Manual Inmuno

Manual de Laboratorio de Inmunología

Universidad Autónoma de Chihuahua Facultad de Ciencias Químicas

Manual de Laboratorio de Inmunología

Semestre Enero – Junio 2012 M.C. Carmen Miriam de la O C.

Dra. Rocío Infante R. M.C. Tania Siqueiros C.

Dr. Gilberto Erosa de la V.

CONSIDERACIONES GENERALES.

El correcto desarrollo de cualquier tipo de prácticas de laboratorio, implica la necesidad de contar con elementos apropiados que permitan establecer los fundamentos y metodologías sobre el trabajo a realizar. Así mismo es necesario marcar algunas consideraciones sobre las reglas de seguridad, condiciones para trabajar dentro del laboratorio así como los parámetros de evaluación. Se establece:

1. La hora de entrada al laboratorio es la indicada en los horarios establecidos y publicados por la Secretaría Académica y sólo se permitirá la entrada al alumno hasta diez minutos después de iniciada la clase; después de este tiempo, podrá entrar al laboratorio pero manteniendo inasistencia en las listas de control.

2. No se permite la entrada de alumnos sin bata, la cual deberá usarse abrochada. 3. No se permite la entrada al laboratorio con alimentos o bebidas. 4. No se permite fumar dentro del laboratorio. 5. El alumno deberá permanecer dentro de las instalaciones del laboratorio hasta en

tanto no concluya con la práctica, a menos que se indique que puede salir. 6. El alumno es enteramente responsable por material(es) y equipo(s) que emplee,

los cuales deberán usarse adecuadamente. 7. Es responsabilidad del alumno dejar su área de trabajo perfectamente limpia y

ordenada al concluir con la práctica. 8. El material empleado debe ser enjuagado y depositado en los contenedores

especialmente preparados para su desinfección, para posteriormente ser lavados.

Con relación a la forma de calificar se establece.

o Presentación escrita y/o oral (según corresponda) de formato en V para cada práctica como prerrequisito, equivalente al 25% de la calificación final

o Evaluación durante las prácticas (25 %): Actitud Disciplina Medidas de seguridad Destreza Conocimiento del método Trabajo en equipo o Evaluación escrita: 3 exámenes equivalente al 25% de la calificación final.

Entrega de 3 reportes escritos equivalente al 25 % de la calificación final.

FORMATO “V” TÍTULO. Correspondiente a la práctica

OBJETIVO GENERAL. (es proporcionado en el programa de prácticas)

DIAGRAMA DE FLUJO. Consiste en un diagrama rápidoelaborado explícitamente para cada práctica, éste debe ser presentado al inicio de cada práctica, así sean más de una las que se vayan a realizar.

RESULTADOS. Datos concretos de los resultados obtenidos, incluye cálculos,

gráficas, tablas,unidades de medición, etc...

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS Y CONCLUSIONES. Significado de los

resultados expresado en sus propias palabras.

REGLAMENTO DE LABORATORIO.

Con el objetivo de definir los derechos y obligaciones del laboratorio, así como los aspectos de seguridad e higiene que deben contemplarse dentro de éstos, se transcriben los artículos relacionados del Reglamento de Laboratorios de la Facultad de Ciencias Químicas.

Articulo 14o. Derechos de los usuarios:

Los grupos de docencia tendrán la prioridad para el uso de las instalaciones en el horario establecido para tal fin, siempre bajo la supervisión del maestro que tiene asignado el grupo. Articulo 15o. Obligaciones de los usuarios:

a). Trabajar en los horarios oficialmente asignados para ello. b). Ser responsables del uso correcto de instalaciones, mobiliario, equipo especializado, equipo de seguridad y sustancias utilizadas durante su trabajo. c). Al finalizar su trabajo, deberá devolver el material que le fue entregado. En el caso de material extraviado o dañado deberá reponerlo en un plazo no mayor de cinco días hábiles. Articulo 17o. Seguridad e Higiene

Con el fin de mantener la salud y la seguridad de las personas que trabajan en el laboratorio, los usuarios deberán acatar las disposiciones de seguridad como son: a). Usar los equipos de protección tales como bata, guantes, cubreboca, lentes, pinzas y mascarillas según se requiera en el laboratorio. b). Comentar al maestro las sugerencias y observaciones que juzgue para evitar accidentes. c). Dar aviso inmediato al maestro, cuando se registre algún accidente. d). Quedan prohibidas las siguientes acciones:

• Fumar, consumir alimentos y bebidas dentro del laboratorio. • Pipetear directamente con la boca. • Trabajar a solas en el laboratorio. • La permanencia en el laboratorio de personas ajenas a éste.

MANEJO DE RPBI

SEPARACIÓN Y ENVASADO

TIPO DE RESIDUO ESTADO FÍSICO ENVASADO COLOR

Sangre Líquido Recipiente Hermético Rojo

Cultivos y Cepas de

Agentes Infecciosos Sólido Bolsa de Plástico Rojo

Residuos No

Anatómicos Sólido Bolsa de Plástico Rojo

Patológico Sólido Bolsa de Plástico Amarillo

Patológico Líquido Recipiente Hermético Amarillo

Objetos

Punzocortantes Sólido Recipiente Rígido Rojo

RESIDUOS SÓLIDOS BOLSA ROJA Abatelenguas, algodón, aplicadores de madera, bolsas recolectoras de secreciones, cajas de Petri con cultivos contaminados, cubrebocas, gasas con sangre, hisopos, jeringas, medios de cultivo, tiras reactivas, torundas con sangre y tubos que hayan contenido sangre. RESIDUOS LÍQUIDOS CONTENEDOR HERMÉTICO ROJO La sangre y sus componentes en su forma líquida, así como sus derivados. RESIDUOS PATOLÓGICOS SÓLIDOS BOLSA AMARILLA

Órganos o partes de órganos tejidos. Cadáveres de animales y vísceras RESIDUOS PATOLÓGICOS LÍQUIDOS CONTENEDOR HERMÉTICO AMARILLO

Orina, Esputo, Heces y Líquido cefalorraquideo. RESIDUOS PUNZOCORTANTES

Agujas, Cubreobjetos y portaobjetos, Hojas de bisturí, Lancetas y Pipetas Pasteur

A) Botón de mando

B) Ajuste de Volumen

C) Botón expulsor de

puntillas

D) Puntilla Desechable

Práctica No. 1.

Uso de Micropipetas

Objetivo Aprender el uso correcto de las micropipetas, así como sus partes y funcionamiento; realizar una curva de calibración para utilizar el lector de placas de ELISA.

Fundamento Las micropipetas son dispositivos que permiten medir volúmenes pequeños desde 0.2uL hasta 1mL o más, dependiendo de la micropipeta. En las micropipetas de volumen variable se puede seleccionar un volumen dentro de un rango de valores determinado. Todas utilizan puntas de plástico desechables que se ajustan al extremo de la micropipeta, en ellas se deposita el líquido a medir. Para absorber el líquido, la pipeta debe estar en posición vertical, el pistón es presionado hasta una primera posición o tope, la punta se pone en contacto con el líquido sumergiéndola de 1 a 3mm y después, lentamente, se permite que el pistón vuelva a su posición original para llenar la punta con el volumen seleccionado previamente. Para depositar el líquido tomado, se coloca la parte inferior de la punta contra la pared interior del recipiente donde se colocará el líquido, con un ángulo entre 10 y 40º; se aprieta el botón pulsador suavemente hasta el primer tope y después hasta el segundo tope para vaciar el resto del líquido. Manteniendo apretado el botón pulsador en el segundo tope, retirar la micropipeta deslizando la punto por la pared del recipiente y soltar el botón pulsador. Finalmente se expulsa la punta con el botón expulsor en un recipiente especial para puntillas usadas.

Figura 1. Esquema de Micropipeta. A) Botón de mando o

pulsador. B) Ajuste de volumen. C) Botón expulsor de puntillas. D) Puntilla desechable.

Material Micropipetas Puntas para micropipeta de 10uL (blancas) y 200 uL (Amarillas) Balanza analítica Agua destilada Placas de ELISA Colorante de concentración conocida Guantes

Metodología NOTA: Asegurarse de utilizar la micropipeta correcta para el volumen indicado. 1. Utilizar el colorante azul de bromofenol a una concentración inicial de 10 mg/mL

para hacer diluciones seriadas en una placa de ELISA. 2. Hacer las diluciones por duplicado. 3. Poner 200uL del colorante en el primer pozo de la placa (A1 y B1) 4. Poner 100uL de agua en los pozos A2 hasta A7 y de B2 hasta B7. 5. Tomar 100uL del primer pozo (A1) y ponerlos en el pozo A2, mezclar con la

micropipeta 3 veces subiendo y bajando el líquido hasta el PRIMER tope de la micropipeta para no meter aire (dilución 1:2).

6. Tomar 100uL de la dilución 1:2 (pozo A2) y pasarlos al pozo A3 (1:4), mezclar con la micropipeta 3 veces, tomar 100uL y pasar al pozo siguiente hasta llegar al pozo A7.

7. En el pozo A7 finalmente quedarán 200uL como volumen final, de ahí desechar 100uL al pozo A8 para que todos los pozos queden con el mismo volumen.

8. Aquí se tienen las diluciones seriadas desde el concentrado que es el pozo A1 hasta la última dilución que será 1:64 en el pozo A7.

Pozo A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8

Vol. 200uL

colorante 100uL

agua

100uL agua

100uL agua

100uL agua

100uL agua

100uL agua

Dil. Conc. 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64

Conc. 10mg/mL 50 25 12.5 6.25 3.125 1.56

9. Leer en el lector de ELISA Microplate Reader Benchmark de Biorad

10. Promediar las Absorbancias obtenidas para cada dilución y graficar las

lecturas de Absorbancia promediadas contra las concentraciones de cada

dilución.

11. Sacar el valor de R2 del gráfico el cual debe estar entre 0.96 y 1.0.

Práctica No. 2

Toma de Muestra Objetivo El alumno asistirá a una conferencia "Métodos Actuales del Manejo de Muestras", donde conocerá las diferentes metodologías para la obtención de muestras, la forma de manejarlas y almacenarlas; Posteriormente en clase se practicarán los diferentes métodos de toma de muestra. Introducción

Composición de la Sangre: La sangre está formada por un líquido amarillento denominado plasma, en el que se encuentran en suspensión millones de células que suponen cerca del 45% del volumen de sangre total. Tiene un olor característico y una densidad relativa que oscila entre 1,056 y 1,066. En el adulto sano el volumen de la sangre es una onceava parte del peso corporal, de 4,5 a 6 litros. Una gran parte del plasma es agua, medio que facilita la circulación de muchos factores indispensables que forman la sangre. Un milímetro cúbico de sangre humana contiene unos cinco millones de corpúsculos o glóbulos rojos, llamados eritrocitos o hematíes; entre 5.000 y 10.000 corpúsculos o glóbulos blancos que reciben el nombre de leucocitos, y entre 200.000 y 300.000 plaquetas, denominadas trombocitos. La sangre también transporta muchas sales y sustancias orgánicas disueltas.

Funciones de la Sangre

1. Respiración: La sangre transporta oxígeno desde los pulmones hasta los tejidos y lleva CO

2 desde los tejidos a los pulmones.

2. Nutrición: La sangre transporta los materiales alimenticios absorbidos. 3. Excreción: La sangre lleva los desechos metabólicos a riñones, pulmones,

piel e intestino para su eliminación. 4. La sangre interviene en el mantenimiento del equilibrio ácido-básico normal

del organismo. 5. Interviene en la regulación del balance hídrico por los efectos que ella tiene

sobre el recambio de agua que ocurre entre el compartimiento intravascular y el intersticial.

6. Interviene también en la regulación de la temperatura corporal distribuyendo el calor en el organismo.

7. Constituye uno de los mecanismos de defensa del organismo contra la infección por medio de los leucocitos y de los anticuerpos circulantes.

8. Contribuye a la regulación del metabolismo, transporte de hormonas. 9. Transporta a los metabolitos.

Equipos, Materiales y Sustancias:

Cantidad Equipos y Materiales

* Tubos al vacío Vacutainer

* Jeringa de 3 ml

1 Pipeta Pasteur

1 Tubo de ensaye (centrífuga)

1 Lanceta

1 Ligadura

1 Torundas con alcohol

Cantidad Sustancias

* Etanol

2- 3 ml Sangre Venosa

Metodología

Punción venosa

1. Procure mostrar seguridad al paciente, de esta manera será mas fácil tomar la muestra.

2. Tome la aguja y rompa el sello de seguridad a la vista del paciente 3. Coloque la aguja en el sistema vacutainer o bien en el caso de jeringa de

plástico puede ser necesario o no realizar este paso 4. **En caso de utilizarse una jeringa debe de sacarle el aire y verificar que la

aguja esté bien apretada** 5. Coloque el brazo que se va a puncionar apoyando en la mesa de trabajo

formando un ángulo. 6. Ponga la ligadura, localice la vena de mejor grosor, haga asepsia

correspondiente y destape la jeringa colocando el bicel hacia arriba que dando en forma perpendicular a la vena.

7. Introduzca la aguja, cuando esté en vena, en el caso de vacutainer es en este momento cuando se introduce el tubo de vacío para obtener la muestra, en cambio en el caso de jeringa de plástico se debe de jalar el émbolo para aplicar la presión negativa. En ambos casos se debe de fijar la jeringa esto es para evitar movimientos de avance hacia dentro o afuera la vena.

8. Quite la ligadura y presente la torunda en donde se encuentra la aguja, saque ésta lentamente y aplique presión sobre el sitio de la punción.

9. Retire y agite suavemente el tubo en caso de vacutainer. 10. Quite la aguja y en el caso de la jeringa introduzca la sangre por las paredes

de tubo de ensaye. 11. Retire el coágulo de su muestra utilizando un “palillo” de madera

introduciendo éste por la pared del tubo y girándolo en la muestra con movimiento circular sin separarlo de la pared del tubo (coágulo-recipiente rojo).

12. Coloque su muestra en la centrífuga cuidando que tenga un tapón así como un contrapeso exacto. Centrifugue a 3500rpm por 5 minutos.

13. Una vez centrifugada extraiga su muestra de la centrífuga y retire el suero (parte clara y superficial) con la ayuda de una pipeta pasteury deposite en un tubo para muestras de SHT (Tubo eppendorf de 1.5mL). Tenga cuidado de hacerlo en un área cercana a la interfase de su muestra ya que esto puede contaminar su muestra con eritrocitos y demás células sanguíneas.

14. Para la extracción de sangre de la mano se utiliza la aguja en mariposa pero la metodología y cuidados son los mismos sólo que en esta se debe de tener en consideración que el flujo sanguíneo es menor y por esto tardarán en llenarse los tubos.

Punción capilar

1. Hacer asepsia en el dedo que se va a puncionar. 2. Abrir la lanceta por la parte superior dejando la punta en el paquete. 3. Presionar el dedo y picar con fuerza una sola vez. 4. Comienze a llenar el tubo capilar hasta ¾ partes dando ligeros masajes al

dedo puncionado sin tocar el sitio de punción. Tiempo estimado de la práctica: 5 horas Disposición de RPBI: Recipiente color rojo, residuos de origen sanguíneo; bolsa roja material y equipo en contacto con dichos residuos. Equipo de Seguridad: Guantes de látex, bata.

Práctica No. 3

Inmunización de Animales Objetivo

Conocer el funcionamiento del bioterio de la Facultad así como la manera correcta de manejar a los animales del mismo. Conocer las diferentes vías de administración de antígenos y lograr distinguir entre éstas, cual es la más conveniente según el tipo de antígeno y realizar la aplicación en conejos parara lograr obtener la respuesta inmunológica más adecuada (sueros hiperinmunes). Introducción Se conoce como inmunización al proceso mediante el cual, se induce una respuesta inmunológica en el individuo competente, a consecuencia del

contacto con antígeno específico en forma natural o artificial. La respuesta inmune obtenida puede ser humoral, celular o ambas dependiendo de diversos factores tales como: dosis, vía de administración. tipo de antígeno, etc. En el caso de la respuesta humoral, el suero con un alto contenido de anticuerpos, se conoce como antisuero o suero hiperinmune. La aplicación práctica de los antisueros es muy diversa pues se puede utilizar con fines terapéuticos (inmunización pasiva) en diversos estados infecciosos o tóxicos (neumonía, tétanos, etc.). Además son útiles en la identificación de microorganismos aislados de procesos infecciosos y en la clasificación taxonómica de diversas especies. También han servido como herramientas de trabajo para dilucidar mecanismos inmunológicos básicos: especificidad inmunológica, activación del complemento, fagocitosis, citotoxicidad y en la determinación rápida y específica de la naturaleza de diversas substancias químicas (proteínas, carbohidratos, haptenos, etc.).

Vías de inmunización: Se pueden emplear vías tales como la oral, nasal, intramuscular, intravenosa, intracardíaca, subcutánea, intradérmica, intraperitoneal, etc. La elección de la „vía dependerá, entre otras cosas, de la especie que se trate, de las características del antígeno y del propósito de la inmunización. Sin constituirse en regla los antígenos particulados, resultan buenos inmunógenos cuando se administran por vía intravenosa en conejos por ejemplo, mientras que para antígenos solubles la vía usual es la intradérmica o subcutánea, siempre y cuando el antígeno se acompañe de los llamados adyuvantes.

Adyuvantes: Son substancias que cuando se inyectan junto con el antígeno, permiten aumentar el nivel de anticuerpos circulantes aunque también pueden inducir o elevar el grado de respuesta celular, Algunos adyuvantes son en sí antigénicos (endotoxinas de bacterias Gram negativas como Bordetellapertusis, micobacterias, etc.), mientras que otros no lo son (tartrato alumínico de potasio o alumbre, fosfato de calcio, aceite mineral, lanolina, diversos agentes tensodepresores, polinucleótidos y otros). Teóricamente los adyuvantes pueden funcionar:

a) Aumentando directamente el número de células involucradas en la formación de anticuerpos.

b) Favoreciendo el mejor procesamiento del antígeno por las células fagocíticas. c) Prolongando la duración del antígeno en el animal inmunizado.

Actualmente, el adyuvante de mayor uso es el de Freund. El llamado adyuvante “incompleto” de Freund es una mezcla de aceite mineral (Drakeol, Bayol, Nujol) con un detergente (Falba,Arlacel, Aquafor) en diferentes proporciones, por ejemplo: Arlacel-Drakeol (1:9); Arlacel-Bayol (3:17), etc. El adyuvante “completo” de Freund contiene además una micobacteria (M. tuberculosis, M.bovis, M. phelei u otros) cuya cantidad es variable (por ejemplo, de 1.0 a 5.0 mg de la bacteria, peso seco, por cada 1.0 mi de la mezcla incompleta de Freund). En los humanos no se recomienda el uso de este tipo de adyuvantes (Freund completo o incompleto) ya que su aplicación puede conducir al desarrollo de granulomas severos. Sangrado: Para todos los antígenos el sangrado se hará antes y después del protocolo de inmunización, generalmente de 4 a 7 días después de la última inmunización, tratando de extraer la mayor cantidad de sangre posible. El sangrado es indispensable para contar con el suero testigo. La separación del suero se hace después de incubar la sangre coagulada a 37ºC durante 30 a 60 minutos. Es conveniente remover el coágulo con un aplicador al principio de la incubación, con el objeto de facilitar la retracción del mismo y la separación del suero. El suero se separa del coágulo mediante centrifugación a 3000 rpm durante 2 min y se transfiere con pipetas Pasteur a recipientes apropiados. Se puede conservar indefinidamente si se mantiene estéril o adicionado con merthiolate (concentración final 0.01%) o azida de sodio (0.1 %). Equipos, Materiales y Sustancias:


* Jeringas estériles de 2.5 ml con agujas del #21.

* Jeringas estériles de 50 ml, con agujas del 18 para sangrado

1 Una caja para sujetar animales (conejos).

1 Frasco con torundas de algodón con alcohol.

* Tubos de 13 x l00 mm

1 Frascos con solución salina estéril al 0.85 %.

1 Mechero

Cantidad Sustancias

* Antígeno suficiente para inmunizar a conejos de acuerdo al protocolo de inmunización. (Se describen a continuación).

1 Animales (conejos) suficientes para obtener la cantidad adecuada de antisueros, según la necesidad del curso.

Metodología PROTOCOLO DE INMUNIZACIÓN

Jaula .

Antígeno .

Un programa estándar de inmunización para conejos es el siguiente:

Día 0 14 28 38 56 66 87

Inyección 1ª* 2ª** 3ª** 4ª**

Sangrado Pre-

inmune 2 ml 20 ml 60 ml

* Inmunización: se realiza por vía intradérmica (día 1 del protocolo). En el inóculo se administran 250µg de antígeno en un volumen de 1ml (Se añade PBS al antígeno hasta completar 0.5ml y posteriormente se mezcla con 0.5ml de Adyuvante Completo de Freund uniendo dos jeringas con un conector y pasando el fluido de una a otra para conseguir una correcta homogenización de los componentes). Precaución: ¡esté seguro que el montaje es seguro! ** Boosters= dosis de recuerdo. En cada booster se administran 125µg de antígeno en un volumen de 0.5ml por vía intramuscular (Se añade PBS al antígeno hasta completar 0.25ml y posteriormente se mezcla con 0.25ml de Adyuvante Incompleto de Freund siguiendo el mismo proceso que en la inmunización)

Tiempo estimado de la práctica: 3 horas Disposición de RPBI: Recipiente color rojo, residuos de origen sanguíneo; bolsa roja material y equipo en contacto con dichos residuos. Equipo de Seguridad: Guantes de látex, bata.

Reporte: Datos del Conejo: Raza Edad Sexo Características particulares

Jaula ____________. Antígeno ______________.

Día Fecha Procedimiento Ag/Adyuvante Observaciones

1 Obtención suero preinmune / Inmunización

14 1erBooster

28 2doBooster

38 Obtención de suero para titular.

56 3erBooster

66 Obtención de suero para titular.

87 Sangrado final. Obtención suero hiperinmune.

Bibliografía: - Campbell, D.D., Garvey, J.S., Cremer, N.E., Sussdorf, D.H. (1970). Methods in Immunology.2aEd. W.A. Benjamm, Inc. - Kabat, E.A., Mayer, M.M. (1961). Experimental Immunochemistry, 2aEd. Charles C. Thomas, Illinois, USA: 150. - Williams, C.A., Chase, M.W. (1967). Methods in Immunology and Immunochemistry. Ed. Academic Press Inc., New York and London. 2:197. http://depa.pquim.unam.mx/inmuno/contenido/capi-4/adyuvantes-3.htm - Garvey, J.S., Cremer, noreste, y Sussdorf, ADO. (1977) En: Métodos en inmunología. Pub. Benjamin/Cummings Publishing Company. Massachusetts pp545

http://depa.pquim.unam.mx/inmuno/contenido/capi-4/adyuvantes-3.htm

Práctica No. 4

Demostración de Órganos Linfoides Objetivo

Identificar los órganos Iinfoides y las diferentes células que intervienen en la respuesta inmune utilizando modelos animales. Introducción

El sistema inmune está organizado para llevar a cabo sus funciones de defensa, homeostasia y vigilancia. Al respecto son de especial importancia cuatro tipos de tejido linfático: 1) Nódulos linfáticos 2) Ganglios linfáticos 3) Bazo 4) Timo Aunque las cuatro variedades parecen llevar a cabo linfopoyesis, solo responden activamente a los estímulos antigénicos los tres primeros. El timo parece autónomo al respecto, podría ser un órgano linfático encargado de la embriogénesis y la orquestación del resto de los tejidos linfoides periféricos. Timo Es un órgano plano y blando situado en la cavidad torácica, por encima del corazón. Está formado por dos lóbulos rodeados por cápsula de tejido conjuntivo. A su vez, los lóbulos están divididos en lobulillos separados entre sí por trabéculas de tejido conjuntivo. Cada lobulillo tímico está relleno de células linfoides denominadas timocitos, dispuestas en una corteza de gran densidad celular y una médula (interior) de menor densidad celular. Desde la corteza hasta la médula existe un gradiente de diferenciación. El timo de los mamíferos va involucionando con la edad, a partir de la pubertad. La Bolsa (bursa) de Fabricio es una porción especial dorsal de la cloaca, con una estructura a base de corteza y médula. La médula ósea en los adultos de los mamíferos es un equivalente "disperso" de la Bolsa de Fabricio. La porción implicada en la maduración de los linfocitos B está constituida por islas de tejido hematopoyético. Precisamente por su carácter difuso es más difícil de estudiar que la Bolsa. Los linfocitos maduros vírgenes que salen de los órganos linfoides primarios emigran a los órganos y tejidos linfoides periféricos: Capsulados: en ellos se produce la secreción de Anticuerpos (Ac) que se distribuirán por la circulación; también se dan respuestas celulares locales. ganglios (recogen Antígenos (Ag) de la piel y de superficies internas) bazo (recoge Ag de la sangre)

Órganos no capsulados asociados a mucosas (MALT): protegen del Ag que entre directamente a través de mucosas (gastrointestinal, respiratoria, genitourinaria). Su respuesta es la secreción de inmunoglobulina A secretoria (sIgA), que recubrirá la superficie mucosal (epitelial). Acúmulos más o menos difusos (no capsulados), dispersos por casi todo el cuerpo.



2 Guantes

1 Ratones

1 Equipo de disección

1 Caja para anestesiar animales

* Cloroformo

3 Caja de petri

1 Émbolo de jeringa

* Pipetas pasteur

* Bulbos para pipeta

Metodología 1. Aplique la anestesia a un algodón y colóquelo en un frasco de plástico.

2. Introduzca el algodón impregnado de cloroformo o éter y espere a que se duerma

completamente.

3. Se coloca boca arriba, se toma de la cabeza y se tira fuertemente de lacola, con el fin de desnucarlo. 4. Después se coloca en la plataforma y se aseguran las patas en cada extremo.

5. Se procede haciendo un botón en la parte ventral del cuello a la altura delas extremidades superiores y se hace el corte longitudinal (del cuello a labase de la cola). 6. Cortar con las tijeras por el borde del tórax, las costillas y extraiga los órganos linfoides con pinzas y deposítelos en la caja petri (que contiene solución salina) para su observación. 7. Macerar los órganos con el émbolo de la jeringa. 8. Corte una de las patas traseras del animal y retire el tejido adherido a el hueso. 9. Con la ayuda de una jeringa inyecte solución salina por uno de los extremos y reciba el contenido en un portaobjetos.

10. Realizar un frotis haciendo una extensión* sobre un portaobjetos tanto de sangre como de cada uno de los órganos a analizar. Marcar los portaobjetos. * La extensión ideal comprende una porción gruesa y una delgada, con una transición gradual entre ambas; su aspecto ha de ser liso y nivelado, sin ondulaciones, resaltes, ni poros. 11. Dejar secar al aire todos los frotis. Tinción Rápida con Hemocolorante 1. Sumergir el frotis en la solución fijadora 5 veces durante 1 segundo cada vez, dejar escurrir el exceso. 2. Sumergir el frotis en el hemocolorante UNO, 5 veces durante 1 segundo cada vez, dejar escurrir el exceso. 3. Sumergir el frotis en el hemocolorante DOS, 5 veces durante 1 segundo cada vez, dejar escurrir el exceso. 4. Lavar con agua destilada y dejar secar. 5. Observar al microscopio. RESULTADOS E INTERPRETACIÓN

1. Los eritrocitos son rosa salmón. 2. Los núcleos de los neutrófilos es púrpura, sus gránulos son lila marrón y el

citoplasma rosa pálido. 3. Los eosinófilos tienen núcleo violeta; con gránulos rojo a naranja y

citoplasma azul. 4. Los basófilos tienen un núcleo púrpura o azul oscuro, con gránulos púrpura

oscuro (casi negro). 5. Los linfocitos tienen un núcleo púrpura oscura y citoplasma azul. 6. Los monocitos tienen núcleo púrpura y citoplasma azul-gris. 7. Las plaquetas tienen coloración violeta o púrpura.

Tiempo estimado de la práctica: 3 horas y media Disposición de RPBI: Recipiente color rojo, residuos de origen sanguíneo;

bolsa roja material y equipo en contacto con dichos residuos. Equipo de Seguridad: Guantes de látex, bata.

Bibliografía: Abbas, A., Lichtman, A., Pober, J. (1995).Cellular and Molecular Immunology. ED. W.B. Saunders Company. U.S.A :22- 32. Roitt,I. (1994) Essential Immunology. Eighth Edition.E.D.Blackwell Scientific Publications. Roitt,I., Brostoff,J., Male,D.(1994).Immunology. Fouth Edition.Ed Mosby. Gradwohl S. y Jarett. (1986). Métodos y diagnósticos del Laboratorio Clínico. Ed. Méd. Panam. 8a. Ed. Vives J.L., Aguilar J.L. (1992) Manual de Técnicas de Laboratorio en Hematología. Ed. Masson-Salvat Med.

REACCIONES DE PRECIPITACIÓN

La reacción de precipitación se presenta cuando un antígeno multivalente en estado soluble, se une con su anticuerpo específico y así da lugar a la formación de un complejo insoluble. Esta reacción se utiliza ampliamente para demostrar y cuantificar antígenos y anticuerpos y se puede llevar a cabo en medio líquido o semisólido. La precipitación en medio líquido puede ser semicuantitativa o cuantitativa. En la primera sólo se estima la cantidad relativa de precipitado formado y en la segunda, al precipitado formado se le determina la concentración de proteínas totales por métodos espectrofotométricos. Cuando la reacción se realiza en MEDIO LÍQUIDO, la cantidad de precipitado varía según la proporción de los reactivos. Si disponen una serie de tubos conteniendo el mismo volumen de antisuero y cantidades crecientes de antígeno, puede observarse que el precipitado formado alcanza un máximo, después del cual, progresivamente se encuentra una disminución en la cantidad de precipitado. Si se analizan los sobrenadantes de todos los tubos, los correpondientes a los que presentan un máximo de precipitación prácticamente no tienen antígeno ni anticuerpos, en tanto en los precedentes, puede demostrarse la presencia de anticuerpos y en el resto, la presencia de antígeno. Si los resultados se grafican, colocando en el eje de las abscisas la cantidad de antígeno agregado y en el de las ordenadas la cantidad de precipitado, se obtiene una curva, generalmente en forma de campana, que se puede dividir en 3 regiones, según se ilustra en la figura siguiente:

La reacción de precipitación en MEDIO SEMISÓLIDO, se efectúa en gel y se

conoce como Inmunodifusión. Esta consiste en la difusión, a través de un gel, de un antígeno y su anticuerpo homólogo con la consiguiente aparición de una banda de precipitado en el sitio en donde se alcanzan las concentraciones óptimas de ambos reactivos. La velocidad de la difusión depende de la forma, tamaño y concentración de las moléculas participantes, así como de la temperatura a la cual se realice la reacción. Cuando se tienen dos o más tipos de moléculas, estas pueden difundir a diferente velocidad. En el sitio en que se localicen zonas de concentración óptima de antígenos y de anticuerpos, se formarán bandas de precipitación. El número de bandas presentes es igual al número mínimo de sistemas antígeno-anticuerpo. Existen diferentes tipos de inmunodifusión. Aquel en el que ambos reactivos difunden libremente en el gel, se le llama Doble difusión o Método de Ouchterlony, en el cual puede tener diversas aplicaciones, por ejemplo, la determinación de la posible relación inmunológica entre dos antígenos, el número de sistemas antígeno-anticuerpos presentes y la semicuantificación de un antígeno o de un anticuerpo. Otra variante en la que sólo uno de los reactivos (generalmente el antígeno) difunde en el gel, donde se haya embebido otro (generalmente el antisuero), se conoce como inmunodifusion simple. En la inmunodifusion radial se aplica este principio para determinar cuantitativamente la concentración de un antígeno, este se encuentra en una concentración inicial tan alta, que se forman complejos solubles y a medida que va difundiendo, la concentración disminuye hasta que en el sitio en donde los reactivos están en proporciones óptimas se forma un halo de precipitación cuyo diámetro tiene relación directa a la concentración del antígeno. Para esta prueba se deben utilizar muestras estandarizadas de concentración conocida del antígeno, que sirven como patrones de referencia. La técnica de inmunoelectroforesis fue propuesta por Grabar y Williams quienes combinaron las técnicas de electroforesis y de inmunodifusion, para separar y determinar la presencia de los componentes de una mezcla de sustancias antigénicas. Primeramente los componentes de la mezcla son separados por la aplicación de una corriente eléctrica y posteriormente se hacen reaccionar con sus anticuerpos específicos, con lo que se realiza la precipitación. En la contrainmunoelectroforesis, los antígenos y sus anticuerpos, simultáneamente se someten a la acción de un campo eléctrico en un gel a pH 8.6. En estas condiciones, los anticuerpos, casi no tienen carga, por lo que no se desplazan bajo el efecto de la corriente eléctrica, sin embargo, se mueven hacia el cátodo debido al flujo endosmótico del regulador usado. Los antígenos que posean carga negativa migran hacia el ánodo y mediante la disposición apropiada de los pozos en el agar, se puede lograr que el antígeno y el anticuerpo se encuentren, reaccionen y se desarrollen bandas de precipitación en poco tiempo, dependiendo de la concentración y la velocidad de migración de los reactivos. Obviamente este método no es aplicable a antígenos con carga positiva o neutra. BIBLIOGRAFÍA. Rose,N., Friedman,H. Fahey. J.C. Thirth Edition.(1986). Clinics Immunologic Methods. Ed. American Society Of Microbiology.

Práctica No.5

Inmunodifusión Doble (Método de Oüchterlony). Objetivo Practicar las diferentes reacciones antígeno-anticuerpo, usadas con más frecuencia en inmunología clínica y distinguir entre reacciones de precipitación, aglutinación activa y aglutinación pasiva. Introducción

Gracias a que las moléculas de inmunoglobulina tienen por lo menos dos sitios para unirse con el antígeno, es decir son por lo menos divalentes; a que normalmente son policlonales y a que las moléculas de antígeno tienen generalmente más de un determinante antigénico, el encuentro entre las dos poblaciones, la de antígenos y la de sus inmunoglobulinas específicas, resulta en la formación de una red tridimensional entre ellas. Esta red o complejo, Ag-Ac, facilita fagocitosis del antígeno in vivo; y, siendo lo suficientemente grande para ser visible, se utiliza in vitro para demostrar la presencia de antígenos específicos para una Ig de especificidad determinada. Diversas técnicas tales como, inmunodifusión radial, inmunoelectroforesis e inmunodifusión doble utilizan la formación de complejos Ag-Ac para detectar antígenos. En este ejercicio haremos inmunodifusión doble. En esta técnica se prepara un gel de agarosa, en el cual se colocan, a una distancia de varios mm una de otra, las dos poblaciones. Tanto las inmunoglobulinas como los antígenos migran por difusión y en minutos, o pocas horas, se encuentran. Si hay especificidad entre ellas y están presentes en las concentraciones apropiadas se forma en pocas horas, el complejo Ag-Ig que es visible como una línea blanca. Esta línea se forma en el frente del encuentro de las dos poblaciones y es por lo tanto perpendicular a la dirección de migración entre ellas. Generalmente se quiere comparar la presencia de antígeno en diversas muestras, entonces las diversas muestras se colocan a distancias equidistantes de la preparación de Ig. Si dos preparaciones colocadas en la vecindad una de otra contienen el antígeno sus líneas de complejo Ag-Ac, también llamadas líneas de precipitación, se fusionan y aparecen como un arco continuo. Principio de la Prueba: Las pruebas de Inmunodifusión, se basan en el principio de Difusión Doble. Anticuerpos y Antígenos solubles se inoculan en pozos separados sobre la superficie de un medio de difusión (Gel de Agarosa comercial (Placas de Agarosa IMMY) ò casero y/o Cleargel), permitiendo que difundan a través del mismo durante el tiempo de incubación. En todos aquellos puntos donde el Antígeno y los Anticuerpos difundan juntos, es decir se combinen en concentraciones relativamente equivalentes acorde a la especificidad de la reacción Ag-Ac, se formaran bandas ó líneas visibles de precipitado, que pueden leerse fácilmente

observando la placa contra un fondo negro y bajo la incidencia de una lámpara de luz blanca de alta intensidad Lectura de la Prueba: -Las bandas precipitantes que se formaron en la placa después de la incubación, pueden ser fácilmente leídas o detectadas colocando la placa sobre un fondo negro y haciendo pasar un haz de luz blanca de alta intensidad desde el fondo de la placa hacia la superficie de la misma y en un ángulo de incidencia de aproximadamente 45º. -El ojo de la persona que está leyendo debe estar sobre la placa, fuera del punto donde incide el haz de luz y en una posición adecuada de manera tal que la luz refractada a partir de la superficie de la placa le permita observar las bandas existentes, las cuales se observan más brillantes que el gel. -Las Bandas de No Identidad son significativas ya que los Sueros Controles pueden no reaccionar con todos los epítopes antigénicos específicos presentes. Cuando se observan Bandas de No – Identidad, la placa debe ser sumergida en una solución de Citrato de Sodio al 5% ph 7.0 por 45 min. Posteriormente a esta incubación, se decanta el exceso de Citrato de Sodio y se reexaminan las placas. Al observar de nuevo las placas, es posible que algunas de las Bandas de No – Identidad observadas inicialmente ya no aparezcan. Si esto ocurre, estamos seguros que esas bandas eran causadas por la presencia de Proteína C reactiva en la muestra del paciente y no por ser una Banda de No – Identidad realmente. Si después de la incubación con Citrato de Sodio, se siguen observando la presencia de Bandas de No – Identidad, estas deben ser reportadas. -Para que la Corrida sea válida, siempre deben estar presentes las Bandas de Control. Si las mismas no pueden ser detectadas, es decir, no se formaron, la prueba debe ser repetida. Equipos, Materiales y Sustancias:

Cantidad Equipos , Materiales y Sustancias

1.2 gr Agar Noble o agarosa.

* Solución salina isotónica, pH 7.2

* Solución de merthiolate al 1%

2 Portaobjetos limpios y desengrasados.

2 Cajas Petri

4 Aplicadores.

2 Discos de papel filtro.

2 Pipetas pasteur o capilares.

* Soluciones de antígeno

* Antisueros

* Tubos de 13 x 100

Metodología

1. En un vaso de precipitado de 250 ml, se colocan 150 ml de agua destilada. 2. Se agregan 150 ml de agar noble o agarosa y se hace hervir hasta la disolución

total del agar (aproximadamente 1 h). El volumen de agua evaporada, se repone con agua destilada.

3. En la solución de agar aun caliente, se sumergen portaobjetos perfectamente limpios y desengrasados, los cuales posteriormente son secados y colocados en un horno precalentado a 100oC, hasta que se sequen.

4. En forma semejante a la indicada en los pasos 1 y 2, se preparan 100 ml de una solución de agarosa al 1% en solución salina pH 7.2. Se debe añadir 1 ml de solución de merthiolate.

5. Los portaobjetos secos se acomodan sobre una superficie perfectamente horizontal y con una pipeta de punta ancha, se les colocan a cada uno, 4 ml del agarosa al 1% caliente. La agarosa deberá dejarse gelificar a temperatura ambiente.

NOTA: los pasos del 1 al 5 los realizan previo a la práctica los alumnos de

ayudantías. 6. Con ayuda de un molde apropiado, se practican perforaciones al gel y la agarosa

residual se remueve con un aplicador. 7. Los pozos así formados, se llenan con el antígeno en el centro y los sueros

alrededor y viceversa según sea el caso. 8. Se improvisa una cámara húmeda, usando una caja de petri cuya tapa se recubre

con un disco de papel filtro húmedo. 9. Se colocan los portaobjetos en el interior de la cámara húmeda sobre aplicadores

de madera. 10.Se incuban a temperatura ambiente durante 24 a 48 hrs y se buscan bandas de

precipitación. Tiempo estimado de la práctica: 2 horas Disposición de RPBI: Recipiente color rojo, residuos de origen sanguíneo; bolsa roja material y equipo en contacto con dichos residuos. Equipo de Seguridad: Guantes de látex, bata. Resultados:

Se dibuja el esquema de perforaciones utilizado, indicando que solución fue colocada en cada perforación, así como las bandas que hayan aparecido.

Bibliografía:

Manual of ClinicalLaboratoryInmunology 3ª Edición. Autor(es): Noel R.Rose, Herman Friedman, John L. Fahey

http://www.labgeminis.com/techinfo/immy/serologia_hongos.html

Práctica No. 6

Inmunodifusión Radial Equipos, Materiales y Sustancias:


1.2 gr Agar Noble o agarosa.

* Solución isotónica, pH 7.2

* Solución de merthiolate al 1%


2 Cajas Petri

4 Aplicadores.

2 Discos de papel filtro.


* Soluciones de antígeno (1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32; 1:64)

* Antisueros

* Tubos de 13 x 100

1 Micropipeta de 10-200 µl

Metodología

1. Se preparan portaobjetos barnizados con agarosa, en forma similar a la descrita para la inmunodifusion doble (incisos IIb, 1, 2 y 3).

2. Se prepara una solución de agarosa de igual manera a la descrita para la inmunodifusion doble (incisos IIB,4).

3. La solución de agarosa se deja enfriar entre 50-55o y se le añade 5% (v/v) del antisuero mezclando perfectamente.

4. Los portaobjetos barnizados y secos se colocan sobre una superficie perfectamente horizontal y con una pipeta de punta ancha, se les colocan a cada uno, 4 ml de la solución de agarosa al 1% que ya contiene el antisuero. La agarosa deberá dejarse gelificar a temperatura ambiente.


ayudantías. 5. Sobre un eje longitudinal al centro del gel, se practican 4 perforaciones

equidistantes de un diámetro de 3mm y la agarosa residual se remueve con un aplicador.

6. Cada pozo se llena con un volumen conocido de las soluciones de antígeno de diferente concentración.

7. Se improvisa una cámara húmeda usando una caja petri cuya tapa se recubre con un disco de papel filtro húmedo.

8. Se colocan los portaobjetos en el interior de la cámara sobre aplicadores de madera.

9. Se incuban a temperatura ambiente, durante 24 a 48 h. 10.Se miden los diámetros de los halos de precipitación obtenidos. Tiempo estimado de la práctica: 2 horas Disposición de RPBI: Recipiente color rojo, residuos de origen sanguíneo; bolsa roja material y equipo en contacto con dichos residuos. Equipo de Seguridad: Guantes de látex, bata.

Resultados

Bibliografía:

- Campbell,D.H., Garvey, J.S., Cremer,N.E., y Sussdorf, D.H 1970 Methods in Immunology, 2a E. W.A Benjamin, Inc. N.Y - Cawley, L.P 1969. Electrophoresis and inmmunoelectrophoresis. Little Brown and Co., Boston. - Davis, B.D., Dulbecco, R., Ginsberg, H.S., Eissen, H.N. y Wood, W.B. 1968. Principles of Microbiology and Immunology. Ed. Harper International N.Y. y Tokio.

Práctica No. 7

Inmunoelectroforesis Equipos, Materiales y Sustancias: Cantidad Equipos y Materiales * Unidad de Electroforesis 2 Portaobjetos limpios y desengrasados 2 Cajas petri 2 Aplicadores Algodón 1 Disco de papel filtro 2 Pipetas transferencia Cantidad Sustancias * Buffer de barbituratos 0.1M, pH 8.6 * Solución de antígeno Antisuero o antisueros específicos Solución de merthiolate al 1% 1.2 gr agarosa. Metodología:

1. Se preparan 100ml de una solución de agarosa al 1% en buffer de barbituratos 0.1M pH 8.6. 2. Finalmente se agrega 1 ml de merthiolate al 1% para tener una concentración final de 0.01%. 3. Los portaobjetos secos se acomodan sobre una superficie perfectamente horizontal y con una pipeta de punta ancha se les colocan 4 ml de agarosa al 1% caliente a cada uno. La agarosa deberá dejarse gelificar a temperatura ambiente. 4. Hasta antes de su uso los portaobjetos con agarosa se deberán conservar sumergidos en regulador de barbituratos 0.1 M pH 8.6 a 4°C.


ayudantías. 5. Para ser empleados los portaobjetos con agarosa se perforan según el esquema seleccionado, extrayendo cuidadosamente el cilindro de agarosa de la perforación pero NO el del canal. 6. En el recipiente de la cámara de inmunoelectroforesis se agrega la cantidad necesaria de regulador de barbituratos. Se acomodan los portaobjetos, se establece el contacto entre la placa de agarosa y el regulador mediante tiras de papel filtro. 7. En las perforaciones de las placas de agar se colocan las soluciones de antígeno usando una pipeta o capilar y cuidando que quede completamente llena la cavidad pero sin que se derrame el líquido sobre la superficie de la placa. Una de las muestras de antígeno deberá estar teñida con azul de bromofenol para que sirva como indicador del desplazamiento.

8. Se conecta la cámara de electroforesis a la fuente de poder y se ajusta la corriente a 8-10 volts/cm de gel. La electroforesis debe llevarse a cabo de negativo a positivo. 9. Al cabo de 2 o 3 horas, cuando en el portaobjetos se observe que la muestra se ha desplazado unos 3 o 4 cm, se suspende la corriente y la cámara se desconecta. 10.Se retiran los portaobjetos, se remueve el canal de agarosa y se llena con el antisuero. 11.Se toma una caja petri, y en el interior se colocan aplicadores de madera sobre los cuales les se coloca al portaobjetos. En el fondo de la placa se pone algodón humedecido con agua, se deja a temperatura ambiente durante 24 a 48 hr, al cabo de las cuales les se hacen las lecturas.

Tiempo estimado de la práctica: 2 horas Disposición de RPBI: Recipiente color rojo, residuos de origen sanguíneo; bolsa roja material y equipo en contacto con dichos residuos. Equipo de Seguridad: Guantes de látex, bata. Resultados Bibliografía: - Campbell,D.H., Garvey, J.S., Cremer,N.E., y Sussdorf, D.H 1970 Methods in Immunology, 2a E. W.A Benjamin, Inc. N.Y - Cawley, L.P 1969. Electrophoresis and inmmunoelectrophoresis. Little Brown and Co., Boston. - Davis, B.D., Dulbecco, R., Ginsberg, H.S., Eissen, H.N. y Wood, W.B. 1968. Principles of Microbiology and Immunology.Ed. Harper International N.Y. y Tokio.

Práctica No. 8

Cuantificación de las fracciones C3 y C4 del Complemento por turbidimetría Objetivo General

Interpretar los resultados de la cuantificación de las fracciones C3 y C4 del complemento en una muestra problema. Introducción:

El complemento sérico comprende un grupo de proteínas que median las respuestas inmunológica e inflamatoria. La denominada cascada del complemento involucra una serie de reacciones enzimáticas que se llevan a cabo en la sangre. La actividad del complemento (CH50, CH100, componente terminal del complemento o proteínas del complemento individual) se mide para determinar si el complemento está involucrado en el origen de muchas enfermedades. La actividad del complemento también se mide para evaluar la severidad de una enfermedad o determinar la eficacia del tratamiento. Por ejemplo, los pacientes con lupus eritematoso activo pueden tener niveles deprimidos de C3 y C4 y estos niveles del componente pueden servir como índice preliminar de la actividad de la enfermedad. FUNDAMENTO. Es un ensayo turbidimétrico para cuantificación del complemento C3 y C4 en suero o plasma humano. Los anticuerpos anti-C3 y anti-C4 forman compuestos insolubles cuando se combinan con el C3 o C4 respectivamente de la muestra del paciente, ocasionando un cambio en la absorbancia proporcional a la concentración de C3 o C4 en la muestra problema y que puede ser cuantificada por comparación con un calibrador de concentración conocida. Equipos, Materiales y Sustancias:


Diluyente R1 para montar muestras y calibradores

Diluyente tris 20 mmol/L, g/L, PEG 8000 pH 8.2 azida sódica

Muestra Suero o plasma diluído 1:21 con diluyente.

Anticuerpo R2

Suero humano, conteniendo azida de sódica 1 g/L. La concentración deC3 es de 480 mg/dL y de C4 es de 80 mg/dL

Calibrador PROT CAL

Metodología

TODOS LOS REACTIVOS DEBEN LLEVARSE A TEMPERATURA AMBIENTE ANTES DE TRABAJAR. Reactivo de Ac y diluyente, listos para trabajar. Curva de calibración.

Preparar las siguientes diluciones del Calibrador de proteínas (PROT CAL en NaCl 0.9% como diluyente) PARA OBTENER LAS CONCENTRACIONES DE CADA DILUCIÓN DE C3 Y C4, MULTIPLICAR LA CONCENTRACIÓN DE C3 O C4 DEL CALIBRADOR POR EL FACTOR CORRESPONDIENTE INDICADO EN LA TABLA.

PROCEDIMIENTO Curva de calibración.

C3 Y C4 SE PROCESAN EXACTAMENTE IGUAL, SOLO TENGA CUIDADO DE ETIQUETAR ADECUADAMENTE SUS TUBOS DE REACCIÓN.

# Dilución del Calibrador 1 2 3 4 5 6

Calibrador (µl) -- 10 25 50 75 100

NaCl 0.9% (µl) 100 90 75 50 25 --

Factor de dilución 0 0.1 0.25 0.5 0.75 1.0

Concentración de la dilución de C3 0 48 120 240 360 480

Concentración de la dilución de C4 0 8 20 40 60 80

PROCEDIMEINTO PARA PROCESAR LA CURVA DE CALIBRACIÓN Y LAS MUESTRAS PROBLEMA.

1. Calentar los reactivos y los portacubetas del espectrofotómetro a 37°C. 2. Ajustar el espectrofotómetro a CERO frente a agua destilada a 37°C 3. Pipetear en una cubeta (*o en placa de ELISA):

Reactivo R1 950 µl (238 µl*)

Muestra Problema o cada calibrador 10 µl (2.5 µl*)

4. Mezclar y leer la absorbancia (A1) a 340 nm, después de la adición de la muestra.

5. Inmediatamente después pipetear en la cubeta:

Reactivo R2 Anticuerpo 50 µl (12.5 µl*)

* Volúmenes para utilizar en placa de ELISA

6. Mezclar y leer la absorbancia (A2) a 340 nm, exactamente 2 min después de añadir el reactivo R2

CÁLCULOS Calcular las diferencias de absorbancias (A2-A1), obtenidas para los distintos

calibradores y construir la curva de calibración de los valores obtenidos frente a las concentraciones de C3 o C4 de cada dilución del calibrador. La concentración de C3 o C4 en la muestra se calcula por interpolación directa de su diferencia (A2-A1) en la curva de calibración. DIFERENCIA DE ABSORBANCIA CONTRA CONCENTRACIÓN) Dibujar la curva uniendo los puntos. Para determinar las concentraciones reales de proteína en una muestra clínica, marcar diferencia de la absorbancia de la muestra en el eje de las ordenadas y buscar el punto de inserción en la curva de calibración deslizándose luego hasta el eje de las abscisas donde se lee el valor de la concentración. VALORES DE REFERENCIA

C3 Recién nacidos: 70-196 mg/dL

Adultos: 90-180 mg/dL

C4 Recién nacidos: 13-38 mg/dL

Adultos: 10-40 mg/dL

Sin embargo los valores normales varían en función de diversos factores como la edad, sexo, área geográfica, raza y la metodología. Tiempo estimado de la práctica: 60 a 90 min Disposición de RPBI: Recipiente color rojo, residuos de origen sanguíneo; bolsa roja material y equipo en contacto con dichos residuos. Equipo de Seguridad: Guantes de látex, bata.

Resultados - Interpretación de Resultados y Conclusiones

Bibliografía:

1. Clinical guide to laboratoty test, edited by NW Tietz W.B Saunders Co.

Philadelphia, 483,1983. 2. Yang Y et cal. CurrdirAutoimmun 2004 :7:98-132 3. Carrol MC, Annual Review Of Immunology 1998:16:545-568 4. http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/003356.htm

Práctica No. 9

Fagocitosis: Reducción de Nitroazul de Tetrazolio (Punción Capilar) Objetivo General

• Determinar la capacidad fagocítica de las células como método de evaluación de

la respuesta inmune inespecífica. Introducción

EllieMetchnikoff, en 1880, descubrió que la función de lascélulas fagocíticas era esencial para la supervivencia de todaslas especies del reino animal. En los organismos unicelularescomo los protozoarios, la función fagocítica es el único mediopor el cual estos organismos adquieren su alimento. Lafunción fagocítica de estas células se mejora a lo largo de laevolución y se mantiene en los animales más evolucionados,aunque aquí la función de los fagocitos deja de serpreponderantementenutricional para constituirse en un eficientemecanismo de protección no específico contra agentes infecciososy de eliminación de células muertas o seniles. Cadaetapa del proceso fagocítico (la migración, el reconocimientode lo que puede y debe ingerirse, la endocitosis y la destrucciónde partículas) se descubre cada vez más complicada; día a díase identifican más componentes moleculares y se establecenmás interacciones y rutas metabólicas. Aunque el proceso dela fagocitosis no está esclarecido en su totalidad, ahoratenemos una mejor idea de cómo se reconocen las partículasque deben eliminarse y de los mecanismos subsecuentes quellevan a su destrucción. En este artículo, se hace una revisiónconcisa del proceso de la fagocitosis y se enfatiza suimportancia como mecanismo de protección en losvertebrados, señalando, aunque de manera somera, aquellosaspectos que en la actualidad son objeto de mayor estudio,incluyendo estructura celular, la existencia y función de lasproteínas de adhesión, los receptores para endocitosis, lasproteínas G, las cascadas de señalización, la maduración delos fagosomas, y la generación de los metabolitos tóxicos deloxígeno y el nitrógeno. Introducción: Equipos, Materiales y Sustancias:


1 Lanceta

* Sangre periférico

1 Portaobjetos

Levaduras opsonizadas

* NBT

* Metanol

* Safranina

Metodología

1. Por punción con lanceta, poner en un portaobjetos, una gota de sangre periférica del paciente y en el otro extremo un testigo (paciente normal).

2. Colocar los portaobjetos, en una cámara húmeda, incubar a 37°C durante 20 minutos.

3. Desfibrinar con una aguja, quitando la capa superior de cada una de las gotas de sangre y queda una capa inferior donde se encuentran los fagocitos.

4. Las preparaciones se lavan con solución salina con cuidado que escurra lentamente.

5. Colocar los portaobjetos en la cámara húmeda y agregar NBT cubriendo la superficie de la preparación, más levaduras opsonizadas.

6. Incubar a 37ºC durante 30 minutos. 7. Lavar con solución salina para quitar el exceso de NBT. 8. Fijar con metanol por 1 minuto. 9. Teñir con safranina por 7 minutos. 10. 1Observar al microscopio y contar las células que reduzcan el NBT (gránulos

de formazán) y reportar en porcentaje de reducción.

RESULTADOS:

Observar células fagocíticasendocitando levaduras y distinguir entre células que redujeron el NBT (levaduras azules en su interior) de aquellas que no lo hicieron (solo levaduras rojas en su interior). El grado de endocitosis ocurrido y la capacidad de las células para reducir el NBT se puede evaluar determinando el porcentaje de células que han endocitado levaduras y el porcentaje de células que habiendo endocitado, han reducido el colorante. Tiempo estimado de la práctica: 30 a 60 min Disposición de RPBI: Recipiente color rojo, residuos de origen sanguíneo; bolsa

roja material y equipo en contacto con dichos residuos. Equipo de Seguridad: Guantes de látex, bata.

Referencia Oscar Rojas-Espinosa O. Arce-Paredes P. 2003. Fagocitosis: mecanismos y consecuencias. Bioquimia. 28:4. P20.

Práctica No.10

Cuantificación de IgG por el Método Turbidimétrico Objetivo

Utilizar un método de análisis de Turbidez para cuantificar la IgG. Introducción

La cuantificación de las subclases de IgG y su distribución en los anticuerpos puede proporcionar información para identificar inmunodeficiencias, evaluar las defensas del huésped en la producción de anticuerpos, y la fisiopatología de los mismos. La determinación de las concentraciones de las subclases de IgG es esencial en el diagnóstico de las inmunodeficiencias.

La IgG es la inmunoglobulina más importante producida por células plasmáticas, y representa un 75% del total de inmunoglobulinas. Su principal función es neutralizar toxinas en el espacio tisular. El déficit de IgG puede ser debido a problemas congénitos primarios (inmunodeficiencia congénita y adquirida) y supone un riesgo especial en niños. La hiperglobulinemiapoliclonal es la respuesta normal a infecciones, especialmente en hepatitis y cirrosis así como en enfermedades autoinmunes. Incrementos de IgG monoclonal se observan en el mieloma múltiple, leucemia linfocítica y la macroglobulinemia de Waldenstrôm. Los anticuerpos anti-IgG forman compuestos insolubles cuando se combinan con la IgG de la muestra del paciente, ocasionando un cambio de absorbancia proporcional a la concentración de IgG en la muestra, y que puede ser cuantificada por comparación con un calibrador de IgG de concentración conocida. MUESTRA.

Suero o plasma. REACTIVOS.

Diluyente RI Buffer tris 20 mmol/L. PEG 8000, pH 8.2, azida sódica 0.95.

Anticuerpo R2 Suero de cabra anti-IgG humana pH 7.5. azida sódica 0.95 g/L.

opcional Calibrador IgG 2606 mg/dL

Advertencia y precauciones: Deben manejarse todos los reactivos como potencialmente infecciosos a pesar de que fueron NO reactivos para las enfermedades transmitidas por sangre, líquidos corporales y tejidos. USAR SIEMPRE GUANTES.

Contiene azida de sodio, en contacto con la piel, lávese abundantemente con agua. Su ingestión es peligrosa. Forma complejos de plomo y cobre al contacto con las tuberías, deje correr el agua durante algún tiempo después de verter soluciones que contengan azida de sodio. Metodología: Curva de calibración.

Preparar las siguientes diluciones del Calibrador de proteínas (PROT CAL) en NaCl 0.9% como diluyente. PARA OBTENER LAS CONCETRACIONES DE CADA DILUCIÓN DE IgG, MULTIPLICAR LA CONCENTRACIÓN DE IgG DEL CALIBRADOR POR EL FACTOR CORRESPONDIENTE INDICADO EN LA TABLA.

# Dilución del Calibrador 1 2 3 4 5 6

Calibrador (µl) -- 10 25 50 75 100

NaCl 0.9% (µl) 100 90 75 50 25 --

Factor de dilución 0 0.1 0.25 0.5 0.75 1.0

Concentración de la dilución de IgG 0 260.6 651.5 1303 1954.5 2606

PROCEDIMEINTO PARA PROCESAR LA CURVA DE CALIBRACIÓN Y LAS MUESTRAS PROBLEMA.

1. Calentar los reactivos y los portacubetas del espectrofotómetro a 37°C. 2. Ajustar el espectrofotómetro a CERO frente a agua destilada a 37°C 3. Pipetear en una cubeta:

Reactivo R1 950 µl

Muestra Problema o Cada Calibrador 7 µl

4. Mezclar y leer la absorbancia (A1) a 600 nm (580-620nm), después de la adición de la muestra.

5. Inmediatamente después pipetear en la cubeta:

Reactivo R2 Anticuerpo 50 µl

6. Mezclar y leer la absorbancia (A2) a 600 nm, exactamente 2 min después de añadir el reactivo R2

CÁLCULOS Calcular las diferencias de absorbancias (A2-A1), obtenidas para los distintos calibradores y construir la curva de calibración de los valores obtenidos frente a las concentraciones de IgG de cada dilución del calibrador. La concentración de IgG en la muestra se calcula por interpolación directa de su diferencia (A2-A1) en la curva

de calibración. Dibujar la curva uniendo los puntos. Para determinar las concentraciones reales de proteína en una muestra clínica, marcar diferencia de la absorbancia de la muestra en el eje de las ordenadas y buscar el punto de inserción en la curva de calibración deslizándose luego hasta el eje de las abscisas donde se lee el valor de la concentración. VALORES DE REFERENCIA Entre 700 – 1600 mg/dL. Sin embargo los valores normales varían en función de diversos factores como la edad, sexo, área geográfica, raza y la metodología. Tiempo estimado de la práctica: 3 horas Disposición de RPBI: Recipiente color rojo, residuos de origen sanguíneo; bolsa roja material y equipo en contacto con dichos residuos. Equipo de Seguridad: Guantes de látex, bata.

Bibliografía:

1. Clinical Guide to Laboratory tests, edited by NW Tietz W B Saunders Co., Philadelphia, 483, 1983.

2. SkougJonh W et al. Clinchem1988 ; 34/2 : 309-315. 3. Dati F et al. Eur J ClinchemClinbiochem 1996, 34: 517-520.

Práctica No.11

Tipificación del Sistema ABO y Sistema Rh. Objetivo General

• Identificar los resultados de aglutinación para un suero control así como para la

muestra problema. Introducción:

Debido a la globalización tecnológica y mercantil, se encuentra una amplia variedad de reactivos, tanto nacionales como extranjeros para una infinidad de determinaciones, y nos encontramos ante un dilema; ¿Cuál elegir?

En base a esto se realizó el siguiente estudio para determinar si ambos insumos cuentan con el mínimo control aceptado por el Centro Nacional de la Transfusión Sanguínea, organismo rector en

cuanto a transfusiones o trasplantes de Hemoderivados se refiere.

Los resultados arrojados muestran que ambos, nacionales y extranjeros, cuentan con el mínimo control antes mencionado, incluso algunos nacionales superan a otros extranjeros, ya sea en avidez o en titulación.

La primera transfusión que salvó una vida la llevó a cabo hace menos de 200 años James Blundell, en 1818. En la actualidad en Estados Unidos se transfunden anualmente

más de 22 millones de donaciones de sangre1

. La seguridad de la transfusión sanguínea ha mejorado de manera sostenida desde que se fundó el primer banco de sangre de

EUA en el decenio de 19401

. En la actualidad se investigan nuevas técnicas diagnósticas moleculares para mejorar la sensibilidad de las pruebas utilizadas en el análisis de la sangre donada, en donde se incluyen, reactivos para determinación de isoantígenos humanos, pruebas de

compatibilidad, técnicas para la detección de agentes infecciosos, solo para tener un fin común, la transfusión de sangre segura y asegurar el bienestar tanto del donante como del receptor.

El sistema ABO fue descubierto en 1900 por Karl Landsteiner, quien observó que los glóbulos rojos humanos podían ser clasificados en tres grupos (ABO) de acuerdo a la presencia de antígenos específicos en la membrana eritrocitaria. El cuarto grupo (AB), de menor frecuencia fue descubierto por Von Decostello y Sturly.

El antígeno A puede presentarse bajo varias formas. Las dos más comunes de A son A1 y A2, y ambas comprenden el 99% de todos los grupos de A. Los subgrupos de B son aún más raros que los de A.

En la actualidad para la determinación de grupos sanguíneos se utilizan antisueros que pueden ser del tipo de las IgG o bien una mezcla de IgGs e IgMs, que son elaboradas a partir de murinos o de conejos. Estos anticuerpos son producidos por fusión de células de mieloma murino linfocitos de ratones inmunizados en el caso de transclone anti A: 26A2, transclone antiB:95.3, transclone antiAB:AB5-63 A5A2/26A/95.3 o bien anticuerpos producidos por cultivo de eritrocitos de hibridomamurino de la línea Birma-1 y ES-4, los cuales secretan anticuerpos Anti-A y Anti-B, respectivamente. El reactivo anti-AB es una mezcla de anticuerpos monoclonales de la misma línea de células, junto con una que reacciona con ambos antígenos A y B. Este es un producto de células de hibridoma de la línea ES-15. Estos reactivos pueden incluír un buffer especial que potencializa la aglutinación, con o sin albúmina bovina, libre de caprilato y a una concentración de proteínas que no exceda del 3% a 0.1% de azida de sodio como preservativo; además el reactivo anti-A contiene azul potente como colorante y el Anti-B amarillo naftol. Para la tipificación de subgrupos de A, en el laboratorio, se utiliza un reactivo a base de extractos de semillas, las cuales contienen aglutininas con especificidad hacia grupos de glóbulos rojos humanos. El extracto de las emillas de Dolichusbiflorus (lectina) es específico para el antígeno A1 de los eritrocitos. Los glóbulos rojos que son aglutinados con lectina Anti-A1 se clasifican dentro del subgrupo A1. Aquellos que no son aglutinados con la lectina Anti-A1 caen dentro de subgrupos más débiles perteneciendo la mayoría al subgrupo A2. La tipificación sanguínea D y la detección de anticuerpos es recomendada en todas las mujeres gestantes en su primer visita prenatal, incluyendo visitas por cesáreas electivas. Repetir el dosaje de anticuerpos D en todas las mujeres D-negativas no sensibilizadas en las semanas 24-28 de gestación, seguido de la administración de una dosis completa de 300 ˜g de inmunoglobulina D si son anticuerpos negativos (Recomendación “B”). Esta dosis debe repetirse dentro de las 72 horas después del parto si el infante es D-positivo. A menos que el padre sea conocido como D-negativo, la dosis completa de inmunoglobulina D es recomendada para todas las mujeres D-negativas después de un aborto electivo (50g antes de las 13 semanas) y anmiocentesis. Es insuficiente la evidencia para recomendar la administración de rutina de inmunoglobulina D después de otros procedimientos o complicaciones obstétricas como ser tomar muestra de una vellosidad coriónica, terminación de un embarazo ectópico, cordocentesis, cirugía fetal o manipulación (incluyendo versión externa), hemorragia placentaria anteparto, muerte fetal anteparto, y alumbramiento de un mortinato. Equipos, Materiales y Sustancias:



1 jeringas

4 Muestras problemas.

2 palillos de madera

* antisueros A, B, AB y D(Rh).


Metodología TIPADO GLOBULAR (MÉTODO DE PLACA) 1. Con un lápiz graso se marcan las letras A, B, AB, y Rh de derecha a izquierda. 2. Se coloca una gota de sangre TOTAL en cada uno de las secciones. 3. Se coloca una gota de antisuero correspondiente en cada sección. 4. Con ayuda de un palillo de madera se mezclan las gotas de antisuero y sangre, usando un aplicador distinto para cada muestra. 5. Esperar un máximo de tres minutos, dando a la placa un movimiento de rotación suave. 6. La presencia de aglutinación indica que el antígeno está presente en el glóbulo rojo. Interpretación de resultados:

TIPADO SÉRICO (Identificación de aglutininas)

Confirmación del grupo sanguíneo. Técnica: 1. Marcar los tubos con la letras A, B, AB y 0respectivamente. 2. lnactivar los sueros por tres minutos a 62ºC en bañomaría. La inactivación es necesaria para inactivar elcomplemento y evitar que destruya los glóbulos rojos. 3. Colocar una o dos gotas del suero por analizar en cadatubo. 4. Agregar una gota de suspensión en solución salina al 2% de glóbulos rojos frescos de los diferentes tipossanguíneos a cada uno de los tubos. ORh(+), ARh(+), BRh(+), ABRh(+). 5. Mezclar bien y centrifugar durante 30 seg a 2000rpm. 6. Para la lectura se sacude ligeramente cada tubo a fin de resuspender elcentrifugado y se observa la aglutinación. 7. La ausencia de aglutinación indica el tipo sanguíneo respectivo a lamuestra de suero problema, ya que se están determinando losanticuerpos circulantes contra los determinantes antigénicos presentes enlos glóbulos rojos conocidos. Tiempo estimado de la práctica: 30 a 60 min Disposición de RPBI: Recipiente color rojo, residuos de origen sanguíneo; bolsa


Interpretación de Resultados y Conclusiones

Tipado globular: Como se puede apreciar en la imagen de la izquierda el resultado es A

1Rh (+) y a la derecha se puede apreciar la confirmación por medio de la

tipificación sérica. El segundo Tubo es el ARh(+) en tanto que el tercero de izquierda a derecha es el tubo ABRh(+) quedando ala izquierda el tubo para BRh(+) y a la derecha el Orh(+)

En la imagen de la izquierda se muestran los resultados para el factor Rh, por tanto el resultado completo es A

1Rh (+)

(Epos

epos

Cneg

cpos

).

Bibliografía:

Manual de prácticas de Laboratorio de Inmunología / M.C. Ana Bertha Torres Reyes , M.C.

Rocío Infante Ramírez.

Inmunología básica y clínica. 9a edición. El Manual Moderno. México, 1997 pp. Págs 319-320. http://www.geocities.com/spectroq/vol3no2/valoracion.htm

http://www.geocities.com/spectroq/vol3no2/valoracion.htm

Práctica No. 12

Pruebas Cruzadas Previo a la realización de una transfusión sanguínea entre individuos compatibles en el sistema ABO y para el sanguíneo D, es necesario realizar una prueba cruzada que ponga de manifiesto la existencia de otros anticuerpos dirigidos contra antígenos de los sistemas menores. Esta prueba cruzada se lleva a cabo con eritrocitos del donador y suero del receptor (prueba mayor) y con eritrocitos del receptor y suero del donador (prueba menor). Antes de efectuar una prueba cruzada, es necesario conocer los datos clínicos del receptor y del donador para elegir las pruebas adecuadas del análisis, sin embargo, si se desconocen estos datos en necesario efectuar todas las pruebas que se indican a continuación. 1) Paciente que nunca ha sido transfundido o que no haya tenido embarazos:

prueba de salina rápida, albumina rápida y ficina o papaína rápida. 2) Paciente politransfundido, que haya tenido embarazos o que se desconozcan sus

antecedentes: prueba de salina rápida, albúmina rápida, ficina o papaína rápida, salina a 37ºC/Coombs.

En el primer caso podrían existir anticuerpos contra antígenos de los sistemas sanguíneos menores, adquiridos en forma natural. En el segundo caso, además de estos anticuerpos, pueden existir otros inducidos por las transfusiones previas o por el paso de eritrocitos del producto hacia la madre. MATERIAL POR GRUPO: • Centrifuga clínica MATERIAL POR EQUIPO: • 2 jeringas estériles con aguja del # 20 • 11 tubos de 10x75 mm • 2 tubos de 15x125 mm con 5 ml de solución salina estéril • 2 tubos de 13x100 mm • Pipetas Pasteur • Solución de albúmina al 25 % • Solución de ficina (1mg/ml) o de papaína (10mg/ml). Esta solución se vende

comercialmente, lista para usarse. • Suero de Coombs.

METODO: PROCEDIMIENTO DE PRUEBAS CRUZADAS

1. Se obtienen5mldesangrevenosasin anticoagulante,deldonador,ysecolocan 0.1mldeesasangreenuntuboquecontengasoluciónsalina(suspensiónal5%).Elrestodelasangresedepositaenuntuboparaobtenerelsuero.

2. Serepiteelproceso,ahoraconlasangredelreceptor. 3. Sedisponeunaseriede3tubosyseetiquetancomosigue:

PM (prueba mayor)

pm (prueba menor)

Auto (autotestigo)

4. A cada tubo se le agregan las siguientes cantidades según corresponda:

SUSPENCIÓN AL 5% GR

DEL DONADOR

SUERO DEL DONADOR

SUSPENCIÓN AL 5% GR

DEL RECEPTOR

SUERO DEL RECEPTOR

PM 1 gota 1 gota

Pm 1 gota 1 gota

Auto 1 gota 1 gota

5. Una vez hechas las mezclas centrifugar 15 segundos a 2500 rpm y observar

en búsqueda de aglutinación, en caso de observarla se detiene el proceso

marcando que son incompatibles, en caso de no observar aglutinación

continuar con el proceso. (A esta fase se le llama SALINA RÁPIDA).

6. En aquellos tubos donde no se observó aglutinación agregar 2 gotas de

albúmina y centrifugar 15 segundos a 2500 rpm y observar en busca de

aglutinación, los tubos que no presentaron aglutinación continúan en el

proceso.

7. Incubar a 37º C por 10 minutos y centrifugar 10 segundos a 2500 rpm.

Observar en busca de aglutinación, los tubos que no se presentaron

aglutinación continúan en el proceso. (A esta fase se le conoce ALBÚMINA)

8. Lavar el contenido de los tubos, agregando 3 ml de solución salina luego

homogeniza la solución, centrifuga 15 segundos a 2500 rpm y desecha el

sobrenadante esto repítelo 2 veces más.

9. Agrega a cada tubo 2 gotas del reactivo de Coombs después centrifuga 15

segundos a 2500 rpm y observa en búsqueda de aglutinación, si ésta es

positiva hay incompatibilidad sanguínea si es negativa hay compatibilidad

sanguínea. (A esta fase es la COOMBS).

Práctica No. 13

Reacciones Febriles Objetivo General • Identificar e interpretar los resultados de aglutinación para un suero control así

como para la (s) muestra(s) problema. Introducción:

Cuando el organismo ha sido invadido por bacterias patógenas, responde en la mayoría de los casos produciendo anticuerpos específicos contra los antígenos de los gérmenes invasores. La demostración de estos anticuerpos y la elevación de los mismos es útil para el diagnóstico e identificación del tipo de infección así como el curso de la misma. La titulación de anticuerpos en el suero del paciente por medio de la aglutinación de las suspensiones de las células bacterianas muertas conocidas (antígeno) es una ayuda diagnóstico valiosa en las fiebres de origen no determinado. Esta prueba determina la mayor dilución del suero del paciente que causará la aglutinación del antígeno bacteriano, conocido como título. Las reacciones febriles incluyen: 1) REACCIÓN DE WINDAL Se usa para el diagnóstico diferencial de Paratifoidea y Tifoidea, y comprende: a) Titulación del antitífico 0 b) Titulación del antitífico H c) Titulación del paratífico A (S. enteritidis A) d) Titulación del paratífico B (S. enteritidis B) a) Titulación del antitífico 0 somático: - Títulos menores de 1:80 carecen de importancia clínica. - Títulos de 1:80 - 1-160 aparecen en el período de incubación de fiebre tifoidea, portadores convalecientes y en caso de respuesta inmunológica por vacunación. - Títulos mayores de 1:160 se consideran anormales y concluyentes de infección activa por Salmonella typhi. b) Titulación del antitífico H flagelar - Títulos menores de 1:80 carecen de importancia clínica. - Títulos de 1:80 a 1:160 se presentan en el período de incubación de la fiebre tifoidea, en pacientes en convalecencia y en caso de portadores crónicos, detectándose en éste último la presencia de anticuerpos específicos para el antígeno Vi (antígeno capsular de

Salmonella typhi). - Títulos mayores de 1:160 son concluyentes de fiebre tifoidea si están elevados junto con las aglutininas anto 0 somáticas en 1:160 o más; de lo contrario tiene la misma significancia clínica que los títulos anteriores. c) Titulación de aglutininas paratífico A: - Títulos menores de 1:80 no tienen ninguna significancia clínica. - Títulos de 1:80 a 1:160 detecta período de incubación de la enfermedad, portadores convalecientes y portadores crónicos. - Títulos mayores de 1:160 indican infección activa por Salmonella enteritidis biotipo A. d) Titulación de aglutininas antiparatífico B: - Títulos menores de 1:80 no tienen ninguna significancia clínica. - Títulos de 1:80 a 1:160 detecta período de incubación de la enfermedad, portadores convalecientes y portadores crónicos. - Títulos mayores de 1:160 indican infección activa por Salmonella enteritidis biotipo B. 2) REACCION DE WEIL FELIX:

En 1916 Weil y Felix aislaron una cepa de Proteus de la orina de un paciente con fiebre tifos. El suero del paciente aglutinaba con ésta cepa de la misma manera que lo hacia con otros pacientes con fiebre tifos. La naturaleza química de los antígenos de Proteus, que reaccionaba en forma cruzada con los anticuerpos rickettsicos no ha sido completamente determinada, sin embargo comparten un antígeno glucolíopido común. Esta prueba es altamente útil en el diagnóstico diferencial de ciertas enfermedades rickettsicas. Basicamente los anticuerpos del tífico (murino) y de la fiebre moteada de las montañas Rocallosas, reaccionan conelProteus OX-19. Los anticuerpos del tifosScub (Tsusugamishi) reaccionan con el Proteus OX-K, mientras que los anticuerpos de la viruela rickettsica y de la fiebre Q no reaccionan con ninguna cepa de Proteus. En la fiebre Tifus los anticuerpos empiezan a aparecer entre 7 y 10 días después de la infección y alcanzan su máximo alrededor del día 14. El título de 1:40 hasta 1:80 son sospechosos y títulos de 1:160 es indicativo de enfermedad Reacción de Weil-Felix en las enfermedades Rickettsicas:

Enfermedad Antígeno Proteus

OX19 OX2 OXK

Tifus epidémico xxxx X 0

Tifus endémico (murino) xxxx X 0

Tifus de Scrub (Tsutsugamuchi) 0 0 xxx

Fiebre Moteada de las Montañas Rocallosas xxxx X 0

Viruela Rickettsica 0 0 0

Fiebre Q 0 0 0

C) REACCIÓN DE HUDDLESON La brucelosis humana es causada por la Brucellaabortus, B. melitensis, B. suis. La principal fuente de B. abortus es la leche de vaca no pasteurizada y el ganado infectado. Los anticuerpos empiezan a aparecer de 2 a 3 semanas después de la inoculación y alcanza un máximo entre 3 a 5 semanas. Un título de 1:80 a 1:160 en presencia de síntomas clínicos es indicativo de infección, mientras que el título de 1:300 o más es conclusivo de enfermedad. Los títulos altos pueden persistir durante años pero generalmente disminuye de manera gradual. Equipos, Materiales y Sustancias:


5 5 placas de vidrio divididas en seis partes

10 palillos de madera

4 Pipetas de l/100ml

1 equipo para reacciones febriles con controles

Metodología

Prueba Cualitativa:

1. Una gota de antígeno y una gota de suero (aproximadamente 0.1 ml)

2. Mezclar homogéneamente con un aplicador y observar Nota: La reacción que de positivo se procederá a hacer la prueba cuantitativa.

Prueba Cuantitativa:

• Con una pipeta serológica graduada de 1 ml hacer las siguientes diluciones:

80µL de suero + 30µL de antígeno = 1:20 40 µL de suero + 30 µL de antígeno = 1:40 20 µL de suero + 30 µL de antígeno = 1:80 10 µL de suero + 30 µL de antígeno = 1:160 5 µL de suero + 30 µL de antígeno = 1:320 Agitar con un aplicador de madera hasta que el contenido se distribuya homogéneamente. Debe usarse aplicador diferente cada vez. Se toma la placa y se sostiene encima de una superficie iluminada de vidrio translúcido. Se rota y se balancea lentamente durante 2 min. Se observa si hay aglutinación, si se encuentra, se reporta hasta dilución que presente franca aglutinación macroscópica. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS El grado de aglutinación se registra como sigue:

4+ Aglutinación del 100% de los organismos




- Aglutinación del 0% de los organismos

El título del suero será la inversa de la dilución más alta en donde se observa una aglutinación del 50% de organismos (2+).

PRECAUCIONES

1. todos lossueros a probar deberán estar totalmente claros y libres de contaminación bacteriana.

2. NO caliente el suero antes de probarlo. 3. Agite bien el antígeno antes de utilizarlo para asegurar una suspensión

uniforme.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

1. Algunos sueros normales pueden dar un título de 1:20 a 1:40 y hasta 1:80 pero esto puede ser debido a vacunaciones o alguna infección anterior. No siempre se presenta producción de aglutininas en infecciones bacterianas.

2. se pueden producir reacciones cruzadas de aglutininas debido a vacunaciones para ciertas enfermedades. La vacuna tífica puede producir aglutininas contra antígenos Proteus.

3. En la reacción de Huddleson títulos de 1:80 pueden considerarse ya de significado clínico.

Tiempo estimado de la práctica: 10 a 20 min Disposición de RPBI: Recipiente color rojo, residuos de origen sanguíneo; bolsa


Resultados

Interpretación de Resultados y Conclusiones Bibliografía: Manual de prácticas de Laboratorio de Inmunología / M.C. Ana Bertha Torres Reyes, M.C.


Spink, W.W.: AMER, J. clin, Path., 22:201, 1952.

http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/000597.htm

http://www.tusalud.com.mx/120663.HTM

Práctica No. 14

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA C REACTIVA Tillet y Francis concluyeron en 1930 que la reacción que se originas en el suero de pacientes que pacientes que sufren de enfermedades inflamatorias precipita con un extracto de pneumococo no protéico llamado polisacárido C. la proteína que causa este tipo de reacción fue llamada proteína C reactiva. Como un fenómeno no específico el incremento en la concentración de proteína C reactiva se puede presentar en cualquier proceso inflamatorio agudo (ya sea infeccioso o no infeccioso). La concentración de proteína C reactiva generalmente se encuentra por debajo de 6mg/L en el suero de adultos sanos y en enfermedades inflamatorias estos valores frecuentemente se incrementan en un lapso de 4 a 8 horas después de presentarse un evento agudo alcanzando niveles de 20 a 500mg/L. El principio del procedimiento involucra una reacción inmunológica entre la proteína C reactiva (como antígeno) y el anticuerpo correspondiente adsorbido a las partículas de látex (látex sensibilizado con anti-proteína C reactiva). Método Cualitativo

1. Enun tubo de 13*100 depositar 950 µL del diluyente glicina-salina pH 8.2 diluido. 2. Añadir 50 µL del suero problema (dilución 1:20). 3. En un anillo de la placa depositar 50µL del suero diluido. 4. En otro anillo depositar una gota del control positivo y en otro anillo una gota del

control negativo. 5. Añadir a cada uno de los 3 anillos una gota de látex anti-proteína C reactiva

previamente resuspendido. 6. La placa se oscila suavemente con la mano o con el agitador mecánico por 2

minutos. 7. Se busca aglutinación de las partículas de látex bajo una fuente de luz directa. Interpretación de Resultados Resultado positivo.- presencia de agregados macroscópicos (aglutinación comparable al control positivo). Resultado Negativo.- ausencia de agregados macroscópicos (sin aglutinación, comparable al control negativo). Método Semicuantitativo

12. Seleccionar los sueros positivos de la prueba cualitativa. 13. colocar en una gradilla 5 tubos de 12x75mm y numerarlos. 14. Depositar al tubo 1 0.95 mL de diluyente diluido. 15. depositar del tubo 2 al 5, 0.5mL de diluyente diluido. 16. Añadir al tubo 1 0.05mL del suero problema dilución 1:20 y mezclar. 17. Pasar 0.5mL del tubo 1 al 2 y mezclar.

18. continuar esta operación hasta el tubo 5. 19. Depositar 0.05mL de cada una de las diluciones en anillos diferentes de la

placa. 20. añadir una gota de látex a cada una de las diluciones. 21. Mezclar durante 2 minutos. 22. Realizar la lectura del resultado bajo una fuente de luz directa.

INTERPRETACIÓN

El título del suero problema será la última dilución que presente agregados macroscópicos (aglutinación).

Tubo 1 2 3 4 5

Dil. 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320

Tiempo estimado de la práctica: 45 a 60 min Disposición de RPBI: Recipiente color rojo, residuos de origen sanguíneo; bolsa roja material y equipo en contacto con dichos residuos. Equipo de Seguridad: Guantes de látex, bata. Resultados

Interpretación de Resultados y Conclusiones Bibliografía: Manual de prácticas de Laboratorio de Inmunología / M.C. Ana Bertha Torres Reyes , M.C. Rocío Infante Ramírez. Harrison F Word et al. The occurrence during aaccute infections of a protein not normal present in the blood. J. Exp. Medical. http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/003509.htm

Práctica No.15

Determinación de Factor Reumatoide FUNDAMENTO El factor reumatoide pertenece a un grupo de anticuerpos dirigidos contra la estructura terciaria modificada de la fracción Fc de la inmunoglobulina IgG. Su presencia se relaciona con enfermedades tales como: Artritis reumatoide y lupus eritematoso generalizado, entre otras. Las técnicas más utilizadas se basan en la aglutinación de partículas de látex de poliestireno cubiertas con una capa de gamma globulina humana adsorbida. El factor reumatoide presente en la muestra reacciona tonel material cubierto originando una aglutinación visible de las partículas de látex inhertes. Método Cualitativo 1. Se prepara una dilución del suero problema 1:20 con 1mL del diluyente

concentrado y 0.05mL del suero. 2. En una división de la placa, se coloca 50 µLdel suero diluido. 3. En otra división colocar una gota del control positivo y en otro una gota del control

negativo. 4. Se añade a cada uno una gota de reactivo de látex-globulina humana

previamente resuspendido. 5. Con un aplicador de madera o un palillo, se mezclan ambas gotas. 6. La placa se oscila suavemente con la mano o con el agitador mecánico durante 2

minutos. 7. Se busca la presencia de aglutinación de las partículas de látex bajo una fuente

de luz directa. Interpretación de Resultados

Resultado positivo.- presencia de agregados macroscópicos (aglutinación comparable al control positivo). Resultado Negativo.- ausencia de agregados macroscópicos (sin aglutinación, comparable al control negativo). Método Semicuantitaivo

1. Seleccionar los sueros positivos de la prueba cualitativa. 2. colocar en una gradilla 8 tubos de 12x75m y numerarlos. 3. Depositar al tubo 1 1 mL de diluyente diluido. 4. depositar del tubo 2 al 8, 0.5mL de diluyente diluido. 5. Añadir al tubo 1 0.05mL del suero problema y mezclar. 6. Pasar 0.5mL del tubo 1 al 2 y mezclar. 7. continuar esta operación hasta el tubo 8. 8. Depositar 0.05mL de cada una de las diluciones en anillos diferentes de la

placa. 9. añadir una gota de látex a cada una de las diluciones.

10. Mezclar durante 2 minutos. 11. Realizar la lectura del resultado bajo una fuente de luz directa.

INTERPRETACIÓN

El título del suero problema será la última dilución que presente agregados macroscópicos (aglutinación).

Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8

Dil. 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560

Bibliografía:

1. Lloyd, Panush R. Cell Mediated Immunity in RhehumatoidArtritis. J. Rheumatology. 1977; 231-244.

2. Segon P. et al. Depress primary in vitro antibody response in rheumatoid artritis. Clin. ExpInmunology. 1979. 93; 196-204.

Práctica No.16

Determinación de VDRL Objetivo General

• Identificar e interpretar los resultados de floculación para un suero control así como

para la muestra problema. Introducción:

La sífilis es una infección altamente tratable. Además de examinar individuos con signos y síntomas de sífilis y/u otras enfermedades de transmisión sexual, el tamizaje de sífilis es una parte rutinaria del cuidado prenatal durante el embarazo. Varios estados también exigen el tamizaje de sífilis antes de obtener una licencia de matrimonio.

La prueba de VDRL es un examen de tamizaje para sífilis que mide los anticuerpos reagínicos que se producen en la sífilis como resultado de la interacción de la bacteria causante de la sífilis (Treponema pallidum) y el cuerpo del paciente. Este examen es una herramienta de tamizaje útil para la sífilis, aunque su capacidad de detección depende de la etapa de la enfermedad. En la etapa más temprana (sífilis primaria) el examen es positivo en aproximadamente el 60% de las ocasiones. Su utilidad aumenta en etapas posteriores como sífilis secundaria y sífilis latente donde puede ser positivo en el 70 a 90% de las ocasiones; en las etapas finales (sífilis terciaria) el examen es positivo en sólo el 60% de los casos. Existen varias condiciones que pueden producir un examen falso positivo tales como VIH, enfermedad de Lyme, neumonía por micoplasma, malaria y lupus eritematoso sistémico. Por lo tanto, si este examen de tamizaje resulta positivo se debe confirmar con un examen más específico como FTA-ABS. FTA-ABS: Prueba de absorción de anticuerpos treponémicos fluorescentes Equipos, Materiales y Sustancias:


1 IMMUTREP USR ANTIGEN

1 SUERO CONTROL POSITIVO

1 Suero problema

1 Micropipeta para 22 y 50uL

1 Placas de aglutinación

1 Placa de agitación 180 r.p.m.

1 Microscopio

Metodología

Tomar la muestra de sangre venosa, se puede trabajar tanto con suero como con plasma siempre y cuando sea fresco. No utilizar suero o plasma hemolizado, contaminado o lipémico ya que puede afectar los resultados. El suero o el plasma se pueden guardar a 4ºC por hasta 48 horas a -20ºC por hasta 6 semanas. Dejar todos los reactivos a temperatura ambiente antes de efectuar la reacción. Agitar el frasco antes de usarlo y durante el reparto. Método Cualitativo

1. colocar una gota de la muestra problema (50uL) 2. adicionar 22uL del antígeno mezclado a la muestra. (no hay necesidad de

mezclar estos 2 componentes). 3. agitar la muestra a 180 r.p.m. durante 4 minutos. 4. Inmediatamente después de los 4 minutos, inspeccionar el resultado

microscópicamente bajo el objetivo de 10X. Método semicuantitativo

1. Utilizando solución salina Isotónica (0.9% NaCl) preparar diluciones seriadas de la muestra (1/2, ¼, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 o más).

2. Transferir una gota de cada dilución de la muestra (50uL) al círculo de prueba en la placa.

3. Adicionar 22uL del antígeno mezclado a la muestra. (no hay necesidad de mezclar estos dos componentes).

4. Agitar la placa por 4 minutos a 180 r.p.m. 5. Inmediatamente después de los 4 minutos, inspeccionar el resultado

microscópicamente bajo el objetivo de 10X RESULTADOS E INTERPRETACIÓN El control positivo del kit debe dar un resultado positivo en títulos ¼ +/- una doble dilución a los 4 minutos. Método Cualitativo Agregados medianos o grandes Reacción Agregados finamente dispersados Reacción débil Agregados no visibles, apariencia grisácea No reacción Método semicuantitativo El título es la última dilución que produce un resultado de reacción

Tiempo estimado de la práctica: 30 a 60 min Disposición de RPBI: Recipiente color rojo, residuos de origen sanguíneo; bolsa roja material y equipo en contacto con dichos residuos. Equipo de Seguridad: Guantes de látex, bata.

Bibliografía: OMEGA DiagnosticsLtd 2003.

Manual de prácticas de Laboratorio de Inmunología / M.C. Ana Bertha Torres Reyes, M.C.


http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/003512.htm http://www.tusalud.com.mx/120010.htm

Práctica No. 17

Determinación de Antiestreptolisina O en suero

INTRODUCCIÓN.

El anticuerpo Antiestreptolisina O se encuentra presente en casi todas las personas en títulos bajos, debido a que las infecciones estreptocócicas son comunes. Sin embargo un título alto o creciente, indica una infección reciente producida por un estreptococo beta hemolítico del grupo A, como amigdalitis, escarlatina, sepsis puerperal, erisipela, etc. FUNDAMENTO DEL MÉTODO.

Los Ac antiestreptolisina O se detectan en suero por su reacción con la estreptolisina O adsorbida sobre un soporte inerte de látex. Los Ac antiestreptolisina reaccionan con la estreptolisina produciendo una aglutinación visible macroscópicamente. MATERIAL Placas de vidrio Palillos de madera Cronómetro Lámpara o fuente de luz Homogenizador de placas a 80-100 rpm Muestra biológica Suero: Obtener suero de manera usual. Los sueros marcadamente lipémicos o contaminados pueden dar resultados falsos positivos. PROCEDIMIENTO.

Llevar todos los reactivos y muestras biológicas a temperatura ambiente TÉCNICA CUALITATIVA.

1. Poner todos los reactivos a temperatura ambiente. 2. Colocar 50µl de control positivo sobre un círculo en el extremo izquierdo de una

placa para aglutinación. 3. Colocar 50 µl de suero problema sobre un circulo en el centro de una placa para

aglutinación 4. Colocar 50 µl de control negativo sobre un círculo en el extremo derecho de una

placa para aglutinación. 5. Homogeneizar suavemente el reactivo de ASO antes de usar. Colocar una gota

de Reactivo de látex a cada una de las gotas anteriores,

6. Mezclar con un palillo desechable (uno para cada muestra) hasta obtener una suspensión uniforme en la superficie de la placa.

7. Inmediatamente disparar el cronómetro y balancear la placa. 8. Observar el resultado dentro de los 2 minutos. TÉCNICA SEMICUANTITATIVA

Los sueros positivos pueden titularse efectuando diluciones seriadas en tubos de Kahn. 1. Colocar 0.5 ml de solución fisiológica en cada uno de los tubos. 2. Agregar 0.5 ml de suero al tubo No.1 y mezclar 3. Transferir 0.5 ml de esta dilución al tubo siguiente y mezclar, continuando así las

diluciones hasta el último tubo. Las diluciones obtenidas equivalen a 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, etc.

4. Ensayar cada dilución según la técnica cualitativa. RESULTADOS:

NEGATIVO: Suspensión homogénea. POSITIVO: Aglutinación que aparece dentro de los 2 minutos. TÏTULO: Inversa de la máxima dilución a la que se produce aglutinación visible macroscópicamente. Se obtiene aplicando la siguiente fórmula: 200 X Titulo de ASO=UI/ml En el método semicuantitativo se define le titulo como la dilución mayor que da resultado positivo. LIMITACIONES

Una determinación aislada no da información suficiente acerca del estado actual de la enfermedad. Tiempos de reacción mayores de 2 minutos pueden producir resultados falsos positivos por efecto de secado de reactivos. Se pueden producir falsos negativos en niños mayores de 6 meses y menores de 6 años o en infección reciente. Debe tenerse en cuenta que en este tipo de infecciones, un resultado aislado sólo constituye un dato auxiliar, por lo que se recomienda efectuar determinaciones seriadas cada 15- 20 días durante 4 ó 6 semanas. BIBLIOGRAFÍA. Sonnewirth, A.C., Jarret, L., GradwohlMethdos and Diagnosis of Clinical Laboratory.ED. Panamericana, (1983)

Práctica No.18

Determinación cualitativa de anticuerposanti-Brucellaabortus por Aglutinación con el Antígeno Rosa de Bengala. Objetivo General • Identificar e interpretar los resultados de aglutinación para un suero control así

como para la muestra problema. Introducción: Fiebre de Malta; fiebre ondulante; fiebre de la roca; fiebre de Chipre; fiebre de Gibraltar Es una enfermedad causada por el contacto con animales de granja portadores de la bacteria Brucella.

La bacteria Brucella infecta al ganado, las cabras, los perros y los cerdos. Esta enfermedad se transmite a los seres humanos por contacto con carne infectada, placenta de animales infectados o ingestión de leche o queso no pasteurizados. La enfermedad puede ser crónica y persistir por años.

Las medidas preventivas más importantes son la pasteurización de la leche y la ingestión exclusiva de quesos pasteurizados. Las personas que manipulan carne deben utilizar lentes y ropas protectoras y cubrir (proteger) cualquier lesión de piel para evitar su infección. La detección de animales infectados permite el control del origen de la infección. Existen vacunas para el ganado, pero no para los seres humanos.

Fundamento: El rosa de bengala es una técnica de aglutinación en porta para la

detección cualitativa y semicuantitativa de anticuerpos anti-brucella en suero humano o animal. La suspensión bacteriana y coloreada es aglutinada por anticuerpos IgG o IgM en el suero del paciente.



1 Pipetas desechables

1 Portaobjetos

4 Palillos de Madera

2 Reloj

Reactivos:

Suspensión de Brucellaabortuscepa 544 en buffer lactate 1 mmol/L, fenol 5g/L, Rosa de bengala pH 6.3 Control positivo: Suero animal con anticuerpos anti-brucela>50UI/ml, azida de sodio

Control negativo: Suero animal en azida de sodio. Metodología

Método cualitativo: 1. Coloque los reactivos, controles y sueros a temperatura ambiente 2. Usando una pipeta, adicione 1 gota del suero paciente en el extremo izquierdo

de un portaobjetos. 3. En el extremo derecho coloque una gota de control positivo. 4. Mezcle el Ag Rosa de Bengala gentilmente, y adicione una gota de reactivo,

tanto a la gota de suero problema como a la gota de control positivo. 5. Mezclar con un palillo desechable (uno para cada muestra) hasta obtener una

suspensión uniforme en la superficie de la placa. 6. Inmediatamente disparar el cronómetro y balancear la placa. 7. Observar la presencia o ausencia de aglutinación a los 2 minutos

exactamente.

La presencia de aglutinación indica una concentración igual o mayor a 25UI/ml. En el métodosemicuantitativo se define el titulo como la dilución mayor que de aglutinación positiva.

Métodosemicuantitativo:

a. Realizar diluciones dobles de las muestras en solución salina. b. Proceder para las diluciones como en la prueba cualitativa.

Cálculos: La concentración aproximada de anticuerpos anti-brucella en la muestra del paciente se obtiene: 25 X título de anti-brucella= UI/ml Valores de referencia: Hasta 25 UI/ml. Tiempo estimado de la práctica: 30 a 60 min Disposición de RPBI: Recipiente color rojo, residuos de origen sanguíneo; bolsa


Bibliografía: Manual de prácticas de Laboratorio de Inmunología / M.C. Ana Bertha Torres Reyes M.C. Rocío Infante Ramírez.


Principio de las pruebas de Inmunocromatografía

a) Composición de la tira: 1- base plástica; 2-membrana de absorción; 3-montaje de conjugado; 4-membrana de trabajo; 5-almoadilla de absorción. b) reactivos introducidos. Ab- anticuerpo específico; Ab2- anticuerpos contra IgG de Conejo; Ab-CG- Anticuerpos específicos conjugados con oro coloidal. c) representación esquemática del análisis: 6-difusión del líquido o muestra; 7-linea de prueba; 8-linea control. d) resultado de la prueba en ausencia del antígeno: una banda coloreada en el área de la línea control. e) resultado de la prueba en presencia del antígeno: dos bandas coloreadas en el área de las dos líneas, la control y la prueba. Referencia: Byzova N.A., Safenkova I.V., Chirkov S.N., Sherdev A.V., Blintsov A.N., Dzantiev B.B. y Atabekov I.G. (2009). Development of Immunochromatographic Test System for Express Detection of Plant Viruses.App Biochem and Microbiol. 45 (2) 204-209.

Práctica No. 19

Determinación Cualitativa de la Hormona Gonadotropina Coriónica Humana (GCH) por el método en Tira (Dipstick). Introducción:

La gonadotropina coriónica humana (GCH) es una glicoproteína, hormona segregada por la placenta después de la fertilización y que aparece en la orina de mujeres embarazadas o con ciertos tipos de procesos neoplásicos. Un embarazo normal la GCH se detecta en suero a los 7 días después de la concepción. El período en el cual el nivel de GCH es óptimo para obtener resultados con esta prueba, comprende hasta el día a 109 aproximadamente después del último período menstrual. La persistencia de GCH en niveles altos es sugerente de un proceso neoplásico. La UNISTEP plus (DIPSTICK) es una prueba cualitativa de inmunoensayo conjugado para la determinación de GCH. El método usado es una combinación de anticuerpos policlonales y monoclonales para la identificación de GCH en las muestras del examen, por lo cual se tiene una gran sensibilidad. La prueba detecta 25 mUl / ml de GCH. PRINCIPIO DE LA PRUEBA La prueba está basada en un complejo de anticuerpos y oro coloidal, para la determinación cualitativa de la GCH en suero y en orina, El resultado es visual para la detección de embarazo. Durante la prueba, la muestra (orina o suero), entra en contacto con el papel absorbente para empezar la reacción, los anticuerpos conjugados de la GCH forman un complejo anticuerpo-antígeno. Este complejo anti-GCH se manifiesta en la zona de reacción positiva y desarrolla una banda de color rosa que indica la concentración de GCH. La aparición de una banda rosa en la zona control indica que la prueba terminó y que estuvo bien realizada. Beta-GCH cualitativa en suero; gonadotropina coriónica humana cualitativa en suero; prueba de embarazo en sangre; beta GCH sérica cualitativa; GCH sérica Definición GCH cualitativa en suero es una prueba que se utiliza para detectar beta-GCH (gonadotropina coriónica humana, una hormona que normalmente se produce durante el embarazo) en suero.



1 Tubos de 10 x50mm

* gradillas para tubos de 10 x 50 mm

* Tiras de prueba (cada una contiene en la membrana, Ac policional y en la zona de problema contiene Ac monoclonal IgG conjugado con una matriz proteica en 0.1 % de azida de sodio.

Metodología

1. La reacción se realiza a temperatura ambiente. 2. No es necesario realizar ningún procedimiento previo a la muestra. 3. Remueva la tira del sobre (tómela por el extremo verde). 4. Introduzca la tira en la orina o suero, verticalmente hasta el nivel de absorción. 5. Espere a que la banda de control aparezca para retirar la tira de la muestra. 6. Espere de 3-5 min para leer la prueba.

Resultados. La aparición de una banda en la zona de control, indica un resultado negativo; la aparición de una banda más en la zona de problema indica un resultado positivo y la ausencia de ambas indica un resultado inválido. VALORES ESPERADOS. Médicamente se considera que no hay embarazo si no está presente la GCH. En aproximadamente 7 días después de la concepción, la concentración de GCH es de 5-50 FALSO NEGATIVO: Diluir la orina y condiciones que pueden ocasionar deterioro de la GCH. Concentraciones menores de 24 mUl / ml es resultado negativo.

Tiempo estimado de la práctica: 45 a 60 min

Disposición de RPBI: Recipiente color rojo, residuos de origen sanguíneo; bolsa


Resultados Interpretación de Resultados y Conclusiones

Bibliografía: Manual de prácticas de Laboratorio de Inmunología / M.C. Ana Bertha Torres Reyes, M.C. Rocío Infante Ramírez.


Práctica No. 20

Determinación de Antígeno Prostático (PSA)

Objetivo General

Detección cualitativa de un nivel anormal de antígeno prostático (PSA) en suero o plasma. INTRODUCCIÓN

El antígeno prostático es una proteína de unos 34 kDa de peso molecular (en estado libre) y con actividad enzimática tipo serin-proteasa que cumple un papel destacado en los procesos de licuefacción-gelificación del semén. Su utilidad en diagnóstico radica en el hecho de ser uno de los pocos marcadores tumorales cuya detección por encima de determinada concentración presenta utilidad clínica en el diagnóstico de cáncer de próstata, el segundo cáncer masculino en importancia y el más significativo en edades avanzadas. PRINCIPIO DEL MÉTODO El PSA presente en el suero reacciona con las partículas de látex coloidal que están conjugadas con anticuerpos monoclonales específicos contra PSA. Este complejo de partículas coloidales-anticuerpos-PSA migra por un proceso cromatográfico hacia la zona de reacción. En esta zona hay anticuerpos contra PSA que reaccionarán con el complejo partículas de látex coloidales-anticuerpos-PSA. Esta reacción origina una línea rojo/rosa. PROCEDIMIENTO 1. Atemperar la muestra y otro material necesario para la prueba antes de realizar el

ensayo. 2. Extraer la placa del sobre y colocarla sobre una superficie plana. Identificar cada

placa con los datos del paciente. 3. con la pipeta suministrada, colocar exactamente 4 gotas (0.125 mL) de suero o

plasma en la ventana circular señalada con una flecha (ventana de la adición de la muestra).

4. leer el resultado a los 5 minutos. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

Negativo.- sólo aparece una línea transversal AZUL en la zona central del dispositivo de reacción (alineada con la letra C (control) marcada en la carcasa). Siempre debe aparecer esta línea. Positivo.- Además de la línea AZUL de control aparece otra línea transversal ROSA/ROJA en la zona central del dispositivo de reacción alineada con la letra T (test) marcada en la carcasa. La intensidad de esta coloración va a ser variable según la concentración presente de antígeno. No válido.- Si no aparece una línea C en la línea de control tras 5 minutos de la adición de la muestra, no se ha procedido correctamente, los reactivos se han deteriorado o se ha añadido una cantidad incorrecta de muestra. Repetir la prueba

con una placa nueva. TODA LÍNEA QUE POR LA NATURALEZA DE LA MUESTRA PUEDA APARECER PASADOS LOS 5 MINUTOS NO TENDRÁ VALOR DIAGNÓSTICO.

CARACTERÍSTICAS DEL MÉTODO

Sensibilidad.- SPIN-PSA da un resultado positivo con muestras que contienen más de 4ng/mL de PSA. Especificidad.- los anticuerpos monoclonales uilizados presentan una especificidad única para PSA, sin reacción cruzada con otras proteínas del suero humano. Detectan tanto PSA libre como PSA acomplejada con ACT (alpha-1-antiquimotripsina). REFERENCIA SPINREACT, S.A. Ctra. Santa Coloma, España.

Práctica No. 21

DETERMINACIÓN DE ANTICUERPOS ANTI-HIV 1/2 POR INMUNOCROMATOGRAFIA OBJETIVO

Determinar la presencia de anticuerpos anti-HIV 1/2 por inmunocromatografía INTRODUCCION En 1983 fue descubierto el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) el cual es un retrovirus que es el agente etiológico del Síndrome de Inmunodeficiencia Humana Adquirida (SIDA). El SIDA es caracterizado por cambios en la población de linfocitos T que tienen una función esencial en sistema inmunológico. En individuos infectados con VIH hay una disminución de la subpoblaciones de linfocitos T, lo cual lleva al paciente a ser susceptible a infecciones oportunistas y ciertos cánceres. La principal ruta de infección es contacto sexual, exposición a sangre o productos sanguíneos contaminados y transmisión mamá- recién nacido. El VIH consiste en un virus con una cápside y envoltura que protegen a una molécula de RNA. La envoltura es el blanco para respuesta inmunológica humoral. La presencia del virus en los pacientes provoca que el sistema inmunológico produzca anticuerpos. La detección de estos anticuerpos puede ser usada como una herramienta diagnostica. Hay varios sistemas que actualmente están disponibles para la detección de VIH-1 y VIH-2 como lo son ELISA, Western Blot, inmunocromatografía, PCR, etc. PRINCIPIO DE LA PRUEBA

Emplea una combinación única de anticuerpos específicos unidos a proteínas los cuales están conjugados a oro coloidal unido a partículas antigénicas VIH-1/2 las cuales se encuentran unidas a una fase sólida membranosa. La muestra sanguínea es aplicada en sitio indicado junto con el buffer de corrida el cual facilita el flujo de la muestra y promueve la unión de los anticuerpos al antígeno. La mezcla muestra/buffer migra a lo largo de la tira de prueba por acción capilar reconstituyendo el conjugado. Si están presentes los anticuerpos se unen al conjugado de oro coloidal. En una muestra reactiva el complejo conjugado-anticuerpo migra en la membrana y es capturado por los antígenos inmovilizados en la prueba produciendo una línea rosa o roja. La muestra continua migrando y produce una línea rosa o roja en el área del control que contiene antígeno IgG.

Equipo, materiales y sustancias

Cantidad Equipo, materiales y sustancias

* Equipo de venopunción

* Tubos amarillo para recolección

sanguínea

* Centrífuga

* Pipetas de transferencia

* Tira de prueba

* Buffer de corrida

1 Cronómetro

Metodología

1. Tomar una muestra de sangre venosa. 2. Separar el suero. 3. Sacar del empaque la prueba rápida. 4. Coloca 5µl de muestra en el pozo indicado para la muestra. 5. Añadir 3 gotas de buffer lentamente y de forma vertical en el pozo donde se

coloca la muestra. 6. Leer los resultados entre 15-20 minutos después de añadir el buffer de corrida.

RESULTADOS Una línea rosa o roja en el área del control sin ninguna línea en área de la muestra indica un resultado negativo, lo cual indica que no se detectaron anticuerpos anti VIH-1/2. Dos líneas rosas o rojas, una en el área del control y otra en el área de la muestra indica un resultado positivo. La línea en el área del control siempre debe aparecer de no ser así la prueba es inválida. Tiempo estimado de la práctica: 45 a 60 min Disposición de RPBI: Recipiente de color rojo, bolsa roja material y equipo en contacto con residuos infecto contagiosos. Equipo de Seguridad: Guantes de látex, bata, Resultados Interpretación de Resultados y Conclusiones Bibliografía: Manual de prácticas de Laboratorio de Inmunología / M.C. Ana Bertha Torres Reyes, M.C. Rocío Infante Ramírez.

Práctica No. 22

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE IgE EN SUERO HUMANO POR ELISA. INTRODUCCIÓN

Los pacientes con enfermedades alérgicas atópicas tales como el asma atópico, dermatitis atópica y fiebre de heno, han demostrado exhibir incremento en los niveles de IgE totales en sangre, en general estos Ac IgE indican una probabilidad incrementada de hipersensibilidad mediada porIgE, responsables de reacciones alérgica. Las infestaciones parasitarias tales como la uncinaria y ciertos desórdenes clínicos como la aspergilosis, han demostrado elevaciones importantes de IgE. Por otro lado, los niveles disminuidos de IgE son encontrados en casos de hipogamaglobulinemia, enfermedades autoinmunes, colitis ulcerativa, hepatitis, cáncer y malaria. Los niveles de IgE en el suero pueden tener un valor diagnóstico para evaluar el riesgo de condiciones alérgicas futuras en niños. PRINCIPIO DE LA PRUEBA. El método de ELISA utiliza un Ac anti-IgE monoclonal que reviste de la fase sólida (pozos de microvaloración) y un Ac anti-IgE de cabra en la solución de conjugado de enzima-Ac (peroxidasa de rábano picante). La muestra de suero es agregada a los pozos revestidos de Ac e incubados con un buffer cero a temperatura ambiente por 30 min. Si hay IgE presente se combinará con el Ac unido al pozo. Después el pozo es lavado para remover cualquier muestra de prueba residual y posteriormente se agrega un Ac conjugado con peroxidasa de rábano. Este conjugado se unirá a la IgE de la muestra (causando que la IgE de la muestra problema quede entre la fase sólida y los anticuerpos del conjugado). Después se incuba por 30 min a temperatura ambiente, se lavan los pozos con agua para remover los Ac no unidos. Se agrega unasolución de H

2O

2/TMB y se incuba por 20 min más, provocando el

desarrollo de un color azul. La reacción es detenida con la adición de HCl 3N cambiando el color azul a amarillo que es medido espectrofotométricamente a 450nm. LA CONCENTRACIÓN DE IgE ES DIRECTAMENTE PROPORCIONAL A LA INTENSIDAD DEL COLOR DE LA MUESTRA. La cantidad mínima detectada en este ensayo es de 6 UI/ml. REACTIVOS

• Placa de microvaloración revestida de Anti-IgE monoclonal • Buffer Cero

• Conjugado de Anti-IgE-enzima • Estándares de referencia de 0,10,15,50,100,500 y 800 UI/ml • Cromógeno (reactivo de color) A • Cromógeno (reactivo de color) B • Solución de frenado (HCl 3N)

MATERIAL REQUERIDO ADICIONAL

• Pipetas de precisión y puntas de 0.02, 0.01 0.2 y 1000µl • Agua destilada • Tubos de ensaye o matraces para mezclar soluciones de reactivos de color A y

B • Mezclador vórtice • Papel absorbente • Lector de ELISA a 450 nm • Papel cuadriculado

MUESTRAS Suero humano total. PROCEDIMIENTO

1. PREPARACIÓN DE REACTIVOS.

Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente. 2. PROCEDIMIENTO PARA EL ENSAYO. 1. Elija el número necesario de pozos de acuerdo al diseño requerido. (Todas

las muestras de estándares y problemas se montan por duplicado)

2. Vierta 20 µl de estándares, y especímenes en los pozos. 3. Agregue 100 µl de Buffer cero en cada pozo. 4. Mezcle completamente por 10 segundos. 5. Incube a temperatura ambiente por 30 min 6. Lavar 2 veces los pozos con agua destilada en lavador automático.Si no

tiene disponible el lavador automático: Retire el contenido de cada pozo en un recipiente para desechos biológico líquidos, lave con agua destilada o desionizada depositando 200 ul y aspirando totalmente el líquido y seque volteando la placa sobre papel absorbente hasta eliminar todas las gotas residuales.

7. Vierta 150 ul de reactivo de conjugado en cada pozo. Mezcle por 10 seg. 8. Incube a temperatura ambiente por 30 min. 9. Para preparar la solución de H

2O

2/TMB. Hacer una mezcla 1:1 de reactivo de

color A y Reactivo de color B 15 minutosantes de su uso. Mezclar bien para asegurar homogeneidad. Puede prepararse inclusive 1 hora antes, ya que es estable hasta 3 horas.

10. Lavar 5 veces los pozos con agua destilada en lavador automático.

11. Vierta 200 µl de solución H2O

2/TMB en cada pozo y mezcle por 5 segundos.

12. Incube a temperatura ambiente por 20 min. EN OBSCURIDAD. 13. Frene la reacción con 50 µl de solución de frenado a cada pozo y mezcle por

30 segundos o hasta asegurarse que todo el color amarillo cambie a azul. 14. Lea Absorbancia a 450 nm en un lector de placas de ELISA.

CALCULOS DE RESULTADOS.

1. Calcule los valores de absorbancia promedio de todos los estándares y muestras problemas.

2. Elabore una curva estándar, graficando Absorbancia contra concentración de los estándares utilizados.

3. Utilice el valor de absorbancia media de cada muestra problema para determinar la concentración correspondiente de IgE en UI/ml desde la curva estándar.

VALORES DE REFERENCIA. Adultos libres de proceso alérgicos. Los niveles de IgE deben ser menores de 100 UI/ml. Tiempo estimado de la práctica: 3 hrs Disposición de RPBI: Los residuos generados durante el desarrollo de la práctica son eliminados en un recipiente hermético rojo, donde permanecen en congelación hasta el momento de su recolección.

Resultados Bibliografía: Zetterstrom and Johansson S.G.O. Allergy 1981; 36:537 Buckley R.H. Immunopharmacology of Allergic Disease 1979; 117 Michel F.B., Bousquet J. and Greilier P. J. Allergy Clin.Immunol.1980; 64:422.

Práctica No. 23

Determinación de Rotavirus por inmunocromatografía Objetivo Realizar una detección cualitativa de Rotavirus en muestras de Heces

Introducción SIGNIFICADO CLÍNICO

Rotavirus es la causa más frecuente de gastroenteritis en niños y jóvenes, también se ha observado en adultos. Este virus se transmite por contacto feco-oral. Los principales síntomas de esta gastroenteritis vírica son diarrea acuosa y vómitos. También puede presentarse con dolores de cabeza, fiebre y dolor de estómago. Por lo general los síntomas comienzan 1 ó 2 días después de infectarse y pueden durar 3 días. PRINCIPIO DEL MÉTODO

Este es un inmunoensayocromatográfico. Durante la prueba, la muestra reacciona con los conjugados coloreados (anticuerpos monoclonales de ratón anti-rotavirus-microesferas rojas) previamente secados en el test. Este complejo avanza por capilaridad a través de la membrana del test. Para dar el resultado como positivo, una línea de color ROJO aparecerá en la zona de resultados de la membrana. La ausencia de esta línea sugiere un resultado negativo. Independientemente de que haya presencia o no de Rotavirus, la mezcla de conjugado va avanzando por la membrana hasta la región de control donde se han inmovilizado anticuerpos y siempre aparecerá una línea de color VERDE (línea de control). La aparición de esta línea se utiliza: 1) para verificar que se ha añadido el volumen de muestra suficiente y 2) que el flujo ha sido el apropiado; y 3) como control interno de los reactivos.

MÉTODO TOMA DE MUESTRA

Tomar suficiente cantidad de muestra de heces (1-2 g o mL para muestras líquidas). Las muestras de heces deberían ser almacenadas en un recipiente limpio y seco (sin conservantes o medios de transporte). Las muestras se pueden conservar, hasta el momento de utilizarlas, 1 ó 2 días a 2-4 ºC. Para conservar las muestras durante un tiempo prolongado, como máximo 1 año, deben mantenerse congeladas a –20ºC. La muestra debe descongelarse totalmente y alcanzar la temperatura ambiente para poder utilizarla en la prueba. Preparación de la muestra

- Con ayuda del palito se toma una muestra de las heces recogidas. Para ello se pasa el palito por la muestra recogiendo una pequeña cantidad de heces. - Se introduce el palito en el tampón de extracción, para dilución de la muestra, cerrando el tubo.

- Agitar para facilitar la dispersión de la muestra. - Para muestras líquidas, utilice una pipeta y añada 100 μL en el vial para muestra con diluyente. PRECAUCIONES

1. Se deben seguir las instrucciones incluidas en el kit para obtener resultados fiables. 2. No usar tests caducados. 3. Tomar las precauciones necesarias durante la toma de muestra y su manipulación; Tratar muestra y material de ensayo como potencialmente infeccioso. 4. Para cada muestra, utilizar una pipeta desechable y una placa. No reutilizar la pipeta ni la placa. 5. Los tests usados deben ser gestionados como residuos sanitarios (contenedor de residuos sanitarios). PROCEDIMIENTO 1. Atemperar (15-30ºC) la muestra y los otros materiales necesarios para el test,

incluidos los dispositivos, antes realizar el ensayo. 2. Para cada muestra o control se debe usar un tubo de dilución de la muestra y un dispositivo diferente. Identificar cada uno con los datos de la muestra. 3. Agitar el tubo de dilución de la muestra para asegurar una buena dispersión. 4. Romper el extremo superior del tubo (4). 5. Extraer el dispositivo de reacción de su envase para utilizarlo inmediatamente. 6. Depositar 5 gotas o 150 µL del líquido de extracción en la ventana circular del dispositivo marcada con una flecha o una S, evitando añadir partículas sólidas con el líquido (5). Si se da el caso de que el test no funciona debido a la presencia de partículas sólidas en la ventana circular, retirarlas y añadir una gota de tampón hasta que se vea avanzar al líquido (zona de reacción y de control). 7. Leer el resultado del test a los 10 minutos tras la adición de la muestra.

INTERPRETACIÓN NEGATIVO: Una sola línea de color VERDE aparece en la ventana central del dispositivo de reacción, en la zona marcada con la letra C (línea de control). POSITIVO: Además de la línea de control VERDE, también aparece una línea ROJA (línea de resultado) en la zona marcada con la letra T (zona de resultado). INVÁLIDO: Cuando la línea de control (VERDE) no aparece independientemente de que aparezca o no la línea de resultado (ROJA). Las causas más comunes por las que puede aparecer un resultado inválido son: una cantidad insuficiente de muestra, una forma de proceder incorrecta o un deterioro de los reactivos. Si ocurriera esto, debe revisarse el procedimiento y repetir la prueba con un nuevo dispositivo de reacción. Si persistiese el problema, debe contactar con su proveedor y dejar de utilizar la prueba. Notas La intensidad de la línea roja en la zona de resultado puede variar dependiendo de la concentración de antígenos presentes en la muestra. Sin embargo, esta prueba es cualitativa por lo que, ni la cantidad ni la tasa de aumento de antígenos puede ser determinada por la misma. CONTROL DE CALIDAD Control de Calidad interno El test contiene un control de calidad interno, la línea verde que aparece en la zona de control (C). La presencia de esta línea indica que se ha usado un volumen correcto de muestra y el procedimiento seguido ha sido el adecuado. La claridad del fondo de la ventana es también un control interno. Si el test funciona correctamente, este fondo estará claro y no interferirá con la lectura del resultado. Control de Calidad externo Se recomiendan controles externos, positivos y negativos, para controlar el desarrollo del ensayo. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO 1. El test es sólo para diagnóstico in vitro

profesional. 2. Una vez abierto, el dispositivo no debe usarse después de 2 horas. 3. Un exceso de muestra puede dar resultados negativos, dando líneas no muy definidas de color pardo que no tienen ningún valor diagnóstico. Diluir la muestra en más tampón y repetir el ensayo. 4. Después de una semana de infección la presencia de virus eliminados en heces disminuye considerablemente por lo que es probable una menor concentración en la muestra. Se debe tomar la muestra de heces dentro de la primera semana de aparición de los síntomas. 5. Esta prueba diagnostica una posible infección de Rotavirus, situación que debe confirmarse por un especialista o médico cualificado, teniendo en cuenta las pruebas clínicas y de laboratorio evaluadas. VALORES PREVISTOS Se esperan resultados negativos en niños y jóvenes

sanos, así como en adultos libres de infección. CARACTERÍSTICAS DEL MÉTODO

Se han realizado estudios y evaluaciones para comparar la eficacia del test. El Spin-Rotavirus Test se evaluó en paralelo con un test rápido del mercado para detección de Rotavirus.

Sensibilidad La detección de Rotavirus presenta un 100% de concordancia en

sensibilidad. Especificidad La detección de Rotavirus presenta un 98% de concordancia en

especificidad. El uso de anticuerpos monoclonales de ratón en el diseño del Spin-Rotavirus asegura un alto grado de especificidad para la detección de rotavirus. BIBLIOGRAFÍA 1. CUKOR G., and BLACKLOW N. R., “Human Viral Gastroenteritis”, Microbiological Reviews, Vol. 48 No 2, June 1984, pp. 157-179 2. ESTES, M. K. and COHEN, J.; “Rotavirus Gene Structure and Function”, Microbiological Reviews, Vol. 53 No 4, Dec. 1989, pp. 410-449 3. PAI C. H., SHAHRABADI M. S., and INCE B., “Rapid Diagnosis of Rotavirus Gastroenteritis by a Commercial Latex Agglutination Test”, Journal of Clinical Microbiology, Vol. 22 No 5, Nov. 1985, pp. 846-850 4. CUKOR, G.,PERRON, D.M., and BLACKLOW, N. R.: “Detection of Rotavirus in Human Stools by Using Monoclonal Antibody”, Journal of Clinical Microbiology, Vol. 19, 888-892

Práctica No. 24

DETERMINACIÓN DE ANTICUERPOS IgM ANTI Rubéola POR EL MÉTODO DE ELISA

Objetivo General

• Utilizar el método de ELISA para determinar anticuerpos tipo IgM contra el virus de

rubéola • Aprender el uso correcto del lector de ELISA BenchmarkMicroplate, para realizar

una correcta interpretación de los resultados. Introducción:

La Rubéola es una enfermedad viral contagiosa con distribución mundial, también llamada sarampión alemán o sarampión de 3 días. La infección por Rubéola es predominantemente una enfermedad que afecta niños y ancianos. Sus manifestaciones clínicas incluyen fiebres, dolores de cabeza y erupción en la piel.

Esta infección durante el embarazo es más peligrosa ya que puede causar malformaciones, cataratas, retraso mental e incluso la muerte del feto.

La demostración de anticuerpos IgG anti- rubéola en mujeres en edad fértil es útil para proteger al feto de posibles infecciones virales con Rubéola durante el embarazo.

PRINCIPIO DE LA PRUEBA

Esta técnica es un análisis inmunoenzimático en fase sólida llamado “Método ELISA indirecto”. Los Ac´sIgM anti- Rubeóla presentes en la muestra se ligan al Ag fijado en los pocillos de la placa. Posteriormente el Ac marcado se liga a las IgM séricas que han reaccionado con el Ag de Rubeóla, la presencia del complejo inmune (Ag de RubeólaIgG séricas anti- Rubeóla conjugado anti-IgG) se revela mediante la adición de una solución de revelado enzimático en cada pocillo. La reacción enzimática se para con la adición de H

2SO

4 4N; la densidad óptica a 492/620 nm es

proporcional a la IgM anti- Rubeóla. Cuando están presentes Ac séricos de la clase IgM, se combinan con el Ag del virus del rubeóla adheridos a los micropozos de poliestireno. El suero residual es removido por lavado y se adiciona el conjugado de peroxidasa con Anti-IgM humana. Los micropozos son lavados y se adiciona entonces un sistema de sustrato incoloro de tetrametilbencidina/peróxido de hidrógeno (TMB/H

2O

2). El

sustrato es hidrolizado por la enzima y el cromógeno cambia a color azul. Después de detener la reacción con ácido, el TMB cambia a amarillo, donde la intensidad del color es directamente proporcional a la concentración de Ac IgM del virus del rubeóla en la muestra problema.

REACTIVOS

1. Tiras microelisas: Depósitos cubiertos de antígeno Rubeóla purificados 2. Solución absorbente. Tapa negra 3. Concentrado de lavado 10X. Tapa blanca 4. TMB sustrato. Botella ámbar 5. Solución C: Conjugado de enzima 6. calibrador Cutt-Off (parámetro) Índice Rubeóla= 1.0. Tapa amarilla 7. Control negativo. Tapa color natural 8. Control Positivo. Tapa roja 9. Solución de paro; HCl 2N.

Metodología

1. Preparar la solución de lavado 1X. (100 ml de solución + 900 ml de agua

destilada). 2. Utilizando una navaja, corte el número deseado de tiras cubiertas, desprenda

la cinta protectora, asegure la tira en el soporte. 3. Preparar una dilución 1:40 de control negativo, control positivo, calibrador y

sueros problema añadiendo 5µL de la muestra y 200uL de solución absorbente. Mezclar bien.

4. vierta 100µL de suero diluido, calibrador y controles en los depósitos apropiados. Para el blanco de reactivo, vierta 100µL de diluyente de muestra en la posición A1. Mezcle e incube por 30 minutos a temperatura ambiente.

5. retire el líquido de todos los depósitos y repita el lavado 3 veces con el buffer de lavado.

6. vierta 100µL de conjugado de enzima a cada depósito e incube 30 minutos a temperatura ambiente.

7. Retire el conjugado de enzima de todos los depósitos. Repita el lavado 3 veces con el buffer de lavado.

8. Vierta 100µL de solución TMB e incube por 30 minutos a temperatura ambiente.

9. agregue 100µL de HCl 2N para detener la reacción. 10. ASEGÚRESE QUE NO ESTAN BURBUJAS EN CADA DEPÓSITO ANTES

DE LA LECTURA. 11. Interprete el O.D. (OpticalDensity/Absorbancia) en 450 nm con un lector de

microelisas. CÁLCULOS:

1. Calcule la media del valor Xc del calibrador duplicado. 2. Calcule la media del control positivo, negativo y muestras duplicados. 3. Calcule el índice Rubeola M de cada determinación al dividir los valores de la

media de cada muestra entre el valor Xc de la media del calibrador.

Ejemplo: Calibrador de Cut-off (parámetro) índice Rubéola M=1.0 D.O. calibrador cut-off= 0.350, 0.375 Xc= 0.363 D.O. control negativo: 0.162, 0.175 Xn= 0.169 Índice rubéola M= 0.169/0.363 = 0.0.46 D.O. control positivo: 1.086, 1.097 Xp= 1.092 Índice Rubéola M= 1.092/0.363 = 3.00 D.O. muestra: 1.119, 1.203 Xm= 1.161 Índice Rubéola M= 1.161/0.363 = 3.20 INTERPRETACIÓN

Negativo: el índice Rubeóla M menor de 0.90 es negativo para el anticuerpo IgM para Rubeola. Erróneo: índice Rubeola M entre 0.91 – 0.99 es erróneo. La muestra debe ser vuelta a procesar. Positivo: índice rubeóla M de 1.00 o mayor es positivo para el antiuerpoIgM para Rubeólaie indica la probabilidad de infección con Rubéola presente o reciente.

Tiempo estimado de la práctica: 2-3 hrs. Disposición de RPBI: Los residuos generados durante el desarrollo de la práctica son eliminados en un recipiente hermético rojo, donde permanecen en congelación hasta el momento de su recolección. MEDIDAS DE SEGURIDAD: 1.- El alumno deberá usar, mientras se encuentre trabajando en el laboratorio, bata abrochada, guantes y lentes de protección. 2.- Queda estrictamente prohibido ingerir cualquier tipo de alimentos dentro del laboratorio. 3.- Al terminar, su área de trabajo deberá quedar totalmente limpia. Bibliografía:

1.Measles mumps and rubella. Vaccine use and strategies for elimination of measles, rubella and congenital rubella syndrome and control of mumps: recommendation of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP). MMWR. May 22, 1998 / 47 (RR); 1-57

2.Center for Disease Control. Measles (Los Angeles County, 1988.MMWR. 1989; 38. 3. Patrick r. Murray., george s. Kobayashi,.,michael a. Pfaller., ken s. RosenthalMicrobiologíageneralSegunda edición. 1996

Práctica No. 25

Determinación de Drogas por Métodos Rápidos Anfetaminas, Cocaína y Marihuana. Objetivo

• Determinar la presencia de metabolitos de drogas a través de métodos rápidos de inmunocromatografía.

Introducción:

Este examen puede emplearse para evaluar posibles sobredosis o envenenamiento por causa accidental o intencional, como cuando existe la necesidad de evaluar el tipo y cantidad de droga legal o ilegal utilizada por una persona. Este examen puede emplearse para determinar la causa de toxicidad aguda por droga, para evaluar la dependencia de la droga y para determinar la presencia de sustancias en el cuerpo (para propósitos médicos y/o legales). Ver también: Primeros auxilios en caso de abuso de drogas.

Si el examen se utiliza como exploración selectiva de drogas existe una cantidad finita de tiempo después de la ingestión durante la cual se puede detectar la droga o cualquiera de sus metabolitos:

• Cocaína o2 a 4 días y desde 10 hasta 22

días si el consumo es excesivo • Anfetaminas o24 a 48 horas

• Heroína o1 a 2 días

• Morfina o1 a 2 días

• Fenciclidina (CFC) o1 a 8 días

• Alcohol o3 a 10 horas

• Benzodiazepinas ohasta 6 semanas con alto nivel de

consumo • Hidromorfona

o1 a 2 días • Tetrahidrocannabinol (THC) o6 a 11 semanas con consumo

excesivo • Propoxifeno

o6 a 48 horas • Metadona

o2 a 3 días • Codeína

o1 a 2 días • Barbitúricos

ohasta 6 semanas

Valores normales Los niveles normales varían de acuerdo a la institución que realiza el examen. La sangre puede ser examinada para detectar la presencia y niveles (cantidades) de medicamentos. La exploración selectiva en orina generalmente se reporta como positiva (la sustancia está presente) o negativa (ausente), pero en la orina también se puede medir con bastante precisión el nivel de ciertas sustancias. Se detectan niveles terapéuticos de medicamentos con o sin receta médica (ver

medicamento específico). Normalmente, no se detecta la presencia de alcohol, de medicamentos que requieren receta, que no han sido indicados por el médico, o de drogas ilegales. Significado de los resultados anormales

La presencia de drogas ilegales o drogas no recetadas indica uso ilegal de drogas . Los niveles elevados de alcohol o drogas prescritas pueden indicar intoxicación y/o sobredosis intencional o accidental. Algunas veces, este examen forma parte de una investigación de uso o abuso de droga; pueden requerirse consentimientos especiales, manejo y etiquetado de especímenes u otros procedimientos especiales. PRINCIPIO.

Se utiliza un inmunoensayo de reconocimiento del Ag (droga) , basado en la detección específica de ésta por anticuerpos marcados con oro coloidal que se unen a la misma y por cromatografía migran hacia la parte superior de la tira donde este complejo es reconocido por otro anticuerpo (anti-anticuerpo) desarrollando color, únicamente presentando una marca (PRUEBA POSITIVA) Para una PRUEBA NEGATIVA, el anticuerpo marcado con oro coloidal migra hacia la parte media de la tira uniéndose a la droga colocada y desarrollando color. El exceso de anticuerpos migra hasta la parte superior y son reconocidos por el complejo previamente mencionado.

Metodología Permitir que la tira y las muestras estén a temperatura ambiente. Antes de realizar la prueba.

1. Sacar la tira reactiva de su empaque y utilizarla lo más pronto posible. Retirar la tapa plástica de la parte inferior de la tira.

2. Sumerja la tira en la orina de manera vertical (flechas apuntando hacia la muestra de orina) por al menos 10 segundos. Sumergir la tira por lo menos al nivel de las líneas onduladas pero no por encima de las flechas de la tarjeta de prueba.

3. Coloque la tapa y mantenga la tarjeta de prueba en una superficie no absorbente. Leer resultados a los 5 minutos.

Interpretación de Resultados

Negativo Positivo Inválido

Disposición de RPBI: Recipiente color rojo, residuos de origen sanguíneo; bolsa


Bibliografía: Hawks RL, CN Chain. Urine Testing for Drugs of Abuse.National Institute for Drug Abuse (NIDA), Research Monograph 73, 1986. Baselt RC. Disposition of Toxic Drugs and Chemicals in Man. 6th Ed. Biomediccal Publ., Foster City.CA. 2002.

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