Katherine Apunte

1.4.1 Limitaciones de la PCR mltiplexEl principal problema que est tcnica presenta es quiz la formacin de artefactos, que son productos adicionales que interfieren con la adecuada interpretacin de los resultados y como consecuencia, en la asignacin de alelos de una muestra (Viljoen et al., 2005).Debido al carcter mltiple de esta reaccin, la probabilidad de formacin de estos artefactos es an mayor, por lo que el analista debe ser capaz de desarrollar estrategias que permitan solventar estos inconvenientes, ya sea modificando el nmero de ciclos, los periodos de tiempo de cada fase o la cantidad de los componentes para llegar a un rendimiento ptimo en todos los loci amplificados (Viljoen et al., 2005; Gonzlez, 2006). Los artefactos e inconvenientes ms comnmente encontrados en las reacciones mltiplex se detallan a continuacin.1.4.1.1 Bandas tartamudas o stuttersLos stutters son artefactos que presentan una unidad de repeticin menos que el alelo verdadero. Una revisin detenida de los electroferogramas expone a las bandas tartamudas como picos pequeos con algunas bases menos que el alelo en cuestin (figura 1.4) (Butler, 2005).

Figura 1. 4: Alelos STR de los marcadores D8S1179, D21S11 y D18S51 con bandas tartamudas o stutters.El principal mecanismo que se ha descrito, explica mejor la existencia de stutters es el deslizamiento de la enzima polimerasa durante la amplificacin. En este modelo, conocido como hebra deslizada-dispareja, una regin del complejo primer-templado permanece libre durante la elongacin, causando el deslizamiento ya sea del primer o del templado, de manera que se forma un bucle no apareado en una unidad de repeticin (figura 1.5). Como consecuencia de este evento se genera un producto de PCR acortado que difiere del alelo verdadero por una sola unidad de repeticin (Butler, 2005) (Abu. 2008) (Gonzlez, 2006).La cantidad observada de estas bandas dependen primeramente del locus y de la secuencia amplificada. Si un alelo tiene secuencias no consenso entonces ser ms proclive a generar bandas tartamudas que aquellas con repeticiones completas (Butler, 2005) (Gonzlez, 2006).Se ha visto que la presencia de stutters puede verse reducida utilizando STRs con unidades de repeticin largas, (ej. Penta D y Penta E) y con polimerasas de rpida capacidad de procesamiento. En este ltimo caso, se ha visto un incremento de estos artefactos cuando la polimerasa es lenta (Walsh et al., 1996).

Figura 1. 5: Ilustracin del modelo Hebra deslizada-dispareja que origina los stutters.a) Proceso de replicacin normal, cada unidad repetitiva se aparea con su respectiva secuencia complementaria. b) Insercin causada por deslizamiento del primer, en este caso el producto final ser una unidad de repeticin ms larga que el alelo verdadero. c) Delecin causada por deslizamiento del templado, que es el mecanismo de formacin de los stutters (Butler, 2005).Algunas de las propiedades que las bandas tartamudas poseen y facilitan su identificacin se describen a continuacin (Gonzlez, 2006). Son una unidad de repeticin ms cortas que el alelo verdadero. Representa menos del 10% del peso del alelo verdadero. La tendencia para formar estas estructuras aumenta si las unidades repetitivas son cortas (dinucleotdicas > trinucleotdicas > tetranucleotdicas > pentanucleotdicas). La cantidad de stutters es mayor para los alelos grandes de un locus.1.4.1.2 Adenilaciones incompletas: split peaks y shoulder peaks La Taq polimerasa a menudo incorpora un nucletido adicional en el extremo 3 del amplicon al finalizar la PCR. Esta adicin generalmente se trata de una Adenina y por eso toma el nombre de Adenilacin o (+A). Cuando la adenilacin no se ha llevado a cabo, la presencia de artefactos en los perfiles genticos es evidente y este hecho toma el nombre de adenilacin incompleta (MacLaren et al., 2008).Las adenilaciones incompletas (-A) pueden aparecer de dos formas en los eletroferogramas. En la primera, se manifiestan como dos picos distintos y se denominan split peaks, donde el segundo pico se muestra una posicin menos que el alelo real. En la segunda, los picos presentan una especie de hombro en el lado izquierdo, a estos ltimos se les llama shoulder peaks (MacLaren et al., 2008) (figura 1.6).

Figura 1. 6: Representacin de las adenilaciones incompletas en los electroferogramas.(Butler, 2005)En trminos generales, estos artefactos se evidencian como picos con una base ms corta que el alelo verdadero debido a la falta de adenilacin terminal. La cantidad de estos productos depende en gran parte al exceso de ADN en la reaccin, motivo por el que la literatura recomienda 0.5-2ng como medida adecuada para la amplificacin de STRs (Abu, 2008).1.4.1.3 Pull-up Los pull-up son picos que representan un fallo en el anlisis para discriminar entre los distintos colores utilizados por el software para la generacin de datos. La presencia de estos picos se ha relacionado con grandes cantidades de ADN en las muestras. Esta sobresaturacin causa que los picos altos pertenecientes a un panel de un color determinado, se levanten o se reflejen en otro color. En un electroferograma pueden ser vistos como picos ubicados en la misma posicin en los diferentes paneles (Michaelis et al., 2011). En la figura 1.7 se muestra a la izquierda los reflejos en el panel azul, producto del exceso de ADN en el pico verde. Del mismo modo se observa un reflejo en el panel verde debido al pico en el color negro. A la derecha, datos unificados de todos los colores en un electroferograma donde se puede evidenciar los reflejos del pico original en los dems colores.

Figura 1. 7: Representacin grfica de los pull-up.(Tomado de www.nfstc.org).1.4.1.4 Off-ladderUn off-ladder es una variante inusual que no est incluida en el lder allico y que se presenta en un eletroferograma a manera de un pico etiquetado como OL. A pesar de que los picos off-ladder pueden llegar a ser alelos verdaderos que por eventos mutacionales poseen un nmero de repeticiones inusual, es importante saber diferenciar de aquellos que nicamente son artefactos por lo que el conocimiento de parmetros de operacin como los lmites PDT son de gran utilidad (Michaelis et al., 2011).El Umbral de Deteccin de Picos o PDT (Peak Detection Threshold) es la intensidad que un pico debe tener para ser reconocido por la mquina. Segn las recomendaciones emitidas por Applied Biosystems, el lmite mnimo de deteccin de picos es de 150 RFU o Relative Fluorescence Units (Michaelis et al., 2011).Resulta frecuente encontrar cierto ruido en los electroferogramas, que son picos localizados por debajo de este nivel. No as, existen productos de la PCR que son significativamente ms intensos y presentan un patrn allico poco comn, por lo que la mquina los detecta fcilmente como OL (off-ladder) (figura 1.8). Por este motivo, la identificacin correcta de alelos es crucial en el laboratorio (Michaelis et al., 2011).

Figura 1. 8: Representacin de un Off-Ladder en un electroferograma.(Adaptado de Michaelis et al., 2011)1.4.1.5 SpikesLos spikes son picos estrechos cuyo origen se atribuye a la fluctuacin del voltaje o a la presencia de burbujas en el capilar. Para sobrellevar este inconveniente se puede correr la muestra nuevamente ya que estos artefactos no son reproducibles (figura 1.9) (Moira, 2013).

Figura 1. 9: Representacin de un spike en un electroferograma(Tomado de www.nfstc.org).Aunque muchos artefactos son claramente identificables, las normas para determinar si un pico es verdadero o no, suelen ser bastante subjetivas creando discrepancias entre las opiniones de los expertos. Sin embargo, no solo los artefactos pueden dificultar el anlisis de los perfiles genticos ya que los productos de la PCR tambin estn expuestos a procesos de degradacin, complicando ms la identificacin de los alelos. 1.4.1.6 Productos degradadosOcurre cuando una muestra no est correctamente preservada y los fragmentos ms largos de ADN empiezan a degradarse, siendo consecuencia directa, la amplificacin baja o nula de los mismos. El efecto que causa en un perfil gentico se conoce como pista de esqu, donde los alelos del lado derecho son notablemente ms pequeos en altura que los ubicados al lado izquierdo, generando un patrn diferencial de amplificacin que asemeja una pista de esqu (Moira, 2013). En la figura 1.10 se puede observar que los productos de mayor peso molecular se amplifican con menos eficiencia que los de menor peso molecular, generando un patrn descendente de amplificacin que asemeja una pista de esqu.

Figura 1. 10: Efecto pista de esqu en un electroferograma.(Butler, 2005)Hoy por hoy, el anlisis molecular se ha convertido en una prctica comn a nivel mundial, no solo por las facilidades que la tecnologa ofrece sino por el contenido de informacin que se puede obtener de un componente tan pequeo pero de tanta trascendencia biolgica como es el ADN. Este es el cdigo de la vida, el papiro sobre el cual se escribe el destino de todo ser viviente sobre el planeta, y aunque por aos ha sido estudiado y ha revelado muchas de las formas como acta sobre los caracteres humanos, an guarda en su interior los ms interesantes y maravillosos secretos de todo cuanto somos como individuos, como especie y como poblacin.Bajo este contexto, su aplicacin en la medicina no ha quedado de lado. Con el advenimiento del diagnstico molecular que permite relacionar las fallas genticas con las enfermedades, atrs quedarn los exmenes clnicos y los bisturs, los genes sern los nuevos aliados al momento de elegir un tratamiento teraputico. Y es que los marcadores genticos al estar ligados a genes, permiten vislumbrar de cierta manera la dinmica de segregacin de los mismos, pudiendo ser determinantes al momento de estudiar la forma de transmisin de una enfermedad de tipo gentico, el grado de sensibilidad a un frmaco o la predisposicin a una afeccin en especial. Por todas las consideraciones anteriores, es necesario conocer el comportamiento gentico de la poblacin, caracterizarla y estudiar a fondo la implicancia de su diversidad, con el fin de que esta informacin, contribuya de manera significativa a la comunidad cientfica y sobre todo al desarrollo de una medicina que beneficie a todos los ecuatorianos. La farmacogenmica y la medicina personalizada son los nuevos campos a incursionar, y la antesala a esta nueva etapa es sin duda determinar el paisaje gentico-poblacional de los ecuatorianos, el cual es motivo del presente trabajo que pretende aportar en parte con el avance de la ciencia en el Ecuador.