libro resumenes AVEDILA 2013 con erratas corregidas y … · complejo para un mundo ... otra nueva...

XVIII XVIII SimposioSimposioAnualAnualAvedilaAvedila

LIBRO DE LIBRO DE RESRESÚÚMENESMENES

www.avedila2013www.avedila2013.es.es

Madrid, 14 y 15 de noviembre de 2013Madrid, 14 y 15 de noviembre de 2013

LIBRO DE RESUMENES

Madrid, noviembre de 2013

2

Edita: ©Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente Secretaría General Técnica Centro de Publicaciones Maquetación, impresión y encuadernación: Talleres del Centro de Publicaciones del MAGRAMA NIPO: 280-23-223-0 (Papel) NIPO: 280-13-224-6 (Línea) ISBN: 978-84-491-1303-1 Depósito Legal: M-31630-2013 Catálogo de Publicaciones de la Administración General del Estado: http://publicacionesoficiales.boe.es/

Datos técnicos: Formato; 17x24 cm. Caja de texto: 12,5x21,5 cm. Composición: una columna. Tipografía: Calibrí a cuerpo 10-11-16-30 y Perpetua a cuerpo 50. Encuadernación: Rústica fresado. Papel: interior cyclus de 90g. Cubierta en cartulina mate de 150g. Tintas: 1. En esta publicación se ha utilizado papel libre de cloro de acuerdo con los criterios medioambientales de la contratación pública.

Distribución y venta: Paseo de la Infanta Isabel, 1

28014 Madrid Teléfono: 91 347 55 41

Fax: 91 347 57 22

Plaza de San Juan de la Cruz s/n 28003 Madrid

Teléfono: 91 597 61 87

Fax: 91 591 61 86

Tienda virtual: www.magrama.es email: [email protected]

MINISTERIO DE AGRICULTURA, ALIMENTACIÓN Y MEDIO AMBIENTE

3

Bienvenida 5

Comité Organizador 7

Comité Científico 8

Patrocinadores 9

Fecha de celebración, Sede 10

Programa 13

Resúmenes Conferencias 19

Resúmenes pósters 81

Autores 123

Índice:

5

Estimado amigo:

En nombre del comité organizador y el comité científico te damos la

bienvenida al XVIII Simposio Anual de AVEDILA que se celebra en Madrid los

días 14 y 15 de noviembre de 2013.

La presente cita, es sin duda, un foro excepcional en que compartir

experiencias en el ámbito del diagnóstico laboratorial veterinario. Esperamos

que esta reunión, sirva a todos como un nexo común para establecer nuevas y

fructíferas colaboraciones con otros profesionales de esta área de trabajo y

permitir el intercambio de conocimientos que nos lleve a una mejora

constante en el campo del diagnóstico.

Agradecer en especial al Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio

Ambiente y a la Asociación de Veterinarios Especialistas en Diagnóstico de

Laboratorio (AVEDILA) el apoyo mostrado en la consecución de este evento, así

como a los patrocinadores sin cuya ayuda no hubiese tenido lugar este

simposio.

Espero que disfrutes de estos días tanto a nivel personal como profesional.

Concepción Gómez‐Tejedor

y

Tomás Mayoral

Bienvenida:

7

Concepción Gómez‐Tejedor Ortiz. Coordinadora General de Laboratorios. Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente (MAGRAMA).

Tomás Mayoral Ortega. Laboratorio de Genética Molecular. Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA.

Enrique Anadón Navarro. Laboratorio de Genética Molecular. Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA.

Montserrat Agüero García. Laboratorio de Sanidad Animal. Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA.

Manuel Durán Ferrer. Laboratorio de Sanidad Animal. Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA.

Lucia Belén Pitarch Mampel. Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA.

Comité Organizador:

8

Concepción Gómez‐Tejedor Ortiz. Coordinadora General de Laboratorios. Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente (MAGRAMA). Tomás Mayoral Ortega. Laboratorio de Genética Molecular. Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA. Montserrat Agüero García. Laboratorio de Sanidad Animal. Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA. Ramón Juste Jordán. NEIKER‐Tecnalia. Concha Caballero Galván. Unidad de Análisis de Sanidad Animal (UASA). Generalitat Valenciana. Carmina Nogareda Burch. ETSEA, Universidad de Lérida. Josep Carrera Mauri. Laboratorio de Sanidad Ganadera de Vic. Generalitat de Cataluña. Marta Eulalia García Sánchez. Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid. José‐Marín Sánchez Murillo. Laboratorio Regional de Sanidad Animal. Junta de Extremadura. Lourdes Porquet Garanto. Laboratorios HIPRA, S.A. Virginia Vigo López. Laboratorio de Sanidad Animal de Canarias. Gobierno de Canarias. Eva Monleón Moscardó. Facultad de Medicina. Universidad de Zaragoza. Mariano Morales Amella. Laboratorios ALBEITAR.

Comité Científico:

9

Patrocinadores:

10

14 y 15 de noviembre de 2013. http://www.avedila2013.es Fundación Carlos de Amberes. C/ Claudio Coello, nº99. 28006. Madrid. http://www.fcamberes.org

Fecha de celebración:

Sede:

11

Programa

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Jueves, 14 noviembre, 2013

8:30‐9:15 Entrega de documentación

9:15‐9:45 Inauguración oficial del simposio.

Dª. Carmen Vela.

Secretaria de Estado de Investigación, Desarrollo e Innovación.

Ministerio de Economía y Competitividad.

Sesión 1 Moderadora: Concepción Gómez –Tejedor.

(Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente).

9:45‐11:00 Biodiversidad y enfermedades emergentes: un concepto ecológico complejo para un mundo cambiante.

Ramón Soriguer.

Estación Biológica de Doñana. CSIC.

Complejidad del mundo vírico y evolución. Miguel Ángel Jiménez

Centro de Investigación en Sanidad Animal‐INIA.

11:00‐11:30 Pausa – Café

Sesión 2 Moderadora: Isabel Simarro

(Universidad Complutense de Madrid).

11:30‐12:10 Diagnóstico de patógenos en fauna silvestre.

Christian Gortázar.

Instituto de Investigación en Recursos Cinegéticos. UCLM.

12:10‐12:50 Técnicas de diagnostico de patógenos de moluscos bivalvos.

Raquel Aranguren.

I Instituto de Investigaciones Marinas, IIM‐CSIC.

Programa:

14

12:50‐13:00 Diagnóstico serológico del virus Schmallenberg y otros patógenos reproductivos en pequeños rumiantes de régimen

extensivo del sur de España

Lucía Reguillo Granados

Facultad de Veterinaria. Universidad de Córdoba/Centro de Investigación Agroalimentaria del Valle de los Pedroches

13:00‐13:10 Enfermedad de Schmallenberg: lesiones e identificación del virus

JF. García Marín

Dpto. Sanidad Animal, Anatomía Patológica. Facultad de Veterinaria. Universidad de León.

13:10‐13:20 Estudio de la sensibilidad antifúngica de Malassezia pachydermatis

S. Álvarez‐Pérez

Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid

13:20‐13:30 Diagnóstico serológico de la neosporosis bovina: estudio comparativo de pruebas ELISA comerciales

Daniel Gutiérrez‐Expósito

SALUVET. Facultad de Veterinaria, UCM

13:30‐14:30 Comida

14:30‐15:10 Visita Pósters

15:10‐15:50 Diagnóstico de ehrlichiosis canina.

Alejandra Villaescusa.

Dpto. de Medicina y Cirugía Animal – UCM

Sesión 3 Moderadora: Montserrat Agüero


15:50‐16:30 Detección e identificación de especies en muestras de origen animal por PCR.

Tomás Mayoral. Laboratorio de Genética Molecular‐ LCV. MAGRAMA.

16:30‐17:00 Pausa – Café

17:00‐17:40 Control de identidad en animales de explotación ganadera técnicas de genética molecular.

José Antonio Bouzada. Laboratorio de Genética. Molecular‐ LCV. MAGRAMA.

18:00 Asamblea General Avedila.

15

Viernes, 15 noviembre, 2013

Sesión 4 Moderadora: Concepción Caballero

(Unidad de Análisis en Sanidad Animal. Valencia)

8:30‐8:40 Monitorización de la seroconversión posinfección de PRRS mediante fluido oral

Alba Martos‐Raich

HIPRA

8:40‐8:50 Validation of the ID Screen Peste des Petits Ruminants Antigen Capture ELISA

L. Comtet

IDvet, Montpellier, France

8:50‐9:00 Comparación de la técnica de inmunoperoxidasa en monocapa de cultivo (IPMA) con tres ELISA comerciales para la detección de

circovirus porcino tipo 2 (PCV2)

Joaquim Segales

Centre de Recerca en Sanitat Animal (CReSA), UAB‐IRTA

9:00‐9:40 Bioseguridad en laboratorios de sanidad animal: Niveles de biocontención 2, 3 y 4.

Gonzalo Pascual.


9:40‐10:20 Red de Laboratorios de Alerta Biológica, RE‐LAB.

Carmen Cañavate.

Unidad de Gestión de la RE‐LAB. Instituto de Salud Carlos III.

10:20‐10:30 Una estrategia para aplicar la serología en el diagnóstico de la tuberculosis bovina

Alicia Aranaz

Universidad Complutense de Madrid

10:30‐10:40 Prevalencia de Clostridium difficile en aves.

Cristina Orden

Grupo de Investigación COVEMI. Universidad Complutense de Madrid

10:40‐10:50 Investigación sobre la presencia de Coxiella burnetii en quesos elaborados con leche cruda de oveja.

Álvaro Piñero

Neiker‐Tecnalia

16

10:50‐11:00 Brote de intoxicación botulínica en una granja de vacuno lechero

Mariano Domingo

Centre de Recerca en Sanitat Animal (UAB‐IRTA)

11:05‐11:35 Pausa – Café

Sesión 5 Moderador: Tomás Mayoral


11:35‐12:15 Claves para el diagnóstico de tricomonosis bovina.

Luis Ortega.

SALUVET‐UCM

12:15‐12:55 Diagnóstico de botulismo.

Francisco Javier García‐Peña.

Laboratorio Central de Veterinaria‐MAGRAMA.

Mesa Redonda:

Gestión de calidad y acreditación en laboratorios.

Aplicación de alcances de acreditación flexibles en los laboratorios de control oficial

Henny Hooghuis.

Laboratorio Arbitral Agroalimentario. MAGRAMA.

Aplicación del Reglamento (CE) 882/2004 para el control oficial: líneas de actuación para facilitar el cumplimiento de la acreditación

obligatoria de procedimientos analíticos.

Lucia Belén Pitarch.

Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA.

Experiencia práctica en la acreditación mediante categorías de ensayos.

Joaquín Berenguer.

Centro Nacional de Alimentación. AESAN.

12:55‐14:15

Gestión de Calidad y Acreditación de laboratorios.

Elisa Gredilla.

Entidad Nacional de Acreditación (ENAC).

14:15 Clausura del Simposio

D. Valentín Almansa.

Director General de Sanidad de la Producción Agraria. Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente.

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Resúmenes Conferencias

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O‐01

BIODIVERSIDAD Y ENFERMEDADES EMERGENTES: UN CONCEPTO ECOLOGÍCO COMPLEJO PARA UN MUNDO CAMBIANTE.

Ramón Soriguer

Estación Biológica de Doñana. CSIC.

El aumento de enfermedades emergentes y re‐emergentes (es decir, enfermedades nuevas que proceden de otras áreas geográficas, y enfermedades antiguas que incrementan su rango de distribución) se considera el resultado del cambio global debido, entre otros factores, a la alteración de los hábitat naturales, el cambio climático, los movimientos migratorios y la expansión de la población humana, la pérdida de biodiversidad, la intensificación de la agricultura y ganadería, la introducción de especies exóticas, la fragmentación del hábitat y el incremento de los transportes de mercancías, personas y animales. Muchas de estas enfermedades, con un ciclo zoonótico en su mayoría, resultan una importante amenaza para la conservación de la biodiversidad, pero también pueden afectar de manera directa o indirecta a la salud humana.

Recientemente se ha sugerido que la biodiversidad podría jugar un papel importante en reducir la frecuencia de epidemias al reducir la amplificación y transmisión de virus, protozoos y otros patógenos. Es por tanto importante conocer si esta menor transmisión se trata de una propiedad emergente de la biodiversidad en sí misma, o si por el contrario esta asociada a la presencia/ausencia de determinadas especies de vertebrados y, por lo tanto, los resultados obtenidos hasta ahora en las áreas estudiadas no pueden ser generalizados a otras áreas o sistemas de estudio.

Resúmenes conferencias:

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O‐02

COMPLEJIDAD DEL MUNDO VÍRICO Y EVOLUCIÓN.

Miguel Ángel Jiménez Clavero


En el siglo XVII, Leeuwenhoek, con su microscopio, abrió una ventana nueva que permitió descubrir un mundo hasta entonces desconocido, el de los microorganismos. De modo similar los recientes avances en técnicas de secuenciación masiva han dado lugar a una nueva disciplina, la metagenómica, que nos han abierto otra nueva ventana que revela la verdadera complejidad que existe en ese mundo microbiano, del cual solo conocíamos una pequeña fracción. Dentro de los microorganismos, la diversidad mayor correspondiente a los virus. Éstos no solo son las entidades biológicas más abundantes de la tierra, sino también las más variables y diversas. Existe una pléyade de virus capaces de infectar a cada una de las demás especies de seres vivos que existen en nuestro Planeta, sean éstas animales, plantas, hongos, bacterias o arqueas. La mayoría conviven pacíficamente con sus hospedadores, pero una pequeña parte causan enfermedades, es decir, son “patógenos”. Por razones obvias, de entre toda esa diversidad de virus conocida como “virosfera”, son los virus patógenos los que más nos interesan, y por ello los más estudiados y mejor conocidos. Sin embargo, la condición de patógeno no es un atributo estable, sino que puede fluctuar. Los virus pueden ganar patogenicidad o perderla dependiendo de cambios muy sutiles: a veces unas pocas mutaciones en su genoma son suficientes para convertir a un virus “pacífico” en patógeno. Entender los factores que desencadenan estos cambios es fundamental para comprender cómo emergen nuevas enfermedades infecciosas, un empeño nada fácil, pues la complejidad nos sale al paso en cualquiera de los niveles que intentemos abordar este fenómeno, ya sea desde el prisma de la interacción entre el virus y el hospedador (y en su caso, de la relación de ambos con los vectores), o desde perspectivas más ecológicas y evolutivas.

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O‐03

DIAGNÓSTICO DE PATÓGENOS EN FAUNA SILVESTRE.

Christian Gortázar

SaBio‐IREC (CSIC‐UCLM) Ronda de Toledo s.n. 13005 Ciudad Real

La mayor parte de los agentes infecciosos y parasitarios conocidos son

compartidos entre animales domésticos y fauna silvestre. Este hecho complica el control de muchos patógenos de importancia médica o veterinaria. España, por su situación geográfica próxima al continente Africano y por su clima, pero también por la variedad y riqueza de sus recursos faunísticos, constituye un laboratorio natural de especial interés en relación con la sanidad de la fauna silvestre. Por ello, resulta necesario contar con herramientas para la detección temprana de problemas sanitarios y desarrollar sistemas de monitorización poblacional y sanitaria que, a su vez, requieren de métodos diagnósticos adecuados. Sin embargo, el diagnóstico en fauna silvestre tiene diversas peculiaridades y dificultades especiales. En primer lugar, se trabaja con una enorme diversidad de especies, a diferencia del número comparativamente limitado de especies domésticas. En segundo lugar, la calidad y cantidad de las muestras no siempre resulta apropiada para la aplicación de determinadas analíticas. Finalmente, algunas técnicas no son aplicables a especies no tradicionales, o simplemente no se han validado. En la presentación se analizan varios ejemplos prácticos relacionados con el diagnóstico en fauna silvestre, desde infecciones por coronavirus y virus de la lengua azul, pasando por la tuberculosis y las cepas patógenas de E. coli, a algunos problemas parasitarios de importancia creciente. El mensaje final es que el diagnóstico de calidad en fauna silvestre es posible y cuenta con una demanda creciente y un importante liderazgo español, si bien requiere un continuo esfuerzo en innovación y desarrollo.

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O‐04

TÉCNICAS DE DIAGNOSTICO DE PATÓGENOS DE MOLUSCOS BIVALVOS.

R. Aranguren y A. Figueras

Laboratorio Nacional de Referencia de enfermedades de Moluscos Bivalvos. Instituto de Investigaciones Marinas, IIM‐CSIC.

El cultivo de moluscos bivalvos es una actividad acuícola bien implantada en muchos países del mundo. Su rentabilidad es alta y sus costes de producción son bajos dentro de las tecnologías de producción de cultivos acuícolas ya que la fase de pre‐engorde y engorde se realiza íntegramente en sistemas abiertos (bateas, playas o esteros). Uno de los principales retos a los que se enfrenta la producción de moluscos bivalvos es la prevención y el control de las enfermedades. Además la posibilidad de lucha contra estas enfermedades es muy limitada. Los moluscos bivalvos solo cuentan con el sistema inmune innato, por lo tanto no es específico y no tiene memoria, ésto significa que no podemos emplear las vacunas como herramienta de control. El hecho de que su cultivo se lleve a cabo en mar abierto también repercute negativamente en la posibilidad de lucha y control de las enfermedades.

La identificación y estudio del desarrollo de la enfermedad puede ayudar a controlar la dispersión de la misma, limitando las pérdidas debidas a mortalidad o morbilidad puesto que en determinadas situaciones, el desarrollo de una enfermedad que no mata al hospedador puede originar la pérdida de valor comercial del mismo como consecuencia de las malformaciones producidas.

La mayoría de las enfermedades de moluscos de declaración obligatoria para la Unión Europea son enfermedades causadas por protozoos. En muchos casos, los protozoos presentan un ciclo de vida complejo con múltiples hospedadores intermediarios. ‐ en el caso de que el parásito necesite tal hospedador para completar su ciclo de vida ‐, o reservorio, ‐ si simplemente se mantiene en dicho organismo sin desarrollarse‐.

Hasta el momento solo la prevención y un correcto y rápido diagnóstico pueden ayudarnos a combatir las enfermedades.

En el caso de las enfermedades causadas por virus, cabe resaltar la falta de líneas celulares de moluscos lo que hace que el diagnóstico y caracterización de virus que afectan a los moluscos bivalvos sea más difícil y a veces no se lleguen a un buen diagnóstico del agente patógeno.

Las perspectivas de investigación sobre las técnicas de diagnóstico para las enfermedades de moluscos bivalvos se orientan hacia la optimización, tanto en lo que respecta a la sensibilidad como a la especificidad, de las técnicas que ya están en uso y, al desarrollo de nuevas técnicas de Biología Molecular más rápidas y fáciles de aplicar

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(PCR cuantitativas). Estas técnicas permiten un diagnóstico temprano del patógeno incluso en etapas muy tempranas de la infección. Resulta interesante los intentos de diagnóstico múltiples de varios patógenos en un mismo hospedador mediante una única técnica (PCR) como ya se ha descrito para H. nelsoni, H. costale y P.marinus, aunque no se ha validado.

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O‐05

DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DEL VIRUS SCHMALLENBERG Y OTROS PATÓGENOS REPRODUCTIVOS EN PEQUEÑOS RUMIANTES DE RÉGIMEN

EXTENSIVO DEL SUR DE ESPAÑA

Reguillo, L; Gómez‐Laguna, J; Hernández, M; Cardoso‐Toset, F; Tarradas, C; Maldonado, A; Astorga, RJ.

Departamento de Sanidad Animal. Facultad de Veterinaria. Universidad de

Córdoba/Centro de Investigación Agroalimentaria del Valle de los Pedroches (CICAP) Tras un primer caso de Virus Schmallemberg (VSB) confirmado en el sur de España en marzo de 2012, se llevó a cabo un estudio serológico retrospectivo en rebaños de ovino en régimen extensivo de áreas cercanas con el fin de determinar la prevalencia de VSB y de otros patógenos reproductivos (Chlamydophila abortus, Coxiella burnetii, Border Disease virus ‘BDV’, Toxoplasma gondii y Neospora caninum). Paralelamente se investigó la presencia de anticuerpos en muestras de jugo de carne con el fin de validar su uso en estudios de seroprevalencia. Un total de 209 ovejas de desvieje de raza Merina, o sus cruces, procedentes de 12 explotaciones fueron muestreadas. Las muestras de suero y jugo de carne se tomaron en el matadero y fueron analizadas mediante kits comerciales de ELISA. Los patógenos con mayor prevalencia fueron C. abortus (62.68%, CI95 56.13‐69.23) y T. gondii (57.42%, CI95 50.72‐64.12). La seroprevalencia frente a BDV (16.27%, CI95 11.27‐21.27) y C. burnetii (13.88%, CI95 9.2‐18.56) fue moderada, y sólo 4 de 209 animales (2.39%, CI95 1.82‐2.96) presentaron anticuerpos específicos frente N. caninum y VSB. Todos los rebaños de ovino examinados fueron positivos a tres o más patógenos. El 25.36% de los rebaños fueron simultáneamente positivos frente a T. gondii y C. abortus. La concordancia entre muestras de suero y jugo de carne fue moderada para T. gondii (72.73%) y BDV (82.86%), y ajustada para C. abortus (65.71%). Nuestros resultados ponen de manifiesto la circulación de VSB en el verano de 2011 en el sur de España. En cualquier caso, C. abortus y T. gondii fueron los patógenos con mayor prevalencia detectada en ovino extensivo. Nuestros resultados preliminares señalan a la muestra de jugo de carne como una muestra biológica de potencial interés para los estudios de seroprevalencia en ovino. Palabras clave: VSB; seroprevalencia; suero; jugo de carne; ovino extensivo.

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O‐06

ENFERMEDAD DE SCHMALLENBERG: LESIONES E IDENTIFICACIÓN DEL VIRUS

García Marín, J.F. 1; Royo, L.J. 2; Gómez, A. 3; Polledo, L. 4 y Balseiro, A. 2

1 Dpto. Sanidad Animal, Anatomía Patológica. Facultad de Veterinaria. Universidad de León.

2 SERIDA, Asturias; 3 Veterinario, Salamanca. 4 Micros Veterinaria. León

En 2011 se diagnóstico por primera vez en Europa la Enfermedad de Smallenberg, causada por un Orthobunyavirus, familia Bunyaviridae (SBV) afectando a ganado vacuno y ovino de Alemania y Holanda y extendiéndose rápidamente a otros países. Hasta la marzo de este año se han comunicado 8,730 casos (Informe European Food Safe Authority (EFSA), marzo 2013) en diversos países Europeos. En España fue diagnosticada en ganado ovino en la provincia de Córdoba en 2012. Entre finales de enero y abril de 2013 se atendieron nueve partos distócicos de fetos de terneros nacidos muertos a término, de otros tantos rebaños localizados en la misma zona y en régimen extensivo observándose en los mismos malformaciones del aparato locomotor y esquelético. En dos de los animales se llevó a cabo una necropsia completa y toma de muestras sistemática para estudios anatomopatológicos. Las lesiones observadas fueron artrogriposis, tórticolis, escoliosis, cifosis, braquignatia e hipoplasia grave del SNC asociada a microcefalia, micromielia e hipoplasia de cerebelo muy manifiestas, junto con lisencefalia e hidranencefalia en el ternero 1 e hidrocefalia y porencefalia en el 2. En los músculos esqueléticos se apreció una intensa hipoplasia/atrofia de lo mismos. En muestras de sangre, SNC, líquido cefalorraquídeo, músculo esquelético, bazo, timo, cordón umbilical, moco de placenta y líquido ascítico se realizaron estudios de detección de ARN vírico mediante RT‐qPCR, siendo todas ellas positivas a excepción del líquido ascítico en el 1 y el líquido cefaloraquideo y placenta en el 2. Se llevaron a cabo estudios serológicos en 11 vacas, siendo 5 positivas, incluidas las madres de los 2 terneros necropsiados. Estos resultados confirman de la enfermedad de Schmallenberg en ganado vacuno en la región estudiada. Dado el extenso periodo de tiempo en que aparecieron los casos y los tipos de lesiones, así como las características epidemiológicas de esta enfermedad, indicarían una persistencia del vector infectante durante largos periodos de tiempo del verano e inicio del otoño de 2012. Asimismo, debido a la similitud de varias de las lesiones observadas con las ocasionadas por otros virus teratógenos, principalmente por BVD en ganado vacuno, se recomienda incluir esta enfermedad en los protocolos de diagnóstico diferencial.

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O‐07 ESTUDIO DE LA SENSIBILIDAD ANTIFÚNGICA DE Malassezia pachydermatis

Álvarez‐Pérez, S. 1,2; Blanco, J.L. 1; Peláez, T. 2; Cutuli, M. 1; García, M.E. 1

1 Departamento de Sanidad Animal, Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense

de Madrid; 2 Servicio de Microbiología Clínica y Enfermedades Infecciosas, Hospital General

Universitario ‘Gregorio Marañón’, Madrid

Malassezia pachydermatis es una levadura considerada como el principal agente fúngico causante de otitis canina, si bien también puede estar implicada en diversos procesos dermatológicos y, ocasionalmente, en infecciones sistémicas. A pesar de la importancia de M. pachydermatis en medicina veterinaria, aún se sabe poco sobre su sensibilidad a los distintos compuestos antifúngicos disponibles para el tratamiento de las micosis animales. El objetivo de este trabajo fue determinar el perfil de sensibilidad antifúngica in vitro de una colección de 60 aislamientos de M. pachydermatis procedentes de casos de otitis canina mediante un método comercial (Etest) y un método de referencia internacional (CLSI modificado para Malassezia), así como hacer una evaluación crítica de las posibilidades, dificultades y limitaciones de dichos métodos. Los resultados obtenidos muestran la sensibilidad de la mayoría de los aislamientos analizados frente a anfotericina B (CMI90 ≤1 mg/L), itraconazol (CMI90 ≤0.125 mg/L), posaconazol (CMI90 ≤1 mg/L) y voriconazol (CMI90 ≤0.5 mg/L). Por el contrario, todos los aislamientos mostraron limitada sensibilidad a caspofungina (CMI90 ≥16 mg/L), y una gran proporción (25‐36%, según el método empleado) presentaron moderada o reducida sensibilidad a fluconazol. En general, el método del Etest es más rápido y sencillo de realizar e interpretar que el método de referencia, si bien supone un notable coste económico. La concordancia entre ambos métodos es aceptable, aunque depende en gran medida del antifúngico analizado y el tiempo de incubación (48 ó 72 h). Otro factor que resulta crítico a la hora de evaluar y comparar los diferentes métodos de estudio in vitro de la sensibilidad antifúngica es el establecimiento de puntos de corte que permitan diferenciar entre aislamientos sensibles y resistentes de la levadura para cada compuesto y tengan además una significación clínica. Tales valores no han sido todavía determinados en el caso de Malassezia spp.

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O‐08

DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE LA NEOSPOROSIS BOVINA: ESTUDIO COMPARATIVO DE PRUEBAS ELISA COMERCIALES

Álvarez‐García, G., García‐Culebras, A., Gutiérrez‐Expósito, D., Navarro‐

Lozano, V., Pastor‐Fernández, I. y Ortega‐Mora, L.M.

SALUVET, Departamento de Sanidad Animal, Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid.

Actualmente, los programas de control frente a la neosporosis bovina se

basan en un diagnóstico serológico previo y en medidas de manejo ya que no existen vacunas ni tratamientos eficaces. A pesar de la gran variedad de técnicas serológicas disponibles, la prueba más utilizada y comercializada a nivel mundial es el ELISA (enzyme‐linked immunosorbent assay). Diversos estudios comparativos realizados en el pasado han quedado obsoletos debido al cambio de pruebas diagnósticas disponibles en el mercado. Por tanto no existen datos actualizados de las características diagnósticas de éstos nuevos ELISAs, de gran utilidad para los laboratorios de diagnóstico. Por ésta razón, el objetivo del presente estudio fue comparar la mayor parte de ELISAs comerciales que hay disponibles en la actualidad (n=10) evaluando su sensibilidad (Se) y espeficidad (Esp) y reajustando los puntos de corte cuando fuera necesario mediante análisis TG‐ROC. Se utilizó un panel de sueros de referencia de ganado bovino con infección natural y experimental, así como no infectado (n=458). Para el cálculo de la Se y Esp se consideraron 2 criterios “gold standard”: (i) el resultado mayoritario de todos los ELISAs y (ii) la información previa basada en datos epidemiológicos, clínicos y serológicos. En ambos casos la mayoría de los ELISAs mostraron niveles de Se y Esp elevados. Además, todas las pruebas mostraron una concordancia (valores kappa) casi perfecta a excepción de las comparaciones que incluían los ELISAs VMRD y SVANOVIR. Los ELISAs que mostraron los valores más elevados de Se y Esp fueron HIPRA‐CIVTEST, IDVET, BIOVET e IDEXX Rum (Se y Sp >95%). No obstante, tras los ajustes realizados mediante TG‐ROC, los ELISAs BIO‐X, LSI Bov, LSI Rum e IDEXX Bov también mostraron valores elevados de Se y Esp, siendo la mejora más significativa para los ELISAs SVANOVIR y VMRD. Los valores kappa mejoraron notablemente con el punto de corte corregido. Este es el primer estudio que ofrece una actualización de las características diagnósticas de los ELISAs comerciales actuales. Estos resultados son importantes y necesarios no solo para los laboratorios de diagnóstico sino también para las empresas que fabrican y distribuyen éstas pruebas.

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O‐09

DIAGNÓSTICO DE LA EHRLICHIOSIS CANINA.

Alejandra Villaescusa Fernández

Departamento de Medicina y Cirugía Animal. Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid.

INTRODUCCIÓN

Las ehrlichiosis caninas son enfermedades de transmisión vectorial causadas por

bacterias gramnegativas intracelulares obligadas del género Ehrlichia, familia Anaplasmataceae.1 En nuestro país hasta el momento solo se ha diagnosticado infección en perros por una de las especies del género, Ehrlichia canis, agente etiológico primario de la ehrlichiosis monocítica canina (EMC). La transmisión de E. canis es llevada a cabo por Rhipicephalus sanguineus, la garrapata más ubicua y frecuente en perros de nuestro país.

El diagnóstico de la EMC puede ser en ocasiones complicado, debido a que la enfermedad se caracterizada por la existencia de signos clínicos inespecíficos y alteraciones de la analítica sanguínea comunes con otras enfermedades. Esta inespecificidad de las manifestaciones clínicas hace que para el diagnóstico de la EMC sea necesario recurrir a pruebas analíticas específicas que determinen de forma directa o indirecta la infección por E. canis.

DIAGNÓSTICO CLÍNICO DE LA EHRLICHIOSIS MONOCÍTICA CANINA

La EMC es una enfermedad multisistémica caracterizada por manifestaciones

clínicas variables. Tras un período de incubación de 8‐20 días se describe en las infecciones experimentales el desarrollo de tres fases en la enfermedad: aguda, subclínica y crónica. Las fases aguda y crónica son las fases “sintomáticas”, mientras que durante la fase subclínica, que puede llegar a durar hasta 5 años en condiciones naturales, los perros parecen clínicamente sanos, mostrando únicamente alteraciones en la analítica sanguínea.1

Las fases aguda y crónica son en la infección natural difíciles de distinguir entre sí, ya que ambas se caracterizan por la presencia de signos clínicos inespecíficos. Concretamente destaca la aparición de fiebre, apatía, anorexia y pérdida de peso, que pueden acompañarse de linfadenomegalia, esplenomegalia, hepatomegalia y palidez de mucosas. Asimismo, es frecuente el hallazgo de signos hemorrágicos, principalmente epistaxis, petequias y equimosis. En ocasiones pueden observarse signos oftalmológicas, respiratorios, neurológicos, locomotores o, incluso, alteraciones

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reproductivas.1‐3 En la fase crónica grave de la EMC pueden aparecer signos clínicos asociados con el desarrollo de glomerulonefritis y/o hipoplasia o aplasia de médula ósea.3

Debido a la inespecificidad de los signos clínicos o a la ausencia de los mismos durante largos períodos de tiempo, no es infrecuente que sean los hallazgos de la analítica sanguínea los que nos hagan sospechar de esta enfermedad. Entre los cambios que con mayor frecuencia se describen en la hematología destacan la trombocitopenia y/o alteraciones en la funcionalidad plaquetaria, que pueden mantenerse durante todas las fases de la enfermedad.1‐3 También es frecuente observar en el curso de la EMC la existencia de anemia, que puede ser regenerativa o no regenerativa.2,3 Se puede producir tanto leucopenia como leucocitosis, aunque esta última es menos frecuente. Dentro de la serie blanca pueden encontrarse alteraciones muy variables, como neutropenia, linfocitosis o linfopenia y monocitosis.1

La hiperproteinemia por hiperglobulinemia generalmente debida a una gammapatía policlonal parece ser el hallazgo más frecuente en la bioquímica sanguínea en los perros con ehrlichiosis.2‐5 También se han descrito en la bioquímica sanguínea la existencia de hipoalbuminemia y elevaciones de algunas enzimas hepáticas, así como de la creatinina.1,2

TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO DIRECTO

Los métodos directos de diagnóstico de EMC se basan en la detección u observación del agente etiológico a partir de muestras obtenidas del animal sospechoso.

La identificación visual del agente, mediante la observación de mórulas de Ehrlichia spp. en el interior de los leucocitos a partir de frotis sanguíneos o aspirados de tejidos (como bazo, médula ósea, nódulo linfático, líquido cefalorraquídeo o líquido sinovial) permite un diagnóstico definitivo de la enfermedad.1 Sin embargo, y a pesar del desarrollo de técnicas destinadas a incrementar la posibilidad de identificar mórulas a partir de estas muestras, esta técnica resulta poco sensible, ya que las mórulas aparecen con mayor frecuencia en la fase aguda de la enfermedad y de forma transitoria. Además, para el empleo de esta técnica se requiere mucho tiempo y experiencia para la detección de las mórulas sin confundirlas con artefactos, tinciones mal realizadas u otras inclusiones.6

Otro posible método de diagnóstico directo de la infección por E. canis sería el cultivo y aislamiento de este agente a partir de muestras del animal sospechoso en líneas celulares susceptibles de ser infectadas por este agente. Sin embargo, este método es laborioso y requiere mucho tiempo y equipamiento laboratorial específico, por lo que queda prácticamente relegado a labores de investigación.5

Las técnicas moleculares, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la posterior secuenciación del material amplificado, son métodos sensibles y específicos para la detección y caracterización de estas infecciones. Esta técnica puede ser especialmente útil para confirmar la eliminación del microorganismo tras el

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tratamiento, ya que detecta el ADN del mismo y, por tanto, la existencia de infección activa.5 Se han empleado técnicas de PCR convencionales, anidadas y en tiempo real para la detección de ADN de este agente. El gen 16S rRNA ha sido el más ampliamente empleado en estas técnicas moleculares, si bien recientes estudios han empleado cebadores frente a otros genes, como p30, groESL, dsb, o gltA, entre otros.7‐9 En la actualidad, algunos autores parecen preferir la PCR cuantitativa frente a la anidada o la convencional debido a su mayor sensibilidad y menor riesgo de contaminación.5 Con el fin de discriminar entre diferentes especies y cepas ehrlichiales se han empleado PCRs múltiples.8, 10 A pesar de la buena sensibilidad y especificidad general de estas técnicas moleculares, la falta de estandarización entre laboratorios y la posible existencia de resultados falsos negativos o falsos positivos, han llevado al Grupo de Estudio de Enfermedades Infecciosas del American College of Veterinary Internal Medicine (ACVIM) a recomendar el empleo de la PCR en combinación con la serología para el diagnóstico de la EMC.4

TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO INDIRECTO

Una alternativa a los métodos diagnósticos que permiten una detección directa

de E. canis son los métodos indirectos, que permiten determinar la exposición al agente mediante la valoración de la respuesta inmunitaria desarrollada por el hospedador.

La inmunofluorescencia indirecta (IFI) para la detección de anticuerpos IgG anti‐E. canis presenta una alta sensibilidad y especificidad y es considerada la técnica serológica de referencia para el diagnóstico de la EMC.4, 5, 11 Para realizarla, por lo general se emplean como antígeno cultivos celulares infectados por E. canis, que se fijan a un porta especial para inmunofluorescencia al que se enfrentarán diluciones seriadas de la muestra sérica del perro sospechoso. Se ha observado que la sensibilidad de la IFI puede ser mayor empleando cepas de E. canis autóctonas.12 A pesar de los buenos resultados de esta técnica se debe tener en cuenta que posee algunos inconvenientes, como la necesidad de aparataje específico y personal entrenado para reducir la subjetividad en la lectura de los resultados.

Además de la IFI, se han desarrollado otras técnicas serológicas para el diagnóstico de la EMC. De hecho, en la actualidad existen kits inmunocromatográficos o de ELISA comercialmente disponibles que detectan anticuerpos IgG frente a este agente y que han permitido poner al alcance de los clínicos veterinarios métodos diagnósticos que pueden realizarse sin necesidad de equipo especial.5 En función de los tests empleados, la sensibilidad y especificidad puede variar, considerándose en general estas técnicas muy sensibles, especialmente para títulos por IFI superiores a 1:320.4

Es importante tener en cuenta que el diagnóstico serológico de la EMC se complica por la existencia de reacciones cruzadas entre E. canis y otras especies de la familia Anaplasmataceae. E. canis no presenta reacción cruzada con Anaplasma platys,

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pero sí con E. chaffeensis, E. ruminatium, E. ewingii, Neorickettsia helminthoeca, N. risticii y, en menor medida que con las anteriores, con A. phagocytophilum.1, 4, 5 Por tanto, ante un resultado serológico positivo se debería valorar la posible exposición a estas especies bacterianas teniendo en cuenta el área geográfica de residencia del perro y su historial de viajes, ya que de las especies mencionadas, solamente se ha descrito la presencia en nuestro país de E. canis, A. phagocytophilum y A. platys. Algunos métodos serológicos han tratado de solventar este problema de especificidad mediante el empleo como antígeno de proteínas recombinantes inmunoreactivas específicas (como p28, p30, gp19, gp36, gp140, gp200 o MAP2, entre otras), en vez del organismo completo.13, 14 El uso de estas proteínas recombinantes podría permitir no solo mejorar la especificidad, sino también incrementar la calidad del antígeno y eliminar la subjetividad, así como mejorar en algunos casos la sensibilidad en comparación con la IFI.14, 15

Por otra parte, el Western immunoblot es una técnica serológica más específica que puede servir de ayuda a la hora de caracterizar el agente implicado en la infección, sobre todo si existen dudas derivadas de las posibles reacciones cruzadas ya descritas, 5, 16 aunque su laboriosidad hace que se emplee principalmente en laboratorios de investigación.

DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL

La inespecificidad de los signos clínicos y alteraciones laboratoriales de la EMC

hace que sea necesario contar con numerosas patologías al establecer el diagnóstico diferencial.

En nuestro país probablemente la enfermedad con la que más frecuentemente se confunde la ehrlichiosis es la leishmaniosis, debido a la similitud de su sintomatología, si bien ambas enfermedades son fácilmente distinguibles con técnicas serológicas o moleculares. Otras enfermedades de transmisión vectorial, como por ejemplo babesiosis o hepatozoonosis, también deben ser tenidas en cuenta en el diagnóstico diferencial. La ehrlichiosis también debe diferenciarse de otras patologías, como el lupus eritematoso sistémico, el mieloma múltiple, la leucemia linfocítica crónica o la leptospirosis.

Por otra parte, es importante destacar el hecho de que los perros con EMC frecuentemente presentan enfermedades concurrentes.

BIBLIOGRAFÍA

1. Neer, T.M. & Harrus, S. Canine Monocytotrophic Ehrlichiosis (E. canis, E.

chaffeensis, E. ruminantium, and N. risticii Infections). Ehrlichiosis, Neorickettsiosis, Anaplasmosis, and Wolbachia Infection. In: Infectious Diseases of the dog and cat, ed. C.E. Greene, Third edn, Saunders Elsevier. 2006. 203‐217.

32

2. Harrus, S., Kass, P.H., Klement, E., Waner, T. Canine monocytic ehrlichiosis: a retrospective study of 100 cases, and an epidemiological investigation of prognostic indicators for the disease. Vet Rec, 1997; 141: 360‐3.

3. Frank, J.R., Breitschwerdt, E.B. A retrospective study of ehrlichiosis in 62 dogs from North Carolina and Virginia. J Vet Intern Med, 1999; 13: 194‐201.

4. Neer, T.M., Breitschwerdt, E.B., Greene, R.T., Lappin, M.R. Consensus statement on ehrlichial disease of small animals from the infectious disease study group of the ACVIM. American College of Veterinary Internal Medicine. J Vet Intern Med, 2002; 16: 309‐15.

5. Harrus, S., Waner, T. Diagnosis of canine monocytotropic ehrlichiosis (Ehrlichia canis): An overview. Vet J, 2011; 187: 292‐296.

6. Mylonakis, M.E., Koutinas, A.F., Billinis, C., Leontides, L.S., Kontos, V., Papadopoulos, O., Rallis, T., Fytianou, A. Evaluation of cytology in the diagnosis of acute canine monocytic ehrlichiosis (Ehrlichia canis): a comparison between five methods. Vet Microbiol, 2003; 91: 197‐204.

7. Stich RW, Rikihisa Y, Ewing SA, Needham GR, Grover DL, Jittapalapong S. Detection of Ehrlichia canis in canine carrier blood and in individual experimentally infected ticks with a p30‐based PCR assay. J Clin Microbiol, 2002; 40:540‐6.

8. Doyle CK, Labruna MB, Breitschwerdt EB, Tang YW, Corstvet RE, Hegarty BC, Bloch KC, Li P, Walker DH, McBride JW. Detection of medically important Ehrlichia by quantitative multicolor TaqMan real‐time polymerase chain reaction of the dsb gene. J Mol Diagn, 2005; 7:504‐10.

9. Aguirre E, Tesouro MA, Amusategui I, Rodríguez‐Franco F, Sainz A. Comparison between different polymerase chain reaction methods for the diagnosis of Ehrlichia canis infection. Ann N Y Acad Sci, 2008; 1149:118‐20.

10. Sirigireddy KR, Ganta RR. Multiplex detection of Ehrlichia and Anaplasma species pathogens in peripheral blood by real‐time reverse transcriptase‐polymerase chain reaction. J Mol Diagn, 2005; 7:308‐16.

11. Waner, T., Harrus, S., Jongejan, F., Bark, H., Keysary, A., Cornelissen, A.W. Significance of serological testing for ehrlichial diseases in dogs with special emphasis on the diagnosis of canine monocytic ehrlichiosis caused by Ehrlichia canis", Vet Parasitol, 2001; 95: 1‐15.

12. Aguirre E, Ayllón T, Sainz A, Amusategui I, Villaescusa A, Rodríguez‐Franco F, Tesouro MA. Results from an indirect fluorescent antibody test using three different strains of Ehrlichia canis. Vet J, 2009; 182:301‐5.

13. Knowles TT, Alleman AR, Sorenson HL, Marciano DC, Breitschwerdt EB, Harrus S, Barbet AF, Bélanger M. Characterization of the major antigenic protein 2 of Ehrlichia canis and Ehrlichia chaffeensis and its application for serodiagnosis of ehrlichiosis. Clin Diagn Lab Immunol, 2003; 10:520‐4.

14. Cárdenas, A.M., Doyle, C.K., Zhang, X., Nethery, K., Corttvet, R.E., Walker, D.H., McBride, J.W. Enzyme‐linked immunoabsorbent assay with conserved immunoreactive glycoproteins gp36 and gp19 has enhanced sensitivity and

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provides species‐specific immunodiagnosis of Ehrlichia canis infection. Clin Vaccine Immunol, 2007; 14:123‐8.

15. McBride JW, Corstvet RE, Breitschwerdt EB, Walker DH. Immunodiagnosis of Ehrlichia canis infection with recombinant proteins. J Clin Microbiol, 2001; 39:315‐22.

16. Rikihisa, Y., Ewing, S.A., Fox, J.C. Western immunoblot analysis of Ehrlichia chaffeensis, E. canis, or E. ewingii infections in dogs and humans. J Clin Microbiol, 1994; 32: 2107‐12.

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O‐10

DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES EN MUESTRAS DE ORIGEN ANIMAL POR PCR.

Tomás Mayoral.

Laboratorio de Genética Molecular‐ LCV. MAGRAMA.

La identificación de especies ha ido en las últimas décadas tomando

importancia a medida que se han incrementado los controles en los procesos de producción. Más aun tras la aparición de diferentes crisis en el área de la salud pública como la encefalopatía espongiforme bovina o la aparición de ADN de caballo en productos cárnicos. De forma general, la identificación de especies se hace necesaria en múltiples aspectos de la vida cotidiana como pueden ser:

‐ El fraude resultante de la suplantación de especies por otras de menor valor. ‐ El control sobre la captura de animales, ya estén en peligro de extinción, con

cuotas de caza/pesca establecidas o prohibiciones de captura hasta alcanzar una talla mínima.

‐ La protección del consumidor por salud o el respeto a determinados estilos de vida o religión.

‐ Identificación de muestras forenses y discriminación de la especie proveniente.

Para muchos de estos casos, han existido hasta la actualidad, métodos de análisis bioquímicos e inmunológicos que han permitido estas tareas. No obstante, algunos de estos métodos pueden presentar falta de especificidad, especialmente con muestras complejas o tratadas con altas temperaturas. Frente a estos ensayos, las técnicas basadas en la amplificación de ADN por PCR han demostrando una alta sensibilidad y especificidad generando un considerable incremento de trabajos que describen la determinación de especies por métodos basados en ella. Actualmente, esta presenta grandes ventajas como son la rapidez, sencillez y la alta reproducibilidad, lo que permite estandarizar métodos que garantizan la homogeneidad de resultados entre diferentes laboratorios. En el presente trabajo, se realiza una revisión de métodos conocidos para la identificación de especies y se describe la experiencia en el Laboratorio Central de Veterinaria con las técnicas llevadas a cabo para la discriminación de rumiantes, carnívoros o especies de peces.

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O‐11

CONTROL DE IDENTIDAD EN ANIMALES DE EXPLOTACIÓN GANADERA MEDIANTE TÉCNICAS DE GENÉTICA MOLECULAR.

José Antonio Bouzada

Dpto. Identificación Genética. Laboratorio de Genética Molecular.

Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA.

Establecer, de manera totalmente fiable, la identidad de los animales de explotación ganadera es una necesidad cuya importancia no ha parado de crecer en los últimos años. Esta necesidad se extiende tanto a los animales en estado vivo como después de su sacrificio y despiece así, como sus producciones. Esta importancia se debe a múltiples motivos como son el establecimiento de planes de mejora genética, planes de conservación de especies y/o razas en peligro de extinción, selección de apareamientos, confirmación de identidad en la venta de animales, trazabilidad de las produciones en la cadena alimentaria, certificación de denominaciones de origen o indicaciones geográficas protegidas, etc.

Se hace mucho hincapié en el concepto de trazabilidad o rastreabilidad, es decir, en el conjunto de acciones, medidas y procedimientos técnicos que permiten identificar y hacer el seguimiento de un animal o producto desde su origen hasta el final de la cadena de comercialización. De ahí que el primer requisito de la trazabilidad sea la implementación de un sistema fiable de identificación animal. A lo largo del tiempo se han desarrollado y utilizado y siguen utilizando una gran variedad de sistemas de identificación individual como tatuajes, marcas de fuego, marcas de frío, crotales, chips electrónicos, bolos ruminales, transponders, la huella nasal, imágenes digitales de retina e iris, aunque todos los citados presentan una gran limitación como es la dificultad de su utilización en las cadenas de transformación o en el seguimiento de las producciones de los animales así identificados.

Una buena solución a estas limitaciones la constituyen los marcadores moleculares, especialmente los basados en el ADN. Esta molécula está presente en prácticamente todas las células de todos los tejidos tanto de animales, como de los productos derivados de éste (carne, leche, semen, saliva, pelo, lana, plumas, etc), con la importante ventaja de que permanece prácticamente inmutable tanto durante la vida del animal como, una vez sacrificado éste, a lo largo de todo el proceso de comercialización de sus productos.

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El principio de la identificación genética animal mediante marcadores moleculares se basa en que, con la excepción de los gemelos monocigóticos y los animales clonados, todos los individuos de una población difieren entre sí a nivel de su ADN (Cunningham y Meghen, 2001), siendo factible realizar una prueba genética para establecer estas diferencias (Lodish et al., 1995).

La identificación de individuos en base a su ADN se ha desarrollado

notablemente en las últimas décadas, tanto en medicina forense humana como en veterinaria. Existen diversas técnicas tales como el polimorfismo de tamaño en los fragmentos de restricción o RFLPs (Restriction Fragment Length Polymorphism), la amplificación aleatoria de ADN polimórfico o RAPDs (Random Amplification of Polymorphic DNA), los polimorfismos de longitud de fragmentos amplificados o AFLPs (Amplified fragment length polymorphisms), la técnica combinada de reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction; PCR) y RFLP (PCR‐RFLP), los polimorfismos de conformación de las cadenas simples o SSCPs (Single‐Strand Conformation Polymorphisms), los polimorfismos de un solo nucleótido o SNPs (Single Nucleotide Polymorphism), los minisatélites (VNTRs), los microsatélites (STRs), etc.

Entre todos ellos, los microsatélites son, actualmente, la herramienta molecular de elección para el análisis genético y para estudios de identificación animal ya que poseen algunas características que los hacen muy útiles. Los microsatélites se encuentran en los genomas de todos los eucariotas y se ha descrito un elevado número de ellos en muchas especies de animales tanto domésticos, (entre ellas las principales especies de explotación ganadera, bovinos, caprinos, equinos, ovinos, porcinos, gallinas, etc), como especies de animales salvajes. Los microsatélites se distribuyen por todo el genoma de manera bastante uniforme, presentan una gran variabilidad genética, su modo de herencia es codominate simple, se pueden analizar mediante PCR multiplex, su análisis es relativamente rápido y para llevarlo a cabo se necesita muy poca cantidad de material biológico cuyo origen puede, además, ser muy diverso. En conjunto, estas características hacen que su análisis sea relativamente sencillo y que posean una gran capacidad de discriminación individual y de exclusión de relaciones de parentesco mal asignadas. A la hora de su análisis, hay que tener en cuenta que los microsatélites presentan una tasa de mutación que es relativamente elevada, varía entre 10‐2 y 10‐5 (Ellegren, 2004).), en algunos casos existen alelos silentes o de difícil amplificación que pueden afectar a algunas poblaciones concretas o estar muy ampliamente distribuídos, lo que lleva a una cierta heterogeneidad de los resultados sobre todo cuando se obtienen en diferentes laboratorios. Todo ello debe ser tenido en cuenta a la hora de interpretar los datos obtenidos.

En concreto, los microsatélites son secuencias de ADN repetidas (entre 2 y 10 nucleótidos) en el genoma del animal, con secuencias conservadas a ambos lados lo que permite desarrollar técnicas de PCR para amplificarlos. Los más típicos constan de

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10‐30 copias de una repetición que usualmente no es superior a 4 pb de longitud (los más útiles suelen ser repeticiones de 2 nucleótidos y que no presenten alelos silentes ni inserciones o deleciones). Cada individuo tiene un número de repeticiones determinado del motivo de cada microsatélites. Ese número de repeticiones en cada marcador analizado caracterizará al individuo de manera que se pueda distinguir prácticamente de cualquier otro individuo aunque sea genealógicamente muy próximo. Además hay que tener en cuenta que, habitualmente, cada loci tiene dos alelos y necesariamente uno se habrá heredado de la madre y otro del padre. Por tanto, conociendo el perfil de microsatélites de uno o ambos progenitores se podrá determinar la paternidad. La presencia de tres o más alelos al analizar un microsatélite puede ser debida a la contaminación de la muestra, de forma accidental durante el análisis o de forma natural (freemartinismo o partos múltiples en general) o ser debida a la existencia de un número anormal de cromosomas.

La determinación del perfil de microsatélites de un individuo, actualmente se realiza mediante PCR multiplex, lo que permite, usando dos parámetros, tamaño del fragmento amplificado y marcajes fluorescentes, realizar numerosas reacciones de amplificación simultáneamente y así disminuir el coste del análisis. Los resultados se visualizan en secuenciadores automáticos mediante electroforesis capilar de fragmentos marcados y posteriormente con programas informáticos se pueden interpretar los resultados. El resultado de dichas técnicas se muestra como un electroferograma comparado con el patrón de tamaño.

Existe una gran cantidad de marcadores de tipo microsatélite descritos en las principales especies de explotación ganadera. La International Society for Animal Genetics (ISAG) y la Food and Agriculture Organization (FAO) llevan años intentando homogeneizar tanto los marcadores utilizados en cada especie como la denominación de los distintos alelos obtenidos, muy importante a la hora de compartir información de individuos analizados en laboratorios diferentes, algo que es muy habitual especialmente en las especies bovina y equina.

Actualmente, en algunas especies, existen paneles de marcadores totalmente

definidos, cuyo análisis se recomienda en todos laboratorios, mientras que en otras simplemente hay descritos una serie de marcadores de los cuales se recomienda analizar al menos 13‐14 de ellos.

Los paneles de marcadores recomendados actualmente por la ISAG y la FAO

para las principales especies de explotación ganadera son los siguientes:

Bovinos (12 marcadores): BM1818, BM1824, BM2113, ETH3, ETH10, ETH225, INRA23, SPS115, TGLA53, TGLA122, TGLA126 y TGLA227.

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Cánidos (21 marcadores): AHT121, AHT137, AHTh130, AHTh171, AHTh260, AHTk211, AHTk253, AME, CXX279, FH2054, FH2848, INRA21, INU005, INU030, INU055, REN105LO3, REN162C04, REN169D01, REN169O18, REN247M23 y REN54P11.

Caprinos (14 marcadores): CSRD247, ILSTS008, ILSTS019, ILSTS087, INRA005, INRA006, INRA023, INRA063, MAF065, McM527, OarFCB20, SRCRSP05, SRCRSP08 y SRCRSP23.

Equinos (12 marcadores): AHT4, AHT5, ASB17, ASB2, ASB23, HMS2, HMS3, HMS6, HMS7, HTG10, HTG4 y VHL20. En el caso de los equinos, también se ha definido un panel secundario de marcadores que se deben analizar en los casos en que exista una única incompatibilidad al analizar con el panel principal. Se deberían analizar 12 de un grupo de 15 marcadores (TKY279, TKY287, TKY294, TKY297, TKY301, TKY312, TKY321, TKY325, TKY333, TKY337, TKY341, TKY343, TKY344, TKY374 y TKY394).

Gallinas (Panel abierto): ADL0268, MCW0206, LEI0166, MCW0295, MCW0081, MCW0014, MCW0183, ADL0278, MCW0067, MCW0104, MCW0123, MCW0330, MCW0165, MCW0069, MCW0248, MCW0111, MCW0020, MCW0034, LEI0234, MCW0103, MCW0222, MCW0016, MCW0037, MCW0098, LEI0094, MCW0284, MCW0078, LEI0192 y ADL0112.

Ovinos (14 marcadores): AME, CSRD247, ETH152, INRA005, INRA006, INRA023, INRA063, INRA172, MAF065, MAF214, McM42, McM527 y OarFCB20

Porcinos (Panel abierto): CGA, IGF1, S0002, S0005, S0026, S0068, S0090, S0101, S0155, S0178, S0215, S0225, S0226, S0227, S0228, S0355, S0386, SW24, SW72, SW240, SW632, SW857, SW911, SW936, SW951.

Camélidos (Llamas y alpacas) (13 marcadores): LCA5, LCA8, LCA19, LCA37, LCA56, LCA65, LCA66, LCA94, LGU49, LGU50, YWLL29, YWLL40 y YWLL44

Búfalos (Panel abierto): CSSM033, CSSM038, CSSM043, CSSM047, CSSM036, CSSM019, CSRM060, CSSM029, CSSM041, CSSM057, BRN, CSSM032, CSSM008, CSSM045, CSSM022, CSSM046, CSSM013, ETH003, CSSM061, BMC1013, DRB3, CSSM062, CSSME070, ETH121, ILSTS033, ILSTS005, ILSTS030, ILSTS008, RM099 y HMH1R.

En el Dpto. de Identificación Genética del Laboratorio Central de Veterinaria

las recomendaciones de la ISAG para la especie equina se han extendido a las especies bovina, caprina, ovina y porcina y se han desarrollado dos paneles de marcadores en cada una de las cinco especies que habitualmente se analizan en este laboratorio (bovina, caprina equina, ovina y porcina). Las muestras son analizadas con el panel principal de la especie correspondiente (de alrededor de 20 marcadores) y en caso de que se necesiten analizar marcadores adicionales se procede a utilizar el panel secundario (con otros 20 marcadores) con lo que se podría llegar a disponer de información de alrededor de 40 marcadores moleculares entre los que además se incluye la secuencia AME y algunos marcadores del cromosoma X como indicadores del sexo del animal analizado. Según las recomendaciones internacionales, con un

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número de marcadores superior a 12‐13 suele conseguirse una probabilidad de identidad o de exclusión de paternidad suficiente para que los resultados obtenidos sean fiables estadísticamente, pero esto depende bastante de la situación genética en la que se encuentre la raza analizada y de los individuos concretos involucrados en el análisis que se esté llevando a cabo, de ahí que la mayoría de los laboratorios obtén por usar un número mayor de marcadores.

Una vez obtenido el genotipo del animal para los marcadores analizados, el control de identidad de las muestras puede hacerse de varias maneras, dependiendo de la información de partida de la que se disponga. Es importante considerar si los perfiles genéticos con los que se está trabajando han sido obtenidos en un solo laboratorio o en varios ya que en este último caso hay que tener en cuenta la fiabilidad de los laboratorios que han obtenido los datos, el momento de la obtención de ese resultado, los equipos utilizados y la forma en que han resuelto cada uno de ellos la interpretación de los alelos de difícil amplificación. Identificación genética con muestras de referencia

En este caso se comparan los perfiles genéticos de dos muestras tomadas

supuestamente de un mismo animal, una será la de referencia, cuya identidad está certificada, y otra la de verificación o control cuya identidad se quiere establecer. En este caso la coincidencia de los perfiles genéticos debe ser absoluta para cada uno de los marcadores genéticos de los que se disponga de datos en los dos análisis. En caso de haber sido obtenidos en dos laboratorios diferentes, discrepancias en 1‐2 marcadores deben ser consultadas con el otro laboratorio para confirmar que no hay ningún error en esos resultados.

La altísima fiabilidad de estas pruebas viene dada porque la probabilidad de

encontrar dos animales con idéntico genotipo es prácticamente nula, salvo que se tratase de muestras tomadas a dos animales que fuesen gemelos idénticos (univitelinos o monocigóticos), situación que muy rara vez aparece en condiciones naturales o ser muestras procedentes de animales clonados. La Probabilidad de Identidad (PI) da una idea de la medida en que es posible o no encontrar dos genotipos exactamente iguales en la población y depende de las características genéticas de la raza o población a la que pertenece el animal analizado y se podría calcular de la siguiente forma:

PI=∑pi4+ ∑ ∑(2pipj)2

Donde pi y pj son las frecuencias de dos alelos diferentes en ese grupo de animales.

El cálculo se hace para cada uno de los marcadores analizados y luego se puede calcular la Probabilidad de Identidad Acumulada (PIA) considerando el genotipo en conjunto.

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En los análisis realizados con los paneles habitualmente usados en las especies de explotación ganadera esta probabilidad suele ser menor a 1 10‐18 y con alrededor de 40 marcadores suele ser inferior a 1 10‐30.

Identificación genética a través de parientes de primer grado

En ocasiones no se dispone de una muestra de referencia para el individuo

cuya identidad se quiere establecer. En este caso es posible utilizar información procedente de parientes de primer grado del individuo estudiado considerando que, normalmente, para cada marcador genético, un individuo hereda un alelo de su madre y uno de su padre, por lo tanto cada marcador genético tiene que tener un alelo en común con el padre y otro con la madre y no puede haber ningún alelo presente en el hijo que no esté presente en alguno de los padres. Al hacer estudios de este tipo se pueden producir varias situaciones: ‐ No aparecen discrepancias:

Cuando la exclusión de paternidad no es posible, en estudios con animales, habitualmente se da como paternidad/maternidad probada. En casos en los que exista un interés especial en la identificación de un individuo y sobre todo en estudios con humanos se suele calcular el Índice de Paternidad (IP), que expresa el cociente entre las probabilidades de las dos hipótesis planteadas. (Individuos relacionados frente a no relacionados).

IP = X/Y X es la frecuencia con la que el presunto padre/madre transmite los genes obligatorios al hijo/a para esa combinación específica madre‐padre‐hijo/a. Y es la frecuencia con la que un individuo de la población al azar transmitirá los genes obligatorios al hijo/a para la misma combinación específica madre‐hijo/a.

El Índice de Paternidad Total (IPtotal) se obtendría multiplicando los IP de cada marcador individual analizado.

Además se suele calcular la Probabilidad de Paternidad (W), valor que expresa la probabilidad de que el presunto padre/madre esté bien asignado, a la vista de los resultados obtenidos en los diferentes marcadores genéticos moleculares realizados y presuponiendo que el otro padre propuesto no ofrece ninguna duda. Para realizar estos cálculos se parte de una probabilidad de paternidad a priori de 0.5, es decir, el presunto padre/madre tiene, a priori, las mismas probabilidades de ser el padre/madre como de no serlo.

W = IP/(1+IP) El cálculo de Probabilidad de Paternidad y del Índice de Paternidad se hace a

partir de frecuencias alélicas obtenidas para ese marcador en la población a la que pertenecen los individuos implicados en el estudio.

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En casos complejos de paternidad (casos de paternidad en ausencia del presunto padre) se suele calcular LR (Likelyhood ratio. ‐ Existencia de una o dos discrepancias (Mutación y alelos nulos):

En el caso de que se observen una o dos discordancias los resultados deben ser revisados y se debe tener en cuenta, además si han sido obtenidos en un solo laboratorio o en varios. Si estos resultados se confirman se debe de considerar la posibilidad de que se hayan producido una o dos mutaciones y se calculará el índice de paternidad teniendo en cuenta las tasas de mutación de los STRs según el método

IP= µ/PE. µ indica la tasa de mutación que se ha estimado en general para los marcadores STRs y PE es la probabilidad de exclusión. (Brenner, 2006). Exclusión de primer orden (por observación directa de la presencia o ausencia de los alelos estudiados): ‐ El supuesto hijo/a posee un alelo que está ausente en el presunto padre y en la presunta madre. ‐ En el supuesto hijo/a no se detecta ninguno de los alelos que están presentes en el presunto padre, en heterocigosis de éste y/o del hijo/a. Estos casos podrían ser debidos a la existencia de mutaciones Exclusión de segundo orden (basado en el estado de homocigosis deducido de un resultado negativo): ‐ El supuesto hijo/a y el presunto padre/madre son homocigotos para alelos distintos. Este caso suele ser debido a la existencia de alelos nulos que no se han detectado correctamente en ambos individuos.

‐ Aparecen más de dos discrepancias: Se excluye la paternidad cuando existan más de dos discordancias entre la

muestra perteneciente al hijo y la de alguno de los presuntos madre o padre. Cuando se ha llegado a la conclusión de exclusión, por haber encontrado al menos dos exclusiones de primer orden, no se tiene en cuenta las compatibilidades de los demás marcadores. Esto es debido a que los alelos detectados con marcadores en una prueba de ADN no son exclusivos de una familia, en realidad en una población muchos individuos tiene los mismos alelos o genotipos sin que esto signifique que estén emparentados. La fortaleza de la prueba está en usar un número elevado de marcadores por lo que se generan muchas combinaciones distintas entre los individuos de la población, aún entre hermanos, por lo que es muy poco probable que al tomar dos individuos al azar ellos tengan perfiles compatibles. Clásicamente, con más de una exclusión de primer orden se consideraba una exclusión probada.

En un caso estándar de un trío de Hijo‐Madre‐Padre analizado con 13 a 16 marcadores, es típico encontrar de 7 a 10 exclusiones, lo que no significa que podamos encontrar un caso con sólo 2 o 3 exclusiones, u otros con 12. En casos de paternidad

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con un solo progenitor el número de exclusiones típico es entre 4 y 5. En casos más complicados donde se pierde información genética se reduce el número de exclusiones que se espera encontrar, por lo que hay que aumentar el número de marcadores investigados, de ahí la necesidad de establecer paneles secundarios de marcadores. Existe un caso particular denominado exclusión de segundo orden, donde el hijo y el padre analizado son homocigotos para alelos diferentes. Este resultado se puede explicar, además de la no‐paternidad, porque comparten un alelo “invisible” (alelo nulo) y realmente hay relación de parentesco entre los individuos analizados.

La Probabilidad de Exclusión, es decir, la probabilidad con la que se detectan relaciones de parentesco mal asignadas da una idea de la potencia con la que el análisis realizado detecta como no emparentados individuos que realmente no están emparentados y se puede calcular de la siguiente manera:

Dados dos padres y un hijo, excluir uno de los padres:

Dados dos padres y un hijo, excluir ambos padres:

Dados y padre y un hijo, excluir su relación:

Donde pi y pj son las frecuencias de dos alelos diferentes en ese grupo de

animales. Aunque este valor es característico de la especie y población de animales que

se esté considerando, los paneles usados habitualmente en las especies de explotación ganadera suelen superar el 99,999% y cuando se analizan alrededor de 40 marcadores suelen superar el 99,99999% ¿Cuántos marcadores son necesarios para un control de filiación?

Se ha sugerido por parte del FBI, entre otros organismos, el uso de 13 STRs para la identificación genética humana, en animales el número de marcadores recomendados suele ser similar, los cuales son suficientes para resolver la mayoría de casos de paternidad. Sin embargo, en realidad el número de marcadores depende del caso, pudiendo ser menor o mayor a 13 marcadores; en realidad lo fundamental es llegar a una conclusión lo suficientemente robusta estadísticamente. Hasta hace algunos años se empleaban algunos enunciados para interpretar el porcentaje de paternidad (W); entre los más famosos están los postulados de Hummel, donde W≥ 99,73% (equivalente a un IP de 400) se traducía como “paternidad prácticamente probada” y era límite máximo para valorar W. El desarrollo científico tecnológico hace que estos enunciados y valores a la fecha se consideren obsoletos e insuficientes.

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Actualmente entre los laboratorios hay dos tendencias: una se basa en indicar el valor de W e IP obtenido a partir del sistema genético analizado, la otra tendencia es fijar un límite mínimo, por ejemplo de 1,000 o hasta 10,000 para el IP. En caso de no llegar al límite mínimo establecido se procedería a incrementar el número de marcadores, hasta alcanzar una exclusión clara o un valor aceptable de IP.

Identificación genética a través de información de parientes alejados: ADN mitocondrial y cromosoma Y.

En la mayoría de las especies el sexo heterogamético es el masculino. El cromosoma Y sólo está presente en los machos y sólo los machos lo dan en herencia a sus hijos que, por recibirlo, serán machos. En caso de aves, polillas, mariposas y algunos peces y anfibios el sexo heterogamético son las hembras.

El cromosoma Y apenas recombina con el X (solo lo hace aproximadamente un fragmento que correspondería al 5% de su longitud), así que se puede considerar, a efectos prácticos, que todos los hijos varones de un mismo padre comparten idéntico cromosoma Y. El análisis de polimorfismos propios del cromosoma Y nos permite abordar investigaciones de linaje paterno, siempre y cuando en todas las generaciones involucradas se analicen varones. Cuando se analizan varios marcadores del cromosoma Y, estos se heredan en bloque o en conjunto de padres a hijos varones, a lo que se le conoce como haplotipo. Al analizar varios STRs del cromosoma se detecta una combinación de alelos que constituye su perfil de ADN masculino.

Es importante considerar que los haplotipos del cromosoma Y son compartidos por todos los parientes vía paterna, que constituyen los llamados linajes paternos y que suelen agruparse dentro de las poblaciones de formas muy particulares de acuerdo a sus historias. Por consiguiente, es necesario considerar que en una prueba forense o de paternidad puede existir un número indeterminado de varones con el mismo haplotipo, además de los parientes por línea paterna del sujeto implicado. Por esta razón, aunque los haplotipos Y‐STRs tienen un gran poder de exclusión y esta no necesita ser confirmada, en casos donde concuerda el perfil genético entre las dos muestras que están analizando, es conveniente confirmar la relación biológica con STRs no‐sexuales. La desventaja más importante del cromosoma Y en pruebas de paternidad es que sólo sirve en aproximadamente el 50% de los casos, es decir, cuando se sigue la línea macho.

Existe también la posibilidad de usar marcadores de ADN mitocondrial. Las mitocondrias son orgánulos citoplasmáticos con carga genética propia: el ADN mitocondrial. Su función es proporcionar energía a la célula y su número varía entre 100 y 1000 por célula. En gran parte de las especies, todas las mitocondrias que tienen sus células proceden de las que portaba el óvulo de su madre en la fecundación, lo que hace que el ADN mitocondrial sea de herencia exclusivamente materna. Así pues, una madre y todos sus hijos (independientemente de su sexo) tendrán el mismo ADN mitocondrial. Es por esto que el estudio del ADN mitocondrial es especialmente útil en el estudio de linajes maternos y en pruebas complejas de maternidad. Las hijas de una

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misma madre pasarán ese mismo ADN mitocondrial a sus descendientes, mientras que los hijos varones nunca pasarán su ADN mitocondrial a sus hijos/as. En consecuencia, el análisis del ADN mitocondrial es una manera muy precisa de verificar lazos biológicos por línea materna.

La interpretación de los resultados del análisis del ADN mitocondrial es compleja, y su poder de discriminación relativamente bajo. Si el ADN mitocondrial encontrado en dos individuos no coincide, se puede concluir que no tienen un mismo origen materno, pero si coinciden, no es evidencia suficiente para considerar probada una madre común.

El ADN mitocondrial tiene tres características fundamentales que lo hacen especialmente resistente a la degradación frente al ADN nuclear a la hora de estudiar muestras biológicas críticas: su reducido tamaño (16.569 pares de bases frente a los 6.000 millones del ADN nuclear), su estructura circular y su gran cantidad de copias dentro de cada célula,(por cada copia de ADN nuclear puede haber entre 100 y 1.000 copias de ADN mitocondrial). Esto lo hace especialmente útil a la hora de trabajar con muestras antiguas y muy degradadas. Identificación genética por asignación a un grupo definido de animales.

Los marcadores genéticos de ADN ofrecen la posibilidad de utilizar los

genotipos individuales para determinar la población de origen de los individuos (Davies et al., 1999). El uso de marcadores microsatélites de ADN combinados con las pruebas estadísticas de asignación y métodos similares permiten la detección de cruces entre poblaciones y la comprobación de la homogeneidad intrapoblacional. Existen varios métodos con los que podemos asignar individuos a poblaciones además de para diferenciar si se trata de un producto procedente de un animal puro o cruzado.

El primer tipo de análisis son los métodos no supervisados o de frecuencias

alélicas (Pritchard et al., 2000) que asumen situaciones de equilibrio de Hardy‐Weinberg para las frecuencias de los alelos. El método consiste en asignar un individuo a una población basándose en el valor de probabilidad de su genotipo individual de pertenecer a ella (Paetkau et al.1995). Esta probabilidad es en realidad la distribución posterior de cada porcentaje de genoma que proviene de las poblaciones ancestrales Este procedimiento presenta como ventajas más destacables el no requerir especificar las frecuencias alélicas de las poblaciones ancestrales y el permitir tener en cuenta situaciones genéticas complejas, incluyendo el caso de muestras que provienen de mezcla entre varias poblaciones. Para aplicar este procedimiento se puede utilizar el software STRUCTURE (Pritchard et al., 2000) que permite también tener una estimación del número de poblaciones que maximizan la verosimilitud de la información molecular disponible, de tal manera que es posible tener una idea del número de poblaciones ancestrales que han dado lugar a las razas de referencia muestreadas.

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El segundo tipo de análisis son los métodos supervisados o basados en

distancias genética, en los que las poblaciones de referencia está determinadas a priori y representadas por un conjunto de individuos muestreados en cada una de ellas (Piry et al., 2004). Los métodos basados en distancias asignan el individuo a la población genéticamente más cercana o próxima. Para ello se requiere definir una distancia entre el individuo y la población.. De esta forma, el método supervisado permite validar el conjunto de poblaciones de referencia, mientras que el método no supervisado permitirá llevar a cabo la asignación de las muestras anónimas. Se pueden llevan a cabo mediante el software GENECLASS2 (Piry et al, 2004) que permite, además de asignar cada muestra problema a las poblaciones más probables, utilizar un método de exclusión que compara la proporción de muestras simuladas cuya probabilidad de pertenencia a una población es inferior que la de la muestra problema.

Ejercicios de Control de Calidad

Para llevar a cabo este tipo de análisis, en los que en muchas ocasiones la información utilizada en un caso procede de diferentes laboratorios, es necesario asegurar la homogeneidad a la hora de la elección de los marcadores analizados, al nombrar los alelos que aparecen en cada uno de los marcadores y en resolver de la misma forma la interpretación de alelos de difícil amplificación o denominación. Para ello es especialmente útil la participación en ensayos de intercomparación ya que de esa manera se puede valorar la fiabilidad de los resultados obtenidos por los diferentes laboratorios. En el campo de la genética animal la ISAG a nivel internacional y el Laboratorio Central de Veterinaria, como laboratorio nacional de referencia, a nivel nacional, organizan un test basado en el genotipado de 19 muestras (más una analizada por el laboratorio organizador y que será el control) procedentes de animales de diferentes razas dentro de esa especie. Cada laboratorio puede analizar los marcadores que crea conveniente además de los propuestos por la organización para los análisis en cada una de las especies de explotación ganadera. El test incluye también preguntas relacionadas con las relaciones de parentesco de algunas de las muestras analizadas.

Finalmente, la ISAG remite a cada laboratorio un certificado con los resultados obtenidos y su ubicación dentro del ranking de los laboratorios participantes. Bibliografía: Cunningham, E., and C. Meghen. 2001. Biological identification systems: genetic

markers. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 20:491‐499. Davies, N., Villablanca, F. X., Roderick, G. K., 1999. Determining the source of

individuals: multilocus genotyping in nonequilibrium population genetics. Trends in Ecology and Evolution 14, 17‐21.

Graber R.A. & Morris J.W. (1983) General equation for the average power of exclusion for genetic systems of n co‐dominant alleles in one‐parent and in no‐parent

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cases of disputed parentage. In: Inclusion Probabilities in Parentage Testing (Ed. By R.H. Walker), pp. 277‐280. American Association of Blood Banks, Arlington, WV. Grundel H. & Reets I. (1981) Exclusion probabilities obtained by biochemical polymorphisms in dogs. Animal Blood Groups and Biochemical Genetics 12, 123–32.

Ellegren H. 2004. Microsatellites: simple sequences with complex evolution. Nat Rev Genet 5(6):435‐445.

Jamieson A. (1965) The genetics of transferrin in cattle. Heredity 20, 419–41. Jamieson A. (1979) Electromorphs and erroneous pedigrees. Proceedings of the XVIITH

International Conference on Animal Blood Groups and Biochemical Polymorphisms, Leningrad1978. Four volumes. The National Committee of the USSR, p.27 (abstract).

Lodish, H., D. Baltimore, A. Berk, S. Zipursky, P. Matsudaira, and J. Darnell. 1995. Molecular cell biology. 1344 p. 3rd ed. Scientific American Books, New York, USA.

Paetkau, D., W. Calvert, I. Stirling y C. Strobeck. 1995. Microsatellite analysis of population structure in Canadian polar bears. Molecular Ecology. 4: 347‐354.

Piry, S., Alapetite, A., Cornuet, J. M., Paetkau, D., Baudouin, L., Estoup, A., 2004. GeneClass2: a software for genetic assignment and the first generation migrants detection. Journal of Heredity (accepted)

Pritchard, J.K., Stephens, M., Donnelly, P., 2000. Inference of population structure using moltilocus genotype data. Genetics 155, 945‐949.

C. Brenner, Mutations in paternity, 2006, http://dna‐view.com/mudisc.htm.

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O‐12

MONITORIZACIÓN DE LA SEROCONVERSIÓN POSINFECCIÓN DE PRRS MEDIANTE FLUIDO ORAL

Martos‐Raich, A.; Badosa‐Brossa, M.; Coma‐Oliva, E.; Serra‐Martínez, J.;

Barrera‐Toro, X. ; Planasdemunt‐Regàs; LL. ; Porquet‐Garanto, L. ; Rebordosa‐Trigueros, X

HIPRA

La serología es el método más utilizado para el monitoreo de PRRS; el sistema más empleado hasta el momento es el sangrado de varios animales a diferentes edades. Sin embargo, varios estudios confirman que en el fluido oral (FO) también se puede encontrar tanto el virus como los anticuerpos (posvacunación y posinfección). Es por este motivo, junto con las ventajas que conlleva esta muestra (facilidad de extracción, menos costes, etc), que el FO está cobrando cada vez más importancia para el monitoreo del PRRS. El objetivo de este estudio es el seguimiento posinfección mediante FO, y su comparación con suero. Para ello se escogieron 30 grupos de 9 nulíparas cada uno, negativas a PRRS (confirmación mediante ELISA y PCR); 10 de ellos se infectaron con una cepa de campo tipo 1 y se les hizo seguimiento a lo largo de 8 semanas mediante ELISA (con diferentes conjugados: IgG, IgA e IgG+IgA) y PCR. A las 3 y 9 semanas posinfección se sangraron todos los animales. El conjugado IgG+IgA fue el que mostró más sensibilidad (100% de animales positivos a T1 –primera semana posinfección‐), seguido del IgG (100% positivos a T3); en ambos casos, la cinética fue la misma (pico en los valores de los títulos a las 3 y 7 semanas posinfección) y la positividad se mantuvo hasta el final del estudio. En cambio, el conjugado IgA, aunque era muy precoz en la detección de la infección, no mantenía la sensibilidad durante las 8 semanas posinfección. Estos resultados demuestran que el fluido oral sigue la misma dinámica que el suero (e incluso con más sensibilidad), y por tanto, es una alternativa a éste último (e incluso a la PCR) para el control de las explotaciones vacunadas y/o infectadas por el virus del PRRS.

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O‐13

VALIDATION OF THE ID SCREEN PESTE DES PETITS RUMINANTS ANTIGEN CAPTURE ELISA

Pourquier, P. 1, Comtet, L. 1, Kwiatek, O. 2, Libeau, G. 2, Salami, H. 2

1 IDvet, Montpellier, France 2 CIRAD, Montpellier, France

INTRODUCTION: Peste des Petits Ruminants (PPR) is a contagious disease

affecting goats and sheep, primarily in Africa, the Middle East and the Indian subcontinent. It is caused by the Peste des Petits Ruminants Virus (PPRV), a species of the Morbillivirus genus. The ID Screen® PPR Antigen Capture ELISA is based upon reagents developed at a FAO/OIE PPRV reference laboratory (CIRAD, Montpellier, France). IDvet contributed to the improvement of this test by optimizing test performance and component stability. This test, which allows for the detection of Peste des Petits Ruminants virus in live animals or for post‐mortem diagnosis, may be used with a wide variety of matrices, including oral, nasal or rectal swabs as well as tears, tissue samples, gum debris or PMBC. This study presents validation data obtained for this test. METHODS AND RESULTS: The ID Screen® PPR Antigen Capture ELISA was performed as per manufacturer’s specifications. Plates are coated with anti PPRV‐nucleoprotein (N) capture antibody. The conjugate is an anti‐PPRV‐N‐horseradish peroxidase (HRP) monoclonal antibody. Comparison with RT‐PCR: 26 samples from 3 different countries were tested in parallel by RT‐PCR and the ID Screen® PPR Antigen Capture ELISA kit. Sample types tested included oral swabs, ocular swabs, mesenteric lymph node homogenate, tears, and nasal swabs. Test agreement was high for the samples tested. Comparison with a previously commercialized antigen capture ELISA 7 PPRV strains were tested in parallel on the ID Screen® ELISA and an antigen capture ELISA which was previously available on a commercial basis. The ID Screen® ELISA showed improved sensitivity on all strains tested, for both strong and weak titres. Moreover, swab elution efficiency can be greatly improved by using the diluant included in the kit as an elution buffer instead of saline (PBS). CONCLUSION: The ID Screen® PPR Antigen Capture ELISA demonstrates improved sensitivity on weak and strong positive samples and high correlation with RT‐PCR. It may be used on a variety of sample types, including oral, nasal or rectal swabs as well as tears, tissue samples, gum debris or PMBC. An easy‐to‐use test, microplates are supplied coated and in a strip format. Validation data will be added as it comes available (studies in regions with outbreaks are underway).

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O‐14 COMPARACIÓN DE LA TÉCNICA DE INMUNOPEROXIDASA EN MONOCAPA DE CULTIVO (IPMA) CON TRES ELISA COMERCIALES PARA LA DETECCIÓN DE

CIRCOVIRUS PORCINO TIPO 2 (PCV2)

Pileri E.1,2, Cortey M.3, Rodríguez F.1, Sibila M.1, Fraile L.1,4, Segalés J.1,2

1. Centre de Recerca en Sanitat Animal (CReSA), UAB‐IRTA, Campus de la Universitat Autònoma de Barcelona, 08193 Bellaterra (Cerdanyola del Vallès), Spain.

2. Departament de Sanitat i Anatomia Animals, Universitat Autònoma de Barcelona, 08193 Bellaterra (Cerdanyola del Vallès), Spain.

3. The Pirbright Institute, Ash Road, GU24 0NF, United Kingdom. 4. Universitat de Lleida, Lleida, Spain.

La determinación de la prevalencia de los títulos o valores serológicos frente a

circovirus porcino tipo 2 (PCV2) permite estudiar el patrón de circulación del virus en una granja, así como aportar elementos de juicio para establecer el momento óptimo de vacunación. La técnica de inmunoperoxidasa en monocapa de cultivo (IPMA) ha sido tradicionalmente usada para la determinación de títulos serológicos frente a PCV2 y la interpretación biológica de los mismos, pero su uso se ha restringido básicamente a actividad investigadora. Ello es debido a que la IPMA es una técnica que requiere un nivel elevado de formación técnica, así como la disponibilidad de cultivos celulares y virus viable. Es más, no se puede automatizar y su lectura presenta un cierto grado de subjetividad. De ahí el interés de disponer de técnicas automatizables y de menores requerimientos técnicos como pueden ser las pruebas de ELISA y cuyos resultados sean comparables a los de la IPMA. Por ello, el objetivo de este estudio fue comparar y correlacionar los títulos de anticuerpos frente a PCV2 determinados por IPMA con los resultados obtenidos para las mismas muestras con tres pruebas de ELISA comerciales (indicados como E1, E2 y E3). Con las 4 técnicas se analizaron un total 1248 sueros correspondientes a cerdos de un estudio longitudinal de vacunación frente a PCV2 que incluía lechones vacunados y no vacunados, y que a su vez procedían de cerdas vacunadas o no. Adicionalmente se usaron 22 sueros de lechones derivados de cesárea y privados de calostro como controles negativos. La correlación entre la IPMA y los resultados de las tres pruebas ELISA fue excelente (R

2 ≥ 0,90). Comparado con la IPMA, el test E2 mostró una mayor sensibilidad

(93,02%), seguido por E3 (90,14%) y E1 (85,02%). La especificidad fue del 100% para las tres técnicas de ELISA. El porcentaje de mayor coincidencia entre las pruebas de ELISA fue entre E2 y E3 (91,02%), seguido por E1‐E2 (86,30%) y E1‐E3 (84,57%). En resumen, los resultados obtenidos indicaron que los tres ELISA comerciales utilizados generaron valores predictivos similares a los ofrecidos por la técnica de IPMA, y representan una sólida posibilidad de substitución de éste último test para la monitorización de respuestas frente a la infección y/o vacunación frente a PCV2. La posibilidad de interpretación biológica representa un paso adicional a la consideración de resultados simplemente positivos o negativos.

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O‐15

BIOSEGURIDAD EN LABORATORIOS DE SANIDAD ANIMAL. NIVELES DE BIOCONTENCIÓN 2, 3 Y 4.

Pascual, G.

Centro de Investigación en Sanidad Animal‐INIA

Trabajar con agentes biológicos que entrañan un riesgo potencial para la

seguridad personal y colectiva, para las poblaciones y explotaciones ganaderas cercanas y para el medio ambiente, requiere de instalaciones que presenten unas medidas de seguridad excepcionales incluso por encima de las marcadas por la legislación vigente. El diseño e implantación de barreas de contención adecuadas y mantenidas, supondrá el establecimiento de una garantía real para la instalación y por lo tanto, íntima colaboradora de su éxito. La actual Normativa Internacional, clasifica y numera a los laboratorios de Sanidad Animal en cuatro Grupos según el riesgo de los agentes patógenos que pretenden albergar y manejar, siendo el Grupo más bajo (1) el que se corresponde con al agente biológico de menos impacto y el Grupo más alto (4) el de mayor impacto. Las instalaciones que albergan los Grupos 2, 3 y 4, tienen como premisa principal la implantación de las denominadas barreas de contención establecidas en tres niveles. Estas barreras engloban los puntos críticos de toda instalación y por lo tanto sobre los que se debe focalizar el máximo esfuerzo tanto en el diseño como en la implantación.

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O‐16

RED DE LABORATORIOS DE ALERTA BIOLÓGICA, RE‐LAB.

Carmen Cañavate.

Unidad de Gestión de la RE‐LAB, Instituto de Salud Carlos III.

Para coordinar la capacidad de respuesta de laboratorio frente a amenazas biológicas en España se crea en el año 2009 la Red de Laboratorios de Alerta Biológica, RE‐LAB, mediante una Orden del Ministerio de la Presidencia (Orden PRE/305/2009, de 18 de febrero). La RE‐LAB tiene su origen en el trabajo de un grupo multidisciplinar de expertos creado en el seno del Comité Nacional de Planes de Emergencia y coordinado desde el Ministerio de Defensa. Tras las conclusiones de este grupo de trabajo se crea la RE‐LAB como una infraestructura de naturaleza científico‐técnica, formada por laboratorios especializados, para el apoyo operativo al Sistema Nacional de Conducción de Situaciones de Crisis ante riesgos y amenazas por agentes biológicos peligrosos, cuya coordinación se encomendó al Instituto de Salud Carlos III.

Actualmente está integrada por ocho laboratorios de microbiología especializados en los diferentes campos considerados de riesgo (salud humana, sanidad animal, vegetal, ambiental y seguridad alimentaria), pudiéndose integrar en el futuro otros laboratorios de ámbito estatal y de Comunidades Autónomas. Estos laboratorios son: El Centro Nacional de Microbiología y el Centro Nacional de Sanidad Ambiental del Instituto de Salud Carlos III, el Centro Nacional de Alimentación de la Agencia Española de Seguridad Alimentaria y Nutrición, el Centro de Vigilancia Sanitaria Veterinaria de la Universidad Complutense de Madrid, el Centro de Investigación en Sanidad Animal del Instituto de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria, el Laboratorio Biológico del Instituto Tecnológico “La Marañosa” del Ministerio de Defensa, el Laboratorio Central de Veterinaria de Algete del Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente, y el Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias. La RE‐LAB está conectada con los organismos de coordinación de alertas sanitarias y redes de vigilancia y respuesta establecidas en los diferentes ámbitos sanitarios nacionales, fundamentalmente a través de los propios laboratorios integrantes de la red que forman parte a su vez, como laboratorios de referencia y apoyo, de las correspondientes redes de vigilancia establecidas en las distintas áreas de riesgo. Entre las funciones de la RE‐LAB cabe destacar: i) La identificación rápida y caracterización de los agentes implicados en amenazas de origen biológico y la puesta en marcha de técnicas rápidas novedosas y optimización de las existentes; ii) el apoyo

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y coordinación de los medios científico‐técnicos necesarios para la toma de decisiones de la autoridad competente en cada caso, en las situaciones de alerta por agentes biológicos que puedan afectar a la salud humana, animal, vegetal o medioambiental; iii) el mantenimiento de una red para intercambio de información y coordinación entre los laboratorios, integrando la identificación de riesgos y la planificación y preparación de respuestas en cada situación; iv) la coordinación de la información derivada de las actuaciones y la comunicación con las distintas instituciones que participan en la respuesta; v) la elaboración de protocolos de actuación para la comunicación y coordinación de la respuesta de laboratorio (comunicación de amenazas, toma de muestras y traslado de las mismas, actuación del laboratorio, protocolos específicos de procesamiento de muestras, etc.); y vi) la formación en el ámbito de estas funciones.

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O‐17

UNA ESTRATEGIA PARA APLICAR LA SEROLOGÍA EN EL DIAGNÓSTICO DE LA TUBERCULOSIS BOVINA

Casal, C. 1 ; Díez‐Guerrier, A. 2; Álvarez, J. 1; Rodríguez‐Campos, S. 1; Mateos, A.

2; Linscott, R. 3; Martel, E. 3; Lawrence, J. 3; Domínguez, L. 1y Aranaz, A. 4

1 Centro VISAVET, Universidad Complutense de Madrid, Spain. 2 Servicios Veterinarios MAEVA, Spain.

3 IDEXX Livestock and Poultry Diagnostics, Westbrook, Maine, USA. 4 Departamento de Sanidad Animal, Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense

de Madrid, Spain.

Las pruebas de diagnóstico in vivo de la tuberculosis bovina (Mycobacterium bovis, M. caprae) están basadas en la respuesta inmunológica mediada por células. Estas pruebas se utilizan a nivel internacional en los planes de erradicación. La respuesta serológica aparece en estadios avanzados de la infección, por lo que los ensayos de detección de anticuerpos han recibido también atención como pruebas complementarias para la identificación de animales considerados anérgicos. Esta complementariedad podría ser beneficiosa en los programas de erradicación. En este estudio hemos aplicado una estrategia de trabajo que se beneficia del efecto anamnésico de la inoculación del Derivado Proteico Purificado de M. bovis en la prueba de intradermotuberculinización (IDTB). Hemos evaluado el ensayo M. bovis Ab Test® (IDEXX), un ELISA diseñado para la detección de anticuerpos frente a MPB70 y MPB83, utilizando muestras tomada antes y después (3 días, 15 días) de la prueba de la tuberculina. Este estudio se llevó a cabo en dos rebaños con infección natural por M. bovis, confirmada por la presencia de lesiones y/o cultivo bacteriológico), y diferente situación epidemiológica y manejo. Los resultados de la sensibilidad de la serología a tiempo cero y 3 días después de la IDTB fueron bajos y variables; sin embargo, los resultados fueron significativamente superiores con las muestras tomadas 15 días tras la tuberculina, obteniendo 70.4% y 66.7% en los rebaños A y B, respectivamente. El ELISA fue más sensible, y los valores de DO fueron también superiores, en los animales que presentaron lesiones visibles compatibles con tuberculosis. A estos animales se les supone un riesgo mayor de infectar a otros animales. El uso combinado de la prueba intradérmica y del ensayo M. bovis Ab Test incrementa el número de animales detectados. En el rebaño A, la sensibilidad aumenta de 59,3% (IDTB simple) a 77,8% al combinar IDTB y serología, siendo este beneficio más evidente en el caso de interpretarse los resultados como IDTB comparada. En el rebaño B, la sensibilidad aumentó del 83,3% (IDTB simple) al 100% al combinar IDTB y serología.

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O‐18

PREVALENCIA DE Clostridium difficile EN AVES

Orden, C.; Blanco, J.L.; Lanzarot, P.; Álvarez‐Perez,S. y García, M.E.

Grupo de Investigación COVEMI, Departamento de Sanidad Animal, Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid

Clostridium difficile (CD) es un bacilo Grampositivo, esporulado y anaerobio

estricto que ha sido aislado de una amplia variedad de animales, incluyendo diversas especies de aves. El objetivo de este trabajo es estudiar la prevalencia de CD en tres poblaciones diferentes de aves sometidas a distinto grado de manejo humano. Los grupos de aves estudiados fueron los siguientes: ‐ 102 canarios criados en jaulas individuales, y sometidos a profilaxis antibacteriana desde la eclosión del huevo hasta el día 10 de vida. ‐ 200 pollos de engorde procedentes de 8 explotaciones aviares. ‐ 118 aves silvestres procedentes del Parque Nacional de Doñana, pertenecientes a las siguientes especies: focha común, ganso común, pato, perdiz roja y milano. En todos los casos, se tomaron muestras de heces con la ayuda de un hisopo de algodón estéril. Las muestras fecales fueron sometidas a un shock en etanol para seleccionar formas esporuladas, tras lo cual se realizó su incubación en medio líquido de enriquecimiento de CD durante 7 días, y una posterior siembra en medio selectivo sólido también para CD. La incubación de todos los cultivos en medio líquido y sólido se llevó a cabo a 37 ºC en condiciones de anaerobiosis. A pesar del método de enriquecimiento específico utilizado para el procesamiento de las muestras fecales, solo 4 de las 420 aves analizadas, todas ellas procedentes de pollos de engorde, resultaron positivas a CD. Los resultados obtenidos confirman observaciones previas de prevalencia cero de CD en aves silvestres. Sin embargo, la baja prevalencia del microorganismo en las explotaciones aviares analizadas en este trabajo contrasta con la alta tasa de colonización en pollos de engorde detectada en otras partes del mundo. Debido al carácter emergente y potencialmente zoonósico de este patógeno oportunista, se recomienda seguir estudiando su presencia en diferentes especies de aves

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O‐19

INVESTIGACIÓN SOBRE LA PRESENCIA DE Coxiella burnetii EN QUESOS ELABORADOS CON LECHE CRUDA DE OVEJA

Piñero; Juste, R. A.; Barandika, J. F.; Hurtado, A.; García‐Pérez, A. L.

NEIKER‐ Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario, Departamento de

Sanidad Animal, Berreaga 1, 48160 Derio (Bizkaia)

La fiebre Q es una zoonosis bacteriana cuyo principal reservorio es el ganado ovino y caprino. En estas especies la infección por C. burnetii causa abortos, y la bacteria se elimina al medio a través de los productos del aborto y/o parto, leche y heces. La excreción de C. burnetii por los animales afectados contamina el entorno de la explotación, en especial durante el periodo de la paridera, generándose aerosoles contaminados con la bacteria que causan infección en personas susceptibles a través de la vía aerógena. El contagio por vía digestiva no está confirmado, solo hay algunos estudios en los que se informa de seroconversión en personas que han consumido productos lácteos contaminados con C. burnetii. Hace unos años realizamos un muestreo de leches de tanque de explotaciones ovinas de la CAPV para el estudio de la presencia de DNA de C. burnetii y en el que el 22% de las explotaciones fueron positivas. Por ello, ahora pretendemos estudiar la presencia de C. burnetii en quesos elaborados con leche cruda de oveja para valorar el riesgo potencial que supondría el consumo de este producto. Se han analizado 23 quesos ovinos elaborados con leche cruda procedentes de dos comunidades autónomas, comprados en tiendas, mercados y supermercados. Se han procesado por duplicado (10 g en cada réplica) realizando un tratamiento previo consistente en dilución en buffer y homogeneizado, lavados, separación de los sobrenadantes, centrifugado final, y extracción del DNA del sedimento obtenido con un kit comercial (Qiagen). Posteriormente se ha estudiado la presencia de DNA de C. burnetii mediante PCR a tiempo real (qPCR) utilizando el gen IS1111 como diana. Esta qPCR utiliza un control interno que identifica la presencia de inhibidores en la reacción. Se ha obtenido una alta prevalencia de quesos positivos a C. burnetii, con Ct entre 24,5 y 31,9, y una estimación de la carga bacteriana que oscila entre 1,06 y 3,22 log bact/g. Queda pendiente el análisis de un mayor número de quesos para conocer la prevalencia real de C. burnetii (estudio en marcha), y también está pendiente el genotipado y el estudio de viabilidad de las bacterias detectadas en los quesos positivos. Los resultados hallados en otros países han revelado altas prevalencias de C. burnetii en quesos, pero en ningún caso las bacterias resultaron ser viables.

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O‐20

BROTE DE INTOXICACIÓN BOTULÍNICA EN UNA GRANJA DE VACUNO LECHERO

Pujols1, J. García‐Peña2 FJ, Estrada3 E, Domingo1 M.

1CReSA (Centre de Recerca en Sanitat Animal), (UAB‐IRTA)

2Laboratorio Central de Veterinaria de Algete (Dpto. de Bacteriología) 3Ramaders de Vaquí

En una granja de vacuno de leche se produjo un episodio de parálisis flácida

de vacas en lactación, caracterizado por postración, incapacidad para levantarse, y ausencia de hipertermia. El curso clínico osciló entre 2‐4 días, y numerosos animales murieron o fueron eutanasiados por bienestar animal. En una semana la mortalidad acumulada fue de 45 de 90 vacas adultas. Finalmente el proceso afectó a 80 vacas, de las que 74 acabaron siendo bajas, y 6 se recuperaron. Los animales afectados eran incapaces de mantenerse en pié, y caían al suelo. La respiración, deglución, y la rumia inicialmente no se alteraron, y los animales estaban conscientes y tranquilos. No se detectaron convulsiones, ni rigidez. La gravedad de la parálisis avanzó con el tiempo y los animales quedaban totalmente extendidos en tierra, hasta que se producía la muerte por deglución desviada, dificultad respiratoria, o bien se realizaba la eutanasia. La sospecha clínica de intoxicación botulínica fue inmediata, basada en los signos clínicos que mostraban los animales. Por ello se procedió a retirar tanto el ensilado como toda la partida de pienso que estaban consumiendo los animales, y se procedió a la limpieza y vaciado de comederos y bebederos. Las necropsias que se realizaron se orientaron a la obtención de muestras para el diagnóstico de laboratorio de botulismo, llevado a cabo en el Laboratorio Nacional de Referencia de Algete. El análisis por bioensayo (inoculación en ratón) detecto la presencia de posible toxina botulínica en muestras de contenido de intestino delgado, la cual se confirmó mediante pruebas de neutralización como toxina botulínica tipo C. Las muestras de leche de glándula mamaria y las de suero sanguíneo fueron negativas. El estudio epidemiológico permitió atribuir el brote a contaminación del pienso con cadáveres de pollos de una granja cercana, aislándose Clostridium botulinum tipo C a partir de pienso recogido de alrededor de restos de cadáveres de pollo.

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O‐21

CLAVES PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRICOMONOSIS BOVINA

Collantes‐Fernández E., Rojo‐Montejo S., Arranz‐Solís D., Sánchez‐Sánchez R., Ortega‐Mora L.M.*

Grupo SALUVET, Departamento de Sanidad Animal, Facultad de Veterinaria, Universidad

Complutense de Madrid, Ciudad Universitaria s/n, 28040‐Madrid. [email protected] La tricomonosis bovina (TB) es una enfermedad parasitaria de transmisión sexual que origina, fundamentalmente, fallo reproductivo temprano y está incluida en la Lista de enfermedades de la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE). En la actualidad, se considera una enfermedad re‐emergente en aquellas zonas de España donde se mantiene el ganado en condiciones extensivas y se utiliza la monta natural, como sucede con la mayor parte del ganado vacuno de cría. En los rebaños infectados, la TB se ha asociado con un empeoramiento en los parámetros reproductivos, observándose un alargamiento del intervalo entre partos (79 días), y una disminución del número de terneros/año (17%), siendo de gran importancia su diagnóstico como punto clave en el establecimiento de planes de control. Por otra parte, el diagnóstico de la TB es obligatorio en los toros de centros de inseminación artificial según se refleja en la Directiva Europea que regula el comercio de semen bovino. El diagnóstico de la TB se basa en la identificación y aislamiento del parásito en medios de cultivo apropiados y en su posterior confirmación por técnicas moleculares (PCR). En los rebaños sospechosos se debe muestrear a los sementales, debido a la persistencia de la infección de por vida. La muestra de elección es el esmegma prepucial recogido después de un reposo sexual del animal de al menos 15 días. Esta muestra puede obtenerse mediante raspado de la mucosa peneana, succión con una pipeta o lavado de la cavidad prepucial, obteniéndose los mejores resultados cuando se utiliza un raspador de plástico. Otro factor importante son las condiciones de transporte de la muestra al laboratorio. Se debe intentar el envío de las muestras lo antes posible después de la recogida y en ningún caso deben transcurrir más de 2 días hasta su análisis. También es importante la utilización de medios adecuados de transporte‐cultivo que limiten la multiplicación bacteriana y favorezcan el crecimiento del parásito. Por último, es de suma importancia la utilización de técnicas moleculares confirmatorias que permitan diferenciar a Tritrichomonas foetus de otros posibles flagelados presentes en la muestra. El parásito también puede aislarse a partir del moco cérvico‐vaginal de la vaca, la placenta, los líquidos placentarios y/o el contenido abomasal

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del feto, siguiendo la misma metodología. Por otra parte, T. foetus ha sido identificado recientemente como una importante causa de diarrea crónica en gatos. En este caso, se recomienda realizar el diagnóstico a partir de muestras de heces del animal sospechoso y, debido a las características de la muestra y la dificultad para su cultivo, se recomienda la detección del parásito por PCR.

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O‐22

DIAGNÓSTICO DE BOTULISMO.

García Peña FJ*1, Frías, N.2*, Lorente, S.2, Castro, M.2, Serrano, T.2 y Varo, J.I.1

1Laboratorio Central de Veterinaria. Dpto. de Bacteriología. Carretera M‐106, km 1,4. 28110 Algete (Madrid).

2Tecnologías y Servicios Agrarios S.A. (TRAGSATEC) *Correspondencia: [email protected] INTRODUCCIÓN El botulismo es causado por la toxina botulínica, una potente neurotoxina producida por Clostridium botulinum y algunas cepas de C. baratii y C. butyricum. Se han identificado 7 tipos de toxina que se nombran con letras desde la tipo A a la tipo G, siendo la toxina tipo C la causante de la mayor parte de los casos de botulismo en animales. La toxina tipo D se ha descrito en ocasiones en ganado vacuno y perros y la tipo B en caballos y ganado vacuno en EEUU. Por último, también se han descrito algunos casos de botulismo en visones y aves por las toxinas tipo A y E. ETIOLOGÍA Y PATOGENIA Clostridium botulinum es una bacteria Gram‐positiva, anaerobia, formadora de esporas y móvil que está ampliamente distribuida en el medio ambiente. Así, es frecuente encontrarla en suelo, vegetales en descomposición, cadáveres y ambientes acuáticos. También, puede encontrarse formando parte de la microbiota intestinal de aves y otros animales, como por ejemplo en ganado vacuno. Las cepas de C. botulinum son heterogéneas fenotípicamente y genéticamente y se clasifican en 4 grupos:

Grupo I: son cepas proteolíticas que producen toxinas A, B y F.

Grupo II: son cepas no proteolíticas productoras de toxinas B, E y F.

Grupo III: son las cepas más importantes en animales e incluye cepas no proteolíticas que producen toxina C y D.

Grupo IV: solo incluye cepas proteolíticas productoras de toxina tipo G y se ha propuesto renombrarlo como otra especie denominada Clostridium argentinense.

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Todas las toxinas se sintetizan como un precursor inactivo formado por componentes no tóxicos y la neurotoxina y es necesaria la lisis de la bacteria para su liberación. La fracción no tóxica protege a la neurotoxina de las condiciones ambientales y participa en su absorción a nivel intestinal. La neurotoxina tiene un peso de 150 kDa y contiene dos subunidades:

Una cadena pesada de 100 kDa: es la responsable de la unión de la neurotoxina a receptores específicos de la membrana de las neuronas y su translocación a través de la membrana sináptica.

Una cadena ligera de 50 kDa: actúa a nivel de las proteínas implicadas en la unión y fusión de las vesículas de acetilcolina con la membrana presináptica, bloqueando la liberación del neurotransmisor. La máxima potencia de las neurotoxinas botulínicas se consigue únicamente después de la activación de la toxina por proteasas endógenas de las cepas proteolíticas o enzimas digestivas como la tripsina en el caso de las no proteolíticas, las cuales fragmentan la cadena polipeptídica en las dos subunidades que quedan unidas por un puente disulfuro. Una vez que la neurotoxina penetra en las neuronas ya no se puede neutralizar por la acción de los anticuerpos. Al inhibirse la liberación de acetilcolina, los músculos no se contraen dando lugar a una parálisis fláccida que puede llevar a la muerte por parálisis de la musculatura cardiaca y respiratoria. Se diferencian tres tipos de botulismo según la forma de entrada de la toxina en el organismo:

Intoxicación por ingestión: es la forma más habitual. Se produce por la ingestión de piensos, forrajes, carroña, restos vegetales, larvas de mosca… que contienen la neurotoxina botulínica preformada.

Toxiinfección: correspondería al denominado botulismo infantil y que en animales se ha descrito principalmente en potros menores de 4 semanas de edad (“shaker foal síndrome” o síndrome del potro “temblón”). Se produce por la ingestión de esporas que germinan y se multiplican en el intestino al no estar la microbiota intestinal plenamente desarrollada y como consecuencia se produce la neurotoxina en el propio lumen gastrointestinal. También, este tipo de botulismo podría ser relativamente frecuente en pollos.

Botulismo por heridas: es una forma poco habitual. Se produce por la multiplicación de C. botulinum en el tejido desvitalizado y la producción local de toxina. Se han descrito otras formas atípicas de botulismo como una forma visceral crónica en ganado vacuno que da lugar a un incremento en la mortalidad de vacas en el periodo

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alrededor del parto. La hipótesis es que se trataría de una toxiinfección como la ya descrita anteriormente. BOTULISMO EN ANIMALES Botulismo en aves El botulismo en aves salvajes migratorias está entre una de las tres principales causas de mortalidad de estos animales. Los tipos de toxinas implicados con mayor frecuencia son:

Toxina tipo C: causa mortalidad principalmente en patos.

Toxina tipo E: afecta principalmente a gaviotas y otras aves que se alimentan de peces como somormujos… En nuestro país, se producen brotes de botulismo todos los años principalmente durante el periodo estival como consecuencia de la temperatura, la disminución del caudal en ríos y del volumen de agua en humedales, pantanos, lagos, estanques… y el aumento de la concentración de la materia orgánica. Estos hechos producen una temperatura óptima de crecimiento para la bacteria, una disminución de los niveles de oxigeno y una abundancia de nutrientes que da lugar a que, si se alcanza un pH adecuado, las esporas germinen y las células vegetativas produzcan las toxinas. Estas toxinas contaminan el agua, suelos y son concentradas por animales acuáticos invertebrados y larvas de moscas. Cuando las aves ingieren los cadáveres de invertebrados o las larvas de mosca vivas con toxina mueren por botulismo y comienza un ciclo de amplificación que puede originar grandes mortalidades. En este ciclo, las moscas depositan sus huevos sobre las aves muertas y las larvas se alimentan de los cadáveres y almacenan la toxina botulínica en su organismo, siendo consumidas por otras aves. Un único cadáver pueden mantener unas 5.000 larvas y la ingestión de entre 2‐5 de estas larvas con toxina es suficiente para producir la muerte del animal. Las aves afectadas muestran una parálisis fláccida progresiva que afecta inicialmente a las patas continuando hacia las alas, cuello y párpados. Las aves acuáticas pueden ahogarse debido a la parálisis del cuello. En pollos los síntomas son similares y se han descrito mortalidades cercanas al 40%. También, en estos animales puede producirse una forma toxiinfecciosa en la que podría verse además diarrea con exceso de uratos.

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Botulismo en mamíferos Los rumiantes, principalmente el ganado vacuno, los équidos y los visones son especialmente sensibles a la toxina botulínica. Por el contrario, el ganado porcino y los perros son bastante resistentes. En el caso de rumiantes los casos están asociados a pastos abonados con gallinaza o acceso de los animales a este material, restos de cadáveres de gatos, roedores, aves… que pueden contaminar el heno, ensilado y el agua de bebida, alimentación con vegetales o restos de cosecha en descomposición, mala realización del ensilado y consumo de carroña por deficiencias de fósforo o dietas bajas en proteína. La intoxicación produce una parálisis fláccida simétrica que progresa desde los curtos traseros hacia la cabeza. Dependiendo probablemente de la dosis ingerida, la rapidez con la que esta parálisis progresa es variable, dando lugar a formas sobreagudas, agudas y crónicas, habiendo también en algunos casos muertes súbitas sin síntomas. Los síntomas clínicos pueden observarse tan pronto como en 24 horas tras la exposición a la toxina, pero en ocasiones no aparecen hasta los 17 días. En un estudio realizado sobre 30 casos de botulismo se determinó que el síntoma más característico es la flaccidez de la lengua, la cual puede sacarse fácilmente de la boca del animal sin que este la reintroduzca o lo haga lentamente. Asimismo suele haber disminución de la salivación y dificultades para masticar y tragar. La mortalidad puede llegar a alcanzar el 90% y muchos animales se sacrifican para evitar su sufrimiento. El ganado ovino y caprino presenta un cuadro similar al anterior excepto en que los músculos implicados en la masticación y la deglución no están afectados. De forma característica presentan inicialmente paso descoordinado y posteriormente el lomo arqueado con la cola, el cuello y la cabeza caídos. En équidos los síntomas son similares a los del ganado vacuno. En el síndrome del potro “temblón”, los síntomas son andares descoordinados, temblor muscular e incapacidad para permanecer de pie más de 4‐5 minutos. A veces se observa disfagia, estreñimiento, midriasis y micción frecuente. En las fases finales hay taquicardia y disnea, produciéndose la muerte por parálisis respiratoria entre las 24‐72 horas del comienzo de los síntomas. En perros se produce debilidad y parálisis de las extremidades, comenzando por las patas traseras, parálisis de los músculos faciales, problemas de visión y dificultad para comer. Se observa un descenso del ritmo cardiaco, dificultad respiratoria y ladrido ronco. La mortalidad suele ser baja con la terapia de soporte adecuada, pero la recuperación puede durar varias semanas.

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En los últimos años se ha producido un aumento en las solicitudes de diagnóstico de botulismo en nuestro Laboratorio, principalmente en ganado vacuno. Así, hemos recibido muestras de unos 12 casos sospechosos, de los que uno fue confirmado y en otros 3 se llegó a un diagnóstico presuntivo, todos ellos por toxinas C o D. Por último, también hemos confirmado dos casos de botulismo en perro por toxina tipo C. DIAGNOSTICO LABORATORIAL El diagnóstico definitivo de botulismo se basa en la detección de la toxina en el suero o en vísceras de animales afectados en los que no haya comenzado el proceso de autolisis. Mientras que en el caso de botulismo en aves y perros la confirmación de botulismo es posible en muchos de los casos, rara vez se consigue en rumiantes y équidos. Debido al curso del botulismo, las técnicas indirectas o de detección de anticuerpos no suelen ser de mucha utilidad. Podrían tener aplicaciones en el caso de animales que se recuperan del proceso o en especies como pollo, perro o cerdo que son más resistentes a las toxinas. 1‐Muestras

Las muestras a enviar al laboratorio son:

Suero: deberá obtenerse la mayor cantidad posible de animales con cuadros sobreagudos y animales que muestren los primeros signos de la intoxicación, ya que en casos avanzados la toxina puede haber desaparecido de la circulación. El suero se congelará a ‐20º C lo antes posible o como mínimo se mantendrá a 4º C para evitar la degradación de las toxinas. Es la muestra ideal para el caso de aves y perros, ya que son más resistentes al botulismo que rumiantes y équidos.

Contenido gástrico e intestinal, hígado y heces: en el caso de rumiantes y équidos pueden constituir una mejor muestra para la detección de toxina. Sin embargo, se debe tener en cuenta que los animales pueden tener bajas concentraciones de C. botulinum en su aparato digestivo, por lo que pueden producirse toxinas durante la autolisis postmorten. En la práctica, si las muestras se obtienen de animales vivos o inmediatamente tras la muerte del animal y se congelan a ‐20º C o se mantienen a 4º C para evitar la multiplicación de la bacteria y la formación de toxina, un resultado positivo permite establecer un diagnóstico prácticamente definitivo de botulismo. La congelación o refrigeración y el análisis de las muestras lo antes posible también e importante porque algunas bacterias de la microbiota del rumen pueden hidrolizar y destruir la toxina existente.

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Agua o alimento sospechoso: la detección de toxina en estas muestras permite establecer la fuente de la intoxicación y un diagnóstico casi definitivo. Es importante chequear si el alimento esta en buen estado o hay partes donde esta estropeado o podrido, así como la presencia de cadáveres de animales. Las muestras se congelarán para examinarse posteriormente. Sin embargo, en muchos casos, el agua o alimento responsable del brote no estará disponible para su recogida en el momento que se observen los síntomas, ya que hay al menos un retraso de 24 horas entre la ingestión de la toxina y el comienzo de los mismos.

Larvas de moscas obtenidas a partir de cadáveres.

Tejidos de alrededor de la herida, pus o hisopos para los casos de botulismo por heridas. 2‐Pruebas de laboratorio 2.1‐ Bioensayo: prueba de letalidad en ratón Esta prueba permanece como la técnica estándar para la detección de las neurotoxinas botulínicas. La prueba se basa en la inoculación intraperitoneal de extractos de las muestras y en caso de que estas contengan toxina, el ratón desarrollará los signos típicos de botulismo, como pelo erizado, debilidad muscular y fallo respiratorio que se manifiesta como “cintura de avispa”. En caso de un resultado positivo, la muestra se neutraliza con las diferentes antitoxinas y la mezcla se inocula intraperitonealmente. Los ratones inyectados con la muestra neutralizada por la antitoxina correspondiente sobrevivirán, mientras que el resto desarrollará botulismo. La prueba tiene las ventajas de que es muy sensible, con una dosis letal 50% de 5‐10 pg, un límite de detección de 0.01 ng/ ml y una muy buena especificidad, permitiendo identificar los siete tipos de toxinas. Entre sus inconvenientes tenemos que es laboriosa, cara y que plantea el dilema ético del uso de animales de laboratorio. Además otro inconveniente es que el ganado vacuno es 13 veces más sensible a la toxina que el ratón, mientras que en équidos se cita que puede llegar hasta 10.000 veces, por lo que un resultado negativo no excluye un diagnóstico de botulismo en estas especies. En el caso de muestras de suero, la muestra se filtra por poros de 0,22 μm para eliminar las posibles bacterias y el filtrado se inocula directamente. Con el resto de las muestras, lo más frecuente es realizar una extracción de la posible toxina usando un buffer fosfato con gelatina. Posteriormente se centrifuga y el

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sobrenadante se filtra a través de 0,22 μm para su inoculación. En caso de un resultado negativo, hay que tener en cuenta que las cepas de C. botulinum tipo III y tipo II son no proteolíticas, por lo que será necesario tratar los filtrados con tripsina para activar la posible pretoxina y repetir la inoculación. Posteriormente se ha desarrollado una prueba de inoculación subcutánea en ratón y observación de parálisis muscular local. La prueba es menos cruenta y es igual de sensible y específica que la prueba de letalidad, pero solo se ha usado para determinar la potencia de toxinas para uso terapéutico y todavía no se ha valorado para matrices más complejas. 2.2‐ ELISA Se han desarrollado diferentes ELISA tipo sándwich para la detección de las toxinas. Sin embargo, la sensibilidad de los ELISA convencionales es de 10 a 100 veces más baja que el bioensayo. Actualmente se ha mejorado la sensibilidad, llegando algunos de ellos a tener una sensibilidad parecida a la prueba de referencia. Sin embargo, muchos de ellos no están comercializados y aquellos que si lo están normalmente solo cubren las toxinas que afectan a humanos, no incluyendo por tanto la tipo C y tipo D. Por último, también se desconoce su eficacia cuando se usan con distintas matrices. En nuestro mercado hay ELISA sándwich para la detección de toxinas tipo C y D. Sin embargo, según las instrucciones la muestra a examinar sería el sobrenadante de cultivos de las muestras sospechosas tras 5 días de incubación, lo cual les resta utilidad. En nuestro Laboratorio se probó este ELISA comercial utilizando sueros de ave positivos a toxina tipo C, extractos de larvas de mosca muy positivos a toxina tipo C, extractos de muestras de dos casos sospechosos de botulismo negativos por inoculación en ratón y caldos incubados cinco días de las muestras de estos dos casos en algunos de los cuales se había detectado crecimiento de C. botulinum tipo C. Todos las muestras fueron negativas por ELISA, lo que puede indicar una baja sensibilidad o bien una influencia de la matriz sobre el resultado. 2.3‐ Técnicas de PCR Hay desarrolladas técnicas de PCR tanto convencionales como en tiempo real para la detección de los genes de la mayor parte de las toxinas. En algunos casos su sensibilidad puede verse afectada por la presencia de sustancias inhibidoras en las muestras, siendo aconsejable realizar una extracción adecuada del ADN y utilizar controles internos.

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En la mayor parte de los casos la ingestión de toxina suele ir acompañada de la ingestión de esporas, así que estas técnicas pueden utilizarse para detectar la bacteria en los extractos de las muestras antes de su filtración. Sin embargo, la detección de los genes de las toxinas en las muestras intestinales, heces, agua o alimento supone solo un diagnóstico presuntivo de botulismo ya que, como ya se ha citado anteriormente, C. botulinum se encuentra de forma habitual en el ambiente (suelo, agua, sedimentos…) y puede haber portadores intestinales de la bacteria sin que haya producción de toxina ni signos clínicos. Por el contrario, aunque un resultado negativo no lo excluye de forma definitiva, supone una evidencia más fuerte de que no se trata de un caso de botulismo 2.4‐ Cultivo y detección de bacteria y/o toxina C. botulinum requiere de una atmósfera anaeróbica estricta para su crecimiento, lo cual complica su aislamiento. Además, en el caso de las cepas de tipo C, estos requerimientos son aún mayores. Debido al alto grado de contaminación de las muestras usadas para el aislamiento, es aconsejable realizar un tratamiento previo que elimine las bacterias vegetativas competidoras y que no afecte a las esporas de la bacteria. Los dos más utilizados son el tratamiento con etanol y el tratamiento por calor. Aunque las muestras pueden cultivarse directamente en medios sólidos, el número de esporas presentes en las mismas sueles ser bajo (10‐1.000 esporas/kg) y al no haber medios selectivos disponibles, normalmente las muestras se enriquecen previamente en caldos apropiados tales como caldo carne cocida, caldo para anaerobios fastidiosos… Antes de realizar el subcultivo a medios sólidos, el sobrenadante de los caldos deberá examinarse por bioensayo en ratón o por pruebas de PCR para detectar crecimiento y tipos de C. botulinum que puedan haber crecido, no realizándose en caso de un resultado negativo. Como medios sólidos pueden utilizarse agar sangre con un mayor porcentaje de agar o agar yema de huevo, el cual nos permite detectar la actividad lipasa. La obtención de cultivos puros puede ser complicada por la presencia de otras especies de clostridios y otras bacterias formadoras de esporas, siendo por ello necesario en ocasiones realizar varias resiembras sucesivas. El problema es que algunas cepas pueden perder los genes de las toxinas por pases sucesivos en laboratorio.

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Una vez obtenido el cultivo puro se pueden utilizar técnicas de PCR para determinar el tipo de toxina y otras técnicas como la PFGE o AFLP para la caracterización molecular de los aislados. Aunque el cultivo y aislamiento de C. botulinum tiene la utilidad de mejorar nuestro conocimiento de la epidemiología, su valor diagnóstico es limitado por las mismas razones que las anteriormente expuestas para las pruebas de PCR. 2.5‐ Nuevas técnicas Se han desarrollado nuevos ensayos para la detección de toxinas que alcanzan la sensibilidad y especificidad de la prueba de letalidad en ratón. Entre otros podemos citar:

Detección por inmuno‐PCR utilizando anticuerpos monoclonales: es la más prometedora para su utilización en laboratorios menos especializados y además hay protocolos descritos para las toxinas C y D.

Ensayo de la actividad endopeptidasa: es muy específica, pero para alcanzar una sensibilidad similar al bioensayo es necesario disponer de un espectrofotómetro de masas.

Ensayos utilizando cultivos celulares, como células de neuroblastoma y células PC‐12: su principal inconveniente es que el tiempo de diagnóstico no se acorta con respecto al bioensayo en ratón. BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA

Lindström M, Korkeala H. 2006. Laboratory dignosis of botulism. Clin Microbiol Rev, 18: 298‐314.

Hogg R, Livesey C, Payne J. 2008. Diagnosis and implications of botulism. In Practice, 30: 392‐397.

Brooks E, Clarke HJ, Graham DA, Ball HJ. Diagnosis of botulism types C and D in cattle by a monoclonal antibody‐based sandwich ELISA. Vet Rec, 168: 455.

Centers for Disease Control and Prevention: Botulism in the United States, 1899‐1996. Handbook for Epidemiologists, Clinicians, and Laboratory Workers, Atlanta, GA. Centers for Disease Control and Prevention, 1998.

Cai S, Singh BR. 2007. Botulism diagnostic: from clinical symptoms to in vitro assays. Critical Rev Microbiol, 33: 109‐125

Nakamura K, Kohda T, Seto Y, Mukamoto M, Kozaki S. 2013. Improved detection methods by genetic and immunological techniques for botulinum C/D and D/C mosaic neurotoxins. Vet Microbiol, 162: 881‐90.

Lindberg A, Skarin H, Knutsson R, Blomqvist G, Báverud V. 2010. Real‐time PCR for Clostridium botulinum type C neurotoxin (BoNTC) gene, also covering a

68

chimeric C/D sequence ‐ Application on outbreaks of botulism in poultry. Vet Microbiol, 146: 118‐123.

Wobeswer G. 1997. Avian botulism ‐ Another perspective. J Wild Dis, 33: 181‐186.

Anniballi F, Auricchio B, Delibato E, Antonacci M, De Medici D, Fenicia L. 2012. Multiplex real‐time PCR SYBR Green for detection and typing of group III Clostridium botulinum 154: 332‐338

Helder LC, McClure JT, Leger ER. 2001. Presumptive diagnosis of Clostridium botulinum type D intoxication in a herd of feedlot cattle. Can Vet J, 42. 210‐212.

Szabo EA, Pemberton JM, Gibson AM, RJ Thomas, Pascoe RR, Desmarchelier PM. 1994. Application of PCR to a clinical and environmental investigation of a case of equine botulism. J. Clin. Microbiol., 32: 1986.

Kirchner S, Krämer KM, Schulze M, Pauly D, Jacob D, Gessler F, Nitsche A, Dorner BG, Dorner MB. 2010. Pentaplexed quantitative Real‐Time PCR assay for the simultaneous detection and quantification of Botulinum Neurotoxin‐Producing Clostridia in food and clinical samples. Appl Environ Microbiol, 76: 4387–4395.

Lindström M, Mari Nevas M, Joanna Kurki J, Raija Sauna‐aho R, Annikki Latvala‐Kiesilä A, Ilpo Pölönen I and Hannu Korkeala H. 2004. Type C Botulism due to toxic feed affecting 52,000 farmed foxes and minks in Finland J Clin. Microbiol, 42: 4718‐4725.

Jones T. 1996. Botulism. In Practice, 18: 312‐313.

Kirchner S, Krämer KM, Schulze M, Pauly D, Jacob D, Gessler F, Nitsche A, Dorner BG, Dorner MB. 2010. Pentaplexed quantitative Real‐Time PCR assay for the simultaneous detection and quantification of Botulinum Neurotoxin‐Producing Clostridia in food and clinical samples. Appl Environ Microbiol, 76: 4387–4395.

Van der Burgt GM, Mitchell ESE, Otter A, Whitaker KA, Hogg R. 2007. Seven outbreaks of suspected botulism in sheep in the UK. Vet Rec, 161: 28‐30

Braun U, Feige K, Schweizer G, Pospischil A. 2005. Clinical findings and treatment of 30 cattle with botulism. Vet Rec, 156: 438‐441

Bruchim Y, Steinman A, Markovitz M, Baneth G, Elad D, Shpigel N. 2006 Toxicological, bacteriological and serological diagnosis of botulism in a dog. Vet Rec 158: 768‐769

Mcgorum BC, Kyles KJW, Prince D, Hahn CN, Mayhew G. 2003. Clinicopathological features consistent with both botulism and grass siknes in a foal. Vet Rec, 152: 334‐336.

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O‐23

APLICACIÓN DE ALCANCES DE ACREDITACIÓN FLEXIBLES EN LOS LABORATORIOS DE CONTROL OFICIAL

H. Hooghuis

Laboratorio Arbitral Agroalimentario. Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio

Ambiente. Madrid (España)

La entrada en vigor del Reglamento (CE) 882/2004 ha afectado significativamente a los laboratorios oficiales que se dedican no sólo al análisis de alimentos y piensos sino también a los laboratorios de sanidad animal, siendo uno de sus requisitos más importantes la obligatoriedad de acreditación según la norma UNE‐EN ISO/IEC 17025:2005. En la definición del alcance de acreditación se diferencian dos sistemas: el clásico de “alcance cerrado” para determinadas matrices y analitos concretos, y el “alcance abierto o flexible”, conocido como acreditación para categorías de ensayo, que permite al laboratorio incluir nuevas matrices y/o analitos en su alcance de acreditación sin necesidad de auditoría previa por parte de la Entidad Nacional de Acreditación (ENAC). En España, el sistema de acreditación para categorías de ensayo se establece en las notas técnicas NT‐18 y NT‐19, exclusiva para plaguicidas, de ENAC. En el resto de Europa, aunque hay intentos de armonización, existen diferentes niveles de flexibilidad, abarcando desde los alcances concretos prácticamente de tipo matriz/analito hasta la acreditación genérica de todas las actividades del laboratorio, como ocurre en Alemania y en Austria. Antes de diseñar su alcance, el laboratorio debe evaluar si es realmente necesario o no disponer de la capacidad de añadir nuevas matrices y/o analitos a su alcance ya acreditado, influyendo en esta evaluación el número y el tipo de muestras previsto, su complejidad técnica, el coste de su ejecución, la disponibilidad de personal cualificado y del instrumental necesario, etc. La acreditación por categorías de ensayo tiene su máxima utilidad en laboratorios que se enfrentan habitualmente a análisis nuevos y no rutinarios, y que necesiten dar una respuesta acreditada con cierta urgencia, sin requerir auditoría externa previa. Conviene mencionar que desde 2012 ENAC ofrece un nuevo proceso rápido de ampliación del alcance de acreditación, la acreditación documental, que también evita tener que esperar a la siguiente auditoría programada.

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Se debe tener en cuenta que el acceso a una categoría de ensayo no es inmediato, ya que se requiere como condición que el laboratorio haya superado con éxito un primer ciclo de acreditación. Además, ENAC se reserva la potestad de permitir o no la aplicación de la NT‐18 dependiendo del fin previsto, y tendrá en cuenta si la experiencia del laboratorio es adecuada y suficientemente representativa en función de la categoría definida. En definitiva, la elección de las estrategias de acreditación siempre debe tener como objetivo la racionalización, en el sentido de evitar duplicidades y tender hacia la especialización y concentración de recursos. En este sentido, en la toma de decisiones deberá participar no sólo el laboratorio sino también los correspondientes órganos directores de las administraciones encargadas del control oficial.

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O‐24

APLICACIÓN DEL REGLAMENTO (CE) 882/2004 PARA EL CONTROL OFICIAL: LÍNEAS DE ACTUACIÓN PARA FACILITAR EL CUMPLIMIENTO DE LA ACREDITACIÓN OBLIGATORIA DE PROCEDIMIENTOS ANALÍTICOS.

Lucía B. Pitarch Mampel

Laboratorio Central de Veterinaria. Ministerio de Agricultura, Alimentación y

Medioambiente. Madrid (España)

Desde la entrada en vigor del Reglamento (CE) 882/2004 sobre los controles oficiales en el ámbito de la Unión Europea, los Laboratorios Oficiales implicados en el sector agroalimentario han ido aumentando o iniciando sus alcances de acreditación en base a la norma UNE‐EN ISO/IEC 17025:2005, ya que según indica el reglamento todos los procedimientos de ensayo utilizados para fines de control oficial deben estar incluidos en sus respectivos alcances de acreditación en base a dicha norma. De este modo y en estos últimos años, al mismo tiempo que cada Laboratorio trabajaba en su proceso de acreditación, se iniciaban diferentes proyectos de coordinación sobre cuestiones relativas a la gestión de calidad entre los Laboratorios Nacionales de Referencia y los Laboratorios Oficiales de las CC.AA., grupos de trabajo entre diferentes Laboratorios oficiales de regiones cercanas y proyectos de colaboración entre los diferentes Laboratorios Nacionales de Referencia. De este último proyecto surge el texto que hoy se presenta “Aplicación del Reglamento (CE) 882/2004 para el control oficial: líneas de actuación para facilitar el cumplimiento de la acreditación obligatoria de procedimientos analíticos.” Asimismo surge de la preocupación manifestada por ambos Ministerios implicados (MAGRAMA y MSSSI) sobre el nivel de cumplimiento a fecha actual de los requisitos de acreditación recogidos en el reglamento y las dificultades que han ido surgiendo. El texto recoge líneas de actuación para racionalizar y optimizar recursos, como son:

1. Identificación de necesidades analíticas: derivadas principalmente de los planes/programas de control y vigilancia, aunque también del requerimiento de dar respuesta ante alertas, imprevistos, urgencias.

2. Evaluación de la capacidad analítica acreditada disponible: con las necesidades definidas se valoraran los recursos existentes. Es importante conocer capacidades analíticas de otros laboratorios, el intercambio de datos (RELSA, LAGRORED, RESALAB, ENAC…)

3. Estrategias de acreditación:

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o Modelo de acreditación: acreditación independiente o acreditación en red

o Tipo de alcance de acreditación: alcance cerrado y/o alcance abierto o flexible

4. Actuaciones para facilitar la acreditación: o Revisión de condiciones y acceso a categorías de ensayo (LNR‐LCO‐

ENAC) o Transferencia de procedimientos de ensayo y validaciones (LNR) o Organización de ensayos de intercomparación y suministro de

materiales de referencia (LNR) o Actividades de formación (LNR) o Definición de categorías de ensayo (LNR‐ENAC)

Sobre cada una de estas líneas se indican los organismos que pueden llevarlas a cabo. Ya que el documento resalta la importancia del trabajo en común de las administraciones responsables del control oficial, los laboratorios y la Entidad Nacional de Acreditación. Todo ello con el fin de agilizar los procesos de acreditación, optimizarlos y dar la mejor respuesta posible a nivel nacional a los requerimientos del Reglamento 882/2004.

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O‐25

EXPERIENCIA PRÁCTICA EN LA ACREDITACIÓN MEDIANTE CATEGORÍAS DE ENSAYOS.

Joaquín A. Berenguer Soler

Centro Nacional Alimentación (CNA).

Agencia Española de Seguridad Alimentaria y Nutrición (AESAN). Ministerio de Sanidad, Servicios Sociales e Igualdad (MSSSI)

La legislación vigente aplicable para el control oficial, establece que el ámbito

de aplicación de la acreditación exigida a los laboratorios debe incluir a todos los métodos utilizados por el laboratorio para análisis, prueba o diagnóstico cuando actúe como laboratorio oficial. Esta exigencia hace que los laboratorios que intervienen en el control oficial puedan necesitar de estrategias de acreditación adicionales a la tradicional mediante “ensayos cerrados” (acreditación “por matriz y analito” concretos, con rangos de trabajo y límites especificados). La experiencia acumulada del CNA (AESAN) durante más de 14 años indica que es razonable adoptar una estrategia de acreditación mixta, en la cual la acreditación para “alcances flexibles” es un esquema adicional de acreditación particularmente útil cuando un laboratorio prevé: - la necesidad de tener que incluir nuevas matrices y analitos en su alcance

acreditado para cumplir adecuadamente con sus funciones asignadas, por ej., como Laboratorio de Control Oficial.

- la necesidad de alcances acreditados muy extensos, como ocurre, por ej., con los Laboratorios Nacionales de Referencia que también tienen entre sus funciones asignadas participar en el control oficial y ‐por ello‐ son requeridos para realizar análisis dirimentes, análisis prospectivos, gestión de emergencias o urgencias analíticas, resolución de problemas analíticos asociados a la aparición de nuevas matrices/analitos, etc.

Para obtener esta acreditación han de cumplirse los requisitos que establecen las notas técnicas de ENAC NY‐18 y NT‐19, que fundamentalmente requieren del laboratorio:

una capacidad de gestión añadida, ya que el sistema se basa en la existencia de un documento (LEBA o LPE) en el que se listan los ensayos concretos, dentro de una categoría de ensayos definida, para los que está acreditado el laboratorio. Dicho documento es controlado y actualizado por el propio laboratorio ‐de acuerdo a sus necesidades‐ sin intervención previa de ENAC. De especial interés es el compromiso que ha de adquirir el laboratorio para ofrecer ensayos acreditados en toda la categoría.

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un nivel de competencia técnica añadida para incrementar progresivamente y de forma válida el alcance acreditado. La estrategia del CNA sobre validaciones consiste en disponer de un procedimiento de validación de carácter general (que puede ser complementado con procedimientos de validación más específicos) que exige realizar una validación inicial completa lo suficientemente extensa y representativa de las matrices/analitos incluidos en la categoría de ensayos, que se complementa con validaciones adicionales, entendiendo por tales los procesos de validación a realizar para ampliar un método validado a matrices o analitos no validados previamente, así como ‐inexcusablemente‐ para incrementar la LEBA/LPE.

En la experiencia práctica, el proceso de obtención de acreditación de alcances flexibles mediante “Categorías de Ensayos” puede enfocarse como un proceso escalonado con los siguientes pasos:

1. Acreditación de “ensayos cerrados” según Norma UNE‐EN ISO/IEC 17025 y CGA‐ENAC‐LEC. Ej.: Determinación de aflatoxina B1 en cacahuete por CL‐fluorescencia

2. Acreditación de “categorías de ensayos” según Norma UNE‐EN ISO/IEC 17025, CGA‐ENAC‐LEC y NT‐18/NT‐19 de ENAC (demostrando experiencia previa en la acreditación de ensayos cerrados tras superar con éxito un ciclo completo de acreditación). Ej.: Determinación de aflatoxinas en alimentos por CL‐fluorescencia

3. Acreditación de categorías de ensayo más genéricas (demostrando experiencia previa en la acreditación de ensayos flexibles y constituyendo categorías de ensayos más amplias que incluyan diversas “familias” de matrices/analitos que se analizan mediante una técnica de ensayo común). Ej.: Determinación de micotoxinas en alimentos por CL con distintos detectores.

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O‐26

GESTIÓN DE CALIDAD Y ACREDITACIÓN DE LABORATORIOS.

Elisa Gredilla Zazo.

Jefe del Departamento Agroalimentario y BPL de ENAC

La acreditación es la herramienta establecida internacionalmente para generar confianza sobre la actuación de cierto tipo de organizaciones denominadas Organismos de Evaluación de la Conformidad y que abarca a los laboratorios de ensayo, laboratorios de calibración, entidades de inspección y de certificación y verificadores.

La Entidad Nacional de Acreditación es la entidad designada por el Real Decreto 1715/2010 como único Organismo Nacional de Acreditación, dotado de potestad pública para otorgar acreditaciones, de acuerdo con lo establecido en el Reglamento (CE) n.º765/2008 del Parlamento Europeo y el Consejo, de 9 de Julio de 2008. ENAC desarrolla su actividad en el ámbito estatal evaluando, a través de un sistema conforme a normas internacionales, la competencia técnica de los Organismos de Evaluación de la Conformidad que operen en cualquier sector, sea en el ámbito voluntario o en el obligatorio cuando reglamentariamente así se establezca. ENAC es el miembro español de la Infraestructura Europea de Acreditación creada por el mismo Reglamento CE nº765/2008 y, como tal, miembro de EA (European Co‐operation for Accreditation), y firmante de los Acuerdos Multilaterales de Reconocimiento en materia de acreditación, suscritos por las entidades de acreditación de 60 países. El desarrollo y realización de análisis es una herramienta que tiene una repercusión decisiva en el ámbito agroalimentario y por supuesto también específicamente en el de la sanidad animal. Los laboratorios que los realizan estos análisis trabajan en un entorno de creciente exigencia y responsabilidad tanto legal como social que reclama un nivel de calidad y de confianza extraordinarios. Por ello, tanto los métodos de ensayo como los laboratorios que realizan los análisis deben asegurar, al máximo nivel permitido por el desarrollo científico, la fiabilidad de los resultados, lo cual implica que además de reunir los criterios técnicos que aseguren su validez, deben ser realizados con una serie de garantías que permitan obtener resultados comparables con independencia del laboratorio que los ejecute. La necesidad de la acreditación de los laboratorios de análisis que participan en el control oficial para garantizar el cumplimiento de la legislación en materia de piensos y

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alimentos y la normativa sobre salud animal y bienestar de los animales, establecida en el Reglamento CE 882/2004, ha llevado a ENAC a desarrollar una serie de documentos cuyo objetivo último es facilitar la acreditación a los laboratorios de análisis. Así se elaboraron ya hace muchos años la Nota Técnica 18 para la acreditación de ensayos con un alcance flexible que ENAC llevó a EA, la Infraestructura Europea de Acreditación y se logró la aprobación de un documento de EA que contempla la acreditación con un alcance flexible de igual manera que había desarrollado ENAC. Complementando esta nota se elaboró la Nota Técnica 19 “Laboratorios de ensayo: acreditación de análisis de residuos de plaguicidas en productos agroalimentarios”, que desarrolla específicamente la acreditación de análisis de residuos de plaguicidas con alcance flexible, es de señalar que en las diferentes revisiones han participado junto a la AESAN y al Ministerio de Agricultura, la Asociación de Entidades de Ensayo, Calibración y Análisis (FELAB), y que estamos tratando también llevar esta Nota a un documento de EA. También es relevante la Nota Técnica‐55 “Laboratorios de referencia en el sector agroalimentario: Política sobre participación en el sistema de acreditación”. El Reglamento 882/2004 mencionado anteriormente establece las funciones y responsabilidades de los laboratorios de referencia de la UE y Nacionales dentro del control oficial. El papel de estos laboratorios es crucial para garantizar un adecuado funcionamiento, desde el punto de vista técnico, de los ensayos realizados por los laboratorios. Por ello ENAC ha establecido esta política en relación con el papel de los laboratorios de referencia de la UE y nacionales en el sistema de acreditación. Una parte básica de esta política es que ENAC considera en todo momento como adecuadas las decisiones, prácticas y procedimientos de ensayo utilizados por los laboratorios que sigan las instrucciones, directrices, recomendaciones o documentos publicados por el correspondiente Laboratorio Nacional de Referencia (LNR) de cualquier estado miembro o el Laboratorio de Referencia de la UE (EU‐RL) respectivo. Esta posibilidad facilita a los laboratorios su acreditación, pues el utilizar métodos desarrollados y validados por los Laboratorios de Referencia garantiza la validez del método. Otro pilar importante es la posibilidad de realizar consultas sobre dudas técnicas surgidas en los procesos de acreditación a los Laboratorios Nacionales de Referencia y considerar vinculantes para ENAC sus respuestas con objeto de fijar criterios de evaluación. Tras la aprobación de esta Nota Técnica, se han producido numerosas consultas que han sido atendidas por los Laboratorios Nacionales y que nos han permitido avanzar rápidamente. Si bien hay margen para un mayor desarrollo de pautas por parte de los LNR Finalmente hay que destacar la Nota Técnica‐56 “Laboratorio de ensayos en el ámbito de la Sanidad Animal: Directrices para la acreditación” , en la elaboración de este

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documento han participado el Grupo de Trabajo de Calidad – Coordinación General de Laboratorios de Sanidad Animal, el Ministerio de Medio Ambiente y Medio Rural y Marino (MARM) y la Asociación Empresarial Española de la Industria de Sanidad y Nutrición Animal (VETERINDUSTRIA), este documento muy relevante en este campo de ensayo. Comentaremos los datos respecto al volumen de acreditaciones actuales y específicamente lo relacionado con el ámbito agroalimentario y con los laboratorios de sanidad animal. Por último comentaremos la problemática entorno a la acreditación con un alcance flexible en el entorno de la sanidad animal. Todos los documentos indicados y más información sobre ENAC, la acreditación y las entidades acreditadas se encuentran disponibles en la página web de ENAC: www.enac.es

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Resúmenes Pósters

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P‐01 UTILIZACIÓN DE NANOPARTÍCULAS MAGNÉTICAS FUNCIONALIZADAS PARA LA PURIFICACIÓN DE MONOCITOS CD14+ DE RUMIANTES PARA LA POSIBLE

DETECCIÓN DE PATÓGENOS INTRACELULARES

Abendaño, N.; Ledo, B.; Boveda, E.; Barandika, J.; Juste, R.A. y Alonso‐Hearn, M.

Neiker‐Tecnalia/Miltenyi Biotec

El diagnóstico de patógenos intracelulares es complicado porque estos

microorganismos son capaces de sobrevivir dentro de macrófagos y células dendríticas (células CD14+) eludiendo al sistema inmune del hospedador. En muchas ocasiones, las cantidades de DNA obtenidas de fluidos biológicos son tan pequeñas que no permiten realizar un correcto diagnóstico por PCR. En otros casos, los componentes biológicos de la matriz pueden inhibir la reacción de PCR dando falsos negativos o resultados dudosos. Por ello, la purificación de las células infectadas facilita la detección de patógenos intracelulares, sobre todo cuando éstos se encuentran presentes en baja cantidad. En rumiantes, la purificación selectiva de células CD14+ a partir de sangre periférica es muy ineficiente por lo que hemos diseñado un protocolo de purificación de células CD14+ caprinas empleando nanopartículas magnéticas unidas a un anticuerpo monoclonal (mAb) anti‐CD14 humano.

Las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se purificaron a partir de

sangre heparinizada de una cabra de raza Azpigorri mediante un gradiente de densidad de Ficoll. Una fracción de los PBMCs obtenidos se tiñó con un mAb anti‐CD14 humano conjugado con ficoeritrina o aloficocianina (Miltenyi). El resto de los PBMCs se incubaron con nanopartículas magnéticas unidas a un mAb anti‐CD14 humano (CD14 Microbeads, Miltenyi), se purificaron empleando columnas MS sometidas a un campo magnético (MiniMACS, Miltenyi) y se tiñeron con los mimos anticuerpos descritos anteriormente. Ambas fracciones celulares se analizaron por citometría de flujo y se calcularon las proporciones de células CD14+ antes y después de la separación magnética. La proporción de células CD14+ tras la separación inmunomagnética fue 10 veces mayor (74‐75 %) que en la fracción original (7‐8 %). La mayoría de las células seleccionadas mostraron una morfología típica de monocitos. La proporción de células CD14+ que se perdieron en los lavados de la columna fue de solo un 4 %. Nuestros resultados demostraron que el mAb anti‐CD14 humano reconoce a las células CD14+ caprinas. La aplicación de nanopartículas magnéticas con distinta funcionalidad podría permitir la purificación selectiva de las células infectadas y mejorar la detección de patógenos intracelulares.

Resúmenes pósters:

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P‐02

RATONES TRANSGÉNICOS COMO MODELO DE DIAGNÓSTICO DE EETS EN AVES NECRÓFAGAS

Parra, B.1; Nevado, M.J.2; Hernández‐Valero, M.2; Varo, I.1; Moreno‐Opo, R.2;

Huélamo, T.2, Castilla, J4 & Mayoral, T.3

1 Laboratorio de Sanidad Animal. Laboratorio Central de Veterinaria (Ministerio de

Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente) 2 Tecnologías y Servicios Agrarios SA.

3 Laboratorio de Genética Molecular. Laboratorio Central de Veterinaria (Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente)

4 CIC‐BioGUNE.

La Península Ibérica tiene un papel fundamental en la conservación de las aves necrófagas puesto que es el único país europeo en el que coexisten cuatro especies de buitres europeos. En España se reproduce el 98% de la población europea de buitre negro (Aegypius monachus), el 94% de buitre leonado (Gyps fulvus), el 82% de alimoche (Neophron percnopterus) y el 66% de la población nidificante de quebrantahuesos (Gypaetus barbatus). La aparición de la Encefalopatía Espongiforme Bovina generó una crisis sanitaria y alimentaria en Europa que propició la aplicación de actuaciones encaminadas a evitar el contagio de ésta entre las especies ganaderas y los seres humanos. En la práctica, la aplicación de la Reglamentación Europea sobre la gestión de los subproductos animales y los productos derivados no destinados al consumo humano obliga a los Estados Miembros a recoger todos los animales muertos en campo, evitando que se puedan alimentar las especies necrófagas. Estas medidas han tenido diversos efectos negativos en las poblaciones de las diferentes especies de buitres presentes en España, algunas de ellos en peligro de extinción. En este estudio se describe el desarrollo de un modelo transgénico de buitre para el estudio de la susceptibilidad de las aves necrófagas a las Encefalopatías Espongiformes Transmisibles (EETs) así como para el diagnóstico de EETs en aves. Para ello, fue necesario clonar y secuenciar la fase de lectura abierta (ORF) del gen PRNP de las diferentes especies de buitres encontradas en España analizando su homología entre ellas así como con otras especies de aves y mamíferos. Además, fue necesaria la producción de un anticuerpo policlonal en conejo frente a la proteína PrP celular (PrP

C) de aves mediante inmunizaciones con proteína recombinante. Se obtuvieron 4

sueros que mostraron una gran sensibilidad (dilución 1:128 PrPC gallina) y especificidad (100%) frente a PrP

C aviar.

Se obtuvieron 8 líneas de ratones transgénicos de las cuales el 50% expresan niveles entre 0’5‐2x PrP

C buitre. Animales de varias líneas seleccionadas serán inoculados con diferentes cepas de

EETs para analizar la susceptibilidad de los buitres a éstas enfermedades.

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P‐03

VALORACIÓN DE LA CALIDAD DE HUEVOS INCUBABLES DE GALLINAS PESADAS EN RELACIÓN CON LA EDAD Y LA CONTAMINACIÓN POR

ESCHERICHIA COLI

Frías, N.3*; Lorente, S.3; Castro, M3; Serrano, T3; García Peña, F.J.1 y Abad, J.C.2

1Laboratorio Central de Veterinaria. Dpto. de Bacteriología. MAGRAMA. 2Cobb España.

3Tecnologías y Servicios Agrarios S.A. Introducción: las colibacilosis tempranas en broilers son generalmente por la infección del pollito en las nacedoras. La fuente de infección es en muchas ocasiones el huevo incubable contaminado. Aunque los huevos para incubar se desinfectan antes de la incubación, las bacterias que hayan alcanzado el interior del huevo estarán protegidas de la acción del desinfectante. El huevo posee varias estructuras para impedir la entrada de bacterias como son la cutícula, la propia cáscara y sus membranas internas y el vitelo. Sin embargo, parece que la calidad de las mimas disminuye con la edad del lote de reproductoras. El objetivo del trabajo es valorar la calidad de los huevos incubables y la proporción de huevos contaminados por Escherichia coli en su superficie o en su interior de tres lotes de reproductorasd de diferentes edades. Material y métodos: se recogieron 120 huevos recién puestos de tres lotes de reproductoras de 32, 45 y 55 semanas respectivamente. En 50 de ellos se valoró la calidad de la cúticula por tinción y la calidad de la cáscara por gravedad específica. En otros 20 se calculó el numero de poros por tinción con azul de metileno y recuento de poros en tres zonas del huevo usando una lupa. Otros 50 huevos se introdujeron en una bolsa estéril, se añadieron 10 ml de agua de peptona y se masajearon durante dos minutos y se sembraron 100 μl en placas de agar MacConkey. Los huevos se vaciaron y su interior se rellenó con agar MacConkey a 42‐45º C y se dejó solidificar. Las placas y los huevos se incubaron a 37º C/24 horas. Resultados y conclusiones: no hubo diferencias importantes en cuanto a calidad de cúticula, gravedad específica y número de poros. Sin embargo el porcentaje de huevos contaminados se incremento desde el 10% en el lote joven a un 14% en el mediano y un 23% en el viejo. Asimismo, el porcentaje de huevos con E. coli en las membranas internas fue del 8%, 14% y 14% respectivamente. Estos resultados indican la necesidad de desarrollar nuevas tecnologías para disminuir la contaminación de huevos en la granja, así con el desarrollo de mejores protocolos de desinfección. Por último, hay que evitar incubar conjuntamente huevos de lotes de reproductoras viejas y jóvenes, por las posibilidades de contaminación cruzada de estos últimos.

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P‐04

EVOLUCIÓN DE ENCEFALOPATÍA ESPONGIFORME BOVINA EN ESPAÑA (2000‐2013).

Huélamo, T.2; Parra, B. 1; Gonzalo, I. 1; Mayoral, T. 3; Nevado, M.J. 2; Vigo, M. 1;

Gómez‐Tejedor, C.4; Sánchez, M.C.5 & Agüero, M.1

1 Laboratorio de Sanidad Animal. Laboratorio Central de Veterinaria (Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente)

2 Tecnologías y Servicios Agrarios SA. 3 Laboratorio de Genética Molecular. Laboratorio Central de Veterinaria (Ministerio de

Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente) 4 Coordinación General de Laboratorios (Ministerio de Agricultura, Alimentación y

Medio Ambiente) 5 Subdirección General de Sanidad e Higiene Animal y Trazabilidad (Ministerio de

Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente)

El Control de las Encefalopatías Espongiformes Transmisibles (EETs) en la UE se instaura a finales de la década de los 80 tras la notificación del primer caso de Encefalopatía Espongiforme Bovina (EEB) en 1986 en Reino Unido. Cuando en 1996 se diagnostica el primer caso de la nueva variante de Creutzfeldt‐Jakob (nvCJD), se instauran los mecanismos de control actuales para garantizar la Seguridad Alimentaria. El Control de las EETs se establece a nivel comunitario en el Reglamento 999/2001. A nivel Nacional, el RD 3454/2000 establece el Programa Integral Coordinado de Vigilancia, Control y Erradicación de las EETs. El Laboratorio Central de Veterinaria (LCV), como laboratorio nacional de referencia para las EETs, es el encargado de confirmar las muestras de EEB y desde el año 2012, ha sido autorizado por el Laboratorio Europeo de Referencia para las EETs, a discriminar las diferentes cepas de EEB. En este estudio se presenta un resumen de todos los casos de EEB diagnosticados en España en el periodo 2000‐2013. Desde esa fecha se han diagnosticado en España, 808 casos distribuidos en 789 focos. Además, tras un estudio retrospectivo de los casos positivos y una implantación en el LCV de las técnicas de discriminación de cepas atípicas de EEB, se han confirmado 12 casos de EEB atípica: 7 Tipo‐H y 5 Tipo‐L. Durante estos años de aplicación de la Reglamentación Europea y Nacional para Vigilancia, Control y Erradicación de las EETs, se ha observado una reducción del número de casos (97% de reducción en los últimos 10 años) y un incremento de la media de edades de los animales detectados (> de 6 años). Estos datos demuestran la efectividad de las medidas de control adoptadas, teniendo además en cuenta que el tamaño poblacional se ha mantenido prácticamente constante.

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P‐05

DETECCIÓN DE UN VIRUS DE INFLUENZA AVIAR (H7N1)DE BAJA PATOGENICIDAD EN UNA EXPLOTACION DE GALLINAS REPRODUCTORAS

EN LLEIDA. MAYO 2013

Sánchez, A.1, Ruano, M.J.1, Buitrago, D.2, Agüero, M.1

1 Laboratorio Central de Veterinaria, Madrid ‐ MAGRAMA

2 Tecnologías y Servicios Agrarios SA.

El Laboratorio Central de Veterinaria (LCV) es Laboratorio Nacional de Referencia para la Influenza Aviar (IA) y como tal realiza la confirmación del diagnóstico de esta enfermedad previa a la declaración de un foco por parte de la Autoridad Veterinaria Competente. El presente estudio describe la actuación del LCV en la confirmación y caracterización del brote de IA de baja patogenicidad ocurrido en mayo de 2013 en una granja de reproductoras de Lleida en el que se registraron 133 aves muertas, 2000 afectadas y 12225 aves sacrificadas. El 9 de mayo se inició la sospecha con una ligera disminución de la producción, caída de la puesta, depresión y diarrea. El día 14 el Centro de Sanidad Avícola de Cataluña y Aragón (CESAC) diagnosticó Influenza Aviar e inmediatamente se establecieron medidas de restricción del movimiento en la zona y el muestreo de las explotaciones ubicadas en un radio de 3 km alrededor de la explotación afectada. El 16 de mayo se recibieron en el LCV muestras de hisopos cloacales y traqueales así como sueros de 20 animales de la explotación afectada, confirmándose el mismo día 16 la presencia de genoma de un virus Influenza tipo A subtipo H7N1 en varias de los hisopos y de anticuerpos frente al mismo en la mayoría de los sueros analizados. El día 17 se completaron los estudios para determinar la patogenicidad molecular, concluyendo que se trataba de un virus de baja patogenicidad y pocos días más tarde el virus pudo ser aislado por inoculación en huevos de gallina embrionados. Asimismo se han realizado análisis de la secuencia nucleotídica del gen de la Hemaglutinina del virus que han permitido establecer sus relaciones filogenéticas más cercanas respecto a otros virus H7 circulantes tanto en España como en Europa. Hay que destacar que en este caso la rapidez en la detección del virus y en la toma de medidas de control impidió que el virus circulante pudiera mutar a un virus de alta patogenicidad, evitando de esta forma mayores consecuencias tanto económicas como mediáticas.

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P‐06 ACTIVIDADES DE DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO Y DE DETECCIÓN DEL AGENTE REALIZADAS EN EL LCV SOBRE LAS MUESTRAS DE LOS BROTES DE FIEBRE DEL

NILO OCCIDENTAL (FNO) DESDE EL AÑO 2010

Villalba, R.1, San Miguel, E. 1, Fernández I.2, Sánchez A.1, Varo J.I.1, Vigo M.3 y Agüero, M.1.

1 Laboratorio Central de Veterinaria (Sanidad animal) – MAGRAMA

2 Tecnologías y Servicios Agrarios SA. 3 Dirección General de Agricultura y Ganadería. Consejería de Agricultura. Junta de

Comunidades de Castilla La Mancha

Desde el año 2010, en España han ocurrido 4 brotes de carácter estacional, de la Fiebre del Nilo occidental (FNO), que han afectado a caballos del sur de la península, habiéndose declarado un total de 62 focos desde septiembre de 2010 hasta la fecha (19/10/2013), basándose, principalmente, en la presencia de sintomatología clínica compatible con la enfermedad y la detección de anticuerpos IgM específicos frente al virus de la FNO.

En el Laboratorio Central de Veterinaria (LCV), como Laboratorio Nacional de Referencia (LNR) para enfermedades zoonóticas transmitidas por artrópodos, en productos para la alimentación animal y en animales vivos (R.D. 1940/2004, de 27 de septiembre, sobre la vigilancia de las zoonosis y los agentes zoonóticos) se llevan a cabo las confirmaciones de las sospechas clínicas en caballos, así como actividades de diagnóstico serológico y virológico de vigilancia de la enfermedad en aves y en caballos, en el marco del Plan de vigilancia de la enfermedad del Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio ambiente (MAGRAMA). Se presenta un resumen de las actividades de diagnóstico serológico y de detección del agente realizadas desde septiembre de 2010 hasta la fecha sobre muestras de la zona de los brotes declarados de la enfermedad. Los análisis incluyen el diagnóstico serológico mediante ELISA de captura IgM específico para caballos, ELISA de competición multiespecie y Micro‐neutralización; así como el diagnóstico para la detección del agente mediante RT‐PCR en tiempo real específica del virus de la FNO con sondas que permiten diferenciar linaje 1 y linaje 2, RT‐PCR genérica para detección de Flavivirus y posterior secuenciación del producto de PCR para su identificación y caracterización, y aislamiento del virus en diversos sistemas in vivo e in vitro. Además se expone la problemática y alguno de los actuales desafíos para el diagnóstico de esta enfermedad, como puede ser es el diagnóstico serológico diferencial con otros Flavivirus o la toma de muestras para la detección del agente.

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P‐07 VALIDATION OF A NEW COMMERICAL ELISA FOR THE DETECTION OF ANTI‐

IBR gE ANTIBODIES

Pourquier, P. & Comtet, L.

IDvet, Montpellier, France

IDvet has developed the ID Screen® IBR gE Competition ELISA for the detection of antibodies against the gE glycoprotein of the BHV‐1 virus. This test can distinguish naturally‐infected cattle from cattle vaccinated with gE deleted vaccines. This study presents validation data for this test. Methods: ID Screen® IBR gE Competition ELISA: The kit uses an anti‐IBR gE monoclonal antibody (Mab) conjugate. This Mab is directed against a different epitope from that recognized by the Mabs in other commercial ELISAs. Plates are coated with BHV‐1 antigen purified lysat. The kit can be used with serum or plasma and individual, pooled or concentrated milk. Results: Specificity was evaluated by testing 940 sera from disease‐free animals, 170 sera from multi‐vaccinated animals (gE deleted vaccine) and 120 bulk milk samples. All samples were correctly identified as negative. Sensitivity was evaluated by testing 82 sera from naturally‐infected, VNT‐positive animals. 8 paired serum/milk samples were also tested. All samples were correctly identified as positive. Analytical sensitivity was evaluated by testing 3 naturally‐infected sera in parallel with another commercial ELISA kit. The ID Screen® test demonstrated equivalent or superior analytical sensitivity on these samples. Conclusion: The ID Screen® IBR gE Competition shows excellent specificity and sensitivity, and improved analytical sensitivity on serum and milk samples. The kit is an excellent tool for monitoring natural infection in vaccinated animals.

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P‐08 IDENTIFICACIÓN DE POLIMORFISMOS DEL GEN PRNP OVINO Y CAPRINO EN

ESPAÑA. ESTUDIO COMPARATIVO CON OTROS PAISES EUROPEOS.

Hurtado, D.2, Hernández‐Valero, M. 2, Parra, B.1; Huélamo, T.2; Anadón, E. 1 & Mayoral, T.1

1 Laboratorio de Genética Molecular. Laboratorio Central de Veterinaria. Ministerio de

Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente. 2 Tecnologías y Servicios Agrarios SA.

La susceptibilidad o resistencia a scrapie tanto en ovejas como en cabras está

influenciada por la presencia de diferentes variantes alélicas del gen PRNP. Se han detectado numerosos polimorfismos en ambas especies, siendo los que aparecen en los codones 136, 154 y 171 los que están más relacionados con scrapie en ovino y las variantes G127S, I142M, H143R, N146S/D, R154H, R211Q y Q222K las que están asociadas con la enfermedad en caprino. Por otro lado, diversos estudios en ovino, han revelado la existencia de polimorfismos en otros codones que también estarían relacionados con la enfermedad (M137T, N176K y L141F). El objetivo de este trabajo ha sido la identificación de polimorfismos en el gen de la proteína del prión en ovejas de diferentes razas y cabras españolas, y la comparación de dichos resultados con los perfiles de polimorfismos del gen PRNP detectados en otras regiones del mundo recogidos en la bibliografía científica. En ovino se han detectado 6 mutaciones silentes y 26 polimorfismos con cambio de aminoácido, de los cuales 1 y 5 respectivamente, no se han descrito con anterioridad. Los polimorfismos con cambio aminoacídico más frecuentes en ovino son L141F y Q171R, presentando las nuevas variantes alélicas frecuencias inferiores al 1%. En caprino se han identificado 4 mutaciones silentes y 11 polimorfismos con cambio de aminoácido, de los cuales 1 de ellos no ha sido descrito previamente. Al comparar los polimorfismos detectados en España, con el resto de los países incluidos en el estudio, se observa una alta diversidad genética en nuestro país, aunque gran número de polimorfismos, detectados en ovinos y en caprinos, aparezcan también en otras regiones del mundo de forma más o menos concreta. El análisis de las regiones codificantes del gen PRNP que presentan mayor variabilidad, muestra que, en general, existe coincidencia entre las mutaciones detectadas en España y las observados en el conjunto de los diferentes alelos de todos los países analizados. Los resultados obtenidos, aportan datos relevantes para la determinación de otras regiones de la proteína del prión relacionadas con el desarrollo de la enfermedad de scrapie ovino y caprino.

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P‐09

DISEÑO Y VALIDACIÓN EN CONDICIONES FAST PCR DE UN ENSAYO MULTIPLEX LIOFILIZADO EN REAL‐TIME PCR PARA LA DETECCIÓN DE

CAMPYLOBACTER

Zoder, P. ; Petrauskene O. V.; Bolchakova E.; Brzoska, P. M.; Brevnov, M. G.; Schumaker, M.; Nunez,A.; Balachandran, P. and Furtado, M. R.

Life Technologies Corporation.

Antecedentes: Campylobacter jejuni , C. coli y C. lari se encuentran entre los patógenos

más frecuentes en muestras medioambientales y entre los transmitidos por alimentos. Por este motivo y para facilitar la identificación de especies patogénicas en humanos, hemos diseñado y validado un ensayo sensible y específico, basado en una multiplex Real‐time PCR en condiciones PCR‐ FAST, para detectar e identificar C. jejuni, C. coli y C. lari. El ensayo incluye un control positivo interno (IPC) y utiliza una configuración de cinco colores en un formato liofilizado. El método basado en la PCR nos proporciona una rápida aproximación, siendo mucho más sensible y rápido que otros métodos usados para la detección, como el cultivo, este método sobre todo es idóneo para la detección de patógenos que son sensibles a diferentes condiciones de crecimiento y ambientales. C. jejuni , C. coli y C. lari fueron detectados de forma individual y en mezclas de 5‐100 UFC / ml. Cada especie se detectó específicamente en presencia o ausencia de otras especies. El ensayo multiplex Campylobacter mostró 100 % de especificidad para todos los objetivos analizados y no hay detección de un panel de exclusión que incluye especies cercanas. Este ensayo multiplex real‐time PCR puede simplificar la detección, la cuantificación de patógenos y la reducción del coste, ya que 3 especies distintas pueden ser analizadas en una sola reacción. La detección de bacterias de Campylobacter se realizó con éxito usando filtros de concentración y lisis testados directamente sobre enjuagues de pollo. Este método incremento la sensibilidad de la detección en alrededor de 1000 veces. La Preparación de las muestras fue totalmente automatizada y mostró la detección entre 10 a 100 UFC / ml de Campylobacter inoculado en los enjuagues de pollo. La detección de Campylobacter ha sido validada para la carne de pollo, carnes procesadas, huevos, leche cruda y entera, enjuagues de pollo.

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P‐10

DISEÑO Y OPTIMIZACIÓN DE UNA RT‐PCR EN TIEMPO REAL PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA NUEVA VARIANTE DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD

HEMORRÁGICA DEL CONEJO

Rocha, A. 2; Chico, I.2; Ruano, M.J.1; Sánchez, A.1 y Agüero, M.1

1 Laboratorio Central de Veterinaria, MAGRAMA. 2 Tecnologías y Servicios Agrarios SA.

La enfermedad Hemorrágica del Conejo (EHC), también llamada septicemia vírica fue

detectada por primera vez en China en 1984, y en 1988 se diseminó en Europa. La EHC es una enfermedad altamente contagiosa y mortal en el conejo (Oryctolagus cuniculus) tanto silvestre como de producción. El agente causal de la enfermedad es el virus de la enfermedad hemorrágica de conejo (RHDV) del género de los Lagovirus perteneciente a la familia Caliciviridae . A principios del año 2012, apareció una nueva variante del RHDV en la Península Ibérica (RHDV‐N11), que presenta diferencias respecto al RHDV clásico, ya que afecta a gazapos en lugar de animales adultos y produce una mortalidad inferior a la ocasionada por las cepas clásicas en los animales infectados. La divergencia genética entre RHDV‐N11 y el virus clásico en la región codificante para la proteína mayoritaria de la envuelta (VP60) es bastante elevada, lo que probablemente sea la causa de la falta de protección frente al RHDV‐N11 en los animales inmunizados con vacunas inactivadas clásicas. Por tanto, es esencial disponer de métodos diagnósticos que permitan detectar diferencialmente ambos tipos de virus, para poder evaluar correctamente la presencia de cada uno de ellos en las poblaciones afectadas y aplicar las adecuadas medidas sanitarias. El objetivo del trabajo que se presenta ha sido desarrollar una RT‐PCR en tiempo real, específico para el virus RHDV‐N11, que permita diagnosticar la presencia de genoma viral en muestras clínicas de forma rápida y con alta sensibilidad. Para ello se realizó una comparación de las secuencias del gen VP60 de todas los virus detectados en el Laboratorio Central de Veterinaria durante los años 2012‐2013 con la de todos los virus RHDV disponibles en Genbank, empleando el programa de alineamiento múltiple Clustal W. Basándose en este alineamiento, se diseñó una pareja de primers y una sonda TaqMan‐MGB, utilizando el programa Primer Express 2.0 (Applied Biosystems), en una región conservada entre las diferentes cepas del virus RHDV y con suficientes cambios respecto a otros cepas clásicas como para garantizar su especificidad. En la optimización de la RT‐PCR en tiempo real se ensayaron distintas combinaciones de concentración de cebadores y sonda para conseguir la mejor eficiencia de la reacción. Se determinó la sensibilidad del método optimizado y se comparó con la del ensayo RT‐PCR empleado en el diagnóstico inicial. Asimismo se realizaron ensayos de especificidad, empleando otros patógenos que infectan conejos, con resultados satisfactorios.

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P‐11 PARASITACIÓN EN POLLOS, CERDOS Y TERNEROS DE GRANJAS ECOLÓGICAS Y

CONVENCIONALES. DETECCIÓN POR ELISA DE ANTÍGENO EN HECES Y ANTICUERPOS EN SUERO DE F.hepatica.

Adamuz, J J; Villalba, D; Cubiló, D; Álvarez‐Rodríguez, J; Nogareda, C

Universitat de Lleida. ETSEA, Departament de Producció Animal

Se analizaron muestras de heces o sangre de tres especies animales: pollos (72), cerdos

(40) y terneros (102 muestras de heces y 102 de sangre) criados en granjas convencionales o ecológicas (proyecto AGAUR 2011 AGEC 006). Las granjas estaban ubicadas en las provincias de Girona, Barcelona, Lleida y Huesca y el recuento de huevos de parásitos en heces se realizó por la técnica McMaster. Se observó que el 85% de los pollos criados en granjas convencionales excretaban ooquistes del género Eimeria con un promedio de 8472 ooquistes/g heces por pollo y el 48% con 677 ooquistes/g en las ecológicas con diferencias significativas (p<0,05). El 44% de los pollos de granjas ecológicas presentaron huevos del orden Ascaridida con un promedio de 1347 huevos/g de heces y no se detectaron en las granjas convencionales. En cerdos no se apreció excreción alguna de huevos de parásitos en heces. Los terneros ecológicos excretaron más ooquistes de Eimeria que los convencionales (80% de animales positivos con una media de 223 ooquistes/g heces frente al 52% con 41 ooquistes/g). En cuanto a huevos de nematodos de la familia Trichostrongilidae, el 85% de los terneros ecológicos fueron positivos con 53 huevos/g heces y el 55% de los convencionales con 62 huevos/g. Se realizaron coprocultivos de las heces de terneros para determinar los géneros más abundantes de esta familia y fueron Haemonchus, Ostertagia y Cooperia en los dos tipos de granja. Para detectar la presencia de antígeno de Fasciola hepatica en heces y anticuerpos en suero de los terneros se utilizaron dos técnicas ELISA y la correlación de los resultados de ambas técnicas fue muy alta. Los 13 terneros positivos a antígeno de F.hepatica lo fueron también a anticuerpos excepto uno y no se detectaron diferencias entre tipos de granja. En este estudio se detectó mayor parasitación en pollos, con más ooquistes de Eimeria en los convencionales y huevos de Ascaridida en los ecológicos.

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P‐12 DEFORMIDAD SEVERA DEL PICO EN PERIQUITO AUSTRALIANO Melopsittacus undulatus (SHAW,1805) (PSITTACIFORMES, PSITTACIDAE) CAUSADA POR

Knemidocoptes pilae.

Alarcón‐Elbal, P.M. 1, Carmona‐Salido, V.J. 1, Calero‐Bernal, R. 2, Masot Gómez‐Landero, J. 3, Lucientes, J. 1, Sánchez‐Murillo, J.M. 4

1 Departamento de Patología Animal, Facultad de Veterinaria. Universidad de

Zaragoza, España. 2 Área de Parasitología. Facultad de Veterinaria de Cáceres, España.

3 Área de Anatomía y Anatomía Patológicas Comparadas. Facultad de Veterinaria de Cáceres. España

4 Departamento de Parasitología. Laboratorio Regional de Sanidad Animal. Servicio de Sanidad Animal. Consejería de Agricultura, Desarrollo Rural, Medio Ambiente y

Energía. Gobierno de Extremadura, España * [email protected] Resumen

Se describe un brote de sarna knemidocóptica causada por Knemidocoptes pilae en periquitos australianos (Melopsittacus undulatus) mantenidos en cautividad en un parque público de L´Eliana (Valencia, España). Se destaca la exacerbada malformación del pico en uno de ellos, presentando afectación de la ranfoteca, rinoteca y gnatoteca, con ligera desviación lateral del maxilar, que no le impedía la alimentación y aseo de plumaje.

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P‐13 ESTUDIO Y CUANTIFICACIÓN DE BACTERIAS EN JUGO GÁSTRICO Y HECES DE

DELFINES MULARES (TURSIOPS TRUNCATUS) EN CAUTIVIDAD

Frías, N.3*; Lorente, S.3; Castro, M3; Serrano, T3; García Peña, F.J.1 y García Párraga D2

1Laboratorio Central de Veterinaria. Dpto. de Bacteriología. MAGRAMA. 2L´Oceanogràfic Valencia

3Tecnologías y Servicios Agrarios S.A. Introducción: los delfines mantenidos en cautividad son propensos a sufrir disbiosis intestinales por la propia estructura de su aparato digestivo , infecciones por bacterias como Helicobacter spp o por la ingestión de cuerpos extraños entre otras causas. Hay pocos estudios sobre la composición de la microbiota digestiva normal de estos animales. En este estudio se intentó llevar a cabo la identificación y cuantificación de las bacterias en jugo gástrico y heces de los delfines del delfinario de L´Oceanographic (Valencia). Material y métodos: Las muestras de jugo gástrico se obtuvieron por endoscopia y la heces por capilaridad. Las muestras se diluyeron al 1:10 en medio de transporte FBP con carbón activado y se refrigeraron un máximo de 24 horas hasta su análisis. Se realizaron diluciones decimales en MRD (Maximun Recovery Diluent) y se sembraron en medios de cultivo adecuados para la enumeración de enterobacterias totales, coliformes, Escherichia coli, Clostridium perfringens, Enterococccus spp y Lactobacillus spp. La dilución inicial se utilizo para la detección de Salmonella y Campylobacter spp. Resultados y conclusiones: en jugo gástrico los recuentos oscilaron entre menos de 10 ufc/ml y 2,1.10

5 ufc/ml, siendo las especies más frecuentes Clostridium perfringens, Plesiomonas

shigelloides, Streptococcus canis y Lactobacillus spp. Además en los delfines con los recuentos más bajos se aislaron levaduras. En heces los recuentos fueron más alto, oscilando entre 1,28. 10

10 y 10

6 ufc/ml, siendo las principales especies

Plesiomonas shigelloides, C. perfringens, Edwarsiella tarda, Escherichia coli y Lactobacillus spp. Solo en dos animales se aislaron enterocococos y todos fueron negativos a Campylobacter y Salmonella spp. Estos resultados permiten conocer la composición normal de la microbiota intestinal y usar el análisis periódico de estas muestras para detectar disbiosis intestinales. El aislamiento de diferentes especies de Lactobacillus abre las puertas a la valoración de algunas de ellas como posibles probióticos homólogos.

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P‐14

DIVERSIDAD DE BIOTOPOS LARVARIOS DE CULEX PIPIENS Y CULEX QUINQUEFASCIATUS (DIPTERA, CULICIDAE) PROVENIENTES DE VALENCIA

(ESPAÑA) Y DE CAMAGÜEY (CUBA).

Alarcón‐Elbal, P.M. 1. Sánchez‐Murillo, J.M. 2, Lucientes, J. 1 & Diéguez, L. 3

1 Departamento de Patología Animal, Facultad de Veterinaria. Universidad de Zaragoza, España.

2 Departamento de Parasitología. Laboratorio Regional de Sanidad Animal. Badajoz, España.

3 Departamento de Control de Vectores. Unidad Municipal de Higiene y Epidemiología de Camagüey, Cuba.

Los mosquitos del complejo Culex pipiens (Diptera, Culicidae) son importantes vectores

de patógenos causantes de enfermedades que comprometen la salud humana y animal, tales como la fiebre del Nilo Occidental, las filariosis o la malaria aviar. Este grupo, cuyos miembros se encuentran ampliamente distribuidos a nivel mundial, consta principalmente con dos especies: Culex pipiens Linnaeus (1758), presente en zonas templadas y Culex quinquefasciatus Say, 1823, que habita en regiones tropicales y subtropicales. La comprensión de los factores que facilitan o impiden la reproducción de estos artrópodos es vital para adoptar medidas de control adecuadas e implementar sistemas de vigilancia activos, eficaces y eficientes. Para ampliar los conocimientos sobre las preferencias biotópicas de estos importantes vectores, así como su coexistencia con otras especies, se realizaron prospecciones periódicas en la provincia de Valencia (España) y la provincia de Camagüey (Cuba) durante el año 2012. Los resultados muestran que Cx. pipiens y Cx. quinquefasciatus explotan una gran variedad de nichos de muy diversa naturaleza, lo que incluye recipientes artificiales de pequeño y gran tamaño pasando por cuerpos de agua naturales como márgenes de ríos, campos de arroz, acequias o canales, entre otros muchos. Ambas especies son un claro ejemplo de artrópodos sumamente eurioicos, capaces de explotar con notable éxito ambientes lóticos y lénticos, de aguas limpias y eutrofizadas, acomodándose a un amplio rango de variaciones físico‐químicas del medio.

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P‐15 REGISTRO Y CONTRASTACION DE KITS DE DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES

ANIMALES

del Sur, E., Tesouro, S., Castro, M.V., Agüero, M.

Laboratorio Central de Veterinaria, Algete, España.

La contrastación de reactivos y kits de diagnóstico para enfermedades es un punto clave para el aseguramiento de resultados de análisis, además de un requisito legal para su comercialización según se establece en la Ley 8/2003 de Sanidad Animal, siendo el Laboratorio Central de Veterinaria, el encargado de realizar este control en las enfermedades para las que está designado Laboratorio Nacional de Referencia De acuerdo a esta disposición, la contrastación debe realizarse tanto de productos que solicitan el Registro en el Magrama, como de todos aquéllos lotes de Kits que están destinados al diagnóstico de enfermedades objeto de campañas de saneamiento ganadero y que son adquiridos por el Ministerio mediante licitación En el primer caso, los fabricantes remiten al laboratorio una memoria técnica junto con una muestra del producto. La documentación presentada se valora requiriendo que sea completada y/o corregida si fuera necesario y paralelamente se realiza una contrastación para comprobar que el reactivo de diagnóstico presentado es adecuado para su uso previsto y cumple los parámetros indicados en su validación. En el segundo, la empresa que ha ganado un concurso para la adquisición de kits por parte del MAGRAMA envía al LCV muestras de todos los lotes antes de distribuirlos al resto de los laboratorios para el mismo tipo de control. Los parámetros estudiados son: Sensibilidad y especificidad analítica repetibilidad intra e interplaca así como especificidad y sensibilidad diagnóstica, tanto a la llegada del producto al laboratorio como al final del periodo de caducidad para asegurar su estabilidad Para el estudio de la sensibilidad y especificidad analítica se emplean sueros de referencia positivos y negativos o subpatrones de dichos sueros. En cambio para el estudio de la sensibilidad, y especificidad diagnóstica se emplea un panel de sueros de campo positivos y negativos conocidos para poder calcular los parámetros deseados Para el estudio de la repetibilidad se emplean sueros positivos y negativos de valor conocido los cuales se repiten un número de veces determinado poder calcular el coeficiente de variación. En este trabajo se recoge el estudio de los controles de lotes durante los últimos cinco años llevado a cabo en el LCV.

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¿CUANTOS CROMOSOMAS SEXUALES TIENEN REALMENTE NUESTROS CABALLOS?

Bouzada, J.A.1, Lozano, J.M.2, Maya, M.R.2, Ossorio, B.2, Trigo, A.2, Bonet, I.2, Castillo, F.2, Fernández‐León, J.2, De la Cruz, V.2, Gómez‐Tejedor, C.1, Mayoral,

T. y Anadón, E.1

1Dpto. Identificación Genética. Laboratorio de Genética Molecular. Laboratorio Central

de Veterinaria. MAGRAMA. 2 Tecnologías y Servicios Agrarios, S.A.

La mayoría de las alteraciones en el número de cromosomas equinos están

relacionadas con los cromosomas sexuales. Estas alteraciones se asocian con frecuencia con signos clínicos que afectan la salud y la reproducción pero su manifestación, por lo general, aparece en la madurez y los trastornos potenciales son, a menudo, difíciles de sospechar. Un análisis fiable en una etapa temprana del desarrollo capaz de detectar y caracterizar las aberraciones de cromosomas sexuales en animales recién nacidos tendría, por lo tanto, importantes efectos económicos.

A través de la determinación rutinaria del genotipo de un panel de marcadores de tipo microsatélite de los animales es posible identificar los perfiles que son indicativos de anomalías cromosómicas. Incluyendo marcadores de ADN adicionales en los paneles habituales para la verificación pedigrí y parentesco estas anomalías cromosómicas pueden ser confirmadas. Determinados perfiles anormales en los marcadores genéticos localizados en los cromosomas sexuales permiten identificar a los animales con alteraciones cromosómicas.

El panel de marcadores utilizados para las pruebas de ADN de caballos por el Laboratorio Central de Veterinaria de Algete (Madrid) consta de diecisiete marcadores microsatélites autosómicos (AHT4, AHT5, ASB2, ASB17, ASB23, CA425, HMS1, HMS2, HMS3, HMS6, HMS7, HTG4, HTG6, HTG7, HTG10, LEX33 y VHL20), dos marcadores de microsatélites ligados a los cromosomas sexuales (LEX3 y LEX27) y el marcador de la Amelogenina, (ubicado en la parte homóloga de los cromosomas X e Y pero con amplificación diferencial), ha demostrado ser muy útil para el control genealógico y de identidad así como para la detección de anomalías cromosómicas en los cromosomas sexuales. Marcadores adicionales ligados al sexo (LEX22, LEX24, LEX28 y TKY598) son utilizados para confirmar los casos que han resultado sospechosos después de su análisis con el panel principal de marcadores.

La detección a una edad temprana y la comprensión de la incidencia de las aberraciones cromosómicas sexuales debería ayudar en el diagnóstico y el manejo de los caballos destinados a la cría.

Palabras clave: anomalías cromosómicas, microsatélites, control genealógico

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ACTIVIDADES DEL LABORATORIO CENTRAL DE VETERINARIA COMO EU‐RL PARA LA PESTE EQUINA AFRICANA

Tena‐Tomás, C. 2, Gómez‐Tejedor, C. 1; Vigo, M. 1 y Agüero, M. 1

1 Laboratorio Central de Veterinaria, MAGRAMA, Madrid; 2 Tecnologías y Servicios Agrarios S.A.

El Laboratorio Central de Veterinaria (LCV) es, desde 1992 y según la directiva 92/35/CEE del Consejo, Laboratorio de Referencia de la Unión Europea para la Peste Equina Africana (AHS EU‐RL). Como tal tiene una serie de funciones entre las que se encuentran: coordinar los métodos de diagnóstico de la enfermedad en los Estados Miembros, prestar una colaboración activa en la identificación de focos, facilitar la información o la puesta al día de los expertos en diagnóstico de laboratorio, proceder a intercambios de información con el laboratorio mundial de la peste equina designado por la Oficina Internacional de Epizootias (OIE) o mantener actualizados los métodos de diagnóstico para la enfermedad. Para garantizar el cumplimiento de dichas funciones el AHS EU‐RL mantiene una colección de cepas del virus de la peste equina africana (VPEA) así como de sueros de referencia para su envío a los países miembros que así lo soliciten con el fin de unificar las técnicas utilizadas en dichos Estados. Asimismo, con vistas a armonizar las técnicas en el ámbito de la Unión Europea (UE), organiza un ensayo de aptitud anual en el que participan todos los Laboratorios Nacionales de Referencia (LNRs) de los Estados Miembros, cuyos resultados son presentados y discutidos en una reunión anual. Cabe destacar la actividad del AHS EU‐RL en el desarrollo de métodos de diagnóstico molecular del VPEA que son ampliamente utilizados en la UE. En este ámbito es reseñable el desarrollo de una RT‐PCR en tiempo real (Agüero et al, 2008) que permite la detección rápida y a gran escala de los virus PEA. Asimismo ha desarrollado RT‐PCRs de tiempo real capaces de detectar específicamente cada uno de los serotipos del virus de una forma rápida y eficaz. Para ello, ha sido de especial importancia la caracterización de cepas mediante la secuenciación de las proteínas VP2 y VP7 tanto de cepas de referencia como de aislados de campo procedentes del brote de PEA ocurrido en España en 1987‐90 y de brotes más recientes de la enfermedad en diferentes países africanos. Además el AHS EU‐RL mantiene un equipo de expertos en VPEA dispuestos a apoyar, asesorar y prestar una colaboración activa en la identificación de los posibles focos de peste equina que pudieran surgir en los Estados Miembros. El LCV es además Laboratorio de referencia OIE para la PEA, realizando como tal tareas de apoyo técnico y suministro de materiales de referencia a todos los países del mundo que lo requieran.

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METODOS MOLECULARES PARA LA DISCIMINACIÓN DE ESPECIES PERTENECIENTES A LOS GÉNEROS MERLUCCIUS Y SCOMBER.

López‐Maroto, C.2, Bouzada, J.A. 1 , García‐Curbelo.E.2, Mayoral, T. 1 y

Anadón,E.1

1 Dpto. Identificación Genética. Laboratorio de Genética Molecular‐LCV. Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente


En los últimos años ha crecido de manera significativa la demanda por parte del consumidor de información clara y precisa sobre los alimentos que adquiere y consume, especialmente en aquellos que provienen del mar, acompañada de legislación que avala esta demanda. El RD 121/2004 sobre la identificación de los productos de la pesca, de la acuicultura y del marisqueo, vivos, frescos, refrigerados o cocidos, ha tratado de regular esa información requerida, si bien, no ha sido igual de efectiva en todos los sectores a los que aplica. En la actualidad, se dispone de herramientas precisas con el fin de poder identificar de qué productos se tratan cuando las características morfológicas como el tamaño, la forma o la apariencia son eliminados. Sin embargo en aquellos casos donde no se aplica, puede conllevar la aparición de fraudes en productos pesqueros sobre todo en aquellos de alto interés comercial En este trabajo analizamos, la problemática presente con dos de los géneros más consumidos en España, el género Merluccius y el género Scomber. En el género Merluccius, la especie Merluccius merluccius o merluza, es la más apreciada, pero al tener las características morfológicas muy conservadas dentro del género, es muy difícil la identificación la especies solo por su forma o su apariencia. En cuanto al género Scomber, la especie Scomber scombrus o caballa es la más apreciada organolepticamente, pero la gran similitud en la apariencia y textura de la carne con S. colias y japonicus lo hacen indistinguible en ausencia de caracteristicas morfológicas externas. Por esto, se han tratado de desarrollar métodos de análisis rápidos y eficientes para verificar el etiquetado del producto. Los basados en el ADN y en especial el ADN mitocondrial, son una buena herramienta como sustituto del análisis proteico utilizado de modo tradicional, ya que las secuencias de ADN permiten una mayor sensibilidad y precisión. En el presente trabajo, se describen las técnicas FINS( Forensically Informative Nucleotide Sequencing) y PCR‐multiplex aplicadas a este campo y el poder de discriminación de poseen para cada especie.

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VALIDATION OF THE ID SCREEN® INTERFERON GAMMA CAPTURE ELISA: INTRODUCTION OF A STANDARD REFERENCE CONTROL TO IMPROVE RESULT

INTERPRETATION

Pourquier, P. & Comtet, L.

IDvet, Montpellier, France This study presents validation data for the ID Screen IFN‐g Capture ELISA. Method: The ID Screen® Interferon Gamma Capture ELISA contains plates coated with an anti‐ruminant IFN‐g Mab. The conjugate is an anti‐ruminant IFN‐g‐HRP Mab. Contrary to other commercial ELISAs, the test expresses results with respect to a freeze‐dried positive reference control in order to guarantee the standardisation of results between runs and batches. Results are expressed as S/P%. Results: Test baseline: 233 bovine and 180 caprine plasmas, incubated with PBS, were tested. 99.5% of these samples gave S/P% values less than 10%. Analytical sensitivity: Samples were activated by both specific and non‐specific antigens, and tested in parallel on the IDvet kit and other commercial kits. Equivalent results were obtained between kits. Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map): 180 caprine plasma samples from a Map‐infected herd were tested further to activation by different antigens. The IDvet kit efficiently detected caprine IFN‐g. Multi‐site field validation for Bovine Tuberculosis: Samples were tested in parallel with the IDvet ELISA and another commercial ELISA. Test agreement was superior to 95%. Repeatability: CV values obtained using threshold dilutions of native IFN‐g were excellent (between 6 and 12%) Conclusion: The new IDvet IFN‐g ELISA has a low baseline, and demonstrates excellent reproducibility and robustness thanks to the incorporation of a positive reference control used for result calculation.

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P‐20 IDENTIFICACIÓN GENÉTICA DE ESPECIES DEL GÉNERO Thunnus MEDIANTE EL

USO DE FINS.

López‐Maroto, C.2, Bouzada, J.A. 1 , Maya, M.R.2, Moraga, L. 2, Mayoral, T.1 y Anadón, E.1

1 Laboratorio de Genética Molecular‐LCV. Ministerio de Agricultura, Alimentación y

Medio Ambiente 2 Tecnologías y Servicios Agrarios SA.

La identificación genética de las especies pesqueras de alto interés comercial así como

en los productos elaborados a partir de las mismas es esencial a la hora de su comercialización. Aunque el examen morfológico es comúnmente utilizado para la identificación en pescado fresco, se hace necesario el desarrollo de nuevas tecnologías basadas en el análisis de ADN, cuando se pretende identificar pescado troceado, congelado o enlatado. Entre las especies más apreciadas y valoradas en la pesca comercial, se encuentran los túnidos, con 8 especies diferentes dentro de este género. Cabe destacar, entre ellas, al atún rojo (Thunnus thynnus) que es una de las especies más controladas, debido a que se encuentra en peligro de extinción . Este control de basa en el establecimiento de cuotas por parte de la Comisión Internacional para la Conservación del Atún Rojo Atlántico (CICAA) que marca, anualmente, la cantidad de capturas a nivel internacional con el objetivo de llevar a cabo un plan de recuperación plurianual de las pesquerías de atún rojo. Así mismo, el gobierno, siguiendo las pautas de este organismo, ha emitido la Orden Ministerial, AAA/642/2013, por la que se regula la pesquería de atún rojo en el Atlántico Oriental y el Mediterráneo en España. Las metodologías usadas en la identificación se centran, en su mayoría, en el estudio del ADN mitocondrial procedente de las muestras de estos individuos. Estas técnicas son precisas y robustas y pueden ser empleadas tanto en pescados frescos como congelados así como en los enlatados. En el Departamento de Identificación Genética del Laboratorio Central de Veterinaria de Algete (Laboratorio de Genética Molecular) se han puesto a punto varias de estas técnicas , más concretamente a través de las posiciones diagnosticas (Viñas et al, PLoS One. 2009 Oct 27, Pardo et al , Food Chemistry ,86,(2004) y Bottero et al, J Biotechnol. 2007 May 1) y del FINS (Secuenciación nucleótidica con información forenese) (Chow et al,Journal of Fish Biology(2006)68), logrando diferenciar correctamente las 8 especies de la que consta este género. En el presente estudio, se muestran los resultados de estas técnicas y su optimización con muestras de campo.

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P‐21 IDENTIFICACIÓN Y PREVALENCIA DE BETALACTAMASAS PRODUCTORAS DE RESISTENCIAS A CEFALOSPORINAS DE TERCERA GENERACIÓN EN CEPAS DE SALMONELLA DE PROCEDENCIA ANIMAL AISLADAS EN ESPAÑA DE 2007 A

2012.

De Frutos, C.1, Buitrago, MD. 2, Serrano, T. 2, de Caso, M. 2, Chico, I. 2, Sánchez, M. 1, Jiménez, C. 2 y Agüero, M.1

1 Laboratorio Central de Veterinaria. Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio

Ambiente 2 Tecnologías y Servicios Agrarios SA.

Las cefalosporinas de tercera generación son antibióticos de elección en el tratamiento de ciertas salmonelosis. La resistencia a estas cefalosporinas se debe normalmente a la producción de betalactamasas de espectro extendido (BLEE) y AmpC. Este trabajo pretende dar una visión de las betalactamasas productoras de resistencias a cefalosporinas de tercera generación identificadas en cepas de Salmonella de origen animal durante 2007 a 2012. Se investigaron 2490 cepas de Salmonella de gallinas reproductoras, gallinas ponedoras, pollos de carne, pavos y porcino de reproducción, determinándose las concentraciones mínimas inhibitorias (CMI) frente a un total de 10/14 antimicrobianos por el método de microdilución en caldo semiautomatizado (ISO 20776‐1:2006). Se seleccionaron 48 cepas (1,9%) con resistencia a Cefotaxima (CMI >0,5 mg/L) y/o Ceftazidima (CMI > 2 mg/L) pertenecientes a 14 serovares. No se identificaron cepas con resistencia a Cefotaxima ni Ceftazidima en gallinas reproductoras y ponedoras. Las cepas de los serovares más frecuentes se caracterizaron por PFGE. La presencia de los genes codificantes de BLEE y AmpC, en las cepas seleccionadas, se confirmó mediante PCR y posterior secuenciación de los productos amplificados. Se investigaron los genes codificantes de 7 familias de BLEE y AmpC (blaTEM, blaSHV, blaCTX‐M, blaCMY, blaDHA, blaACC, blaOXA). Se identificaron las secuencias de 7 betalactamasas (CTX‐M‐1, CTX‐M‐9, CTX‐M‐14, TEM‐1, SHV‐12, OXA‐1 y CMY‐2), encontrándose la mayor prevalencia en pollos de carne, seguidos de porcino de reproducción y pavos. Las familias de betalactamasas detectadas con más frecuencia fueron CTX‐M y SHV. blaCMY‐2 fue el único gen AmpC identificado. De acuerdo a estos resultados, la prevalencia de la resistencia a cefalosporinas de tercera generación en cepas de Salmonella de origen aviar y porcino no es elevada, pero se han encontrado un buen número de familias de betalactamasas distribuidas en diversos serovares y pulsotipos de Salmonella, por lo que es esencial continuar con la vigilancia por el riesgo emergente que suponen para la salud pública.

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P‐22

NUEVO SISTEMA DE EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS MICOBACTERIANAS MARCADAS CON INTEINA EN MYCOBACTERIUM

SMEGMATIS.

González, N, Sánchez, I, Lázaro, B, Bastida, F

Vacunek, S.L.

Aunque se usa E. coli para la expresión de proteínas de Mycobacterium paratuberculosis (MAP), éstas tienen tamaños diferentes a los antígenos nativos micobacterianos, lo que sugiere que existen diferencias en la transcripción y traducción entre ambos microorganismos. Una consecuencia inmunológica es que proteínas recombinantes expresadas por E. coli pueden no ser reconocidas igual que los antígenos nativos. Por tanto, Mycobacterium smegmatis, micobacteria no patógena y de rápido crecimiento, se utiliza a menudo como un huésped alternativo, ya que, además, proporciona chaperonas específicas de micobacterias que ayudan al plegamiento correcto de las proteínas de MAP. Existen muchos vectores de expresión para micobacterias pero la mayoría llevan una cola de histidinas para facilitar la purificación de la proteína en cuestión. Vacunek ha desarrollado un nuevo plásmido de expresión micobacteriano que permite la purificación de la proteína diana sin aminoácidos extras. El nuevo vector se replica extracromosomalmente tanto en E. coli como en micobacterias, utiliza el promotor inducible de la acetamidasa de M. smegmatis. La proteína diana está fusionada por su c‐terminus a una marca de inteina autoescindible que contiene además un dominio de unión a quitina permitiendo, por afinidad, la purificación del precursor en una columna de quitina. Se han conseguido producir ya, mediante este sistema, varios antígenos citoplasmáticos y de membrana de MAP, observando diferencias en la cantidad de antígeno expresado en función del antígeno concreto y del tiempo de inducción con acetamida. Se han estudiado tiempos de inducción que van desde 3h. a 8h. consiguiendo un aumento en el nivel de expresión. Este método de expresión y purificación puede favorecer la labor de encontrar antígenos adecuados tanto para su uso en el diagnóstico de la enfermedad, como para el desarrollo de prototipos de vacunas en subunidades.

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P‐23

ENFERMEDADES DE LOS CRUSTÁCEOS. DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO

Gonzalo, I. 1, Rocha, A. 2, Chico, I. 2, Fernandez‐Somalo, P. 1, Vigo, M. 1, Agüero, M. 1

1 Centro Nacional de Referencia para los Crustáceos. Laboratorio Central de Veterinaria.

Algete. Madrid. Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente (MAGRAMA).


Debido al incremento que el sector de la acuicultura ha experimentado en los últimos años, tanto en su producción como en su comercialización, la Unión Europea aprobó la Directiva 2006/88/CE relativa a los “requisitos zoosanitarios de los animales y de los productos de la acuicultura, y a la prevención y el control de determinadas enfermedades de los animales acuáticos” dentro del marco de la Organización Mundial de la Sanidad Animal (OIE). En el anexo IV (Parte II) aparecen reflejadas las enfermedades de crustáceos y las especies sensibles a esas enfermedades susceptibles de ser evaluados para garantizar un estado sanitario satisfactorio. Tras estas premisas, El Laboratorio Central de Veterinaria (LCV) fue designado como laboratorio Nacional de Referencia para las enfermedades que afectan a los crustáceos RD 1614/2008 de 3 de octubre de 2008. Desde entonces el LCV asiste a las reuniones anuales y participa en los ensayos de aptitud realizados por el Laboratorio Comunitario de Referencia (CEFAS. Weymouth. Reino Unido) para la enfermedad de la mancha blanca. En el LCV se han optimizado los protocolos y técnicas diagnósticas histológicas y moleculares para las tres enfermedades de crustáceos enumeradas en la directiva europea: el Síndrome de Taura, la enfermedad de la cabeza amarilla (enfermedades exóticas), y la enfermedad de la mancha blanca (enfermedad no exótica). Actualmente en el LCV están disponibles los procedimientos diagnósticos recomendados por el CEFAS y la OIE para estas tres enfermedades y están en proceso de optimización las técnicas diagnósticas moleculares para la plaga del cangrejo (Aphanomyces astaci) enumerada en la lista de la OIE.

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P‐24 DESARROLLO DE DOS PROTOCOLOS DE EXTRACCIÓN SEMI‐AUTOMÁTICOS PARA PATÓGENOS DE MAMITIS POR PCR REAL TIME (PATHOPROOF PCR

ASSAYS) EN LECHE BOVINA

Lázaro, B. 1, Rämä, P. 2, Liikanen, M. 2, Silvennoinen, M. 2 y Holopainen, J. 2

1 Vacunek S.L., Derio, Spain; 2 Thermo Fisher Scientific Oy, Vantaa, Finland

El ensayo Mastitis Thermo Scientific™ PathoProof es un sistema rápido y preciso para

la identificación de patógenos de mastitis de leche bovina fresca ó preservada sin previo enriquecimiento bacteriano o cultivo. El análisis comprende la extracción de ADN a partir de muestras de leche, la detección mediante qPCR de hasta 16 patógenos causantes de mastitis, y el análisis de los resultados. Para ello, este ensayo incluye: 1) reactivos químicos, 2) equipo de PCR tiempo real, y 3) software para la interpretación automatizada de los resultados. Los kits de extracción de ADN Thermo Scientific™PathoProof KingFisher Flex y KingFisher Duo proporcionan un protocolo semi‐automático, agilizando de forma significativa el proceso de extracción, sobre todo, en laboratorios que trabajan con un gran volumen de muestras, hecho que se traduciría en ahorro final en el ensayo. Además, las diferencias en la amplificación del control interno (0%‐2% muestras con IAC inhibido) sugieren que el método, en comparación con el método de extracción manual de ADN (PathoProof), reducen con mayor eficiencia la presencia de inhibidores en las muestras de ADN, que por otro lado, mantendrían valores estadísticamente similares de sensibilidad y repetibilidad. La diferencia media entre los resultados obtenidos con PathoProof KingFisher Duo y el kit de extracción manual o PathoProof KingFisher Flex es muy cercana a cero en todas las comparaciones, variando entre ‐0,54 y 0,23. El intervalo de confianza del 95% para la diferencia media varió de ‐0,79 a 0,49, lo que indica que la mayoría de las diferencias fueron pequeñas. Los coeficientes de correlación de Pearson identificaron una fuerte correlación en los resultados. El equipo KingFisher Flex puede procesar hasta 96 muestras en una sola carrera. Por otro lado, la versión más reciente de este equipo, KingFisher Duo, procesa hasta 24 muestras en tandas de 12. En ambos casos se utilizan varillas magnéticas para transferir las partículas a través de varias etapas de purificación. La automatización junto con la tecnología de partículas magnéticas combina eficiencia y velocidad resultando en una alta capacidad de purificación de calidad.

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P‐25

FILOVI: LA HERRAMIENTA DE GESTIÓN PARA ANÁLISIS DE CONTROL GENEALÓGICO E IDENTIFICACIÓN ANIMAL DEL MAGRAMA

Lozano, J.M.2; Ossorio, B.2, Bouzada, J.A.1; Maya, M.R.2; Bonet, I.2; Trigo, A.2;

Castillo, F.2; Fernández‐León, J.2; Gómez‐Tejedor, C.1, Mayoral, T.1 y Anadón, E.1

1 Laboratorio de Genética Molecular. Laboratorio Central de Veterinaria. Ministerio de

Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente 2 Tecnologías y Servicios Agrarios SA.

El Laboratorio Central de Veterinaria (LCV) dependiente del Ministerio de Agricultura,

Alimentación y Medio Ambiente (MAGRAMA), junto con la Subdirección General de Sistemas Informáticos y Comunicaciones del mismo, ha desarrollado una herramienta informática que permite la gestión global de la información relacionada con los análisis de identificación genética y el control genealógico en animales de explotación ganadera que se realizan en los Departamentos de Identificación y Gestión de Recursos Zoogenéticos del Laboratorio de Genética Molecular del LCV. La información requerida para los estudios de filiación procede, por un lado de las Asociaciones de Criadores de animales de razas puras, encargadas de la toma de muestras y el envío de la información asociada a ellas y, por otro, el resultado de los análisis de marcadores genéticos de ADN de dichas muestras que será incorporada en el laboratorio.

El software de la aplicación de filiaciones, se ubica en el ordenador central del MAGRAMA y está disponible en la página principal del Ministerio pudiendo acceder a ella mediante certificado digital o, previa autorización como usuario, con nombre de usuario y contraseña. Hay establecidos distintos perfiles de usuarios, de manera que la aplicación gestiona desde el envío telemático de la información relacionada con los animales y el tipo de análisis que deben ser realizados, hasta el seguimiento de las muestras a través de todo el proceso de análisis en el laboratorio, el estudio de la resultados obtenidos en el laboratorio y permite la comunicación del dictamen final a la Asociación correspondiente. Dispone además de un sistema de alertas generadas una vez realizados los análisis, que ayudan a detectar errores que se puedan cometer en la toma e identificación de las muestras o en el mismo proceso de análisis.

La utilización de esta aplicación informática permite que el trabajo que realizan los técnicos en el campo, así como el del laboratorio, estén coordinados con un alto nivel de informatización y automatización, lo que garantiza una total trazabilidad a lo largo de todo el proceso desde la toma de muestra y recogida de información en las explotaciones, hasta la comunicación de resultados a las Asociaciones, controlando los puntos críticos del sistema.

Palabras clave: aplicación informática, control genealógico, identificación genética, trazabilidad

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P‐26

VERIFICACIÓN DE FILIACIÓN, DE IDENTIDAD Y DE SEXO EN EQUINOS MEDIANTE SECUENCIAS MICROSATÉLITES DE ADN

Maya, M.R.2, Bouzada, J.A.1, Lozano, J.M.2, Ossorio, B.2, Trigo, A. 2, Bonet, I.2, Castillo, F.2, Fernández‐León, J. 2 , De la Cruz, V.2, Gómez‐Tejedor, C.1, Mayoral,

T.1 y Anadón, E.1

1Dpto. Identificación Genética. Laboratorio de Genética Molecular. Laboratorio Central

de Veterinaria. MAGRAMA. 2 Tecnologías y Servicios Agrarios, S.A.

El Real Decreto 2129/2008, de 26 de diciembre designa al Laboratorio Central de

Veterinaria del Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente, como Centro de Referencia de Genética Animal para la homologación de técnicas de análisis de marcadores genéticos para la identificación y control de filiación en animales de explotación ganadera. Para llevar a cabo esta tarea en el caso de los equinos, se ha desarrollado un protocolo de trabajo que cubre todas las etapas desde la extracción de las muestras de material biológico en el campo hasta el envío y recepción de los resultados por parte de las asociaciones de ganaderos.

El análisis al que se someten las muestras que llegan al laboratorio, incluye un panel principal, compuesto por 19 marcadores microsatélites, en donde están incluidos los 12 marcadores recomendados por la ISAG y la secuencia AME (AHT4, AHT5, AME, ASB2, ASB17, ASB23, CA425, HMS1, HMS2, HMS3, HMS6, HMS7, HTG4, HTG6, HTG7, HTG10, LEX3, LEX27, LEX33 y VHL20 ). Este panel se analiza mediante una única reacción múltiplex de PCR. Como aconseja la ISAG, para casos dudosos y que necesitan una mayor capacidad de exclusión, se han diseñado 2 paneles secundarios adicionales, compuestos de 22 marcadores (AHT29, AHT39, HMS8, LEX22, LEX27, TKY19, TKY279, TKY287, TKY294, TKY297, TKY301, TKY312, TKY321, TKY325, TKY333, TKY337, TKY341, TKY343, TKY344, TKY374, TKY394 y UCDEQ405 ) y de 10 marcadores (HMS05, HMS18, HMS20, HTG03, HTG15, LEX24, LEX28, TKY598, UM010 y UM011 ). Además, para resolver incongruencias entre el sexo declarado por el ganadero y el que se obtiene en los marcadores situados en los cromosomas sexuales del panel principal (AME, LEX03 y LEX27), se ha establecido otro panel con 4 marcadores adicionales (AME, LEX3, LEX22, LEX24, LEX27, LEX28 y TKY598) situados en el cromosoma X que confirmarán el sexo del animal. En otros casos se demuestra que estas incongruencias son debidas a alteraciones en el número de cromosomas sexuales.

Los marcadores analizados en estos paneles de marcadores aportan una capacidad de exclusión de relaciones de parentesco mal asignadas del 99,999953% en el panel principal y 99,999998% en el panel secundario. La probabilidad de exclusión conjunta de los dos paneles es del 99,9999999999991%.

Palabras clave: microsatélites, control genealógico, control de identidad, ISAG

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P‐27 ACTIVIDADES DE DIAGNÓSTICO REALIZADAS EN EL LCV EN EL ÁMBITO DEL. PROGRAMA DE VIGILANCIA DE LAS ENFERMEDADES DE LAS ABEJAS 2012‐

2013

Fernandez‐Somalo, P. 1; San Miguel, E.1; Frías N. 3, Cobo, I. P. 2, Vigo, M. 4, López, I. 3 y Rodríguez, A. 3 y Agüero, M. 1

1Laboratorio Central de Veterinaria de Algete. (MAGRAMA)

2Subdirección General de Sanidad e Higiene Animal y Trazabilidad (MAGRAMA) 3Tecnologías y Servicios Agrarios S.A.

4 Dirección General de Agricultura y Ganadería. Consejería de Agricultura. Junta de Comunidades de Castilla La Mancha

El Programa de vigilancia de las enfermedades de las abejas llevado a cabo en España

forma parte de un Programa de vigilancia piloto estandarizado a nivel de la Unión Europea cuyo objetivo es estimar de forma apropiada la pérdida de colonias de abejas, en el que han participado 17 estados miembros. . Por su importancia se han considerado los siguientes patógenos: Varroa destructor, virus de la parálisis aguda (ABPV), virus de las alas deformadas (DWV), Virus de la parálisis crónica (CBPV), Nosema apis, Nosema ceranae, Paenibacillus larvae (agente causal de la Loque americana), Melisscoccus plutonius (agente causal de la Loque europea), Aethina tumida y Tropilaelaps spp, Para llevar a cabo este trabajo se han seleccionado 203 colmenares al azar distribuidos por todo el territorio español que han sido inspeccionados a lo largo de tres visitas por inspectores apícolas. La primera visita tuvo lugar durante el otoño de 2012 teniendo como objetivo principal la valoración de las condiciones iniciales de las colmenas y la toma de muestras sistemáticas de todas las colmenas seleccionadas para el estudio de Varroa destructor y los virus ABPV y DWV; en España, además, se ha analizado y tipado la presencia de N. apis y N. ceranae. La segunda visita de inspección se llevó a cabo en primavera de 2013, en ella se valoró el grado de mortalidad invernal y la tercera visita tuvo lugar a comienzos del verano de 2013 con el fin de evaluar el grado de mortalidad durante el periodo de máxima actividad de pecoreo. En las tres visitas se recogieron además muestras de las colmenas con síntomas. En el Laboratorio Central de Veterinaria (LCV), que actúa como Laboratorio Nacional de Referencia para la salud de las abejas, se han llevado a cabo todos los análisis de las muestras sistemáticas para la detección de ABPV, DWV, N. apis y N. ceranae, así como los análisis de todas las muestras sintomáticas recogidas durante las tres visitas del Programa. Se presenta un resumen de las actividades de diagnóstico para la detección de los agentes estudiados; los métodos empleados fueron los recomendados por el Laboratorio de Referencia de la Unión Europea para la Salud de las Abejas, el Manual de Animales Terrestres de la Organización Mundial de Salud Animal (OIE) y la bibliografía científica.

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P‐28

DIAGNÓSTICO DE UN CASO DE PARASITACIÓN MIXTA POR PIOJOS (PHTHIRAPTERA) MASTICADORES (MALLOPHAGA: TRICHODECTIDAE) Y CHUPADORES (ANOPLURA: LINOGNATHIDAE, HAEMATOPINIDAE) EN

GANADO BOVINO CRIADO EN EXTENSIVIDAD.

Sánchez‐Murillo, J.M.1, Calero‐Bernal, R. 2 y Alarcón‐Elbal, P.M. 3

1 Academia de Ciencias Veterinarias de Extremadura. [email protected] 2 Área de Parasitología. Departamento de Sanidad Animal. Facultad de Veterinaria.

Avda. de la Universidad s/n. C.P. 10071. Cáceres. 3 Departamento de Patología Animal, Unidad de Parasitología y Enfermedades

Parasitarias. Facultad de Veterinaria. Universidad de Zaragoza. España. C/ Miguel Servet 177 ‐ 50013 Zaragoza.

Se describe un caso de parasitación mixta por piojos (Phthiraptera) masticadores

(Mallophaga: Trichodectidae) y chupadores (Anoplura: Linognathidae, Haematopinidae) en ganado vacuno de la comarca de Jerez de los Caballeros en la provincia de Badajoz. Se trata de una explotación con un total de 60 animales adultos pertenecientes a la raza retinta y explotados en extensividad en una finca adehesada con arbolado de encinas (Quercus ilex). En el momento de la visita a la explotación los animales presentan intenso prurito que intentan mitigar frotándose sobre la superficie de árboles y paredes. Se observa la presencia de zonas cutáneas alopécicas fundamentalmente en dorso, cuello, abdomen, rabo, patas y cara, así como anorexia, mala condición corporal y estrés. Para la investigación de la posible presencia de ectoparásitos se toman 4 muestras de raspado cutáneo correspondientes a 4 animales distintos, las cuales se envían para su estudio al laboratorio donde son procesadas. Todas las muestras obtuvieron resultado positivo, identificando mediante las claves de Fiel et al. (2011) y Martín Mateo (1977) tres especies de piojos: Bovicola bovis (Linnaeus,1758), Haematopinus eurysternus (Nitzsch, 1818)) y Linognathus vituli (Linnaeus, 1758).

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PREVALENCIA Y CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE Giardia duodenalis EN BOVINOS ADULTOS DEL NOROESTE DE LA PROVINCIA DE ÁLAVA, PAÍS VASCO

Cardona, G.A.; Bailo, B.; Saugar, J.M.; Fuentes, I.; Marín, C. y Carmena, D.

Centro Nacional de Microbiología

Giardia duodenalis es un protozoo enteroparásito que causa diarrea en bovinos. La

infección afecta predominantemente a individuos jóvenes primoinfectados, causando retraso en el crecimiento y substanciales pérdidas económicas derivadas de la consiguiente disminución de productividad. Los animales adultos, aunque normalmente presentan tasas de prevalencia y cargas parasitarias menores que los jóvenes, pueden actuar como reservorios de enfermedad y contribuir tanto a la infección de otros animales como a la contaminación del medio ambiente (pasto y aguas superficiales) con quistes del parásito. En esta comunicación presentamos datos epidemiológicos y moleculares sobre la infección por G. duodenalis en bovinos adultos del noroeste de la provincia de Álava (País Vasco). La prevalencia del parásito fue estimada mediante RT‐PCR para amplificar ADN parasitario a partir de muestras de heces. Entre Noviembre de 2011 y Diciembre de 2012 se obtuvieron un total de 363 muestras de heces procedentes de 4 explotaciones ganaderas. G. duodenalis fue identificada en el 18,7% de las muestras analizadas. En todas las explotaciones ganaderas visitadas se registraron casos positivos de giardiasis bovina (rango 4,4‐37,9%). Las muestras positivas por RT‐PCR fueron molecularmente caracterizadas usando una semi‐nested PCR para amplificar el gen de la glutamato dehidrogenasa (gdh). Los productos de amplificación obtenidos fueron posteriormente digeridos con NlaIV para determinar el perfil de los polimorfismos de los fragmentos de restricción (RFLP). Estos resultados fueron confirmados mediante secuenciación. Hasta el momento se han caracterizado satisfactoriamente un total de 12 aislados de Giardia, pertenecientes todos ellos al Assemblage E (G. bovis). Nuestros resultados indican que Giardia duodenalis es causa frecuente de infección en la población de bovinos estudiada, siendo el Assemblage E el genotipo de Giardia más frecuentemente hallado en animales adultos. El hecho de que este genotipo es poco infectivo para el hombre sugiere que el ganado vacuno adulto desempeña un papel marginal como reservorio de enfermedad zoonótica. Estudios similares son requeridos para determinar la frecuencia de genotipos de Giardia actualmente circulando en terneros de la provincia de Álava.

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P‐30 PARASITACIÓN POR EL PLEROCERCOIDE LIGULA INTESTINALIS (LINNAEUS, 1758) (CESTODA: PSEUDOPHYLLIDEA) EN ALBURNO, ALBURNUS ALBURNUS (LINNAEUS, 1758) CAPTURADO EN EL RÍO ALBARRAGENA DE LA PROVINCIA

DE BADAJOZ, SO ESPAÑA.

Sánchez‐Murillo, J.M.1 y Alarcón‐Elbal, P.M.2

1 Academia de Ciencias Veterinarias de Extremadura. Badajoz. 2 Departamento de Patología Animal, Facultad de Veterinaria. Universidad de Zaragoza.

La gran mayoría de los cestodos de los peces tienen ciclo indirecto, necesitando uno o dos hospedadores intermediarios, siendo además frecuente la utilización de hospedadores paraténicos. Los parásitos no ocasionan, por lo general, grandes mortandades en peces de aguas naturales. Sin embargo, son causa de estrés que los hacen susceptibles del padecimiento de infecciones secundarias. En el caso de Ligula intestinalis, la inducción de modificaciones del comportamiento del pez infectado, provoca que éste se torne más vulnerable a la predación por parte de las aves. El alburno es un pequeño ciprínido considerado como especie exótica invasora y así queda recogido en el Real Decreto 630/2013. En España fue capturado por primera vez en 1992 en el río Noguera Ribagorzana, en la cuenca del Ebro, ocupando en la actualidad numerosas localidades en las cuencas del Ebro y ríos levantinos. Se describe la parasitación por el plerocercoide de L. intestinalis de un ejemplar de alburno capturado en la Rivera de Albarragena en el término municipal de Alburquerque en la provincia de Badajoz.

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P‐31 VALORACIÓN DE LA PRESENCIA DE ANTICUERPOS FRENTE AL VIRUS DEL NILO OCCIDENTAL EN CABALLOS DE DEPORTE DE LA COMUNIDAD DE MADRID

Sánchez‐Rodríguez, A.; Cruz López, F. y Forés Jackson, P.

Dpto. de Medicina y Cirugía Animal. Facultad de Veterinaria. Universidad Complutense

de Madrid. 28040 Madrid

La fiebre del Nilo Occidental (FNO) es una enfermedad vírica transmitida por vector incluida en la lista única de enfermedades de declaración obligatoria de la OIE. Su ciclo natural se produce entre aves no domésticas y mosquitos, principalmente del género Culex. Accidentalmente, humanos y équidos pueden actuar como hospedadores finales por la picadura del vector. El carácter zoonótico del virus, su rápida propagación internacional y las repercusiones económicas de un brote hacen que sea de elevada trascendencia en el sector equino. La presencia de anticuerpos en équidos se ha evaluado en zonas de circulación del virus, como es Andalucía. Sin embargo, en zonas de bajo riesgo de asentamiento del ciclo hay escasos estudios serológicos en caballos. Por ello, los objetivos de este estudio fueron valorar la presencia de anticuerpos frente al virus de la FNO en caballos de deporte residentes en la Comunidad de Madrid, donde no hay evidencias de presencia del virus, y evaluar la necesidad de vacunar a los caballos en Madrid. Se recogieron 113 muestras de suero de caballos vacunados y no vacunados con la vacuna inactivada frente a la FNO, con y sin historia de haber viajado a Andalucía y fueron analizados mediante un kit ELISA (IdScreen® WN Competition Multispecies). Los resultados mostraron alta persistencia de anticuerpos vacunales, con presencia homogénea de éstos en el 91,7% de caballos de deporte vacunados el año anterior a la toma de muestras. Por otra parte, el 9% de animales no vacunados que no viajaron a Andalucía resultaron positivos, lo cual podría indicar una cierta circulación del virus en la Comunidad de Madrid. Por último, el 13,3% de caballos no vacunados que viajaron a Andalucía fueron seropositivos, indicando un contacto con el virus en esta zona de riesgo. A pesar de que estos resultados son preliminares y deben ser confirmados mediante seroneutralización, este estudio justificaría el uso de la vacuna en caballos de deporte residentes en la Comunidad de Madrid.

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P‐32 ESTUDIO LONGITUDINAL DE LA CALCEMIA, FOSFATEMIA Y MAGNESEMIA EN

YEGUAS PURA RAZA ESPAÑOLA CÍLICAS DURANTE EL CICLO ESTRAL

Satué Ambrojo, K.1, Calvo Capilla, A.2, Gardon Poggi, J.C.2

1Departamento de Medicina y Cirugía Animal. Universidad CEU‐Cardenal Herrera

(Valencia) 2 Departamento de Ciencias Aplicadas y Tecnológicas, Universidad Católica de Valencia

“San Vicente Mártir”, Valencia, España.

Algunas investigaciones realizadas en la mujer han documentado incremento de la calcemia y la magnesemia durante la fase folicular, atribuyéndose dicha elevación al efecto de los estrógenos sobre la glándula paratiroides (Pandya y cols., 1995; Lanje y cols., 2010). El objetivo del presente estudio ha sido analizar las concentraciones de calcio (Ca), fósforo (P), magnesio (Mg) y estradiol (E2) durante la fase folicular (FF) para posteriormente compararlos con los obtenidos en la fase luteínica (FL). Se extrajeron muestras de sangre venosa a 20 yeguas PRE con edades comprendidas entre 5 y 15 años. Las concentraciones plasmáticas de Ca, P y Mg fueron analizadas mediante espectrofotometría (Metrolab 2300 Plus V3®), utilizando reactivos de RAL® y los niveles séricos de E2 se cuantificaron mediante un método enzimático quimioluminiscente competitivo en fase sólida (Immulite 1000, Siemens). El análisis de variación no mostró diferencias estadísticamente significativas en las concentraciones de Ca (FF: 11,38±0,64; FL: 10,76±1,09 mg/dl), P (FF: 3,04±0,54; FL: 3,46±0,72 mg / dl) y Mg (FF: 2,99±0,59; FL: 2,61±0,39 mg/dl) entre ambas fases, siendo las concentraciones de E2 significativamente superiores durante la FF (37,59±0,80 pg/ml) respecto a la FL (31,30±0,09 pg/ml) (p< 0,05). La ausencia de modificaciones en la calcemia, fosfatemia y magnesemia respecto a las fases del ciclo estral en la yegua PRE limita la importancia de los estrógenos en el metabolismo fosfocálcico durante este periodo.

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P‐33

NUEVA HERRAMIENTA DE CONTROL DE TUBERCULOSIS BOVINA

Linscott, R., Martel, E., Lawrence J., Egli C. & Salido, J.I.

IDEXX

Introduction: The IDEXX M. bovis antibody test kit is an ELISA designed to detect the presence of antibody to M. bovis in bovine serum and plasma samples. This test could improve bovine tuberculosis (bTB) detection of tuberculosis (TB)‐infected animals in TB‐infected herds or could be an easy, cost effective surveillance tool in TB‐negative regions. The M. bovis ELISA test is validated and certified by the OIE as fit for the purposes defined in the kit insert. Also, USDA license has been obtained in September 2012, and various European countries are looking into registration of the test. Material and Methods Characterized serum and plasma samples were obtained from worldwide sources and were used to validate the M. bovis ELISA. Two temporal series were produced from animals exposed to M. bovis and followed over time. Positive samples from 3 different countries were obtained from either culture positive animals (n = 307). Sample sets (n = 100) with varying skin or 5‐interferon results were evaluated to demonstrate subsets of positive animals within TB‐infected herds (n = 45) and the power of combining tests to increase overall sensitivity. Negative samples (n = 1473) were obtained from 4 different countries with samples originating from negative herds, states or regions. In addition, to understand potential cross‐reactivity with other Mycobacteria, samples were obtained from animals exposed to large doses of M. paratuberculosis, M. avium and M. kansasii or from a herd with high Johne’s antibody levels. All samples were evaluated on an M. bovis antibody kit manufactured at production scale, according to the standard kit protocol. Samples with S/P ratios of ; 0.30 were considered positive for M. bovis antibodies. Results Data from the M. bovis temporal series revealed that animals can develop antibody titers within weeks of exposure and that an antibody response can be boosted after the application of a skin test. The M. bovis antibody ELISA detected 197/307 samples from culture positive animals resulting in a sensitivity of 64.2%. Using a single test method, between 71.1% and 75.6% of herds would have been detected. Combining tests resulted in an increase in herd sensitivity to between 86.7% (5‐Interferon and ELISA) and 97.8% (5‐Interferon, SICCT and ELISA). On negative sample sets, the M. bovis ELISA demonstrated a specificity of 98% with no cross reactivity observed on M. paratuberculosis (both experimental and field infected) or M. avium samples. Transient, low level reactivity was observed with animals inoculated with large doses of M. kansasii. Discussion & Conclusion The strategic supplemental use of the IDEXX M. bovis antibody test represents a fast, easy, objective and cost effective option for use in bTB programs and can increase overall diagnostic power by detecting subsets of infected animals missed by current methods. This test's high specificity allows for an application of this test in bTB‐negative regions.

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P‐34

ESTUDIO DE LOS POLIMORFISMOS LEU‐154 Y LYS‐171 DEL GEN PRNP EN RAZAS DE OVINO ESPAÑOLAS

López‐Maroto,C.2 ; Martínez, M.J.1; Hurtado,D.2; García‐Curbelo,E.2 ,

Moraga,L.2; De la Cruz,V.2; Velasco,E.2; Bonet,I.2; Anadón,E.1 y Mayoral, T.1 1 Laboratorio de Genética Molecular. Laboratorio Central de Veterinaria. Ministerio de

Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente 2 Tecnologías y Servicios Agrarios SA.

La enfermedad de la tembladera o Scrapie en ovino, muestra una clara dependencia

de los polimorfismo presentes en el gen prnp que codifica para la proteína del prion. Los polimorfismos conocidos están presentes en diferentes codones, siendo los más importantes los presentes en el 136 (A/V), 154 (R/H) y 171 (R/Q/H). La asociación entre susceptibilidad a la enfermedad y estas mutaciones, es la base de los programas de selección de ovino llevados a cabo en la UE. De acuerdo con el Reglamento (CE) 999/2001 y posteriores modificaciones, en España se estableció un programa de selección coordinado por el Ministerio de Agricultura, alimentación y medio ambiente del cual el LCV es Laboratorio Nacional de Referencia. Despues del análisis de más de 3.500.000 animales de 52 razas puras utilizando la tecnología de minisecuenciación, se han detectado otros polimorfismos como el Leu154 y Lys171. El Alelo ALQ se ha encontrado en 527 animales de 19 razas puras de ovino, mientras que el ARK ha sido detectado en 41784 ovinos de 27 razas diferentes. La distribución de ambos alelos no es uniforme entre estas. En el presente trabajo, se muestra la distribución de genotipos relacionados con los polimorfimos Leu154 y Lys171 y su comparación con los encontrados de forma común en el gen prnp. Asimismo se presenta la relación que existe entre los alelos no comunes encontrados ALQ y ARK en grupos de raza en base a su consideración como raza autóctona de fomento, autóctona en peligro de extinción, integrada en España, de la unión europea o de terceros países.

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P‐35

INTERRELACIONES ENTRE LAS CONCENTRACIONES DE COLESTEROL, ESTRADIOL Y PROGESTERONA EN YEGUAS PURA RAZA ESPAÑOLA DURANTE

EL CICLO ESTRAL

Satué Ambrojo, K.1, Calvo Capilla, A.2, Gardon Poggi. J.C.2

1Departamento de Medicina y Cirugía Animal. Universidad CEU‐Cardenal Herrera

(Valencia) 2 Departamento de Ciencias Aplicadas y Tecnológicas, Universidad Católica de Valencia

“San Vicente Mártir”, Valencia, España.

Algunos estudios han descrito una elevación de colesterol (CHOL) sanguíneo a lo largo de ambas fases, folicular y luteínica, de forma simultánea a los picos hormonales de estrógenos y progesterona, respectivamente (Highshoe y cols., 1991; Kedzierski y Krawczyck, 2006). Dicho incremento de CHOL es necesario para la síntesis y ejerce un efecto estimulatorio directo sobre las células de granulosa para iniciar la esteroidogénesis. El objetivo del presente estudio ha sido

analizar la relación existente entre las concentraciones de CHOL, estradiol 17 (E2) durante la fase folicular (FF) y la progesterona (P4) durante la fase luteínica (FL). Se extrajeron muestras de sangre venosa a 20 yeguas PRE con edades comprendidas entre 5 y 15 años. Las concentraciones plasmáticas de CHOL fueron analizadas mediante espectrofotometría (Metrolab 2300 Plus V3®), utilizando reactivos de RAL®, los niveles séricos de E2 se cuantificaron mediante un método enzimático quimioluminiscente competitivo en fase sólida (Immulite 1000, Siemens) y la P4 mediante un método inmunoenzimático de competición (EIA). El análisis de variación no mostró diferencias estadísticamente significativas en las concentraciones de CHOL entre ambas fases (FF: 96,16±25,68; FL: 88,94±18,33 mg/dl). Las correlaciones entre CHOL y E2 y CHOL y P4 fueron de r=0,53 y r=‐0,13, respectivamente. Aunque la colesterolemia no se modifica durante el ciclo estral, los estrógenos sintetizados durante la fase folicular parecen ejercer una influencia más notable sobre el metabolismo de este lípido que la progesterona durante la fase luteínica.

116

P‐36

ADAPTACIÓN Y VERIFICACIÓN DE LA IDENTIFICACIÓN DE ADN DE EQUINO POR PCR EN TIEMPO REAL EN DIFERENTES MATRICES

Pérez‐Barbachano, M.V.1, Estévez, M.2, Velasco, E.2, Mayoral, T.1

y Anadón, E.1

1 Laboratorio de Genética Molecular. Laboratorio Central de Veterinaria. Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente


La identificación de especies, se hace cada día más necesaria, especialmente para el control de fraude en productos de origen animal. En Enero del 2013 se describió la presencia de ADN de caballo en alimentos preparados a base de carne en Irlanda. La ausencia de identificación de este ingrediente generó en la Union Europea una crisis con dos frentes abiertos, el primero la alarma social creada en paises donde la carne de caballo no es considerada culturalmente un alimento y en segundo lugar un problema de salud publica debido a la posible presencia del antiinflamatorio Fenilbutazona en la cadena alimentaria. Con el fin de disponer de una acción coordinada para la detección de ADN de equinos en alimentos, la UE estableció un programa de control en muestras y un protocolo común (del EURL para la detección de proteínas animales en piensos) para PCR en tiempo real. En el presente trabajo se describe la adaptación de dicha PCR realizada en el Laboratorio Central de Veterinaria y estandarización para poder procesar un mayor número de muestras en menor tiempo manteniendo las exigencias de calidad del ADN extraído. Se ha estudiado, el comportamiento del método en distintas matrices, análogas a mezclas comerciales de carne con bovino, porcino, pollo y pavo, así como a muestras de alimentos preparados. De esta forma se ha ampliado la verificación del método a muestras reales de campo con respecto al método de la UE realizado únicamente con carne de bovino. El ensayo de inhibición para todas estas especies y muestras ha reportado resultados en la pendiente de las rectas de inhibición constantes entre ‐3.1 y ‐3.6 lo que demuestra la correcta eficiencia de la PCR y demostrando la ausencia de inhibición en el ensayo. Los resultados han permitido obtener un límite de detección de la PCR del 0.01% para carne de caballo en bovino, porcino, pollo y pavo con un límite de detección de 0.01%, así como los puntos de corte para el 0.1% y 1% en dichas matrices, que permiten el uso de la PCR en cualquier muestra de mercado.

117

P‐37

AISLAMIENTO DE TAYLORELLA ASINIGENITALIS EN ESPAÑA: CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA Y GENOTÍPICA.

Frías, N.2*, Lorente, S.2, Castro, M.2, Serrano, T2, García Peña,F.J.1, Agüero,M. 1

1Laboratorio Central de Veterinaria. Dpto. de Bacteriología. MAGRAMA. 2Tecnologías y Servicios Agrarios S.A.

Introducción: En 1997 se aisló a partir de la fosa uretral de un burro un cocobacilo Gram negativo que crecía en los mismos medios de cultivo y condiciones de incubación que Taylorella equigenitlis y que presentaba una ligera reacción cruzada con dicha bacteria en la prueba de inmunofluorescenecia. A estos nuevos aislados se les denomino T. equigenitalis like . No fue hasta 2001cuando Jang y col determinaron la taxonomía exacta de estas cepas y propusieron la nueva especie Taylorella asinigenitalis. El objetivo de este trabajo es caracterizar las cepas de T. asinigenitalis aisladas en nuestro país para conocer su epidemiología y determinar su persistencia en el aparato genital de equídos. Material y métodos: los animales que forman parte del estudio son yeguas y sementales que van a exportarse a terceros países, sementales cuyo semen va a comercializarse y todos lo animales que se examinan en el Plan Nacional de Sanidad Equina. Las muestras que se reciben son hisopos de uretra, fosa del glande, prepucio y líquido preeyculatorio de los sementales e hisopos de senos y fosa clitoridiana y de cérvix en el caso de las hembras. Los hisopos se introducen en medio Amies o Stuart con carbón acivado, se refrigeran y se analizan en el Laboratorio antes de 48 horas desde su obtención. Los hisopos se analizan siguiendo el protocolo de la Organización Mundial de Sanidad Animal. Los aislados sospechosos se confirman por pruebas fenótipicas, serológicas y una PCR en tiempo real que diferencia ambas especies. Resultados y conclusiones: en el L.C.V. se han aislado 18 cepas de Taylorella asinigenitalis desde 2004, 11 a partir de asnos de 3 cuadras diferentes y 7 a partir de caballos de 1 única cuadra, perteneciendo 5 de estos últimos aislados a un 1 caballo pero en diferentes años (2004, 2005 y 2012). La caracterización de las cepas se ha realizado por su perfil de antibioresistencia y mediante electroforesis en campo pulsante. Los resultados indican la circulación de diferentes clones en nuestro país y la posibilidad de bien reinfecciones o de peristencia prolongada de algunas de las cepas.

118

P‐38 ENSAYOS INMUNOCROMATOGRÁFICOS (ONE‐STEP) PARA DIAGNÓSTICO EN

CAMPO DE PESTE PORCINA CLÁSICA Y PESTE PORCINA AFRICANA.

Pérez, T.1, Sastre, P. 1, Ranz, A. 1, Rueda, P. 1, Yang, X. 2, Räber, A. 2, Blome, S. 3, Gallardo, C. 4, Arias, M. 4 y Sanz, A.J. 1

1 INGENASA, Madrid, Spain.

2 Prionics, Schlieren, Switzerland 3 Institute of Diagnostic Virology. Friedrich‐Loeffer‐Institut. Greifswald‐Insel Riems, Germany

4 Centro de Investigación en Sanidad Animal, CISA‐INIA. European Union Reference Laboratory (URL) for ASF. Valdeolmos, Madrid, Spain.

Las Pestes Porcina Africana (PPA) y Clásica (PPC) son dos enfermedades altamente infecciosas de cerdos y jabalíes. Clínicamente es muy difícil distinguir entre PPA y PPC por lo que se hacen necesarios test de diagnóstico capaces de diferenciarlas. La aparición en Rusia y Cáucaso de PPA ha puesto en evidencia la necesidad de disponibilidad disponer de test rápidos para el control y diferenciación de ambas enfermedades. El objetivo de INGENASA ha sido desarrollar métodos inmunocromatográficos (LFD) para a) detección y diferenciación de anticuerpos, en un único dispositivo dual, para ambas enfermedades (EU, Seventh Research Framework Program FP7‐KBBE‐2011‐5 “Rapidia‐Field”) y b) detección de antígeno de PPA (proyecto Asforce, KBBE.2012.1.3‐02). El prototipo LFD desarrollado para la detección y diferenciación de ambas enfermedades utiliza las proteínas recombinantes E2 y VP72 de los virus de PPC y PPA respectivamente, unidas a microesferas de látex coloreadas y a la membrana. Dependiendo del tipo de anticuerpo presente, aparecerán diferentes líneas coloreadas. Los resultados se obtienen en un tiempo máximo de 10 minutos. El prototipo de LFD para la detección de antígeno de PPA en sangre utiliza anticuerpos monoclonales (AcM) específicos de la proteína VP72 unidos a microesferas de latex y a la membrana. RESULTADOS Para validar el test diferencial de detección de anticuerpos, se han utilizado sueros obtenidos de infecciones experimentales de PPA y PPC respectivamente. Los resultados se compararon con Ios obtenidos en ELISAs comerciales. Además, se analizaron sueros de áreas libres de PPA y PPC. La sensibilidad y especificidad diagnósticas fueron mayores al 99% y no se observó reactividad cruzada entre ambas patologías. Respecto al ensayo de detección de antígeno, se ha valorado con proteína recombinante VP72 y con virus inactivado de cultivo. El límite de detección es de 3 ng de proteína y 6x10

3ufp/ml

respectivamente; muy similares a los del ELISA comercial. CONCLUSIONES Aunque se hace necesario el análisis de un mayor número de muestras, los estudios preliminares sugieren que ambos ensayos pueden ser utilizados como herramientas muy útiles para control y, en su caso diferenciación, de ambas enfermedades en campo donde el personal y equipos especializados son limitados.

119

P‐39 RELACIÓN ENTRE LOS PATRONES DE LESIÓN Y LA RESPUESTA INMUNE LOCAL CON LA PRESENCIA DE VIRUS EN TEJIDOS Y EL NIVEL DE SEROPOSITIVIDAD EN

OVINOS AFECTADOS DE MAEDI‐VISNA

Gayo, E. 1; Polledo, L. 2; Pérez, C. 1; García Iglesias, M.J.1; Ferreras, M.C.1 y García Marín J.F.1

1 Dpto. Sanidad Animal, Anatomía Patológica. Facultad de Veterinaria. Universidad de

León. 2 Micros Veterinaria León.

La enfermedad del Maedi‐Visna ovino esta ocasionada por un virus lentivirus de pequeños rumiantes de la familia Retroviridae. Tiene una distribución mundial y se caracteriza por ser una infección lenta que conduce a un síndrome multisistémico que cursa con una inflamación crónica del pulmón, glándula mamaria, articulaciones y sistema nervioso central. En el ovino lechero intensivo la seroprevalencia en rebaños supera el 80% ocasionando graves pérdidas y habiéndose diagnosticado numerosos casos de la forma nerviosa, además de la mamaria y respiratoria. En este trabajo se llevan a cabo estudios histológicos de muestras de estos tejidos de ovinos con síntomas nerviosos, así como estudios inmunohistoquímicos para la identificación de poblaciones celulares y del agente etiológico en secciones de tejido. En todos los casos se realizó la detección serológica de anticuerpos de Maedi. En el SNC se identificaron dos patrones generales de lesión asociados a cada ovino y relacionada con su respuesta inmune individual, uno linfocítico caracterizado por el predominio de linfocitos T y la escasa presencia de antigeno vírico en tejidos en localización exclusivamente perivascular; y otro patrón histiocítico caracterizado por la abundancia de macrófagos y células B y la mayor precia vírica en toda la lesión. El pulmón y mama mostraban unas patrones lesionales similares a los observados en el SNC, confirmando la asociación de cada patrón a la respuesta inmune individual y no a la ruta de infección o tejidos afectados. Los estudios serológicos confirmaron una relación significativa con el nivel positividad y los patrones descritos, siendo muy elevada en el histiocítico. Este hecho confirmaría también la relación entre la cantidad de virus en tejidos y el nivel de respuesta serológica, con las implicaciones que se derivan para el diagnóstico, epidemiología y programas de control de la infección.

121

Autores

123

Autor Institución / Empresa Comunicación/es

Abad, J.C. Cobb España P‐03 Abendaño, N. Neiker‐Tecnalia/Miltenyi Biotec P‐01 Adamuz, J. J. Universitat de Lleida. ETSEA P‐11 Agüero, M. Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA. P‐04, P‐05, P‐06, P‐

10, P‐15, P‐17, P‐21, P‐23, P‐27, P‐37

Alarcón‐Elbal, P.M. Facultad de Veterinaria. Universidad de Zaragoza

P‐12, P‐14, P‐28, P‐30

Alonso‐Hearn, M. Neiker‐Tecnalia/Miltenyi Biotec P‐01 Álvarez, J. Centro VISAVET. Universidad Complutense de

Madrid O‐17

Álvarez‐García, G., Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid

O‐08

Álvarez‐Perez, S. Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid

O‐07, O‐18

Álvarez‐Rodríguez, J. Universitat de Lleida. ETSEA P‐11 Anadón, E. Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA. P‐08, P‐16, P‐18, P‐

20, P25, P‐26, P‐36, P‐34

Aranaz, A. Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid

O‐17

Aranguren, R. Instituto de Investigación en Recursos Cinegéticos. UCLM

O‐04

Arias, M. INGENASA P‐38 Arranz‐Solís D. Facultad de Veterinaria, Universidad

Complutense de Madrid O‐21

Astorga, R.J. Universidad de Córdoba/CICAP O‐05 Badosa‐Brossa, M. HIPRA O‐12

Bailo, B. Centro Nacional de Microbiología P‐29 Balachandran, P. Life Technologies Corporation P‐09 Balseiro, A. SERIDA, Asturias O‐06 Barandika, J.F. Neiker‐Tecnalia O‐19, P‐01 Barrera‐Toro, X. HIPRA O‐12 Bastida, F. Vacunek S.L. P‐22 Berenguer, J.A. Centro Nacional Alimentación. AESAN. MSSSI O‐25 Blanco, J.L. Facultad de Veterinaria, Universidad

Complutense de Madrid O‐07, O‐18

Blome, S. INGENASA P‐38 Bolchakova E. Life Technologies Corporation P‐09 Bonet, I. Tecnologías y Servicios Agrarios SA. P‐16, P25, P‐26,

P‐34

Autores:

124


Bouzada, J.A. Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA. O‐11, P‐16, P‐18, P‐20, P25, P‐26,

Boveda, E. Neiker‐Tecnalia/Miltenyi Biotec P‐01 Brevnov, M. G. Life Technologies Corporation P‐09 Brzoska, P. M. Life Technologies Corporation P‐09 Buitrago, M.D. Tecnologías y Servicios Agrarios SA. P‐05, P‐21 Calero‐Bernal, R. Facultad de Veterinaria de Cáceres. España P‐12, P‐28 Calvo Capilla, A. Universidad Católica de Valencia “San Vicente

Mártir” P‐32, P‐35

Cañavate, C. Unidad de Gestión de la RE‐LAB, Instituto de Salud Carlos III

O‐16

Cardona, G.A. Centro Nacional de Microbiología P‐29 Cardoso‐Toset, F. Universidad de Córdoba/CICAP O‐05 Carmena, D. Centro Nacional de Microbiología P‐29 Carmona‐Salido, V.J. Facultad de Veterinaria. Universidad de

Zaragoza P‐12

Casal, C. Centro VISAVET. Universidad Complutense de Madrid

O‐17

Castillo, F. Tecnologías y Servicios Agrarios SA. P‐16, P25, P‐26 Castro, M Tecnologías y Servicios Agrarios SA. O‐22, P‐37, P‐13, P‐

03 Castro, M.V. Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA. P‐15 Cobo, I. P. Subdirección General de Sanidad e Higiene

Animal y Trazabilidad. MAGRAMA. P‐27

Collantes‐Fernández E. Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid

O‐21

Coma‐Oliva, E. HIPRA O‐12 Comtet, L. IDvet, Montpellier. France O‐13, P‐07,P‐19 Cortey, M. The Pirbright Institute O‐14 Cruz López, F. Facultad de Veterinaria. Universidad

Complutense de Madrid. P‐31

Cubiló, D. Universitat de Lleida. ETSEA P‐11 Cutuli, M. Facultad de Veterinaria, Universidad


Chico, I. Tecnologías y Servicios Agrarios SA. P‐10, P‐21, P‐23 de Caso, M. Tecnologías y Servicios Agrarios SA. P‐21 De Frutos, C. Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA. P‐21 De la Cruz, V. Tecnologías y Servicios Agrarios SA. P‐16, P‐26, P‐34 Del Sur, E. Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA. P‐15 Diéguez, L. Unidad Municipal de Higiene y Epidemiología de

Camagüey, Cuba P‐14

Diez‐Guerrier, A. Servicios Veterinarios MAEVA, Spain O‐17 Domingo, M. CReSA, Universitat Autònoma de Barcelona‐

IRTA O‐20

Domínguez, L. Centro VISAVET. Universidad Complutense de O‐17

125


Madrid Egli, C. IDEXX P‐33 Estevez, M. Tecnologías y Servicios Agrarios SA. P‐36 Estrada, E. Ramaders de Vaquí O‐20 Fernández, I. Tecnologías y Servicios Agrarios SA. P‐06, Fernández‐León, J. Tecnologías y Servicios Agrarios SA. P‐16, P25, P‐26 Fernández‐Somalo, P. Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA. P‐23, P‐27 Ferreras, M.C. Facultad de Veterinaria. Universidad de León P‐39 Forés Jackson, P. Facultad de Veterinaria. Universidad

Complutense de Madrid. P‐31

Fraile, L. CReSA, Universitat Autònoma de Barcelona‐IRTA ‐ Universitat de Lleida

O‐14

Frías, N. Tecnologías y Servicios Agrarios SA. O‐22, P‐27, P‐37, P‐13, P‐03

Fuentes, I. Centro Nacional de Microbiología P‐29 Furtado, M. R. Life Technologies Corporation P‐09 Gallardo, C. INGENASA P‐38 García Iglesias, M.J. Facultad de Veterinaria. Universidad de León P‐39 García Marín, J.F. Facultad de Veterinaria. Universidad de León O‐06, P‐39 García Párraga, D. L´Oceanogràfic Valecia P‐13 García, M.E. Facultad de Veterinaria, Universidad

Complutense de Madrid O‐07, O‐18

García‐Culebras, A.

Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid

O‐08

García‐Curbelo.E. Tecnologías y Servicios Agrarios SA. P‐18, P‐34 García‐Peña, F.J. Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA. O‐20, O‐22, P‐37,

P‐13, P‐03 García‐Pérez, A.L. Neiker‐Tecnalia O‐19 Gardon Poggi, J.C. Universidad Católica de Valencia “San Vicente

Mártir” P‐32, P‐35

Gayo, E. Facultad de Veterinaria. Universidad de León P‐39 Gómez, A. Veterinario, Salamanca O‐06 Gómez‐Laguna, J. Universidad de Córdoba/CICAP O‐05 Gómez‐Tejedor, C. Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA. P‐04, P‐16, P25,

P‐17, P‐26 González, N. Vacunek S.L. P‐22 Gonzalo, I. Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA. P‐04, P‐23 Gortázar, C. Instituto de Investigación en Recursos

Cinegéticos. UCLM O‐03

Gredilla, E. ENAC O‐26 Gutiérrez‐Expósito, D. Facultad de Veterinaria, Universidad


Hernández, M. Universidad de Córdoba/CICAP O‐05 Hernández‐Valero, M. Tecnologías y Servicios Agrarios SA. P‐02, P‐08 Holopainen, J. Thermo Fisher Scientific Oy P‐24

126


Hooghuis, H. Laboratorio Arbitral Agroalimentario. MAGRAMA.

O‐23

Huélamo, T. Tecnologías y Servicios Agrarios SA. P‐02, P‐04 Hurtado, D. Tecnologías y Servicios Agrarios SA. P‐08, P‐34 Jiménez, C. Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA. P‐21, Jiménez, M.A. CISA. INIA O‐02, Juste, R.A. Neiker‐Tecnalia P‐01, O‐19 Kwiatek, O. CIRAD, Montpellier. France O‐13 Lanzarot, P. Facultad de Veterinaria, Universidad


Lawrence J. IDEXX O‐17, P‐33 Lázaro, B. Vacunek S.L. P‐22, P‐24 Ledo, B. Neiker‐Tecnalia/Miltenyi Biotec P‐01 Libeau, G. CIRAD, Montpellier. France O‐13 Liikanen, M. Thermo Fisher Scientific Oy P‐24 Linscott, R. Facultad de Veterinaria, Universidad

Complutense de Madrid. IDEXX Livestock and Poultry Diagnostics

P‐33

López, I. Tecnologías y Servicios Agrarios SA. P‐27 López‐Maroto, C. Tecnologías y Servicios Agrarios SA. P‐18, P‐20, P‐34 Lorente, S Tecnologías y Servicios Agrarios SA. O‐22, P‐37, P‐13, P‐

03 Lozano, J.M. Tecnologías y Servicios Agrarios SA. P‐16, P25, P‐26 Lucientes, J. Facultad de Veterinaria. Universidad de

Zaragoza P‐12, P‐14

Maldonado, A. Universidad de Córdoba/CICAP O‐05 Marín, C. Centro Nacional de Microbiología P‐29 Martel, E. IDEXX Livestock and Poultry Diagnostics O‐17, P‐33 Martínez, M.J. Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA. P‐34 Martos‐Raich, A. HIPRA O‐12 Masot Gómez‐Landero, J.

Facultad de Veterinaria de Cáceres. España P‐12

Mateos, A. Servicios Veterinarios MAEVA, Spain O‐17 Maya, M.R. Tecnologías y Servicios Agrarios SA. P‐16, P‐20, P25,

P‐26 Mayoral, T. Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA. O‐10, P‐02, P‐04, P‐

08, P‐16, P‐18, P‐20, P25, P‐26, P‐36, P‐34

Moraga, L. Tecnologías y Servicios Agrarios SA. P‐20, P‐34 Moreno‐Opo, R. Tecnologías y Servicios Agrarios SA. P‐02, Navarro‐Lozano, V. Facultad de Veterinaria, Universidad


Nevado, M.J. Tecnologías y Servicios Agrarios SA. P‐02, P‐04, Nogareda, C. Universitat de Lleida. ETSEA P‐11

127


Nuñez, A. Life Technologies Corporation P‐09 Orden, C. Facultad de Veterinaria, Universidad


Ortega‐Mora, L.M. Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid

O‐08, O‐21

Ossorio, B. Tecnologías y Servicios Agrarios SA. P‐16, P25, P‐26 Parra, B. Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA. P‐02, P‐04 Pascual, G. CISA. INIA O‐15 Pastor‐Fernández, I. Facultad de Veterinaria, Universidad


Peláez, T. Hospital General Universitario ‘Gregorio Marañón’, Madrid

O‐07

Pérez, C. Facultad de Veterinaria. Universidad de León P‐39 Pérez, T. INGENASA P‐38 Pérez‐Barbachano, M.V.

Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA. P‐36,

Petrauskene O. V. Life Technologies Corporation P‐09 Pileri, E. Centre de Recerca en Sanitat Animal‐UAB O‐14 Piñero, A. Neiker‐Tecnalia O‐19 Pitarch, L.B. Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA. O‐24 Planasdemunt‐Regàs, L.L.

HIPRA O‐12

Polledo, L. Micros Veterinaria. León O‐06, P‐39 Porquet‐Garanto, L. HIPRA O‐12 Pourquier, P. IDvet, Montpellier. France O‐13, P‐07, P‐19 Pujols, J. CReSA, Universitat Autònoma de Barcelona‐

IRTA O‐20

Räber, A. INGENASA P‐38 Rämä, P. Thermo Fisher Scientific Oy P‐24 Ranz, A. INGENASA P‐38 Rebordosa‐Trigueros, X.

HIPRA O‐12

Reguillo, L. Universidad de Córdoba/CICAP O‐05 Rocha, A. Tecnologías y Servicios Agrarios SA. P‐10, P‐23 Rodríguez, A. Tecnologías y Servicios Agrarios SA. P‐27 Rodríguez, F. CReSA, Universitat Autònoma de Barcelona‐

IRTA O‐14

Rodríguez‐Campos, S. Centro VISAVET. Universidad Complutense de Madrid

O‐17

Rojo‐Montejo S. Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid

O‐21

Royo, L.J. SERIDA, Asturias O‐06 Ruano, M.J. Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA. P‐05, P‐10 Rueda, P. INGENASA P‐38 Salami, H. CIRAD, Montpellier. France O‐13

128


Salido, J.I. IDEXX P‐33 San Miguel, E. Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA. P‐06, P‐27 Sánchez, A. Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA. P‐05, P‐06, P‐10 Sánchez, I, Vacunek S.L. P‐22 Sánchez, M. Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA. P‐21 Sánchez, M.C. Subdirección General de Sanidad e Higiene

Animal y Trazabilidad. MAGRAMA. P‐04.

Sánchez‐Murillo, J.M. Consejería de Agricultura, Desarrollo Rural, Medio Ambiente y Energía. Gobierno de Extremadura

P‐12, P‐14, P‐28, P‐30

Sánchez‐Rodríguez, A. Facultad de Veterinaria. Universidad Complutense de Madrid.

P‐31

Sánchez‐Sánchez R. Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid

O‐21

Sanz, A.J. INGENASA P‐38 Sastre, P. INGENASA P‐38 Satué Ambrojo, K. Universidad CEU‐Cardenal Herrera. Valencia. P‐32, P‐35 Saugar, J.M. Centro Nacional de Microbiología P‐29 Schumaker, M. Life Technologies Corporation P‐09 Segalés, J. CReSA, Universitat Autònoma de Barcelona‐

IRTA O‐14

Serra‐Martínez, J. HIPRA O‐12

Serrano, T. Tecnologías y Servicios Agrarios SA. O‐22, P‐21, P‐37, P‐13, P‐03

Sibila, M. CReSA, Universitat Autònoma de Barcelona‐IRTA

O‐14

Silvennoinen, M. Thermo Fisher Scientific Oy P‐24 Soriguer, R. Estación Biológica de Doñana. CSIC O‐01 Tarradas, C; Universidad de Córdoba/CICAP O‐05 Tena‐Tomás, C. Tecnologías y Servicios Agrarios SA. P‐17, Tesouro, S. Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA. P‐15 Trigo, A. Tecnologías y Servicios Agrarios SA. P‐16, P25, P‐26 Varo, I. Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA. O‐22, P‐02, P‐06 Velasco, E. Tecnologías y Servicios Agrarios SA. P‐36, P‐34 Vigo, M. Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA. P‐04, P‐06, P‐17, P‐

23, P‐27 Villaescusa, A. Facultad de Veterinaria, Universidad


Villalba, D. Universitat de Lleida. ETSEA P‐11 Villalba, R. Laboratorio Central de Veterinaria. MAGRAMA. P‐06 Yang, X. INGENASA P‐38 Zoder, P. Life Technologies Corporation P‐09

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