Manual Del Lab Oratorio de Cultivo de Tejidos

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Instituto Politécnico Nacional

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología

Laboratorio de Cultivo de Tejidos

Manual elaborado por Jesús Agustín Badillo Corona, María del Carmen Oliver Salvador, Karen Gisela Moreno Guerrero,Verónica Pacheco González y Hernán Cortés Arroyo

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS

ACADEMIA DE BIOTECNOLOGÍA

MANUAL DEL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS

ELABORADO POR:

Dr. Jesús Agustín Badillo Corona

Dra. María del Carmen Oliver Salvador

IBt. Karen Gisela Moreno Guerrero

Biol. Verónica Pacheco González

IBt. Hernán Cortes Arroyo

México D. F. Agosto 2009







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Relación de prácticas

No. Titulo sesiones*

1 Germinación de semillas de diversas especies en condiciones de asepsia 4

2 Preparación de medios de cultivo para la generación de callos ymicropropagación

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3 Establecimiento de un cultivo de callos de explantes de zanahoria( Daucus carota).

4

4 Micropropagación de violeta africana Saintpaulia ionantha Wendi. 55 Regeneración de plantas completas a partir de explantes de hojas de

Nicotiana tabacum 5

*La sesiones necesarias para la realización de cada práctica no son necesariamentecontinuas.







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Práctica 1. Germinación de semillas de diversas especies en condiciones de asepsia.

INTRODUCCIONDurante el desarrollo de una planta los procesos de formación de semillas y degerminación son procesos absolutamente indispensables para la dispersión y perpetuaciónde la especie. Por este motivo, averiguar los mecanismos que gobiernan la germinaciónde semillas ha sido esencial para comprender tanto el papel reproductivo de éstas, comoel papel que juegan en un contexto ecológico que tiene implicaciones de competitividad ydispersión.

Hasta el día de hoy se han identificado 4 requerimientos abióticos básicos necesarios parala germinación:

1. Agua, mediado principalmente por el potencial hídrico del ambiente y de lasemilla. Se considera que es el factor determinante para que se realice lagerminación ( si no hay agua no hay germinación).

2. Oxígeno, el cual ingresa a la semilla en forma gaseosa o disuelto en agua.

3. Temperatura, específica para cada especie.

4. Luz, no es considerada un factor determinante, pero si un promotor de lagerminación.

La semilla contiene al embrión generado por la fecundación en la planta madre yel éxito que tenga para su supervivencia depende mucho de su habilidad para germinar enel lugar y momento apropiado. Esto se asocia a mecanismos adaptativos que previenen lagerminación en ausencia de un ambiente adecuado, lo que se denomina latencia desemillas. En estos casos las estructuras de la semilla restringen cualquiera de los factoresantes mencionados, en especial el agua y el oxígeno, con lo cual se limita la germinación.Dentro de los procesos y factores reconocidos para la liberación de las semillas del estado

de latencia se encuentran los siguientes:

• Post maduración (afterrippening ): se obtiene cuando la semilla ha reducido elnivel de humedad por desecación.







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• Escarificación natural. Se refiere a la permeabilización de la testa producto de ladegradación de ésta por diversos medios naturales (microorganismos, desgastemecánico, paso por el tracto digestivo etc.), permitiendo la penetración de agua y

oxígeno hacia el embrión.• Congelamiento/enfriamiento: existen semillas que requieren períodos de

congelamiento para germinar.

• Luz.

OBJETIVOS GENERALES

• Inducir la germinación de semillas de diferentes especies vegetales para la obtenciónde plántulas libres de hongos y bacterias.

• Familiarizar al estudiante con las técnicas de cultivo de vegetales in vitro

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Propiciar el desarrollo de habilidades cognitivas y procedimentales del alumno en elempleo adecuado de las técnicas de asepsia para el cultivo de semillas in vitro.

• Preparar medios de cultivo para la germinación de diferentes especies de semillas yanalizar las diferencias entre ellos.

• Analizar las diferencias que existen entre las condiciones que propician lagerminación de cada especie vegetal empleada.

• Obtener plántulas sanas a partir de semillas de diferentes especies vegetales.

• Cultivar las plántulas sanas obtenidas en condiciones óptimas para su desarrollo.

MATERIALES POR EQUIPO:

BIOLÓGICO

Semillas de jitomate, tabaco, lechuga, zanahoria y de una Bromeliácea, Bromelia

hemisphaerica.

MATERIAL DE LABORATORIO • 2 matraz Erlenmeyer de 500 mL







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• 2 vaso de precipitados de 100 o250 ml

• 1 piceta de 250 mL

• 1 agitador de vidrio

• rollo de papel aluminio

• 4cajas de Petri

• rollo de algodón

• 1esponja

•

10 Frascos tipo “Gerber” con tapade polietilino o Tubos de ensaye2.5 x 30 cm

• Masking-tape

• 2 Espátulas o cucharas de aceroinoxidable

EQUIPOS

• Campana de flujo laminar

• Autoclave

• Potenciómetro

• Balanza analítica

REACTIVOS

• Etanol al 70%

• HCl 1.0 N

• NaOH 1.0 N

• H2SO4 3.0 M

• Sustancias orgánicas e inorgánicas(ver anexo).

DESARROLLO EXPERIMENTAL:

Esterilizar previamente por equipo:

• 2 vasos de precipitado de 250 mL

• 1L de agua destilada

• 2 espátulas

PROCEDIMIENTO:

Preparación del medio de cultivo:

1. Conforme a las indicaciones dadas por el profesor según el número de equipos y lasespecies vegetales a utilizar, preparar medio de cultivo semisólido de Knop o MS







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según la formulación indicada en el Anexo 1. El pH deberá ajustarse con NaOH 1.0 Nantes de adicionar el agar a los medios (Medio Knop a pH de 5.5 y Medio MS a pH.Preparar medio de cultivo en cantidad suficiente para 10 frascos o 10 tubos.

2. Fundir el agar en calor y verter 20 mL en cada frasco (tipo “Gerber”) o 15 mL encada tubo, cubrir con tapa de plástico o doble tapa de papel aluminio y sujetar conligas o Masking-tape, esterilizar en autoclave a 121°C y 15 psi de presión durante 15min.

Desinfección de semillas:

El siguiente protocolo puede ser utilizado para semillas de zanahoria, jitomate y lechuga.

a. Colocar las semillas en agua con extrán al 2% (o detergente) durante 30-40 minutos,mantener en agitación (manual o con un agitador magnético).

b. Enjuagar tres veces con agua estéril para eliminar el detergente. A partir de este pasotrabajar en la campana de flujo laminar. Utilizar la espátula estéril para retener lassemillas.

c. Sumergir las semillas en una solución de etanol al 70% por 30 segundos (exactos).

d. Enjuagar tres veces con agua estéril para eliminar el etanol.

e. Transferir las semillas a un vaso estéril y sumergirlas en una solución de hipocloritode sodio al 1% de cloro libre durante 10 min.

f. Lavar las semillas cinco veces con agua estéril para eliminar el hipoclorito de sodio ydecantar, ayudándose con la espátula estéril.

Siembra e incubación de las semillas

g. Del vaso de precipitados, tomar una a una las semillas y colocarlas en los tubos o

frascos que contengan medio de Knop o MS con la ayuda de una espátula estéril.

h. Colocar 3-5 semillas en cada tubo o frasco, procurando que queden separadas y encontacto con el medio de cultivo.

i. Colocar los recipientes con las semillas en un cuarto de cultivo en oscuridad a unatemperatura de incubación de entre 24 a 26 ºC.







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j. Observar cada semana las semillas. Separar los tubos o frascos contaminados y anotar si se trata de contaminación bacteriana o fúngica. Los frascos o tubos contaminadosdeberán esterilizarse a la brevedad.

k. A la aparición del coleóptilo, exponer los tubos al fotoperíodo natural hasta que la plántula alcance una altura aproximada de 8-10 cm (dependiendo de la especie).

Protocolo para semillas de B. hemisphaerica:

IMPORTANTE: Durante el seguimiento de este protocolo, deberán extremarse precauciones al manejar el acido sulfúrico ( H2SO4). Es altamente tóxico y corrosivo.

a. Colocar las semillas en extrán al 2% (o detergente) durante 40 minutos. Mantener en agitación de forma manual o con un agitador magnético.

b. Enjuagar varias veces con agua para eliminar el detergente. A partir de este pasotrabajar en la campana de flujo laminar.

c. Transferir las semillas a un vaso estéril y sumergir las semillas en una solución deH2SO4 3.0 M durante 10 min.

d. Enjuagar varias veces con agua estéril para eliminar el H2SO4. El enjuague debe

realizarse con extremo cuidado a fin de no mermar la cantidad de semillas duranteel proceso.

e. Transferir las semillas enjuagadas a un vaso estéril y sumergirlas en una soluciónde etanol al 70% durante 30 segundos.

f. Enjuagar varias veces con agua estéril para eliminar el etanol.

g. Transferir las semillas a un vaso estéril y dejarlas en el mismo vaso, hidratandocon agua estéril aproximadamente 24 horas, en condiciones de asepsia (el vasodeberá permanecer perfectamente tapado).

h. Del vaso de precipitados, tomar una a una las semillas y transferirlas a los frascoscon medio Knop con la ayuda de una espátula estéril.

i. Colocar de 3 a 5 semillas por frasco, procurando que queden separadas y encontacto con el medio de cultivo.







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j. Coloque los frascos, con las semillas en el cuarto de cultivo en la oscuridad a unatemperatura de incubación de entre 24 y 26 ºC.

k. Observar cada semana las semillas. Separar los tubos o frascos contaminados yanotar si se trata de contaminación bacteriana o fúngica. Los frascos o tuboscontaminados deberán esterilizarse a la brevedad

l. A la aparición del coleóptilo, exponer los frascos al fotoperíodo natural hasta quela plántula alcance una altura aproximada de 2-3 cm.

CUESTIONARIO

1. ¿Qué pasa si las semillas se dejan más tiempo en etanol?

2. ¿Por qué las semillas de B. hemisphaerica son tratadas con H2SO4?

3. ¿Qué es el coleóptilo?

4. Mencionar 3 puntos críticos para la germinación de semillas de B. hemisphaerica.

5. ¿Por qué algunas semillas requieren de la obscuridad para germinar? ¿Qué tipo detratamiento luminoso requieren algunas semillas para poder germinar?

NOTA. Además de los puntos mínimos que debe incluir el informe escrito de la práctica(Objetivos, introducción, desarrollo, resultados, etc.) se deberán incluir y discutir lossiguientes puntos:

El tiempo de germinación de las semillas

El % de germinación.

Una comparación de estos resultados con los demás equipos.

Discutir a detalle el papel que juega cada una de la soluciones en el proceso dedesinfección.

BIBLIOGRAFÍA







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• Barrera Badillo G. y Oliver Salvador (2004). III Congreso Internacional y XIVCongreso Nacional de Ingeniería Bioquímica. Veracruz, Ver. del 31 de marzo al 2de abril.

• Kieran, P.M., Mac Loughlin P.F., Malone D.M. (1997). Plant cell suspensioncultures: some engineering considerations. Journal of Biotechnology. 59, 39-52.

• Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15(3): 473-497.







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Práctica 2. Preparación de medios de cultivo para la generación de callos ymicropropagación

INTRODUCCIÓN

Entre los factores más importantes a tener en cuenta para lograr la respuesta morfológicadeseada en un cultivo de tejido in vitro, es la composición del medio de cultivo. El mediode cultivo está conformado por macro y micronutrientes esenciales para la supervivenciade la planta, nutrientes (hidratos de carbono, vitaminas), agentes reguladores delcrecimiento y hormonas vegetales, que ayudarán a obtener un callo, una planta completa,o un órgano vegetal en particular, a partir del explante elegido (en condiciones deasepsia) y algún agente gelificante inerte (agar, gelrite, etc.). Los principales

componentes de los diferentes medios de cultivo se presentan en el cuadro 1:

Cuadro 1. Principales componentes del medio para cultivos vegetales in vitro.

Componentes Características

Fuente de carbono

Generalmente, la mayoría de los cultivos de células vegetales noson autótrofos y por lo tanto dependen completamente de unafuente externa de carbono. En muchos casos, se prefieresacarosa, y ocasionalmente glucosa (Ej., cultivos de algodón) omaltosa (Ej., cultivo de anteras).

Sustanciasinorgánicas

Macroelementos (N, P, K, Ca, Mg, S) y microelementos (Fe,Co, Zn, Ni, B, Al, Mn, Mo, Cu, I) en proporciones adecuadas.

Vitaminas

Vitaminas B1, B2, B6, vitamina H, vitamina E, ácido fólico,ácido nicotínico, entre otras.

Hormonasreguladores delcrecimiento

Auxinas: promueven la elongación celular, la formación decallos y raíces adventicias, inhiben la formación de brotesaxilares adventicios y, en ocasiones, inhiben la embriogénesis.

Citocininas: promueven la división celular, regulan el

crecimiento y el desarrollo de los tejidos vegetales. Otras: giberelinas, ácido absícico, etileno.

Adaptado de Hall (2000).

Las exigencias minerales varían con la especie, la naturaleza del tejido y su estadofisiológico, pero, además, también varían con el método de cultivo y el tipo de







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organogénesis estudiado. Por ejemplo, los meristemos y, en forma general, los tejidos conactividad metabólica elevada, pueden presentar importantes necesidades en potasio.

En 1962, Murashige y Skoog propusieron un medio para la investigación del crecimientoóptimo de callos de la planta del tabaco ( Nicotiana tabacum). Este medio es netamentesuperior a los medios anteriormente usados para iniciar la organogénesis y, particularmente, para la formación de yemas.

A partir de estos resultados, el medio MS se ha empleado de una manera muy general para todos los tipos de cultivo in vitro. Además, puede afirmarse que ha sido lautilización del medio MS junto con el empleo de fitohormonas apropiadas (citocininas yauxinas), lo que ha permitido el éxito de los trabajos sobre organogénesis en cultivo invitro. El medio MS está caracterizado, principalmente, por un contenido elevado de

nitrógeno del cual 1/3 del total está aportado en forma reducida (NH4+) y por unaconcentración igualmente elevada en potasio.

Los tejidos y células cultivadas in vitro son ampliamente heterótrofos con respecto alcarbono debido a la ausencia o insuficiente asimilación por clorofila. Por lo que resultaindispensable añadir azúcares a los medios de cultivo, siendo los dos más utilizados lasacarosa y la glucosa. La concentración óptima del azúcar en los medios de cultivo varíaentre 20–80 g/L, en dependencia del tipo de cultivo, material vegetal, etc. Los azúcares presentan una acción metabólica y energética (Hall, 2000).

OBETIVO GENERAL

• Preparar medios de cultivo para el cultivo in vitro de tejidos vegetales

DESARROLLO EXPERIMENTAL

1. Preparar medio de cultivo MS semi-sólido (ver anexo). Complementarlo con losreguladores del crecimiento vegetal apropiados. Para cultivos de zanahoria utilizar 1.0mg/L 2,4-D (2,4 ácido diclorofenoxiacético). Para generación de callos de la plantadel tabaco, adicionar 1.0 mg/L de BAP (Bencil aminopurina) y 0.1 mg/L de ANA.

Para la micropropagación de violeta utilizar 1.0 mg/L de AIA y 0.08 mg/L de BAP.2. Adicionar a todos los medios sacarosa 20 g/L y agar-agar 6.0 g/L, mioinositol 0.1

g/L.

3. Utilizar las vitaminas de Gamborg (1976), también conocidas como B5. Para violetay zanahoria utilizar vitaminas MS.

4. Ajustar el pH a 5.5 con NaOH 1.0 N, antes de agregar el agar.







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5. Fundir el agar en calor y verter 25 mL por frasco (tipo “Gerber”). Cubrir con dobletapa de papel aluminio y sujetar con una liga o con tapa de plástico, esterilizar enautoclave a 121°C y 15 lb. de presión durante 15 min.







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BIBLIOGRAFÍA

• Hall R.D (2000). Plant cell culture initiation. Molecular Biotechnology 16:161-173.

• Gamborg OL, Miller RA and Ojima K. (1968). Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp Cell Res. 50:151-8.

• Murashige T and Skoog F (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15(3): 473-497.







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Práctica 3. Establecimiento de un Cultivo de Callos de Explantes de Zanahoria ( Daucus carota)

Adaptada de Dodd and Roberts, 1985.

INTRODUCCION

Los callos de plantas son masas celulares diferenciadas, no organizadas y de rápidocrecimiento que pueden ser producidas en todas las especies de plantas en respuesta a unsuplemento de hormonas endógenas o externas. Los cultivos de callos de plantas (callosque crecen asépticamente en medios semisólidos con agar y hormonas vegetales) ycultivos de suspensión de callos (callos que crecen asépticamente en medio líquidos enmatraces o biorreactores) han incrementado su uso en Biotecnología como unaherramienta para la manipulación genética de plantas, micropropagación, estudios delmetabolismo y de desarrollo celular de plantas, así como para la producción comercial de productos naturales (metabolitos primarios y secundarios). (Mc Donald, y col. 1995).

OBJETIVO GENERAL

• Familiarizar al estudiante con las técnicas de cultivo de vegetales in vitro y establecer cultivos de callos.

MATERIALES:

BIOLÓGICO

Raíces de Zanahoria ( Daucus carota)sanas y frescas.

MATERIAL DE LABORATORIO (por cada equipo)

3 vasos de precipitado de 250 ml

2 pipetas de 1 ml1 piceta de 250 ml

2 cajas de Petri

Hojas de papel blanco o papel “kraft”(estéril)

Algodón

Bisturí, navajas de bisturí y pinzas de

disección

EQUIPOS

Campana de flujo laminar

Autoclave

Potenciómetro

Balanza analítica

REACTIVOS

Etanol al 70%Solución de hipoclorito de sodio: blanqueador comercial (5.5 % de clorolibre) al 10 %.

HCl 1.0 N

NaOH 1.0 N







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1.0 litro de agua destilada estéril.

Frascos “Gerber” con Medios de Murashige y Skoog (MS) preparados en la Práctica 2 o

(Soluciones patrón de sustancias orgánicas e inorgánicas del Anexo de dicha práctica).

PROCEDIMIENTO

1. Preparar medio de cultivo MS semi-sólido, complementarlo con 2,4-D 1.0 mg/L,sacarosa 20 g/L y agar-agar 6.0 g/L, mioinositol 0.1 g/L y vitaminas. Ajustar el pH a5.5 con NaOH 1.0 N, antes de agregar el agar.

2. Preparar otro medio de cultivo, MS sin mioinositol. Todo los demás componentes a lamisma concentración y ajustar el pH del medio a 5.5.

3. Fundir el agar en calor y verter 25 mL por frasco, tapar con doble tapa de papelaluminio y sujetar con una liga o con tapa de plástico, esterilizar en autoclave a 121°Cy 15 lb. de presión durante 15 min.

MATERIAL VEGETAL

Utilizar zanahorias de aproximadamente 20 cm de longitud y 4 cm de diámetro.

a. Lavar las zanahorias con agua corriente y jabón dentro de un recipiente agitandomanualmente.

b. Pelar las zanahorias con un pelador de vegetales, eliminar 2 mm del tejido.

c. Cortar a las zanahorias en rebanadas de un cm de grueso.

d. Sumergir las rebanadas en una solución de etanol al 70% por 30 seg.

e. Sumergir las rebanadas en una solución de hipoclorito de sodio al 10%, durante 10minutos, a partir de este paso trabajar en la campana de flujo laminar.

f. Durante el tiempo de espera, numerar y pesar los frascos en los cuales se van acolocar los tejidos.

g. Lavar el material vegetal cinco veces con agua destilada y estéril, con agitacióndentro de un vaso de precipitados, durante 30 seg.

h. Del vaso de precipitados, tomar una a una las rebanadas y transferirlas a una caja dePetri estéril y con la ayuda de unas pinzas de disección, cortar cubos de la zona delcambium de un centímetro por lado de acuerdo con lo indicado en la figura 1.

i. Colocar tres cortes (cubos) de cambium por frasco, procurando que la superficie deuno de los lados del cubo quede en contacto con la superficie del medio de cultivo.







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j. Volver a pesar los frascos y calcular el peso de los explantes por diferencia.

k. Coloque los frascos con los explantes en un cuarto de cultivo con fotoperiodo de 16horas de luz por 8 de oscuridad a una temperatura de 24-26 ºC.

l. Observar cada tres días el desarrollo de los cultivos, anotar las apariencias y cambiosque van sufriendo los explantes. Separar los frascos con explantes necrosados ycontaminados y describir si se trata de contaminación bacteriana o fúngica. Es de particular importancia determinar el tiempo de aparición de los callos.

m. Pesar los frascos cada semana para calcular la tasa de crecimiento del callo.

Requisitos para el informe escrito.

1. Con los datos obtenidos del peso de los frascos, realizar la curva de crecimientodel cultivo de callos, en peso fresco vs tiempo.

2. El informe de la práctica debe contener los resultados de todos los equipos delgrupo con los que se realizará la discusión y las conclusiones de los experimentosrealizados en la misma.

3. ¿Cual es el papel, en general, del mioinositol en la fisiología de las plantas?

4. Incluir en su informe (después de haberlo leído) una copia de, por lo menos, unartículo reciente sobre el tópico o el cultivo de células y/o tejidos vegetales.

BIBLIOGRAFÌA.

1. Lebowitz, R. J. 1995. Micropropagation of African Violet. In Plant Biothecnology. ALaboratory Manual. WCB Wm. C. Brown Publishers. Dubuque, Iowa; Melbourne,Australia; Oxford, England.

2. Mc Donald, K., Jackman, A., Thorup, J. And Dandekar, A. (1995), Applied Biochemistry and Biotechnology. 54. 93-108.

3. Dixon, R. A.(1985), Isolation and Maintenance of callus and cell suspension culturesin plant cell culture. A practical approach. Ed. Dixon R. A. IRL Press, Oxford.Washington.

4. Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassayswith tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15(3): 473-497.







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Práctica 4. Micropropagación de violeta africana Saintpaulia ionantha Wendi.

Adaptada de Franco y García, 1995.

INTRODUCCION

La técnica de micropropagación de especies vegetales, utiliza diversas porciones deórganos, tejidos, etc. y proporciona una herramienta capaz de producir un gran número de plantas en cada cultivo; como consecuencia de la totipotencialidad de las célulasvegetales.

Una planta ornamental de gran interés dentro del comercio y la jardinería, es la violetaafricana Saintpaulia ionantha Wendi, originaria del este de África. En la actualidad, se

conocen más de 20 especies y cientos de variedades, las que se propagan por germinaciónde semillas o en forma vegetativa por esquejes. Las violetas son plantas muy apreciadas y por lo mismo, se encuentran ampliamente distribuidas por todo el mundo a través de lasasociaciones de floricultores y aficionados. Las violetas africanas presentan grandiversidad morfológica y con una amplia gama de tonalidades de flores que van desdevioleta púrpura a blancas.

En la literatura encontramos varios autores que desarrollaron diversas técnicas de cultivo“in vitro” para obtener violetas africanas a gran escala, a partir de pequeñas porciones de peciolo y tejido foliar, entre ellos se puede citar a Start y Cumming (1976), Bilkey yMc.Cown (1978) y Cooke R. (1977).

OBJETIVOS GENERALES

• Demostrar los principios de la micropropagación y regeneración de plantas.• Propagar violeta africana Saintpaulia ionantha Wendi, por cultivo in vitro de

explantes foliares y de peciolo.

MATERIALES

BIOLOGICOS

1 maceta con una planta de violeta africana (Saintpaulia ionantha Wendi.)

EQUIPOS


Autoclave

Potenciómetro







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Balanza analítica

MATERIAL DE LABORATORIO

1 matraz Erlenmeyer de 2L

1 matraz Erlenmeyer de 1L

2 vasos de precipitados de 250 ml

2 pipetas de 1 ml

1 piceta de 250 ml

1 agitador de vidrio

5 cajas de Petri

rollo de papel aluminio

rollo de algodón

bisturí y pinzas de disección

REACTIVOS

Etanol al 70%

Solución de hipoclorito de sodio: blanqueador comercial (5.5 % de clorolibre) al 10 %

HCl 1.0 N

NaOH 1.0 N

2.0 litros de agua bidestilada estéril.

Soluciones patrón de sustanciasorgánicas e inorgánicas (ver apéndice).

DESARROLLO EXPERIMENTAL

1. Preparar un litro de medio de cultivo semi-sólido de Murashige y Skoog (1962), MS,complementarlo con ácido nicotínico 0.5 mg, piridoxina 0.5 mg, ácido indolacético2.0 mg, 6-bencil aminopurina 0.08 mg, sacarosa 30 g y agar 6.0 g. Ajustar el pH a5.7.

2. Preparar el medio MS disminuyendo a la cuarta parte la concentración de lassustancias inorgánicas y sacarosa 15 g/L. El resto de los componentes se utilizará enla misma concentración. Ajustar el pH a 5.7.

3. Fundir el agar en calor y verter 20 mL por frasco, tapar con doble tapa de papelaluminio y sujete con una liga o con tapa de plástico. Esterilizar en autoclave a 15libras de presión y 121°C durante 15 min.

PREPARACIÓN DEL MATERIAL VEGETAL.

Utilizar hojas de violeta africana, de la planta patrón o una planta sana. Escoger variashojas desarrolladas, jóvenes (2-3 cm de diámetro) y sanas, dejar un centímetro de peciolo.







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a. Colocar las hojas dentro de un vaso de precipitados, lavar con agua corriente y jabónagitando manualmente.

b. Sumergirlas en una solución de etanol al 70% por 30 seg.c. Sumergir las hojas en una solución de hipoclorito de sodio al 10%, durante 10

minutos. A partir de este paso trabajar en la campana de flujo laminar.d. Lavar el material vegetal cinco veces con agua destilada y estéril, con agitación

dentro de un vaso de precipitados, durante 30 seg.e. Del vaso de precipitados, tomar una a una las hojas, trasnferir a una caja Petri estéril y

con la ayuda de unas pinzas de disección, cortar en fracciones de un centímetrocuadrado como se muestra en la figura 1.

f. Colocar dos o tres fracciones foliares por frasco, procurando que el envés foliar quedeen contacto con la superficie del medio de cultivo.

g. Colocar los frascos con los explantes en un cuarto de cultivo, con fotoperiodo de 16horas luz, por 8 horas de oscuridad, a temperatura de 24ºC.

h. Observar cada tercer día el desarrollo de sus cultivos. Anotar los cambios en laapariencia de los explantes. Separar los frascos con explantes necrosados ycontaminados y registrar si se trata de contaminación bacteriana o fúngica

Colocar en diferentes frascos los explantes de: a) peciolo, b) parte central de hoja y c) parte externa de la hoja (ver figura 1). Deben utilizarse los siguientes medios con losexplantes: 1) MS y 2) MS a un cuarto de sales y 15 g/L de sacarosa.

Discutir en el informe escrito sobre los siguientes puntos:

1. ¿Cuál es el significado del término totipotencialidad celular?.2. ¿En la práctica, considera factible el cultivo de una célula aislada y obtener una planta

completa?3. Escriba el significado del término micropropagación.4. ¿Qué es una célula somática?

Incluir en su informe, al menos un artículo, reciente, sobre el tema de la práctica o elcultivo de callos, células y/o tejidos vegetales al que previamente se le ha dadolectura.

5. El informe de la práctica debe contener los resultados de los todos los equipos ,discusión y conclusiones sobre los experimentos realizados bien estructuradas ysustentadas en la literatura consultada.

BIBLIOGRAFIA.

1. Bilkey, P.C. and B.H. Mc Cown 1978. Micropropagation of African Violet fromPetiolo Cross- Section. HortScience 13 (1):37-38.







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2. Cooke, R. 1997. Tissue Culture Propagation of African Violets. HortScience12(6):549

3. Franco Rodríguez José y M. T. García, 1995. Ensayo demostrativo sobre la propagación de violeta africana Saintpaulia ionantha Wendi por cultivo de tejidos.An.Esc.Nac.Cienc.Biol.México, 40:107-115.

4. Martin, C. 1985. Cultivo de plantas en probeta. Mundo Científico. No.44:160-169.5. Murashige, T. And Skoog, 1962. A revised medium of rapid growth and bioassays

with tobacco tissue. Physiol.Plantarum. 15:473-497.6. Pierik, R.L.M.1994. Biotecnología Vegetal como herramienta en la horticultura

ornamental: Revista Chapingo, serie Horticultura 1:45-57. México.7. Smith, R.H. and R.E. Noris. 1983. In vitro propagation African Violet chimeras.

HortScience 18(4):436-437.8. Star, N.D. and B.G. Cumming. 1976. In vitro propagation of Saintpaulia ionantha

Wendl. HortScience 11:204-206.9. Lebowitz, R. J. 1995. Micropropagation of African Violet. In Plant Biothecnology. A

Laboratory Manual. WCB Wm. C. Brown Publishers. Dubuque, Iowa; Melbourne,Australia; Oxford, England.







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Práctica 5. Regeneración de plantas completas a partir de explantes de hojas de Nicotiana tabacum

Introducción.

Para poder regenerar una planta completa en cultivo de tejido in vitro, es necesario proveer al tejido de los requerimientos nutricionales y factores ambientales necesarios,tales como el medio de cultivo, vitaminas, reguladores del crecimiento vegetal, pH,temperatura, etc. De particular importancia son los reguladores del crecimiento vegetal,ya que de éstos depende la respuesta que tendrá el tejido in vitro. En 1962, Murashige ySkook realizaron experimentos con la planta del tabaco y con ello marcaron la pauta paradeterminar los requerimientos para poder regenerar la planta completa del tabaco a partir

de explantes de hojas. Actualmente, la regeneración de cualquier planta completa encultivo de tejidos in vitro es de particular interés para la Ingeniería genética de plantas yaque este paso ha sido decisivo para llevar a cabo modificaciones genéticas de plantasutilizando Agrobacterium tumefaciens (Práctica 6) y bombardeo de micropartículas.

OBJETIVO GENERAL

Familiarizar al alumno con las técnicas utilizadas para el cultivo de explantes de la plantadel tabaco y regenerar la planta completa.

MATERIALES:

BIOLOGICO

Plantas de tabaco crecidas en condiciones de asepsia. Utilizar las obtenidas en la práctica

MATERIAL DE LABORATORIO (por cada equipo)

2 cajas de PetriBisturí, navajas de bisturí y pinzas de disección

EQUIPOS


Autoclave

Potenciómetro







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Balanza analítica REACTIVOS

Etanol al 70%

Frascos “Gerber” con Medios de Murashige y Skoog (MS) preparados en la Práctica 2.(Ver Anexo I para la composición de las soluciones patrón de sustancias orgánicas einorgánicas).

PROCEDIMIENTO

1. En una campana de flujo laminar, abrir los frascos en los que se germinaron las

semillas de tabaco.2. Con un bisturí, cortar hojas jóvenes de la planta del tabaco. Las hojas que masrápido y mejor regeneran son las jóvenes pero en teoría hojas de cualquier edadson útiles.

3. Colocar las hojas en una caja de Petri y realizar cortes de 1 x 1 cm. Cortar eltejido vascular principal y eliminar. Las hojas se manipulan mejor si se colocancon el envés hacía arriba.

4. Colocar los cortes (3-4 por frasco) en medio MS semi-sólido suplementado con1.0 mg/L de BAP y 0.1 mg/L de ANA.

5. Realizar observaciones cada semana. El tejido se expande y luego forma brotes pasando por un periodo casi imperceptible de callo.

6. Si a las 4 semanas no han surgido brotes, transferir el tejido a medio fresco.7. Cuando hayan surgido brotes y éstos hayan crecido de 2-3 cm, transferirlos amedio MS semi-sólido, con vitaminas B5 y SIN REGULADORES DELCREIMIENTO VEGETAL, para que formen raíces.

Requisitos para el reporte escrito.

• Incluir fotos del desarrollo del tejido.

• Explicar si es posible utilizar explantes de otros tejidos (tallo, hojas, polen, etc)

• ¿Cómo se llama a la regeneración que no pasa por tejido calloso?

• ¿Qué otras especies son capaces de formar una planta completa a partir deexplantes de hojas?







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Bibliografía

1. Murashige, T. And Skoog, 1962. A revised medium of rapid growth and bioassayswith tobacco tissue. Physiol.Plantarum. 15:473-497.







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Anexo I

Formulación de medios de cultivo

Medio de Knop

Sustancia mg/L

MgSO4 • 7H2O 200

KNO3 200

KH2PO4 200

Ca(NO3) • 4H2O *CaCl2 800 *374

Agar 6000

pH 5.5

Medio de Murashige y Skoog (1962)

Macronutrientes Concentración final mg/L g (para un stock 10X en 1L)

NH4 NO3 1650 16.5

KNO3 1900 19.0

CaCl2 • H2O 440 4.4

MgSO4 • 2H2O 370 3.7

KH2PO4 170 1.7

NaH2PO4 • H2O 85 0.85

Micronutrientes mg/L mg (para un stock 100X en 100 mL)

KI 0.83 83

H3BO3 6.2 620

MnSO4 • 4H2O 22.3 2203

ZnSO4 • 4H2O 8.6 860







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NaMoO5 • 2H2O 0.25 25

CuSO4 • 5H2O 0.025 25

CoCl2 • 6H2O 0.025 25

Na2EDTA • 2H2O 37.2 3720

FeSO2 • 7H2O 27.8 2780

Murashige y Skoog (micronutrientes) No cat. Sigma M0519 1L (Stock 10X)

Se recomienda preparar por separado los stocks para macronutrientes, micronutrientes y Na2EDTA • 2H2O y FeSO2 • 7H2O. Es importante verificar la cantidad de moléculas deagua que contiene el compuesto, en caso de tener más o menos moléculas de agua, esnecesario hacer el ajuste.

CompuestosOrgánicos

Murashige & Skoog(1962) mg/L

*MS Vitaminas1000X mg/mL

Ácido nicotínico 0.5 0.5

Piridoxina•HCl 0.5 0.5

Tiamina•HCl 0.1 0.1

Glicina 2.0 2.0

Mioinositol 100

*MS Vitamin solution (1000X) 50 ml No cat Sigma M3900

Sacarosa 20 g/L

Agar-agar o agar bacteriológico 6.0 g/L

pH 5.8







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ANEXO II

GLOSARIO

Apical: zona extrema del tallo que le proporciona crecimiento en longitud al mismo.

Aséptico: libre de gérmenes contaminantes.

Axial: zona comprendida entre el eje de un tallo o rama y una hoja.

Callogénesis: proceso en el que a partir de un explante se genera una masa amorfa decélulas llamada callo.

Cámara de flujo laminar: aparato que proporciona en su interior un ambientetotalmente estéril, necesario para la manipulación del material aséptico (tejido y mediosde cultivo).

Catalogación: método utilizado para determinar si una planta tiene o no virus.

Clon: elemento de un grupo de individuos propagados asexualmente a partir de un soloorganismo, del cual conservan las características genéticas.

Embriogénesis somática: proceso en el cual se forman, a partir de un explante,embriones asexuales, los cuales dan origen a plantas completamente desarrolladas.

Explante: pequeña porción del tejido vegetal que funciona como generador de nuevas plantas en el cultivo in vitro.

Fito-hormonas: compuestos químicos que actúan, en muy bajas concentraciones,regulando el crecimiento de los tejidos vegetales.

Fito-patógenos: microorganismos que actúan en forma dañina en las plantas.

Hibridación: cruza entre dos organismos de variedades o especies diferentes.

Híbrido: organismo obtenido por la hibridación.

In vitro: técnicas de reproducción artificial en condiciones de laboratorio.

Meristemo: estructura localizada en diferentes zonas de la planta a partir del cual seforman todos los órganos de la misma.







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Organogénesis somática: proceso en el cual se forman órganos (raíces, tallos, etc.) a partir del explante.

Plántulas: plantas pequeñas en proceso de desarrollo.

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