee el mayor contenido de

polifenoles y alto poder antioxidante, lo que otorga a sus vinos características particulares: color

intenso y gran estructura en boca. Por esto la industria vitivinícola uruguaya ha establecido una

estrategia para producir vinos finos Tannat utilizando tecnologías vitícolas y enológicas

avanzadas.

En nuestro primer estudio genético en Tannat (Gonzalez-Techera et al. 2004) investigamos

polimorfismos de microsatélites en diferentes clones de Tannat, y descubrimos que es altamente

homocigota. Históricamente, Tannat era la variedad dominante y casi exclusiva del suroeste de

Francia. Es posible que este aislamiento geográfico haya resultado en un proceso de auto-

fertilización natural que explicaría el alto grado de homocigosis observado. Característica innata

de Tannat que facilitó la secuenciación de su genoma.

Recientemente en colaboración con la Universidad de Verona publicamos el genoma de Tannat

en la prestigiosa revista The Plant Cell (Da Silva et al. 2013), siendo la tapa de la edición de

Diciembre del 2013. Aquí investigamos las bases genéticas de las principales características de

los vinos Tannat mediante la secuenciación del genoma del clon uruguayo UY11, utilizando la

tecnología Illumina. Por medio de la secuenciación de ARNs provenientes de uvas en etapas

anteriores al envero, encontramos 5.901 genes no identificados en vid y descubrimos 1.873

genes que Tannat no comparte con el genoma de Pinot Noir (primer y único genoma de vid

secuenciado junto a Tannat hasta el día de hoy). También mostramos que estos genes específicos

de Tannat contribuyen sustancialmente a la expresión general de las enzimas implicadas en la

biosíntesis de polifenoles, los cuales contribuyen a las características fenotípicas únicas de las

uvas Tannat. La caracterización del genoma del Tannat nos mostró que el genoma publicado de

Pinot Noir carece de muchos genes que son importantes para el fenotipo de cada variedad.

La siguiente etapa de nuestro proyecto es secuenciar ARNs provenientes de uvas en etapas de

crecimiento posteriores al envero, para así poder caracterizar genes específicos de Tannat que se

expresan en estas etapas más tardías de la maduración de la uva. Con estos resultados podremos

terminar de determinar los genes claves que diferencian a Tannat de las demás variedades.

Como objetivos futuro esta realizar este mismo estudio en diferentes zonas vitivinícolas del

Uruguay, para poder determinar el efecto que tiene el ambiente (suelto, clima, etc) en la

expresión de genes relacionados a la biosíntesis de polifenoles y por ende en la cálida de las

uvas y vinos Tannat. Con estos conocimientos podríamos predecir características de los vinos

Tannat según la región de plantación.

Conocer detalladamente el genoma y transcriptoma de nuestra variedad insignia nos otorga, en

un futuro no muy lejano, la posibilidad de realizar mejoramientos de esta vid guiados por

métodos modernos que no involucran transgénicos, como por ejemplo la edición genómica.



Página 2

El manejo del viñedo y su efecto en la sanidad de la uva

Virginia Ferrari*, Andrés Coniberti***, Eduardo Dellacassa**, Edgardo Disegna***

* Bqca. Programa Nacional de Investigación en Producción Frutícola, INIA Las Brujas

** Dr. Laboratorio de Biotecnología de Aromas, Facultad de Química-UdelaR *** Ing. Agr. Programa Nacional de Investigación en Producción Frutícola, INIA Las Brujas

El mercado mundial de vinos en los últimos años atraviesa por un proceso de cambio estructural

caracterizado por exigencias en la calidad e inocuidad de los productos, acompañado de fuertes

reglamentaciones que contemplan estos aspectos. Uruguay, como país productor de vinos, debe

adaptarse a estas exigencias y normativas; para diferenciarse en la oferta de productos,

apuntando a un mayor valor agregado y al acceso de nuevos nichos comerciales.

Bajo este punto de vista el vino, además de ser agradable a la vista y paladar de quién lo

consume, deberá ser inocuo. Esto implica que el mismo sea el resultado de procesos de

producción y control en todos los eslabones de la cadena productiva-industrial atendiendo a la

seguridad alimentaria, en particular a la calidad sanitaria de las uvas ya que de ellas depende la

inocuidad del vino.

En nuestras condiciones climáticas las principales enfermedades que afectan a las uvas son

provocadas por hongos. Como resultado de la infección de ciertas especies pueden aparecer

compuestos tóxicos en los vinos, principalmente fumonisinas y ocratoxina A (OTA), cuya

ingesta crónica puede causar daños a la salud humana.

Para obtener datos nacionales sobre estos aspectos, se realizó un estudio sobre la

biodiversidad de especies fúngicas durante las vendimias 2007-2008-2010 en 22 predios

comerciales de la variedad Tannat en la región sur del Uruguay. Como consecuencia de la

aplicación de un sistema HACCP se determinaron los riesgos existentes y los principales

factores que influyen en el estado sanitario de las uvas y la inocuidad de los vinos. Para ello se

analizaron las características climáticas, culturales y vegetativas de cada viñedo, y la

composición química de las uvas, mostos y vinos producidos.

Los resultados indicaron que la contaminación fúngica fue mayor en la temporada 2006/2007, y

si bien existe correlación con la ocurrencia de lluvias 30 días previos a la cosecha, esta no fue

estadísticamente significativa. Los géneros mayoritariamente encontrados fueron: Alternaria,

Fusarium, Penicillium, Botrytis, Aspergillus y Epicoccum; y en menor medida: Rhizopus,

Cladosporium y Trichoderma. Las cepas de Aspergillus y Botrytis fueron las que presentaron

mayor riesgo por los graves daños que causa su ataque. Los factores que mostraron mayor

incidencia sobre la presencia de estas especies, fueron la altura del plano de poda y la

compactación de la canopia.

Las correlaciones se comprobaron bajo condiciones experimentales en la Estación Experimental

W. F. Aldunate (INIA Las Brujas), y se confirmó que el microclima al que estuvieron expuestos

los racimos y el vigor de las plantas son factores determinantes en el grado de infestación y la

presencia de OTA en los vinos.

Si bien en ninguno de los vinos producidos se determinaron valores superiores al límite

reglamentario de 2g/l de OTA, la presencia constatada de cepas productoras y potencialmente

productoras en los viñedos y el cambio climático, predisponen a aumentar el riesgo. Por este

motivo la aplicación de prácticas de manejo en los viñedos son recomendables para reducir la

presencia y desarrollo de B. cinerea y Aspergillus spp., obteniendo uvas sanas, de calidad

enológica y vinos con bajo riesgo de contenido de OTA.



Página 3

El balance del Tannat en el sur de Uruguay

Andrés Coniberti, Edgardo Disegna*, * Virginia Ferrari** * Ing. Agr. Programa Nacional de Investigación en Producción Frutícola, INIA Las Brujas ** Bqca. Programa Nacional de Investigación en Producción Frutícola, INIA Las Brujas

Es reconocida por técnicos y productores la relevancia que tiene el alcanzar en el viñedo, un

adecuado equilibrio hoja/fruta cuando se pretende optimizar nuestra ecuación de

rendimiento/calidad. Aunque menos tomado en cuenta, un adecuado equilibrio hoja

expuesta/hoja total es igualmente relevante a la hora de conseguir maximizar la

productividad/calidad de un viñedo. Si bien es extensa la información producida en las últimas

décadas sobre esta temática, desde el punto de vista práctico el equilibrio del viñedo no es

posible definirlo en forma universal. Por esta razón este trabajo tuvo como objetivo producir

información que permita orientar a los viticultores locales a responderse algunas preguntas

simples: ¿Mi viñedo está equilibrado?¿Está mi viñedo en su potencial productivo?¿A qué nivel

de producción debo ajustar mi viñedo si pretendo maximizar su potencial de calidad?¿Cómo

logro equilibrar mi viñedo?



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Clones de Tannat en Uruguay

Edgardo Disegna*, Andrés Coniberti,* Virginia Ferrari** * Ing. Agr. Programa Nacional de Investigación en Producción Frutícola, INIA Las Brujas ** Bqca. Programa Nacional de Investigación en Producción Frutícola, INIA Las Brujas

La industria vitivinícola uruguaya ha adoptado a la variedad Tannat para la producción de vinos

que la identifiquen a nivel mundial. Introducida al país a fines del siglo diecinueve, ha sido

acogida por gran parte del sector, ocupando en la actualidad casi el 25% de la superficie total de

viñedos. En un proceso de replantación primeramente con plantas de selección masal,

proseguido por la introducción al país de materiales certificados libres de virus seleccionados en

Francia, el clon 398 se consolidó como el más cultivado, sin la existencia previa de ensayos de

campo ni estudios de sus atributos cualitativos. Según estimaciones, este clon representaría más

del 50% de las plantaciones de Tannat del país. Existen escasos reportes bibliográficos sobre el

comportamiento de los clones de Tannat disponibles a nivel comercial. Al ser esta variedad

raramente cultivada a nivel mundial y estando circunscripta su plantación a una región de

Francia y al Uruguay, el comportamiento de Tannat y sus clones no ha sido estudiado en

profundidad en distintas situaciones productivas.

En este contexto se inicia un proyecto conjunto entre el Instituto Nacional de Investigación

Agropecuaria (INIA) y el Instituto Nacional de Vitivinicultura (INAVI), en el año 2002 que

incluye 2 líneas de investigación:

A) Estudio del comportamiento cualitativo y productivo de los principales clones comerciales

en las condiciones agro-climáticas del Uruguay. Se comienza un ensayo en la Estación

Experimental INIA Las Brujas en que se comparan los clones ENTAV-INRA: 398, 399, 472,

474, 475, 717, 794 y 944, injertados sobre SO4. Las evaluaciones fueron realizadas a partir de

que las plantas alcanzaron su estado adulto (primera cosecha comercial) durante el período

2005-2010.

B) Paralelamente, y con la recomendación del sector acerca de las ventajas comerciales que

podría significar el exportar vinos producidos con un clon uruguayo, INIA e INAVI comienzan

un programa de selección de plantas candidatas a cabeza de clon, en acuerdo a los protocolos

europeos, partiendo de antiguos viñedos (mayores a 50 años) existentes en distintas zonas del

país. El proceso de selección comienza a realizarse durante las temporadas 2002 – 2003.

Cumplida la etapa de preselección las plantas candidatas fueron analizadas por serología y por

indicadoras leñosas para las principales virosis. En paralelo y una vez extraído el ADN de las

plantas candidatas, se realizaron estudios moleculares a través de la técnica de AFLP (Amplified

Fragment Length Polymorphism) en el Laboratorio de Biotecnología de INIA Las Brujas, a los

efectos de evaluar la posible existencia de diferencias genéticas entre los individuos

seleccionados. Las primeras plantaciones a campo de los materiales preseleccionados se realizan

en el año 2006. Las evaluaciones abarcan el período 2009 – 2014.

Del estudio comparativo de clones comerciales de origen francés podemos concluir que en el

período en estudio, los clones 717 y 474 mostraron un excelente comportamiento, expresado por

su grado alcohólico, contenido de antocianos y atributos sensoriales de sus vinos. Estos clones

se manifiestan como más precoces y por su comportamiento y performance cualitativa deberían

ser considerados para plantaciones destinadas a la producción de vinos de alta gama en el país.

Si bien algunos clones mostraron diferencias estadísticamente significativas en productividad,

los rendimientos relativos entre el más (475, 398 y 399)y menos productivo 474 cuando las

plantas no fueron raleadas fue del orden del 10%.

En relación a la selección de clones uruguayos los avances logrados nos permiten concluir que:

a) de acuerdo a los análisis moleculares, muchos de los materiales en estudio podrían ser

considerados diferentes a los clones importados y comercialmente disponibles en el país. b)

Asimismo, se destacan por sus características productivas y cualitativas la potencialidad de al

menos 14 clones uruguayos (2, 18, 20, 21, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 36, 37). Cabe resaltar

que muchos de estos comparten altos niveles de producción de azúcares expresados como GAP

y color aún con altos rendimientos.



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En función de los objetivos comerciales deberían ser probados en comparación con los que

mostraron mejor performance dentro de los originarios de Francia (717 y 474) en distintos

predios del país.



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Alan Lakso

School of Integrative Plant Science Horticulture Section, Cornell University, College of

Agriculture and Life Sciences.

Cornell University College of Agriculture and Life Sciences

Research Focus

My area of research is integrative plant and crop physiology, primarily on fruit crops. I

investigate the individual physiological bases of specific processes such as the regulation of sink

activity in the grape berry, carbon partitioning as related to developmental stage, temperature,

water availability and light microclimate. I try, however, to also emphasize how these individual

processes are integrated in the whole plant and what the grower can do to influence such

processes to improve plant productivity, especially under field conditions. As indicated by our

increasing use of dynamic simulation modeling, I feel that we will need more and more

integrative physiology to understand plant responses to the environment and cultural treatments,

to improve our management and culture, and to attack increasingly complex problems such as

global climate change and environmental compatibility through IPM and sustainable

approaches. I have a new emphasis on application and integration of new micro-engineering,

remote sensing, information technologies to problems of agriculture

Outreach and Extension Focus

My approach to extension and outreach reflects my research on understanding the principles of

fruit crop behavior in relationship to the environment and cultural practices. I feel that for

complex issues such as growing fruit crops in NY, recipe approaches are dangerous as each year

presents new challenges that can only be handled by knowledge of a complex system and how it

behaves. I extend this approach and information at different levels and in different formats. For

fruit growers, the focus is on understanding the principles of crop behavior so they can adjust

appropriately each year or location. For school children the message is simpler but also focused

on how plants behave.

Teaching Focus

I teach an Advanced Viticulture Senior/Grad course and lead and co-teach a Grapevine Biology

junior/senior course. These are upper division classes so a primary learning outcome is the

ability to synthesize substantial amount of factual information about grapevines and their

culture to critically assess complex issues in grapevine physiology and culture. This requires

creative thinking and the use of multiple hypotheses or explanations to elucidate the many

complex interactions of plant, environment and culture. Examples are climate change, dealing

with site and plant variability, and regulation of growth and wine quality by water relations.

http://plantscience.cals.cornell.edu/

http://hort.cals.cornell.edu/

http://www.cornell.edu/

http://cals.cornell.edu/



Página 7

Aplicaciones de un método rápido para la determinación de madurez aromática

E. Boido

1, L. Fariña

1, D. Cozzolino

2, F. Carrau

1, E. Dellacassa

1

1Sección Enología, Facultad de Química, UdelaR, Uruguay.

2The Australian Wine Research

Institute, Australia.

El aroma del vino depende de numerosos factores como son la variedad de uva, proceso de

vinificación y crianza, siendo los metabolitos secundarios de la uva los responsables del carácter

varietal de los vinos. Algunos de estos metabolitos, que se presentan glicosilados en las uvas,

pueden ser hidrolizados durante la vinificación produciendo compuestos aromáticos. Para uvas

no aromáticas como el Tannat, una importante fuente de aromas en el vino luego de la crianza

son los precursores glicosilados, siendo importantes para esta variedad los norisoprenoides. Por

lo tanto, el contenido de compuestos aromáticos glicosilados es un parámetro necesario para

poder clasificar la fruta según su calidad, así como además para determinar el momento óptimo

de cosecha dependiendo de la vinificación objetivo. Es por esto que resulta relevante disponer

de técnicas rápidas para su determinación, útiles para el enólogo, ya que los métodos

tradicionales utilizados para su análisis requieren de etapas de extracción, hidrólisis, y posterior

separación de los compuestos por cromatografía gaseosa, consumiendo tiempos importantes de

análisis.

La espectroscopía en infrarrojo cercano (NIR) es una técnica rápida, no destructiva, que

requiere cantidades y preparación mínima de la muestra. Su aplicación cuantitativa se basa en la

correlación entre la composición de la muestra y la absorción de luz en infrarrojo cercano,

permitiendo la calibración usando técnicas quimiométricas Los modelos lineales, como la

regresión por mínimos cuadrados parciales (PLS), son los más utilizados. Sin embargo, los

modelos no lineales como las redes neuronales (RNs) presentan ventajas.

En este trabajo se utilizaron las técnicas de NIR-PLS y NIR-RNs para la cuantificación de

compuestos aromáticos glicosilados, particularmente norisoprenoides, en uvas Tannat. Para esto

se realizó la calibración de los espectros NIR con la concentración de los compuestos,

determinados por GC-MS, presentes en uvas en diferentes zonas y etapas de madurez. Los

resultados obtenidos demuestran que es posible utilizar estas técnicas rápidas para

cuantificación de norisoprenoides en uvas, presentando los mejores resultados la calibración

con RNs utilizando un modelo de perceptrón multicapa con dos capas ocultas y como método

de aprendizaje un algoritmo de gradiente descendiente.

Esta calibración obtenida es validada con muestras de uvas de tres cosechas, y es posible

utilizarla con equipos NIR para obtener en forma rápida la concentración de norisoprenoides en

uvas Tannat (error cuadrático medio 270 µg/L).



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¿Saccharomyces o no-Saccharomyces? Biodiversidad para incrementar complejidad sensorial.

Facundo Giorello

1; Valentina

Martin

1, Laura Fariña

1, Eduardo Boido

1, Karina Medina

1, Eduardo

Dellacassa1.Luisa Berna

2; Pablo S. Aguilar

2; Carina Gaggero

3; Francisco Carrau

1

1Sección Enología, Facultad de Química, Universidad de la República, 11800, Montevideo, Uruguay.

2Laboratorio de Biología Celular de Membranas, Institut Pasteur de Montevideo,

11400 Montevideo, Uruguay. 3Departamento de Biologia Molecular, Instituto de Investigaciones

Biológicas Clemente Estable (IIBCE), 11600 Montevideo, Uruguay.

Saccharomyces cerevisiae, la levadura ampliamente utilizada para la cerveza, el pan, la sidra y

la producción de vino, es la especie utilizada casi exclusivamente en estas industrias. Cada vez

con mayor frecuencia se considera el uso de nuevas cepas de levadura para la elaboración del

vino como una forma de mejorar la calidad y proporcionar variación, incluyendo diferencias

sutiles en los vinos finos. Por otra parte, las fermentaciones espontáneas se asocian con la

producción de mayor cuerpo del vino, aromas y sabores inusuales, textura cremosa y una mayor

complejidad. Por lo que es previsible que el trabajo de selección de diversidad en levaduras

nativas ofrezca oportunidades innovadoras para mejorar el aroma y sabor, incrementando la

diferenciación de los vinos en un mercado cada vez más competitivo. En este sentido, se

propone lo que llamamos: la estrategia de búsqueda de nuevos fenotipos del sabor en la flora

nativa proveniente de uvas. Metodológicamente la integración de conocimientos sobre análisis

sensorial y biodiversidad natural de cepas no-Saccharomyces abre la oportunidad de lograr

nuevas cepas de aplicación enológica a nivel industrial. Más de 800 cepas de no-Saccharomyces

se aislaron del medio ambiente de uvas y vinos de Uruguay en los últimos 5 años. De esta

colección en primera instancia se seleccionaron cepas de Hanseniaspora vineae y

Metschnikowia pulcherrima para estudiar estrategias de fermentaciones secuenciales con y sin

la presencia de una cepa de Saccharomyces comercial. Sobre la base de los parámetros de

elaboración del vino, la formación de compuestos volátiles y no volátiles discriminantes y el

análisis sensorial, fue posible definir un perfil metabólico y rasgos sensoriales específicos para

cada cepa. En general, la estrategia de co-fermentación con estas cepas ha proporcionado

aumentos significativos en glicerol y acetatos, con disminuciones relativas de alcoholes, ácidos

grasos, y aminas biógenas.

Con el fin de comprender la base genética de los fenotipos "aroma y gusto" se secuenciaron dos

cepas diferentes de H. vineae. A pesar de la gran cantidad de secuencias divergentes entre H.

vineae y S. cerevisiae industriales a nivel de vías metabólicas de fermentación, 68% de estos

genes se encontraron en H. vineae. Curiosamente, se discuten las grandes divergencias en los

genes relacionados con el metabolismo de compuestos aromáticos. Por ejemplo, el gen asociado

con la biosíntesis de los acetatos en Saccharomyces (ATF2) en H. vineae está presente pero con

un alto % de divergencia genética. Por otro lado, H. vineae presenta 4 genes nuevos para la

formación de estos esteres (AAT) lo que también puede explicar el incremento de estos

compuestos en vinos producidos con esta especie. Los genes implicados en la regulación de los

alcoholes superiores (ARO8 y ARO9) se presentaron en más de 3 copias en comparación con

copias únicas en S. cerevisiae. Estos genes también pueden tener un impacto clave en la

diferente calidad sensorial de vinos elaborados con esta especie y con cepas comerciales. Una

de estas cepas seleccionadas, H. vineae 025A, ha comenzado a ser producida a nivel industrial

por Lage y Cia en Uruguay, siendo la primer cepa comercial de esta especie en el mundo. En los

ensayos que se han realizado con esta cepa desde el 2008, se han obtenido vinos de alta calidad

ya a nivel comercial en blancos varietales como Chardonnay y Petit Manseng fermentados en

barricas, o variedades neutras como Ugni Blanc o Macabeo en tanque, resultando en vinos de

mucha más complejidad sensorial que con cepas de Saccharomyces comerciales.



Página 9

Sistema de clasificación de levaduras aptas para vinificación de acuerdo a su capacidad de administrar nitrógeno

L. Fariña

(1), M. Urruty

(1), E. Boido

(1), K. Medina

(1), E. Dellacassa

(2), F.

Carrau

(1)

(1) Sección Enología, Departamento de Ciencia y Tecnología de los Alimentos, Facultad de

Química, (2)

Cátedra de Farmacognosia y productos Naturales, Departamento de Química Organica, facultad de Química.

,

El aroma del vino es la sumatoria de un gran número de compuestos volátiles que provienen de

diversos orígenes. Entre estos se encuentran los denominados aromas fermentativos, que se

originan a partir del metabolismo secundario de Saccharomyces cerevisiae. Este metabolismo es

afectado por la cepa de levadura utilizada y por los distintos factores del medio en el cual se

desarrolla como temperatura, pH y nivel de nitrógeno asimilable (FAN). Este último factor

resulta determinante en la expresión metabólica de las levaduras y la producción de metabolitos

secundarios con impacto en el aroma final del vino. La adición de amonio se ha transformado en

una operación sistemática de muchos enólogos con el fin de evitar complicaciones debidas a la

falta de nitrógeno en el mosto que trae como consecuencia la formación de compuestos

aromáticos responsables de defectos y/o fermentaciones lentas. Por otro lado, esta adición

provoca la modificación del perfil de aminoácidos natural de la variedad de uva utilizada,

afectando la tipicidad aromática varietal. Además actualmente se trata de evitar la adición en

exceso de sales de amonio para prevenir el riesgo de producción de etilcarbamatos e histamina,

que pueden resultar nocivos para la salud del consumidor o aumentando los niveles de FAN

residual en el vino terminado lo que arriesga la estabilidad microbiológica posterior del vino en

la crianza en barricas o botellas.

De acuerdo con trabajos previos realizados por nuestro grupo se diseñó un modelo en el cual se

plantea la existencia de levaduras con distinta capacidad de administrar nitrógeno en base a los

compuestos volátiles generados en un medio de cultivo químicamente definido. Las cepas

“buenas administradoras de nitrógeno” (BAN) producen vinos con aromas agradables a bajas

concentraciones de nitrógeno debido a la mayor producción de esteres y ácidos grasos de

cadena media, mientras que las cepas “malas administradoras de nitrógeno” (MAN) producen

vinos con aromas poco agradables debido al aumento de la producción de aromas asociados a

los alcoholes superiores, los isoacidos y algunos compuestos azufrados.

En este trabajo se realizó una clasificación de cepas de levaduras comerciales y nativas (con

potencial uso industrial) de acuerdo a su capacidad de administrar nitrógeno utilizando como

referencias las cepas M522 (MAN) y la cepa KU1 (BAN). Las cepas estudiadas se fermentaron

en símil vino químicamente definido utilizando fermentadores y válvulas estandarizadas de

manera que el método de clasificación sea universal mediante la aplicación de un protocolo

definido. Las fermentaciones se realizaron a 20ºC y su avance se monitoreó mediante

desprendimiento de CO2. Una vez finalizada la fermentación para cada una de las cepas

estudiadas, se realizó la extracción en fase solida de componentes volátiles. Los extractos se

concentraron e inyectaron en un cromatógrafo con detector de masa (GC-MS). Se cuantificaron

33 compuestos volátiles que se agruparon en: alcoholes, esteres etílicos y acetatos, ácidos

grasos, isoácidos, lactonas y miscellaneos. Se realizó un análisis de componentes principales

logrando disminuir el número de variables a 2 componentes principales, de esta forma se obtuvo

la agrupación alrededor de las dos cepas del modelo M522 y la KU1 que permitió caracterizar

dos grupos de cepas (MAN y BAN). Se observó que la mayor diferencia entre las cepas de

referencia se encuentra en el componente principal 1 siendo los compuestos más significativos:

1-butanol, ácido butanoico, acetato de propilo, ácido hexanóico y ácido octanóico.



Página 10

Control y huella microbiológica en vinos

Dr. Albert Mas Depto. Bioquímica y Biotecnología. Facultad de Enología. Universitat Rovira y Virgili.

Tarragona, España.

En los últimos años, las preferencias de los consumidores se han orientado hacia distintas

características regionales (vinos de terroir ), así como para los vinos elaborados mediante

procedimientos naturales y orgánicos. Estas tendencias se reflejan en el aumento en la

producción de vinos de agricultura ecológica o biodinámica, el aumento de la comercialización

de los vinos obtenidos sin adición de inóculos comerciales, el cambio en el mercado

internacional de vinos de mesa hacia vinos de calidad superior. Esto plantea una oportunidad

para que los países productores potencien los vinos que corresponden a terruños peculiares que

junto a antiguas tradiciones puedan producir nuevos vinos de calidad ultra-premium con

sistemas de producción “naturales”. El uso de levaduras Saccharomyces y no- Saccharomyces

indígenas puede ofrecer un gran potencial para abordar los aspectos críticos mencionados con

técnicas actuales de vinificación.

Las levaduras forman el núcleo de la elaboración del vino. Las levaduras llevan a término la

fermentación alcohólica, pero también tienen un papel destacado en la calidad del vino. La

actividad de diferentes especies de levaduras y/o cepas se refleja en diversos perfiles

organolépticos de los vinos lo que añade complejidad y riqueza organoléptica al vino.

Actualmente, los productores de todo el mundo utilizan inóculos comerciales de Saccharomyces

cerevisiae para asegurar una fermentación predecible, reproducible y controlada. Sin embargo,

el uso generalizado de cultivos iniciadores eliminan los efectos que la microbiota nativa podría

incorporar, resultando vinos con propiedades analíticas y sensoriales semejantes, privándolos

de la variabilidad, la complejidad y personalidad que definen la tipicidad de un vino. El uso de

levaduras autóctonas o indígenas es una herramienta para defender la tipicidad. Las levaduras

Saccharomyces asegurarían la fermentación y la evolución de las propiedades sensoriales típicas

de vino de una región determinada se complementaría con el uso de las levaduras No-

Saccharomyces. La alternativa que se está utilizando en la actualidad en algunos casos, la

ausencia de inóculos, implica grandes riesgos y, sobre todo un aspecto fundamental: la pérdida

del control por parte del enólogo. No es posible controlar la microbiota autóctona y, por lo tanto,

el vino final puede sufrir graves alteraciones que lo hagan poco aceptable para el mercado.

La adición de los iniciadores de fermentación industriales puede entrar en conflicto con las

necesidades de los vinos que se producen bajo las prácticas más naturales y orgánicos. Aunque

el establecimiento de normas específicas en la fase de elaboración del vino es todavía objeto de

debate, se espera que la producción de vino orgánico se someta a limitaciones específicas. En

este sentido, es muy probable que se deba indicar en las etiquetas menciones específicas (por

ejemplo, “obtenidos sin la adición de levadura comercial” o “producido con las levaduras

indígenas”), como se anticipó en la organización común del mercado del vino orgánico. El uso

de levaduras autóctonas es una de las prácticas que se observa con mayor interés por parte de

los organismos reguladores.

Cada vez más hay una necesidad de aislar levaduras indígenas enológicamente competentes

para ser utilizadas como inóculos para la producción de vinos convencionales o ecológicos, pero

para lograr este objetivo se requiere una evaluación enológica de los aislados naturales. El

concepto de explotar levaduras autóctonas no es nuevo. Hace ya muchos años que diferentes

productores de levaduras están desarrollando levaduras comerciales “de selección local” en un

intento de defender la autenticidad y tipicidad de los vinos. No obstante, en todos los casos se

han centrado en una única levadura de la especie de Saccharomyces cerevisiae. La propuesta

actual radica en la reproducción del ecosistema natural presente en la uva en los inóculos, con

una presencia notable de levaduras No-Saccharomyces que permitan el enriquecimiento

sensorial. Este concepto se ha propuesto en el proyecto europeo WildWine

(http://www.wildwine.eu/en/), actualmente en desarrollo en regiones de prestigio europeo como

Burdeos (Francia), Priorato (Eapaña), Piemonte (Italia) o Creta (Grecia) y algo similar en el

proyecto “la huella microbiológica chilena”. El objetivo del proyecto WildWine es dotar a las

http://www.wildwine.eu/en/



Página 11

Pequeñas y medianas empresas y las diferentes denominaciones de origen de instrumentos para

diversificar y ofrecer vinos innovadores de calidad superior para los mercados nacionales y

mundiales. Estos vinos están dirigidos también a la captación de nuevos consumidores,

mediante unos vinos controlados y en el que el factor del terroir esté especialmente destacado.

Según se declara en el proyecto el objetivo estratégico de WildWine es desarrollar mezclas de

levaduras originales y peculiares combinando Saccharomyces indígenas con levaduras no-

Saccharomyces para la producción de vinos de calidad premium con un fuerte carácter terroir.



Página 12

¿Podemos evitar la pérdida de color con levaduras?

Dra. Karina Medina Sección Enología, Facultad de Química, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.

En el proceso de vinificación de vinos tintos, la optimización en la obtención de color

constituye un área clave en la elaboración de vinos tintos de calidad. En dicho proceso

intervienen una serie de variables, que van desde el viñedo hasta la bodega, donde la

fermentación alcohólica llevada a cabo por las levaduras puede afectar positivamente la

concentración de color. Durante la fermentación alcohólica, las levaduras transforman los

azúcares del mosto en etanol y anhídrido carbónico como principales compuestos, pero además

sintetizan o modifican una gran diversidad de compuestos polifenólicos de la uva, que a pesar

de estar en muy baja concentración, son los compuestos claves que determinan en buena medida

la calidad de un vino tinto.

Desde el punto de vista del color, las consecuencias de la interacción de las levaduras con el

mosto pueden ser tanto beneficiosas como perjudiciales para la calidad del vino.

Dentro de las consecuencias beneficiosas, se encuentra la producción de pigmentos derivados

de antocianos por parte de levaduras. Estos pigmentos son desde el punto de vista del color de

vital importancia en la elaboración de vinos tintos, debido a su estabilidad frente a la presencia

de SO2 y cambios de pH, y a su vez por manifestarse intensamente coloreados al pH del vino;

todas características que impactan en un mayor potencial de guarda.

Por otro lado, las interacciones perjudiciales y a la vez “inevitables” son la adsorción de

antocianos a nivel de la pared celular de las levaduras.

Considerando ambos fenómenos, y la posibilidad enológica de solo poder intervenir sobre el

primero de ellos, para evitar la pérdida de color por levaduras, en este trabajo se realizó la

caracterización y selección de cepas nativas provenientes de uvas de diferentes viñedos del

Uruguay.

Los resultados obtenidos demostraron que la formación de estos derivados de antocianos es

dependiente de la cepa, y pusieron de relevancia la contribución de algunas levaduras en la

preservación y/o aumento del color durante la vinificación, lo que constituye un importante

carácter de selectividad para cepas de vinos tintos.



Página 13

Aplicación de H. vineae para vinificación en blanco y tinto

M.Sc. Valentina Martín Sección Enología, Facultad de Química, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.

En la actualidad la mayoría de las bodegas utilizan iniciadores comerciales de fermentación,

formulados en su mayoría por levaduras pertenecientes al género Saccharomyces, ya que

aseguran un correcto desarrollo del proceso de fermentación. Sin embargo, la gran biodiversidad

de levaduras nativas no se ve reflejada en la disponibilidad de levaduras comerciales. Es así que,

en la enología ocurre una situación paradójica: la biodiversidad de cepas de levaduras nativas

presentes en las uvas y en la bodega es muy grande, mientras que a nivel industrial existe una

muy limitada cantidad de cepas comerciales para su aplicación por el Enólogo. Por lo que

muchas veces se utilizan las mismas levaduras para fermentar distintos vinos en distintas

bodegas y regiones. Esto conlleva a una estandarización de los vinos y a una disminución de la

tipicidad transmitida por la aplicación de las distintas cepas.

Diversos autores se han dedicado a estudiar el aporte de las levaduras nativas, en su gran

mayoría No-Saccharomyces sobre las características organolépticas de los vinos, el aporte

mayormente está asociado a las reacciones enzimáticas que ocurren en el mosto durante las

etapas tempranas de la fermentación alcohólica, participando en la producción de compuestos

no volátiles como el glicerol, y otros volátiles como los esteres y ácidos grasos que aportan

atributos sensoriales beneficiosos al vino.

En este trabajo se muestran resultados en el estudio de levaduras de la especie Hanseniaspora

vineae, que en trabajos previos realizados por el grupo de la Sección Enología se constató que

aumentan la complejidad aromática y de boca de vinos blancos fermentados en barrica. Se

muestran los resultados obtenidos con uvas Chardonnay y Macabeo en blanco, y con uvas

Merlot y Tannat en tinto.



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“AquiBrett”: Medio selectivo y diferencial para la detección de contaminación

por Dekkera/Brettanomyces en jugos de uva y vinos.

Gabriel Pérez Giffoni.

Sección Enología, Facultad de Química, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.

Brettanomyces en enología es asociada a defectos sensoriales en los vinos. Se trata de un tipo de

levaduras que preocupa a bodegueros de todo el mundo debido a que su eliminación es muy

difícil y su desarrollo impredecible, en consecuencia las pérdidas que ocasiona pueden llegar a

ser muy elevadas.

Es bien reconocido actualmente que las levaduras del genero Dekkera/Brettanomyces son las

responsables del defecto comúnmente conocido como aroma a etilfenol (descrito sensorialmente

como aroma a “establo”, “sudor de caballo”, “curita medicinal”). Este defecto se debe a la

habilidad de estas cepas de producir fenoles volátiles a partir de los ácidos fenólicos

normalmente presentes en los vinos, principalmente en tintos. Junto con el etilfenol y el

etilguaiacol, se producen ácido acético, esterasas (con fuerte impacto sobre los componentes de

aroma y color) y tetrahidropiridinas, resultando en vinos con pérdida del carácter varietal y

encubriendo las notas frutales de un buen vino. Descriptores aromáticos tales como vinagre,

acetona, medicina, plástico quemado, tempera, perro mojado, sudor de caballo, madera húmeda,

orín de ratón, etc, son algunos de los defectos que estas levaduras pueden causar en los vinos.

Dada la importancia y el prestigio que en los últimos años los vinos Uruguayos han sabido

ganar a nivel mundial, se ha planteado la necesidad de desarrollar métodos que permitan la

detección de estas levaduras en los inicios de la contaminación para prevenir la formación de

estos aromas defectuosos en el vino, determinar su origen y distribución ecológica.

Al tener estas cepas un desarrollo muy lento, su aislamiento e identificación es muy difícil al ser

superadas por otras levaduras que coexisten en el medio.

El principal objetivo fue entonces desarrollar un método rápido de diagnostico de la presencia

de la levadura Dekkera/Brettanomyces con potencial para su aplicación en bodegas. Esta

levadura, considerada uno de los contaminantes de vinos más difíciles de controlar en esta

industria, se sabe actualmente que quizás pueda cumplir un papel preponderante debido a su

gran resistencia a las condiciones de bajo pH y altos niveles de anhídrido sulfuroso.

La presencia de esta levadura en bodegas ha sido relevada en forma preliminar por la Sección

Enología de la Facultad de Química en diversas bodegas y regiones de Uruguay. Su presencia

fue detectada principalmente en barricas y botellas, particularmente en vinos Tannat. Esto puede

indicar que los vinos Tannat, dado su alto contenido en algunos ácidos fenólicos, son proclives a

esta contaminación lo que resulta en aromas desagradables cuando supera determinados

umbrales sensoriales. La formación de etilfenoles es la causa de la aparición de estos aromas

que encubren los aromas frutales típicos de la variedad, disminuyendo el frescor del vino y el

carácter varietal.

El medio de cultivo desarrollado por nuestro equipo, permite especialmente la detección de

levaduras del género Dekkera/Brettanomyces, en vinos y mostos. Su actividad se basa en una

fórmula que asocia selectividad y producción de aromas indicadores, asegurando una detección

rápida y precisa de dichas levaduras mucho antes que se produzca en el vino de Bodega. En la

siguiente tabla, se relacionan los días a los cuales se detecta el olor fenólico por el enólogo, con

la concentración de levaduras Dekkera/Brettanomyces por mL de muestra de vino o jugo de uva

estimada. Esta escala fue realizada por recuento de colonias desarrolladas en la superficie del

medio de cultivo sólido especifico para esta especie. ):



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Número de días a los que se detecta olor

fenólico

Número aproximado de células por mL de

muestra

2 105 - 10

6

4 104 - 10

5

6 103 - 10

4

8 101 – 10

2 - 10

3

10 101 - 10

2

10 a 15 1 - 10 células por cada 20 mL

15 o más Ausencia de contaminación

Validación de la técnica.

La presencia de estas levaduras en vinos o jugo de uva y la validación de este medio y método

microbiológico fueron confirmadas por la cuantificación de etilfenol y etilguaiacol por

cromatografía gaseosa de alta resolución. En caso de que el enólogo detecta la presencia del

defecto con este test, toma las medidas preventivas que considere necesarias para que las células

presentes no sigan desarrollándose, o si son vinos para embotellar definir una filtración más

estricta antes del embotellado del vino. AquiBrett esta siendo distribuido en Uruguay por la

empresa Abastecimientos.



Página 16

Novedades en la caracterización y trazabilidad de los taninos enológicos

Roberto Larcher y Giorgio Nicolini

Centro Transferimento Tecnologíco. Fondazione Edmund Mach di Institute San Michele all'Agige San Michele all Adige, Italia.

En esta presentación se muestran los resultados de la aplicación de nuevas herramientas

analíticas para la caracterización y trazabilidad del origen botánico de los taninos

enológicos. Las técnicas desarrolladas con este objetivo están enfocadas en la

cuantificación de azúcares por cromatografía iónica acoplada a detección amerométrica

pulsada (Ion Chromatograph Pulsed Amperometric Detection, IC-PAD) y de fenoles

simples por cromatografía líquida de alta presión acoplada a un detector de detección

electroquímica (HPLC-ECD). Estos enfoques analíticos, desarrollados en la Fundación

E. Mach de San Michele all'Adige (Trento, Italia), complementan y mejoran la

capacidad discriminante de los métodos analíticos de la OIV.

Se presentará también información en relación a la trazabilidad del origen botánico de

los taninos mediante el estudio de su composición isotópica y de microelementos.



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Tioles derivados de los taninos de la uva. Nuevas opciones enológicas

Giorgio Nicolini y Roberto Larcher

Centro Transferimento Tecnologíco. Fondazione Edmund Mach di Institute San Michele all'Agige San Michele all Adige, Italia.

El reciente descubrimiento de la presencia de precursores del 3-mercaptohexanol (por

unión con glutatión y cisteína) en algunos taninos de uvas comerciales, ha impulsado

evaluar la posibilidad de incidir realmente en la formación de la forma libre de este tiol

varietal en los vinos. El 3-mercaptohexanol es responsable en los vinos de notas frutales

como fruta de la pasión y pomelo.

En esta presentación se mostrarán los resultados obtenidos en experimentos realizados,

a escala de laboratorio y semi-industrial, sobre Sauvignon blanc, Mueller-Thurgau y

Traminer aromático.

Anexos

“Aislamiento e identificación molecular de especies de levaduras No-Saccharomyces presentes en uvas”

Ana Godoy

Tesis de grado , Licenciatura en Bioquímica , Facultad de Ciencias

Tutora: Dra Carina Gaggero, Departamento de Biología Molecular, IIBCE Co-tutora: M.Sc Karina Medina, Sección Enología, Facultad de Química

Montevideo, Uruguay Noviembre, 2013

Las levaduras del género No-Saccharomyces constituyen el 99% de la flora nativa de la uva.

Aunque la especie Saccharomyces cerevisiae(S.cerevisiae) es la que predomina y completa el

proceso de fermentación, el aporte de ciertas cepas No-Saccharomyces durante las primeras

etapas de la misma, es de gran importancia ya que producen aromas deseables y enzimas

capaces de liberar aromas ligados mejorando así el “bouquet” del vino final. Mediante la

realización de fermentaciones mixtas, combinando levaduras S. cerevisiae con cepas

seleccionadas No-Saccharomyces, es posible mejorar la complejidad aromática del vino final

y su estructura en boca. Por otro lado, algunas de estas cepas No-Saccharomyces podrían

desempeñar un papel clave en el control biológico de fitopatógenos en uvas y otras frutas.

Este trabajo consistió en el aislamiento e identificación, a nivel de especie, de levaduras

nativas No-Saccharomyces presentes en uvas. A partir de diferentes vendimias y variedades

de vid, se lograron aislar un total de 165 aislamientos con morfologías diferentes en el medio

diferencial WLN. Se aislaron sus ADNs y se amplificaron y secuenciaron las regiones

ribosomales variables D1/D2, a partir de las cuales fue posible identificar 25 especies No-

Saccharomyces, pertenecientes a diez géneros diferentes. También se encontraron cepas

de S. cerevisiae y por lo tanto se discute cual sería la metodología más apropiada para evitar

el aislamiento de esta especie. Para un grupo de once cepas de la especie Hanseniaspora

guilliermondii (H. guilliermondii) se realizó una discriminación molecular a nivel de sub-

especie, evidenciando que se trataba de individuos diferentes.

Elaboración de un protocolo de calidad que defina atributos

diferenciales para vinos Tannat uruguayos de exportación con un

sello de calidad

Valeria Villar Tesis de Maestría. Sección Enología, Departamento de Ciencia y Tecnología de los

Alimentos, Facultad de Química.

Uruguay utiliza la variedad Tannat como carta de presentación ante el mercado vitivinícola mundial,

ya que entre las variedades de alta gama es la que presenta mayor área de superficie plantada. Pero la

competitividad internacional de los productores vitivinícolas de nuestro país ha sido difícil de lograr

desde hace décadas, debido fundamentalmente a su focalización en producir un vino destinado a

mercado interno como estrategia de producción. Un mercado de vino de mesa que se considera que a

mediano plazo no podrá seguir siendo rentable principalmente para establecimientos pequeños. Este

factor, junto con la competencia de regiones donde el costo de las uvas es mucho menor converge en la

necesidad nacional de implementar un sistema evaluador y certificador de las técnicas vitivinícolas

utilizadas para lograr un vino que se prestigie en el mercado internacional y que siga siendo

reconocido como típico de Uruguay, el Tannat.

Para implementar dicho sistema es necesario desarrollar un protocolo de calidad que defina atributos

de producto, proceso y envase. Para el desarrollo del protocolo de calidad del producto y de envase se

trabajó en caracterizar los vinos finos Tannat que se comercializan actualmente en mercados exigentes.

Se estudió el perfil de componentes volátiles de 10 vinos finos Tannat pertenecientes a distintas

bodegas y distintos años producidos en Uruguay, mediante análisis por cromatografía gaseosa

acoplada a masa (GC-MS), con el cual se identificaron y cuantificaron diferentes componentes

aromáticos. Conjuntamente se realizó una evaluación sensorial con consumidores, y varios análisis

fisicoquímicos clásicos. Mediante la representación gráfica del mapeo proyectivo obtenido, se logró

una buena agrupación de muestras según la gama del producto, De este ensayo se logró además

obtener una serie de descriptores aromáticos planteados por el panel.

Asimismo se desarrolló un protocolo de calidad del proceso de elaboración de estos vinos, con el fin

de lograr obtener un producto con los atributos composicionales identificados en el relevamiento

inicial. Este protocolo propone buenas prácticas de elaboración, considerando los siguientes aspectos:

- Requisitos generales

- Planificación estratégica y operativa

- Actividades tercerizadas o subcontratadas

- Información documentada

- Sistema de trazabilidad

- Condiciones del establecimiento

- Gestión de recursos humanos

- Calidad de agua

- Limpieza y desinfección

- Control de plagas

- Gestión de residuos

- Gestión de compras

- Procedimiento de Emergencias

- Retirada de productos del mercado

Finalmente se propone validar los protocolos propuestos, mediante la recolección de evidencia objetiva

que demuestre que los protocolos desarrollados son eficaces para el cumplimiento de los objetivos

propuestos, es decir, aspirar a obtener un vino Tannat de exportación con los atributos composicionales

identificados en la primera parte.

Método rápido para el seguimiento de la fermentación maloláctica.

Eduardo Boido1, Eduardo Dellacassa2, Francisco Carrau2 y Patrick Moyna2. 1 Escuela de Vitivinicultura, Ruta 48, Km 18, El Colorado, Canelones. 2 Facultad de Química, Avda. Gral. Flores 2124, 11800 Montevideo.

Resumen.

Para la obtención de vinos de calidad, el control de la fermentación maloláctica (FML) es

esencial. En este trabajo se describe un método por cromatografía en capa fina, mucho más

eficiente que la tradicional en papel, para el control de la FML en bodega. Las ventajas de

éste método son la rapidez de obtención del resultado (aproximadamente una hora), la buena

separación del ácido láctico y el succínico con lo cual se determina con facilidad el inicio de

la FML, su bajo costo y la sencillez para ser utilizada por el enólogo.

Introducción.

En la fermentación secundaria del vino por bacterias lácticas, llamada fermentación

maloláctica (FML), el ácido málico se metaboliza formando ácido láctico y CO2 (8, 9, 10).

La FML ocurre luego de la fermentación alcohólica, aunque en algunos casos se produce

durante la misma, siendo importante en la elaboración de vinos por tres razones:

desacidificación, modificación de las características organolépticas y estabilidad

microbiológica. Esta fermentación puede ser deseada o no según la región vitícola, variedad

de uva, composición del vino, técnicas de elaboración y el estilo buscado por el enólogo.

El seguimiento de la FML es imprescindible en la elaboración de vinos de calidad, ya sea en

aquellos en los cuales se desea que se produzca, y por lo tanto debe conocerse precisamente

el momento en que todo el ácido málico ha sido degradado, así como en aquellos en que

desea evitarse esta fermentación y por lo tanto debe determinarse que no exista formación de

ácido láctico.

El control de la FML puede realizarse por exámenes microbiológicos acompañados de

determinaciones de las cantidades de ácido málico y láctico por medio de métodos

enzimáticos (7) o por cromatografía líquida de alta performance (HPLC) (6).

El método más usado en general para la determinación de estos ácidos es la cromatografía en

papel, ya que las pequeñas bodegas no poseen potentes microscopios, espectrofotómetros o

cromatógrafos, siendo todos estos equipos de alto valor (1).

En cromatografía en papel se utilizan sistemas de solventes como butanol-ácido acético-agua,

usando como revelador azul de bromofenol (4, 11, 12, 13, 14). Este método presenta algunos

inconvenientes, como ser la dificultad para determinar el inicio

de la FML ya que el ácido láctico y succínico tienen la misma movilidad en este sistema, y

además el sistema de solventes necesita varias horas para evaporarse antes de que los ácidos

puedan visualizarse en el cromatograma (1). Todo lo cual lo hace un método poco eficiente.

Para solucionar estos inconvenientes se trabajó con cromatografía en capa fina (TLC, Thin

Layer Cromatography), la cual es una técnica analítica desarrollada hace más de 30 años y

que no requiere de equipos costosos (1, 2, 3).

El método utiliza placas de sílica gel y un sistema de solventes no acuoso ácido acético-

acetato de n-butilo, revelándose con azul de bromofenol. Entre las beneficios respecto a la

cromatografía en papel tenemos que este sistema corre en solo unos 15 a 20 minutos, los

solventes se evaporan rápidamente pudiendo revelar el cromatograma rápidamente y el inicio

de la FML se determina fácilmente por la mejor separación entre el ácido láctico y el

succínico.

En el presente trabajo, se describe un método para el seguimiento de la FML por

cromatografía en capa fina, se ajusta también un método para la cuantificación de los ácidos,

mediante la medida colorimétrica de las manchas obtenidas en la TLC utilizando un TLC-

Scanner (densitómetro).

Materiales y métodos.

Para la realización de la TLC se utilizaron los siguientes materiales:

1 - Una cuba para cromatografía de aproximadamente 10 cm de alto (envase de vidrio con

tapa para poder mantener la cámara saturada de solvente).

2 - Placas para cromatografía en capa fina, de sílica gel de espesor 0.25 mm, Macherey-Nagel

Polygam Sil G/UV254. Estas placas consisten en una fina capa de sílica gel unida a una hoja

de material plástico flexible.

3 - El sistema de solventes ácido acético-acetato de n-butilo (en relación 1-2). Estos

solventes tienen aproximadamente el mismo punto de ebullición y por lo tanto la mezcla es

estable, pudiendo guardarse en un recipiente cerrado por tiempo prolongado.

4 - El revelador utilizado es una solución de azul de bromofenol de 1 g/L en metanol, la que

se ajusta al tono sensible azul con unas gotas de NaOH al 0.4%.

El procedimiento seguido para realizar la TLC es el siguiente:

Las hojas de TLC se cortan de 8 a 10 cm de alto y el ancho suficiente para colocar el número

de muestras requerido, las cuales se colocan con una separación 8 a 10 mm. Las muestras se

colocan a una distancia aproximada de 10 mm del borde inferior, mediante el uso de una

s aplicaciones, secando con aire caliente

una aplicación antes de realizar la siguiente, no debiendo tener las manchas un diámetro

mayor a 2 mm. En la cuba de cromatografía se coloca el sistema de solventes (2 partes de

acetato de n-butilo y 1 parte de ácido acético) hasta tener una profundidad de unos 5 mm,

siendo conveniente colocar los solventes antes de preparar la

placa de cromatografía para dejar que se sature la cámara. Luego se coloca la placa de

cromatografía preparada, debiendo quedar las manchas de las muestras sobre el nivel de

solvente, se tapa y se deja que el solvente ascienda hasta aproximadamente 10 mm del borde

superior lo cual requiere unos pocos minutos en el sistema descrito. Se extrae la placa, se

deja secar los solventes bajo una corriente de aire caliente (durante 10 a 15 minutos) y se

aplica el revelador mojando la placa con un algodón humedecido en el mismo. Los ácidos se

revelan como manchas amarillas sobre un fondo azul.

Para la cuantificación se utiliza un TLC-Scanner Shimadzu CS-9000. Se realiza una curva de

calibración para ácido málico a partir de una solución conteniendo 4.036 g/L en agua

2.4216, 3.2288 y 4.036 g/L (referidos

determinó la longitud de onda de trabajo mediante barrido en el visible de las manchas

obtenidas, escogiéndose el máximo de reflexión que se produce a los 430 nm. La

cuantificación de las manchas se realiza mediante barrido en zig zag de 8 mm y a 430 nm,

relacionándose las áreas de los picos obtenidos con las concentraciones de ácido aplicadas,

determinándose la curva de calibración.

Resultados y discusión.

Los ácidos se separan mediante esta cromatografía ubicándose en orden ascendente el ácido

tartárico, málico, láctico y por último succínico con los valores de Rf que se muestran en la

tabla.

ÁCIDO Rf

Tartárico 0.2

Málico 0.60

Láctico 0.69

Succínico 0.82

La longitud de onda de trabajo para la realización de la curva de calibración es de 430 nm,

correspondiendo a un máximo en la curva de reflexión (figura 1). Este máximo es estable

hasta cinco días de realizada la cromatografía.

La curva de calibración se realiza a partir de los datos de concentración y área de los picos

obtenidos, los cuales se presentan en la tabla.

Concentración (g/L) Área

0.8072 16774,00

1.6144 31817,00

2.4216 48311,00

3.2288 57745,00

4.0360 59921,00

Los datos obtenidos se ajustaron a una curva cuadrática de la siguiente forma:

A = a.C2 + b.C + c

donde: A = área del pico

C = concentración (g/L)

y se obtienen los siguientes coeficientes: a = -3595

b = 31314

c = -7150

con un coeficiente de correlación r2 = 0.9936

En la figura 2 puede verse la curva de ajuste a los datos. El comportamiento de los mismos

es lineal (con correlación 0.999) para concentraciones menores a 3 g/L.

Conclusiones.

La TLC resulta ser un método sencillo, rápido y poco costoso. Los ácidos se revelan

fácilmente y se hacen visibles rápidamente. Los colores son estables por un tiempo

razonable. Por todo lo dicho antes, el método descrito resulta mucho más eficiente frente a la

tradicional cromatografía en papel, siendo más eficiente para controlar la FML en la bodega,

y de fácil aplicación por el enólogo.

Es posible, contando con un equipo más sofisticado, realizar una determinación cuantitativa

de los ácidos del vino.

Bibliografía.

1 - Harris, Roger L.N.; Monitor our MLFs with TLC. Annual Technical Issue, 13-15 (1993)

2 - Dirchner, J.G.; Thin layer chromatography. Wiley-Interscience, New York (1978)

3 - Touchstone, J.T., Dobbins, M.R.; Thin layer chromatography. Wiley, New York (1978)

4 - Ribereau-Gayon, J., Peynaud, E., Sudraud, P., Ribereau-Gayon, P.; Tratado de enología:

Ciencias y técnicas del vino. Tomo I. Hemisferio Sur, Buenos Aires (1980)

5 - Skoog, D.A., West, D.M.; Análisis instrumental. Interamericana, México (1984)

6 - Farinotti, R.; Caude, M.; Mahuzier, G.; Rosset, R.; Separation et detection d'acides mono

carboxyliques saturés a courte chaine par chromatographie ne phase liquide. Analysis, 7,

449-453 (1979)

7 - Boehringer Mannheim; Methods of enzimatic food analysis. Mannheim, West Germany

(1980)

8 - Henick-Kling, T.; Wine, microbiology and biotechnology. Chapter 10: Malolactic

fermentation. Harwood Academic Publishers, Switzerland (1993)

9 - Davis, C.R.; Wibowo, D.; Eschenbruch, R.; Lee, T.H.; Fleet, G.H.; Practical implications

of malolactic fermentation: a review. Am. J. Enol. Vitic., 36 (4), 290-301 (1985)

10 - Henschke, P.A.; An overview of malolactic fermentation research. Wine Industry

Journal, February, 69-79, (1993)

11 - Marsh, G.L.; Kean, C.C. Wines and vines, 33, 19 (1952)

12 - Zampelas, D.A.; Clark, W.L. American Journ. Enol., 8, 43 (1957)

13 - Ribereau-Gayon, J.; Peynaud, E. Bull. Soc. Chim., 5, 226 (1938)

14 - Michod, J.; Rev. romande agric. vitic. arboric., 15, 85 (1959)

Zimevit: un biofungicida que combina la acción de una bacteria y una levadura

para el control del moho gris de la vid ocasionado por Botrytis cinerea.

Zimevit: a biofungicide that combines the action of one bacteria and one yeast for thecontrol of gray mold of grape caused by Botrytis cinerea.

MONDINO, Pedro1; CASANOVA, Leticia1; CALERO, Graciela2; BETANCUR, Oscar3; ALANIZ, Sandra1

1 Unidad de Fitopatología, Facultad de Agronomía, Montevideo - Uruguay, [email protected],[email protected], [email protected]; 2 Escuela Superior de Vitivinicultura, Universidad del Trabajo delUruguay, El Colorado Canelones - Uruguay, [email protected]; 3 Departamento de Estadística y Cómputo,E.E.M.A.C, Paysandú - Uruguay, [email protected]

RESUMO: Botrytis cinerea, provoca pérdidas importantes en la producción de vid. Zimevit, un biofungicida

desarrollado en Uruguay que combina la acción de una bacteria (Bacillus subtilis, UYBC38) y una levadura

(Metschnikowia pulcherrima, M26) fue evaluado a campo en las variedades Cabernet Franc y

Gewurztraminer. Los tratamientos fueron: Zimevit; iprodione como tratamiento convencional y agua como

testigo. En los tres ensayos efectuados la aplicación de Zimevit resultó en una menor incidencia y severidad

del moho gris en los racimos al momento de la cosecha sin diferenciarse del fungicida iprodione. El hecho

de que Zimevit haya logrado reducir tanto la incidencia como la severidad de la enfermedad estaría

demostrando la existencia de un doble efecto inhibitorio, tanto sobre la germinación de esporas como sobre

el desarrollo posterior de la enfermedad. Si bien se recomienda realizar nuevas evaluaciones para conocer

su comportamiento en años con clima favorable al desarrollo de la enfermedad, puede afirmarse que

Zimevit aparece como una herramienta potencial a ser usada en sistemas de manejo integrado del moho

gris de la vid en Uruguay.

PALABRAS CLAVE: Botrytis cinerea; control biológico; moho gris; Zimevit

ABSTRACT: Botrytis cinerea, causes significant losses in grapes production. Zimevit, a biological product

developed in Uruguay that combines the action of a bacterium (Bacillus subtilis, UYBC38) and the yeast

(Metschnikowia pulcherrima, M26), was tested in field in the varieties Cabernet Franc and Gewurztraminer.

The treatments were: Zimevit, iprodione as conventional treatment, and water as untreated control. In the

three tests carried, Zimevit application resulted in a lower incidence and severity of gray mold on grapes at

harvest. No statistically significant differences were observed between the Zimevit and iprodione

treatments. The decrease in the incidence and severity would indicate that Zimevit has a double inhibitory

effect on B. cinerea, both on spores germination and disease development. This effect is attributed to the

combined action of M. pulcherrima and B. subtilis. In spite of that further evaluations are needed in years

with favorable conditions to disease development, Zimevit appears as a tool with potential for use in

integrated management systems of gray mold of grapes in Uruguay.

KEY WORDS: biological control; Botrytis cinerea; grey mold,; Zimevit

Revista Brasileira de AgroecologiaRev. Bras. de Agroecologia. 7(3): 127-134 (2012)ISSN: 1980-9735

Correspondências para: [email protected]

Aceito para publicação em 20/04/2012

Introducción

La viticultura en Uruguay ocupa 8.000 ha con

aproximadamente 27 millones de plantas. La

producción de uva en el año 2010 superó los 110

millones de kilogramos y se destina en su mayoría

a la elaboración de vino (INAVI, 2010). El principal

desafío de los viticultores consiste en lograr una

producción de muy alta calidad, cuidando el medio

ambiente y la salud del consumidor. El moho gris

causado por Botrytis cinerea Pers.:Fr causa

podredumbres de los racimos, provocando

pérdidas importantes en la producción e

interfiriendo con la fermentación, afectando el

sabor y color del vino.

El manejo de B. cinerea basado en el uso de

fungicidas de síntesis química ha demostrado no

ser sustentable, debido a la facilidad con que las

poblaciones de B. cinerea se han tornado

resistentes a los principales grupos químicos

utilizados (POMMER & LORENZ, 1982; ELAD et

al., 1991; LATORRE et al., 1994). En trabajos

recientes se pudo constatar la resistencia a

fungicidas por parte de B. cinerea en Uruguay

(GEPP et al., 2011). Por otra parte, la mayor

conciencia y conocimiento público sobre los efectos

negativos del uso de fungicidas en el medio

ambiente y en la salud de aplicadores y

consumidores se ha visto reflejado en las

regulaciones gubernamentales que han restringido

fuertemente su uso. Las mayores restricciones

impiden la aplicación de fungicidas especialmente

durante el período de precosecha. Es precisamente

durante este período, que las uvas maduran y se

tornan más susceptibles a la infección por B.

cinerea (ELMER & REGLINSKI, 2006).

Las limitaciones del control químico del moho

gris de la vid han obligado al desarrollo de métodos

culturales y biológicos que, incorporados en

sistemas de manejo integrado (MI), permitan

minimizar las pérdidas. El control biológico aparece

como una herramienta promisoria y factible de ser

utilizada en estos sistemas, debido entre otras

cosas, a que los agentes de biocontrol son

percibidos como poco agresivos sobre el medio

ambiente. A su vez, al poseer complejos modos de

acción, su riesgo de generar resistencia es menor.

El hecho de que existan diversos productos

biológicos para el control de B. cinerea que han

alcanzado la etapa comercial muestra que es

posible lograr un control exitoso. Algunos de los

géneros de microorganismos que han mostrado

poseer potencial para el bicontrol de B. cinerea son

Trichoderma y Clonostachys entre los hongos

filamentosos (HARMAN et al., 1996; LATORRE et

al., 1997; SUTTON et al., 1997; COTA el al., 2008),

Bacillus y Pseudomonas entre las bacterias

(WALKER et al., 2001; JACOBSEN et al., 2004) y

Cryptococcus, Pichia y Candida entre las levaduras

(XIANG-HONG et al., 2010; LIMA et al., 1998;

NUNES, et al., 2002; MASIH et al., 2000;

KARABULUT et al., 2003; GARMENDIA et al.,

2005). Las levaduras tienen la capacidad de

colonizar las superficies de las plantas y las heridas

por largos periodos bajo condiciones de muy baja

humedad y antagonizan a los patógenos mediante

la competencia por espacios y nutrientes (SCHENA

et al., 2000; MERCIER & WILSON 1994). En el

caso de las bacterias como Bacillus y

Pseudomonas su principal modo de acción parece

ser la producción de antibióticos (ANJAIAH 2004;

HANG et al., 2005).

Si bien el control biológico de B. cinerea en

ensayos de campo ha tenido resultados erráticos,

eso se explica entre otros factores, por la

variabilidad natural del ambiente en el campo. Para

mejorar la efectividad del control biológico se han

propuesto diversos mecanismos entre los cuales se

encuentra la combinación de agentes de biocontrol

con modos de acción complementarios (GUETSKY

et al., 2001; ELMER & REGLINSKI, 2006).

Aplicaciones foliares tanto de bacterias como de

levaduras saprófitas han demostrado ser efectivas

en el control de B. cinerea (ELAD et al., 1994;

MAGNIN-ROBERT et al., 2007; LIU et al., 2010).

Bacterias y levaduras pueden aplicarse en forma

conjunta debido a que poseen requerimientos

Mondino, Casanova, Calero, Betancur & Alaniz

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ecológicos y nutricionales diferentes entre sí. Por

otra parte los mecanismos mediante los cuales

ejercen su acción biocontroladora son diferentes y

su aplicación simultanea ha mostrado tener un

efecto sinérgico en el control de B. cinerea

(NUNES et al., 2002; CALVO et al., 2003).

Zimevit es un producto biológico desarrollado en

Uruguay que combina las acciones de una bacteria

y una levadura, aisladas a partir de muestras de

suelo de un viñedo y de la superficie de las uvas

respectivamente. La bacteria es una cepa de

Bacillus subtilis (cepa UYBC38) y la levadura fue

identificada como Metschnikowia pulcherrima

(cepa M26). Ambos aislamientos demostraron ser

fuertemente inhibitorios del crecimiento de B.

cinerea in vitro y no interfieren con las levaduras

responsables de la fermentación para la producción

de vino (RABOSTO et al., 2006).

B. cinerea tiene la capacidad de establecerse

en los restos florales durante el período de floración

de la vid, luego al crecer el racimo queda protegido

dentro del mismo (infecciones latentes). Finalmente

cuando las uvas maduran, se tornan susceptibles a

la invasión de este hongo (ELMER &

MICHAILIDES, 2004). Esta característica del ciclo

de B. cinerea en la uva, define los momentos de

aplicación: floración, previo al cierre del racimo y

envero. La aplicación de agentes de control

biológico tiene por objetivo lograr que los

antagonistas se instalen y colonicen los sitios de

infección antes de que arribe el patógeno

(Mondino, 2006).

La variedad Cabernet Franc es apropiada para

zonas frías por su temprana maduración; presenta

racimos de tamaño mediano-pequeño con una

compacidad media, las bayas son de tamaño

pequeño y contienen un grosor de piel medio. Estas

características le otorgan alta sensibilidad al moho

gris. Gewurztraminer es una variedad de uva de

color rosado y especialmente aromática y de sabor

cítrico, originaria de Europa central empleada para

la elaboración de ciertos vinos blancos de calidad.

Presenta racimos pequeños y compactos lo que

dificulta la aireación de las bayas haciéndolos muy

sensibles a B. cinerea, a pesar del grueso tamaño

de la piel de la uva.

El presente trabajo tiene por objetivo evaluar el

uso del biofungicida Zimevit que combina la acción

de una cepa de la bacteria Bacillus subtilis con una

cepa de la levadura Metschnikowia pulcherrima, en

ensayos de campo para el control del moho gris

ocasionado por Botrytis cinerea en uva de las

variedades Cabernet Franc y Gewurztraminer.

Materiales y métodos

Localización de los ensayos y variedades de

uva utilizadas

Los ensayos fueron realizados en viñedos

pertenecientes a la Escuela Superior de

Vitivinicultura, Universidad del Trabajo del

Uruguay, Ruta 48 km 18, El Colorado Canelones.

Coordenadas 34º 42` 48 S y 56º 14`56 O. El primer

ensayo se realizó durante la temporada 2008-2009

en la variedad Cabernet Franc y los dos siguientes

durante la temporada 2009-2010 en las variedades

Cabernet Franc y Gewurztraminer.

Ambos viñedos son conducidos en espaldera de

1,5m de altura, guiada por 3 alambres sostenidos

por postes de madera separados 8m entre ellos. La

orientación de la filas es Norte Sur y el marco de

plantación 1m entre plantas por 3m entre filas.

Tratamientos efectuados, forma y momentos de

aplicación

En los tres ensayos se efectuaron los siguientes

tratamientos: 1) biofungicida Zimevit (Laboratorio

Santa Elena, Montevideo, Uruguay) a una

concentración de 300mL 100L-1 de agua, 2)

fungicida Rovral (iprodione) (Rovral Aquaflo, Bayer,

500g i.a. L-1) a una concentración de 150mL 100L-

1 de agua como tratamiento convencional y, 3)

agua como testigo sin aplicación.

En cada ensayo se utilizaron 6 filas de 80m.

Cada fila posee 10 tramos de 8m delimitados por

Zimevit: un biofungicida que

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postes de madera. Los tramos terminales de cada

fila se excluyeron del ensayo para eliminar el efecto

de borde. Cada tratamiento estuvo compuesto por

tres repeticiones. Cada repetición se compuso por

cuatro tramos consecutivos evaluándose solamente

los dos tramos centrales. Los tratamientos fueron

asignados mediante sorteo aleatorio.

En cada tratamiento la aplicación de los

productos se realizó en forma manual mediante

máquina de mochila aplicando directamente a la

zona de los racimos hasta lograr el punto de goteo,

en los estadios fenológicos de floración, estadio de

“arveja” y envero.

Evaluación de los ensayos

Al inicio de la cosecha se evaluó incidencia y

severidad en la totalidad de los racimos de los dos

tramos centrales de cada tratamiento. Para evaluar

incidencia se consideró que un racimo se

encontraba enfermo si poseía al menos una baya

afectada. Para la evaluación de la severidad se

utilizó una escala visual que diferencia entre siete

valores de porcentaje de infección: 1, 5,10, 20, 30,

50 y 75% (CHAMBRE D´AGRICULTURE

GIRONDE, 2000). El uso de la escala visual fue

entrenado previamente y una sola persona realizó

la evaluación, mientras que otra anotaba los datos

de forma de minimizar errores debido a la

subjetividad del evaluador.

Análisis de los resultados

Los valores de incidencia se analizaron

utilizando un modelo lineal generalizado asumiendo

una distribución binomial y la función de enlace

logit, mientras que los valores de severidad

mediante un modelo lineal generalizado asumiendo

una distribución multinomial y la función de enlace

logit acumulativa. En ambos casos las medias

fueron comparadas mediante el test Tukey con un

valor de P ≤ 0,05. Todos los análisis se efectuaron

el paquete estadístico SAS 9.2 (SAS Institute Inc.,

Cary, NC. USA)

Resultados y discusión

Los resultados de incidencia y severidad de B.

cinerea en racimos de uva de los tres ensayos

efectuados, se muestran en la Tabla 1.

La aplicación de Zimevit resultó en una menor

incidencia del moho gris en los racimos al momento

de la cosecha comparado con el tratamiento testigo

en los tres ensayos efectuados. Con excepción del

ensayo 3, las diferencias entre las medias

resultaron estadísticamente significativas.

En los tres ensayos las aplicaciones de Zimevit

redujeron la severidad de la enfermedad en los

racimos afectados. En todos los casos la reducción

lograda resultó estadísticamente significativa en

comparación con el tratamiento testigo.

En ninguno de los 3 ensayos realizados hubo

diferencias estadísticamente significativas entre las

aplicaciones del producto biológico Zimevit y del

fungicida iprodione tanto para la incidencia como

para la severidad del moho gris. En el caso del

ensayo realizado sobre la variedad Gewurztraminer

el valor de severidad obtenido fue menor incluso, al

logrado mediante el fungicida iprodione, aunque sin

diferenciarse estadísticamente de éste. Estos

resultados alimentan la expectativa de uso del

Zimevit en el manejo del moho gris de la vid tanto

en sustitución, como en complemento del control

químico en base a iprodione.

El hecho de que Zimevit haya logrado reducir

tanto la incidencia como de la severidad de la

enfermedad estaría demostrando la existencia de

un doble efecto inhibitorio, tanto sobre la

germinación de esporas como sobre el desarrollo

de la enfermedad. Este efecto se debe atribuir a la

acción combinada de M. pulcherrima y de B.

subtilis.

Diferentes levaduras y bacterias han

demostrado ser útiles para el control de B. cinerea

en diferentes cultivos. Recientemente se ha

demostrado que la aplicación de Hanseniaspora

uvarum redujo la incidencia del moho gris en uvas



tanto inoculadas artificialmente como por

inoculación natural. Los autores del trabajo

sugieren que la inhibición lograda se debe

principalmente a su efecto inhibidor de la

germinación de esporas y del desarrollo de las

lesiones (LIU et al., 2010). En tanto que

Saravanakumar et al., (2008) demostraron que la

cepa MACH1 de Metschnikowia pulcherrima inhibe

la germinación de conidios y produce degeneración

del micelio de B. cinerea. Otros trabajos muestran

que cepas de B. subtilis han sido capaces de

antagonizar a B. cinerea mediante la producción

de diferentes antibióticos (HANG et al., 2005). Sin

embargo no se han encontrado trabajos que

evalúen el potencial biocontrolador de ambos tipos

de microorganismos actuando en conjunto. El

control del moho gris en uva mediante el uso de

Zimevit resulta de la acción combinada de estos

dos antagonistas y los ensayos realizados son los

primeros evaluando este formulado comercial.

En los tres ensayos realizados la incidencia y

severidad de la enfermedad resultaron ser muy

bajas, menor al 1% y 5% respectivamente, lo que

es consecuencia de años poco favorables al

desarrollo del moho gris en racimos. Durante las

dos temporadas en que se realizaron los ensayos,

los eventos de lluvia fueron aislados. Durante la

temporada 2008-2009 no ocurrieron

precipitaciones en los meses de diciembre y enero

con un periodo de 55 días consecutivos sin lluvia,

mientras que durante la temporada 2009-2010 no

ocurrieron lluvias luego del 7 de febrero y hasta la



Tabla1: Efecto del biofungicida Zimevit (Bacillus subtilis + Metschnikowia pulcherrima) en la incidencia y

severidad del moho gris causado por B. cinerea en uvas de las variedades Cabernet Frank y

Gewurztraminer durante las zafras 2008-2009 y 2009-2010.

a Para evaluar la incidencia todo racimo con al menos una baya afectada se considero enfermo.b Para evaluar la severidad se utilizó una escala visual que diferencia entre siete valores de porcentaje de infección 1,

5, 10, 20, 30, 50 y 75%.c En cada ensayo las medias en las columnas seguidas por la misma letra no se diferencian estadísticamente según el

test de Tukey (P ≤ 0,05).d Iprodione (500g i.a. L-1)

cosecha. Como consecuencia no existieron

periodos lo suficientemente prolongados de alta

humedad relativa como para que la epidemia de B.

cinerea alcanzase la etapa de desarrollo

exponencial.

Las condiciones climáticas poco conducentes al

desarrollo de la enfermedad ponen un manto de

dudas acerca de qué desempeño tendría Zimevit en

condiciones ambientales más favorables al

desarrollo del moho gris. Esto es debido a que

existiría la posibilidad de que los niveles de

enfermedad hubiesen sido mayores si el patógeno

hubiera tenido mejores condiciones para

desarrollarse sobre la planta. Sin embargo se debe

tener en cuenta que las condiciones ambientales

que favorecen al patógeno también pueden

potenciar la acción de estos antagonistas

favoreciendo su actividad antagónica.

B. cinerea es un hongo oportunista por

excelencia y su estrategia es invadir tejidos muertos

o en descomposición, como los restos florales, y

establecerse allí esperando la oportunidad de

invadir los tejidos sanos (HOLZ et al., 2004). Es por

esto que la precolonización de los órganos de la

planta y de las heridas por parte de los

antagonistas, es un elemento clave en el biocontrol

de B. cinerea. La estrategia de aplicación de

Zimevit durante la floración y antes del cierre de

racimo procura que tanto la levadura como la

bacteria antagonistas colonicen estos restos

florales, compitan por ellos con B. cinerea y ejerzan

un efecto antagónico directo sobre el patógeno. Es

importante que esta acción colonizadora y

antagonista la puedan ejercer cuando las

condiciones ambientales sean favorables al

patógeno. En nuestro caso no disponemos de

información generada acerca de cuáles serían las

condiciones ambientales que potencien la acción

colonizadora de flores y frutos por ambos

antagonistas. Lo óptimo sería que las mismas

condiciones que favorecen al patógeno en forma

simultánea favorezcan también la acción de los

antagonistas. Si esto fuese así, es probable que,

condiciones como las ocurridas durante las dos

temporadas en que se desarrollaron los ensayos,

hayan perjudicado simultáneamente tanto a los

antagonistas como al patógeno.

La aplicación de mezclas de antagonistas puede

brindar algunas ventajas como por ejemplo la de

afectar al patógeno en diferentes etapas de su

desarrollo, evitando la infección o previniendo la

esporulación. En este caso el producto biológico ha

demostrado que impide la instalación de las

infecciones reduciendo la incidencia de la

enfermedad en todos los ensayos. A su vez las

reducciones en la severidad logradas en los tres

ensayos pueden explicarse por una menor

esporulación de B. cinerea sobre las bayas

afectadas minimizando el contagio a bayas

contiguas.

Si bien las temporadas en que se realizaron los

ensayos fueron desfavorables al desarrollo de la

enfermedad por las esporádicas precipitaciones

ocurridas, los resultados obtenidos indican que es

posible pensar en la integración del biofungicida

Zimevit en un programa de manejo integrado del

moho gris de la vid. Sin embargo será necesario

evaluar el comportamiento de este biofungicida en

condiciones de mayor presión de enfermedad por lo

que es recomendable repetir ensayos de campo

antes de brindar una recomendación definitiva.

Agradecimientos

Todos los ensayos fueron realizados en viñedos

pertenecientes a la Escuela Superior de

Vitivinicultura, Universidad del Trabajo del Uruguay.

Laboratorio Santa Elena formuló y cedió sin costo el

Zimevit utilizado en estos ensayos. Colaboraron en

los tres ensayos los estudiantes Esteban

Valenzuela; Fiorella Chiola; Leonel López y Juan

Porro.



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Transworld Research Network 37/661 (2), Fort P.O. Trivandrum-695 023

Kerala, India

Multidisciplinary Approaches on Food Science and Nutrition for the XXI Century, 2011: 53-71 ISBN: 978-81-7895-504-9 Editor: Rosana Filip

4. Vitis vinifera Tannat, chemical characterization and functional properties.

Ten years of research

F. Carrau1, E. Boido1, C. Gaggero2, K. Medina1, L. Fariña1

E. Disegna3 and E. Dellacassa1,4

1Sección Enología, Facultad de Química, Universidad de la República, Gral. Flores 2124 11800-Montevideo, Uruguay; 2Departamento de Biología Molecular

Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, Avenida Italia 3318 11600-Montevideo, Uruguay; 3Instituto Nacional de Investigación

Agropecuaria, Estación Experimental INIA-Las Brujas, Km. 10 de la Ruta 48 Rincón del Colorado, Canelones, Uruguay; 4Cátedra de Farmacognosia y Productos Naturales, Facultad de Química, Universidad de la República

Gral. Flores 2124, 11800-Montevideo, Uruguay

Abstract. Although the ancient Vitis vinifera Tannat variety is virtually unknown in the international wine market, the strategy to promote it as the Uruguayan emblematic grape variety is starting to become successful in the red wines market. This paper presents a summary of the latest research and developments performed in Uruguay with Tannat since the late 1970s, its origin and production statistics. As an expression of the state-of-the-art viticultural technology developed in Uruguay for this variety during the last ten years, the chemical characterization of the polyphenolic and aroma profiles, typical for this variety, is also presented. The high

Correspondence/Reprint request: Dr. E. Dellacassa, Cátedra de Farmacognosia y Productos Naturales, Facultad de Química, Universidad de la República, Gral. Flores 2124, 11800-Montevideo, Uruguay E-mail: [email protected]

F. Carrau et al. 54

polyphenolic content of this V. vinifera variety, when compared to other red grapes, confer its wines a high free radicals scavenging activity. Furthermore, from the winemaking point of view, some New World wine-producing countries have planted this grape to blend it with their own varieties, with the purpose of adding more structure and aging potential to their premium red wines. 1. Historical context and origin of Tannat With the arrival of the Spaniards in Uruguay at the end of the 16th century, the first vines were introduced for religious purposes. Spaniards continued to be important in the development of vineyards, and they were instrumental in the arrival of commercial viticulture in Uruguay in 1870, mainly by Basques and Catalans from the Pyrenees region. Many other founding families came from south of France and north of Italy, and a few from Germany, Switzerland and Algeria. Most of them established their vineyards in the south, near the capital city Montevideo. The two main grape varieties first established were Vitis vinifera Tannat and Folle Noir, originating from France [1]. The first one was introduced by Pascual Harriague, a Frenchman from the Basque region, who planted a vineyard of Tannat in 1870, 400 km north of Montevideo, on the outskirts of the city of Salto. Later in the 1880s, this vineyard together with a small winery were bought by the British brothers G. and C. Dickinson & Co., who transformed the winery into one of the best of that time, including a laboratory for microbiology [1]. This was an interesting contribution to the South American wine technology of those days, taking into account that the first studies concerning wine microbiology were published by Louis Pasteur in 1866. Although the technology improved between 1930 and 1970, the wine producers thought in terms of increasing quantity rather than increasing quality. This could be explained by the existence of a closed market for imported wines, very little demand for quality by the consumer and an increase in the local consumption of wine from about 15 to 28 1iters per capita. During the 50s the first hybrids were introduced, the production of Tannat wines were usually blended with Muscat varieties or with these red hybrids and the Harriague wine (name given to Tannat at the time), did not have very good reputation. The search for quality During the 70’s an important phase started aiming for quality and with one clear objective: export. A few private projects began to develop a regional fine wines market, particularly searching for new soils and region conditions all around the country.

Ten years of research on Vitis vinifera Tannat 55

Some of the pioneers of these changes were Juan Carrau in the northeast Rivera region in collaboration with the University of California, Davis [2]; the Faraut family in the central part of the country (Durazno Province); Dante Irurtia in the Carmelo region and other smaller producers that created in 1975 the CREA groups (Regional Centers for Agricultural Experimentation) of grape growers. The first Tannat selected clones and virus free plants were introduced in those days, imported from France and California. Therefore, the Uruguayan Tannat vines are composed by many very old vineyards coming from the original plant material brought by Harriague in 1870, and these first selected clones introduced 100 years later. A summary of the present statistics of the Uruguayan wine industry is shown in Tables 1 and 2. Uruguay is a land of small vineyards in private enterprises (only 1.02% organized in cooperatives and 1.76% in CREA groups). Most of these grape-growers have been running their businesses for more than three generations. The Uruguayan wine industry is, for example, comparable in size with the New Zealand wine industry, except that Uruguayans consume 32 liters per capita per year, doubling the domestic general consumption of New Zealand [3]. It must also be highlighted that Uruguay is considered the purest environment for vineyards of the world, according to the Environmental Sustainability Index (ESI) developed by Yale and Columbia Universities, where different key parameters like air, soil, water, education, etc., are evaluated within 143 countries [4]. According to this index, Uruguay ranked third in the world, after Finland and Norway. An overview of the amount of Vitis vinifera planted in Uruguay is shown in Table 2. Since the 1970’s, Uruguay has been producing fine wines with the Tannat grape which is today considered the Uruguayan flagship variety [5]. It accounts for 1784 hectares of the area of V. vinifera grapes planted in 2009 (Table 2), representing 25% of the total wine grapes. Uruguay was the only country in the Americas where this grape was found 15 years ago [6]. For this reason, the strategy has been to produce wines with this grape using state-of-the-art viticultural technology. In comparison to the viniferas that were planted 10 years ago, there has been an increase of around 3.000 hectares in this period [5]. Oenology: R&D in the industry In 1988, the first oenology course of international level was organized by the CREA groups under the guidance of Professor Robert Cordonnier (from Montpellier). In the 1990s, although the quality of viticultural material had

F. Carrau et al. 56

Table 1. Statistics of the Uruguayan wine and vines sector.

Hectares planted with vineyards 8.300

Hectares of Vitis vinifera wine varieties 7.500

Grapes producers 2.500

Wine production / year 800.000 hectoliters in 2009

Local consumption 97.0 % (32 L /capita /year including

imported wines)

Exports 3.0% (35.000 cases in 1996)

Total wineries 258 (52% producing under 100.000

liters per year). Source INAVI - Instituto Nacional de Vitivinicultura – Uruguay (2009). Table 2. Major V. vinifera wine varieties in Uruguay, total grape area for 2009 were 7.500 hectares.

Source INAVI - Instituto Nacional de Vitivinicultura – Uruguay (www.inavi.com.uy, 2009).


improved, R&D on winemaking and oenology under Uruguayan conditions was still very limited. During this time, only a few missions organized by the Centro de Bodegueros (Consultant winemaker Paul Hobbs from California) and wine tastings organized by INAVI (Consultant Dr M. Isabel Mijares, Professor D. Cabezudo and Dr Jose Saez, all from Spain) continued to maintain a minimal critical evaluation, necessary for the evolution of wine quality. Aiming to fill this gap and to give the Uruguayan winemakers the opportunities to acquire the essential knowledge for the next millennium, the School of Chemistry of the Universidad de la República started to organize Advanced Courses of Oenology in 1996 with invited researchers [5]. The first part of these courses included: aroma compounds (Dr G. Versini, Italy), wine microbiology and biotechnology (Dr P. Henschke, Australia) and practical winemaking (invited winemaker Charles Hopkins, South Africa). Since 1994, the oenology section of the School of Chemistry (previously directed by Prof. Cano Marotta) has designed a strategic plan for improving research and has undertaken research projects on:

1. recovery and genetic characterization of old and new Tannat clones 2. biological control of Vitis viniferas pathogenic fungi with native

yeasts and bacteria [7] 3. selection of native yeasts and lactic bacteria. Mixed strain fermentations

with an impact on aroma compounds resulting in increased Tannat complexity.

4. characterization of aroma and phenol compounds from V. vinifera Tannat and other grapes cultivated in Uruguay

5. antioxidant potential and health benefits of V. vinifera Tannat wines. Grape and wine composition

6. understanding consumer expectations about Tannat, sensory analysis, communication and packaging [8].

Tannat clones diversity Paradoxically, very few studies have genetically differentiated clones within a grape variety and together with Pinot noir, the quite unknown Tannat variety is one of the exceptions. Many analyzed microsatellite loci amplified only one allele, implying that Tannat is a highly homozygous variety. For a given set of 15 microsatellites the level of homozygosity was 53 % for Tannat, in contrast to 6 % for Pinot, 20 % for both Cabernet Franc and Chardonnay and 33 % for Cabernet Sauvignon.

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Gonzalez Techera et al. [9] showed that the Tannat clones are genetically very uniform and that the ampelographic differences assigned to the different clones [10] are probably due to epigenetic differences. Only one microsatellite (VMCNg 1d12) out of 89 tested in this study, could clearly distinguish two groups of clones. Both old Uruguayan clones and French commercial clones were found in each group, suggesting that the original sources were probably the same. Interestingly, studying the molecular diversity within Pinot noir clones, 15 microsatellite loci out of 100 were found to be polymorphic, 12 clones out of the 25 under study could be uniquely distinguished and the remaining 13 clones could be separated into 3 groups [11]. These results for Pinot noir contrast with those found for Tannat clones, suggesting that there could have been only two different original sources and propagation histories for these Tannat clones. The considerable clonal diversity observed in Pinot noir may reflect the old origin of this variety, its spreading and crossing history and/or a genome that is more prone to accumulate mutations. However, in spite of the very limited clone diversity found in Tannat, this variety was defined by Durquety as an ancient “cépage” [12] of southwestern France. Historically, Tannat was the dominant and almost exclusive variety planted in the Madiran region of France [13]. This geographic isolation may have promoted natural events of self-fertilization which could explain the high frequency of homozygous loci found for this variety. In contrast with the Pinots, where the viability of selfed progenies declines after a few generations [14], an inbreeding process is not detrimental to Tannat. In the breeding programs of INRA, France, self-fertilization of Tannat plants has been performed successfully, although the resulting new varieties did not perform very well for red wines [15]. On the other hand, the statistical analysis of concentrations for aroma compounds from microvinifications also resulted in the same two groupings of Tannat clones [9]. Interestingly, this was the first report of a correlation between aroma-related compounds and molecular markers within clones of a Vitis vinifera cultivar. 2. Tannat grape and wine composition. Aroma and polyphenols Free and bound volatile compounds of grapes and wines play a definitive role in the quality of our food and luxury products, as a result of their pronounced effect on our sensory organs. As is the case with most food products, the aroma or "bouquet" of a wine is influenced by the action of several hundred different compounds on the human sensory organs.


Besides, the composition of odorous molecules in grapes is often used for varietal differentiation. The rationale for these studies is that the concentration of volatile compounds of grapes including several alcohols, esters, acids, terpenes, ketones, and aldehydes, can vary depending on the variety [16-18]. Specifically, quali-quantitative composition of terpenes is considered to be very strictly related to varietal origin [16-19]. Genes encoding enzymes catalyzing the biosynthesis of monoterpenes are responsible for the production of these compounds with large structural diversity. In grapes and wines, terpenes can be present in free or bound (glycoside) form. After their synthesis they are converted into their more hydrophilic form in order to prevent cell membrane damage [20]. Glycosidically conjugated terpenes are not odorous and in most cases they are more abundant than non-glycosylated free forms; they give a potential contribution to the aroma of the grape as they are varietal aroma precursors and, during the winemaking process, some terpene compounds can be generated from these precursors through slow enzymatic or chemical hydrolysis [21, 22]. In wines the aroma is influenced by many different factors: grape variety, climate, soil, fermentation conditions, yeast strains, and other oenological production processes. The resulting aromatic profile, with its qualitative and quantitative descriptors, has a key role in the characterization of a typical wine, and compounds considered strictly related to the variety like terpenes and norisoprenoids can be important for the expression of varietal characteristics in wine [23, 24].

Finally, the total content of aroma compounds in wine amounts to approximately 0.8-1.2 g/1, which is equivalent to about 1% of the ethanol concentration. Significant differences exist amongst the individual grape varieties pertaining to the composition of the aroma compounds. From the aromagrams (finger print patterns) it is clear that the quantity of different components (key substances) vary greatly from one another. The work carried out in recent years has demonstrated that most flavor compounds in non-floral grapes are in glycosylated form [25, 26]. It has been proved that some important aromas in wine come from these flavor precursors. For example, β-damascenone, vitispirane, Riesling acetal, 1,1,6-trimethyl-1,2-dihydronaphthalene (TDN), and tert-1-(2,3,6-trimethylphenyl)but-1,3-diene (TPB) are present as free molecules at low or even null levels in grapes, whereas they can be found at higher concentrations in aged wines [27, 28]. Some important monoterpenes, such as α-terpineol, linalool, and geraniol, are also formed from glycoside precursors during fermentation [29, 30], although in this case other sources coexist, such as de novo synthesis [31] or the chemical transformation of free monoterpenes by wine yeasts [31, 32]. In any case, it can be stated that there is strong evidence supporting the

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existence of a connection between the aromatic quality of wine and the grape content of aroma precursors [33]. Tannat grapes produce a very colorful wine, with high acidity and amounts of tannins which allow it to keep for a long time; however, its aroma intensity has been considered moderate when compared to other grape varieties like Cabernet Sauvignon. In our research strategy regarding the aroma components of Tannat wines, we focused the attention principally on compounds possibly linked to varietal peculiarities, in particular the isoprenoids and compounds such as monoterpenols and their bound forms, with the aim of improving the characterization and classification of young Tannat wines [34]. The analytical characterization of the complex flavor profile of Tannat [35] was started as the first approach to better understand this variety. The presence of high concentrations of aromatic glycosylated compounds in Tannat derived from aromatic aglycones, such as C13-norisoprenoids, benzene derivatives, volatile phenols and aliphatic alcohols was determined [36]. From a sensory point of view, Tannat wine aromas were described as raspberry, plum, quince, and small-berry-like scents. In aged wines the aroma descriptors change to dry fruits, smoked, and licorice character [37, 38]. Possible peculiarities of the free forms and also the heteroside fraction may explain some of these aroma descriptors [35]. Sensory analysis of hydrolyzed products also demonstrates the contribution of other glycosylated compounds on Tannat wines [39, 40]. On the other hand, the process of acid hydrolysis occurs quite slowly and can also promote the rearrangement of aglycones, resulting in new aroma molecules [41-43]. Furthermore, the richness of the flavor and quality improvement can be reached through malolactic fermentation (MLF). The influence of lactic acid bacteria during MLF on glycosylated compounds of V. vinifera Tannat wines, using traditional winemaking conditions has also been demonstrated [44, 45]. β-Glycosidase activity of lactic acid bacteria can be proposed as a useful tool for aroma liberation in winemaking. Some modifications found were related to fruity aroma notes, for example differences in “raspberry”, “cherry”, “apricot”, and “dried fig” descriptors. Finally, according to our first results [40], the application of GC-olfactometry technique could also be used for a more in-depth study of the impact of free and bound aroma compounds in this variety. Our data confirmed the presence and potential importance of the relatively high amounts of γ-decalactone and the low levels of linalool, ethyl 2-methylpropanoate, and ethyl hexanoate in the wines of the Tannat variety which were also found to be rich in β-damascenone.


These results clearly indicate the ability to objectively measure fruit quality as an important requirement to enhance wine quality. However, for glycosylated compounds, no correlation has been found between the classic parameters of fruit evaluation (sugar, pH, acidity) and their concentration. The only method fast enough to assess these glycoconjugates (Glycosyl-Glucose method) is the one developed by Williams et al. [25] and further modified, but this assay might still be considered as a too complex and time-consuming analytical method for practical use when many samples need to be analyzed in a short period of time. Recently, we examined the potential of NIR spectroscopy in combination with chemometric techniques to determine the concentration of the different glycosylated aroma compounds present in Tannat grapes cultivated in Uruguay [46]. Occurrence of polyphenols in Tannat wines Grapes and wine contain different classes of polyphenols. Anthocyanins are responsible for the wine red color while flavan-3-ols are responsible for wine astringency and bitterness. Polymerization of both polyphenol groups contributes to the stabilization of aged wine color. Another group of polyphenols, the flavonols, are usually found as glycosidic forms in almost all higher plants. Phenolic compounds are mainly found in the seeds and internal layers of grape skins, whereas the pulp usually contains very low amounts. Their concentration depends on the cultivar and is influenced by viticultural and environmental factors. The color of wine is one of the first features perceived by consumers, influencing its acceptance and informing about its age, storage conditions, etc. Anthocyanins are extracted to the must during winemaking, providing the characteristic red-purple hue of the young red wines. Once extracted, and at the end of the fermentation, its concentration begins to decline probably due to adsorption by yeasts in the first steps of winemaking, as it was demonstrated for Tannat wines anthocyanins [47]. Later, anthocyanins disappearance could be related to their precipitation or to different type of chemical transformations as condensation, polymerization and oxidation reactions. Some of these chemical modifications imply the anthocyanins degradation, whereas other modifications could yield products that can provide, in turn, different hues to the wine. As a result, during aging the color of the wine evolves to orange-brick hues.

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In the international wine market there is an increasing demand for Tannat wines because they are considered to be original, rich in structure and with aging potential. In fact, one of the most remarkable features of these wines is their intense color, and some studies have shown that Tannat wines, when compared to red wines made from other grape varieties, possess the highest pigment contents [4, 48]. These wines are also characterized by high tannin contents, which lend structure to the wine. Thus, the phenolic fraction of this variety is, nowadays, beginning to be the aim of different studies. The main anthocyanins and their variations with vintage and vineyard treatments have also been reported for Tannat grapes [49]. The anthocyanins composition in young Tannat wines [49, 50] and the qualitative and quantitative changes produced during aging in the main pigment families (anthocyanins, pyranoanthocyanins, direct and acetaldehyde-mediated flavanol-anthocyanin condensation products) have been reported in detail [49]. The wine color properties were considered in order to monitor the color evolution during a 6-year aging period, and also to establish the contribution of the anthocyanin profile to the wine quality [49]. The flavonols, which are found in the grape skins, are extracted to the wine during the vinification. Their content in Tannat grapes was studied and the main compounds quantified were the glucosides and galactosides of quercetin and miricetin, and the laricetin and syringetin glucosides [51]. Grape tannins are sensorial significant components for wine quality. In the wine, the term tannin describes a range of polyphenolic compounds which includes the flavan-3-ol monomers and the proanthocyanidins. Proanthocyanidins are found in all the grape parts, but skins contain lower amounts of proanthocyanidins than do seeds, and their structural characteristics also differ [52]. Grape seed tannins comprise only the procyanidins [53, 54], whereas grape skin tannins comprise both prodelphinidins and procyanidins [53, 55]. Skin proanthocyanidins have a higher mean degree of polymerization (mDP) and a lower percentage of galloylated subunits than those from seeds [56, 57]. Tannat seed flavan-3-ols showed mDP values ranging from 2,5 to 3,0 with an increase during ripening, while the galloylation percentage was around 40% with lower values during maturity [51] (Table 3). In the Tannat skin flavan-3-ol, the prodelphinidins percentage ranged from 30% to 35%, but galloylated forms were not detected [51].


Table 3. Flavan-3-ol evolution in V. vinifera cv Tannat grape seeds.

Sampling: m1, 20 days after veraison; m2, 10 days before harvest; m3, harvest. Different letters indicate significant differences (p<0.05)3. Functional nutrient and health. 3. Functional nutrient and health

Tannat and oxidative stress During the past decade, many epidemiological studies have shown that the Mediterranean diet appears to have beneficial effects on cardiovascular diseases, a fact that has been known as the “French paradox” [58]. Epidemiological studies have also indicated that dietary habits could influence the incidence or evolution of pathologies such as neurodegenerative disorders [59] in which oxidative stress has been identified as a main contributor. The regular and moderate consumption of wine, especially red wine, appears to be one of the main reasons for these healthy effects. Flavan-3-ols or flavonoids, such as catechin, epicatechin and procyanidins, contribute to the major antioxidant activity of red wines in the prevention of low-density lipoprotein (LDL) cholesterol oxidation [60]. The amount of flavonoids in red wine depends on the grape variety, cultivation area, sun exposure, wine-making technique and wine age [61-63]. Stilbene derivatives present in red wines, as resveratrol, are also postulated as the compounds responsible for the French Paradox. The measurement of resveratrol levels in Tannat wines resulted in an average of 2.7 mg/L, a value higher than the one reported for Pinot Noir, Merlot and Cabernet wines [64]. More recently, Corder et al. [64] used cultured endothelial cells to identify the most potent vasoactive polyphenols in red wine. These compounds were shown to be straight-chain B-type oligomeric procyanidins (OPCs) (tetra-epicatechin gallate, m/z = 1305; procyanidin trimer-gallate, m/z = 1017; procyanidin tetramer, m/z = 1153; and pentamer-gallate, m/z = 1593) by high-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry. To investigate how the OPC content of red wines from a particular region might relate to mortality in that region, the authors compared wines produced in areas of increased longevity (as an index of overall good health) with a broad selection of wines

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from different countries. Gers or the Southwest of France was shown to have the higher index of human longevity, and this was correlated to the higher OPC content of the wines produced in that region. The authors mention that the higher OPC concentration in wines from southwest France is due to the flavonoid-rich Tannat grape, which makes up a large proportion of the grapes used to produce local wines in the Gers area but is rarely grown elsewhere [65]. Tannat antioxidant activity Moreover, the prevention of pathologies associated with oxidative stress has been related to red wine consumption and the antioxidant phenolic compounds have been suggested as being responsible for this effect. Although a correlation between the antioxidant properties of red wine and its content of phenolic compounds such as flavanols, anthocyanins and tannic acid has been described, the antioxidant properties of red wine has been linked with total polyphenol concentration rather than with individual polyphenols [66]. In this context, different viticultural practices, vinification and maturation processes of the red wine Tannat variety were studied [67] as possible factors influencing the antioxidant capacity and phenolic composition of red wines. In all Tannat wines studied, antioxidant capacity increased with aging although most of the phenolic families remained constant, suggesting the relevance of qualitative changes of these compounds for antioxidant capacity. The same authors [68] intended to assess the cytoprotective capacity of Tannat wine and its phenolic fractions against an oxidative stress stimulus in the pheochromocytoma cell line PC12. The results pointed to natural polyphenols as potential neuroprotective compounds and showed that the specific phenolic fraction is involved in wine cytoprotective properties. Guigluicci et al. [69] reported biochemical modifications of the wine flavonoids during aging that modified their antioxidant properties. The authors paid particular attention to polyphenols of Tannat wine using human low-density lipoprotein (LDL) as clinical model and spectroscopic analysis to follow the oxidation products. In this case it was reported that younger Tannat wines had a more active inhibition of the LDL oxidation by peroxinitrite and lipooxigenase and, as it was expected, shorter macerations time during vinification and barrel aging could also decrease this capacity. On the other hand, Tannat wines with similar total polyphenol content as a Californian Merlot or Cabernet Sauvignon demonstrated double inhibition effect in the oxidation of LDL. The dilution factor for these experiments in a standard red wine is about 1/1000 [70], while for the Tannat wines dilutions


up to 1/3000 were necessary to discriminate the different treatments. Interestingly, they also showed that an open bottle could lose 30% of its antioxidant capacity after being open for 6 hours [69]. Based on these previous results, Bracesco et al. [71] analyzed a possible genome protection provided by Tannat wine in yeast cell populations exposed to H2O2. Haploid and diploid strains of Saccharomyces cerevisiae were used as eukaryotic model. Cell samples were exposed to H2O2 in a nutrient medium. Chromosomal DNA was analyzed after isolation and separation by pulsed field electrophoresis. Double strand breaks were determined by laser densitometry and application of Poisson distribution. Both haploid and diploid cells showed H2O2 dose dependent DNA fractionation, as well as an increase of lethal -and mutation- events. Upon combination of the Tannat wine and H2O2, a significant decrease of double strand breaks was observed, in association with an increase in surviving fractions. Moreover, no mutagenic effect was observed after wine exposure. Part of the observations regarding protective wine effect was simulated by exposure to high concentrations of α-tocopherol. These results indicate that a grape derivative could act as a genome shielder increasing cell survival probabilities. Among others, the molecular targets involved could be components of transduction redox cascades as well as DNA repair enzymes. 4. Winemaking technology, the Uruguayan strategy As mentioned above, the cultivation area for V. vinifera Tannat is the most extensive in Uruguay and represents the double of hectares cultivated in the French Pyrenees region. Tannat wines are rich in color and tannin contents (two or three times the total polyphenol content of an average Cabernet Sauvignon), but this may result in limited aroma intensity [5]. Moreover, the high polyphenol content of this variety could be explained by a different adaptation to its natural habitat when compared to other varieties. For example, Muscat aromatic varieties may have developed a different environmental strategy, reaching monoterpene concentrations one hundred times higher than other white varieties (e.g. Chardonnay or Sauvignon) or the majority of red varieties. In the last ten years, Uruguayan winemakers and researchers have focused their work in the search for modifications that could increase the aroma expression of the glycosylated aroma compounds of this variety. In parallel, “sur lie” aging winemaking practices resulted in more soft and friendly tannins in the final wine. The results of this work had a great impact on the development of new approaches for the canopy and fruit management,

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open tanks maceration methods, native yeast selection, barrel microxygenation processes and bottle aging. In fact, many vineyard and winemaking practices are being investigated to increase grape aroma precursors and the sensory expression of this variety [31, 34, 45, 47, 73, 74]. As it was stated, the presence of high concentrations of aromatic glycosylated compounds in Tannat [36] furthered the selection of yeast strains applicable for this grape variety and showing increased glucosidase capacity [75]. These odorless glycosidic compounds can be hydrolysed by yeast and malolactic bacteria enzymes during fermentation, as it was demonstrated for Tannat [45]. On the other hand, the presence of high levels of phenolic acids in this variety, the precursors of ethyphenol aroma typically developed by Brettanomyces strains during barrel aging in red wines, has challenged winemakers to monitor this contamination more strictly [76] than for other red wines so as to prevent losing fruit intensity of the final wine. Interestingly, from the winemaking point of view it is worthy to answer the question of: why has this variety been planted in the last 10 years in California, Chile, Argentina, Australia and South Africa. The evident answer is that Tannat grapes give wines with great structure and components which contribute to the wine protection from oxidation in the bottle during the marketing process. Furthermore, between 1985 and 1992, well-known varieties from exotic countries were attractive for a very limited type of consumer. During the last 15 years, an 'experimental consumer' has appeared in the market, particularly interested in New World wines. In this last period, the Tannat variety started to grow and open some important markets. Tannat is the Uruguayan answer to Argentinean Malbec or New Zealand’s Sauvignon blanc. So, although in the beginning it was somewhat difficult to export wines from a small unknown country to the rest of the world, after some years of traveling and participating in fairs in Europe and North America, markets have started to open where Uruguayan wine had not been available before. These new markets include countries such as Finland, Germany, the Netherlands, Denmark, United States, UK, Switzerland, Sweden, Norway and Canada. Even though exports are still too small to be known in the international market, they are expected to increase five-fold by the year 2020. A new organization, Wines of Uruguay (WOU), has defined Tannat as the flagship wine for the next 5 years marketing strategy for the US and European markets, as the ideal wine to differentiate Uruguay from other New World wine producers. This country could occupy an interesting position within the quality wines of the international market in the near future.


Tannat: Signature red of Uruguay, one example of the many interesting wines now fighting for shelf space from all over the world. The ABCs of Wine Updated Glossary by Dorothy J. Gaiter and John Brecher

The Wall Street Journal, Sunday May 16th, 2009. 5. Perspectives for the 21st century Our researchers in oenology, both chemists and biologists, employ the most efficient analytical methods to conduct their research on the Tannat variety. New molecules of wine aroma, color and flavor have been identified. Besides, we have profiled red wines for important polyphenolic secondary metabolites such as proanthocyanidin and tannins. Sensory analysis, included in the laboratory alongside chemical analysis methods, reveals the importance of molecules present at very low concentrations and the importance of the interactions between them. Genomics used in research on plants, yeast and bacteria reveals the extraordinary complexity of this work for the optimal use of the natural biodiversity involved. Wondering about how chemical composition affects the flavor and body of a wine took our group from the work in viticulture and enology into metabolomics research. There are so many questions in wine science that maybe only a global analysis might start to give answers. Is the so called wine-omics the answer? Does knowing the chemistry behind that wonderful bottle of wine take away the pleasure? Research, Development and Innovation - no question, 21st century is all about them. Acknowledgements The authors wish to thank the scientific assistance of Dr. G. Versini (Istituto Agrario di San Michele all’Adige, Trento, Italy) and Dr. P. Henschke (Australian Wine Research Institute, Adelaide, Australia). Financial support for these ten years of research came from Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIA), Comisión Sectorial de Investigación Científica (CSIC-UdelaR), Agencia Nacional de Investigación e Innovación (ANII-PDT, Fondo Clemente Estable). We also wish to thank to Dr. Rosana Filip for her invitation to participate in this publication.

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