Lineas y Proyectos

LINEAS Y PROYECTOS DE INVESTIGACIÓN

Parasitología

TITULO DEL PROYECTO:

Participación de las proteínas fosfatasas del parásito

leishmania en la modulación de las vías de señalización de la célula hospedera

Palabras clave:

Proteina fosfatasa/parasitología/leishmania/respuesta inmune/ OBJETIVO:

Objetivos: objetivo principal:analizar el efecto de las proteínas fosfatasas de leishmania sobre las vías de señalización de células que participan en la respuesta inmune innata. Objetivos particulares: 1. Clonar, purificar y caracterizar las proteínas fosfatasa (pp2c y ptp) de leishmania. 2. Analizar el efecto de las proteínas fosfatasas (pp2c y ptp) de leishmania en: a) la fosforilación de proteínas en residuos de tirosina y serina/treonina de macrófagos y células dendríticas (cd). B) la producción de citocinas como tnf?, il-12, il-10 en macrófagos murinos de cepas susceptibles (balb/c) y resistentes (c57/bl6) a la leishmaniasis. C) la producción de óxido nitrico y estallido oxidativo en macrófagos murinos de cepas susceptibles (balb/c) y resistentes (c57/bl6) a la leishmaniasis. D) en la fagocitosis de macrófagos. E) la activación de las cinasas jak y mapkinasas (p38 y erk 1/2) en macrófagos y cd. F) la activación de factores de transcripción (nfkb, nfat, ap1 y stat) en núcleos de macrófagos y cd. 3. Analizar la participación de las proteínas fosfatasas (pp2c y ptp) de leishmania en la infección de macrófagos en comparación con cd. A) mediante el uso irna dirigidos hacia las proteinas fostatasas del parásito b) análisis por rtpcr de productos amplificados de proteínas fosfatasas del parásito durante el proceso de infección.

RESUMEN:

Leishmania es un parásito protozoario que infecta a macrófagos y células dendríticas. En modelos murinos se ha caracterizado la respuesta inmune adaptativa, estableciéndose que la respuesta tipo th1 se correlaciona con la curación mientras que la respuesta th2 lleva a la progresión del padecimiento. En el humano la leishmaniasis también se presenta en forma bi-polar, siendo la leishmaniasis cutánea localizada (lcl) la forma "benigna" que cursa con una buena respuesta inmune celular y la leishmaniasis cutanea difusa (lcd), la forma progresiva que se caracteriza por un cuadro clínico severo donde el paciente presenta nódulos que diseminan a toda la piel con invasión a mucosas en etapas finales, lo cual lleva a la muerte del paciente. Aunque se desconoce la causa que lleva a esta forma clínica, se considera que factores y mecanismos establecidos a nivel de inmunidad innata son determinantes . Leishmania utiliza varios mecanismos para evadir la respuesta inmune del huésped. Se han estudiado varias moléculas del parásito que intervienen en la fisiopatogenia de la relación huésped-parásito, siendo las más importantes el lipofosfoglicano (lpg) y la glicoproteina de 63 kda (gp63). Se ha encontrado que estas moléculas se localizan en la superficie del parásito y que juegan un papel esencial en proteger al parásito de las actividades líticas de los


macrófagos. Se sabe que leishmania modula diversas vías de señalización del macrófago, sin embargo las moléculas del parásito que participan en ello, han sido poco estudiadas. Por ejemplo en la vía de las map cinasas se observó que las células infectadas con el parásito y estimuladas con pma mostraron una disminución en la fosforilación de las map cinasas p42 y p44. Estos resultados sugieren que la infección con el parásito específicamente afecta la fosforilación en tirosina de las map cinasas. Por otra parte en macrófagos infectados con leishmania donovani se demostró una inhibición en la vía de señalización del interferón gama (ifn?), la cual es una de las citocinas más importante en la activación, donde participa la vía de señalización jak/stat (cinasa de activación janus/transductor de señales y activador de la transcripción). Datos obtenidos en nuestro laboratorio demuestran por primera vez la presencia de proteínas fosfatasas en el parásito leishmania. Estas enzimas han sido clonadas y obtenidas las proteínas recombinantes que se han caracterizado bioquímicamente como proteinas tirosinas fosfatasas y proteinas fosfatasas pp2c. Es decir las primeras defosforilan residuos fosforilados en tirosina y las segundas defosforilan residuos fosforilados en serina treonina. Estos residuos fosforilados están presentes en multiples proteínas que participan de manera importante en diversas vías de señalización necesarias para la activación celular (fagocitosis, producción de citocinas, producción de radicales del oxigeno etc.). En otros microorganismos estas proteínas fosfatasas han sido reportadas como un factor de virulencia porque participan en la inhibición de las vías de señalización (jak/stat, map kinasas ) de células inmunes. En este proyecto estamos interesados en estudiar la participación de las proteinas fosfatasas de leishmania sobre distintas vías de señalización y mecanismos efectores del macrófago y de la célula dendrítica, lo cual permitirá entender la posible causa de la modulación diferencial que ejerce el parásito sobre ambas células y aportará nuevos datos sobre las interacciones positivas y negativas entre leishmania y sus células hospedero, que pueden ser significativas en la regulación que lleva hacia una protección inmune o hacia la progresión patológica observada en pacientes infectados con el parásito leishmania. En este proyecto participará un grupo de 2 investigadores, 2 estudiantes de doctorado, 1 de maestría y 4 de licenciatura.



Identificación de elementos genéticos de virulencia que

favorecen la prevalencia y diseminación de cepas nosocomiales de klebsiella pneumoniae

Palabras clave:

OBJETIVO:

Determinar la capacidad de adherencia e invasividad a células epiteliales humanas in vitro determinar la capacidad de formación de biopelículas a superficies abióticas estudiar genotípica y fenotípicamente la producción de pili estudiar la asociación de factores de virulencia con la presencia del plasmido r en cepas de kpn nativas y transconjugantes determinar la secuencia nucleotídica del genoma (cromosoma y plasmido r) de cepas multirresistentes de kpn causantes de in analizar las secuencias obtenidas con el fin de identificar genes que codifiquen para la producción de factores de virulencia

RESUMEN:

Es un estudio descriptivo de biología molecular para la caracterización del mecanismo de transmisión y permanencia de cepas de klebsiella pneumoniae causantes de infecciones nosocomiales (in) en el hospital civil de guadalajara. Se utilizarán dos cepas multirresistentes portadoras de un plasmido r conjugativo causantes de varias in y brotes intrahospitalarios y se compararán con dos cepas causantes de una sola in aisladas durante un estudio previo realizado en el laboratorio de infectología, microbiología e inmunología clinica del departamento de medicina experimental, facultad de medicina, unam. Se determinará si en estas cepas existen factores de virulencia (por ejemplo los que participan en la colonización del tracto gastrointestinal y en la formación de biopelículas) asociados al plásmido r y/o al cromosoma que les permiten diseminarse entre diferentes pacientes y permanecer por largos periodos dentro del ambiente hospitalario. Se estudiará la capacidad de adherencia e invasividad a células epiteliales en ensayos in vitro, se investigarán el tipo de adhesinas que genotípica y fenotípicamente se encuentran expresadas en estas bacterias. Se realizará la secuenciación de todo el genoma bacteriano (cromosoma y plásmido) con la finalidad de identificar genes relacionados con factores de virulencia



Alteraciones inducidas en la expresión de proteínas del

citoesqueleto de parásitos por la acción de sustancias antiparasitarias

Palabras clave:

OBJETIVO:

Objetivo general en el proyecto propuesto se contempla profundizar en la expresión de proteínas del citoesqueleto de diversos parásitos mediante evaluaciones de tipo inmunoquímico, proteómico y de localización celular y tisular. Se busca, que una vez comprendida la forma en que tales proteínas son expresadas, se logre identificarlas, definir su número de isoformas y determinar su nivel de expresión. Finalmente, se espera determinar si el efecto en la expresión de las proteínas puede estar asociado al tratamiento que sufrirán los parásitos cultivados in vitro en presencia de agentes químicos con reconocido efecto cestocida o con potencial antiparasitario que hayan sido sintetizados mediante química medicinal. Objetivos particulares o Continuar con los estudios de caracterización bioquímica e inmunoquímica de proteínas

mediante análisis de tipo proteómico del citoesqueleto de ténidos y ampliar los mismos para otros céstodos como hymenolepis y protozoarios como g. Intestinalis y t. Cruzi. En el caso de los protozoarios se esperan lograr las identificaciones de las proteínas detectadas, mediante su análisis por espectrometría de masas del tipo tof-tof o qtof.

o Determinar y comparar el número de isoformas de las proteínas del citoesqueleto que se estudien en los distintos parásitos, así como determinar cual es su nivel de expresión por evaluaciones de tipo inmunoproteómico mediante el empleo de anticuerpos específicos comerciales que se hayan encontrado con reactividad.

o Identificar, mediante el empleo de mapas proteómicos en combinación con inmunoelectrotransferencia y anticuerpos específicos comerciales, las proteínas del citoesqueleto que se expresan en extractos enriquecidos con proteínas del citoesqueleto de parásitos céstodos y de protozoarios. Se esperan identificar proteínas específicas de los parásitos en estudio.

o Determinar, mediante estudios de colocalización por microscopía confocal, en que sitios de los tejidos parasitarios o de los parásitos en si, se están expresando las proteínas asociadas a proteínas del citoesqueleto y las proteínas contráctiles correspondientes.

o Establecer, por análisis de imágenes, la variabilidad de la expresión de las proteínas en los tejidos parasitarios y buscar ampliar los análisis mediante el uso del programa amira para visualización en tercera dimensión.

o Determinar, mediante observaciones por microscopía electrónica de transmisión combinada con inmunohistoquímica, a nivel ultraestructural, los sitios en donde se están expresando las proteínas asociadas a proteínas del citoesqueleto y las proteínas contráctiles correspondientes.

o Determinar la viabilidad de los parásitos, mediante el marcador vital fluorescente cmfda, en presencia de las sustancias químicas o de fármacos antihelmínticos seleccionados.


o Determinar mediante análisis observacionales microscópicos, tanto al nivel de microscopía fotónica como electrónica, los posibles efectos que produzcan los compuestos químicos en estudio en los parásitos en evaluación y comparar tales efectos con fármacos de probado efecto en los parásitos.

o Determinar, mediante mapeos proteómicos combinados con inmunoelectrotransferencias, el efecto en la expresión de las proteínas por mantenimiento in vitro de los parásitos con sustancias químicas o fármacos antihelmínticos seleccionados.

o Identificar y secuenciar las proteínas, previamente seleccionadas de los análisis de imágenes de los mapas proteómicos generados, mediante análisis de espectrometría de masas del tipo maldi-tof, tof-tof y qtof.

o Evaluar el efecto de nuevos análogos del bencimidazol sobre fases parasitarias específicas de parásitos seleccionados y determinar si hay posible acción sobre la expresión de proteínas de su citoesqueleto.

o Determinar el tipo de proteínas del citoesqueleto que resultaren afectadas por los tratamientos in vitro de los parásitos con las sustancias químicas experimentales seleccionadas.

RESUMEN:

Las enfermedades parasitarias continúan siendo un problema de salud pública, por lo que la oms considera que una de las estrategias con mayor efectividad a corto alcance es la quimioterapia. Sin embargo, la falta de atención por parte de los grandes consorcios farmaceúticos, la aparición de casos de resistencia en medicina veterinaria y la carencia de fármacos efectivos para parasitosis como algunas de las producidas por protozoarios, son causas que generan la necesidad imperiosa de desarrollar fármacos más efectivos, menos costosos y con mayor espectro de acción. Aunque las metas son buenas, aún se requiere mucho por hacer a causa del desconocimiento de muchos aspectos de la biología celular de los parásitos, sobre todo de lo que se refiere a su citoesqueleto y a su relación con el efecto de fármacos antiparasitarios. La falta de conocimiento se debe a que no se ha puesto mucho énfasis en su estudio, ya que la mayor parte de la investigación se ha enfocado hacia la epidemiología, la clínica, el diagnóstico y la prevención. En la actualidad, sumado a las posibilidades que hay de encontrar nuevos fármacos o rediseñar los actuales que se han encontrado son funcionales; es posible diseñar, sintetizar y evaluar candidatos antiparasitarios en menor tiempo de lo que antes se hacía, debido a que se cuentan con campos de estudio de vanguardia como la bioinformática, la química medicinal, la proteómica y la microscopía. Nuestro grupo de investigación se ha dedicado a lo largo de mas de diez años a la caracterización de proteínas del citoesqueleto de ténidos, sin embargo, en el último año se ha comenzado con la caracterización de proteínas semejantes en el protozoario gardia intestinalis en conjunto con un grupo de investigación del cmn siglo xxi-imss y recientemente, bajo colaboración con otro de la encb-ipn, se han iniciado estudios con dos modelos experimentales en los que se producen un protozoario, trypanosoma cruzi; así como el céstodo hymenolepis nana. A su vez, con la colaboración que ha venido sosteniendo con investigadores en quimica medicinal de la facultad de química de la unam, se han estado evaluando in vitro diferentes tipos de sustancias que principalmente son derivados del bencimidazol (bzm). Al comparar el efecto de las sustancias experimentales, en todos los grupos mencionados, hemos encontrado que algunas de ellas tienen mayor eficiencia para dañar a los parásitos en comparación con fármacos convencionales como el sulfóxido de albendazol. Luego, dados los resultados y al hacer el análisis de la forma en que las sustancias han dañado a los parásitos, hemos considerado en nuestro grupo de investigación que el principal efecto se podría estar manifestando en alteraciones en la expresión de proteínas del citoesqueleto, por lo cual creemos que este tipo de proteínas podrían ser excelentes blancos farmacológicos y por ello requieren de una adecuada caracterización. El proyecto que se presenta aquí es una continuación de uno anterior financiado denominado "evaluación de cambios inducidos por


estrés químico en la expresión de proteínas del citoesqueleto de taenia solium y taenia crassiceps" (proyecto dgapa in216107), en el que por los resultados obtenidos se comenzó a evaluar si había alteración en proteínas semejantes de otros parásitos distintos. Para llegar a la caracterización de proteínas filamentosas como actina, tubulina y miosina tipo ii muscular hemos estandarizado en el laboratorio diferentes tipos de análisis bioquímicos, inmunoquímicos e inmunohistoquímicos y en la actualidad ya contamos con la habilidad para la obtención de mapas proteómicos en geles bidimensionales de proteínas del citoesqueleto de los parásitos mencionados. Con esta última tecnología ya hemos iniciado la identificación de las proteínas a través de ensayos de inmunoproteómica tanto con el empleo de anticuerpos policlonales como monoclonales comerciales o con algunos preparados en los laboratorios. Esta forma de identificación de las proteínas, dado que son proteínas ubicuas para las que hay mas posibilidades de detectarlas, es una estrategia útil sobre todo para casos, como en los ténidos, en donde no se ha publicado el genoma completo. Lo que hemos obtenido, parte ya ha sido publicado y otra está en proceso, nos ha mostrado que en los distintos parásitos hay expresión diferencial de sus proteínas del citoesqueleto dependiendo de la fase o estadio de desarrollo, existe la presencia de distintas isoformas y, bajo los tratamientos in vitro con sustancias antiparasitarias conocidas, o en fase experimental, hay alteraciones en los patrones de expresión de las proteínas. En algunos casos hemos logrado cotejar que los cambios en la expresión de las proteínas tienen relación con alteraciones de tipo morfológico en los parásitos. En otros casos, dado que sólo hemos logrado tener observaciones microscópicas que sugieren que el efecto de las sustancias evaluadas, aún hay necesidad de continuar con estudios de tipo proteómico que permitan corroborar que las proteínas del citoesqueleto están involucradas en el efecto de tales sustancias. Según los análisis de los efectos, la composición de los derivados influye en su forma de acción en contra de los parásitos, por lo que su diseño tiene que estar asociado al tipo de parásito, así como a las características particulares que presenten sus proteínas del citoesqueleto. Según los proteomas obtenidos en el caso de tratamientos de g. Intestinalis, nos hemos percatado que hay proteínas que aumentan o disminuyen su expresión y su identidad ha sido asegurada mediante análisis por espectrometría de masas. En el presente proyecto buscamos establecer bajo los tratamientos in vitro con sustancias con poder antiparasitario los posibles cambios que se producen la expresión de proteínas del citoesqueleto de los parásitos. Adicionalmente a la caracterización de las proteínas, ya podemos aplicar estrategias computacionales (en colaboración con grupos de visualización científica de la dgsca-unam y de la propia facultad) que permiten la reconstrucción y visualización tridimensional de la estructuración del citoesqueleto de parásitos. En el caso de cisticercos de t. Solium y de t. Crassiceps se han generado imágenes de la forma en que se producen cambios en la estructuración del citoesqueleto debido al efecto de las sustancias que se han venido estudiando. Bajo estas circunstancias, consideramos que tenemos el manejo de suficiente tecnología de vanguardia y conocimiento que nos permiten abordar las evaluaciones de si las proteínas del citoesqueleto son alteradas directa o indirectamente por las sustancias en estudio. Los resultados que sean obtenidos podrían ser utilizados como la base de estrategias de desarrollo o mejoramiento de las sustancias antiparasitarias. Esto se propone porque es bien sabido que cualquier alteración en el citoesqueleto de cualquier organismo, produce cambios importantes en aspectos tales como la contracción muscular, el tráfico vesicular y la secreción/excreción de sustancias o el desarrollo de formas morfológicas específicas, que en el caso de los parásitos son aspectos importantes para éxito de su sobrevivencia y patogenicidad.



Cronoterapia alimenticia en trastornos de desincronización

interna por cambios de horario (jet-lag)

Palabras clave:

OBJETIVO:

Objetivo general: El presente proyecto propone identificar los trastornos circadianos generados por los cambios de horario súbito, síndrome de jet-lag, así como la utilización de la cronoterapia alimenticia y la utilización de dosis fisiológicas de melatonina como alternativa para mejorar las condiciones fisiológicas y terapéuticas asociadas a este fenómeno. Objetivos específicos 1. Caracterizar los ritmo circadianos conductuales, neuronales y metabólicos en un modelo de "jet-lag" en roedores diurnos y nocturnos 2. Determinar si la sincronización por alimento o por melatonina previo al cambio de horario previene la desincronización de ritmos metabólicos, conductuales y de actividad neuronal generada en el jet-lag. 3. Determinar si la sincronización por alimento o por melatonina inmediatamente después del cambio de horario acelera la re-sincronización de de ritmos metabólicos, conductuales y de actividad neuronal.

RESUMEN:

El desarrollo de la vida en un ambiente que presenta cambios cíclicos ha llevado a los organismos a desarrollar diversas estrategias tanto conductuales como fisiológicas para mantener un equilibrio funcional con el medio cambiante. Se sugiere que la repetición ordenada y por lo tanto predecible de los ciclos ambientales, ha sido asimilada por los organismos mediante la creación de programas temporales internos que sincronizan las actividades metabólicas, fisiológicas y conductuales, permitiendo adaptarse y anticiparse al cambio ambiental que van a enfrentar. Sin embargo, cuando se pierde la coherencia entre las fluctuaciones del medio externo y las oscilaciones generadas por el reloj biológico, o mas grave cuando se pierde la relación entre el reloj y el resto del organismo se genera un fenómeno conocido como desincronización interna. Este fenómeno puede ser desencadenado en pacientes expuestos a avances o retrasos del horario, como sucede en los viajes a través de husos horario, de donde surge el fenómeno conocido como "jet-lag". Recientemente han surgido evidencias de que pacientes que padecen el síndrome de jet-lag manifiestan alteraciones de los ritmos circadiano de sueño-vigilia, de secreción hormonal y en sus funciones digestivas. A largo plazo estas alteraciones de ritmos circadianos repercuten en enfermedades metabólicas y cardiovasculares. Por lo anterior es evidente que la intervención directa sobre la re-sincronización de los ritmos biologicos tanto conductuales como fisiológicos, redundarán en la prevención de estas enfermedades.en este proyecto se propone abordar de forma integral problemas de sincronización, ya que se estudiará y analizará al organismo desde el punto de vista conductual, metabólico-energético y cronobiológico. Previamente hemos caracterizado el


poder que tiene el alimento para sincronizar los ritmos circadianos de variables metabólicas, neuronales y conductuales, por lo que ahora se propone aplicar estos conocimientos para abordar uno de los trastornos cada vez más común en la población moderna: la desincronización interna. Para ello se pretende caracterizar de forma detallada, primeramente las alteraciones circadianas que acompañan al síndrome de "jet-lag". Aunque actualmente están descritos algunos de los trastornos circadianos que constituyen este padecimiento (cassone y stephan, 2002) también existe mucha controversia en las medidas terapéuticas que se deben tomar. La originalidad de este estudio se basa en la utilización de los horarios de alimentación restringidos así como la cronoterapia con melatonina, como apoyo coadyuvante a los tratamientos específicos para revertir las alteraciones que se presentan en este padecimiento



Participación de los sistemas pro oxidante y antioxidante en

la nefrotoxicidad por fármacos

Palabras clave:

OBJETIVO:

Caracterizar los sistemas pro-oxidante y antioxidante en la insuficiencia renal aguda por ciclofosfamida, metotrexato y diatrizoato. Caracterizar la participación de antioxidantes exógenos en la prevención del daño renal inducido por ciclofosfamida, metotrexato y diatrizoato. Evaluar la participación de la ho-1 y la poli (adp-ribosa) polimerasa en la insuficiencia renal aguda por ciclofosfamida, metotrexato y diatrizoato. Caracterizar la toxicidad por ciclofosfamida, metotrexato y diatrizoato en células de túbulo proximal (nrk-52e) y la participación del estrés oxidativo. Caracterizar el efecto de antioxidantes exógenos en la actividad anticancerígena de la ciclofosfamida y el metotrexato.

RESUMEN:

La nefrotoxicidad por fármacos es un efecto secundario de algunos fármacos que complican el estado de un paciente con una enfermedad crónica (cardiopatía, diabetes) o grave (cáncer). Existen estudios que sugieren que el estrés oxidativo se encuentra involucrado en la aparición del daño renal por los fármacos ciclofosfamida, metotrexato y diatrizoato. La ciclofosfamida y el metotrexato son fármacos antineoplásicos y el diatrizoato es un medio de contraste radiológico. Los estudios radiológicos son frecuentes en pacientes con enfermedades crónicas como diabetes y enfermedad cardiaca. Estos fármacos se encuentran en el cuadro básico de medicamentos y por tanto son muy utilizados en nuestro país. Por estos motivos el propósito de este proyecto es caracterizar parte de los mecanismos de daño y posibles formas de evitar o disminuir el daño renal. Se pretende caracterizar los sistemas pro-oxidante y antioxidante, así como el estrés oxidativo. Se evaluarán dos antioxidantes exógenos para tratar de disminuir o evitar el daño renal. Anteriormente se ha demostrado que los antioxidantes exógenos, extracto de ajo envejecido y jugo de mangostán tienen propiedades antioxidantes que evitan el daño. Asi mismo, se evaluará la posibilidad de que los antioxidantes exógenos aumenten la activdad antineoplásica de la ciclofosfamida y el metotrexato; o al menos no la inhiban dicha actividad. Por otra parte se evaluará la posible protección de confiere la ho-1 al preinducirla y/o la protección que genere la inhibición de la poli adp-ribosa polimerasa. También se realizarán estudios en células de tubulo proximal de riñón de rata (nrk-52e) para determinar el daño específico es dicha sección del riñón. Este tipo de células es muy importante porque se encarga de la reabsorción de casi todos los nutrientes del filtrado glomerular y es la sección del riñón que mas es afectada por nefrotoxinas, generando insuficiencia renal aguda. En este proyecto participan dos académicos: la dra. Barrera (responsable) quien tiene experiencia en modelos de nefrotoxicidad en ratas y estrés oxidativo; el dr. Molina tiene y ha trabajado con células de cáncer; la alumna de maestría, qfb gabriela carranza, esta realizando sus estudios de maestría con un modelo de nefrotoxicidad por medio de contraste; las alumnas de licenciatura rocio álvarez, mariel becerril, maricela garcía y tania palacios realizaron una estancia profesional en el laboratorio de la dra. Barrera y de esos resultados se derivaron sus trabajos de tesis que se


encuentran realizando; la alumna de licenciatura claudia zendejas realizó su servicio social en el laboratorio de la dra. Barrera, actualmente realizará una estancia profesional y su tesis de licenciatura.


Ciencias de la vida


Análisis de la participación de células nkt y cebadas en la

regulación de la inflamación y la susceptibilidad a la leishmaniasis

Palabras clave:

Infecciones/leishmania mexicana/mecanismos citotóxicos/ OBJETIVO:

Objetivo general: Analizar moléculas, células y mecanismos que regulan la inflamación temprana y la actividad citotóxica y estudiar su asociación con la susceptibilidad a la leishmaniasis. Objetivos específicos: 1.- separar y lisar glándulas salivales de lutzomyia olmeca. 2.- analizar la degranulación, la producción de citocinas proinflamatorias (il-1ß, il-17 y tnf-a) y quimiocinas (cxcl8, ltb4) de células cebadas de ratones (balb/c, c57bl/6 y c3h/hj) estimuladas con lpg y con distintas dosis de extractos de glándulas salivales. 3.- infectar ratones (susceptibles balb/c y resistentes c57bl/6 y c3h/hj) con promastigotes de leishmania mexicana en presencia y ausencia de extractos salivales y estudiar el infiltrado inflamatorio y la carga parasitaria en las lesiones en distintas etapas de la infección. 4.- analizar la capacidad citotóxica y la producción de citocinas proinflamatorias de células nkt estimuladas con lpg o con células dendríticas pulsadas con lpg o ?-galcer, sobre macrofagos autologos infectados con leishmania mexicana. 5.- estudiar si la activación de tlr2 regula la producción de citocinas y la exocitosis en células nkt y analizar la vía de transducción de señales que participa. 6.- realizar una análisis inmunohistoquímico del infiltrado de células inflamatorias (cebadas, leucocitos polimorfonucleares, eosinófilos), de células citotóxicas (nk, nkt, cd8), así como de las citocinas proinflamatorias (il-1ß, il-17 y tnf-a) en tejidos congelados de pacientes con lcl y lcd y en lesiones de ratones susceptibles y resistentes a la leishmanisis. 7.- continuar con el análisis de polimorfismos en mediadores de la inflamación en muestras de sangre de pacientes con lcl y lcd y asociar los polimorfismos con la susceptibilidad a la leishmaniasis.

RESUMEN:

La leishmaniasis es causada por parásito protozoario del género leishmania, que infecta a humanos y a otras especies de mamíferos. En méxico la especie más común es leishmania mexicana y el vector comprobado de transmitirla es el flebótomino lutzomyia olmeca (1,2). Durante la picadura de la mosca transmisora el parásito es inoculado en la dermis del hospedero junto con componentes salivales del flebótomo, causando leishmaniasis cutánea de distinta severidad: la leishmaniasis cutánea localizada (lcl) y la leishmaniasis cutánea difusa (lcd. Aun se sabe poco sobre los factores que participan en la susceptibilidad de pacientes con lcd para padecer la forma progresiva del padecimiento (3). Nuestro grupo de trabajo se ha abocado a estudiar la respuesta inmune innata en la leishmaniasis y demostramos por primera vez que lpg (lipofosfoglicano) de leishmania activa


receptores tlr2 en células nk (4).en el proyecto anterior (in221806-3) encontramos que la activación de tlr2 en células nk de pacientes con lcl induce la producción de citocinas (ifn-gama y tnf-alfa), lleva a sobre-expresión de tlr2 e induce actividad citotóxica sobre macrófagos autólogos infectados con leishmania. En contraste, las células nk de pacientes con lcd no responden al estímulo de tlr2 y muestran inhibición de su respuesta citotóxica, uno de los mecanismos leishmanicidas más importantes (manuscrito en preparación). Buscamos si la distinta susceptibilidad a la leishmaniasis entre ambos grupos de pacientes radica en variabilidad genética relacionada con tlr2 y citocinas pro-inflamatorias. Encontramos que polimorfismos en nucleótidos (snps) de la citocina pro-inflamatoria il-1beta representan un factor de riesgo para leishmaniasis. Con esta información iniciamos el análisis de las características de la respuesta inflamatoria en modelos murinos de leishmaniasis de distinta susceptibilidad y encontramos que la susceptibilidad a la leishmaniasis se asociaba con una intensa inflamación temprana (6 horas) inducida por células cebadas (5)que se asociada con un infiltrado masivo de leucocitos polimorfonucleares (pmn), que han sido descritos como células facilitadoras de la infección por su capacidad de transportar al parásito. En resumen, los resultados del proyecto anterior sugieren dos factores de riesgo para la leishmaniasis: 1) inflamación temprana mediada por células cebadas y 2) inhibición de mecanismos citotóxicos sobre macrófagos infectados con leishmania. En el presente proyecto planteamos continuar explorando los mecanismos inflamatorios y citotóxicos asociados con la susceptibilidad a la leishmaniasis. Queremos continuar con el estudio de las moléculas y mecanismos que participan en la inflamación y en la actividad citotóxica en leishmaniasis con un análisis de cebadas y células nkt y su repercusión en la leishmaniasis. En el presente proyecto proponemos analizar los siguientes puntos: 1.- queremos analizar moléculas que pueden activar a células cebadas durante la infección por leishmania, tanto endógenas como exógenas. Entre las exógenas se encuentran componentes salivales de la mosca transmisora (lutzomyia), que contiene componentes farmacológicamente activos, como el maxadilan, un potente vasodilatador que facilita la hemofagia. Aun no se ha estudiado su efecto sobre células cebadas. Otra molécula moduladora de células cebadas es lpg de leishmania a través de tlr2, sin embargo aun se desconoce su participación en la desgranulación. Entre los factores endógenos se encuentra il-33, liberada por queratinocitos activados, que induce la producción de il-17 por células cebadas, una molécula fuertemente quimiotáctica para pmn. 2.- analizaremos si estas moléculas inducen la liberación de citocinas proinflamatorias (il-1beta, tnf-alfa, il-17), quimiocinas (ltb4 y cxcl8)asi como la degranulación con liberación de mediadores vasoactivos preformados (histamina y tnf-alfa) en las células cebadas y si esto ocurre a través de tlr2. Dado que histamina, cxcl4, ltb4 e il-17 ejercen un efecto quimiotáctico importante sobre los pmn, será interesante analizar la participación de los distintos activadores de células cebadas en su producción. 3.- en modelos de ratones con distinta susceptibilidad a la infección por leishmania mexicana (balb/c, c57bl/6 y c3h/hj) estudiaremos si los componentes salivales de lutzomia modifican el curso de la infección por leishmania, analizaremos la carga parasitaria así como las características del infiltrado inflamatorio en las lesiones a distintos tiempos de la infección. 3.- otra de las células que posiblemente participe de manera crucial en la respuesta innata inflamatoria es la célula nkt, productora de citocinas proinflamatorias como tnf-alfa e il-17, es una célula citotóxica y adicionalmente migra a la dermis durante infecciones. Las células nkt se caracterizan por tener la capacidad de reconocer glicolípidos mediante dos receptores distintos: puede reconocerlos por su tcr invariante cuando son presentados a través de moléculas cd1d por células dentríticas o bién los puede reconocer mediante tlr2. Esto posiciona a las células nkt en una posición privilegiada para reconocer patrones moleculares como lpg de leishmania, permitiéndole desempeñar un papel dual en la leishmaniasis: a pueden favorecer la inflamación temprana mediante la produción de factores como tnf-alfa e il-17 induciendo la llegada de pmn que favorecen la progresión de la enfremedad,


b)pueden mediar protección en lesihmaniasis através de su actividad citotóxica. En el presente proyecto se analizará la capacidad citotóxica de células nkt sobre macrófagos autólogos infectados con leishmania mexicana. Analizaremos los receptores que participan así como las moléculas efectoras (granzimas y perforinas o fasl). 4.- analizaremos las características de las citocinas liberadas por células nktcuando son estimuladas con lpg. Analizaremos las vías de señalización que participan en la activación de la célula. 5.- estudiaremos si tlr2 regula la exocitsis y en las citocinas cuando las células nkt son estimuladas con lpg o con células dendríticas pulsadas con lpg o con alfa-galactosilceramida. 6.- estudiaremos las células del infiltrado inflamatorio (células cebadas, células nkt, pmn) así como las citocinas proinflamatorias en las lesiones de pacientes con lcl y lcd así como en ratones susceptibles y resistentes a la leshmaniasis. 7.- continuaremos con el análisis de polimorfismos en mediadores de la inflamación en muestras de sangre de pacientes con lcl y lcd, así como buscar una asociación entre los polimorfismos y la susceptibilidad a la leishmanaisis. Tomando en cuenta los datos anteriores, en el presente proyecto se pretende definir la importancia de la inflamación temprana en la patogenia de la leishmaniasis mediante el análisis de: 1) los factores activadores de la célula cebada, con un estudio de los mediadores inflamatorios que libera la célula cebada durante las primeras etapas de la infección con leishmania mexicana; 2) la participación de las células nkt en la inflamación mediante un estudio de sus receptores, de sus vías de activación, de sus mecanismos efectores y de su distribución microanatómica en las lesiones por leishmania, lo cual permitirá entender su papel como mediadora de la inflamación y célula citotóxica durante los eventos tempranos de la infección, que posiblemente definen la evolución de la leishmaniasis.


Medicina


Canales catiónicos tipo hcn en células epiteliales

Palabras clave: Canales catiónicos/nucleóticos cíclicos/células epiteliales/

OBJETIVO:

El objetivo más importante de este proyecto es demostrar la existencia de un canal hcn epitelial que desarrolla funciones propias de los epitelios. Si, como hemos propuesto, en las células de la thl y en los hepatocitos se expresan (a nivel mrna y a nivel proteína) los mismos genes hcn que en las células del imcd, y también presentan una corriente similar a ivti, avanzaríamos en su identificación como una corriente hcn. Si al bloquear la síntesis de una o varias proteínas alfa-hcn se bloquea la expresión de la corriente ivti, se habrá demostrado, en forma más que razonable, que ivti es una corriente hcn (7, 29, 38). Si la secuenciación de los hcn-mrna completos muestra la expresión de una o más variantes, por empalme alternativo, de los mrna expresados en células excitables (31), es posible que esto explique la escasa sensibilidad de ivti a cs+ y su bloqueo por cd2+ extracelulares. También es posible que esta característica farmacológica pueda derivar de modificaciones postraduccionales, tal como la n-linked glycosylation (22) que podría explicar que hayamos encontrado en médula interna renal 2 proteínas hcn2 con pesos moleculares cercanos a 120 y 90 kda (5) o, aún más interesante, la farmacología de ivti pudiera depender de la expresión de un gen hcn hasta ahora desconocido (¿existe un hcn5?, detectamos una proteína que reacciona con un anticuerpo hcn3, pero no detectamos transcritos con secuencias compatibles con hcn3). El segundo aspecto del problema, es encontrar el significado funcional de la expresión de estos canales hcn en células epiteliales. Por la característica no excitable de estas células, una función de ivti como corriente marcapaso parece ser poco probable. Nuestros resultados experimentales sugieren que los canales ivti pueden participar en el mantenimiento del equilibrio osmótico entre el imcd y el intersticio durante la antidiuresis. Esta suposición es reforzada por el efecto estimulatorio del camp sobre los canales ivti. Esta hipótesis obtendría un mejor fundamento si demostráramos que la hormona antidiurética (avp) ejerce un efecto estimulatorio, mediado por camp, sobre ivti, sobre todo si éste se potenciara en presencia de una concentración hipertónica de na+ extracelular. Objetivos particulares

Evidenciar la presencia de proteínas hcn1-4 en imcd, thl y en hepatocitos en cultivo primario e "in situ".

Obtener las secuencias completas de los mrna que codifican las proteínas hcn detectadas.

Determinar la naturaleza molecular de los canales ivti, demostrando la participación de las distintas proteínas alfa-hcn en la conformación de los canales ivti, mediante la inhibición selectiva de la síntesis de estas proteínas con sirnas.

Explorar la posible expresión de una corriente similar a ivti en células de los segmentos delgados del asa de henle y en hepatocitos en cultivo primario.

Estudiar la regulación de los canales ivti por nucleótidos cíclicos y por agentes que promueven la formación de éstos en las células del imcd.

Determinar la permeabilidad relativa de los canales ivti a cationes mono y divalentes.


Estudiar la regulación de estos canales en términos de su dependencia de la concentración extracelular de na+.

RESUMEN:

Las células del conducto colector de la médula interna (imcd) renal, en cultivo primario, exhiben una corriente entrante (que llamamos ivti), catiónica no selectiva, cuya característica más sobresaliente es la de activarse a potenciales hiperpolarizantes, en forma dependiente de tiempo, con una cinética lenta de activación. La activación dependiente de voltaje de ivti inicia a un potencial cercano a -40 mv, pero en condiciones especiales puede iniciar a un potencial tan despolarizado como 0 mv. Ivti es sensible a regulación por camp y puede ser bloqueda por cd2+ pero no por cs+ extracelulares. Por esto, ivti exhibe una gran semejanza, pero también importantes diferencias, con las corrientes ih e if que fluyen a través de canales de tipo hcn. Las células del imcd también expresan transcritos de genes hcn (1, 2 y 4), y proteínas compatibles con la presencia de la subunidad alfa de canales hcn2 (y al parecer también alfa hcn1, 3 y 4), lo que permite suponer que ivti fluye por canales hcn. Además, la proteína alfa hcn2 parece estar también en la porción delgada del asa de henle (thl). Por otra parte, en el hígado parecen expresarse los mismos transcritos hcn que en la médula interna, por lo que pensamos que los hepatocitos expresan canales hcn similares a los de ivti. Este proyecto pretende demostrar la existencia de una variante epitelial de canales hcn, aun cuando actualmente, en mamíferos, estos canales sólo han sido estudiados en células excitables. Por sus características electrofisiológicas y farmacológicas, ivti es una corriente diferente de ih e if, por lo que cabe esperar que las subunidades alfa que conforman los canales hcn por los que fluye ivti, presenten substanciales diferencias en comparación con sus homólogas de células excitables. Igualmente, cabe esperar que el papel fisiológico de los canales ivti sea diferente del atribuido a los canales hcn en células excitables. A fin de estudiar esta propuesta, se determinará la identidad molecular de los canales ivti y se estudiará su posible papel fisiológico. La identificación de la composición molecular de los canales ivti se iniciará mediante la identificación de las subunidades alfa-hcn específicas que se expresen en las membranas plasmáticas de imcd, thl y hepatocitos, y mediante la inmunoprecipitación de las subunidades alfa identificadas. Para confirmar la presencia de canales hcn y las subunidades que los conforman, las células serán marcadas con anticuerpos específicos para cada una de las subunidades alfa hcn y la inmunoreactividad será determinada mediante microscopía confocal. Adicionalmente, se hará la inmunolocalización de las subunidades alfa?en extractos enriquecidos en proteínas de membrana que serán separados en geles de dos dimensiones. Se determinará la identidad de aminoácidos de las proteínas hcn localizadas por maldi-tof, así como la secuencia de los mrna correspondientes, que se compararán con las de las subunidades alfa hcn presentes en células excitables, con el propósito de establecer sus similitudes y diferencias. A fin de determinar que una proteína alfa-hcn es constituyente de los canales ivti, se bloqueará la expresión de esta proteína en los cultivos primarios, transfectando con un sirna, y se estudiarán las consecuencias de esta transfección sobre la presencia de la proteína y sobre las características electrofisiológicas de ivti. Para estudiar el papel fisiológico de los canales ivti, se determinará su localización apical o basolateral, y se explorarán algunos de sus posibles mecanismos de regulación, en los que se abarcarán mecanismos comunes a los canales hcn (regulación por nucleótidos cíclicos y hormonas con estos segundos mensajeros) y otros que parecen regular a los canales ivti.


Medicina


Canales cationicos activados por hiperpolarización y

regulados por nucleótidos cíclicos (canales hcn) en células epiteliales

Palabras clave:

Canales catiónicos/nucleóticos cíclicos/células epiteliales/ OBJETIVO:

Demostrar que la corriente ivti es mediada por canales hcn. Objetivos particulares

Evidenciar la presencia de proteínas hcn1-4 en imcd, thl y en hepatocitos en cultivo primario e (in situ).

Determinar la naturaleza molecular de los canales ivti, demostrando la participación de las distintas proteínas alfa-hcn en la conformación de los canales ivti, mediante la inhibición selectiva de la síntesis de estas proteínas con sirnas.

Explorar la posible expresión de una corriente similar a ivti en células de los segmentos delgados del asa de henle y en hepatocitos en cultivo primario.

Estudiar la regulación de los canales ivti por nucleótidos cíclicos y por agentes que promueven la formación de éstos en las células del imcd.

Determinar la permeabilidad relativa de los canales ivti a cationes mono y divalentes. Estudiar la regulación de estos canales en términos de su dependencia de la

concentración extracelular de na+.

RESUMEN:

Las células del imcd, en cultivo primario, exhiben una corriente entrante (ivti), catiónica no selectiva, cuya característica más sobresaliente es la de activarse a potenciales hiperpolarizantes, en forma dependiente de tiempo, con una cinética lenta de activación. La activación dependiente de voltaje de ivti inicia a un potencial cercano a -40 mv, pero en condiciones especiales puede iniciar a un potencial tan despolarizado como 0 mv. Ivti es sensible a regulación por camp y puede ser bloqueda por cd2+ pero no por cs+ extracelulares. Por esto, ivti exhibe una gran semejanza, pero también importantes diferencias, con las corrientes ih e if que fluyen a través de canales de tipo hcn. Las células del imcd también expresan transcritos de genes hcn (1, 2 y 4), y proteínas compatibles con la presencia de la subunidad alfa de canales hcn2 (y al parecer también alfa hcn1, 3 y 4), lo que permite suponer que ivti fluye por canales hcn. Además, la proteína alfa-hcn2 parece estar también en la thl. Por otra parte, en el hígado parecen expresarse los mismos transcritos hcn que en la médula interna, por lo que pensamos que los hepatocitos expresan canales hcn similares a los de ivti. Este proyecto pretende demostrar la existencia de una variante epitelial de canales hcn, aun cuando actualmente, en mamíferos, estos canales sólo han sido estudiados en células excitables. Por sus características electrofisiológicas y farmacológicas, ivti es una corriente diferente de ih e if, por lo que cabe esperar que las subunidades alfa que conforman los canales hcn por los que fluye ivti, presenten substanciales diferencias en comparación con sus homólogas de células excitables. Igualmente, cabe esperar que el papel fisiológico de los canales ivti sea diferente del atribuido a los canales hcn en células excitables. A fin de estudiar esta


propuesta, se determinará la identidad molecular de los canales ivti y se estudiará su posible papel fisiológico. La identificación de la composición molecular de los canales ivti se iniciará mediante la identificación de las subunidades alfa-hcn específicas que se expresen en las membranas plasmáticas de imcd, thl y hepatocitos, y mediante la inmunoprecipitación de las subunidades alfa identificadas. Para confirmar la presencia de canales hcn y las subunidades que los conforman, las células serán marcadas con anticuerpos específicos para cada una de las subunidades alfa y serán analizadas por citometría de flujo. Adicionalmente, se hará la inmunolocalización de las subunidades alfa en extractos enriquecidos en proteínas de membrana que serán separados en geles de dos dimensiones. Se determinará la identidad de aminoácidos de las proteínas hcn localizadas por maldi-tof, así como la secuencia de los mrna correspondientes, que se compararán con las de las subunidades alfa-hcn presentes en células excitables, para establecer sus similitudes y diferencias. A fin de determinar que una proteína alfa-hcn es constituyente de los canales ivti, se bloqueará la expresión de esta proteína en los cultivos primarios, transfectando con un sirna, y se estudiarán las consecuencias de esta transfección sobre la expresión de la proteína y sobre las características electrofisiológicas de ivti. Para estudiar el papel fisiológico de los canales ivti, se determinará su localización apical o basolateral, y se explorarán algunos de sus posibles mecanismos de regulación, en los que se abarcarán mecanismos comunes a los canales hcn (regulación por nucleótidos cíclicos y hormonas con estos segundos mensajeros) y otros que parecen regular a los canales ivti.


Parasitología


Extracción y evaluación de un antígeno soluble para el

diagnóstico de la infección por trypanosoma cruzi

Palabras clave: Trypanosoma cruzi/anticuerpos/leishmania mexicana/la

enfermedad de chagas/ OBJETIVO:

Objetivo general Evaluar un extracto antigénico soluble obtenido a partir de tres cepas de trypanosoma cruzi de procedencia mexicana, para la detección de anticuerpos anti - t. Cruzi con técnica de elisa indirecta con fines diagnósticos. Objetivos particulares

Obtener tres extractos antigénicos de aislados (previamente caracterizados), provenientes de diferentes regiones y de los tres principales transmisores del país.

Caracterizar inmunoquímicamente la mezcla de los extractos antigénicos obtenidos. Identificar las fracciones proteicas de los antígenos por peso molecular (sds-page). Integrar un panel de sueros humanos reactivos y no reactivos a t. Cruzi y l. Mexicana. Evaluar la reactividad inmune de las fracciones proteicas con anticuerpos anti-t. Cruzi y

normales (western-blot). Evaluar la reactividad del extracto antigénico hacia páneles de sueros de individuos con

anticuerpos anti-t. Cruzi, normales y anti- leishmania mexicana (elisa indirecta) Comparar y analizar la reactividad mostrada en la técnica de elisa con antígenos de un

centro de referencia de la ops/oms Determinar sensibilidad, especificidad y valores predictivos de la técnica de elisa

indirecta.

RESUMEN:

Extracción y evaluación de un antígeno soluble para el diagnóstico de la infección por trypanosoma cruzi. La enfermedad de chagas, causada por el protozoario trypanosoma cruzi afecta a millones de personas de américa latina; está asociada directamente con factores socioeconómicos, particularmente con individuos de escasos recursos y que viven en condiciones higiénico-sanitarias deficientes como es el caso de las áreas rurales de méxico en donde se ha encontrado al transmisor en todos los estados; aún cuando es considerado un problema en salud pública, a la fecha, no existen vacunas ni quimioterapias eficientes, por lo que es de suma importancia tanto la prevención como la detección de casos en etapas tempranas de la infección. Los principales mecanismos de transmisión de la infección por t. Cruzi son el natural o vectorial y la transfusión de sangre o de los componentes sanguíneos. Normativamente, está contemplado el tamizaje en bancos de sangre, pero no es de observancia obligatoria debido a los altos costos de los reactivos comerciales necesarios. Por lo anterior, es necesario desarrollar e implementar reactivos, técnicas y procedimientos nacionales que sean eficaces, confiables y de bajo costo.


El extracto antigénico de este trabajo se obtendrá a partir de una mezcla de tres cepas de procedencia nacional obtenidas de transmisores diferentes y de regiones geográficas distintas. El extracto antigénico será caracterizado inmunoquímicamente, mediante determinación de proteínas totales, identificación de fracciones proteicas por peso molecular (sds-page) y evaluación de la reactividad inmune con anticuerpos anti-t. Cruzi y normales (western-blot). Se estandarizará el sistema para su empleo con la técnica de elisa indirecta en microplaca con 170 sueros con reactividades comprobadas previamente con 2 pruebas serológicas concordantes (elisa e ifi) (85 reactivos y 85 no reactivos) los cuales forman parte de la seroteca del laboratorio de biología de parásitos de la facultad de medicina de la unam; también se determinará la reactividad del extracto antigénico hacia sueros con anticuerpos anti-leishmania mexicana. Se analizarán los resultados estadísticamente para determinar sensibilidad, especificidad y valores predictivos positivo y negativo de la técnica de elisa indirecta contra el antígeno de rutina empleado en nuestro laboratorio y a su vez ambos serán evaluados por un centro de referencia de la ops/oms.


Bioquímica


Análisis funcional del sitio activo de la lipasa de bacillus

pumilus

Palabras clave: Bacillus pumilus/lipasa/

OBJETIVO:

General Analizar la función del sitio activo de la bpla utilizando herramientas cinéticas y moleculares. Particulares Sugerir por métodos computacionales cuáles son los residuos involucrados en la entrada y liberación de sustratos en el sitio activo y proponer mutaciones pertinentes que mejoren la liberación del segundo producto de la reacción. Estudiar la cinética de hidrólisis de ésteres cromogénicos en estado pre-estacionario de la bpla y algunas mutantes seleccionadas. Determinar las constantes cinéticas y de equilibrio de las diferentes enzimas. Estudiar la enantioselectividad de las enzimas silvestre y mutantes seleccionadas en medio acuoso a través de la hidrólisis del 1-feniletil acetato racémico. Inmovilizar a las enzimas en materiales mesoporosos para utilizarlas en medios no acuosos. Estudiar la enantioselectividad en el sentido biosintético de las enzimas silvestre y mutantes inmovilizadas a través de la síntesis de ésteres de ácido hexanoico y el racemato de 1-feniletil alcohol. Estudiar el efecto de las mutaciones sobre la promiscuidad a través de la hidrólisis de 4-nitrofenil-bencil carbonato con todas las mutantes y la enzima silvestre como control. Estudiar la promiscuidad en el sentido biosintético de las enzimas silvestre y mutantes inmovilizadas a través de la alcoholisis de un carbonato orgánico, el dimetil carbonato, con alcohol bencílico.

RESUMEN:

Las lipasas poseen una enorme importancia económica debido a que, junto con las proteasas, son las enzimas más ampliamente utilizadas a nivel industrial y en investigación. La capacidad de estas enzimas de realizar distintas reacciones en medios acuosos y no acuosos ha hecho posible su utilización en industrias diversas como la de los lácteos, la farmacéutica, la peletera y la de los detergentes entre otras. Como consecuencia natural de un proyecto anterior apoyado por papiit, contamos con la lipasa recombinante de bacillus pumilus gma1 así como algunas mutantes con actividad catalítica y estabilidades mejoradas. Hemos profundizado en el estudio de sus propiedades catalíticas, tanto en medio acuoso como en medio orgánico, auxiliados por técnicas de inmovilización y hemos estudiado la cinética de la hidrólisis de carbonatos orgánicos por esta enzima. Lla lipasa de b. Pumilus gma1 (bpla) pertenece a la subfamilia i.4 de las lipasas. Estas son proteínas pequeñas de sólo 181 residuos de aminoácidos. Su tamaño pequeño las convierte en un excelente modelo para estudiar la relación entre la estructura y la función. En este proyecto nos proponemos utilizar el cambio en el la velocidad de los pasos cinéticos de la reacción como herramienta para predecir el efecto de algunas mutaciones en la capacidad


hidrolítica y sintética de la enzima. Las mutaciones en la vecindad del sitio activo, y otras fuera de él, pueden modificar la velocidad del paso limitante del mecanismo cinético, al igual que la estabilidad, la enantioselectividad, y la promiscuidad de la enzima. Nos planteamos construir varias mutantes bien seleccionadas y estudiar su cinética en estado pre-estacionario en el sentido lítico de la reacción; buscaremos una correlación entre los datos cinéticos obtenidos y las propiedades catalíticas en el sentido sintético en medios no acuosos. El conocimiento generado nos ayudará a entender mejor a esta familia de enzimas como catalizadores y podría utilizarse con fines de aplicación industrial de estas proteínas en las muchas industrias que las utilizan.

Lineas y Proyectos

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