Casa m. sbiena al tiempo

n ¡ve rsi dad etropolitana lztapalapa

J MEZA LOEZA LIDIA ITZEL

Matricula Aicenciatura /División

Unidad

Trimestre lectivo Horas a la semana

0 Teléfono

93329196 INGENIERIA BIOQU~MICA INDUSTRIAL CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD IZTAPALAPA 685-61 -95 97-0 20 HORAS

/Título del trabajo METANOGÉNESIS A PARTIR DE ACETAMIDA POR BICULTIVO DE

Baclllus sphaericus y Mefhanosarcina rnarei

JAsesor: M. EN c. FLORINA RAM~REZ VIVES PROFESOR TITULAR DETIEMPO COMPLETO

Fecha de inicio: 9 /Fecha de terminación:

26 de febrero de 1997 26 de agosto de 1997 c 1

Lidia ltzel Meza Geza

I

Casa m sbiena al IiernDo

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

Mexico, D.F. a 28 octubre de 1997

Dr. José Luis Aredondo Figueroa Director División de Ciencias Biológicas y de la Salud.

Presente

Por medio de la presente deseo hacer constar que Lidia ltzel Meza Loeza con matricula 93329196 de la carero de Ingeniería Bioquimica Industrial concluyó satisfactoriamente su Servicio Social con el proyecto titulado:

“Metanogénesis a partir de acetamida por bicultivo de Bacillus sphaericus y Mefhanosarcina maze?’

y realizado en el Laboratorio de Microbiología Ambiental del Departamento de Biotecnología de esta Unidad.

cj

Atentamente

Profesor Titular de Tiempo Completo

UNIDAD IZTAPALAPA AV. Michoadn y La Purisima, Col. Vicentina. 09340 México, D.F. ~e i . : 724-4600 TEEFAX: (5) 612 0885

México, D.F. a 28 octubre de 1997

Dr. Jose Luis Arredondo Figueroa Director División de Ciencias Biológicas y de la Salud.

Presente

Por medio de la presente me permito informarle la terminación de mi Servicio Social, el cual se llevó a cabo en el Laboratorio de Microbiología Ambiental del Departamento de Biotecnología de la Univenidad Autónoma Metropolitana Iztapalapa.

“Metanogénesis a partir de acetamida por bicultivo de Bacillus sphaencus y Methanosarcha mazei”

c El trabajo realizado llevó por título:

Y fue asesorado por la M. en C. Florina Ramírez Vives, profesor titular de tiempo completo en el Departamento de Biotecnología de esta división.

Atentamente

Lidia ltzel Meza Loeza (933291 96)

Mexico, D.F. a 28 de octubre de 1997

Dr. Jose Luis Arredondo Figueroa Director División de Ciencias Biológicas y de la Salud.

Presente

InSIJ1 Me dirijo a usted con el motivo de justificar la entrega del reporte final de

Servicio Social después de la fecha señalada, esto se debió a que mi trabajo de investigación terminó en el periodo vocacional de verano. Dada esta situación debí esperar el comienzo del trimestre en curso para poder concluir los experimentos pendientes y discutir los resultados del trabajo con mi asesor de Servicio Social la M. en C. Flonna RarnÍrez Vives, y asi poder terminar el presente reporte.

Atentamente

Lidia ltzel Meza Loeza (933291 96)

La acetamida es un compuesto que tiene PM de 59.07, p.f. de 82T,

cristalina y sólido incoloro en estado puro.

La acetamida es utilizada como solvente en procesos industriales como en la

industria textil, farmacéutica y de pinturas, por lo cual forma parte de las descargas

residuales de dichas industrias (Guyot y col. 1994).

Se ha observado que la acetamida administrada oralmente a ratas forma

tumores malignos en el higado y debido a la liberación de amonio también es causa

de la desnaturalización de las proteínas (Kirt-Otmer,1978)

La acetamida tiene un3 estructum semejante a la del acetato, el cual es un

intermediario en el proceso de digestión anaerobia, por lo que se han realizado

diversos estudios para degradar anaerobicamente la acetamida (Ramirez, 1992)

Por otro lado se ha estudiado a bacterias anaerobias y aerobias que utilizan la

acetamida, y se ha visto que pueden coexistir para llevar a cabo la degradación de

dicho compuesto.(Raniírez, 1992, 1993 y 1995).

La acetamida puede ser tratada por digestión anaerobia, este es un proceso

microbiono aerobio complejo de conversión de la materia orgánica en acetato.

dióxido de carbono, hidrógeno y metano.

La formación de metano y bióxido de carbono corresponde a la Última etapa

de una serie de reacciones por los cuales los compuestos orgánicos son degradados.

El metano corresponde a la forma más reducida y el bióxido de carbono a la mas

oxidada del carbono.

La biometanización puede ocurrir en ambientes psicrófilos (10 -1 5 "C), mesófilos

(30-40°C) y termófilos (mas de 45°C).

El hombre ha utilizado este fenómeno natural de biometanización para su

propio beneficio, tanto para producción de biogas con fines energéticos como la

descomposición 'y tratamiento de sus desechos sólidos y líquidos.

Las especies bacterianas implicadcs en el proceso de la digestión anaerobia de

la materia orgánica, pueden ser diferentes dependiendo de las condiciones

fiscoquímicas como tempera!ura, pH, presión osmótica y la composición del sustrato.

La producción de meíano en los ecosistemas anaerobias es descrito como un

proceso de trss etapas: la hidrólisis y acidogénesis, acetogenesis y la melanogenesis.

La primera etapa consiste en la hidrólisis y acidogénesis de los compuestos de

alto peso molecular ( proíeínas, lipidos y carbohidraios ) a unidades químicas mas

simples como azúcares, aminojcidcs, alcoholes, iiidrogeno y bióxido de carbono. Esta

etapa se realiza por microorganismos diversos [bacterias y hongos), anaerobios o

facultativos.

La segunda etapa del bioproceso es la occtogenesis que es la transformación

de los productos de la primera etapa en acetoio, hidrógeno y bióxido de carbono. En

esta etapa pueden intervenir tres tipos de microorganismos: bacterias aceloghicas

productoras de hidrógeno, bacterias sulfato-reductoras y bacterias

homoaceiogenicas.

En la tercera etapa que es la metanogénesis se lleva a cabo la producción d e

metano a partir d e acetato, hidrógeno y bióxiodo de carbono.

Diaestión anaerobia

[MATERIA ORGÁNICA I

BACTERIAS FORMADORAS DE ÁCIDO

I (DANOL. PROPIONAIO, BUTIRAIO. ETC.)

SO4 =

I BACTERIAS ACETOG~NICAS BACTERIAS SULFATOREDUCTORAS -

‘1 BACTERIAS HOMOACETOG~NICAS

rl

-$ H2S

H z + CO? I

ACETATO I

I METANdGENAS ACETOCÁSTICAS I e c o ? METANOGEN AS HlDROGENOF¡LlCAS

Metanooénesis

La metanogénesis ocurre en ecosistemas muy diversos lales como pantanos,

sedimentos marinos o lacusires; se requieren tres condiciones básicas para tener un

proceso adecuado: anaerobiosis estrktas. condiciones reductoras rigurosas y ausencia

de aceptores minerales finales que favorezcan otras vías e n competición con la

metünogénesis.

La mayoría de las bacterias metanógenas emplean el COZ como su aceptor

de electrones terminal en la respiración anaerobia, convirtiéndolo en metano: el

donador de electrones utilizado en este proceso es generalmente el hidrógeno, Hz. La

reacción general de la metanogénesis en esta vía es de la manera siguiente:

4H2 + COZ -----+ CHI + 2Hz0 A Go' =-32 kcal

lo que demuestra que la reducción del COZ al metano es un proceso de 8 electrones

(4 moléculas de Hz). Además del COZ, unas pocas sustancias adicionales pueden ser

convertidas en metano, incluyendo el meianol, CH30H; el formiato, HCOO- : el

metilmercaptano, CH3SH: el acetato, CHLOO-: y l as metilaminas.

La formación de metano tiene lugar durante la descomposición de sustratos tan

diversos como celulosa, almidón y carbohidratos, proteínas y aminoácidos, grasas y

ácidos grasos, alcoholes, ácido benzoic0 y numeroscs sustancias de otros tipos.

Aunque en un principio se pensó que las bacterias metanógenas atacaban algunos

de estos sustratos directamente, en la actualidad se sabe bien que la formación de

metano a partir de estos materiales requiere la participación de otras bacterias

anaerobias

Microoraanismos meianóaenos

Los microorganisrnos capaces de llevar a cabo la melanogenesis tienen

divenas formas que van desde cocos en cadenas o scrcinas, hasta bacilos largos

unidos también en cadenas y espirales, algunos son móviles; pueden ser Gram-

positivos o Gram-negativos, miden de 0.5 a 0.8 pm de ancho y 0.8 a 7 pm de largo,

son anaerobios estricfos, crecen en ambientes naturales anóxicos. El pH en el que se

desarrollan es de 6.5 - 7.8 y la temperatura es de 30 - 40 "C en lo mesófilos y de 45 -65

"C en los termófilos.

0

Los meianógenos son 10s rnicroorganismos mas abundantes de las

arqueobacterias, estos se caracterizan por que de la materia orgánica en

descomposición a través de una vía anaeróbica toman sus requerimientos energéticos

y producen biomosa.

Las bacterias melanogenicas se diferencian del reslo de los procarionies por

contener una serie de coenzimas no Presentes en otros rnicroorganismos.

o

Varios tipos morfológicos de bacterias metanogénicas han sido aisladas en años

recientes, y un profundo estudio de su fisiología y secuencia de RNA ribosómico ha

originado la calsificación de este grupo en cuatro familias que tienen un total de doce

géneros.

Las bacterfas denominadas metanogenicas producen CH4 , y pueden

clasificarse en:

a) Bacterias hidrogenofilicas no acetociasicas.

Obtienen su energía de la oxidación del Hz en presencia de COZ como aceptor

de electrones. Estas bacterias no pueden utilizar el acetalo como fuente energía,

pero unas pueden utilizarlo como fuente de carbono. (Methanobacterium forrnicicurn,

Methanobacterium hungatei, Methanobacterium thermoautotrophicurn y

Methanobrevibacter sp.)

b) Bacterias meianogénicas aceioclasticas

Producen metano a partir del grupo metil del acetato, el 73% del metano

producido por los digestores anaerobios viene del acetato.

Este grupo de bacterias pueden dividirse en dos géneros:

i) Las de baja afinidad para el acetato san del generoMethanosarcina ademas de

acetaio estas bacterias pueden utilizar como fuente de energía y de carbono las -

metilaminas, metanol, y algunas el H2 . Las especies más representativas son:

h.lefhanosarcina barker;, Id. maze; y M. :hermophila.

ii) Las bacterias del genero Metanotrix que forman filamentos largos, no utilizan el H2 y

el formido y no son inhibidas por estos. Presentan alta afinidad por el acetato.

Bioauímica de las bacterias metanóaenas

Debido a una muy antigua divergencia evolutiva las arqueobacterias poseen

una bioquímica muy característica que se ha mantenido aislada y que no es

compartida por ningún otro ser vivo: en condiciones anóxicas todos lo metanógenos

usan un grupo metilo como aceptor final de electrones. la reducción de dicho grupo

a CH4 es energéticamente favorable (Go=-112 kJ). tomando de ahí parte de los

requerimientos para su crecimiento. En general lo que hace este tipo de bacteria es

que usando ocho elecfrones reducen el C02 a CH4 para lo cual ponen en marcha

todo un sistema multienzimatico.

La reducción del bióxido de carbono a metano no se lleva a cabo sobre el

compuesto o los intermediarios que se encuentren libres, sino que el primero reacciona

con uno de los cofactores del complejo multienz¡matico(paso de activación del COI

y de ahí en forma de unidad de Ci (un carbono)es transferido de un transportador a

otro sufriendo cambios en su estado de oxidación, interactuando con diversas enzimas

y cofaclores hasta llegar a metano y dejar libre al Último transportador, que activara

otra molécula de COI por estados de oxidación tales como: formaldehído, metenilo,

metileno, metilo y metano.

4

Ciclo Ci para la reducción de C02 a CHI

Formil-metanofurano 4 I

,- Metenil-H4MPT

t+ 2e

Metilen-H4MPT

Metil-H4MPT

::"Jq ,~ p- I,j H2

CH3-S-CoM

Fa0 red F420 OX

hidrogenasa

Los factore: que intervienen en el ciclo son: rnetilfurano,

fetrahidrornetanopterina (H4M,PT), coenzinla M (2-m~rraptoetono sulfónico), factor

F430 y el cofactor F420.

0

~5~~~~~~ QENLML

Estudio de la metanogénesis a partir de acetamida

&DBJErnWO ~~~~~~~~~

Metanogénesis en la hidrólisis de acetamida por bicultivos de Bacillus sphaericus y

Methanosarcina mazei

Metanogénesis en un reactor UASB con acetamida

PRIMERA FASE

En la primera fase del experimento se realizó la propagación tanto de

Methanosarcina mazei, como de Methanosarcina barker;, para lo cual se contó con

dos cepas puras de colección y cuyas características principales las reportan Krieg y

col. (1984), J. L Garcia (1990), estas bacterias fueron seleccionadas porque Ramírez

(1 992) aisló e identificó bacterias del género Meihanosarcina y Methanobacterium

presentes en un reactor anaerobio UASB que trataba acetamida y que eran las

responsables de la producción de metano. rl)i' Para lograr la propagación se emplearon botellas de 500 y de 250 mL, los

cuales contenían 225 y 135 mL de medio anaerobio (Balch y col.,l979. -anexo A-2.)

respectivamente, las botellas fueron inoculadas con 50 y 30 mL de un cultivo en fase

exponencial de Methanosarcina respectivamente. (Se utilizaron das botellas de

diferente volumen para cada especie de bacteria]. La inoculación s e llevó a cabo

purgando las jeringas con nitrógeno y dejando la misma cantidad de este Último en

cada toma de muestra tanto de las soluciones como del inóculo. Después se

mantuvieron en incubación a 35 "C (botellas invertidas para evitar la fuga de metano).

Se tomaron muestras continuas de metano (tres veces por semana) para

observar su producción, y una muestra liquida cada semana para determinar el

consumo de aceiato. Los cultivos se mantuvieron de esta manera durante un mes

hasio obsewar que el acetoio se había consumido, después se realimentoron con

medio anaerotio (anexo A-3). y :e continuó fomarido muestras durante otro mec para

lograr obtener una concentración suficienfe de bacterias para poder realizar el

experimenfo de los bicultivos.

0

SEGUNDA FASE

Se realizó un bicultivo en un reactor batch con 6acillus sphaericus (cepa aislada

de un reactor anaerobio UASB -Ramirez, 1993- cuyas características fueron reportadas

por Ramirez -1995) y Methanosarcina maze;. Se utilizó un frasco serológico de un litro

de capacidad, al cual se le adicionaron 200 mL de medio aerobio (Anexo A-4) y se le

adicionó acetamida hasta tener una concentración de 20 mM en el bicultivo al

tiempo inicial. El inóculo adicionado fue de 50 mL de Bacillus sphaericus. y 50 mL de

Methanosarcina maze; El reactor se mantuvo en incubación a 35 "C, durante un mes,

en el transcurso del cual se tomaron muestras de gas para determinar metano (Anexo

8-3), y muestras líquidas para observar el consumo de acetcto (Anexo 8-2), y dado

que no se preseritó un consumo significante de acetafo ni la producción de metano,

se dio por terminado el experhenlo y se continuó con la siguiente fase para obtener

mayor información y así poder tener las condiciones mas apropiadas para este

reactor. '@#

TERCERA FASE Se realizaron una serie de bicultivos en los cuales se variaba el volumen de

medio aerobio (Anexo A-4) y el medio anaerobio (Anexo A-2) en el cual se

encontraba la bacteria metanog6nica.

En lo serie de bicultivos se mantiene una concentración de acetamida de 25

nM, considerando el volumen total.

Cada bicultivo se llevó a cabo por duplicado.

Se utilizaron boteilas serológicas de 60 rnL, y los diferentes experimentos fueron

como se describe en Ius iablas siguientes.

Tabla 1

Descripcibn de los bicultivos c m 3;ici:lus sphoericiis y Mefhanosoicino rnazei

Bicultivo Medio Medio Inóculo de Solución de Volumen total No. oorobio anaerobic(ml.) B. sphaoncvs acetamida I (mL)

( rn l ) M. ?.laze¡ (ni 1.) 1M (mL) 1 20 O 2 0.55 22.55 2 5 15 2 0.55 3 IO 10 2 0.55 22.55 4 15 5 2 0.55 22.55

22.55 - . -

Tabla 2

Descripción de los bicultivos con Bacillus sphaericus y Methanosarcina barker¡

o Para realizar los experimentos descritos en las tablas anteriores, primero fue

adicionada la acetamida, después el inóculo de Bacillus sphaericus y por ultimo se

adiciona el medio anaerobio dentro del cual se encuentra el inóculo de

Methanosarcina

Después de haber adicionado todo lo anterior, se desplazó la fase gaseosa

contenida en las botellas serológicas con una corrienie de nitrógeno, con lo cual sólo

se tendría oxigeno en forma disuelta en el medio.

Es necesario aclarar que el un cultivo sólo contenía Bacillus sphaericus por lo

que se tomó como control en la hidrólisis de acetamida

Para poder evaluar todos estos bicultivos se determinaron cuatro diferentes

parametros a lo 1a:go del experimento: acetamida, acetato, metano y amonio ( las

técnicas utilizadas para dichas determinaciones están reportadas en el anexo B J . La

duración de eslas cineticas fue de mes y medio. También se evaluaron el pH y el

oxígeno disuelto en el tiempo inicial y el tiempo final. $0 CUARTA FASE

Se trató de poner en marcha el reactor en conlinuo UASB, pero dado que era

un diseno especial con el cual s e permitiría la entrada del electrodo para medir el

oxígeno disuelto en el medio, no fue bien construido del iodo y se presentaron fugas

de la corriente de la chaqueta al reactor.

El diseño del reacior esta siendo mejorado y hasta el momenlo no se ha puesto

en marcha.

El reactor utilizado en esta etapa s e encuntra representado en el esquema

siguiente:

. I

Mediante' el presente estudio se logró llevar a cabo la metanogénesis a partir de

acetamida como sustrato inicial, realizando bicultivos entre microorganismos como

Bacillus sphaericus que es una bacteria aerobia estricta y Methanosarcina (mazei y

barqueri) que son bacterias anaerobias.

o También se demuestra que la metanogénesis es posible a partir de acetamida, y a

que el oxígeno disuelto en el medio es utiljzado por el Bacillus sphaericus para llevar a

cabo la hidrolisis de acetamida para dar como resultado la formación de acetato y

amonio, reduciendo el medio para que Methanosarcina utilice el acetato como

sustrato y lo lleve hosta metano y COZ mediante un proceso anaerobio.

También fue posible observar que a pesar de las condiciones limitadas de oxígeno

dentro de los bicultivos Bacillus sphaericus pudo realizar la hidrólisis de acetamida

0

Los resultados reportados a continuación son los que se obtuvieron en los diferentes bicultivos realizados.

En la tabla 3 se presentan los valores de oxígeno y de pH encontrados en el tiempo inicial en los diferentes bicultivos.

Tabla 3 Condiciones iniciales de oxígeno disuelto y pH

I medio anaerobio (M. barkeri) 1 I I I I

Se puede apreciar que a comparación del cultivo control en donde se tiene sólo medio aerobio se encontró un valor de 6 mg/L de oxígeno disuelto, el cual es relativamente alto comparándolo con el valor que se presenta en los diierentes cultivos mixtos, ya que el máximo valor observado en estos es de 1.22 mg/L de oxígeno en los bicultivos con mayor proporción de medio aerobio.

o

Con respecto al pH no se encontró una diferencia significativa, pero se observa mientras mayor es el volumen de medio anaerobio el pH se incrementa que

ligeramente.

En la tabla 4 se reportan las condiciones de pH y oxígeno disuelto en el tiempo final encontrados en los diversos experimentos.

Tabla 4 Condiciones finales de oxígeno disuelto y pH

. . anaerobio (M. ~mazei) 15 mL de medio aerobio v 5 mL de medio O I 7.855

anaerobio (M. mazei) 5 mL de medio aerobio y 15 mL de medio

anaerobio (M. barkeri)

anaerobio (M. barken) 15 mL de medio aerobio y 5 mL de medio

anaerobio [M. barken)

O 8.035

O 7.87

O 7.785

10 mL de medio aerobio y 1 O mL de medio

Podemos observar en la tabla anterior que el oxígeno se consumió en su

totalidad durante los 45 días del experimento, lo cual resulta de la actividad de Bacillus

sphaencus, ya que éste utiliza el oxígeno existente para degradar acetamida y llevarla

a acetato.

A continuación se presentan los resultados obtenidos en las determinaciones de

acetamida, acetato, metano y amonio en los diferentes cultivos a lo largo del

experimento. Q

Figura 1 Cinbtica de hidrólisis de sceiamida por

Baci//us sphaencus Cultiva conlrol 25 I

*

"1 10 : e x O

X O 1

O 10 20 30 40 50

Te- (dks)

En la figura 1 se presenta el cultivo control, es decir en el cual sólo se tiene

Bacillus sphaericus: en esta cinetica se puede observar que la acetamida es

consumida desde el principio pasando de una concentración de 21.56 mM a 7.5 mM,

dando como resultado la producción de acetato y amonio. En el día 8 se presenta la maxima producción de acetato en una concentración de 3.3 mM, de la cual se

consume aproximadamente 1.6 mM, esto se debe que 6. sphaericus también

aprovecha el acetato como sustrafo.

La producción de amonio aumenta en proporción a la hidrólisis de acetamida,

llegando a su máxima concentración en el día 10, siendo ésta de 10.7 mM Y

decreciendo hasta llegar o 6.4 mM. 0

Figura 2 Cinbtica de hidr6lisis de acetamida por

Bacillus sphaericus y il43ihanosarcina rnazei en un mlumen de 5 rnL de medio aerobio y15 mL de anaerobio

20

15

6 “3.2- 4 < “ E . : 0 2 10

: * - e : S j g :e‘,- 5 u ó P

o <

En la figura 2 se representa un bicultivo de B. sphaericus y M. maze; , en el cual existe 5 mL de medio aerobio y 15 mL de medio anaerobio. En esta cinetica se observa que la mayor producción de amonio está en el día 8 con una concentración de 6.1

mM y de ahi es consumida hasta alcanzar una concentración de 4.2 mM.

El acetato se produce hasta concentraciones de 7.2 mM en el día 8, y se

La producción de metano no es significativa. Con respecto a la acetamida se puede ver que es hidrolizada en

consume de esta producción un aproximadamente 5.8 mM.

aproximadamenle un 85 %.

Figura 3 CinBtica de hidrólisis de aceíamida por

Bacillos sphaencus y hMhanosarcina mazei en un wlumen de 10 mL de medio aerobio y 10 m L de anaerobio

e AcetanMa

m Acetato

x Anunio

En la figura 3 se tiene un bicultivo de B. sphaericus y M. mazei, y e n este caso el volumen de medio anaerobio y aerobio es igual 110 rnL de cada uno], en este experimento podemos ver que la mayor producción de acetato se tienen a los 16 dias con un valor de 5.8 mM consumiendose hasta una concentración de 2.4 mM.

El amonio por su parte llaga a 17.5 rnM y decrece hasta 3.3 mM.

Por otro lado el metano no se produce y, con respecto a la acetarnida, se observa que presenta una hidrólisis del 1 O0 %.

Figura 4 Cinetica de hidrólisis de aceiamida por

Bacillus sphaericus y&üianosarcina mazai en un mlumen de 15 mL de medio aerobio y 5 mL de anaembio

25

Aceiato A Metano x Anunio

X A

A A A M

O 10 20 30 40 50 Tienpo (dkis)

En la figura 4 esta representado el experimento en el que se tenia B. sphaericus

y M. mazei en un medio en donde la proporción de medio aerobio era mayor (15 mL)

que la de medio anaerobio (5 mLJ.

Se puede observar que la producción de metano es alta de hasta de 5.9 mM en

el día 20.

El acetato alcanza una producción maxima en los primeros días del

experimento, siendo esta de 6.9 mM y después se consume aproximadamente 5.4 mM.

Por otro lado el amonio se produjo de forma proporcional a la hidrólisis de acetamida,

presentando una concentración máxima de 8 mM en el día 10.

T)

Figura 5 Cinbtica de hidrólisis de aceiamida por

Bacillus sphaencus y hbthanosarcina barken n un mlumen de 5 m ~ = & ~ U k a e E b j ~ W 3 . l M s & ? b i o

357----- 1 30 t

A . ,A O 4 ..-- I - L 10 20 30 40

-5 Tierrpo (db)

ta Aceiam A Matano

x Anunio

En la figura 5 están los resultados obtenidos en el experimento con B. sphaencus y M. barken en el que se el volumen de medio aerobio es menor que el anaerobio (5

mL de medio aerobio y 15 mL de medio anaerobio]. Primeramente la acetamida se hidroliza aproximadamente 16.5 mM, y se

observa que a partir del dia 8 permanece casi constante hasta los 45 días, esto se debe que el oxígeno se agota rápidamente por que sólo se tienen 5 mL de medio aerobio y por lo tanto el oxígeno disuelto es poco.

Por lo que respecta a el amonio se observa que se produce en una concentración máxima de 9.6 mM y posteriormente es consumida hasta una concentración de 4.2 mM.

El acetato alcanza una concentración máxima de 15.3 mM en el día 8 y de ella T se consume aproximadamente un 12.4 mM.

La producción de metano es baja durante el experimento.

Flgura 6 Cin4tica de hidroiisis de aceiamida por

Bacillus sphaeflcus y Wthanosarcina barken en un valumen de 10 mL de medio aerobio y 10 mL de anaerobio

25 I

10 20 30 40 -5

Tierrpo (dfas)

e Acetamide m Aceiaio

x Amnio

En la figura 6 se presenta la cinética con B. sphaencus y M. barken que se

En esfa figura se muestra que la acetumida se hidroliza en aproximadamente un

Se puede observar que la producción máxima de acetato se alcanza en el día

Por otro lado el metano empieza a producirse en forma significativa a partir del

También se puede ver que el amonio tlene un máximo de 12.2 mM a los 8 días

encuentran en 1 O mL de medio aerobio y 1 O mL de anaerobio.

87 %, ya que de una concentración inicial de 13.4 mM termina con una de 1.6 mM.

10 con una concentración de 7.48 mM y decrece hasta 4.2 mM.

día 6, alcanzando su máximo en el día 24 con 1.9 mM.

de iniciado el experimento.

Flgura 7 Cinética de hidrblisis de acetamida por

Bacillus sphaencus y hMhanosam'na barken en un wlumen de 15 mL de medio aerobio y 5 mL de anaerobio

45 40

O 10 20 30 40 50 Tienpo (dias)

Por último en la figura 7 se presenta la cinetica con 8. sphaencus y M. barked, en la cual se tiene un volumen de 15 mL de medio aerobio y 5 de medio anaerobio.

Se muestra que la acetamida es hidrolizada paulatinamente hasta alcanzar un

El amonio alcanza una concentración de hasta 17.7 mM y después es

El acetaío que es producido llega a concentraciones de 9.5 mM y

El metano producido por la bacteria metanogenica llega hasta una

46 %, ya que de 11.4 mM termina con una concentración de 6 mM

consumida hasta llegar a 4.4 mM.

posteriormente es consumido hasta quedar con 1.7 mM.

concentración de 4 mM.

")

Los resultados observados se resumen en la siguiente tabla:

medio onaerobio IM mazeil I I I I I

10 ml de medio 1.22 O 5.8 3.4 - oerobio y 10 m L de

medio onoerobio IM. maze11 I I I I I

15 rnL de medio 4.22 3.7 6.9 5.4 5.9 oerobio y 5 mL de

medio anaerobio IM. mazeil I I I I I

5 m L de medio 0.92 6.5 15.3 12.4 1.3 oerobio Y 15 mL de

medio anóeiobio IM. barkeiil

aerobioy IOmLde medio anclerobio IM.

10 mL de medio 1.22 1.6 7.48 3.28 1.9 ~~. ~ ~~

barker¡) I I5 mL de medio 4.22 6 9.5 1.7 4

oerobio y 5 mi de medio anaerobio IM.

barked] I I I I I

Con los resultados anteriores podemos ver que el oxígeno disuelto en el tiempo

inicial del cultivo control que sólo tiene medio aerobio es de 6.1 1 mg/L y que éste es

relativamente alto con respecto valor que se presenta en los cultivos mixtos, en éstos

últimos se observa que cuando se tiene un volumen de 15 mL de medio aerobio y 5 mL

de anaerobio se tiene 4.22 mg/L de oxígeno disuelto y éste valor baja conforme

aumenta el volumen de medio anaerobio.

Con respecto al pH presentado se tiene que inicialmente en los cultivos con

mayor volumen de medio anaerobio es ligeramente mayor, lo que se debe a que el

inoculo de Methcinosarcifla (maze; y barker; 1 se encuentra aproximodamente en un

p~ de a. Los valores encontrados de pH inicial y final varían ligeramente siendo mayores

al tiempo final, pero conservando la proporcionalidad entre los divenos cultivos. esto

se debe a la producción de "3

Por otro lado la mejor hidrólisis de acetamida se presenta en los cultivos que

tienen el mismo volumen tanto de medio aerobio como anaerobio, esto sin importar la

bacteria metanogénica de que se trate, puesto que tanto M.mazet’ como M. barken se

comportaron de la misma forma en este caso.

Se puede decir que en general la hidrólisis de acetamida no depende de ni de

Y en el experimento con M. mazei tenemos que la segunda mejor hidrólis de

acetamida cuando el volumen de medio aerobio es mayor. Es conveniente aclarar

que la diferencia de eficiencia de hidrólisis de acetamida cuando se tienen diferentes

volúmenes de medio aerobio y anaerobio (15/5 o 5/15] es muy baja.

la cantidad de inóculo ni de la cantidad de oxígeno disuelto.

Por otro lado podemos ver que con respecto a la producción de amonio es

mayor en los COSOS en los que los volúmenes de medio aerobio y anaerobio son

iguales.

En todos los experimentos se observó que después de alcanzar un valor máximo

el amonio, éste empezaba a decrecer, lo cual se debe a que los microorganismos

presentes en los cultivos lo consumen como fuente de nitrógeno, ya que el medio esta

limitado de éste compuesto.

Con respecto al metano, se tiene que en los cultivos que son con mayor

Por otro lado se esperaba que la concentración de metano aumentara

conforme aumentaba el volumen de medio anaerobio, lo cual no fue así. ya que se

observó que la producción de metano fue mayor cuando se tenia un mayor volumen

de medio aerobio, siendo mayor en el bicultivo en el que se encuentra M. mazei . También se observa que la producción de metano disminuye conforme aumenta el

volumen de medio anaerobio, esto se presentó tanto en los bicultivos con M. mazei y

M. barkeri, pero se presentan valores mayores en el cultivo con M. mazei.

volumen de medio aerobio

En los cultivos en los que se tiene una producción significativa de metano Se

observó que de la producción máxima de acetato es consumido un 70%, y que de lo

que se consume un 79 % se va a la formación de metano , esto es en el caso con M.

barker¡, y con M. rnazei se tiene que de el acetato formado un 77 % es consumido Y

que el 100 % del acetafo que se consume se va a formación de metano. Esto se

presenta en los cultivos con 15 mL de medio aerobio y 5 mL de medio anaerobio.

* Es posible lograr la metanogénesis a partir de bicultivos de bacterias aerobias y

anaerobias estrictas.

* Existe una mayor producción de metano cuando se tiene el bicuitivo con una

relación de inóculo 75/25 (Bacillus /Methanosarcina) ,-'

* La hidrólisis de acetamida es independiente de la cantidad de oxígeno disuelto en

el medio.

Es recomendable que cuando se trabaje con bacterias que crecen en forma de

agregados como Methanosarcina, inocular considerando el peso total de la bacteria.

ya que en volúmenes iguales no se tiene la misma concentración celular.

Brock, T. D., Smith, D. W., y Madigan, M.T. (1987). Microbiología. 4 O edición, Prentice-

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Rev. Lat.-Arnc;r. Microbiol. 35:459-468

Ell Preparación de las soluciones necesarias para el medio de cultivo

Solución mineral 1 :Kz HP04 6g/L

Solución mineral 2: KH2P04 6: (NH4jzS04 6: NaCI 12; MgS04 .7H20 2.6:

CaC1.2H~0 0.1 6 (g/L)

Solución de oligoelementos: Disolver 1.5 g de ácido nitritoacético en 950 mL de agua destilada y ajustar el pH a 6.5 con NaOH al lo%, adicionar MgS04.7HzO 3: MnS04.2H20 0.5 NaCl 1.0 FeSO4 .~HzO 3: MnSO4.2HZ0 0.5: NaCl 1.0

FeS04.7H20 0.1; CoS04.5H~0 0.1: CaC12.2H20 0.1; ZnSO4 0.1; CuS04.5H20 0.01; ric, AIK(S04) 0.01; t i 3 6 0 3 0.01: Na~Mo04.H20 0.1 (g/L]

Solución de vitaminas: biotina 0.02, ácido fólico, piridoxina tiamina 0.05,

riboflavina 0.05: DL ácido pantoténico 0.05; BIZ 0.001; ácido p-aminobenzoico

0.05; ácido lipóico 0.05 g/L

Solución de cloruro de níquel: 0.5 g/L

Solución de sulfato ferroso: 2 g/L

Solución de rezanurina: 0.1 g/100 mL

Sulfur0 de sodio 2.5 %: Na2S.9H20 2.5 g/100 rnL de agua reducida bajo

comente de nitrógeno s Solución patrón de Acetamida 1M: se prepara con agua reducida y bajo

0 corriente de nitrógeno

Solución patrón de Acetato 1M: se prepara con agua reducida y bajo

corriente de nitrógeno

Nota: Todas las soluciones se preparan con agua destilada

Preparación de medio de cultivo anaerobio con reductores

Medio de balch (1 979)

Tabla 1 . Preparación para un litro

Preoaración

1. Mezclar todos los componentes de la tabla 1 excepto la cisteína

2. Marcar hasta el aforo

3. Ajustar el pH a 7 con NaOH al 10% o con HCI diluido

4. Adicionar una tercera parte de agua más, y poner a ebullir hasta la marca de

/-D aforo

5. Enfriar bajo comente de nitrógeno para remover el oxigeno

6. Agregar la cisteína

7. Agregar por cada 50 mL de medio 0.5 mL de sulfur0 de sodio 8. Llenar las botellas serológicas que se vayan a utilizar

9. Desplazar el nitrógeno con una mezcla de nitrógeno y bióxido de corbono (NZ-

80-/C0~-20-)

Esterilizar a 120" C durante 15 min.

A-3

Preparación de medio de cultivo anaerobio de realimentación

Se realiza de forma semejante al descrito en la parte 1 de este anexo, pero

se. hace tres veces concentrado para que al adicionado al medio ya existente se

mantengan las concentraciones iniciales. La Única diferencia es que la

rezanunna y el sulfur0 de sodio no se agrega ,-

r

A 4 Preparación de medio' de cultivo aerobio

. Tabla 1

Preparación para 250 mL ~.

0

Prei3aración

1. Mezclar todos los componentes de la tabla 1

2. Marcar hasta el aforo

3. Ajustar el pH a 7 con NaOH al 10% o con HCI diluido

4. Desplazar el oxígeno con una comente de nitrógeno

5. Llenar las botellas serológicas que se vayan a utilizar (Si son botellas de 60 mL,

poner sólo 20 mL de medio]

6. Esterilizar a 120" C durante 15 min. c

&1

Determinación de Acetamida

1. Tomar un mililitro de muestra líquida en un vial y Centnfugar a 13 O00 rpm.

durante 15 min para eliminar la formación de precipitado.

2. Pasar el sobrenadante a otro vial y acidificarlo con 50 pL de ácido fórmico.

3. Tomar 2 pL con la jeringa, procurando que no haya formación de burbujas.

4. Inyectar la muestra en el cromatógrafo de gases "Varian mod. star 3400"

5. Tomar la lectura del área y hacer la correlación con la C U N ~ estándar de

acetamida [anexo C) para obtener la concentración de acetamida en la

solución problema.

c,

CONDICIONES DEL CROMATÓGRAFO "VARIAN MOD. STAR 3400"

Detector de ionización de flama (FID)

Columna Conitor AT 1 O00

Gas acerreador helio Temperatura del inyector de 200°C

Temperatura de detector de 220°C

Temperatura de la columna de 130-200°C

Rango de temperatura de 1 O"C/min

(C

&a Determinación de Acetato

o

1. Tomar un-mililitro de muestra líquida en un vial y Centrifugar a 13 O00 rpm.

2. Pasar el sobrenadante a otro vial y acidifcarlo con 50 1L de ácido clorhídtico

al 50 % 3. Tomar 0.2 pL con la jeringa, procurando que no haya formación de burbujas.

4. inyectar la muestra en el cromatógrafo de gases "Hewlett Packard mod. 5890"

5. Tomar la lectura del área y hacer la correlación con la curva estándar de

acetato (anexo C) para obtener la concentración de acetato en la solución

problema.

durante 15 min para eliminar la formación de precipitado.

CONDICIONES DEL CROMATÓGRAFO " H E W L ~ PACKARD MOD. 5890"

Detector de ionización de flama (FID)

0 Columna Megaboro AT 1000 en cromosorb W-AW (longitud 10 m).

Gas acarreador nitrógeno

Temperatura del inyector de 200°C

Temperatura de detector de 22OOC

Temperatura de la columna de 130°C

0 Rango de temperatura de 7O0C/min

lntegrador Shimadzu C-R-34 Cromatopac (como factores se utilizaron la pendiente y ordenada obtenidas en la curva estándar de acetato, reportadas en el anexo 2).

i&.3

Determinación de Metano

1. Trabajar en área estéril

2. Flamear la botella serológica de donde se tomara la muestra problema

3. Purgar una jeringa de 1 mL estéril con una corriente de nitrógeno (utilizar una

4. Tomar 0.2 mL de nitrógeno e inyectarlo en la botella serológica (para

compensar el gas que se extraerá para la determinación]

5. Tomar de la botella serológica 0.2 mL de muestra gaseosa

6. Inyectar 0.1 mL de muestra gaseosa en el cromotógrafo de gases “GOW-MAC,

serie 550” 7. Tomar la lectura del área y hacer la correlación con la Cuma estándar de

metano (anexo C) para obtener IC concentración de metano

jeringa de insulina)

CONDICIONES DEL CROMATóGRAFO “GOW-MAC, SERIE 550”

O Detector de conductividad térmica

Columna de acero inoxidable empacada con Carbosphere 80/100

Longitud 0.d. 7/6

O Temperatura de la columna 1 4OoC

Temperatura del detector 190°C

Temperatura del inyector 170°C

La corriente de los filamentos (detector] es de 120 mA.

O Gas acarreador : Helio

O Flujo de helio: 30 mL/min

Presión de 50 psi.

O lntegrador modelo SP4290 Spectra-Physics.

= Determinación de Amonio

1. Tomar 50 mL de muestra líquida y colocarla en un vaso de precipitado del

mismo volumen( en caso de no poder disponer de dicho volumen de muestra,

hacer dilusiones aforando a 50 mL con agua destilada)

2. AI momento de realizar la determinación, acidificar la muestra con 500 pL de

NaOH 10N

3. Realizar la lectura con un electrodo Phoenix para amonio. Cat.No.NH31501,

con un medidor pH/mV.

4. Tomar la lectura en mV después de 3 min.

5. Hacer la correlación con la curva estándar de amonio(anexo C) para obtener

la concentración

Cálculos a realizar

1. Con la pendiente y la ordenada obtenidadas en la CUWQ estándar calcular la

concentración amonio de la siguiente manera:

[NH,] = m * (mV) + 6

2. Obtener el antilogarkno (anti log] de la concentración de amonio obtenida

3. En el caso de que se hayan realizado dilusiones, calcular el ifactor de dilusión

como se indica en seguida:

en el paso anterior

50.d mL.demuesira fd =

4. Por lo tanto la concentración final de amoniaco se obtiene:

(anrilodNH,] * fd) 17

[ NH, ]mM =

CARACTERkTlCAS DEL ELECTRODO PHOENIX PARA AMONIO. CAT.NO.NH31501

o

o

o

o

c

Medidor pH/mV.

Determina amoniaco en rangos de 5x10 -' a 1 M NH3 (0.01 a 17 O00 ppm NH3 o

de 0.01 a 14 O00 ppm en forma de N)

Maneja rangos de pH por ambo de 11

Rango de temperatura de O a 50 "C

Reproductibilidad de 1: 2 %.

i

f

a-1 CURVA ESTANDAR DE ACElAMlDA

1- Preparar una solución patrón de acetarnida 0.1M

2- Preparar una solución de ácido fórrnico

2- Hacer las dilusiones para tener las concentraciones correspondientes a: 1, 1 O y

20 milirnolar de acetarnida como se muestra en la tabla (1 J.

Tabla 1

Dilusiones para realizar la curva estándar de acetato

3- Realizar cada concentración por triplicado en viales de 1 mL

4- Acidificar posteriormente con 50 pL de ácido fórrnico.

6- Realizar la determinación de acetomido crornatograficarnente.

Se inyectan 0.2 pL de la solución problema [procurar que no haya aire en

la jeringa] en un cromatógrafo de gas Vanan modelo star 3400 con detector de

ionización de flama (FID), columna Megaboro AT 1000, utilizando helio como gas

acarreador. La temperatura del inyector de 2OO0C, temperatura de detector de

22OoC, temperatura de la columna de 130-200°C y rango de temperatura de

1 O°C/min

7- Realizar los cálculos necesarios para obtener los parametros estadísticos como:

pendiente, ordenada al origen y coeficiente de correlación

I

Tabla 2

curva estándar de acetamida

para la cwa ertbndar

Pendiente: 441 00.83057

Ordenada: 13651 6.6953 ci Coeficiente de correlación: 0.991 371 1 12

CLe CURVA ESTÁNDAR DE ACElATO

1- Preparar una solución patrón de acetato de sodio 0.1 M

2- Preparar una solución de HCI al 50%

2- Hacer las diluciones para tener las concentraciones correspondientes a: 1, 5,

1 O y 50 milimolar de acetamida como se muestra en la tabla (1).

Tabla 1

Dilusiones para realizar la curva estándar de acetato

3- Realizar cada concentración por triplicado en viales de 1 mL

4- Acidificar posteriormente con 50 pL de HCI al 50 % 5- Centrifugar a 13 O00 rpm. durante 15 min para eliminar la formación de

precipitado.

6- Realizar la determinación de acetato cromatograficamente.

Se inyectan 0.2 pL de la solución problema (procurar que no haya aire en

la jeringa) en un crornatógrafo Hewlett Packard modelo 5890 con detector de

ionización de flarna, columna Megaboro AT 1000 en cromosorb W-AW, utilizando

nitrógeno como gas acarreador (longitud 10 m). La temperatura del inyector de

20O0C, temperatura de detector de 220°C, temperatura de la columna de 130T y

rango de temperatura de 70Vmin

7- Realizar los cálculos necesarios Para obtener los parámetros estadísticos como:

pendiente, ordenada al origen y coeficiente de correlación

Para calcular las concentraciones de las soluciones problema se utilizó un

integrador Shimadzu C-R-34 Cromatopac, al cual se le metieron como factores la

pendiente y la ordenada obtenidas en la curva patrón.

Tabla 2

Curva estandar de acetato

I I 50 I09568 1 05378 I

Pendiente: 2232.41862

Ordenada: 6.384461 7

Coeficiente de correlación: 0.99970875

e

CURVA ESTANDAR DE METANO

1- Pesar 50 botellas serológicas de 60 mL con septo perfectamente lavadas y

secas

2- Llenarlas completamente con agua destilada con jeringa para no tener espacios vacíos.

3- Pesar

4- Calcular el promedio de las botellas llenas y vacías

5- La diferencia en peso de las botellas llenas menos los vacías dará el volumen

total de la botella

6- Colocar 1L de agua destilada en un matraz y ponerlo a ebullir (así se logra

reducir en agua]

7- Enfriar en una palangana con agua fría colocándole corriente de nitrógeno

para desplazar el aire presente

8- En las botellas serológicas poner 25 mL de agua reducida

9- Añadir los mililitros de metano para tener las concentraciones deseadas. Todo

por triplicado.

Las concentraciones se calcularon con la siguiente fbrmula:

una.mol.de. gm. m. la.Cd.de. Merico),

Tabla 1

Diiusiones para realizar la curva estandar de acetato

Las determinaciones se realizaron en un cromatógrafo de gases GOW-

MAC, sene 550 con detector de conductividad térmica, columna de acero

inoxidable empacada con Carbosphere 80/100, longitud 0.d. 7/6. La temperatura

de la columna fue de 140%. detector dee 190°C e inyector de 170°C. La comente

de los filamentos [detector) es de 120 mA. El gas acarreador fué helio con un flujo

de 30 mL/min y una presión de 50 psi. El volumen de inyección fue de 0.1 mL con

Para calcular las areas se utilizó un integrador modelo SP4290 Spectra-

*o jeringa de insulina.

Physics.

Tabla 2

Curva estándar de metano

Pendiente 2841 9671 7

Ordenada 2841 .WI 7

Coeficiente de correlación 0.95082871

c-4 Curva estándar de amonio

1. Preparar una solución patrón de amonio NH4CI al 0.1 M

2. Preparar una solución 10N de NaOH

3. Hacer las dilusiones en 50 mL de agua destilada para tener las concentraciones

conespondientes a: 50,100 y 500 ppm de amonio como se muestra en la tabla.

4. Realizar por triplicado

5. AI momento de realizar la determinación, acidificar la muestra con 500 pL de

NaOH 10 N

6. Realizar la lectura con un electrodo Phoenix para amonio. Cat.No.NH31501,

con un medidor pH/mV.

‘E Las características de el electrodo son: , puede determinar amoniaco en

rangos de 5x10 -7 a 1 M NH3 (0.01 a 17 O00 ppm NH3 o de 0.01 a 14 O00 ppm en

forma de N), maneja rangos de pH por ambo de 11, rango de temperatura de O a 50 OC y tiene una reproductibilidad de f 2 %.

7. Tomar la lectura después de 3 min.

Tabla 1

Lecturas de las diferentes concentraciones de amonio

Nota: por esta ocasión se consideraron 17 detemilnaciones de los puntos de la curva y no solo 3 como se recomienda.

Tabla 2

Curva estandar de arnonio

CONCENTRACIÓN DE AMONIO

Pendiente -0.0198841

Ordenada -0.69752402

Coeficiente de correlación -0.99973689

Cinética de hidrólisisi de acetamida por Bacillus sphaeric us

Cultivo control

iiempo (día) Acetamida O 19.2315 1 3.0589 2 21.5635 3 1.391 6 14.5834 8 12.4775

10 17.1 901 15

20 24 27 31 41 45 7.5643

16.9 7,7985

Acetato 1.9199 1.9779 1.5129

1.27 2.2623 3.3557 2.9703

2.2868

1.7401

Metano Arnonb eficiencia de hidrólisls 3.7079 4.661 a 84.09433

4.4843 92.767322

8.8549 35.1 194919

2.5707 -12.1256561

10.22176 24.169249

10.7026 10.61 52696

59.4492121

6.423 60.6673075

Nota: Las concentraciones de acetamida, ncetato, metano y amonio están en mM

Datos representados en la figura 1

Cinetica de hidrólisisi de acetamida por Bacillus sphaericus y Methanosarcina mazei

, en un volumen 5 mL de medio aerobio y 15 mL de anaerobio

Tiempo (día) Acetamida O 19.3032942 1 12.9637764 2 12.0654259 3 6.11225007 6 3.16686337 8 10.1556433

10 2.74644045 15 16 9.1 1298721 a 24 27 31 41 45 9.28731 499

Acetato Metano Amonlo eficiencia de hidrólisis 2.7539 3.40788561 1.7537 3.70791 32 32.841 637

2.8761 4.25637484 68.33571 5 3.2986 0.1 7481442 5.38673993 83.594181 7 7.2447 0.59431577 6.13921252 47.3890662 ' 7.2822 0.36709733 4.691 57382 85.7721 671

2.4737 0.9997a789 52.7905075

2.8833 -3.9 37.4955081

0.44357037

0.77256946 0.61 2471 24 0.73543327 0.63640344

0.8 1.428 0.71 452697 4.25384693 51.8874089

Nota: Las concentraciones de acetamida, ecetato, metano y arnonio están en mM

Datos reprentados en la figura 2

0

Cinetica de hidrólisisi de acetamida por Bacillus sphaericus y Methanosarcina mazei

en un volumen 10 mL de medio aerobio y 10 mL de anaerobio

Tiempo (día) Acetamida O 17.5095411 1 8.78700695 2 5.27169901 3 0.04610582 6 3.81558131 8 9.32885616

1 O 3.675221 14 15 16 16.1558024

20.4 24 27 31 41 45 -0.1 1865299

..,

Acetoto Metano Amonio eflciencla de hidrólisls 2.4359 7.42023335 3.986 17.5868864 49.81 58923 2.3576 1 6.7998289 69.8924205

4.189 0.2 78.2085591 4.9266 0.1 12.22531 81 46.721 2983 4.6507 0.59871709 3.3854731 79.0101801

5.8688 o. 1 7.73143436

2.9692 6.46792928 99.73668ia

0.2

1.551 60409 -0.0826631 3 -0.13025246 -0.09889302 -0.1761913

2.4257 0.2 13.3623966 100.677648

Nota: Las concentraciones de amtamida. acetato, metano y amonio están en mM

Datos representados en la flgura 3

c

o

Cinetica de hidróliski de acetamida por Bacillus sphaencus y Methanosarcina maze;

en un volumen 15 mL de medio aerobio y 5 mL de anaerobio

Tiempo (día] Acetamida O 12.4326 1 10.6385 2 0.9065 3 10.578 6 3.7059 8 9.236

10 13.0803 15 16 2.9749 20 24 27 31 41 45 1.2357

,-

Acetato 1.9636 6.9587 6.1397 1.3606 3.7301 4.1 191 2.0269

2.0458

1 S963

Metano

0.8347 2.5568 3.3625

4.4 4.4914 5.9551

4.5 3.9528 3.4846 3.3696 2.681 1

Amonio eficiencia de hidróliis

5.1088 14.4310676 24.2314 92.7089031

14.91 74896 6.7279 70.1 92323 3.5667 25.9966771 8.0801 -5.20929366

76.071 5185

18.4108 90.0610309

Nota: Las concentraciones de acetmida, acetato. metano y amonio esten en mM

Datos representados en la figura 4

Cinetica de hidrólisisi de acetamida por Bacillus íphaericus y Mefhanosarcina barqueri

en un volumen 5 mL de medio aerobio y 15mL de anaerobio

Tiempo (día) Acetamida O 23.3528551 1 23.1853526 2 15.7921131 3 2.27907963

8 5.50575356 6 3.97589575

1 o 2.87457862 15 16 10.056963 20 24 27 31 41 45 6.57459964

Acetato Metano 10.5688

12.09 14.91

10.3371 12.02 -0.16243715

15.3737 -0.1 0521 992 9.1 637 0.32693524

5.9258 -0.0821 1296

3.23621 147 -0.14015544 1.30045345

-0.05047843 2.91 32 -0.1 0797075

-0.1 0989633

-0.09476677

Amonio eficiencia d e hidrólisls 3.38346243 9.69830099 0.71 726782

15.329806 32.3760925 7.81 754084 90.240681

33.6271 459 76.4236384 8.76509482 82.974691

4.28455289 87.6906759

56.9346746

14.6437585 71.8466988

Nota: Las concentraciones de acetamida, acetato. metano y amonio están en mM

Datos representados en la flguro 5

f,'C

Cinética de hidrólisisi de acetamida por Bacillus sphaericus y Methanosarcina barken’

en un volumen 10 mL de medio aerobio y 1 O mL de anaerobio

Tiempo (día) Acetarnida O 13.496 1 6.0404 2 1 1.6222 3 7.9642 6 10.4509 8 18.2832

10 1.6684 15 16 O 20 24 27 31 41 45 13.6187

Acetato 4.2952 3.2495 6.1 839 5.5728 6.878

5.6363 7.4896

5.0081

4.2664

Metano

0.3949 2.1 601

-0.0227 -0.0103 0.1 148 0.1424 1.9656 0.0648

-0.0455 -0.01 36 -0.106

Arnonlo eficiencia de hidróllsis 15.4405 6.7239 55.2432994 8.8497 13.8842474 5.421 2 40.9885792

12.2004 22.562721

8.8549 87.6375804 21.9836 -35.471 4739

Nota: Las concentraciones de acetarnida, acetato. metano y amonio están en mM

Datos representados en la figura 6

D-7

I >

.- Ca

Cinética de hidrólisisi de acetamida por Bacillus sphaericus y Methanosarcina barker;

en un volumen 15 mL de medio aerobio y 5 mL de anaerobio

nernpo (día) Acetarnitia O 11.4255967 1 6.3979363 2 4.91855373 3 8.35703773 6 6.3 8 6.08506237

10 15 16 20 24 27 31 41 45 6.3

Acetato Metano Arnonio eficiencia de hidróiisii 1.376 13.3623966

8.5481 43.941 1034 44.0034822

5.63 12.271 1328 26.856881 7 6.0949 0.16161044 17.7138355 19.2494892 3.186 0.40313319 12.7719811 46.7418418

9.545 17.m~a64 56.951 4498

2.7 0.56213107 4.453136 2.1 6366343

3.31 63 1.69932358 2.07948808 3.47800929

3.3 3

4.05320753 1.743 1.60579541 19.2733478 31 .io92973

Nota: Las concentraciones de acetamida, acetato, metano y amonio están en mM

Datos representados en la figura 7

Caraabierta aliiempo

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD M EN C. ARlURO PRECIADO LOPEZ SECRETARIO ACADEMIC0

A QUIEN CORRESPONDA:

Por medio Lie la presente se hace constar que el (la) M. en C. FLORINA RAMIREZ VIVES

del Departamento de: Biotecnolugia

T1TULO:”Mclanogenesis a partir de acetamida por bicultivo de Bacillus sphaericus y , iPlutIi«riisrircirrn rnazci”.

A.LUIvlN0: LIDIA ITZEL MEZA LOEZA

dc la División de Ciencias Biológicas y de la Salud, asesoró el siguiente Servicio Social: I

MATRICULA: 93329196

8 , LICENCIATUIU: Iiigciiiería Bioquímica Industrial

PEIUODO: 26 de febrero de ! 997 - 26 de agosto de 1997.

Se extiende la presente para los fines que al interesado convengan, en la Ciudad de México, D.F. a doce de noviembre de inil novecientos noventa y siete.

- (

A t e n t a m e n t e “CASA ABIERTA A TIEII/lPO” t.